BRPI0721067A2 - Métodos e composições para tratar distúrbios gastrointestinais. - Google Patents

Métodos e composições para tratar distúrbios gastrointestinais. Download PDF

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disease
condition
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amide
agonist
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Guang Liang Jiang
Wha Bin Im
Larry A Wheeler
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Allergan Inc
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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA TRATAR DISTÚRBIOS GASTROINTESTINAIS".
Campo Técnico da Invenção
Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisó- rio série N0 60/870.444, depositado em 18 de dezembro de 2006, o qual é aqui incorporado por referência neste pedido.
Esta invenção refere-se ao tratamento ou prevenção de certas doenças ou condições, usando composições terapeuticamente ativas. Parti- cularmente, esta invenção refere-se a métodos que usam certos componen- tes agonistas de prostaglandina EP4 para tratar ou prevenir certas doenças ou condições do trato gastrointestinal, incluindo, porém sem limitações, a- quelas condições que têm um efeito sobre o esôfago, estômago, intestino delgado e/ou intestino grosso.
Antecedentes da Invenção
As prostaglandinas potencializam membros de uma de subfamí- Iia da família de receptores acoplados à proteína G (GPCR) de receptores da superfície celular. Os membros da família GPCR de receptores se carac- terizam por serem dobrados e configurados de modo a cruzar a membrana celular sete vezes; e assim sendo, estes receptores são algumas vezes refe- ridos como receptores sete-transmembrana.
Existem atualmente nove receptores conhecidos de prostaglan- dinas em vários tipos de células. Estes receptores são denominados DP1-2, EP1-4, FP1 IP, e TP, sendo que a nomenclatura corresponde ao receptor que se liga e é potencializado pela prostaglandina correspondente (por e- xemplo, receptores EP4 se ligam e são potencializados pela prostaglandina E4 ou PGE4). As prostaglandinas, assim, atuam sobre uma série de células tais como as células do músculo liso vasculares que causam constrição ou dilatação em plaquetas que causam agregação ou desagregação e nos neu- rônios espinhais que causam dor. As prostaglandinas têm uma ampla série de ações, incluindo, porém sem limitações, constrição muscular e a media- ção de inflamação. Outros efeitos incluem movimento de cálcio, regulação hormonal e controle do crescimento celular. O tromboxano é criado em pia- quetas e causa constrição vascular e agregação de plaquetas. A prostacicli- na é sintetizada por células nas paredes dos vasos sanguíneos e atagonísti- ca para tromboxano.
As prostaglandinas podem ser descritas fazendo referência à sua similaridade estrutural com ácido prostanóico, e têm a seguinte fórmula estrutural e esquema de numeração:
13 15 17 19
Vários tipos de prostaglandinas são conhecidos, dependendo da estrutura de substituintes carregados no anel alicíclico do esqueleto do ácido prostanóico. Outra classificação de prostaglandinas baseia-se no número de ligações insaturadas na cadeia lateral, indicadas pelos subscritos numéricos conforme o tipo geral de prostaglandina [por exemplo, prostaglandina Ei (PGEi), prostaglandina E2 (PGE2)], e a configuração no anel alicíclico indi- cada por α ou β [por exemplo, prostaglandina ?2a (PGF2p)].
Além das prostaglandinas de ocorrência natural, vários análo- gos, derivados que não ocorrem na natureza, e outros compostos que têm alguma similaridade estrutural com as prostaglandinas também foram des- cobertos como tendo atividade nos receptores de prostaglandinas em geral, e o receptor EP4 em particular.
Um composto de particular interesse que tem atividade de ago- nista do receptor EP4 de prostaglandina tem o nome químico ácido (Z)-7- {(1R,4S,5R)-5-[(E)-5-(3-cloro-benzo[b]tiofen-2-il)-3-hidróxi-pent-1-enil]-4- hidróxi-3,3-dimetil-2-oxo-ciclo-pentil}-hept-5-enóíco, e está descrito na paten- te n° US 2005/0164992, aqui incorporado como referência.
Acredita-se que os agonistas seletivos do receptor de prosta- glandina EP4 têm vários usos médicos. Por exemplo, a patente n- US 6.552.067 Β2, aqui expressamente incorporada como referência, enuncia o uso de agonistas seletivos do receptor de prostaglandina EP4 para o trata- mento de "métodos para tratar condições que apresentam baixa massa ós- sea, particularmente osteoporose, fragilidade, uma fratura osteoporótica, um 5 defeito ósseo, perda óssea idiopática na infância, perda óssea alveolar, per- da óssea mandibular, fratura óssea, osteotomia, perda óssea associada com periodontite, ou encravamento protético em um mamífero".
A patente n° US 6.586.468 B1, aqui expressamente incorporada como referência, enuncia que certos agonistas seletivos do receptor de pros- taglandina EP4 "são úteis para a profilaxia e/ou tratamento de doenças imu- nes (doenças autoimunes (esclerose lateral amiotrófica (ALS), esclerose múltipla, síndrome de Sjoegren, artrites, artrite reumatoide, lúpus eritemato- so sistêmico, etc.), rejeição a enxertos pós-transplante, etc.), asma, forma- ção óssea anormal, morte de neurócitos pulmopatia, hepatopatia, hepatite aguda, nefrite, insuficiência renal, hipertensão, isquemia do miocárdio, sín- drome inflamatória sistêmica, dor induzida por ambustão, sépsis, síndrome de hemofagocitose, síndrome da ativação de macrófagos, doenças de Still1 doenças de Kawasaki, queimaduras, granuloma sistêmico, colite ulcerativa, doenças de Crohn, hipercitocinemia em diálise, insuficiência de múltiplos órgãos, choque, etc."
A patente ng US 2005/0164992, incorporada como referência acima e comumente pertencente à presente requerente, descreve o uso de certos agonistas do receptor de prostaglandina EP4 para o tratamento de doença inflamatória dos intestinos (IBD), distinguidas por inflamação nos 25 intestinos grosso ou delgado e se manifesta em sintomas tais como diarréia, dor, e perda de peso. Acredita-se que os fármacos anti-inflamatórios não- esteroides estejam associados com o risco de desenvolver IBD, e Kabashi- ma e outros descreveram que "EP4 funciona para manter integridade da mu- cosa, para suprimir a imunidade inata, e para regular de forma descendente 30 a proliferação e ativação de células CD4+ T. Estas descobertas não apenas elucidaram os mecanismos de IBD por NSAIDs, mas também indicaram o potencial terapêutico de agonistas seletivos de EP4 em prevenção e trata- mento de IBD." (Kabashima, et. al., The Journal of Clinicai Investigation, abril de 2002, Volume 9, 883-893).
Várias outras condições do trato gastrointestinal podem ocorrer em detrimento do indivíduo afetado. Dentre tais doenças ou condições estão 5 a doença do refluxo esofágico, gastrite aguda e crônica (incluindo, porém sem limitações, gastrite induzida por Helibacter pylori, gastrite atrófica, ane- mia perniciosa, dano da mucosa relacionado à tensão, gastropatia de álcool, gastrite alcalina pós-operatória, e gastrite eosinofílica), duodenite, diverticuli- te, síndrome de Zolliger-Ellison, toxicidade gastrointestinal induzida por qui- 10 mioterapia, toxicidade gastrointestinal induzida por radiação, e feridas ou lesão no trato gastrointestinal causadas por lesão ou cirurgia.
Novos métodos e composições para tratar ou prevenir tais doen- ças ou condições seriam altamente benéficos.
Sumário da Invenção A presente invenção refere-se a métodos e composições para
tratar ou prevenir uma ou mais doenças ou condições do trato gastrointesti- nal de, por exemplo, corpo de mamífero. Particularmente, a presente inven- ção refere-se a métodos e composições para tratar condições gastrointesti- nais, incluindo doença do refluxo esofágico, gastrite aguda e crônica (inclu- 20 indo, porém sem limitações, gastrite induzida por Helibacter pylori, gastrite atrófica, anemia perniciosa, dano da mucosa relacionado à tensão, gastropa- tia de álcool, gastrite alcalina pós-operatória, e gastrite eosinofílica), duode- nite, diverticulite, síndrome de Zolliger-Ellison, toxicidade gastrointestinal in- duzida por quimioterapia, toxicidade gastrointestinal induzida por radiação, e 25 feridas ou lesão no trato gastrointestinal causadas por lesão ou cirurgia. Tra- tar ou prevenir tais doenças ou condições proporciona uma ou mais vanta- gens substanciais, como por exemplo, aumenta ou mantém a saúde do indi- víduo, por exemplo, ser humano ou animal, afligido ou suscetível à aflição com tais doenças ou condições.
