BRPI0718880A2

BRPI0718880A2 - Uso da beta-lactamase

Info

Publication number: BRPI0718880A2
Application number: BRPI0718880-3A
Authority: BR
Inventors: Pertti Koski; Tapio Korkolainen; Kristiina Raatesalmi
Original assignee: Ipsat Therapies Oy
Priority date: 2006-11-28
Filing date: 2007-11-21
Publication date: 2013-12-17
Also published as: CA2670440A1; EP2086570A1; FI119678B; NO20092433L; WO2008065247A1; US20090311234A1; RU2009124460A; AU2007327472A1; CN101563099A; JP2010511020A; KR20090085122A; FI20065757A; FI20065757A0

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DA BE- TA-LACTAMASE".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a redução do efeito adverso de antibióticos sobre a microbiota normal no trato intestinal. Mais precisamente, ela se refere ao uso de beta-lactamases de classe A para a preparação de um medicamento para a redução dos efeitos colaterais no intestino. Um mé- todo para a redução de efeitos colaterais do antibiótico beta-lactamo não- absorvido no intestino também é descrito.

Campo técnico

Os antibióticos de beta-lactamo estão entre os antibióticos mais amplamente usados contra as infecções bacterianas. Todos eles têm uma característica estrutural comum, isto é, eles contêm um núcleo de beta- lactamo. Os antibióticos de beta-lactamo inibem a biosíntese da parede da célula bacteriana possuindo ao mesmo tempo uma baixa toxidez com rela- ção ao hospedeiro. No entanto, um problema associado com a terapia de beta-lactamo é que muitas bactérias produzem uma enzima chamada de beta-lactamase, que é capaz de inativar o antibiótico beta-lactamo através da hidrolisação da ligação de amida do anel de beta-lactamo.

O aumento da prevalência de cepas produtoras de beta- lactamase de bactérias gram-positivas e gram-negativas tem restringido a utilidade dos antibióticos beta-lactamos. Por esse motivo as composições farmacêuticas que contêm combinações de antibióticos de beta-lactamo com inibidores da beta-lactamase têm sido desenvolvidos para prover uma tera- pia efetiva independente das bactérias que produzem a beta-lactamase. As combinações conhecidas são, por exemplo, amoxicilina e ácido clavulânico, ampicilina e sulbactamo, piperacilina e tazobactamo, e ticarcilina e ácido cla- vulânico (Higgins et al., 2004).

Outro problema associado com o tratamento por antibióticos é que quando os antibióticos chegam ao trato intestinal eles promovem a re- sistência do antibiótico exercendo uma pressão seletiva sobre a microbiota do intestino. Não-limitativo somente os beta-lactamos administrados oral- mente porém também por via parenteral podem ter efeitos adversos sobre a composição da microbiota intestinal, presumivelmente devido a que eles são secretados dentro da bile em concentrações apreciáveis. A partir da bile eles são excretados dentro do intestino, onde eles podem causar a ruptura da 5 microflora intestinal normal. O distúrbio do equilíbrio ecológico entre o hos- pedeiro e a microbiota intestinal pode conduzir o antibiótico associado à diar- réia, crescimento exagerado de bactérias patogênicas tais como os entero- coccus resistentes a vancomicina, beta-lactamase prolongada produzindo bacilos gram-negativos ou a emergência e a dispersão da resistência ao an- 10 tibiótico entre a microbiota intestinal normal ou patógenos associados ao antibiótico (Sullivan et al., 2001 , Donskey1 2006).

Uma estratégia para a redução dos desarranjos na microbiota intestinal é a de selecionar agentes antimicrobianos com uma excreção biliar mínima durante a terapia antibiótica parenteral (Rice et al., 2004). Outra es- tratégia inclui o uso de probióticos. Uma quantidade de probióticos diferentes tem sido avaliada na prevenção e na redução da diarréia associada com an- tibióticos em adultos e em crianças, incluindo o fermento não-patogênico Saccharomyces boulardii e múltiplas bactérias fermentadoras do ácido lático, tais como o Lactobacillus rhamnosus GG (LGG). O tratamento com a S. bou- Iardii parece prevenir a diarréia recorrente associada com antibióticos por C. difficile em adultos, embora a LCC seja útil para o tratamento de diarréia as- sociada com antibióticos em crianças (Katz, 2006). Outra estratégia engloba os produtos de leite bovino imunizado com base em colostro, que tem pro- vado serem efetivos na profilaxia contra diversas infecções intestinais asso- ciadas com os antibióticos (Korhonen et a/., 2000).

Ainda outra estratégia adicional para evitar os efeitos adversos dos antibióticos de beta-lactamo nos intestinos é a coadministração do anti- biótico com uma beta-lactamase. A administração oral da beta-lactamase toma possível inativar o beta-lactamo não-absorvido no trato gastrointestinal, 30 por meio do que os efeitos colaterais incluindo as alterações na microbiota normal do intestino e o crescimento exagerado das bactérias resistentes ao beta-lactamo são reduzidos. A beta-lactamase é formulada de modo conve- niente de tal forma a ser liberada em uma secção desejada do trato gastroin- testinal (WO 93/13795).

A beta-lactamase administrada oralmente em conjunto com a terapia de ampicilina parenteral em caninos mostrou degradar a ampicilina 5 excretada pela bile de uma maneira dependente da dose sem afetar os ní- veis de ampicilina no soro (Harmoinen et al., 2003). Além do mais, a terapia da beta -Iactamase também tem sido ilustrada para prevenir as alterações induzidas por antibióticos na microbiota fecal durante vários dias de trata- mento com a ampicilina parenteral em um modelo canino (Harmoinen et al., 10 2004). Resultados comparáveis também tem sido obtidos através do empre- go de formas de dosagem da beta-lactamase dirigidas para o cólon (US 2005/249716).

A beta-lactamase empregada nos estudos realizados por Har- moinen et al., em 2003 e 2004 é recombinante com a beta-lactamase do Ba- 15 cillus Iicheniformis (PenP) que pertence as enzimas Ambler de classe A Am- bler, 1980). Ela possui uma alta atividade “hidrólitica” contra as penicilinas, aminopenicilinas, tais como a ampicilina e a amoxicilina e a ureidopenicilina, tal como a piperacilina. No entanto, ela é desativada facilmente pelos inibido- res comuns da beta-lactamase tais como o sulbactamo, ácido clavulânico e 20 tazobactamo.

Os inibidoras da beta-lactamase são efetivos com relação a pre- venção da inativação dos beta-lactamos pelas bactérias que produzem a beta-lactamase. Os inibidores da beta-lactamase podem, por esse motivo, ser combinados com os beta-lactamos. Em geral, ambos os componentes de 25 uma tal combinação tem parâmetros fármaco-cinéticos bastante similares com relação a diversos fluidos e tecidos do corpo e meias-vidas de elimina- ção similar, que é considerado um pré-requisito essencial para a eficácia terapêutica das preparações da combinação. No entanto com respeito à eli- minação biliar, as propriedades farmaco-cinéticas dos inibidores do beta- 30 Iactamo e da beta-lactamase foram descobertos para variar. Por exemplo, a proporção de sulbactamo com relação a ampicilina foi achada como quase constante (aproximadamente de 1:2) no soro, enquanto que as proporções de sulbactamo/ampicilina na bile variaram a partir de 1:3 até 1:13 (Wildfeuer et al. 1988). A despeito das altas variações em suas proporções na bile, a combinação de beta-lactamo com o inibidor da beta-lactamase tem sido considerada como uma terapia segura e efetiva contra as infecções no trato 5 biliar (Morris et al., 1986., Brogard et al., 1989, Westphal et al., 1997).

