CN105288653A - 一种两亲性寡聚多肽药物结合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种两亲性寡聚多肽药物结合物，本发明将药物通过化学结构上的羟基或氨基直接与寡聚多肽C端的羧基缩合形成酯键或酰胺键，或者药物通过化学结构上的羧基与寡聚多肽N端的氨基缩合形成酰胺键，或者药物通过一定的链接分子与寡聚多肽结合。本发明以安全性高的氨基酸制备的寡聚多肽为主要构筑材料，与抗癌药物偶联，制备为寡聚多肽药物结合物，与传统的制剂相比，由于药物与载体材料直接结合，具有安全性好、载药量高的优点，进入体内后可以长时间发挥药效的作用。

Description

一种两亲性寡聚多肽药物结合物

技术领域

本发明属于多肽自组装领域，特别涉及一种安全性高的氨基酸制备的寡聚多肽用作主要构筑材料，与抗肿瘤药物偶联，制备为寡聚多肽药物结合物(Amphiphilicpeptidedrugconjugate：APD)。

背景技术

在我国，肝癌在各类肿瘤的年发病率中位居第三，达25.7/10万人，因肝癌死亡人数达23.7/10万人，是危害我国人民健康的重大疾病之一。由于肝癌患者常并发肝纤维化，难以实施手术切除，故常用放化疗进行治疗。动脉栓塞是临床上常用的肝癌化疗手段，可在阻断肿瘤组织血液供应同时实现化疗药物的局部蓄积。然而，由于肝门静脉血供的存在以及肿瘤部位血管组织和枝化状况的高度紊乱，动脉栓塞难以完全阻断肝癌部位的血液供应，而化疗药物的低选择性导致药物在杀伤肿瘤细胞同时损害正常肝组织，导致肝功能损伤进一步加剧。此外，肝癌细胞膜多药耐药蛋白(如P-糖蛋白)表达较高，能将各种抗肿瘤药物(也包括分子靶向药物，如索拉非尼)从胞内转运至胞外，表现出天然的耐药特性，且化疗药物可诱导这些蛋白的表达，进一步加剧肝癌细胞耐药能力，降低药物的治疗效果。因此，如何实现化疗药物的精确性给药，并克服肝癌细胞的天然耐药性是肝癌治疗的重要研究方向。

阿霉素具有良好的体外抗肿瘤活性，然而其临床应用往往受限于其载体和药物本身蓄积于非病灶部位所带来的严重副作用。有鉴于此，通过共价键或非共价键修饰方式改善其体内药物动力学行为的研究已成为抗肿瘤药物研发的热点之一。

选择性地使用大剂量抗肿瘤药物杀灭肿瘤，是抗肿瘤治疗追求的目标。由于实体肿瘤生长过程存在着血管供应相对较少、间质张力高、血液灌注不良等生理特征，使实体肿瘤在生长过程中受到一定的制约，但也给肿瘤的药物治疗带来了一定的困难。常规的全身性系统化疗往往无法在肿瘤组织中达到有效的药物浓度，要提高肿瘤组织中药物浓度必须加大药物剂量，而传统意义上的抗肿瘤药都具有一定的全身毒副作用，加大药物剂量势必使病人不能耐受，长时间化疗还会产生肿瘤耐药等问题。还有的肿瘤组织所在的脏器与人体的内环境之间存在着一些屏障，如血脑屏障等，故即使进行区域性动脉灌注化疗，有时也不一定能达到有效疗效。但是如果在肿瘤内直接注射抗肿瘤药，就有可能克服现有化疗方法的许多不足之处。

目前许多人认为抗肿瘤药物持续性静脉滴注疗效好于静脉推注，即理想的用药方法是使抗肿瘤药以一定的浓度和时间在肿瘤组织内充分发挥作用，同时减少毒副作用。并且随着现代医学的发展，先进的医疗仪器和医疗诊断技术的不断提高，都为肝癌的瘤内注射治疗提供了有利的条件支持。

发明内容

本发明的目的在于解决现有药物抗肿瘤制剂不足的问题，提供一种载药量高、生物相容性好、在病变部位驻留时间长的两亲性寡聚多肽药物结合物，该两亲性寡聚多肽药物结合物能够在疏水作用、氢键和静电作用的引导下，在溶液中自发形成高度有序的纳米结构，且随着环境的变化可以进一步形成凝胶。

技术方案：为了达到以上目的，本发明采取的技术方案如下：

一种两亲性寡聚多肽药物结合物，药物通过化学结构上的羟基或氨基直接与寡聚多肽C端的羧基缩合形成酯键或酰胺键，或者药物通过化学结构上的羧基与寡聚多肽N端的氨基缩合形成酰胺键，或者药物通过一定的链接分子与寡聚多肽结合。

