BRPI0721384A2

BRPI0721384A2 - peptÍdeos de trÂnsito de cloroplasto para objetivaÇço eficiente de dmo e usos dos mesmos

Info

Publication number: BRPI0721384A2
Application number: BRPI0721384-0A
Authority: BR
Inventors: Paul C C Feng; Marianne Malven; Stanislaw Flasinski
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2007-02-26
Filing date: 2007-06-06
Publication date: 2013-02-26
Also published as: IL217482A0; AP2014008058A0; AP2014008059A0; CA2883869C; US8791325B2; US20120151620A1; CN102337275B; CA2883869A1; IN2014CN03433A; CA3014137A1; IL200567A0; CN103361363A; US20110126307A1; AU2007347770B2; CN102321632A; WO2008105890A3; EP2527453A2; IL217483A0; US8084666B2; IN2014CN03434A

Abstract

PEPTÍDEOS DE TRÂNSITO DE CLOROPLASTO PARA OBJETIVAÇçO EFICIENTE DE DM0 E USOS DOS MESMOS. A presente invençáo refere-se à identificação e uso de determinados peptideo de trânsito de cloroplasto para processamento e localização eficientes de enzima mono-oxigenase de dicamba (DM0) em plantas transgênicas. Métodos para produção de plantas tolerantes à dicamba, métodos para controle de crescimento de ervas daninhas e métodos para produção de alimento, ração e outros produtos também são proporcionados, bem co- mo uma semente que confere tolerância à dicamba quando ele é aplicado pré- ou pós-emergência.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PEPTÍDEOS DE TRÂNSITO DE CLOROPLASTO PARA OBJETIVAÇÃO EFICIENTE DE DMO E USOS DOS MESMOS".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O presente pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisório U.S. Número de Série 60/891.675, depositado em 26 de fevereiro de 2007 e Pedido de Patente U.S. Número de Série 11/758.659, depositado em 5 de junho de 2007, as divulgações dos quais são aqui incorporadas por referência em sua totalidade. Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao campo de biotecnologia de planta. Mais particularmente, a presente invenção refere-se à identificação e uso de peptídeos de trânsito de cloroplasto que permitem processamento e localização eficiente de enzimas mono-oxigenase de dicamba em plantas. Descrição da Técnica Relacionada

DMO (mono-oxigenase de dicamba) catalisa a degradação do herbicida dicamba (ácido 3,6-dicloro-o-anísico) em ácido 3,6- diclorossalicílico (3,6-DCSA) não-tóxico em plantas, assim, conferindo tole- rância ao herbicida. A atividade de DMO requer duas proteínas intermediá- rias para embaralhamento de elétrons a partir de NADH em dicamba, uma reductase e uma ferredoxina (Patente U.S. 7.022.896; Herman e outros, 2005). Contudo, a tolerância ao dicamba em plantas transgênicas tem sido demonstrada através de transformação com DMSO apenas, indicando que uma reductase e ferredoxina endógenas de planta podem substituir o emba- ralhamento de elétrons. A ferredoxina de planta que está envolvida em trans- ferência de elétrons está localizada nos plastídeos. Assim, de forma a obter desempenho eficiente de DMO e, assim, tolerância aperfeiçoada ao dicam- ba, há uma necessidade pela objetivação de DMO aos cloroplastos.

Em muitos casos, essa objetivação pode ser obtida pela presen- ça de uma extensão N-terminal, denominada um peptídeo de trânsito de clo- roplasto (CTP) ou peptídeo de trânsito em plastídeo. Transgenes cromos- sômicos de fontes bacterianas devem ter uma seqüência que codifica uma seqüência de CTP fundida a uma seqüência que codifica um polipeptídeo expresso se o polipeptídeo expresso tem de ser compartimentalizado no plastídeo de planta (por exemplo, cloroplasto). Consequentemente, a locali- zação de um polipeptídeo exógeno a um cloroplasto é, freqüentemente, rea- Iizada por meio de operavelmente ligar uma seqüência polinucleotídica que codifica uma seqüência de CTP à região 5' de um polinucleotídeo que codifi- ca o polipeptídeo exógeno. O CTP é removido em uma etapa de processa- mento durante translocação para o plastídeo. A eficiência de processamento pode, contudo, ser afetada pela seqüência de aminoácido do CTP e sequên- cias vizinhas no término NH2 do peptídeo.

Weeks e outros (Patente U.S. 7.022.896) descrevem o uso po- tencial de uma seqüência sinalizadora cab-m7 de milho (veja Becker e ou- tros, 1992 e PCT WO 97/41228; Acesso ao Banco de genes N0. X53398) e uma seqüência sinalizadora de reductase de glutationa de ervilha (Creissen e outros, 1992 e PCT WO 97/41228) na objetivação de DMO a plastídeos de planta, mas nenhum dado sobre a eficiência de processamento ou objetiva- ção é fornecido. Um CTP de pequena subunidade Rubisco de ervilha (RbcS) incluindo uma seqüência de 27 aa incluindo a seqüência de codificação para a pequena subunidade da enzima Rubisco de ervilha também foi usado para objetivar DMO aos cloroplastos (veja, por exemplo, Ped. Prov. U.S. N°. de Sér. 60/811.152). Contudo, durante análise de Western blot, descobriu-se que esse CTP de RbcS de ervilha gera uma banda de proteína de DMO cor- retamente processada (-38 kDa), mas também uma banda maior (-41 kDa) correspondendo àquela de DMO e os 27 aa da região de codificação de RbcS. Os aminoácidos extra poderiam ter um impacto adverso sobre a ativi- dade de DMO. Além disso, proteínas extra em um produto transgênico em virtude de processamento incompleto de DMO criam obstáculos regulatórios e requerem esforços adicionais na caracterização do produto para fins de registro de produto por agências governamentais, desse modo, elevando o custo de registro do produto. Assim, há uma necessidade pela identificação de CTPs que geram eficazmente DMO corretamente processado, desse modo, proporcionando a vantagem de atividade completa de DMO, bem co- mo facilidade de caracterização de produto. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um aspecto da invenção refere-se a uma molécula de DNA re- combinante compreendendo uma seqüência nucleotídica que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto operavelmente ligada a uma seqüência nucleotídica que codifica mono-oxigenase de dicamba, em que a seqüência nucleotídica codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto compreendendo uma seqüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1-11. Em determinadas modalidades, a molécula de DNA recombinante compreende uma seqüência nucleotídica selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 12-22. Em determinadas modalidades, a molécula de DNA recombi- nante compreende uma seqüência nucleotídica que codifica mono- oxigenase de dicamba selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 e 40. Um construto de DNA compreendendo a molécula de DNA operavelmente ligada a um promotor o qual é funcional em uma célula de planta também é um aspecto da invenção.

Em outro aspecto, a invenção compreende uma célula de planta transformada com uma molécula de DNA compreendendo uma seqüência nucleotídica que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto operavel- mente ligada a uma seqüência nucleotídica que codifica mono-oxigenase de dicamba, em que a seqüência do peptídeo de trânsito de cloroplasto é sele- cionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1-11. Em determinadas mo- dalidades, a molécula de DNA recombinante compreende uma seqüência nucleotídica selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 12-22. Em determinadas modalidades, a molécula de DNA compreende uma seqüência nucleotídica que codifica uma mono-oxigenase de dicamba selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 e 40, em que a molécula de DNA é operavelmente ligada a um promotor o qual é fun- cional em uma célula de planta. Em modalidades particulares, a molécula de DNA compreende uma seqüência nucleotídica selecionada do grupo consis- tindo em SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 e 39.

Em determinadas modalidades, a célula de planta é uma célula de planta dicotiledônea. Em outras modalidades, a célula de planta é uma célula de planta monocotiledônea. Em modalidades particulares, a célula de planta é uma célula de planta de soja, algodão, milho ou colza. A invenção também refere-se a uma cultura de tecido de planta compreendendo tal célu- Ia e a uma semente transgênica e a uma planta transgênica compreendendo tais células. Em determinadas modalidades, a planta ou semente transgêni- ca é uma planta ou semente de dicotiledônea. Em outras modalidades, a semente ou planta transgênica é uma semente ou planta monocotiledônea. A semente ou planta transgênica pode ser uma semente ou planta de soja, algodão, milho ou colza.

A invenção ainda refere-se a um método para produção de uma planta tolerante ao dicamba compreendendo: introdução de uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma seqüência nucleotídica que co- difica um peptídeo de trânsito de cloroplasto operavelmente ligada a uma seqüência nucleotídica que codifica mono-oxigenase de dicamba, em que a seqüência nucleotídica que codifica o peptídeo de trânsito de cloroplasto é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 12-22, em uma célula de planta e regeneração de uma planta a partir da mesma. Em determinadas modalidades, a molécula de DNA recombinante compreende uma seqüência nucleotídica que codifica mono-oxigenase de dicamba a qual é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 e 40. A molécula de DNA pode ser operavelmente ligada a um promotor o qual é funcional em uma célula de planta. O método pode ainda compreender pro- dução de uma planta tolerante ao dicamba através de cruzamento de uma planta parental consigo mesma ou com uma segunda planta, em que a plan- ta parental e/ou a segunda planta compreende um construto de DNA e a planta tolerante ao dicamba herda o construto de DNA da referida planta parental e/ou da segunda planta.

Um método para expressão de mono-oxigenase de dicamba em uma planta compreendendo, operavelmente ligado, um CTP selecionado a uma seqüência que codifica mono-oxigenase de dicamba é um outro aspec- to da invenção. Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para con- trole do crescimento de ervas daninhas em um ambiente de crescimento de safra compreendendo: crescimento de tal planta ou uma semente da mesma e aplicação, ao ambiente de crescimento da safra, de uma quantidade de herbicida dicamba eficaz para controlar o crescimento de ervas daninhas. O herbicida dicamba pode ser aplicado por cima do ambiente de crescimento da safra, pelo que a quantidade de herbicida dicamba não danifica a referida planta ou semente da mesma e danifica uma planta ou semente do mesmo genotipo que tal planta ou semente, mas carecendo do construto. Um outro aspecto da invenção refere-se a um método para pro-

dução de alimento, ração ou um produto industrial compreendendo:

a) obtenção de uma planta compreendendo uma seqüência nu- cleotídica que codifica um promotor funcional em uma célula de planta ope- ravelmente ligada, na direção 5' para 3', a uma seqüência nucleotídica que

codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto e uma seqüência nucleotídica que codifica mono-oxigenase de dicamba ou uma parte da mesma;

b) preparo do alimento, ração, fibra ou produto industrial a partir da planta ou parte da mesma.

Em determinadas modalidades do método, o alimento ou ração é um grão, farelo, óleo, amido, farinha ou proteína. Em outras modalidades do método, o produto industrial é biocombustível, fibra, produtos químicos industriais, um produto farmacêutico ou nutracêutico.

Uma semente tolerante ao dicamba para proporcionar proteção contra aplicação pré-emergência de dicamba compreendendo um DNA que codifica peptídeo de trânsito de cloroplasto operavelmente ligado a um DNA que codifica mono-oxigenase de dicamba é um outro aspecto da invenção. Em determinadas modalidades, a semente tolerante ao dicamba compreen- de uma seqüência nucleotídica que codifica um peptídeo de trânsito de clo- roplasto, tal como uma seqüência nucleotídica selecionada do grupo consis- tindo em SEQ ID NOs: 12-22. A semente tolerante ao dicamba pode ainda compreender uma seqüência nucleotídica que codifica mono-oxigenase de dicamba selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 e 40.

Outro aspecto da invenção refere-se a um método para melhorar a capacidade de sustentação de uma planta monocot compreendendo: a) obtenção e crescimento de uma planta produzida através de cruzamento de uma planta parental consigo mesma ou com uma segunda planta, em que a planta parental e/ou a segunda planta compreende o construto de DNA e a planta tolerante ao dicamba herda o construto de DNA da referida planta parental e/ou da segunda planta; e b) tratamento da planta com dicamba. Em determinadas modalidades, a planta é uma planta de milho. Em ainda outras modalidades, parâmetros relacionados à capacidade de sustentação, incluindo formato de raiz, número, comprimento e/ou estrutura de raiz de fixação; acamamento percentual; e rendimento podem ser medidos. BREVE DESCRIÇÃO DAS figuras

figura 1 Uso de construtos de CTP-DMO para processamento apropriado de DMO e fornecimento de tolerância a dicamba. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

De acordo com a invenção, composições e métodos são propor- cionados para expressão e transporte de polipeptídeos de mono-oxigenase de dicamba (DMO) com eficiência aumentada aos cloroplastos em células de planta. As composições e métodos da invenção, portanto, encontrarão uso no aumento da tolerância de plantas e células ao herbicida dicamba. Objetivando a DMO aos cloroplastos com um peptídeo de trânsito de cloro- plasto (CTP) em particular, expressão de DMO e tolerância ao dicamba a- perfeiçoadas podem ser obtidas. Surpreendentemente, contudo, os presentes inventores desco-

briram que determinados CTPs não funcionam bem em combinação com DMO. Por exemplo, alguns CTPs não resultam em expressão adequada de proteína. Isso pode incluir expressão incorreta da proteína, com a produção de proteínas de tamanho alterado e atividade incompleta in vivo. Isso pode resultar em tolerância incompleta ao herbicida e aprovação regulatória com- plicada. A presente invenção proporciona CTPs que, quando usados em combinação com DMO, proporcionam benefícios inesperados incluindo, mas não necessariamente limitado a, níveis aperfeiçoados de transporte ao clo- roplasto, tolerância aumentada ao herbicida em plantas transgênicas ex- pressando DMO1 níveis desejados de expressão de proteína do tamanho correto e modificações pós-traducionais apropriadas. Um de tais exemplos de um CTP que proporciona benefícios inesperados quando em combinação com DMO é o peptídeo de trânsito CTP2, incluindo os ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 4 ou 5 e incluindo seqüências que codificam SEQ ID NOs: 15 e 16. Em outras modalidades, uma seqüência de codificação de CTP da pe- quena subunidade Rubisco de ervilha (Pisum sativum) é usada, tal como representado por SEQ ID NO: 2 ou que codifica SEQ ID NO: 13. Um cons- truto de DNA compreendendo uma seqüência de codificação de DMO ope- ravelmente ligada a um CTP2 e/ou seqüência de codificação de peptídeo de trânsito de CTP de pequena subunidade Rubisco de ervilha, assim, forma um aspecto da invenção, assim como uma proteína codificada pelo mesmo. Mono-oxigenase de dicamba da cepa D16 de Pseudomonas

maltophilia (Herman e outros, 2005; Publicação de Patente U.S. 20030115626; Acesso ao Banco de Genes AY786443, a seqüência de codi- ficação de DMO da qual é aqui incorporada por referência) catalisa a desin- toxicação do herbicida dicamba. DMO é parte de um sistema com 3 compo- nentes para desintoxicação de dicamba ao ácido 3,6-diclorossalicílico (3,6- DCSA) não-tóxico e, conforme mencionado acima, requer funções de reduc- tase e ferredoxina para transferência de elétrons. Uma vez que a ferredoxina endógena de planta que está envolvida na transferência de elétrons está localizada nos plastídeos, de forma a obter atividade eficiente de DMO e, assim, tolerância tal como em dicots ou tolerância aperfeiçoada, tal como em monocotiledôneas, ao dicamba, DMO é, de preferência, objetivada aos plas- tídeos (por exemplo, cloroplastos).

Peptídeos de trânsito de cloroplasto (CTPs) foram testados com relação à eficiência ao permitir a objetivação e processamento de DMO em plastídeos. Localização e processamento da DMO em plastídeos com rela- ção a esses CTPs oscilavam de nenhum ou parcial a completos. Descobriu- se que apenas alguns dos CTPs permitem processamento completo de DMO em um tamanho correto. A capacidade de qualquer dado CTP de pro- porcionar processamento completo e eficiente de DMO, portanto, era impre- visível e surpreendentemente baseada em sua proteína ou seqüências nu- cleotídicas.

Ainda, descobriu-se também que, em Arabidopsis sem um CTP apropriado, há pouca ou nenhuma expressão de DMO, se correlacionando com pouca ou nenhuma tolerância ao dicamba. Isso sugere que objetivação ao cloroplasto é importante para desintoxicação de dicamba e, consequen- temente, tolerância. CTPs que permitem processamento eficiente de DMO serão úteis na objetivação de DMO aos plastídeos, tais como cloroplastos, de plantas de safra, desse modo, proporcionando a vantagem de atividade total de DMO e maior tolerância ao dicamba, bem como facilidade de carac- terização de produto e custo de registro reduzido.

Moléculas de DNA quiméricas compreendendo um DNA que co- difica um peptídeo de trânsito de cloroplasto operavelmente ligado a um DNA que codifica mono-oxigenase de dicamba podem ser preparadas atra- vés de métodos biológicos moleculares conhecidos por aqueles versados na técnica (por exemplo, Sambrook e outros, 1989). CTPs operavelmente liga- dos a moléculas de DNA conhecidas que codificam DMO, incluindo aqueles identificados na Tabela 1, são proporcionados pela invenção para a expres- são aperfeiçoada de DMO em plantas.

Um peptídeo de trânsito de cloroplasto de qualquer gene que é codificado no núcleo e o produto do qual objetiva um polipeptídeo ao cloro- plasto pode ser testado com relação à expressão eficiente de DMO. Se- qüências de peptídeo de trânsito de cloroplasto podem ser isoladas ou sinte- tizadas. A seqüência nucleotídica que codifica um CTP pode ser otimizada para expressão em dicots, monocotiledôneas ou ambos. Os seguintes peptí- deos de trânsito foram testados através de ligação operável de cada um a uma seqüência de codificação de DMO: CTPs PsRbcS-derivados (SEQ ID Nos: 1 e 2: CTP da pequena subunidade Rubisco de Pisum sativurrr, Coruzzi e outros, 1984); CTP AtRbcS (SEQ ID NO: 3: CTP da pequena subunidade 1A de Rubisco de Arabidopsis thaliana\ CTP1; Patente U.S. 5.728.925); CTP AtShkG (SEQ ID NO: 4: sintase de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato de Arabi- dopsis thaliana (EPSPS); CTP2; Klee e outros, 1987); CTP AtShkGZm (SEQ ID NO: 5: CTP2sintético; códon otimizado para expressão em mono- cot; SEQ ID NO: 14 do W004009761); CTP PhShkG (SEQ ID NO: 6: EPSPS de Petunia hybrida; CTP4; códon otimizado para expressão em monocot; Gasser e outros, 1988); CTP TaWaxy (SEQ ID NO: 7: CTPsintético de sin- tase de amido grânulo-ligado de Triticum aestivum, códon otimizado para expressão em milho: Clark e outros, 1991): CTP OsWaxy (SEQ ID NO: 8: CTP de sintase de amido de Oryza sativa\ Okagaki1 1992); CTP NtRbcS (SEQ ID NO: 9: peptídeo de trânsito de cloroplasto da pequena subunidade de carboxilase de 1,5-bifosfato de ribulose de Nicotiana tabacunr, Mazur e outros, 1985); CTP ZmAS (SEQ ID NO: 10: CTP do gene da subunidade alfa 2 de sintase de antranilato de Zea mays\ Gardiner e outros, 2004); e CTP RgAS (SEQ ID NO: 11: CTP de sintase de antranilato de Ruta graveoiens; Bohlmann e outros, 1995). As seqüências nucleotídicas de codificação para SEQ ID NO: 1- SEQ ID NO: 11 são fornecidas em SEQ ID NO: 12- SEQ ID NO: 22, respectivamente.