Pode ser concluído a partir das informações acima que o efeito dos antibióticos de beta-lactamo foi aumentado através da combinação dos mesmos com os inibidores de beta-lactamase para a redução dos efeitos de beta-lactamase que de outra forma inativam o antibiótico. Também tem sido 10 sugerido um número de maneira para a redução dos efeitos colaterais ad- versos do tratamento com antibióticos tais como o distúrbio da microbiota nos intestino. Continua ainda a necessidade com relação a tratamentos com antibióticos mais eficazes sem os efeitos colaterais adversos. A presente invenção resolve essas necessidades. Ela reduz os riscos de super infec- 15 ções e de aumento da resistência ao antibiótico associada com o uso de an- tibióticos de beta-lactamo.

Resumo da Invenção

A presente invenção refere-se à terapia com o antibiótico beta- lactamo, que não-limitativo seja suscetível a inativação por bactérias que 20 produzem a beta-lactamase, e que não-limitativo rompa o equilíbrio da flora microbiológica normal no intestino. Foi agora descoberto que a beta- lactamase é efetiva na inativação do beta-lactamo residual no intestino em conexão com o tratamento com antibiótico, com uma combinação do antibió- tico beta-lactamo e inibidor da beta-lactamase. Isso foi surpreendente; devi- 25 do a que era conhecido que a beta-lactamase e os seus inibidores são par- cialmente eliminados a partir do corpo através da bile para dentro do intesti- no delgado, e que os referidos inibidores inativam a beta-lactamase in vitro.

A presente invenção proporciona o uso da beta-lactamase de classe A para a fabricação de um medicamento para a redução dos efeitos colaterais no intestino associados com o tratamento com uma combinação do antibiótico beta-lactamo e um inibidor da beta-lactamase.

A invenção também descreve um método de redução dos efeitos colaterais no intestino associados com o tratamento com uma combinação do antibiótico beta-lactamo e um inibidor da beta-lactamase, no qual uma quantidade efetiva de uma beta-lactamase de classe A é administrada a um sujeito que esteja necessitando da mesma.

As modalidades específicas da invenção estão descritas nas

reivindicações dependentes. Outros objetivos, detalhes e vantagens da pre- sente invenção se tomarão aparentes a partir dos desenhos e da descrição detalhada e dos exemplos que se seguem.

Descrição Resumida dos Desenhos A figura 1 mostra uma seqüência de nucleotídeos e uma se-

qüência deduzida de aminoácidos do gene de beta-lactamase do Bacillus Iichenifoirmis clonados no vetor de secreção pkTG141.

A figura 2 mostra a concentração de ampicilina no quimo do je- juno de cães beagle depois da administração parenteral de uma combinação de ampicilina/sulbactamo na ausência ou na presença de beta-lactamase administrada oralmente.

A figura 3 mostra a concentração de amoxicilina no quimo do jejuno de cães beagle depois da administração parenteral de uma combina- ção de amoxicilina/ácido clavulânico na ausência ou na presença de beta- lactamase administrada por oralmente.

As figuras 4 e 5 mostram a concentração de piperacilina no qui- mo do jejuno de cães beagle depois da administração parenteral de uma combinação de piperacilina/tazobactamo na ausência ou na presença de beta-lactamase administrada oralmente em doses diferentes.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção se refere ao uso de beta-lactamase admi- nistrada oralmente para a preparação de um medicamento para a redução dos efeitos adversos na microbiota intestinal do antibiótico beta-lactamo re- sidual não-absorvido a partir da terapia com uma combinação do antibiótico 30 beta-lactamo e um inibidor da beta-lactamase. A composição farmacêutica administrada oralmente da beta-lactamase é destinada à redução dos efeitos de uma combinação de beta-lactamo/inibidor da beta-lactamase sobre a mi- 10

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crobiota principal na parte distai do íleo e no cólon, e como segue, para man- ter o equilíbrio ecológico da microbiota do intestino. Por isso, através do em- prego da terapia de beta-lactamase, os efeitos colaterais associados com os resíduos não-absorvidos do beta-lactamo e do inibidor da beta-lactamase no intestino delgado e no cólon são evitados.

Beta-lactamase.

A beta-lactamase é uma enzima hidrolase de beta-lactamo clas- sificada como 3,5,2,6. A beta-lactamase também é classificada com base na sua seqüência de aminoácidos em quatro classes A, B, C e D (Ambler, 1980), As classes A, C e D também são denominadas de beta-lactamase serina, devido a que elas tem um resíduo de serina em seu sítio ativo. Junto com as suas estruturas primarias, três seqüências de peptídios conservadas, importantes para o reconhecimento do substrato ou da catálise, foram identi- ficadas através da comparação das estruturas de 3D (Colombo et al., 2004):

Beta-lactamase

Classe A Classe C Classe D

1

SXXK

Elemento

2

SD(N/S/G)

YAN

SXV

(K/R/H)(T/S) g KTG K(T/S)G

O primeiro elemento é uniforme entre todas as beta- Iactamases de serina. Ele contém sítios ativos de serina (S) e de Iisina (K) cujas cadeias laterais apontam para dentro do sítio ativo. O segundo elemento forma um dos lados da cavidade catalítica. Ela é chamada de alça SDN nas beta- Iactamases de classe A. A alça SDN é quase invariável entre as enzimas de classe A exceto a partir de algumas exceções. O terceiro elemento está no filamento mais interno da folha-beta e forma a parede oposta da cavidade catalítica. Ele é em geral KGT. A Iisina (K) pode ser substituída por histidina (H) ou arginina (R) em alguns casos excepcionais, e a treonina (T) pode ser substituída por serina (S) em diversas beta-lactamases de classe A (Mata- gane et al.; 1998).

De acordo com uma modalidade da invenção a beta-lactamase de classe A é derivada a partir de uma espécie de Bacillus. De acordo com uma modalidade específica da invenção, a beta-lactamase de classe A é PenP do Bacillus licheniformis. Esta enzima foi descrita, inter alia por Izui et al., 1980 e pode ser derivada, por exemplo, a partir de S. licheniformis 749/C (ATCC 25972). A seqüência de aminoácidos de PenP a partir da cepa 749/C 5 é mostrada na seqüência de proteína de base dos dados Swiss-Prot como a seqüência de números P00808. Ela também é dada aqui, como a SEQ ID N0

1. A seqüência de nucleotídios do gene PenP correspondente é dada na ba- se de dados do GenBank DDJ/EMBL como a seqüência V00093. A beta- lactamase do B. licheniformis é uma lipoproteína, que está ancorada á 10 membrana citoplasmática do Bacillus através de uma cauda de ácido graxo de tal maneira que a parte da proteína está dobrada para fora da membrana. A SEQ ID N0 1 mostra o comprimento total da seqüência de aminoácidos da proteína incluindo a seqüência longa de sinal de 26 aminoácidos. Isso forma a lipoproteína precursora. O diglicerídio é ligado de forma covalente no ter- 15 minai NH2 da cisteína (C) na posição 27 resultando na forma de lipoproteína.

