BRPI0719984A2

BRPI0719984A2 - Plantas de tabaco possuindo atividade de nicotina desmetilase reduzida

Info

Publication number: BRPI0719984A2
Application number: BRPI0719984-8A
Authority: BR
Inventors: Dongmei Xu; Mark T Nielsen; Yanxin Shen
Original assignee: Us Smokeless Tobacco Co
Priority date: 2006-12-15
Filing date: 2007-12-13
Publication date: 2014-02-11
Also published as: CN103993023A; HK1156352A1; TW200845887A; US20100218270A1; JP2010512751A; EP2333081A2; EP2540830A2; CN101611146B; EP2540830A3; WO2008076802A3; AR064392A1; EP2121941A2; CN103993023B; EP2121941A4; AP2009004905A0; EP2333081A3; EP2333081B1; WO2008076802A2; EP2537939A1; EP2121941B1

Description

PLANTAS DE TABACO POSSUINDO ATIVIDADE DE NICOTINA DESMETILASE REDUZIDA

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente U.S. N0 de Série 11/611.782, depositado em 15 de dezembro de 2006, aqui incorporado por referência em sua totalidade.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

1. Campo técnico

A presente invenção está dirigida de forma geral às

composições e aos métodos relacionados às plantas de tabaco que possuem atividade reduzida de nicotina desmetilase.

2. Fundamentos

As plantas de tabaco são conhecidas por N-desmetilarem 15 nicotina para formar nornicotina, um alcalóide secundário conhecido por ser um precursor para a formação mediada por micróbios de N-Nitrosonornicotina (daqui em diante, "NNN") em folhas curadas. A reação de N-desmetilação é catalisada pela enzima nicotina desmetilase (NDM). Os métodos atuais

2 0 para a redução da conversão do substrato nicotina no

produto nornicotina no tabaco utilizam avaliação para eliminar plantas conversoras dos lotes de geração de sementes que são usados para a produção de sementes comerciais. As sementes produzidas diretamente por sementes 25 submetidas à avaliação, no entanto, ainda contêm conversores.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

São aqui fornecidos composições e métodos relacionados à produção de plantas, híbridos, variedades e linhagens de

3 0 tabaco que possuem uma mutação em um gene de nicotina desmetilase ou que expressam um RNA de fita dupla que compreende uma seqüência de um gene de nicotina desmetilase.

São aqui fornecidos híbridos, variedades e linhagens de tabaco. Um híbrido, uma variedade ou uma linhagem de tabaco pode compreender plantas que possuem uma mutação em um gene de nicotina desmetilase. Uma planta que possui uma mutação em um gene de nicotina desmetilase pode ter um fenótipo não-conversor, e a prole de uma planta desse tipo pode ter uma taxa de reversão que é reduzida pelo menos 2X (por exemplo, IOX a 1.000X ou 2X a 100X) , comparada com a taxa de reversão do híbrido, variedade ou linhagem de tabaco correspondente que compreende plantas compreendendo um gene de nicotina desmetilase do tipo selvagem. Um híbrido, uma variedade ou uma linhagem de tabaco pode ser um tabaco do tipo Burley, do tipo escuro, com folhas secas em secador de ar quente (flue-cured) ou do tipo Oriental. Um híbrido, uma variedade ou uma linhagem de tabaco pode ser um híbrido, variedade ou linhagem de Nicotiana tabacum. Uma variedade pode ser derivada basicamente de BU 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CU 263, DF911, tabaco Galpao, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY 10, KY 14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KTY14 x L8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, tabaco "Perique", PVH03, PVHO9, PVHl9, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG Η51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 5 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight Η-6, Speight Η20, Speight NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN8 6LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309 ou VA3 59.

Também são fornecidos híbridos, variedades e linhagens de tabaco que compreendem plantas que possuem um alelo mutante em um lócus de nicotina desmetilase. Em certas modalidades, um alelo mutante em um lócus de nicotina desmetilase codifica uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: ID. DE SEQ. N°: 2, em que o triptofano no aminoácido 329 é substituído com um códon de parada; ID. DE SEQ. N°: 2, em que a prolina no aminoácido 107 é substituída com um aminoácido selecionado do grupo que consiste em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina; ID. DE SEQ. N°: 2, em que a isoleucina no aminoácido 163 é substituída com metionina, a lisina no aminoácido 309 é substituída com ácido glutâmico, a glicina no aminoácido 353 é substituída com cisteína e a serina no aminoácido 452 é substituída com prolina; ID. DE SEQ. N° :

2, em que a glutamina no aminoácido 416 é substituída com leucina e a serina no aminoácido 423 é substituída com prolina; ID. DE SEQ. N°: 2, em que a isoleucina no aminoácido 163 é substituída com metionina, a lisina no aminoácido 309 é substituída com ácido glutâmico, a glicina no aminoácido 353 é substituída com cisteína, a glutamina no aminoácido 416 é substituída com leucina, a serina no aminoácido 423 é substituída com prolina e a serina no aminoácido 452 é substituída com prolina; ID. DE SEQ. N°:

2, em que a seqüência de aminoácidos compreende três substituições selecionadas do grupo que consiste em I163M, L309E, G353C, Q416L, S423P e S452P; ID. DE SEQ. N°: 2, em que um aminoácido P107 é eliminado; ID. DE SEQ. N°: 2, em 10 que pelo menos três aminoácidos selecionados do grupo que consiste em 1163, L309, G353, Q416, S423 e S452 são eliminados; ID. DE SEQ. N°: 2, em que uma inserção de um ou dois aminoácidos está adjacente a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em P107, 1163, L309, G353, Q416, S423 15 e S452; ID. DE SEQ. N°: 2, em que um aminoácido em qualquer posição de 1 a 328 é substituído com um códon de parada; e ID. DE SEQ. N°: 2, em que um aminoácido em qualquer posição de 330 a 457 é substituído com um códon de parada. Em uma modalidade em particular, um alelo mutante codifica uma 20 seqüência de aminoácidos que compreende a seqüência definida no ID. DE SEQ. N°: 2, em que a prolina no aminoácido 107 é substituída com uma leucina.

Em outras modalidades, um alelo mutante compreende uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo que 25 consiste em: ID. DE SEQ. N°: 1, em que a guanina no ácido nucléico +2021 é substituída com uma adenina; ID. DE SEQ. N°: 1, em que a guanina no ácido nucléico +2291 é substituída com uma adenina; ID. DE SEQ. N°: 1, em que um doador de splice é inserido no íntron; e ID. DE SEQ. N°: 1,

3 0 em que um receptor de splice é inserido no íntron. Em uma modalidade em particular, um híbrido, uma variedade ou uma linhagem é um híbrido, uma variedade ou uma linhagem de Nicotiana tabacum. Em outra modalidade, uma variedade é derivada basicamente de BU 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 5 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CU 263, DF911, tabaco Galpao, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT2 04LC, KY 10, KY 14, KY 160, KY 17, 10 KY 171, KY 907, KY907LC, KTYl4 x L8 LC, Little Crittenden, McNair 3 73, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, tabaco "Perique", 15 PVHO3, PVHO9, PVHl9, PVH5 0, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220,. Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H2 0, Speight NF3, TI 20 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309 ou VA359.

Em certas outras modalidades, a invenção é dirigida aos métodos de produção de uma planta de tabaco. Em modalidades particulares, um método de produção de uma 25 planta de tabaco compreende a indução de mutagênese em células de uma espécie de Nicotianal obtenção de uma ou mais plantas das referidas células, e identificação de pelo menos uma dessas plantas que contém um gene de nicotina desmetilase que possui pelo menos uma mutação. Em outras 30 modalidades, o método ainda compreende o cruzamento de uma planta que contém a referida (pelo menos uma) mutação em um gene de nicotina desmetilase com uma segunda planta de Nicotiana; e seleção da prole do cruzamento que possui a mutação do gene de nicotina desmetilase. Em certas

modalidades, uma mutação compreende um gene de nicotina desmetilase que codifica a seqüência de aminoácidos definida no ID. DE SEQ. N°: 2, em que o triptofano no aminoácido 32 9 é substituído com um códon de parada; um gene de nicotina desmetilase que codifica a seqüência de 10 aminoácidos definida no ID. DE SEQ. N°: 2, em que a prolina no aminoácido 107 é substituída com um aminoácido selecionado do grupo que consiste em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, histidina, isoleucina, leucina, lisina,

metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina; um gene de nicotina desmetilase que codifica a seqüência de aminoácidos definida no ID. DE SEQ. N°: 2, em que a isoleucina no aminoácido 163 é substituída com metionina, a lisina no aminoácido 309 é substituída com 20 ácido glutâmico, a glicina no aminoácido 353 é substituída com cisteína e a serina no aminoácido 4 52 é substituída com prolina; um gene de nicotina desmetilase que codifica a seqüência de aminoácidos definida no ID. DE SEQ. N°: 2, em que a glutamina no aminoácido 416 é substituída com leucina 25 e a serina no aminoácido 423 é substituída com prolina; um gene de nicotina desmetilase que codifica a seqüência de aminoácidos definida no ID. DE SEQ. N°: 2, em que a isoleucina no aminoácido 163 é substituída com metionina, a lisina no aminoácido 309 é substituída com ácido glutâmico, 30 a glicina no aminoácido 353 é substituída com cisteína, a glutamina no aminoácido 416 é substituída com leucina, a s.erina no aminoácido 423 é substituída com prolina e a serina no aminoácido 4 52 é substituída com prolina; um gene de nicotina desmetilase que codifica a seqüência de aminoácidos definida no ID. DE SEQ. N°: 2, em que a seqüência de aminoácidos compreende três substituições selecionadas do grupo que consiste em I163M, L309E, G353C, Q416L, S423P e S452P; um gene de nicotina desmetilase que codifica a seqüência de aminoácidos definida no ID. DE SEQ. N°: 2, em que um aminoácido P107 é eliminado; um gene de nicotina desmetilase que codifica a seqüência de aminoácidos definida no ID. DE SEQ. N°: 2, em que pelo menos três aminoácidos selecionados do grupo que consiste em 1163, L309, G353, Q416, S423 e S452 são eliminados; um gene de nicotina desmetilase que codifica a seqüência de aminoácidos definida no ID. DE SEQ. N°: 2, em que uma inserção de um ou dois aminoácidos está adjacente a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em P107, 1163, L309, G353, Q416, S423 e S452; um gene de nicotina desmetilase que codifica a seqüência de aminoácidos definida no ID. DE SEQ. N°: 2, em que um aminoácido em qualquer posição de 1 a 328 é substituído com um códon de parada; um gene de nicotina desmetilase que codifica a seqüência de aminoácidos definida no ID. DE SEQ. N° : 2, em que um aminoácido em qualquer posição de 33 0 a 457 é substituído com um códon de parada em um gene de nicotina desmetilase que compreende a seqüência definida no ID. DE SEQ. N°: 1, em que a guanina no ácido nucléico +2021 é substituída com uma adenina; um gene de nicotina 3 0 desmetilase que compreende a seqüência definida no ID. DE SEQ. N°: 1, em que a guanina no ácido nucléico +2291 é substituída com uma adenina; um gene de nicotina desmetilase que compreende a seqüência definida no ID. DE SEQ. N°: 1, em que um doador de splice é inserido no 5 íntron; um gene de nicotina desmetilase que compreende a seqüência definida no ID. DE SEQ. N°: 1, em que um receptor de splice é inserido no íntron. Em modalidades particulares, a indução da mutagênese em células de uma espécie de Nicotiana está em uma semente.

Em algumas modalidades, a segunda planta de tabaco

exibe um traço fenotípico como, por exemplo, resistência a doenças; alto rendimento; índice de alto grau; curabililidade; qualidade da cura; capacidade de colheita mecânica; capacidade de manipulação; qualidade da folha; altura, amadurecimento da planta (por exemplo, amadurecimento precoce, amadurecimento precoce a médio, amadurecimento médio, amadurecimento médio a tardio ou amadurecimento tardio); tamanho do caule (por exemplo, um caule pequeno, médio ou grande); ou número de folhas por planta (por exemplo, um número pequeno (por exemplo, 5-10 folhas) , médio (por exemplo, 11-15 folhas) ou grande (por exemplo, 16-21) de folhas). Ainda em outras modalidades, o método ainda inclui autopolinização ou polinização de um receptor de pólen macho-estéril com um doador de pólen capaz de ser usado na produção de um híbrido ou um híbrido macho-estéril. A planta receptora de pólen macho-estéril ou a planta doadora de pólen possui um alelo mutante em um lócus de nicotina desmetilase. Em algumas modalidades, ambos os alelos no lócus de nicotina desmetilase são alelos 3 0 mutantes. Também é aqui fornecido material de tabaco curado. Em certas modalidades, um tabaco curado é feito de um híbrido, uma, variedade ou uma linhagem que compreende plantas que possuem uma mutação em um gene de nicotina desmetilase. Em outras modalidades, uma planta de tabaco que possui uma mutação em um gene de nicotina desmetilase possui um fenótipo não-conversor. Em outras modalidades, a prole das plantas possui uma taxa reduzida de reversão, quando comparada com o híbrido, variedade ou linhagem correspondente que compreende plantas que possuem um gene de nicotina desmetilase do tipo selvagem. Em outras modalidades, um tabaco curado é feito de um híbrido, uma variedade ou uma linhagem que compreende plantas transformadas com uma construção de RNAi que compreende um gene de nicotina desmetilase, ou um fragmento deste. Em outras modalidades, um tabaco curado é feito de um híbrido, uma variedade ou uma linhagem que compreende plantas transformadas com uma construção de RNAi que compreende uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N°: 5, ID. DE SEQ. N°: 6, ID. DE SEQ. N°: 7 e ID. DE SEQ. N°: 8. Em certas modalidades, o material de tabaco curado é feito por um processo de cura selecionado do grupo que consiste em cura em secadores de ar quente, cura com livre circulação de ar, cura ao fogo e cura ao sol.

Também são aqui fornecidos produtos de tabaco. Em uma modalidade em particular, um produto de tabaco compreende material de tabaco curado obtido de um híbrido, uma variedade ou uma linhagem que compreende plantas que 3 0 possuem um alelo mutante em um lócus de nicotina desmetilase. Em outras modalidades, um tabaco curado é fei.tp de um híbrido, uma variedade ou uma linhagem que compreende plantas transformadas com uma construção de RNAi que compreende um gene de nicotina desmetilase, ou um 5 fragmento deste. Em outras modalidades, um tabaco curado é feito de um híbrido, uma variedade ou uma linhagem que compreende plantas transformadas com uma construção de RNAi que compreende uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N°: 5, ID. 10 DE SEQ. N°: 6, ID. DE SEQ. N°: 7, e ID. DE SEQ. N°: 8. Em certas modalidades, um produto de tabaco é um cigarro, um charuto, um tabaco para cachimbo, um produto de tabaco sem fumaça, uma película, uma placa, um gel, uma parte moldada, um bastão ou uma espuma.

São aqui fornecidas plantas Mi de tabaco e prole de

plantas Mi de tabaco. Uma planta de tabaco Mi pode ser heterozigota para um alelo mutante em um lócus de nicotina desmetilase e produzir prole, em que pelo menos uma porção da prole autopolinizada de primeira geração da referida planta exibe um fenótipo não-conversor. A prole da referida planta de tabaco Mi pode reverter para um fenótipo conversor em uma taxa que é estatisticamente significativamente menor do que a taxa de reversão da prole da planta de tabaco correspondente que compreende um alelo do tipo selvagem no referido lócus de nicotina desmetilase. Uma planta de tabaco M1 pode exibir um fenótipo não- conversor e produzir uma prole que pode reverter para um fenótipo conversor em uma taxa que é estatisticamente significativamente menor do que a taxa de reversão da prole 3 0 de uma planta de tabaco correspondente que compreende um alelo do tipo selvagem no referido lócus de nicotina desmetilase. Em uma modalidade em particular, uma planta ou prole é derivada basicamente de BU 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900,

Coker 17 6, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CU 263, DF911, tabaco Galpao, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY 10, KY 14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KTYl 4 x L8 LC, Little 10 Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, tabaco "Perique", PVHO3, PVHO9, PVHl9, PVH50, PVH51, R 610, R 630, 15 R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, TI 1406, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN 20 D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309 ou VA359.

Também são aqui fornecidos híbridos, variedades ou linhagens de tabaco, em que as plantas dos híbridos, variedades ou linhagens são transformadas com uma construção de RNAi que compreende um gene de nicotina 25 desmetilase, ou um fragmento deste, e em que as plantas exibem expressão diminuída de um gene de nicotina desmetilase, quando comparadas com plantas de um híbrido, variedade ou linhagem de tabaco de controle desprovida da construção de RNAi. 0 gene de nicotina desmetilase, ou um 30 fragmento deste, pode ter de 25 a 500 ou de 100 a 300 nucleotídeos de comprimento. Um híbrido, uma variedade ou uma linhagem de tabaco pode ser um tabaco do tipo Burley, do tipo escuro, do»tipo *seco com secadores de ar quente ou do tipo Oriental. Um híbrido, uma variedade ou uma linhagem 5 de tabaco pode ser um híbrido, uma variedade ou uma linhagem de Nicotiana tabacum. Uma variedade pode ser derivada basicamente de BU 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CU 263, DF911, 10 tabaco Galpao, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY 10, KY 14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KTYl4 x L8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, NC 15 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, tabaco "Perique", PVHO3, PVH09, PVHl9, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 20 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309 ou VA359. Um 25 híbrido, uma variedade ou uma linhagem pode ser um híbrido, uma variedade ou uma linhagem de Nicotiana taJbacum.

