BR102013023224B1 - PEPTÍDEO (ARGº)N-ANGIOTENSINA-(1-7) E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS PARA TRATAMENTO DE DOENÇAS - Google Patents

Abstract

PEPTÍDEO (ARG0)N-ANGIOTENSlNA-(1-7) E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS PARA TRATAMENTO DE DOENÇAS. A presente invenção consiste no peptídeo (Arg0)n-Angiotensina- (1-7) [(Arg0)n- Ang-(1-7)], onde n é 1 a 10 (SEQ ID N°1, onde Xaa representa uma variação de 1 a 10 aminoácidos L-Arg), o qual é produzido pela inserção de pelo menos um aminoácido arginina na posição aminoterminal da Ang-(1-7), bem como composições farmacêuticas contendo este peptídeo e o uso dos mesmos para tratamento ou prevenção de doenças ou distúrbios que sejam devidos ou cursem com produção reduzida de óxido nítrico, tendo como exemplos não limitantes patologias cardiopulmonares e hepáticas, vasculopatias, distúrbios metabólicos, neurais, do aparelho genito- urinário, músculo-esqueléticos, renais, cutâneos, alopecia ou tumores. O peptídeo é capaz de causar, por exemplo, dilatação de vasos aórticos e mesentéricos, redução da pressão arterial média, diminuição do ganho de peso corporal, bloqueio do desenvolvimento de adiposidade visceral, redução dos níveis de colesterol séricos e hepáticos, normalização da intolerância à glicose e da resistência à insulina e efeito anti-proliferativo. O peptídeo (Arg0)n-Ang-(1-7) pode estar opcionalmente associado a um sistema carreador ou sistema de liberação controlada de fármacos.

Description

A presente invenção consiste no peptídeo (Arg°)π-Angiotensina-(1-7) [(Arg°)n-Ang-(1-7)], onde nl é 1 a 10 (SEQ ID N°1, onde Xaa representa uma variação de 1 a 10 aminJácidos L-Arg), o qual é produzido pela inserção de pelo menos um aminoácido arginina na posição aminoterminal da Ang-(1-7), bem como composições farmacêuticas contendo este peptídeo e o uso dos mesmos para tratamento cu prevenção de doenças ou distúrbios que sejam devidos ou cursem com produção reduzida de óxido nítrico, tendo como exemplos não limitantes patologias cardiopulmonares e hepáticas, vasculopatias, distúrbios metabólicos, neurais, do aparelho genito-urinário, músculo-esqueléticos, renais, cutâneos, alopecia ou tumores. O peptídeo é capaz de causar, por exJmplo, dilatação de vasos aórticos e mesentéricos, redução da pressão arterial média, diminuição o ganho de peso corporal, bloqueio do desenvolvimento de adiposidade visceral, redução dos níveis de colesterol séricos e hepáticos, normalização da intolerância à glicose e da resistência à insulina e e:eito anti-proliferativo. O peptídeo (Arg°)n-Ang-(1-7) pode estar opcionalmente associado a um sistema carreador ou sistema de liberação controlada de fármacos.

O peptídeo objeto da presente invenção é obtido com base no peptídeo angiotensina-(1-7), uma das moléculas envolvidas no sistema renina- angiotensina (SRA). O SRA é um sistema hormonal, circulante e local responsável por regular as funções renais e cardiovasculares, exercendo papel central na homeostasia da cressão arterial e no balanço hidroeletrolítico.

Classicamente, a ativação do SRA se inicia pela enzima renina, a qual é sintetizada e liberada pelas células justaglomerulares das arteríolas aferentes renais. Esta, por sua vez, cliva o angiotensinogênio (AGT), formando um decapeptídeo inativo, a An^iotensina I (Ang I). (Fyhrquist, F. & Saijonmaaa, O. et al. Renin-Angiotensin System Revisited. Journal of Internal Medicine, v. 3 ,p. 224-236, 2008). A Enzima Conversora de Angiotensina (ECA), outro componente do SRA, é uma enzima presente na superfície luminal do endotélio vascular contendo dois domínios ativos, os quais são inibidos pelos inibidores da EGA. Ela é responsável por catalisar a remoção dos dois aminoácidos da porção amino-terminal da Ang I dando origem a um octapeptídeo biologicamente ativo, a An'g II. Além disso, essa enzima hidrolisa a bradicinina e o heptapeptídeo Ang-(1-7) em metabólitos inativos (TURNER, A. et al. The Angiotensin-Converting Enzyme Gene Family: Genomics and Pharmacology. Trends in Pharmacologies ' Sciences, v. 23, n. 4, p. 177-183, 2002). Assim, a ECA participa do controle cardiovascular por degradar peptideos vasodilatadores e contribjuir para a formação da Ang II (WEI, C. et al. Differential ANG II Generation in Plasma and Tissue of Mice with Decreased Expression of the ACE dene. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology, v. 282, n. 6, p. H2254-2258, 2002). Tanto a Ang I quanto a Ang II podem ser hidrolisadas pela ECA2 formado a Ang-(1-7), urn Cjornponente biologicamente ativo do SRA. A ECA2 é uma enzima homóloga a ECA, porém ela não é inibida por inibidores da enzima conversora de angiotensina. No entanto, a atividade catalítica da ECA2 para hidrolisar a Ang II é 400 lezes maior do que para a Ang I. Esta enzima, ao hidrolisar a Ang I, remove um único resíduo C-terminal, para formar o peptídeo Angiotensina-(1-9) [(Ang-(1-9)]. Este pode ser convertido em Ang-(1-7) por ação da ECA e de outras endopeptidases (DONOGHUE, M. et al. A Novel Angiotensin-Converting Eijzyme-Related Carboxypeptidase (ACE2) Converts Angiotensin I to Angiotensin 1-9. Circulation Research, v. 87, p. E1-E9, 2000; SANTOS, R. A. S. et al. Recents Advances in the Angiotensin-Converting Enzyme 2-Angiotensin-(1-7)-Mas Axis. Experimental Physiology, v. 5 , p. 519527,2008).

Peptideos adicionεis da família das angiotensinas, incluindo a Angiotensina Hie Angiotensina IV (Ang IV) estão menos caracterizados. Estes peptídos antagonizam ou têm feitos adicionais quando comparados com a Ang II (Fyhrquist, F. & SaijonrJaaa, O. et al. Renin-Angiotensin System Revisited. Journal of Internal Medicine, v. 3 ,p. 224-236, 2008).

A Ang-(1-7) possui ações muitas vezes opostas às atribuídas a Ang II, como vasodilatação mediada pela produção de óxido nítrico e prostaglandinas, efeito anti-trombótico, anti-arritmogênico, anti-proliferativo, anti-tumorigêncio, cardioprotetor e metabólicoprotetor, inibe a liberação de norepinefrina, modula o controle tônico e reflexo da pressão arterial, aumentando a sensibilidade do reflexo baroceptor, ativa a via de sinalização da insulina aumentando a fosforilação da AKT, previne a distrofia muscular esquelética, além de apresentar efeitos nos processos de ovulação e espermatogênese. Assim, o heptapeptídeo tem sido considerado o principal contra-regulador dos efeitos deletérios da Ang II (Marques, F. etal. An Oral Formulation of Angiotensin-(1 -7) Produces Cardioprotective Effects in Infarcted and Isoproterenol-Treated Rats. Hypertension, v. 3, p. 477-483, 2011; SANTOS, R. A. S. et al. Recents Advances in the Angiotens-in-Converting Enzyme 2-Angiotensin-(1 -7)-Mas Axis. Experimental Physiology, y. 5, p. 519-527, 2008; Ribeiro-Oliveira, A Jr. et al. The Renin-Angiotensin System and Diabetes: an update. Vascular health and risk management, v.4, p. 787-803, 2008; SANTOS, R. A. S. et al. Angiotensin- (1-7): an update. Regulatory Peptides, v. 1-3, p. 45-62, 2000).

Recentemente, foi identificado o receptor Mas acoplado à proteína G (GPCR) como um receptor para a Ang-(1-7). Relata-se, no estado da técnica, que o fragmento angiotensinérgico biologicamente ativo, Ang-(1-7) (Asp1-Arg2- Val3-Tyr4-lle5-His6-Pro7), é um ligante com alta afinidade para o receptor Mas. Esse receptor está envovido em várias ações da Ang-(1-7), incluindo a regulação da pressão artsrial e melhora metabólica, além de efeitos anti- trombóticos e anti-cancerígenos (SANTOS, R. et ai. Angiotensin-(1-7) is an endogenous ligand for the G protein - coupled receptor Mas. Proceedings of the National Academy of Science, v. 100, n. 14, p. 8258-8263, 2003; SANTOS, R. A. S. et al. Recents Advances in the Angiotensin-Converting Enzyme 2- Angiotensin-(1-7)-Mas Axisj. Experimental Physiology, v. 5, p. 519-527, 2008).

Muitas ações da Ang-(1-7) são bloqueadas por um antagonista seletivo do receptor Mas, o A-779 (Asp1-Arg2-Val3-Tyr4-lle5-His6-D-Ala7), embora alguns efeitos da Ang-(1-7p sejam apenas parcialmente bloqueados por ele. Além disso, encontra-se na literatura que algumas ações do heptapeptídeo podem envolver a ECA, receptores AT, e AT2. Estudos mais recentes, mostraram a possível existência de um subtipo de receptor diferente para a Ang-(1-7) na aorta de ratos Sprague-Dawley sensível a outro antagonista do receptor Mas, o D-Pro7-Ang-(1-7) (Asp1-Arg2-Val3-Tyr4-lle5-His6-D-Pro7) (SILVA, D. M. R. et al. Evidence for a new angiotensin-(1-7) receptor subtype in the aorta of Sprague-Dawley rats. Peptides, v. 28, n. 3, p. 702-707, 2007).