Outros peptídeos de trânsito que podem ser úteis incluem a se- qüência sinalizadora cab-m7 de milho (Becker e outros, 1992; PCT WO 97/41228) e a seqüência sinalizadora de reductase de glutationa de ervilha (Pisum sativum) (Creissen e outros, 1995; PCT WO 97/41228). CTPs com aminoácidos adicionais derivados da região de codificação do gene que eles fazem parte ou são fundidos a, tal como CTP AtRbcS, o qual inclui o peptí- deo de trânsito, 24 aminoácidos da proteína Rubisco madura e, então, uma repetição dos últimos 6 aminoácidos do peptídeo de trânsito, podem ser utili- zados para a produção de DMO. CTP ZmAS também contém 18 aminoáci- dos adicionais derivados da região de codificação do gene. Outros CTPs com aminoácidos adicionais (por exemplo, 27 aminoácidos) derivados da região de codificação do gene que eles fazem parte, tal como CTP PsRbcS, seguido por aminoácidos introduzidos através de métodos de clonagem (por exemplo, 3 aminoácidos) podem também ser utilizados para a produção de DMO. CTPs com menos aminoácidos (por exemplo, 21 aminoácidos) que codificam um CTP de comprimento total, tal como CTP RgAs, também po- dem ser utilizados para a produção de DMO. De preferência, uma seqüência de ácido nucleico que codifica um CTP de comprimento total é utilizada. Uma ou mais adições ou deleções de nucleotídeo podem ser incluídas para facilitar a clonagem de um CTP. Essas adições ou deleções podem ser após ou antes de outros elementos de expressão e regiões de codificação, resul- tando em modificação de um ou mais aminoácidos maduros, por exemplo, em ou próximo de um sítio de reconhecimento de enzima de restrição.

Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma seqüência de ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto que tem pelo menos 70% de identidade a uma seqüência polipeptídica de qualquer uma ou mais de SEQ ID NOs: 1-11, incluindo pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% e mais de identidade de seqüência a essas seqüências, incluindo 100% de identidade. Em modalidades particula- res, a seqüência de ácido nucleico codifica um peptídeo de trânsito de cloro- plasto idêntico a uma de SEQ ID NOs: 1-11. Em outra modalidade, o ácido nucleico que codifica o CTP tem pelo menos 70% de identidade a uma se- qüência de ácido nucleico de qualquer uma ou mais de SEQ ID NOs: 12-22, incluindo pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% e mais de identidade de seqüência, incluindo 100% de identidade de se- qüência, a uma ou mais dessas seqüências. Comparações de polipeptídeo ou polinucleotídeo dessas e qualquer outra seqüência conforme descrito a- qui pode ser realizada e a identidade determinada conforme é bem- conhecido na técnica, por exemplo, usando o MEGAIign (DNAStar, Inc., 1228 S. Park St., Madison, Wl) com os parâmetros de default. Tal software combina seqüências similares atribuindo graus de similaridade ou identidade.

DMO pode ser objetivada a outros organelas, tais como mito- côndrias, usando pré-sequências para fazer uso do sistema redox de ferro- doxina presente nesse organela. Alternativamente, DMO pode ser objetivada ao cloroplasto e mitocôndrias através de um peptídeo de objetivação dupla para fazer uso de dois sistemas redox de ferrodoxina para funcionar mais eficazmente. Tais elementos são conhecidos por aqueles versados na técni- ca. por exemplo, pré-sequências mitocondriais são descritas em Silva Filho e outros (1996). Seqüências de ácido nucleico que codificam seqüências peptídicas de objetivação dupla podem ser identificadas a partir dos ácidos nucleicos que codificam as seguintes proteínas, as quais são conhecidas por serem objetivadas a cloroplastos e mitocôndrias: Zn-MP (Moberg e outros, 2003), reductase de glutationa (Rudhe e outros, 2002; Creissen e outros, 1995) e sintetase de histidil-tRNA (Akashi e outros, 1998). Exemplos de se- qüências de codificação de DMO que podem ser usadas a esse respeito são encontrados, por exemplo, nas seqüências que codificam os polipeptídeos de SEQ ID NOs 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, conforme mostrado na Tabela 1.

Tabela 1 . DMO e variantes de DMO utilizados.

DMO/ ou variante PRT SEQ ID DNA SEQ ID Comprimento de PRT Aa pre- visto na posição 2 Aa pre- visto na posição 3 Aa previs- to na posi- ção 112 Uso de códon DMO- Cat(A) 24 23 340 Ala Thr Cys dicot DMO- Cat(L) 26 25 340 Leu Thr Cys dicot DMO- Wat(L) 28 27 340 Leu Thr ΤΦ dicot DMO- Cnat(A) 30 29 340 Ala Thr Cys Bactérias DMO- Wat(A) 32 31 340 Ala Thr Trp dicot DMO- Wnat(T) 34 33 339 Thr Phe Trp (em 111) Bactéria DMO- Cnat(L) 36 35 340 Leu Thr Cys Bactéria DMO- Wmc(L) 38 37 340 Leu Thr Trp monocot DMO- Wmc(A) 40 39 340 Ala Thr Trp monocot

Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica uma

mono-oxigenase de dicamba tem pelo menos 70% de identidade a uma se- quência que codifica um polipeptídeo de qualquer uma de SEQ ID NOs: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 ou 40, incluindo pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% e mais de identidade de seqüência a essas seqüências. Em determinadas modalidades, o ácido nucleico tem pelo me- nos 70% de identidade de seqüência a uma seqüência de ácido nucleico de qualquer uma de SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 ou 39, incluindo pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% e mais de identidade de seqüência a uma dessas seqüências. Em outras modalidades, uma mono-oxigenase de dicamba pode ser uma variante de qualquer uma de tais seqüências e/ou pode ser uma molécula de DMO sintética manipula- da, por exemplo, conforme descrito no Ped. Prov. U.S. N°. de Ser. 60/884.854, depositado em 12 de janeiro de 2007, intitulado "DMO Methods And Compositions," a divulgação toda do qual é especificamente incorpora- da aqui por referência.

Variantes de DMOs tendo uma capacidade de degradar herbici- das similares à auxina, bem como genes de tolerância ao glifosato ou outro herbicida podem ser prontamente preparadas e ensaiadas com relação à atividade de acordo com métodos padrão. Tais seqüências também podem ser identificadas através de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, a partir de organismos, incluindo bactérias que degradam herbicidas similares à auxina, tal como dicamba ou outros herbicidas (Patente U.S. 5.445.962; Cork e Krueger, 1991; Cork e Khalil, 1995). Um meio de isolar um DMO ou outra seqüência é através de hibridização de ácido nucleico, por exemplo, a uma biblioteca construída a partir do organismo fonte ou através de RT-PCR usando mRNA do organismo fonte e iniciadores baseados nas desaturases divulgadas. A invenção, portanto, abrange o uso de ácidos nucleicos que se hibridizam, sob condições estringentes, a uma seqüência de codificação de DMO descrita aqui. Aqueles versados na técnica compreenderão que condi- ções podem ser tornadas menos estringentes aumentando a concentração de sal e diminuindo a temperatura. Assim, condições de hibridização podem ser prontamente manipuladas e, assim, geralmente será um método de es- colha, dependendo dos resultados desejados. Um exemplo de condições de alta estringência é 5X SSC, formamida a 50% e 42°C. Conduzindo uma la- vagem sob tais condições, por exemplo, durante 10 minutos, aquelas se- qüências que não se hibridizam a uma sequência-alvo em particular sob es- sas condições podem ser removidas.

Variantes também podem ser quimicamente sintetizadas, por exemplo, usando as seqüências polinucleotídicas de DMO conhecidas de acordo com métodos bem-conhecidos na técnica. Por exemplo, seqüências de DNA podem ser sintetizadas através de química com fosforoamidita em um sintetizador de DNA automático. Síntese química tem uma série de van- tagens. Em particular, a síntese química é desejável porque códons preferi- dos pelo hospedeiro, no qual a seqüência de DNA será expressa, podem ser usados para otimizar a expressão. Nem todos os códons precisam ser alte- rados para obter expressão aperfeiçoada mas, de preferência, pelo menos os códons raramente usados no hospedeiro são alterados para códons hos- pedeiro-preferidos. Altos níveis de expressão podem ser obtidos alterando mais de cerca de 50%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 80% dos códons para códons hospedeiro-preferidos. As preferências de códon de muitas células hospedeiras são conhecidas (por exemplo, PCT WO 97/31115; PCT WO 97/11086; EP 646643; EP 553494; e Patentes U.S. Nos: 5.689.052; 5.567.862; 5.567.600; 5.552.299 e 5.017.692). As preferências de códon de outras células hospedeiras podem ser deduzidas através de méto- dos conhecidos na técnica. Também, usando síntese química, a seqüência da molécula de DNA ou sua proteína codificada pode ser prontamente alte- rada, por exemplo, para otimizar a expressão (por exemplo, eliminar estrutu- ras de mRNA secundário que interferem com a transcrição ou tradução), adicionar sítios de restrição únicos em pontos convenientes e deletar sítios de clivagem de protease.

Modificação e alterações podem ser feitas na seqüência polipep- tídica de uma proteína, tais como as seqüências de DMO fornecidas aqui, ao mesmo tempo em que se retém ou modifica a atividade enzimática, confor- me desejado. Métodos ilustrativos para geração de seqüências de DMO são fornecidos no Ped. Prov. U.S. N0. Sér. 60/884.854, depositado em 12 de ja- neiro de 2007. O seguinte é uma discussão baseada quando de alteração dos aminoácidos de uma proteína para criar um polipeptídeo modificado e- quivalente ou mesmo aperfeiçoado e seqüências de codificação correspon- dentes. Sabe-se, por exemplo, que determinados aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos em uma estrutura de proteína sem per- da apreciável de capacidade de ligação interativa com estruturas tais como sítios de ligação sobre moléculas de substrato. Uma vez que é a capacidade interativa e a natureza de uma proteína que definem qual atividade biológica funcional da proteína, determinadas substituições de seqüência de aminoá- cido podem ser feitas em uma seqüência de proteína e, naturalmente, sua seqüência de codificação de DNA subjacente e, todavia, obter uma proteína com propriedades similares. Assim, considera-se que várias alterações po- dem ser feitas nas seqüências peptídicas de DMO descritas aqui ou outros polipeptídeos de tolerância ao herbicida e seqüências de codificação de DNA correspondentes sem perda apreciável de sua utilidade ou atividade biológica.

Ao fazer tais alterações, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considerado. A importância do índice hidropático de aminoácido ao conferir função biológica interativa a uma proteína é geralmente entendida na técnica (Kyte e outros, 1982). É aceito que o caráter hidropático relativo do aminoácido contribui para a estrutura secundária da proteína resultante a qual, por sua vez, define a interação da proteína com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, DNA, anticorpos, antígenos e si- milares. A cada aminoácido foi atribuído um índice hidropático com base em sua hidrofobicidade e características de carga (Kyte e outros, 1982); esses são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); Ieucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteí- na/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (- 3,5); Iisina (-3,9); e arginina (—4,5).

Sabe-se na técnica que aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos tendo um índice ou escore hidropático similar e ainda resultar em uma proteína com atividade biológica similar, isto é, ainda obter uma proteína biológica funcionalmente equivalente. Ao fazer tais alterações, a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de + 2 é preferida, aquelas que estão dentro de ±1 são particularmente preferidas e aquelas dentro de ±0,5 são ainda mais particularmente preferidas. Também é entendido na técnica que a substituição de tais ami- noácidos pode ser feita eficazmente com base na hidrofilicidade. A Patente U.S. 4.554.101 afirma que a maior hidrofilicidade média local de uma proteí- na, conforme orientado pela hidrofilicidade de seus aminoácidos adjacentes, se correlaciona com uma propriedade biológica da proteína. Conforme deta- lhado na Patente U.S. 4.554.101, os seguintes valores de hidrofilicidade fo- ram atribuídos aos resíduos de aminoácido: arginina (+3,0); Iisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (- 0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); Ieucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano (-3,4). É entendido que um aminoácido pode ser substituído por outro tendo um valor de hidrofilicidade similar e ainda obter uma proteína biologicamente equivalente. Em tais alterações, a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estão dentro de ±2 é preferida, aqueles os quais estão den- tro de +1 são particularmente preferidos e aqueles dentro de ±0,5 são ainda mais preferidos. Substituições exemplificativas as quais levam essas e vá- rias das características precedentes em consideração são bem-conhecidas por aqueles versados na técnica e incluem: arginina e lisina; glutamato e aspartato; serina e treonina; glutamina e asparagina; e valina, Ieucina e iso- leucina.

Um construto de DNA compreendendo uma seqüência de CTP operavelmente ligada a uma seqüência de DMO pode ser expresso em um sistema de teste, tais como protoplastas, células de planta transitória ou es- tavelmente transformadas, através de ligação operacional do mesmo a um promotor funcional em plantas. Exemplos que descrevem tais promotores incluem Patente U.S. 6.437.217 (promotor RS81 de milho), Patente U.S. 5.641.876 (promotor de actina de arroz; OsActI), Patente U.S. 6.426.446 (promotor RS324 de milho), Patente U.S. 6.429.362 (promotor PR-1 de mi- lho), Patente U.S. 6.232.526 (promotor A3 de milho), Patente U.S. 6.177.611 (promotores constitutivos de milho), Patentes U.S. 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196 (promotor 35S), Patente U.S. 6.433.252 (promotor de oleosina L3 de milho), Patente U.S. 6.429.357 (promotor de actina 2 de ar- roz, bem como íntron de actina 2 de arroz), Patente U.S. 5.837.848 (promo- tor raiz-específico), Patente U.S. 6.294.714 (promotores induzíveis pela luz), Patente U.S. 6.140.078 (promotores induzíveis por sal), Patente U.S.

6.252.138 (promotores induzíveis por patógeno), Patente U.S. 6.175.060 (promotores induzíveis por deficiência de fósforo), Patente U.S. 6.388.170 (por exemplo, promotor PCISV), o promotor PCISV de SEQ ID NO: 41, Pa- tente U.S. 6.635.806 (promotor de gama-coixina) e Patente U.S. N°. 7.151.204 (promotor de aldolase de cloroplasto de milho). Promotores adi- cionais que podem encontrar uso são um promotor de sintase de nopalina (NOS) (Ebert e outros, 1987), o promotor de sintase de octopina (OCS) (o qual é trazido sobre plasmídeos de indução de tumor de Agrobacterium tu- mefaciens), os promotores do vírus da couve-flor, tal como o promotor 19S do vírus mosaico da couve-flor (CaMV) (Lawton e outros, 1987), o promotor 35S de CaMV (Odell e outros, 1985), o promotor 35S do vírus mosaico de figo (Walker e outros, 1987), o promotor de sintase de sacarose (Yang e outros, 1990), o promotor do complexo do gene R (Chandler e outros, 1989) e o promotor do gene de proteína de ligação a/b de clorofila, etc. Na presen- te invenção, promotores 35S de CaMV com seqüências intensificadoras (e35S; Patentes U.S. Nos. 5.322.938; 5.352.605; 5.359.142; e 5.530.196), FMV35S (Patentes U.S. 6.051.753; 5.378.619), vírus da listra clorótica de amendoim (PCISV; Patente US 5.850.019), At.Act 7 (Acesso # U27811), At.ANTI (Pedido de Patente US 20060236420), FMV.35S-EF1a (Pedido de Patente US 20050022261), elF4A10 (Acesso # X79008) e AGRtu.nos (A- cesso ao Banco de Genes V00087; Depicker e outros, 1982; Bevan e ou- tros, 1983), isomerase de fosfato de triose citosólica de arroz (OsTPI; Paten- te US N°. 7.132.528) e gene de actina 15 de arroz (OsAct15; Pedido de Pa- tente U.S. 2006-0162010) podem ser de benefício particular.