Também são aqui fornecidos híbridos, variedades ou linhagens de tabaco, em que as plantas do referido híbrido, variedade ou linhagem são transformadas com uma construção de RNAi que compreende uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N°: 5, ID. DE SEQ. N°: 6, ID. DE SEQ. N°: 7 e ID. DE SEQ. N° : 8, e em que as plantas exibem expressão diminuída de um gene de nicotina desmetilase, quando comparadas com plantas de um 5 híbrido, variedade ou linhagem de tabaco de controle desprovida da construção de RNAi. Uma variedade pode ser derivada basicamente de BU 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CU 263, DF911, 10 tabaco Galpao, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY 10, KY 14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KTYl4 x L8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, NC 15 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, tabaco "Perique", PVHO3, PVHO9, PVHl9, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 20 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H2 0, Speight NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309 ou VA359.

São aqui fornecidos métodos de produção de uma planta

de tabaco. Os métodos compreendem a introdução em uma célula de uma planta de Nicotiana de uma construção de RNAi que compreende um gene de nicotina desmetilase, ou um fragmento deste, a obtenção de uma ou mais plantas da 3 0 referida célula, a identificação de pelo menos uma das plantas que exibe expressão diminuída de um gene de nicotina desmetilase, quando comparada com a planta de tabaco correspondente -desprovida da construção de RNAi. Os métodos podem ainda compreender o cruzamento de uma planta 5 que contém a construção de RNAi com uma segunda planta de Nicotiana, e a seleção da prole do cruzamento que exibe expressão diminuída de um gene de nicotina desmetilase, quando comparada com a planta de tabaco correspondente desprovida da construção de RNAi.

Em certas outras modalidades, a invenção é dirigida

aos métodos de produção de uma planta de tabaco. Em modalidades particulares, um método de produção de uma planta de tabaco compreende o cruzamento de uma planta que foi transformada com uma construção de RNAi que compreende 15 um gene de nicotina desmetilase, ou um fragmento deste, com uma segunda planta de Nicotiana-, e seleção da prole do cruzamento que possui a construção de RNAi.

Em algumas modalidades, a segunda planta de tabaco exibe um traço fenotípico como, por exemplo, resistência a doenças; alto rendimento; índice de alto grau; curabililidade; qualidade da cura; capacidade de colheita mecânica; capacidade de manipulação; qualidade da folha; altura, amadurecimento da planta (por exemplo, amadurecimento precoce, amadurecimento precoce a médio, amadurecimento médio, amadurecimento médio a tardio, ou amadurecimento tardio); tamanho do caule (por exemplo, um caule pequeno, médio ou grande); ou número de folhas por planta (por exemplo, um número pequeno (por exemplo, 5-10 folhas), médio (por exemplo, 11-15 folhas) ou grande (por exemplo, 16-21 folhas) de folhas). Ainda em outras modalidades, o método ainda inclui autopolinização ou polinização de um receptor de pólen macho-estéril com um doador de pólen capaz de ser usado na produção de um híbrido ou um híbrido macho-estéril. A planta receptora de 5 pólen macho-estéril ou a planta doadora de pólen é transformada com uma construção de RNAi que compreende um gene de nicotina desmetilase, ou um fragmento deste.

A menos que definido de forma diferente, todos os termos técnicos e científicos aqui usados possuem o mesmo significado normalmente usado por aqueles habilitados na técnica à qual esta invenção pertence. Embora possam ser usados métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos para a prática da invenção, métodos e materiais adequados serão descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência em sua totalidade. No caso de conflito, a presente especificação, incluindo definições, irá controlar. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos, e não visam ser limitantes.

Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são apresentados nos desenhos em anexo e na descrição detalhada apresentada abaixo. Outras características, objetivos e vantagens da invenção ficarão evidentes a partir da descrição e dos desenhos e pelas reivindicações.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 revela o percentual de conversão de nicotina em nornicotina medido por cromatografia a gás em folhas tratadas com etileno de linhagens de tabaco TN90 em 3 0 relação ao estado de mutação. A: Linhagem 424 6, B: Linhagem 1849, C: Linhagem 4278, D: Linhagem 4215, E: Linhagem 3320, e F: Linhagem 1394. "Hetero" indica que a planta é heterozigota para um alelo mutante de nicotina desmetilase. "Homo" indica que a planta é homozigota para um alelo 5 mutante de nicotina desmetilase. "Selvagem" indica que a planta é homozigota para nicotina desmetilase do tipo selvagem.

A Figura 2 mostra uma seqüência de ácidos nucléicos (ID. DE SEQ. N°: 1) e uma seqüência de aminoácidos (ID. DE 10 SEQ. N°: 2) de nicotina desmetilase. Os números que correspondem à seqüência de nucleotídeos estão no lado esquerdo e os números que correspondem à seqüência de aminoácidos estão no lado direito. Foram usados o programa "Web Signal Scan" e ferramentas de alinhamento de 15 seqüências para identificar os seguintes: sítios de reconhecimento de substrato (em caixas), domínio transmembrana hidrofóbico do terminal N (sublinhado), região rica em prolina (sublinhada e em itálico), bolsa de ligação de oxigênio que contém treonina (sublinhado

2 0 pontilhado), consenso de hélice K e PERF (sublinhado

tracejado) e região de ligação de heme que contém cisteína (sublinhado duplo e em negrito).

A Figura 3 mostra uma representação esquemática de uma construção de RNAi de nicotina desmetilase. Promotor do 25 vírus do mosaico das nervuras da mandioca - CsVMV; seqüência anti-senso de nicotina desmetilase - NDMas; seqüência senso de nicotina desmetilase - NDMs; terminador Ter-Nos; promotor de Actina 2 de Arabidopsis thaliana - Act2; gene de neomicina fosfotransferase II - NPTII.

3 0 DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção se dirige às composições e aos métodos relacionados às, plantas de tabaco que possuem atividade reduzida de nicotina desmetilase. Por exemplo, este documento fornece plantas de tabaco que compreendem 5 uma ou mais mutações em um gene de nicotina desmetilase. Este documento também fornece plantas de tabaco que compreendem um RNA de fita dupla que compreende uma seqüência de ácidos nucléicos de um gene de nicotina desmetilase. Essas plantas de tabaco que compreendem uma 10 seqüência mutante de nicotina desmetilase em seu genoma ou um RNA de fita dupla que compreende uma seqüência de ácidos nucléicos de um gene de nicotina desmetilase tipicamente possuem um teor reduzido de nornicotina. Essas plantas são úteis no programas de cruzamento de tabaco, na produção de 15 tabaco curado e na produção de vários produtos de tabaco e/ou produtos derivados do tabaco.

Mutações em um gene de nicotina desmetilase

As plantas de tabaco aqui descritas são geradas tipicamente por indução de mutagênese em células de uma espécie de Nicotiana. 0 termo "mutagênese" refere-se ao uso de um agente mutagênico para induzir mutações genéticas dentro de uma população de indivíduos. Uma população a ser mutagenizada pode compreender plantas, partes de plantas, ou sementes. Para populações mutagenizadas, a dosagem da substância química ou radiação mutagênica é determinada experimentalmente para cada tipo de tecido de planta, de tal forma que seja obtida uma freqüência de mutação que esteja abaixo do nível limite caracterizado por letalidade ou esterilidade reprodutiva. O número de sementes de 3 0 geração M1 ou o tamanho de populações de plantas M1 resultante dos tratamentos mutagênicos são estimados com base na freqüência esperada de mutações.

A população mutagenizada, ou uma geração subseqüente daquela população, é então avaliada quanto a um traço(s) 5 desejado (por exemplo, um fenótipo não-conversor) que resulta da mutação (ou mutações). Alternativamente, a população mutagenizada, ou uma geração subseqüente daquela população, é avaliada quanto a uma mutação em um gene de interesse, por exemplo, um gene de nicotina desmetilase. 10 Por exemplo, a geração da prole M2 de plantas Mi pode ser avaliada quanto à presença de uma mutação em um gene de nicotina desmetilase. Uma "população" é qualquer grupo de indivíduos que compartilham um pool gênico comum. Como aqui usado, ''M0" refere-se às células de planta (e plantas 15 desenvolvidas a partir delas) expostas a um agente mutagênico, enquanto ''Mi" refere-se às sementes produzidas por plantas M0 autopolinizadas, e plantas desenvolvidas a partir dessas sementes. "M2" é a prole (sementes e plantas) de plantas Mi autopolinizadas, "M3" é a prole de plantas M2 20 autopolinizadas, e uM4" é a prole de plantas M3 autopolinizadas. "M5" é a prole de plantas M4 autopolinizadas. "M6", "M7" etc. são, cada um, a prole de plantas autopolinizadas da geração anterior. 0 termo nselfed", como aqui usado, significa autopolinizada.

Agentes mutagênicos adequados incluem, por exemplo,

mutágenos químicos e radiação ionizante. Mutágenos químicos adequados à indução de mutações incluem ácido nitroso, azida de sódio, laranja de acridina, brometo de etídio e etil metano sulfonato. A radiação ionizante adequada à

3 0 indução de mutações inclui raios X, raios gama, irradiação rápida de nêutrons e radiação UV. Outros métodos incluem o uso de transposons (Fedoroff e cols. , 1984; Pat. U.S. N0 4.732.856 e; Pat. U.S. N0 5.013.658), assim como metodologias de inserção de T-DNA (Hoekema e cols., 1983;

Pat. U.S. N0 5.149.645). Os tipos de mutações que podem ser induzidas em um gene de tabaco incluem, por exemplo, mutações pontuais, eliminações, inserções, duplicações e inversões.

Em algumas modalidades, a mutagênese é induzida por crescimento das células de planta em cultura de tecido, o que resulta na produção de variantes somaclonais. Alternativamente, a aplicação de metodologias padronizadas de cultura de protoplasto desenvolvidas para a produção de plantas híbridas com o uso de fusão de protoplasto também é útil para a geração de plantas que possuem expressão do gene variante (por exemplo, expressão variante do gene de nicotina desmetilase). Conseqüentemente, são gerados protoplastos a partir de uma primeira e uma segunda planta de tabaco que possuem expressão do gene variante. Os calos são cultivados a partir de fusões de protoplasto bem sucedidas e as plantas são então regeneradas. As plantas híbridas da prole resultantes são identificadas e selecionadas quanto à expressão variante do gene de acordo com métodos aqui descritos, e podem ser usadas em um dos protocolos de cruzamento aqui descrito.

O termo "gene de nicotina desmetilase", como aqui usado, refere-se a uma seqüência de ácidos nucléicos genômica que codifica um polipeptídeo de nicotina desmetilase. Um gene de nicotina desmetilase inclui seqüências codificadoras em um lócus de nicotina desmetilase, além de seqüências não codificadoras como, por exemplo, regiões reguladoras, íntrons e outras seqüências não traduzidas. Um gene de nicotina desmetilase do tipo selvagem pode compreender a seqüência de ácidos nucléicos 5 definida no ID. DE SEQ. N°: I. O termo "polipeptídeo de nicotina desmetilase", como aqui usado, refere-se a um polipeptídeo do citocromo P450 CYP82E4 que possui atividade de nicotina desmetilase. "Atividade de nicotina desmetilase" é a habilidade para N'-desmetilar nicotina 10 para produzir nornicotina. Um polipeptídeo de nicotina desmetilase do tipo selvagem pode compreender a seqüência de aminoácidos definida no ID. DE SEQ. N°: 2.

Como aqui fornecido (por exemplo, na Figura 2 e no Exemplo 5) , um polipeptídeo de nicotina desmetilase pode conter regiões que possuem homologia com domínios conservados em outros polipeptídeos do citocromo P450. Por exemplo, um polipeptídeo que possui a seqüência definida no ID. DE SEQ. N°: 2 contém seis sítios de reconhecimento de substrato (SRS), um domínio transmembrana hidrofóbico do terminal N, uma região rica em prolina, uma bolsa de ligação de oxigênio que contém treonina, um consenso de hélice K, um consenso PERF e uma região de ligação de heme que contém cisteína, como identificado pelos programas TFSEARCH e Web Signal Scan. Veja a Figura 2. Acredita-se que as seqüências de consenso de hélice K e PERF estabilizem a estrutura central de polipeptídeos do citocromo P450. A região de ligação de heme contém uma cisteína que é absolutamente conservada em polipeptídeos do citocromo P450 dependentes de doador de elétron. Acredita- 3 0 se que a região rica em prolina forme uma dobradiça entre a região transmembrana e a parte globular do polipeptídeo. Veja, por exemplo, Werck-Reichhart e Feyereisen (2000) Genome Biology 1: 3.003.

De preferência, uma mutação em um gene de nicotina desmetilase resulta na eliminação reduzida ou até mesmo completa da atividade de nicotina desmetilase em uma planta que compreende a mutação. Tipos adequados de mutações em um gene de nicotina desmetilase incluem, sem limitação, inserções de nucleotídeos, eliminações de nucleotídeos ou transições ou transversões na seqüência do gene de nicotina desmetilase do tipo selvagem. Mutações na seqüência codificadora podem resultar em inserções de um ou mais aminoácidos, eliminações de um ou mais aminoácidos e/ou substituições não conservadoras de aminoácidos no produto gênico correspondente. Em alguns casos, a seqüência de um gene de nicotina desmetilase compreende mais de uma mutação ou mais de um tipo de mutação.

A inserção ou eliminação de aminoácidos em uma seqüência codificadora pode, por exemplo, romper a conformação de uma bolsa de ligação de substrato do produto gênico resultante. Inserções ou eliminações de aminoácido também podem romper os sítios catalíticos importantes para a atividade do produto gênico (por exemplo, um sítio de ligação de heme). Sabe-se na técnica que a inserção ou eliminação de um número maior de aminoácidos contíguos aumenta a probabilidade de tornar o produto gênico não funcional, comparada com um número menor de aminoácidos inseridos ou eliminados. Um exemplo de uma mutação desse tipo é uma mutação em um gene de nicotina desmetilase que codifica a seqüência de aminoácidos definida no ID. DE SEQ. Ν°: 2, cuja mutação resulta na substituição do triptofano no aminoácido 329 com um códon de parada.

.Substituições de aminoácidos não conservadoras podèm substituir um aminoácido de classe com um aminoácido de uma classe diferente. Substituições não conservadoras podem fazer uma alteração substancial na carga ou hidrofobicidade do produto gênico. Substituições de aminoácidos não conservadoras também podem fazer uma alteração substancial no volume da cadeia lateral do resíduo, por exemplo, a substituição de um resíduo de isoleucina por um resíduo de alanina. Exemplos de substituições não conservadoras incluem um aminoácido básico para um aminoácido não polar, ou um aminoácido polar para um aminoácido ácido. Um exemplo dessas mutações é uma mutação em um gene de nicotina desmetilase que codifica a seqüência de aminoácidos definida no ID. DE SEQ. N°: 2, cuja mutação resulta na substituição de prolina no aminoácido 107 por uma leucina.

Em algumas modalidades, uma mutação em um gene de nicotina desmetilase resulta na ausência de mudanças de aminoácidos (por exemplo, uma mutação silenciosa). Mutações silenciosas são mutações em uma seqüência de nucleotídeos que não afetam a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo codificado. Mutações silenciosas eficazes para redução da atividade de nicotina desmetilase incluem mutações no gene de nicotina desmetilase do ID. DE SEQ. N°: 1, em que a guanina no ácido nucléico +2.021 é substituída com uma adenina, ou a guanina no ácido nucléico +2.291 é substituída com uma adenina. Outras mutações que resultam na ausência de mudanças de aminoácidos podem ser em uma região não codificadora 5' (por exemplo, um promotor ou uma região não traduzida 5'), um intron, ou uma região não codificadora 3'. Tais mutações, embora não afetem a seqüência de aminoácidos da nicotina desmetilase codificada, podem alterar os níveis de transcrição (por exemplo, aumentando ou diminuindo a transcrição), diminuir os níveis de tradução, alterar a estrutura secundária de DNA ou mRNA, alterar sítios de ligação para o maquinário da transcrição ou tradução, ou diminuir a eficiência da ligação de tRNA. Mutações adequadas que reduzem ou eliminam a atividade de nicotina desmetilase incluem mutações que inserem um doador de splice no íntron do gene de nicotina desmetilase, inserem um receptor de splice no íntron, ou eliminam um sítio de splice do íntron.

Em certas modalidades, uma mutação em um gene de nicotina desmetilase eficaz para a redução da atividade de nicotina desmetilase é determinada por identificação de uma planta que possui uma mutação em um gene de nicotina desmetilase e pela medida da atividade da enzima nicotina desmetilase. Em outras modalidades, uma mutação em um gene de nicotina desmetilase que é adequada para a redução da atividade de nicotina desmetilase é prevista com base no efeito das mutações aqui descritas, por exemplo, aquelas mutações contidas nas linhagens TN90 4246, 1849, 4278 e 4215, como apresentadas na Tabela 1 e na Tabela 3. Por exemplo, uma mutação em um gene de nicotina desmetilase que codifica a seqüência de aminoácidos definida no ID. DE SEQ. N0: 2 pode incluir uma mutação que substitui qualquer um dos aminoácidos 1-328 com um códon de parada.