Além disso, existem formas mais curtas da proteína que são se- cretadas fora da célula. Essas formas também são denominadas de exofor- mas. As exoformas são o resultado da atividade hidrolítica das proteases na parede da célula ou no meio de cultura.

PenP, como usado aqui, engloba qualquer fragmento ativo de

beta-lactamase e/ou variante da seqüência de aminoácido dada explicita- mente (SEQ ID N0 1). Especialmente ela é uma forma N truncada da se- qüência o que significa que ela foi truncada no terminal amino. Além da parte truncada do terminal N, ela pode compreender uma ou mais deleções, subs- 25 tituições e/ou inserções adicionais de aminoácidos, contanto que tenham uma atividade de beta-lactamase. As referidas modificações tanto podem ser variações ou mutações de ocorrência natural, ou modificações artificiais in- troduzidas, por exemplo, através da tecnologia de genes. Exoformas trunca- das no terminal amino de forma diferente tem sido encontradas no meio de 30 crescimento de B. licheniformis. Essas exoformas também estão englobadas aqui, através do termo PenP. Matagne et al., 1991 descreveu diversos tre- chos de microheterogeneidade em formas extra celulares produzidas através do hospedeiro natural B. licheniformis 749/C. As cinco exoformas diferentes secretadas que se seguem com diferentes resíduos de aminoácidos no ter- minal N foram identificadas:

SQPAEKNEKTEMKDD KALNMNGK (aminoácidos 35-49...300-307 )

EKTEMKDD KALNMNGK (aminoácidos 42-49...300-307)

KTEMKDD KALNMNGK (aminoácidos 43-49...300-307)

EMKDD.....KALNMNGK (aminoácidos 45-49...300-307 )

MKDD KALNMNGK (aminoácidos 46-49...300-307)

Os resíduos dos aminoácidos iniciais são apresentados em ne- grito. O terminal C dos aminoácidos está indicado à direita. As posições do aminoácidos se referem a SEQ ID N0 1; A exoforma que se inicia a partir da serina (S) na posição 35 é denominada de “forma secretada grande” beta- lactamase do B. licheniformis, e a que se inicia a partir da Iisina (K) na posi- ção 43 é denominada de “forma secretada pequena”. A primeira hélicealfa (αι-hélice} se inicia a partir do ácido aspártico (D) na posição 48 e o final da ultima hélice alfa (an.hélice} acaba na asparagina (N) na posição 303. De acordo com uma modalidade da invenção o PenP compreende pelo menos os aminoácidos de 48 até 303, que fazem parte da estrutura secundaria da proteína (Knox et al., 1991). De acordo com outra modalidade da invenção uma ou mais dos referidos aminoácidos de 40 até 303 foram deletados ou substituídos.

De acordo com ainda outra modalidade da invenção o terminal amino do PenP se inicia com NH2-KTEMKDD (aminoácidos de 43 a 49 da SEQ ID N0 1). Essa assim denominada exoforma ES-beta pode ainda não- 25 Iimitativo ter 21 resíduos contíguos como descrito por Gebhard et al., 2006. De acordo com outra modalidade da invenção o terminal amino se inicia com o ácido glutâmico (E) da SEQ ID N0 1 e especialmente ele se inicia com NH2-EMKDD (aminoácidos de 45 a 49 da SEQ ID N0 1), ou de forma alterna- tiva ele se inicia com NH2-MKDD (aminoácidos de 46 a 49 da SEQ ID N01). 30 Os quatro últimos aminoácidos no final carboxílico da proteína

PenP MNKG-COOH não-limitativo fazem parte da estrutura secundária, e podem, por esse motivo também serem deletados sem a perda da atividade. Em outra modalidade até nove aminoácidos do terminal C podem ser dele- tados. As formas C truncadas da proteína foram descritas por Santos et al., 2004.

Todas as formas diferentes da beta-lactamase mostradas acima estão englobadas através do termo PenP como usado aqui, junto com outras formas da proteína que tenham a atividade da beta-lactamase. De acordo com uma modalidade específica da invenção a beta-lactamase tem uma se- qüência de aminoácidos que tem pelo menos 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98 ou 99 % de identidade de seqüência à SEQ ID N0 1 ou a um fragmento ativo da beta-lactamase da mesma, especialmente com relação ao fragmen- to maduro da proteína que se inicia na posição 27, e de preferência até o fragmento N truncado da proteína se iniciando na posição que corresponde à posição 45 ou 46 da SEQ ID N0 1. A identidade da seqüência é determina- da com a utilização de BLAST (Basic Local Alignment Search Tools) como descrito em Altschul et al., 1997.

A atividade de beta-lactamase pode ser determinada através da análise de nitrocefina como descrita por 0’Callaghan et al., 1972.

A beta-lactamase de classe A é produzida convenientemente como uma proteína recombinante. Ela é produzida de preferência em uma 20 cepa hospedeira de Bacillus que seja adequada para a produção de produ- tos farmacêuticos tais como B. amyloliquefaciens, B. pumulis, ou B. subtilis. Uma maneira para produzir a beta-lactamase em uma cepa não-limitativo esporulante de B. subtilis está descrita na WO 03/040352. A proteína tam- bém pode ser produzida de forma homóloga em B. licheniformis através de 25 produção em excesso.

Formulação.

A beta-lactamase é formulada de forma conveniente dentro de uma composição farmacêutica com revestimento entérico administrada o- ralmente, como por exemplo, péletes de beta-lactamase gastro resistentes, 30 para ser obtida uma formulação de beta-lactamase objetivada. De acordo com uma modalidade da invenção a beta-lactamase é administrada de forma conveniente como péletes de revestimento entérico, como por exemplo cáp- sulas de gelatina rígida. As formas de dosagem com revestimento entérico são bem conhecidas entre os produtos orais na indústria farmacêutica. Os produtos de fármaco com revestimentos entéricos são projetados para pas- sar pelo estômago em forma intacta e para liberar o conteúdo da forma de dosagem no intestino delgado, isto é no duodeno, jejuno e/ou no íleo. As razões para a aplicação de formulações entéricas sólidas são as de proteger a substância do fármaco da ação destrutiva das enzimas gástricas ou do ambiente de pH baixo do estômago, ou para evitar a irritação, náusea ou sangramento da mucosa gástrica induzida pelo fármaco, ou para o supri- mento da substancia do fármaco em forma não-limitativo-diluída em um local objetivado no intestino delgado. Com base nesses critérios, os produtos de fármacos com revestimento entérico podem ser considerados como um tipo de formas de dosagem de liberação retardada. As formas de revestimento com base aquosa parecem ser os materiais mais favoráveis para o processo de revestimento da proteína PenP hidrófila. Os polímeros aquosos usados para serem conseguidas as propriedades entéricas são os polimetacrilatos tais como o Eudragit®, polímeros com base em celulose, como por exemplo os éteres de celulose como por exemplo o Duodcell®, ou os ésteres de celu- lose, como por exemplo, o Aquateric® ou copolímeros de acetato de polivini- Ia como por exemplo o Opadry®.

Método de tratamento.