Em um aspecto amplo da invenção, a presente invenção refere-
se a métodos que compreendem administrar uma quantidade terapeutica- mente eficaz de uma composição terapeuticamente eficaz que compreende um agonista de prostaglandina EP4 que tem a seguinte estrutura (e seus
sais e ésteres, bem como misturas deles:
o
a um mamífero afligido ou suscetível à aflição com uma ou mais doenças ou condições selecionadas entre doença do refluxo esofágico, gastrite aguda e 5 crônica (incluindo, porém sem limitações, gastrite induzida por Helibacter pylori, gastrite atrófica, anemia perniciosa, dano da mucosa relacionado à tensão, gastropatia de álcool, gastrite alcalina pós-operatória, e gastrite eo- sinofílica), duodenite, diverticulite, síndrome de Zolliger-Ellison, toxicidade gastrointestinal induzida por quimioterapia, toxicidade gastrointestinal induzi- 10 da por radiação, e feridas ou lesão no trato gastrointestinal causadas por lesão ou cirurgia, tratando ou prevenindo desta forma uma ou mais condi- ções.
Em outra modalidade, a invenção refere-se a composições far- macologicamente eficazes que compreendem um agonista de prostaglandi- na EP4 que tem a seguinte estrutura (e seus sais e ésteres, com como mis- turas deles):
o
Em outra modalidade, a composição terapeuticamente eficaz é administrada a um ser humano. O componente agonista de prostaglandina EP4 pode ser administrado, por exemplo, administrado por via oral ao trato gastrointestinal de um mamífero, por exemplo, um ser humano.
Qualquer uma e todas características aqui descritas e as combi- nações de tais características estão incluídas no âmbito da presente inven- ção, desde que as características de cada combinação sejam mutuamente inconsistentes.
Breve Descrição dos Desenhos
A figura 1A ilustra um Western blot de um gel de eletroforese em poliacrilamida de um Iisado de células IEC-18 que tem bandas para a proteí- 10 na Akt no qual um anticorpo seletivo para Akt fosforilada foi usado secunda- riamente como uma sonda da espécie Akt. As fileiras incluem amostras de: células tratadas com veículo (0,1% de DMSO) isoladamente, células trata- das com celecoxib 10 μΜ, células tratadas com SC-560 5 μΜ, e células tra- tadas com indometacina a 10 μΜ.
A figura 1B ilustra um Western blot de um gel de poliacrilamida
de eletroforesede um Iisado de células IEC-18 que tem bandas para a prote- ína Akt, na qual um anticorpo seletivo para Akt fosforilada foi usado secun- dariamente como uma sonda da espécie Akt. As fileiras incluem amostras de: células tratadas com veículo, células tratadas com indometacina (10 μΜ) isoladamente, e células tratadas com indometacina e Composto 7 a 10 nM.
A figura 2 ilustra varreduras de citometria de fluxo (FACS) de células IEC-18 tratadas com veículo isoladamente (figura 2A), células trata- das com doxorrubicina e também oxorrubicina (0,05 pg/mL) e celecoxib (10 μΜ) (figura 2B), e células tratadas com doxorrubicin e tabém celecoxib e Composto 7 a 10 nM (figura 2C).
A figura 2D é um gráfico de barras que ilustra os graus relativos de apoptose nessas amostras.
A figura 3A é um gráfico de barras que ilustra tamanhos de úlce- ras em um modelo de úlceras em camundongos, onde os camundongos di- ferentes do controle receberam indometacina.
A figura 3B é um gráfico de barras ilustra contagens de células leucócitos, linfócitos, neutrófilos, e monócitos DM um modelo de úlcera em camundongos, onde os camundongos diferentes do controle receberam in- dometacina.
A figura 3C é um gráfico de barras que ilustra os níveis de eritró- citos, hemoglobina (HGB) e hematócritos em um modelo de úlcera em ca- mundongos, onde os camundongos que não do controle receberam indome- tacina.
A figura 4A é um gráfico de barras que ilustra os tamanhos de úlceras em um modelo de úlcera em camundongos, os os camundongos do controle receberam veículo e os camundongos e os camundongos diferentes do controle receberam o Composto 7.
A figura 4B é um gráfico de barras que ilustra os níveis de neu- trófilos e necrose no tecido de granulação em um modelo de úlcera em ca- mundongos, onde os camundongos do controle receberam veículo e os ca- mundongos diferentes do controle receberam o Composto 7.
A figura 4C ilustra fotografias que comparam morfologias brutas
e microscópicas de tecido ulcerado em um modelo de úlcera em camundon- gos, onde os camundongos do controle receberam veículo e os camundon- gos diferentes do controle receberam o Composto 7.
A figura 5A é um gráfico de barras que ilustra os níveis de eritró- citos, hemoglobina (HGB) e hematócritos em um modelo de úlcera em ca- mundongos, onde os camundongos do controle receberam indometacina (3 mg/kg/d) e os camundongos diferentes do controle receberam indometacina (3 mg/kg/d) e o Composto 7 (0,1 mg/kg/d).
A figura 5B é um gráfico que ilustra os níveis de leucócitos (WBC), linfócitos (LYM) e neutrófilos (NEU) em um modelo de úlcera em camundongos, onde os camundongos do controle receberam indometacina (3 mg/kg/d) e os camundongos diferentes do controle receberam indometa- cina e o Composto 7 (0,1 mg/kg/d).
Descrição Detalhada da Invenção Um agonista de prostaglandina EP4 é amplamente definido co-
mo um composto que os versados nessas técnicas acreditam razoavelmente agoniza um receptor de prostaglandina EP4 de acordo com um ou mais entre inúmeros ensaios para determinação da atividade de EP4, são bem conheci- dos pelos versados nessas técnicas. Por exemplo, e sem limitações, um desses sistemas de ensaio é conhecido como tecnologia de ensaio RSAT descrita, em parte, em Brann, patente n- US 5.707.798, aqui incorporada como referência. Este sistema de ensaio é usado comumente para testar os efeitos (e não simplesmente a ligação) de moduladores putativos de mem- bros da superfamília de receptores acoplados à proteína G (GPCR) de re- ceptores da superfície celular em um dado receptor clonado. Esta superfamí- lia de GPCRs inclui o receptor de prostaglandina EP4.
Outros ensaios que podem ser usados para determinar a ativi- dade de um modulador do receptor de prostaglandina EP4 incluem o empre- go de células que expressam e apresentam o receptor EP4 recombinante em um ensaio de sinalização de cálcio intracelular. Quando as células são pré-carregadas com um corante fluorescente, tal como o corante Fluo-4®, a liberação subsequente de Ca++ a partir de depósitos intracelulares é detecta- da como um aumento na fluorescência na emissão máxima de Fluo-4® (en- tre 510 e 570 nm). A atividade do agonista do receptor EP4 pode, portanto, ser medida por uma mudança na concentração de cálcio intracelular, usando um dispositivo tal como o aparelho FLIPR®.
Os profármacos dos agonistas de prostaglandina EP4 descritoa em e usados na publicação de patente n- US 2005/0164992, é incorporada como referência em sua totalidade como parte deste relatório descritivo aci- ma comumente pertencente à presente requerente, são contemplados para estar dentro do âmbito dos métodos e composições da presente invenção, conforme eles se apliquem aos agonistas do receptor EP4 específico aqui descrito. Assim sendo, deve-se entender que os compostos agonistas de EP4 aqui descritos podem ser administrados como agentes terapêuticos como o composto biologicamente ativo ou como um ou mais profármacos, por exemplo, e sem limitações, aqueles derivados ou que contêm ligações alqueno, alquileno, alquino e éster; um éster, éter, ou amida de um carboi- drato; um éster, éter ou amida de um aminoácido; um éster, éter ou amida de glicosídeo; um éster, éter ou amida de glicuronídeo; um éster, éter ou amida de ciclodextrina; ou um éster, éter ou amida de dextrano; e misturas deles.
Geralmente, as formulações e métodos para distribuir um fárma- co para o trato gastrointestinal, ou parte dele desejada, são bem conhecidos 5 nessas técnicas. Vide, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Scien- ces", Mack Publishing Company, Easton, PA, 16â Edição (1980). Por exem- plo, as formas de dosagem orais podem incluir formas sólidas e semissóli- das (tais como comprimidos, cápsulas duras e moles, incluindo cápsulas preenchidas com líquido gel ou comprimidos), e formas líquidas aquosas e 10 não-aquosas, incluindo, porém sem limitações, emulsões de óleo em água e água em óleo, suspensões, soluções, xaropes líquidos, e similares, são co- nhecidos nessas técnicas.
