BRPI0717355A2 - planta transgênica de nicotina, semente, construto de ácido nucleico recombinante e método de redução da conversão de nicotina em nornicotina em uma planta de nicotiana - Google Patents

Abstract

PLANTA TRANSGêNICA DE NICOTIANA, SEMENTE, CONSTRUTO DE áCIDO NUCLéICO RECOMBINANTE E MéTODO DE REDUçãO DA CONVERSãO DE NICOTINA EM NORNICOTINA EM UMA PLANTA DE NICOTIANA. São apresentadas composições e métodos para a redução do nível de nornicotina e N'-nitrosonornicotina (NNN) em plantas e parte de plantas de Nicotiana. As composições abrangem polinucleotídeos e polipeptídeos isolados do citocromo P450 envolvidos na conversão metabólica da nicotina em nornicotina nessas plantas. Também são apresentados cassetes de expressão, vetores, plantas, e partes de plantas que abrangem sequências inibidoras que têm como alvo a expressão ou função dos polipeptídeos do citocromo P450 descobertos. Também são apresentados métodos para o uso dessas novas sequências para inibir a expressão ou função de polipeptídeos do citocromo P450 envolvidos nessa conversão metabólica. Os métodos têm uso na produção de produtos do tabaco que possuem níveis reduzidos de nornicotina e seu metabólito carcinogênico, NNN e, portanto, um potencial carcinogênico reduzido para indivíduos que consomem esses produtos do tabaco ou estão expostos ao fumo secundário derivado desses produtos.

Description

PLANTA TRANSGÊNICA DE NICOTIANA, SEMENTE, CONSTRUTO DE ÁCIDO NUCLÉICO RECOMBINANTE E MÉTODO DE REDUÇÃO DA CONVERSÃO DE NICOTINA EM NORNICOTINA EM UMA PLANTA DE NICOTIANA

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção se refere a composições e métodos para reduzir o nível de nornicotina e seus metabólitos, W-nitrosonornicotina, em uma planta que é membro do gênero Nicotiana, especialmente composições e métodos para inibir a expressão ou função de um polipeptídeo do citocromo P450, envolvido na conversão metabólica da nicotina em nornicotina.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O alcalóide predominante encontrado nas variedades comerciais de tabaco é a nicotina, que corresponde normalmente a 90 - 95% do total do pool de alcalóide. A fração de alcalóide remanescente é formada principalmente por três alcalóides de piridina: nornicotina, anabasina, e anatabina. A nornicotina é gerada diretamente da nicotina através da atividade da enzima nicotina iV-demetilase (Figura 1). A nornicotina representa geralmente menos de 5% do total do reservatório de alcalóide de piridina, mas através de um processo chamado de "conversão", as plantas de tabaco que produzem inicialmente quantidades muito baixas de nornicotina dão origem a uma progênie que "converte" metabolicamente uma grande percentagem de nicotina da folha em nornicotina. Em plantas de tabaco que convertem geneticamente (chamadas de "conversoras"), a grande maioria da produção de nornicotina ocorre durante a senescência e cura da folha madura (Wernsman and Matzinger (1968) Tob. Sei. 12:226-228). Os tabacos do tipo Burley são particularmente propensos à conversão genética, com altas taxas que chegam a 20% por geração em alguns cultivares.

Durante a cura e processamento da folha de tabaco, uma parte da nornicotina é metabolizada ao composto W-nitrosonornicotina (NNN; Figure 1), uma nitrosamina específica do tabaco (TSNA, em inglês, tobacco-specific nitrosamine) a qual tem se mostrado carcinogênica em animais de laboratório (Hecht and Hoffmann (1990) Câncer Surveys 8:273-294; Hoffmann et al. (1994) J. Toxicol. Environ. Health 41:1- 52; Hecht (1998) Chem. Res. Toxicol. 11:559-603). Em tabacos curados em fumeiros, constatou-se que as TSNAs são formadas predominantemente através da reação de alcalóides com quantidades insignificantes de óxidos de nitrogênio presentes em gases de combustão formados pelos sistemas de aquecimento de queima direta, encontrados em celeiros de cura tradicionais (Peele and Gentry (1999) "Formation of Tobacco- specific Nitrosamines in Flue-cured Tobacco," CORESTA Meeting, Agro-Phyto Groups, Suzhou, China). O aperfeiçoamento desses celeiros de cura com trocadores de calor elimina virtualmente a mistura de gases de combustão com o ar da secagem, e reduz acentuadamente a formação de TSNAs em tabacos curados dessa maneira (Boyette and Hamm (2001) Rec. Adv. Tob. Sei. 27:17-22.). Em contraste, nos tabacos do tipo Burley curados ao ar, a formação de TSNA ocorre principalmente através da reação dos alcalóides do tabaco com nitrito, um processo catalisado por micróbios provenientes da folha (Bush etal. (2001) Rec. Adv. Tob. Sei. 27:23-46). Até agora, as tentativas de reduzir as TNSAs através da modificação das condições de cura mantendo ao mesmo tempo padrões de qualidade aceitáveis não têm sido bem sucedidas para tabacos curados ao ar.

Em tabacos do tipo Burley, tem sido encontrada uma correlação positiva entre o conteúdo de nornicotina da folha e a quantidade de NNN acumulada no produto curado (Bush et al. (2001) Rec. Adv. Tob. Sei. 27:23-46; Shi et al. (2000) Tob. Chem. Res. Conf. 54:Abstract 27). No entanto, manter níveis mínimos de nornicotina tem sido difícil por causa do fenômeno da conversão, que resulta na introdução contínua de plantas com alta produção de nornicotina dentro de populações Barley crescidas para fins comerciais. A minimização do número de plantas tipo Burley que acumulam altos níveis de nornicotina tradicionalmente tem sido responsabilidade dos cultivadores de planta e produtores de sementes. Apesar da possibilidade da percentagem de plantas conversoras crescidas basicamente em campos de fazendeiros serem reduzida através da invasão das plantas conversoras por outras espécies, durante a propagação de estoques de sementes, esse processo é custoso, demanda tempo, e é imperfeito.

Estudos prévios têm mostrado que uma vez que a planta é convertida, o traço de alta nornicotina é herdado como um gene dominante simples (Griffith et al. (1955) Science 121:343-344; Burk and Jeffrey (1958) Tob. Sci 2:139-141; Mann et al. (1964) Crop Sei. 4:349-353). No entanto, a natureza desse gene é atualmente desconhecida. Nos cenários mais simples, o lócus da conversão pode representar um gene não funcional de nicotina /V-demetilase que recupera sua função em plantas conversoras, possivelmente através da mobilização de um elemento transponível indutor de mutação. Alternativamente, o locus conversor pode decodificar uma proteína que inicia uma cascata de eventos, que ao final capacita a planta a metabolizar a nicotina em nornicotina, o que pode significar que genes múltiplos estão envolvidos.

Apesar de poderem existir um ou muitos genes associados ao processo de conversão, está claro que o(s) gene(s) codificadores de polipeptídeos que têm atividade de nicotina demetilase desempenha(m) um papel essencial nesse processo. Embora a incapacidade de purificar a nicotina /V-demetilase ativa a partir de extratos brutos tenha impedido o isolamento e identificação dessa enzima, há evidência de que um membro da superfamília de monooxigenases citocromo P450 possa estar envolvido (Hao and Yeoman (1996) Phytochem. 41:477-482; Hao and Yeoman (1996) Phytochem. 42:325-329; Chelvarajan et al. (1993) J. Agric. Food Chem. 41:858-862; Hao and Yeoman (1998) J. Plant Physiol. 152:420-426). Contudo, esses estudos não são conclusivos, uma vez que os inibidores clássicos de P450, monóxido de carbono e tetcilase, têm falhado em diminuir a atividade da enzima a taxas comparáveis a outras reações mediadas por P450 (Chelvarajan et al. (1993) J. Agric. Food Chem. 41:858-862).

Além disso, os citocromos P450 são proteínas transmembrana onipresentes que participam do metabolismo de uma ampla série de compostos (revisados por Schuler (1996) Crít. Rev. Plant Sei. 15:235-284; Schuler and Werck-Reichhart (2003) Annu. Rev. Plant Biol. 54:629-667). Os exemplos de reações bioquímicas mediadas por citocromos P450 incluem hidroxilações, demetilações, e epoxidações. Em plantas, as famílias de genes do citocromo P450 são muito grandes. Por exemplo, o exame da seqüência do genoma total revelou 272 genes previstos de citocromo P450 em Arabidopsis e no mínimo 455 genes únicos de citocromo P450 em arroz (ver, por exemplo, Nelson et al. (2004) Plant Physiol. 135(2):756-772). Embora o citocromo P450 esteja implicado em um papel na conversão metabólica da nicotina em nornicotina, a identificação de membros chave que participam dessa família de proteínas ainda é um desafio. Salvo o fato de servir como precursora para NNN, estudos recentes sugerem que a nornicotina encontrada em produtos do tabaco pode ter conseqüências indesejáveis para a saúde. Dickerson e Janda demonstraram que a nornicotina causa a glicação de proteínas aberrantes dentro da célula (Dickerson and Janda (2002) Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 99:15084-15088). Constatou-se que concentrações de proteínas modificadas por nornicotina são muito mais altas no plasma de fumantes quando comparadas aos não-fumantes. Além disso, esse mesmo estudo mostrou que a nornicotina pode modificar covalentemente fármacos esteróides comumente prescritos como a prednisona. Tais modificações têm o potencial de alterar tanto a eficácia como a toxicidade desses fármacos.

Em vista das dificuldades associadas à conversão e efeitos indesejáveis à saúde relacionados à acumulação de nornicotina, é desejável a criação de métodos aperfeiçoados para redução do conteúdo da nornicotina em variedades de tabaco, especialmente o tabaco Burley. Tais métodos não atenuariam apenas potenciais conseqüências negativas à saúde causadas pela nornicotina em si, como descrito acima, mas poderiam também reduzir concomitantemente os níveis de NNN.

RESUMO DA INVENÇÃO

Apresentam-se composições e métodos para redução do conteúdo de nornicotina em plantas que são membros do gênero Nicotiana. As composições incluem polinucleotídeos isolados de citocromo P450 e polipeptídeos que estão envolvidos na conversão metabólica da nicotina em nornicotina em plantas, particularmente nas espécies de Nicotiana. Os polinucleotídeos isolados incluem uma seqüência de nucleotídeos apresentados na ID SEQ N°: 1, 3, 5, 7, 9, ou 11, uma seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo conforme mostrado na ID SEQ N°:2, 4, 6, 8, 10, ou 12, e fragmentos e variantes dessas. Polipeptídeos isolados da invenção abrangem uma seqüência de aminoácidos mostrada na ID SEQ N°:2, 4, 6, 8, 10, ou 12, uma seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência de nucleotídeos mostrada em ID SEQ N°: 1, 3, 5, 7, 9, ou 11, e fragmentos e variantes dessas.

Os polinucleotídeos da invenção têm uso na supressão da expressão de um citocromo P450 que está envolvido na conversão metabólica da nicotina em nornicotina em uma planta, incluindo os citocromos P450 da presente invenção. Desse modo, as composições incluem ainda cassetes de expressão abrangendo uma seqüência inibidora que é capaz de inibir a expressão ou função de um polipeptídeo de citocromo P450 da invenção, no qual a seqüência inibidora está ligada operacionalmente a um promotor que é funcional em uma célula de planta. Em algumas concretizações, a seqüência inibidora inclui a seqüência apresentada nas IDs SEQ N°: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 14, 15, ou 16, ou um complemento ou fragmento dessas. As composições também incluem plantas transformadas e partes de plantas que incluem um cassete de expressão da presente invenção, opcionalmente incorporado de modo estável dentro do genoma da planta. Adicionalmente são apresentados produtos de tabaco, incluindo gomas de mascar de tabaco, tabaco em pós, cigarros, tabaco de cachimbo, e charutos, que possuem um nível reduzido de nornicotina, e sua nitrosamina relacionada, a /V'-nitrosonornicotina.

Os métodos da invenção abrangem a inibição da expressão ou função de um polipeptídeo do citocromo P450 da presente invenção. Em algumas concretizações, um cassete de expressão abrangendo uma seqüência inibidora, que tem como alvo a expressão ou função de um polipeptídeo do citocromo P450 da presente invenção, é introduzida dentro da planta ou parte da planta de interesse, na qual a expressão da seqüência inibidora produz um polinucleotídeo ou polipeptídeo que inibe a expressão ou função de um polipeptídeo do citocromo P450 da invenção. Em uma concretização, a seqüência inibidora inclui a seqüência apresentada nas ID SEQ N°: 1, .3, 5, 7, 9, 11, 13, 14, 15, ou 16, ou um complemento ou fragmento dessas.

Os métodos da invenção têm uso na produção da plantas de Nicotiana que possuem níveis reduzidos de nornicotina e seu metabólito, a nitrosamina N'- nitrosonornicotina, dentro dos tecidos da folha e caule. Quando colhidos, os tecidos da folha e do caule dessas plantas podem ser utilizados para produzir tabaco com níveis reduzidos de nornicotina e sua nitrosamina específica do tabaco, e portanto reduzir o potencial carcinogênico para indivíduos que consomem esses produtos ou são expostos ao fumo secundário derivado desses produtos.

Também são apresentadas plantas transgênicas de Nicotiana que têm uma taxa de conversão de nicotina em nornicotina de aproximadamente menos de 2%, sendo que as plantas abrangem um construto de ácido nucléico heterólogo que inclui um promotor capaz de funcionar em uma célula de planta, ligado operacionalmente a uma seqüência de ácido nucléico, que tem a primeira seqüência de nucleotídeos com um fragmento de cerca de 100 a 400 nucleotídeos de polinucleotídeo nicotina demetilase de Nicotiana, e uma segunda seqüência de nucleotídeos capaz de formar um RNA de dupla fita com a primeira seqüência de nucleotídeos, sendo que as plantas transgênicas de Nicotiana são linhagens transgênicas conversoras de Nicotiana . Em algumas concretizações, o polinucleotídeo de Nicotiana nicotina demetilase é um polinucleotídeo de nicotina demetilase do tabaco.

A presente invenção também apresenta um construto de ácido nucléico recombinante que abrange um promoter capaz de funcionar em uma célula de planta ligada operacionalmente a uma seqüência de ácido nucléico que tem a primeira seqüência de nucleotídeos abrangendo um fragmento de cerca de 100 a 400 nucleotídeos de um polinucleotídeo de nicotina demetilase de tabaco e uma segunda seqüência de nucleotídeos capaz de formar um RNA de dupla hélice com a primeira seqüência de nucleotídeos.

Também são apresentados métodos para redução da conversão de nicotina em nornicotina em uma planta de Nicotiana, que abrange a transformação de uma planta de Nicotiana com um construto de ácido nucléico recombinante incluindo um promoter capaz de funcionar em uma célula de planta, ligado operacionalmente a uma seqüência de ácido nucléico, que tem uma primeira seqüência de nucleotídeos abrangendo um fragmento de cerca de 100 a 400 nucleotídeos de um polinucleotídeo nicotina demetilase de Nicotiana e uma segunda seqüência de nucleotídeos capaz de formar um RNA de dupla hélice com a primeira seqüência de nucleotídeos; e regenerar uma planta transgênica de Nicotiana. Em algumas concretizações, o polinucleotídeo de Nicotiana nicotina demetilase é um polinucleotídeo de nicotina demetilase do tabaco.

A presente invenção também apresenta sementes obtidas a partir de plantas transgênicas de Nicotiana que têm uma taxa de conversão de nicotina em nornicotina de cerca de menos 2%, em que as plantas abrangem um construto de ácido nucléico heterólogo que inclui um promoter capaz de funcionar em uma célula de planta, ligado operacionalmente a uma seqüência de ácido nucléico, que tem a primeira seqüência de nucleotídeos com um fragmento de cerca de 100 a 400 nucleotídeos de polinucleotídeo nicotina demetilase de Nicotiana, e uma segunda seqüência de nucleotídeos capaz de formar um RNA de dupla hélice com a primeira seqüência de nucleotídeos, sendo que as plantas transgênicas de Nicotiana são linhagens transgênicas conversoras de Nicotiana. Em algumas concretizações, o polinucleotídeo de Nicotiana nicotina demetilase é um polinucleotídeo de nicotina demetilase do tabaco.

A presente invenção também apresenta células de planta transgênica que abrangem uma molécula de ácido nucléico que tem um promoter funcional em uma célula de planta e uma seqüência de ácido nucléico que codifica a nicotina demetilase tendo um resíduo de isoleucina na posição 274 e um resíduo de triptofano na posição .330.

A presente invenção também apresenta métodos de rastreamento para uma seqüência de nicotina demetilase que abrange: a obtenção de uma seqüência de ácido nucléico que possui mais de 90% de identidade da seqüência com SEQ ID NO:5 e identificação de uma seqüência de códon que codifica um resíduo de triptofano na posição 330 do polipetídeo codificado.

Adicionalmente são apresentados métodos para rastreamento da nicotina demetilase que têm um isoleucina na posição 274 ou um triptofano na posição 330, abrangendo a obtenção de uma seqüência de ácido nucléico que tem mais de 90% de identidade de seqüência com SEQ ID N°: 5 e a identificação de uma primeira seqüência de códon que codifica um resíduo de isoleucina na posição 274, ou uma segunda seqüência de códon que codifica um resíduo de triptofano na posição 330 do polipetídeo codificado.

BREVE DESCRIÇÃO DAS ILUSTRAÇÕES

A Figura 1 mostra as estruturas da nicotina, nornicotina, e N'- nitrosonornicotina (NNN).

A Figura 2 mostra uma análise de Northern blot dos RNAs conversores e não- conversores usando 7D_A06 como probe hibridização. As bandas 1 e 2 mostram RNAs isolados a partir de folhas tratadas com bicarbonato de sódio de genótipos DH .98-325-5 (não-conversor) e DH 98-325-6 (conversor), respectivamente. As bandas 3 e 4 mostram RNAs isolados a partir de folhas tratadas com etefon de genótipos DH 98- .326-3 (não-conversor) e DH 98-326-1 (conversor), respectivamente. O tamanho estimado da banda hibridizada é indicado em kilobases (Kb).

A Figura 3A-3G mostra o alinhamento de uma seqüência de nucleotídeos de membros da família de gene 3D_C12. Os asteriscos denotam posições onde a identidade da seqüência é conservada entre todas as seqüências comparadas. As posições onde se encontram diferenças são indicadas com hífens e os resíduos correspondentes estão sombreados em cinza. As seqüências de nucleotídeos presentes no alinhamento incluem 3D_C12 (SEQ ID N°: 1), 3D_C12-10 (SEQ ID N°:3);

3D_C12-7 (SEQ ID N°:5); 7D_A06 (SEQ ID N°:7); 3D_C12-15 (SEQ ID N°:9); e 131A_A02 (SEQ ID N°:ll). As entradas 3D_C12-I5 e 131A_A02 são seqüências de DNAc de comprimento parcial. A região 99 bp de 3D_C12 que foi usada para fazer o construto com base em RNAi está sublinhada.

A Figura 4 mostra um alinhamento das seqüências de aminoácidos previstas para membros de comprimento inteiro da família 3D_C12 de genes P450. As seqüências de aminoácidos presentes no alinhamento incluem 3D_C12 (ID SEQ N°:2), 3D_C12-10 (ID SEQ N°:4); 3D_C12-7 (ID SEQ N°:6); e 7D_A06 (ID SEQ N°: 8). Os asteriscos denotam posições conservadas entre todas as quatro seqüências. Os resíduos que diferem entre os membros estão sombreados em cinza.

A Figura 5 mostra uma análise de Northern blot de plantas transgênicas que possuem o construto 3D_C12/RNAi. (A) Hibridização da sonda 3D_C12-7 em RNAs isolados a partir de folhas de plantas transgênicas curadas e tratadas com etefon mostra fenótipos baixos de nornicotina (3D_C12/RNAi-l, 3, e 4) e fenótipos altos de nornicotina (3D_C12/RNAi-6, 7, e planta 11 de controle apenas por vetor). O tamanho estimado da banda hibridizada é indicado em kilobases (Kb). (B) Coloração com brometo de etídio da porção do gel usado em (A) que contém o RNA ribossômico 28S para mostrar a equivalência relativa da carga de RNA entre as bandas.

A Figura 6 mostra a análise de Northern blot de plantas transgênicas que possuem construtos de orientação senso de membros da família de gene 3D_C12. (A) Hibridização do probe 3D_C12-7 em RNAs isolados a partir de folhas não tratadas de linhagens transgênicas independentes que expressam os construtos 3D_C12-7, 3D_C12, e 7D_A06 e um controle apenas por vetor (controle 8). O tamanho estimado da banda hibridizada é indicado em kilobases (Kb). (B) Coloração com brometo de etídio da porção do gel usado em (A) que contém o RNA ribossômico 28S para mostrar a equivalência relativa da carga de RNA entre as bandas.

A Figura 7 mostra uma seqüência genômica de um fragmento do gene 3D_C12-10 que possui um íntron. As seqüências de íntrons estão indicadas em negrito e itálico. As seqüências éxons são mostradas em tipo simples. As seqüências correspondentes aos primers de PCR (reação em cadeia de polimerase) usadas para amplificar o fragmento a partir do DNA genômico do tabaco estão sublinhadas.

A Figura 8 mostra um diagrama dos construtos de RNAi usados para silenciar a expressão dos membros da família do gene 3D_CD12.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Antecedentes e definições

Antes de descrever a presente invenção detalhadamente, deve ser entendido que muitas modificações e outras concretizações das invenções aqui apresentadas virão à mente de uma pessoa habilitada na técnica a qual esta invenção se refere, tendo o benefício das instruções apresentadas nas descrições seguintes e nas ilustrações associadas. Portanto, deve ser entendido que a invenção não deve se limitar às concretizações específicas reveladas aqui e pretende-se que modificações e outras concretizações sejam incluídas dentro do escopo das reivindicações anexas. Preferivelmente, essas concretizações são apresentadas de modo que esta descoberta satisfaça aos requerimentos legais aplicáveis.

Embora aqui sejam empregados termos específicos, eles são usados apenas no sentido genérico e descritivo e não com o propósito de limitação. Números parecidos se referem aos elementos parecidos em todo o documento. Adicionalmente, o artigo "um" e "uma" são usados aqui se referindo a um ou mais que um (i.e., a no mínimo um) do objeto gramatical do artigo. A fim de exemplo, "um elemento" significa um ou mais elementos. Do início ao fim da especificação entende-se que a palavra "abranger" ou variações como "abrange" ou "abrangendo" implica a inclusão de um elemento declarado, inteiro ou fração, ou grupos de elementos, inteiros ou frações, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, inteiro ou fração, ou grupo de elementos, inteiros ou frações.

A presente invenção é representada por composições e métodos para inibir a expressão ou função de polipeptídeos do citrocromo P450, que estão envolvidos na conversão metabólica da nicotina em nornicotina em uma planta, particularmente plantas do gênero Nicotiana, incluindo plantas de tabaco de diversas variedades comerciais. Conforme usado aqui, os termos "inibir", "inibição", e "inibindo" são definidos como qualquer método conhecido da técnica ou descrito aqui que reduza a expressão ou função de um produto do gene de interesse (i.e., o produto do gene alvo) "Inibição" pode estar no contexto de uma comparação entre duas plantas, por exemplo, uma planta geneticamente alterada versus uma planta selvagem. Alternativamente, a inibição da expressão ou função do produto do gene alvo pode estar dentro do contexto de uma comparação entre células, organelas, órgãos, tecidos, ou parte de plantas dentro da mesma planta ou entre plantas diferentes, e inclui comparações entre estágios do desenvolvimento ou temporários dentro da mesma planta, ou parte de planta, ou entre plantas ou partes de planta. "Inibição" inclui qualquer decréscimo relativo da função ou produção de um produto do gene de interesse, até a (e incluindo a) eliminação completa da função ou produção daquele produto de gene. O termo "inibição" inclui qualquer método ou composição que regula para baixo a tradução e/ou transcrição do produto do gene alvo ou da atividade funcional do produto do gene alvo.

O termo "seqüência inibidora" inclui qualquer polinucleotídeo ou seqüência de polipeptídeo capaz de inibir a expressão ou função de um polipeptídeo do citocromo P450 envolvido na conversão metabólica da nicotina em nornicotina em uma planta, tal como um polinucleotídeo de comprimento inteiro ou seqüências de polipeptídeos, polinucleotídeos ou seqüências de polipeptídeos truncados, fragmentos de polinucleotídeos ou seqüências de polipeptídeos, variantes de polinucleotídeos ou seqüências de polipeptídeos, seqüências de nucleotídeos com orientação senso, seqüências de nucleotídeos com orientação antisenso, o complemento de uma seqüências de nucleotídeos com orientação senso ou antisenso, regiões invertidas de seqüências de nucleotídeos, grampos de seqüências de nucleotídeos, seqüências de nucleotídeos de dupla fita, seqüências de nucleotídeos de única fita, combinações dessas, e semelhantes. O termo "seqüência de polinucleotídeos" inclui seqüências de RNA, DNA, ácidos nucléicos quimicamente modificados, análogos de ácidos nucléicos, combinações desses, e semelhantes.

Seqüências inibidoras são designadas aqui pelo nome do produto do gene alvo. Portanto, uma "seqüência inibidora do citocromo P450" se refere a uma seqüência inibidora capaz de inibir a expressão de um polipeptídeo de citrocromo P450 que está envolvida na conversão metabólica da nicotina em nornicotina em uma planta, por exemplo, no nível da transcrição e/ou tradução, ou que seja capaz de inibir a função de esse polipeptídeo do citrocromo P450. Quando a frase "capaz de inibir" é usada no contexto de uma seqüência inibidora de polinucleotídeos, isso pretende significar que a seqüência inibidora exerce em si o efeito inibidor; ou, que a seqüência inibidora codifica uma molécula de nucleotídeo inibidora (por exemplo, um RNA em alça, RNAmi, ou polinucleotídeo de RNA de dupla hélice), ou codifica um polipeptídio inibidor (i.e, um polipeptídio que inibe a expressão ou função do produto de gene alvo), após sua transcrição (por exemplo, no caso de uma seqüência inibidora que codifica um RNA em alça, RNAmi, ou polinucleotídeo de RNA de dupla hélice) ou sua transcrição e tradução (no caso de uma seqüência inibidora que codifica um polipeptídio inibidor), o produto transcrito ou traduzido, respectivamente, exerce o efeito inibidor sobre o produto do gene alvo (i.e., inibe a expressão ou função do produto do gene alvo).

"Célula hospedeira" significa uma célula de abrange uma seqüência heteróloga de ácido nucléico da invenção. Embora as seqüências de ácido nucléico da invenção, e fragmentos e variantes dessas, possam ser introduzidas dentro de qualquer célula de interesse, são de interesse particular as células de plantas, mais particularmente as células de espécies da planta Nicotiana, por exemplo, as espécies de planta de tabaco e variedades descritas abaixo.

O uso do termo "polinucleotídeo" não pretende limitar a presente invenção a polinucleotídeos que abrangem DNA. Pessoas com habilidade comum na técnica reconhecerão que polinucleotídeos podem abranger ribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos. Esses ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos incluem tanto moléculas de ocorrência natural como análogos sintéticos. Os polinucleotídeos da invenção também incluem todas as formas de seqüências, incluindo, mas não se limitando a, formas de única hélice, formas de dupla hélice, grampos, estruturas em grampo, e semelhantes.

O termo "variante" conforme usado aqui pretende significar uma seqüência substancialmente similar, e o termo polinucleotídeo ou polipeptídeo "nativo" pretende significar uma seqüência de nucleotídeos de ocorrência natural ou seqüência de aminoácidos, respectivamente. Por "fragmento" entende-se uma porção de um polinucleotídeo ou uma porção de uma seqüência de aminoácidos e então a proteína codificada por meio dela.

Conforme usado aqui, o termo "parte de planta" inclui células de plantas, protoplastos de plantas, culturas de tecidos de células de plantas, a partir das quais uma planta inteira pode ser regenerada, calos de planta, grupos de plantas, e células de plantas que são intactas em plantas ou partes de plantas, como embriões, pólen, anteros, óvulos, sementes, folhas, flores, caules, ramos, frutos, raízes, extremidades de raízes e semelhantes. A progênie, as variantes e mutantes de plantas regeneradas também estão incluídas dentro do escopo da invenção, desde que essas incluam seqüências introduzidas de ácido nucléico da invenção.

Por "mudança fenotípica" entende-se uma mudança mensurável em uma ou mais funções celulares. Por exemplo, plantas que possuem uma modificação genética no lócus gênico que codifica um polipeptídio do citocromo P450 da invenção podem mostrar uma expressão ou atividade reduzida ou eliminada daquele polipeptídio do citocromo P450.

O termo "introduzir" significa apresentar à planta o polinucleotídeo ou polipeptídeo de modo que a seqüência tenha acesso ao interior da célula da planta.

O termo "operacionalmente ligado" pretende significar uma ligação funcional entre dois ou mais elementos. Por exemplo, uma ligação operacional entre um polinucleotídeo de interesse e uma seqüência reguladora (i.e, um promoter) é uma ligação funcional que permite a expressão do polinucleotídeo de interesse. Elementos operacionalmente ligados podem ser contíguos ou não-contíguos. Quando usado para se referir à união de duas regiões que codificam proteína, por operacionalmente ligadas entende-se que as regiões codificadoras estão no mesmo quadro de leitura.

O termo "heterólogo" de acordo com a presente invenção, quando usado em referência a uma seqüência, pretende significar uma seqüência que se origina a partir de uma espécie exótica, ou se a partir da mesma espécie, é substancialmente modificada a partir de sua forma nativa em composição e/ou lócus genômico por intervenção humana deliberada. O termo também é aplicável a construtos de ácido nucléico, também referido aqui como "construtos de polinucleotídeo" ou "construtos de nucleotídeo". Dessa maneira, um construto de ácido nucléico "heterólogo" pretende significar um construto que se origina de espécies exóticas, ou, se a partir da mesma espécie, é substancialmente modificado a partir de sua forma nativa em composição e/ou lócus genômico por intervenção humana deliberada. Construtos de ácido nucléico heterólogo incluem, mas não se limitam a, construtos de nucleotídeos recombinantes que foram introduzidos dentro de uma planta ou parte da planta, por exemplo, através de métodos de transformação ou cruzamento subsequentes de uma planta transgênica com outra planta de interesse.

Por exemplo, um promoter operacionalmente ligado a um polinucleotídeo heterólogo é de uma espécie diferente das espécies das quais o polinucleotídeo foi derivado, ou, se da mesma espécie ou análoga, uma ou ambas são substancialmente modificadas a partir de sua forma original e/ou lócus genômico, ou o promoter não é o promoter nativo para o polinucleotídeo operacionalmente ligado. Além disso, conforme usado aqui o gene quimérico abrange uma seqüência codificadora operacionalmente ligada a uma região de iniciação de transcrição que é heteróloga à seqüência codificadora.