A beta-lactamase de classe A é usada para a redução dos efei- tos colaterais no intestino induzidos por uma combinação do antibiótico beta- lactamo com um inibidor da beta-lactamase. A beta-lactamase com revesti- 25 mento entérico é liberada no intestino em uma quantidade capaz de eliminar o antibiótico beta-lactamo não-absorvido, por meio do que os efeitos adver- sos do antibiótico são reduzidos. A beta-lactamase, por exemplo, reduz ou previne os distúrbios associados com o antibiótico no equilíbrio ecológico entre o hospedeiro e a microbiota intestinal, o que pode levar a diarréia, 30 crescimento exagerado de bactérias patogênicas tais como o enterococcus resistente à vancomicina, beta-lactamase prolongada produzindo bacilos gram-negativos ou a emergência e dispersão de resistência ao antibiótico entre a microbiota normal do intestino ou patógenos. A beta-lactamase torna possível dessa forma evitar as superinfecções, por exemplo, através de Clostridium difficile e leveduras patogênicas, o que é de importância especi- fica em pacientes imunossuprimidos. A beta-lactamase com revestimento 5 entérico objetivada é de forma adequada administrada oralmente em conjun- to com antibióticos possivelmente administrados oralmente ou parenteral e inibidor da beta-lactamase. O sujeito a ser tratado com a beta-lactamase é um ser humano ou um animal tal como um animal de fazenda que é tratado com uma combinação do antibiótico beta-lactamo e um inibidor da beta- 10 lactamase.

Antibióticos e inibidores.

O “antibiótico beta-lactamo” é um composto antibacteriano que contém um beta-lactamo de anel de quatro elementos (azetidin-2-ona). Os antibióticos beta-lactamos são bastante conhecidos na técnica e eles podem 15 ser de origem natural, semissintética ou sintética. Os antibióticos beta- lactamos podem ser classificados em geral em penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas, oxa-beta-lactamos, carbapenemos, carbacefemos e nonobac- tamos com base em suas outras características estruturais. De preferência o antibiótico é um que seja administrado por via parenteral. Os antibióticos 20 beta-lactamos é combinado com um inibidor de beta-lactamo apropriado. O antibiótico adequados para essa finalidade são, por exemplo, as penicilinas, incluindo, por exemplo a penicilina G, as aminopenicilinas tais como a amo- xicilina e ampicilina, ureidopenicilina, tais como a piperacilina ou a alfa- carboxipenicilina tal como a ticarcilina.

O “inibidor da beta-lactamase” é um composto que é capaz de

inibir uma beta-lactamase, que por sua vez é capaz de hidrolizar um antibió- tico de beta-lactamo. Os inibidores são em geral, porém não-limitativo ne- cessariamente, relacionados estruturalmente aos antibióticos de beta- lactamo, e podem ter uma fraca atividade antibacteriana per se, porém a sua 30 função na terapia de combinação é a de proteger o antibiótico principal de ser desativado através da beta-lactamase bacteriana. No presente contexto o inibidor é especialmente um inibidor contra a beta-lactamase de classe A. Os inibidores apropriados são, por exemplo, o sulbactamo, o ácido clavulâ- nico e o tazobactamo. O ácido clavulânico é um análogo natural, enquanto que o sulbacatamo e o tazobactamo são semissinteticos. A maioria dos ini- bidores é administrada por via parenteral, isto é, pela via intravenosa ou por 5 via intramuscular. O ácido clavulânico também pode ser administrado oral- mente. Diversas combinações de antibiótico beta-lactamo/inibidor da beta- lactamase têm sido descritas na técnica e usadas clinicamente.

O antibiótico e o inibidor são administrados de forma convenien- te como uma mistura. Os inibidores da beta-lactamase disponíveis comerci- 10 almente são usados clinicamente em combinação com os diversos beta- lactamos. O ácido clavulânico é usado em combinação com amoxicilina ou ticarcilina, de modo similar o sulbactamo é usado com a ampicilina e o tazo- bactamo com a piperacilina. Outras combinações também são possíveis. A beta-lactamase pode ser administrada oralmente, simultaneamente, ou an- 15 tes do tratamento com a combinação antibiótico-inibidor. De preferência, ela é administrada simultaneamente com a combinação antibiótico-inibidor. Dosaqens.

O grau do distúrbio na microbiota intestinal e a incidência de e- feitos colaterais devido a administração de uma combinação de beta-lactamo e um inibidor de beta-lactamase são dependentes de uma variedade de fato- res, incluindo a dosagem do fármaco, a via de administração e as proprieda- des farmacocinéticas/ dinâmicas do beta-lactamo e do inibidor. A beta- lactamase é administrada em uma quantidade efetiva para a redução dos efeitos colaterais associados com o beta-lactamo residual não-absorvido no intestino delgado e no cólon. Nos experimentos realizados, as doses de cer- ca de 0,1 mg de beta-lactamase/kg de peso corporal foram efetivas para a eliminação da ampicilina e da amoxicilina até uma concentração abaixo do limite de detecção no guimo do jejuno, enquanto que uma dose mais eleva- da é necessária para a eliminação da piperacilina. Uma dose adequada pose ser de 0,1 a 1,0, especialmente 0,2 a 0,4 mg de beta-lactamase/ kg de peso corporal.

A invenção é também ilustrada através dos exemplos não- Iimitativo Iimitativos que se seguem. No entanto, deve ser entendido que as modalidades fornecidas na descrição acima e nos exemplos são somente para a finalidade de ilustração, e que diversas mudanças e modificações são possíveis dentro do âmbito da invenção. Os resultados do teste mostram um 5 efeito não-limitativo previsto da beta-lactamase sobre o beta-lactamo não- absorvido em conexão com a terapia de beta-lactamo/ inibidor de beta- lactamase. Os resultados amparam o uso prolongado de da beta-lactamase do Bacillus licheniformis para a terapia antibiótica com combinações de beta- lactamo com o inibidor de beta-lactamase.

Exemplo 1.

Beta-lactamase recombinante derivada a partir da cepa 749/C do Bacillus licheniformis, foi usada nos experimentos. A proteína foi produzi- da em uma cepa não-limitativo esporulante de Bacillus subtilis como descrito na WO 03/0400352.

Foi usado um vetor de secreção pKTH141, que compreende um

cassete de expressão que contém um promotor vegetativo forte (amyQp), um sítio de ligação com o ribossomo (RBS) e uma região codificando uma se- qüência de sinal (amyQss) do gene da amilase E18 do B. amyloliquefaciens (amyQ). Além disso, foi inserido um oligonucleotidío sintético com um único 20 sítio HindlW diretamente no terminal 3’ da região codificando a seqüência de sinal. Desse modo, o inserto codificando a proteína pode ser clonado dentro do sítio Hind\\\ de uma maneira tal que ele será traduzido na mesma estrutu- ra de leitura como a seqüência de sinal de uma alfa amilase. O oligonucleo- tídio Hind\\\ codifica três resíduos de aminoácidos (NH2-QAS), que é previsto 25 para compreender uma extensão do terminal NH2 na proteína madura.