As formulações específicas para formas de dosagem orais inclu- em, sem limitações: 1) colocar o fármaco em contato com excipientes com- patíveis, como por exemplo, excipientes convencionais, incluindo, sem limi- tações, óleos, tais como óleo de mamona hidrogenado, outros óleos vege- tais, e similares e misturas deles; derivados celulósicos e derivados de ami- dos, tais como alquil-celuloses, hidróxi-alquil-celuloses, carboxilatos de ami- dos de metais alcalinos, por exemplo, glicolato de amido sódico, e similares e misturas deles; e açúcares e derivados de açúcares, e similares e misturas deles; de tal como que o fármaco seja liberado no trato gastrointestinal supe- rior ou inferior, por exemplo, no esôfago, estômago, duodeno e cólon; 2) co- locar o fármaco em contato com excipientes compatíveis, por exemplo, os excipientes convencionais assinalados em 1) acima, com o profármaco que está sendo selecionado, de tal modo que o fármaco seja liberado no trato gastrointestinal superior e/ou trato gastrointestinal inferior, conforme deseja- do, 3) revestir o fármaco e/ou profármaco, ou encapsular ou impregnar o fármaco e/ou profármaco dentro de um polímero, tal como uma alquil- celulose ou seu derivado e/ou gelatina projetada para distribuir para o trato gastrointestinal superior ou inferior, 4) formulações para distribuição liberada com o tempo do fármaco e/ou profármaco, 5) uso de um sistema bioadesivo, tal como um emplastro transdérmico, e similares. Caso desejado, as composições ou formas de dosagem presen- temente úteis podem compreender adicionalmente outros excipientes farma- ceuticamente aceitáveis, tais como componentes para tonicidade, compo- nentes de tamponamento, componentes eletrólitos, espessantes, cargas, 5 diluentes, agentes saporíferos, agentes colorantes, antioxidantes, conser- vantes (tais como agentes antibacterianos ou antifúngicos), ácidos e/ou ba- ses para ajustar o pH, e similares, e misturas deles. Cada aditivo desses, caso presente, pode compreender tipicamente 0,0001% ou menos, ou cerca de 0,01% ou menos a cerca de 10% ou mais em peso da composição. Tais 10 aditivos podem incluir os aditivos que são convencionais e/ou bem conheci- dos para uso em composições farmacêuticas similares. Por exemplo, os a- gentes espessantes apropriados incluem qualquer um daqueles conhecidos nessas técnicas, como por exemplo, polímeros e/ou espessantes inorgâni- cos farmaceuticamente aceitáveis. Tais agentes incluem, porém sem Iimita- 15 ções, homopolímeros e copolímeros de poliacrilatos; celuloses e derivados de celulose; poli(vinil-pirrolidonas); resinas polivinílicas; silicatos; e similares e misturas deles.
Em uma modalidade, o uso de um profármaco baseado em azo pode ser empregado para produzir o fármaco no trato gastrointestinal inferi- 20 or. Acredita-se que a microflora intestinal inferior seja capaz de clivagem re- dutora de uma ligação azo que deixa os dois átomos de nitrogênio como grupos amina funcionais. As bactérias do trato gastrointestinal inferior te- nham enzimas que podem digerir glicosídeos, glicuronídeos, ciclodextrinas, dextranos, e outros carboidratos, e profármacos ésteres formados a partir 25 destes carboidratos demonstraram distribuir os fármacos ativos originários seletivamente para o trato gastrointestinal inferior.
Os polímeros de carboidratos, incluindo, porém sem limitações, amilase, arabinogalactano, quitosano, sulfato de condroitona, dextrana, go- ma guar, pectina, xilina, e similares, e misturas deles, podem ser usados 30 para revestir um fármaco e/ou profármaco, ou um fármaco e/ou profármaco pode ser impregnado ou encapsulado no polímero. Depois da administração oral, os polímeros permanecem estáveis no trato gastrointestinal superior, mas são digeridos pela microflora do trato gastrointestinal inferior, liberando assim o fármaco para efeito terapêutico.
Os polímeros que são sensíveis ao pH também podem ser usa- dos, pois o trato gastrointestinal inferior tem um pH mais alto do que o trato 5 gastrointestinal superior. Tais polímeros estão disponíveis comercialmente. Por exemplo, Rohm Pharmaceuticals, Darmstadt, Alemanha, comercializa polímeros baseados em metacrilatos dependentes do pH e copolímeros co- mercializados sob a marca comercial Eudragit®, que têm solubilidades vari- adas em diferentes faixas de pH, baseado no número de grupos carboxilato 10 livres no polímero. Os sistemaa de liberação com o tempo, sistemas bioade- sivos e outros sistemas de distribuição também podem ser empregados.
A coadministração de agonistas de prostaglandina EP4 com um ou mais outros fármacos, tais como fármacos diferentes de agonistas de EP4, seja em composição individual ou em formas de dosagem separadas, 15 também está contemplada. Embora não pretendendo limitar o âmbito de in- venção de forma alguma, outros fármacos que podem ser incluídos nas te- rapias combinadas que visam a tratar distúrbios gastrointestinais com ago- nistas de prostaglandina EP4 e seus profármacos incluem, porém sem limi- tações:
Fármacos antiinflamatórios. tais como inibidores de COX não-seletivos e inibidores seletivos de COX-2, incluindo, sem limitações, aspirina e deriva- dos de aspirina, propanolol, ibuprofeno, cetorolac, napoxeno, piroxicam, na- bumetona, diclofenaco, diflunisal, etodolac, fenoprofeno, cetoprofeno, ácido mefenâmico, meloxicam, nabumetona, oxaprozin, sulindac, e tolmetina, e 25 similares e misturas deles; indóis, tais como indometacina e similares; diaril- pirazóis, tais como celecoxib e similares; pirrolo-pirróis; outros agentes que inibem a síntese de prostaglandinas; aminossalicilatos; outros fármacos anti- inflamatórios não-esteroides, e simlares e profármacos e misturas deles; Esteroides, tais como hidrocortisona, cortisona, prednisolona, prednisona, 30 triamcinolona, dexametasona, medrisona, fluorometolona, estrogênios, pro- gesteronas, e similares e misturas deles;
Imunomoduladores, tais como azatioprina, 6-mercaptopurina, ciclosporina (tais como ciclosporina A), e similares e misturas deles; e Anticorpos monoclonais humanizados e não-humanizados (incluindo frag- mentos. derivados e muteínas deles) contra citocinas pró-inflamatórias, tais como infliximab, etanercept, onercept, adalimumab, CDP571, CDP870, nata- 5 lizumab, MLN-02, ISIS 2302, cM-T412, BF-5, vasilizumab, daclizumab, rani- bizymab, bevacizumab, basiliximab, Anti-CD40L, e similares e misturas de- les.
Tais outros fármacos ou fármacos são administrados em quanti- dades eficazes para proporcionar o efeito ou efeitos terapêuticos desejados. Os ensaios para triar e determinar a atividade e seletividade de
agonistas de prostaglandina EP4 estão descritos abaixo, mas não são ape- nas os únicos ensaios com este propósito conhecidos pelos versados nes- sas técnicas.
Receptores Humanos Recombinantes EPi, EP?. EP^. EP4, FP, TP. IP e DP: Transfectantes Estáveis
Os plasmídeos que codificam os receptores EPvEP2, EP3, EP4, FP, TP, IP e DP humanos são preparados clonando as respectivas seqüên- cias codificadoras no vetor de expressão eucariótico pCEP4 (Invitrogen). O vetor pCEP4 contém uma origem de replicação do vírus Epstein-Barr (EBV), 20 que permite a replicação epissômica em linhagens de células de primatas que expressam o antígeno nuclear de EBV (EBNA-1). Ele contém também um gene de resistência à higromicina que é usado para a seleção eucarióti- ca. As células empregadas para transfecção estável são células do rim em- brionário humano (HEK-293) que são transfectadas com a proteína EBNA-1 25 e expressam-na. Estas células HEK-293-EBNA (Invitrogen) são desenvolvi- das em meio que contém Geneticina (G418) para manter a expressão da proteína EBNA-1. As células HEK-293 são desenvolvidas em DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS), 250 pg ml_'1 de G418 (Life Technologies) e 200 pg mL'1 de gentamicina ou penicilina/estreptomicina. A seleção de trans- 30 fectantes estáveis é realizada com 200 pg ml'1 de higromicina, sendo a con- centração ótima determinada por estudos anteriores da curva de extermina- ção de higromicina. Para a transfecção, as células são desenvolvidas até 50-60% de confluência em placas de 10 cm. O plasmídeo pCEP4 que incorpora os enxertos de DNAc para o respectivo receptor prostanoide humano (20 pg) é adicionado a 500 pL de CaCI2 250 mM. Solução salina tamponada com HEPES x 2 (2 x 5 HBS1 NaCI 280 mM, ácido HEPES 20 mM, Na2 HPO4 1,5 mM, pH 7,05 - 7,12) é então adicionada na forma de gotas a um total de 500 pL, sob contí- nuo turbilhonamento à temperatura ambiente. Depois de 30 min, 9 ml_ de DMEM são adicionados à mistura. A mistura DNA/DMEM/fosfato de cálcio é então adicionada às células, que é previamente enxaguada com 10 mL de 10 PBS. As células são então incubadas por 5 h a 37 0C em 95% de ar/5% de CO2 umidificado. A solução de fosfato de cálcio é então removida e as célu- las são tratadas com 10% de glicerina em DMEM por 2 min. A solução de glicerina é então substituída por DMEM com 10% de FBS. As células são incubadas de um dia para o outro e o meio é substituído por DMEM/10% de 15 FBS contendo 250 pg mL"1 de G418 e penicilina/estreptomicina. No dia se- guinte a higromicina B é adicionada até uma concentração final de 200 pg mL'1.
Dez dias depois da transfecção, clones resistentes à higromicina B são selecionados individualmente e transferidos para um poço separado 20 em uma placa com 24 poços. Em confluência cada clone é transferido para um poço de uma placa com 6 poços, e depois expandido em uma placa de 10 cm. As células são mantidas sob seleção continua de higromicina até o uso.