Uma 5' UTR que funciona como uma seqüência líder de tradu- ção é um elemento genético de DNA localizado entre a seqüência promotora de um gene e a seqüência de codificação pode ser incluída entre um promo- tor e a seqüência de CTP-DMO. A seqüência líder de tradução está presente no mRNA totalmente processado a montante da seqüência de início de tra- dução. A seqüência líder de tradução pode afetar o processamento do trans- crito primário em mRNA, estabilidade do mRNA ou eficiência de tradução. Exemplos de seqüências líderes incluem líderes da proteína de choque tér- mino de milho e petunia (Patente U.S. N°. 5.362.865), líderes de proteína do envoltório de vírus de planta, líderes de rubisco de planta, GmHsp (Patente U.S. 5.659.122), PhDnaK (Patente U.S. 5.362.865), AtAntI, TEV (Carrington e Freed, 1990) e AGRtunos (Acesso ao Banco de Genes V00087; Bevan e outros, 1983) dentre outros (Turner e Foster, 1995). Na presente invenção, 5' UTRs que podem, em particular, encontrar benefício são GmHsp (Patente U.S. 5.659.122), PhDnaK (Patente U.S. 5.362.865), AtAntI, TEV (Carrington e Freed, 1990), OsActI (patente US 5641876), OsTPI (Patente US N°. 7.132.528), OsActI 5 (Publicação US N°. 20060162010) e AGRtunos (Aces- so ao Banco de Genes V00087; Bevan e outros, 1983). A seqüência não-traduzida 3', região de término de transcrição 3'

ou região de poliadenilação significa uma molécula de DNA ligada a e locali- zada a jusante de uma molécula polinucleotídica estrutural e inclui polinucle- otídeos que proporcionam sinal de poliadenilação e sinais regulatórios capa- zes de afetar a transcrição, processamento de mRNA ou expressão gênica. O sinal de poliadenilação funciona em plantas para causar a adição de nu- cleotídeos de poliadenilato à extremidade 3' do precursor de mRNA. A se- qüência de poliadenilação pode ser derivada do gene natural, de uma varie- dade de genes de planta ou de genes de T-DNA. Essas seqüências podem ser incluídas a jusante de uma seqüência de DMO-CTP. Um exemplo de uma região de término de transcrição 3' é a região 3' de sintase de nopalina (nos 3'; Fraley e outros, 1983). O uso de diferentes regiões não-traduzidas 3' é exemplificado (lngelbrecht e outros, 1989). Moléculas de poliadenilação do gene RbcS2 de Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi e outros, 1984), AGRtu.nos (Acesso ao Banco de Genes E01312), E6 (Acesso # U30508) e TaHspI 7 (gene de proteína de choque térmico de baixo peso molecular de trigo; Acesso # X13431) em particular pode ser de benefício para uso com a invenção. Além de elementos de expressão descritos acima, um íntron po- de ser requerido entre um promotor e uma 3'UTR para expressão de uma região de codificação, especialmente em monocotiledôneas. Um "íntron" re- fere-se a uma molécula polinucleotídica que pode ser isolada ou identificada da seqüência interveniente de uma cópia genômica de um gene e pode ser definida geralmente como uma região dividida durante processamento de mRNA antes de tradução. Alternativamente, íntrons podem ser sinteticamen- te produzidos. íntrons podem, em si, conter subselementos, tais como cis- elementos ou domínios intensificadores que realizam a transcrição de genes operavelmente ligados. Um "íntron de planta" é um íntron nativo ou não- nativo que é funcional em células de planta. Um íntron de planta pode ser usado como um elemento regulatório para modulação de expressão de um gene ou genes operavelmente ligados. Uma seqüência de molécula polinu- cleotídica em um construto de transformação pode compreender íntrons. Os íntrons podem ser heterólogos com relação à seqüência da molécula polinu- cleotídica passível de transcrição. Exemplos de íntrons incluem o íntron de actina de milho (Patente U.S. 5641876), o íntron HSP70 de milho (Z- mHSP70; Patente U.S. 5.859.347; Patente U.S. 5.424.412) e o íntron TPI de arroz (OsTPI; Patente U.S. N°. 7.132.528) e são de benefício na prática da presente invenção.

Os construtos de DMO-CTP podem ser testados com relação ao fornecimento de processamento apropriado de DMO em um sistema de tes- te, tal como protoplastas ou células de planta transitória ou estavelmente transformadas de monocotiledôneas ou dicots através de métodos conheci- dos por aqueles versados na técnica de cultura e transformação de tecido de planta. Qualquer um dos métodos conhecidos na técnica para introdução de construtos de transgene em plantas pode ser usado de acordo com a inven- ção (veja, por exemplo, Miki e outros, 1993). Acredita-se que métodos ade- quados para transformação de planta incluam virtualmente qualquer método pelo qual DNA pode ser introduzido em uma célula, tal como através de ele- troporação, conforme ilustrado na Patente U.S. N°. 5.384.253; bombardea- mento de microprojétil, conforme ilustrado nas Patentes U.S. Nos. 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880; 6.160.208; 6.399.861; e 6.403.865; trans- formação Agrobacterium-medlada, conforme ilustrado nas Patentes U.S. Nos. 5.635.055; 5.824.877; 5.591.616; 5.981.840; e 6.384.301; e transfor- mação de protoplasta, conforme ilustrado na Patente U.S. N0. 5.508.184.

Aplicando técnicas tais como essas, as células de virtualmente qualquer es- pécie de planta podem ser estavelmente transformadas e essas células po- dem ser desenvolvidas em plantas transgênicas. Técnicas que podem ser particularmente úteis no contexto de transformação de algodão são divulga- das nas Patentes U.S. Nos. 5.846.797, 5.159.135, 5.004.863 e 6.624.344. Técnicas para transformação de plantas Brassica são divulgados, em parti- cular, por exemplo, na Patente U.S. 5.750.871; e técnicas para transforma- ção de soja são divulgadas, por exemplo, em Zhang e outros, 1999, Patente US 6.384.301 e US 7.002.058. Técnicas para transformação de milho são divulgadas no W09506722. Alguns exemplos não-limitativos de plantas que podem encontrar uso com a invenção incluem alfafa, cevada, feijões, beter- raba, brócolis, couve, cenoura, canola, couve-flor, aipo, couve Chinesa, mi- lho, algodão, pepino, feijão seco, berinjela, funcho, ervilhas, cabaça, alho- poró, alface, melão, aveia, quiabo, cebola, ervilha, pimenta, abóbora, amen- doim, batata, rabanete, arroz, sorgo, soja, espinafre, moranga, milho sacarí- nico, beterraba sacarínica, girassol, tomate, melancia e trigo.

Após realizar a distribuição de DNA exógeno a células recipien- tes, as próximas etapas na geração de plantas transgênicas geralmente re- fere-sem à identificação de células transformadas para cultura e regenera- ção de planta adicionais. De forma a melhorar a capacidade de identificar transformantes, pode ser desejado empregar um gene marcador passível de seleção ou triagem com um vetor de transformação preparado de acordo com a invenção. Nesse caso, se poderia, então, ensaiar de modo geral a população de célula potencialmente transformada expondo as células a um agente ou agentes seletivos ou se poderia selecionar células para o traço do gene marcador desejado.

Células que sobrevivem à exposição ao agente seletivo ou célu- las que foram classificadas positivas em um ensaio de seleção podem ser cultivadas em meio que sustenta a regeneração de plantas. Qualquer meio de cultura de tecido de planta adequado, por exemplo, meio MS ou N6 (Mu- rashige e Skoog, 1962; Chu e outros, 1975) pode ser modificado através de inclusão de outras substâncias, tais como reguladores de crescimento. Teci- do pode ser mantido sobre um meio básico com reguladores de crescimento até que tecido suficiente esteja disponível para regeneração, tipicamente pelo menos 2 semanas, então, transferido para meio condutivo à formação de broto. As culturas são transferidas periodicamente até que formação de broto suficiente tenha ocorrido. Uma vez que os brotos são formados, eles são transferidos para meio condutivo à formação de raiz. Uma vez que raí- zes suficientes são formadas, as plantas podem ser transferidas para o solo para crescimento e maturidade adicionais.

Para confirmar a presença do DNA exógeno ou "transgene(s)" nas plantas em regeneração, uma variedade de ensaios podem ser realiza- dos. Tais ensaios incluem, por exemplo, ensaios "biológicos moleculares", tais como Southern e Northern blotting e PCR™; ensaios "bioquímicos", tal como detecção da presença de um produto de proteína, por exemplo, atra- vés de meios imunológicos (ELISAs e Western blots) ou através de função enzimática; ensaios de partes de planta, tais como ensaios de folha ou raiz; e também através de análise do fenotipo da planta inteira.

Uma vez que o transgene tenha sido introduzido em uma planta, esse gene pode ser introduzido em qualquer planta sexualmente compatível com a primeira planta através de cruzamento sem a necessidade de outra transformação direta da segunda planta. Portanto, conforme usado aqui, o termo "prole" denota os rebentos de qualquer geração de uma planta paren- tal preparada de acordo com a presente invenção, em que a prole compre- ende um construto de DNA selecionado preparado de acordo com a inven- ção. Uma "planta transgênica" pode, assim, ser de qualquer geração. "Cru- zamento" de uma planta para proporcionar uma linhagem de planta tendo um ou mais transgenes ou alelos adicionados com relação a uma linhagem de planta inicial, conforme divulgado aqui, é definido como as técnicas que resultam em uma seqüência em particular sendo introduzida em uma linha- gem de planta através de cruzamento de uma linhagem inicial com uma li- nhagem de planta doadora que compreende um transgene ou alelo da in- venção. Para obter isso se poderia, por exemplo, realizar as seguintes eta- pas: (a) sementes de planta das primeira (linhagem inicial) e segunda (linha- gem de planta doadora que compreende um transgene ou alelo desejado) plantas parentais; (b) crescimento das sementes das primeira e segunda plantas parentais em plantas que trazem flores; (c) polinização de uma flor da primeira planta parental com pólen da segunda planta parental; e (d) colheita de sementes produzidas sobre a planta parental trazendo a flor fertilizada.

Os tecidos de planta e plantas estavelmente transformados po- dem ser testados com relação ao fornecimento de tolerância ao dicamba através de processamento correto de proteína de DMO. Fornecimento de tolerância ao dicamba em uma planta de safra pode ser usado para criação de um método de controle de crescimento de ervas daninhas em um ambi- ente de crescimento compreendendo aplicação, ao ambiente de crescimento da safra, de uma quantidade de herbicida dicamba eficaz para controlar o crescimento de erva daninha. O herbicida dicamba é aplicado por cima do ambiente de crescimento da safra em uma quantidade que não danifica a planta de safra ou semente transformada com um construto de DMO-CTP e danifica uma planta de safra do mesmo genotipo carecendo do construto de DMO-CTP.

O preparo de composições herbicidas para uso com relação à presente invenção será evidente para aqueles versados na técnica em vista da divulgação. Tais composições, as quais estão comercialmente disponí- veis, incluirão, tipicamente, além do ingrediente ativo, componentes tais co- mo tensoativos, veículos sólidos ou líquidos, solventes e aglutinantes. E- xemplos de tensoativos que podem ser usados para aplicação a plantas in- cluem os sais de metal alcalino, metal alcalino-terroso ou amônio de ácidos sulfônicos aromáticos, por exemplo, ácido ligno-, fenol-, naftaleno- e dibutil- naftaleno-sulfônico e de ácidos graxos de aril-sulfonatos, de alquil éteres, de Iauril éteres, de sulfatos de álcool graxo e de glicol éter sulfatos de ácido graxo, condensados de naftaleno sulfonato e seus derivados com conden- sados de formaldeído de naftaleno ou dos ácidos naftaleno-sulfônicos com fenol e formaldeído, condensados de fenol ou ácido fenol-sulfônico com for- maldeído, condensados de fenol com formaldeído e sulfito de sódio, polioxie- tileno octilfenil éter, iso-octil-, octil- ou nonilfenol etoxilado, tributilfenil poligli- col éter, álcoois de alquilaril poliéter, álcool isotridecílico, óleo de mamona etoxilado, triarilfenóis etoxilados, sais de etoxilatos de triarilfenol fosfatados, acetato de poliglicol éter de álcool laurílico, sorbitol éteres, licores residuais de lignina-sulfito ou metilcelulose ou misturas desses. Prática comum no ca- so do uso de tensoativo é cerca de 0,25% a 1,0% em peso e, mais comu- mente, cerca de 0,25% a 0,5% em peso.

Composições para aplicação a plantas podem ser sólidas ou líquidas. Onde composições sólidas são usadas, pode ser desejado incluir um ou mais materiais veículo com o composto ativo. Exemplos de veículos incluem terras minerais, tais como sílicas, sílica-géis, silicatos, talco, caulim, atargila, calcário, giz, limo argilo-calcário, argila, dolomita, terra diatomácea, sulfato de cálcio, sulfato de magnésio, óxido de magnésio, materiais sintéti- cos triturados, fertilizantes, tais como sulfato de amônio, fosfato de amônio, nitrato de amônio, tioureia e uréia, produtos de origem vegetal, tais como farelos de cereal, farelo de casca de árvore, farelo de madeira e farelo de casca de nozes, pós de celulose, atapulgitas, montmorilonitas, mica, vermi- culitas, sílicas sintéticas e silicatos de cálcio sintéticos ou misturas desses.

Para soluções líquidas, compostos ou sais solúveis em água podem ser incluídos, tais como sulfato de sódio, sulfato de potássio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, acetato de sódio, hidrogenossulfato de amô- nio, cloreto de amônio, acetato de amônio, formiato de amônio, oxalato de amônio, carbonato de amônio, hidrogeno carbonato de amônio, tiossulfato de amônio, hidrogeno difosfato de amônio, dihidrogeno monofosfato de a- mônio, hidrogeno fosfato de sódio de amônio, tiocianato de amônio, sulfama- to de amônio ou carbamato de amônio.

Outros componentes exemplificativos em composições herbici- das incluem aglutinantes, tais como polivinilpirrolidona, álcool polivinílico, acetato de polivinila parcialmente hidrolisado, carboximetil celulose, amido, copolímeros de vinilpirrolidona/acetato de vinila e acetato de polivinila ou misturas desses; lubrificantes, tais como estearato de magnésio, estearato de sódio, talco ou polietileno glicol ou misturas desses; antiespumantes, tais como emulsões de silicone, álcoois de cadeia longa, ésteres fosfóricos, ace- tileno diois, ácidos graxos ou compostos de organoflúor e agentes de quela- ção, tais como: sais de ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA), sais de ácido trinitrilotriacético de ácidos polifosfóricos ou misturas desses.

Dicamba pode ser usado em cerca de 2,5 g/ha a cerca de 10.080 g/ha, incluindo cerca de 2,5 g/ha a cerca de 5.040 g/ha, cerca de 5 g/ha a cerca de 2.020 g/ha, cerca de 10 g/a a cerca de 820 g/h e cerca de 50 g/ha a cerca de 1.000 g/ha, cerca de 100 g/ha a cerca de 800 g/ha e cerca de 250 g/ha a cerca de 800 g/ha.

Os construtos de CTP-DMO podem ser ligados a uma ou mais moléculas polinucleotídicas contendo elementos genéticos para um marca- dor passível de seleção/classificação/triagem e/ou para um gene que confe- re outro traço desejado. Genes comumente usados para seleção de células presumivelmente transformadas incluem: β-glucoronidase (GUS), β- galactosidase, Iuciferase e acetiltransferase de cloranfenicol (Jefferson, 1987; Teeri e outros, 1989; Koncz e outros, 1987; De Block e outros, 1984), proteína fluorescente verde (GFP) (Chalfie e outros, 1994; Haseloff e Amos, 1995; e pedido PCT WO 97/41228). Exemplos não-limitativos de genes mar- cadores selecionáveis são descritos, por exemplo, em Miki e McHugh, 2004.

A molécula nucleotídica que confere outro traço desejado pode incluir, mas não está limitada a, um gene que proporciona uma característica desejável associada à morfologia, fisiológica, crescimento e desenvolvimen- to da planta, rendimento, intensificação nutricional, resistência à doença ou peste ou tolerância ambiental ou química e pode incluir elementos genéticos compreendendo resistência ao herbicida (Patentes U.S. 6.803.501; 6.448.476; 6.248.876; 6.225.114; 6.107.549; 5.866.775; 5.804.425; 5.633.435; 5.463.175), rendimento aumentado (Patentes U.S. RE38.446; 6.716.474; 6.663.906; 6.476.295; 6.441.277; 6.423.828; 6.399.330; 6.372.211; 6.235.971; 6.222.098; 5.716.837), controle de inseto (Patentes U.S. 6.809.078; 6.713.063; 6.686.452; 6.657.046; 6.645.497; 6.642.030; 6.639.054; 6.620.988; 6.593.293; 6.555.655; 6.538.109; 6.537.756 6.521.442; 6.501.009; 6.468.523; 6.326.351; 6.313.378; 6.284.949 6.281.016; 6.248.536; 6.242.241; 6.221.649; 6.177.615; 6.156.573 6.153.814; 6.110.464; 6.093.695; 6.063.756; 6.063.597; 6.023.013 5.959.091; 5.942.664; 5.942.658. 5.880.275; 5.763.245; 5.763.241), resis- tência à doença fúngica (Patentes U.S. 6.653.280; 6.573.361; 6.506.962 6.316.407; 6.215.048; 5.516.671; 5.773.696; 6.121.436; 6.316.407 6.506.962), resistência ao vírus (Patentes U.S. 6.617.496; 6.608.241 6.015.940; 6.013.864; 5.850.023; 5.304.730), resistência aos nematóides (Patente U.S. 6.228.992), resistência à doença bacteriana (Patente U.S. 5.516.671), crescimento e desenvolvimento de planta (Patentes U.S. 6.723.897; 6.518.488), produção de amido (Patentes U.S. 6.538.181; 6.538.179; 6.538.178; 5.750.876; 6.476.295), produção modificada de óleos (Patentes U.S. 6.444.876; 6.426.447; 6.380.462), alta produção de óleo (Pa- tentes U.S. 6.495.739; 5.608.149; 6.483.008; 6.476.295), teor modificado de ácido graxo (Patentes U.S. 6.828.475; 6.822.141; 6.770.465; 6.706.950; 6.660.849; 6.596.538; 6.589.767; 6.537.750; 6.489.461; 6.459.018), alta pro- dução de proteína (Patente U.S. 6.380.466), amadurecimento de fruto (Pa- tente U.S. 5.512.466), nutrição animal e humana intensificadas (Patentes U.S. 6.723.837; 6.653.530; 6.5412.59; 5.985.605; 6.171.640), biopolímeros (Patentes U.S. RE37.543; 6.228.623; 5.958.745 e Publicação de Patente U.S. N°. US20030028917), resistência ao estresse ambiental (Patente U.S. 6.072.103), peptídeos farmacêuticos e peptídeos secretáveis (Patentes U.S. 6.812.379; 6.774.283; 6.140.075; 6.080.560), traços de processamento aper- feiçoados (Patente U.S. 6.476.295), digestibilidade aperfeiçoada (Patente U.S. 6.531.648), baixo teor de rafinose (Patente U.S. 6.166.292), produção de enzima industrial (Patente U.S. 5.543.576), aroma aperfeiçoado (Patente U.S. 6.011.199), fixação de nitrogênio (Patente U.S. 5.229.114), produção de semente híbrida (Patente U.S. 5.689.041), produção de fibra (Patente U.S. 6.576.818; 6.271.443; 5.981.834; 5.869.720) e produção de biocombustível (Patente U.S. 5.998.700). Qualquer um desses e outros elementos genéticos, métodos e transgenes podem ser usados com a invenção, conforme será a- preciado por aqueles versados na técnica em vista da presente divulgação.