As ações cardiovaslculares e barorreflexas da Ang-(1-7) contrarregulam os efeitos deletérios da Ang II. Por exemplo, a Ang II agindo via receptor ATi causa vasoconstrição e concomitante aumento da pressão arterial, enquanto a Ang-(1-7) agindo via receptor Mas causa vasodilatação e diminuição da pressão. A Ang-(1-7) apresenta efeito vasodilatador em vários leitos vasculares, incluindo artéria coronária canina e porcina, aorta de rato e artéria mesentérica de mamífero. Além disso, foi mostrado que a Ang-(1 -7) bloqueou a vasocontrição induzida pela Ang II em artérias isoladas humanas e na circulação do antebraço em homens normotensos. Acredita-se que os efeitos vasodilatadores da bradicinina são potencializados pela Ang-(1-7) (SANTOS, R. A. S. et al. Angiotensin (1-7): an update. Regulatory Peptides, v. 1-3, p. 4562, 2000).

O efeito vasodilatador do heptapeptideo, via Mas, ocorre pela liberação de óxido nítrico (NO). A Aig-(1-7) estimula a ativação da enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) e, consequentemente, a produção de NO via sinalização dependente de AKT (SAMPAIO, W. O. et al. Angiotensin-(1-7) through receptor Mas mec iates endothelial nitric oxide synthase activation via Akt-dependent pathways. Hypertension, v. 49, n. 1, p. 185-192, 2007).

O NO é produzido por muitas células em todo o corpo e a enzima responsável pela sua produção é a óxido nítrico sintase, a qual é capaz de gerar NO e L-cirtrulina a partir da L-arginina. A presença de óxido nítrico no endotélio vascular é particularmente importante para a regulação do fluxo sanguíneo, sendo que sua produção anormal, como ocorre em diferentes estados de doença, pode afetar o fluxo sanguíneo e outras funções.

Além de apresentar 'ações no sistema vascular, o NO participa de muitos processos fisiológicos no sistema nervoso central e periférico, prevenção do desenvolvimento de acidente vascular encefálico, no controle de infecções e neoplasias, na regulação da microcirculação renal e como mediador da ereção peniana (Moncada, S. et al. The Discovery of Nitric Oxide and its Role in

Vascular Biology. British Journal of Pharmacology, v. 147, suppl. 1, p. S193- S201,2006).

O NO foi identificado como um mediador inibitório na neurotransmissão não-adrenérgica, não-co inérgica (NANC) em nervos periféricos. Essa 5 neurotransmissão 'nitrérgica' tem sido demonstrada nos corpos cavernosos, resultando em ereção do pênis. Assim, danos seletivos dos nervos nitrérgicos pode levar a disfunção eréictil (Moncada, S. et al. The Discovery of Nitric Oxide and its Role in Vascular Biology. British Journal of Pharmacology, v. 147, suppl. 1, p. S193-S201,2006). Dsvido as propriedades vasodilatadoras da Ang-(1-7), io o eixo Ang-(1-7)/receptor Mas também desempenha um papel importante na ereção peniana. Foi obserj/ado que a infusão de Ang-(1-7) em ratos induziu a liberação de NO e potencializou a elevação da pressão nos corpos cavernosos. Estes efeitos foram blo'queados pelo A-779 e pelo /V_-nitro-L-arginine methylester (L-NAME), upn inibidor da enzima NO sintase. Além disso, 15 camundongos com deleção genética do receptor Mas apresentaram comprometimento da função erétil, como demonstrado pela fibrose peniana e menor resposta a estimililação do gânglio pélvico (Gonçalves, A.C.C. et a/. Evidence that the Vasodilator Angiotensin-(1-7)-Mas Axis Plays an Important Role in Erectile Function. American Journal of Physiology. Heart and Circulation 20 Physiology, v. 293, n. 4, p. H2588- H2596, 2007).

O SRA também tem um papel importante na homeostase do metabolismo. Ensaios clínicos e modelos animais de diabetes do tipo I e tipo II têm mostrado que a hi peratividade das vias de sinalização da Ang II contribuem para o desenvolvimento da resistência à insulina e diabetes 25 (VELLOSO, L. A. et al. T ie multi-faceted cross-talk between the insulin and angiotensin II signaling systems. Diabetes/Metabolism Research and Reviews, v. 22, n. 2, p. 98-107, 2006). Por outro lado, o heptapeptídeo Ang-(1-7) exerce uma ação protetora, aumentando a sensibilidade à insulina via IRS-1/PI3K/AKT e melhorando o metabolismo lipídico (GIANI, J. F. et al. Chronic infusion of 30 angiotensin-(1-7) improves' insulin resistance and hypertension induced by a high-fructose diet in rats. American Journal of Physiology - Endocrinology And Metabolism, v. 296, p. 262-271, 2009; SANTOS, S. H. S. et al. Improved lipid and glucose metabolism in transgenic rats with increased circulating angiotensin-(1-7). Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, v. 30, p. 953-61, 2010). Estes efeitos são mediados via receptor Mas, uma vez que o antagonista específico deste receptor, o A-779, bloqueou as ações da Ang-(1 - 5 7). Além disso, camundongos com deleção genética do receptor Mas foram caracterizados como um modelo de síndrome metabólica por apresentarem aumento do tecido adiposo epididmal, resistência à insulina e dislipidemia (SANTOS, S. H. S. et al Mas Deficiency in FVB/N Mice Produces Marked Changes in Lipid and Glycemic Metabolism. Diabetes, v. 57, p. 340-347, 2008). io É descrito na literatura que há correlação inversa entre o potencial metastático de tumores ej a produção de NO e que o desenvolvimento do tumor, sua vascularização e seu potencial lesivo estão relacionados a reduzidas concentrações |je NO. As ações anti-tumorigênicas do NO estão relacionadas com a ativação do fator nuclear p-53, um fator de transcrição 15 envolvido na apoptose de[ células anormais ou danificadas, e a ativação da isoforma induzida da enzima NO sintase . (MUNTANÉ, J.; DE LA MATA, M. Nitric Oxide and Cancer. World Journal of Hepatology, v. 9, n. 2, p. 337-344, 2010). O eixo Ang-(1-7)/receptor Mas também apresenta importante efeito anti- tumorigênico e anti-proliferativo. Trabalho de Verano-Braga e colaboradores 20 mostrou que células endoteliais humanas e células A549 (adenocarcinoma alveolar humano) quando estimuladas com Ang-(1-7) apresentaram desfosforilação do sítio S256 do fator de transcrição forkhead box protein O 1 (FOXO1). Como consequência, houve a translocação dessa proteína do citoplasma para o núcleo, onde ela fica ativa e regula vários genes envolvidos 25 na proliferação celular, apoptose, reparação de lesão do DNA e supressão de tumor. Esse dado sugerJ que a atividade anti-carcinogênica da Ang-(1-7) envolve a ativação da ROXO1, como também a inativação de proteínas envolvidas na proliferação celular e tumorogênese , como a MAPK1, HDAC1 e mTORCI (VERANO-BR^XGA, T. et al. Time-Resolved Quantitative 30 Phosphoproteomics: New Insights into Angiotensin-(1-7) Signaling Networks in Human Endothelial Cells, \journal of proteome research, v. 6, n. 11, p. 3370-3381,2012.

O NO tem uma função importante na regulação do fluxo sanguíneo cerebral e na proteção de células nervosas contra fatores patogênicos associados com isquemia cerebral, trauma e hemorragia (TODA, N. et al. Cerebral Blood Flow Regulation by Nitric Oxide: Recent Advances. 5 Pharmacological Rev/ewsj, v. 61, n. 1, p. 62-97, 2009). O eixo Ang-(1- 7)/receptor Mas também exerce efeitos benéficos contra déficits neurológicos e lesão no sistema nervoso central como consequência do acidente vascular cerebral. Estudo mostrou que a infusão intracerebroventricular de Ang-(1-7), em modelo de isquemia cerebral, reduziu o tamanho da área cerebral infartada 10 e os déficts neurológicos, cujos efeitos foram bloqueados pelo inibidor do receptor Mas, o A-779 (MECA, A.P. et al. Cerebroprotection by Angiotensin-(17) in Endothelin-1-induced Ischaemic Stroke. Experimental Physiology, v. 96, n.10, p.1084-1096, 2011).

O efeito protetor da Ang-(1-7) no sistema cardiopulmonar foi 15 demonstrado por meio de um estudo em que se observou que a superexpressão do heptaoeptídeo reduziu a fibrose pulmonar induzida por bleomicina, além de reverter a hipertensão cardiopulmonar em modelo de monocrotalina. Esses efeitos foram abolidos pelo antagonista do receptor Mas A-779 (SHENOY, V. et al. The Angiotensin-Converting Enzyme 2/Angiotensin- 20 (1 -7)/Mas Axis Confers Cardiopulmonary Protection Against Lung Fibrosis and

Pulmonary Hypertension. ^American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, v. 182, p. 1065-1072, 2010).

Um estudo, ainda não publicado, mostrou o potencial da Ang-(1-7) como agente terapêutico para o tratamento da distrofia muscular esquelética tanto in 25 vitro como in vivo associada à, e que os efeitos benéficos na redução da fibrose muscular e aumentL da força contrátil foram revertidos na presença no antagonista do receptor Me.s, o A- 779 (ACUNA, M. J. et al. Angiotensin (1-7), A Novel Agent That Reduces Fibrosis And Improves Muscular Strength In Dystrophyc Skeletal Muscle. New Directions in Biology and Disease of Skeletal 30 Muscle Conference. New Orleans, Louisiana, 2012).

Embora tanto a Ang-(1-7) como o NO sejam amplamente conhecidos, não existe no estado da técnica uma descrição ou aplicação descrita para um peptídeo que carreia em sua sequência um precursor do NO e a Angiotensina- (1-7). O peptídeo (Arg°)n-Angiotensina-(1-7) [(Arg°)n-Ang-(1-7)], objeto dessa invenção, contém a L-arginina, precursor de NO, e a sequência da Ang-(1-7).

Foi encontrado no estado da técnica o pedido de patente PI0800585-0, intitulado “Peptídeo Des-[Asp1]-[Ala1]- agonista da angiotensina-(1-7) e composições farmacêuticas para tratamento de doenças”, que descreve um peptídeo derivado de Ang-(1-7), o qual foi obtido pela troca do aspartato (Asp), o primeiro aminoácido na posição N-terminal da Ang-(1-7), por alanina (Ala). Este heptapeptídeo apresenta efeito vasculoprotetor e cardioprotetor em mamíferos. Portanto, traa-se de um produto diferente do objeto desta invenção, uma vez que (Arg°)n-Ang-(1-7) é um octapeptídeo que apresenta pelo menos uma arginina (Arg) inserida na posição N-terminal da Ang-(1-7). Além disso, o peptídeo do pedido PI0800585-0 tem efeitos restritos ao sistema cardiovascular.

