BRPI0504978B1 - Processo de preparação de compostos entre os antagonistas do receptor at1 e angiotensina-(1-7) seus análogos e/ou misturas desses sistemas, suas composições farmacêuticas e uso dos produtos derivados - Google Patents

Abstract

Processo de preparação de composto entre os antagonistas do receptor ATI e Angiotensina (1-7) seus análogos e/ou misturas desses sistemas, suas composições farmacêuticas e uso dos produtos derivados. A presente invenção caracteriza- se pelo processo de preparação de composto entre os antagonistas do receptor ATI e Angiotensina (1-7), como exemplo o losartanato de ang-(1-7) e seus análogos, e/ou misturas desses sistemas, suas composições farmacêuticas e uso dos produtos derivados.caracteriza-se ainda pelo uso de ciclodextrinas, seus derivados, para o micro-encapsulamento dos compostos como exemplo o losartanato de angiotensina(1-7), lipossomas e os polímeros biodegradáveis e /ou misturas desses sistemas e /ou dos produtos derivados, para a obtenção de nano ou micropartículas como dispositivos de liberação controlada ou sustentada do losartarada de Ang-(1-7) e seus a~álogos, e/ou misturas. Outra característica dos compostos aqui reivindicados é o uso dos mesmos como agentes para o tratamento ou prevenção de hipertensão, doenças cardiovasculares, hipertrofia cardíaca, insuficiência caedíaca, doenças coronarianas tais como angina de peito, disfunção endotelial ou danos endoteliais, como uma conseqüência por exemplo, de processo de ateroscleroses ou em associação com diabetes mellitus. Ainda como alvo para estudo e terapêutica de doenças cardiovasculares, renais, reprodutivas, dermatológicas, neoplásicas, sanguineas e cerebrais,(...).

Description

A presente invenção caracteriza-se pelo processo de preparação de compostos 5 entre os antagonistas do receptor ATI e Angiotensina-(l-7), como exemplo o losartanato de Angiotensina-(l-7) e seus análogos, e/ou misturas desses sistemas, suas composições farmacêuticas e uso dos produtos derivados.

Os compostos como exemplo o losartanato de Angiotensina-(l-7) e seus análogos, bem como suas formulações podem ser usados como agentes para o 10 tratamento ou prevenção de hipertensão, doenças cardiovasculares, hipertrofia cardíaca, insuficiência cardíaca, doenças coronarianas tais como angina de peito, disfunção endotelial ou danos endoteliais, como uma conseqüência por exemplo de processos de ateroscleroses ou em associação com diabetes mellitus. Os compostos também podem ser usados em doenças cardiovasculares, renais, reprodutivas, 15 dermatológicas, neoplásicas, sanguíneas e cerebrais.

A presente invenção caracteriza-se pelo uso de ciclodextrinas, seus derivados, para o micro-encapsulamento dos compostos como exemplo o losartanato de Angiotensina-(l-7), lipossomas e os polímeros biodegradáveis e/ou misturas desses sistemas e/ou dos produtos derivados, para a obtenção de nano ou 20 micropartículas como dispositivos de liberação controlada ou sustentada do losartanato de Angiotensina-(l-7) e seus análogos, e/ou misturas.

As formulações ora reivindicadas compreendem o losartanato de Angiotensina-(l-7) e seus análogos, em forma encapsulada ou não, como alvo para estudo e terapêutica de doenças cardiovasculares, renais, reprodutivas, 25 dermatológicas, neoplásicas, sanguíneas e cerebrais. Ainda reivindica-se o uso desses compostos bem como suas formulações de liberação controlada, encapsulados ou não em ciclodextrinas, para uso em stent, com o intuito de modular o crescimento da neointima e evitar a re-estenoses após processos de cateterismo.

Uma característica da presente invenção é o uso de forma sinérgica das 30 propriedades anti-hipertensivas, anti-inflamátorias, anti-agregantes e anti-trombóticas da Ang-(l-7) e o losartan, com propriedades farmacológicas mais eficientes quando \Q

Na maioria dos países do mundo, de 15% a 25 % da população adulta 5 apresenta pressão arterial elevada (MacMahon, S. et. Al. Blood pressure, stroke, and coronary heart disease, Lancet 335:765-774, 1990). O risco cardiovascular aumenta com o nível de pressão arterial. Quanto mais alta a pressão arterial, maior o risco de acidente vascular cerebral e eventos coronarianos. Considerada a principal responsável por doenças coronarianas, cerebrais e vasculares renais, a 10 hipertensão é a principal causa de morte e incapacidade entre adultos.

A insuficiência cardíaca é em nível mundial a principal causa de hospitalização na faixa etária de 60 a 80 anos. Só o envelhecimento da população já é fator de aumento de sua incidência, enquanto 1% dos indivíduos apresentam insuficiência cardíaca na faixa de 25 a 54 anos, entre os mais idosos a incidência é 15 muito maior, atingindo cerce de 10% naqueles com mais de 75 anos (Kaannel, W. B. et. al. Changing epidemiological features of cardiac failure, Br. Hear J 1994; 72 (suppl): S3-S9).

A insuficiência cardíaca pela sua característica clínica é doença limitante, que com o seu agravamento reduz a qualidade de vida dos pacientes e, nas formas 20 avançadas, tem características de doença maligna com mortalidade superior a 60% no primeiro ano, mesmo nos dias de hoje (Oliveira, M.T. Características clínicas e prognóstico de pacientes com insuficiência cardíaca congestiva avançada, Faculdade de Medicina, USP 1999). Calcula-se que atualmente são afetados mais de 15 milhões de indivíduos só no mundo industrializado e que só nos EUA, por 25 exemplo, o número de casos tenha aumentado 450% entre 1973-1990 (Kannel, W.B. et. El. Changing epidemiological features of cardiac failure, Br. Hear J 1994; 72 (suppl 3): S3-S9).

A hipertensão é complexa, multifatorial, de alta prevalência, responsável por inúmeros efeitos deletérios e alta morbimortalidade (Kaplan, N. M. Blood 30 pressure as a cardiovascular risk factor: prevention ant treatment. JAMA. 275:1571-1576, 1996). Inúmeros estudos para avaliação da eficácia de seu controle na população em geral e em grupos especiais têm sido desenvolvidos, objetivando o seu melhor entendimento. O controle pressórico sem ampla intervenção não medicamentosa e/ou farmacêutica nos fatores de riscos associados (diabete, obesidade, tabagismo) pode reduzir ou mesmo desprover os benefícios do 5 tratamento em longo prazo de hipertensão arterial na redução da mortalidade, em geral, por doença coronariana (Wilson, P. W. et. al. Hypertension, the risk factors and the risk of cardiovascular disease. Raven Press. 94-114).

A hipertensão é a patologia que mais contribui para a arterosclerose cardiovascular (The fifth Report of the Joint National Committee on detection, 10 evaluation, and treatment of High Blood Pressure. National Institute of Health (VJNC). Arch. Intern. Med. 153:154-181, 1994). Segundo estatísticas, de cada quatro americanos, um é ou será hipertenso, sendo que são estimadas 4,78 milhões de pessoas com insuficiência cardíaca. A cada ano 400 mil novos casos são diagnosticados, provocando 800 mil hospitalizações, com um gasto de US$ 17,8 15 bilhões de dólares no tratamento.

No Brasil dados do Sistema Único de Saúde mostraram que, em 1997, a insuficiência cardíaca foi a principal causa de hospitalizações entre as doenças cardíacas, tendo o governo gasto R$ 150 milhões no tratamento, equivalente a 4,6% das despesas com a saúde (Filho, Albanesi F. Insuficiência cardíaca no 20 Brasil. Arq. Bras. Cardiol, 71:561-562, 1998).

O sistema renina-angiotensina (SRA) é responsável pela regulação da pressão arterial, da homeostase cardiovascular e do equilíbrio hidroeletrolítico, tanto em condições fisiológicas quanto patológicas (Krieger, E. M.; Santos, R. A. S. Angiotensinas - aspectos fisiológicos. Hipertensão, 1:7-10,1998). A 25 angiotensina II (Ang II) é o principal peptídeo efetor do SRA, possuindo ações vasopressora, estimuladora da síntese de esteróides adrenais, proliferativa ( fibroblastos, músculo liso vascular) e hipertróficas (miócitos cadíacos). Sua via de formação envolve a produção de angiotensinogênio pelo fígado e a produção de renina no aparelho justa glomerular. Essas substâncias são liberadas na corrente 30 sangüínea onde, o angiotensinogênio é hidrolisado pela renina, formando a Ang I, que, no pulmão sofrerá ação da enzima conversora de angiotensina (ECA) e originará a Ang II. Essa por sua vez, exercerá suas ações em órgãos-alvo distantes do local de sua produção (Krieger, E. M.; Santos, R. A. S. Angiotensinas - aspectos fisiológicos. Hipertensão, 1: 7-10, 1998).