Alternativamente, a uma ou mais moléculas polinucleotídicas ligadas ao construto de DMO-CTP podem afetar a característica ou fenotipo de planta acima mencionado através de codificação de uma molécula de RNA que causa a inibição objetivada de expressão de um gene endógeno, por exemplo, via mecanismos antissenso, RNA inibitório (RNAi) ou cossu- pressão-mediados. O RNA também poderia ser uma molécula de RNA cata- lítica (isto é, uma ribozima) manipulada para clivar um produto de mRNA endógeno desejado. Assim, qualquer molécula polinucleotídica que codifica uma molécula de RNA transcrita que afeta um fenotipo ou altera uma morfo- Iogia de interesse pode ser útil para a prática da presente invenção. A presente invenção também divulga um método para produção de alimento, ração ou um produto industrial compreendendo uma planta contendo um construto de DMO-CTP ou uma parte de tal planta e preparo do alimento, ração, fibra ou produto industrial a partir da planta ou parte da mesma, em que o alimento ou ração é um grão, farelo, óleo, amido, farinha ou proteína e o produto industrial é biocombustível, fibra, produtos químicos industriais, um produto farmacêutico ou nutracêutico.

Outro aspecto da invenção refere-se a um método para melhorar a capacidade de sustentação de uma planta monocot compreendendo: a) obtenção de crescimento de uma planta produzida através de cruzamento de uma planta parental consigo mesma ou com uma segunda planta, em que a planta parental e/ou a segunda planta compreende o construto de DNA e a planta tolerante ao dicamba herda o construto de DNA da referida planta parental e/ou da segunda planta; e b) tratamento da planta com di- camba. Parâmetros referentes à capacidade de sustentação podem ser me- didos, por exemplo, incluindo número, formato, comprimento ou estrutura de raiz de fixação; acamamento percentual; e rendimento. Em determinadas modalidades, a planta é uma planta de milho. EXEMPLOS

Os exemplos a seguir são incluídos para ilustrar modalidades da invenção. Será apreciado por aqueles versados na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos que seguem representam técnicas descobertas pelo inventor para funcionar bem na prática da invenção. Contudo, Aqueles versados na técnica apreciarão, à luz da presente divulgação, que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades específicas as quais são divul- gadas e ainda obter um resultado similar ou similar sem se desviar do con- ceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, será evidente que determinados agentes os quais são química e fisiologicamente relacio- nados podem ser substituídos pelos agentes descritos aqui, ao mesmo tem- po em que resultados similares ou similares serão obtidos. Todos de tais substitutos e modificações similares evidentes para aqueles versados na técnica são considerados como estando dentro do espírito, escopo e concei- to da invenção, conforme definido pelas reivindicações em anexo. Preparo de construtos de CTP-DMO para transformação Construtos de DNA conforme mostrado na Tabela 2 foram pre-

parados de acordo com métodos padrão (por exemplo, Sambrook e outros, 1989), compreendendo um CTP operavelmente ligado a um gene de DMO ou uma variante do mesmo entre um promotor de planta e uma seqüência de sinal de poliadenilação. Esses construtos foram testados em um sistema de protoplasta de milho ou em plantas Arabidopsis ou de soja estavelmente transformadas conforme descrito abaixo.

Tabela 1. Processamento de variantes de DMO e DMO por diferentes CTPs.

pMO Pro- CTP PR DN Versão 3'U Sistema # de Tama- % total de N motor T A de DMO TR deteste ban nho de expres- SE SE das banda são (1 Q Q (1 banda/2 ID ID ban- bandas) da/2 ban- das) 84254 P- PsRbcS CTP 1 12 DMOc- Rb Folha de 2 41 kDa/ 10/90 CISV cxMTi região de nati- cS2 soja 38 kDa codificação vo{A) -E9 58498 P- PsRbcS CTP 1 12 DMOc- Rb Folha de 2 41 kDa/ 50/50 CISV com região de nati- cS2 soja 38 kDa codificação vo{A) -E9 73749 P- PsRbcS CTP 1 12 DMOc- E6 Folha de 2 41 kDa/ 50/50 CISV com região de dc(A) Arabidop- 38 kDa codificação sis 73725 P- CISV PsRbcS CTP sem região de codificação 2 13 DMOw- dc(A) No S Folha de ArabkJop- sis 1 38 kDa 100 73728 P- CISV PsRbcS CTP sem região de codificação 2 13 DMOw- dc(L) No S Folha de Arabidop- sis 1 38kDa 100 73729 P- CISV AtRbcS CTP (CTP1) 3 14 DMOw- dc(A) No S Protoplas- tas de milho 1 >41 kDa 100 73708 P- CISV AtRbcS CTP (CTP1) 3 14 DMOw- mc(L) Hs p17 Protoplas- tas de milho 1 >41 kDa 100 73698 FMV 35S AtRbcS CTP (CTP1) 3 14 DMOo- dc(L) Rb cS2 -E9 Folha de Arabidop- sis 1 >41 kDa 100 73731 CaMV 35S- enh AtShkG CTP (CTP2) 4 15 DMOw- mc(L) Hs p17 Protoplas- tas de milho 1 -38 kDa 100 73740 P- CISV AtShkG CTP (CTP2) 4 15 DMOe- nativo(L) No S Protoplas- tas de milho 1 -38 kDa 100 73713 P- CISV AtShkG CTP (CTP2sintético) 5 16 DMOw- mc(L) Hs p17 Protoplas- tas de milho 1 -38 kDa 100 73742 P- CISV AtShkG CTP (CTP2sintético) 5 16 DMOc- nativo(L) Hs p17 Protoplas- tas de milho 1 -38 kDa 100 73724 P- CISV AtShkG CTP (CTP2sintético) 5 16 DMOw- dc(A) No S Folha de Arabidop- sis 1 -38 kDa 100 73727 P- CISV AtShkG CTP (CTP2sintético) 5 16 DMOw- dc(L) No S Folha de Arabidop- sis 2 >38 kDa/ -38 kDa 50/50 73736 CaMV 35S- enh PhShkG CTP (CTP4sintético) 6 17 DMOw- mc(L) Hs P17 Protoplas- tas de milho 1 -38 kDa 100 73747 P- CISV PhShkG CTP (CTP4sintétieo) 6 17 DMOw- mc(L) Hs p17 Protoplas- tas de milho 1 ~38kDa 100 73714 P- asv TaWaxy CTP- siritético 7 18 DMOw- mc(L) Hs p17 Protoplas- tas de milho O - - 73716 P- CISV TaWaxy CTP- sintético 7 18 DMOw- mc(L) Hs p17 Protoplas- tas de milho O - - 73733 CaMV 35S- enh OsWaxyCTP 8 19 DMOw- mc(L) Hs p17 Protoplas- tas de milho 1 <38kDa 100 73734 CaMV 35S- enh NtRbcS CTP 9 20 DMOw- mc(L) Hs p17 Protoplas- tas de milho 2 >41 kDa /38kDa 75/25 73732 CaMV 35S- enh ZmAS CTP 10 21 DMOw- mc(L) Hs P17 Protoplas- tas de milho 1 >38kDa 100 73735 CaMV 35S- enh RgAS CTP 11 22 DMOw- mc(L) Hs p17 Protoplas- tas de milho 1 >38kDa 100 Exemplo 2

Análise de construtos de CTP-DMO em protoplastas de milho

Protoplastas de mesofilo de folha de milho foram preparados a partir de mudas etioladas de 12 dias de idade (a partir de um cruzamento LH200 χ LH5). As partes medianas das folhas secundárias (cerca de 6 cm de comprimento) foram cortadas em tiras de 0,5 cm com um bisturi e digeri- das em um frasco com uma solução enzimática contendo 2% (peso/v) de celulase RS1 0,3% (peso/v) de Macerozyme R10 (ambos da Karlan Resear- ch Products Corp, Santa Rosa, CA), manitol a 0,6 M, MES a 10 mM (pH de 5,7) e CaCI2 a 1 mM, durante não mais do que 2 horas a 32°C após 30 minu- tos de infiltração a vácuo. Protoplastas de tecido de folha infiltrado e digerido foram liberados agitando o frasco manualmente durante 5 min e separados por meio de filtração através de uma malha de náilon de 60 μΐη. Os proto- plastas foram coletados através de centrifugação a 150 g durante 2 min, Ia- vados em solução gelada de manitol a 0,6 M uma vez, centrifugados e res- suspensos a 2 χ 106/mL em manitol gelado a 0,6 M. Os protoplastas foram, então, transformados com 12,5 μg de DNA usando polietileno glicol (PEG) e incubados em temperatura ambiente durante 16 a 20 horas.

Os protoplastas foram armazenados a -80°C até análise através de Western blot. Os protoplastas foram descongelados sobre gelo e 1-3 vo- lumes de 3x tampão de amostra de Laemmli/corante (BioRad) com β-ΜΕ a 5,0% foram adicionados aos protoplastas. Alíquotas das amostras de proteí- na de protoplasta foram, então, aquecidas para cerca de 100°C durante 5 minutos e carregadas sobre um gel de poliacrilamida a 10% com Tris-HCI pré-fundido. Eletroforese foi realizada em uma corrente constante de cerca de 80-100 Amps durante cerca de 35 minutos. Proteína do gel foi eletro- transferida para uma membrana de nitrocelulose de 0,2 mícrons durante 1-3 horas em uma tensão constante de 100 V. A membrana foi bloqueada du- rante uma hora em temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C com 5% (peso/v) de leite desnatado em TBST. A membrana foi hibridizada com uma diluição a 1:200 de anticorpo anti-DMO de coelho em TBST durante uma hora. Anticorpo em excesso foi removido usando três lavagens de 5 min com TBS. A membrana foi hibridizada com IgG anti-cabra de coelho peroxidase- conjugada (Sigma, St. Louis1 MO) em uma diluição de 1:7.500 em 0,5% (pe- so/v) de leite desnatado em TBST durante uma hora. Conjugado de peroxi- dase em excesso foi removido usando três lavagens de 5 min com TBST. Todos os procedimentos, incluindo bloqueio e todas as incubações foram realizados em temperatura ambiente, exceto onde mencionado. Bandas imu- norreativas foram visualizadas usando o sistema de detecção ECL (Amer- sham Biosciences, Piscataway, NJ) e expostas a um filme Kodak BioMax® MS. A presença de bandas imunorreativas do tamanho apropriado indica processamento e localização apropriados de DMO (Tabela 1). Assim, por exemplo, o uso de CTP4 operavelmente ligado ao DMO e transformado em protoplastas de milho resultou em uma banda imunorreativa de 38 kDa, após análise de Western blot. Exemplo 3

Testagem de vários construtos de CTP-DMO em Arabidopsis

Plantas Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia foram transfor- madas de acordo com o método desenvolvido por Clough e Bent (1998). Sementes obtidas através desse método foram plantadas sobre um meio de seleção de cultura de planta contendo dicamba em várias concentrações, de 0,5,1,0 a 2,0 ou 4,0 mg/litro. As lâminas foram incubadas durante 48 horas a 4°C e, então, transferidas para uma incubadora Percival ajustada a 23,5°C com um fotoperíodo de 16 horas. Sementes que foram transformadas com construtos de DMO-CTP foram crescidas em plantas sobre meio contendo dicamba e desenvolveram folhas primárias e secundárias, enquanto que as sementes não-transformadas e segregantes negativos morreram ou não de- senvolveram folhas primárias e secundárias. As plantas transgênicas que foram testadas positivas para a 3'UTR através do ensaio de PCR Invader® foram usadas para outra análise.

Três a cinco maços de filha das plantas Arabidopsis transgêni- cas foram usados para análise de Western blot. Extração de proteína foi rea- lizada com 500-1000 μΙ de PSBT e 4 glóbulos de vidro em um agitador de tinta Harbil durante 3 min. Amostras foram centrifugadas a 3000 rpm durante 3 minutos a 4°C. Um volume igual de 2x tampão de amostra de Laem- mli/corante ((cat. N°. 161-0737 BioRad) peso/ β-ΜΕ a 5,0% foi adicionado a alíquotas do sobrenadante. As etapas restantes de análise de Western blot foram as mesmas conforme no Exemplo 2. A presença de bandas imunorre- ativas do tamanho apropriado indica processamento e localização apropria- dos de DMO (Tabela 2). Por exemplo, conforme mostrado na Tabela 2, em uma comparação de bandas observadas após transformação de Arabidopsis com pMON73749 ou pMON73725, uso de RbcSnoc-CTP, carecendo da se- qüência de codificação de 27 aa derivada da enzima Rubisco de ervilha, re- sultou em DMO apropriadamente processado localizado no cloroplasto, en- quanto que uso do CTP RbcS incluindo a seqüência de codificação de 27 aa resultou em duas bandas imunorreativas. Exemplo 4

Testagem de construtos de CTP-DMO em soja

Plantas transgênicas de soja (por exemplo, cvs. Thorne, NE3001 e A3525) foram obtidas através de transformação Agrobacterium-mediada de soja usando procedimentos padrão (por exemplo, Zhang e outros, 1999; US 7.002.058). Três de cinco maços de folha das plantas de soja transgêni- ca foram usados para análise de Western blot. Extração de proteína foi reali- zada com de 500 a 1000 μΙ de PSBT e 4 glóbulos de vidro em um agitador de tinta Harbil durante 3 min. Amostras foram centrifugadas a 3000 rpm du- rante 3 minutos a 4°C. Um volume igual de 2x tampão de amostra de La- emmli/corante (BioRad) peso/ β-ΜΕ a 5,0% foi adicionado à alíquotas do sobrenadante. As etapas restantes de análise de Western blot foram as mesmas conforme no exemplo 2. A presença de bandas imunorreativas do tamanho apropriado indica processamento e localização apropriados de DMO (tabela 2).

Plantas de soja que foram transformadas com um construto que codifica um DMO ligado a um peptídeo de trânsito Rubisco de ervilha preso a 24 aminoácidos adicionais da região de codificação de Rubisco e 3 amino- ácidos em virtude da introdução de sítios de reconhecimento de enzima de restrição mostraram uma taxa de dano de 17 a 20% quando tratadas com 0,23 kg (0,5 libra) de dicamba no estágio pré-emergência, seguido por 0,91 kg (2 libras) de dicamba no estágio pós-emergência (V6). Isso se compara com plantas de soja que foram transformadas com um construto que codifica um DMO ligado a um peptídeo de trânsito Rubisco apenas, que mostraram uma taxa de dano de cerca de 12%. Esses resultados indicam que o uso de um peptídeo de trânsito em aminoácidos adicionais resulta na produção de uma única atividade de DMO (ao invés de múltiplos polipeptídeos parcial ou diferentemente processados) e maior tolerância ao dicamba. A produção de uma única forma da enzima também levará à facilidade de caracterização de produto e custo de registro reduzido. Exemplo 5

Produção eficiente de DMO e maior tolerância ao dicamba requer um CTP

Plantas Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia foram transfor- madas com vários construtos (figura 1), conforme descrito no exemplo 3. As sementes transformadas foram selecionadas sobre um meio de cultura de tecido de planta contendo dicamba em várias concentrações, de 0,5, 1,0 a 2,0 mg/litro. Sementes que foram transformadas com construtos de DMO- CTP cresceram em plantas sob meio contendo dicamba e desenvolveram folhas primárias e secundárias, enquanto que sementes não-transformadas e segregantes negativos morreram ou não desenvolveram folhas primárias e secundárias. As plantas transgênicas que cresceram e foram testadas posi- tivas para o gene de DMO foram usadas para outra análise.

Conforme mostrado na figura 1, plantas que foram transforma- das com construtos sem um CTP exibiram pouca ou nenhuma tolerância ao dicamba. Plantas de soja transformadas com um construto de DNA que codi- fica um DMO sem ligá-lo a um CTP não mostraram tolerância pré- emergência, enquanto que plantas transformadas com construtos onde o DMO foi ligado ao CTP mostraram tolerância pré- e pós-emergência ao di- camba quando tratadas com 6,04 χ 10"5 kg/m2 (0,5 libra/a) de dicamba no estágio pré-emergência, seguido por 2,42 χ 10~4 kg/m2 (2 libras/a) de dicam- ba no estágio pós-emergência (V6). Exemplo 6 Produção de plantas transgênicas de milho tolerantes ao dicamba.

Para testar o uso de um gene de DMO ao proporcionar tolerân- cia ao dicamba em monocotiledôneas, plantas transgênicas de milho foram produzidas que compreendem um gene de DMO (por exemplo, SEQ ID NOS: 29, 33, 35, 37, 39) com ou sem um peptídeo de trânsito (por exemplo, TaWaxy1 CTP1, CTP2sintético, CTP4) sob o controle de elementos de ex- pressão de gene de planta, tal com um promotor (por exemplo, PCISV, e35S, OsActI, OsTPI, OsActI 5) e um íntron (por exemplo, OsActI, OsActI 5, OsTPI, ZmHSP70). Esse elemento de expressão contém um primeiro íntron e seqüências exônicas UTR de flanqueamento do gene de actina 1 de arroz e incluem 12 nt do éxon na extremidade 5' e 7 nt do éxon 2 na extremidade 3') e uma 3'UTR (por exemplo, TaHspI 7).