Ligação de Radioliqante Os estudos da ligação de radioligantes são uma etapa inicial útil
para triar quanto aos moduladores prospectivos do receptor de prostaglandi- na EP; entretanto, estudos de ligação isoladamente não fornecem informa- ções concernentes a se um Iigante de ligação é um agonista, agonista inver- so, ou antagonista do receptor. Estudos da ligação de radioligantes em fra- 30 ções de membranas plasmáticas preparadas a partir de células são realiza- dos da maneira que se segue. As células lavadas com tampão TME são raspadas do fundo dos frascos e homogeneizadas por 30 segundos usando um Polytron Brinkman PT 10/35. Tampão TME é adicionado conforme ne- cessário para atingir um volume de 40 mL nos tubos da centrífuga. TME compreende base TRIS 50 mM, MgCI2 10 mM, EDTA 1 mM; pH 7,4 é reali- zado adicionando HCI 1 N. O homogeneizado de células é centrifugado a 5 19.000 rpm por 20-25 min a 4 0C usando um rotor Beckman Ti-60 ou Ti-70. O pélete é então recolocado em suspensão no tampão TME para produzir concentração final de proteína de 1 mg/mL, determinada por ensaio Bio-Rad. Os ensaiosde ligação do radioligante são realizados em um volume de 100 pL ou 200 pL.
A ligação de [3H] PGE2 (atividade específica de 165 Ci/mmol) é
determinada em duplicata e em pelo menos 3 experimentos separados. As incubações são por 60 min a 25 0C e são terminadas pela adição de 4 mL TRIS-HC1 50 mM gelado, e em seguida, rápida filtração através de filtros Whatman GF/B e três lavagens adicionais de 4 ml em uma colhedeira de 15 células (Brandel). Os estudos de competição são realizados usando uma concentração final 2,5 ou 5 nM de [3H] PGE2 e a ligação inespecífica é de- terminada com PGE2 não-marcado 10'5 M.
Para os estudos da ligação de radioligante, os critérios para in- clusão são ligação específica >50% e entre 500 e 1.000 contagens deslocá- veis ou melhores.
Métodos para Estudos de FLIPR® (Leitora de Placas com Reprodução de Imagens Fluorimétricas)
(a) Cultura de Células
Células HEK-293 (EBNA), que expressam de forma estável um 25 tipo ou subtipo de receptors de prostaglandina recombinantes humanos (re- ceptores de prostaglandina expressados: hDP/Gqs5; hEP.-ι ; hEP2 /Gqs5; IiEP3a /Gqi5; IiEP4 /Gqs5; hFP; hIP; hTP), são cultivadas em placas de cultu- ra de 100 mm meio DMEM com alto teor de glicose, contendo 10% de soro fetal bovino, 1-glutamina 2 mM, 250 μg/mL de geneticina (G418) e 200 30 μg/mL de higromicina B como marcadores de seleção, e 100 unidades/mL de penicilina G, 100 μg/mL de estreptomicina e 0,25 μg/mL de anfotericina B. (b) Estudos de Sinal de Cálcio em FL/Pf?®
Células transfectantes são semeadas em uma densidade de 5 x 104 células por poço em placas Biocoat® com 96 poços de fundo claro, pare- des escuras, revestidas com poli-D-lisina (Becton-Dickinson) e deixadas afi- 5 xar durante a noite inteira em uma incubadora a 37 0C. As células são então lavadas duas vezes com tampão HBSS-HEPES (Solução de Sal Equilibrada de Hank sem bicarbonato e vermelho de fenol, HEPES 20 mM, pH 7,4), u- sando uma lavadora de placas Denley Cellwash (Labsystems). Depois de 45 minutos de carregamento de corante no escuro, usando o corante sensível a 10 cálcio Fluo-4 AM em uma concentração final 2 μΜ, as placas são lavadas quatro vezes com tampão HBSS-HEPES para remover o excesso de coran- te, deixando 100 μΙ_ em cada poço. As placas são então reequilibradas até 37 0C por alguns minutos.
As células são excitadas com um laser de argônio a 488 nm, e a 15 emissão é medida através de um filtro de emissão com largura de faixa de 510-570 nm (FLIPR.TM., Molecular Devices, Sunnyvale, CA). A solução de fármaco é adicionada em um volume de 50 μΙ_ a cada poço para dar a con- centração final desejada. O aumento do pico na intensidade de fluorescência é registrado para cada poço. Em cada placa, quatro poços servem, cada um, 20 como controles negativos (HBSS-HEPES buffer) e positivos (agonistas- padrão: BW245C (hDP); PGE2 (IiEP1 ; hEP2 /Gqs5; hEP3A /Gqi5; IiEP4 /Gqs5); PGF2a; (hFP); carbaciclina (hIP); U-46619 (hTP), dependendo do receptor). A mudança da fluorescência de pico em cada poço que contém fármaco é então expressada em relação aos controles.
Os compostos são testados em um formato de alto volume de
produção (ETS) ou resposta à concentração (CoRe). No formato HTS, qua- renta e quatro compostos por placa são examinados em duplicatas em uma concentração 10"5 M. Para gerar curvas de resposta à concentração, quatro compostos por placa são testados em duplicatas em uma faixa de concen- 30 tração entre 10‘5 e 10'11 M. Os valores Tira-se a média dos valores das du- plicatas. Em qualquer um dos dois formatos HTS ou CoRe cada composto é testado em pelo menos 3 placas separadas usando células de diferentes passagens para dar um valor de 3. Medição de Mudanças na AMP Cíclica Intracelular
Outros ensaios da atividade do agonista do receptor acoplado à proteína podem empregar a detecção de mudanças nas concentrações se- gundos mensageiros intracelulares que não Ca++, tais como AMP cíclica (cAMP). Os métodos de ensaio de cAMP são muito bem conhecidos. Tais métodos podem incluir, por exemplo, a cotransfecção de ácidos nucléicos que codificam o receptor, tal como o receptor adrenégico do receptor de prostaglandina EP4, com um plasmídeo repórter de cloranfenicol acetil trans- ferase (CAT) dependente de cAMPferase dentro de células de coriocarcino- ma JEG-3 humano, e desafiando as células com moduladores do receptor. Por exemplo, as células JEG-3 humanas (American Type Culture Collection, Rockville, MD) são cultivadas em Meio de Eagle Modificado de Delbecco (DMEM) contendo 10% de soro fetal vitelínico (FCS), 100 unidades/mL de penicilina, e 100 microgramas/mL de estreptomicina. As células são plaque- adas em placas de 10 cm 1-2 dias antes da transfecção. As células são en- tão transfectadas com 10 microgramas de um repórter CAT tal como o plas- mídeo TESBglllCRE(+)A NHSE (fornecido por P. Mellon, Salk lnstitute, La Jolla, CA) contendo elemento responsivo a AMP cíclico com 18 pares de bases a partir do promotor do gene da subunidade α para o hormônio de glicoproteína humana ligado ao promotor de timidina cinase do vírus do her- pes simples, por sua vez ligado a CAT (Delegeane et al., Mol. Cell Biol. 7:3994-4002 (1987)), e 10 microgramas do plasmídeo receptor relevante, usando a técnica de precipitação com fosfato de cálcio (Graham e van der Eb, Virology 52:456-467 (1973)). Depois da transfecção, as células são man- tidas em DMEM/5% de FCS por 36-40 horas, e depois enxaguadas duas vezes com DMEM. A forscolina (1 μΜ), um fármaco conhecido para estimu- lar a atividade de adenilato ciclase, pode ser então adicionada em 5 mL de DMEM como um controle positivo, junto com os compostos em teste. As cé- lulas são então incubadas por 4 horas a 37°C e colhidas.
Para o ensaio CAT, depois de incubações dos fármacos as célu- las são enxaguadas com PBS gelado e raspadas dentro de 1 mL de Tris-HCI 40 mM, pH 7,5, NaCI 150 mM, EDTA 1 mM. As células são centrifugadas e Iisadas por 3 ciclos de congelamento-descongelamento em 200 μΙ_ de Tris- HCI 250 mM, pH 7,5. Ensaios com (3H]-CAT são realizados usando 50 pL de citosol, 200 nCi [3H]-cloranfenicol e butiril-CoA 300 μΜ (Seed e Sheen, Gene 67:271-277 (1988)). As amostras são incubadas por 1 hora a 37 0C e as rea- ções foram interrompidas com a adição de 200 pL de xilenos mistos. Cloran- fenicol butirilado é extraído em xilenos mistos que são então retroextraídos duas vezes com 200 pL de Tris-HCI 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM. O produto radiomarcado é medido por contagem de cintilação líquida usando um Pac- kard Tri-Carb 460C a 50-52% de eficiência. A maior atividade de CAT indi- cada por transferência de grupos butirila de butiril-CoA para [3H]- cloranfenicol, é uma medida de cAMP aumentada.