Recentemente descobriu-se que além do sistema que gera Ang II circulante, 5 diferentes tecidos contém SRA independentes que geram a Ang II, aparentemente para ação local. Os componentes do SRA tecidual, são encontrados nas paredes dos vasos sanguíneos, no útero, na porção exócrina do pâncreas, olhos, coração, córtex adrenal, testículo, ovários, lobos anterior e intermediário da hipófise, pineal e cérebro. As funções desses SRA’s teciduais não estão muito bem esclarecidas. (Ardaillou, R.; Michel, J. B. The relative roles of circulating and tissue reninangiotensin systems. Nephrol. Dial. Transplant., 14:283-286,1999). As ações locais do SRA podem ocorrer em nível da célula que produz os peptídeos (funções intrácrina e autócrina), sobre células adjacentes (função parácrina) ou em locais distantes da região de produção (função endócrina).

Observações recentes indicam que importantes ações periféricas e centrais do SRA podem ser mediadas por seqüências menores de peptídeos angiotensinérgicos, incluindo Angiotensina-III [Ang-(2-8)], Angiotensina-IV [Ang- (3-8)] e Angiotensina-(l-7). Podemos considerar que tanto a Angiotensina-I [Ang- (1-10)], como a Angiotensina-II [Ang-(l-8)] podem sofrer um processo de 20 biotransformação, gerando uma “família”de peptídeos de angiotensina biologicamente ativos. ( Santos, R. A. S.; Campagnole-Santos, M. J.; Andrade, S. P. Angiotensin-(l-7): an update. Regulatory Peptides , 91:45-62, 2000).

A angiotensina-(l-7) é um dos peptídeos da “família” das angiotensinas biologicamente ativos, sendo formada por uma via indenpendente da EC A. O 25 processamento da Ang I por endopeptidades ou da Ang II por prolil-peptidases ou carboxi-peptidases geram o heptapeptídeo Ang-(l-7). Depois de formada, a Ang- (1-7) pode ser hidrolisada por amino-peptidases gerando Ang-(2-7) e Ang-(3-7). A hidrólise da Ang-(l-7) pela ECA origina Ang-(l-5). ( Santos, R. A. S.; Campagnole-Santos, M. J.; Andrade, S. P. Angiotensin-(l-7): an update. 30 Regulatory Peptides , 91:45-62, 2000).

A Ang-(l-7) juntamente com a Ang II, são os principais efetores do SRA. Duas características importantes separam a Ang-(l-7) da Ang II: a primeira possui ações biológicas altamente específicas e sua via de formação é independente da ECA ( Santos, R. A. S.; Campagnole-Santos, M. J.; Andrade, S. P. Angiotensin- 5 (1-7): an update. Regulatory Peptides , 91:45-62, 2000).

O objetivo primário do tratamento da hipertensão não só visa a queda dos gastos, como também a prevenção das lesões em órgãos-alvo, através das modificações da qualidade de vida e do uso de medicamentos, quando necessário (The Fifth Report of The Joint National Committee on detection, evaluation, and 10 treatment of High Blood Pressure. National Institute of Health (VJNC). Arch. Intern. Med. 153:154-181, 1994).

O tratamento medicamentoso tem indicação frente a não resposta às mudanças de estilo de vida após um período de três a seis meses, e na vigência de lesões em órgãos-alvo (hipertrofia ventricular esquerda, isquemia do miocárdio, 15 acidente vascular encefálico ou retinopatia hipertensiva). Todos os pacientes com pressão arterial sistólica superior a 180 mmHg ou pressão arterial diastólica maior que 110 mmHg devem ser submetidos a tratamento farmacológico, independente de outros fatores presentes ou não (Report the Canadian Hypertension Society. Consensus Conference. 3. Pharmacological treatment of essential hypertension. Xan. Med. Assoc. J. 149 (3): 575-584, 1993).

Durante os anos 70 e 80, entretanto, os anti-hipertensivos tornaram-se uma ferramenta importante no tratamento da pressão arterial elevada (Ménard, J. Anthology of renin-angiotensin system: A one hundred reference approach to angiotensin II antagonista. J. Hypertension 11 (suppl 3): S3-S11, 1993). Durante as 25 últimas quarto décadas, a pesquisa farmacológica produziu novas classes de drogas para tratar a hipertensão: os diuréticos nos anos 60, os betabloqueadores nos anos 70, os bloqueadores do canal de cálcio, os antagonistas dos receptores da angiotensina II e os inibidores da enzima conversora da angiotensina (ECA).

Os diuréticos podem ser divididos em três categorias: tiazídicos, de alça e 30 os poupadores de potássio. Os tiazídicos e similares incluem Clorotiazida e Hidroclotiazida, os quais apresentam nos primeiros dias de tratamento diminuição da pressão arterial em torno de 10 a 15 %, estando relacionada esta queda com a diminuição do volume extracelular secundário e aumento da diurese e natriurese. Após seis meses, o volume plasmático e o débito cardíaco retornam a valores normais e a diminuição da pressão arterial é relacionada com a diminuição da resistência vascular periférica (Frolich, E. Current Approaches in the treatment of Hypertension, 405-469). São habitualmente utilizados em monoterapia, apresentando melhores respostas em pacientes de raça negra e, em baixas doses, nos idosos. Têm como efeitos colaterais : aumento da resistência periférica a insulina, aumento dos triglicerídios, aumento do LDL, hipocalcemia, hiperucemia.

Entre os diuréticos de alça temos Furosemida, Bumetamida e Triantereno, sendo diuréticos muito mais potentes que os tiazídicos. Atuam predominantemente nas porções medulares e corticais da alça de henle. Apresentam os mesmos efeitos colaterais que os tiazídicos. Já os poupadores de potássio, incluindo a Amilorida, o Triatereno e a Espironolactona, são drogas de ação diurética fraca, sendo 15 raramente utilizados isoladamente.

Os betabloqueadores, entre eles o Atenolol e Naolol, são classificados em beta-1 e beta-2. Têm como efeitos colaterais: alterarem a resposta à insulina, prolongarem o coma hipoglicêmico, aumentarem os triglicerídios e aumentarem a creatinina por diminuição do fluxo renal.

Os bloqueadores dos canais de cálcio são utilizados há pelo menos 25 anos (Frolich, E. D. Current Approaches in the Treatment of Hypertension, 405-469, 1994). Podem ser reunidos em dois grandes grupos, de acordo com suas ações farmacológicas: os que exercem maior ação na condução do estímulo, como Verapamil e o Diltiazem e aqueles que apresentam ação predominante vasodilatadora, como os derivados diidropirínicos (Nifedipina e outros) (Frolich, E. D., Hypertension. Adult Clinical Cardiology Self Assessment Program (ACCSAP), 6: 3-19, 1995). Têm como efeitos colaterais edema de membros inferiores e taquicardia.

Os inibidores da enzima conversora têm como ação principal inibir a 30 conversão da angiotensina I. Dessa forma, ações essencialmente vasoconstritora da angiotensina II são minimizadas. Estudos preliminares mostraram que o Teprotide, o primeiro inibidor usado clinicamente, exerce atividade anti-hipertensiva quando ministrado via intravenosa, porém é inativo por via oral, o que limitou seu emprego. Sabe-se atualmente que a EC A é uma enzima com ações múltiplas, isto é, que atua em diversos substratos. Além de agir como uma dipeptidase na 5 angiotensina I e na bradicina, é capaz também de clivar as cadeias peptídicas do peptídeo natriurético, indicando que a enzima pode atuar em diversos tecidos. A EC A tem papel importante na inativação da Ang-(l-7) circulante e tecidual. A concentração desse peptídeo circulante é semelhante a concentração da Ang II e mostra-se aumentada após inibição da EC A. Esse aumento pode ser devido ao 10 aumento do precursor (Ang I) e a diminuição da degradação pela EC A ( Santos, R.

A. S.; Campagnole-Santos, M. J.; Andrade, S. P. Angiotensin-(l-7): an update. Regulatory Peptides , 91:45-62, 2000). Os inibidores da ECA são excelentes quando ministrados em monoterapia, uma vez provocam queda relativamente rápida da pressão arterial em 60 a 70% dos pacientes com hipertensão arterial 15 (Ganong, W. Neuropeptides in cardiovascular control. J. Hypertens 2 (suppl 3): 15-22, 1984). Além do mais, são em geral bem tolerados, mas seu uso pode acarretar efeitos colaterais e reações adversas, algumas das quais relativamente graves, entre elas edema angioneurótico, erupções cutâneas e tosse seca (8 a 10%).

As primeiras tentativas de desenvolver antagonistas da Ang II datam do 20 início da década de 70 e concentrou-se no desenvolvimento de peptídeos análogos a Ang II. O primeiro, saralasina, 1-sarcosina, 8-isoleucina angiotensina II, e posteriormente outros. No entanto, não tiveram aceitação clínica, pois apresentavam atividade agonista parcial. Em 1982, foram desenvolvidos dois primeiros antagonistas dos receptores ATi e não peptídicos (S-8307 e S8308) que, 25 embora fossem altamente específicos e sem atividade agonista, apresentavam fraca ligação aos receptores da Ang II. Com uma série de modificações na estrutura molecular desses dois precursores, para melhorar a potência, reter a seletividade e atingir as propriedades farmacocinéticas, um novo produto de uso oral, potente e de alta especificidade, foi desenvolvido o Losartan. A partir de então, muitos 30 outros antagonistas não-peptídicos foram desenvolvidos, tais como Candesartan, Irbesartan, Valsartan, Telmisartan, Eprosartan, Tasosartan e Zolasartan.