Plantas transgênicas de milho foram produzidas essencialmente através do método descrito no Pedido de Patente U.S. 20040244075. Even- tos transgênicos de milho tendo uma única cópia foram avaliados com rela- ção à tolerância ao dicamba em um experimento repetido em um único local. Seis eventos de cada um dos seis construtos foram usados. O design expe- rimental foi como segue: fileiras/entrada: 1; tratamento: 6,04 χ 10~5 kg/m2 (0,5 libras/a) de dicamba no estágio V3, seguido por 1,12 χ 10"4 kg/m2 (1 libra/a) de dicamba no estágio V8 (Clarity®, BASF, Raleigh, NC); repetições: 2; es- paçamento das fileiras: 0,76 m (30 polegadas); comprimento do lote: mínimo de 9,14 m (30 pés); densidade da planta: cerca de 30 plantas/5,33 m (17,5 pés); sulcos: 0,76 m (2,5 pés). O lote todo foi fertilizado uniformemente para obter uma safra agronomicamente aceitável. Um inseticida para o solo, tal como Force® 3G (Syngenta Crop Protection, Greensboro, NC, EUA) a 0,14 kg (5 oz). por 304,8 m (1000 pés) de fileira para controle da lagarta da raiz do milho foi aplicado no momento de plantio. Se infestação pela lagarta ne- gra foi observada, POUNCE® 3.2EC em uma taxa de 0,11 a 0,22 kg (4 a 8 oz). por 4,0 χ 103 m2 (acre) (FMC Corporation, Filadélfia, PA) foi usado. Além disso, um programa de pulverização de inseticida foi usado para controlar todas as pestes lepidópteras acima do solo, incluindo broca do milho Euro- peu, broca grande do milho e lagarta-do-cartucho. POUNCE® 3.2EC a 0,11 a 0,22 kg (4 a 8 oz). por 4,0 χ 103 (acre) foi aplicado a cada 3 semanas para controlar pestes lepidópteras; cerca de 4 aplicações foram feitas. O lote foi mantido sem erva daninha com uma aplicação pré-emergência de um herbi- cida, tal como Harness® Xtra 5.6L (Monsanto, St. Louis, MO) e Degree X- tra® (Monsanto, St. Louis, MO). Se escapes de ervas daninhas eram obser- vados na verificação não-tratada, eles eram controlados arrancando as er- vas daninhas manualmente ou com uma aplicação pós-emergência de PERMIT (Monsanto, St. Louis, MO) ou BUCTRIL® (Bayer, Research Triangle Park, NC) durante todo o experimento.

Linhagens endógamas de milho transformadas com construtos de DNA compreendendo um transgene de DMO foram testadas com relação à tolerância ao dicamba medindo o dano à raiz de fixação quando tratadas com 6,04 χ 10"5 kg/m2 (0,5 libras/a) de dicamba no estágio V3, seguido por 1,12 χ 10"4 kg/m2 (1 libra/a) de dicamba no estágio V8. O dano à raiz de fixa- ção foi avaliado visualmente contando o número de plantas em uma fileira que mostrava uma morfologia "atípica" de ter raízes de fixação fundidas quando comparado com uma morfologia típica de estrutura "similar a dedo". Conforme mostrado na tabela 4, plantas de milho transformadas com cons- trutos de DNA que codificam um DMO sem ligá-los a um CTP (pMON73699, pMON73704) mostraram maior nível de dano à raiz de fixação, isto é, menor nível de proteção quando de tratamento com dicamba. Os construtos que codificam um DMO ligado a um CTP (pMON73716, pMON73700, pMON73715, pMON73703) mostraram menor nível de dano à raiz de fixa- ção, isto é, maior nível de proteção quando de tratamento com dicamba. Tabela 4. Dano percentual à raiz de fixação exibido por plantas transgênicas de milho transformadas com construtos de DNA trazendo DMO quando tes- tadas com relação à tolerância ao dicamba. Endógamos/Construtos Detalhes Dano à raiz de fixação 01CSI6 Endógamo suscetível ao dicamba 95,4 LH244 Endógamo resistente ao dicamba 93,8 pMON73699 PC1SV/l-0sAct1/DM0- Wmc/TaHsp17 93,2 pMON73704 e35S/l-OsAct1/DMO- Wmc/TaHsp17 91,3 pMON73716 PC1 SV/l-OsAct1/TaWaxy/DMO- Wmc/TaHsp17 78,8 pMON73700 PC1 SV/l-OsAct1 /CTP1 /DMO- Wmc/TaHsp17 74,4 PMON73715 PC1 SV/l-OsAct1 /CTP2syn/DMO- Wmc/TaHsp17 68,2 PMON73703 | e35S/l-OsAct1/CTP1/DMO- Wmc/TaHsp17 68,8

A partir desses estudos em diversas espécies de planta (tam- bém, por exemplo, exemplos 3, 4 e 8), um peptídeo de trânsito de cloroplas- to é útil para objetivação eficiente de DMO e produção total de atividade de

DMO, levando a uma maior tolerância ao dicamba. Ainda, expressão de um CTP-DMO proporciona tolerância pré-emergência ao dicamba em milho. Exemplo 7

Construção de unidades de expressão de DMO eficientes

Vários elementos genéticos podem influenciar a expressão efici- ente de um gene, tal como um promotor, seqüência de peptídeo de trânsito de cloroplasto, um íntron, 5'UTR, região de codificação do gene, 3'UTR. Contudo, não é óbvio qual combinação funcionará melhor. Unidades de ex- pressão ou construtos de DMO eficientes são requeridos para produzir pro- dutos aperfeiçoados, tais como sementes e plantas tolerantes ao dicamba. Várias unidades de expressão de DMO foram construídas através de ligação operacional de um de cada um dos vários promotores, CTPs, variantes de DMO e 3'UTRs a fim de obter unidades de expressão de DMO eficientes para desenvolvimento de produto. Esses construtos foram transformados em soja através de métodos conhecidos na técnica (por exemplo, U.S. 6.384.301, U.S. 7.002.058 ou Zhang e outros, 1999). Sementes transgêni- cas foram obtidas e testadas com relação à tolerância pré- e pós- emergência ao herbicida dicamba. A tabela 5 mostra o dano % causado pelo dicamba (menor dano significa maior tolerância) quando sementes e plantas foram tratadas com 6,04 χ 10"5 kg/m2 (0,5 libras/a)cre de dicamba pré- emergência, seguido por 2,42 χ 10"4 kg/m2 (2 libras/acre) de dicamba pós- emergência no estágio V6. Sementes transformadas com construtos de DNA pMON68939 e pMON73723 que não traziam CTP foram incapazes de tole- rar a aplicação pré-emergência de dicamba, indicando que a objetivação de DMO ao cloroplasto é requerida para obter tolerância pré-emergência ao dicamba. Plantas transformadas com pMON68939 e pMON73723 (sem CTP) que foram tratadas com dicamba no estágio pós-V3 em uma taxa de 1,12 χ 10"4 kg/m2 (1 libra/a) mostraram uma taxa de dano de 55% e 57%, respectivamente, similar à soja do tipo silvestre (60%), enquanto que as plantas transformadas com pMON68938 (com CTP) mostraram muito pouco dano. Esses resultados indicam que um CTP é requerido para obtenção de tolerância pré- e pós-emergência ao dicamba em soja.

Tabela 5 . Dano percentual exibido por plantas de soja transformadas com uma unidade de expressão de DMO específica e tratadas com dicamba pré- emergência e pós-emergência._

Unidade de expressão Designação pMON Dano % PC1 SV/CTP2syn/DMO-Wat(A)/nos 73724 9 e35S/CTP 1 /D MO-Wat( L )/nos 68938 12 PC1 SV/RbcSnoc/DMO-Wat(A)/nos 73725 12 PC1 SV/RbcSnoc/DMO-Wat(L)/nos 73728 12 PCSV/CTP1/DMO-Wat(A)/nos 73729 13 PC1 SV/CTP2syn/DMO-Wat(L)/nos 73727 13 ANT1/CTP1/DMO-Wat(L)/nos 68945 14 PC1 SV/RbcSnoc/DMO-Wat(A)/nos 73730 15 PC1 SV/RbcS-CTP/DMO-Cnat(A)/nos 68934 17 Act7/CTP 1 /DM 0-Wat( L )/nos 68942 17 FMV.35S-EF1a/CTP1/DMO-Wat(L)/nos 68940 17 PCISV/ RbcS-CTP/DMO-Cnat(A) /E9 84254 20 FMV/CTP1 /DMO-Wat(L)/nos 68941 29 elF4A10/CTP1/DMO-Wat(L)/nos 68943 60 e35S/CTP1/DMO-Cat(A)/nos 68937 62 e35S/CTP1/DMO-Cnat(L)/nos 68946 73 e35S/DMO-Wat(A)/nos 68939 100 (Pré) PC1 SV/DMO-Wat(A)/nos 73723 100 (Pré)

Exemplo 8

Produção de plantas transgênicas de algodão tolerantes ao dicamba.

Para testar o uso do gene de DMO ao proporcionar tolerância ao dicamba a algodão, plantas transgênicas de algodão foram produzidas. Vá- rios construtos de DNA trazendo uma região de codificação de DMO (por exemplo, SEQ ID Nos: 23, 25, 27, 29, 31, 35) com um peptídeo de trânsito (por exemplo, PsRbcS CTP1 CTP1, CTP2) sob o controle de elementos de expressão do gene de planta, tal como um promotor (por exemplo, PCISV, FMV ou e35S) e uma 3'UTR (por exemplo, E6; Acesso # U30508) foram produzidas e transformadas em algodão (Gossypium hirsutum) como segue. Os meios usados são mencionados na tabela 6.

Mudas de algodão cv Coker 130 foram crescidas in vitro e se- ções do hipocótilo foram cortadas com uma suspensão líquida de Agrobacte- rium tumefaciens trazendo um construto de DNA, secas em papel toalha e cocultivadas durante 2 dias. Explantes de hipocótilo inoculados foram, então, transferidos para meio de seleção com glicose durante 4 semanas, meio de seleção com sacarose durante 1 semana e para meio de seleção com glico- se durante mais 4 semanas para indução de caule. As culturas foram incu- badas em um ciclo de 16/8 (claro/escuro) e temperatura de 28°C. Caules resistentes à canamicina foram, então, transferidos para meio UMO e culti- vados no escuro durante de 16 a 24 semanas a 28 a 30°C para indução de caule embriogênico. O caule embriogênico foi, então, colhido desses caules e mantido durante até de 4 a 16 semanas no escuro a 28 a 30°C sobre meio TRP+. Pequenos embriões do caule embriogênico foram colhidos e germi- nados sobre meio SHSU em um ciclo de 16/8 (claro/escuro) e temperatura de 28 a 30°C. Mudas que pareciam normais foram, então, transferidas para o solo a fim de obter plantas de algodão maduras. A natureza transgênica dos transformantes foi confirmada através de testagem de DNA.

Tabela 6. Composição de vários meios usados para transformação de algodão.

Componentes Quantidade/L Glicose Saca- rose UMO TRP+ SHSU Sais basais MS (Phytotech.) 4,33 g 4,33 g 4,33 g 4,33 g - Vitaminas B5 de Gamborg (Phytotech) (500X) 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml - 2, 4-D (1 mg/ml) 0,1 ml 0,1 ml - - Stewart and Hsu majors (10X) _ - _ 100 ml Stewart and Hsu minors (100X) 10 ml Steward and Hsu organic (100X) 10 ml Cinetina (0,5 mg/ml) 1 ml 1 ml - - - Ferro quelado (100X) . - - 1,5 ml Glicose 30 g 30 g 30 g 30 g 5g Nitrato de potássio - 1,9 g - Hidrolisato de caseína _ - 0,1 g - PH 5,8 5,8 5,8 5,8 6,8 Phytagel (Sigma) 2,5 g 2,5 g - - - Gelrite (KeIco) - 3,5 g 3,5 g 2,2 g Carbenicilina (250 mg/ml) 1,7 ml 1,7 ml 1,7 ml 1,7 ml - Cefotaxima (100 mg/ml) 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml - Benlato (50 mg/ml) _ - 1 ml 1 ml Canamicina (50 mg/ml) 0,8-1,0 ml 0,8-1,0 ml 1 ml - - Sacarose - 0,1 g - - - Ácido ascórbico - 100 mg

Plantas de algodão transformadas que compreendem tal cons-

truto de DNA, cada uma compreendendo uma combinação diferente de uma região de codificação de DMO com um peptídeo de trânsito, um promotor e uma 3'UTR, foram tratadas com dicamba (Clarity®, BASF, Raleigh1 NC) co- mo um tratamento pós-emergência no estágio de crescimento V4-5 na taxa de 6,04 χ 10"δ kg/m2 (561 g ae/ha (0,5 libras/a)) e descobriu-se que eram tolerantes, enquanto que plantas de algodão não-transformadas mostraram uma taxa de dano de 79% a 86%. Plantas transgênicas mostrando mais de 95% de tolerância (igual a menos de 5% de dano) foram selecionadas para outros estudos. Plantas transgênicas também eram tolerantes a um trata- mento pós-emergência subsequente de dicamba. Por exemplo, as plantas que foram tratadas com 6,04 χ 10"5 kg/m2 (0,5 libras/a)cre de dicamba no estágio V3-4, seguido por 1,12 χ 10~4 ou 2,24 χ 10"4 kg/m2 (1 ou 2 libras/acre) de dicamba em V5 ou estágios posteriores ainda eram tolerantes ao dicam- ba. Esse exemplo mostra que um gene de DMO pode proporcionar tolerân- cia ao dicamba ao algodão em vários estágios de crescimento, assim, permi- tindo a aplicação de dicamba em vários estágios para obter controle eficaz de ervas daninhas. Exemplo 9

Método para melhorar a capacidade de sustentação de milho

Determinadas monocotiledôneas, tal como milho, produzem raí- zes de fixação as quais crescem a partir dos nódulos acima da superfície do solo e ajudam a sustentar a planta e remover as camadas superiores do solo para água e nutrientes durante os estágios reprodutivos. Um sistema de raiz de fixação saudável se torna importante se as plantas são submetidas a grandes ventos ou quando o sistema de raiz subterrânea se torna mais fraco por infecção pelo verme da raiz ou sob um déficit de água no solo. Herbici- das sintéticos, tais como dicamba e 2,4-D, são permitidos para uso sobre monocotiledôneas, tal como milho, para amplo controle de ervas daninhas da folha. Para controle de erva daninha pós-emergente, o dicamba é o 5° herbicida mais amplamente usado. Embora a taxa ótima para amplo controle de erva daninha na folha esteja entre 280 χ 10"7 a 560 χ 10"7 kg/m2 (280 a 560 gramas/hectare (g/h)) ou 3,02 χ 10~5 a 6,04 χ 10"5 kg/m2 (0,25 a 0,5 li- bras/acre), a taxa de uso médio em milho é de 168 g/h ou 1,81 χ 10"6 kg/m2 (0,15 libras/acre) uma vez que, em taxas maiores e sob determinadas condi- ções ambientais, tal como em dias quentes, o dicamba pode danificar o mi- lho. Além disso, vários híbridos de milho, tais como DKC61-42, DKC64-77, DKC63-46, DKC66-21 e DKC61-44 e endógamos, tais como 01CSI6, 16IUL2, 70LDL5 e 90LCL6, são sensíveis à aplicações de dicamba. A sensi- bilidade é manifestada de muitas formas, tal como ocorrência de formação de folhas em cebola, má formação de pendões, altura reduzida da planta ou formação de raiz de fixação anormal, por exemplo, formação de raiz fundida ou enrolada. As raízes de fixação se tornam retorcidas, tendendo a crescer juntas e não crescendo no solo para suportar a planta. Isso pode resultar em pobre capacidade de sustentação de uma safra de milho, maior suscetibili- dade a acamamento e, eventualmente, perdas de rendimento. Vários produ- tos herbicidas que contêm dicamba, por exemplo, Clarity®, BANVEL, MARKSMAN, DISTINCT, NORTHSTAR e CELEBRITY PLUS podem, assim, causar esses efeitos. Aumento da tolerância de milho ao dicamba também será útil na proteção de campos de milho plantados mais próximos de espé- cies de safra, tais como soja e algodão, que são tolerantes ao dicamba e onde uma maior taxa de aplicação de dicamba é permitida.

O presente exemplo proporciona um método para melhorar a capacidade de sustentação de milho e outras monocotiledôneas através de incorporação de um gene de DMO em milho e tratamento do milho com di- camba. Em uma modalidade, o gene de DMO é expresso sob o controle de um promotor constitutivo que também é capaz de expressar DMO na região nodal e/ou em raízes de fixação. Em outra modalidade, o gene de DMO é expresso sob o controle de um promotor constitutivo quimérico e raiz de fi- xação/nódulo-específico. Em outra modalidade, o gene de DMO é expresso sob o controle de um promotor raiz-específico, tal como RCc3 ou uma vari- ante do mesmo (por exemplo, SEQ ID N0s: de 1 a 6, conforme encontrado na US20060101541). A expressão de DMO em raízes de fixação resulta em nenhum ou menos dano às raízes de fixação, resultando em melhor capaci- dade de sustentação do milho, menos acamamento e, portanto, melhor ren- dimento.

Sementes R1 ou F1 de três eventos de cópia única de plantas de milho transformadas com vários construtos de DMO (esboçados na tabe- la 7) foram germinadas em bandejas de 4,0". Plantas saudáveis foram trans- plantadas para vasos de cerca de 10". Os meios de germinação e cresci- mento compreendiam Redi-earth® (Scotts-Sierra Horticultural Products Co., Marysville, Ohio). Os vasos foram colocados sob ação capilar em bandejas para molhar de fibra de vidro de 88,9 cm (35 polegadas) χ 152,4 cm (60 po- legadas) para subirrigação durante o decorrer do período de teste, de modo a manter umidade ótima do solo para crescimento da planta. Os vasos foram fertilizados com Osmocote (liberação lenta 14-14-14; Scotts-Sierra Horticul- tural Products Co., Marysville, Ohio) na taxa de 3,53 g/l (100 gm/cu.pé) para sustentar o crescimento da planta durante o período de experimentos na estufa. As plantas foram crescidas na estufa em uma temperatura de 29°C/210C dia/noite, com umidade relativa entre 25% e 75% para estimular condições de crescimento na estação quente no final da primavera. Um fo- toperíodo mínimo de 14 h foi proporcionado, com luz suplementar em torno de 600 μΕ conforme necessário.

Aplicações de dicamba foram feitas com o pulverizador regulável usando um bico de pulverização de jato plano Teejet 9501E (Spraying Sys- tems Co, Wheaton, IL) com a pressão do ar ajustada em um mínimo de 165 kpa (24 psi). O bico de pulverização foi mantido em uma altura de cerca de 40,64 cm (16 polegadas) acima da parte superior do material de planta para pulverização. O volume de pulverização foi de 10 galões por acre ou 92 litros por hectare. As aplicações foram feitas quando as plantas tinham atingido o estágio de folha V4-5.

Plantas com uma linhagem de milho endógama transformadas com construtos de DNA compreendendo uma unidade de expressão de DMO foram testadas com relação ao dano à raiz de fixação e acamamento através de tratamento com 2,42 χ 10"4 kg/m2 (2 libras/acre) ou 4,84 χ 10"4 kg/m2 (4 libras/acre) de dicamba no estágio V4-5 e avaliação das plantas com relação ao dano à raiz de fixação (0%; nenhum dano visível à planta) a 100% (morte completa da planta); e acamamento (grau de inclinação) a 24 DAT.