Em outra modalidade, uma mutação em um gene de nicotina desmetilase que é eficaz para a redução da atividade de nicotina desmetilase é identificada com base na função de seqüências relacionadas, por exemplo, ID. DE SEQ. N°: 3 e ID. DE SEQ. N°: 4. Por exemplo, um gene de nicotina desmetilase pode ser mutado de tal forma que 5 codifique um polipeptídeo de nicotina desmetilase que possui uma combinação de mutações no ID. DE SEQ. N°: 2, por exemplo, a combinação de I163M, K309E, G353C e S452P, ou a combinação de Q416L e S423P.

Em certas outras modalidades, uma mutação em um gene 10 de nicotina desmetilase que é eficaz para a redução da atividade de nicotina desmetilase é identificada com base em um modelo molecular ou análise de seqüências da estrutura de um polipeptídeo de nicotina desmetilase. Um modelo molecular ou uma análise de seqüências desse tipo 15 pode ser usado para identificar quais aminoácidos, quando mutados, irão alterar a estrutura ou a função do polipeptídeo. Por exemplo, um modelo molecular pode ser usado para identificar quais aminoácidos em uma bolsa de ligação de substrato podem ser eliminados ou substituídos

2 0 com um aminoácido não conservador para reduzir o nível de conversão de nicotina em nornicotina. Em outro exemplo, a análise de seqüências pode determinar quais aminoácidos podem ser substituídos com um códon de parada para romper um domínio conservado. Por exemplo, uma mutação em um gene 25 de nicotina desmetilase que codifica a seqüência de aminoácidos definida no ID. DE SEQ. N°: 2 pode incluir uma mutação que substitui qualquer um dos aminoácidos 330-457 com um códon de parada, rompendo, dessa forma, o sítio de ligação de heme de nicotina desmetilase.

Plantas de tabaco que possuem alelos mutantes de nicotina desmetilase

Uma ou mais plantas Mi de tabaco são obtidas a partir

de células, de íàndá^íduos= mufeagenizados e pelo menos uma das

.... ^ -

plantas é identificada como contendo uma mutação em um gene de nicotina desmetilase. Uma planta de tabaco M1 pode ser heterozigota para um alelo mutante em um lócus de nicotina desmetilase e, em função da presença do alelo do tipo selvagem, exibir um fenótipo conversor, ou seja, ser capaz de converter nicotina em nornicotina. Nesses casos, pelo menos uma porção da prole autopolinizada de primeira geração de uma planta desse tipo exibe um fenótipo não- conversor. Alternativamente, uma planta de tabaco M1 pode ter um alelo mutante em um lócus de nicotina desmetilase e exibir um fenótipo não-conversor. Essas plantas podem ser heterozigotas e exibir um fenótipo não-conversor em função de fenômenos como, por exemplo, uma supressão dominante negativa, apesar da presença do alelo do tipo selvagem, ou podem ser homozigotas das mutações induzidas independentemente em ambos os alelos no lócus de nicotina desmetilase. A prole subseqüente de ambos os tipos de plantas M1, no entanto, reverte para um fenótipo conversor em uma taxa que é estatisticamente significativamente menor do que a taxa de reversão da prole de uma planta de tabaco correspondente que é do tipo selvagem no lócus de nicotina desmetilase, como discutido abaixo.

Plantas de tabaco M1 que carregam alelos mutantes de nicotina desmetilase podem ser de espécies de Nicotiana como, por exemplo, Nicotiana tabacum, Nicotiana otophora, Nicotiana thrysifIoral Nieotiana tomentosa, Nieotiana tomentosiformis, Nieotiana africana, Nicotiana amplexicaulis, Nicotiana arentsii, Nicotiana benthamiana, Nieotiana bigelovii, Nieotiana corymbosa, Nieotiana debneyi, Nicotiana ^xcelsior, Nieotiana exigua, Nieotiana glutinosa, Nieotiana goodspeedii, Nieotiana gossei, 5 Nieotiana hesperis, Nieotiana ingulba, Nieotiana knightiana, Nieotiana maritima, Nieotiana megalosiphon, Nieotiana miersii, Nieotiana nesophila, Nieotiana noetiflora, Nieotiana nudieaulis, Nieotiana otophora, Nieotiana palmeri, Nieotiana panieulata, Nieotiana 10 petunioides, Nieotiana plumbaginifolia, Nicotiana repanda, Nieotiana rosulata, Nieotiana rotundifolia, Nieotiana rústica, Nicotiana setchelli, Nicotiana stocktonii, Nicotiana eastii, Nicotiana suaveolens ou Nicotiana trigonophylla.

Variedades de Nicotiana tabacum particularmente úteis

incluem tabacos do tipo Burley, do tipo escuro, com folhas secas em secador de ar quente e do tipo Oriental, tais como as variedades de tabaco BU 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CU 263, DF911, tabaco Galpao, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY 10, KY 14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KTY14 x L8 LC, Little Crittenden, McNair 3 73, McNair 94 4, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, tabaco "Perique", PVHO3, PVHO9, PVHl9, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight, 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight Η2 0, Speight NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, 5 TN D95 0, TR (Tom Rosson) Madole, VA 3 09 ou VA359.

Uma planta de tabaco que carrega um alelo mutante de nicotina desmetilase pode ser usada em um programa de cruzamento de plantas para criar linhagens, variedades e híbridos inéditos e úteis. Dessa forma, em algumas 10 modalidades, uma planta de tabaco de geração M1, M2, M3 ou posterior contendo pelo menos uma mutação em um gene de nicotina desmetilase é cruzada com uma segunda planta de Nicotiana., e é identificada a prole do cruzamento na qual a mutação (ou mutações) do gene de nicotina desmetilase está 15 presente. Será observado que a segunda planta de Nicotiana pode ser uma das espécies e variedades aqui descritas. Também será observado que a segunda planta de Nicotiana pode conter a mesma mutação de nicotina desmetilase que a planta com a qual é cruzada, uma mutação de nicotina 20 desmetilase diferente, ou ser do tipo selvagem no lócus de nicotina desmetilase.

O cruzamento é realizado por meio de procedimento conhecidos. Técnicas de impressões digitais do DNA {DNA fingerprinting) , SNP ou tecnologias similares podem ser 25 usadas em um programa de cruzamento por seleção assistida por marcador (MAS) para transferir ou cruzar alelos mutantes de um gene de nicotina desmetilase em outros tabacos, como aqui descrito. Por exemplo, um criador pode criar populações segregantes de hibridizações de um 3 0 genótipo que contém um alelo mutante com um genótipo agronomicamente desejável. As plantas nas gerações F2 ou de retrocruzamento podem ser avaliadas com o uso de um marcador desenvolvido a partir de uma seqüência de nicotina desmetilase ou de um fragmento desta, com o uso de uma das 5 técnicas aqui listadas. As plantas identificadas como possuindo o alelo mutante podem ser retrocruzadas ou autopolinizadas para criar uma segunda população a ser avaliada. Dependendo do padrão de hereditariedade esperado ou da tecnologia MAS usada, pode ser necessário 10 autopolinizar as plantas selecionadas, antes de cada ciclo de retrocruzamento, para auxiliar a identificação das plantas individuais desejadas. 0 retrocruzamento ou outro procedimento de cruzamento pode ser repetido até que o fenótipo desejado do parente recorrente seja recuperado.

Espécies de Nicotiana que exibem compatibilidade de

cruzamento com Nicotiana tabacum incluem Nicotiana amplexieaulis, PI 271989; Nieotiana benthamiana PI 555478; Nieotiana bigelovii PI 555485; Nieotiana debneyi; Nieotiana exeelsior PI 224063; Nieotiana glutinosa PI 555507; Nieotiana goodspeedii PI 241012; Nieotiana gossei PI 23 0953; Nieotiana hesperis PI 271991; Nieotiana knightiana PI 555527; Nieotiana maritima PI 555535; Nieotiana megalosiphon PI 555536; Nieotiana nudieaulis PI 555540; Nieotiana panieulata PI 555545; Nieotiana plumbaginifolia PI 555548; Nieotiana repanda PI 555552; Nieotiana rústica; Nicotiana suaveolens PI 230960; Nicotiana sylvestris PI 555569; Nieotiana tomentosa PI 266379; Nieotiana tomentosiformis; e Nieotiana trigonophylla PI 555572. Vejam também, "Compendium of Tobacco Diseases", publicado por "American Phytopathology Society", ou "The Genus Nieotiana Illustrated", publicado por "Japan Tobacco Inc.".

Os cruzamentos bem sucedidos geram plantas Fi que são férteis e que podem ser retrocruzadas com um dos parentes, se desejado. Em algumas modalidades, uma população de plantas da geração F2 é avaliada quanto à expressão variante do gene de nicotina desmetilase; por exemplo, é identificada uma planta que não expressa nicotina desmetilase em função da ausência de um gene de nicotina desmetilase de acordo com métodos padronizados, por exemplo, com o uso de um método de PCR com iniciadores baseados nas informações de seqüências de nucleotídeos para nicotina desmetilase aqui descritas. As plantas selecionadas são então cruzadas com um dos parentes, e as plantas da primeira geração de retrocruzamentos (BCi) são autopolinizadas para produzir uma população BCiF2 que é novamente avaliada quanto à expressão variante do gene de nicotina desmetilase (por exemplo, a versão nula do gene de nicotina desmetilase). O processo de retrocruzamento, autopolinização e avaliação é repetido, por exemplo, pelo menos 4 vezes, até que a avaliação final produza uma planta que seja fértil e razoavelmente similar ao parente recorrente. Essa planta, se desejado, é autopolinizada e a prole é subseqüentemente avaliada novamente para confirmar que a planta exibe expressão variante do gene de nicotina desmetilase (por exemplo, uma planta que exiba a condição nula para nicotina desmetilase) ou expressão variante da seqüência de ácidos nucléicos NDM, ou um fragmento desta. São realizadas opcionalmente análises citogenéticas das plantas selecionadas para confirmar o complemento de 3 0 cromossomos e os relacionamentos de pareamento de cromossomos. A semente do criador da planta selecionada é produzida com o uso de métodos padronizados que incluem, por exemplo, teste de campo, confirmação da condição nula para nicotina desmetilase, análises químicas da folha 5 curada para determinar o nível de alcalóides e/ou análises químicas da folha curada para determinar a proporção de nornicotina para nicotina + nornicotina.

Em situações nas quais o híbrido F1 original resultante do cruzamento entre um primeiro tabaco parente 10 mutante (por exemplo, TN 90) e um segundo tabaco parente do tipo selvagem (por exemplo, N. rústica) é hibridizado ou retrocruzado com o tabaco parente mutante, a prole do retrocruzamento pode ser autopolinizada para criar uma geração BC1F2 que é avaliada quanto ao alelo mutante de 15 nicotina desmetilase.

O resultado de um programa de cruzamento de plantas com o uso das plantas de tabaco mutante aqui descritas são linhagens, híbridos e variedades inéditas e úteis. Como aqui usado, o termo "variedade" refere-se a uma população de plantas que compartilham características constantes que as separam da de outras plantas da mesma espécie. Uma variedade é freqüentemente, embora nem sempre, vendida comercialmente. Embora possua um ou mais traços distintivos, uma variedade é ainda caracterizada por uma variação global muito pequena entre indivíduos dentro daquela variedade. Uma variedade de "linhagem pura" pode ser criada por várias gerações de autopolinização e seleção, ou propagação vegetativa a partir de um único parente com o uso de técnicas de cultura de tecido ou célula. Uma variedade pode ser derivada basicamente de outra linhagem ou variedade. Como definido pela "International Convention for the Protection of New Varieties of Plants"* s( 2 de dezembro de 1961, revisado por Genebra em 10 de novembro de 1972, em 23 de outubro de 1978 5 e em 19 de março de 1991) , uma variedade é "essencialmente derivada" de uma variedade inicial se: a) ela é derivada predominantemente da variedade inicial, ou de uma variedade que seja derivada predominantemente da variedade inicial, ao mesmo tempo em que retém a expressão das características 10 essenciais que resultam do genótipo ou combinação de genótipos da variedade inicial; b) ela é nitidamente distinguível da variedade inicial; e c) exceto pelas diferenças que resultam do ato de derivação, ela está de acordo com a variedade inicial na expressão das 15 características essenciais que resultam do genótipo ou combinação de genótipos da variedade inicial. Variedades essencialmente derivadas podem ser obtidas, por exemplo, pela seleção de um mutante natural ou induzido, uma variante somaclonal, uma variante individual de plantas da 20 variedade inicial, retrocruzamento ou transformação. Uma "linhagem", como distinguida de uma variedade, mais freqüentemente representa um grupo de plantas usadas não comercialmente, por exemplo, em pesquisa de plantas. Uma linhagem tipicamente exibe pouca variação global entre 25 indivíduos quanto a um ou mais traços de interesse, embora possa haver alguma variação entre indivíduos quanto a outros traços.

Variedades híbridas de tabaco podem ser produzidas evitando-se a autopolinização de plantas parentes fêmeas (ou seja, sementes parentes) de uma primeira variedade, permitindo-se que o pólen de plantas parentes machos de uma segunda variedade fertilize as plantas parentes fêmeas e permitindo-se que sementes híbridas F1 se formem nas plantas fêmeas. A autopolinização de plantas fêmeas pode 5 ser evitada por emasculação das flores em um estágio inicial do desenvolvimento da flor. Alternativamente, a formação de pólen pode ser evitada nas plantas parentes fêmeas com o uso de uma forma de esterilidade masculina. Por exemplo, a esterilidade masculina pode ser produzida 10 por esterilidade masculina citoplasmática (CMS), esterilidade masculina nuclear, esterilidade masculina genética, esterilidade masculina molecular, em que um transgene inibe a microesporogênese e/ou a formação de pólen ou auto-incompatibilidade. As plantas parentes fêmeas 15 que contêm CMS são particularmente úteis. Em modalidades nas quais as plantas parentes fêmeas são CMS, as plantas parentes machos tipicamente contêm um gene restaurador de fertilidade para assegurar que os híbridos F1 sejam férteis. Em outras modalidades nas quais os parentes fêmeas

2 0 são CMS, podem ser usados parentes machos que não contêm um

restaurador de fertilidade. Os híbridos F1 produzidos a partir de parentes desse tipo são macho-estéreis. A semente do híbrido macho-estéril pode ser interplantada com semente macho-fértil para fornecer pólen para semear plantas macho- estéreis resultantes.

As variedades e linhagens aqui descritas podem ser usadas para formar híbridos F1 de tabaco por cruzamento único. Nessas modalidades, as plantas das variedades parentes podem ser desenvolvidas como populações adjacentes

3 0 substancialmente homogêneas para facilitar cruzamento- polinização natural a partir das plantas parentes machos para as plantas parentes fêmeas. A semente Fi formada nas plantas parentes. fêmeas é colhida seletivamente por meios convencionais. Pode-se também desenvolver as duas 5 variedades de plantas parentes a granel e colher uma mistura de semente de híbrido Fi formada no parente fêmea e semente formada pelo parente macho como o resultado da autopolinização. Alternativamente, podem ser feitos cruzamentos de três vias, em que um híbrido Fi de 10 cruzamento único é usado como um parente fêmea e é cruzado com um parente macho diferente. Como outra alternativa, podem ser criados híbridos de cruzamento duplo nos quais a prole Fi dos dois cruzamentos únicos diferentes são, eles próprios, cruzados. A auto-incompatibilidade pode ser usada 15 com uma vantagem particular para evitar a autopolinização de parentes fêmeas quando se forma um híbrido de cruzamento duplo.

Como aqui usado, uma planta de tabaco que possui um fenótipo conversor é uma planta de tabaco que possui um percentual de desmetilação de nicotina de pelo menos 5% (por exemplo, 5,0%, 5,1%, 5,5%, 6%, 8%, 15%, 30%, 50%, 70%, 90%, 95%, 98% ou 99%) , como medido em uma folha da posição média tratada com etileno colhida de uma planta de tabaco no estágio da altura do joelho ou posterior. Os termos "planta que possui um fenótipo conversor" e "planta conversora" são aqui usados de forma intercambiável. Similarmente, uma planta de tabaco que possui um fenótipo não-conversor é uma planta de tabaco que possui um percentual de desmetilação de nicotina de menos de 5% (por exemplo, 4,9%, 4,5%, 4,2%, 4%, 3,8%, 3,5%, 3%, 2%, 1%, 0,8%, 0,6%, 0,5%, 0,05%, 0,02%, 0,01%, ou indetectável), como medido em uma folha da posição média tratada com etileno colhida dê uma planta de tabaco no estágio da altura do joelho ou posterior. Os termos "planta que possui 5 um fenótipo não-conversor" e "planta não conversora" são aqui usados de forma intercambiável.

A nicotina e a nornicotina podem ser medidas em folhas tratadas com etileno com o uso de métodos conhecidos na técnica (por exemplo, cromatografia a gás). 0 percentual de 10 desmetilação de nicotina em uma amostra é calculado dividindo-se o nível de nornicotina pelo nível combinado de nicotina e nornicotina, como medido na amostra, e multiplicando-se por 100.