Também foi encontrado o pedido de patente GB1487115, intitulado “Angiotensins antagonist”, descreve um octapeptídeo cuja sequencia de aminoácidos é R-Arg-Vel-Tyr-lle-His-Pro-X, em que R representa N,N- dimetilglicil, N-metilisoleucil, guanidilacetil ou sarcosil e X é treonina, O-metil- treonina or isoleucina. Este peptídeo é capaz de inibir o efeito vasoconstritor da angiotensina II. Contudo, Jovamente, se trata de um peptídeo diferente do que é objeto da presente invenção.

O peptídeo (Arg°)n-Ang-(1-7) pode ser utilizado para o tratamento ou prevenção de doenças ou desordens cardiopulmonares, vasculares ou renais, bem como doenças ou distúrbios metabólicos, incluindo, de forma não limitante, hipertensão, hipertensão primária ou secundária, hipertensão vascular renal, aterosclerose, lesões devidas à isquemia/reperfusão, infarto agudo do miocárdio, insuficiência cardíaca congestiva aguda ou crônica, hipertrofia ventricular esquerda, hipertrofia vascular, glaucoma, hiperaldosteronismo primário ou secundário, neuropatia diabética, glomerulonefrite, esclerodermia, esclerose glomerular, insuficiência renal, terapia de transplante de órgão, retinopatia diabética, nefropatia e disfunção erétil, dislipidemia, resistência à insulina, diabetes mellitus tipo 1 e tipo 2 ou síndrome metabólica.

O peptídeo (Arg°)n-Ang-(1-7) pode também ser usado como agente cardioprotetor e metabolic oprotetor em pacientes que tenham fatores de risco 5 para doenças e/ou desordens descritas acima. Outra opção de uso do peptídeo pode ser para o tratamen :o, prevenção e/ou manejo de neoplasias, benignas ou malignas, não limitadas a uma região específica do organismo. Além disso, este peptídeo pode ser uti izado para o tratamento, prevenção e/ou manejo de doenças ou desordens neurológicas, já que o NO participa de processos 10 fisiológicos relacionados aos sistemas nervosos central e periférico. Essas doenças ou desordens incluem, mas não se limitam a, neuropatia diabética periférica, dor, acidente Jascular cerebral e isquemia cerebral. O peptídeo (Arg°)n-Ang-(1-7) pode também ser usado como agente neuroprotetor em pacientes que tenham fatores de risco para doenças e/ou desordens descritas 15 acima. O peptídeo (Arg°)n-Ang-(1-7) pode também ser agente etrapêutico no tratamento de distrofia muscular esquelética. O peptídeo (Arg°)n-Ang-(1-7) pode ser usado ainda na prevenção e no tratamento da alopecia.

Esse peptídeo e derivados que o tornam mais resistente à hidrólise, como, mas não limitadas, la formas cíclicas ou esterificadas, pode também ser 20 utilizado para prevenção ej/ou tratamento de doenças que podem ser tratadas e/ou prevenidas por agon stas do receptor Mas, como a Angiotensina-(1-7), AVE0991 e CGEN 856.

DESCRIÇÃO BREVE DAS FIGURAS

A Figura 1 mostra a produção de óxido nítrico pelo peptídeo Arg°-Ang- 25 (1-7) e pela Ang-(1-7) ém cultura celular de ovário de hamster chinês transfectadas com o receptor Mas. Cada ponto apresenta a média ± erro- padrão da média. O símbolo (###) considera p<0,0001 em relação ao controle e o símbolo (***) considera p<0,0001 em relação a Ang-(1-7).

As Figuras 2A e 2B mostram o efeito vasodilatador concentração- 30 dependente do peptídeo krg°-Ang-(1-7) e da Ang-(1-7) em anéis de aorta torácica de ratos Wistar rormotensos e ratos espontaneamente hipertensos (SHR), respectivamente. Na Figura 2A, o símbolo (***) indica que p<0,0001 veículo vs. Ang-(1-7); o símbolo (###) indica que p<0,0001 veículo vs. Arg°- Ang-(1-7); e Ns = não há significância. Na Figura 2B, o símbolo (*) indica que p<0,05 veículo vs. Ang-(1 -7); o símbolo (***) indica que p<0,0001 veículo vs. Arg°-Ang-(1-7); e o símbob (###) indica que p<0,0001 Arg0-Ang-(1-7) vs. Ang- (1-7). A Figura 2C mostra o efeito vasodilatador concentração-dependente do peptídeo Arg°-Ang-(1-7) J da Ang-(1-7) em anéis de artéria mesentérica de ratos SHR. Cada ponto apresenta a média ± erro-padrão da média. O símbolo (***) indica que p<0,0001 Ang-(1-7) vs. Arg°-Ang-(1-7).

A Figura 3 mostra o bloqueio do efeito vasodilatador da Arg°-Ang-(1 -7) após a inibição da produção de óxido nítrico pelo tratamento com L-NAME em anéis de aorta de ratos SHR. Cada ponto representa a média ± erro-padrão da média. Legenda: o símbolo (***) indica que p < 0,0001 L-NAME 10’7M + Arg°- Ang-(1-7) vs. Arg°-Ang-(1-7).

As Figuras 4A e 4B mostram o efeito do A-779 e do D-Pro, respectivamente, em anéis de aorta torácica de ratos SHR imediatamente antes de se adicionar o peptídeo Arg°-Ang-(1-7) em concentrações cumulativas crescentes. Na Figura 4A o símbolo (***) inidica que p<0,0001 A779 10'6M + Arg°-Ang-(1-7) vs. Arg°-Ang-(1-7); o símbolo (###) indica que p<0,0001 veículo vs Arg0-Ang-(1-7); e Ns = não há significância. Na Figura 4B, o símbolo (***) indica que p<0,0001 D-F^ro 10'6M + Arg0-Ang-(1-7) vs. Arg0-Ang-(1-7); o símbolo (###) indica que |D<0,0001 veículo vs Arg0-Ang-(1-7); e Ns = não há significância. A Figura 4C mostra o efeito do A-779 em anéis de artéria mesentérica de ratos SHR. Cada ponto apresenta a média ± erro-padrão da média. O símbolo (***) indica que p<0,0001 A779 10'6M + Arg0-Ang-(1-7) vs. Arg°-Ang-(1-7). A Figura 4^ mostra o bloqueio do efeito vasodilatador da Arg°- Ang-(1-7) em anéis de aorla de camundongos nocaute para o receptor Mas de Angiotensina-(1-7) (KO-Mas). Cada ponto representa a média ± erro-padrão da média.O símbolo (*) considera p < 0,05 em relação ao animal controle wild type (WT).

A Figura 5 mostra o efeito vasodilatador concentração-dependente induzido pela Arg°-Ang-(1 -7) em anéis de aorta de camundongos nocaute para o receptor AT2 (K0-AT2) Cada ponto representa a média ± erro-padrão da média. A sigla ns indica não há significância entre os animais K0-AT2 e WT.

A Figura 6 mostra o bloqueio do efeito vasodilatador da Arg°-Ang-(1-7) após a inibição de prostaç landinas pelo tratamento indometacina em anéis de 5 aorta de ratos SHR. Cada ponto representa a média ± erro-padrão da média. Legenda: o símbolo (***) indica que p < 0,0001 Indometacina 10'5M + Arg°-Ang- (1 -7) vs. Arg°-Ang-(1 -7).

As Figuras 7A-1 a 7B-4 mostram a redução tempo e dose-dependente da pressão arterial média (PAM) após a administração aguda in bolus dos io peptídeos Arg°-Ang-(1-7) Lu Ang-(1-7) nas doses de 0,1 (Figura 7A-1); 0,5 (Figura 7A-2); 2,5 (Figura 7A-3) e 12,5 (Figura 7A-4) nmol/kg em ratos SHR acordados. Dados estatísticos: Na Figura 7A-2, o símbolo (*) indica que p < 0,05 Arg°-Ang-(1-7) vs. salina. Na Figura 7A-3, o símbolo (*) indica que p < 0,05 Arg°-Ang-(1-7) e Ang-(1-7) vs. salina. Na Figura 7A-4, o símbolo (*) indica 15 que p < 0,05 Arg°-Ang-(1-7) e Ang-(1-7) vs. salina. Já as Figuras 7B-1, 7B-2, 7B-3 e 7B-4, mostram que não há alteração na frequência cardíaca após a administração, sob as mesmas condições, dos peptídeos Arg°-Ang-(1 -7) e Ang- (1-7). Cada ponto apresenta a média ± erro-padrão da média.

As Figuras 7C-1 e 7C-2 mostram que não houve redução da pressão 20 arterial média e da frequência cardíaca após administração in bolus dos peptídeos Arg0-Ang-(1-7) ou Ang-(1-7), na dose de 0,5 nmol/kg, em ratos Wistar acordados. Cada ponto apresenta a média ± erro-padrão da média.

As Figuras 8A-1 e 8B-1 mostra a redução tempo-dependente da PAM após a administração por via oral de uma única dose (10ug/kg) de Arg°-Ang-(1- 25 7) ou Ang-(1-7) incluída em ciclodextrina em ratos SHR acordados. Dados estatísticos: na Figuras 8A-1 o símbolo (*) indica p < 0,05 Arg°-Ang-(1 -7) vs. HPβCD, (**) p < 0,001 Arg°-Ang-(1-7) vs. HPβCD e (***) p < 0,0001 Arg°-Ang- (1-7) vs. HPβCD. Já a Figuras 8B-1 mostra que não há alteração na frequência cardíaca após a administração, sob as mesmas condições, dos 30 peptídeos Arg°-Ang-(1 -7) ou Ang-(1-7). Cada ponto apresenta a média ± erro- padrão da média. As Figuras 8A-2 e 8B-2 mostram que não houve redução da PAM e da frequência cardíaca após a administração por via oral de uma única dose (10ug/kg) da Arg°-Ang-(1-7) ou Ang-(1-7) incluída em ciclodextrina em ratos Wistar acordados. Cada ponto apresenta a média ± erro-padrão da média

A Figura 9A mostra os resultados obtidos para a ativação (fosforilação) da proteína AKT na presejnça do peptídeo Arg°-Ang-(1-7), Ang-(1-7) e insulina (controle positivo) em cultura celular de cardiomiócitos. Dados estatísticos: *p<0,05 controle vs. Ang-(1-7); **p<0,01 controle vs. Insulina; ***p<0,0001 controle vs. Arg0-Ang-(1-7); #p<0,05 Ang-(1-7) vs. Arg0-Ang-(1-7) ; $ p<0,05 insulina vs. Arg0-Ang-(1-7); $$p<0,01 insulina vs. Ang-(1-7). Já a Figura 9B mostra os resultados obtidos para o efeito do peptídeo Arg°-Ang-(1-7) na ativação da proteína AKT em cultura celular primária de pré-adipócitos extraídas do tecido adiposo epididimal de ratos machos adultos Wistar. Os dados representam a média + erro padrão da média, analisados por teste t de Student (*p<0,05 e **p<0,01 versus controle), n=6.