作为优选方案，以上所述的两亲性寡聚多肽药物结合物，所述的药物为阿霉素，紫杉醇及其衍生物。

作为优选方案，以上所述的两亲性寡聚多肽药物结合物，所述的寡肽含有5种氨基酸，分别为芴甲氧羰酰基保护的赖氨酸，甘氨酸，苯丙氨酸，精氨酸和色氨酸。

作为优选方案，以上所述的两亲性寡聚多肽药物结合物，其特征在于，所述的氨基酸的数目为5个。

本发明所述的种两亲性寡聚多肽药物结合物，优选如下结构如：Dox-Fmoc-KGFRWR(阿霉素-芴甲氧羰酰基保护的赖氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸)可以很好的形成纤维，进一步形成凝胶。作为优选方案，以上所述的两亲性寡聚多肽药物结合物，所述的两亲性寡聚多肽药物结合物能够自组装形成纤维或形成凝胶。

一种肿瘤原位注射制剂，它含有本发明所述的两亲性寡聚多肽药物结合物。

本发明提供的肿瘤原位注射制剂，所述寡聚多肽药物结合物能够在体内发生缓慢降解，释放药物发挥药效。

本发明所述的肿瘤原位注射制剂，所述寡聚多肽药物结合物能够用于实体瘤原位注射。

本发明的另一目的在于提供本发明所述的两亲性寡聚多肽药物结合物在制备具有抗肿瘤药物中的应用，如用于制备治疗实体瘤药物中的应用。

本发明的另一目的在于提供本发明所述的原位制剂在制备抗肿瘤药物中达到缓释长效治疗肿瘤的应用。

本发明另一个发明目的在于提供寡聚多肽药物结合物的制备方法。

有益效果：本发明提供的寡聚多肽药物结合物及其制备方法和现有技术相比具有以下优点：

(1)本发明的制备方便快捷、操作简单和产率较高。

(2)本发明以安全性高的氨基酸制备的寡聚多肽为主要构筑材料，与抗肿瘤药物偶联，制备为寡聚多肽药物结合物，具有结构稳定，载药量高，且均匀可控等特点。

(3)本发明提供了一种利用新型多肽药物结合物自组装构建纳米凝胶，丰富了肿瘤原位注射的制剂的种类。

附图说明

图1为实施例1制备的Dox-Fmoc-KGFRWR的结构式。

图2为实施例1制备的Dox-Fmoc-KGFRWR高效液相色谱图。

图3为实施例1制备的Dox-Fmoc-KGFRWR质谱图。

图4为实施例2中Dox-Fmoc-KGFRWR建立的标准曲线。

图5为实施例3中Dox-Fmoc-KGFRWR在不同pH值下自组装的透射电镜显微镜检测图。

图6为实施例4中Dox-Fmoc-KGFRWR在不同pH值下对自组装体电位的影响。

具体实施方式

实施例1：由芴甲氧羰酰基保护的赖氨酸，甘氨酸，苯丙氨酸，精氨酸以及色氨酸和抗肿瘤药物阿霉素制备两亲性寡聚多肽药物结合物(Dox-Fmoc-KGFRWR:阿霉素-芴甲氧羰酰基保护的赖氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸)

1、材料

用芴甲氧羰酰基(Fmoc)和4-甲基-三苯甲基(Mtt)保护的赖氨酸(K)、叔丁氧羰基(Boc)保护的甘氨酸(G)、Boc保护的苯丙氨酸、Boc保护的精氨酸以及色氨酸、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC、99％)、1-羟基苯并三唑(HOBt、99％)、2-(1H-苯并三唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU、99％)、N,N-二甲基氨基吡啶(DMAP、99％)、9-芴甲氧羰基(Fmoc、99％)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA、99％)、三异丙基硅烷(TIS)、(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基六氟磷酸盐(PyAOP)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF、99％)、吡啶、哌啶、乙酸酐、茚三酮、王树脂，乙腈，三氟乙酸(TFA)，甲醇，1％氨水溶液

2、制备方法

利用常规的固相合成方法，进行寡聚多肽的合成，然后再偶联药物。具体如下：

COOH-Fmoc-KGFRWR(阿霉素-芴甲氧羰酰基保护的赖氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸)的合成：

用9-芴基(Fmoc)固相肽来合成所述KGFRWR序列(Fmoc-K(MTT)GFRWR-Rink)，合成量为0.25mmol。这些程序都是使用FocusXC自动肽合成仪(AAPPTEC)完成的。从KGFRWR序列基(Fmoc-K(NH2)GFRWR-Rink)除去MTT保护基团，脱保护用3：5:92比例的TFA/TIS/DCM的混合液振摇5分钟脱去MTT，并且过程重复两次。将赖氨酸的一端氨基转化成羧酸形式，在DMF中加入1.25mmol的琥珀酸酐和1.6mmol的DIEA与0.25mmol的多肽进行反应，室温下振摇过夜。反应均通过游离胺的茚三酮试验监测。用比例为95:2.5:2.5的TFA/TIS/H2O的混合液振摇3小时将COOH-Fmoc-KGFRWR肽从树枝上切断。通过旋转蒸发以及加冷乙醚沉淀得到粗肽除去过量的TFA。将沉淀的粗肽和乙醚用离心法(6000rpm下1分钟)，将乙醚溶液弃去得到分离的组肽。以除去尽可能多的TFA为目的，在洗涤步骤通过加入20毫升乙醚加入到粗肽，摇动以及并离心。该过程重复3次。所有离心管用封口膜密封，以尽量减少乙醚在高速离心期间蒸发。