Conforme mostrado na tabela 7, plantas de milho transformadas com os construtos de DNA tendo uma unidade de expressão de DMO mos- traram pouco ou nenhum dano à raiz de fixação β acamamento Quando comparado com a linhagem endógama de controle não-transformada e plan- tas transformadas com uma unidade de expressão de marcador selecionável apenas (pMON73746). Esse exemplo mostra que plantas contendo DMO podem ser usadas para proporcionar capacidade de sustentação aperfeiço- ada quando tratadas com dicamba.

Tabela 7. Plantas de milho transformadas com vários construtos de DMO mostram nenhum ou pouco dano às raízes de fixação e acamamento quan-

do tratadas com dicamba.

Endoga- mia / construto Evento Detalhes do construto Nivel de aplica çâo de dicamba 2,42 χ 10"4 kg/m2 (2 libras/acre) 4,84 χ 10"4 kg/m2 (4 li- bras/acre) % de dano à raiz de fixação e acamamento em 24 DAT 24 DAT controle 17,5 31,7 73746 R1 S21454 O Sem unidade de expressão de DMO 20,0 28,1 73746 F1 S21588 6 33,8 40,0 73703 F2 S18300 1 e35S/l-OsAct1/CTP1-DMO Wmc/TaHsp17 0,9 1,0 73744 F1 S20838 8 OsActI/I-OsActI/CTP2syn- DMOWmc/TaHspI 7 0,0 0,2 73744 F1 S20837 3 0,0 0,4 73744 F1 S20838 2 0,0 0,0 73747 R1 S20761 2 PCISV/l-OsAct1/CTP4-DMOWmc/TaHsp17 0,6 1,8 73747 R1 S20760 8 0,8 1,0 73747 R1 S20836 7 0,0 0,0 73743 R1 S20847 6 PCSV/l-OsAct1 /CTP2syn/DMO- Cmc/TaHsp17 3,9 19,6 73743 R1 S20846 θ 1,3 22,9 73743 R1 S20807 1 2,7 13,5 73742 R1 S21340 4 PCISV/l-OsAct1 /CTP2syn-DM0- Cnat/TaHsp17 0,0 0,0 73742 R1 S21339 5 0,2 0,4 73742 R1 I S21211 1 0,4 0,5 REFERÊNCIAS

As referências listadas abaixo são incorporadas aqui por refe- rência até o ponto em que elas suplementam, explicam, proporcionam uma base para ou ensinam a metodologia, técnicas e/ou composições emprega- das aqui.

Patente U.S. 4.554.101 5.846.797; Patente U.S. 5.004.863 5.159.135; Patente U.S. 5.229.114 5.322.938; Patente U.S. 5.352.605 5.362.865; Patente U.S. 5.378.619 5.424.412; Patente U.S. 5.463.175 5.512.466; Patente U.S. 5.516.671 5.538.880; Patente U.S. 5.543.576 5.552.299; Patente U.S. 5.641.876 5.567.862; Patente U.S. 5.591.616 5.633.435; Patente U.S. 5.635.055 5.659.122; Patente U.S. 5.689.041 5.716.837; Patente U.S. 5.728.925 5.750.876; Patente U.S. 5.763.241 5.773.696; Patente U.S. 5.804.425 5.837.848; Patente U.S. 5.850.019 5.859.347; Patente U.S. 5.866.775 5.942.664; Patente U.S. 5.958.745 5.981.834; Patente U.S. 5.981.840 5.998.700; Patente U.S. 5.942.658 6.5412.59; Patente U.S. 6.011.199 6.015.940; Patente U.S. 6.023.013 6.063.597; Patente U.S. 6.063.756 6.080.560; Patente U.S. 6.093.695 6.110.464; Patente U.S. 6.121.436 6.140.078; Patente U.S. 6.153.814 6.160.208; Patente U.S. 6.166.292

Patente U.S. 5.015.580 Patente U.S. 5.017.692 Patente U.S. 5.304.730 Patente U.S. 5.359.142 Patente U.S. 5.384.253 Patente U.S. 5.508.184 Patente U.S. 5.530.196 Patente U.S. 5.550.318 Patente U.S. 5.567.600 Patente U.S. 5.608.149 Patente U.S. 5.641.876 Patente U.S. 5.689.052 Patente U.S. 5.750.871 Patente U.S. 5.763.245 Patente U.S. 5.824.877 Patente U.S. 5.850.023 Patente U.S. 5.869.720 Patente U.S. 5.959.091 Patente U.S. 5.985.605 Patente U.S. 5.880.275 Patente U.S. 6.013.864 Patente U.S. 6.051.753 Patente U.S. 6.072.103 Patente U.S. 6.107.549 Patente U.S. 6.140.075 Patente U.S. 6.156.573 Patente U.S. 6.171.640

Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. 6.175.060; Patente U.S. 6.177.611; Patente U.S. 6.177.615

6.215.048; Patente U.S. 6.221.649 6.225.114; Patente U.S. 6.228.623 6.232.526; Patente U.S. 6.235.971 6.248.536; Patente U.S. 6.248.876 6.271.443; Patente U.S. 6.281.016 6.294.714; Patente U.S. 6.313.378 6.326.351; Patente U.S. 6.372.211 6.380.466; Patente U.S. 6.384.301 6.399.330; Patente U.S. 6.399.861 6.423.828; Patente U.S. 6.426.446 6.429.357; Patente U.S. 6.429.362 6.437.217; Patente U.S. 6.441.277 6.448.476; Patente U.S. 6.459.018 6.476.295; Patente U.S. 6.476.295 6.489.461; Patente U.S. 6.495.739 6.506.962; Patente U.S. 6.506.962 6.521.442; Patente U.S. 6.531.648 6.537.756; Patente U.S. 6.538.109 6.538.179; Patente U.S. 6.538.181 6.573.361; Patente U.S. 6.576.818 6.593.293; Patente U.S. 6.596.538 6.617.496; Patente U.S. 6.620.988 6.635.806; Patente U.S. 6.639.054 6.645.497; Patente U.S. 6.653.280 6.657.046; Patente U.S. 6.660.849 6.686.452; Patente U.S. 6.706.950 6.716.474; Patente U.S. 6.723.837 6.770.465; Patente U.S. 6.774.283 6.809.078; Patente U.S. 6.812.379

Patente U.S. 6.222.098 Patente U.S. 6.228.992 Patente U.S. 6.242.241 Patente U.S. 6.252.138 Patente U.S. 6.284.949 Patente U.S. 6.316.407 Patente U.S. 6.380.462 Patente U.S. 6.388.170 Patente U.S. 6.403.865 Patente U.S. 6.426.447 Patente U.S. 6.433.252 Patente U.S. 6.444.876 Patente U.S. 6.468.523 Patente U.S. 6.483.008 Patente U.S. 6.501.009 Patente U.S. 6.518.488 Patente U.S. 6.537.750 Patente U.S. 6.538.178 Patente U.S. 6.555.655 Patente U.S. 6.589.767 Patente U.S. 6.608.241 Patente U.S. 6.624.344 Patente U.S. 6.642.030 Patente U.S. 6.653.530 Patente U.S. 6.663.906 Patente U.S. 6.713.063 Patente U.S. 6.723.897 Patente U.S. 6.803.501 Patente U.S. 6.822.141

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Monsanto Technology LLC Feng, Paul C.C. Malven, Marianne Stanislaw Flasinski

<120> PEPTÍDEOS DE TRÂNSITO DE CLOROPLASTO PARA OBJETIVAÇÃO EFICIENTE

DE DMO E USOS DOS MESMOS

<130> <140> <141> <150> <151> <150> <151> <160> <170> <210> <211> <212> <213> <4 00>

MONS:107WO Desconhecido

2007-06-06 11/758,659 2007-06-05 60/891,675 2007-02-26 41

3.3 1

84

PRT

Pisum sativum 1

Met Ala Ser Met Ile Ser Ser Ser Ala Val Thr Thr Val Ser Arg Ala 10 15

Ser Arg Gly Gln Ser Ala Ala Met Ala Pro Phe Gly Gly Leu Lys Ser

25 30

Met Thr Gly Phe Pro Val Arg Lys Val Asn Thr Asp Ile Thr Ser Ile

40 45

Thr Ser Asn Gly Gly Arg Val Lys Cys Met Gln Val Trp Pro Pro Ile

50 55 60

Gly Lys Lys Lys Phe Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Pro Pro Leu Thr Arg 65 70 75 80

Asp Ser Arg Ala

<210> 2

<211> 57

<212> PRT

<213> Pisum sativum

<400> 2

Met Ala Ser Met Ile Ser Ser Ser Ala Val Thr Thr Val Ser Arg Ala 10 15

Ser Arg Gly Gln Ser Ala Ala Met Ala Pro Phe Gly Gly Leu Lys Ser

25 30

Met Thr Gly Phe Pro Val Arg Lys Val Asn Thr Asp Ile Thr Ser Ile

40 45

Thr Ser Asn Gly Gly Arg Val Lys Cys

50 55

<210> 3

<211> 85

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 3

Met Ala Ser Ser Met Leu Ser Ser Ala Thr Met Val Ala Ser Pro Ala 10 15

Gln Ala Thr Met Val Ala Pro Phe Asn Gly Leu Lys Ser Ser Ala Ala

25 30

Phe Pro Ala Thr Arg Lys Ala Asn Asn Asp Ile Thr Ser Ile Thr Ser

40 45

Asn Gly Gly Arg Val Asn Cys Met Gln Val Trp Pro Pro Ile Glu Lys

50 55 60

Lys Lys Phe Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Pro Asp Leu Thr Asp Ser Gly 65 70 75 80

Gly Arg Val Asn Cys

85

<210>

4 <211> 76 <212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 4

Met Ala Gln Val Ser Arg Ile Cys Asn Gly Val Gln Asn Pro Ser Leu 10 15

Ile Ser Asn Leu Ser Lys Ser Ser Gln Arg Lys Ser Pro Leu Ser Val

25 30

Ser Leu Lys Thr Gln Gln His Pro Arg Ala Tyr Pro Ile Ser Ser Ser

40 45

Trp Gly Leu Lys Lys Ser Gly Met Thr Leu Ile Gly Ser Glu Leu Arg

50 55 60

Pro Leu Lys Val Met Ser Ser Val Ser Thr Ala Cys 65 70 75

<210> 5

<211> 76

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<4 00> 5

Met Ala Gln Val Ser Arg Ile Cys Asn Gly Val Gln Asn Pro Ser Leu 10 15

Ile Ser Asn Leu Ser Lys Ser Ser Gln Arg Lys Ser Pro Leu Ser Val

25 30

Ser Leu Lys Thr Gln Gln His Pro Arg Ala Tyr Pro Ile Ser Ser Ser

40 45

Trp Gly Leu Lys Lys Ser Gly Met Thr Leu Ile Gly Ser Glu Leu Arg

50 55 60

Pro Leu Lys Val Met Ser Ser Val Ser Thr Ala Cys 65 70 75

<210> 6 <211> 72

<212> PRT

<213> Petunia hybrida

<4 00> 6

Met Ala Gln Ile Asn Asn Met Ala Gln Gly Ile Gln Thr Leu Asn Pro 10 15

Asn Ser Asn Phe His Lys Pro Gln Val Pro Lys Ser Ser Ser Phe Leu

25 30

Val Phe Gly Ser Lys Lys Leu Lys Asn Ser Ala Asn Ser Met Leu Val

40 45

Leu Lys Lys Asp Ser Ile Phe Met Gln Lys Phe Cys Ser Phe Arg Ile

50 55 60

Ser Ala Ser Val Ala Thr Ala Cys 65 70

<210> 7

<211> 69

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 7

Met Ala Ala Leu Val Thr Ser Gln Leu Ala Thr Ser Gly Thr Val Leu 10 15

Ser Val Thr Asp Arg Phe Arg Arg Pro Gly Phe Gln Gly Leu Arg Pro

25 30

Arg Asn Pro Ala Asp Ala Ala Leu Gly Met Arg Thr Val Gly Ala Ser

40 45

Ala Ala Pro Lys Gln Ser Arg Lys Pro His Arg Phe Asp Arg Arg Cys

50 55 60

Leu Ser Met Val Val 65

<210> 8

<211> 77

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 8

Met Ala Ala Leu Thr Thr Ser Gln Leu Ala Thr Ser Ala Thr Gly Phe 10 15

Gly Ile Ala Asp Arg Ser Ala Pro Ser Ser Leu Leu Arg His Gly Phe 20 25 30 Gln Gly Leu Lys Pro Arg Ser Pro Ala Gly Gly Asp Ala Thr Ser Leu 35 40 45 Ser Val Thr Thr Ser Ala Arg Ala Thr Pro Lys Gln Gln Arg Ser Val 50 55 60 Gln Arg Gly Ser Arg Arg Phe Pro Ser Val Val Val Cys 65 70 75 <210> 9 <211> 57 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <4 00> 9 Met Ala Ser Ser Val Leu Ser Ser Ala Ala Val Ala Thr Arg Ser Asn 1 5 10 15 Val Ala Gln Ala Asn Met Val Ala Pro Phe Thr Gly Leu Lys Ser Ala 20 25 30 Ala Ser Phe Pro Val Ser Arg Lys Gln Asn Leu Asp Ile Thr Ser Ile 35 40 45 Ala Ser Asn Gly Gly Arg Val Gln Cys 50 55 <210> 10 <211> 65 <212> PRT <213> Zea mays <400> 10 Met Glu Ser Leu Ala Ala Thr Ser Val Phe Ala Pro Ser Arg Val Ala 1 5 10 15 Val Pro Ala Ala Arg Ala Leu Val Arg Ala Gly Thr Val Val Pro Thr 20 25 30 Arg Arg Thr Ser Ser Arg Ser Gly Thr Ser Gly Val Lys Cys Ser Ala 35 40 45 Ala Val Thr Pro Gln Ala Ser Pro Val Ile Ser Arg Ser Ala Ala Ala 50 55 60

10

15

20

25

30

Ala

65

<210> 11

<211> 72

<212> PRT

<213> Ruta graveolens

40 <400> 11

Met Gly Ala Ala Ala Thr Ser Met Gln Ser Leu Lys Phe Ser Asn Arg 10 15

Leu Val Pro Pro Ser Arg Arg Leu Ser Pro Val Pro Asn Asn Val Thr 25 30

45 Cys Asn Asn Leu Pro Lys Ser Ala Ala Pro Val Arg Thr Val Lys Cys 40 45

Cys Ala Ser Ser Trp Asn Ser Thr Ile Asn Gly Ala Ala Ala Thr Thr

50 55 60

Asn Gly Ala Ser Ala Ala Ser Ser

50 65 70

<210> 12

<211> 252

<212> DNA

<213> Pisum Sativum

55 <4 00> 12

atggcttcta tgatatcctc ttccgctgtg acaacagtca gccgtgcctc tagggggcaa 60 tccgccgcaa tggctccatt cggcggcctc aaatccatga ctggattccc agtgaggaag 120 gtcaacactg acattacttc cattacaagc aatggtggaa gagtaaagtg catgcaggtg 180 tggcctccaa ttggaaagaa gaagtttgag actctttcct atttgccacc attgacgaga 240 60 gattcccggg cc 252

<210> 13

<211> 171

<212> DNA

<213> Pisum sativum

65 <400> 13

atggcttcta tgatatcctc ttccgctgtg acaacagtca gccgtgcctc tagggggcaa 60 tccgccgcaa tggctccatt cggcggcctc aaatccatga ctggattccc agtgaggaag 120 10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

gtcaacactg

<210>

<211>

<212>

<213>

<4 00>

atggcttcct gtcgctcctt aacgacatta ccgattgaaa ggtcgcgtca <210> <211> <212> <213> <4 00>

atggcgcaag

tcgaaatcca

cgagcttatc

tctgagcttc

<210>

<211>

<212>

<213>

<400>

atggcgcaag

tcgaaatcca

cgagcttatc

tctgagcttc

<210>

<211>

<212>

<213>

<400>

atggcccaga

cacaagccgc

aatagcgcca

tcctttcgca

<210>

<211>

<212>

<213>

<4 00>

atggcggcac

cgcttccggc

gggatgagga

gaccgccggt

<210>

<211>

<212>

<213>

<400>

atggcggctc

aggtcggcgc

gccggcggcg

cagcggtcgg

<210>

<211>

<212>

<213>

<4 00>

atggcttcct

aacatggttg

caaaaccttg

<210>

<211>

<212>

acattacttc cattacaagc

14

255

DNA

Arabidopsis thaliana

14

ctatgctctc ttccgctact tcaacggact taagtcctcc cttccatcac aagcaacggc agaagaagtt tgagactctc actgc

15 228 DNA

Arabidopsis thaliana

15

ttagcagaat ctgcaatggt gtcaacgcaa atctccctta cgatttcgtc gtcgtgggga gtcctcttaa ggtcatgtct

16 228 DNA

Seqüência artificial 16

ttagcagaat ctgcaatggt gtcaacgcaa atctccctta cgatttcgtc gtcgtgggga gtcctcttaa ggtcatgtct 17 216 DNA

Seqüência artificial

17

tcaacaacat ggcccagggc aagtgcccaa gtctagctcc attccatgct ggtcctgaag tcagtgcttc ggttgcgact

18 207 DNA

Seqüência artificial 18

tggtgacctc ccagctcgcg

gtcccggctt ccagggactg

cggtgggcgc gtccgcggct

gcttgagcat ggtcgtc

19

231

DNA

Oryza sativa

19

tcaccacgtc ccagctcgcc cgtcgtcgct gctccgccac acgcgacgtc gctcagcgtg tgcagcgtgg cagccggagg

20 171 DNA

Nicotiana tabacum 20

cagttctttc ctctgcagca

cacctttcac tggccttaag

acatcacttc cattgccagc

21

195

DNA

aatggtggaa gagtaaagtg c

171

atggttgcct ctccggctca ggccactatg gctgccttcc cagccacccg caaggctaac ggaagagtta actgtatgca ggtgtggcct tcttaccttc ctgaccttac cgattccggt

60 120 180 240 255

gtgcagaacc catctcttat ctccaatctc tcggtttctc tgaagacgca gcagcatcca ttgaagaaga gtgggatgac gttaattggc tctgtttcca cggcgtgc