A dosagem do componente agonista de prostaglandina EP4 em- pregada de acordo com a presente invenção varia em uma faixa relativa- mente ampla e depende de fatores bem conhecidos nas técnicas medicinais, porém sem limitações: o peso do indivíduo para quem o componente agonis- ta é administrado, a estado/condição de saúde geral desse indivíduo, a do- ença/condição que se procura tratar/prevenir por essa administração, a gra- vidade dessa doença/condição nesse indivíduo, a potência do componente agonista do receptor específico de EP4 que está sendo administrado, a sen- sibilidade desse indivíduo ao componente agonista específico que está sen- do administrado, o modo de administração, a idade desse indivíduo, o sexo desse indivíduo, o estado de gravidez desse indivíduo, as outras terapias de fármacos que estão sendo administradas a esse indivíduo e fatores simila- res. O composto ácido (Z)-7-{(1R,4S,5R)-5-[(E)-5-(3-cloro-benzo[b]tiofen-2- il)-3-hidróxi-pent-1-enil]-4-hidróxi-3,3-dimetil-2-oxo-ciclopentil}-hept-5-enoico tem uma CE50 (concentração em 50% de eficácia máxima) entre 0,03 e 0,1 nM no teste de fluxo FLIPR® Ca++ e também no teste de atividade alternativa que mede mudanças na concentração intracelular de cAMP em células HEK- EBNA que expressam o receptor de prostaglandina EP4 humano.
A quantidade de componente agonista de prostaglandina EP4 empregada em base diária para cada ser humano ou animal pode ficar na - i
faixa de cerca de 0,1 mg a cerca de 30 mg ou cerca de 50 mg ou cerca de 100 mg ou cerca de 150 mg ou cerca de 200 mg ou mais. Em uma modali- dade, esta quantidade diária pode ficar em uma faixa de cerca de 5 mg a cerca de 150 mg ou cerca de 200 mg ou mais. O componente agonista de 5 prostaglandina EP4 pode ser administrado em uma ou mais doses diaria- mente, por exemplo, uma vez ao dia, duas vezes ao dia, três vezes ao dia ou mais frequentemente. Em uma modalidade, a dosagem uma vez ao dia é útil.
Geralmente, o componente agonista de prostaglandina EP4 é 10 administrado por um período de tempo suficiente para obter o efeito ou efei- tos terapêuticos desejados; isto é, o alívio dos sintomas do distúrbio gastro- intestinal para o qual o fármaco é administrado. A duração do tratamento pode ser, por exemplo, em uma faixa de cerca de 1 dia ou cerca de 3 dias ou cerca de 1 semana ou cerca de 2 semanas a cerca de 4 semanas ou cer- 15 ca de 8 semanas ou cerca de 12 semanas ou cerca de 20 semanas ou mais. Em uma modalidade útil, a duração do tratamento fica em uma faixa de cer- ca de 2 semanas a cerca de 12 semanas.
Os exemplos não-limitativos que se seguem ilustram certos as- pectos da presente invenção.
Exemplos 1 a 4
Uma série de 4 (quatro) composições de comprimidos é produ- zida usando um agonista de prostaglandina EP4 3 (três) profármacos agonis- tas de prostaglandina EP4. Cada uma das composições de comprimidos é preparada da maneira que se segue.
Dentro de uma área de contenção de poeira, uma mistura de
ingredientes é preparada e misturada até a mistura ficar uniforme. A mistura uniforme, tendo uma composição como listada na tabela diretamente abaixo, é então usada em uma máquina de prensar comprimidos convencional para produzir comprimidos de 100 mg que têm essa composição. Os comprimidos 30 podem ser embalados, por exemplo, em frascos de polietileno de alta densi- dade, com pacotes de sílica-gel apropriados, tampados e rotulados.
As misturas e comprimidos têm as seguintes composições: Ingrediente Composição 1 2 3 4 % em % em % em % em peso peso peso peso Agonista de prostaglandi¬ 10,0 - - - na EP4 1(1) Profármaco agonista de - 10,0 - - prostaglandina EP4 1(2) Profármaco agonista de - - 10,0 - prostaglandin EP42(3) Profármaco agonista de - - - 10,0 prostaglandin EP4 3(4) Açúcar 50,0 50,0 50,0 50,0 Excipientes(5) 40,0 40,0 40,0 40,0 (1)
(2) Um éster isopropílico de (1) acima.
(3) Um éster metílico de (1) acima.
(4) Um derivado amida de (1) acima com 2-amino-etanol.
(5) Uma mistura de excipientes farmacêuticos convencionais úteis, por e- xemplo, como cargas, auxiliares de prensagem de comprimidos, agentes encorpantes, conservantes, tampões e similares. Os exemplos incluem, po- rém sem limitações, misturas óleo de mamona hidrogenado, hidróxi-etil- celulose, glicolato de amido sódico, sorbitol e similares.
Cada um dos comprimidos que é produzido nos Exemplos 1 a 4
inclui cerca de 10 mg da preparação de agonista ou preparação do profár- maco, como possa ser o caso, sendo o peso total de cada comprimido cerca de 100 mg.
Exemplos 5 e 6
Uma série (2) de composições de cápsulas de gelatina duras é
produzida usando um agonista de prostaglandina EP4 e um profármaco de agonista de prostaglandina EP4. Cada uma destas composições de cápsulas é preparada da maneira que se segue.
Dentro de uma área de contenção de poeira, pequenas esferas de açúcar são disponibilizadas. Uma mistura aquosa do agonista ou profár-
5 maco, incluindo um aglutinante/selador, tal como Opadry® transparente, é disponibilizada e borrifada sobre as esferas de açúcar, usando um sistema de aspersão de leito fluidizado. Uma segunda mistura que inclui um agluti- nante/selador, por exemplo, Opadry® transparente, em um veículo líquido é borrifado sobre as primeiras esferas borrifadas, usando um sistema de as- 10 persão com leito fluidizado. Esta etapa resulta em péletes carregados com agonista ou profármaco com um revestimento selador.
Estes péletes são revestidos com uma mistura aquosa de citrato de trietila, talco e um copolímero de ácido metacrílico, usando um sistema de aspersão em leito fluidizado. Esta etapa resulta em péletes carregados com 15 agonista ou profármaco com um revestimento selador e um revestimento externo entérico. Estes péletes são encapsulados em cápsulas de gelatina com casca dura natural transparente. As cápsulas enchidas podem ser em- baladas, por exemplo, em frascos de polietileno de alta densidade, com pa- cotes de sílica-gel apropriados, tampados e rotulados.
Os péletes com o revestimento entérico têm as seguintes com- posições;__
Composição Ingrediente 5 % em peso 6 % em peso Agonista de prostaglandina EP41(1) 35,5 _ Profármaco agonista de prostaglandina - 35,5 EP4 2(2) Esferas de açúcar 33,5 33,5 Aglutinante/Selador 11,0 11,0 Copolímero de ácido metacrílico(3) 14,8 14,8 Talco(4) 3,7 3,7 Citrato de trietila(5) 1,5 1,5 (1)
(2) Um éster de dextrano de (1) acima.
(3) Composição de revestimento entérico identificada como Eudragit® L30- D55 comercializada por Rohm Pharmaceuticals.
(4) Útil como um deslizante
(5) Útil como um plastificante
Cada uma das 4 (quatro) cápsulas produzida nos Exemplos 5 e
6 inclui cerca de 35,5 mg do agonista ou profármaco.
Exemplos 7 a 10
Uma série de 4 (quatro) composições de cápsulas de gelatina
com casca mole é produzida usando um agonista de prostaglandina EP4 e 3 (três) profármacos agonistas de prostaglandina EP4 diferentes. Cada uma das composições de cápsulas é preparada da maneira que se segue.
Dentro de uma área de contenção de poeira, uma mistura de gelatina com casca mole uniforme, que compreende cerca de 20-45% de gelatina, cerca de 15-30% de água, cerca de 17,5-35% de um plastificante que por sua vez compreende glicerina ou sorbitol ou uma mistura deles e cerca de 5-25% de hidrolisado de amido hidrogenado é disponibilizada. A mistura de gelatina com casca mole é agitada até que resulte um fundido uniforme. Uma segunda mistura que é uma suspensão ou solução uniforme do agonista ou profármaco agonista é disponibilizada como o material de enchimento das cápsulas de gelatina mole. O material de enchimento é in- tencionado para ser substancialmente isento de água (menos ou igual a cer- ca de 5-7% de água) e inclui o agonista ou profármaco agonista e quantida- des opcionais de cossolventes, tampões, tensoativos, espessantes, e simila- res. O material de enchimento pode ser na forma sólida, semissólida, gel, ou líquida, desde que ele seja uniforme e compatível com a encapsulação de gelatina mole, isto é, ele não degrada substancialmente a casca de gelatina mole. O material de enchimento tem uma composição como listada na tabela diretamente abaixo e é, de preferência, desgaseificado antes do uso na pró- xima etapa. A preparação de gelatina com casca moles acima é usada para encapsular parcelas de 100 mg do material de enchimento, empregando 5 tecnologia de encapsulação usual para produzir cápsulas de gelatina mole seladas hermeticamente em um pedaço. As cápsulas de gelatina com casca mole podem ser embaladas, por exemplo, em frascos de polietileno de alta densidade com pacotes de sílica-gel apropriados, tampados e rotulados.