A Figura 10 mostra os resultados obtidos para a avaliação do ganho de peso corporal e adiposidade visceral em modelo de síndrome metabólica tratado com Arg°-Angiotensina-(1-7). Ratos machos Sprague-Dawley alimentados (Frutose), oi não (Controle), com 10% de frutose na água e tratados (Arg°), ou não (Veículo), com Arg°-Ang-(1-7) incluído em ciclodextrina foram submetidos a avaliação do ganho de peso corporal (A) e aumento de massa do tecido adipoJo epididimal (B) e mesentérico (C). Os dados representam a média + erro padrão da média, analisados por ANOVA two-way (*p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 versus controles (A) e versus demais grupos (B e C); #p<0,05 versus tratamento), n=6.

A Figura 11 mostra os resultados obtidos para a avaliação dos níveis séricos e hepáticos de triacilglicerol e colesterol em modelo de síndrome metabólica tratado com Arg°-Angiotensina-(1-7). Ratos machos Sprague- Dawley alimentados com 10% de frutose na água (Frutose) ou não (Controle), e tratados com Arg°-Ang-(1-7) incluído em ciclodextrina (Arg°), ou não (Veículo), foram submetidJs à avaliação dos níveis de triacilglicerol sérico (A) e hepático (B) e de colesterol sérico (C) e hepático (D) após 6 horas de jejum. Os dados representam a média + erro padrão da média, analisados por ANOVA de Student (C e D) (*p<0,05 versus demais grupos),

A Figura 12 mostra os resultados obtidos para a avaliação da tolerância à glicose e resistência à insulina em modelo de síndrome metabólica tratado com Arg°-Angiotensina-(ll-7). Ratos machos Sprague-Dawley alimentados (Frutose), ou não (Controle), com 10% de frutose na água e tratados (Arg°), ou não (Veículo), com Arg°-Àig-(1-7) incluído em ciclodextrina foram submetidos ao teste de tolerância à glicose oral após 12 horas de jejum. A glicemia foi avaliada nos tempos 0 (basal), 15, 30, 45, 60, 90 e 120 minutos após administração oral de glicose (2g/Kg de peso corporal), a liberação de insulina foi avaliada nos tempos 0 (basal), 15 e 120 minutos de protocolo experimental, e o índice de HOMA-IR foi avaliado através da glicemia e insulinemia de jejum (6-8 horas). Os dados dk glicemia pelo tempo (A), área sob a curva (B), liberação de insulina (C) e HOMA-IR (D) representam a média + erro padrão da média, analisados por ANOVA two-way (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 e ****p<0,0001 versus tratamento ou versus demais grupos (C); #p<0,05, ##p<0,01 e ###p<0,001 versus controles ou versus Controle Arg° (A); &p<0,05 versus Controle Veículo (A)), n=6.

A Figura 13 mostra e Ang-(1-7) em células de adenocarcinoma alveolar humano (A-549).

A Figura 14 mostra peptideos Arg°-Ang-(1 -7) Wistar. O símbolo (**) considera p < 0,001 Arg°-Ang-(1-7) em relação ao controle. Cada ponto apresenta a média ± erro-padrão da média.

DESCRIÇÃO DETALHDA DA INVENÇÃO

A presente invenção consiste no peptídeo (Arg°)n-Ang-(1-7), onde n é 1 a 10 (SEQ ID N°1, onde Xaa representa uma variação de 1 a 10 aminoácidos L-Arg),o qual é produzido pela inserção de pelo menos um aminoácido arginina na posição aminoterminal prevenção de doenças vasculopatias, distúrbios músculo-esqueléticos, renais, cutâneos, alopecia ou tumores. O peptídeo (Arg°)n-Ang-(1-7) é capaz de ativar a proteína kinase B (AKT), que é fundamental para as açodes metabólicas da insulina, bem como aumentar a produção de óxido nítrico (NO) via AKT-dependente. Consequentemente, o peptídeo causa, por exemplo, dilatação de vasos aórticos e mesentéricos, redução da pressão arterial média e efeito anti-proliferativo.

A invenção também abrange formulações farmacêuticas compreendendo este peptlídeo. O peptídeo pode ser preparado na forma sólida (incluindo granula, pó ou supositório) ou na forma líquida (por exemplo, soluções, suspensões e emulsões) e pode ser submetido a operações como esterilização e pode conter excipientes farmacêutica e farmacologicamente aceitáveis, como estabilizantes, agentes umectantes, emulsificantes, conservantes, co-solventes, agentes de suspensão, agentes espessantes, componentes para ajuste de osmolaridade e força iônica e outros excipientes além de sistemas tampões. Outros excipientes apropriados são lactose, sacarose, pó de amido, ésteres de celulose de ácidos alcanóicos, ácido esteárico, talco, estearato de magnésio, óxido de magnésio, sais de sódio ou de cálcio de ácidos fosfórico ou sulfúrico, acácia, gelatina, alginato de sódio, polivinilpirrolidona e/ou fjolivinil álcool, e preparado como comprimido ou encapsulado para adminisjtração convencional.

Substâncias conservantes solúveis em água que podem ser utilizadas no veículo incluem o bisulfite de sódio, o tiosulfato de sódio, o ascorbato, o cloreto de banzalcônio, clorobutanol, timerosal, borato de fenilmercúrio, parabenos, álcool benzílico, feniletanol ou antioxidantes como a vitamina E, tocoferol, quelantes como EDTA e EGTA.

De forma alternativa, o peptídeo desta invenção pode ser dissolvido em salina, água, polietilenJglicol, polipropilenoglicol, soluções coloidais de carboximetil celulose, hidroxietil celulose, carbopol, etanol, oleato de etila, triglicerídeos, óleo vegetal, goma tragacanto e/ou diversos tampões. O carreador ou diluente pode incluir materiais para liberação retardada, como o gliceril monoestearato, o gliceril diestearato só ou com wax, ou outros materiais conhecidos no estado da arte.

O peptídeo pode ser administrado pelas vias oral, local, transdérmica, tópica, intranasal, ocular, parenteral, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal, intratendinosa, intraespinal, intracraniana e intratorácica.

As formas convencionais para administração tópica incluem curativo de ferimento, bandagens, filmes poliméricos, pastas, pomadas, loções, cremes, géis, sprays, adesivos transdérmicos e aerossol. A passagem transdérmica do peptídeo pode ser aumen ada através do uso de promotores de permeação ou de nanossistemas carreadores como lipossomas, niossomas e vesículas lipídicas ultradeformáveiJ e ciclodextrinas. Os promotores de permeação cutânea classicamente usados no estado da técnica incluem, de forma não limitante, terpenos, terpenóides, óleos essenciais, pirrolidonas e derivados, ácidos graxos e seus ésteres, sulfóxidos e compostos similares, álcoois, glicóis, glicerídeos, dodecil-N,N-dimetilamino acetato

As formas farmacêuticas sólidas para administração oral incluem cápsulas, comprimidos, gélulas, pós e grânulos. Nessas formulações, o peptídeo é misturado com pelo menos um diluente como sacarose, lactose ou amido. Tal formulação pode conter ainda substâncias adicionais, por exemplo, agente lubrificantes como o estearato de magnésio, desintegrantes, aglutinantes ou tensoativos, quitosana, ciclodextrina ou seus derivados como promotor de absorção. No caso de cápsulas, comprimidos ou gélulas, a formulação pode conter ainda sistemas tampões. Os comprimidos e cápsulas podem ser preparados ainda com revestimento entérico.

As formas líquidas para administração oral podem incluir emulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires. Essas composições podem incluir também excipientes comb agentes umectantes, emulsificantes, adocicantes, edulcorantes e perfumes.

O peptídeo pode ser associado ainda a sistemas carreadores e/ou sistemas de liberação controlado de fármaco, visando um aumento de estabilidade do peptídeJ, uma maior biodisponibilidade, uma ação mais prolongada e/ou um direcionamento para o tecido alvo. Esses sistemas carreadores ou de liberação controlada classicamente usados no estado da técnica incluem, de forma não limitante, ciclodextrinas, polímeros, polímeros mucoadesivos, vesículas lipídicas, lipossomas, polimersomas, nanopartículas lipídicas sólidas, micro- e nanopartículas poliméricas, micro- e nanocapsulas, micro- e nanoemulsões, dendrímeros, micelas, micelas poliméricas, nanopartículas inorgânipas, nanopartículas de carbono, adesivos transdérmicos, matrices poliméricas implantáveis e dispositivos que possam ser implantados.

Além disso, o peptídeo objeto da invenção pode ser usado em combinação com, ou no luígar de outros fármacos.

A presente invenção pode ser melhor compreendida, de modo não limitante, a partir dos exemplos a seguir.

Exemplo 1 - Efeito da Arg°-Ang-(1-7) na produção de óxido nítrico

Células de ovário de hamster chinês (CHO) foram transfectadas estavelmente com o cDIj^A do receptor Mas de rato direcionado por um promotor de citomegalovíjrus e selecionados por neomicina. A produção de óxido nítrico foi monitorada utilizando o indicador de NO 4-amino-5-metilamino- 2',7'-difluorofluorescente diacetato.