O termo "expressão" conforme usado aqui se refere à biossíntese de um produto de gene, incluindo a transcrição e/ou tradução desse produto do gene. Por exemplo, para a finalidade da presente invenção, um cassete de expressão, conforme descrito aqui, capaz de expressar um polinucleotídeo que inibe a expressão de no mínimo um polipeptídeo do citocromo P450 da invenção é um cassete de expressão capaz de produzir uma molécula de RNA que inibe a transcrição e/ou tradução de no mínimo um polipeptídeo do citocromo P450. A "expressão" ou "produção" de uma proteína ou polipeptídio a partir de uma molécula de DNA se refere à transcrição e tradução da seqüência codificadora para produzir a proteína ou polipeptídio, enquanto que a "expressão" ou "produção" de uma proteína ou polipeptídeo a partir de uma molécula de RNA se refere à transcrição e tradução da seqüência codificadora de RNA para produzir a proteína ou polipeptídio.

Polinucleotídeos e polipeptídeos de citocromo P450, e variantes e fragmentos desses

As composições da presente invenção incluem polinucleotídeos e polipeptídeos isolados de citocromo P450 que estão envolvidos na conversão metabólica da nicotina em nornicotina em plantas, incluindo variedades comerciais de plantas de tabaco. Em particular, as composições da invenção incluem polipeptídeos isolados que abrangem seqüências de aminoácidos como é mostrado nas SEQ ID N°s:2, 4, 6, 8, 10, e 12, e polinucleotídeos isolados que abrangem seqüências de nucleotídeos como é mostrado nas SEQ ID N°s:l, 3, 5, 7, 9, e 11. Os polinucleotídeos da invenção têm uso na inibição da expressão desses polipeptídeos do citocromo P450 ou variantes desses, que estão envolvidos na conversão metabólica da nicotina em nornicotina em plantas, particularmente plantas de tabaco.

Dessa maneira, a invenção ainda apresenta cassetes de expressão que abrangem toda ou uma porção da seqüência de polinucleotídeos mostrada nas SEQ ID N°: 1, 3, 5, 7, 9, ou 11, ou um complemento ou fragmento desses, ou uma seqüência que tenha uma identidade de seqüência substancial às SEQ ID N°: 1, 3, 5, 7, 9, ou 11, ou um complemento ou fragmento dessas, operacionalmente ligadas a um promoter que é funcional em uma célula de planta para uso na expressão de um transcrito de RNA inibidor que interfere na expressão (i.e, transcrição e/ou tradução) de polipeptídeos do citocromo P450 descritos aqui. Em algumas concretizações, os cassetes de expressão abrangem a seqüência de nucleotídeos como é mostrado nas SEQ ID N°13, 14, 15, ou 16, ou um complemento um fragmento desses, ou uma seqüência que tenha uma identidade de seqüência substancial às SEQ ID N°: 13, 14, 15, ou 16 ou complemento um fragmento dessas. A introdução desses cassetes de expressão para dentro de uma planta de Nicotiana de interesse, especialmente uma planta de tabaco de variedades geralmente conhecidas como variedades de fumeiro ou brilhante, variedades Burley, variedades escuras, e variedade Oriental/Turca, resulta na produção de plantas de tabaco que têm quantidades reduzidas de nornicotina e nitrosamina, W-nitrosonornicotina (NNN). A folha e o caule dessas plantas transgênicas podem ser usados para produzir uma variedade de produtos de tabaco que possuem níveis reduzidos de nornicotina, e uma redução concomitante desse metabólito de nitrosamina carcinogênico.

Os polinucleotídeos do citocromo P450 e polipeptídeos codificados da presente invenção representam uma nova família de genes do citocromo P450, designada de família de genes do citocromo P450 3D_C12, recentemente identificada por seu papel na conversão metabólica da nicotina em nornicotina em plantas de tabaco. A supressão da expressão de seus produtos de gene codificados nas plantas de tabaco transgênicas resulta em uma redução significativa da acumulação de nornicotina nas folhas dessas plantas transgênicas. Embora ainda não esteja vinculado à teoria, o papel metabólico desses polipeptídeos pode ser direto, i.e., catalisando diretamente a reação de /V-demetilação, ou indireto, i.e., na forma de produção de um produto que leva à regulação para cima da atividade de demetilase de nicotina da folha. Independentemente desse mecanismo, quaisquer meios pelos quais a expressão e/ou função dos polipeptídios codificados por membros desta família de genes do citocromo P450 são direcionados para a inibição dentro da planta de Nicotiana, e serão efetivos na redução dos níveis de nornicotina, e dos níveis de seus metabólitos carcinogênicos, NNN, dentro de folhas e caules dessas plantas.

Os genes do citocromo P450 da invenção foram isolados de linhagens de tabaco de uma variedade do tipo Burley. O primeiro desses genes do citrocromo P450, designado 3D_C12, codifica um transcrito de RNAm que corresponde aos nucleotídeos (nt) 1-1551 da seqüência de DNAc apresentada na SEQ ID N°: 1, que codifica o polipeptídio de comprimento inteiro de 517 resíduos apresentado na SEQ ID N°:2. O segundo membro dessa nova família de citocromo P450, designada 3D_C12-10, codifica um transcrito de RNAm que corresponde aos nucleotídeos (NT) 1-1551 da seqüência de DNAc apresentada na SEQ ID N°:3, que codifica o polipeptídeo de comprimento inteiro de 517 resíduos apresentado na SEQ ID N°:4. O terceiro desses genes de citocromo P450, designado 3D_C12-7, codifica um transcrito de RNAm que corresponde aos nt 1-155Ida seqüência de DNAc apresentada na SEQ ID N°:5, que codifica o polipeptídeo de comprimento inteiro de 517 resíduos apresentado na SEQ ID N°:6. O quarto membro dessa nova família de citocromo P45, designada 7D_A06, codifica um transcrito de RNAm que corresponde aos nt 1-1554 da seqüência de DNAc apresentada na SEQ ID Ν°:7, que codifica o polipeptídio de comprimento inteiro de 518 resíduos apresentado na SEQ ID N°:8.

Duas seqüências de genes P450 de comprimento parcial que compartilham uma alta identidade de seqüência para os membros de comprimento inteiro da família do gene 3D_C12 do citocromo P450 também foram isolados a partir dessas linhagens de tabaco Burley. O primeiro desses, designado 3D_C12-15, codifica um transcrito de RNAm que corresponde à seqüência de DNAc apresentada na SEQ ID N°:9, que codifica o polipeptídeo de comprimento parcial apresentado na SEQ ID N°: 10. a segunda seqüência de gene P450 de comprimento parcial, designada 131A_A02, codifica um transcrito de RNAm que corresponde à seqüência de DNAc apresentada na SEQ ID N°: 11, que codifica o polipeptídeo de comprimento parcial apresentado na SEQ ID N°: 12.

Sob um aspecto, os genes do citocromo P450da presente invenção estão envolvidos na conversão de nicotina em nornicotina em uma planta.Sob um aspecto, os genes do citocromo P450da presente invenção têm atividade de nicotina demetilase.

Um alinhamento dos membros da família de genes do citocromo P450 .3D_C12 é mostrado na Figura 3A-3G. As seqüências de aminoácidos previstas para os clones de comprimento inteiro estão alinhadas na Figura 4. Essas seqüências compartilham uma alta identidade de seqüência uma com a outra (no mínimo 90% do nível de nucleotídeo e de aminoácido (ver Tabelas 2 e 3, Exemplo 4, mostrados mais adiante)

A invenção abrange composições de polinucleotídeos ou proteínas isoladas ou substancialmente purificadas. Um polinucleotídeo ou proteína "isolada" ou "purificada" ou uma porção biologicamente ativa desses, é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham ou interagem com o polinucleotídeo ou proteína encontrados em sua ocorrência natural no ambiente. Portanto, um polinucleotídeo ou proteína isolada ou purificada é substancialmente livre de outro material celular, ou meio de cultura quando produzidos por técnicas recombinantes, ou substancialmente livre de precursores ou outros químicos quando quimicamente sintetizado. Da melhor forma, o polinucleotídeo "isolado" é livre de seqüências (otimamente seqüências codificadoras de proteína) que flanqueiam naturalmente o polinucleotídeo (i.e., seqüências localizadas nas extremidades 5' e 3' do polinucleotídeo) no DNA genômico do organismo a partir do qual o polinucleotídeo é derivado. Por exemplo, em várias concretizações, o polinucleotídeo isolado pode conter menos de cerca de 5 kb, 4 kb, .3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, ou 0.1 kb de seqüência de nucleotídeos que flanqueiam naturalmente o polinucleotídeo no DNA genômico da célula a partir da qual o polinucleotídeo é derivado. Uma proteína que é substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteína que têm menos de cerca de 30%, 20%, 10%, .5% ou 1% (por peso seco) de proteína contaminada. Quando a proteína da invenção ou uma porção biologicamente ativa dessa é produzida de maneira recombinante, o meio de cultura representa otimamente menos de cerca de 30%, 20%, 10%, 5%, ou .1% (por peso seco) de precursores químicos ou químicos que não constituem a proteína de interesse.

Fragmentos de polinucleotídeos do citocromo P450 aqui revelados e polipeptídios codificados desse modo também são abrangidos pela presente invenção. Fragmentos de um polinucleotídeo podem codificar fragmentos de proteína que retêm a atividade biológica da proteína nativa e por isso estão envolvidos na conversão metabólica da nicotina em nornicotina em uma planta. De modo alternativo, fragmentos de um polinucleotídeo que são úteis como probes de hibridização ou primers PCR que usam métodos descritos abaixo, geralmente não codificam fragmentos de proteína que retêm atividade biológica. Além do mais, fragmentos das seqüências de nucleotídeos reveladas aqui incluem aqueles que podem ser montados dentro de construtos recombinantes para uso no silenciamento do gene com qualquer método conhecido da técnica, incluindo, mas não se limitando a, supressão/cossupressão do senso, supressão antisenso, interferência de RNA de dupla hélice (RNAds), interferência de RNA de alça e interferência de RNA de alça contendo íntron, ribozimas, e RNA ou microRNA de baixa interferência, conforme descrito abaixo. Portanto, fragmentos de uma seqüência da polinucleotídeos do citocromo P450 podem variar de no mínimo cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 70 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos, cerca de 150 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos, cerca de 250 nucleotídeos, cerca de 300 nucleotídeos, cerca de 350 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos, e até o comprimento inteiro do polinucleotídeo que codifica as proteínas da invenção, dependendo do resultado desejado. Sob um aspecto, os fragmentos da seqüência da polinucleotídeos do citocromo P450 podem ser um fragmento com comprimento entre de cerca de 50 e cerca de 400 nucleotídeos, entre cerca de 70 e cerca de 350 nucleotídeos, entre cerca de 90 e de 325 nucleotídeos, entre cerca de 90 e cerca de 300 nucleotídeos, entre cerca de 90 e de 275 nucleotídeos, entre cerca de 100 e cerca de 400 nucleotídeos, entre cerca de 100 e cerca de 350 nucleotídeos, entre cerca de 100 e de 325 nucleotídeos, entre cerca de 100 e cerca de 300 nucleotídeos, entre cerca de 125 e de 300 nucleotídeos, ou entre cerca de 125 e cerca de 275 nucleotídeos. Em certas concretizações, um fragmento de polinucleotídeo do citocromo P450 tem comprimento de cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 100, de 125, cerca de 150, de 175, cerca de 200, cerca de 225, cerca de 250, cerca de 275, cerca de 300, cerca de 325, cerca de 350, cerca de 400 nucleotídeos, e outros valores como cerca de 70 e cerca de 400 nucleotídeos. Em outra concretização, um fragmento de um polinucleotídeo do citocromo P450 da invenção tem cerca de 90 bp a cerca de 110 bp de comprimento, incluindo 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, e 110 bp de comprimento. Em outra concretização, um fragmento de um polinucleotídeo do citocromo P450 da invenção tem cerca de 290 bp a cerca de 310 bp de comprimento, incluindo 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, e 310 bp de comprimento.

Um fragmento de um polinucleotídeo do citocromo P450 da presente invenção que codifica uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo do citocromo P450 da presente invenção codificará no mínimo 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, ou 500 aminoácidos contíguos, ou até o número total de aminoácidos presentes em um polipeptídeo do citocromo P450 de comprimento inteiro da invenção (por. ex., 517 para as ID SEQ N°s: 2, 4, e 6; e 518 para a ID SEQ N°:8), ou codificará no mínimo 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, ou até o número total of aminoácidos presentes no polipeptídeo do citocromo P450 de comprimento parcial da invenção (por ex., 173 para ID SEQ N°: 10; e 222 para a ID SEQ N°: 12). Sob um aspecto, um fragmento de um polinucleotídeo do citocromo P450 da presente invenção codifica uma polipeptídeo que abrange a posição 330 da seqüência de polipeptídeo codificada. Sob outro aspecto, o fragmento de polinucleotídeo codifica um fragmento de um polipeptídeo do citocromo P450, sendo que o fragmento do polipeptídeo abrange os aminoácidos da posição 225 até o fim do aminoácido na posição aproximada de 600 da ID SEQ N°:6. Em tal concretização, o fragmento de polinucleotídeo codifica um fragmento de polipeptídeo do citocromo P450, no qual o fragmento de polipeptídeo abrange aminoácidos da posição aproximada 239 até o fim do aminoácido na posição aproximada de 402 da ID SEQ N°:6. Uma porção biologicamente ativa do polipeptídeo do citocromo P450 pode ser preparada através do isolamento de uma porção de um dos polinucleotídeos do citocromo P450 da presente invenção, que expressa uma porção codificada do polipeptídeo do citocromo P450 (por ex., por expressão recombinante in vitro), para avaliar a atividade da porção codificada do polipeptídeo do citocromo P450, i.e., a capacidade de promover a conversão da nicotina em nornicotina, usando ensaios conhecidos da técnica e aqueles mostrados mais adiante.

Os polinucleotídeos que são fragmentos de uma seqüência de nucleotídeos do citocromo P450 da presente invenção abrangem no mínimo 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, ou 1700 nucleotídeos contíguos, ou até o número de nucleotídeos presentes em um polinucleotídeo do citocromo P450 de comprimento inteiro conforme revelado aqui (por ex., 539 para a ID SEQ N°:9; 666 para a ID SEQ N°: 11; 1733 para a ID SEQ N°s: 1, 3, e 5; e 1727 para a ID SEQ N°:7). Os polinucleotídeos que são fragmentos de uma seqüência de nucleotídeos do citocromo P450 da presente invenção abrangem fragmentos de cerca de 20 a cerca de 1700 nucleotídeos contíguos, de cerca de 50 a cerca de 1600 nucleotídeos contíguos, de cerca de 75 a cerca de 1500 nucleotídeos contíguos, de cerca de 100 a cerca de 1400 nucleotídeos, de cerca de 150 a cerca de 1300 nucleotídeos contíguos, de cerca de 150 a cerca de 1200 nucleotídeos contíguos, de cerca de 175 a cerca de 1100 nucleotídeos contíguos, ou de cerca de 200 a cerca de 1000 nucleotídeos contíguos do polinucleotídeo do citocromo P450, conforme revelado aqui.

Sob um aspecto, os fragmentos do polinucleotídeo do citocromo P450 abrangem uma seqüência de polinucleotídeos que contém nucleotídeos da posição aproximada de 700 à posição aproximada de 1250 de uma seqüência codificadora do citocromo P450. Sob outro aspecto, os fragmentos do polinucleotídeo do citocromo P450 abrangem uma seqüência de polinucleotídeos que contém nucleotídeos da posição aproximada de 715 à posição aproximada de 1210, ou da posição aproximada de 717 à posição aproximada de 1207 de uma seqüência codificadora do citocromo P450 revelada aqui.

Em outras concretizações da invenção, os fragmentos do polinucleotídeo do citocromo P450 abrangem uma seqüência de polinucleotídeos que contém nucleotídeos da posição aproximada de 265 à posição aproximada de 625 de uma 25 seqüência codificadora do citocromo P450 revelada aqui, ou um complemento dessa. Em algumas concretizações, os fragmentos da seqüência codificadora do citocromo P450 revelados aqui abrangem os nucleotídeos que correspondem à posição aproximada de 297 à posição aproximada de 594 da seqüência codificadora do P450 apresentada na ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5, ou um complemento dessas. 30 Em outras concretizações da invenção, os fragmentos do polinucleotídeo do

citocromo P450 abrangem uma seqüência de polinucleotídeos que contém nucleotídeos da posição aproximada de 1420 à posição aproximada de 1580 de uma seqüência codificadora do citocromo P450 revelada aqui, ou um complemento dessa. Em algumas dessas concretizações, os fragmentos da seqüência codificadora do citocromo P450 revelados aqui abrangem os nucleotídeos que correspondem à posição aproximada de 1453 à posição aproximada de 1551 da seqüência codificadora do P450 apresentada na ID SEQ N°: 1, ou um complementos dessa.

Variantes dos polinucleotídeos e polipeptídeos codificados desse modo também estão abrangidos pela presente invenção. Essas variantes de ocorrência natural incluem variantes que compartilham uma identidade de seqüência substancial com os polinucleotídeos e polipeptídeos do citocromo P450 revelados aqui, conforme definido mais adiante. As composições e métodos da invenção podem ser usados para direcionar a expressão ou função de qualquer citocromo P450 de ocorrência natural que compartilha uma identidade de seqüência substancial com os polipeptídeos do citocromo P450 revelados aqui, e que possuem a atividade relevante do citocromo P450, i.e., envolvimento na conversão metabólica da nicotina em nornicotina em plantas. Tais variantes podem resultar de, por exemplo, polimorfismo genético ou da manipulação humana, como ocorre com o cruzamento e seleção. Variantes biologicamente ativas de uma proteína do citocromo P450 da invenção, por exemplo, variantes do polipeptídeo apresentadas nas ID SEQ N°:2, 4, 6, 8, 10, ou 12, terão cerca de no mínimo 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, .91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácidos da proteína nativa, conforme determinado pelo programas de alinhamento de seqüência e parâmetros descritos aqui, e são caracterizadas por seu envolvimento funcional na conversão metabólica da nicotina em nornicotina em plantas. Uma variante biologicamente ativa de uma proteína pode diferir daquela proteína por apenas 1 a 15 resíduos de aminoácidos, apenas 10, apenas .9, apenas 8, apenas7, apenas 6, apenas 5, apenas 4, apenas 3, apenas 2, ou apenas 1 resíduo de aminoácido.

Variantes de um polinucleotídeo particular da presente invenção incluem aqueles polinucleotídeos de ocorrência natural que codificam um polipeptídeo do citocromo P450, o qual está envolvido na conversão metabólica da nicotina em nornicotina em plantas. Tais variantes de polinucleotídeos podem abranger uma deleção e/ou adição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios dentro do polinucleotídeo nativo revelado aqui e/ou uma substituição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios no polinucleotídeo nativo. Por causa da degeneração do código genético, variantes conservadoras para polinucleotídeos incluem aquelas seqüências que codificam a seqüência de aminoácidos para um dos polipeptídeos do citocromo P450 da invenção. Variantes de ocorrência natural como essas podem ser identificadas com o uso de técnicas bem conhecidas da biologia molecular, como por exemplo, uma reação da cadeia de polimerase (PCR) e técnicas de hibridização, conforme é descrito mais adiante. Polinucleotídeos variantes também incluem polinucleotídeos sinteticamente derivados, como aqueles gerados, por exemplo, pelo uso de mutagênese direcionada ao sítio, mas que ainda compartilham uma identidade de seqüência substancial com as seqüências de ocorrência natural reveladas aqui e, portanto, podem ser usados métodos da invenção para inibir a expressão ou função de um citocromo P450 envolvido na conversão metabólica de nicotina em nornicotina, incluindo os polipeptídeos do citocromo P450 apresentados nas ID SEQ N°s:2, 4, 6, e 8, e polipeptídeos que abrangem a seqüência apresentada na ID SEQ N°: 10 ou 12. Geralmente, variantes de um polinucleotídeo particular da invenção, por exemplo, a seqüência apresentada nas ID SEQ N°: 1, 3, 5, 7, 9, ou 11, terá cerca de no mínimo 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou maior identidade de seqüência com aquele polinucleotídeo particular determinado por programas de alinhamento de seqüência e parâmetros descritos aqui.

Variantes de um polinucleotídeo particular da presente invenção (também referido como o polinucleotídeo de referência) também podem ser avaliadas pela comparação da percentagem da identidade de seqüência entre o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de referência, e o polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo variante. Por exemplo, são revelados aqui polinucleotídeos isolados que codificam um polipeptídeo com uma percentagem de identidade de seqüência com o polipeptídeo de comprimento inteiro das ID SEQ N°:2, 4, 6, ou 8, ou um polipeptídeo de comprimento parcial codificado pela ID SEQ N°:9 ou 11. Tais polinucleotídeos podem ser usados em métodos da presente invenção para direcionar a expressão de polipeptídeos do citocromo P450 envolvidos na conversão metabólica da nicotina em nornicotina em plantas, particularmente plantas de tabaco, inibindo desse modo a acumulação de nornicotina e seu metabólito /V'-nitrosonornicotina nos caules e folhas de uma planta geneticamente modificada. A percentagem de identidade de seqüência entre dois polipeptídeos pode ser calculada com o uso de programas de alinhamento de seqüência e parâmetros descritos aqui. Quando qualquer par de polinucleotídeos da invenção é avaliado por comparação da percentagem da identidade de seqüência compartilhada pelos dois polipeptídeos que eles codificam, a percentagem da identidade de seqüência entre dois polipeptídeos codificados é no mínimo cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou maior identidade de seqüência. Sob um aspecto, um polipeptídeo variante da presente invenção inclui um polipeptídeo que tem um triptofano na posição 330 ou uma isoleucina na posição 274 do polipeptídeo do citocromo P450, ou ambos, i.e., triptofano na posição 330 e isoleucina na posição 274.

Além disso, os polinucleotídeos da invenção podem ser usados para isolar as seqüências de citocromo P450 a partir de outros organismos, particularmente outras plantas, mais particularmente outros membros do gênero Nicotiana. PCR, hibridização e outros métodos podem ser usados para identificar essas seqüências com base na sua homologia em relação às seqüências apresentadas aqui. Seqüências isoladas com base na identidade de seqüência relativa às seqüências de nucleotídeos apresentadas aqui ou às variantes e fragmentos dessas são incluídas pela presente invenção. Tais seqüências incluem seqüências que são ortólogas das seqüências reveladas aqui.

De acordo com a presente invenção, "ortólogos" são genes derivados de um gene ancestral comum que são encontrados em diferentes espécies como resultado da especiação. Genes encontrados em diferentes espécies são considerados ortólogos quando sua seqüências de nucleotídeos e/ou suas seqüências de proteína codificada compartilham no mínimo 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou uma maior identidade de seqüência. As funções dos ortólogos geralmente são muito conservadas entre as espécies. Portanto, polinucleotídeos isolados que codificam um polipeptídeo do citocromo P450 envolvido na conversão metabólica da nicotina em nornicotina e que hibridizam sob condições adversas com as seqüências do citocromo P450 reveladas aqui, ou com variantes ou fragmentos dessas, são abrangidos pela presente invenção. Tais seqüências podem ser usadas em métodos da presente invenção para inibir a expressão de polipeptídeos do citocromo P450 que estão envolvidos na conversão metabólica da nicotina em nornicotina em plantas. Usando o PCR, os primers de oligonucleotídeos podem ser desenhados para uso em reações PCR para amplificar as seqüências de DNA correspondentes a partir do DNAc ou DNA genômico extraído a partir de qualquer plantas de interesse. Métodos para desenhar primers de PCR e clonagem de PCR geralmente são conhecidos da técnica e são revelados em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2o ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis e Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); e Innis e Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Métodos de PCR incluem, mas não se limitam a, métodos que usam primers pareados, primers aninhados, primers específicos simples, primers degenerados, primers gene-específicos, primers vetor-específicos, primers parcialmente mal emparelhados, e semelhantes.

Técnicas de hibridização envolvem o uso de todos ou parte de polinucleotídeos conhecidos como uma sonda que hibridiza seletivamente com outros polinucleotídeos correspondentes presentes em uma população de fragmentos de DNA genômico clonados ou fragmentos de DNAc (i.e. bibliotecas de DNAc ou genômicas) a partir de um organismo escolhido.

A hibridização pode ser realizada sob condições estringentes. Por "condições estringentes" ou "condições de hibridização estringentes" entende-se condições sob as quais uma sonda irá hibridizar com sua seqüência alvo com um grau detectavelmente maior do que outras seqüências (por ex., no mínimo duas vezes à seqüência original). Condições estringentes são dependentes da seqüência e serão diferentes sob circunstâncias diferentes. Através do controle da estringência da hibridização e/ou condições de lavagem, as seqüências alvo que são 100% complementares a sonda podem ser identificadas (sonda homóloga). De modo alternativo, as condições estringentes podem ser ajustadas para permitir algum mau emparelhamento em seqüências, de modo que graus mais baixos de similaridade sejam detectados (sonda heteróloga). Geralmente, uma sonda é menor do que 1000 nucleotídeos de comprimento, otimamente menor do que 500 nucleotídeos de comprimento.

Tipicamente, as condições estringentes serão aquelas nas quais a concentração de sal é menor do que cerca de 1,5 M de concentração de íon Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M íon Na (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3 e temperatura de cerca de no mínimo 30°C. Condições estringentes também podem ser alcançadas pela adição de agentes desestabilizadores como a formamida. Condições exemplares de baixa estringência incluem a hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, 1 M NaCl, 1% SDS (dodecil sulfato de sódio) a 37°C, e uma lavagem em IX a 2X SSC (20X SSC = 3,0 M NaCl/0,3 M de citrato de trisódio) à temperatura de 50 a 55°C. Condições exemplares de moderada estringência incluem a hibridização em 40 a 45% de formamida, 1,0 M NaCl, 1% SDS a 37°C, e uma lavagem em 0,5X a IX SSC à temperatura de 55 a 60°C. Condições exemplares de alta estringência incluem a hibridização em 50% de formamida, 1,0 M NaCl, 1% SDS a 37°C, e uma lavagem em 0,1X SSC à temperatura de 60 a 65°C. Otimamente, tampões de lavagem podem abranger cerca de 0,1% a cerca de 1% SDS. A duração da hibridização é de geralmente menos de 24 horas, geralmente cerca de 4 a cerca de 12 horas. A duração do tempo de lavagem será de no mínimo um período de tempo suficiente para alcançar o equilíbrio.

Em uma concretização específica, condições de estringência incluem a hibridização em uma solução contendo 5X SSC, 0,5% SDS, 5X de Denhardt, 0,45 μg/μl de Poli A RNA, 0,45 μg/μl de timo de bezerro e 50% de formamida a 42°C, e no mínimo uma lavagem pós-hibridização em uma solução que inclua cerca d 0,0 IX SSC a cerca de IX SSC. A duração da hibridização é de aproximadamente 14 a 16 horas. A especificidade é geralmente a função das lavagens pós-hibridização, sendo os fatores críticos a força iônica e temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos DNA-DNA, a Tm pode ser aproximada a partir da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; em que M é a molaridade de cátions monovalentes, %GC é a percentagem de nucleotídeos de guanosina e citosina no DNA, % form é a percentagem de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do híbrido em pares de bases. A Tm é a temperatura (na definição de força iônica e pH) na qual o 50% de um seqüência alvo complementar hibridiza com uma sonda perfeitamente emparelhada. A Tm é reduzida cerca de 1°C para cada 1% de mau emparelhamento; portanto, Tm, hibridização, e/ou condições de lavagem podem ser ajustadas para hibridizar com seqüências da identidade desejada. Por exemplo, se forem buscadas seqüências com identidade >90%, a Tm pode ser diminuída 10°C. Geralmente, condições estringentes são selecionadas para serem cerca de menos de 5°C do ponto de fusão termal (Tm) para a seqüência específica e seus complementos em uma força iônica e pH definidos. Contudo, condições severamente estringentes podem utilizar a hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3, ou 4°C abaixo do ponto de fusão termal (Tm); condições moderadamente estringentes podem utilizar a hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9, ou IO0C abaixo ponto de fusão termal (Tm); condições de baixa estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem ali, 12, 13, 14, 15, ou 20°C abaixo do ponto de fusão termal (Tm). Usando a equação, as composições de hibridização e lavagem, e a Tm desejada, as pessoas habilitadas na técnica entenderão que as variações na estringência de hibridização e/ou soluções de lavagem são inerentemente descritas. Se o grau desejado de mau emparelhamento resultar em uma a Tm menor do que 45°C (solução aquosa) ou 32% (solução de formamida), é mais adequado aumentar a concentração de SSC de modo que uma temperatura mais alta possa ser usada. Um guia amplo para a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nueleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, New York); e Ausubel et ai, eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Ver Sambrook et ai. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). As sondas de hibridização podem ser fragmentos do DNA genômico, fragmentos de DNAc, fragmentos de RNA, ou outros oligonucleotídeos, e podem ser rotulados com um grupo detectável como as P, ou qualquer outro marcador detectável. Por exemplo, as sondas para hibridização podem ser feitas pela rotulagem de oligonucleotídeos sintéticos com base nas seqüências de polinucleotídeos do citocromo P450 da presente invenção. Métodos para a preparação de sondas para hibridização e construção de DNAc e bibliotecas genômicas são geralmente conhecidos da técnica e são revelados em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).

Por exemplo, seqüências de polinucleotídeos do citocromo P450 reveladas aqui, ou uma ou mais porções dessas, podem ser usadas como sondas capazes de hibridizar especificamente com polinucleotídeos do citocromo P450 correspondentes e com RNAs mensageiros. Para alcançar uma hibridização específica sob condições variadas, tais sondas incluem seqüências que são únicas entre as seqüências de polinucleotídeos do citocromo P450, incluindo regiões 5' à montante da seqüência codificadora e regiões 3' à jusante da seqüência codificadora, e é mais adequado terem um comprimento de cerca de no mínimo 10 nucleotídeos, e ainda mais adequado um comprimento de cerca de no mínimo 20 nucleotídeos. Tais sondas podem ser usadas para amplificar os polinucleotídeos do citocromo P450 correspondentes. Essa técnica pode ser usada para isolar seqüências codificadoras adicionais a partir de uma planta desejada, ou como um ensaio diagnóstico para determinar a presença de seqüências codificadoras em uma planta. Técnicas de hibridização incluem o rastreamento de hibridização de bibliotecas de DNA plaqueadas (sejam placas ou colônias; ver, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).

Conforme usado aqui, a respeito dos relacionamentos de seqüência entre dois ou mais polinucleotídeos ou polipeptídeos, o termo "seqüência de referência" é uma seqüência definida usada como base para comparação de seqüências. Uma seqüência de referência pode ser um subconjunto ou a totalidade de uma seqüência especificada; por exemplo, como um segmento de um DNAc de comprimento inteiro ou seqüência de genes, ou o DNAc completo ou seqüência de genes. Conforme usado aqui, o termo "janela de comparação" faz referência a um segmento contíguo e especificado de uma seqüência de polinucleotídeos, em que a seqüência de polinucleotídeos na janela de comparação pode abranger adições ou deleções (i.e., gaps) comparados com a seqüência de referência (que não abrange adições ou deleções) para o alinhamento ótimo dos dois polinucleotídeos. Geralmente, a janela de comparação tem no mínimo 20 nucleotídeos contíguos de comprimento, e opcionalmente pode ter 30, 40, 50, 100, ou mais. As pessoas habilitadas na técnica entenderão que para evitar uma alta similaridade com uma seqüência de referência, devido à inclusão de gaps na seqüência de polinucleotídeos, geralmente é introduzida uma penalidade por gap, e é subtraída do número de emparelhamentos.