O material de enchimento das cápsulas tem as seguintes elabora- 10 ções:_
Composição Ingrediente 7 % 8 % 9% 10 % em peso em peso em peso em peso Agonista de prostaglandi- 10,0 - - - na EP4 1(1) Profármaco agonista de - 10,0 - - prostaglandina EP4 1(2) Profármaco agonista de - - 10,0 - prostaglandina EP4 2(3) Profármaco agonista de - - - 10,0 prostaglandina EP4 3(4) Excipientes(5) 90,0 90,0 90,0 90,0 (1)
(2) Um éster isopropílico de (1) acima.
(3) Um éster metílico de (1) acima.
(4) Um derivado amida de (1) acima com 2-amino-etanol.
(5) Uma mistura de quantidades opcionais de excipientes farmacêuticos convencionais úteis, por exemplo, como cossolventes, tampões, conservan- tes, tensoativos, espessantes, e similares, desde que eles sejam substanci- almente isentos de água (menos ou igual a cerca de 5-7% de água) e sejam compatíveis com a encapsulação de gelatina mole, isto é, eles não degra- dem substancialmente a casca de gelatina mole. Os exemplos incluem, po- 5 rém sem limitações, misturas de óleos vegetais, polialquilenoglicóis líquidos e similares.
Cada uma das cápsuias que é produzida nos Exemplos 7 a 10 inclui cerca de 10 mg do agonista ou profármaco, conforme possa ser o ca- so, sendo o peso total de cada uma das cápsulas depende do peso da casca de gelatina mole.
Exemplos 11 a 20
Dez humanos adultos são diagnosticados com doença do refluxo esofágico. Cada uma destas pessoas toma por via oral um comprimido ou uma cápsula (produzida como descrito nos Exemplos 1 a 10), tendo uma 15 das diferentes Composições 1 a 10 uma vez ao dia por doze semanas. No final deste período de tempo, cada um dos humanos relata alívio substancial da doença do refluxo esofágico. A dor e/ou outros sintomas da doença são reduzidos.
Exemplos 21 a 30
Dez humanos adultos são diagnosticados com gastrite. A gastri-
te é aguda ou crônica e inclui tipos tais como gastrite induzida por Helicobac- ter pylori, gastrite atrófica, gastrite induzida por anemia perniciosa, gastrite induzida por lesão da mucosa relacionada à tensão, gastrite induzida por gastropatia alcoólica, gastrite alcalina pós-operatória e gastroenterite eosino- 25 fílica. Cada uma das dez pessoas toma por via oral um comprimido ou cáp- sula (produzida como descrito nos Exemplos 1 a 10), tendo uma das diferen- tes Composições 1 a 10 uma vez ao dia por doze semanas. No final deste período de tempo, cada um dos humanos relata alívio substancial da gastri- te. A dor e/ou outros sintomas da doença são reduzidos.
Exemplos 31 a 40
Dez humanos adultos são diagnosticados com duodenite. Cada uma destas pessoas toma por via oral um comprimido ou uma cápsula (pro- *
duzida como descrito nos Exemplos 1 a 10), tendo uma das diferentes Com-
A
posições 1 a 10 uma vez ao dia por doze semanas. No final deste período de tempo, cada um dos seres humanos relata alívio substancial da duodeni- te. A dor e/ou outros sintomas desta doença são reduzidos.
5 Exemplos 41 a 50
Dez humanos adultos são diagnosticados com diverticulite. Cada uma destas pessoas toma por via oral um comprimido ou uma cápsula (pro- duzida como descrito nos Exemplos 1 a 10), tendo uma das diferentes Com- posições 1 a 10 uma vez ao dia por doze semanas. No final deste período 10 de tempo, cada um dos seres humanos relata alívio substancial da diverticu- lite. A dor e/ou outros sintomas desta doença são reduzidos.
Exemplos 51 a 60
Dez humanos adultos são diagnosticados com síndrome de Zol- linger-EIlison. Cada uma destas pessoas toma por via oral um comprimido 15 ou uma cápsula (produzida como descrito nos Exemplos 1 a 10), tendo uma das diferentes Composições 1 a 10 uma vez ao dia por doze semanas. No final deste período de tempo, cada um dos seres humanos relata alívio subs- tancial da doença. A dor e/ou outros sintomas desta doença são reduzidos. Adicionalmente, as úlceras gástricas e/ou duodenais resultantes da doença 20 são reduzidas de tamanho ou cicatrizadas de forma substancialmente com- pleta.
Exemplos 61 a 70
Dez humanos adultos são diagnosticados com toxicidade gastro- intestinal induzida por quimioterapia. Cada uma destas pessoas toma por via 25 oral um comprimido ou uma cápsula (produzida como descrito nos Exemplos
1 a 10), tendo uma das diferentes Composições 1 a 10 uma vez ao dia por doze semanas. No final deste período de tempo, cada um dos seres huma- nos relata alívio substancial da toxicidade gastrointestinal induzida por qui- mioterapia. A dor e/ou outros sintomas desta doença são reduzidos.
30 Exemplos 71 a 80
Dez humanos adultos são diagnosticados com toxicidade gastro- intestinal induzida por terapia de radiação. Cada uma destas pessoas toma por via oral um comprimido ou uma cápsula (produzida como descrito nos Exemplos 1 a 10), tendo uma das diferentes Composições 1 a 10 uma vez ao dia por doze semanas. No final deste período de tempo, cada um dos humanos relata alívio substancial da toxicidade gastrointestinal induzida por 5 terapia de radiação. A dor e/ou outros sintomas advindos desta toxicidade são reduzidos.
Exemplos 81 a 90
Dez humanos adultos têm feridas de lesão e/ou cirurgia do trato gastrointestinal. Cada uma destas pessoas toma por via oral um comprimido 10 ou uma cápsula (produzida como descrito nos Exemplos 1 a 10), tendo uma das diferentes Composições 1 a 10 uma vez ao dia por doze semanas. No final deste período de tempo, cada um dos humanos relata alívio substancial da dor e/ou outros sintomas da lesão e/ou cirurgia. Adicionalmente, as feri- das as feridas da lesão/cirurgia foram cicatrizadas de forma substancialmen- 15 te completa.
Exemplos 91 a 100
Dez humanos adultos sofrem de ulceração gástrica. Cada uma destas pessoas toma por via oral um comprimido ou uma cápsula (produzida como descrito nos Exemplos 1 a 10), tendo uma das diferentes Composi- 20 ções 1 a 10 uma vez ao dia por doze semanas. No final deste período de tempo, cada um dos seres humanos relata alívio substancial dos sintomas da úlcera gástrica, perda de sangue, e volumes mais baixos de hemoglobina e hematócritos. Adicionalmente, a ulceração no estômago foi cicatrizada de forma substancialmente completa.
Exemplo 101
A via de PI3k (fosfoinositídeo-3-cinase)/Akt fosforilação de Akt é uma via de transdução de sinais celulares importantes para a regulação do crescimento, migração, diferenciação e apoptose celular. Particularmente, demonstrou-se que a via de PI3k/Akt é essencial para a proliferação de célu- 30 Ias epiteliais intestinais in vitro e in vivo. Esta via transduz sinais proliferati- vos entre receptores e a maquinaria do ciclo celular em células epiteliais in- testinais (Sheng H., et ai, Gut 52:1472-1478 (2003)). . i
Akt (conhecida também como proteína cinase B ou PKB) é uma serina/treonina proteína cinase que possui um domínio, o domínio PH, que se liga a (3,4,5)-tris-fosfato de fosfatidil-inositol (Ptdlns(3,4,5)P3, conhecido como PIP3) com alta afinidade. PIP3 é formado por fosforilação do fosfoinosi- 5 tídeo di-fosforilado-Ptdins(4,5)P2 por fosfoinositídeo-3-cinase ativado, co- nhecido como PI3k. Depois de formado, PIP3 pode se ligar a Akt.
Ciclooxigenase (COX) é uma família de enzimas (COX 1, COX 2) envolvidas na síntese de prostaglandinas. Os mecanismos da regulação de COX 1 não são inteiramente bem entendidos. Entretanto, trabalho consi- 10 derável demonstrou que a síntese de COX 2 é pelo menos parcialmente re- gulada pela via de PI3k (fosfoinositídeo-3-cinase)/fosforilação de Akt. Resu- midamente, depois da ligação de PIP3, Akt é parcialmente ativada e é capaz de ser fosforilada pela PDK1 (cinase-1 dependente de fosfoinositídeo). De- pois da fosforilação, Akt está completamente ativada, e pode por sua vez 15 fosforilar IkB cinase, que fosforila IkB para a qual é recrutado pelos fatores de transcrição p65 e p50. O complexo ΙκΒ/ρ65/ρ50 fosforilado então entra no núcleo celular e estimula a transcrição de COX-2 (vide, por exemplo, Little et al., J. Vet. Med.21:367-377 (2007)). Acredita-se que o inibidor de COX-2 ini- be a atividade de PDK1; portanto também bloqueia a fosforilação de Akt.