Uma planta que compreende uma mutação em um gene de nicotina desmetilase pode ser identificada por seleção ou avaliação do material da planta mutagenizada, ou prole desta. Essas metodologias de avaliação e seleção são conhecidas por aqueles que possuem habilidade na técnica. Exemplos de metodologias de avaliação e seleção incluem, sem limitação, análise Southern ou amplificação por PCR para a detecção de um polinucleotídeo; Northern blots, proteção de SI RNase, extensão de iniciador ou amplificação por RT-PCR para a detecção de transcritos de RNA; ensaios enzimáticos para a detecção de atividade de enzima ou ribozima de polipeptídeos e polinucleotídeos; e eletroforese em gel de proteína, Western blots, imunoprecipitação e imunoensaios ligados à enzima para detectar polipeptídeos. Outras técnicas, tais como hibridização in situ, coloração de enzima e imunocoloração, 3 0 também podem ser usadas para detectar a presença ou expressão de polipeptídeos e/ou polinucleotídeos. São conhecidos métodos para a realização de todas as técnicas citadas.

Uma população de plantas pode ser avaliada e/ou selecionada quanto àqueles membros da população que possuem um traço ou fenótipo desejado conferido por uma mutação em um gene de nicotina desmetilase, por exemplo, um fenótipo não-conversor. A seleção e/ou avaliação pode ser realizada ao longo de uma ou mais gerações, o que pode ser útil para identificar aquelas plantas que possuem um traço desejado. Em algumas modalidades, plantas que possuem um fenótipo não-conversor podem ser identificadas na geração M1. A seleção e/ou avaliação também pode ser realizada em mais de uma localização geográfica. Além disso, a seleção e/ou avaliação pode ser efetuada durante um estágio do desenvolvimento em particular no qual o fenótipo seja exibido pela planta.

Uma população de plantas que possuem um fenótipo não- conversor pode ser usada para selecionar e/ou avaliar 20 quanto às plantas com uma taxa reduzida de reversão, ou seja, a percentagem de plantas com fenótipo conversor na prole da geração seguinte de uma planta não conversora. A taxa de reversão é medida coletando-se sementes produzidas por uma planta não conversora após autopolinização, 25 plantando-se 300 a 500 das sementes e determinando-se o número de plantas resultantes que possuem um fenótipo conversor. A taxa de reversão é expressa como a percentagem de plantas da prole que possuem um fenótipo conversor.

Uma planta não conversora que possui uma mutação em um 3 0 gene de nicotina desmetilase e que exibe uma taxa reduzida de reversão pode ser cruzada para gerar um ou mais híbridos, variedades ou linhagens de tabaco que possuem uma taxa de reversão que é estatisticamente significativamente menor do que a taxa de reversão de um híbrido, variedade ou linhagem de tabaco de controle que possua a mesma base genética ou uma base genética similar, mas que carrega um gene de nicotina desmetilase do tipo selvagem. Tipicamente, uma redução na taxa de reversão em relação a um híbrido, variedade ou linhagem de controle é considerada estatisticamente significante em p ^ 0,05 com uma estatística paramétrica ou não paramétrica apropriada, por exemplo, teste de qui-quadrado, teste t de Student, teste de Mann-Whitney ou teste F. Em algumas modalidades, uma redução na taxa de reversão é estatisticamente significante em p < 0,01, p < 0,005 ou p < 0,001.

A extensão na qual a taxa de reversão é reduzida tipicamente depende do tipo de tabaco. Por exemplo, um' tabaco do tipo Burley não conversor que possui uma mutação em um gene de nicotina desmetilase tipicamente possui uma taxa de reversão que é reduzida 10X ou mais (por exemplo, 10X a 1.000X, 10X a 100X, 50X a 250X, 50X a 100X, 150X a 300X, 100X a 1.000X, 500X a 1.000X, 800X a 5.000X, ou 1500X a 10.000X) em relação a uma variedade de tabaco do tipo Burley da mesma base genética ou de base genética similar, mas que possui um gene de nicotina desmetilase do tipo selvagem. Em outro exemplo, um tabaco do tipo escuro não conversor que possui uma mutação em um gene de nicotina desmetilase tipicamente possui uma taxa de reversão que é reduzida 2X ou mais (por exemplo, 2X a 100X, 2X a 5X, 2X a 10X, 5X a 30X, 10X a 50X, 5X a 100X, 10X a 100X, 50X a 300Χ, 250Χ a 500X, 300X a 3.000X, ou 3.OOOX a 5.000X) em relação a uma variedade de tabaco do tipo escuro da mesma base genética ou de -base genética similar, mas que possui um gene de nicotina desmetilase do tipo selvagem. Em outro 5 exemplo, um tabaco com folhas secas em secador de ar quente não conversor que possui uma mutação em um gene de nicotina desmetilase tipicamente possui uma taxa de reversão que é reduzida 2X ou mais (por exemplo, 2X a 10X, 5X a 30X, IOX a 50X, IOX a 100X, 50X a 150X, 100X a 500X, 200X a 800X, 400X 10 a 1.000X, 500X a 3.000X, ou 1.000X a 5.000X) em relação a uma variedade de tabaco com folhas secas em secador de ar quente da mesma base genética ou de base genética similar, mas que possui um gene de nicotina desmetilase do tipo selvagem. Em alguns casos, a taxa de reversão de híbridos, 15 variedades ou linhagens de tabaco que compreendem plantas que possuem uma mutação em um gene de nicotina desmetilase pode ser tão baixa a ponto de ser indetectável.

O método de avaliação quanto à taxa de reversão reduzida pode depender da fonte do material de planta

2 0 mutagenizada. Por exemplo, caso o material de planta mutagenizada seja a semente de uma planta que possui um fenótipo conversor, métodos de avaliação adequados incluirão a identificação da prole que possui uma mutação em um gene de nicotina desmetilase e/ou identificação da 25 prole que possui um fenótipo não-conversor. Após essa prole ser identificada, seus membros são avaliados em busca daquelas plantas cuja prole exibe uma taxa reduzida de reversão. Em outro exemplo, caso o material de planta mutagenizada seja a semente de uma planta que possui um 30 fenótipo não-conversor, um método de avaliação adequado incluirá a identificação da prole que possui uma mutação em um gene de nicotina desmetilase e/ou a determinação de se a prole possui uma taxa reduzida de reversão.

Em algumas modalidades de métodos aqui descritos, linhagens resultantes de cruzamento e avaliação quanto aos genes de nicotina desmetilase variantes são avaliadas no campo com o uso de procedimentos de campo padronizados. Genótipos de controle que incluem um parente não mutagenizado original estão incluídos, e as entradas são dispostas no campo em um design de bloco completo randomizado ou em outro design de campo apropriado. São utilizadas práticas agronômicas padronizadas para tabaco, por exemplo, o tabaco é colhido, pesado e tem amostras coletadas para testes químicos e outros testes comuns, antes e durante a cura. São feitas análises estatísticas dos dados para confirmar a similaridade das linhagens selecionadas com a linhagem parente.

Interferência de RNA de nicotina desmetilase

Vetores de transformação adequados à interferência de RNA (RNAi) incluem aqueles que produzem RNAs capazes de formação de duplex (por exemplo, uma construção de RNAi de nicotina desmetilase), duas seqüências de ácidos nucléicos, uma na orientação senso e a outra na orientação anti-senso, podem ser ligadas operacionalmente, e colocadas sob o controle de um promotor, por exemplo, CaMV 35S, o promotor isolado do vírus da estria marrom da mandioca (CBSV), ou o promotor isolado do vírus do mosaico da veia da mandioca (CsVMV) . 0 uso de um promotor endógeno, por exemplo, um promotor de nicotina desmetilase, ou um fragmento deste que 3 0 conduza a transcrição, também pode ser desejável. Além disso, um ácido nucléico desse tipo pode ser ligado operacionalmente a uma seqüência de terminação da transcrição, por exemplo, o terminador do gene de nopalina sintase (nos).

0 comprimento das seqüências de ácidos nucléicos de

nicotina desmetilase de tabaco incluídas em uma construção desse tipo é desejavelmente de pelo menos 22 nucleotídeos, por exemplo, pelo menos 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 35, 40, 50, 80, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1.000, 2.000 10 nucleotídeos ou mais, mas pode englobar uma seqüência que inclui até um gene de nicotina desmetilase do tabaco de comprimento total. O comprimento de seqüências de ácidos nucléicos de nicotina desmetilase do tabaco incluídas em uma construção desse tipo pode ser de 22 nucleotídeos a 15 2.552 nucleotídeos, por exemplo, 22 a 100 nucleotídeos, 25

a 250 nucleotídeos, 25 a 500 nucleotídeos , 50 a 100 nucleotídeos, 50 a 500 nucleotídeos, 100 a 300 nucleotídeos, 100 a 500 nucleotídeos, 300 a 600 nucleotídeos, 500 a 1.000 nucleotídeos, 700 a 1500 nucleotídeos ou 1.000 a 2 . 000 nucleotídeos. Geralmente, pode ser usada uma homologia maior para compensar o uso de uma seqüência mais curta. Ácidos nucléicos adequados para uso em uma construção de ácido nucléico que codifica um RNA de fita dupla que são similares ou idênticos a um gene de 25 nicotina desmetilase incluem o ID. DE SEQ. N°: 5, ID. DE SEQ. N°: 6, ID. DE SEQ. N° : 7, e ID. DE SEQ. N°: 8, e complementos destes.

Um RNA capaz de formação de duplex pode compreender uma porção em alça. A porção em alça de um RNA de fita dupla pode ser de 3 nucleotídeos a 5.000 nucleotídeos, por exemplo, de 3 nucleotídeos a 25 nucleotídeos, de 15 nucleotídeos a 1.000 nucleotídeos, de 20 nucleotídeos a 500 nucleotídeos, ou de 25 nucleotídeos a 200 nucleotídeos. A porção em alça do RNA pode incluir um íntron ou um 5 fragmento deste. Porções em ALCA adequadas incluem o ID. DE SEQ. N°: 9, ID. DE SEQ. N°: 10 e ID. DE SEQ. N°: 11. Utilidade

As plantas de tabaco mutantes e transgênicas aqui fornecidas possuem usos particulares em indústrias 10 agrícolas. Uma planta desse tipo pode ser usada em um programa de cruzamento, como aqui descrito, para produzir uma linhagem, variedade ou híbrido de tabaco que compreende plantas que possuem um fenótipo não-conversor, em que a linhagem, variedade ou híbrido possui uma taxa reduzida de 15 reversão, quando comparada com uma linhagem, variedade ou híbrido de tabaco correspondente que seja do tipo selvagem para o gene de nicotina desmetilase ou que não possua uma construção de RNAi de nicotina desmetilase. Em alguns casos, as plantas de tabaco mutantes ou transgênicas aqui

2 0 fornecidas podem ser cruzadas com plantas que possuem outro

traço desejado para a produção de variedades de tabaco que possuam tanto uma taxa reduzida de reversão quanto outro traço desejado. Exemplos de outros traços desejados incluem tolerância à seca, resistência a doenças, teor de nicotina, 25 teor de açúcar, tamanho da folha, largura da folha, comprimento da folha, cor da folha, vermelhidão da folha, comprimento internodal, tempo de floração, resistência ao armazenamento, espessura do caule, rendimento da folha, resistência a doenças, alto rendimento, índice de alto

3 0 grau, curabililidade, qualidade da cura, capacidade de colheita mecânica, capacidade de manipulação, qualidade da folha, altura, amadurecimento, tamanho do caule e número de folhas por planta. Linhagens, variedades ou híbridos de tabaco podem ser cruzados de acordo com procedimentos 5 padronizados na técnica.

Em outros casos, com base no efeito de mutações de nicotina desmetilase reveladas sobre o fenótipo de plantas que possuem essas mutações, pode-se pesquisar e identificar plantas de tabaco que carregam em seus genomas alelos 10 mutantes de ocorrência natural em um lócus de nicotina desmetilase. Essas plantas podem ser usadas em um programa de cruzamento para a produção de uma linhagem, variedade ou híbrido de tabaco que compreende plantas que possuem uma mutação em um gene de nicotina desmetilase, por exemplo, 15 uma linhagem, variedade ou híbrido que possua uma taxa reduzida de reversão, quando comparada com uma linhagem,, variedade ou híbrido de tabaco correspondente que possui um gene de nicotina desmetilase do tipo selvagem.

Em certas modalidades, linhagens, variedades ou

2 0 híbridos de tabaco que compreendem plantas que possuem uma

mutação em um gene de nicotina desmetilase ou que compreendem uma construção de RNAi de nicotina desmetilase aqui fornecida são usadas para produzir material de tabaco para uso na fabricação da produtos de tabaco. Material de 25 tabaco adequado inclui a folha inteira, iguarias de tabaco, pó de tabaco, lâmina de tabaco, hastes de tabaco compactadas cortadas ou em rolo, tabaco com volume expandido e tabaco picado. O material de tabaco das plantas de tabaco mutante reveladas pode ser curado com o uso de

3 0 métodos conhecidos na técnica, tais como cura ao ar, cura com fogo, cura com secador de ar quente (por exemplo, cura a granel) e cura ao sol. Em algumas modalidades, o material de tabaco é condicionado e/ou fermentado. Veja, por exemplo, Publicação de Patente U.S. N0 20050178398.

Em outras modalidades, as linhagens, variedades ou

híbridos de tabaco que compreendem plantas que possuem uma mutação em um gene de nicotina desmetilase ou que compreendem uma construção de RNAi de nicotina desmetilase aqui fornecida são usadas para produzir um produto de 10 tabaco que possui um teor reduzido de nornicotina, quando comparado com um produto correspondente que compreende tabaco obtido de uma linhagem, variedade ou híbrido de tabaco correspondente que compreende plantas que contêm um gene de nicotina desmetilase do tipo selvagem. Os produtos 15 de tabaco que possuem uma quantidade reduzida de teor de nitrosamina podem ser fabricados com o uso de material de planta de tabaco aqui descrito. 0 produto de tabaco tipicamente possui uma quantidade reduzida de nornicotina de menos de cerca de 5 mg/g. Por exemplo, o teor de 20 nornicotina, ou o teor de NNN, em um produto desse tipo pode ser de 4,5 mg/g, 4,0 mg/g, 3,5 mg/g, 3,0 mg/g, 2,5 mg/g, 2,0 mg/g, 1,5 mg/g, 1,0 mg/g, 750 pg/g, 500 pg/g, 250 μς/g, 100 pg/g, 75 μς/g, 50 μς/g, 25 ug/g, 10 ug/g, 7,0 pg/g, 5,0 ug/g, 4,0 ug/g, 2,0 ug/g, 1,0 yg/g, 0,5 yg/g, 0,4 25 ug/g, 0,2 μς/g, 0,1 ug/g, 0,05 pg/g ou 0,01 yg/g. A percentagem de alcalóides secundários em relação ao teor total de alcalóide nele contido é de menos de 90%, por exemplo, menos de 70%, 50%, 30%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1,5%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25% ou 0,1%.

3 0 A frase "uma quantidade reduzida" com relação à nornicotina ou NNN refere-se a uma quantidade de nornicotina ou NNN ou de ambas em uma planta de tabaco ou ,componente da planta, ou em um produto de tabaco que é de menos do que a que seria encontrada em uma planta de tabaco 5 ou componente de planta ou produto de tabaco do tipo selvagem da mesma variedade de tabaco, processada da mesma forma, que não foi feita transgênica para nornicotina ou NNN reduzida ou que não possua uma mutação em um gene de nicotina desmetilase. Em um exemplo, uma planta de tabaco 10 do tipo selvagem da mesma variedade que foi processada da mesma forma é usada como um controle para medir se foi obtida uma redução de nornicotina ou NNN ou de ambas pelos métodos aqui descritos. Em outro exemplo, plantas que possuem uma quantidade reduzida de teor de nitrosamina são 15 avaliadas com o uso de métodos padronizados, por exemplo, por monitoramento da presença ou ausência de um gene ou produto gênico, por exemplo, uma nicotina desmetilase, um transgene ou uma mutação em particular em um gene. Ainda em outro exemplo, o teor de nitrosamina de plantas que

2 0 resultam de um programa de cruzamento é comparado como o

teor de nitrosamina de uma das linhagens parentes usadas para cruzar a planta que possui a quantidade reduzida de nitrosamina. Os niveis de nornicotina e NNN ou de ambos são medidos de acordo com métodos bem conhecidos na técnica do tabaco.

Em certas modalidades, o material de tabaco obtido das linhagens, variedades ou híbridos de tabaco aqui fornecidos é usado para a produção de produtos de tabaco que incluem, sem limitação, produtos de cigarro (por exemplo, cigarros e

3 0 cigarrilhas), produtos de charuto (por exemplo, tabaco para cigarros enrolados e cigarrilhas), produtos de tabaco de cachimbo, produtos de cigarro sem fumaça, produtos de tabaco sem fumaça, (por; exemplo, tabaco rapé úmido, rapé seco e de mascar), película, mastigáveis, placas, partes 5 moldadas, géis, unidades consumíveis, matrizes insolúveis, formatos ocos e semelhantes. Veja, por exemplo, a Publicação de Patente U.S. N0 US 2006/0191548.

A invenção será ainda descrita nos exemplos seguintes, os quais não limitam o escopo da invenção descrita nas reivindicações.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Produção de plantas mutantes de Nicotiana

Um grama de semente conversora de tabaco TN90 (Tennessee 90) (aproximadamente 10.000 sementes) foi lavado 15 em Tween® 0,1% por quinze minutos e depois embebido em 30 ml de ddH20 por duas horas. Cento e cinqüenta (150) μΐ (0,5%) de EMS (Catálogo Sigma N0 M-0880) foram então misturados na solução de semente/ddH20 e incubados por 8-12 horas (girando a 30 rpm) sob uma coifa em temperatura

2 0 ambiente (RT, aproximadamente 20°C) . O líquido foi então

removido das sementes e foi misturado em NaOH I M de um dia para o outro para descontaminação e eliminação. As sementes foram então lavadas duas vezes com 100 ml de ddH20 por 2-4 horas. As sementes lavadas foram então suspensas em solução de ágar 0,1%:água.

