BRPI0717020A2 - Moléculas de ligação - Google Patents

Description

"MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO" Campo da Invenção

A presente invenção se refere aos métodos para construção genética de domínios VH, de modo a aperfeiçoar sua solubilidade e estabilidade. A invenção provê a incorporação das substituições de aminoácido definidas com base nas informações estruturais tridimensi- onais no interior dos segmentos V de um local de cadeia pesada, expressando o local em um mamífero não humano e selecionando domínios Vh solúveis como resultado da redispo- sição VDJ. Mutações de estabelecimento ou solubilização adicionais podem ser introduzidas como resultado da maturação de afinidade durante a maturação da célula B in vivo. Tais mutações são distintas daquelas mutações específicas, antigênicas, presentes predominan- temente na região CDR3 que aperfeiçoa o reconhecimento e ligação do antígeno.

Os anticorpos apenas de cadeia pesada gerados empregando os métodos da pre- sente invenção também são descritos.

Na descrição que se segue, todos os números de posição do resíduo de aminoáci- do são fornecidos pelo sistema de numeração projetado por Kabat e outros. [I], ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Anticorpos

A estrutura dos anticorpos é bem conhecida na arte. Os anticorpos mais naturais são tetraméricos, compreendendo duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. As cadeias pesadas são ligadas uma a outra através das ligações de dissulfeto entre domínios de arti- culação localizados aproximadamente a meio caminho de cada cadeia pesada. Uma cadeia leve está associada a cada cadeia pesada no lado de término N do domínio de articulação. Cada cadeia leve é normalmente ligada a sua respectiva cadeia pesada por uma ligação de dissulfeto próxima ao domínio de articulação.

Quando uma molécula de anticorpo é corretamente dobrada, cada cadeia se dobra dentro de vários domínios globulares distintos unidos por sequencias de polipeptídeo mais lineares. Por exemplo, a cadeia leve se dobra dentro de um domínio (Vl) variável e um do- mínio (Cl) constante. As cadeias pesadas possuem um domínio Vh variável, simples, um primeiro domínio constante (CH1), um domínio de articulação e dois ou três domínios cons- tantes adicionais. Os domínios constantes de cadeia pesada e o domínio de articulação em conjunto formam o que é geralmente conhecido como região constante de uma cadeia pe- sada de anticorpo. A interação dos domínios variáveis de cadeia pesada (Vh) e cadeia leve (Vl) resulta na formação de uma região de ligação de antígeno (Fv). A interação das cadeias leve e pesada é facilitada pelo dom ínio Ch 1 da cadeia pesada e o domínio Ck ou CA da ca- deia leve. De modo geral, ambos Vh e Vl são necessários para ligação do antígeno, embora os dímeros de cadeia pesada e fragmentos de terminal amino se mostraram como retendo atividade na ausência da cadeia leve [2]. Dentro dos domínios variáveis de ambas as cadeias pesada (Vh) e leve (VL), alguns segmentos de polipeptídeo curtos mostram excepcional variabilidade. Estes segmentos são denominados regiões hipervariáveis ou regiões de determinação de complementaridade (CDRs). Os segmentos de intervenção são denominados regiões de estrutura (FRs). Em cada um dos domínios Vh e VL, existem três CDRs (CDR1-CDR3).

As classes de anticorpo diferem em sua função fisiológica. Por exemplo, IgG de- sempenha um papel dominante em uma reposta imune madura. IgM está envolvido na fixa- ção do complemento e aglutinação. IgA é a maior classe de Ig nas secreções - lágrimas, saliva, colostro, muco e assim desempenha um papel na imunidade local. As funções efeto- ras dos anticorpos naturais são providas pela região constante de cadeia pesada.

Nos mamíferos existem cinco tipos de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM com 4 subtipos IgG e 2 IgA presentes nos seres humanos.