Métodos para o alinhamento de seqüências para comparação são bem conhecidos da técnica. Portanto, a determinação da percentagem da identidade de seqüência entre duas seqüências quaisquer pode ser realizada com o uso de um algorismo matemático. Exemplos não limitantes de tais algoritmos matemáticos são o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABIOS 4:11-17; o algoritmo de alinhamento local de Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482 o algoritmo de alinhamento global de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; o método de alinhamento de busca-do-local de Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. 85:2444-2448; o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. ScL USA 872264, modificado em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877.

Os programas BLAST de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 são baseados no algoritmo de Karlin e Altschul (1990) supra. As buscas de nucleotídeos do BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTN, escore = 100, comprimento de palavra =12, para obter seqüências de nucleotídeos homólogos a uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína da invenção. As buscas de proteína do BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTX, escore = 50, comprimento de palavra = 3, para obter seqüências de aminoácidos homólogos a uma proteína ou polipeptídeo da invenção. Para obter alinhamentos em gap para fins de comparação, o Gapped BLAST (em BLAST 2.0) pode ser utilizado conforme descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. De modo alternativo, o PSI- BLAST (em BLAST 2.0) pode ser usado para realizar uma busca iterativa que detecta relacionamentos distantes entre moléculas. See Altschul et al. (1997) supra. Quando da utilização do BLAST, Gapped BLAST, e PSI-BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por ex., BLASTN para seqüências de nucleotídeos, BLASTX para proteínas) podem ser usados (Ver www.ncbi.nlm.nih.gov). O alinhamento também pode ser realizado manualmente por inspeção.

Os valores de identidade/similaridade de seqüência fornecidos aqui foram calculados com o uso do BLASTX (Altschul et ai. (1997) supra), Clustal W (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680), e os algoritmos GAP (pacote de software do Genetic Computing Group da Universidade de Wisconsin ) com o uso de parâmetros padrão. A presente invenção também abrange o uso de qualquer programa equivalente para análise e comparação de seqüências de ácido nucléico e proteína. Por "programa equivalente" entende-se qualquer programa de comparação de seqüência que, para duas seqüências quaisquer em questão, é gerado um alinhamento que tem emparelhamento idêntico de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos, e uma percentagem de identidade de seqüência idêntica quando comparados ao alinhamento correspondente gerado pelo BLASTX, Clustal W, ou GAP.

Para fins da discussão precedente sobre seqüências de nucleotídeos e polipeptídeos variantes abrangidos pela presente invenção, o termo "identidade de seqüência" ou "identidade" no contexto de duas seqüências de polinucleotídeos e polipeptídeos se refere aos resíduos das duas seqüências, que são os mesmos quando alinhados para a correspondência máxima em uma janela de comparação especificada. Quando a percentagem de identidade de seqüência é usada em relação a proteínas, reconhece-se que as posições de resíduo que não são geralmente idênticas diferem por meio da substituição de aminoácidos conservadores, sendo que os resíduos de aminoácidos são substituídos por outros resíduos de aminoácidos com propriedades químicas semelhantes (por ex., carga ou hidrofobicidade), e portanto, não modificam as propriedades funcionais da molécula. Quando as seqüências diferem por substituições conservadoras, a percentagem de identidade de seqüência pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservadora da substituição. Diz-se que as seqüências que diferem por tais substituições conservadoras têm "similaridade de seqüência" ou "similaridade". Meios para fazer esses ajustes são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Isso envolve tipicamente pontuar uma substituição conservadora como parcial em vez de um emparelhamento completo, aumentando dessa forma a percentagem da identidade de seqüência. Portanto, por exemplo, quando se dá a um aminoácido idêntico um escore de 1 e à substituição conservadora um escore de zero, dá-se à substituição conservadora um escore entre zero e 1. A contagem de substituições conservadoras é calculada, por ex., conforme implementado no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Califórnia).

O termo "percentagem de identidade de seqüência" usado aqui significa o valor determinado pela comparação entre duas seqüências otimamente alinhadas sobre uma janela de comparação, em que a porção da seqüência de polinucleotídeos na janela de comparação pode incluir adições ou deleções (i.e, gaps) quando comparada com a seqüência de referência (que não inclui adições ou deleções) para o alinhamento ótimo das duas seqüências. A percentagem é calculada através da determinação do número de posições nas quais a base de ácido nucléico idêntico ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas as seqüências, para dar o número de posições emparelhadas, dividindo o número de posições emparelhadas pelo total do número de posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100 para obter a percentagem da identidade de seqüência.

Quando dois polipeptídeos quaisquer estão otimamente alinhados para comparação, reconhece-se que os resíduos que aparecem opostos uns aos outros dentro do alinhamento ocupam posições dentro de seus respectivos polipeptídeos que correspondem uma a outra. Tais posições são chamadas aqui de "posições correspondentes" e os resíduos que residem nas posições correspondentes são chamados de "resíduos correspondentes" ou resíduos que "correspondem" uns aos outros. Portanto, por exemplo, quando um polipeptídeo de interesse está otimamente alinhado a uma seqüência de polipeptídeo de referência, que tenha por exemplo, 10 resíduos, o resíduo dentro do polipeptídeo de interesse que aparece oposto ao resíduo 5 da seqüência de referência é chamado de "resíduo na posição correspondente ao resíduo 5" da seqüência de referência.

De modo semelhante, quando duas seqüências de polinucleotídeos estão otimamente alinhadas para comparação, reconhece-se que os nucleotídeos que aparecem opostos uns aos outros dentro do alinhamento ocupam posições dentro de suas respectivas posições de polinucleotídeos que correspondem uma a outra. Tais posições são chamadas aqui de "posições correspondentes" e os nucleotídeos que residem nas posições correspondentes são chamados de "nucleotídeos correspondentes" ou nucleotídeos que "correspondem" um ao outro. Portanto, por exemplo, quando um polinucleotídeo de interesse está otimamente alinhado a uma seqüência de polinucleotídeos de referência que tenha, por exemplo, 300 nucleotídeos, o nucleotídeo dentro do polinucleotídeo de interesse que aparece oposto ao nucleotídeo 275 da seqüência de referência é chamado de "nucleotídeo na posição correspondente ao nucleotídeo 275" da seqüência de referência .

Quando uma região de nucleotídeos está sendo comparada entre um polinucleotídeo de interesse e um polinucleotídeo de referência, diz-se que os nucleotídeos dentro dessas regiões "correspondem' um ao outro. Portanto, por exemplo, quando uma região de uma seqüência de polinucleotídeos de referência, por exemplo, a seqüência de polinucleotídeos apresentada na ID SEQ N°:5, reside na posição de nucleotídeo 265 à posição de nucleotídeo 625 do polinucleotídeo de referência, e essa região de nucleotídeos está sendo comparada à região correspondente dos nucleotídeos dentro de uma seqüência de polinucleotídeos de interesse otimamente alinhada, os nucleotídeos dentro da região correspondente do polinucleotídeo de interesse são chamados aqui de uma "região" do polinucleotídeo de interesse que "corresponde à posição de nucleotídeo 265 à posição de nucleotídeo 625" da seqüência de referência, nesse caso, a ID SEQ N°:5.

As seqüências de polinucleotídeos e polipeptídeos do citocromo P450 podem ser identificadas usando as seqüências apresentadas aqui. Tais métodos incluem a obtenção de uma seqüência de polinucleotídeos ou polipeptídeos com no mínimo 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% de identidade de seqüência com a seqüência de polinucleotídeos das IDs SEQ N0 1, 3, 5, 7, 9, ou 11 ou um complemento ou fragmento dessas, ou uma seqüência de polipeptídeos das ID SEQ N°:2, 4, 6, 7, 10, ou 12. Em uma concretização, a seqüência identificada contém ou codifica um resíduo de triptofano na posição 330 e um resíduo de isoleucina na posição 274.

Dessa maneira, um aspecto da presente invenção é direcionado para um método de rastreamento de uma seqüência de nicotina demetilase. Esse método abrange a obtenção de uma seqüência de ácido nucléico que tem cerca de mais de 90% de identidade de seqüência com ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5, e a identificação, dentro dessa seqüência de ácido nucléico, de uma seqüência de códon que codifica um resíduo de triptofano na posição 330 do polipeptídeo codificado pela seqüência de ácido nucléico. Em algumas concretizações, essa seqüência de ácido nucléico codifica uma isoleucina na posição 274 do polipeptídeo codificado. Qualquer método adequado conhecido da técnica pode ser usado para identificar a seqüência de códons que codifica o resíduo de triptofano ou isoleucina. Em uma concretização, a seqüência de códons é identificada por um método selecionado a partir de um grupo que consiste na identificação de um polimorfismo de nucleotídeo simples e RT-PCR. Em algumas concretizações desse aspecto da invenção, o método de rastreamento identifica uma nicotina demetilase que converte a nicotina em nornicotina a uma taxa de cerca de no mínimo 5 vezes maior do que a taxa de conversão da nicotina demetilase codificada pela ID SEQ N°:3 (polipeptídeo apresentado na ID SEQ N°:4) ou ID SEQ N°:5 (polipeptídeo apresentado na ID SEQ N°:6). Em certas concretizações, a nicotina demetilase identificada com esse método de rastreamento tem uma taxa de conversão que é cerca de no mínimo 8 vezes maior do que a taxa de conversão da nicotina demetilase codificada pela ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.

Sob outro aspecto, a presente invenção apresenta um método para rastreamento de uma nicotina demetilase que tem uma isoleucina na posição 274 ou um triptofano na posição 329 do polipeptídeo. Esses métodos abrangem a obtenção de uma seqüência de ácido nucléico que tem cerca de mais de 90% de identidade de seqüência com ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5; e a identificação de uma primeira seqüência de códons para um resíduo de isoleucina na posição 274 do polipeptídeo codificado ou uma segunda seqüência de códons que codifica um resíduo de triptofano na posição 330 do polipeptídeo codificado. Como foi observado acima, qualquer método adequado conhecido de pessoas habilitadas na técnica pode ser usado para identificar esses códons. Em uma concretização, o primeiro ou segundo códon, ou ambos, são identificados por um método selecionado a partir de um grupo que consiste na identificação de um polimorfismo de nucleotídeo simples e RT-PCR. Em algumas concretizações desse aspecto da invenção, o método de rastreamento identifica uma nicotina demetilase que converte a nicotina em nornicotina a uma taxa de cerca de no mínimo 5 vezes maior do que a taxa de conversão da nicotina demetilase codificada pela ID SEQ N°:3 (polipeptídeo apresentado na ID SEQ N°:4) ou ID SEQ N°:5 (polipeptídeo apresentado na ID SEQ N°:6). Em certas concretizações, a nicotina demetilase identificada com esse método de rastreamento tem uma taxa de conversão que é cerca de no mínimo 8 vezes maior do que a taxa de conversão da nicotina demetilase codificada pela ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.

A presente invenção também apresenta células de plantas, plantas e sementes transgênicas que abrangem uma molécula de ácido nucléico que tem um promotor funcional em uma célula de planta, e uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma nicotina demetilase que tem um resíduo de isoleucina na posição 274 e um resíduo de triptofano na posição 330. Em algumas concretizações, a seqüência de ácido nucléico que codifica essa nicotina demetilase é derivada de uma seqüência selecionada do grupo que consiste das ID SEQ N°:3, ID SEQ N°:5, e ID SEQ N°:7. Essas células de plantas, plantas e sementes transgênicas incluem, mas não se limitam a, células de plantas de Nicotiana, plantas de Nicotiana,e sementes de plantas de Nicotiana. Em algumas concretizações, as células de plantas de Nicotiana, plantas de Nicotiana, e sementes de plantas de Nicotiana são de plantas de Nicotiana conversoras.

Cassetes de Expressão para Uso em Métodos da Invenção

Composições da presente invenção ainda incluem cassetes de expressão que abrangem seqüências inibidoras capazes de inibir a expressão ou função de um polipeptídeo de um citocromo P450 envolvido na conversão da nicotina em nornicotina em uma planta de Nicotiana ou parte dessa planta, em que as seqüências inibidoras estão operacionalmente ligadas a um promotor que é funcional em uma célula de planta. Dessa forma, são construídos cassetes de expressão que abrangem toda ou parte da seqüência apresentada nas ID SEQ N°: 1, 3, 5, 7, 9, ou 11, um complemento ou fragmento dessas, ou seqüências que compartilham uma identidade de seqüência substancial com as ID SEQ NO:l, 3, 5, 7, 9, 11, ou um complemento ou fragmento dessas, operacionalmente ligadas a um promotor que é funcional em uma célula de planta para uso em métodos de silenciamento de genes da presente invenção. Tais seqüências são chamadas aqui de "seqüências inibidoras" ou "seqüências de polinucleotídeos inibidoras" conforme elas sejam capazes de serem expressas como uma molécula de RNA que inibe a expressão (i.e., transcrição e/ou tradução) do polipeptídeo alvo do citocromo P450, por exemplo, os polipeptídeos apresentados nas ID SEQ N°:2, 4, 6, ou 8 e variantes dessas, ou um polipeptídeo que inclui a seqüência apresentada na ID SEQ N°: 10 ou 12 e variantes dessas, em que os polipeptídeos variantes têm um identidade de seqüência substancial com esses polipeptídeos do citocromo P450 revelados aqui, e estão envolvidos na conversão metabólica da nicotina em nornicotina em uma planta. Como observado acima, essas seqüências inibidoras incluem seqüências de fragmentos dos polinucleotídeos alvo do citocromo P450. Por exemplo, uma seqüência de fragmento pode incluir qualquer porção da seqüência do citocromo P450, incluindo a seqüência codificadora e não-codificadora (por ex., as seqüências 5' UTR, íntron, e 3' UTR), e pode incluir fragmentos entre cerca de 20 e cerca de 400 nucleotídeos, entre cerca de 50 e cerca de 400 nucleotídeos, entre cerca de 100 e cerca de 400 nucleotídeos, entre cerca de 125 e cerca de 325 nucleotídeos, entre cerca de 125 e cerca de 300 nucleotídeos, ou entre cerca de 125 e cerca de 275 nucleotídeos.

Dessa maneira, tais seqüências inibidoras incluem, mas não se limitam a, um fragmento de uma seqüência da polinucleotídeos do citocromo P450 que varia de no mínimo cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 70 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos, cerca de 150 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos, cerca de 250 nucleotídeos, cerca de 300 nucleotídeos, cerca de 350 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos, e até o comprimento inteiro do polinucleotídeo que codifica as proteínas da invenção, dependendo do resultado desejado. Sob um aspecto, as seqüências inibidoras abrangem um fragmento da seqüência da polinucleotídeo do citocromo P450 que possui entre cerca de 50 e cerca de 400 nucleotídeos, entre cerca de 70 e cerca de 350 nucleotídeos, entre cerca de 90 e cerca de 325 nucleotídeos, entre cerca de 90 e cerca de 300 nucleotídeos, entre cerca de 90 e cerca de 275 nucleotídeos, entre cerca de 100 e cerca de 400 nucleotídeos, entre cerca de 100 e cerca de 350 nucleotídeos, entre cerca de 100 e cerca de 325 nucleotídeos, entre cerca de 100 e cerca de 300 nucleotídeos, entre cerca de 125 e cerca de 300 nucleotídeos, ou entre cerca de 125 e cerca de 275 nucleotídeos de comprimento. Em certas concretizações, as seqüências inibidoras abrangem um fragmento de um polinucleotídeo do citocromo P450 que tem cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 125, cerca de 150, cerca de 175, cerca de 200, cerca de 225, cerca de 250, cerca de 275, cerca de 300, cerca de 325, cerca de 350, cerca de 400 nucleotídeos de comprimento, e outros valores entre cerca de 50 e cerca de 400 nucleotídeos. Admite-se que a seqüência inibidora também pode abranger uma seqüência que é complementar a todo ou parte do fragmento da seqüência de polinucleotídeo do citocromo P450.

Em uma concretização, as seqüências inibidoras abrangem um fragmento de um polinucleotídeo de um citocromo P450 da invenção que tem cerca de 90 pb (pares de bases) a cerca de 110 pb de comprimento, incluindo 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, e 110 pb de comprimento, e também podem abranger uma seqüência que é complementar a toda ou parte da seqüência do fragmento. Em outra concretização, um fragmento de um polinucleotídeo do citocromo P450 da invenção tem cerca de 290 pb a cerca de 310 pb de comprimento, incluindo 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, e 310 bp de comprimento, e também pode abranger uma seqüência que é complementar a toda ou parte da seqüência do fragmento.

Em outras concretizações da invenção, a seqüência inibidora dentro de um cassete de expressão da invenção abrange uma seqüência de polinucleotídeos que contém os nucleotídeos na posição aproximada de 265 à posição aproximada de 625 de uma seqüência codificadora do citocromo P450 revelada aqui, e uma seqüência que é completa ou parcialmente complementar a essa. Em algumas concretizações, a seqüência inibidora abrange os nucleotídeos correspondentes na posição aproximada de 297 à posição aproximada de 594 da seqüência codificadora de P450 apresentada na ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5 e uma seqüência que é completa ou parcialmente complementar a essa. Nas concretizações preferidas, essas seqüências inibidoras são expressas como um RNA em alça conforme descrito mais adiante.

Ainda em outras concretizações da invenção, a seqüência inibidora dentro de um cassete de expressão da invenção abrange uma seqüência de polinucleotídeos que contém os nucleotídeos na posição aproximada de 1420 à posição aproximada de 1580 de uma seqüência codificadora do citocromo P450 revelada aqui e uma seqüência que é completa ou parcialmente complementar a essa. Em algumas concretizações, a seqüência inibidora abrange os nucleotídeos correspondentes na posição aproximada de 1453 à posição aproximada de 1551 da seqüência codificadora apresentada na ID SEQ N°: 1 e uma seqüência que é completa ou parcialmente complementar a essa. Nas concretizações preferidas, essas seqüências inibidoras são expressas como um RNA em alça conforme descrito mais adiante.

Admite-se que os cassetes de expressão da presente invenção incluem construtos nos quais a seqüência de ácido nucléico desejada está operacionalmente ligada a um promotor que é funcional em uma célula de planta, particularmente na célula de uma planta de Nicotiana. Por "promotor" entende-se uma região reguladora de DNA que abrange geralmente uma caixa TATA capaz de conduzir a RNA polimerase II a iniciar a síntese de RNA no sítio de iniciação de transcrição apropriado para uma seqüência de nucleotídeo particular. Um promotor pode abranger adicionalmente outras seqüências de reconhecimento posicionadas geralmente à montante ou 5' para a caixa TATA, referidas como elementos de promotor à montante, que influenciam a taxa de iniciação de transcrição. Também se admite que os cassetes de expressão da presente invenção incluem domínios adicionais que modulam o nível de expressão, tempo de expressão, ou tipo de tecido em que a expressão ocorre em (por ex., Patente Australiana N°. AU-A-Ill51/94 e Patente dos EUA N°s. 5.466.785 e 5.635.618). Por "funcional" entende-se que o promotor, quando operacionalmente ligado a uma seqüência inibidora que codifica uma molécula inibidora de nucleotídeo (por exemplo, um RNA em alça, RNA dupla fita, polinucleotídeo de RNAmi, e semelhantes), o promotor é capaz de iniciar a transcrição da seqüência inibidora operacionalmente ligada de modo que a molécula do nucleotídeo inibidor seja expressa. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Os ácidos nucléicos podem ser combinados com promotores constitutivos, preferivelmente de tecidos, ou outros para a expressão em plantas.

Um cassete de expressão da presente invenção pode também conter no mínimo um gene adicional para ser cotransformado dentro da planta. De modo alternativo, o(s) gene(s) adicionais pode(m) ser fornecidos em cassetes de expressão múltipla. Tal cassete de expressão é fornecido com uma pluralidade de sítios de restrição e/ou sítios de recombinação para que a inserção da seqüência inibidora de polinucleotídeos do citocromo P450 ocorra sob a regulação transcricional das regiões reguladoras. O cassete de expressão pode conter adicionalmente genes marcadores selecionáveis.

Desse modo, um cassete de expressão da presente invenção inclui uma região de iniciação transcricional e traducional (i.e., um promotor) na direção de transcrição 5'-3', uma seqüência inibidora conforme descrito aqui, e uma região terminal transcricional e traducional (i.e., região terminal) funcional em uma célula de planta. As regiões reguladoras (i.e, promotores, regiões reguladoras transcricionais, e regiões reguladoras traducionais) e/ou a seqüência inibidora da invenção podem ser nativas/análogas à célula hospedeira ou uma a outra. De modo alternativo, as regiões reguladoras e/ou a seqüência inibidora da invenção podem ser heterólogas à célula hospedeira ou uma a outra. Apesar dos promotores heterólogos poderem ser usados para expressar seqüências inibidoras da invenção, seqüências de promotor nativas também podem ser usadas.

A região terminal pode ser nativa para a região de iniciação transcricional, pode ser nativa para a seqüência inibidora operacionalmente ligada da invenção, pode ser nativa para a planta hospedeira, ou pode ser derivada de outra fonte (i.e., externa ou heteróloga ao promotor, à seqüência inibidora de interesse, à planta hospedeira, ou qualquer combinação dessas). Regiões terminais convenientes estão disponíveis a partir do plasmídeo-Ti de A. tumefaciens, tais como regiões terminais de octopina sintase e nopalina sintase. Ver também Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Aeids Res. 15:9627-9639.

Os cassetes de expressão da presente invenção podem conter adicionalmente seqüências 5' líderes que podem atuar para intensificar a tradução. Líderes de tradução são conhecidos da técnica e incluem: líderes picornavírus, por exemplo, líder EMCV (região 5' não codificadora de Encefalomiocardite) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl Aead. Sei. USA 86:6126-6130); líderes potivírus, por exemplo, líder TEV (Tobacco Etch Vírus, em português,Vírus de Corrosão de Tabaco) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2):233-238), líder MDMV (Maize Dwarf Mosaic Virus, em português,Vírus do Mosaico Anão do Milho) (Virology 154:9-20), e proteína de ligação de cadeia pesada da imunoglobulina (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94); líder não traduzido da proteína de RNAm de cabra do vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); vírus líder do mosaico do tabaco (TMV, tobacco mosaic vírus) (Gallie et al. (1989) in Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp. 237-256); e vírus líder do milho mosqueado clorótico (MCMV, maize chlorotic mottle virus ) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Ver também, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968. Outros métodos conhecidos para intensificar a tradução também podem ser utilizados.

Na preparação do cassete de expressão, fragmentos de DNA da invenção podem ser manipulados de modo a preparar as seqüências de DNA na orientação adequada e, conforme apropriado, no quadro de leitura adequado. Adaptadores ou ligadores podem ser empregados para juntar os fragmentos de DNA ou podem estar envolvidas outras manipulações para preparar sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição, ou semelhantes. Para esse fim, podem estar envolvidos a mutagênese, reparo de primer, restrição, recozimento, resubstituições, por ex. transições e transversões.

Os cassetes de expressão da presente invenção também podem abranger um gene marcador selecionável para seleção de células transformadas. Os genes marcadores selecionáveis são utilizados para expressão de células ou tecidos transformados. Genes marcadores incluem genes que codificam a resistência a antibióticos, como aqueles que codificam neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), bem como genes que conferem resistência a compostos herbicidas, tais como o glufosinato de amônio, bromoxinil, imidazolinonas, e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Marcadores selecionáveis adicionais incluem marcadores fenotípicos como a β- galactosidase e proteínas fluorescentes como a proteína fluorescente verde (green fluorescent protein, GFP) (Rouwendal et al. (1997) Plant Mo. Biol. 33:989-999; Su et al. (2004) Biotechnol Bioeng £3:610-9 e Fetter et al. (2004) Plant Cell 16:215-28), proteína fluorescente ciano (cyan florescent protein, CYP) (Bolte et al. (2004) J. Cell Science 777:943-54 e Kato et al. (2002) Plant Physiol 729:913-42), e proteína fluorescente amarela (yellow fluorescent protein, PhiYFP™) da Evrogen, ver, Bolte et al. (2004) J. Cell Science 777:943-954). Para marcadores selecionáveis adicionais, ver Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley et al. (1980) em The Operon, pp. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566; Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Figge et al. (1988) Cell 52:713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86:5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Tese de Ph.D., University of Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt et al (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Tese de Ph.D., University of Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:5547- 5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al. (1988) Nature 334:721-724. Tais descobertas estão incorporadas aqui por referência. A lista de genes marcadores selecionáveis acima não pretende ser limitante. Qualquer gene marcador selecionável pode ser usado na presente invenção.

Vários promotores podem ser usados na prática da invenção. De interesse particular são os promotores constitutivos, promotores induzíveis, particularmente ou promotores quimicamente induzíveis, e promotores que preferem tecidos, particularmente promotores que preferem folhas.

Os promotores quimicamente induzíveis podem ser usados para inibir a expressão de um citocromo P450 que está envolvido na conversão metabólica da nicotina à nornicotina em uma planta através da aplicação de um regulador químico exógeno. Os promotores quimicamente induzíveis são conhecidos da técnica e incluem, mas não se limitam a, promotor PR-Ia do tabaco, que é ativado pelo ácido salicílico. Outros promotores quimicamente induzíveis de interesse incluem os promotores responsivos a esteróides (ver, por exemplo, o promotor induzível por glucocorticóide em Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:10421-10425 e McNellis et al. (1998) Plant J. 14(2):247-257) e promotores induzíveis por tetraciclina (ver, por exemplo, Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237, e patentes do EUA N°s. 5.814.618 e 5.789.156), incorporadas aqui por referência. Promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor core do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos revelados nas Patentes do EUA N0 6.072.050; o promotor core de CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); ubiquitina (Christensen et al. (1989) PIant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (Patente dos EUA No. 5.659.026), e semelhantes. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, Patentes dos EUA N°s 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; e 6.177.611. Promotores que preferem tecidos podem ser utilizados para direcionar a expressão de uma seqüência inibidora de polinucleotídeo da presente invenção dentro de um tecido específico de planta. Promotores que preferem tecidos incluem Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol 38(7):792- 803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol 112(3): 1331- 1341; Van Camp et al (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) PlantMolBiol 23(6): 1129-1138; Matsuoka et al (1993) ProcNatl. Acad. Sei. USA 90(20):9586-9590; e Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505.

De interesse particular são os promotores que preferem folhas, que apresentam expressão predominantemente em tecidos de folhas. Ver, por exemplo, Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol 35(5):773-778; Gotor et al. (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6): 1129-1138; Baszczynski et al. (1988) Nucl. Acid Res. 16:4732; Mitra et al. (1994) Plant Molecular Biology 26:35-93; Kayaya et al (1995) Molecular and General Genetics 248:668-674; e Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90(20):9586-9590. Também são usados genes regulados por senescência, como o SAM22 (Crowell et al. (1992) Plant Mol. Biol. 75:459-466); SAG12 (Lohman et al. (1994) Physiol Plant. 92:322-328; Wingler et al. (1998) Plant Physiol 116:329-335); SAG 13 (Gan e Amasino (1997) Plant Physiol 113:313-319; SAG15 (Gan (1995) "Molecular Characterization and Genetic Manipulation of Plant Senescence," Tese de Ph.D., University of Wisconsin, Madison); SENl (Oh et al (1996) Plant Mol Biol 30:739-754; promotor de um gene específico de senescência para expressão de IPT (Gan e Amasino 91995) Science 270:1986-1988); e semelhantes (ver, por exemplo, Ou: et al. (1999) Plant Cell 11:1073-1080 e McCabe et al. (2001) Plant Physiol. 127:505-516). Métodos para inibição da expressão ou função de um citocromo P450 envolvido na conversão de nicotina a nornicotina

Apresenta-se aqui métodos para a redução da concentração do conteúdo, e/ou atividade de um polipeptídeo de um citocromo P450 da presente invenção em uma planta de Nicotiana ou parte de planta, particularmente o tecido da folha. Muitos métodos podem ser usados, sozinhos ou em combinação, para reduzir ou eliminar a atividade de um polipeptídeo do citocromo P450 da presente invenção. Além disso, combinações de métodos podem ser empregadas para reduzir ou eliminar a atividade de dois ou mais polipeptídeos diferentes de citocromo P450.

De acordo com a presente invenção, a expressão de um polipeptídeo do citocromo P450 da presente invenção é inibido se o nível de proteína do polipeptídeo do citocromo P450 é estatisticamente mais baixo do que o nível de proteína do mesmo polipeptídeo do citocromo P450 em uma planta que não foi geneticamente modificada ou mutagenizada para inibir a expressão daquele polipeptídeo do citocromo P450, quando essas plantas foram cultivadas e colhidas com o uso dos mesmos protocolos. Em concretizações particulares da invenção, o nível de proteína do polipeptídeo do citocromo P450 em uma planta modificada de acordo com a invenção é menor que 95%, menor que 90%, menor que 80%, menor que 70%, menor que 60%, menor que 50%, menor que 40%, menor que 30%, menor que 20%, menor que 10%, menor que 5%, menor que 4%, menor que 3%, menor que 2%, ou menor que 1% do nível de proteína do mesmo polipeptídeo do citocromo P450 em uma planta que não é mutante ou que não tenha sido geneticamente modificada para inibir a expressão daquele polipeptídeo do citocromo P450 e que foi cultivada e colhida com o uso dos mesmos protocolos . O nível de expressão do polipeptídeo do citocromo P450 pode ser medido diretamente, por exemplo, por ensaio do nível do transcrito do citocromo P450 ou polipeptídeo do citocromo P450 expresso na planta ou parte de planta de Nicotiana1 ou indiretamente, por exemplo, por mensuração da conversão de nicotina em nornicotina na planta ou parte de planta de Nicotiana. Métodos para monitorar o nível de expressão de uma proteína são conhecidos da técnica, e incluem, mas não se limitam a, análise de Northern blot, conforme discutido nos exemplos mostrados adiante. Métodos para determinação da atividade do polipeptídeo alvo do citocromo P450 na conversão de nicotina em nornicotina são descritos mais adiante, e incluem, mas não se limitam a, análise de alcalóide com uso de cromatografia gasosa, como por exemplo, os procedimentos descritos nos exemplos mostrados abaixo.

Em outras concretizações da invenção, a atividade de um ou mais polipeptídeos do citocromo P450 é reduzida ou eliminada pela transformação de uma planta ou parte de planta com um cassete de expressão que abrange um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que inibe a atividade de um ou mais polipeptídeos do citocromo P450 da presente invenção. A atividade do polipeptídeo do citocromo P450 na conversão de nicotina em nornicotina em uma planta ou parte de planta de Nicotiana é inibida de acordo com a presente invenção, se essa atividade de conversão é estatisticamente mais baixa do que atividade de conversão do mesmo do polipeptídeo do citocromo P450, em uma planta ou parte de planta de Nicotiana que não foi geneticamente modificada para inibir a atividade de conversão daquele polipeptídeo do citocromo P450, e que foi cultivada e colhida com o uso dos mesmos protocolos. Em concretizações particulares, a atividade do polipeptídeo do citocromo P450 na conversão de nicotina em nornicotina em uma planta ou parte de planta de Nicotiana de acordo com a invenção é inibida se a atividade é menor que 95%, menor que 90%, menor que 80%, menor que 70%, menor que 60%, menor que 50%, menor que 40%, menor que 30%, menor que 20%, menor que 10%, menor que 5%, menor que 4%, menor que 3%, menor que 2%, ou menor que 1% da atividade de conversão do mesmo polipeptídeo do citocromo P450 em uma planta Nieotiana que tenha sido geneticamente modificada para inibir a expressão daquele polipeptídeo do citocromo P450 e que foi cultivada e colhida com o uso dos mesmos protocolos. A atividade do polipeptídeo do citocromo P450 na conversão da nicotina em nornicotina em uma planta ou parte de planta de Nieotiana é eliminada de acordo com a invenção quando ela não é detectável pelos métodos de ensaio descritos aqui. Métodos de determinação da atividade de um polipeptídeo do citocromo P450 na conversão da nicotina em nornicotina em uma planta ou parte de planta de Nieotiana são descritos aqui, e incluem as análises de alcalóide com o uso de cromatografia gasosa reveladas nos exemplos abaixo.