As sementes tratadas com EMS em solução de ágar foram espalhadas igualmente sobre "Carolina's Choice Tobacco Mix3" embebida em água (Carolina Soil Company, Kinston, NC) em bandejas em uma taxa de aproximadamente 2.000

3 0 sementes/bandeja. As bandejas foram então cobertas por uma embalagem Saran3 e colocadas em uma câmara de crescimento. Após as mudas surgirem do solo, a embalagem Saran3 foi perfurada para .permitir que a umidade declinasse gradualmente. A embalagem Saran3 foi removida completamente 5 após duas semanas. As bandejas foram movidas para uma estufa e fertilizadas com fertilizante NPK. As mudas foram plantadas em uma bandeja flutuante e crescidas até o tamanho para transplante. As plantas foram transplantadas em um campo. Durante o crescimento, as plantas foram 10 autopolinizadas para formar sementes Mi. No estágio maduro, cinco cápsulas foram colhidas de cada uma das cerca de 7.000 plantas, e foram atribuídas designações individuais ao conjunto de sementes de cada planta. Isso formou a população M1.

Exemplo 2 - Identificação de mutações

Um composto de sementes Mi de cada planta M0 do Exemplo 1 foi desenvolvido, folhas de 4 a 5 plantas M1 foram reunidas em pool e o DNA foi extraído das amostras de tecido em pool. Amostras em pool foram recolhidas de cada 20 linhagem M1. Kits "DNeasy plant mini" (QIAGEN, N0 de Catálogo 69104) foram usados para extração de DNA, de acordo com o manual do fabricante.

Iniciadores diretos marcados com IRDye™ 700 e iniciadores reversos marcados com IRDye™ 800 foram 25 designados para amplificar um gene de nicotina desmetilase (ID. DE SEQ. N°: 1) . Dois pares de iniciadores seqüência- específicos, que cobriam dois éxons separados, foram selecionados para amplificar o gene de nicotina desmetilase (ND) por PCR. Iniciadores F6 (5'-GGAATTATGCCCATCCTACAG) e

3 0 Rl (5' - CCAGCATTGCAGGGTTCGGGAAGA) cobriam o gene de ND de - 82 a +1.139 e geraram um fragmento de 1.220 nucleotídeos. Iniciadores F3 (Bf-CAGGTAAGGTCTAAAACGTGTGTTTGCTT) e R2 (5'- AATAAAGCTCAGGTGCCAGGCGAGGCGCTAT) cobriam o gene de ND de +1.720 a +2.549 e geraram um fragmento de 830 nucleotídeos.

Os iniciadores diretos foram preparados por mistura

(1:4) de iniciador marcado com IRDye™ 700:iniciador não marcado com uma concentração de 5 TM. Os iniciadores reversos foram preparados por mistura (3:2) de iniciador marcado com IRDye™ 800:iniciador não marcado com uma 10 concentração de 5 TM. Os iniciadores estocados foram preparados em uma proporção de 2:1 de Direto:Reverso (concentração total de iniciador 5 TM). A amplificação por PCR da região-alvo foi feita com o uso de 50-100 ng de DNA genômico das amostras de DNA de tecido de planta em pool 15 (em reação de 10 μΐ com 2 μΐ de iniciador) e DNA polimerase Platina Taq (Invitrogen, N0 de Catálogo 10966-034). As condições de PCR foram as seguintes: 1 ciclo de 940C por dois minutos, 40 ciclos de 94°C por um minuto, 67°C por um minuto, 72 0C por 1,5 minuto, 1 ciclo de 72°C por dez 20 minutos e manter a 40C. Após a amplificação, as amostras foram desnaturadas por aquecimento e re-aneladas (1 ciclo de 950C por dez minutos, 95°C a 85°C a -2°C/segundo, e 85°C a 25°C a 0,1°C/segundo) para gerar heteroduplexes entre amplicons mutantes e suas contrapartes do tipo selvagem.

Nuclease Surveyor3 (Transgenomic®, N0 de Catálogo

706025) foi usada de acordo com as recomendações do kit para a digestão de heteroduplexes. A condição de incubação de nuclease foi de 42 0C por vinte minutos e as reações foram interrompidas pela adição de Solução de Interrupção (kit Transgenomic®) . Os heteroduplexes foram desnaturados com corante de carga de seqüenciamento (formamida 98% deionizada, EDTA 10 mM (pH 8,0), azul bromofenol 0,025%) por aquecimento a 95°C por dois minutos. As amostras desnaturadas foram resfriadas em gelo e aplicadas ao 5 sistema de eletroforese de desnaturação de gel de poliacrilamida. A eletroforese foi realizada com um gel KBPlus 6,5%, executada em uma montagem de placa de 18 cm com espaçadores de 0,25 mm em um Analisador de DNA LI-COR® (LI-COR® Biosciences) com condições de execução de 1.500- 10 2.000 V, 30 mA, 50 W e 45°C por 3,5 horas.

Nas raias do gel de poliacrilamida que tinham uma mutação no pool, era visível uma banda abaixo da banda do tipo selvagem na imagem com corante de infravermelho IRDye™ 700. Uma banda da contraparte era visível na mesma 15 raia na imagem com corante de infravermelho IRDye™ 800. Essa banda era o produto da clivagem marcado com corante de infravermelho IRDye™ 800 da fita de DNA complementar. A soma do comprimento das duas bandas de contraparte era igual ao tamanho do amplicon. Após análise da imagem, os

2 0 pools de mutação (com as bandas deferidas) foram

identificados.

Foi realizada uma segunda rodada de avaliação nas plantas individuais de pools nos quais foi detectada uma mutação. 0 DNA da planta individual de linhagens positivas 25 foi extraído e combinado com amostras de DNA do tipo selvagem para a segunda rodada de avaliação. Isso ajudou a separar plantas do tipo selvagem de mutantes (incluindo mutantes homozigotos e heterozigotos) dentro do mesmo pool Mi. As amostras com bandas clivadas tinham uma seqüência de

3 0 gene de ND mutante, enquanto as amostras desprovidas de uma banda clivada tinham uma seqüência do gene de ND do tipo selvagem.

.,Uma terceira rodada, de avaliação foi usada para distinguir plantas heterozigotas de homozigotas usando 5 somente DNA de planta mutante como modelo. As amostras sem bandas clivadas eram homozigotas. As informações de traços de seqüências foram analisadas com o uso do seqüenciador CEQ 8000 (Beckman, Fullerton, Califórnia) para confirmar a mutação. Com o uso do DNA extraído como modelo, foi 10 efetuada amplificação por PCR para gerar fragmentos do gene de ND para seqüenciamento. Os produtos de PCR foram separados em um gel de agarose 1%, purificados e seqüenciados.

0 procedimento de seqüenciamento foi o seguinte: o DNA 15 foi desnaturado por aquecimento a 95 0C por 2 minutos, e subseqüentemente colocado em gelo. A reação de seqüenciamento foi preparada em gelo com o uso de 0,5 a 10 μΐ de modelo de DNA desnaturado, 2 μΐ de 1,6 pmol do iniciador direto, 8 μΐ de "DTCS Quick Start Master Mix" e o 20 volume total levado até 20 μΐ com água. 0 programa de termociclagem consistiu em 30 ciclos do seguinte ciclo: 96°C por 20 segundos, 50°C por 20 segundos e 60°C por 4 minutos, seguidos por manutenção a 4°C. A seqüência foi interrompida por adição de 5 μΐ de tampão de interrupção 25 (volume igual de NaOAc 3 M e EDTA 100 mM e 1 μΐ de 20 mg/ml de glicogênio) . A amostra foi precipitada com 60 μΐ de etanol 95% gelado e centrifugada a 6.000 g por 6 minutos. 0 etanol foi descartado. O pélete passou por 2 lavagens com 200 μΐ de etanol 70% gelado. Após o pélete estar seco, 40

3 0 μΐ de solução de SLS foram adicionados, e o pélete foi re- suspenso e coberto com uma camada de óleo mineral. A amostra foi então seqüenciada (Seqüenciador Automatizado CEQ 8 000) . As seqüências foram alinhadas com a seqüência do tipo selvagem. Além disso, o DNA genômico de nicotina 5 desmetilase para várias linhagens selecionadas foi seqüenciado para confirmar que somente uma mutação única para o gene de nicotina desmetilase estava presente em cada linhagem.

Após avaliação, foram identificados 700 pools M1 independentes, 19 linhagens mutadas. A mutação em cada linhagem é apresentada na Tabela 1.

Tabela 1

Mutações do gene de nicotina desmetilase no tabaco mutado

por EMS (TN90)

LINHAGEM POSIÇÃO DA TEOR DA OBSERVAÇÃO DE TABACO ALTERAÇÃO 1 ALTERAÇÃO TN90-4246 +1.985 nt de ATG G para A Gerada mutação +32 9 aa de M Parada não senso de 32 9 W329 aa TN90-1849 +320 nt de ATG C para T Mutação missense +107 aa de M P107L no domínio SRS-I TN90-1394 +412 nt de ATG G para A Mutação missense +138 aa de M V138I TN90-1761A +934 nt de ATG G para A Mutação missense +312 aa de ATG V312M imediatamente antes do íntron, em SRS-4 TN90-4281 +2191 nt de ATG G para A Mutação missense +398 aa de M S 398 N TN90-1516 +23 07 nt de ATG G para A Mutação missense +4 37 aa de M D4 37N ΤΝ90-1514 + 2 . 307, nt de ATG G para A Mutação missense +43 7? aa de M D437N TN90-3320 +4 3 7 nt de ATG G para A Mutação missense +14 6 aa de M S146N ΤΝ90-3341 +7 04 nt de ATG C para T Mutação missense +235 aa de M P235L TN90-3387 +668 nt de ATG G para A Mutação missense +23 0 aa de M D230N ΤΝ90-1804 +244 nt de ATG C para T Mutação missense +82 aa de M L82F TN90-1777 +114 nt de ATG C para T Mutação sem alteração de P38P silenciosa aa TN90-1803 +342 nt de ATG C para T Mutação sem alteração de Y114Y silenciosa aa ΤΝ90-4264 +486 nt de ATG C para T Mutação +163 aa de M S162S silenciosa ΤΝ90-1921 +2024 nt de ATG G para A Mutação +343 aa de M K34 3K silenciosa ΤΝ90-3147 +429 nt de ATG C para T Mutação sem alteração de L142L silenciosa aa ΤΝ90-4278 +2.021 nt de ATG G para A Mutação +342 sem T342T silenciosa alteração de aa ΤΝ90-4215 +22 91 nt de ATG G para A Mutação +431 sem E431E silenciosa alteração de aa TN90-1431 +2.397 nt de ATG G para A Mutação missense +4 67 aa de M E467K 1 nt = número de nucleotídeo e aa = número do resíduo de aminoácido nos IDS. DE SEQ. Nos: 1 e 2.

Essas linhagens mutadas incluíam uma linhagem com uma proteína truncada (TN90-424 6) , onze linhagens com mudanças 5 de aminoácidos únicas (TN90-1849, TN90-1394, TN90-1761, TN90-4281, TN 90-1516, TN90-1514, TN90-3320, TN90-3341, TN90-3387, TN90-1804 e TN90-1431) e sete linhagens com mutações silenciosas (TN90-1777, TN90-1803, TN90-4264, TN90-1921, TN90-3147, TN90-4278 e TN90-4215) . Essas 10 linhagens foram transplantadas em um campo para caracterização posterior. Sementes Mi adicionais das mesmas linhagens apresentadas na Tabela 1 foram semeadas e desenvolvidas na estufa para avaliar mais plantas homozigotas e para análise do teor de alcalóide.

Exemplo 3 - Medida da desmetilação de nicotina Materiais de plantas e tratamento de indução

As linhagens Mi mutantes selecionadas do Exemplo 2 desenvolvidas no campo foram testadas quanto à sua habilidade para converter nicotina em nornicotina. Uma 20 folha da posição média de cada planta M1 no estágio da altura do joelho ou posterior foi pulverizada com uma solução de etileno 0,3% (Preparação da marca Ethephon (Rhone-Poulenc)) para induzir a formação de nornicotina. Cada folha pulverizada foi pendurada em uma estante de cura 25 coberta com plástico equipada com um umidificador. As amostras de folhas foram pulverizadas periodicamente com a solução de etileno por todo o período de tratamento. Aproximadamente três dias após o tratamento com etileno, as folhas foram coletadas e secas em um forno a 500C por análise por cromatografia a gás (GC) de alcalóides.

Análise por cromatografia a gás de alcalóides A análise de alcalóide por GC foi realizada da

seguinte forma: as amostras (0,1 g) foram agitadas a 150 rpm com 0,5 ml de NaOH 2 N e uma solução de extração de 5 ml que continha quinolina como padrão interno e éter metil t-butílico. As amostras foram analisadas em um aparelho de 10 GC HP 6890 (Hewlett Packard, Wilmington, DE, EUA) equipado com um detector FID. Foi usada uma temperatura de 250 0C para o detector e injetor. Foi usada uma coluna de GC (30 m-0,32 nm-1 m) que consiste em sílica fundida entrecruzada com fenol 5% e metil silício 95% em um gradiente de 15 temperatura de 110-185°C a IO0C por minuto. A coluna foi operada em uma taxa de fluxo a IOO0C de 1,7 cm3/min, com uma proporção de divisão de 40:1, com um volume de injeção 2 μΐ, usando hélio como o gás transportador. 0 percentual de desmetilação de nicotina foi calculado como a quantidade

2 0 de nicotina dividida pela soma das quantidades de nicotina e nornicotina, multiplicada por 100.

A Tabela 2 mostra o percentual de plantas que possuem um fenótipo não-conversor e o percentual médio de desmetilação de nicotina para oito linhagens mutantes, em 25 relação ao estado de mutação genética das plantas individuais daquela linhagem, incluindo mutante homozigoto, mutante heterozigoto e do tipo selvagem homozigoto. Quatro das linhagens mutantes tinham um percentual de desmetilação de nicotina de menos de 5% na geração M1 e foram 30 classificadas como exibindo um fenótipo não-conversor, linhagens mutantes 4.246, 1.849, 4.215 e 4.278. As outras quatro linhagens mutantes tinham um percentual de desmetilação de nicotina de 5% ou mais na geração Mi e foram classificadas como tendo um fenótipo conversor, linhagens mutantes 1.394, 3.320, 4.264 e 1.924. Tabela 2 Níveis de desmetilação de nicotina em linhagens mutantes de nicotina desmetilase

Linhagem Estado Número de % médio de desmetilação % de fenótipo % de fenótipo não EMS plantas de nicotina conversor conversor (TN90) 4.246 Homozigoto 11 0, 85 0 , C 100 Heterozigoto 36 51,47 94,45 5,6 do tipo 34 68, 85 100 0 selvagem Total 81 1.849 Homozigoto 2 0, 65 0 100 Heterozigoto 21 62,28 95, 2 4,8 do tipo 2 71,2 100 0 selvagem Total 25 4.215 Homozigoto 4 0, 025 0 100 Heterozigoto 12 43,32 100 0 do tipo 5 79, 66 100 0 selvagem Total 21 4 .278 Homozigoto 6 1, 05 O 100 Heterozigoto 12 34,3 83, 3 16, 7 do tipo 2 82, 1 100 0 selvagem Total 20 1.394 Homozigoto 1 96, 8 100 0 Heterozigoto 2 88,6 100 0 do tipo 3 65, 77 100 0 selvagem Desconhecido 7 66, 59 85,7 14,3 Total 13 3.320 Homozigoto 4 62, 54 100 0 Heterozigoto 9 48, 55 100 0 do tipo 6 62, 03 100 0 selvagem Total 19 Homozigoto 2 83, 6 100 0 Heterozigoto 3 59,27 100 0 4 .264 do tipo 4 31,48 100 0 selvagem Total 9 I. 921 Homozigoto 1 5,7 100 0 Heterozigoto 10 38,9 100 0 do tipo O selvagem Total 11 As Figuras IA-ID mostram a freqüência de fenótipos conversores e não-conversores entre plantas M1 mutantes heterozigotas, mutantes - homozigota e homozigotas do tipo selvagem para as linhagens mutantes 4.246, 1.849, 4.215 e 5 4.278. As Figuras IE e IF mostram resultados representativos para linhagens mutantes nas quais não há diferenças na desmetilação de nicotina entre plantas Mi. Exemplo 4 - Análise da expressão de RNA em linhagens mutantes de nicotina desmetilase 10 O RNA de duas linhagens foi analisado com o uso de RT-

PCR semi-quantitativa para medir sua expressão de mRNA. Cerca de 20 plantas Mi individuais de cada linhagem foram tratadas com etileno, como descrito no Exemplo 3, e o RNA total foi extraído 3 dias pós-tratamento. O RNA total foi 15 isolado com o uso do kit "RNeasy Plant Mini Kit®" (Qiagen, Inc., Valencia, Califórnia) de acordo com o protocolo do fabricante. A amostra de tecido foi triturada sob nitrogênio líquido até um pó fino usando um pilão e almofariz tratado com DEPC. Aproximadamente 100 mg de

2 0 tecido moído foram transferidos para um tubo Eppendorf® estéril de 1,5 ml, e o tubo foi colocado em nitrogênio líquido até que todas as amostras fossem coletadas. A seguir, 450 μΐ de Tampão RLT, como fornecido no kit (com a adição de β-Mercaptoetanol) , foram adicionados a cada tubo 25 individual. As amostras foram turbilhonadas vigorosamente e incubadas a 56°C por três minutos. 0 lisado foi então aplicado à coluna giratória QIAshredder™ depositando em um tubo de coleta de 2 ml, e centrifugado por dois minutos na velocidade máxima.