60 120 180 228

atccagaccc tgaaccctaa ctctaacttc ttcctcgtgt tcggctccaa gaagctcaag aaagactcga tcttcatgca gaagttctgc gcctgc

60 120 180 216

acaagcggca ccgtcctgtc ggtgacggac aggccacgga acccagccga tgccgctctc cccaagcaga gcaggaagcc acaccgtttc

60 120 180 207

acctcggcca ccggcttcgg catcgccgac gggttccagg gcctcaagcc ccgcagcccc acgaccagcg cgcgcgcgac gcccaagcag ttcccctccg tcgtcgtgtg c

60 120 180 231

gttgccaccc gcagcaatgt tgctcaagct tcagctgcct cattccctgt ttcaaggaag aacggcggaa gagtgcaatg c

60 120 171 10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<213> Zea mays

<400> 21

atggaatccc tagccgccac ctccgtgttc gcgccctccc cgggccctgg ttagggcggg gacggtggta ccaaccaggc accagcgggg tgaaatgctc tgctgccgtg acgccgcagg agcgctgcgg cggcc <210> 22 <211> 216 <212> DNA

<213> Ruta graveolens

<400> 22

atgggtgcag cggcaacgtc gatgcaatcc cttaaattct agtcgccgtc tgtctccggt tccgaacaat gtcacctgca gctcccgtcc ggacagtcaa atgctgcgct tcttcctgga gccgccacga ccaacggtgc gtccgccgcc agtagc <210> 23

<211> 1023

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<400> 23

atggccactt tcgttagaaa cgcttggtac gttgctgcac aagcctctag gaagaactat cctcgatact ccactagctc gttgtcgctg ccctgcttga tatttgtccg catcgcttcg ctagtcaacg gacatctcca gtgtccatat cacggtctgg tgtgtccaca acccgcacgg caacggagcc cgccctgctt cctgtcgtgg aaagagacgc attgatctgg atctgccctg cccggtgcta tccctgactt tgggtgtcgt gttgatccag tacggtcacg tggactgcaa ctacaagctc cttgtggata gctcagtacg tgcaccgcgc taacgcccaa acagacgcct gtgatcgttg gcgacggcga gatccaggcg ctcatgaaga gttctcatgg ctaagttctt gcgtggtgct aacacaccag cggtggaata aggtgtcggc tatgctgaac ttcatcgcgg aaggagcagt caatccactc ccgaggaacc catatcctta tgccattact tcttcggtag ttcccgcaac ttcggtatag gttctcagga gctggcaagc tcaagccctg gtgaaggagg atcgaaaggc ggagggctta cgtcgaagcg aacgggatca gacgaggcag ccgtcagggt atccagggag attgagaagc tga

gcgtcgccgt cccggcggcg ggacgagcag ccggagcgga cgagcccagt gattagcagg

60 120 180 195

ccaaccgtct ggtcccaccc ataacctccc caagtctgca acagtaccat caacggcgcg

60 120 180 216

ttcctgagga tctatcgtca ctccgttgag aatttgacgg ctctgaacgt gagatccagc cttaccgtac acctcatgga tcgatagact tccctggtgg ttgacgcctg tcgcgccgga ctcctgagac acgatccaga acaaagtggt gacccgccat tcgaacaact

gttgagcgag acctgacgga tgacggtatt aggtggccag gcgatcattc actcgcagat tgtcggaggt tcttggacac tgagcgtgag cacaccctca gaacgacatc agggacgccg cgaggcaagc gatggacggt cgttgaagct gttgtcctgc agaagcggcg

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1023

<210> 24 <211> 340 <212> PRT <213> Seqüência artificial <400> 24 Met Ala Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu 1 5 10 15 Glu Leu Ser Glu 20 Lys Pro Leu Gly Arg 25 Thr Ile Leu Asp Thr 30 Pro Leu Ala Leu Tyr 35 Arg Gln Pro Asp Gly 40 Val Val Ala Ala Leu 45 Leu Asp Ile Cys Pro 50 His Arg Phe Ala Pro 55 Leu Ser Asp Gly Ile 60 Leu Val Asn Gly His Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln 65 70 75 80 Cys Val His Asn Pro 85 His Gly Asn Gly Ala 90 Arg Pro Ala Ser Leu 95 Asn Val Arg Ser Phe 100 Pro Val Val Glu Arg 105 Asp Ala Leu Ile Trp 110 Ile Cys Pro Gly Asp 115 Pro Ala Leu Ala Asp 120 Pro Gly Ala Ile Pro 125 Asp Phe Gly Cys Arg 130 Val Asp Pro Ala Tyr 135 Arg Thr Val Gly Gly 140 Tyr Gly His Val Asp Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His 145 150 155 160 Ala Gln Tyr Val His 165 Arg Ala Asn Ala Gln 170 Thr Asp Ala Phe Asp 175 Arg Leu Glu Arg Glu 180 Val Ile Val Gly Asp 185 Glv Glu Ile Gln Ala 190 Leu Met Lys Ile Pro 195 Gly Gly Thr Pro Ser 200 Val Leu Met Ala Lys 205 Phe Leu Arg Gly Ala 210 Asn Thr Pro Val Asp 215 Ala Trp Asn Asp Ile 220 Arg Trp Asn Lys Val Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro 225 230 235 240 Lys Glu Gln Ser Ile 245 His Ser Arg Gly Thr 250 His Ile Leu Thr Pro 255 Glu Thr Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly 260 265 270 Ile Asp Asp 275 Pro Glu Met Asp Gly 280 Val Leu Arg Ser Trp 285 Gln Ala Gln Ala Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg 290 295 300 Arg 305 Ala Tyr Val Glu Ala 310 Asn Gly Ile Arg Pro 315 Ala Met Leu Ser Cys 320 Asp Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Glu Lys Leu Glu Gln

325 330 335

Leu Glu Ala Ala

340

<210> 25

<211> 1023

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<400> 25

atgctcactt tcgttagaaa cgcttggtac gttgctgcac ttcctgagga gttgagcgag 60 aagcctctag gaagaactat cctcgatact ccactagctc tctatcgtca acctgacgga 120 gttgtcgctg ccctgcttga tatttgtccg catcgcttcg ctccgttgag tgacggtatt 180 ctagtcaacg gacatctcca gtgtccatat cacggtctgg aatttgacgg aggtggccag 240

tgtgtccaca acccgcacgg caacggagcc cgccctgctt ctctgaacgt gcgatcattc 300

cctgtcgtgg aaagagacgc attgatctgg atctgccctg gagatccagc actcgcagat 360

cccggtgcta tccctgactt tgggtgtcgt gttgatccag cttaccgtac tgtcggaggt 420

tacggtcacg tggactgcaa ctacaagctc cttgtggata acctcatgga tcttggacac 480

gctcagtacg tgcaccgcgc taacgcccaa acagacgcct tcgatagact tgagcgtgag 540

gtgatcgttg gcgacggcga gatccaggcg ctcatgaaga tccctggtgg cacaccctca 600

gttctcatgg ctaagttctt gcgtggtgct aacacaccag ttgacgcctg gaacgacatc 660

cggtggaata aggtgtcggc tatgctgaac ttcatcgcgg tcgcgccgga agggacgccg 720

aaggagcagt caatccactc ccgaggaacc catatcctta ctcctgagac cgaggcaagc 780

40 tgccattact tcttcggtag ttcccgcaac ttcggtatag acgatccaga gatggacggt 840

gttctcagga gctggcaagc tcaagccctg gtgaaggagg acaaagtggt cgttgaagct 900

atcgaaaggc ggagggctta cgtcgaagcg aacgggatca gacccgccat gttgtcctgc 960

gacgaggcag ccgtcagggt atccagggag attgagaagc tcgaacaact agaagcggcg 1020

tga 1023

45 <210> 26

<211> 340

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

50 <400> 26

Met Leu Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu

10 15

Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu 55 20 25 30 Ala Leu Tyr 35 Arg Gln Pro Asp Gly 40 Val Val Ala Ala Leu 45 Leu Asp Ile Cys Pro 50 His Arg Phe Ala Pro 55 Leu Ser Asp Gly Ile 60 Leu Val Asn Gly 60 His Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln 65 70 75 80 Cys Val His Asn Pro 85 His Gly Asn Gly Ala 90 Arg Pro Ala Ser Leu 95 Asn Val Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Cys 65 100 105 110 Pro Gly Asp 115 Pro Ala Leu Ala Asp 120 Pro Gly Ala Ile Pro 125 Asp Phe Gly

Cys Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val 130 135 140

Asp Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His 145 150 155 160

Ala Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Thr Asp Ala Phe Asp Arg

165 170 175

Leu Glu Arg Glu Val Ile Val Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met

180 185 190 Lys Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu Met Ala Lys Phe Leu Arg 195 200 205 Gly Ala 210 Asn Thr Pro Val Asp 215 Ala Trp Asn Asp Ile 220 Arg Trp Asn Lys Val Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro 225 230 235 240 Lys Glu Gln Ser Ile 245 His Ser Arg Gly Thr 250 His Ile Leu Thr Pro 255 Glu Thr Glu Ala Ser 260 Cys His Tyr Phe Phe 265 Gly Ser Ser Arg Asn 270 Phe Gly Ile Asp Asp Pro Glu Met Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln 275 280 285 Ala Leu 290 Val Lys Glu Asp Lys 295 Val Val Val Glu Ala 300 Ile Glu Arg Arg Arg Ala Tyr Val Glu Ala Asn Gly Ile Arg Pro Ala Met Leu Ser Cys 305 310 315 320 Asp Leu Glu Glu Ala Ala Ala Ala 340 Val 325 Arg Val Ser Arg Glu 330 Ile Glu Lys Leu Glu 335 Gln

30

35

40

45

50

55

60

65

<210> <211> <212> <213> <220> <4 00>

27

1023 DNA

Seqüência artificial 27

atgctcactt tcgttagaaa cgcttggtac gttgctgcac aagcctctag gaagaactat cctcgatact ccactagctc gttgtcgctg ccctgcttga tatttgtccg catcgcttcg ctagtcaacg gacatctcca gtgtccatat cacggtctgg tgtgtccaca acccgcacgg caacggagcc cgccctgctt cctgtcgtgg aaagagacgc attgatctgg atctggcctg cccggtgcta tccctgactt tgggtgtcgt gttgatccag tacggtcacg tggactgcaa ctacaagctc cttgtggata gctcagtacg tgcaccgcgc taacgcccaa acagacgcct gtgatcgttg gcgacggcga gatccaggcg ctcatgaaga gttctcatgg ctaagttctt gcgtggtgct aacacaccag cggtggaata aggtgtcggc tatgctgaac ttcatcgcgg aaggagcagt caatccactc ccgaggaacc catatcctta tgccattact tcttcggtag ttcccgcaac ttcggtatag gttctcagga gctggcaagc tcaagccctg gtgaaggagg atcgaaaggc ggagggctta cgtcgaagcg aacgggatca gacgaggcag ccgtcagggt atccagggag attgagaagc tga

28 340 PRT

Seqüência artificial

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1023

<210> <211> <212> <213> <220> <400> Met 1

28

Leu Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val 10

Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile

25

Ala Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala

40

Cys Pro His Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly

50 55

His Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe

Ala Ala Leu Pro Glu 15

Leu Asp Thr Pro Leu 30

Ala Leu Leu Asp Ile 45

Ile Leu Val Asn Gly 60

Asp Gly Gly Gly Gln 65 70 75 80 Cys Val His Asn Pro 85 His Gly Asn Gly Ala 90 Arg Pro Ala Ser Leu 95 Asn Val Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Trp 100 105 110 Pro Gly Asp 115 Pro Ala Leu Ala Asp 120 Pro Gly Ala Ile Pro 125 Asp Phe Gly Cys Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val 130 135 140 Asp 145 Cys Asn Tyr Lys Leu 150 Leu Val Asp Asn Leu 155 Met Asp Leu Gly His 160 Ala Gln Tyr Val His 165 Arg Ala Asn Ala Gln 170 Thr Asp Ala Phe Asp 175 Arg Leu Glu Arg Glu Val Ile Val Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met 180 185 190 Lys Ile Pro 195 Gly Gly Thr Pro Ser 200 Val Leu Met Ala Lys 205 Phe Leu Arg Gly Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Trp Asn Asp Ile Arg Trp Asn Lys 210 215 220 Val Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro 225 230 235 240 Lys Glu Gln Ser Ile 245 His Ser Arg Gly Thr 250 His Ile Leu Thr Pro 255 Glu Thr Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly 260 265 270 Ile Asp Asp 275 Pro Glu Met Asp Gly 280 Val Leu Arg Ser Trp 285 Gln Ala Gln Ala Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg 290 295 300 Arg 305 Ala Tyr Val Glu Ala 310 Asn Gly Ile Arg Pro 315 Ala Met Leu Ser Cys 320 Asp Glu Ala Ala Val 325 Arg Val Ser Arg Glu 330 Ile Glu Lys Leu Glu 335 Gln

35

40

45

50

55

60

65

Leu Glu Ala Ala 340

<210> <211> <212> <213> <220> <4 00>

29

1023 DNA

Seqüência artificial 29

atggccacct tcgtccgcaa tgcctggtat gtggcggcgc aagccgctcg gccggacgat tctcgacaca ccgctcgcgc gtggtcgcgg cgctgctcga catctgtccg caccgcttcg ctcgtcaacg gccatctcca atgcccctat cacgggctgg tgcgtccata acccgcacgg caatggcgcc cgcccggctt ccggtggtgg agcgcgacgc gctgatctgg atctgtcccg cctggggcga tccccgactt cggctgccgc gtcgatcccg tatgggcatg tcgactgcaa ctacaagctg ctggtcgaca gcccaatatg tccatcgcgc caacgcccag accgacgcct gtgatcgtcg gcgacggtga gatacaggcg ctgatgaaga gtgctgatgg ccaagttcct gcgcggcgcc aatacccccg cgctggaaca aggtgagcgc gatgctcaac ttcatcgcgg aaggagcaga gcatccactc gcgcggtacc catatcctga tgccattatt tcttcggctc ctcgcgcaat ttcggcatcg gtgctgcgca gctggcaggc tcaggcgctg gtcaaggagg atcgagcgcc gccgcgccta tgtcgaggcg aatggcatcc gacgaagccg cagtccgtgt cagccgcgag atcgagaagc tga <210> <211> <212> <213> <220> <400>

tgcccgagga tctaccgcca cgccgctgag aattcgatgg cgctcaacgt gcgatccggc cctatcggac acctgatgga tcgaccggct ttcccggcgg tcgacgcttg tggcgccgga cccccgagac acgatccgga acaaggtcgt gcccggcgat ttgagcagct

actgtccgaa gcccgacggt cgacggcatc cggcgggcag ccgctccttc gctggccgat cgtcggcggc cctcggccac ggagcgcgag cacgccgagc gaacgacatc aggcaccccg ggaggcgagc gatggacggc cgtcgaggcg gctgtcgtgc cgaagccgcc

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1023

30

340

PRT

Seqüência artificial 30

Met Ala Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tvr Val 10

Ala Ala Leu Pro Glu 15 Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu 25 30

Ala Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile 40 45

Cys Pro His Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly Ile Leu Val Asn Gly

50 55 60

His Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln 65 70 75 80

Cys Val His Asn Pro His Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ala Ser Leu Asn

85 90 95

Val Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Cys 100 105 110

Pro Gly Asp Pro Ala Leu Ala Asp Pro Gly Ala Ile Pro Asp Phe Gly 115 120 125

Cys Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val

130 135 140

Asp Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His 145 150 155 160

Ala Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Thr Asp Ala Phe Asp Arg

165 170 175

Leu Glu Arg Glu Val Ile Val Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met 180 185 190

Lys Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu Met Ala Lys Phe Leu Arg 195 200 205

Gly Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Trp Asn Asp Ile Arg Trp Asn Lys

210 215 220

Val Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro 225 230 235 240

Lys Glu Gln Ser Ile His Ser Arg Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu

245 250 255

Thr Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly 260 265 270

Ile Asp Asp Pro Glu Met Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln 275 280 285

Ala Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg

290 295 300

Arg Ala Tyr Val Glu Ala Asn Gly Ile Arg Pro Ala Met Leu Ser Cys

40 305 310 315 320

Asp Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Glu Lys Leu Glu Gln 325 330 335

Leu Glu Ala Ala 340

45 <210> 31

<211> 1023

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220> 50 <400> 31

atggccactt tcgttagaaa cgcttggtac gttgctgcac ttcctgagga gttgagcgag 60

aagcctctag gaagaactat cctcgatact ccactagctc tctatcgtca acctgacgga 120

gttgtcgctg ccctgcttga tatttgtccg catcgcttcg ctccgttgag tgacggtatt 180

ctagtcaacg gacatctcca gtgtccatat cacggtctgg aatttgacgg aggtggccag 240

55 tgtgtccaca acccgcacgg caacggagcc cgccctgctt ctctgaacgt gcgatcattc 300

cctgtcgtgg aaagagacgc attgatctgg atctggcctg gagatccagc actcgcagat 360

cccggtgcta tccctgactt tgggtgtcgt gttgatccag cttaccgtac tgtcggaggt 420

tacggtcacg tggactgcaa ctacaagctc cttgtggata acctcatgga tcttggacac 480

gctcagtacg tgcaccgcgc taacgcccaa acagacgcct tcgatagact tgagcgtgag 540

60 gtgatcgttg gcgacggcga gatccaggcg ctcatgaaga tccctggtgg cacaccctca 600

gttctcatgg ctaagttctt gcgtggtgct aacacaccag ttgacgcctg gaacgacatc 660

cggtggaata aggtgtcggc tatgctgaac ttcatcgcgg tcgcgccgga agggacgccg 720

aaggagcagt caatccactc ccgaggaacc catatcctta ctcctgagac cgaggcaagc 780

tgccattact tcttcggtag ttcccgcaac ttcggtatag acgatccaga gatggacggt 840

65 gttctcagga gctggcaagc tcaagccctg gtgaaggagg acaaagtggt cgttgaagct 900

atcgaaaggc ggagggctta cgtcgaagcg aacgggatca gacccgccat gttgtcctgc 960

gacgaggcag ccgtcagggt atccagggag attgagaagc tcgaacaact agaagcggcg 1020 10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

10

tga

1023

<210> <211> <212> <213> <220> <4 00>

32

340

PRT

Seqüência artificial

Met Ala Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu 10 15

Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu

25 30

Ala Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile

40 45

Cys Pro His Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly Ile Leu Val Asn Gly