Células confluentes- CHO tranfectadas com o receptor Mas e cultivadas em placas de 6 poços foram pré-incubadas em 1,5 ml_ de meio isento de soro (DMEM) contendo DAF-FM (menos 5 uM) e suplementado com 0,2% de BSA, bacitracina 0,005%, 0,1 mol.L’1 de fluoreto de fenilmetilsulfonil e 0,5 mol.L’1 i 1,10-fenantrolina a 37°C, ‘numa incubadora humidificada, sob uma atmosfera com 5% de CO2. Após 30i minutos, as células foram lavadas e incubadas com Arg°-Ang-(1-7) ou Ang-*(1-7) a 10’7 mol.L'1 , durante 60 minutos. Subsequentemente, as células foram lavadas duas vezes e as lâminas foram montadas para avaliação por microscopia confocal.

Medidas relativas dé fluorescência foram realizadas em um microscópio laserscanning confocal Zeiss LSM 510 META excitado a 488 nm com um argônio-ion laser (lente objetiva de imersão em óleo, 63X).

Os resultados são apresentados como média ± E.P.M. Análise One-way das variâncias com pós-teste de Bonferroni de comparação múltipla foi utilizado para comparar a curva concentração-resposta em células CHO transfectadas com o receptor Mas. Todas as análises estatísticas foram consideradas significativas quando p <0joõ. Arg°-Ang-(1-7) e Ang-(1-7) estimularam a produção de óxido nítrico em células de ovário de hamster chinês transfectadas com o receptor Mas. Notavelmente, Arg°-Ang-(| -7) estimulou mais acentuadamente a produção de óxido nítrico em célula^ CHO transfectadas com o receptor Mas na concentração de 10'7 mol.L1 quando comparado com Ang-(1-7) (Figura 1).

Exemplo 2 - Efeito vasorelaxante da Arg -Ang-(1-7) em vasos aórticos e mesentéricos

Anéis de 3-4 mm da aorta torácica descendente, isento de tecido adiposo e conectivo, foram mantidos em solução gaseificada (95% O2 e 5% CO2) de Krebs-Hanseleit, à 37°C, sob uma tensão 1,0 g, por 1 h, para estabilização. A presençk de endotélio funcional foi avaliada através da habilidade da acetilcolina [ACh] (10 μmol.L1) em induzir mais de 70% de relaxamento em vasos prd-contraídos com fenilefrina (0,1 μmol.L1). A atividade mecânica, registrada isómetricamente por um transdutor de força, foi alimentada para um gravador-amplificador e para um computador equipado com uma placa conversora analógica-digital, usando CVMS de aquisição de dados / software de gravação.

Os vasos de ratos Wistar normotensos e ratos espontaneamente hipertensos (SHR) forarn pré-contraídos em mesmo nível de tensão (aproximadamente 1,0 g de tensão) com concentração submáxima de fenilefrina (0,1 μmol.L1). jArg°-Ang-(1-7) e Ang-(1-7) foram adicionados em concentrações cumulativas crescentes uma vez que a resposta à fenilefrina foi estabilizada. Os resultados são apresentados como média + E.P.M. Análise one-way das variâncias I (ANOVA) com pós-teste de Newman Keuls de comparação múltipla foi uéada para comparar as curvas concentração-resposta obtidas em anéis aórticos. O efeito vasodilatador da Arg°-Ang-(1-7) e Ang-(1-7) foi expresso como porcentagem da diminuição na concentração máxima induzida pela fenilefrina. Todas as análises estatísticas foram consideradas significativas quando p<0,05. Arg°-Ang-(1-7) e Xng-(1-7) produziram vasorelaxamento em anéis aórticos de ratos Wistar nórmotensos e SHR, sendo que o Emax da Arg°-Ang-(1 - 7) (Emax=18.97±1.33% em anéis de ratos Wistar e 38.0±3.3% em anéis de ratos SHR) foi maior que o da Ang-(1-7) (Emax=12.46±0.98% em anéis de ratos Wistar e 30±3% em anéis be ratos SHR).

Os resultados obtidos, apresentados nas figuras 2A e 2B, mostram que o efeito vasorelaxante oroduzido pela Arg°-Ang-(1-7) é dependente de endotélio, similar ao efeito vasorelaxante produzido pela Ang-(1-7). i

Anéis de 2,0 mm da artéria mesentérica (2° e/ou 3o ramos) de ratos espontaneamente hipertensos (SHR), isento de tecido adiposo e conectivo, foram mantidos em solução gaseificada (95% O2 e 5% CO2) de Krebs- Hanseleit à 37°C. Após um período de estabilização de 15 minutos, a artéria foi estirada, pouco a pouco, a uma tensão de repouso considerada ótima em relação ao seu diâmetro interno. Para isso, em cada segmento arterial, a relação tensão/diâmetro! foi calculada pela circunferência interna que corresponde à pressão transmural de 100 mmHg para um vaso relaxado in situ (IC100), utilizando o softvi/are específico para normalização de artérias de resistência. Para a realização dos experimentos, as artérias foram mantidas com uma circunferência iJterna ICi, calculada por meio da fórmula ICi=0,90 x IC100, na qual o desenvólvimento de força é máximo, como previamente i descrito por Mulvany e i Halpern (1977). O diâmetro luminar efetivo foi determinado de acordo com a equação h = ICi/π. O diâmetro dos vasos i utilizados variou de 200 a 300μm. í-

As artérias foram estimuladas com alta concentração de cloreto de potássio (KCI 120 mmol/lp, com a finalidade de se avaliar sua integridade funcional. A administração'de KCI foi realizada duas vezes, com intervalo de 15 minutos, para reprodução da resposta contrátil. As preparações que atingiram uma contração igual ou superior a 6 mN/mm foram consideradas viáveis. As preparações que apresentaram contração menor que 6 mN/mm foram descartadas. j

A presença de endotélio funcional foi avaliada através da habilidade da acetilcolina [ACh] (0,1 μmol.L'1) em induzir mais de 60% de relaxamento em vasos pré-contraídos corri fenilefrina (0,1 μmol.L’1). A atividade mecânica foi registrada isometricamentè através do miógrafo, e este estava conectado a um sistema para aquisição de dados e um computador.

Os vasos de ratos SHR foram pré-contraídos com concentração submáxima de fenilefrina (0,1 μmol.L’1) e os peptídeos Arg°-Ang-(1-7) e Ang- (1-7) foram adicionados èm concentrações cumulativas crescentes, uma vez que a resposta à fenilefrii|ia foi estabilizada. Os resultados são apresentados como média + E.P.M. Anã ise two-away das variâncias (ANOVA) com pós-teste de Bonferroni de comparação múltipla foi usada para comparar as curvas concentração-resposta obtidas em anéis mesentéricos. O efeito vasodilatador da Arg°-Ang-(1-7) e Ang-(1-7) foi expresso como porcentagem da diminuição na concentração máxima induzida pela fenilefrina. Todas as análises estatísticas foram consideriadas significativas quando p<0,05. Arg°-Ang-(1-7) e ^\ng-(1-7) produziram vasorelaxamento em anéis mesentéricos de ratos SHR, sendo que o Emax da Arg°-Ang-(1-7) (Emax= 51,7 em anéis de ratos SHR) foi maior que o da Ang-(1-7) (Emax=28,0 em anéis de ratos SHR) (Figura 2C).

Exemplo 3 - Participação do óxido nítrico no efeito vasodilatador da Arg°- Ang-(1-7) em anéis de ao;rta de ratos SHR

Para avaliar se a vià da óxido nítrico sintase (NOS) tem participação no I efeito vasodilatador induzido pela Arg°-Ang-(1-7), vasos contendo endotélio funcional foram pré-incubádos com NG-Nitro-L-Arginina Metil Ester (L-Name), i um inibidor da NOS, aW.M por 20 minutos. Em seguida, os vasos foram pré- contraídos com FE a 10f M e, após a estabilização da contração, curvas concentração-resposta cuihnulativas (10’12 a 10’6 M) foram construídas com a Arg°-Ang-(1-7). Como controle positivo, outro segmento vascular foi simultaneamente monitorado apenas na presença da Arg°-Ang-(1 -7).

Os resultados são apresentados como média ± erro-padrão da média.

Analise two-way das variancias (ANOVA) com pos-teste de Bonferroni de comparação múltipla foi usjada para comparar as curvas concentração-resposta obtidas em anéis aórticos. O efeito vasodilatador da Arg°-Ang-(1-7) foi i expresso como porcentagem da diminuição na concentração máxima induzida pela fenilefrina. Todas as análises estatísticas foram consideradas significativas quando p<0,05.

O resultado obtido, apresentado na Figura 3, mostra que o efeito vasorelaxante produzido pela Arg°-Ang-(1-7) foi totalmente bloqueado na presença de L-NAME a 1Q'7 M, sendo assim dependente da produção de óxido I nítrico. ;

Exemplo 4 - Atuação do receptor Mas no efeito vasorelaxante da Arg°- Ang-(1-7) em vasos aórticos e mesentéricos

Anéis de 3-4 rpm da aorta torácica descendente de ratos espontaneamente hipertensos (SHR), isento de tecido adiposo e conectivo, foram mantidos em solução gaseificada (95% O2 e 5% CO2) de Krebs- Hanseleit, à 37°C, sob uma tensão 1,0 g, por 1 h, para estabilização. A presença de endotélio funcional foi avaliada através da habilidade da acetilcolina [ACh] (10 μmpl.L1) em induzir mais de 70% de relaxamento em vasos pré-contraídos com fenilefrina (0,1 μmol.L’1). A atividade mecânica, registrada isometricamente por um transdutor de força, foi alimentada para um gravador-amplificador e para um computador equipado com uma placa conversora analógica-digitàl, usando CVMS de aquisição de dados / software de gravação.

Os vasos de ratos SHR foram pré-contraídos em mesmo nível de tensão (aproximadamente 1,0 g de tensão) com concentração submáxima de fenilefrina (0,1 μmol.L1). Ós antagonistas do receptor Mas, A-779 e 0 D-Pro, foram adicionados a 10’6 jμmol.L1 imediatamente antes de adicionar a Arg°- Ang-(1-7) em concentrações cumulativas crescentes. Os resultados são apresentados como média? + E.P.M. Análise one-way das variâncias (ANOVA) com pós-teste de Newman-Keuls de comparação múltipla foi usada para comparar as curvas conóentração-resposta obtidas em anéis aórticos. O i resultado foi expresso como porcentagem da diminuição na concentração máxima induzida pela fenilefrina. Todas as análises estatísticas foram consideradas significativas quando p<0,05.