Em concretizações específicas, uma seqüência inibidora do citocromo p450 descrita aqui é introduzida em uma planta ou parte de planta de Nieotiana. Subseqüentemente, a planta ou parte de planta de Nieotiana que tem a seqüência inibidora de polinucleotídeo da invenção é selecionada usando métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica como, mas não se limitando a, análise de Southern blot, sequenciamento de DNA, análise de PCR, ou análise fenotípica. Uma planta ou parte de planta alterada ou modificada através das concretizações anteriores é crescida sob condições de criação de plantas por tempo suficiente para modular a concentração e/ou atividade de polipeptídeos da presente invenção na planta. Condições de criação de plantas são bem conhecidas e discutidas brevemente mais adiante.

Em algumas concretizações, uma planta transformada de tabaco contendo uma seqüência inibidora de polinucleotídeo de um citocromo P450 descrito aqui tem um nível reduzido de conversão de nicotina em nornicotina. Em concretizações particulares, a conversão de nicotina em nornicotina em uma planta ou parte de planta transformada de tabaco de acordo com a invenção é menor que 95%, menor que 90%, menor que 80%, menor que 70%, menor que 60%, menor que 50%, menor que 40%, menor que 30%, menor que 20%, menor que 10%, menor que 5%, menor que 4%, menor que 3%, menor que 2%, ou menor que 1% da conversão em uma planta de tabaco que não tenha sido geneticamente modificada para inibir a expressão daquele polipeptídeo do citocromo P450 e que foi cultivada e colhida com o uso dos mesmos protocolos. Em algumas concretizações, a planta transformada de tabaco é uma planta de tabaco conversora. Em algumas concretizações, a planta de tabaco transformada tem um taxa de conversão mais baixa do que a taxa observada em plantas de tabaco não-conversoras comerciais.

Também se admite que o nível e/ou atividade do polipeptídeo pode ser modulado pelo emprego de um polinucleotídeo que não é capaz de dirigir, em uma planta transformada, a expressão de uma proteína ou RNA. Por exemplo, os polinucleotídeos da invenção podem ser usados para desenhar construtos de polinucleotídeos que podem ser empregados em métodos para alterar o mutar uma seqüência genômica em um organismo. Tais construtos de polinucleotídeos incluem, mas não se limitam a, vetores RNA:DNA, vetores mutacionais RNA:DNA, vetores de reparo RNA:DNA, oligonucleotídeos duplex mistos, oligonucleotídeos de RNA:DNA autocomplementares, e oligonucleases recombinogênicas.Tais construtos de nucleotídeos e métodos de uso são conhecidos da técnica. Ver Patente dos EUA n°s .5.565.350; 5.731.181; 5.756.325; 5.760.012; 5.795.972; e 5.871.984; todas as quais estão aqui incorporadas por referência. Ver também, WO 98/49350, WO 99/07865, WO 99/25821, e Beetham et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96:8774-8778; incorporados aqui por referência.

Portanto admite-se que os métodos da presente invenção não dependem da incorporação do polinucleotídeo inibidor inteiro do citocromo P450 dentro do genoma, somente que aquela planta ou parte de planta Nicotiana é alterada como resultado da introdução desse polinucleotídeo inibidor dentro de uma célula. Em uma concretização da invenção, o genoma pode ser alterado logo após a introdução do polinucleotídeo inibidor do citocromo P450 dentro de uma célula. Por exemplo, o polinucleotídeo inibidor, ou qualquer parte desse, pode se incorporar dentro do genoma da planta. Alterações do genoma incluem, mas não se limitam a, adições, deleções, e substituições de nucleotídeos dentro do genoma. Embora os métodos da presente invenção não dependam de adições, deleções, e substituições de qualquer número específico de nucleotídeos, admite-se que essas adições, deleções, e substituições abrangem no mínimo um nucleotídeo.

Admite-se ainda que a redução do nível e/ou atividade de uma seqüência do citocromo P450 da presente invenção pode ser realizada para extrair os efeitos da seqüência somente durante certos estágios de desenvolvimento e para desligar o efeito em outros estágios em que a expressão não é mais desejável. O controle da expressão do citocromo P450 pode ser obtido através do uso de promotores com preferência por tecidos ou induzíveis. De modo alternativo, o gene poderia ser invertido ou deletado usando recombinases sítio-específicas, transposons ou sistemas de recombinação, que também ligariam ou desligariam a expressão da seqüência do citocromo P450.

De acordo com a presente invenção, mudanças nos níveis, proporções, atividade, ou distribuição de polipeptídeos do citocromo P450 da presente invenção, ou mudanças no fenótipo da planta ou parte de planta Nicotiana, particularmente a acumulação reduzida de nicotina e seu metabólito carcinogênico, NNN, poderiam ser medidas por comparação de uma planta ou parte de planta-sujeito com uma planta ou parte de planta-controle, em que a planta ou parte de planta-sujeito e a planta ou parte de planta-controle tenham sido cultivadas e/ou colhidas com o uso dos mesmos protocolos. Conforme usado aqui, uma planta ou parte de planta-sujeito é uma planta na qual a alteração genética, como uma transformação, foi influenciada quanto ao polipeptídeo de interesse, ou uma planta ou parte de planta Nicotiana que descende de uma planta ou parte de planta Nicotiana assim alterada e que abrange a alteração. Uma planta ou parte de planta controle apresenta um ponto de referência para medir mudanças no fenótipo da planta ou parte da planta-sujeito.

A medição de mudanças no fenótipo pode ser feita em qualquer tempo em uma planta ou parte de planta, incluindo durante o desenvolvimento, senescência, ou após a cura da planta. Em outras concretizações, a medição de mudanças no fenótipo pode ser medida em plantas crescidas sob quaisquer condições, incluindo plantas crescidas em uma câmara de crescimento, estufa, ou no campo. Em uma concretização, as mudanças no fenótipo podem ser medidas pela determinação da taxa de conversão de nicotina em nornicotina. Em uma concretização preferida, a conversão pode ser medida através da divisão da percentagem de nicotina (como uma percentagem do peso total do tecido) pela soma da percentagem de nicotina em nornicotina (como percentagens do peso total do tecido) e multiplicando por 100.

De acordo com a presente invenção, uma planta ou parte de planta-controle pode abranger uma planta ou parte de planta selvagem de Nicotiana, i.e., do mesmo genótipo como material de partida para a alteração genética que resultou na planta ou parte de planta-sujeito. Uma planta ou parte de planta-controle também pode abranger uma planta ou parte de planta de Nicotiana do mesmo genótipo como material de partida, mas que tenha sido transformada com um construto nulo (i.e, com um construto que tem um efeito conhecido sobre o traço de interesse, tal como um construto que abrange um gene marcador selecionável). De modo alternativo, uma planta ou parte de planta-controle pode abranger uma planta ou parte de planta de Nicotiana que é uma segregante não transformada entre uma progênie de uma planta ou parte de planta-sujeito, ou uma planta ou parte de planta de Nicotiana geneticamente idêntica à planta ou parte de planta-sujeito, que não é exposta a condições ou estímulos que induzam a supressão do gene do citocromo P450 de interesse. Por fim, uma planta ou parte de planta-controle pode abranger a planta ou parte de planta-sujeito em si sob condições nas quais a seqüência inibidora do citocromo P450 não é expressa. Em todos os casos, a planta ou parte de planta-sujeito e a planta ou parte de planta-controle são cultivadas e colhidas usando os mesmos protocolos.

Conforme descrito aqui, os métodos são apresentados para reduzir ou eliminar a atividade e/ou concentração do polipeptídeo do citocromo P450 da presente invenção pela introdução, dentro de uma planta ou parte de planta Nicotiana, de uma seqüência de polinucleotídeos inibidora do citocromo P450 que está envolvida na conversão metabólica da nicotina em nornicotina. Em algumas concretizações, as seqüências inibidoras são introduzidas pela transformação da planta ou parte de planta, tal como uma célula de planta, com um cassete de expressão que expressa um polinucleotídeo que inibe a expressão do polipeptídeo do citocromo P450. O polinucleotídeo pode inibir diretamente a expressão de um polipeptídeo do citocromo P450, impedindo a tradução do RNA mensageiro do polipeptídeo do citocromo P450, ou indiretamente, pela codificação de um polipeptídeo que inibe a transcrição ou tradução de um gene de polipeptídeo do citocromo P450 que codifica um polipeptídeo do citocromo P450. Métodos para inibição ou eliminação da expressão de um produto de gene em uma planta são bem conhecidos da técnica, e quaisquer desses métodos podem ser usados na presente invenção para inibir a expressão de polipeptídeos do citocromo P450.

Em outras concretizações, a atividade de um polipeptídeo do citocromo P450 da presente invenção pode ser reduzida ou eliminada através da disrupção do gene que codifica o polipeptídeo do citocromo P450. A invenção abrange plantas mutagenizadas que carregam mutações nos genes do citocromo P450, sendo que a mutações reduzem a expressão do gene do citocromo P450 ou inibem a atividade de um polipeptídeo do citocromo P450 codificado da presente invenção.

Em algumas concretizações da presente invenção, uma planta ou parte de planta de Nicotiana é transformada com um cassete de expressão capaz de expressar um polinucleotídeo que inibe a expressão de uma seqüência de um citocromo P450. Tais métodos podem incluir o uso supressão/cossupressão senso, ou supressão antisenso, interferência de RNA dupla fita (RNAds), interferência de RNA em alça e interferência de RNA em alça contendo íntron, interferência mediada por amplicon, ribozimas, e pequena interferência de RNA ou micro RNA.

Para a cossupressão, um cassete de expressão é desenhado para expressar uma molécula de RNA correspondente a todo ou parte de um RNA mensageiro que codifica um polipeptídeo do citocromo P450 de interesse (por exemplo, um polipeptídeo do citocromo P450 que abrange a seqüência apresentada nas ID SEQ N°:2, 4, 6, 8, 10, ou 12 ou uma seqüência que tem uma identidade de seqüência substancial às ID SEQ N°:2, 4, 6, 8, 10, ou 12) na orientação "senso". A expressão excessiva da molécula de RNA pode resultar na redução da expressão do gene nativo. Linhagens múltiplas de plantas transformadas com o cassete de expressão de cossupressão são então rastreadas para identificar aquelas que mostram a maior inibição da expressão do polipeptídeo do citocromo P450.

O polinucleotídeo usado para a cossupressão pode corresponder a toda ou parte da seqüência que codifica um polipeptídeo do citocromo P450 da presente invenção, toda ou parte da região 5' e/ou 3' não traduzida de um transcrito de polipeptídeo do citocromo P450, ou toda ou parte da seqüência codificadora, bem como das regiões não traduzidas de um transcrito que codifica um polipeptídeo do citocromo P450. Em algumas concretizações em que o polinucleotídeo abrange toda ou parte da região codificadora para um polipeptídeo do citocromo P450 da presente invenção, o cassete de expressão é desenhado para eliminar o códon de partida do polinucleotídeo, de modo que nenhum produto de proteína seja transcrito.

A cossupressão pode ser usada para inibir a expressão de genes de plantas para produzir plantas que têm níveis de proteína não detectáveis para as proteínas que codificam através desses genes ou pode também ser usada para inibir a expressão de múltiplas proteínas na mesma planta (por ex., Broin et al. (2002) Plant Cell 14:1417- .1432; Patente dos EUA N°. 5.942.657). Métodos para usar a cossupressão para inibir a expressão de genes endógenos em plantas são descritos em Flavell et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:3490-3496; Jorgensen et al. (1996) Plant Mol Biol .31:957-973; Johansen and Carrington (2001) Plant Physiol. 126:930-938; Broin et al. (2002) Plant Cell 14:1417-1432; Stoutjesdijk et al (2002) Plant Physiol 129:1723- .1731; Yu et al. (2003) Phytochemistry 63:753-763; Patentes dos EUA N°s. .5.034.323, 5.283.184, e 5.942.657; cada uma das quais está incorporada aqui por referência. A eficiência da cossupressão pode ser aumentada incluindo-se uma região poli-dT no cassete de expressão na posição 3' para a seqüência senso e 5' do sinal de poliadenilação. Ver a Publicação de Patente dos EUA N°. 20020048814, incorporada aqui por referência. Tipicamente, tal seqüência de nucleotídeos tem uma identidade de seqüência substancial em relação à seqüência do transcrito do gene endógeno, com identidade de seqüência otimamente maior do que 65%, mais otimamente maior do que 85%, e otimamente muito maior do que 95% (por ex., Patentes dos EUA N°s .5.283.184 e 5.034.323), incorporadas aqui por referência.

Em algumas concretizações da invenção, a inibição da expressão do polipeptídeo do citocromo P450 da presente invenção pode ser obtida através da supressão antisenso. Para a supressão antisenso, o cassete de expressão é desenhado para expressar uma molécula de RNA complementar a todo ou parte do RNA mensageiro que codifica o polipeptídeo do citocromo P450. A expressão excessiva da molécula de RNA antisenso pode resultar na redução da expressão do gene nativo. Consequentemente, linhagens múltiplas de plantas transformadas com o cassete de expressão de supressão antisenso são rastreadas para identificar aquelas que mostram a maior inibição da expressão do polipeptídeo do citocromo P450.

O polinucleotídeo usado para supressão antisenso pode corresponder a todo ou parte do complemento da seqüência que codifica um polipeptídeo do citocromo P450, toda ou parte da região 5' e/ou 3' não traduzida de um transcrito do polipeptídeo do citocromo P450, ou todo ou parte do complemento da seqüência codificadora e das regiões não traduzidas de um transcrito que codifica um polipeptídeo do citocromo P450. Além disso, o polinucleotídeo antisenso pode ser completamente complementar (i.e. 100% idêntico ao complemento da seqüência alvo) ou parcialmente complementar (i.e., menos de 100% idêntico ao complemento da seqüência alvo) à seqüência alvo. A supressão antisenso também pode ser usada para inibir a expressão de múltiplas proteínas na mesma planta (por ex., Patente dos EUA N°. 5.942.657). Além disso, porções dos nucleotídeos antisenso podem ser usadas para a disrupção da expressão do gene alvo. Geralmente podem ser usadas seqüências de no mínimo 50 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 200 nucleotídeos, 300, 400, 450, .500, 550, ou maiores. Métodos de uso da supressão antisenso para inibir a expressão de genes endógenos são descritos, por exemplo, em Liu et al (2002) Plant Physiol. .129:1732-1743 e Patentes do EUA N°s. 5.759.829 e 5.942.657; cada uma das quais está incorporada aqui por referência. A eficiência da supressão pode ser aumentada incluindo-se uma região poli-dT no cassete de expressão na posição 3' para a seqüência senso e 5' do sinal de poliadenilação. Ver, Publicação de Patente dos EUA N°. 20020048814, incorporada aqui por referência.

Para a interferência de RNAds, uma molécula de RNA senso como aquela descrita acima para a cossupressão e uma molécula de RNA antisenso que é completa ou parcialmente complementar à molécula de RNA senso são expressas na mesma célula, resultando na inibição da expressão do RNA mensageiro endógeno correspondente. A expressão das moléculas senso e antisenso pode ser obtida através do desenho do cassete de expressão para abranger ambas as seqüências, senso e a antisenso, para a seqüência do citocromo P450 alvo. De modo alternativo, cassetes de expressão separados podem ser usados para as seqüências senso e antisenso.

Linhagens múltiplas de plantas transformadas com o cassete de expressão de interferência de RNAds ou cassetes de expressão são então rastreadas para identificar linhagens de plantas que mostram a maior inibição da expressão do polipeptídeo do citocromo P450 alvo. Métodos para uso de interferência de RNAds para inibir a expressão de genes endógenos em plantas são descritos em Waterhouse et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:13959-13964, Liu et al (2002) Plant Physiol .129:1732-1743, e WO 99/49029, WO 99/53050, WO 99/61631, e WO 00/49035; cada um dos quais está incorporado aqui por referência.

Cassetes de expressão de amplicon abrangem uma seqüência derivada de vírus de planta que contém todo ou parte do gene alvo, mas geralmente não todos os genes do vírus nativo. As seqüências virais presentes no produto da transcrição do cassete de expressão permitem que o produto da transcrição dirija sua própria replicação. Os transcritos produzidos pelo amplicon podem ser senso ou antisenso em relação à seqüência alvo (i.e, o RNA mensageiro para um polipeptídeo do citocromo P450 que está envolvido na conversão metabólica de nicotina em nornicotina). Métodos para o uso de amplicons para inibir a expressão de genes endógenos de plantas são descritos, por exemplo, em Angell e Baulcombe (1997) EMBO J. 16:3675-3684, Angell e Baulcombe (1999) Plant J. 20:357-362, e Patentes do EUA N°. 6.646.805, cada uma das quais está incorporada aqui por referência.

Em concretizações adicionais da presente invenção, o polinucleotídeo expresso pelo cassete de expressão da invenção é RNA catalítico ou tem uma atividade de ribozima específica para o RNA mensageiro de um polipeptídeo do citocromo P450 descrito aqui. Portanto, o polinucleotídeo causa a degradação do RNA mensageiro endógeno, resultando na expressão reduzida do polipeptídeo do citocromo P450. Esse método é descrito, por exemplo, na Patente dos EUA N0 .4.987.071, incorporada aqui por referência.

Em concretizações adicionais da invenção, a inibição da expressão de um ou mais polipeptídeos do citocromo P450 pode ser obtida pelo RNA de interferência (RNAi) por expressão de um gene que codifica um micro RNA (RNAmi). Os RNAmi são agentes reguladores que consistem em cerca de 22 ribonucleotídeos. Os RNAmi são altamente eficientes na inibição de genes endógenos. Ver, por exemplo, Javier et al. (2003) Nature 425: 257-263), incorporados aqui por referência.

Para a interferência do RNAmi, o cassete de expressão é desenhado para expressar uma molécula de RNA que é modelada sobre um gene de RNAmi endógeno. O gene do RNAmi codifica um RNA que forma uma estrutura em alça contendo 22 nucleotídeos que é complementar a outro gene endógeno (seqüência alvo). Para a supressão da expressão do polipeptídeo do citocromo P450, a seqüência de 22 nucleotídeos é selecionada a partir de uma seqüência de transcrito do polipeptídeo do citocromo P450 e contém 22 nucleotídeos de uma seqüência antisenso correspondente que é complementar à seqüência senso. Moléculas de RNAmi são altamente eficientes na inibição da expressão de genes endógenos, e a interferência de RNA que elas induzem é herdada pelas gerações de plantas subsequentes.

Ainda em outras concretizações da invenção, a inibição da expressão de um ou mais polipeptídeos do citocromo P450 pelo RNAi pode ser obtida pela interferência do RNA em alça (RNAhp, de "hairpin") ou interferência de RNA em alça contendo íntron (RNAihp). Esses métodos são altamente eficientes na inibição da expressão de genes endógenos. Ver, Waterhouse and Helliwell (2003) Ncit. Rev. Genet. 4:29-38 e as referências citadas pelos autores.

Para a interferência de RNAhp, o cassete de expressão é desenhado para expressar uma molécula de RNA que hibridiza com ela mesma para formar uma estrutura em alça que abrange um região de Ioop de única fita e uma haste de bases pareadas. A região de haste de bases pareadas abrange uma seqüência senso correspondendo a todo ou parte do RNA mensageiro endógeno que codifica o produto do gene cuja expressão deve ser inibida, nesse caso, um polipeptídeo do citocromo P450 descrito aqui, e uma seqüência antisenso que é completa ou parcialmente complementar à seqüência senso. De modo alternativo, a região de haste de bases pareadas pode corresponder a uma porção de uma seqüência promotora que controla a expressão do gene que codifica o polipeptídeo do citocromo P450 a ser inibido. Portanto, a região de haste de bases pareadas da molécula geralmente determina a especificidade da interferência do RNA. As moléculas de RNAhp são altamente eficientes na inibição da expressão de genes endógenos, e a interferência que elas induzem é herdada pelas gerações de plantas subsequentes. Ver, por exemplo, Chuang e Meyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:4985-4990; Stoutjesdijk et al. (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; e Waterhouse e Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38. Métodos para uso na interferência de RNAhp para inibir ou silenciar a expressão de genes são descritos, por exemplo, em Chuang e Meyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:4985-4990; Stoutjesdijk et al. (2002) Plant Physiol 129:1723-1731; Waterhouse e Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Pandolfini et al. BMC Biotechnology 3:7, e Publicação de Patente dos EUA N°. .20030175965; cada uma das quais está incorporada aqui por referência. Um ensaio transiente para a eficiência de construtos de RNAhp para silenciar a expressão de genes in vivo foi descrita por Panstruga et al. (2003) Mol. Biol. Rep. 30:135-140, incorporado aqui por referência.

Para o RNAihp, as moléculas de interferência têm a mesma estrutura geral do RNAhp, mas a molécula de RNA abrange adicionalmente um íntron que é capaz de ser combinado na célula em que o RNAihp é expresso. O uso de um íntron minimiza o tamanho do Ioop na molécula de RNA em alça após a união, e isso aumenta a eficiência da interferência. Ver, por exemplo, Smith et al. (2000) Nature 407:319- .320. Na verdade, Smith et al. mostram uma supressão de 100% da expressão de genes endógenos com o uso da interferência mediada por RNAihp. Métodos para uso de interferência de RNAds para inibir a expressão de genes endógenos em plantas são descritos em Smith et al. (2000) Nature 407:319-320; Wesley et al. (2001) Plant J. .27:581-590; Wang e Waterhouse (2001) Curr. Opin. Plant Biol. 5:146-150; Waterhouse e Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Helliwell e Waterhouse (2003) Methods 30:289-295, e Publicação de Patente dos EUA N°. 20030180945, cada uma das quais está incorporada aqui por referência.

Em uma concretização, o RNAi é efetuado pela expressão de uma seqüência inibidora que abrange uma primeira seqüência de um polinucleotídeo do citocromo P450 da invenção que tem cerca de 90 pb (pares de bases) a cerca de 110 pb de comprimento, incluindo 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, .105, 106, 107, 108, 109, e 110 pb de comprimento, uma seqüência que é complementar a toda ou parte da primeira seqüência. Em outra concretização, uma seqüência inibidora que abrange uma primeira seqüência de um polinucleotídeo do citocromo P450 da invenção que tem cerca de 290 pb a cerca de 310 pb de comprimento, incluindo 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, .302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, e 310 bp de comprimento, e uma segunda seqüência que é complementar a toda ou parte da seqüência do fragmento.

Em outras concretizações da invenção, o RNAi é finalizado pela expressão de uma seqüência inibidora que abrange uma seqüência de polinucleotídeos que contém os nucleotídeos na posição aproximada de 265 à posição aproximada de 625 de uma seqüência codificadora do citocromo P450 revelada aqui e uma segunda seqüência que é completa ou parcialmente complementar a essa. Em algumas dessas concretizações, a seqüência inibidora abrange como primeira seqüência de nucleotídeos os nucleotídeos correspondentes à posição aproximada de 297 à posição aproximada de 594 da seqüência codificadora do P450 apresentada na ID SEQ NO:3 ou ID SEQ NO:5 e a segunda seqüência é o complemento (i.e, uma seqüência antisenso) da primeira seqüência. A seqüência inibidora pode abranger opcionalmente uma seqüência de íntrons ligada entre a primeira e a segunda seqüências. Qualquer íntron conhecido por pessoas habilitadas na técnica pode ser usado desse forma. Em algumas concretizações, o íntron é o ácido graxo ômega-6 desaturase de soja (FAD, fatty acid desaturase) (ver GenBank Accession N°. DQ672337, e o Exemplo 7 adiante). Em tal concretização, o íntron abrange cerca de 151 nucleotídeos, o que abrange nucleotídeos de 100-247 do polinucleotídeo de ácido graxo ômega-6 desaturase de soja mostrado no GenBankk Accession N°. DQ672337. Exemplos de outros íntrons incluem, mas não se limitam às seqüências de nucleotídeos de íntron de genes da enzima álcool desidrogenase (adhi). A expressão dessa seqüência inibidora produz um RNA em alça contendo íntron que interfere fortemente na expressão dos polipeptídeos do citocromo P450 revelados aqui. Dessa forma, plantas de Nicotiana que normalmente são conversoras de nicotina em nornicotina que são transformadas com um cassete de expressão abrangendo essa seqüência inibidora têm, vantajosamente, uma taxa de conversão de nicotina em nornicotina surpreendentemente ainda mais baixa do que a observada para plantas de Nicotiana que são não-conversoras de nicotina em nornicotina.

Ainda em outras concretizações da invenção, o RNAi é efetuado pela seqüência inibidora que abrange uma primeira seqüência de polinucleotídeos que contém os nucleotídeos na posição aproximada de 1420 à posição aproximada de .1580 de uma seqüência codificadora do citocromo P450 revelada aqui e uma seqüência que é completa ou parcialmente complementar a essa. Em algumas dessas concretizações, a seqüência inibidora abrange como primeira seqüência de polinucleotídeos os nucleotídeos correspondentes na posição aproximada de 1453 à posição aproximada de 1551 da seqüência codificadora do P450 apresentada na ID SEQ N°: 1 e a segunda seqüência é o complemento (i.e, uma seqüência antisenso) da primeira seqüência. A seqüência inibidora pode abranger opcionalmente uma seqüência de íntrons ligada entre a primeira e a segunda seqüências. Qualquer íntron conhecido por pessoas habilitadas na técnica pode ser usado desse forma, como pode ser observado acima. A expressão dessa seqüência inibidora produz um RNA em alça (ou RNA em alça contendo íntron quando o íntron está presente) que também interfere na expressão dos polipeptídeos do citocromo P450 revelados aqui.

O cassete de expressão para interferência do RNAhp também pode ser desenhado de modo que a seqüência senso e a seqüência antisenso não correspondam a um RNA endógeno. Nessa concretização, as seqüências senso e antisenso flanqueiam uma seqüência em Ioop que abrange uma seqüência de nucleotídeos correspondentes a todo ou parte do RNA mensageiro endógeno do gene alvo. Portanto, é a região em Ioop que determina a especificidade da interferência do RNA. Ver, por exemplo, WO 02/00904, incorporado aqui por referência.

O silenciamento do gene transcricional (TGS, transcriptional gene silencing) pode ser realizado através do uso de construtos de RNAhp em que a repetição invertida em alça compartilha a identidade de seqüência com uma região promotora do gene a ser silenciado. O processamento do RNAhp em RNAs curtos que podem interagir com a região promotora homóloga pode precipitar a degradação ou metilação para resultar no silenciamento (Aufsatz et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sei. .99 (Suppl. 4): 16499-16506; Mette et al. (2000) EMBO J. 19(19):5194-5201).

Em concretizações adicionais, um polinucleotídeo pode ser utilizado para codificar uma proteína do dedo de zinco que se liga a um gene que codifica o polipeptídeo do citocromo P450, resultando na expressão reduzida do gene. Em concretizações particulares, a proteína do dedo de zinco se liga a uma região reguladora do gene o polipeptídeo do citocromo P450. Em outras concretizações, a proteína do dedo de zinco se liga a um RNA mensageiro que codifica um polipeptídeo do citocromo P450 e impede sua tradução. Métodos de seleção de sítios para direcionamento ao alvo por parte de proteínas do dedo de zinco têm sido descritos, por exemplo, na Patente dos EUA N°. 6.453.242, e métodos para o uso de proteínas do dedo de zinco na inibição da expressão de genes em plantas são descritos, por exemplo, na Patente do EUA N0. 20030037355; cada uma das quais está incorporada aqui por referência.

Em outras concretizações da invenção, o polipeptídeo codifica um anticorpo que se liga a no mínimo um polipeptídeo do citocromo P450, e reduz a atividade de um polipeptídeo do citocromo P450 da presente invenção. Em outra concretização, a ligação do anticorpo resulta na rotatividade do complexo anticorpo-polipeptídeo do citocromo P450 por mecanismos de controle de qualidade celular. A expressão de anticorpos em partes de plantas e a inibição de vias moleculares através de expressão e ligação de anticorpos a proteínas em partes de plantas são bem conhecidas da técnica. Ver, por exemplo, Conrad e Sonnewald (2003) Nature Biotech. 21:35-36, incorporados aqui por referência.

Em outras concretizações, a atividade de um polipeptídeo do citocromo P450 da presente invenção é reduzida ou eliminada através da disrupção do gene que codifica o polipeptídeo do citocromo P450. O gene codificador do polipeptídeo do citocromo P450 pode sofrer disrupção por qualquer método conhecido da técnica, por exemplo, por etiquetagem de transposon ou por mutagenização de plantas usando mutagênese aleatória ou direcionada ao alvo, e por seleção de plantas que têm atividade reduzida do citocromo P450.

A etiquetagem de transposon pode ser usada para reduzir ou eliminar a atividade de um ou mais polipeptídeos do citocromo P450 da presente invenção. A etiquetagem de transposon abrange a inserção de um transposon dentro do gene endógeno do citocromo P450 para reduzir ou eliminar a expressão do polipeptídeo do citocromo P450.

Nessa concretização, a expressão de um ou mais polipeptídeos do citocromo P450 é reduzida ou eliminada pela inserção de um transposon dentro da região reguladora ou codificadora do gene que codifica o polipeptídeo do citocromo P450. Um transposon que está dentro de um éxon, íntron ou seqüência não traduzida 5' ou .3', promotor, ou de outra seqüência reguladora de um gene do polipeptídeo do citocromo P450 pode ser usado para reduzir ou eliminar a expressão e/ou atividade do polipeptídeo do citocromo P450 codificado. Métodos para a etiquetagem de transposon de genes específicos em plantas são bem conhecidos da técnica. Ver, por exemplo, Maes et al. (1999) Trends Plant Sei. 4:90-96; Dharmapuri e Sonti (1999) FEMS Microbiol. Lett. 179:53-59; Meissner et al. (2000) Plant J. 22:265-274; Phogat et al. (2000) J. Biosci. 25:57-63; Walbot (2000) Curr. Opin. Plant Biol 2:103-107; Gai et al (2000) Nucleic Acids Res. 28:94- .96; Fitzmaurice et al. (1999) Geneties 153:1919-1928).

Métodos adicionais para diminuição ou eliminação da expressão de genes endógenos em plantas são bem conhecidos da técnica e podem ser aplicados de modo similar à presente invenção. Esses métodos incluem outras formas de mutagênese, tais como a mutagênese induzida por etil metanosulfonato, mutagênese de deleção, e mutagênese de deleção rápida de nêutrons usados em um senso genético reverso (com PCR) para identificar linhagens de plantas em que o gene endógeno foi deletado. Para exemplos desse método ver Ohshima et al. (1998) Virology 243:472-481; Okubara et al (1994) Geneties 137:867-874; e Quesada et al. (2000) Geneties .154:421-436; cada um dos quais está incorporado aqui por referência. Além disso, um método rápido e automatizável para rastreamento de mutações quimicamente induzidas, o TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes, em português, Mira de Lesões Locais Induzidas em Genomas), que usa a desnaturação HPLC ou digestão seletiva de endonuclease de produtos de PCR selecionados também é aplicável à presente invenção. Ver McCallum et al. (2000) Nat. Bioteehnol. 18:455- .457, incorporados aqui por referência.