Classe Cadeia H Cadeia L Subuni- dades mg/m L Observações IgG gama Capa ou Iambda H2L2 6-13 Transferida através da placenta IgM mu Capa ou Iambda (H2L2)5 0,5-3 Primeiros anticorpos aparecem após imunização IgA Alfa Capa ou Iambda (H2L2)5 0,6-3 Concentrações muito maiores nas secreções IgD delta Capa ou Iambda H2L2 <0,14 Função indeterminada IgE épsilon Capa ou Iambda H2L2 <0,0004 Liga-se aos basófilos e células mastóides sensibilizando os mes- mos para determinadas reações alérgicas

IgA pode ser encontrada nas áreas contendo muco (por exemplo, intestino, no trato respiratório ou no trato urogenital) e impede a colonização das áreas da mucosa por agen- tes patogênicos. IgD funciona principalmente como um receptor antigênico nas células B, IgG se liga aos alergenos e desencadeia a liberação da histamina das células mastóides (o mecanismo subjacente da alergia) e também provê proteção contra helmintos (vermes). IgG (em seus quatro isotipos) provê a maioria da imunidade com base em anticorpo contra a- gentes patogênicos invasores. IgM é expressa na superfície das células B e também em uma forma secretada com afinidade muito alta para eliminar agentes patogênicos nos está- gios precoces da imunidade mediada pela célula B (isto é, antes de existir IgG suficiente para eliminar os agentes patogênicos).

As células B normais contêm um local de cadeia pesada a partir do qual o gene co- dificando uma cadeia pesada é produzido por redistribuição. Um local de cadeia pesada normal compreende vários segmentos de gene V, vários segmentos de gene D e vários segmentos de gene J. A maior parte do domínio Vh é codificada por um segmento de gene V, porém a extremidade de término C de cada domínio Vh é codificada por um segmento de gene D e um segmento de gene J. A redisposição de VDJ nas células B, seguido por matu- ração de afinidade, provê um gene redisposto codificando cada domínio VH. A análise da sequencia dos tetrâmeros H2L2 demonstra que a diversidade resulta de uma combinação de redisposição de VDJ e hipermutação somática e que a diversidade na região CDR3 é sufici- ente para a maior parte das especificidades do anticorpo [vide referência 3].

Com o advento das novas técnicas de biologia molecular, a presença de anticorpo apenas de cadeia pesada (isento de cadeia leve) foi identificada nos transtornos proliferati- vos de célula B nos homens (Doença de Cadeia Pesada) e nos sistemas de modelo de mu- rinos. A análise da doença de cadeia pesada em nível molecular mostrou que as mutações e deleções no nível do genoma podem resultar na expressão inadequada do domínio Ch1 de cadeia pesada, fomentando a expressão do anticorpo apenas de cadeia pesada não a- presentando a capacidade de se ligar à cadeia leve [4,5],

Foi mostrado que os camelídeos, como resultado das mutações de gene natural, produzem dímeros apenas de cadeia pesada lgG2 e lgG3 funcionais que são incapazes de se ligarem à cadeia leve em razão da ausência do domínio CH1, que media a ligação à ca- deia leve [6], Um aspecto característico do anticorpo apenas de cadeia pesada dos camelí- deos é um subconjunto específico de domínios Vh dos camelídeos, que fornece solubilidade aperfeiçoada em relação aos domínios Vh dos camelídeos normais e de seres humanos. O subconjunto específico dos domínios de Vh dos camelídeos é geralmente referido como do- mínios Vhh-

Foi demonstrado também que as espécies, tais como tubarão, produzem uma famí- lia de proteína de ligação semelhante a apenas de cadeia pesada, provavelmente relaciona- da ao receptor de célula T de mamífero ou cadeia leve de anticorpo [7].

Os domínios VHh dos camelídeos encontrados nos anticorpos apenas de cadeia pesada são também caracterizados por CDR3 modificado. Este CDR3 é, em média, mais longo eu aqueles encontrados nos anticorpos de não camelídeos e é um aspecto considera- do como sendo uma influência maior na afinidade e especificidade do antígeno total, que compensa a ausência de um domínio Vl no anticorpo apenas da cadeia pesada dos camelí- deos [8,9].

Para a produção de anticorpo apenas de cadeia pesada dos camelídeos, o local da cadeia pesada no germinal dos camelídeos compreende segmentos de gene codificando algumas ou todas as regiões constantes de cadeia pesada possíveis. Durante a maturação, um transcrito gênico redisposto codificando um domínio de ligação de VHhDJ é recomposto na extremidade 5' de um segmento gênico transcrito codificando um domínio de articulação, para prover um gene redisposto codificando uma cadeia pesada que não possua um domí- nio CH1 e é portanto incapaz se de associar a uma cadeia leve.