A Angiotensina-(l-7), (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro) e seu derivativo Sar1 - Ang-(l-7) também antagonizam os efeitos pressores da Ang II no homem (Ueda S, Masumori-Maemoto S, Ashino K, Nagahara T, Gotoh E, Umemura S, Ishii M. Angiotensin-(l-7) attenuates vasoconstriction evoked by angiotensin II but not by 5 noradrenaline in man. Hypertension 2000; 35:998-1001) e ratos (Bovy PR, Trapani AJ, McMahon EG, Palomo M. A carboxy-terminus truncated analogue of angiotensin II [Sar1] angiotensin II-(l-7)-amide, provides an entry to a new class of angiotensin II antagonists. J Med Chem. 1989; 32:520-522). A contração produzida pela Ang II em artérias isoladas de coelhos e humanos também é 10 reduzida pela angiotensina-(l-7) (Bovy PR, Trapani AJ, McMahon EG, Palomo M.

A carboxy-terminus truncated analogue of angiotensin II [Sar1] angiotensin II-(l-7)- amide, provides an entry to a new class of angiotensin II antagonists. J Med Chem. 1989; 32:520-522. Roks AJ, Van-Geel PP, Pinto YM, Buikema H, Henning RH, de Zeeuw D, van-Gilst WH. Angiotensin-(l-7) is a modulator of the human 15 renin-angiotensin system. Hypertension 1999; 34(2):296-301).

Até recentemente os receptores responsáveis pela transdução do sinal da Ang-(l-7) não tinham definição, podendo existir várias possibilidades em relação a mediação do sinal. A primeira evidência da existência de receptores diferentes e/ou de mecanismos diferenciados da transdução do sinal para a Ang-(l-7), está baseado 20 nas ações opostas e/ou diferentes entre a Ang II e a Ang-(l-7). Recentemente foi caracterizado o heptapeptídeo D-[Ala 7]-Ang-(l-7) (A-779), como um potente antagonista da Ang -(l-7)(Santos RAS, Campagnole-Santos MJ, Baracho NCV, Fontes MAP, Silva LCS, Neves LAA, Oliveira DR, Caligiorne SM, Rodrigues ARV, Gropen Jr. C, Carvalho WS, Silva ACS, Khosla MC. Characterization of a 25 new angiotensin antagonist selective for angiotensin-(l-7): Evidence that the actions of angiotensin-(l-7) are mediated by specific angiotensin receptors. Brain Res. Bull. 1994;35:293-299). Os resultados desse estudo indicaram que esse peptídeo é um antagonista seletivo da Ang-(l-7) sem demonstrar atividade agonista em várias preparações biológicas. Esse peptídeo mostrou-se potente em antagonizar 30 o efeito antidiurético da Ang-(l-7) em ratos com sobrecarga hídrica. A vasodilatação produzida pela Ang-(l-7) nas arteríolas aferentes de coelhos, seu efeito pressor na RVLM, a vasodilatação produzida na microcirculação mesentérica in vivo, são bloqueadas completamente pela administração de A-779, não sendo modificadas pelos antagonistas da Ang II. Outros estudos com culturas de células endoteliais bovinas, artérias coronárias de cães, aorta de SHR, fibroblastos 5 epiteliais humanos, fibroblastos cardíacos humanos e cortes de rim, tem fornecido evidências da existência de receptores específicos da Ang-(l-7) bloqueados pelo A-779. ( Santos, RAS; Campagnole-Santos, MJ.; Andrade, SP. Angiotensin-(l-7): an update. Regulatory Peptides , 91:45-62, 2000).

O A-779 e seus análogos como a Sarcoisinal - D- Ala 7-Ang-(l-7) (Bovy 10 PR, Trapani AJ, McMahon EG, Palomo M. A carboxy-terminus truncated analogue of angiotensin II [Sari] angiotensin II-(l-7)-amide, provides an entry to a new class of angiotensin II antagonists. J Med Chem. 1989; 32:520-522.), e o D- Pro7-Ang-(l-7) (Naves-Santos, V., Khosla, M. C., Oliveira, R. C., Campagnole- Santos, M. J., Lima, D. X., Santos, RAS. Inibição seletiva do efeito pressor 15 central da angiotensina-(l-7) pelo seu análogo [D-Pro7]-angiotensina-(l-7). XI Reunião Annual da Federação de Sociedade de Biologia Experimental, 1996, Caxambu, MG) e outros podem servir de ferramentas extremamente utéis para esclarecer efeitos biológicos da Ang-(l-7).

Tem sido demonstrado que a Ang-(l-7) atua como um peptídeo 20 contraregulador dentro do sistema renina-angiotensina, atuando em múltiplos pontos (Ferrario CM, Chappell MC, Dean RH, Iyer SN. Novel angiotensin peptides regulate blood pressure, endothelial function, and natriuresis. J Am Soc Nephrol. 1998; 9: 1716-1722. Santos, R. AS, Campagnole-Santos, MJ, Andrade, SP. Angiotensin-(l-7): an update. Regulatory Peptides, 91:45-62, 2000. Henriger- 25 Walther S, Batista EN, Walther T, Khosla MC, Santos RAS, Campagnole-Santos MJ. Baroreflex improvement in SHR after ACE inhibitors involves angiotensin-(l- 7). Hypertension, 37: 1309-1313, 2001).

A Ang-(l-7) inibe a angiogênese (Machado, RDP, Santos, RAS, Andrade, SP. Mechanisms of angiotensin-(l-7) induced inhibition of angiogenesis. Am J 30 Physiol, 280: 994-1000, 2001. Entretanto esse peptídeo aumenta a regeneração tecidual Rodgers K, Xiong S, Felix J, Roda N, Espinoza T, Maldonado S,

Foram encontradas no estado da técnica algumas tecnologias que descrevem 5 o uso da Ang-(l-7) como agente farmacológico, porém não tem sido descrito a obtenção de um produto entre a Angiotensina-(l-7) e o losartan, como o losartanato de Angiotensina-(l-7) reivindicado na presente invenção.

A patente US 6900033 de Parry, et al. (2005) descreve os métodos e as composições para modular a atividade da ACE2. Os polipeptídeos ligantes contêm 10 as seqüências específicas de aminoácidos que se ligam especificamente a proteína ACE2 ou os polipeptídeos do tipo ACE2. Os polipeptídeos ligantes podem ser usados nos métodos da invenção detectando, isolando, ou purificando a proteína ACE2 ou os polipeptídeos de ACE2-like nas soluções ou nas misturas, ou em amostras biológicas. A invenção relaciona-se também às moléculas de ácido 15 nucléico que codificam estes polipeptídeos ACE2 ligantes, vetores e células anfitriãs que contêm estes ácidos nucléicos, e métodos para produzir o mesmo. Nessa invenção relaciona-se também aos métodos e às composições para detectar, diagnosticar, fazer prognóstico, prevenir, tratar ou melhorar uma doença ou um distúrbio associado com significativa expressão do receptor ACE2 ou o ACE2 ou 20 funções impróprias do receptor de ACE2 ou do tipo ACE2, compreendendo o uso dos polipeptídeos ACE2 ou de fragmentos ou dos seus ligantes variantes, que se ligam especificamente a ACE2. Porém não foi descrito o uso de Angiotensina-(l-7) e o composto losartanato de angiotensina e suas formulações farmacêuticas, com excipientes farmacêutica e farmacologicamente aceitáveis usados como fármacos 25 moduladores da atividade da ACE2, reivindicados na presente invenção.

A patente US 6475988 de Rodgers, et al., (2002) descreve métodos para aumentar a sobrevivência de células de defesa (brancas) do sangue após a quimioterapia. A invenção atual fornece métodos melhorados, kits, e composições farmacêuticas para um aumento de sobrevivência das células de defesa do sangue 30 depois da quimioterapia, mobilizando progenitores de células hematopoiéticas da medula óssea no sangue periférico, compreendendo a administração de uma

Dessa forma os compostos descritos na presente invenção podem ser usados 5 para a proteção e sobrevivência das células de defesa, pela combinação Ang-(l-7) e losartan, o losartanato de Ang-(l-7) e suas formulações farmacêuticas. US5834432, (AU5990796, CA2221730, EP0828505, WO09639164, JP115073625), Rodgers, Katlen Elizabeth et. al. (1998 ), utilizaram agonistas dos receptores AT2 para acelerar a cicatrização de ferimentos. Rodgers, et al., descreveram em varias patentes US 6455501 (2002), US 6475988 de (2002), US 6444646 de (2002) e US 6165978 (2000) as composições farmacêuticas de Angiotensina II e seus resíduos, para uso na recuperação de feridas.

Mas não foram reivindicados o uso dos composto losartanato de Ang-(l-7) e 15 suas formulações farmacêuticas para a recuperação de feridas, característica da presente invenção.