As mutações que têm impacto na expressão de genes ou que interferem na função da proteína codificada do citocromo P450 podem ser determinadas com o uso de métodos bem conhecidos da técnica. Mutações insercionais em éxons de genes geralmente resultam em mutantes nulos. Mutações em tecidos conservados podem ser particularmente efetivas na inibição da função metabólica da proteína codificada. Têm sido descritos resíduos conservados de polipeptídeos do citocromo P450 adequados para mutagênese com a meta de eliminar a atividade de um polipeptídeo do citocromo P450 na conversão da nicotina em nornicotina em uma planta ou parte de planta de Nicotiana (Ver, por exemplo, Figuras 3 e 4) Tais mutantes podem ser isolados de acordo com procedimentos bem conhecidos da técnica.

Em outra concretização desta invenção, mutantes dominantes podem ser usados para precipitar o silenciamento de RNA devido à inversão e recombinação de genes de um lócus de gene duplicado. Ver, por exemplo, Kusaba et al. (2003) Plant Cell 15:1455-1467.

Apesar de várias seqüências serem reconhecidas na prática da invenção, em particular as ID SEQ N°:3 e ID SEQ N°:5 encontram uso específico. Embora não ligadas a quaisquer mecanismos de ação específicos, acredita-se que essas seqüências codificam a nicotina demetilase que catalisa a N-demetilação oxidativa de nicotina em nornicotina. Portanto, métodos para inibir especificamente essas seqüências codificadoras e não outras seqüências de P450 podem ser benéficas para a planta recombinante. Ou seja, estratégias que levariam à inibição da função do gene nesse lócus individual podem se mostrar superiores àquelas que inibem a família inteira de genes. A enzimas P450 estão envolvidas em muitos mecanismos na planta, sendo que sua inibição pode ser mostrar deletéria ou prejudicial ao crescimento e desenvolvimento da planta, ou pode ter impacto negativo sobre fatores como a capacidade de defesa da planta contra doenças. Igualmente, devido à implicação das enzimas P450 da planta de Nicotiana em metabólitos como o fenilpropanóides, alcalóides, terpenóides, lipídeos, glicosídeos cianogênicos, glucosinolatos, e outras inúmeras entidades químicas, a disrupção da atividade de p450 pode alterar componentes envolvidos no sabor, textura, ou outras propriedades do tabaco que teriam impacto sobre a utilidade comercial da planta. Portanto, pode ser preferido o uso dos métodos discutidos acima para inibir a expressão de modo que tenha como alvo específico a seqüência codificadora da ID SEQ N°: 3 ou ED SEQ N°: 5, incluindo estratégias mutacionais direcionadas ao alvo, como a quimeroplastia. Ver, por exemplo, Stewart et al. (2000) Biotechniques 29(4): 838-843; Graham et al (2002) Biochim Biophys Aeta 1587(1): 1-6, incorporados aqui por referência.

A proteína codificada pelo DNAc designada 3D_C 12-10 (ID SEQ N°:4) difere de 3D_C12-7 (ID SEQ N°:6) em apenas dois resíduos aminoácidos imediatamente após a metionina de partida. Os códons correspondentes a esses aminoácidos foram incluídos dentro do primer de PCR usado para gerar o DNAc 3D_C12-7. Portanto, o template de RNAm a partir do qual 3D_C12-7 foi amplificado pode ser o mesmo que o correspondente ao gene 3D_C12-10, com as seqüências do primer de PCR mediando as mudanças observadas na segunda e terceira seqüências de aminoácidos. Apesar disso, os produtos de proteína codificados funcionariam identicamente. O local dos dois aminoácidos que diferem entre as proteínas previstas está na seqüência de sinal N-terminal que serve meramente para ancorar a proteína na membrana do retículo endoplasmático e, portanto, não se deve esperar que isso influencie as propriedades catalíticas da enzima.

Em outra concretização da invenção, as composições da invenção têm uso nos métodos de rastreamento para identificar plantas não-conversoras para uso em programas de cruzamento. Dessa forma, as seqüências de nucleotídeos da invenção podem ser usadas para rastrear germoplasmas nativos para plantas não-conversoras que têm uma mutação estável em um ou mais genes P450 identificados aqui. Essas plantas não-conversoras identificadas por métodos da invenção podem ser usadas para desenvolver linhagens de cruzamento.

Além disso, para as seqüências de nucleotídeos que codificam seqüências de codificação de P450, as composições da invenção incluem uma seqüência de íntrons na seqüência de 3D_C12-10 que pode ser usada em métodos de rastreamento. Embora não ligadas por qualquer mecanismo de ação o(s) gene(s) 3D_C12-7/3D_C12-10 podem representar o(s) único(s) membro(s) da família 3D_C12 envolvidos na conversão metabólica de nicotina em nornicotina (e conforme declarado previamente, há uma boa probabilidade de que os DNAcs de 3D_C12-7 e .3D_C12-10 se originem a partir de um único lócus genético simples. Para certas aplicações seria útil ter um meio de diferenciar diagnosticamente esse membro específico da família de genes 3D_C12 do resto das seqüências intimamente relacionadas dentro dessa família. Por exemplo, é possível que dentro do germoplasma de tabaco existente naturalmente (ou em populações mutagenizadas), podem existir acessos nos quais esse gene é naturalmente disfuncional e pode, portanto, ser valioso como um recurso permanentemente não-conversor. Um método de ensaio específico para tais genótipos (por ex., mutantes de deleção, rearranjos, e semelhantes) poderia servir como uma ferramenta poderosa. Para obter tal ferramenta, o alinhamento de seqüência mostrado na Figura 3A-3G foi usado para desenhar primers de PCR em regiões que possuem polimorfismos entre os membros. Uma combinação de primer (primer 5' mostrado na ID SEQ N°:25 e primer 3' mostrado na ID SEQ N°:26) usando seqüências específicas para 3D_C12-10 produz dois resultados particularmente úteis. (1) todos os produtos de PCR amplificados a partir do DNA genômico de tabaco resultaram no mesmo produto exclusivo (conforme determinado pela análise de seqüência de DNA); e (2) foi revelado que a presença de um íntron de 992 pb está localizada entre as seqüências do primer (Figura 7; íntron mostrado na ID SEQ N°:24).

Quando um DNAc que corresponde a um membro da família de 3D_C12 é usado como uma sonda de hibridização em um ensaio de Southern Blot do DNA genômico do tabaco, um padrão complexo é observado. Isso é esperado, dado que existem múltiplos membros intimamente relacionados dessa família de genes. Por causa das regiões de íntrons de genes serem tipicamente menos conservadas do que as de éxons, é previsto que o uso de uma sonda específica de íntron reduza essa complexidade e possibilite uma melhor distinção do(s) gene(s) que correspondem ao gene 3D_C12-7/3D_C12-10 de outros membros da família. De fato, a sonda correspondente à seqüência mostrada na Figura 7 resultou em um padrão de Southern Blot com uma complexidade muito mais reduzida. O uso de uma sonda de 3D_C12- .10 íntron-específico, e/ou primers de PCR usados para gerar o fragmento mostrado na Figura 7 fornece, portanto, ferramentas poderosas em ensaios para determinar se plantas de tabaco de ocorrência natural ou mutagenizadas possuem deleções ou rearranjos que possam produzir o gene inativo. Tal planta pode ser então usada em programas de cruzamento para criar linhagens de tabaco que são incapazes de realizar a conversão.

Plantas transformadas, parte de plantas e produtos que têm conteúdo reduzido de nornicotina e NNN

Os polinucleotídeos do citocromo P450 da invenção, e variantes e fragmentos desses, podem ser usados em métodos da presente invenção para inibir a expressão ou função do citocromo P450 que está envolvida na conversão metabólica da nicotina à nornicotina em uma planta. Dessa forma, seqüências inibidoras que a expressão ou função alvo de um polipeptídeo do citocromo P450 revelado aqui são introduzidas dentro de uma planta ou célula de planta de interesse. Em algumas concretizações os cassetes de expressão descritos aqui são introduzidos dentro de uma planta de interesse, por exemplo, uma planta de Nicotiana, como observado adiante, usando quaisquer métodos adequados de transformação conhecidos da técnica, incluindo aqueles descritos aqui. Os métodos da invenção não dependem de um método específico para introduzir uma seqüência dentro de uma planta ou parte de planta, somente aquele em que a seqüência desejada obtém acesso ao interior de no mínimo uma célula de planta ou parte de planta. Métodos para introdução de seqüências de polinucleotídeos em plantas são conhecidos da técnica e incluem, mas não se limitam a, métodos de transformação estáveis, métodos de transformação transientes, e métodos mediados por vírus.

Protocolos de transformação bem como protocolos para introdução de seqüências heterólogas de polinucleotídeos para dentro de plantas variam dependendo do tipo de planta ou célula de planta alvo para a transformação. Métodos adequados de introdução de polinucleotídeos para dentro de células de planta da presente invenção incluem microinjeção ((Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), eletroporation (Shillito et al. (1987) Meth. Enzymol. 153:313-336; Riggs et al. (1986) Proc. Natl Acad. Sei. USA 83:5602-5606), transformação mediada por Agrobaeterium (Patente dos EUA N°s. 5.104.310, 5.149.645, 5,.177.010, 5.231.019, .5.463.174, 5.464.763, 5.469.976, 4.762.785, 5.004.863, 5.159.135, 5.563.055, e .5.981.840), transferência direta de gene (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. .3:2717-2722), e aceleração balística de partículas (ver, por exemplo, Patentes do EUA N°s. 4.945.050, 5.141.131, 5.886.244, 5.879.918, e 5.932.782; Tomes et al. (1995) in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al. (1988) Bioteehnology .6:923-926). Ver também Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer e McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol .27P: 175-182 (soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pp. 197-209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 e Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl Genet. 84:560-566 (transformação mediada por whisker); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (eletroporação); todos os quais estão incorporados aqui por referência.

Qualquer tecido de planta que possa ser posteriormente propagado com o uso de métodos de clonagem, seja por organogênese ou embriogênese, pode ser transformado com um construto recombinante abrangendo uma seqüência inibidora do citocromo P450, por exemplo, um cassete de expressão da presente invenção. Por "organogênese" entende-se o processo pelo qual brotos e raízes são desenvolvidos seqüencialmente a partir de centros meristemáticos. Por "embriogênese" entende-se o processo pelo qual brotos e raízes desenvolvem-se juntamente de modo conjunto (não seqüencialmente), seja a partir de células somáticas ou gametas. Tecidos exemplares que são adequados para vários protocolos de transformação descritos aqui incluem, mas não se limitam a, tecido do calo, tecido meristemático existente (por ex. meristemas apicais, brotos axilares, e meristemas de raiz) e tecido de meristema induzido (por ex. meristema do cotilédone e meristema do hipocótilo), hipocótilos, cotilédones, receptáculos de folha, pólen, embriões, e semelhantes.

Conforme usado aqui, o termo "transformação estável" pretende significar que o construto do nucleotídeo de interesse introduzido dentro de uma planta se integra dentro do genoma da planta e é capaz de ser herdado pela progênie da mesma. "Transformação transiente" pretende significar que uma seqüência é introduzida dentro da planta e é expressa apenas temporariamente ou está presente apenas transitoriamente na planta.

Em concretizações específicas, as seqüências inibidoras da invenção podem ser fornecidas a uma planta usando uma variedade de métodos de transformação transiente. As seqüência inibidoras da invenção podem ser temporariamente transformadas dentro da planta com o uso de técnicas conhecidas. Tais técnicas incluem sistemas de vetores virais e a precipitação de polinucleotídeo de modo que evite a liberação subsequente de DNA. Portanto, a transcrição a partir de DNA ligado por partículas pode ocorrer, mas a freqüência no qual ele é liberado para se tornar integrado dentro do genoma é muito reduzida. Tais métodos incluem o uso de partículas revestidas com polietilenoimina (PEI; Sigma #P3143).

Em outras concretizações, a seqüência inibidora da invenção pode ser introduzida dentro de plantas colocando-as em contato com um vírus ou ácidos nucléicos virais. Geralmente, tais métodos envolvem a incorporação de um cassete de expressão da invenção dentro de uma molécula de DNA ou RNA viral. Admite-se que os promotores para uso em cassetes de expressão da invenção também abrangem promotores utilizados para transcrição por polimerases de RNA viral. Métodos para introdução de polinucleotídeos dentro de plantas e para expressão de uma proteína codificada dessas, envolvendo moléculas de DNA ou RNA viral, são conhecidos da técnica. Ver, por exemplo, Patentes do EUA N°s 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785,5.589.367, 5.316.931, e Porta et ai. (1996) Molecular Biotechnology 5:209-221; incorporadas aqui referência.

Células transformadas podem ser crescidas dentro de plantas de Nicotiana de acordo com métodos convencionais. Ver, por exemplo, métodos revelados aqui em Vasil e Hildebrandt (1965) Science 150:889; Negaard e Hoffman (1989) Biotechniques 7(8):808-812. Essas plantas podem então ser crescidas, e mesmo polinizadas com a mesma linhagem transformada ou linhagens diferentes, e a progênie resultante terá a expressão desejada da característica fenotípica identificada, i.e. expressão reduzida de um ou mais citocromos P450 que estão envolvidos na conversão metabólica de nicotina a nornicotina, e portanto um conteúdo reduzido de nornicotina, e um conteúdo concomitantemente reduzido de seu metabólito nitrosamina, NNN, na planta, particularmente em tecidos da folha. Duas ou mais gerações podem ser crescidas para assegurar que a expressão da característica fenotípica desejada seja mantida estável e herdada, e as sementes colhidas para assegurar que a expressão da característica fenotípica desejada foi alcançada. Dessa maneira, a presente invenção apresenta sementes transformadas (também referidas como "semente transgênica") que tem um polinucleotídeo da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, estavelmente incorporado dentro de seu genoma.

As composições e métodos da invenção podem ser usados para reduzir o conteúdo de nornicotina, particularmente nas folhas e caules, de qualquer planta do gênero Nicotiana incluindo, mas não se limitando às seguintes espécies: acuminata, affinis, alata, attenuate, bigelovii, clevelandii, excelsior, forgetiana, glauca, glutinosa, langsdorffii, longiflora, obtusifolia, palmeri, paniculata, plumbaginifolia, qudrivalvis, repanda, rústica, suaveolens, sylvestris, tabacum, tomentosa, trigonophylla, e χ sanderae. A presente invenção também abrange a transformação de quaisquer variedades de um planta do gênero Nicotiana, incluindo mas não se limitando a Nicotiana acuminata multiflora, Nicotiana alata grandiflora, Nicotiana bigelovii quadrivalvis, Nicotiana bigelovii wallacei, Nicotiana obtusifolia obtusifolia, Nicotiana obtusifolia plameri, Nicotiana quadrivalvis bigelovii, Nicotiana quadrivalvis quadrivalvis, Nicotiana quadrivalvis wallacei, and Nicotiana trigonophylla palmeri, bem como variedades conhecidas como variedades de fumeiro ou brilhante, variedades Burley, variedades escuras, e variedades oriental/Turca

As plantas transgênicas do gênero Nicotiana descritas aqui são adequadas para técnicas de crescimento e colheita convencionais, como o cultivo em solo rico em esterco ou sem esterco, com ensacamento das flores ou sem ensacamento, com cobertura ou sem cobertura. As folhas e caules colhidos podem ser usados em qualquer produto convencional do tabaco incluindo, mas não se limitando a, cachimbo, charuto, e cigarro de tabaco, tabaco para mascar, e em qualquer forma, incluindo tabaco em folha, tabaco triturado, ou tabaco coitado.

Portanto a presente invenção apresenta uma planta de Nicotiana, particularmente tecidos da folha dessas plantas, que abrangem um cassete de expressão da invenção e uma quantidade reduzida de nornicotina e N'- nitrosonornicotina. Conforme usado aqui, o termo "quantidade reduzida" ou "nível reduzido" pretende se referir a uma quantidade de nornicotina e/ou N'- nitrosonornicotina em uma planta tratada ou transgênica do gênero Nicotiana ou uma parte de planta ou produto de tabaco dessa planta, que é menor do que a quantidade que seria encontrada em uma planta ou parte de planta ou produto do tabaco a partir da mesma variedade de tabaco, processada (i.e. cultivada e colhida) da mesma forma, que não tenha sido tratada ou não transformada em transgênica para nornicotina e/ou .7V'-nitrosonornicotina reduzida. A quantidade de nornicotina pode ser reduzida em cerca de 10% a mais de cerca de 90%, incluindo mais do que cerca de 20%, cerca de .30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, e cerca de 80%.

O termo "produtos do tabaco", conforme usado aqui incluem, mas não se limitam a, materiais do fumo (por ex., tabaco de cigarros, cachimbo, charuto), rapé, tabaco para mascar, goma, e tabletes. A presente invenção também abrange uma série de misturas de produtos do tabaco que podem ser feitas pela combinação do tabaco convencional com quantidades diferentes de baixa nornicotina e/ou Ar'- nitrosonornicotina descritas aqui. Em concretizações adicionais, a planta ou parte de planta do gênero Nicotiana como descrito acima é tabaco curado.

Em algumas concretizações da presente invenção, o produto do tabaco reduz o potencial carcinogênico da fumaça de tabaco que é inalada diretamente com o consumo de um produto de tabaco como charutos, cigarros, ou cachimbo, ou inalada por fumo secundário (i.e., por aqueles indivíduos que inalam a fumaça de tabaco gerada por um indivíduo que consome um produto de tabaco como charutos, cigarros, ou cachimbo. O tabaco curado descrito aqui pode ser usado para preparar um produto de tabaco, particularmente um que passe por mudanças químicas devido ao aquecimento, abrangendo uma quantidade reduzida de nornicotina e/ou N'- nitrosonornicotina na fumaça inalada diretamente ou como fumo secundário. Da mesma forma, os produtos de tabaco da invenção podem ser úteis na preparação dos produtos de tabaco sem fumaça como tabaco para mascar, rapé, e semelhantes.

Os produtos de tabaco obtidos a partir de plantas de tabaco transgênicas da presente invenção encontram uso em métodos para reduzir o potencial carcinogênico desses produtos do tabaco, e reduzir a exposição de humanos à nitrosamina NNN carcinogênica, particularmente para indivíduos que são usuários desses produtos de tabaco.

Os seguintes exemplos são oferecidos como ilustração e não com o objetivo de limitação.

EXPERIMENTAL

Os seguintes materiais e protocolos foram utilizados nos experimentos descritos abaixo.

Materiais de plantas

Todos os materiais de plantas utilizados nesses experimentos foram fornecidos por Dr. Earl Wernsman, Department of Crop Science (Departmento de Ciências de Safra), North Carolina State University. DH 91-1307-46(NC) e DH91-1307-46(Con) são linhagens do tipo Burley duplo-haplóides quase isogênicas (não-conversoras e conversoras, respectivamente) recuperadas a partir da mesma planta haplóide materna. Linhagens do tipo Burley DH 98-326-3 (não-conversoras) e DH 98-326-1 (conversoras), e DH 98-325-5 (não-conversoras) e DH 98-325-6 (conversoras) representam dois pares adicionais de linhagens quase isogênicas. SC58 é uma variedade de tabaco curada em fumeiro, cujos indivíduos não-conversores são designados SC58(cTcT). SC58(CTCT) é uma linhagem conversora estável quase isogênica que é originada apesar da introgressão de um lócus conversor dominante simples (Ct) encontrado nas espécies progenitoras de tabaco N. tomentosiformis dentro de SC58 (Mann et al. (1964) Crop Sei. 4:349-353. Após oito retrocruzamentos adicionais para SC58, a linhagem SC58(CtCt) quase isogênica foi criada e posteriormente mantida via autofertilização.

Todas as plantas foram mantidas em câmaras de crescimento ou estufas usando envasamento com solo e fertilizante padrão. Para estudos de microarranjo, o metabolismo de nicotina em nornicotina foi acelerado pela excisão de folhas individuais e inserção dos pecíolos dentro de uma solução a 0,1 % de etefon ou 1% de bicarbonato. As folhas foram então colocadas em uma câmara de crescimento (ITC) por 5 a 7 horas para facilitar a entrada do etefon ou bicarbonato de sódio através do fluxo transpiracional. As folhas tratadas foram colocadas em pequenos sacos plásticos de armazenagem e foram levemente borrifadas com água (para manter a umidade alta) e curadas por três dias a 30°C no escuro. Para aumentar a conversão de nicotina em nornicotina nas plantas transgências geradas neste estudo, as folhas removidas foram imersas em uma solução de 0,2% de etefon, secas, e curadas em sacos plásticos de armazenagem por sete dias à temperatura ambiente. Bibliotecas de DNAc e etiquetas de seqüência expressa

O RNA celular total foi isolado a partir do tecido de folha de senescênia de linhagens tipo Burley DH 91-1307-46(NC) e DH 91-1307-46(Con) usando o reagente TRIzol® de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen). O RNA PolyA+ foi isolado a partir do RNA total usando o sistema MessageMaker (Invitrogen), e o DNAc foi subseqüentemente sintetizado e clonado para dentro vetor lambda fago ZAP II usando a Síntese ZAP-DNAc e o Kit de clonagem GigaPack III Gold (Stratagene). Alíquotas das bibliotecas de fagos foram convertidas para as bibliotecas do plasmídeo com base em pBluescript seguindo o protocolo de excisão de massa descrito pela Stratagene.

Milhares de colônias de ambas as bibliotecas conversoras e não-conversoras foram crescidas em um meio sólido seletivo e colocadas numa placa de 384 poços contendo meio de cultura Luria (com ampicilina) em 10% de glicerol para facilitar a armazenagem dos clones em longo prazo a -80°C. Mais de 11.000 clones da cada biblioteca foram transferidos das placas de 384 poços para blocos de crescimento de .96 poços e crescidas em meio seletivo. Os plasmídeos foram isolados em formato de .96 poços usando o Kit de preparação R.E.A.L. (Qiagen) com a ajuda de uma Workstation BioRobot 3000 (Qiagen). Para gerar as ETS (etiquetas de seqüência expressa, do inglês, "expressed sequence tags") os clones de plasmídeos foram sequenciados usando o Primer T3 (Qiagen) e o BigDye® Terminator system (Applied Biosystems) de acordo com o protocolo de sequenciamento de ciclo BigDye®. Placas de 96 poços Performa® DTR (Edge Biosystems) foram usadas para remover o corante não incorporado das reações de sequenciamento antes de carregar as amostras sobre um Sequenciador de DNA Automatizado de 96 capilares Perkin Elmer Prism 3700.

Preparação dos chips de DNA

Para obter DNAs adequados para o arranjo em lâminas de vidro, o M13 a seguir e os primers de sequenciamento reverso (Qiagen) foram usados como primers de PCR para amplificar os insertos de DNAc de plasmídeos contendo DNAcs representados nas bases de dados de EST. Os clones de plasmídeos foram submetidos a PCR no formato de 96 poços usando um termociclador modelo 9700 Amp da Applied Biosystems Gene. Os produtos de PCR resultantes foram processados através de sistemas de purificação Millipore Multiscreen™ PCR ou Montage™ PCRµ96. Os produtos resultantes foram transferidos para dentro de placas de 384 poços contendo volumes iguais de DSMO. As concentrações finais de DNA foram estimadas como sendo iguais ou maiores do que 0,1 mg/ml. Os DNAs foram subseqüentemente arranjados sobre uma lâmina cobertas com amino silano (Corning® GAPS II) usando uma impressora de arranjo Affymetrix GMS 417. Os DNAs foram imobilizados na superfície da lâmina através de ligação cruzada com UV (~120mJ/m ), seguida por cozedura a 75°C por duas horas.

Análise de hibridização de mícroarranjo

O método indireto com base em amino-alil dUTP de incorporação de corante descrito pelo "The Institute of Genome Research" (http://pga.tigr.org/protocols.html) foi usado para rotular RNAs conversores e não-conversores com corante Cy3 e Cy3 fluorescente (Amersham Biosciences). Brevemente, 20 μg de RNA total foi transcrito em reverso em um volume de 30 μΐ contendo 400 unidades de SuperScript II RT (Invitrogen), 6 ng de primers ramdom hexamer, 0,5 mM cada de dATP, dCTP, e dGTP, 0,3 mM dTTP, e 0,2 mM amino-alil dUTP (Sigma) no primeiro tampão de síntese de primeira fita (Invitrogen). As reações foram incubadas por 6 a 14 horas a .42°C, seguido por hidrólise do RNA com NaOH. As moléculas de DNAc de primeira fita resultantes foram purificadas (Qiagen) em coluna e lavadas com tampão de fosfato. As reações de acoplamento dos corantes NHS-éster Cy3 ou Cy5 fluorescente para o DNAc ocorreram durante a incubação em 0,05 M de tampão de carbonato de sódio (pH 9) e 25% de DMSO à temperatura ambiente por 1,5 horas.

Lâminas de microensaio foram pré-hibridizadas em uma solução de 5X SSC, .0,1% de SDS, e 1% de BSA a 42°C por 45 minutos, enxaguadas gentilmente com dH2O e isopropanol, e secas por centrifugação em baixa velocidade. Os DNAs rotulados Cy3 e Cy5 foram purificados em coluna (Qiagen), combinados, e hibridizados em lâminas de DNA em uma solução contendo 5X SSC, 0,5% de SDS, .5X de Denhardt, 0,45 μg/μl Poli A RNA, 0,45 μg/μl de DNA de timo de bezerro, e .50% de formamida. As lâminas foram incubadas com a solução de hibridização por .14 a 16 horas a 42°C. As lavagens pós-hidridização consistiram em incubações seqüenciais de 4 minutos com as seguintes soluções: IX SSC, 0,2% de SDS; 0,1X SSC, 0,2% de SDS; 0,1 X de SSC, em um enxágüe final de 10 segundos com 0,01X SSC. Os microensaios foram subseqüentemente escaneados com o uso de ScanArray 2.1 (GSI Lumonics) ou ScanArray Express (PerkinElmer). O escaneamento seqüencial para Cy5 e Cy3 fluorescente foi realizado em uma resolução máxima de 10 gm/pixel, e a força do laser e ganho de PMT ajustados para fornecer forças de sinal confiáveis e equivalentes. As imagens de arranjo obtidas foram quantificadas para a intensidade de sinal com software de análise QuantArray™ (PerkinElmer), usando o método baseado em histograma. As intensidades totais foram usadas como campos de saída de quantificação, e os conjuntos de dados obtidos foram salvos como Unicode, arquivos de texto tab-delimitados. A importação dos arquivos de texto para o Microsoft Excel possibilitou o cálculo subsequente das proporções de Cy5/Cy3 e Cy3/Cy5, a estatística empregada para a identificação de genes candidatos.

Clonagem de comprimento inteiro e membros adicionais da família de genes 3D C12

Para clonar a região de codificação inteira de 3D_C12 e 7D_A06, uma estratégia 5'-RACE modificada foi empregada com o uso de um primer avançado vetor-específico pBluescript II (BlueSK; 5'-CGCTCTAGAACTAGTGATC-3'; ID SEQ NO: 17) e um conjunto de primers reversos gene-específicos. Dois primers reversos 3D_C12-específicos foram desenhados, um dos quais é complementar à porção à jusante da região não traduzida (5'-TTTTTGGGACAATCAGTCAA-3'; ID SEQ N°: 18) e o outro complementar à seqüência dentro da região de codificação (5'- GTTAGATTTATCGTACTCGAATT-3'; ID SEQ N°: 19). Para o primer anterior, as primeiras cinco Ts são complementares à cauda polyA do transcrito. Um primer reverso 7D_A06-específico (5-TTCATTTCAAATTATTTTATGCACCA-3'; ID SEQ N°:20) também foi desenhado, sendo complementar a um segmento na região de não codificada desse gene. As reações de PCR continham 10 ng de biblioteca de DNAc de folha de tabaco conversor (dentro do vetor pBluescript) como template, concentração de 2 μΜ de cada primer, 350 μΜ de cada dNTP, e 1,5 mM MgCl2 em um volume de reação final de 50 μι. A amplificação foi iniciada pela adição de 2,5 unidades de mix de enzima UinPol, usando condições descritas pelo fabricante (Roche). Após uma etapa de desnaturação inicial a 94°C por 4 minutos, as amostras foram submetidas a 30 ciclos de desnaturação a 94°C por 15 segundo, enrijecimento a .57°C por 30 segundos, e extensão a 12°C por 90 segundos. Uma etapa de extensão final a 72°C por 10 minutos foi incluída ao final dos 30 ciclos. Os amplicons foram ligados dentro do vetor pGEM Easy T/A (Promega), e 10 clones selecionados aleatoriamente de cada amplificação foram submetidos à análise de seqüência de DNA. As seqüências de ácido nucléico e proteína previstas para os vários membros da família de genes 3D_C12 foram analisadas e comparadas usando BLASTX (Altschul et al. (1997) Nucleic Aeids Res. 25:3389-3402), ClustalW (Higgins et al. (1994) Nueleie Aeids Res. 4673-4680), e os algoritmos GAP (pacote de software do Genetic Computing Group da Universidade de Wisconsin ).

A estratégia descrita acima foi efetiva na identificação da informação de seqüência de comprimento inteiro para 3D_C12 e 7D_A06. Além disso, as amplificações de PCR usando o primer de PCR interno à região de codificação de .3D_C12 originou informação sobre a seqüência parcial para o DNAc único 3D_C12-15. Na tentativa de obter informação sobre a seqüência de comprimento inteiro para .3D_C12-15, um primer gene-específico complementar ao 5' terminal de sua região de codificação (5ATGGTTTTTCCCATAGAAGCC-3'; ID SEQ N°:21) foi usado em conjunto com um primer reverso pBluescript-específico (5-

TCGAGGTCGACGGTATC-3'; ID SEQ N°:22). Embora o DNAc 3D_C12-15 de comprimento inteiro não tenha sido recuperado, essa amplificação resultou no isolamento de 3D_C12-7, que provou ser outro membro único da família de genes .3D_C12.

Análise de plantas transgênicas

Os construtos silenciadores de gene baseados em RNAi foram montados numa versão do vetor de clonagem pKYL80 (Schardl et al (1987) Gene 61:1-11) que foi engenhe irado para conter um fragmento de 151-pb do íntron do gene FAD3 de soja entre os sítios de restrição Xhol e SacI do polylinker (pKYLX80I). Para criar um construto no qual o íntron FAD3 foi flanqueado por um fragmento senso e antisenso de 3D_C12, uma região de 99-pb localizada imediatamente à montante do códon de parada do 3D_C12 cDNA (Figura 3A-3G) foi clonada entre os sítios de restrição HindIIl - Xhol e SacI - Xbal de pKYLX80I em sua orientação senso e antisenso, respectivamente. O fragmento HindIII - Xbal resultante contendo o braço senso .3D_C12, íntron FAD3, e braço antisenso 3D_C12 foi subclonado para dentro do vetor binário de expressão de planta pKYLX71 (Maiti et al. (1993) Proc. Natl. Aead. Sei. USA 90:6110-6114) entre o promotor 35S CaMV e um terminador de pequena subunidade da rubisco.