Dox-Fmoc-KGFRWR的合成：

将COOH-Fmoc-KGFRWR(0.18mmol)首先溶解于500uL的无水DMF中，再加入盐酸阿霉素(100mg，0.184mmol)，PyAOP(134毫克，0.257mmol)和DIEA(72uL，0.41mmol)加入到该肽溶液。将反应混合物用磁力搅拌器棒避光搅拌2天。用制备液相纯化得到产物，其结构式如图1所示，其中Dox-Fmoc-KGFRWR的氨基酸序列为SEQIDNO.1。并通过ESI-MS和HPLC鉴别分析。

将实施例1制备的Dox-Fmoc-KGFRWR利用高效液相色谱(HPLC)检测，参见图2，由图2中的谱峰面积可计算其纯度已达到90％以上。将实施例1制备的Dox-Fmoc-KGFRWR采用质谱(ESI-MS)检测，参见图3，说明其分子量为1696是正确的。

实施例2：Dox-Fmoc-KGFRWR的标准曲线的建立

取实施例1制备的Dox-Fmoc-KGFRWR配制成1mg/ml的母液，逐级稀释为5、10、50、100、250、500ug/ml进高效液相(HPLC)记录峰面积，绘制标准曲线，参见图4。

实施例3：Dox-Fmoc-KGFRWR在不同pH值下自组装的透射电镜显微镜(TEM)检查

(1)盐酸和氢氧化钠溶液调节水溶液的pH值分别为3、7，备用。称取实施例1的Dox-Fmoc-KGFRWR适量加入配好的不同pH值的溶液中制成500uM的溶液，静置约数天。

(2)首先，将配制好的待测样品滴加在400目的铜网上，片刻用，镊子取出铜网，滤纸吸去多余液体，将铜网放在磷钨酸染色剂上染色约90s，用镊子取出铜网后将多余的液体用滤纸吸掉，放置晾干，准备实验，用透射电子显微镜观察其成像的情况，参见图5，左至右分别为pH3和pH7下的电镜图，在pH3的酸性条件下，两亲性寡聚多肽药物结合物未能很好的自组装，未见纤维的存在，而在pH7的条件下，可以看见形成了很明显的柔性较强的纤维。

实施例4：Dox-Fmoc-KGFRWR在不同pH值下自组装体电位的变化

用盐酸和氢氧化钠溶液调节水溶液的pH值分别为3、5、7、9、11，备用。称取实施例1制备得到的Dox-Fmoc-KGFRWR适量，加入配好的不同pH值的溶液中制成溶液，静置约数天。取其中的1ml放入测电位的容器中，用马尔文粒径仪测定三次，取平均值。参见图6。图6可以得到当pH为10左右时，两亲性寡聚多肽药物结合物的电位为0，这个时候说明其是电中性的。

实施例5

取本发明实施例1制备得到的Dox-Fmoc-KGFRWR按药学常规方法制备成注射剂，用于实体瘤原位注射，实验结果表明，对肝癌细胞具有很好的抑制作用。

SEQUENCELISTING

<110>南京中医药大学

<120>一种两亲性寡聚多肽药物结合物

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

LysGlyPheArgTrpArg

15

Claims (9)

1.一种两亲性寡聚多肽药物结合物，其特征在于，药物通过化学结构上的羟基或氨基直接与寡聚多肽C端的羧基缩合形成酯键或酰胺键，或者药物通过化学结构上的羧基与寡聚多肽N端的氨基缩合形成酰胺键，或者药物通过一定的链接分子与寡聚多肽结合。

2.根据权利要求1所述的两亲性寡聚多肽药物结合物，其特征在于，所述的药物为阿霉素、紫杉醇及其衍生物。

3.根据权利要求1所述的两亲性寡聚多肽药物结合物，其特征在于，所述的寡聚多肽含有5种氨基酸，分别为芴甲氧羰酰基保护的赖氨酸，甘氨酸，苯丙氨酸，精氨酸和色氨酸。

4.根据权利要求3所述的两亲性寡聚多肽药物结合物，其特征在于，所述的氨基酸的数目为5个。

5.根据权利要求1所述的两亲性寡聚多肽药物结合物，其特征在于，两亲性寡聚多肽药物结合物能够自组装形成纤维或形成凝胶。

6.一种肿瘤原位注射制剂，其特征在于，它含有权利要求1-4任一项所述的两亲性寡聚多肽药物结合物。

7.根据权利要求6所述的肿瘤原位注射制剂，其特征在于，所述寡聚多肽药物结合物能够在体内发生缓慢降解、释放药物发挥药效。

8.根据权利要求6所述的肿瘤原位注射制剂，其特征在于，所述寡聚多肽药物结合物能够用于肿瘤原位注射。

9.权利要求1～5任一项所述的两亲性寡聚多肽药物结合物在制备治疗实体瘤药物中的应用。