O vasorelaxamento produzido pela Arg°-Ang-(1-7) foi bloqueado em anéis aórticos de ratos S>HR em presença do A-779 e D-Pro (Emax do A- 779=14.0±1.2% ; Emax do D-Pro=11+1.5%) (Figuras 4A e 4B). Esses resultados mostram que o peptídeo Arg°-Ang-(1 -7) age via receptor Mas, já que os antagonistas específicos do receptor Mas, A-779 e D-Pro, bloquearam o efeito vasorelaxante do peptídeo.

Anéis de 2,0 mm da artéria mesentérica (2o e/ou 3o ramos) de ratos espontaneamente hipertensos (SHR), isento de tecido adiposo e conectivo, foram mantidos em solução gaseificada (95% O2 e 5% CO2) de Krebs- i Hanseleit, à 37°C, Após u(m período de estabilização de 15 minutos, a artéria foi estirada, pouco a poudo, a uma tensão de repouso considerada ótima em relação ao seu diâmetro | interno. Para isso, em cada segmento arterial, a relação tensão/ diâmetro foi calculada pela circunferência interna que corresponde à pressão transmural de 100 mmHg para um vaso relaxado in situ (IC-ioo), utilizando o software específico para normalização de artérias de resistência. Para a realização dos experimentos, as artérias foram mantidas com uma circunferência injterna ICi, calculada por meio da fórmula ICi =0,90 x IC100, na qual o desenvólvimento de força é máximo, como previamente i descrito por Mulvany e ; Halpern (1977). O diâmetro luminar efetivo foi determinado de acordo corn a equação h = ICi/π. O diâmetro dos vasos utilizados variou de 200 a 300μm.

As artérias foram èstimuladas com alta concentração de cloreto de potássio (KCI 120 mmol/L), com a finalidade de se avaliar sua integridade funcional. A administração ide KCI foi realizada duas vezes, com intervalo de 15 minutos, para reprodução ida resposta contrátil. As preparações que atingiram uma contração igual ou süperior a 6 mN/mm foram consideradas viáveis. As preparações que apresentaram contração menor que 6 mN/mm foram descartadas.

A presença de endotélio funcional foi avaliada através da habilidade da acetilcolina [ACh] (0,1 μmol.L-1) em induzir mais de 60% de relaxamento em vasos pré-contraídos comi fenilefrina (0,1 μmol.L-1). A atividade mecânica foi registrada isometricamenté através do miógrafo, o qual estava conectado a um sistema para aquisição de dados e a um computador.

Os vasos de ratos SHR foram pré-contraídos com concentração submáxima de fenilefrina (0,1 μmol.L1). O antagonista do receptor Mas, A-779, foram adicionados a 10'61 μmol.L1 imediatamente antes de adicionar a Arg°- Ang-(1-7) em concentrações cumulativas crescentes. Os resultados são apresentados como médiá + E.P.M. Análise two-way das variâncias (ANOVA) com pós-teste de Bonferroni de comparação múltipla foi usada para comparar as curvas concentração-resposta obtidas em anéis mesentéricos. O resultado i foi expresso como porcentagem da diminuição na concentração máxima induzida pela fenilefrina. Todas as análises estatísticas foram consideradas significativas quando p<0,Ó5.

O vasorelaxamento produzido pela Arg°-Ang-(1-7) foi bloqueado em anéis mesentéricos de ratos SHR em presença do A-779 (Emax do A-779=14,1) (Figura 4C). Esses resultados mostram que o peptídeo Arg°-Ang-(1-7) age via receptor Mas, já que oj antagonista específico do receptor Mas, A-779, bloqueou o efeito vasorelakante do peptídeo.

a) Efeito da Arg°-Ang-0-7) em anéis de aorta de camundongos com deleção genética do receptor Mas (KO-Mas)

Para confirmar a participação do receptor Mas no efeito vasodilatador induzido pela Arg°-Ang-(1-7), foram utilizados anéis de aorta de camundongo KO-Mas e seu controle WT. Os vasos com endotélio funcional foram pré- contraídos com FE e, durànte a fase tônica da contração, foi construída uma curva concentração-resposta cumulativa (10’12 a 10'6 M) com a Arg°-Ang-(1 -7).

Os resultados são apresentados como média ± erro-padrão da média. Análise two-way das variâncias (ANOVA) com pós-teste de Bonferroni de comparação múltipla foi usada para comparar as curvas concentração-resposta obtidas em anéis aórticos. O efeito vasodilatador da Arg°-Ang-(1-7) foi expresso como porcentagem da diminuição na concentração máxima induzida pela fenilefrina. Todas as ánálises estatísticas foram consideradas significativas quando p<0,05. Como póde-se observar na Figura 4D, não foi observado efeito vasodilatador do peptídeo Arg°-Ang-(1-7) em anéis de aorta de camundongos KO-Mas. Esse resultado confirma os dados obtidos com o bloqueio farmacológico do' receptor Mas com os antagonistas A-779 e D-Pro.

Assim, conclui-se que ai Arg°-Ang-(1-7) age via receptor Mas, já que em i camundongos com deleçãp do receptor Mas o efeito vasorelaxante do peptídeo foi totalmente bloqueado. '

Exemplo 5 - Efeito da Arg°-Ang-(1-7) em anéis de aorta de camundongos com deleção genética dQ receptor AT2 (KO-AT2)

Anéis de aorta de çamundongo KO-AT2, contendo endotélio funcional, foram pré-contraídos comi FE a 10"6M e, após a estabilização da contração, uma curva concentração-resposta cumulativa (W12 a 106 M) foi construída com a Arg°-Ang-(1 -7). ;

Os resultados são apresentados como média ± erro-padrão da média. Análise two-way das variâncias (ANOVA) com pós-teste de Bonferroni de comparação múltipla foi usada para comparar as curvas concentração-resposta obtidas em anéis aórticps. O efeito vasodilatador da Arg°-Ang-(1-7) foi expresso como porcentagèm da diminuição na concentração máxima induzida pela fenilefrina. Todas as análises estatísticas foram consideradas significativas quando p<0,05.

Como se pode observar na Figura 5, o efeito vasorelaxante induzido pela Arg°-Ang-(1-7) não fòi inibido na ausência do receptor AT2. O resultado obtido mostra que o peptídeo Arg°-Ang-(1 -7) não age via receptor AT2.

Exemplo 6 - Participação das prostaglandinas no efeito vasodilatador da Arg°-Ang-(1-7) em anéis de aorta de ratos SHR

Para avaliar se a via das ciclooxigenases tem participação no efeito vasodilatador induzido pela Arg°-Ang-(1-7), vasos contendo endotélio funcional foram pré-incubados com indometacina a 10’5 M por 20 minutos. Em seguida, os vasos foram pré-contraídos com FE a 10’7 M e, após a estabilização da contração, curvas concentração-resposta cumulativas (W12 a 10'6 M) foram construídas com a Arg°-Ang-(1-7). Como controle positivo, outro segmento vascular foi simultaneamente monitorado apenas na presença da Arg°-Ang-(1- 7)- ;

Os resultados são apresentados como média ± erro-padrão da média. Análise two-way das variâncias (ANOVA) com pós-teste de Bonferroni de comparação múltipla foi usada para comparar as curvas concentração-resposta obtidas em anéis aórticos. O efeito vasodilatador da Arg°-Ang-(1-7) foi expresso como porcentagem da diminuição na concentração máxima induzida pela fenilefrina. Todas as análises estatísticas foram consideradas significativas quando p<0,05. ,

O resultado obtido, ãpresentado na Figura 6, mostra que após a inibição da produção de prostaglándinas, o efeito vasodilatador da Arg°-Ang-(1-7) foi parcialmente bloqueado ém anéis de aorta de ratos SHR com endotélio funcional e pré-contraídos com FE. Esse resultado sugere que a vasodilatação induzida pela Arg°-Ang-(1-7) é parcialmente dependente da produção de prostaglandinas.

Exemplo 7 - Efeito anti-hipertensivo da Arg°-Ang-(1-7) a) Após administração aguda in bolus

Ratos Wistar e SHR foram anestesiados com tribromoetanol a 2,5%, via intraperitonial (1 mL/100g). Para a canulação da artéria femoral, foram utilizadas cânulas confeccionadas a partir da conexão de 15 cm de polietileno PE50 à 4 cm de polietileno PE10, preenchida com solução fisiológica (NaCI 0,9%) e heparina (100 U.l/ 0,1mL). Após o posicionamento do animal em decúbito dorsal sobre a ímesa cirúrgica, foi realizada tricotomia da região inguinal direita do animal. Uma pequena incisão na pele foi realizada, o feixe vásculo-nervoso femoral foi localizado e a artéria femoral isolada. A cânula foi introduzida na aorta abdominal através da artéria femoral, sendo utilizada para obtenção do registro dos parâmetros cardiovasculares. Uma segunda cânula, confeccionada a partir da conexão de 15 cm de polietileno PE50 à 2 cm de polietileno PE10, preenchida com solução fisiológica (NaCI 0,9%), foi introduzida na veia femoral para a administração dos peptídeos. Após a canulação, os cateteres foram fixados e exteriorizados subcutaneamente, em direção ao dorso do animal, na região cervical. As incisões foram suturadas e os animais colocados em caixas individuais, com livre acesso à água e ração.