0 fluxo foi coletado, e 0,5 volume de etanol foi adicionado ao lisado depurado. A amostra foi bem misturada e transferida para uma coluna giratória mini Rneasy® colocada em um tubo de coleta de 2 ml. A amostra foi centrifugada por um minuto a 10.000 rpm. A seguir, 700 μΐ 5 de tampão RWl foram pipetados sobre a coluna Rneasy® e centrifugados por um minuto a 10.000 rpm. O Tampão RPE foi pipetado sobre a coluna Rneasy® em um novo tubo de coleta, e centrifugado por um minuto a 10.000 rpm. Tampão RPE foi novamente adicionado à coluna giratória Rneasy®, e 10 centrifugado por dois minutos na velocidade máxima para secar a membrana.

Para eliminar qualquer etanol transportado, a membrana foi colocada em um tubo de coleta separado e centrifugada por mais um minuto na velocidade máxima. A coluna Rneasy® 15 foi transferida para um novo tubo de coleta de 1,5 ml, e 40 μΐ de água sem Rnase foram pipetados diretamente sobre a membrana Rneasy®. Esse tubo de eluto final foi centrifugado por um minuto a 10.000 rpm. A qualidade e a quantidade de RNA total foram analisadas por gel de

2 0 formaldeído desnaturado e espectrofotômetro.

O cDNA da primeira fita foi produzido com o uso de transcriptase reversa SuperScript3 de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia). Cerca de 100 ng de RNA total foram usados para a geração de cDNA de primeira fita.

A RT-PCR foi realizada com 100 pmoles cada de iniciadores diretos e reversos. As condições de reação foram 940C por dois minutos e depois 40 ciclos de PCR a 94 0C por um minuto, 67 0C por um minuto, 72 0C por três

3 0 minutos, seguidos por uma extensão única a 720C por dez minutos. Cinqüenta microlitros da amostra amplificada foram analisados por eletroforese usando um gel de agarose 1%.

Os géis de agarose foram corados com o uso de brometo de etídio, e a quantidade de RNA de ND presente foi 5 classificada como baixa ou alta com base na intensidade da banda. As amostras selecionadas foram fatiadas e purificadas do gel de agarose. 0 DNA purificado foi seqüenciado por CEQ 8000, como descrito abaixo.

Exemplo 5 - Análise de seqüência de nicotina desmetilase A seqüência de aminoácidos definida no ID. DE SEQ. N°:

2 foi submetida à análise com o uso do programa TFSEARCH (cbrc.jp/htbin/nph-tfsearch) e do programa "Web Signal Scan" (dna.affrc.go.jp/sigscan) para identificar elementos da região reguladora (por exemplo, caixas TATA e CAAT), 15 elementos órgão-especificos e elementos WRKY. Como mostrado na Figura 2, a análise indicou que o ID. DE SEQ. N°: 2 contém seis sítios de reconhecimento de substrato (SRS) nos aminoácidos 108-129, 212-220, 249-256, 312-326, 380-390, e

4 91-4 97, um domínio transmembrana hidrofóbico do terminal N 20 nos aminoácidos 9-20, uma região rica em prolina nos aminoácidos 34-38, uma bolsa de ligação de oxigênio que contém treonina nos aminoácidos 346-351, um consenso de hélice K nos aminoácidos 353-356, um consenso PERF nos aminoácidos 430-433 e uma região de ligação de heme que 25 contém cisteína nos aminoácidos 450-459.

Exemplo 6 - Estabilidade da conversão de nicotina em linhagens mutantes de nicotina desmetilase

Foram feitos experimentos de campo de larga escala com linhagens mutantes M2 selecionadas, 4.24 6-8 e 1.859-8B, usando uma variedade comercial Certificada classificada como baixa conversora (LC) (TN90-LC) e sua contraparte alta conversora (TN90-C) como controles. A variedade classificada LC Certificada- é disponível comercialmente por "F.W. Rickard Seeds" (Winchester, Kentucky). A semente 5 classificada como LC Certificada é coletada de plantas desenvolvidas a partir da semente classificada LC Foundation. A semente de classificada LC Foundation é coletada de uma população de plantas de tabaco da qual as plantas com um nível de conversão de nicotina acima de 3% 10 foram removidas, e da qual quaisquer flores ou cápsulas que forma produzidas antes da remoção das plantas que possuem um nível de conversão de nicotina acima de 3% foram removidas.

Duas linhagens mutantes M2, 4246-8 e 1859-8B, foram produzidas por meio de autopolinização de plantas mutantes homozigotas Mi. Essas linhagens foram desenvolvidas em 3 experimentos de campo com uma população total de cerca de 200 plantas por linhagem. As plantas crescidas no campo foram testadas quanto à sua habilidade para converter nicotina em nornicotina. Uma folha da posição média de cada planta M2 foi tratada com etileno, como descrito no Exemplo 3. Aproximadamente três dias após o tratamento com etileno, as folhas foram coletadas e secas em um forno a 500C por análise de alcalóides por cromatografia a gás (GC), como descrito no Exemplo 3.

A Tabela 3 mostra a estabilidade da conversão de nicotina em linhagens M2 mutantes em comparação com a linhagem comercial LC e controle conversor. A linhagem mutante 4246-8 teve percentagem média de conversão de nicotina de 1,9%, e não teve plantas que foram classificadas como altas conversoras. A linhagem mutante 1849-8B teve uma percentagem média de conversão de 2,1%, e teve 3 plantas do tofeal de 214 que foram classificadas como altas conversoras. As linhagens LC e conversoras tiveram 5 conversão média de 6,6% e 80,6%, respectivamente, e tiveram 24% e 100% das plantas, respectivamente, classificadas como altas conversoras.

A geração M3 teve uma freqüência de conversão baixa similar, demonstrando a estabilidade do fenótipo baixo conversor nas linhagens mutantes.

Tabela 3

Níveis de desmetilação de nicotina em linhagens M2 mutantes de nicotina desmetilase, classificadas como conversoras baixas e controles de conversor

Linhagem Número Número de Conversores Taxa de de conversores (% da conversão plantas população) média (%) 4246-8 184 0 0 1,9 1849-8B 212 3 1,4 2,1 TN90-LC 218 53 24, 3 6,6 TN 9 0-C 95 95 100 80,6 Exemplo 7 - Detecção de formação de nitrosamina tabaco - específica em linhagens mutantes de nicotina desmetilase

Foram feitos experimentos de campo de larga escala com linhagens mutantes M2 selecionadas, 4246-8 e 1859-8B, com o uso da variedade comercial Certificada classificada como

2 0 baixa conversora (LC) (TN90-LC) e sua contraparte alta conversora (TN90-C) como controles, como descrito no Exemplo 6.

As plantas desenvolvidas no campo do Exemplo 6 foram desenvolvidas até a maturidade, e foram colhidas e curadas ao ar com o uso de práticas padronizadas de produção de tabaco. A química do tabaco foi analisada por análise de cromatograf ia a gás-TAE. A Tabela 4 revela o teor de 5 nitrosamina tabaco-específica (TSNA) de linhagens mutantes, em comparação com controles LC e conversores. 0 teor de N- nitrosonornicotina (NNN), que é derivada diretamente de nornicotina, e o teor total de TSNA em linhagens mutantes foram menores do que aqueles em linhagens TN90-LC e TN90- 10 conversoras.

Tabela 4

Níveis de N-nitrosonornicotina (NNN) e de nitrosamina tabaco-específica (TSNA) total em linhagens mutantes de tabaco Burley seco ao ar

Linhagem NNN (ppm) TSNA Total (ppm) 4246-8 0,7 0,9 1849-8B 0,8 0,9 TN 90 Vetor 1,6 1,9 vazio TN 9O-LC 1,6 1,6 TN 90-C (alto 5,5 5,6 conversor) Exemplo 8 - Interferência de RNA de nicotina desmetilase

Construções de interferência de RNA (RNAi) Ti de nicotina desmetilase foram construídas com o uso de fragmentos de uma seqüência de ácidos nucléicos de nicotina desmetilase (ID. DE SEQ. N°: 1) de tal forma que cada

2 0 construção de RNAi de nicotina desmetilase continha um promotor do vírus do mosaico das nervuras da mandioca (CsVMV) ligado operacionalmente a um fragmento de ácido nucléico de nicotina desmetilase (ID. DE SEQ. N°: 5, ID. DE SEQ. N0 : 6, ID. DE SEQ. N°: 7 OU ID. DE SEQ. N°: 8) em orientação anti-senso em relação ao promotor, seguido por 5 uma seqüência de alça, o complemento do respectivo fragmento e um terminador Nos, como indicado na Figura 3. Cada construção de RNAi de nicotina desmetilase continha um gene de neomicina fosfotransferase II ligado operacionalmente a um promotor de Actina 2 de Arabidopsis 10 t haliana e um terminador Nos. Veja a Figura 3. As seqüências presentes nas construções de RNAi de nicotina desmetilase são mostradas na Tabela 5.

Tabela 5

Seqüências de ácidos nucléicos usadas para construir construções de RNAi de nicotina desmetilase

Construção de Seqüência Seqüência da alça RNAi de da haste nicotina desmetilase pGen-RNAiI-IN ID. DE íntron NDM (ID. DE SEQ. N°: 9) SEQ. N°: 5 pGen-RNAil- ID. DE Fragmento gus em orientação gus SEQ. N°: 5 anti-senso (ID. DE SEQ. N°: 10) pGEN-RNAi 2 -AT ID. DE íntron 2 de Actina II de SEQ. N°: 6 Arabidopsis thaliana (ID. DE SEQ. N°: 11) pGEN-RNAi3-IN ID. DE íntron NDM (ID. DE SEQ. N°: 9) SEQ. N°: 7 pGEN-RNAi4-AT ID. DE íntron 2 de Actina II de SEQ. N°: 8 Arabidopsis thaliana (ID. DE ___SEQ. N°: 11)_

Cada construção de RNAi de nicotina desmetilase foi introduzida em tabaco escuro Madole Narrow Leaf e tabaco Burley TN 90 como uso de transf ormação-padrão de Agrobacterium. Resumidamente, tecido de folha de plantas desenvolvidas de forma asséptica de 4 semanas de idade foi cortado em pedaços e incubado em meio líquido contendo A. tumefaciens (cepa LB44 04) com as construções desejadas. Deixou-se que o tecido crescesse em meio basal sem antibióticos por dois dias para aumentar a infecção do tecido. No terceiro dia, o tecido foi plaqueado em meio contendo canamicina (3 00 mg/l), para seleção de transformantes, e cetofexina (500 mg/l) para matar o A. tumefaciens restante. 0 meio de cultura foi substituído a cada semana, até que se desenvolvesse tecido de calo. Os brotos derivados do tecido do calo foram transferidos para meio de formação de raiz para formação da raiz, e, subseqüentemente, as plântulas com raiz foram transplantadas em potes de 10,16 centímetros contendo mistura de solo comercial. As plantas cresceram até a maturidade em uma estufa e foram autopolinizadas.

Como aqui usado, o termo "R0" refere-se às células de planta (e às plantas desenvolvidas a partir delas) transformadas com um ácido nucléico exógeno, enquanto ''Ri" refere-se às sementes produzidas por plantas R0 25 autopolinizadas, e às plantas desenvolvidas a partir dessas sementes. "R2" é a prole (sementes e plantas) de plantas Ri autopolinizadas, "R3" é a prole de plantas R2 autopolinizadas e "R4" é a prole de plantas R3 autopolinizadas. "R5" é a prole de plantas R4 autopolinizadas. "R6", "R7" etc. são, cada um, a prole de de plantas autopolinizadas da geração prévia.

Avaliação e regeneração de linhagens transgênicas

Sementes Ri derivadas de autopolinização dos transformantes primários foram germinadas e desenvolvidas em meio contendo 300 mg/l de canamicina. O número de mudas resistentes e sensíveis à canamicina foi determinado 2-3 semanas após a germinação, quando as mudas sensíveis eram cloróticas e incapazes de produzir folhas verdadeiras. Esses dados foram usados para identificar o padrão de segregação. As plantas resistentes à canamicina foram desenvolvidas até a maturidade em uma estufa, e autopolinizadas. A semente foi coletada de cada planta e semeada em meio contendo canamicina para determinar quais plantas Ri eram homozigotas para o transgene.

As sementes de cada linhagem de RNAi transgênico foram plantadas no campo, e a conversão de nicotina em nornicotina foi medida e comparada com três controles para cada variedade de tabaco: 1. plantas de tabaco contendo um vetor vazio (ou seja, um vetor desprovido de um fragmento de ácido nucléico de nicotina desmetilase, uma seqüência de alça e uma seqüência complementar ao fragmento de nicotina desmetilase); 2. as plantas de uma linhagem LC disponível comercialmente (ou seja, semente LC Certificada Madole Narrow Leaf (F.W. Rickard Seeds, Winchester, Kentucky) para as plantas transgênicas Madole Narrow Leaf e semente LC Certificada TN 90 para as plantas transgênicas TN 90); e 3. plantas de uma linhagem alta conversora (ou seja, 181 CK para as plantas transgênicas Madole Narrow Leaf e TN 90-C 3 0 para as plantas transgênicas TN 90) . Uma planta de tabaco escuro era identificada como um conversor caso sua taxa de conversão fosse de 3% ou mais. Uma planta de tabaco Burley era identificada como conversor caso sua taxa de conversão fosse de 5% ou mais. Os resultados são mostrados nas Tabelas 6 e 7.

Tabela 6

Conversão de nicotina em nornicotina em tabaco escuro Madole Narrow Leaf transgênico

Linhagem de Vetor Percentual Percentual de tabaco médio de conversores conversão na população NLM-IN5-44 pGen-RNAil-IN 0,1 0 NLM-IN5-52 pGEN-RNAil-IN 0,2 --- NLM-2IN-22 pGen-RNAi 3 -IN 0,2 --- NLM-2IN-38 pGEN-RNAi 3 -IN 0,3 0 NLM-2AT-33 pGen-RNAi2-AT 0,4 0 NLM-2AT-32 pGEN-RNAi2-AT 0,4 0 NLM-3AT-11 pGEN-RNAi4-AT 0,5 --- NLM-G2-2 pGEN-RNAi1-gus 0,5 --- NLM-vetor Vetor vazio 1,7 --- NL Madole LC --- 1,5 5 181 CK 95, 1 100 Tabela 7

Conversão de nicotina em nornicotina em tabaco Burley transgênico TN 90

Linhagem de Vetor Percentual Percentual de tabaco médio de conversores conversão na população TN90-IN5-14 pGen-RNAil-IN 0,6 0 TN90-IN5-22 pGEN-RNAil-IN 1,1 TN90-2IN-12 pGen-RNAi 3 -IN 1,2 TN90-2AT-4 pGEN-RNAi 2-AT 2,7 TN90-2AT-5 pGen;- RNA'i2 - AT 2,8 TN90-G2-7 pGEN-RNAi1-gus 4,6 TN90-vetor Vetor vazio 4,2 TN90 LC 6,5 24 TN 90 C 63, 7 100 A expressão de RNA de nicotina desmetilase foi medida em relação à expressão de RNA de nicotina desmetilase em TN 90-LC com o uso de RT-PCR quantitativa. Os resultados são mostrados na Tabela 8.

Tabela 8

Expressão relativa de mRNA de NDM

Linhagem de tabaco Expressão de mRNA de NDM em relação à TN 90-LC Madole Narrow Leaf IN5 0,1 Madole Narrow Leaf 2IN 0,1 Madole Narrow Leaf 2IN-I não detectável TN 90 2AT 0,1 TN 90 G2 não detectável TN 90-LC 1,0 TN 90-C (alta conversora) 3,1 181 CK (alta conversora) 6,6 Exemplo 9 - Detecção de formação de nitrosamina tabaco- específ ica em linhagens de RNAi de nicotina desmetilase

Foram feitos experimentos de campo de larga escala com linhagens selecionadas de RNAi de NDM: NLM-IN5-44, NLM-IN5- 52, NLM-2IN-22, NLM-2IN-38, NLM-2AT-33, NLM-2AT-32, NLM- 3AT-11, TN90-IN5-14, TN90-IN5-22, TN90-2IN-12, TN90-2AT-4, TN90-2AT-5 e TN90-G2-7 com o uso das respectivas variedades transformadas por vetor vazio, das respectivas variedades comerciais Certificadas classificadas como baixas conversoras (LC) (ou seja, Madole Narrow Leaf LC e TN 90- LC) e das respectivas contrapartes altas conversoras (ou 5 seja, 181 e TN90-C) como controles. As sementes LC foram produzidas como descrito no Exemplo 7. Seis linhagens de RNAi TN 90 e oito linhagens de RNAi Madole Narrow Leaf que foram produzidas por meio de autopolinização de plantas transgênicas Ri homozigotas foram usadas para medir os 10 níveis de nitrosamina tabaco-específica (TSNA).