Os domínios VHh dos camelídeos contêm várias características dos aminoácidos nas posições 37, 44, 45 e 47 [vide ref. 9]. Acredita-se que estes aminoácidos conservados sejam importantes para conferir solubilidade aos anticorpos apenas de cadeia pesada [9]. Apenas determinados domínios Vh dos camelídeos são domínios VHh com características de solubilidade aperfeiçoadas. Em contraste, os domínios Vh humanos derivados de bibliotecas de exposição não possuem estas alterações de aminoácido características na interface VH/VL e, consequentemente, são menos solúveis ou "aglutinantes" em relação aos domínios VHH dos camelídeos [10]. Infelizmente, os resultados dos esforços para construção ou came- lização dos domínios Vh humanos permanecem imprevisíveis, uma vez que a introdução das mutações de camelização no domínio Vh na interface VH/VL sozinhas não é suficiente para aperfeiçoar a solubilidade de modo previsível. Parece que a introdução dos aspectos para melhorar a solubilidade pode precisar ser compensada por mutações ainda não defini- das, em qualquer lugar no domínio VH, de modo a manter a estabilidade estrutural [vide revi- são 9].

Os anticorpos monoclonais apenas de cadeia pesada podem ser recuperados de células B do baço dos camelídeos por tecnologia de clonagem padrão ou por RNAm de cé- lula B por fago ou outra tecnologia de mostra [10]. Anticorpos apenas de cadeia pesada de- rivados dos camelídeos são de afinidade alta. A análise da sequencia de RNA codificando anticorpo apenas de cadeia pesada demonstra que a diversidade resulta, primariamente, de uma combinação de redisposição VDJ e hipermutação somática [11].

Um aspecto importante e comum dos domínios Vh de humanos e camelídeos deri- vados por fago e outras abordagens de mostra in vitro é que cada domínio se liga como um monômero sem dependência da dimerização com um domínio VL. Estes domínios de ligação de Vh ou "nanocorpos" parecem especificamente apropriados para a produção dos agentes de bloqueio e agentes de penetração de tecido e eliminam a necessidade de derivar scFv in vitro , quando da construção dos complexos de ligação com base em anticorpo (vide PCT/GB2005/002692).

Fabricação de Produtos á base de Anticorpo

A fabricação de produtos à base de anticorpo por construção genética, especifica- mente, a fabricação de produtos à base de anticorpo humano ou humanizado, resultou na geração de novas classes de medicamentos, diagnósticos e reagentes e, em paralelo, a oportunidade para uma nova indústria, empregos e criação de riquezas (vide www.druqresearcher.com,www.leaddiscoverv.co.uk). Os produtos à base de anticorpos, derivam, geralmente, de anticorpos tetraméricos. Existem muitas Patentes e Pedidos de Patente que se referem à obtenção de produtos à base de anticorpo. Estas Patentes e Pe- didos de Patente se referem às vias de derivação (por exemplo, de camundongos trangêni- cos), vias de fabricação e substâncias específicas de produtos. Tais produtos à base de an- ticorpo incluem anticorpos tetraméricos completos, fragmentos de anticorpo e moléculas de Fv (scFv) de cadeia simples.

As moléculas de scFv compreendem apenas os domínios variáveis das cadeias pe- sada (Vh) e leve (Vl) ligados por um Iigante peptídico para formar uma molécula simples e são geralmente obtidos por classificação de bibliotecas de exposição (por exemplo, exposi- ção de fago e exposição de emulsão). Alternativamente, elas são construídas geneticamen- te de anticorpos naturais por clonagem das regiões de ácido nucléico codificando os domí- nios Vh e Vl em uma unidade de transcrição. As moléculas de scFv obviamente possuem um peso molecular muito menor e não possuem as funções efetoras da região constante dos anticorpos naturais. As moléculas de scFv são freqüentemente otimizadas in vitro .

Produtos à base de anticorpo representarão uma proporção alta dos novos medi- camentos lançados no século 21. A terapia do anticorpo monoclonal já é aceita como uma via preferida para o tratamento de artrite reumatóide e doença de Crohn e existe progresso expressivo no tratamento do câncer. Os produtos à base de anticorpo estão também em desenvolvimento para o tratamento de doenças cardiovasculares e infecciosas. A maior par- te dos produtos à base de anticorpo comercializados reconhece e se liga a um epítopo sim- ples, bem definido no Iigante alvo (por exemplo, TNFa).