Sinisterra, R.D. et al., descreveram na aplicação de patente americana 20050069533 (2005) Processo de preparação de formulações do peptídeo da angiotensina-(l-7) e seus análogos, agonistas e antagonistas usando ciclodextrinas, 20 lipossomos e polímeros biodegradáveis e/ou misturas desses produtos. A invenção prévia trata de formulações, aplicação ou produção de D-Ala7-Angiotensina-(l-7) (A-779), seus análogos e os derivados, o D-Pro7- Angiotensina-(l-7), seus análogos e os derivados ou da Ang-(l-7) seus análogos e derivados usando ciclodextrinas, lipossomas, polímeros biodegradáveis e derivados para o estudo e 25 tratamento da hipertensão arterial e outras doenças cardiovasculares, feridas, queimaduras, eritema, tumors, diabetes mellitus, mobilidade do esperma, nefropatia, desordens gastrintestinais e ginecológicas, angiogênese, angioplastia, alopécia e doenças sanguíneas em animais de sangue quente, ou como ligantes do receptores ligado a proteína G, Mas. Isto caracteriza a invenção atual como uma 30 opção mais eficaz para o estudo e tratamento das patologias associadas ou não a este receptor. Uma combinação de duas tecnologias diferentes é fornecida: o

encapsulamento molecular do peptídeo angiotensina-(l-7) e seus análogos e derivados em ciclodextrinas e o microencapsulamento em polímeros biodegradáveis e lipossomas.

Contudo não foi reivindicado nessa invenção o composto losartanato de 5 angiotensina-(l-7) característico da presente invenção que pode ser usado no tratamento dessas patologias descritas nessa patente de forma sinérgica.

Sinisterra R.D. et al., reivindicam na aplicação de patente americana 20040171584 (2004) a preparação de formulações de antagonistas dos receptores ATI da angiotensina II para o tratamento da hipertensão arterial, de outras doenças cardiovasculares e suas complicações. Até agora, nenhuma aplicação usando os antagonistas do receptor ATi e as ciclodextrinas ou derivados e/ou os polímeros biodegradáveis para o tratamento da hipertensão arterial, outras doenças cardiovasculares e suas complicações, foram encontradas no estado técnico da arte. A atual invenção é caracterizada pela combinação de duas tecnologias diferentes: um o encapsulamento molecular de antagonistas do receptor ATi nas ciclodextrinas e o outro é o microencapsulamento em polímeros biodegradáveis. Compreende também o aumento da eficácia dos antagonistas do receptor ATI tanto quanto um aumento em sua biodisponibilidade.

A presente invenção reivindica, contudo o uso das propriedades do losartan e da Ang-(l-7) de forma sinérgica, na forma de losartanato de Ang-(l-7) encapsulados ou não em ciclodextrinas, apresentando propriedades farmacológicas mas eficazes quando comparados com os componentes livres (losartan e Ang-(l-7).

Tallant, E. A. et al. descreveram na aplicação de patente americana 20030203834 (2003) o uso da Ang-(l-7) e agonistas da Ang-(l-7) como agente 25 terapêutico anticancerígeno. Assim, a invenção compreende aplicações de composições farmacêuticas de Ang-(l-7) ou agonistas no aumento da expressão de genes envolvidos na supressão tumoral, apoptoses, bem como no ciclo da inibição celular e a diminuição da expressão dos conhecidos oncogenes, proteínas quinases e/ou o ciclo celular de progressão de genes. Os cânceres tratados usando os 30 métodos e as composições descritas incluem os cânceres que têm receptores de Ang-(l-7), incluindo, mas não limitado ao do peito e pulmão.

Christine Kramer, et al., discutem que o losartan e os antagonistas do receptor (ATI) apresentam propriedades antiinflamatórias e anti-agregantes além das propriedades anti-hipertensivas já conhecidas, Angiotensin II Receptor- Independent Antiinflammatory and Antiaggregatory Properties of Losartan. Role of 5 the Active Metabolite EXP3179 (Circulation Research 2002; 90:770.). Assim, a presente invenção reivindica o uso do losartanato de Ang-(l-7) e suas composições farmacêuticas, como agentes antiinflamatórios e anti-agregantes além das propriedades anti-hipertensivas.

Bas Langeveld et al., descrevem o papel atenuante da Ang-(l-7) na 10 formação de neointima após implantação de stent em ratos, melhorando a função endotelial, (Angiotensin-(l-7) Attenuates Neointimal Formation After Stent Implantation in the Rat , Hypertension. 2005;45:138).

Iwona Kucharewicz, et al., descreveram que o efeito anti-trombótico dos agentes bloqueadores do sistema renina-angiotensina é mediado pela Ang-(l-7) 15 envolve a liberação de NO e protaciclina, (Antithrombotic Effect of Captopril and Losartan Is Mediated by Angiotensin-(l-7), Hypertension 2002;40:774). Dessa forma o losartanato de Ang-(l-7) bem como suas formulações farmacêuticas apresentam atividade anti-trombótica.

A Ang-(l-7) pode atuar como um inibidor da EC A tanto no domínio amino- 20 terminal da enzima, no qual atua como substrato, como no domínio c-terminal no qual atua como um inibidor (Deddish PA, Mareie B, Jackman HL, Wang HZ, Skidgel RA, Erdos EG. N-domain-specific substrate and C-domain inhibitors of angiotensin-converting enzyme: angiotensin-(l-7) and keto-ACE. Hypertension. 1998; 31:912-917. Tom B, De Vries R, Saxena PR, Danser AHJ. Bradykinin 25 potentiation by angiotensin-(l-7) and ACE inhibitors correlates with ACE C- and N-domain blockade. Hypertension, 38: 95-99, 2001). A ICso para inibição da ECA pela Ang-(l-7) é aproximadamente 1 micromolar (Chappell MC, Pirro NT, Sykes A, Ferrario CM. Metabolism of angiotensin-(l-7) by angiotensin-converting enzyme. Hypertension. 1998; 31(part 2):362-367. Paula, RD, Lima, CV, Britto, 30 RR, Campagnole-Santos, MJ, Khosla, MC, Santos, RAS. Potentiation of the hypotensive effect of bradykinin by angiotensin-(l-7)-related peptides. Peptides, v.2O, p.493-500, 1999. Deddish PA, Mareie B, Jackman HL, Wang HZ, Skidgel RA, Erdos EG. N-domain-specific substrate and C-domain inhibitors of angiotensin-converting enzyme: angiotensin-(l-7) and keto-ACE. Hypertension, 5 31:912-917, 1998).

Além de inibir a EC A a Ang-(l-7) inibe as ações a Ang II por dois mecanismos: 1) competindo pela ligação em receptores ATi (Bovy PR, Trapani AJ, McMahon EG, Palomo M. A carboxy-terminus truncated analogue of angiotensin II [Sar1] angiotensin II-(l-7)-amide, provides an entry to a new class of angiotensin 10 II antagonists. J Med Chem. 1989; 32:520-522. - Ueda S, Masumori-Maemoto S, Ashino K, Nagahara T, Gotoh E, Umemura S, Ishii M. Angiotensin-(l-7) attenuates vasoconstriction evoked by angiotensin II but not by noradrenaline in man. Hypertension 2000; 35:998-1001. Roks AJ, Van-Geel PP, Pinto YM, Buikema H, Henning RH, deZeeuw D, van-Gilst WH. Angiotensin-(l-7) is a 15 modulator of the human renin-angiotensin system. Hypertension 1999; 34(2):296- 301. Rowe BP, Saylor DL, Speth RC, Absher DR. Angiotensin-(l-7) binding at angiotensin II receptors in the rat brain. Regul Pep. 1995; 56(2): 139-146. Mahon JM, Carrr RD, Nicol AK, Hendersn IW. Angiotensin-(l-7) is an antagonist at the type 1 angiotensin II receptor. J Hypertension 1994; 12:1377-1381), e 2) alterando 20 a sinalização dos efeitos da Ang II, possivelmente por alterar a disponibilidade de cálcio intracelular (Chansel D, Vandermeerch S, Andrzej O, Curat C, Ardaillou R. Effects of angiotensin IV and angiotensin-(l-7) on basal angiotensin Il-stimulated cytosolic Ca+2 in mesangial cells. Eur J Pharmacol. 2001; 414:165-175). Um terceiro mecanismo pelo qual a Ang-(l-7) antagoniza os efeitos deletérios da Ang 25 II sobre o aparelho cardiovascular é pela potenciação dos efeitos da bradicinina (Paula, RD; Lima, CV, Khosla, MC, Santos, RAS. Angiotensin-(l-7) potentiates the hypotensive effect of bradykinin in concious rats. Hypertension, 26: 1154-1159, 1995. Li P, Chappell MC, Ferrario CM, Brosnihan KB. Angiotensin-(l-7) augments bradykinin-induced vasodilation by competing with ACE and releasing 30 nitric oxide. Hypertension. 1997; 29 (part 2):394-400).

A bradicina é um peptídeo endógeno com potente ação vasodilatadora (Rocha e Silva, M, Beraldo, WT, Rosenfeld, G. Bradykinin, a hypotensive and smooth muscle stimulating factor releases from plasma globulin by snake venoms and by trypsin. Am. J. Physiol. 156, 261-273, 1949). Tem sido também descritos 5 ações benéficas da bradicina no coração (Linz W, Wohlfart P, Scholkens BA, Malinski T, Wiemer G. Interactions among ACE, kinins and NO. Cardiovasc Res. 1999; 43:549-561). A Ang-(l-7) potência os efeitos da bradicinina, tanto em vasos (Paula, R. D.; Lima, C. V.; Khosla, M. C.; Santos, R. A. S. Angiotensin-(l-7) potentiates the hypotensive ffect of bradykinin in concious rats. Hypertension, 26: 1154-1159, 1995. Li P, Chappell MC, Ferrario CM, Brosnihan KB. Angiotensin- (1-7) augments bradykinin-induced vasodilation by competing with ACE and releasing nitric oxide. Hypertension. 1997; 29 (part 2):394-400), como no coração (Almeida, AP, Frábregas, BC, Madureira, MM, Santos, RJ S, Campagnole- Santos, MJ, Santos, RAS. Angiotensin-(l-7 potentiates the coronary vasodilatory effect of bradykinin in the isolated rat heart. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 33: 709-713, 2000).