Cerca de 200 plantas por linhagem foram desenvolvidas até a maturidade em 3 experimentos de campo. As plantas foram colhidas e curadas como indicado nas Tabelas 9-11 com o uso de técnicas padronizadas. A química do tabaco foi 15 analisada por análise por cromatografia a gás-TAE. As Tabelas 9-11 mostram os níveis de N-nitrosonornicotina e nitrosaminas tabaco-específicas (TSNAs) totais de linhagens de RNAi em comparação com vetor vazio, LC e controles conversores. Os dados indicam que os níveis de N- 20 nitrosonornicotina (NNN) e os níveis de TSNA total em linhagens de RNAi NDM foram menores do que em linhagens de controle.

Tabela 9

Níveis de NNN e TSNA total em linhagens de RNAi de tabaco escuro curado com fogo

Linhagem Vetor NNN (ppm) TSNA total (ppm) NLM-IN5-44 pGen-RNAiI-IN 0, 196 1, 003 NLM-XN5-52 pGEN-RNAiI-IN 0,19 1, 069 NLM-2IN-22 pGen-RNAi 3 -IN 0,337 1, 22 NLM-2IN-38 pGEN-RNAi3- IN 0,338 1, 414 NLItf - 2 AT - 3 3 pGen-RNAi2-AT 0, 288 1, 113 NLM-'2AT-32 pGEN:-,RNAi2 - AT ~ 0, 254 1, 321 NLM-3AT-11 t ?■' As-f'·· v w.’■ ·'·.■■ * ’ ··* 0, 323 1, 428 pGEN.-RNAi4 -AT NLM-G2-2 pGEN-RNAi1-gus 0, 318 1,456 NLM-vetor Vetor vazio 0, 791 1,606 NL Madole LC --- 0, 952 2 , 041 181 CK 18,696 20,488 Tabela 10

Níveis de NNN e TSNA total em linhagens de RNAi de tabaco escuro curado ao ar

Linhagem Vetor NNN (ppm) TSNA total (ppm) NLM-IN5-44 pGen-RNAil-IN 0, 093 0, 254 NLM-IN5-52 pGEN-RNAiI-IN 0, 186 0, 567 NLM-2IN-22 pGen-RNAi3-IN 0, 195 0, 595 NLM-2IN-38 pGEN-RNAi3-IN 0, 166 0, 394 NLM-2AT-33 pGen-RNAi2-AT 0, 205 0, 762 NLM-2AT-32 pGEN-RNAi 2 -AT 0, 112 0, 439 NLM-3AT-11 pGEN-RNAi 4 -AT 0, 142 0, 373 NLM-G2-2 pGEN-RNAi1-gus 0, 165 0, 681 NLM-vetor Vetor vazio 3, 673 5, 597 NL Madole LC --- 0, 617 1, 167 181 CK 8, 756 10,909 Tabela 11

Níveis de NNN e de TSNA total em linhagens de RNAi de tabaco Burley curado ao ar

TSNA total Linhagem Vetor NNN (ppm) (ppm) TN90-IN5-14 pGen-RNAil-IN 0,239 0, 365 TN90-IN5-22 pGEN-RNAi1-IN 0, 573 1, 689 TN90-2IN-12 pGen-RNAi3-IN 0, 708 0,785 TN90-2AT-4 pGEN-RNAi2-AT 0,335 0,472 TN90-2AT-5 pGen-RNAi2-AT 0, 435 0, 763 TN90-G2-7 pGEN-RNAi1-gus 0, 892 1, 091 TN90-vetor Vetor vazio 1, 635 1,869 TN90 LC --- 1, 552 1,606 TN90 C 5, 523 5, 572 Exemplo 10 - Características fenotípicas em linhagens de nicotina desmetilase mutante e de RNAi

Foram feitos experimentos de campo de larga escala com linhagens de nicotina desmetilase mutante e RNAi 5 desenvolvidas até a maturidade, como descrito nos Exemplos 7 e 9. A altura da planta, comprimento da folha, largura da folha e rendimento foram medidos. Os resultados são mostrados nas Tabelas 12-14. Tabela 12. Características fenotípicas de linhagens de RNAi de tabaco escuro

Linhagem Vetor Altura da Altura da Comprimento Largura da Rendimento Rendimento planta - planta-not da IO1 IO1 folha (T/Km2) (T/Km2) topped topped (cm) folha (cm) (cm) curado com curado ao (cm) fogo ar NLM-IN5- pGen- 108 130 79 40 401,29 392,89 44 RNAil-IN NLM-IN5- pGEN- 110 129 80 39 384,83 374,08 52 RNAil-IN NLM-2IN- pGen- 106 115 77 37 389,31 391,44 22 RNAi3 -IN NLM-2IN- pGEN- 109 128 79 38 372,96 369,71 38 RNAi3-IN NLM-2AT- pGen- 112 130 78 39 407,01 389,76 33 RNAi2-AT NLM-2AT- pGEN- 110 130 79 39 345,96 382,59 32 RNAi2-AT NLM-3AT- pGEN- 106 128 77 33 383,71 378,67 11 RNAi4-AT NLM-G2-2 pGEN- 109 130 80 39 386,40 364,67 RNAil-gus NLM- Vetor 108 129 76 35 385,84 401,74 vetor vazio NL 111 132 80 39 399,50 389,08 Madole LC 181 CK 114 132 77 44 404,99 362,09 Tabela 13.

Características fenotípicas de linhagens de RNAi de tabaco Burley

Linhagem Vetor Altura da Altura da Comprimento Largura da Rendimento planta- planta-nofc da 10a folha 10* folha (T/Km2) topped (cm) topped (cm) (cm) (cm) TN90-IN5-14 pGen-RNAil-IN 139 179 68 36 371,39 TN90-IN5-22 pGEN-RNAiI-IN 138 178 68 40 358,40 TN90-2IN-12 pGen-RNAi3-IN 139 177 69 39 350,00 TN90-2AT-4 pGEN-RNAi2-AT 140 179 70 40 359,18 TN90-2AT-5 pGen-RNAi2-AT 141 180 70 42 362,54 TN90-G2-7 pGEN-RNAil- 132 174 70 40 345,85 gus TN90-vetor Vetor vazio 139 179 70 T. 366,12 39 TN90 LC 138 179 70 39 376,43 TN90 C 141 182 69 40 355,60 Tabela 14.

Características fenotípicas de linhagens mutantes de tabaco Burley

Linhagem Altura da Altura da Comprimento Comprimento Rendimento planta-topped planta-not da 10a folha da 10a folha (T/Km2) (cm) topped (cm) (cm) (cm) 4246-8 118 146 62 32 325,24 1849-8B 112 138 60 34 329,72 TN90 LC 138 179 70 39 376,43 TN90 C 141 182 69 40 355,60 OUTRAS MODALIDADES

Deve-se entender que, embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com sua descrição detalhada, a descrição precedente visa ilustrar, e não limitar, o escopo 5 da invenção, que é definida pelo escopo das reivindicações em anexo. Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do escopo das reivindicações seguintes. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA <110> U.S. Smokeless Tobacco Company

<120> PLANTAS DE TABACO QUE POSSUEM ATIVIDADE REDUZIDA DE NICOTINA DESMETILASE

<130> 2 0210-07 5W01

<150> US 11/611,782 <151> 2006-12-15

<160> 11

<170> FastSEQ para Windows Versão 4.0

<210> 1 <211> 2552 <212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 1

atgctttctc

cttcttcttc

ctatggacaa

ccccggagga

tggccggtaa

tccattagct

cgaaaactcg

gctaggcctt

ccccttgtct

tacaaatgac

gccatttttt

caataatgcc

atgctatttt

agttattcag

gaagttctct

aagaattcaa

gcgagcatta

aaatttaact

gattggttag

aaaaaattat

gaatccggta

ggattttatg

attttatcaa

taaatgggtg

gattttcaag

ttctgttttt

cagaattggt

tgcagaaggg

aatgaacaag

tcttggtgaa

ccatagaagc

60

aaaaatctca

120

tcggccatct

180

gagacttagc

240

tagttgtaag

300

ccaatcgtcc

360

tggccaatta

420

ccgctagtcg

480

agaatttata

540

aagaattgaa

600

aaggagatga

660

tggagtttgt

720

ggcatgttaa

780

tagaggaaca

840

atttcattga

900

cattgtagga

aaaaccttca

tttccacttc

tgacaaatac

cagttacgaa

agcttttctt

cggaccttac

tctcgaaaaa

tactcgaatt

ttttggtctg

acaagtggag

gttatgggat

ggctatgaaa

tattaataaa

tgtggtgctt

ctagtaacct

aaacccttac

aatgacgacg

ggccccgttt

gctgtaaaag

tacggcgatt

tggcgaaaaa

ttcaaacacg

gatggaaatt

atcgtgaaga

agatttaaga

gcatttccaa

aggactttta

agagaaaaaa

tcaaaaatga

tcacatttct

caccgaaaat

gcgacgaccg

tcacttttcg

actgtttctc

accttggcta

atcgaaaatt

tgagatttgc

cgagtacgat

tgatcgctgg

aagcgtttaa

ttccattatt

aagatataga

tggaggttaa

gtaatgaata ggttactctc

tgtcattttt

catttattca

gcaactgtaa

agttatctat

tattagatta

tgttgtctgc

caatgctgga

tgctggatgc

actaaggatg

atttaataaa

gggctatatg

gattcgcccg

actccagaac

tttatctcga

atctttgatg

gtaaaaagat

aataaaactt

ctttactccc

ttttttaggg

ggaaattcct

tttaataatg

atgaaaatca

caagttatat

tggaactata

acattttttt

tggataaata

ctaaaacgtg

tgtttgcttt

atttgaaata

aatgaattat

atgtgtgcat

acttgacaat

tcctttttta

attattcttt

cttcacataa

attggggaat

caagaagaga

tagacacaaa

gatttggtat

acctccaagc

ttgttagtac

cacacgaaaa

gggacaagat

tattcgcaaa

cctgatactt

tcgatccaga

tataagtata

tcccgtttgg

caagtggaac

acttaacaat

gacgagccct

tggatatgaa

gaactgataa

tagcgcctcg

2552

gtgatactgt

960

cttttatttt 102 0 , gtgtacaggt 1080

atcatacccc

1140

tttatgtatc

1200

aatatagaat

1260

ggctttggga

1320

gagctctgaa

1380

gagatataac

1440

attcagcata

1500

taattgcttg

1560

atatagtcaa

1620

taatacgtct

1680

tttgatttat

1740

tacactaaat

1800

tttattgtta

1860

aactatacta

1920

tttccagagt

1980

ggcattattg

2040

agttggtaag

2100

tattgttaaa

2160

tgtagaagat

2220

cgtcatgaaa

2280

gagattcatt

2340

ttctggaaga 2400

ggcacatttg

2460

ggaaggtgca

2520

cctggcacct

cattaaagca

gaggagcaga

tcgagcctca

taattggagt

agactgacct

ggtaaacaga

ggtaaaacgg

taaaaatgaa

ctcttataat

agaaaaatga

ttgaatatag

agttaatact

attatagaat

tggattaaaa

aaacttgacc

atcaattaaa

actaaaacaa

ttggtcttgg

ataaacaatc

gacagatggg

gaagtgttac

tgtgttgtta

ctgcaacgtg

gctactgata

cgatcttgtc

atccaaggtt

ggcataacta

gagctttatt

acggtgtttg

catgttaata

ggtgcaacca

gtggctcttc

ttttgttaaa

aaaagatgag

tatctaccag

atagtattta

tgattgaacc

aaccaaacgg

attcatgtcg

tatgtcattt

agtgattatt

atagaatata

tcgtacaatt

aaaatcatag

ggtatgtgaa

atgcagcaga

aaaaggcctt

tagaagagag

gattatatcc

gtggatatca

atcctaaact

ttgactttcg

cagggatgac

tcaattacag

tacgtaaggt

aa

taagttcatc

ataatttgga

ctaatgcttg

ccgaaccctg

ctatctaaat

attatttttg

ttgagacttt

ccactccaaa

acgttgatag

aattcttctc

ttattctatt

ggtttgcgga

tagaggatat

caggtaaggt

ctaagaaaat

tatagatgag

taattgatat

cacagttgct

gacgaaagca

tgatattaag

accaggacct

cattcctaaa

ctggtctgat

tggtcagtac

ttatgcattg

aactccaaat

aaatcctgtg <210> 2

<211> 517

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 2 Met Leu Ser Pro Ile Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe 1 5 10 15 Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro 20 25 30 Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe 35 40 45 His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly 50 55 60 Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu 65 70 75 80 Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe 85 90 95 Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly 100 105 110 Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly 115 120 125 Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser 130 135 140 Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln 145 150 155 160 Ala Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr 165 170 175 Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val 180 185 190 Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln 195 200 205 Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Leu Ser Met 210 215 220 Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val 225 230 235 240 Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile 245 250 255 Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu 260 265 270 Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val 275 280 285 Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg 290 295 300 Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala 305 310 315 320 Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn 325 330 335 Asn Gln Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val 340 345 350 Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr 355 360 365 Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro 370 375 380 Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val 385 390 His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu 405 Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp 420 Phe Ile Ala Thr Asp Ile Asp Phe 435 440 Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser 450 455 Gln Val Glu His Leu Thr “Met Ala 465 470 Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu 485 Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val 500 Ala Pro Glu Leu Tyr 515 Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr 395 400 Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln 410 415 Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg 425 430 Arg Gly Gln Tyr Tyr Lys Tyr Ile 445 Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu 460 His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr 475 480 Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile 490 495 Glu Leu Ile Ile Ala Pro Arg Leu 505 510 <210> 3 <211> 517 <212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 3

Met Leu Ser Pro 1 Leu Phe Phe Phe 20 Leu Pro Pro Lys 35 His Phe Asn Asp 50 Asp Leu Ala Asp 65 Pro Leu Val Leu Ser Thr Asn Asp 100 Asp Tyr Leu Gly 115 Pro Tyr Trp Arg 130 Ala Ser Arg Leu 145 Ala Ser Met Lys Ile Asn Leu Thr 180 Lys Met Ile Ala 195 Val Glu Arg Phe 210 Glu Phe Val Leu Ile Glu Ala Ile Leu Trp Thr Lys Ile Pro Gly Gly 40 Asp Gly Asp Asp 55 Lys Tyr Gly Pro 70 Val Val Ser Ser 85 Ala Ile Phe Ser Tyr Asn Asn Ala 120 Lys Asn Arg Lys 135 Glu Lys Phe Lys 150 Asn Leu Tyr Thr 165 Asp Trp Leu Glu Gly Lys Asn Tyr 200 Lys Lys Ala Phe 215 Trp Asp Ala Phe Val Gly Leu Val 10 Lys Ser Gln Lys Trp Pro Val Ile Arg Pro Leu Ala 60 Val Phe Thr Phe 75 Tyr Glu Ala Val 90 Asn Arg Pro Ala 105 Met Leu Phe Leu Leu Val Ile Gln 140 His Val Arg Phe 155 Arg Ile Asp Gly 170 Glu Leu Asn Phe 185 Glu Ser Gly Lys Lys Asp Phe Met 220 Pro Ile Pro Leu Thr Phe Thr Phe 15 Pro Ser Lys Pro 30 Gly His Leu Phe 45 Arg Lys Leu Gly Arg Leu Gly Leu 80 Lys Asp Cys Phe 95 Phe Leu Tyr Gly 110 Ala Asn Tyr Gly 125 Glu Val Leu Ser Ala Arg Ile Gln 160 Asn Ser Ser Thr 175 Gly Leu Ile Val 190 Gly Asp Glu Gln 205 Ile Leu Ser Met Phe Lys Trp Val 225 Phe Gln Gly His 230 Lys Ala Met Lys 235 Thr Phe Lys Asp 240 Asp Val Arg Ile Asp Ser Val Phe 245 Asn Trp Leu Glu 250 His Ile Asn Lys 255 Glu Gln Glu Arg Lys Met Glu 260 Asn Ala Glu 265 Glu Gln Asp Phe 270 Asp Val Val Gly Asn Ile Val Leu 275 Lys Met Ser Asn 280 Tyr Leu Gly Glu 285 Tyr Ser Arg Ser Glu Gly Asp 290 Val Ile Glu Ala 295 Val Phe Ser Leu 300 Leu Asp Ala Ala Thr Thr Val 305 Thr Val Ala Leu 310 Ile Asn Trp Gly 315 Ala Leu Leu Ile 320 Asp His Met Asn Asn Gln Lys Ala 325 Thr Lys Ala Gln 330 Glu Ile Asp Thr 335 Val Leu Glu Lys Cys Lys Asp 340 Trp Val Glu Glu 345 Asp Ile Lys Asp 350 Val Tyr Arg Ser Leu Leu Gln 355 Ile Val Lys Glu 360 Leu Arg Leu Tyr 365 Pro Gly Pro Ala Val Pro Leu 370 Val Pro His Glu 375 Val Glu Asp Cys 380 Val Ser Gly Tyr Leu Asn Val 385 Ile Pro Lys Gly 390 Arg Leu Phe Ala 395 Val Met Lys Leu 400 His Thr Asn Gln Arg Asp Pro Lys 405 Trp Ser Asp Pro 410 Thr Phe Asp Pro 415 Arg Leu Asp Glu Phe Ile Ala 420 Asp Ile Asp Phe 425 Gly Gln Tyr Tyr 430 Tyr Ile Thr Arg Lys Pro Phe 435 Pro Gly Arg Arg 440 Cys Pro Gly Met 445 Tyr Ala Leu Gly Ser Thr Gln 450 Glu His Leu Thr 455 Ala His Leu Ile 460 Gly Phe Asn Tyr Val Met Gln 465 Thr Pro Asn Asp 470 Pro Leu Asp Met 475 Glu Gly Ala Gly 480 Arg Glu Lys Ile Thr Ile Arg Lys 485 Asn Pro Val Glu 490 Ile Ile Ala Pro 495 Leu Val Leu Arg 500 Ile 505 Gly Leu Val Thr 510 Thr Phe Ala Pro Glu Leu Tyr Val Phe 515 <210> 4 <211> 517 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 4 Met Leu Ser Pro Ile Glu Ala 1 Phe Phe Phe 5 Trp Thr Lys Lys 10 Gln Lys Pro Ser 15 Pro Leu Leu Ser Lys Leu Pro Pro 20 Ile Pro Gly 25 Pro Val Ile Gly 30 Leu Phe Lys Gly Trp His His Phe 35 Asp Asp Gly Asp 40 Arg Pro Leu Ala 45 Lys Leu Gly Asn Asp Arg Asp 50 Ala Asp Lys Tyr 55 Pro Val Phe Thr 60 Arg Leu Gly Leu Leu η η Gly Phe ο η Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe 85 90 95 Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly 100 105 110 Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly 115 120 125 Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser 130 135 140 Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln 145 150 155 160 Ala Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr 165 170 175 Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val 180 185 190 Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln 195 200 205 Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Leu Ser Met 210 215 220 Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val 225 230 235 240 Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile 245 250 255 Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu 260 265 270 Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val 275 280 285 Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg 290 295 300 Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala 305 310 315 320 Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn 325 330 335 Asn Gln Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val 340 345 350 Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr 355 360 365 Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro 370 375 380 Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr 385 390 395 400 His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Leu 405 410 415 Arg Asp Pro Lys Leu Trp Pro Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg 420 425 430 Phe Ile Ala Thr Asp Ile Asp Phe Arg Gly Gln Tyr Tyr Lys Tyr Ile 435 440 445 Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu 450 455 460 Gln Val Glu His Leu Thr Met Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr 465 470 475 480 Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile 485 490 495 Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Leu Ile Ile Ala Pro Arg Leu Ala Pro Glu 500 Tyr 505 510 515 Leu <210> 5