A fabricação dos produtos à base de anticorpo para terapia continua a depender da cultura celular do mamífero. A combinação de um anticorpo tetramérico e processos de gli- cosilação pós-tradução subsequentes impedem o uso de sistemas bacterianos, embora le- veduras construídas geneticamente para produção de padrão de glicosilação de mamíferos mostrem ser promissoras como uma alternativa para os sistemas de produção à base de célula de mamíferos. Os custos de produção e custos de capital para a fabricação dos pro- dutos à base de anticorpo pelo cultivo de células de mamíferos são altos e tendem a limitar o potencial das terapias à base de anticorpo na ausência de alternativas aceitáveis. Vários organismos transgênicos são capazes de expressar anticorpos completamente funcionais. Estes incluem plantas, insetos, frangos, cabras e gado.

Os fragmentos de anticorpo funcional podem ser fabricados em E.coli, porém o produto geralmente possui baixa estabilidade no soro a menos que pegilado durante o pro- cesso de fabricação.

Recentemente, domínios Vh de alta afinidade foram selecionados dos domínios Vh humanos aleatorizados nas bibliotecas de exposição derivadas de anticorpo apenas de ca- deia pesada produzido naturalmente do desafio com antígeno dos camelídeos ou derivado de bibliotecas de domínio Vh fabricadas dos camelídeos. Esses domínios Vh de alta afinida- de foram incorporados aos produtos à base de anticorpo. Estes domínios VH, também de- nominados domínios VHh. exibem várias diferenças dos domínios Vh clássicos, especifica- mente o número de mutações que garantem solubilidade aperfeiçoada das cadeias pesadas na ausência de cadeias leves. A mais proeminente dentre estas alterações é a presença de aminoácidos carregados nas posições 44, 45 e 47. Supõe-se que estas alterações compen- sem a ausência de Vl através da substituição dos resíduos hidrófobos por aminoácidos mais hidrófilos, pelo que, mantendo a solubilidade na ausência da interação de VH/VL [para revi- são vide referência 9 e outras referências citadas neste documento].

Vários grupos trabalharam para a geração de anticorpos apenas de cadeia pesada derivados dos anticorpos tetraméricos naturais. Jaton e outros [2 e outras referências cita- das neste documento] descrevem a separação dos componentes da cadeia pesada reduzi- dos de um anticorpo de coelho bem caracterizado, purificado por afinidade, seguido pela renaturação subsequente das cadeias pesadas do indivíduo. A caracterização imunológica das cadeias pesadas renaturizadas demonstrou que um homodímero de cadeia pesada so- zinho, isento de cadeia leve, se liga ao antígeno.

Mais tarde, Ward e outros [10] demonstraram ambiguamente que as regiões de Vh de murino clonadas, quando expressas como monômeros de proteína solúvel em um siste- ma de expressão de E.coli, mantêm a capacidade de se ligarem com afinidade alta. Ward e outros [10] descrevem o isolamento e a caracterização dos domínios Vh e estabelece as vantagens comerciais em potencial desta abordagem, quando comparada à produção de anticorpo monoclonal clássica (vide último parágrafo). Eles também reconhecem que os domínios Vh isolados das cadeias pesadas que normalmente se associem a uma cadeia leve não possuem solubilidade dos anticorpos tetraméricos naturais. Hence Ward e outros [10] empregaram o termo "aglutina" para descrever estas moléculas e propor que esta "aglu- tinação" possa ser direcionada para o projeto de domínios Vh com propriedades de solubili- dade melhoradas.

O aperfeiçoamento da solubilidade de Vh foi subseqüentemente direcionado ao uso de combinações de abordagens aleatorizadas e direcionadas ao sítio usando a exposição do fago. Por exemplo, Davies e Riechmann [12] e outros (vide W092/01047) incorporaram alguns aspectos dos domínios Vh dos anticorpos de camelídeos apenas de cadeia pesada em combinação com a exposição do fago para aperfeiçoar a solubilidade, enquanto quanto à especificidade de ligação.