Com o intuito de melhorar as propriedades dos fármacos pode ser usados diferentes métodos farmacotécnicos para melhorar as propriedades de solubilidade, propriedades de absorção, biodisponibilidade, liberação e diminuição de efeitos 20 colaterais. Entre esses se encontram o uso de solventes orgânicos, emulsões, lipossomas, ajuste de pH, modificações químicas e complexação dos fármacos com um agente encapsulate apropriado como as ciclodextrinas, lipossomas e o microencapsulamento em polímeros biodegradáveis.

As ciclodextrinas são oligossacarídeos cíclicos que incluem seis, sete ou oito 25 unidades de glucopiranose. Devido a interações estéricas, as ciclodextrinas, CD’s, formam uma estruturas cíclica na forma de cone truncado com uma cavidade interna apoiar. Trata-se de compostos quimicamente estáveis que podem ser modificados de maneira regioseletiva. As ciclodextrinas (hospedeiros) formam complexos com várias moléculas hidrófobas (convidados) incluindo as mesmas de 30 forma completa ou em parte na cavidade. As CD’s têm sido usadas para a solublização e encapsulação de drogas, perfumes e aromatizantes como descrito por Szejtli, J., Chemical Reviews, (1998), 98, 1743-1753. Szejtli, J., J. Mater. Chem., (1997), 7, 575-587. Conforme estudos detalhados de toxicidade, mutagenecidade, teratogenicidade e carciongenecidade sobre as ciclodextrinas, descritos em [Rajewski, R.A., Stella, V., J. Pharmaceutical Sciences, (1996), 85, 1142-1169], 5 essas se apresentam com baixa toxicidade, em especial da hidroxipropil-(- ciclodextrinas, como relatado em Szejtli, J. Cyclodextrins: Properties and aplications. Drug Investig., 2(suppl. 4): 11-21, 1990. Exceto para altas concentrações de alguns derivados, que provocam danos aos eritrócitos, esses produtos em geral não acarretam riscos à saúde. A utilização das ciclodextrinas 10 como aditivos em alimentos já foi autorizada em países como Japão e a Hungria e para aplicações mais específicas, na França e na Dinamarca. Todas essas características são uma motivação crescente para a descoberta de novas aplicações.

Não foram encontrados no estado da técnica nem a descrição do composto losartanato de Ang-(l-7) bem como a formulação do mesmo usando as 15 ciclodextrinas, polissacarídeos cíclicos ou não, lipossomas ou encapsulados em polímeros biodegradáveis. Assim a presente invenção reivindica o uso da formação de compostos de inclusão bem como as formulações farmacêuticas usando as ciclodextrinas naturais como a α, β-ciclodextrina, e y-ciclodextrina, combinações e as modificadas como hidroxi-propil-β-ciclodextrina como exemplo.

A administração de drogas na forma incorporada em uma matriz polimérica permite sua liberação no organismo em pequenas e controláveis doses diárias, durante dias, meses ou até anos.

Vários polímeros já foram testados em sistemas de liberação controlada. Muitos em função de suas propriedades físicas, tais como: poli(uretanos) por sua 25 elasticidade, poli(siloxanos) ou silicone por ser um bom isolante, poli(metil- metacrilato) por sua força física, poli(vinil álcool) por sua hidrofobicidade e resistência, poli(etileno) por sua dureza e impermeabilidade (Gilding, D. K. Biodegradable polymers. Biocompat. Clin. Implat. Mater. 2: 209-232, 1981).

Entretanto, para uso em humanos, o material deve ser quimicamente inerte 30 e livre de impurezas. Alguns dos materiais utilizados em sistemas de liberação são: poli (2-hidroxi-etilmetacrilato), poliacrilamida, polímeros na base de ácido láctico (PLA), na base de ácido glicólico (PGA), e os respectivos co-polimeros, (PLGA) e os poli (anidridos) tais como os polímeros na base de ácido sebásico PSA e os co- polimeros com polímeros hidrofóbicos.

Os lipossomas são vesículas lipidicas que incluem compartimentos internos 5 aquosos em qual moléculas, por exemplo, drogas, podem ser encapsuladas com objetivo de alcançar uma liberação lenta da droga depois de administração dos lipossomas em um indivíduo.

São relatados no estado da técnica muitas patentes para a preparação de lipossomas [Pat US 4,552,803, Lenk; Pat US 4,310,506, Baldeschwieler; Pat US 10 4,235,871, Papahadjopoulos; Pat US 4,224,179, Schneider; Pat US 4,078,052, Papahadjopoulos; Pat US 4,394,372, Alfaiate; Pat US 4,308,166, Marchetti; Pat US 4,485,054, Mezei; e Pat US 4,508,703, Redziniak; Woodie e Papahadjopoulos, Methods Enzymol. 171:193-215 (1989)]. Lipossomas unilamelares têm uma única membrana que inclui um volume aquoso [Huang, 15 Biochemistry 8:334-352 (1969)] enquanto lipossomas multilamelares têm numerosas membranas concêntricas [Bangham et Col., J. Mol. Biol. 13:238-252 (1965)].

Lipídeos satisfatórios incluem por exemplo, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, cardiolipin, colesterol, ácido fosfatidico, esfingolipídeos, 20 glicolipídeos, ácidos graxas, esterois, fosphatidiletanolamina, fosfolipídeos polimerizáveis na sua forma polimerizada ou não-polimerizada declara, e misturas desses lipídeos.

Estudos nesta área demonstraram que diferentes fatores afetam a meia-vida de circulação dos lipossomas-PEG, e idealmente, o diâmetro das vesículas deveria 25 ser abaixo de 200 nm, com PEG de peso molecular de aproximadamente 2.000 Da, em uma proporção de 3% [Lasic e Martin, Cautela Lipossomas, CRC Press, Inc., Boca Raton, Fia. (1995); Woodle et Col., Biochim. Biophys. Acta 1105:193-200 (1992); Litzinger et Col., Biochim. Biophys. Acta 1190:99-107 (1994); Bedu Addo et Col., Pharm. Res. 13:718-724 (1996)].

O direcionamento ativo envolve alteração dos lipossomas através da sua associação com um ligante como um anticorpo monoclonal, açúcar, glicolipídeo, proteína, polímero ou mudando a composição ou o tamanho dos lipossomas para direcioná-los para orgãos e células diferentes dos locais onde se acumulam os lipossomas convencionais.

Veículos a base de lipossomas foram propostos para uma variedade de 5 substâncias farmacologicamente ativas, inclusive antibióticos, hormônios e agentes anti-tumorais [Medical applications of liposomes (D.D. Lasic, D. Papahadjopoulos Ed.), Elsevier Science B.V., Holanda, 1998].

A Ang-(l-7) e seus análogos tem grande potencial para tratamentos de doenças cardiovasculares. Outro aspecto importante relacionado ao SRA está 10 relacionado à clara necessidade de ampliação dos conhecimentos sobre suas ações fisiológicas, que poderão propiciar o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Contudo, o modo convencional de administração da maioria das drogas anti-hipertensivas e especialmente de peptídeos biologicamente ativos, como as angiotensinas e derivados, sofre limitações devido a sua curta meia-vida e 15 quando procura-se obter informações sobre as suas ações crônicas.

Nesse sentido, a presente invenção é caracterizada pelo uso de lipossomas, ciclodextrinas e polímeros biodegradáveis como sistemas de liberação controlada do losartanato de Ang-(l-7) e derivados para aumentar a biodisponibilidade, a duração e a intensidade de seus efeitos biológicos.

A formulação da presente invenção caracteriza-se pelo uso da mistura de excipientes aceitáveis farmaceuticamente combinados a Ang-(l-7) e/ou análogos da Ang-(l-7). Podem ser preparadas formulações com um excipiente ou misturas desses. Exemplos de excipientes incluem água, solução salina, soluções tamponadas com fosfato, a solução de Ringer, solução de dextrose, a solução de 25 Hank, soluções salinas biocompatíveis contendo ou não polietileno glicol. Veículos não aquosos, como óleos fixos, óleo de sesame, etil-oleato, ou triglicerídeo também podem ser usados. Outras formulações úteis incluem agentes capazes de aumentar a viscosidade, como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol, ou dextran.

Os excipientes também podem conter quantidades menores de aditivos, 30 como substâncias que aumentam isotonicidade e estabilidade química de substância ou tampões. Exemplos de tampões incluem tampão fosfato, tampão bicarbonato e tampão Tris, enquanto exemplos de preservativos incluem timerosal, m - ou o- cresol, formalin e benzil-álcool. As formulações padrões podem ser líquidos ou sólidos. Desta forma, uma formulação não-líquida, o excipiente pode incluir dextrose, albumina de soro humano, preservativos, etc. para qual água ou solução 5 salina estéril pode ser acrescentada antes da administração.