Células epiteliais intestinais do rato (células IEC-18) são células
epiteiliais normais imortalizadas adquiridas da American Type Culture Col- lectíon (ATCC). Para estes experimentos, as células IEC-18 foram cultivadas em Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) com alto teor de glicose a 37 0C sob 5% de CO2 e incubadas por 24 horas com a) 5 μΜ do inibidor de 25 COX-1 SC-560 (adquirido da Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 10 μΜ do inibi- dor de COX-2 celecoxib, ou 10 μΜ do inibidor de COX-1/2 indometacina. Os fármacos foram fornecidos em uma solução a 0,1% do veículo sulfóxido de dimetila (DMSO).
A via de PI3k/Akt é monitorada usando o procedimento de en- saio geral que se segue. Depois da incubação das células, os Iisados são coletados com tampão de Iise contendo inibidores de fosfatase e proteinase. Os sobrenadantes são coletados e as concentrações de proteínas são me- didas. Depois, tampões de amostras de SDS (dedocil-sulfato de sódio) são feitas para assegurar a concentração final de proteínas que é igual em cada amostra e fervidos por 10 minutos a 100 °C. Depois, as amostras são carre- gadas em um SDS-PAGE a 4%-12% pré-fabricado (eletroforse em gel de poliacrilamida) e o gel é desenvolvido sob eletroforese. Quando as amostras atingem o fundo do gel, o gel é removido do equipamento de eletroforese e transferido para uma membrana de nitro-celulose e a membrana é bloquea- da com leite. A membrana é incubada com um anticorpo primário seletivo para a) Akt total ou b) Akt fosforilada de um dia para o outro a 4 0C. Um anti- corpo secundário que tem uma porção de peroxidase de rábano silvestre conjugada (HRP) é usado para ligar as regiões constantes dos anticorpos primários. A membrana é lavada sob condições que favorecem a ligação seletiva de anticorpo. Finalmente, a HRP é detectada usando um substrato quimioluminescentes iniciado enzimaticamente, tal como os Substratos Sig- nal® ELISA Pico, disponíveis na Thermo Fisher Scientific.
Como ilustrado na figura 1, cada um desses agentes inibiu a fos- forilação de Akt. Especificamente, a indometacina inibiu a fosforilação de Akt até um grau que SC-560 ou celecoxib não o fizeram sob estas condições. Entretanto, a coincubação das células por 24 horas com indometacina a 10 μΜ e também agonista de prostaglandina EP4 da Composição 7 (aqui dora- vante referido como "Composto 7") manteve a fosforilação de Akt em níveis mais altos em comparação com as amostras que forneceram indometacina na ausência de agonista de EP4 adicionado. Portanto, os agonistas de pros- taglandina EP4 tais como o Composto 7 podem restaurar ou fortalecer a ati- vidade de Akt quando usados isoladamente ou na presença de inibidores de COX, tais como fármacos anti-inflamatórios não-esteroides (NSAIDS). Exemplo 102
Células IEC-18 foram cultivadas em DMEM com alto teor de gli- cose, contendo 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de penicilina, 1% de es- treptomicina, e 50 unidades de insulina essencialmente como indicado no Exemplo 101 por 48 horas na presença do agente quimioterápico a 0,05 μg/mL doxorrubicina para induzir apoptose. Na presença de celecoxib 10 μΜ I 28
(que inibe a expressão de prostaglandina PGE2 endógena, a apoptose de
- *
células IEC-18 tratadas com doxorrubicina prosseguiu dentro de 48 horas nessas concentrações muito baixas de doxorrubicina. Finalmente, as células coletadas por tripsina foram submetidas à análise de citometria de fluxo para 5 identificação da porcentagem de células em diferentes estágios do ciclo ce- lular.
As células cultivadas foram preparadas para citometria de fluxo por tripsinização e centrifugação. As células foram então lavadas com solu- ção salina tamponada com fosfato (PBS) gelada, e depois fixadas com eta- 10 nol gelado a 70% durante a noite inteira. As células foram então lavadas no- vamente com PBS e coradas com iodeto de propídio, um corante de interca- lação de ácido nucleico, na presença de RNase por 30 minutos à temperatu- ra ambiente. As células foram então selecionadas usando o tampão forneci- do por Becton-Dickenson, o marcador do equipamento de citometria de flu- 15 xo.
A figura 2A ilustra a análise por citometria de fluxo de células IEC-18 somente no veículo; a figura 2B ilustra a análise por citometria de fluxo sob as mesmas condições (exceto que as células foram tratadas previ- amente com 0,05 μg/mL de doxorrubicina (D) e celecoxib 10 μΜ (C); a figura 20 2C ilustra os resultados quando as células IEC-18 são incubadas com 0,05 μg/mL de doxorrubicina (D), celecoxiba 10 μΜ (C) e o Composto 7 a 10 nM.
Adicionalmente, usando o software CelIQuest® (Becton- Dickenson), uma quantificação da porcentagem de apoptose que ocorre em células IEC-18 depois de realizar 48 horas de incubação. A figura 2D ilustra 25 a porcentagem de apoptose de células em 0,1% de veículo DMSO isolado que é de aproximadamente 2%. Em contraste, a porcentagem de células que sofrem apoptose aumenta para cerca de 13% depois do tratamento com doxorrubicina e celecoxib 10 μΜ. Entretanto, a adição do Composto 7 a 10 nM à mistura de incubação resulta em uma redição da apoptose para apro- 30 ximadamente 5%, perto do nível referencial.
Assim sendo, este experimento ilustra que o Composto 7, um agonista de prostaglandina EP4 reduz o efeito citotóxico de NSAIDS e agen- tes quimioterápicos sobre as células epiteliais intestinais, proporcionando assim um efeito protetor contra lesão ao intestino causada por tais agentes. Exemplo 103
Úlceras gástricas foram produzidas em camundongos C57BL/6 5 usando ácido acético a 40% da maneira que se segue. Os animais foram anestesiados. O abdome de cada animal foi aberto cirurgicamente, e o es- tômago, exposto. Uma cureta de 3 mm foi colocada sobre a superfície ante- rior de cada estômago. Uma solução de ácido acético a 40% foi colocada dentro da cureta. A cureta impede lesão ao tecido circundante. O tratamento 10 com ácido acético causa lesão aos vasos sanguíneos do estômago, produ- zindo morte química da camada mucosa.
No terceiro dia depois da indução da ulceração, os animais re- ceberam vários tratamentos por gavagem oral. Primeiramente, veículo (4% de DMSO-óleo de melho) ou uma dose baixa (3 mg/kg/dia) de indometacina 15 em 4% de DMSO-óleo de melho foi usada. Esta dose de indometacina foi relatada não induzindo lesões grossas no estômago, embora ela possa inibir a produção de prostglandina PGE2 endógena.
No 7° dia o sangue foi retirado para análise hematológica dos animais sacrificados, e submetido a teste automatizado para parâmetros 20 hematológicos usuais padronizados. As áreas ulceradas (definidas como as regiões do estômago não cobertas pelas células epiteliais do estômago) fo- ram medidas por microscopia de dissecção para análise macroscópica; adi- cionalmente, a seção mais larga de cada amostra de úlcera foi medida e ob- servada quanto ao índice de tamanho sob microscopia. Os estômagos foram 25 processados por análise patológica dissecção e seção através da parte mais larga da úlcera. As seções foram coradas usando hematoxilina e eosina.
Os resultados indicaram que a indometacina retardou a cicatri- zação espontânea de úlceras gástricas usando medições microscópicas grossas (figura 3A), inflamação exacerbada (figura 3B; indicada por um au- 30 mento de linfócitos (LYM) no sangue). A figura 3B ilustra uma legenda de eixo x de "WBC" (leucócitos), LYM (linfócitos; um aumento no qual é um in- dicador padrão de inflamação crônica), NEU (neutrófilos) e MONO (monóci- I
tos). Estes dois íúltimos tipos de células estão associados resposta immune aguda (por exemplo, mediada por bactérias). WBC, portanto, é uma medida de todos leucócitos (incluindo linfócitos, neutrófilos e monócitos), com os tipos específicos de células, então "rompidos" nas barras que se seguem. A 5 indometacina demonstrou exacerbar a perda de sangue em locais de úlceras (figura 3C). Os resultados acima indicam que PGE2 endógena desempenha um papel importante em promover a cicatrização espontânea de úlcera gás- trica crônica. Os perfis hematológicos foram analisados por pessoas alheias aos tratamentos usando o Sistema de Hematologia ADVIA120 automático 10 (Bayer, Tarrytown, NY).
Os camundongos foram então tratados com o Composto 7 a 10 nM ou veículo sob condições idênticas a não ser isto. Neste experimento, o veículo foi 4% de DMSO em óleo de milho em um volume de 0,1 ml. Os ca- mundongos foram sacrificados e os estômagos examinados no 7° dia ou no 15 11s dia depois da ulceração. Os resultados indicam que os camundongos tratados com o Composto 7 a 10 nM resultaram em tamanhos de úlceras significativamente menores do que os camundongos tratados com veículo (figura 4A). Sob microscopia de dissecção, as áreas das úlceras em camun- dongos tratados com o Composto 7 foram 60% e 32% do controle nos dias 7 20 e 11, respectivamente. As úlceras dos camundongos tratados com o Com- posto 7 tinham significativamente menos infiltrações celulares inflamatórias e tecido necrótico em tecido de granulação em comparação com os do grupo de controle, o que pode indicar uma condição mais sadia para para epiteli- zação (figura 4B).