Os construtos de expressão excessiva (sobre-expressão) foram criados para substituir a 3-glucuronidase do ORF (open reading frames, em português, quadro de leitura aberta) do vetor binário de expressão da planta pBI121 (Clontech) com as regiões de codificação de comprimento inteiro 3D_C12, 7D_A06, e 3D_C12-7 cDNAs. Isso colocou o tabaco P450 sob o controle transcricional do promotor 35S do CaMV. Os construtos baseados em pBI121- e pKYLX71 foram transformados dentro de uma cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 e introduzidos dentro dos cultivares de tabaco Petite Havana e DH98-325-6 (conversor), respectivamente, usando protocolos estabelecidos (Horsch et al (1985) Science 227:1229-1231).

Análise de Northern Blot

Os RNAs celulares totais foram isolados a partir de folhas de tabaco usando o método TRIZOL® conforme descrito pelo fabricante (Invitrogen). Cinco em dez microrganismos de RNA foram fracionados por tamanho sobre 1,2% de gel de agarose preparado em tampão TBE. A imobilização de RNA, rotulagem de sonda, e detecção de sinal foram realizados usando os kits DIG de detecção e rotulagem de ácido nucléico de acordo com as instruções do fabricante (Roche). De modo alternativo, as sondas foram sintetizadas usando 32P-dCTP de acordo com os protocolos que acompanham o kit Random Primed DNA Labeling (Roche).

Análise alcalóide

As folhas de tabaco foram colhidas e secas ao ar em um forno a 65°C por 2 dias. A uma amostra de 100 mg de folhas secas e esmagadas, foi adicionado 0,5 ml de NNaOH em um frasco de cintilação de 20 mL. A amostra foi misturada e deixou-se incubar por 15 minutos à temperatura ambiente. Alcalóides foram extraídos pela adição de 5 mL de solução de extração [0,04% de quinolina (peso/volume) dissolvida em metil-t-butil éter] e rotacionada gentilmente em um agitador linear por 3 horas. Após a separação das fases, uma alíquota da fase orgânica foi transferida para um frasco de amostra. As amostras foram analisadas usando o cromatógrafo a gás Autosystem XL da PerkinElmer, equipado com um detector de ionização de chama, um liner de vidro de modo split/splitless de 4mm, uma coluna ID DB-5 de 30 m χ .0.53 mm. As condições cromatográficas foram as seguintes: detector de temperatura: .250°C; temperatura do injetor: 250°C; taxa de fluxo de hélio da 120°C: 20 mL/min; volume de injeção: 2 μί; condições da coluna: 120°C, mantido por 1 minuto, taxa de alteração 120-280°C a 30°C /minuto, mantido a 280°C por 2 minutos. A composição do alcalóide foi determinada pelo software TotalChrome Navigator usando uma curva de calibração.

Exemplo 1: Geração das bases de dados de EST

RNAs isolados a partir de folhas de senescência do genótipo conversor DH .91-1307-46(Con) e sua contraparte não-conversora quase isogênica DH 91-1307-46(NC) foram usados para gerar bibliotecas de DNAc. Sequenciadores automatizados de DNA de alto rendimento foram usados inicialmente para gerar informação de seqüência de série única (ESTs) para 11.136 DNAcs escolhidos aleatoriamente a partir da biblioteca conversora. A ferramenta de busca de alinhamento local (Altschul et ai (1990) J. Mol. Biol 215:403-410) foi usada para comparar a seqüência de proteína prevista de cada DNAc de tabaco com a base de dados de proteínas não redundante controlada pelo National Center for Biotechnology Information da National Library of Medicine e National Institutes of Health (em português, Centro Nacional da Informação sobre Biotecnologia da Biblioteca Nacional de Medicina e Institutos Nacionais de Saúde). Subseqüentemente, uma base de dados de EST similar anotada foi gerada pela condução de séries de sequenciamento em 11.904 DNAs selecionados a partir da biblioteca não-conversora.

Exemplo 2: Análises de microarranjo da biblioteca de CDNA conversora Métodos

Após a finalização da base de dados EST gerada a partir da biblioteca de DNAc conversora, os insertos a partir de 4992 clones foram amplificados por PCR e arranjados sobre lâminas de vidro. Dada a possibilidade da enzima nicotina demetilase poder ser catalisada por uma enzima da classe P450 de enzimas oxidativas, atenção especial foi dada às entradas na biblioteca que foram previstas por análise BLASTX para codificar P450. A partir de inspeção visual dos resultados da BLASTX, foi estimado que 31 genes P450 únicos foram representados na base de dados. Quando foram selecionadas placas de 96 poços específicas para serem incluídas no microensaio, tomou-se cuidado para assegurar que todos os genes P450 únicos fossem incluídos entre os 4992 selecionados.

O RNA isolado a partir dos genótipos do tipo Burley DH 98-326-3 quase isogênicos (não-conversores) e DH 98-326-1 (conversores), e DH 98-325-5 (não- conversores) e DH 98-325-6 (conversores) foram usados para gerar DNAcs rotulados de Cy3 e Cy5 . Para maximizar a conversão metabólica de nicotina em nornicotina em genótipos conversores, as folhas retiradas foram tratadas com bicarbonato de sódio e etefon antes da cura, tratamentos que mostraram acelerar a produção de nornicotina em plantas conversoras, tendo nenhum efeito em indivíduos não- conversores (Fannin e Bush (1992) Med. Sei. Res. 20:867-868; Shi et al. (2003) J. Agric. FoodChem. 51:7679-7683).

Para minimizar a variabilidade inerente aos experimentos de microarranjos, experimentos recíprocos foram conduzidos simultaneamente. Desse modo, o RNA DH 98-325-5 foi rotulado com Cy5 e o RNA DH 98-325-6 foi rotulado com Cy3, e então um experimento recíproco de RNA DH 98-325-5 foi rotulado com Cy3 e o RNA DH 98-325-6 RNA foi rotulado com Cy5 (coletivamente referido como Exp. .20 2.1). De modo similar, os RNAs DH 98-326-3 e DH 98-326-1 foram rotulados com Cy3 e Cy5, respectivamente, em um experimento, e então os mesmos RNAs foram rotulados com Cy5 e Cy3, respectivamente, em um experimento recíproco (coletivamente referido como Exp. 2.2).

Mesmo quando conduzidos reciprocamente, os resultados de quaisquer experimentos de microarranjos provavelmente incluem "falso positivos", representando genes que são regulados diferencialmente entre um par genotípico específico e/ou unicamente em resposta a um tratamento específico, em oposição às diferenças diretamente associadas ao fenômeno de conversão. Para definir um conjunto de genes candidatos que mais provavelmente são regulados para cima devido ao processo de conversão, os DNAcs foram identificados para satisfazer aos seguintes critérios: Para qualquer conjunto de experimentos recíprocos (i.e. Exp. 2.1, ou Exp. 2.2), a intensidade de hibridização de um dado DNAc teve de ser no mínimo .2 vezes mais alta com a sonda conversora do que com a sonda não-conversora, em no mínimo uma das hibridizações, não menos do que 1,5 vezes mais alta no experimento recíproco.

Experimento 2.1 - Folhas de linhagens quase isogênicas DH 98-325-5 e DH .98-325-6 foram tratadas com etefon e curadas por 3 dias a 30°C. A análise de alcalóide revelou que virtualmente toda a nicotina tinha sido metabolizada em nornicotina na folha de DH 98-325-6 durante esse período enquanto o mínimo de nornicotina foi observado na folha de DH 98-325-5. RNAs da planta DH 98-325-5 não-conversora foram rotulados com corante fluorescente Cy3, e os RNAs extraídos da folha de DH 98-325-6 (conversora) foram rotulados com Cy5. Os DNAcs rotulados com Cy3 e Cy5 foram incubados juntamente no mesmo chip de DNA, deixando-os hibridizar por uma noite.

Experimento 2.2 - Uma análise de microarranjo similar a Exp. 2.1 foi conduzida com o uso de linhagens quase isogências DH 98-326-3 (não-conversoras) e DH 98-326-1 (conversoras). Nesses experimentos, as folhas de cada genótipo foram tratadas com 1% de bicarbonato de sódio e curadas por 3 dias a 30°C Ao final do período de tratamento, a nicotina foi o alcalóide predominante na folha de DH 98-326-3, enquanto que aproximadamente todo o alcalóide encontrado na folha de DH .98-326-1 foi a nornicotina. Conforme descrito no Exp. 2.1, esses experimentos foram conduzidos reciprocamente.

Resultados

Em ambos os Experimentos 2.1 e 2.1, a grande maioria dos 4992 DNAcs arranjados sobre as lâminas de vidro mostraram diferenças substanciais em suas intensidades de hibridização em relação às sondas rotuladas com Cy3 e Cy5.

Dos 4992 DNAcs arranjados sobre as lâminas de vidro, apenas cinco mostraram no mínimo uma expressão duas vezes mais alta em uma hibridização, e não menos do que 1,5 vezes na hibridização recíproca para ambos os Exp. 2.1, e Exp. .2.2. Essas entradas foram designadas 3D C12, 7D_A06, 27C_C12, 33A_D06, e .34D_F06. A análise BLASTX da informação de seqüência parcial para 3D_C12 e . 7D_A06 encontrada em nossa base de dados EST previu que os DNAcs codificam duas enzimas intimamente relacionadas à enzima P450. Previu-se que 27C_C12 e .33A_D06 codificam proteínas de parede celular rica em glicina, mostrando mais de 90% de identidade de seqüência com pequenas proteínas ricas em glicina de tabaco encontradas no GenBank (e.g., N0 de Acesso. AAK57546). Constatou-se que o clone .34D_F06 contém um duplo inserto de DNAc, um inserto que mostra homologia com as quinases das proteínas serina/treonina, e o outro mostra alta identidade de seqüência com as mesmas proteínas de parede celular rica em glicina como os DNAcs de 27C C12e33AD06.

Exemplo 3: Análises de microarranjo da biblioteca de CDNA não-conversora

Após a finalização da base de dados de EST a partir da biblioteca não- conversora (gerada de folhas senescentes de genótipo DH 91-1307-46 (NC), outro conjunto de experimentos de microarranjo foi iniciado. Para a primeira geração de microarranjos, a meta foi produzir lâminas de vidro contendo um conjunto completo e não redundante de genes representados em ambas as bibliotecas.

Para obter uma estimativa do número de genes únicos que estão representados na base de dados, foi conduzida uma análise de agrupamento para identificar ESTs previstas para serem representadas múltiplas vezes na base de dados (contigs) versus aquelas previstas para serem representadas em apenas uma vez (singletons) (Huang and Madan (1999) Genome Res. 9:868-877). Devido à natureza dos algoritmos de agrupamento, as seqüências que mostraram identidade de seqüência alta, mas imperfeita, foram agrupadas dentro do mesmo contig. O conjunto total de genes únicos previstos, ou unigenes, dentro de uma base de dados é calculado como a soma dos contigs e singletons. A análise de agrupamento das bases de dados conversora e não-conversora combinadas previu 2246 contigs e 4717 singletons para um total de .6.963 unigenes. Insertos de todos os singletons e um individual para cada contig foram amplificados por PCR e arranjados em lâminas de vidro, resultando num chip de gene contendo o conjunto completo de 6.963 unigenes.

Além da criação de um novo chip de DNA, os materiais genéticos usados para gerar sondas de hibridização também diferiram daqueles usados no Exemplo 2. SC58 é uma variedade de tabaco curada por fumeiro, cujos indivíduos não-conversores são designados SC58(ctct). SC58(CtCt) é uma linhagem conversora estável quase isogênica que é originada apesar da introgressão de um lócus conversor dominante simples (Ct) encontrado nas espécies progenitoras de tabaco N. tomentosiformis dentro de SC58 (Mann et al. (1964) Crop Sei. 4:349-353). Após oito retrocruzamentos adicionais para SC58, a linhagem SC58(CtCt) quase isogênica foi criada e posteriormente mantida via autofertilização. O fenótipo de conversão de plantas SC58(CtCt) é único em relação às linhagens padrão de tabaco conversor em que o metabolismo de nicotina em nornicotina na folha não requer senescência ou curagem. Plantas que possuem o lócus conversor Ct de N. tomentosiformis contém a nornicotina como o alcalóide predominante mesmo no tecido de folhas verdes (Wernsman e Matzinger (1968) Tob. Sei. 12:226-228)

Os RNAs isolados de tecido de folhas verdes SC58(ctCt) e SC58(CtCt) foram rotulados com Cy3 e Cy5, respectivamente, e simultaneamente hibridizados para um chip de DNA contendo o conjunto inteiro de 6.963 unigenes de DNAcs. Os corantes fluorescentes foram revertidos para produzir as sondas para um experimento recíproco conforme descrito nos Exps. 2.1 e 2.2 do Exemplo 2.

Resultados

Os resultados foram avaliados usando os mesmos critérios do Exemplo 2, i.e., foram identificados os DNAcs individuais que mostraram uma hibridização no mínimo duas vezes melhor em relação os DNAcs rotulados de SC58(CtCt) versus SC58(ctCt) em um experimento, e no mínimo 1,5 vezes melhor no ensaio recíproco.

Os resultados foram comparados àqueles do Exp. 2.1, e Exp. 2.2 no Exemplo .2 acima. A hibridização melhorada dos RNAs conversores em membros codificadores de DNAcs da mesma família de P450 intimamente relacionada foi o único resultado compartilhado por todos os três experimentos de microarranjo usando os critérios definidos. 131 A_A02 é o nome do cDNA que foi arranjado sobre o chip unigene de 6963 membros, representativo da família de P450 intimamente relacionada que inclui 3D_C12 e 7D_A06 (3D_C12 e 7D_A06 não foram arranjados sobre a lâmina unigene). Nenhum outro DNAc do arranjo do Exemplo 3, que incluiu representantes dos contigs contendo os DNAcs codificadores de proteína rica em glicina 27C_C12 e 33A_D06 e 34D_F06, tiveram escores positivos pelo critérios definidos e também escore positivo no Exp. 2.1, ou Exp. 2.2 do Exemplo 2 acima, sem considerar se os resultados foram comparados individual ou coletivamente. Tabela 1. Resultados de microarranjos de membros da família do gene 3DJZ12

<table>table see original document page 76</column></row><table> <table>table see original document page 76</column></row><table> <table>table see original document page 76</column></row><table> Resultados combinados

Os resultados combinados dos experimentos de microarranjo descritos acima definiram membros de uma família de genes do P450 intimamente relacionados, daqui em diante referida como a família 3D_C12, como sendo os melhores candidatos a desempenhar um papel direto na conversão metabólica da nicotina em nornicotina em plantas de tabaco conversoras. Os resultados da hibridização dos membros dessa família P450 em cada um dos três experimentos de microarranjos são mostrados na Tabela 1. Os resultados dos microarranjos foram confirmados independentemente com o uso de ensaios de Northem Blot. Conforme mostrado na Figura 2, um sinal aproximadamente duas vezes mais alto foi observado em folhas conversoras senescentes e curadas, em comparação as suas contrapartes não conversoras quando manchas (blots) de RNA foram incubadas com uma sonda de hibridização radiorotulada de 7D_A06. Exemplo 4: Análise da seqüência da família do gene 3D C12

Uma vez que os experimentos de microarranjo definiram 3D_C12 e 7D_A06 como potencialmente envolvidos no processo de conversão, a obtenção de informação sobre a seqüência completa de DNA para esses genes torna-se a próxima etapa para sua caracterização. Os clones originais de 3D_C12 e 7D_A06 que foram sequenciados quando da geração da base de dados de EST descrita aqui (e colocados sobre os microarranjos) não eram DNAcs de comprimento inteiro. Para obter a seqüência de comprimento inteiro, primers foram gerados para corresponder às regiões na região de flanqueamento 3' e no interior das regiões de codificação que foram suficientemente polimórficas para distinguir entre 7D_A06 e 3D_C12 Esses primeiros gene-específicos foram usados em combinação com primers específicos ao sítio de clonagem de pBluescript II para amplificar os DNAcs a partir da biblioteca conversora de DNAc numa tentativa de obter a seqüência que incluísse os terminais 5' completos dos quadros de leitura de 3D_C12 e 7D_A06.

Essa estratégia levou à determinação da seqüência de DNA correspondente às regiões de codificação completas de 3D_C12 (nt 1-155Ida ID SEQ N°: 1; seqüência prevista de aminoácidos mostrada na ID SEQ N°:2) e 7D_A06 (nt 1-1554 da ID SEQ N°:7; seqüência prevista de aminoácidos mostrada na ID SEQ N°:8) (Figuras 3A-3G e .4). As análises GAP do DNA de 3D_C12 e 7D_A06 e as seqüências de proteínas previstas mostraram que elas compartilham 93,4% da identidade de seqüência e .92,3% da identidade em nível de proteína (Tabelas 2 e 3). A análise BLASTX inicial contra a base de dados GenBank não redundante revelou que 3D_C12 e 7D_A06 compartilham a maior homologia de seqüência com CYP82E1, um gene P450 de tabaco de função desconhecida que é regulado para cima em resposta a elicitores fúngicos (Takemoto et ai. (1999) Plant Cell Physiol. 40:1232-1242). A proteína CYP82E1 é 66,9% e 67,5% idêntica às seqüências de aminoácidos previstas de .3D_C12 (ID SEQ N°:2) e 7D_A06 (ID SEQ N°:8), respectivamente, e a seqüência de DNA de CYP82E1 é 72,1% e 73,5% idêntica às respectivas seqüências de codificação de 3D_C12 (nt 1-1551 da ID SEQ N°: 1) e 7D_A06 (nt 1-1554 da ID SEQ N°:7) <table>table see original document page 79</column></row><table>

<table>table see original document page 79</column></row><table>

Além de possibilitar a aquisição de informação sobre a seqüência de comprimento inteiro para os DNAcs de 3D_C12 e 7D_A06, as amplificações de PCR descritas acima produziram produtos adicionais que estavam intimamente relacionados a, ainda que claramente distintos, as seqüências de DNAc de 3D_C12 e .7D_A06. Usando um primer direcionado contra o interior da seqüência de DNAc de .3D_C12, em combinação com um primer específico ao pBluescript II, uma seqüência única designada 3D_C12-15 (Figura 3A-3G; ED SEQ N°:9; a seqüência de aminoácidos prevista mostrada em ID SEQ N°: 10) foi amplificada, além do produto esperado de 3D_C12. 3D_C12-15 é 95,5% idêntico à seqüência de DNA correspondente de 3D C12 e 92,6% idêntico a mesma região de 7D_A06 (Tabela 2).

Devido ao fragmento de 3D_C12-15 representar um membro distinto e adicional da família do gene 3D_C12, foi feita uma tentativa de obter a seqüência de DNAc de comprimento inteiro desse gene. Um primer de PCR específico aos primeiros sete códons do quadro de leitura 3D_C12-15 foi usado em combinação com um primer pBluescript II-específico em uma reação de amplificação usando uma biblioteca de DNAc conversora como template. A análise da seqüência de vários produtos de amplificação independentes falhou em revelar o gene 3D_C12-15 de comprimento inteiro. Em vez disso, um novo membro dessa família foi recuperado, designado 3D_C12-7 (Figura 3A-3G; seqüência codificadora apresentada como nt 1-1551 da ID SEQ N°:5). Através de toda a seqüência de nucleotídeos mostrada na ID SEQ N°:5, 3D_C12-7 compartilha 93,7% da identidade de seqüência de nucleotídeos com 3D_C12 (através da ID SEQ N°: 1), 94,0% de identidade de seqüência de nucleotídeo com 7D_A06 (através da ID SEQ N°:7), e 93,1% de identidade com a região correspondente do fragmento 3D_C12-15 (ID SEQ N°:9) (Tabela 2) A seqüência de aminoácidos prevista de 3D_C12-7 (ID SEQ N°:6) é 92,8% idêntica à proteína de 3D_C12 (ID SEQ N°:2), e 94,8% idêntica à proteína de 7D_A06 (ID SEQ N°:8) (Tabela 3)

Dois membros adicionais da família 3D_C12 também foram identificados. Um gene designado 3D_C12-10 (Figura 3A-3G; seqüência codificadora apresentada como nt 1-1551 da ID SEQ N°:3; seqüência codificadora apresentada como ID SEQ N°:4) foi recuperado a partir de uma reação de amplificação usando um primer de PCR complementar à seqüência na região de flanqueamento 3' de 3D_C12 juntamente com um primer Bluescript II-específico (e a biblioteca conversora como template). 3D_C12-10 difere por apenas cinco posições de nucleotídeos da seqüência de nucleotídeos de 3D_C12-7 (ID SEQ N°:5) (Figura 3A-3G), e por apenas duas posições de aminoácidos do produto de proteína de 3D_C12-7 previsto (ID SEQ N°:6) (Figura 4).

Com a finalização da base de dados de EST não-conversora, outro membro da família de genes 3D_C12 foi revelado. A seqüência parcial de DNA de 13IA _A02 (ID SEQ Ν°: 11; seqüência de aminoácidos prevista apresentada na ID SEQ N°: 12) que é encontrada nessa base de dados é 98,0% idêntica à seqüência correspondente de .3D_C12, e 94,0% idêntica a mesma região de 7D_A06 (Figura 3A-3G e Tabela 2). Conforme descrito na seção anterior, 131A_A02 é membro da família de gene de .3D_C12 que foi representada no amplo chip unigene usado em ensaios de microarranjo conforme descrito aqui.

Exemplo 5: Análise de planta transgênica de membros da família de gene 3D C12

Para determinar se os membros da família 3D_C12 de genes do citocromo P450 estão envolvidos na conversão metabólica da nicotina em nornicotina, foram geradas plantas transgênicas usando construtos desenhados seja para aumentar ou inibir a expressão do gene. Para testar os efeitos da atividade do gene relativa à regulação para cima, uma estratégia de RNA de interferência (RNAi) foi empregada. Uma região de 99-pb de 3D_C12 localizada imediatamente à montante do códon de parada (Figura 3A-3G), foi usada para criar um construto que formaria uma alça de RNAds dentro da célula da planta. Tais estruturas de RNAds são conhecidas como ativadoras de um complexo silenciador de RNAi que leva à degradação dos RNAs transgenes e dos RNAs endógenos que são idênticos ou altamente homólogos à seqüência encontrada no RNAds (Wesley et ai. (2001) Plant J. 27: 581-590; Waterhouse & Helliwell (2002) Nat. Gen. Rev. 4: 29-38).

Dado que cada membro do 3D_C12, caracterizado conforme descrito aqui, compartilha mais de 90% da identidade de seqüência de DNA, espera-se que um construto de RNAi sintetizado a partir de um membro silencie a família de genes inteira. Especificamente, o construto de RNAi gerado a partir da seqüência de .3D_C12 compartilha identidades de seqüência de 90/99 e 91/99 com os DNAcs de .7D_A06 e 3D_C12-7, respectivamente, sobre essa região (Figura 3A-3G). O construto 3D_C12/RNAi (também referido no Exemplo 7 como o construto .3D_C12Ri99) foi clonado à jusante do promotor 35S constitutivo do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV, em inglês, cauliflower mosiac viras) e introduzido dentro de uma linhagem de tabaco Burley, DH 98-325-6 fortemente conversora usando a transformação mediada por Agrobacterium.

Uma característica distintiva de silenciamento mediado por RNAi é a redução marcada na acumulação do transcrito do gene em estado estacionário cuja atividade tenha sido regulada para baixo. Para confirmar que o silenciamento de gene da família .3D_C12 ocorreu nas plantas que mostraram baixo fenótipo de nornicotina, uma análise de Northern blot foi conduzida usando RNAs isolados a partir de três das plantas transgênicas que possuíam construtos 3D_C12/RNAi e mostravam baixo fenótipo de nornicotina, dois indivíduos transformados com o construto .3D_C12/RNAi ainda mostrando altos níveis de nornicotina e uma das plantas- controle por vetor.

Para avaliar os efeitos da expressão excessiva da atividade do gene, os DNAcs de três membros da família do gene 3D_C12, para os quais primeiro foi obtida informação da seqüência de comprimento inteiro (3D_C12, 7D_A06, e 3D_C12-7) foram clonados na orientação senso à jusante do promotor de CaMV 35S. Esses construtos foram subseqüentemente introduzidos para dentro de um cultivar de N. tabacum Petite Havana usando a transformação mediada por Agrobacterium. A linhagem Petite Havana é geralmente usada por pesquisadores por causa de sua baixa estatura e tempo abreviado de geração em relação aos cultivares comerciais de tabaco. A condição conversora/não-conversora do cultivar de Petite Havana é desconhecida, mas os ensaios de alcalóide do presente pedido de patente mostraram claramente que as plantas em nossa posse eram fortes conversoras.

Embora as plantas hospedeiras nesses experimentos fossem conversoras, a presente estratégia teve o objetivo de conduzir ensaios de alcalóides em tecidos verdes e não curados, em que uma quantidade mínima de nornicotina se acumula igualmente em planta conversoras e não-conversoras (e o promotor de CaMV 35S é muito ativo). Na verdade, uma linhagem não-conversora foi propositadamente escolhida por causa da cultura do tecido - conforme requerido quando se conduz a transformação mediada por Agrobacterium - a qual é conhecida por aumentar a freqüência da conversão genética, e portanto complicaria potencialmente a interpretação dos resultados (por ex., avaliar se um novo fenótipo era atribuível somente ao transgene ou resultante da planta ter passado por conversão genética.

Resultados

Dado o alto grau de variabilidade tipicamente observado entre plantas transgênicas independentes com o mesmo construto de transgenes, 10 indivíduos transformados independentemente foram selecionados para avaliar os efeitos do construto 3D_C12/RNAi sobre a conversão metabólica de nicotina em nornicotina. Folhas da cada um dos 10 indivíduos 3D_C12/RNAi, além de duas plantas-controle transformadas apenas pelo vetor pBI121, foram tratadas com etefon e curadas por sete dias. A análise de alcalóide desses materiais é mostrada na Tabela 4. <table>table see original document page 84</column></row><table>Típico da linhagem DH 98-325-6, o tratamento e cura com etefon resultou na produção substancial de nornicotina em duas plantas-controle (48,9% e 87,8% de conversão de nicotina em nornicotina). Em um contraste surpreendente, sete de dez plantas transgênicas independentes que possuíam o construto 3D_C12/RNAi mostraram uma conversão de nicotina em nornicotina mínima, com as percentagens de conversão variando 2,8 a 7,0 por cento. As outras três linhagens de 3D_C12/RNAi mostraram conteúdos de alcalóides similares aos das plantas-controle apenas pelo vetor. Concentrações dos alcalóides menores anabasina e anatabina não parecem ser significativamente influenciadas pela presença ou ausência do transgene .3D_C12/RNAi (Tabela 4).

Embora o inserto do DNAc do gene 3D_C12-7 tenha sido usado com sonda de hibridização específica, nas condições de hibridização e lavagem usadas nesse experimento, seria esperada a hibridização cruzada para a família inteira do gene .3D_C12. Conforme mostrado na Figura 5, um forte sinal de hibridização foi detectado em cada planta que mostrou um alto fenótipo de nornicotina, e uma hibridização mínima foi detectada nas plantas transformadas com o construto .3D_C12/RNAi que mostraram um baixo fenótipo de nornicotina. Portanto, conclui-se que o silenciamento efetivo da família do gene 3D_C12 inibe a conversão metabólica de nicotina em nornicotina no tabaco.

A análise de alcalóide das plantas transgênicas Petite Havana é mostrada na Tabela 5. Quatro plantas independentemente transformadas contendo os construtos .35S:3D_C12 e 35S:3D_C12-7 foram testadas juntamente com sete indivíduos .35S:7D_A06 independentes e três plantas independentemente transformadas com o vetor controle pBI121. Conforme esperado, as folhas verdes e não curadas das plantas-controle apenas por vetor continham quantidades mínimas de nornicotina. Da mesma forma, todas as plantas transformadas com os construtos 35S:3D_C12 e .35S:7D_A06 mostraram uma conversão metabólica mínima de nicotina em nornicotina. Contudo, um fenótipo muito diferente foi observado em plantas transformadas com 35S:3D_C12-7. Todas as quatro plantas independentemente transformadas com esse construto continham nornicotina como o alcalóide predominante na folha verde não tratada; as percentagens de conversão de nicotina em nornicotina variaram de 94,6 a 98,6. <table>table see original document page 86</column></row><table> Exemplo 6: Cossupressão da família do gene 3D C12

Além da conclusão principal de que o gene 3D_C12-7 foi capaz de mediar a conversão de nicotina em nornicotina, uma observação adicional sobressaiu-se nas análises de alcalóides de plantas transgênicas de Petite Havana. O resultados de alcalóides relatados na Tabela 5 juntamente com os ensaios de alcalóides adicionais conduzidos independentemente (dados não mostrados) mostraram de modo consistente que uma das plantas transformadas com o construto 35S:3D_C12 (35S:3D_C12(1)) continha menos nicotina na folha verde não tratada do que qualquer outra planta desse estudo. Isso pode ser resultado da cossupressão da família do gene .3D_C12 nessa planta específica, um fenômeno observado freqüentemente em plantas transgênicas mesmo quando um transgene é expresso na sua orientação senso (Fagard e Vaucheret (2000) Annu. Rev. Plant Physiol. PlantMol. Biol. 51: 167-194).

Se a planta 35S:3D_C12 (1) estivesse mostrando verdadeiramente um fenótipo de cossupressão, seria esperada a manutenção desse fenótipo mesmo após o tratamento com etefon e cura das folhas, similar aos fenótipos de baixa nornicotina conferidos pelo construto 3D_C12/RNAi no genótipo conversor DH 98-325-6 conforme mostrado acima. Para testar essa predição, os perfis de alcalóide foram determinados em folhas de 35S:3D_C12 (1) tratadas com etefon e curadas e duas plantas-controle apenas por vetor. Conforme mostrado da Tabela 6, o tratamento com etefon e cura resultaram em mais de 97% de conversão de nicotina em nornicotina nas duas plantas-controle enquanto que folhas 35S:3D_C12 (1) tratadas de modo similar mostraram uma conversão negligente (0,6%). Folhas a partir de outras cinco plantas que expressaram os transgenes 35S:3D_C12 e 35S:7D_A06 também foram submetidas ao tratamento com etefon e cura. Em cada caso, um alto fenótipo de nornicotina foi observado, similar ao de plantas-controle apenas por vetor (dados não mostrados). <table>table see original document page 88</column></row><table>

Finalmente, os ensaios de Northern blot foram conduzidos na seleção de plantas que representavam cada um dos genótipos transgênicos de Petite Havana (Figura 6). Usando um DNAc de 3D_C12-7como sonda de hibridização, foi observado um sinal mínimo detectado com RNAs isolados a partir de folhas verdes não tratadas da planta-controle apenas por vetor. Em contraste, a hibridização foi facilmente detectada em amostras de RNA de todas as quatro plantas transgênicas independentes que possuíam o construto 35S:3D_C12-7. Um forte sinal de hibridização foi similarmente observado usando os RNAs de todas as outras plantas transgênicas testadas que foram transformadas com os construtos 35S:3D_C12 e .35S:7D_A06, com exceção da planta contendo baixa nornicotina 35S:3D_C12 (1).