A presente invenção caracteriza-se ainda pela preparação de sistemas de liberação controlada contendo losartanato do Ang-(l-7) e análogos da Ang-(l-7) visando facilitar a interação receptor-ligante com o receptor acoplado a proteína G, MAS. Os sistemas de liberação controlada satisfatórios incluem, mas não são 10 limitados às ciclodextrinas, polímeros biocompatíveis, polímeros biodegradáveis, outras matrizes poliméricas, cápsulas, microcápsulas, micropartículas, preparações de bolus, bombas osmóticas, dispositivos de difusão, lipossomas, lipoesferas, e sistemas de administração transdermicos. Outras composições de liberação controlada da presente invenção incluem líquidos que, após administração para um 15 animal, formem um sólido ou um gel in situ.

O receptor MAS (Young, D., Waitches, G., Birchmeier, C., Fasano, O., and Wigler, M. (1986). Isolation and characterization of a new cellular oncogene encoding a protein with multiple potential transmembrane domains. Cell 45: 711- 719) foi inicialmente descrito como um receptor de angiotensina II (Jackson, T.R., 20 Blair, A.C., Marshall, J., Goedert, M. & Hanley, M.R. The mas oncogene encodes an angiotensin receptor. Nature 335, 437-440 (1988)), no entanto estudos posteriores mostraram que essa hipótese não era verdadeira (Ambroz, C., Clark, A.J.L. & Catt, K.J. The mas oncogene enhances angiotensin-induced [Ca2+]i responses in cells with pre-existing angiotensin II receptors. Biochem. Biophys. Acta 1133, 107-111 (1991)). Essa proteina está expressa no cérebro (Bunnemann, B., Fuxe, K., Metzger, R., Mullins, J., Jackson, T.R., Hanley, M.R. & Ganten, D. Autoradiographic localization of mas proto-oncogene mRNA in adult rat brain using in situ hybridization. Neurosci. Lett. 114, 147-153 (1990)) e em outros tecidos. Não existe no estado da técnica nenhuma descrição da interação do MAS 30 com a angiotensina-(l-7) ou seus análogos.

A presente invenção caracteriza-se ainda pela preparação de sistemas de liberação controlada contendo losartanto de Ang-(l-7) e/ou análogos da Ang-(l-7). Os sistemas de liberação controlada satisfatórios incluem, mas não são limitados às ciclodextrinas, polímeros biocompatíveis, polímeros biodegradáveis, outras 5 matrizes poliméricas, cápsulas, micro- e nano-cápsulas, micro- e nano-partículas, preparações de bolus, bombas osmóticas, dispositivos de difusão, lipossomas, lipoesferas, e sistemas de administração transdérmicos. Outras composições de liberação controlada da presente invenção incluem líquidos que, quando submetidos a mudanças de temperatura, formam um sólido ou um gel in situ.

A presente invenção caracteriza-se pela obtenção de sistemas de liberação controlada do losartanato de Angiotensina -(1-7) e/ou dos seus derivados, usando as ciclodextrinas e/ou seus derivados, que diminuem a degradação do peptídeo no trato gastrointestinal (TGI), significando maior biodisponibilidade do peptídeo no sistema biológico.

A presente invenção caracteriza-se pela obtenção de sistemas de liberação controlada do losartanato de Angiotensina-(l-7) e/ou dos seus derivados, usando polímeros biodegradáveis, lipossomas ou misturas desses sistemas com ciclodextrinas, os quais aumentam a biodisponibilidade dos peptídeos.

Até o presente, nenhuma aplicação usando o losartanato de Angiotensina-(1- 20 7) ou seus análogos, agonistas e antagonistas associados às ciclodextrinas ou seus derivados, aos polímeros biodegradáveis ou aos lipossomas foi descrita.

A presente invenção pode ser melhor entendida através dos seguintes exemplos mas não limitantes:

Exemplo 1:

Esse exemplo descreve a preparação do composto losartanato de angiotensina na proporção molar 1:1 e 2:1, losartan:Ang-(l-7), como exemplo não limitante.

Prepararam-se soluções aquosas de Angiotensina (1-7), 2,22 xl0-5mol em 3mLde água mili-Q( 20mg), e de Losartan Potássico, 2,22 xl0-5moL em 2 mL de 30 água mili-Q 10,2mg. Adicionou-se aos poucos (μL) a solução de Losartan Potássico à solução de Angiotensina (1-7), sob agitação, a temperatura ambiente, por 2 horas, num pH aproximadamente de 3.2, e com proteção do béquer de reação com lamina de alumínio para proteção do composto à luz. Observou-se a formação de um precipitado branco a partir da primeira gota adicionada. Filtrou-se a solução à vácuo e o resíduo obtido foi chamado de PID.O filtrado foi armazenado e 5 chamado de PHD. PID e PIID foram colocados em tubos eppendorfs e congelados em nitrogênio líquido e submetidos a liofilização por 24 horas. Pesaram-se e foram guardados sob dessecador os compostos para posterior caracterização físico-química.

A determinação da estequiometria do complexo foi feita utilizando a técnica 10 de calorimetria isotérmica de titulação: Foi titulada solução de Losartan 30 mmolL- 1 em água Milli-Q pura (branco) e em solução de Ang-(l-7) 2 mmolL. O volume utilizado na cela calorimétrica foi de 1,5 mL.

Cada titulação consistiu de 40 injeções de 5 μL e uma primeira injeção de 1 μL, a qual foi descartada para eliminar efeitos de difusão de material da seringa 15 para a cela e da cela para a seringa. O volume total injetado foi de volume total de 206 μL. O tempo de injeção foi de 2s e o intervalo de tempo entre cada injeção foi de 360s, o qual foi suficiente para garantir o alcance do equilíbrio termodinâmico entre as sucessivas injeções. A correção das concentrações bem como a conversão do fluxo de calor envolvido nos experimentos em entalpia molar parcial de injeção 20 - AinjHo, foi feito automaticamente com o emprego do programa Microcal Origin 5.0, gerenciador do ITC. Antes do ajuste não linear, os dados calorimétricos foram subtraídos dos respectivos brancos. Na titulação do compostos foram obtidos dois domínios: um domínio no qual se tem formação de agregados iônicos com excesso de Ang-(l-7) e losartan e um segundo domínio no qual se tem a formação do 25 composto Losartanato de Ang-(l-7) na proporção molar 1:1.

O espectro de infravermelho obtido para o Losartan Potássico, Angiotensina-(l-7) e PID. As principais bandas são apresentadas na Tabela 1, sendo que as atribuições das freqüências de vibração foram feitas com base na literatura (1. Y. Maeda , N. Ogawa and Y.Takashima, J. Chem. Soc. Dalton 30 Trans., (1987) 627, 2. Sinisterra,R. D. Santos, R. A. S., Paula, W. Frézard, F. Preparação de formulações antagonistas dos receptores ATI usando as ciclodextrinas, seus derivados e os polímeros biodegradáveis para o tratamento da hipertensão arterial. INPI N° 0102252-0, 2001. 3. CAMPBELL, L, GORDON, C. Polymorphs of losartan and the process for the preparation of form II of losartan. Patente US5608075, 1995).

No espectro da Ang (1-7), podem ser identificadas bandas características de aminoácidos, como os estiramentos dos grupos C=O entre 1650 15 cm'1 1700 cm'1, estiramento das ligações [C = N} do anel da histidina e C = C do anel de tirosina entre 1400 cm1 e 1600 cm'1, assim como outras bandas de vibrações de anel, envolvendo os chamados movimentos de respiração do anel compostos de estiramentos e contrações (1500 cm1 a 1300 cm1). Na região entre 1000 cm1 e 1250 cm'1 são observados as bandas relativas aos modos de vibração 20 das ligações C-N de aminas alifáticas.

No espectro do PID verifica-se um afunilamento das bandas características dos estiramentos dos grupos O-H e N-H entre 3200 cm'1 e 3500 cm' ', bandas características de aminoácidos da Angiotensina-(l-7) com picos menos intensos. Verifica-se ainda o aparecimento de um novo pico largo na região de 25 1980-2000 cm'1, associados a estiramentos C=O após interação entre o losartan e a Ang-(l-7). Os estiramentos dos grupos C=O, entre 1650 cm'1 1700 cm'1, além do estiramento das ligações [C = N] do anel da histidina, e C = C do anel de tirosina entre 1400 cm'1 e 1600 cm1. São observadas bandas características do Losartan com picos um pouco mais intensos, e discretos deslocamentos químicos como 30 estiramento C-H entre 2900cm1 e 2800cm1, deformação C=C(aromático) entre 1400 e 1450 e estiramento e deformações do anel imidazólico em lOOOcrn1.

Análise Térmica

Analisando as curvas TGA obtido para o Losartan Potássico, Angiotensina-(l-7) e PID, verificam-se os sequintes eventos térmicos: a curva TG do Losartan apresenta três eventos térmicos de decomposição, os quais 5 correspondem primeiramente à perda de água (4,8 %) em torno de 100 °C, seguida por uma estabilidade térmica até 300 °C, seguido por uma perda de massa (31,2%) em torno de 350 °C, atribuída à decomposição parcial do Losartan e por último uma perda de massa (30 %) correspondente a uma segunda decomposição do Losartan.