<211> 316

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> fragmento sinteticamente gerado

<400> 5

ctgcaacgtg atcctaaact ctggtctgat cctgatactt tcgatccaga gagattcatt 60

gctactgata ttgactttcg tggtcagtac tataagtata tcccgtttgg ttctggaaga 12 0

cgatcttgtc cagggatgac ttatgcattg caagtggaac acttaacaat ggcacatttg 180

atccaaggtt tcaattacag aactccaaat gacgagccct tggatatgaa ggaaggtgca 24 0

ggcataacta tacgtaaggt aaatcctgtg gaactgataa tagcgcctcg cctggcacct 300 gagctttatt aaaacc 316

<210> 6

<211> 179

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Fragmento sinteticamente gerado <400> 6

ggtctgatcg tgaagatgat cgctggaaaa aattatgaat ccggtaaagg

agatgaacaa 60

gtggagagat ttaagaaagc gtttaaggat tttatgattt tatcaatgga

gtttgtgtta 120

tgggatgcat ttccaattcc attatttaaa tgggtggatt ttcaagggca tgttaaggc 179

<210> 7

<211> 254

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Fragmento sinteticamente gerado <400> 7

gggatgcatt tccaattcca ttatttaaat gggtggattt tcaagggcat

gttaaggcta 6 0

tgaaaaggac ttttaaagat atagattctg tttttcagaa ttggttagag

gaacatatta 120 ataaaagaga aaaaatggag gttaatgcag aagggaatga acaagatttc àttgatgtgg 180

tgctttcaaa aatgagtaat gaatatcttg gtgaaggtta ctctcgtgat

actgtcatta 240

aagcaacggt gttt

254 , ' ‘

<210> '8 <211> 120 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Fragmento sinteticamente gerado <400> 8

ttggatatga aggaaggtgc aggcataact atacgtaagg taaatcctgt ggaactgata 60

atagcgcctc gcctggcacc tgagctttat taaaacctaa gatctttcat cttggttgat 120

<210> 9 <211> 998 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Fragmento sinteticamente gerado

<400> 9

gtaagttcat ctgtcatttt tcatttattc acttttattt tgaggagcag acatgttaat 60

aataatttgg agcaactgta aagttatcta tgtgtacagg ttcgagcctc aggtgcaacc 120

actaatgctt gtattagatt atgttgtctg catcataccc ctaattggag tgtggctctt 180

cccgaaccct gcaatgctgg atgctggatg ctttatgtat cagactgacc tttttgttaa 240

actatctaaa tactaaggat gatttaataa aaatatagaa tggtaaacag aaaaagatga 300

gattattttt ggggctatat ggattcgccc gggctttggg aggtaaaacg gtatctacca 360

gttgagactt tactccagaa ctttatctcg agagctctga ataaaaatga aatagtattt 42 0

accactccaa aatctttgat ggtaaaaaga tgagatataa cctcttataa ttgattgaac 480

cacgttgata gaataaaact tctttactcc cattcagcat aagaaaaatg aaaccaaacg 54 0

gaattcttct cttttttagg gggaaattcc ttaattgctt gttgaatata gattcatgtc 600

gttattctat ttttaataat gatgaaaatc aatatagtca aagttaatac ttatgtcatt 660 tggtttgcgg acaagttata ttggaactat ataatacgtc tattatagaa tagtgattat 720

ttagaggata tacatttttt ttggataaat atttgattta ttggattaaa aatagaatat 780

acaggtaagg tctaaaacgt gtgtttgctt ttacactaaa taaacttgac ctcgtacaat 840

tctaagaaaa tatttgaaat aaatgaatta ttttattgtt aatcaattaa aaaaatcata 900

gtatagatga gatgtgtgca tacttgacaa taactatact aactaaaaca aggtatgtga 960

ataattgata ttcctttttt aattattctt ttttccag 998

<210> 10 <211> 431 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Fragmento sinteticamente gerado <400> 10

gtctgccagt tcagttcgtt gttcacacaa acggtgatac gtacactttt cccggcaata 60

acatacggcg tgacatcggc ttcaaatggc gtatagccgc cctgatgctc catcacttcc 120

tgattattga cccacacttt gccgtaatga gtgaccgcat cgaaacgcag cacgatacgc 18 0

tggcctgccc aacctttcgg tataaagact tcgcgctgat accagacgtt gcccgcataa 240

ttacgaatat ctgcatcggc gaactgatcg ttaaaactgc ctggcacagc aattgcccgg 3 00

ctttcttgta acgcgctttc ccaccaacgc tgatcaattc cacagttttc gcgatccaga 360

ctgaatgccc acaggccgtc gagttttttg atttcacggg ttggggtttc tacaggacgt 420 aaactagtca g 431

<210> 11 <211> 155 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Fragmento sinteticamente gerado <400> 11

gtaataagat cttcaacacc tacaccattt ttttaatcac tactacccat tgcattgaac 60

aaacttccaa gttcttctta gcttcagatt aagaaagtac cctttcttgg ctttgttgat 120

gtggtaccat tgtccattgt cttgtgtgtt tccag 155

Claims

1. Híbrido, variedade ou linhagem de tabaco c aracteri z ado por compreender plantas que possuem uma mutação em um gene de nicotina desmetilase, as referidas plantas exibindo um fenótipo não-conversor, em que a prole das referidas plantas possui uma taxa de reversão que é reduzida pelo menos 2X comparada com a taxa de reversão do híbrido, variedade ou linhagem de tabaco correspondente que compreende plantas que possuem um gene de nicotina desmetilase do tipo selvagem.

2. Híbrido, variedade ou linhagem de tabaco, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender plantas que possuem um alelo mutante em um lócus de nicotina desmetilase, o referido alelo mutante codificando uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: a) ID. DE SEQ. N° : 2, em que o triptofano no aminoácido 329 é substituído com um códon de parada; b) ID. DE SEQ. N°: 2, em que a prolina no aminoácido 107 é substituída com um aminoácido selecionado do grupo que consiste em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina; c) ID. DE SEQ. N° : 2, em que a isoleucina no aminoácido 163 é substituída com metionina, a lisina no aminoácido 309 é substituída com ácido glutâmico, a glicina no aminoácido353 é substituída com cisteína e a serina no aminoácido 4 52 é substituída com prolina; d) ID. DE SEQ. N°: 2, em que a glutamina no aminoácido 416 é substituída com leucina e a serina no aminoácido 423 é substituída com prolina; e) ID. DE SEQ. N°: 2, em que a isoleucina no aminoácido 163 é substituída com metionina, a lisina no aminoácido 309 é substituída com ácido glutâmico, a glicina no aminoácido 353 é substituída com cisteína, a glutamina no aminoácido 416 é substituída com leucina, a serina no aminoácido 423 é substituída com prolina e a serina no aminoácido 452 é substituída com prolina; f) ID. DE SEQ. N°: 2, em que a seqüência de aminoácidos compreende três substituições selecionadas do grupo que consiste em I163M, L309E, G353C, Q416L, S423P e S452P; g) ID. DE SEQ. N° : 2, em que um aminoácido P 107 é eliminado; h) ID. DE SEQ. N°: 2, em que pelo menos três aminoácidos selecionados do grupo que consiste em 1163, L309, G353, Q416, S423 e S452 são eliminados; i) ID. DE SEQ. N°: 2, em que uma inserção de um ou dois aminoácidos está adjacente a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em P107, 1163, L3 09, G353, Q416, S423 e S452; j) ID. DE SEQ. N°: 2, em que um aminoácido em qualquer posição de 1 a 328 é substituído com um códon de parada; e k) ID. DE SEQ. N°: 2, em que um aminoácido em qualquer posição de 330 a 457 é substituído com um códon de parada.

3. Híbrido, variedade ou linhagem de tabaco, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender plantas que possuem um alelo mutante em um gene que codifica uma nicotina desmetilase, o referido alelo mutante compreendendo uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo que consiste em: a) ID. DE SEQ. N°: 1, em que a guanina no ácido nucléico +2.021 é substituída com uma adenina,- e b) ID. DE SEQ. N°: 1, em que a guanina no ácido nucléico +2.2 91 é substituída com uma adenina c) ID. DE SEQ. N°: 1, em que um doador de splice é inserido no íntron; e d) ID. DE SEQ. N°: 1, em que um receptor de splice ê inserido no íntron.

4. Método de produção de uma planta de tabaco, caracterizado por compreender as etapas de: a) indução de mutagênese em células de uma espécie de Nicotiana; b) obtenção de uma ou mais plantas das referidas células; c) identificação de pelo menos uma das referidas plantas que contenha um gene de nicotina desmetilase que possua pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste em: i) um gene de nicotina desmetilase que codifica a seqüência de aminoácidos definida no ID. DE SEQ. N°: 2, em que o triptofano no aminoácido 329 é substituído com um códon de parada; ii) um gene de nicotina desmetilase que codifica a seqüência de aminoácidos definida no ID. DE SEQ. N°: 2, em que a prolina no aminoácido 107 é substituída com um aminoácido selecionado do grupo que consiste em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina; iii) um gene de nicotina desmetilase que codifica a seqüência de aminoácidos definida no ID. DE SEQ. N°: 2, em que a isoleucina no aminoácido 163 é substituída com metionina, a lisina no aminoácido 3 09 é substituída com ácido glutâmico, a glicina no aminoácido 353 é substituída com cisteína e a serina no aminoácido 452 é substituída com prolina; iv) um gene de nicotina desmetilase que codifica a seqüência de aminoácidos definida no ID. DE SEQ. N°: 2, em que a glutamina no aminoácido 416 é substituída com leucina e a serina no aminoácido 423 é substituída com prolina; v) um gene de nicotina desmetilase que codifica a seqüência de aminoácidos definida no ID. DE SEQ. N°: 2, em que a isoleucina no aminoácido 163 é substituída com metionina, a lisina no aminoácido 3 09 é substituída com ácido glutâmico, a glicina no aminoácido 353 é substituída com cisteína, a glutamina no aminoácido 416 é substituída com leucina, a serina no aminoácido 423 é substituída com prolina e a serina no aminoácido 452 é substituída com prolina; vi) um gene de nicotina desmetilase que codifica a seqüência de aminoácidos definida no ID. DE SEQ. N°: 2, em que a seqüência de aminoácidos compreende três substituições selecionadas do grupo que consiste em I163M, L309E, G353C, Q416L, S423P e S452P; vii) um gene de nicotina desmetilase que codifica a seqüência de aminoácidos definida no ID. DE SEQ. N° : 2, em que um aminoácido P 107 é eliminado; viii) um gene de nicotina desmetilase que codifica a seqüência de aminoácidos definida no ID. DE SEQ. N°: 2, em que pelo menos três aminoácidos selecionados do grupo que consiste em 1163, L309, G353, Q416, S423 e S452 são eliminados; ix) um gene de nicotina desmetilase que codifica a seqüência de aminoácidos definida no ID. DE SEQ. N°: 2, em que uma inserção de um ou dois aminoácidos está adjacente a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em P107, 1163, L309, G353, Q416, S423 e S452; x) um gene de nicotina desmetilase que codifica a seqüência de aminoácidos definida no ID. DE SEQ. N°: 2, em que um aminoácido em qualquer posição de 1 a 328 é substituído com um códon de parada; xi) um gene de nicotina desmetilase que codifica a seqüência de aminoácidos definida no ID. DE SEQ. N°: 2, em que um aminoácido em qualquer posição de 330 a 457 é substituído com um códon de parada; xii) um gene de nicotina desmetilase que compreende a seqüência definida no ID. DE SEQ. N°: 1, em que a guanina no ácido nucléico +2.021 é substituída com uma adenina; xiii) um gene de nicotina desmetilase que compreende a seqüência definida no ID. DE SEQ. N°: 1, em que a guanina no ácido nucléico +2.291 é substituída com uma adenina xiv) um gene de nicotina desmetilase que compreende a seqüência definida no ID. DE SEQ. N°: 1, em que um doador de splice é inserido no íntron; e xv) um gene de nicotina desmetilase que compreende a seqüência definida no ID. DE SEQ. N°: 1, em que um receptor de splice é inserido no íntron.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado ainda por compreender as etapas de: cruzamento da referida planta que contém a referida (pelo menos uma) mutação no referido gene de nicotina desmetilase com uma segunda planta de Nicotiana; e seleção da prole do referido cruzamento que possui a referida (pelo menos uma) mutação no referido gene de nicotina desmetilase.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as referidas células estão em uma semente.

7. Planta Mi de tabaco caracterizada por ser heterozigota para um alelo mutante em um lócus de nicotina desmetilase, em que pelo menos uma porção da prole autopolinizada de primeira geração da referida planta exibe um fenótipo não-conversor, e em que a prole da referida planta Mi de tabaco reverte para um fenótipo conversor em uma taxa que é estatisticamente significativamente menor do que a taxa de reversão da prole de uma planta de tabaco correspondente que compreende um alelo do tipo selvagem no referido lócus de nicotina desmetilase.

8. Prole da planta de tabaco, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a referida prole possui o referido alelo mutante no referido lócus de nicotina desmetilase e possui o referido fenótipo não- conversor.

9. Planta Mi de tabaco caracterizada por carregar em seu genoma um alelo mutante em um lócus de nicotina desmetilase, a referida planta exibindo um fenótipo não- conversor e cuja prole reverte para um fenótipo conversor em uma taxa que é estatisticamente significativamente menor do que a taxa de reversão da prole de uma planta de tabaco correspondente que compreende um alelo do tipo selvagem no referido lócus de nicotina desmetilase.

10. Prole da planta de tabaco da reivindicação 9, carcaterizada pelo fato de que a referida prole possui o referido alelo mutante no referido lócus de nicotina desmetilase e que possui o referido fenótipo não-conversor.

11. Híbrido, variedade ou linhagem de tabaco, plantas do referido híbrido, variedade ou linhagem caracterizada por ser transformada com uma construção de RNAi que compreende uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N°: 5, ID. DE SEQ. N°: 6, ID. DE SEQ. N°: 7 e ID. DE SEQ. N°: 8, as referidas plantas exibindo expressão diminuída de um gene de nicotina desmetilase, quando comparadas com plantas de um híbrido, variedade ou linhagem de tabaco de controle desprovidas da referida construção de RNAi.

12. Método de produção de uma planta de tabaco, caracterizado por compreender as etapas de: a) introdução em uma. célula de uma. planta de Nicotiana de uma construção de RNAi que compreende um gene de nicotina desmetilase, ou um fragmento deste; b) obtenção de uma ou mais plantas da referida célula; c) identificação de pelo menos uma das referidas plantas que exiba expressão diminuída de um gene de nicotina desmetilase, quando comparada com a planta de tabaco correspondente desprovida da referida construção de RNAi.

13. Tabaco curado caracterizado por ser feito a partir do híbrido, variedade ou linhagem de qualquer uma das das reivindicações 1, 2 ou 3, ou 11.

14. Produto de tabaco caracterizado por compreender o tabaco curado da reivindicação 13.