Os valores da pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC) foram calculados a partir de pulsos de PA e registrados pelo sistema de aquisição de dados (Biopaç System, modelo MP150). A pressão arterial pulsátil (PAP) foi registrada por um sinal enviado a um transdutor conectado à cânula inserida na aorta abdominal pela artéria femoral. As oscilações de pressão captadas foram amplificadas e convertidas através de placa de conversão analógico/digital em sinais que alimentam a placa de aquisição de dados. Através do software dei leitura da placa, Acqknowledge v.3.5.7 (Biopac System), a PAP foi registrada continuamente com uma frequência de amostragem de 2000-4000 Hz. Vinte e quatro horas após a implantação das cânulas foi realizado o primeiro protocolo que consistiu da administração aguda intravenosa dos peptideos. Para isso, durante a realização do experimento, a cânula arterial foi conectada ao transdutor de pressão para o início do registro. Após o período de 90 minutos de estabilização dos parâmetros cardiovasculares (período basal), foi feita a administração aguda in bolus do peptídeo Arg°-Ang-(1-7), Ang-(1-7) ou salina em um volume final de 300 μL. Uma curva dose-resposta (0,1; 0,5; 2,5 e 12,5 nmol/Kg) foi construída com o objetivo de se obter a dose mais efetiva da Arg°-Ang-(1 -7). A Ang-(1 -7) também foi utilizada para comparar o efeito induzido por ambos os peptideos. As doses de 0,1; 0,5; 2,5 e 12,5 nmol/Kg foram administradas em ratos SHR (n=5-7 para cada dose) conscientes. Apenas a dose mais efetiva obtida com a Arg°-Ang-(1-7) foi administrada em ratos Wistar (n= 7-8) conscientes, como controle do SHR.

Após a injeção do peptídeo ou salina, os parâmetros cardiovasculares foram monitorados continuamente por um período de 5 horas. Os valores da PAM e FC foram obtidos a cada 10 minutos durante todo o período experimental.

Os resultados são apresentados como média ± erro-padrão da média. Análise two-way das variâncias (ANOVA) com pós-teste de Bonferroni de comparação múltipla foram usadas para comparar a curva tempo-resposta obtidas durante a administração in bolus da Arg°-Ang-(1-7) e Ang-(1-7). Todas as análises estatísticas foram consideradas significantes p<0,05.

As variações da PAM e FC, após a administração aguda intravenosa de diferentes doses da Arg°-Ang-(1-7) e Ang-(1-7) em ratos SHR acordados, estão apresentadas nas Figuras 7A.1 a 7B.4. Como podemos observar, a administração intravenosa da Arg°-Ang-(1-7) ou Ang-(1-7) induziu uma redução significativa da PAM de maneira tempo e dose-dependente quando comparado com o grupo salina. : A Arg°-Ang-(1-7), na dose de 0,5 nmol/kg, apresentou um efeito anti- 5 hipertensivo potente e sustentado, que durou por pelo menos 5 horas, quando comparado com o grupo salina. O efeito anti-hipertensivo da Arg°-Ang-(1-7) começou a ser significativo 170 minutos após a administração do mesmo, reduzindo a PAM em torno de 21 ±3 mmHg. Não foi observada diferença significativa no efeito da Ang-(1-7) sobre a PAM, na dose de 0,5 nmol/kg, io quando comparado com O grupo salina.

Nenhuma mudança adicional na PAM foi observada quando a dose aumentou 5 e 10 vezes; ao contrário, nas doses de 2,5 e 12,5 nmol/kg, a injeção aguda da Arg°-Ang-(1-7) produziu um efeito anti-hipertensivo de menor magnitude, e observado apenas nos últimos 30 minutos do período 15 experimental, quando comparado com o grupo salina. Já a Ang-(1-7), nas doses de 2,5 e 12,5 nmol/kg, produziu um efeito anti-hipertensivo significativo após 110 minutos da administração do mesmo, quando comparado com o grupo salina; porém seu efeito foi mais potente na dose de 2,5 nmol/kg.

A administração aguda intravenosa da Arg°-Ang-(1-7) e Ang-(1-7) na 20 dose de 0,1 nmol/kg, não alterou significativamente a PAM de ratos SHR.

Em relação à FC, não foi observada nenhum alteração após a administração in bolus de Arg°-Ang-(1-7) ou Ang-(1-7) em ratos SHR, com exceção da dose de 12,5nmol/kg de Ang-(1-7), que reduziu significativamente a FC nos últimos 30 minutos do período experimental quando comparado com o 25 grupo controle.

Em ratos Wistar (Figuras 7C-1 e 7C-2) a Arg°-Ang-(1-7), bem como a Ang-(1-7), na dose de 0,5 nmol/kg, não induziram mudanças significativas na PAM e FC quando comparado com o grupo controle.

b) Após administração aguda por via oral

Após 90 minutos de estabilização dos parâmetros cardiovasculares, foi administrada, por via oral (gavagem), uma única dose dos peptídeos Arg°-Ang- (1-7) ou Ang-(1-7), em um volume final de 500 μL, em ratos SHR e Wistar. Os peptídeos estavam incluídos em hidroxipropil beta-ciclodextrina (HPβCD) para evitar a degradação dos mesmos pelo trato gastrointestinal.

A dose administradla foi de 10 μg/kg e os parâmetros cardiovasculares foram monitorados continuamente por um período de 5 horas, com os animais acordados. Os valores da PAM e FC foram obtidos a cada 10 minutos durante todo o período experimental.

Os resultados são apresentados como média ± erro-padrão da média Análise two-way das variâncias (ANOVA) com pós-teste de Bonferroni de comparação múltipla foram usadas para comparar a curva tempo-resposta obtidas durante a administração in bolus da Arg°-Ang-(1-7) e da Ang-(1-7). Todas as análises estatísticas foram consideradas significantes p<0,05.

As Figuras 8A-1 a 8B-2 mostram as variações da PAM e FC, após a administração aguda por via oral de 10ug/kg do HPβCD/Arg°-Ang-(1-7) e HPβCD/Ang-(1-7), em ratos SHR e Wistar acordados. Como podemos observar na Figura 8A-1, a administração por via oral da Arg°-Ang-(1-7) em ratos SHR induziu um efeito anti-hípertensivo de maneira tempo-dependente quando comparado com o grupo salina. A redução da PAM foi significativa após 220 minutos da administração da Arg°-Ang-(1-7), permanecendo reduzida até o final do período de experimentação. O peptídeo Ang-(1-7) não induziu alterações na PAM de ratós SHR na dose de 10ug/kg quando comparado com o grupo controle. Em relação à FC (Figura 8B-1), não foi observada alteração significativa após a administração dos peptídeos.

Em ratos Wistar a administração aguda por via oral de 10ug/kg de HPβCD/Arg°-Ang-(1-7), bem como a HPβCD/Ang-(1-7), não induziram mudanças significativas na PAM (Figura 8A-2) e na FC (Figura 8B-2) quando comparado com o grupo controle.

Exemplo 8 - Ativação da proteína AKT pela Arg°-Ang-(1-7) a) Teste em células de cardiomiócitos

Cardiomiócitos de ratos Wistar neonatos foram cultivados em meio de crescimento regular consistindo de meio DEMEM suplementado com 10% de soro de cavalo, 5% de soro fetal bovino, 1% de penicilina/estreptomicina e 0,1% de inibidor de fibroblasto. As células foram mantidas em meio sem soro por três horas antes do início do tratamento. Este foi realizado de maneira aguda, por cinco minutos, na concentração de 10’9 mol.L-1 das seguintes drogas diluídas em meio de cultura: Ang-(1-7), Arg°-Ang-(1-7) e insulina. Células encubadas com somente com meio de cultura foram usadas como o grupo controle.

Proteínas totais foram isoladas das células de cardiomiócitos com tampão de lise contendo coquetel de inibidores de proteases (DIAS-PEIXOTO et al, Hypertension 52:542-548, 2008). Sessenta microgramas de proteínas totais foram separadas por eletroforese, transferidas para uma membrana de nitrocelulose, bloqueadas com 5% de leite desnatado em pó diluído em solução Tris-salina adicionado de 0,1% de Tween e finalmente incubada pernoite com anticorpo policlonal anti-AKT (1:1000), anti-Ser473 phospho-AKT (1:600), anti- gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase (GAPDH - 1:1000). Posteriormente, as membranas foram incubadas com anticorpo secundário marcado com fluorescência (1:10000), seguido por análise e quantificação através do programa da odyssey (li-cor).

Os resultados são apresentados como média + E.PM. Teste t student foi usado para analisar a fosforilação da proteína quinase B (AKT) na presença de Arg°-Ang-(1-7), Ang-(1-7) e insulina, comparando com o grupo controle (*) e comparando a estimulação produzida pelos peptideos Arg°-Ang-(1-7) e Ang-(1- 7) (#). Todas as análises estatísticas foram consideradas significativas quando p<0.05.

Os peptideos Arg°-Ang-(1-7) e Ang-(1-7) desencadearam a ativação da proteína quinase B (AKT), em células de cardiomiócitos, sendo este resultado mais acentuado em presença da Arg°-Ang-(1 -7) (Figura 9A).

b) Teste em cultura celular primária de pré-adipócitos

Foi realizada cultura primária de pré-adipócitos extraídos do tecido adiposo epididimal de ratos machos adultos Wistar. As células foram cultivadas em meio de crescimento regular consistindo de meio DEMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina. Os pré- adipócitos foram mantidos em meio sem soro por seis horas antes do início do tratamento, que foi realizado de maneira aguda, por cinco minutos, na concentração de 10'9 mol.L1 das seguintes drogas diluídas em meio de cultura: Arg°-Ang-(1-7); insulina; Arg°-Ang(1-7) + insulina; e Arg°-Ang(1-7) + A-779. O antagonista do receptor Mas, A-779, foi adicionado na concentração de 10’8 mol.L1 10 minutos antes da estimulação com o peptídeo Arg°-Ang(1-7). Células encubadas somente com meio de cultura foram usadas como o grupo controle.

Proteínas totais foram isoladas das células de pré-adipócitos com tampão de lise contendo coquetel de inibidores de proteases proveniente do Kit de ELISA comercial. A seguir, as proteínas extraídas foram dosadas pelo método de Bradford (Bradford, M. M., Analytical Biochemistry 72: 248-254, 1976) e utilizadas para a quantificação da forma ativa da AKT através do Kit de ELISA comercial conforme especificação do fabricante.

Os resultados são apresentados como média + E.PM. Teste t student foi usado para analisar a fosforilação do resíduo Serina 473 da AKT na presença de Arg°-Ang-(1-7); insulina; Arg°-Ang-(1-7) + insulina; e Arg°-Ang(1-7) + A-779 comparando com o grupo controle (*). Todas as análises estatísticas foram consideradas significativas quando p<0.05.

O peptídeo Arg°-Ang-(1-7) aumentou a ativação da AKT em células de pré-adipócitos, sendo este resultado bloqueado em presença do antagonista do receptor Mas, A-779 (Figura 9B). Portanto, o Arg°-Ang-(1-7) é um peptídeo que ativa a via de sinalização da insulina, aumentando a sensibilidade para as ações deste hormônio.