A Angiotensina-(l-7) sofre duas perdas de massa na faixa de temperatura analisada(0 °C a 800 °C). A primeira perda de 35,72% ocorre na faixa de temperatura de 24,88 °C a 262,72 °C. A segunda perda de massa de 50,68% ocorre na faixa de temperatura 244,75 °C a 640,60 °C. Forma-se um resíduo de 13,81%.

A curva TG do composto formado pela interação da Angiotensina-(l-7) e

Losartan Potássico (PID) sofre três perdas de massa na faixa de temperatura analisada (0 °C a 800 °C). A primeira perda de 16,57% ocorre na faixa de temperatura de 34,32 °C a 301,34 °C. A segunda perda de massa de 33,09% ocorre na faixa de temperatura 301,34 °C a 581,29 °C e a terceira perda de massa 20 de 33,09% ocorre na faixa de temperatura 301,34 °C a 581,29 °C. Finalmente forma-se um resíduo de 18%.

DSC-DTA

A curva DSC correspondente ao composto formado pela interação da Angiotensina-(l-7) e Losartan Potássico (PID) apresenta um fenômeno de transição 25 de fase exotérmico a 242,91 °C. Na curva DSC da Angiotensina (1-7) são observados dois eventos endotérmicos relevantes correspondendo à fusão do peptídeo em 205,71° C, seguida da decomposição térmica em 286,28° C.

Já o Losartan apresenta polimorfismo, com duas formas denominadas I e II segundo (CAMPBELL, J., GORDON, C. Polymorphs of losartan and the process 30 for the preparation of form II of losartan. Patente US5608075, 1995). A forma II é obtida pelo aquecimento da formal. Analisando a curva DSC do Losartan, verifica- se um evento endotérmico em 239,5 °C, correspondente a uma mudança de fase ocorrida com a forma I, obtendo assim a forma II, o que confirma o polimorfismo citado. Em seguida, há um pico endotérmico em 272,6 °C, atribuído à fusão do Losartan, e a seguir dois picos exotérmicos indicando o processo de 5 termodecomposiçao final do Losartan.

Difratometria de raios-X de pó

Analisando o difratograma de raios-X do Losartan, verifica-se que este se apresenta como um composto cristalino, com um ligeiro halo de amorficidade em torno de 20-30° 20, que apresenta comportamento semelhante à forma polimórfica 10 (CAMPBELL, J., GORDON, C. Polymorphs of losartan and the process for the preparation of form II of losartan. Patente US5608075, 1995).

Ressonância Magnética Nuclear de ’H Analisando os espectros de RMN de 'H da Angiotensina (1-7) obtido em D2O e do Losartan Potássico obtido em D2O e do composto formado pela interação 15 da Angiotensina-(l-7) e Losartan Potássico (PID), bem como as expansões do espectro do composto PID nas regiões de δ 6.6 a 8.2 e de δ 0.76 a 5.23, verifica-se claramente picos correspondentes a Ang-(l-7) e do Losartan e deslocamentos químicos após sua interação.. De posse dos resultados obtidos pode-se concluir a obtenção do pró-fármaco Losartanato de Ang-(l-7) (PID), resultante da interação 20 entre o losartan Potássico e, a Ang-(l-7). Os deslocamentos químicos do da Ang- (1-7) e losartan estão apresentados na Tabela 2 e 3 respectivamente, com o intuito de comparação com os deslocamentos observados para o pró-fármaco PID. Tabela 2- Deslocamentos químicos de para o Angiotensina-(l-7) em D2O:

Exemplo 2: Protocolo de preparação de PAD: (Losartan + Ang-(l-7) Arginina), como exemplo não limitante:

O Composto (PID) losartanato de Ang-(l-7) foi pesado e colocado então em 10 um béquer ao qual acrescentou-se alguns mL de água Milli-Q, como esse composto é insolúvel em água observou-se uma solução turva com partículas em suspensão. Adicionou-se a essa solução, sob agitação, L-arginina em uma proporção molar 4:1:1 (L-arginina:Losartan:Angiotensina-( 1-7)), e observou-se um clareamento total da solução, o que indicou a solubilidade do composto após interação com L- 15 arginina. A solução final foi acondicionada em tubos eppendorfs, e congelados em nitrogênio líquido e submetidos ao processo de liofilização por 24 horas. O composto foi chamado de PAD e foi submetido a caracterização físico-química.

Analisando a curva TG do composto PAD verifica-se que a mesma é termicamente mais estável quando comparado com a Ang-(l-7) e menos estável do 20 que o losartan livre e arginina, resultado esse que sugere o papel modulador da arginina na formulação do composto PID. Na curva DSC da formulação PAD verificam-se as transições de fase do composto PID losartanato de Ang-(l-7) em 122 e 209 °C respectivamente, bem como os eventos endotérmicos da arginina, em 96, 212 e 240 °C, sugerindo que mesmo no estado sólido não há um interação entre 25 a arginina e o composto PID.

O espectro infravermelho do composto PAD mostra um alargamento da banda NH na região de 3400-3000 cm1, devido a formação de ligações de hidrogênio entre o aminoácido arginina e o composto PID. Não foram observados deslocamentos químicos apreciáveis quando comparado ao composto PID, isto c. reforça a hipótese que a arginina só tem um efeito modulador na solubilidade do composto.

O espectro delH do composto PAD, sugere a presença do composto losartanato de Ang-(l-7) em menor proporção, pela alta quantidade de arginina que foi colocada no composto com o intuito de aumentar a solubilidade do composto, aumentar a biodisponibilidade e aumentar a atividade anti-hipertensiva, uma vez que é conhecido no estado da técnica que arginina é um agente vasodilatador. Assim pela primeira vez é descrito no estado da técnica o uso da arginina nesse tipo de composto como o losartanato de Ang-(l-7).

Exemplo 3. Protocolo de preparação de HPA: (Losartanato de Ang-(l-7) + Arginina + HPβCD):

O composto (PID) foi pesado e colocado então em um béquer ao qual acrescentou-se alguns mL de água Milli-Q, como esse composto é insolúvel em água observou-se uma solução turva com partículas em suspensão. A essa solução foi adicionado, sob agitação, L-arginina em uma proporção molar 4:1:1 (L- arginina: Losartan :Angiotensina-( 1-7)), e observou-se um clareamento total da solução, o que indicou a solubilidade do composto após interação com L-arginina. Ainda a essa solução acrescentou-se HPβCD (hidroxi-propil-β ciclodextrina) em uma proporção 1:1:1 (HPβCD:Losartan:Angiotensina-(1-7)) no intuito de incluir o composto formado anteriormente. A solução final foi colocada em tubos eppendorfs e congelados em nitrogênio líquido e submetidos a liofilização por 24 horas. O composto foi denominado de HPA, e foi feita a caracterização físico-química.

No espectro infravermelho do composto HPA verifica-se uma diminuição de intensidade dos picos associados aos grupos C=O na região do 1500-1600 cm1, na região de 1400-1500 cm1 região associada aos grupos aromáticos da tirosina e do losartan. Verifica-se a presença da HP-β-ciclodextrina pelo aparecimento do pico em 1100 cm’1 associada ao grupo C-O-C, observa-se também o afilamento desse grupo junto com os estiramentos OH da ciclodextrina em 3300 cm’1. Finalmente observa-se pico largo na região de freqüência menor do que 500 cm’1, sugerindo um aumento da solubilidade do composto. O espectro !H do HPA não apresentou grandes mudanças quando comparado ao composto PAD, sugerindo interações fracas entre esse composto e a ciclodextrina.

Analisando a curva TG do composto HPA verifica-se um aumento da estabilidade térmica quando comparado ao composta PAD, reforçando a hipótese 5 do aumento das forças intermoleculares, tais como ligações de hidrogênio entre o composto PAD e a ciclodextrina. Esse resultado é muito importante pela estabilização térmica do peptídeo após a inclusão. Na curva DSC não foram observadas eventos térmicos característicos do composto PAD, isto talvez devido a grande estabilização térmica do mesmo após inclusão na ciclodextrina, como 10 verificado na curva TG. Esse resultado assemelha-se muito a curva DSC da HP-β- ciclodextrina. O espectro *H do HPA não apresentou grandes mudanças quando comparado ao composto PAD, sugerindo interações fracas entre esse composto e a ciclodextrina.

Exemplo 4. O presente exemplo apresenta o teste anti-hipertensivo dos 15 compostos PID, PAD, HPA e suas formulações usando os polímeros biodegradáveis, na forma micro ou nanoparticulados.

Registro de pressão arterial por telemetria: Animais Foram utilizados ratos machos, espontaneamente hipertensos (SHR) com 20 idade inicial de 14-16 semanas, provenientes do Centro de Bioterismo (CEBIO). Os animais foram mantidos com acesso livre à alimentação e água e foram submetidos a um ciclo luz-escuro (12 horas cada).