Os resultados gerais dos ensaios de Northern blot mostram que o promotor CaMV 35S foi em geral efetivo na mediação de um alto nível de expressão gênica para cada um dos três membros da família do gene 3D_C12 testada nesse estudo. A falha na detecção de um sinal de hibridização em plantas 35S:3D_C12 (1) é consistente com a interpretação de que a família do gene 3D_C12 teria sido silenciada através da cossupressão nesse indivíduo. Exemplo 7: Caracterização e supressão adicional de genes 3D C12

Um Segundo construto de RNAi foi preparado usando seqüências de polinucleotídeos a partir da seqüência 3D_C12-7. A montagem do cassete de expressão 3D_C12-7/RNAi seguiu as mesmas etapas básicas daquelas descritas acima para 3D_C12/RNAi. Resumidamente, uma fita senso e antisenso de 298-pb do DNAc de 3D_C12-7 (ID SEQ N°:5) que corresponde à região entre as posições de nucleotídeos 297 e 594 da seqüência de codificação (posições 1-1551 da ID SEQ N°:5) foram ligadas dentro do vetor pKYLX801 à jusante a à montante do íntron de ácido graxo ômega-6 desaturase de soja de 151-pb (ver GenBank Acesso N°. DQ672337), respectivamente. Os primers (E4SFwd e E4SRev) usados para o isolamento da região de 298-pb pelos braços senso e antisenso foram 5'- AAGCTTTG ACGCC ATTTTTTCC A ATCG-3' (ID SEQ NO:27), e 5'- CTCGAGTTTTCCAGCGATCATCTTCAC-3' (ID SEQ NO:28), respectivamente. O cassete de RNAi foi removido de pKYL801 e colocado entre um promotor CaMV35S2 forte e um terminador de pequena subunidade da rubisco do vetor binário de expressão da planta pKYLX71 (ver Figura 8). Nas discussões abaixo, o construto de RNAi é referido como construto 3D_C12-7-Ri298.

Plantas transgênicas de tabaco foram geradas através de transformação mediada por Agrobacterium seguindo os procedimentos apresentados acima. Resumidamente, as plantas de tabaco Burley transformadas foram regeneradas a partir de calos em um meio Murashige-Skoog (MS) suplementado com 100 mg/L de canamicina e hormônios vegetais em uma sala de crescimento a 25°C sob um ciclo claro/escuro de 16 horas/8 horas. Os calos foram transferidos para meios de seleção frescos a cada 2-3 semanas até aparecerem os ramos. Pequenos ramos foram transferidos para meio de enraizamento para permitir o desenvolvimento da raiz por 2 semanas. Plantas completamente regeneradas foram transferidas para uma estufa e crescidas sob condições padrão.

Química SYBR ® Green I

O RNA total foi isolado a partir de folhas curadas de plantas de tabaco conversoras e não-conversoras usando o reagente TRIzol® (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA) O RNA purificado foi tratado com DNase livre de RNase (TURBO DNA-free™, Ambion, Austin, TX) A primeira fita de DNAc foi sintetizada usando 5 μ£ do RNA total e o StrataScript® First-Strand Synthesis System (Stratagene, Cedar Creek, TX). Foi empregada a RT-PCR para determinar a abundância do DNAc de 3D_C12-7 usando a química fluorescente SYBR® Green I, Morrison et ai. (1998) Biotechniques 24:954-962.

Uma curva de calibração foi gerada com uma diluição serial do DNAc de 3D_C12-7 clonado para dentro do vetor pGEM®-T Easy (Promega Corporation, Madison, WI) A mistura RT-PCR continha 2,5 mM de MgCl2, 125 μΜ de dNTP, 0,5 μΜ de cada primer, 0,5x SYBR® Green I, 0,5 μg de cDNA (ou 1 μΐ do plamídeo de referência), e 1,25 de polimerase U Platinum Taq (lnvitrogen Life Technologies). As seqüências dos primers 3D_C12-7 alelos-específicos (E4SyFwd e E4SyRev) foram 5'- ACGTG ATCCT AAACTCTGGTCTG-3' (E4SyFwd (ID SEQ N°:29)) e 5'- GCCTGCACCTTCCTTCATG-3' (E4SyRev (ID SEQ N°:30)). A RT-PCR foi realizada em um termociclador BioRad (BioRad Laboratories, Hercules, CA) ajustado para o seguinte protocolo: 95°C por 2 min; 35 ciclos de 95°C por 30 seg, 55°C por 30 seg Il0C por 50 seg, seguido de uma extensão final de 12°C por 5 min. Um fragmento de 165-pb do gene α-tubulina foi usado como padrão interno. A concentração de DNAc de 3D_C12-7 foi determinada a partir da curva de calibração transcrito-específico e normalizada para o padrão interno. O número de indução foi calculado pela divisão dos valores de fluorescência normalizados do conversor pelas amostras não-conversoras. A análise da curva de fusão foi usada para confirmar a pureza de produtos da PCR conforme descrito em Ririe et al. (1997) Anal. Biochem. 245:154-160. Duas plantas foram amostradas por tratamento e as amplificações foram repetidas três vezes.

Química TagMan®

O RNA total foi isolado de linhagens de tabaco usando o reagente TRIzol. O RNA purificado foi tratado com DNase livre de RNase (TURBO DNA-free™). A primeira fita DNAc foi sintetizada usando 10 μg de RNA total e o Kit High Capacity cDNA Archive (Applied Biosystems, Foster City, CA). A mistura RT-PCR continha IX TaqMan® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), 400 nM de cada primer (E4TmFwd e E4TmRev), 250 nM de ligador de depressões menores TaqMan® (MGB) sonda (E4MGB), 2 ng de cDNA, e água livre de nuclease (Afonina et al. (2002) Biotechniques 32:940-949). As seqüências do primer e da sonda foram 5'-CGGTAATCGGCCATCTTTTC-3' (E4TmFwd (ID SEQ N°:31)), 5'- CCGAGTTTTCGAGCTAATGGA-3' (E4TmRev(ID SEQ N°:32)), e sonda 5'- CAATGACGAACGGCGACAG-3' (MGB(ID SEQ N°:33)). A RT-PCR foi realizada em um ABI 7500 Real-Time System (Applied Biosystems, Foster City, CA) ajustado para o seguinte protocolo. 50°C por 2 min; 95°C por 10 min; 40 ciclos de 95°C por 15 seg, 60°C por 1 min. A Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (G3PDH) foi usada como o controle endógeno para normalizar a quantidade do template de cDNA dentro das reações. O número de mudanças foi determinado pela divisão dos valores de fluorescência normalizados de cada amostra por aqueles obtidos a partir de uma amostra controle não-conversora ou não curada. Para cada tratamento, o RNA foi isolado a partir de três plantas independentes e as amplificações foram repetidas 3 vezes para cada amostra.

Análises deNorthern e Southern Blot

O RNA total foi isolado a partir de folhas de tabaco curadas usando o reagente TRIzol de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, Life Technologies). Amostras de RNA total foram separadas em de gel de agarose a 1,2% em TBE, e transferidas para membranas de nylon positivamente carregadas por eletroblotting com tampão de TBE 2X. As membranas passaram por ligação cruzada UV e lavadas 2X SSC por 5 min. A hibridização de Northern blot, lavagem e detecção foram realizadas usando o Sistema digoxigenina (DIG) conforme descrito pelo fabricante (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN). O OFR de comprimento inteiro de 1,8 kb no DNAc de 3D_C12-7 cDNA foi rotulado com DIG e usado como uma sonda.

O DNA genômico foi extraído com DNAzol® (Invitrogen, Life Technologies) a partir de folhas de tabaco verdes de acordo com o protocolo do fabricante. Após a incubação com FcoRl ou enzimas de restrição Ncol por uma noite, 15 μg do DNA digerido foram separadas em gel de agarose a 0,7% em TBE, depurinadas com 0,25 M de HCl por 10 min, e desnaturadas com 0.5 N de NaOH por 30 minutos. O DNA foi marcado por uma noite por transferência capilar sobre membranas de nylon carregadas positivamente (Roche Diagnostics Corp.) e hibridizado a 65°C por uma noite com um fragmento do gene neomicina fosfotransferase II (NPT II) de 515-pb rotulado por DIG. A hibridização, lavagem, e detecção foram realizadas de acordo com os protocolos fornecidos com o DIG System. Os primers usados para as amplificações das sondas de hibridização de Northern e Southern foram E4FIFwsd (5'-ATGGTTTTTCCCATAGAAGCC-3' (ID SEQ N°:34)), E4FIRev (5'- TTTTTGGG AC AATC AGTC AAT-3' (ID SEQ N°:35)), KanFwd (5'- TG AATG AACTGC AGGACGAG-3' (ID SEQ N°:36», e KanRev (5'- AATATCACGGGTAGCCAACG-3' (ID SEQ N°:37)).

Análise de alcalóide

As folhas de tabaco foram colhidas e secas ao ar em um forno a 50°C por 2 dias. A uma amostra de 100 mg de folhas secas e esmagadas foi adicionado 0,5 ml de 2 N de NaOH em um frasco de cintilação de 20 mL. A amostra foi misturada e deixou-se incubar por 15 minutos à temperatura ambiente. Alcalóides foram extraídos pela adição de 5 mL de solução de extração [0,04% de quinolina (peso/volume) dissolvida em metil-t-butil éter] e rotacionada gentilmente em um agitador linear por .3 horas. Após a separação das fases, uma alíquota da fase orgânica foi transferida para um frasco de amostra. As amostras foram analisadas usando o cromatógrafo a gás Autosystem XL da PerkinElmer, equipado com um detector de ionização de chama, um liner de vidro de modo split/splitless de 4mm, uma coluna ID DB-5 de 30 m χ 0.53 mm. As condições cromatográficas foram as seguintes: detector de temperatura: 250°C; temperatura do injetor: 250°C; fluxo de hélio da 120°C: 20 mL/min; volume de injeção: 2 μί; condições da coluna: 120°, mantido por 1 min, 20- .280°C a taxa de alteração 30°C /min, mantido a 280°C por 2 min. A composição de alcalóide foi determinada pelo software TotalChrome Navigator usando uma curva de calibração. As médias das medidas de alcalóides foram separadas de acordo com o Protected LSD de Fisher (PROC MIXED).

Plantas

Linhagens duplo-haplóides de tabaco Burley DH 98-325-5 (325-5; não- conversoras) e DH98-325-6 (325-6; conversoras) descritas acima foram usadas em todos os experimentos, exceto para os ensaios de RT-PCR fluorogênico da nuclease 5' (TaqMan®), em que foram usadas as linhas isogênicas DH 91-1307-46 (não- conversoras) e DH 91-1307-46 (conversoras). Todas as plantas foram crescidas em uma estufa de ambiente controlado equipada com iluminação suplementar que possibilitou um ciclo claro-escuro de 10h/14h.

Para a curagem, as folhas de tabaco foram coletadas a partir de plantas conversoras e não-conversoras cerca de um mês antes da floração e tratadas por imersão de cada folha duas vezes por 10 segundos em etefon a 2% e secas por duas horas. As folhas foram curadas por até duas semanas em sacos plásticos, em ambiente escuro, até se tomarem amarelas. As folhas curadas foram usadas para análises de alcalóide e Northern. Amostras das folhas curadas submetidas à análise GC foram secas a 50°C por 2 dias. Para a análise de Southern, foram usadas folhas de tabaco verdes de plantas adultas. Para produzir a geração Ti de plantas transgênicas, as transformantes primárias (To) foram autopolinizadas, e a semente de Ti colhida foi abrigada por mudas de germinação em placas de ágar-MS contendo 100 mg/L de canamicina por 6 semanas. As sobreviventes foram transplantadas para o solo e crescidas em uma estufa conforme descrito acima. As plantas foram fertilizadas com o Professional All Purpose Plant Food de Peter (20-20-20; Spectrum Brands Inc., Madison, WI) uma vez por semana.

Análise de RT-PCR da expressão de3D C12-7 em tabaco conversor e não-conversor Ainda para caracterizar o papel de 3D_C12-7 na iV-demetilação de nicotina, foram realizados experimentos para demonstrar que a regulação da expressão de 3D_C12-7 é consistente com os níveis de atividade de iV-demetilação de nicotina observados em tabaco conversor versus não-conversor.

Para determinar a taxa de acumulação de RNAm de 3D_C12-7 em tabaco conversor e não-conversor, foi empregada uma estratégia de RT-PCR alelo-específica em tempo real. Devido ao RT-PCR envolver a detecção e medida dos produtos da amplificação de um template de PCR, o uso de primers alelo-específicos permite a quantificação de uma isoforma simples entre um grupo de seqüências altamente homólogas. Para a quantificação acurada do transcrito de 3D_C12-7, dois segmentos diferentes da região de codificação de 3D_C12-7 foram amplificados e as químicas SYBR® Green e TaqMan® foram usadas para gerar sinais fluorescentes. A análise RT-PCR que usou a química SYBR® Green I revelou um aumento de 80 vezes nos níveis do transcrito de 3D_C12-7 nas folhas curadas de tabaco conversor versus não- conversor. As análises de curva de fusão com pico único e a eletroforese em gel dos amplicons confirmaram a homogeneidade dos produtos de PCR.

No experimento de RT-PCR baseado na química TaqMan®, os níveis do transcrito de 3D_C12-7 foram quantificados em folhas de tabaco conversoras e não- conversoras, tratadas e não tratadas com etefon, que foram curadas por 0, 1 ou 5 dias. Baixos níveis dos transcritos de 3D_C12-7 foram detectados nas folhas não curadas ou após um dia de período de cura, sem considerar o tipo de conversão ou tratamento com etefon. De modo similar, os níveis de linha de base da transcrição de 3D_C12-7 foram observados em folhas conversoras e não-conversoras que foram curadas por 5 dias sem tratamento com etefon. Em contraste, um aumento de 7,5 vezes na acumulação do transcrito de 3D_C12-7 foi detectado em folhas curadas de tabaco conversor versus não-conversor, e um aumento de 70 vezes foi observado em folhas não curadas versus curadas de uma variedade de tabaco conversor quando o tratamento com etefon precedeu o período de curagem de 5 dias. Embora não pretendam ser limitados por qualquer teoria particular, esses resultados sugerem que 3D_C12-7 é um contribuinte principal para a iV-demetilação de nicotina, e é fortemente induzível por etileno em folhas senescentes de tabaco.

Supressão da conversão de nicotina em nornicotina pelos construtos 3D C12-RÍ99 e 3D C12-7-RÍ298

Para comparar a extensão na qual 3D_C12 e 3D_C12-7 mediam a supressão da produção de nornicotina, plantas de tabaco Burley conversoras e não-conversoras foram transformadas com dois vetores silenciadores de gene. Dez (10) plantas transgênicas foram regeneradas pelo construto RNAi. Cerca de 80% das plantas de tabaco que expressaram excessivamente a repetição invertida de 99-pb ou 298-pb mostraram níveis reduzidos de nornicotina em comparação aos controles de vetor vazio (Tabelas 7 e 8). No genótipo não-conversor, a expressão de 3D_C12-Ri99 e 3D_C12-7-Ri298 reduziu a conversão de nicotina em nornicotina em cerca de 1,8 vezes (2,0%) e 3,0 vezes (1,2%), respectivamente, em comparação com a taxa de conversão detectada nos controles de vetor (3,6%) (Tabela 7). Entre as plantas não- conversoras silenciadas, o nível de conversão mais baixo de 0,9% foi alcançado com o uso de construto 3D_C12-7-Ri298 (Tabela 7). - Tabela 7. Análise de alcalóide de plantas de tabaco Burley não-conversoras transformadas com o construto 3D_C12-Ri99 ou 3D_C12-7-Ri298 .

Linhagemc

<table>table see original document page 96</column></row><table>

aAs folhas de tabaco foram tratadas com etefon e curadas por 2 semanas a 25°C.

bDas plantas transformadas com um construto de RNAi, apenas são mostrados os indivíduos silenciados.

Os dados de alcalóide representam as médias de 2 mensurações.

cOs números representam indivíduos independentemente transformados.

dPercentagem de peso seco da folha.

e[% de nornicotina/(% de nicotina + % de nornicotina)] χ 100; valores seguidos por diferentes letras são significativamente diferentes de acordo com o PSD Protegido de Fisher (0,05). fDP, desvio padrão

gPlantas de tabaco transformadas apenas com o vetor pKYLX7 lforam usadas como controles. Em relação ao tabaco não-conversor, a acumulação de nornicotina foi suprimida ainda mais dramaticamente nos indivíduos silenciados das plantas fortemente conversoras (Tabela 8). Usando os construtos 3D_C12-Ri99, a conversão de nicotina foi reduzida a níveis tão baixos como 4,5% em plantas de tabaco 325-6 transformadas por 3D_C12-Ri 99, em contraste marcante com as plantas-controle 325-6 que exibiram taxas de conversão de cerca de 98%; Tabela 8). No entanto, com o uso do construto 3D_C12-7-Ri298 foram obtidas reduções ainda maiores na conversão e nicotina em nornicotina (Tabela 8). Quatro indivíduos transformados por 3D_C12-7-Ri298 converteram um valor tão baixo quanto 0,8% de sua nicotina em nornicotina, e a média aritmética das 9 transformantes silenciadas foi de 0,9% de conversão, Todas as plantas silenciadas foram morfologicamente indistinguíveis do vetor vazio e dos controles selvagens (dados não mostrados). Tabela 8. Análise de alcalóide de plantas de tabaco Burley conversoras transformadas com o construto 3D_C12-Ri99 ou 3D_C12-7-Ri298 .

<table>table see original document page 98</column></row><table>

aAs folhas de tabaco foram tratadas com etefon e curadas por 2 sèmanas a 25°C.

bDas plantas transformadas com um construto de RNAi, apenas são mostrados os indivíduos silenciados. cOs números representam indivíduos independentemente transformados. dPercentagem de peso seco da folha.

e[% de nornicotina/(% de nicotina + % de nornicotina)] χ 100; valores seguidos por diferentes letras são significativamente diferentes de acordo com o PSD Protegido de Fisher (0,05). fDP, desvio padrão

gPlantas de tabaco transformadas apenas com o vetor pKYLX7 lforam usadas como controles. Para testar a heretabilidade da supressão de nornicotina nas plantas transformadas por 3D_C12-7-Ri298, um conjunto de linhagens conversoras e não- conversoras transformadas por 3D_C12-7-Ri298 que mostraram os níveis mais baixos de conversão de nicotina foram promovidas para a geração Ti (Tabela 9). Devido à segregação do(s) transgene(s) ocorrer na progênie T|, indivíduos transgênicos foram identificados através da seleção de mudas capazes de crescer em meio contendo canamicina. Nove progênies resistentes à canamicina de cada transformante 3D_C12-7-Ri298 selecionado da geração To , e quadro indivíduos resistentes à canamicina de cada linhagem de controle de vetor selecionada foram analisados para verificar o conteúdo de alcalóide. A taxa de nicotina não diferiu significativamente entre os transformantes 3D_C12-7-Ri29S primários e sua progênie Ti, indicando uma alta heritabilidade do traço de supressão de nornicotina (ver Tabelas 7, 8 e 9). No entanto, a promoção da linhagem de controle por vetor "não-conversora" por uma única geração aumentou a taxa de conversão de nicotina em nornicotina de 4,2% a um valor médio de 11,6%, ilustrando o alto grau de instabilidade do lócus de conversão em plantas transgênicas desprovidas do construto de RNAi 3D_C12-7-Ri298- específico (Tabela 7 e 9). Em geral, esses resultados mostram que o silenciamento mediado por RNAi da subfamília do gene 3D_C12 é um meio altamente efetivo de reduzir a produção de nornicotina nas tanto nas plantas de tabaco não-conversoras como nas fortemente conversoras. Tabela 9. Análise de alcalóides de transformantes da geração Ti de 3D_C12-7-Ri298

<table>table see original document page 100</column></row><table>

aAs folhas de tabaco foram tratadas com etefon e curadas por 2 semanas a 25°C.

bAs médias e desvios-padrão (DP) representam as progênies 9 e 4 Ti do construto 3D_C 12-7-RÍ298 e linhagens vazias transformadas por vetor (vetor controle), respectivamente. cPercentagem de peso seco da folha.

d[% de nornicotina/(% de nicotina + % de nornicotina)] χ 100; valores seguidos por diferentes letras são

significativamente diferentes de acordo com o PSD Protegido de Fisher (0,015).

ePlantas de tabaco transformadas apenas com o vetor pKYLX71 foram usadas como controles. 100/103

Além do mais, a transformação de tabaco com o construto 3D_C 12-7-298 conferiu uma redução de 3,6 vezes na conversão de nicotina em relação às plantas- controle não conversoras típicas, sem afetar o crescimento e desenvolvimento da planta.

Para demonstrar que a regulação para baixo da produção de nornicotina no tabaco transformado por 3D_C 12-7-298 foi concomitante à redução dos transcritos da subfamília do gene 3D_C12, uma sonda de DNAc de 3D_C12-7 foi hibridizada com o RNA total isolado a partir de folhas curadas de plantas conversoras e não- conversoras. Um sinal fraco de hibridização foi gerado pelo RNA isolado a partir de transformantes 3D_C12-7-Ri298 que mostraram baixo conteúdo de nornicotina em contraste com o forte sinal produzido pelo RNA extraído do plasmídeo de controle ou de plantas selvagens. Esses resultados indicam que a regulação para baixo de conversão de nicotina foi resultado do silenciamento de gene mediado por RNAi do(s) gene(s) de nicotina yV-demetilase.

Determinação do número de cópias do transgene

Para determinar se a integração de múltiplas cópias de 3D_C12-7-Ri298 era requerida para produzir transplantas que mostrassem uma atividade muito baixa de nicotina yV-demetilase, foi realizada uma análise de Southern em indivíduos que exibiram acumulação de nicotina menor do que 1,5%. O número de transgenes variou amplamente entre essas plantas incluindo indivíduos que continham 1 cópia (325-5, linhagens 5 e 8; 325-6, linhagens 2 e 8), 5 cópias (325-6, linhagem 10), e 6 cópias (325-5, linhagem 6) do construto 3D_C12-7-Ri298 com o uso da análise de Southern blot do DNA genômico digerido com a enzima de restrição EcoRI. O número de cópias de transgene foi confirmado pelo uso de DNA digerido de Ncol (dados não mostrados). Esses resultados indicam que a integração de um único construto 3D_C12-7-Ri298 dentro do genoma de um tabaco fortemente conversor é suficiente para suprimir a produção de nornicotina a níveis muito baixos.

Conclusões gerais

As análises descritas nos Exemplos 1 a 6 acima resultaram na descoberta de uma família de genes P450 intimamente relacionados, designada família 3D_C12, cujos níveis de transcrito em estado estacionário coletivo foram significativamente elevados nas plantas de tabaco conversoras que metabolizaram ativamente a nornicotina em comparação a suas contrapartes não-conversoras. A análise de plantas transgênicas demonstrou que a supressão da expressão gênica dessa família P450 em linhagens conversoras de tabaco inibiu o metabolismo de nicotina em nornicotina em níveis similares aos observados em plantas não-conversoras. Além disso, a expressão senso de vários indivíduos dessa família de genes intimamente relacionados identificou um membro, designado 3D_C12-7, que desempenha um papel direto na conversão metabólica da nicotina em nornicotina. A expressão excessiva de 3D_C12-7 usando um forte promotor constitutivo causou um aumento dramático na produção de nornicotina e acumulação em folhas verdes não curadas de plantas de tabaco transgênicas, um tecido onde a nicotina é o alcalóide predominante igualmente em plantas conversoras e não-conversoras. Dado que o membro da família do citocromo P450 designado 3D_C12-10 difere de 3D_C12-7 em apenas dois resíduos de aminoácidos imediatamente após a metionina de partida e dentro da seqüência de sinal N-terminal, prevê-se que esses produtos codificados funcionam de modo idêntico.

O contraste em fenótipos alcalóides entre a planta 35S:3D_C12 (1) e as plantas-controle apenas por vetor foi mais dramático em folhas que foram tratadas com etefon e curadas (0,6% de conversão versus mais de 97% de conversão; Tabela 6). Contudo, é digno de atenção que o conteúdo de nornicotina da planta 35S:3D_C12 (1) cossuprimida foi reduzido mesmo em folhas verdes não tratadas nas quais o alto fenótipo de nornicotina geralmente não se manifesta em linhagens de tabaco conversoras ou não-conversoras. As folhas verdes não tratadas da linhagem 35S:3D_C12 (1) mostraram apenas 0,7% de conversão de nicotina em nornicotina, enquanto que cada outra planta nesse experimento mostrou percentagens de conversão variando de 1,3 a 3,7 (Tabela 5). Esse resultado sugere que a inibição da expressão do gene da família 3D_C12 pode provar ser efetivo na diminuição dos níveis de nornicotina mesmo em linhagens de tabaco nas quais a conversão genética geralmente não é um problema principal (como os tabacos curados por fumeiro) ou em indivíduos não-conversores de linhagens que são propensas à conversão genética (como tabacos Burley).

Os ensaios de Southern Blot que usam membros da família de genes 3D_C12 como sondas de hibridização apresentam padrões de banda muito complexos, sugerindo que podem existir mais membros dessa família de gene, mesmo além daqueles que foram identificados e caracterizados aqui (dados não mostrados). A hipótese de que a família de genes 3D_C12 é composta por membros adicionais ainda é apoiada pela publicação recente de 75 DNAcs de tabacos P450 de comprimento inteiro com função desconhecida (Publicação de Pedido de Patente dos EUA 20040162420). Dentro dessa lista de P450s estão os DNAcs

adicionais que seriam, com base no trabalho descrito aqui, colocados dentro da família 3D_C12 em vista da identidade de seqüência de aminoácidos de mais de 90% em relação às seqüências de proteína mostradas na Figura 4.

A respeito da função molecular específica do gene 3D_C12-7 ou do membro aproximadamente idêntico da família 3D_C12-10, é possível que essa função seja codificar a enzima nicotina demetilase que catalisa a TV-demetilação oxidativa de nicotina em nornicotina (Figura 1). De modo alternativo, a enzima codificada de 3D_C12-7 ou a enzima aproximadamente idêntica codificada de 3D_C12-10 pode produzir um produto que leva à regulação para cima da atividade da nicotina demetilase da folha, em oposição à catalisação direta da reação de /V-demetilação.

Além disso, uma RT-PCR alelo-específica foi empregada para comparar a expressão de 3D-C12-7 entre as plantas conversoras e não-conversoras (Exemplo 7). Foi identificado um aumento de aproximadamente 80 vezes na expressão de 3D-C12- 7 em plantas conversoras versus não-conversoras com o uso do ensaio SYBR® Green-chemistry RT-PCR. Uma regulação para cima de 7,5 vezes foi identificada pelo experimento RT-PCR baseado em química TaqMan®. Embora a variedade de tabaco DH 91-1307-46 usada no experimento de RT-PCR baseado em química TaqMan® exiba um nível leve a moderado de conversão de nicotina, as plantas não- conversoras DH98-325-5 usadas no ensaio RT-PCR baseado em SYBR® Green convertem de modo consistente uma percentagem muito baixa de nicotina em nornicotina. A expressão do gene 3D-C12-7 foi induzida no mínimo 7 vezes por etileno em folhas senescentes de plantas de tabaco conversoras.

Um construto de RNAi adicional, 3D_C12-7-Ri298, foi preparado com base em uma região do polinucleotídeo de 3D_C12-7 que corresponde às posições de nucleotídeos 297 a 594 da ID SEQ N°:5. A expressão desse construto de RNAi permite a supressão da produção de nornicotina em uma linhagem de tabaco fortemente conversora abaixo dos níveis normalmente encontrados em plantas não- conversoras. O cassete de expressão do construto 3D_C12-7-Ri298 codificou um RNA em alça combinado por íntron no qual a região do caule foi engenheirada a partir do fragmento de 298-pb do DNAc de 3D_C12-7 inserido como uma repetição invertida. O Ioop da alça foi criado pela colocação de um íntron de 151-pb do gene FAD entre os dois lados das seqüências palindrômicas. Um braço de comprimento de 298-pb foi usado para as repetições invertidas.

As plantas transformadas de 3D_C12-7-Ri298 acumularam menos nornicotina do que aquelas que hospedaram o construto 3D_C12-Ri99 (Tabelas 7 e 8) Nenhuma correlação foi encontrada entre o número de cópias do construto 3D_C12-7-Ri298 e a produção de nornicotina (Tabelas 7 e 8). O cassete de expressão 3D_C12-7-Ri298 possibilitou a produção de tabaco com uma taxa de conversão tão baixa quanto 0,8%, que está abaixo da taxa de 3 a 5% detectada em linhagens Burley usadas como produtoras de sementes. Essa redução surpreendente na produção de nornicotina pelo direcionamento a essa região particular do polinucleotídeo de 3D_C12-7 é um resultado inesperado. Também, a supressão da produção de nornicotina mostrou um alto grau de heritabilidade na progênie Ti dos transformantes primários (Tabela 9). A supressão da produção de nornicotina nessas plantas transgênicas não produziu diferenças óbvias no crescimento e desenvolvimento quando comparadas às plantas de tipo selvagem.

Todas as publicações e pedidos de patentes mencionados na especificação são indicativos do nível daquelas pessoas habilitadas na técnica a qual essa invenção pertence. Todas as publicações e pedidos de patentes estão incorporados aqui por referência como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse especifica e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

Embora a invenção precedente tenha sido descrita em detalhe através de ilustrações e exemplos para fins de clareza e compreensão, será óbvio que certas mudanças e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações anexas. LISTAGEM DE SEQUENCIA

<110> Depositantes: Dewey, Ralph E.

Siminszky, Balazs Bowen, Steven W.

Gavilano, Lily

<120> Título da Invenção: PLANTA TRANSGÊNICA DE NICOTIANA, SEMENTE,

CONSTRUTO DE ÁCIDO NUCLÉICO RECOMBINANTE E MÉTODO DE REDUÇÃO DA CONVERSÃO DE NICOTINA

EM NORNICOTINA EM UMA PLANTA DE NICOTIANA

<130> Referência do documento: 035051/333142

<150> Número do Documento de Prioridade: 11/580,765

<151> Data de Depósito do Documento de Prioridade: 13-10-2006

<150> Número do Documento de Prioridade: PCT/US2005/005665 <151> Data de Depósito do Documento de Prioridade: 23-02-2005

<160> Quantidade de SEQ ID NOs.: 37

<170> Software: FastSEQ para Versão Windows 4.0

<210> SEQ ID NO: 1

<211> Comprimento: 1733

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Nicotiana sp.

<220> Características: <221> Nome/Chave: CDS <222> Localização: (1)...(1551)

<400> Seqüência: 1

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<210> SEQ ID NO: 2

<211> Comprimento: 517

<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Nicotiana sp.

<400> Seqüência: 2 Met Val Fen Pro Ile Glu Ala Fen Val Gli Leu Val Tre Fen Tre Fen

Leu Leu Tir Fen Leu Trp Tre Lis Lis Ser Gln Lis Leu Pro Lis Pro

Leu Pro Pro Lis Ile Pro Gli Gli Trp Pro Val Ile Gli His Leu Fen His Fen Asn Asn Asp Gli Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lis Leu Gli

Asp Leu Ala Asp Lis Tir Gli Pro Val Fen Tre Fen Arg Leu Gli Leu

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<210> SEQ ID NO: 5

<211> Comprimento: 1733

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Nicotiana sp.