Exemplo 9 - Efeito do peptídeo Arg°-Ang-(1-7) no tratamento de um modelo de síndrome metabólica

A partir da observação de que o peptídeo Arg°-Ang-(1-7) é capaz de ativar a via de sinalização da insulina, foi avaliado o efeito do tratamento com Arg°-Ang-(1-7) em um modelo de síndrome metabólica.

A síndrome metabólica foi induzida em ratos Sprague-Dawley através da ingestão de 10% de frutose na água por 9 semanas. Nas últimas 4 semanas do protocolo experimental, os animais foram tratados oralmente (10 μg/Kg peso corporal) com Arg°-Ang-(1-7) incluído em β-Hidroxi-propilciclodextrina. Os animais foram divididos em 4 grupos experimentais: Controle Veículo — sem ingestão de frutose e tratados somente com o composto de inclusão; Controle Arg° - sem ingestão de frutose e tratados com Arg°-Ang-(1-7); Frutose Veículo - com ingestão de frutose e tratados somente com o composto de inclusão; e Frutose Arg° - com ingestão de frutose e tratados com Arg°-Ang-(1 -7).

Através deste protocolo experimental, foram avaliados o ganho de peso corporal; a adiposidade visceral; os níveis séricos e hepáticos de triacilglicerol e colesterol; a tolerância à glicose e resistência à insulina.

De modo geral, o tratamento com Arg°-Ang-(1-7) normalizou todas as alterações metabólicas avaliadas em modelo de síndrome metabólica induzida pela ingestão de alta concentração de frutose. Os principais benefícios metabólicos promovidos pelo tratamento com Arg°-Ang-(1 -7) inclui: melhora da sensibilidade à insulina e da tolerância à glicose; diminuição do ganho de peso corporal e de massa adiposa; diminuição dos níveis de triacilglicerol séricos e hepáticos, além da diminuição dos níveis de colesterol sérico e hepático produzido em ambos os grupos tratados.

a) Avaliação do ganho de peso corporal e adiposidade visceral em modelo de síndrome metabólica tratado com Arg°-Angiotensina-(1-7)

O ganho de peso corporal foi avaliado na 8â semana do protocolo experimental. Ao término dos experimentos, o tecido adiposo epididimal e mesentérico foi removido, pesado e corrigido pelo peso corporal total para avaliar a adiposidade visceral.

Os resultados são apresentados como média + E.P.M. Análise Two- away das variâncias (ANOVA) com pós-teste de Bonferroni de comparação múltipla foi utilizado para comparar o ganho de peso corporal e adiposidade visceral entre os grupos. Todas as análises estatísticas foram consideradas significativas quando p<0,05.

O tratamento com Arg°-Ang-(1-7) amenizou o ganho de peso corporal (A) e bloqueou o aumento de massa do tecido adiposo epididimal (B) e mesentérico (C) induzido pela ingestão de frutose (Figura 10). Portanto, o Arg°-Ang-(1-7) diminuiu o ganho de peso corporal e evitou o desenvolvimento de adiposidade visceral no modelo de síndrome metabólica induzido por frutose.

b) Avaliação dos níveis séricos e hepáticos de triacilglicerol e colesterol em modelo de síndrome metabólica tratado com Arg°-Angiotensina-(1-7)

Ao término do protocolo experimental, o soro e o fígado dos animais foram coletados para avaliação bioquímica dos níveis de lipídios, que foram mensurados através de kits comerciais de acordo com as especificações do fabricante.

Os resultados são apresentados como média + E.P.M. Análise Two- away das variâncias (ANOVA) com pós-teste de Bonferroni de comparação múltipla, ou teste t de student, foi utilizado para comparar os níveis séricos e hepáticos de triacilglicerol e colesterol entre os grupos. Todas as análises estatísticas foram consideradas significativas quando p<0,05.

O tratamento com Arg°-Ang-(1-7) bloqueou o aumento dos níveis de triacilglicerol promovido pela ingestão de frutose tanto no soro (A) quanto no tecido hepático (B) dos animais (Figura 11). Além disso, o tratamento com Arg°-Ang-(1-7) reduziu os níveis de colesterol séricos (C) e hepáticos (D) em ambos os grupos tratados (Figura 11). Portanto, o Arg°-Ang-(1 -7) melhorou o perfil lipídico tanto no modelo de síndrome metabólica quanto em animais normais.

c) Avaliação da tolerância à glicose e resistência à insulina em modelo de síndrome metabólica tratado com Arg°-Angiotensina-(1-7).

O teste de tolerância à glicose foi realizado através avaliação da glicemia basal e nos tempos 15, 30, 45, 60, 90 e 120 minutos após a administração oral de glicose (2 g/Kg de peso corporal). Foi avaliado também a liberação de insulina basal e nos tempos 15 e 120 minutos de protocolo experimental. Os valores de glicemia e insulinemia de jejum (6-8 horas) foram utilizados para estimar o grau de resistência à insulina através do cálculo do Modelo de Avaliação Homeostática de Resistência à Insulina (HOMA-IR; Matthews et al, Diabetologia 28: 412 - 419, 1985).

Os resultados são apresentados como média + E.P.M. Análise Two- away das variâncias (ANOVA) com pós-teste de Bonferroni de comparação múltipla foi utilizado para comparar o restabelecimento da glicemia, liberação de insulina e grau de resistência à insulina entre os grupos. Todas as análises estatísticas foram consideradas significativas quando p<0,05.

O tratamento com Arg°-Ang-(1-7) normalizou o restabelecimento da normoglicemia (A e B), bem como a liberação de insulina (C) compensatória à administração de glicose oral, alterados pela ingestão de frutose (Figura 12). Ademais, o Arg°-Ang-(1-7) reduziu a elevada relação entre insulinemia e glicemia de jejum (D) apresentada pelo grupo submetido ao consumo de frutose (Figura 12). Portanto, o Arg°-Ang-(1-7) normalizou a intolerância à glicose e a resistência à insulina em modelo de síndrome metabólica.

Exemplo 10 - Efeito anti-prol if erati vo da Arg°-Ang-(1-7)

Células de adenocarcinoma alveolar humano (A549), cultivadas em meio de crescimento regular DÉMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina, foram distribuídas em placa de 96 poços na densidade de 2 x 104 células/poço. Após 48 horas de incubação em estufa a 37° C, os peptídeos Arg°-Angiotensina-(1-7) e Angiotensina-(1-7) foram adicionados aos poços e diluídos seriadamente (1x10 4 à 2x10'7M) em meio de cultura isento de soro fetal bovino. Foram usados como controles poços não plaqueados com células e poços com células estimulados somente com meio de cultura. O estímulo, que durou 48 horas, foi seguido da adição do reagente AlamarBIue (invitrogen), utilizado para detectar a viabilidade celular.

Os resultados mostram que o peptídeo Arg°-Angiotensina-(1-7) apresentou efeito anti-proliferativo semelhante ao da Angiotensina-(1-7) (Figura 13).

Exemplo 11 - Efeito relaxante da Arg-Arg-Ang-(1-7) em anéis aórticos de ratos Wistar

Anéis de aorta de ratos Wistar, contendo endotélio funcional, foram pré- contraídos com FE e, durante a fase tônica da contração, foi construída uma curva concentração-resposta cumulativa (10‘12 a 10'6 M) com a Arg-Arg-Ang- (1 -7), e a Arg°-Ang-(1 -7) foi usada como controle positivo.

Os resultados são apresentados como média ± erro-padrão da média. Análise two-way das variâncias (ANOVA) com pós-teste de Bonferroni de comparação múltipla foi usada para comparar as curvas concentração-resposta obtidas em anéis aórticos. O efeito vasodilatador da Arg-Arg-Ang-(1-7) foi expresso como porcentagem da diminuição na concentração máxima induzida pela fenilefrina. Todas as análises estatísticas foram consideradas significativas 5 quando p<0,05. Como pôde-se observar na Figura 14, o peptídeo Arg-Arg- Ang-(1-7) produziu um efeito vasodilatador semelhante ao da Arg°-Ang-(1-7) em anéis de aorta de ratos Wistar.

O resultado obtido mostra que a adição de mais uma arginina na posição amino-terminal da Ang-(1-7) não resultou em aumento do efeito vasodilatador, io pelo menos em ratos Wistar.

Claims (6)

1. Peptídeo caracterizado por ser (Arg0)n-Angiotensina-(1-7), onde n é 1 a 10, e apresentar a sequência de aminoácidos indicada em SEQ ID N°1, onde Xaa representa uma variação de 1 a 10 aminoácidos L-Arg.

2. Composição farmacêutica caracterizada por compreender o peptídeo (Arg0)n-Angiotensina-(1-7), representado pela SEQ ID N°1 e descrito na reivindicação 1, e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

3. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por compreender o peptídeo (Arg0)n-Angiotensina-(1- 7), representado pela SEQ ID N°1, opcionalmente associado a um sistema carreador ou sistema de liberação controlada de fármacos.

4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo sistema carreador ou sistema de liberação controlada ser selecionado do grupo compreendendo ciclodextrinas, polímeros, polímeros mucoadesivos, vesículas lipídicas, lipossomas, polimersomas, nanopartículas lipídicas sólidas, micro- e nanopartículas poliméricas, micro- e nanocapsulas, micro- e nanoemulsões, dendrímeros, micelas, micelas poliméricas, nanopartículas inorgânicas, nanopartículas de carbono, adesivos transdérmicos, matrizes poliméricas implantáveis ou dispositivos que possam ser implantados.

5. Composição farmacêutica, de acordo com as reivindicações 2 a 4, caracterizada por ser administrada pela via oral, intramuscular, intravenosa, subcutânea, tópica, transdérmica, nasal, pulmonar, inalatória, por dispositivos que possam ser implantados ou injetados, preferencialmente, pela via oral.

6. Uso do peptídeo caracterizado pelo peptídeo ser aquele descrito na reivindicação 1 na preparação de medicamentos para tratamento de doenças ou distúrbios do aparelho genito-urinário, cardiopulmonares e hepáticos, metabólicos, neurais, músculo-esqueléticos, renais, cutâneos, cancerígenos, alopecia ou vasculopatias.

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