O gene estrutural (PenP) da beta-lactamase do Bacillus licheni- formis, que codifica os resíduos seqüenciais dos aminoácidos 43 a 307 da SEQ ID NO: 1 foi amplificado por PCR com os iniciadores apropriados que continham um sítio de restrição HindWl com a utilização do DNA cromossô- 30 mico do B. licheniformis, como um gabarito. O fragmento amplificado foi em seguida clivado com Hindlll e ligado dentro do sítio correspondente do pK- TH141 resultando em uma fusão de estrutura entre a seqüência que codifica o peptídio de sinal AmyQ e a proteína PenP. As seqüências de nucleotídios do gene da beta-lactamase foram determinadas através do método de ter- minação de cadeia dideóxi com um sequenciador de DNA automático. O nucleotídio completo e as seqüências de aminoácido deduzidas do gene da 5 beta-lactamade da cepa 749;C do B. licheniformis, são mostradas como as SEQ ID N0: 2 e 3 e apresentadas na figura 1.

Na figura 1 os números em baixo da linha e mostrados entre pa- rênteses se referem aos resíduos de aminoácidos. O sítio de clonagem Hin- d\\\ que codifica uma extensão NH2-QAS1 é apresentado acima da seqüência de nucleotídios. O sítio de clivagem da peptidase de sinal previsto depois da alanina na posição de -31.

A estrutura aberta de leitura codifica um polipeptídio de 299 ami- noácidos que possui uma seqüência de sinal com o comprimento de 31 ami- noácidos do gene amyQ. O sítio de clivagem de peptidase do sinal está pre- 15 visto para se localizar depois da alanina na posição -1. A beta-lactamase madura foi prevista para iniciar a partir da glutamina (Q) na posição +1. Por conseqüência, a beta-lactamase madura foi prevista para conter 268 resí- duos de aminoácidos dos quais a extensão NH2-QAS é codificada através do sítio de clonagem HZndIII.

A seqüência do terminal NH2 da beta-lactamase recombinante

purificada foi determinada através de degradação Edman automatizada com um sequenciador de proteína. A análise revelou que a beta-lactamase re- combinante não-limitativo possui o penta peptídio NH2-QASKT no seu termi- nal amino deduzido. O resultado indica que a forma truncada da proteína 25 beta-lactamase recombinante é gerada através de ação pós-translacional das enzimas proteolíticas que estão presentes tanto na parede da célula bacteriana como no meio de cultura. Para concluir, a parte principal da beta- lactamase recombinante compreende 263 resíduos de aminoácidos, e tem uma massa molecular de 29,3 kDa. A seqüência determinada do terminal 30 amino se inicia depois de cinco resíduos de aminoácidos à jusante a partir da seqüência de aminoácidos deduzida. O resíduo de aminoácido inicial da beta-lactamase recombinante é o ácido glutâmico (E) na posição +6 na figu- ra 1.

A proteína da enzima purificada é denominada de P1A. Ela con- siste essencialmente (pelo menos em 95% em peso) de resíduos seqüenci- ais de aminoácidos de 45 até 307 da SEQ ID NO: 1. O resto consiste essen- 5 cialmente de resíduos seqüenciais de aminoácidos de 48 até 307 da SEQ ID NO: 1. A beta-lactamase foi administrada na forma de péletes com revesti- mento entérico essencialmente similares às péletes utilizadas nos estudos realizados por Harmoninen et al., 2004. A capacidade da beta-lactamase do

S. licheniformis para a eliminação da ampicilina excretada pela bile no intes- tino delgado durante a terapia parenteral com uma combinação de ampicili- na/sulbactamo foi investigada em um modelo canino. Uma válvula de bocal foi inserida de forma cirúrgica no jejuno de beagles de laboratório aproxima- damente a 170 cm distante do piloro para permitir a coleta de amostras para as analises. A cirurgia intestinal não-limitativo alterou a motilidade intestinal. Foram usados seis cães beagle através de todo o estudo. O estudo foi reali- zado como dois tratamentos em seqüência: no primeiro experimento, duas doses consecutivas de uma combinação de ampicilina com sulbactamo (40 mg de ampicilina e 20 mg de sulbactamo por kg de peso corporal) foram administradas por via intravenosa em intervalos de dosagem de 6 horas e 20 minutos depois da alimentação. Sete dias mais tarde, um segundo experi- mento foi realizado de forma similar ao primeiro experimento, exceto em que os mesmos cães foram adicionalmente administrados oralmente beta- lactamase 10 minutos antes da injeção de ampicilina com sulbactamo. Uma única dose de péletes do revestimento entérico que continha cerca de 0,1 mg da beta-lactamase ativa por kg de peso corporal foi usada.

Foram coletadas amostras do quimo do jejuno em diversos pon- tos de tempo. As amostras do quimo foram imediatamente congeladas e ar- mazenadas a -70°C para aguardar a análise. As amostras do quimo foram limpas através de extração da fase sólida. Um método de cromatografia Ii- 30 quida de alto desempenho em fase reversa (HPLC) com detecção de UV foi usada para a quantificação da ampicilina.

Os resultados obtidos mostraram que níveis elevados de ampici- Iina foram detectados nas amostras do jejuno no primeiro experimento reali- zado sem a terapia de beta-lactamase, enquanto que o segundo experimen- to mostrou que a beta-lactamase administrada oralmente é capaz de reduzir os níveis de ampicilina no jejuno abaixo do limite de quantificação (10 micro- 5 gramas de ampicilina por grama de quimo do jejuno).

A figura 2 mostra o efeito das péletes de beta-lactamase admi- nistradas oralmente (dose de cerca de 0,1 mg de beta-lactamase por kg de peso corporal) sobre a concentração de ampicilina no quimo do jejuno de cães beagle (n = 6) depois das administrações por via intravenosa da com- 10 binação de ampicilina/ sulbactamo (40 mg de ampicilina e 20 mg de sulbac- tamo por kg de peso corporal). Os valores com relação a ambos os experi- mentos são apresentados como as concentrações medias de ampicilina no jejuno em pontos de tempo diferentes. Os valores da ampicilina no experi- mento 1, representam as concentrações de ampicilina no jejuno conseguidas 15 depois de duas administrações separadas de ampicilina/ sulbactamo. Os cães beagle foram tratados com a combinação de ampicilina/ sulbactamo com a terapia concorrente de beta-lactamase no experimento 2. A dose de beta-lactamase empregada é capaz de eliminar a maior parte da ampicilina no jejuno em cães beagle durante o primeiro tratamento com ampicilina/ sul- 20 bactamo, e as concentrações caíram e permaneceram abaixo do nível de quantificação através de todo o segundo tratamento com ampicilina/ sulbac- tamo com a terapia concorrente de beta-lactamase.

Os resultados mostram que o inibidor da beta-lactamase residual excretado pela bile possui uma influencia limitada sobre a atividade da beta- lactamase.

Exemplo 2.

A capacidade efetiva da beta-lactamase P1A para a inativação da amoxicilina excretada pela bile durante a terapia parenteral com uma combinação de amoxicilina e ácido clavulânico foi investigada de forma simi- 30 Iar a do Exemplo 1, exceto em que uma única dose da combinação de amo- xicilina e ácido clavulânico continha 25 mg de amoxicilina e 5 mg de ácido clavulânico por kg de peso corporal, e o método de análise por HPLC foi e- laborado para ser adequado para a análise da amoxicilina (o limite de quanti- ficação era de 2 microgramas por grama de guimo do jejuno).