A figura 4C ilustra as morfologias grosas e microscópicas repre-
sentativas do tecido ulcerado neste experimento tomadas depois de sacrifi- car os camundongos com o veículo no 7dia e o mesmo veículo contendo o Composto 7, respectivamente. Como pode ser observado, os resultados fo- tográficos se correlacionam com os resultados patológicos e demonstram 30 que o agonista de prostaglandina EP4. O Composto 7 estimula a cicatriza- ção da úlcera e facilita a remoção e tecido necrótico.
Como outra indicação do efeito de agonistas de prostaglandina ΕΡ4 sobre lesão tecidual gastrointestinal induzida por NSAIDs, a hematolo- gia indicou que os camundongos tratados com 0,1 mg/kg/dia do Composto 7 e 3 mg/kg/dia de indometacina tinham significativamente menos perda de sangue do que aqueles camundongos nos as úlceras foram induzidas e fo- 5 ram subsequentemente tratados com indometacina sozinha. A figura 5A ilus- tra que o número de eritrócitos ("RBC") x 106/μΙ_ de sangue total é significati- vamente maior em camundongos que receberam o Composto 7 ("camun- dongos tratados")em comparação com aqueles que receberam o veículo sozinho ("camundongos do controle"). Neste experimento os dados de 20 10 camundongos tratados tiveram a média tirada (n=20) e comparados com os dados médios de 20 camundongos do controle. Similarmente, nas populaces tratadas e do controle de animais as quantidades de hemoglobina (HGB)1 expressadas em gramas por decalitro, e hematócritos (HCT), expressadas em % de volume de sangue foi determinada. HGB e HCT foram significati- 15 vãmente maiores nos camundongos tratados do que nos camundongos do controle; estes dados, como a baixa contagem de RBC, são indícios típicos de perda de sangue no trato gastrointestinal.
A figura 5B ilustra que o grupo tratado teve resposta inflamatória significativamente diminuída do que o fizeram o grupo de controle de ca- 20 mundongos. Assim sendo, WBC e as contagens de linfócitos foram signifi- cativamente mais altas no grupo de controle do que no grupo tratado, en- quanto que o nível de neutrófilos no sangue permaneceu relativamente constante.
Assim sendo, os dados demonstram claramente que os agonis- 25 tas de prostaglandina EP4, tal como o Composto 7, são capazes de causar uma aceleração na cicatrização de úlceras estomacais. Adicionalmente, tais agentes são capazes de prevenir ou moderar os efeitos citotóxicos de NSAIDs (por exemplo, indometacina) no trato gastrointestinal, particularmen- te prevenindo ou moderando o grau de apoptose em células epiteliais intes- 30 tinais e gástricas.
Consequentemente, a presente invenção engloba também uma composição quimioterápica que compreende um componente agonista de I 32
prostaglandina EP4 que tem a estrutura:
.i o
em combinação com um fármaco anti-inflamatório não-esteroide (NSAID). O NSAID pode ser qualquer NSAID, mas particularmente pode ser selecionado no grupo que consiste em aspirina, paracetamol, indometacina, ibuprofeno, 5 cetorolac, napoxeno, piroxicam, nabumetona, celecoxib, diclofenaco, difluni- sal, etodolac, fenoprofeno, cetoprofeno, ácido mefenâmico, meloxicam, na- bumetona, oxaprozin, sulindac, e tolmetina.
Adicionalmente, a presente invenção pode compreender um mé- todo para tratar um paciente que tem uma condição responsiva ao tratamen- to por um NSAID, compreendendo administrar ao dito paciente um NSAID e um componente agonista de prostaglandina EP4 que compreende uma es- trutura:
o
Evidentemente, o componente agonista de prostaglandina EP4 pode compreender um profármaco do composto correspondente à dita estru- tura.
Todos artigos, patentes, pedidos de patentes e publicações refe- renciadas citadas e/ou enunciadas acima são aqui incorporados por referên- cia em sua totalidade. Embora esta invenção tenha sido descrita com respeito e vários exemplos e modalidades específicas, deve-se entender que a invenção não está limitada a eles e que ela pode ser praticada de forma variada dentro das reivindicações que se seguem.

Claims (33)

1. Método que compreende administrar uma quantidade terapeu- ticamente eficaz de um componente agonista de prostaglandina EP4 que compreende uma estrutura: <formula>formula see original document page 35</formula> a um mamífero que necessita de tratamento para uma doença ou condição selecionada no grupo que consiste em doença do refluxo gastroesofágico, gastrite aguda e crônica, duodenite, diverticulite, síndrome de Zolliger- Ellison, toxicidade gastrointestinal induzida por quimioterapia, toxicidade gastrointestinal induzida por radiação, toxicidade gastrointestinal induzida por NSAID, úlceras gástricas, úlceras duodenais, úlceras intestinais e feridas ou lesão ao trato gastrointestinal causadas por lesão ou cirurgia, tratando ou prevenindo desta forma a doença ou condição.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a dita doença ou condição é gastrite selecionada no grupo que consiste em gastrite induzi- da por Heliobacter pylori, gastrite atrófica, anemia perniciosa, lesão à muco- sa relacionada à tensão, gastropatia alcoólica, úlceras gástricas, úlceras du- odenais, úlceras intestinais, gastrite alcalina pós-operatória, e gastroenterite eosinofílica.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde o mamífero está necessitando de tratamento profilático para a dita condição ou doença.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde o componente agonista de prostaglandina EP4 é administrado ao trato gastrointestinal do mamífero.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a doença ou condição é gastrite induzida por Heliobacter pylori
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a doença ou condição é gastrite atrófica.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a doença ou condição é doença do refluxo gastroesofágico.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a doença ou condição é anemia perniciosa.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a doença ou condição é lesão à mucosa relacionada à tensão.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a doença ou condição é gastropatia alcoólica.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a doença ou condição é gastrite alcalina pós-operatória.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a doença ou condição é gastroenterite eosinofílica.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a doença ou condição é duodenite.
14. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a doença ou condição é diverticulite.
15. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a doença ou condição é síndrome de Zolliger-Ellison.
16. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a doença ou condição é toxicidade gastrointestinal induzida por quimioterapia.
17. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a doença ou condição é toxicidade gastrointestinal induzida por radiação..
18. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a doença ou condição é toxicidade gastrointestinal induzida por NSAID.
19. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a doença ou condição é uma ferida no trato gastrointestinal.
20. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a doença ou condição é uma úlcera gástrica.
21. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a doença ou condição é úlcera duodenal.
22. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a doença ou condição é uma úlcera intestinal.
23. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde o o compo- nente agonista de prostaglandina EP4 compreende o dito agonista de pros- taglandina EP4,um sal farmaceuticamente aceitável do dito agonista de pros- taglandina EP4, um profármaco do dito agonista de prostaglandina EP4, ou uma mistura de dois ou mais destes agentes.
24. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde o o compo- nente agonista de prostaglandina EP4 compreende um profármaco de um agonista de prostaglandina EP4.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, onde o profárma- co é um éster, éter, ou amida de um carboidrato; ou o profármaco é éster, éter, ou amida de um aminoácido.
26. Método, de acordo com a reivindicação 24, onde o profárma- co é uma amida, éster, ou éter, um aminoácido.
27. Método, de acordo com a reivindicação 24, onde o compo- nente agonista 24, componente agonista de prostaglandina EP4 compreende um éster, éter ou amida de glicosídeo; um éster, éter ou amida de glicuroní- deo; um éster, éter ou amida de ciclo-dextrina; ou um éster, éter ou amida de dextrano.
28. Composição terapêutica que compreende um NSAID e um componente agonista de prostaglandina EP4 que compreende a estrutura: <formula>formula see original document page 37</formula>
29. Composição, de acordo com a reivindicação 28, onde o componente agonista de prostaglandina EP4 compreende um profármaco de um agonista de prostaglandina EP4.
30. Composição, de acordo com a reivindicação 29, onde o pro- fármaco é um éster, éter, ou amida de um carboidrato; ou o profármaco é um éster, éter, ou amida de um aminoácido.
31. Composição, de acordo com a reivindicação 29, onde o pro- fármaco é uma amida, éster, ou éter de um aminoácido.
32. Composição, de acordo com a reivindicação 29, o compo- nente agonista de prostaglandina EP4 compreende um éster, éter ou amida de glicosídeo; um éster, éter ou amida de glicuronídeo; um éster, éter ou amida de ciclodextrina; ou um éster, éter ou amida de dextrano.
33. Composição, de acordo com a reivindicação 28, onde o NSAID é selecionado no grupo que consiste em aspirina, paracetamol, in- dometacina, ibuprofeno, cetorolac, napoxeno, piroxicam, nabumetona, cele- coxib, diclofenaco, diflunisal, etodolac, fenoprofen, cetoprofen, ácido mefe- nâmico, meloxicam, nabumetona, oxaprozin, sulindac, e tolmetina.
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