50 55 60

His Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln 65 70 75 80

Cys Val His Asn Pro His Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ala Ser Leu Asn

85 90 95

Val Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Trp

100 105 110

Pro Gly Asp Pro Ala Leu Ala Asp Pro Gly Ala Ile Pro Asp Phe Gly

115 120 125

Cys Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val

130 135 140

Asp Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His 145 150 155 160

Ala Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Thr Asp Ala Phe Asp Arg

165 170 175

Leu Glu Arg Glu Val Ile Val Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met

180 185 190

Lys Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu Met Ala Lys Phe Leu Arg

195 200 205

Gly Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Trp Asn Asp Ile Arg Trp Asn Lys

210 215 220

Val Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro 225 230 235 240

Lys Glu Gln Ser Ile His Ser Arg Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu

245 250 255

Thr Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly

260 265 270

Ile Asp Asp Pro Glu Met Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln

275 280 285

Ala Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg

290 295 300

Arg Ala Tyr Val Glu Ala Asn Gly Ile Arg Pro Ala Met Leu Ser Cys 305 310 315 320

Asp Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Glu Lys Leu Glu Gln 325 330 335

Leu Glu Ala Ala

atgaccttcg tccgcaatgc ctggtatgtg gcggcgctgc ccgaggaact gtccgaaaag 60

ccgctcggcc ggacgattct cgacacaccg ctcgcgctct accgccagcc cgacggtgtg 120

gtcgcggcgc tgctcgacat ctgtccgcac cgcttcgcgc cgctgagcga cggcatcctc 180

gtcaacggcc atctccaatg cccctatcac gggctggaat tcgatggcgg cgggcagtgc 240

gtccataacc cgcacggcaa tggcgcccgc ccggcttcgc tcaacgtccg ctccttcccg 300

gtggtggagc gcgacgcgct gatctggatc tggcccggcg atccggcgct ggccgatcct 360

ggggcgatcc ccgacttcgg ctgccgcgtc gatcccgcct atcggaccgt cggcggctat 420

gggcatgtcg actgcaacta caagctgctg gtcgacaacc tgatggacct cggccacgcc 480

caatatgtcc atcgcgccaa cgcccagacc gacgccttcg accggctgga gcgcgaggtg 540

atcgtcggcg acggtgagat acaggcgctg atgaagattc ccggcggcac gccgagcgtg 600

<210> <211> <212> <213> <400>

340 33 1020 DNA

Pseudomonas maltophilia

33 ctgatggcca agttcctgcg cggcgccaat acccccgtcg acgcttggaa cgacatccgc 660 tggaacaagg tgagcgcgat gctcaacttc atcgcggtgg cgccggaagg caccccgaag 720 gagcagagca tccactcgcg cggtacccat atcctgaccc ccgagacgga ggcgagctgc 780 cattatttct tcggctcctc gcgcaatttc ggcatcgacg atccggagat ggacggcgtg 840 ctgcgcagct ggcaggctca ggcgctggtc aaggaggaca aggtcgtcgt cgaggcgatc 900 gagcgccgcc gcgcctatgt cgaggcgaat ggcatccgcc cggcgatgct gtcgtgcgac 960 gaagccgcag tccgtgtcag ccgcgagatc gagaagcttg agcagctcga agccgcctga 1020 <210> 34

<211> 339

<212> PRT

<213> Pseudomonas maltophilia

<400> 34

Met Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu Glu 1 5 10 15

Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu Ala 25 30

Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile Cys

40 45

Pro His -Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly Ile Leu Val Asn Gly His 50 55 60

Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln Cys 65 70 75 80

Val His Asn Pro His Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ala Ser Leu Asn Val 85 90 95

Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Trp Pro 100 105 110

Gly Asp Pro Ala Leu Ala Asp Pro Gly Ala Ile Pro Asp Phe Gly Cys

115 120 125

Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val Asp

130 135 140

Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His Ala 145 150 155 160

Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Thr Asp Ala Phe Asp Arg Leu 165 170 175

Glu Arg Glu Val Ile Val Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met Lys 180 185 190

Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu Met Ala Lys Phe Leu Arg Gly

195 200 205

Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Trp Asn Asp Ile Arg Trp Asn Lys Val

40 210 215 220

Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro Lys 225 230 235 240

Glu Gln Ser Ile His Ser Arg Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu Thr 245 250 255

45 Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly Ile 260 265 270

Asp Asp Pro Glu Met Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln Ala

275 280 285

Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg Arg

50 290 295 300

Ala Tyr Val Glu Ala Asn Gly Ile Arg Pro Ala Met Leu Ser Cys Asp 305 310 315 320

Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Glu Lys Leu Glu Gln Leu 325 330 335

55 Glu Ala Ala

<210> 35

<211> 1023

<212> DNA

60 <213> Seqüência artificial

<400> 35

atgctcacct tcgtccgcaa tgcctggtat gtggcggcgc tgcccgagga actgtccgaa 60 aagccgctcg gccggacgat tctcgacaca ccgctcgcgc tctaccgcca gcccgacggt 120 gtggtcgcgg cgctgctcga catctgtccg caccgcttcg cgccgctgag cgacggcatc 180 65 ctcgtcaacg gccatctcca atgcccctat cacgggctgg aattcgatgg cggcgggcag 240 tgcgtccata acccgcacgg caatggcgcc cgcccggctt cgctcaacgt ccgctccttc 300 ccggtggtgg agcgcgacgc gctgatctgg atctgtcccg gcgatccggc gctggccgat 360 cctggggcga tccccgactt cggctgccgc gtcgatcccg cctatcggac cgtcggcggc 420 tatgggcatg tcgactgcaa ctacaagctg ctggtcgaca acctgatgga cctcggccac 4 80 gcccaatatg tccatcgcgc caacgcccag accgacgcct tcgaccggct ggagcgcgag 540 gtgatcgtcg gcgacggtga gatacaggcg ctgatgaaga ttcccggcgg cacgccgagc 600 gtgctgatgg ccaagttcct gcgcggcgcc aatacccccg tcgacgcttg gaacgacatc 660 cgctggaaca aggtgagcgc gatgctcaac ttcatcgcgg tggcgccgga aggcaccccg 720 aaggagcaga gcatccactc gcgcggtacc catatcctga cccccgagac ggaggcgagc 7 80 tgccattatt tcttcggctc ctcgcgcaat ttcggcatcg acgatccgga gatggacggc 840 gtgctgcgca gctggcaggc tcaggcgctg gtcaaggagg acaaggtcgt cgtcgaggcg 900 atcgagcgcc gccgcgccta tgtcgaggcg aatggcatcc gcccggcgat gctgtcgtgc 960 gacgaagccg cagtccgtgt cagccgcgag atcgagaagc ttgagcagct cgaagccgcc 1020 tga 1023

<210> 36

<211> 340

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<4 00> 36

Met Leu Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu 10 15

Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu

25 30

Ala Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile

40 45

Cys Pro His Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly Ile Leu Val Asn Gly

50 55 60

His Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln 65 70 75 80

Cys Val His Asn Pro His Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ala Ser Leu Asn

85 90 95

Val Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Cys

100 105 110

Pro Gly Asp Pro Ala Leu Ala Asp Pro Gly Ala Ile Pro Asp Phe Gly

115 120 125

Cys Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val

130 135 140

Asp Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His 145 150 155 160

Ala Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Thr Asp Ala Phe Asp Arg

165 170 175

Leu Glu Arg Glu Val Ile Val Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met

180 185 190

Lys Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu Met Ala Lys Phe Leu Arg

195 200 205

Gly Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Trp Asn Asp Ile Arg Trp Asn Lys

210 215 220

Val Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro 225 230 235 240

Lys Glu Gln Ser Ile His Ser Arg Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu

245 250 255

Thr Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly

260 265 270

Ile Asp Asp Pro Glu Met Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln

275 280 285

Ala Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg

290 295 300

Arg Ala Tyr Val Glu Ala Asn Gly Ile Arg Pro Ala Met Leu Ser Cys 305 310 315 320

Asp Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Glu Lys Leu Glu Gln 325 330 335

Leu Glu Ala Ala 340

<210> 37

<211> 1023

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<400> 37

atgctcacct tcgttaggaa cgcctggtac gtcgccgctc tccctgagga gctgagcgag 60 aagcccttgg gtcgcaccat cctagacact ccgttagccc tttaccgcca gcctgacggc 120

gtagtggcgg ccctgcttga catctgcccg cataggttcg ctccgctcag cgacggcatc 180

ctcgtcaacg ggcatcttca gtgcccgtac cacgggctgg aatttgacgg cggtgggcag 240

tgtgtccaca acccgcacgg caacggcgca cggccagctt ccctcaacgt taggtcgttc 300

cctgttgtcg agcgcgacgc actgatctgg atctggcctg gcgacccagc tctggccgat 360

ccaggagcca ttcccgactt cggttgccgc gtggacccag cctatcggac ggtcggcggt 420

tacgggcacg tcgattgtaa ctataagctc cttgtggaca accttatgga tttgggccac 480

gctcagtacg tgcaccgggc taacgctcag actgacgcct ttgaccgtct cgaaagggag 540

gtcatcgtcg gcgacggaga gattcaggcg ctgatgaaga tccctggagg cacgccctct 600

gtgctcatgg cgaagtttct cagaggcgcg aacacgcccg tggacgcctg gaacgacatc 660

cgctggaata aggtctccgc gatgctgaac ttcatcgccg ttgcgcccga gggcacaccc 720

aaagagcagt caatccacag cagagggacc catattctta caccggaaac cgaggctagt 780

tgccactact tcttcggctc gtcacggaat ttcgggatag acgatccgga gatggacggt 84 0

gttcttcgat cttggcaagc gcaagctctc gtcaaggaag ataaggtggt cgtggaggct 900

atcgagcgta ggcgcgccta cgttgaggcg aacggtatta ggcccgcgat gctgtcctgc 960

gacgaggccg cagttagagt gtcgcgcgag atagaaaagc tggagcagct agaggccgcc 1020

tga 1023

<210> 38

<211> 340

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<212> PRT <213> Seqüência artificial <400> 38 Met Leu Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu 1 5 10 15 Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu 20 25 30 Ala Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile 35 40 45 Cys Pro His Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly Ile Leu Val Asn Gly 50 55 60 His Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln 65 70 75 80 Cys Val His Asn Pro His Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ala Ser Leu Asn 85 90 95 Val Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Trp 100 105 110 Pro Gly Asp Pro Ala Leu Ala Asp Pro Gly Ala Ile Pro Asp Phe Gly 115 120 125 Cys Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val 130 135 140 Asp Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His 145 150 155 160 Ala Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Thr Asp Ala Phe Asp Arg 165 170 175 Leu Glu Arg Glu Val Ile Val Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met 180 185 190 Lys Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu Met Ala Lys Phe Leu Arg 195 200 205 Gly Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Trp Asn Asp Ile Arg Trp Asn Lys 210 215 220 Val Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro 225 230 235 240 Lys Glu Gln Ser Ile His Ser Arg Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu 245 250 255 Thr Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly 260 265 270 Ile Asp Asp Pro Glu Met Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln 275 280 285 Ala Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg 290 295 300 Arg Ala Tyr Val Glu Ala Asn Gly Ile Arg Pro Ala Met Leu Ser Cys 305 310 315 320 Asp Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Glu Lys Leu Glu Gln 325 330 335 Leu Glu Ala Ala 340 10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210> 39

<211> 1023

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<400> 39

atggccacct tcgttaggaa cgcctggtac gtcgccgctc tccctgagga gctgagcgag 60

aagcccttgg gtcgcaccat cctagacact ccgttagccc tttaccgcca gcctgacggc 120

gtagtggcgg ccctgcttga catctgcccg cataggttcg ctccgctcag cgacggcatc 180

ctcgtcaacg ggcatcttca gtgcccgtac cacgggctgg aatttgacgg cggtgggcag 240

tgtgtccaca acccgcacgg caacggcgca cggccagctt ccctcaacgt taggtcgttc 300

cctgttgtcg agcgcgacgc actgatctgg atctggcctg gcgacccagc tctggccgat 360

ccaggagcca ttcccgactt cggttgccgc gtggacccag cctatcggac ggtcggcggt 420

tacgggcacg tcgattgtaa ctataagctc cttgtggaca accttatgga tttgggccac 480

gctcagtacg tgcaccgggc taacgctcag actgacgcct ttgaccgtct cgaaagggag 540

gtcatcgtcg gcgacggaga gattcaggcg ctgatgaaga tccctggagg cacgccctct 600

gtgctcatgg cgaagtttct cagaggcgcg aacacgcccg tggacgcctg gaacgacatc 660

cgctggaata aggtctccgc gatgctgaac ttcatcgccg ttgcgcccga gggcacaccc 720

aaagagcagt caatccacag cagagggacc catattctta caccggaaac cgaggctagt 780

tgccactact tcttcggctc gtcacggaat ttcgggatag acgatccgga gatggacggt 840

gttcttcgat cttggcaagc gcaagctctc gtcaaggaag ataaggtggt cgtggaggct 900

atcgagcgta ggcgcgccta cgttgaggcg aacggtatta ggcccgcgat gctgtcctgc 960

gacgaggccg cagttagagt gtcgcgcgag atagaaaagc tggagcagct agaggccgcc 1020

tga 1023

<210> 40 <211> 340 <212> PRT <213> Seqüência artificial <4 00> 40 Met Ala Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu 1 5 10 15 Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu 20 25 30 Ala Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile 35 40 45 Cys Pro His Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly Ile Leu Val Asn Gly 50 55 60 His Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln 65 70 75 80 Cys Val His Asn Pro His Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ala Ser Leu Asn 85 90 95 Val Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Trp 100 105 110 Pro Gly Asp Pro Ala Leu Ala Asp Pro Gly Ala Ile Pro Asp Phe Gly 115 120 125 Cys Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val 130 135 140 Asp Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His 145 150 155 160 Ala Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Thr Asp Ala Phe Asp Arg 165 170 175 Leu Glu Arg Glu Val Ile Val Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met 180 185 190 Lys Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu Met Ala Lys Phe Leu Arg 195 200 205 Gly Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Trp Asn Asp Ile Arg Trp Asn Lys 210 215 220 Val Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro 225 230 235 240 Lys Glu Gln Ser Ile His Ser Arg Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu 245 250 255 Thr Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly 260 265 270 Ile Asp Asp Pro Glu Met Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln 275 280 285 Ala Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg 290 295 300 Arg Ala Tyr Val Glu Ala Asn Gly Ile Arg Pro Ala Met Leu Ser Cys 10

15

305

Asp Glu Ala

Leu Glu Ala

<210> <211> <212> <213> <220> <400>

agatcttgag taagggctta cctttacttt aacgagatct gacgtaaggg agaaccttta acctgtgcat aagacacggc

310 315

Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile 325 330

Ala 340 41 433 DNA

Seqüência artificial

320

Glu Lys Leu Glu Gln 335

41

ccaatcaaag cgcccatacg ttatgtttgg tgagccaatc cttacgccca ctttttatat ccgctttgcc cat

aggagtgatg aaataattaa cgtgtatttt aaagaggagt tacgaaataa ttggcgtgta tataaataag

tagacctaaa aggctgatgt taaatttcca gatgtagacc ttaaaggctg tttttaaatt ttttagtttg

gcaataatgg gacctgtcgg cggcaatgac taaagcaata atgtgacctg tccacggcaa tattgatcga

agccatgacg 60

tctctcagaa 120

gatgtgaccc 180

atggagccat 240

tcggtctctc 300

tgacgatgtg 360

cacggtcgag 420 433

Claims

1. Molécula de DNA recombinante compreendendo uma se- qüência de DNA que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto opera- velmente ligada a uma seqüência de DNA que codifica mono-oxigenase de dicamba, em que a seqüência de DNA que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto codifica uma seqüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID N0s: de 1 a 11.

2. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindica- ção 1, em que a seqüência de DNA que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto compreende uma seqüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID N0s: de 12 a 22.

3. Molécula de DNA recombinante compreendendo uma se- qüência de DNA que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto opera- velmente ligada a uma seqüência de DNA que codifica mono-oxigenase de dicamba em que a seqüência de DNA que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto codifica uma seqüência selecionada do grupo consistindo em uma seqüência de peptídeo de trânsito de cloroplasto CTP2 de sintase de 5- enolpiruvilchiquimato-3-fosfato de Arabidopsis thaliana e uma seqüência de peptídeo de trânsito de cloroplasto da pequena subunidade Rubisco de ervi- lha.

4. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindica- ção 1, em que a seqüência de DNA que codifica mono-oxigenase de dicam- ba codifica um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID N0s: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 e 40.

5. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindica- ção 4, em que a seqüência de DNA é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID N0s: 23, 25, 27, 29. 31, 33, 35, 37 e 39.

6. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindica- ção 1, ainda compreendendo um promotor.

7. Célula de planta transgênica compreendendo uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma seqüência de DNA que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto operavelmente ligada a uma sequên- cia de DNA que codifica mono-oxigenase de dicamba, em que a seqüência de DNA que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto codifica uma seqüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID N°s: de 1 a 11.

8. Planta ou semente transgênica compreendendo uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma seqüência de DNA que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto operavelmente ligada a uma seqüên- cia de DNA que codifica mono-oxigenase de dicamba, em que a seqüência de DNA que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto codifica uma seqüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID N°s: de 1 a 11.

9. Planta ou semente transgênica de acordo com a reivindicação 8, em que a planta ou semente é uma dicot.

10. Planta ou semente transgênica de acordo com a reivindica- ção 8, em que a planta ou semente é uma monocot.

11. Método para produção de uma planta tolerante à dicamba compreendendo introdução, em uma célula de planta, de uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma seqüência de DNA que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto operavelmente ligada a uma seqüência de DNA que codifica mono-oxigenase de dicamba, em que a seqüência de DNA codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto que codifica uma se- quência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID N0s: de 1 a 11 e rege- neração de uma planta a partir da mesma que compreende a molécula de DNA recombinante.

12. Método para controle de ervas daninhas em um campo com- preendendo crescimento de uma planta transgênica compreendendo uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma seqüência que codifi- ca um peptídeo de trânsito de cloroplasto operavelmente ligada a uma se- qüência de DNA que codifica mono-oxigenase de dicamba, em que a se- qüência de DNA que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto codifica uma seqüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID N0s: de 1 a 11 e aplicação de uma quantidade de herbicida dicamba eficaz para controlar o crescimento de erva daninha no referido campo sem danificar a referida planta transgênica.