Os resultados obtidos estão apresentados na figura 3, que mos- tra o efeito das péletes de beta-lactamase administradas oralmente sobre as concentrações de amoxicilina no quimo do jejuno de cães beagle (n = 6) de- pois da administração por via intravenosa da combinação de amoxicilina e ácido clavulânico (25 mg de amoxicilina e 5 mg de ácido clavulânico por kg de peso corporal). Os valores com relação a ambos os experimentos são apresentados como as concentrações medias de amoxicilina no jejuno em pontos de tempo diferentes. Os valores de amoxicilina no experimento 1 re- presentam as concentrações de amoxicilina no jejuno conseguidas depois de duas administrações separadas de amoxicilina e ácido clavulânico em um intervalo de dosagem de 6 horas sem o tratamento com a beta-lactamase. O tratamento oral com a beta-lactamase foi combinado com a terapia parente- ral da combinação de amoxicilina e ácido clavulânico no experimento 2.

Foi descoberto que o tratamento com a beta-lactamase é capaz de eliminar uma parte maior da amoxicilina excretada durante a terapia pa- renteral com uma combinação de amoxicilina e ácido clavulânico. Os traços de amoxicilina encontrados em algumas amostras do jejuno em pontos de 20 tempo diferentes podem ser eliminados através do aumento da dose de be- ta-lactamase. Os resultados sugerem que a beta-lactamase do B. lichenifor- mis é um potente candidato como uma substância de fármaco para a redu- ção dos efeitos colaterais relacionados com o uso parenteral de amoxicilina / ácido clavulânico.

Exemplo 3.

Os cães beagle foram tratados com uma combinação e piperaci- lina e tazobactamo sem e com a terapia simultânea de beta-lactamase. Os experimentos foram realizados essencialmente como aqueles descritos nos exemplos 1 e 2, exceto em que uma única dose da combinação de piperaci- 30 Iina e tazobactamo continha 100 mg de piperacilina e 12,5 mg de tazobac- tamo por kg de peso corporal, e que o método de análise por HPLC foi ela- borado para ser adequado com relação à análise de piperacilina (o limite de quantificação foi de 10 microgramas por grama de guimo do jejuno).

Os resultados obtidos estão apresentados na figura 4, que mos- tra o efeito das péletes de beta-lactamase administradas oralmente sobre as concentrações de piperacilina no quimo do jejuno de cães beagle (n = 6) de- 5 pois da administração por via intravenosa da combinação de piperacili- na/tazobactamo (100 mg de piperacilina e 12,5 mg de tazobactamo). Os va- lores para ambos os experimentos são apresentados como as concentra- ções medias de piperacilina no jejuno em pontos de tempo diferentes. Os valores de piperacilina no experimento 1 representam as concentrações de 10 piperacilina no jejuno conseguidas depois de duas administrações separa- das de piperacilina/ tazobactamo em um intervalo de dosagem de 6 horas sem o tratamento com a beta-lactamase. Os cães beagle foram tratados com uma combinação de piperacilina/ tazobactamo com a terapia concorren- te de beta-lactamase no experimento 2.

Os resultados obtidos sem a beta-lactamase (experimento 1)

mostraram que a eliminação biliar de piperacilina em cães beagle é conside- ravelmente mais alta do que aquela da ampicilina ou da amoxicilina. Não obstante, o tratamento com a beta-lactamase reduziu as concentrações de piperacilina no jejuno em todos os pontos de tempo. No entanto, as concen- 20 trações da piperacilina permaneceram detectáveis através de todo o trata- mento com a beta-lactamase (experimento 2). Por conseqüência, os resulta- dos obtidos mostraram que a terapia com a beta-lactamase é capaz de eli- minar a piperacilina do jejuno durante a terapia parenteral com uma combi- nação de piperacilina/ tazobactamo, porém a quantidade da beta-lactamade 25 nas péletes revestidas de forma entérica deve ser aumentada com a finali- dade de se conseguir uma formulação de dosagem que seja capaz de elimi- nar a concentração de piperacilina no jejuno para abaixo do limite de quanti- ficação.

O experimento foi repetido exceto em que a dose única das pé- Ietes de beta-lactamase continha cerca de 0,3 mg de beta-lactamase ativa por kg de peso corporal, e que a dose única da combinação de piperacilina/ tazobactamo continha 65,6 mg de piperacilina e 9,4 mg de tazobactamo por kg de peso corporal. Os resultados são apresentados na figura 5 que mostra que a beta-lactamase foi bastante eficiente na eliminação da piperacilina do jejuno.

Listagem de Referência

Altschul S.F., Madden T.L., Seháffer A.A., Zhang J., Zhang Z,, Msffer W., Upman D.J. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein data base search programs. Nucfeic Acids Res. 25: 3389-3402

Ambler, RP. 1980. The structure of beta-tacíamases. Phüos. Trans.

R. Soe. London 8 Bioí. Sci 280:321-331

Brogard1 J.M., Jeh!, F., BiiekieJ.F., Adioff M., Donner, M. and H, Monteii, 1989. Biüary eliminaticn of ticarcíSIin plus elavulartic acíd (Glaventin): experimental and clinicai study. Int. J. Clin. Pharmacol. Ther ToxicoL 27:135- 144.

Cofombol M., L., Hanique1 S., Baurin, S.L., Bauvois, C., De Vríendt,

K., Van Beeumen1 JJ,, Frere, J.M., and B. Joris. 2004. The ybxl gene of Batil- Ius subtilis 168 eneodes a class D beta-lactamase of Iow activity. Antímicrob. Agents C he molhe r. 4 B :484~490

Donskey, CJ., 2006, Antfbiotic regimens and irrteslinai colonizatíort with antíbiofie-resistaml Gram-negatíve bacílli. Clin. fnfect. Dís. 43:62-69,

Harmoinen, J., Mentula, S., Heikkilã, M., van der Rest M., Rajaia- SchuJtz, P.J., Donskey, CJ., Frias, R., Koski, R., WickstrarKdI, N., Jousimies- Sorner. H., Westermarck, E., and K, Lindevatl. 2004. Orally adminlstered tar- geted recombinant beta-lactamase preveni s ampicítiin-induced selective pres- sure on Ihe gut microbiota: a novel approach fo reducing antimícrobia) resis- tance. Antímicrob. Agents Chemother» 48:75-79

Harmoírsea J Vaaíi, K,. Koski, P., Syrjanen, K., Laitinen, O., Linde* vali, K,, and E- Westermarck, 2003. Enzymattc dagradation of a 0-iactam anti- biotic, ampiciilin, In the gut: a nove! treaimeni modality. J.Antirnicrob. Chemo- ther. 51:287-292.