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<211> Comprimento: 517

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Leu Fen Tir Fen Leu Trp Tre Lis Lis Ser Gln Lis Pro Ser Lis Pro

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Val Glu Arg Fen Lis Lis Ala Fen Lis Asp Fen Met Ile Leu Ser Met 210 215 220

Glu Fen Val Leu Trp Asp Ala Fen Pro Ile Pro Leu Fen Lis Trp Val 225 230 235 240

Asp Fen Gln Gli His Val Lis Ala Met Lis Arg Tre Fen Lis Asp Ile 245 250 255

Asp Ser Val Fen Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Lis Lis Arg Glu 260 265 270

Lis Ile Met Glu Val Gli Tre Glu Gli Asn Glu Gln Asp Fen Ile Asp 275 280 285

Val Val Leu Ser Lis Met Ser Asn Glu Tir Leu Gli Glu Gli Tir Ser 290 295 300

Arg Asp Tre Val Ile Lis Ala Tre Val Fen Ser Leu Val Leu Asp Ala 305 310 315 320

Ala Asp Tre Val Ala Leu His Ile Asn Cis Gli Met Ala Leu Leu Ile 325 330 335

Asn Asn Gln Asn Ala Leu Lis Lis Ala Gln Glu Glu Ile Asp Tre Lis 340 345 350

Val Gli Lis Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lis Asp Leu Val 355 360 365

Tir Leu Gln Ala Ile Val Lis Glu Val Leu Arg Leu Tir Pro Pro Gli 370 375 380

Pro Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cis Val Val Ser Gli 385 390 395 400

Tir His Ile Pro Lis Gli Tre Arg Leu Fen Ala Asn Val Met Lis Leu 405 410 415

Gln Arg Asp Pro Lis Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lis Fen Asn Pro Glu 420 425 430

Arg Fen Ile Ala Arg Asp Ile Asp Fen His Gli Gln His Tir Glu Tir 435 440 445

Ile Pro Fen Gli Ser Gli Arg Arg Ser Cis Pro Gli Met Tre Tir Ala 450 455 460

Leu Gln Val Glu His Leu Tre Met Ala His Leu Ile Gln Gli Fen Asn 465 470 475 480

Tir Arg Tre Pro Tre Asp Glu Pro Leu Asp Met Lis Glu Gli Ala Gli 485 490 495

Ile Tre Ile Arg Lis Val Asn Pro Val Lis Val Ile Ile Tre Pro Arg 500 505 510

Leu Ala Pro Glu Leu Tir 515 <210> SEQ ID NO: 9 <211> Comprimento: 53 9 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Nicotiana sp.

<220> Características:

<221> Nome/Chave: CDS

<222> Localização: (1)...(539)

<400> Seqüência: 9

atg gtt ttt ccc ata gaa gcc ttt gta gga cta gta acc ttc aca ttt 48

Met Val Fen Pro Ile Glu Ala Fen Val Gli Leu Val Tre Fen Tre Fen

ctc tta tac ttc cta tgg aca aaa aaa tct caa aaa ctt cca aaa ccc 96

Leu Leu Tir Fen Leu Trp Tre Lis Lis Ser Gln Lis Leu Pro Lis Pro

tta cca ccg aaa ate ccc gga gga tgg ccg gta ate ggc cat ctt ttt 144

Leu Pro Pro Lis Ile Pro Gli Gli Trp Pro Val Ile Gli His Leu Fen

cac ttc aat aac gac ggc gac gac cgt cca tta gct cga aaa ctc gga 192

His Fen Asn Asn Asp Gli Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lis Leu Gli

gac tta gct gat aaa tac ggc ccc gtt ttc act ttt cgg cta ggt ctt 240

Asp Leu Ala Asp Lis Tir Gli Pro Val Fen Tre Fen Arg Leu Gli Leu

ccc ctt gtg cta gtt gta age agt tac gaa gct ata aaa gat tgc ttc 288

Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tir Glu Ala Ile Lis Asp Cis Fen

tct aca aat gat gcc att ttc tcc aat cgt cca gct ttt ctt tat ggc 336

Ser Tre Asn Asp Ala Ile Fen Ser Asn Arg Pro Ala Fen Leu Tir Gli

gaa tac ctt ggc tac agt aat gcc atg cta ttt tga caa aat acg gac 3 84

Glu Tir Leu Gli Tir Ser Asn Ala Met Leu Fen * Gln Asn Tre Asp

ctt act ggc gaa aaa ata gaa aat tag tca ttc agg aag ttc tct gtg 432

Leu Tre Gli Glu Lis Ile Glu Asn * Ser Fen Arg Lis Fen Ser Val

cta gtc gtc tcg aaa aat tga age acg tga gat ttg gtg aaa ttc aga 480

Leu Val Val Ser Lis Asn * Ser Tre * Asp Leu Val Lis Fen Arg

cga gea tta aga att tat aca ctc gaa ttg atg gaa att cga gta cga 52 8

Arg Ala Leu Arg Ile Tir Tre Leu Glu Leu Met Glu Ile Arg Val Arg

taa ate taa ca 539

* Ile * <210> SEQ ID NO: 10 <211> Comprimento: 173 <212> Tipo: PRT <213> Organismo: Nicotiana sp.

<400> Seqüência: 10

Met Val Fen Pro Ile Glu Ala Fen Val Gli Leu Val Tre Fen Tre Fen Leu Leu Tir Fen Leu Trp Tre Lis Lis Ser Gln Lis Leu Pro Lis Pro Leu Pro Pro Lis Ile Pro Gli Gli Trp Pro Val Ile Gli His Leu Fen His Fen Asn Asn Asp Gli Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lis Leu Gli Asp Leu Ala Asp Lis Tir Gli Pro Val Fen Tre Fen Arg Leu Gli Leu Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tir Glu Ala Ile Lis Asp Cis Fen Ser Tre Asn Asp Ala Ile Fen Ser Asn Arg Pro Ala Fen Leu Tir Gli Glu Tir Leu Gli Tir Ser Asn Ala Met Leu Fen Gln Asn Tre Asp Leu Tre Gli Glu Lis Ile Glu Asn Ser Fen Arg Lis Fen Ser Val Leu Val Val Ser Lis Asn Ser Tre Asp Leu Val Lis Fen Arg Arg Ala Leu Arg Ile Tir Tre Leu Glu Leu Met Glu Ile Arg Val Arg Ile

<210> SEQ ID NO: 11 <211> Comprimento: 666 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Nicotiana sp.

<220> Características:

<221> Nome/Chave: CDS

<222> Localização: (1) .. . (666)

<400> Seqüência: 11

atg gtt ttt ccc ata gaa gcc att gta gga gca gta acc cta att aca 48 Met Val Fen Pro Ile Glu Ala Ile Val Gli Ala Val Tre Leu Ile Tre ttt etc tta tac ttc cta tgt aca aaa aaa tct caa aaa cat tca aag 96

Fen Leu Leu Tir Fen Leu Cis Tre Lis Lis Ser Gln Lis His Ser Lis

ccc tta cca acg aaa ate ccc gga gga tgg ccg gta ate ggc cat ctt Pro Leu Pro Tre Lis Ile Pro Gli Gli Trp Pro Val Ile Gli His Leu

ttc cac ttc aat aac gac ggc gac gac cgt cca ttt gct cga aaa ctc Fen His Fen Asn Asn Asp Gli Asp Asp Arg Pro Fen Ala Arg Lis Leu

gga gac tta gct gat aaa tac ggc ccc gtt ttc act ttt cgg cta ggt Gli Asp Leu Ala Asp Lis Tir Gli Pro Val Fen Tre Fen Arg Leu Gli ctt ccc ctt gtg cta gtt gta age agt tac gaa gct ata aaa gat tgc 288

Leu Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tir Glu Ala Ile Lis Asp Cis

.85 90 95

ttc tet aca aat gac gcc att ttc tcc aat cgt cca gct ttt ctt tac 336

Fen Ser Tre Asn Asp Ala Ile Fen Ser Asn Arg Pro Ala Fen Leu Tir

.100 105 110

ggc gaa tac ctt ggc tac aat aat aca atg ctt ttt cta gea aat tac 3 84

Gli Glu Tir Leu Gli Tir Asn Asn Tre Met Leu Fen Leu Ala Asn Tir

.115 120 125

gga cct tac tgg cga aaa aat cgt aaa tta gtc att cag gaa gtt ctc 432

Gli Pro Tir Trp Arg Lis Asn Arg Lis Leu Val Ile Gln Glu Val Leu

. 130 135 140

tet gct agt cgt ctc gaa aaa ttc aaa caa gtg aga ttc acc aga att 480

Ser Ala Ser Arg Leu Glu Lis Fen Lis Gln Val Arg Fen Tre Arg Ile

.145 150 155 160

caa acg age att aag aat tta tac act cga att aat gga aat tcg agt 52 8

Gln Tre Ser Ile Lis Asn Leu Tir Tre Arg Ile Asn Gli Asn Ser Ser

.165 170 175

acg ata aat cta agt gat tgg tta gaa gaa ttg aat ttt ggt ctg atc 57 6

Tre Ile Asn Leu Ser Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Fen Gli Leu Ile

.180 185 190

gtg aaa atg ate gct ggg aaa aat tat gaa tcc ggt aaa gga gat gaa 62 4

Val Lis Met Ile Ala Gli Lis Asn Tir Glu Ser Gli Lis Gli Asp Glu

.195 200 205

caa gtg gaa aga ttt aag aat gcg ttt aag gat ttt atg gtt 666 Gln Val Glu Arg Fen Lis Asn Ala Fen Lis Asp Fen Met Val 210 215 220

<210> SEQ ID NO: 12

<211> Comprimento: 222

<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Nicotiana sp.

<400> Seqüência: 12 Met Val Fen Pro Ile Glu Ala Ile Val Gli Ala Val Tre Leu Ile Tre .15 10 15

Fen Leu Leu Tir Fen Leu Cis Tre Lis Lis Ser Gln Lis His Ser Lis

.20 25 30

Pro Leu Pro Tre Lis Ile Pro Gli Gli Trp Pro Val Ile Gli His Leu .50 35 40 45

Fen His Fen Asn Asn Asp Gli Asp Asp Arg Pro Fen Ala Arg Lis Leu

.50 55 60

Gli Asp Leu Ala Asp Lis Tir Gli Pro Val Fen Tre Fen Arg Leu Gli .65 70 75 80

Leu Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tir Glu Ala Ile Lis Asp Cis

.85 90 95

Fen Ser Tre Asn Asp Ala Ile Fen Ser Asn Arg Pro Ala Fen Leu Tir

.100 105 110

Gli Glu Tir Leu Gli Tir Asn Asn Tre Met Leu Fen Leu Ala Asn Tir 60 115 120 125 Gli Pro Tir Trp Arg Lis Asn Arg Lis Leu Val Ile Gln Glu Val Leu 130 135 140 Ser Ala Ser Arg Leu Glu Lis Fen Lis Gln Val Arg Fen Tre Arg Ile 145 150 155 160 Gln Tre Ser Ile Lis Asn Leu Tir Tre Arg Ile Asn Gli Asn Ser Ser 165 170 175 Tre Ile Asn Leu Ser Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Fen Gli Leu Ile 180 185 190 Val Lis Met Ile Ala Gli Lis Asn Tir Glu Ser Gli Lis Gli Asp Glu 195 200 205 Gln Val Glu Arg Fen Lis Asn Ala Fen Lis Asp Fen Met Val 210 215 220 <210> SEQ ID NO: : 13 <211> Comprimento: 99

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Seqüência de codificação parcial selecionada a partir da SEQ ID Ns : 1

<400> Seqüência: 13

gacgaggcct tggatatgaa ggaaggtgca ggcataacca tacgtaaggt aaatccagtg 60 gaattgataa taacgcctcg cttggcacct gagctttac 99

<210> SEQ ID NO: 14 <211> Comprimento: 99

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Seqüência de codificação parcial selecionada a partir da SEQ ID Na : 3

<400> Seqüência: 14

gacgagccct tggatatgaa ggaaggtgca ggcataacta tacgtaaggt aaatcctgtg 60 gaactgataa tagcgcctcg cctggcacct gagctttat 99

<210> SEQ ID NO: 15 <211> Comprimento: 99 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Seqüência de codificação parcial selecionada a partir da SEQ ID Na : 5

50 <400> Seqüência: 15

gacgagccct tggacatgaa ggaaggtgca ggcataacta tacgtaaggt aaatcctgtg 60 gaactgataa tagcgcctcg cctggcacct gagctttat 99

<210> SEQ ID NO: 16

<211> Comprimento: 99

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Seqüência de codificação parcial selecionada a partir da SEQ ID N2 : 7 <400> Seqüência: 16

gatgagccct tggatatgaa agaaggtgca ggcataacta tacgtaaggt aaatcctgtg 60 aaagtgataa ttacgcctcg cttggcacct gagctttat 99

<210> SEQ ID NO: 17 <211> Comprimento: 19 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Primer

<400> Seqüência: 17

cgctctagaa ctagtgatc 19

<210> SEQ ID NO: 18 <211> Comprimento: 20 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Primer

<400> Seqüência: 18

tttttgggac aatcagtcaa 2 0

<210> SEQ ID NO: 19 <211> Comprimento: 23 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características: <223> Primer

<400> Seqüência: 19

gttagattta tcgtactcga att 23

<210> SEQ ID NO: 20 <211> Comprimento: 26 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Primer

<400> Seqüência: 20

ttcatttcaa attattttat gcacca 26

<210> SEQ ID NO: 21 <211> Comprimento: 21 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características: <223> Primer <400> Seqüência: 21

atggtttttc ccatagaagc c 21

<210> SEQ ID NO: 22 <211> Comprimento: 17 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Primer

<400> Seqüência: 22

tcgaggtcga cggtatc 17

<210> SEQ ID NO: 23 <211> Comprimento: 1118 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Nicotiana sp.

<400> Seqüência: 23 ctgtcattaa agcaacggtg tttgtaagtt ttttgaggag cagacatgtt aataataatt aggttcgagc ctcaggtgca accactaatg cccctaattg gagtgtggct cttcccgaac tatcagactg acctttttgt taaactatct gaatggtaaa cagaaaaaga tgagattatt gggaggtaaa acggtatcta ccagttgaga tgaataaaaa tgaaatagta tttaccactc taacctctta taattgattg aaccacgttg cataagaaaa atgaaaccaa acggaattct cttgttgaat atagattcat gtcgttattc tcaaagttaa tacttatgtc atttggtttg gtctattata gaatagtgat tatttagagg ttattggatt aaaaatagaa tatacaggta aaataaactt gacctcgtac aattctaaga gttaatcaat taaaaaaatc atagtataga actaactaaa acaaggtatg tgaataattg gagtttggtc ttggatgcag cagacacagt attgataaac aatcaaaagg ccttgacgaa

catctgtcat ttttcattta ttcactttta 60 tggagcaact gtaaagttat ctatgtgtac 12 0 cttgtattag attatgttgt ctgcatcata 180 cctgcaatgc tggatgctgg atgctttatg 240 aaatactaag gatgatttaa taaaaatata 300 tttggggcta tatggattcg cccgggcttt 360 ctttactcca gaactttatc tcgagagctc 420 caaaatcttt gatggtaaaa agatgagata 480 atagaataaa acttctttac tcccattcag 540 tctctttttt agggggaaat tccttaattg 600 tatttttaat aatgatgaaa atcaatatag 660 cggacaagtt atattggaac tatataatac 720 atatacattt tttttggata aatatttgat 780 aggtctaaaa cgtgtgtttg cttttacact 840 aaatatttga aataaatgaa ttattttatt 900 tgagatgtgt gcatacttgg caataactat 960 atattccttt tttaattatt cttttttcca 1020 tgctcttcac ataaattggg gaatggcatt 1080 agcacaag 1118

<210> SEQ ID NO: 24 <211> Comprimento: 998 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Nicotiana sp.

<400> Seqüência: 24 gtaagttcat ctgtcatttt tcatttattc aataatttgg agcaactgta aagttatcta actaatgctt gtattagatt atgttgtctg cccgaaccct gcaatgctgg atgctggatg actatctaaa tactaaggat gatttaataa gattattttt ggggctatat ggattcgccc gttgagactt tactccagaa ctttatctcg accactccaa aatctttgat ggtaaaaaga cacgttgata gaataaaact tctttactcc gaattcttct cttttttagg gggaaattcc gttattctat ttttaataat gatgaaaatc tggtttgcgg acaagttata ttggaactat ttagaggata tacatttttt ttggataaat acaggtaagg tctaaaacgt gtgtttgctt

acttttattt tgaggagcag acatgttaat 60 tgtgtacagg ttcgagcctc aggtgcaacc 12 0 catcataccc ctaattggag tgtggctctt 180 ctttatgtat cagactgacc tttttgttaa 240 aaatatagaa tggtaaacag aaaaagatga 3 00 gggctttggg aggtaaaacg gtatctacca 360 agagctctga ataaaaatga aatagtattt 42 0 tgagatataa cctcttataa ttgattgaac 480 cattcagcat aagaaaaatg aaaccaaacg 540 ttaattgctt gttgaatata gattcatgtc 600 aatatagtca aagttaatac ttatgtcatt 660 ataatacgtc tattatagaa tagtgattat 72 0 atttgattta ttggattaaa aatagaatat 780 ttacactaaa taaacttgac ctcgtacaat 840 tctaagaaaa tatttgaaat aaatgaatta ttttattgtt aatcaattaa aaaaatcata 900 gtatagatga gatgtgtgca tacttggcaa taactatact aactaaaaca aggtatgtga 960 ataattgata ttcctttttt aattattctt ttttccag 998

<210> SEQ ID NO: 25 <211> Comprimento: 2 0 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características: <223> Primer PCR

<400> Seqüência: 25

ctgtcattaa agcaacggtg 20

<210> SEQ ID NO: 26

<211> Comprimento: 20

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Primer PCR

55

<400> Seqüência: 26

ggccttgacg aaagcacaag 20

<210> SEQ ID NO: 27 <211> Comprimento: 27 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Primer de oligonucleotídeo

<400> Seqüência: 27 aagctttgac gccatttttt ccaatcg 27

<210> SEQ ID NO: 28

<211> Comprimento: 27

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Primer de oligonucleotídeo

45 <400> Seqüência: 28

ctcgagtttt ccagcgatca tcttcac 27

<210> SEQ ID NO: 29

<211> Comprimento: 2 3

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Primer de oligonucleotídeo

<400> Seqüência: 29

acgtgatcct aaactctggt ctg 23

<210> SEQ ID NO: 30 <211> Comprimento: 19 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Primer de oligonucleotídeo

<400> Seqüência: 30

gcctgcacct tccttcatg 19

<210> SEQ ID NO: 31 <211> Comprimento: 20 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Primer de oligonucleotídeo

<400> Seqüência: 31 cggtaatcgg ccatcttttc

<210> SEQ ID NO: 32

<211> Comprimento: 21

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Primer de oligonucleotídeo

<400> Seqüência: 32

ccgagttttc gagctaatgg a 21

<210> SEQ ID NO: 33 <211> Comprimento: 19 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Primer de oligonucleotídeo

<400> Seqüência: 33 caatgacgaa cggcgacag 19

<210> SEQ ID NO: 34

<211> Comprimento: 21

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Primer de oligonucleotídeo

<400> Seqüência: 34

atggtttttc ccatagaagc c 21

<210> SEQ ID NO: 35

<211> Comprimento: 21

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Primer de oligonucleotídeo <400> Seqüência: 35

tttttgggac aatcagtcaa t 21

<210> SEQ ID NO: 36 <211> Comprimento: 20 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Primer de oligonucleotídeo

<400> Seqüência: 36

tgaatgaact gcaggacgag 2 0

15 <210> SEQ ID NO: 37

<211> Comprimento: 2 0

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

2 0 <220> Características:

<223> Primer de oligonucleotídeo

<400> Seqüência: 37 aatatcacgg gtagccaacg

20

Claims (54)

1. Planta transgênica de Nicotiana caracterizada por ter uma taxa de conversão de nicotina em nornicotina de aproximadamente menos de 2%, em que as plantas abrangem um construto de ácido nucléico heterólogo que inclui um promotor capaz de funcionar em uma célula de planta, ligado operacionalmente a uma seqüência de ácido nucléico, que tem a primeira seqüência de nucleotídeos com um fragmento de cerca de 100 a 400 nucleotídeos do polinucleotídeo de nicotina demetilase de Nicotiana, e uma segunda seqüência de nucleotídeos capaz de formar um RNA de dupla fita com a primeira seqüência de nucleotídeos, sendo que as plantas transgênicas de Nicotiana são linhagens transgênicas conversoras de Nicotiana .

2. Planta transgênica de Nicotiana de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dita conversão é medida após da cura.

3. Planta transgênica de Nicotiana de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ter menos de aproximadamente 1% de conversão de nicotina em nornicotina.

4. Planta transgênica de Nicotiana de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dito fragmento do polinucleotídeo de nicotina demetilase de tabaco abrange nucleotídeos da região do polinucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste de uma seqüência codificadora e uma seqüência de íntrons.

5. Planta transgênica de Nicotiana de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que dita região é uma seqüência codificadora que tem no mínimo 90% da identidade de seqüência com a seqüência codificadora da nicotina demetilase apresentada nos nucleotídeos 1 a 1551 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5

6. Planta transgênica de Nicotiana de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que dito fragmento do polinucleotídeo de nicotina demetilase abrange nucleotídeos a partir da região de tal polinucleotídeo de nicotina demetilase que corresponde à posição de nucleotídeo 265 à posição de nucleotídeo -625 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.

7. Planta transgênica de Nicotiana de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo de nicotina demetilase abrange a seqüência apresentada na ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5, e na qual o dito fragmento abrange os nucleotídeos 265 a 625 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.

8. Planta transgênica de Nicotiana de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que dito fragmento do polinucleotídeo de nicotina demetilase abrange nucleotídeos a partir da região do polinucleotídeo de nicotina demetilase que corresponde à posição de nucleotídeo 297 à posição de nucleotídeo 594 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.

9. Planta transgênica de Nicotiana de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo de nicotina demetilase abrange a seqüência apresentada na ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5, e na qual o dito fragmento abrange os nucleotídeos 297 a 594 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.

10. Planta transgênica de Nieotiana de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a segunda seqüência de nucleotídeos abrange o complemento de nucleotídeos 297 a 594 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.

11. Planta transgênica de Nicotiana de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a primeira e segunda seqüências de nucleotídeos são ligadas por uma seqüência de íntrons.

12. Planta transgênica de Nieotiana de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que dita seqüência de íntrons é uma seqüência de íntrons passível de ser combinada.

13. Planta transgênica de Nieotiana de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o fragmento de polinucleotídeo de nicotina demetilase de tabaco abrange uma região de uma seqüência codificadora que tem no mínimo .90% da identidade de seqüência com a seqüência codificadora da nicotina demetilase apresentada nos nucleotídeos 1 a 1551 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.

14. Planta transgênica de Nicotiana de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que dito fragmento do polinucleotídeo de nicotina demetilase abrange nucleotídeos a partir da região de tal polinucleotídeo de nicotina demetilase que corresponde à posição de nucleotídeo 265 à posição de nucleotídeo .625 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.

15. Planta transgênica de Nicotiana de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo de nicotina demetilase abrange a seqüência apresentada na ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5, e na qual o dito fragmento abrange os nucleotídeos 265 a 625 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.

16. Planta transgênica de Nicotiana de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o dito fragmento do polinucleotídeo de nicotina demetilase abrange nucleotídeos a partir da região de tal polinucleotídeo de nicotina demetilase que corresponde à posição de nucleotídeo 297 à posição de nucleotídeo . 594 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.

17. Planta transgênica de Nieotiana de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo de nicotina demetilase abrange a seqüência apresentada na ID SEQ N°:3 ou ED SEQ N°:5, na qual o dito fragmento abrange os nucleotídeos 297 a 594 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.

18. Planta transgênica de Nieotiana de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a segunda seqüência de nucleotídeos abrange o complemento de nucleotídeos 297 a 594 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.

19. Planta transgênica de Nieotiana de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que a planta de tabaco transgênica é crescida no campo.

20. Semente caracterizada por ser obtida a partir da planta transgênica de Nicotiana de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 19.

21. Construto de ácido nucléico recombinante caracterizado por abranger um promotor capaz de funcionar em uma célula de planta ligada operacionalmente a uma seqüência de ácido nucléico que tem uma primeira seqüência de nucleotídeos abrangendo um fragmento de cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 400 nucleotídeos de um tabaco de polinucleotídeo de nicotina demetilase capaz de formar um RNA de dupla fita com a primeira seqüência de nucleotídeos.

22. Construto de ácido nucléico recombinante de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o dito fragmento do polinucleotídeo de nicotina demetilase de tabaco abrange nucleotídeos da região dos polinucleotídeos selecionados a partir do grupo que consiste de uma seqüência codificadora e uma seqüência de íntrons.

23. Construto de ácido nucléico recombinante de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a dita região é uma seqüência codificadora que tem no mínimo 90% da identidade de seqüência com a seqüência codificadora da nicotina demetilase apresentada nos nucleotídeos 1 a 1551 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5

24. Construto de ácido nucléico recombinante de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que dito fragmento do polinucleotídeo de nicotina demetilase abrange nucleotídeos a partir da região de tal polinucleotídeo de nicotina demetilase que corresponde à posição de nucleotídeo 265 à posição de nucleotídeo 625 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.

25. Construto de ácido nucléico recombinante de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de nicotina demetilase abrange a seqüência apresentada na ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5, e na qual o dito fragmento abrange os nucleotídeos 265 a 625 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°: 5.

26. Construto de ácido nucléico recombinante de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o dito fragmento do polinucleotídeo de nicotina demetilase abrange nucleotídeos a partir da região de tal polinucleotídeo de nicotina demetilase que corresponde à posição de nucleotídeo 297 à posição de nucleotídeo 594 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.

27. Construto de ácido nucléico recombinante de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de nicotina demetilase abrange a seqüência apresentada na ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5, e na qual o dito fragmento abrange os nucleotídeos 297 a 594 da ID SEQ N°: 3 ou ID SEQ N°:5.

28. Construto de ácido nucléico recombinante de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a segunda seqüência de nucleotídeos abrange o complemento de nucleotídeos 297 a 594 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.

29. Construto de ácido nucléico recombinante de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a primeira e segunda seqüências de nucleotídeos são ligadas por uma seqüência de íntrons.

30. Construto de ácido nucléico recombinante de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que dita seqüência de íntrons é uma seqüência de íntrons passível de ser combinada.

31. Construto de ácido nucléico recombinante de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o fragmento de polinucleotídeo de nicotina demetilase de tabaco abrange uma região de uma seqüência codificadora que tem no mínimo 90% da identidade de seqüência com a seqüência codificadora da nicotina demetilase apresentada nos nucleotídeos 1 a 1551 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.

32. Construto de ácido nucléico recombinante de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que dito fragmento do polinucleotídeo de nicotina demetilase abrange nucleotídeos a partir da região de tal polinucleotídeo de nicotina demetilase que corresponde à posição de nucleotídeo 265 à posição de nucleotídeo 625 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.

33. Construto de ácido nucléico recombinante de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de nicotina demetilase abrange a seqüência apresentada na ID SEQ N°: 3 ou ID SEQ N°: 5, e na qual o dito fragmento abrange os nucleotídeos 265 a 625 da ID SEQ N°: 3 ou ID SEQ N°: 5.

34. Construto de ácido nucléico recombinante de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que dito fragmento do polinucleotídeo de nicotina demetilase abrange nucleotídeos a partir da região de tal polinucleotídeo de nicotina demetilase que corresponde à posição de nucleotídeo 297 à posição de nucleotídeo 594 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.

35. Construto de ácido nucléico recombinante de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de nicotina demetilase abrange a seqüência apresentada na ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5, na qual o dito fragmento abrange os nucleotídeos 297 a 594 da ID SEQ N°: 3 ou ID SEQ N°: 5.

36. Construto de ácido nucléico recombinante de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a segunda seqüência de nucleotídeos abrange o complemento de nucleotídeos 297 a 594 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.

37. Método de redução da conversão de nicotina em nornicotina em uma planta de Nicotiana caracterizado por abranger: a) transformar uma planta de Nicotiana com um construto de ácido nucléico recombinante, que abrange um promotor capaz de funcionar em uma célula de planta ligada operacionalmente a uma seqüência de ácido nucléico, que tem uma primeira seqüência de nucleotídeos abrangendo um fragmento de cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 400 nucleotídeos de um tabaco de polinucleotídeo de nicotina demetilase capaz de formar um RNA de dupla fita com a primeira seqüência de nucleotídeos. b) regenerar uma planta transgênica de Nicotiana.

38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que dita planta transgênica de Nicotiana tem menos de aproximadamente 2% de conversão de nicotina em nornicotina.

39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que dita planta transgênica de Nicotiana tem menos de aproximadamente 1% de conversão de nicotina em nornicotina.

40. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que dito fragmento do polinucleotídeo de nicotina demetilase de tabaco abrange nucleotídeos da região de polinucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste de uma seqüência codificadora e uma seqüência de íntrons.

41. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o fragmento de polinucleotídeo de nicotina demetilase de tabaco abrange uma região de uma seqüência codificadora que tem no mínimo 90% da identidade de seqüência com a seqüência codificadora da nicotina demetilase apresentada nos nucleotídeos 1 a 1551 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.

42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que dito fragmento do polinucleotídeo de nicotina demetilase abrange nucleotídeos a partir da região de tal polinucleotídeo de nicotina demetilase que corresponde à posição de nucleotídeo 265 à posição de nucleotídeo 625 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°: 5.

43. Método de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de nicotina demetilase abrange a seqüência apresentada na ID SEQ N°:3 ou ID SEQ Ν°:5, e na qual o dito fragmento abrange os nucleotídeos 265 a -625 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.

44. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que dito fragmento do polinucleotídeo de nicotina demetilase abrange nucleotídeos a partir da região de tal polinucleotídeo de nicotina demetilase que corresponde à posição de nucleotídeo 297 à posição de nucleotídeo 594 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°: 5.

45. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de nicotina demetilase abrange a seqüência apresentada na ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5, e na qual o dito fragmento abrange os nucleotídeos 297 a 594 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.

46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a segunda seqüência de nucleotídeos abrange o complemento de nucleotídeos 297 a 594 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.

47. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a primeira e segunda seqüências de nucleotídeos são ligadas por uma seqüência de íntrons.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a dita seqüência de íntrons é uma seqüência de íntrons passível de ser combinada.

49. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o fragmento de polinucleotídeo de nicotina demetilase de tabaco abrange uma região de uma seqüência codificadora que tem no mínimo 90% da identidade de seqüência com a seqüência codificadora da nicotina demetilase apresentada nos nucleotídeos 1 a 1551 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.

50. Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que dito fragmento do polinucleotídeo de nicotina demetilase abrange nucleotídeos a partir da região de tal polinucleotídeo de nicotina demetilase que corresponde à posição de nucleotídeo 265 à posição de nucleotídeo 625 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°: 5.

51. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de nicotina demetilase abrange a seqüência apresentada na ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5, e na qual o dito fragmento abrange os nucleotídeos 265 a 625 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.

52. Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que dito fragmento do polinucleotídeo de nicotina demetilase abrange nucleotídeos a partir da região de tal polinucleotídeo de nicotina demetilase que corresponde à posição de nucleotídeo 297 à posição de nucleotídeo 594 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°: 5.

53. Método de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de nicotina demetilase abrange a seqüência apresentada na ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5, e na qual o dito fragmento abrange os nucleotídeos 297 a 594 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.

54. Método de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a segunda seqüência de nucleotídeos abrange o complemento de nucleotídeos 297 a 594 da ID SEQ N°:3 ou ID SEQ N°:5.