Preparação e Cuidados Pré-cirúrgicos: Os ratos foram adaptados por duas semanas antes da cirurgia em 25 caixas de polipropileno (45 cm de comprimento x 32 cm de largura x 17 cm de altura) na sala de telemetria, isolada, com temperatura ambiente controlada (aproximadamente 23° C) e com ciclo claro-escuro de 12hs (dia - 06:00 Hs às 18:00 Hs; noite - 18:00 Hs às 6:00 Hs), controlado por um timer. A ração dos animais foi retirada na noite anterior ao dia da cirurgia para facilitar o 30 procedimento cirúrgico. Todo o material cirúrgico foi auto-clavado. A área para o procedimento cirúrgico foi isolada e o cirurgião e assistente utilizaram máscara cirúrgica, luva e avental.

Procedimento cirúrgico: Após anestesia com tribromoetanol (0.25g / Kg de peso corporal), era feita 5 tricotomia da região abdominal e assepsia local. Após ajuste do campo cirúrgico, era feita incisão mediana no abdômen de 4 a 6 cm e implante do cateter transdutor na aorta abdominal. Após a cirurgia, foi administrado pentabiótico veterinário (0.1 ml) por via intramuscular (i.m.). O registro de parâmetros cardiovasculares foi iniciado 10-12 dias após a cirurgia de implante do cateter sensor. A coleta de dados 10 foi feita por 10 segundos a cada 10 minutos, por 24 horas durante toda a duração do estudo.

Registro de parâmetros cardiovasculares Os registros dos parâmetros cardiovasculares, pressão arterial média (PAM) e freqüência cardíaca (FC) foram obtidos por um sistema de aquisição de dados por 15 telemetria (Data Science International). Este sistema de monitoramento consiste de 4 elementos básicos: (A) um cateter-sensor (modelo - TA11PA-C40) que era inserido na aorta abdominal do animal para a captação, processamento e transmissão da pressão arterial pulsátil; (B) uma placa receptora de sinal (RPC-1); (C) um multiplexador que recebia o sinal de várias placas receptoras e os enviava 20 para (D) o sistema de aquisição de dados propriamente dito que coletava, armazenava e analisava os dados através de um software específico, ART-Gold v. 2.0. A PAM e FC foram calculadas pelo software a partir da pressão arterial pulsátil, coletada continuamente. A cada 10 min, durante cada período de 24 h, a média aritmética dos valores de PAM e FC, coletados por 10 segundos, era 25 armazenada no disco rígido do PC, de maneira que foram obtidas 72 medidas de cada parâmetro, por animal a cada 24h.

Protocolo experimental: Drogas e administração A droga foi pesada e diluída imediatamente antes da sua administração. As 30 doses escolhidas para a administração, em doses únicas diárias, por via oral foram o equivalente a Img/ Kg/ dia de Losartan.

Telemetria Os efeitos cardiovasculares agudos da administração do composto LA de foram determinados. O ensaio agudo se resumiu a um período de registro de 48 horas por telemetria e teve por objetivo obter informações preliminares importantes 5 sobre os efeitos cardiovasculares e a dose, para serem testados em experimentos de maior duração.

Ratos espontaneamente hipertensos (SHR, n = 2) foram instrumentados para registro telemétrico de parâmetros cardiovasculares, conforme a descrição anterior. O ensaio realizado em um período de 2 dias consistiu em 3 horas de 10 coleta controle, seguidos de administração oral do composto efetuada entre 14 hs e 14:30 hs da tarde, e o período de recuperação de até 24 horas. Para referência foi usada coleta do dia anterior ao experimento, no mesmo período do dia. Foi realizado 1 (um) experimento para completar o número de animais necessário para o um dado preliminar (n=2).

Resultados

A administração do composto teste reduziu a PAM nos ratos SHR ratos (p< 0,0001 em comparação com o período controle) à partir de 30 minutos. O valor máximo da queda na PAM (- 24 mmHg) foi observado após 5 horas e o efeito obtido foi mantido por 12 horas após a administração do composto teste. Em contraste a 20 administração de losartan isoladamente produziu queda da PAM de -10 mmHg com horas da administração. Esse efeito durou por 12 horas.

Exemplo 5. Este exemplo descreve a preparação de microsferas e nanoesferas de losartanato de Ang-(l-7) em PLGA, como exemplo não limitante e a liberação prolongada do mesmo.

Partículas poliméricas foram preparadas, a partir de co-polímeros do ácido lático e glicólico (PLGA 50:50), pelo método da emulsão múltipla A/O/A com posterior evaporação do solvente [Jeffery et al. Int. J. Pharm. 77:169-175 (1991)]. Tal método foi empregado para o encapsulamento de Ang-(l-7) com as seguintes etapas. 100 mg de polímero PLGA (50:50 p/p) foi dissolvido em 1 mL de 30 diclorometano. Em seguida, foi adicionado 1,8 mg de Ang-(l-7), previamente dissolvido em 200 μL de água desionizada, e a mistura foi submetida à sonicação para obtenção de uma emulsão água/óleo (A/O). A emulsão A/O resultante foi adicionada à 50 mL de uma solução de PVA 1 % (p/v) em água desionizada. A mistura foi submetida à sonicação (5000 rotações/minuto) por aproximadamente 1 minuto. Deste modo é formado a segunda emulsão água/óleo/água (A/O/A). A 5 emulsão foi mantida em agitação constante por 2 horas em temperatura ambiente para evaporar o diclorometano. Em seguida, as microesferas ou nanoesferas formadas foram submetidas à 3 ciclos de centrifugação/lavagem com água desionizada. As microesferas foram então liofilizadas e armazenadas em -20oC. Para se determinar a quantidade de peptídeo incorporada, o peptídeo foi 10 extraído das partículas poliméricas depois da dissolução do polímero em diclorometano. A dosagem do peptídeo foi realizada por radioimunoensaio [Neves et al., Biochem. Pharmacol. 50:1451-1459 (1995)]. A quantidade incorporada foi de 1,9 mg peptídeo por g de microesferas ou nanoesfera o que representa um percentual de incorporação de 15 %.

A cinética de liberação do peptídeo foi avaliada após resuspensão das microesferas ou nanoesferas em solução salina tamponada (pH 7,2) e incubação em 37°C. Essas condições experimentais representam condições fisiológicas modelo. O peptídeo liberado foi dosado por radioimunoensaio nos intervalos de 8 h, 24 h e 48 h. A percentagem de peptídeo liberado das microesferas em condições fisiológicas 20 modelo foi aproximadamente 60% em 8 h e cerca de 90% em 48 h.

Portanto, esse exemplo ilustra a capacidade das microesferas ou nanoesferas poliméricas incorporarem o losartanato de Ang-(l-7) e promoverem uma liberação prolongada do mesmo.

Claims (9)

1. Processo de preparação de compostos entre antagonistas do receptor ATI e Ang-(1-7) caracterizado por compreender: a. Reagir em meio aquoso o composto antagonista do receptor AT1 e Ang-(1-7) em temperatura ambiente sob proteção contra luz para preparar o complexo; b. Filtrar a vácuo para remover o produto obtido.

2. Processo de preparação de compostos entre antagonistas do receptor ATI e Ang-(1-7), de acordo com a reivindicação 1, etapa “a”, caracterizado pelo antagonista do receptor AT1 ser o sal de losartan, ou seu metabolito ativo EXP-3174, nas proporções molares 1:1 ou 2:1 entre losartan:Ang-(1-7).

3. Processo de preparação de compostos entre antagonistas do receptor ATI e Ang-(1-7), de acordo com a reivindicação 1, etapa “a”, caracterizado pela reação de soluções aquosas entre os sais de losartan, ou soluções do composto EXP-3174, e a Ang-(1-7) nas proporções molar 1:1 e 2:1, losartan:Ang-(1-7), formando o losartanato de Ang(1-7).

4. Processo de preparação de compostos entre antagonistas do receptor ATI e Ang-(1-7), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela formação do composto de inclusão de suspensões aquosas de losartanato de Ang-(1-7) e soluções aquosas de ciclodextrinas, na proporção molar desde 1:1 até 1:10, losartanato de Ang-(1-7):ciclodextrina.

5. Processo de preparação de compostos entre antagonistas do receptor ATI e Ang-(1-7), de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela produção de composição farmacêutica compreendendo o losartanato de Ang-(1-7) e seus compostos de inclusão com ciclodextrinas e excipientes farmacológica ou farmacêuticamente aceitáveis.

6. Processo de preparação de compostos entre antagonistas do receptor ATI e Ang-(1-7), de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela composição farmacêutica compreender o aminoácido arginina nas proporções de 1:1 até 1:10, losartanato de Ang- (1-7):arginina.

7. Processo de preparação de compostos entre antagonistas do receptor ATI e Ang-(1-7), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo uso do composto losartanato de Ang-(1-7) para o preparo de medicamentos para doenças cardiovasculares, renais, reprodutivas, dermatológicas, neoplásicas, sanguíneas e cerebrais.

8. Processo de preparação de compostos entre antagonistas do receptor ATI e Ang-(1-7), de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo uso do composto losartanato de Ang-(1-7) e seus compostos de inclusão com ciclodextrinas para o preparo de medicamentos para doenças cardiovasculares, renais, reprodutivas, dermatológicas, neoplásicas, sanguíneas e cerebrais.

9. Composições farmacêuticas, conforme definidas na reivindicação 5, caracterizadas por conter o losartanato de Ang-(1-7) e seus compostos de inclusão com ciclodextrinas, na proporção molar desde 1:1 até 1:10, losartanato de Ang-(1-7):ciclodextrina.