Izui1 K., J.B.K. NieIsen, M.P. Gauliffeld, and J.O. Lampen, 1980. Large exopeníciilinase, initial extraeellular form deteeted in gnowths of Bacillus licheniformis, Btochemistry 19:1882-1886

J.A. Katz. 2006. Probiotics for prevention of antibiotic-assoeiated di- arrtiea and Ciosíridíum dtWcile díarrhea. J, Cltn. Gastroenterol. 40:249-255,

Gebhard L.G., Rrisso V.A. Sanots J., Ferreyra R.G., Noguera M.E, and Ermacora M.R., 2006. Wapping the distribution of conformational Informa- tion ihroughout a protein sequence. J. Mol. BioL 21:358(1)280-288

Higglns1 P.G., Wisplinghoff1 H., StefaniK1 D„ and H. Seifert 2004. In Vitro acíiviíies of the β-lactamase inhibltors clavuiantc acíd, sulbaetam, and ta- zobactanrs alone or m combinstion with β-laciarris againsí epidemíologically eharacierízed muiüdrug-resistaní Acinetobactei beunmmü straíns. 48: 1586- 1592

Knox, J.R.. and P.C. Moews. 1991. Beta-lactamase of Badlfus licheniformis 749/C. Refinement at 2 A resolution and analysis of hydratíon, J-MoLBtoL 220:435-455

Korhonen1 H.» Marnila, P„ and H.S, Gil!. 2000, Bovine milk antibod- íes for health. Br J Nuír. 84: 135-146

Matagne, A„, Jorís, B., van Beeumen Jm and J-Ml Frere 1991 Ragged N-termini and other variants of cJass A beta-laotamases analysed by chromatofocuslng, Btochem. J.273: 503-510

Matagne, A., Lamotte-Brasseur, J., and J.M. Frere. 1998. Catalytic properties of class A befs-facíamases: efficiency and diversity. Bíochem. J. 330: 581-598

Morris, D.L., Ubbí, C.S., Robertsoni C.S., and K.W. Brammer. 1906. Bfliary pharmacokinetics of sulbaetam »n humans. RevJnfecí.Dis, 8:589-592

OVailaghan, C, H„ Morris, A,, Krrby1 S.M., and A. H. Slngler. 1972. Novel method for detection of beta-lactamases by using a chromogenic cepha- Iosporin substrate, Antinrwerab. Agents Cbemotber, 1:283-288

Rice, L.B., Hutton-Thomas1R., Lakticova, V., Heifand1 M.S., and CJ. Donskey.2004. Béta-íactam antrbtoties and gastrointestinal coíonization of vancomycin-resístant enterocecci. JJnfect.Dis. 189:1113-1118.

Santos, Js Gebhartí L.G., Risso V.A., Fereyra R.G*, Rossi J,P„ and Errnacora M.R. 2004. Folding of an abridged beta-lactamase. Bíochemistry 43(6):1715-123

Sullivan., Â., Edlund, C., and Nord, C,E. 2001. Effect of antimicrobial

agants on the ecoiogica! balance oi human microfiora. Lancet 1:101-114.

Westphal, J.F., Brogardr J.M„ Carc-Sampara, F., Adtoff, M., Blickle,, J.F., Monteíl, H., and F. Jehl. 1997. Assessment of biliary excretior* of piper- acilím-tazobactam In humans. Antímicrob. Agents Chemother. 41:1636-1640.

Wildfeuer, A., Schwierscbf U., Engel, K., von Castelfj E,, Schiiiing, A., Potempar J., and H. Lenders. 1988, Pharmacokinetics of sulbaetam and ampiciilin Intravenously applied In combination to healthy volunteers and pa- tíents. Determínaííon of the ratio of the íwo drugs in serum and In various tis- sues, Arzneimittelforschung. 38:1640-1643.

SEQUENCE LISTING

<110> IPSAT Therapies <120> Uso da Beta-Lactamase <130> 20 622 95FIE <160> 3 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 307 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <220> <221> Sinal <222> (I)..(26) <22 0> <221> ACT SITE <222> (86) . . (86) <220> <221> ACT SITE <222> (182) . . (182) <220> <221> Ligação <222> (248) .. (250) <4 00> 1 Met Lys Leu Trp Phe Ser Thr Leu 1 5 Leu Leu Phe Ser Cys Val Ala Leu 20 Asn Ala Ser Gln Pro Ala Glu Lys 35 40 Asp Phe Ala Lys Leu Glu Glu Gln 50 55 Ala Leu Asp Thr Gly Thr Asn Arg 65 70 Arg Phe Ala Phe Ala Ser Thr Ile 85 Leu Gln Gln Lys Ser Ile Glu Asp 15

30

35 40 45

60

75

90 95 100 105 HO

Arg Asp Asp Leu Val Asn Tyr Asn Pro Ile Thr Glu Lys His Val 115 120 125

Thr Gly Met Thr Leu Lys Glu Leu Ala Asp Ala Ser Leu Arg Tyr 130 135 140

Asp Asn Ala Ala Gln Asn Leu Ile Leu Lys Gln Ile Gly Gly Pro 145 150 155

Ser Leu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Ile Gly Asp Glu Val Thr Asn 165 170 175

Glu Arg Phe Glu Pro Glu Leu Asn Glu Val Asn Pro Gly Glu Thr 180 185 190

Asp Thr Ser Thr Ala Arg Ala Leu Val Thr Ser Leu Arg Ala Phe 195 200 205

Leu Glu Asp Lys Leu Pro Ser Glu Lys Arg Glu Leu Leu He Asp

210 215 220

Met Lys Arg Asn Thr Thr Gly Asp Ala Leu Ile Arg Ala Gly Val

225 230 235

Asp Gly Trp Glu Val Ala Asp Lys Thr Gly Ala Ala Ser Tyr Gly

245 250 255

Arg Asn Asp Ile Ala Ile Ile Trp Pro Pro Lys Gly Asp Pro Val

260 265 270

Leu Ala Val Leu Ser Ser Arg Asp Lys Lys Asp Ala Lys Tyr Asp

275 280 285

Lys Leu Ile Ala Glu Ala Thr Lys Val Val Met Lys Ala Leu Asn

290 295 300

Asn Gly Lys 305 <210> 2 <211> 900 <212> DNA

<213> Bacillus licheniformis <220>

Asp

Ser

Glu

160

Pro

Gln

Ala

Trp

Pro

240

Thr

Val

Asp

Met <221> sig_peptide <222> (I) .. (93)

<220>

<221> CDS <222> (94) . . (897)

<400> 2

atgattcaaa aacgaaagcg gacagtttcg ttcagacttg tgcttatgtg cacgctgtta tttgtcagtt tgccgattac aaaaacatca gcg caa gct tcc aag acg gag atg

Gln Ala Ser Lys Thr Glu Met

1 5

aaa gat gat ttt gca aaa ctt gag gaa caa ttt gat gca aaa ctc ggg Lys Asp Asp Phe Ala Lys Leu Glu Glu Gln Phe Asp Ala Lys Leu Gly

15 20

atc ttt gca ttg gat aca ggt aca aac cgg acg gta gcg tat cgg ccg Ile Phe Ala Leu Asp Thr Gly Thr Asn Arg Thr Val Ala Tyr Arg Pro 30 35

gat gag cgt ttt gct ttt gct tcg acg att aag gct tta act gta ggc

Asp Glu Arg Phe Ala Phe Ala Ser Thr Ile Lys Ala Leu Thr Val Gly 40 45 50 55

gtg ctt ttg caa cag aaa tca ata gaa gat ctg aac cag aga ata aca

Val Leu Leu Gln Gln Lys Ser Ile Glu Asp Leu Asn Gln Arg Ile Thr 60 65 70

tat aca cgt gat gat ctt gta aac tac aac ccg att acg gaa aag cac

Tyr Thr Arg Asp Asp Leu Val Asn Tyr Asn Pro Ile Thr Glu Lys His

75 80 85

gtt gat acg gga atg acg ctc aaa gag ctt gcg gat gct tcg ctt cga

Val Asp Thr Gly Met Thr Leu Lys Glu Leu Ala Asp Ala Ser Leu Arg

90 95 100

tat agt gac aat gcg gca cag aat ctc att ctt aaa caa att ggc gga

Tyr Ser Asp Asn Ala Ala Gln Asn Leu Ile Leu Lys Gin Ile Gly Gly

105 110 115

cct gaa agt ttg aaa aag gaa ctg agg aag att ggt gat gag gtt aca

60

114

162

210

258

306

354

402

450

498 Pro Glu Ser Leu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Ile Gly Asp Glu Val Thr 120 125 130 135

aat ccc gaa cga ttc gaa cca gag tta aat gaa gtg aat ccg ggt gaa Asn Pro Glu Arg Phe Glu Pro Glu Leu Asn Glu Val Asn Pro Gly Glu 140 145 150

act cag gat acc agt aca gca aga gca ctt gtc aca age ctt cga gcc Thr Gln Asp Thr Ser Thr Ala Arg Ala Leu Val Thr Ser Leu Arg Ala 155 160 165

ttt gct ctt gaa gat aaa ctt cca agt gaa aaa cgc gag ctt tta ate Phe Ala Leu Glu Asp Lys Leu Pro Ser Glu Lys Arg Glu Leu Leu Ile 170 175 180

gat tgg atg aaa cga aat acc act gga gac gcc tta ate cgt gcc ggt Asp Trp Met Lys Arg Asn Thr Thr Gly Asp Ala Leu Ile Arg Ala Gly 185 190 195

gtg ccg gac ggt tgg gaa gtg gct gat aaa act gga gcg gca tea tat Val Pro Asp Gly Trp Glu Val Ala Asp Lys Thr Gly Ala Ala Ser Tyr 200 205 210 215

gga acc cgg aat gac att gcc ate att tgg ccg cca aaa gga gat cct Gly Thr Arg Asn Asp Ile Ala Ile Ile Trp Pro Pro Lys Gly Asp Pro 220 225 230

gtc gtt ctt gca gta tta tcc age agg gat aaa aag gac gcc aag tat Val Val Leu Ala Val Leu Ser Ser Arg Asp Lys Lys Asp Ala Lys Tyr 235 240 245

gat gat aaa ctt att gca gag gca aca aag gtg gta atg aaa gcc tta Asp Asp Lys Leu Ile Ala Glu Ala Thr Lys Val Val Met Lys Ala Leu 250 255 260

aac atg aac ggc aaa taa Asn Met Asn Gly Lys 265

<210> 3 <211> 268 <212> PRT

546

594

642

690

738

786

834

882

900 <213> Bacillus licheniformis <400> 3

Gln Ala Ser Lys Thr Glu Met Lys Asp Asp Phe Ala Lys Leu Glu 15 10 15

Gln Phe Asp Ala Lys Leu Gly Ile Phe Ala Leu Asp Thr Gly Thr 20 25 30

Arg Thr Val Ala Tyr Arg Pro Asp Glu Arg Phe Ala Phe Ala Ser 35 40 45

Ile Lys Ala Leu Thr Val Gly Val Leu Leu Gln Gln Lys Ser Ile

50 55 60

Asp Leu Asn Gln Arg Ile Thr Tyr Thr Arg Asp Asp Leu Val Asn

65 70 75

Asn Pro He Thr Glu Lys His Val Asp Thr Gly Met Thr Leu Lys 85 90 95

Leu Ala Asp Ala Ser Leu Arg Tyr Ser Asp Asn Ala Ala Gln Asn 100 105 110

Ile Leu Lys Gln Ile Gly Gly Pro Glu Ser Leu Lys Lys Glu Leu 115 120 125

Lys Ile Gly Asp Glu Val Thr Asn Pro Glu Arg Phe Glu Pro Glu 130 135 140

Asn Glu Val Asn Pro Gly Glu Thr Gln Asp Thr Ser Thr Ala Arg 145 150 155

Leu Val Thr Ser Leu Arg Ala Phe Ala Leu Glu Asp Lys Leu Pro 165 170 175

Glu Lys Arg Glu Leu Leu Ile Asp Trp Met Lys Arg Asn Thr Thr 180 185 190

Asp Ala Leu Ile Arg Ala Gly Val Pro Asp Gly Trp Glu Val Ala 195 200 205

Lys Thr Gly Ala Ala Ser Tyr Gly Thr Arg Asn Asp Ile Ala Ile

210 215 220

Trp Pro Pro Lys Gly Asp Pro Val Val Leu Ala Val Leu Ser Ser 225 230 235

Glu

Asn

Thr

Glu

Tyr

80

Glu

Leu

Arg

Leu

Ala

160

Ser

Gly

Asp

Ile

Arg

240 Asp Lys Lys Asp Ala Lys Tyr Asp Asp Lys Leu Ile Ala Glu Ala Thr 245 250 255

Lys Val Val Met Lys Ala Leu Asn Met Asn Gly Lys 260 265

Claims

1. Uso da beta-lactamase de classe A para a fabricação de um medicamento para a redução dos efeitos colaterais no intestino associados com o tratamento com uma combinação de antibiótico de beta-lactamo e inibidor de beta-lactamase.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, no qual a referida beta- lactamase de classe A é a PemP do Bacillus licheniformis.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1, no qual o antibiótico de beta-lactamo é selecionado a partir do grupo que consiste de penicilinas, aminopenicilinas, ureídopenicilinas e carboxipenicilinas.

4. Uso de acordo com a reivindicação 3, no qual o antibiótico de beta-lactamo é selecionado a partir do grupo que consiste de penicilina G, amoxicilina, piperacilina e ticarcilina.

5. Uso de acordo com a reivindicação 1, no qual o inibidor é um inibidor contra a beta-lactamase de classe A.

6. Uso de acordo com a reivindicação 5, no qual o inibidor é se- lecionado a partir do grupo que consiste de sulbactamo, ácido clavulânico e tazobactamo.

7. Uso de acordo com a reivindicação 1, no qual a combinação do antibiótico de beta-lactamo e o inibidor da beta-lactamase é uma combi- nação selecionada a partir do grupo que consiste em ampicilina e sulbacta- mo; amoxicilina e ácido clavulânico; piperacilina e tazobactamo e ticarcilina e ácido clavulânico.

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a beta-lactamase é derivada a partir da cepa 749/C do Bacillus li- cheniformis (ATCC 25972).

9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que a beta-lactamase é uma beta-lactamase recombinante, que tenha sido produzida em Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumulis, ou Bacillus licheniformis.

10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que a beta-lactamase é fabricada como uma composição farmacêutica oral.

11. Uso de acordo com a reivindicação 10, no qual a composi- ção farmacêutica é uma composição de revestimento entérico.

12. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o antibiótico de beta-lactamo e o inibidor da beta-lactamase são ad- ministrados por via parenteral.

13. Método para a redução dos efeitos colaterais no intestino associados com o tratamento com uma combinação de antibiótico de beta- lactamo e um inibidor de beta-lactamase, em que uma quantidade efetiva de beta-lactamase de classe A é administrada a um sujeito necessitando da mesma.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, no qual a beta- lactamase do grupo A é a PemP do Bacillus licheniformis.