Os domínios Vh humanos podem ser construídos geneticamente in vitro para carac- terísticas de solubilidade aperfeiçoadas [9,12], Quando os domínios de ligação Vh são deri- vados de bibliotecas de fago, afinidades intrínsecas para antígeno permanecem na faixa micromolar baixa a nanomolar alta, a despeito da aplicação das estratégias de aperfeiçoa- mento por afinidade envolvendo, por exemplo, aleatorização de ponto aquecido por afinida- de [13]. Contudo, a construção genética de domínios Vh de mamífero com solubilidade aper- feiçoada permanece imprevisível. Além disto, fica claro que, a despeito dos relatórios publi- cados (12, 14, 15), a introdução de mutações de "camelização" é insuficiente para prover resultados previsíveis e mutações adicionais são necessárias se solubilidade melhorada precisar ser obtida na ausência de agregação [9].

Domínios Vh humanos ou VHh dos camelídeos produzidos in vivo, diferente do Vh produzido por tecnologia de exposição de fago, possuem a vantagem de características a- perfeiçoadas na região CDR3 do sítio de ligação de anticorpo normal como resultado de mutações somáticas introduzidas como um resultado de maturação por afinidade, além da diversidade provida pela recombinação do segmento de gene D e J. VHh de camelídeos, enquanto mostrando benefícios na solubilidade em relação ao Vh humano é antigênico no homem e deve ser gerado por imunização dos camelídeos ou por tecnologia de exposição de fago.

Recentemente, foram desenvolvidos métodos para produção de anticorpos apenas de cadeia pesada nos mamíferos não humanos transgênicos (vide, W002/085945, W002/085944; e [16]). Anticorpo apenas de cadeia leve, de alta afinidade, funcional poten- cialmente de qualquer classe (IgM, IgG, IgD, IgA ou IgE) e derivado de qualquer mamífero pode ser produzido usando mamíferos não humanos transgênicos (preferivelmente roedo- res) como resultado do desafio com antígeno.

Estes anticorpos apenas de cadeia pesada solúveis foram derivados de um local de cadeia pesada do anticorpo em uma configuração de germinação (isto é, não redispostos) que continha dois segmentos de gene de Vhh de Ihama (classe 3) acoplados a todos os segmentos de gene DeJ humanos e segmentos de gene codificando todas as regiões constantes humanas. Os segmentos de gene codificando tais regiões constantes tinham uma deleção do domínio CH1 para prevenir a ligação da cadeia leve. Além disto, o local con- tinha o anticorpo LCR na extremidade 3' e outros elementos melhoradores intrangênicos para garantir um alto nível de expressão nas células da linhagem de B [17].

Foi observado um desafio com o antígeno, recombinação de VDJ e ativação de cé- lula B com maturação por afinidade associada como resultado das mutações somáticas. As mutações somáticas foram observadas no segmento de gene V da Ihama além das muta- ções esperadas predominantemente na região CDR3 [16].

Parece, provavelmente, que a produção ótima e seleção de anticorpos apenas de cadeia pesada compreendendo alta afinidade, domínios de ligação Vh solúveis (se huma- nos, de camelídeos ou de outra origem) se beneficiarão das abordagens alternativas em relação aos dependentes da seleção de bibliotecas de fago aleatorizadas que não facilitam a recombinação in vivo e maturação por afinidade.

Assim, permanece a necessidade na técnica de se maximizar a diversidade do an- ticorpo apenas de cadeia pesada e resposta de célula B in vivo, especificamente, para gerar um repertório funcional de anticorpos apenas de cadeia pesada, humanos, específicos da classe, e domínios de ligação apenas de cadeia pesada de Vh funcionais que retenham po- tencial máximo de ligação de antígeno na ausência de agregação para uso em diversas a - plicações clínicas, industriais e de pesquisa.

Portanto, permanece a necessidade na técnica de se produzir segmentos de gene V que, quando recombinados com segmentos DeJ nos mamíferos não humanos transgêni- cos em resposta ao desafio do antígeno, gerem anticorpos apenas de cadeia pesada fun- cionais, solúveis, específicos para antígeno na ausência de agregação (aglutinação).

A Invenção

Os presentes inventores superaram, surpreendentemente, as limitações da técnica e mostraram que os domínios Vh completamente humanos podem ser obtidos por incorpo- ração de segmentos V humanos ao local da cadeia pesada, onde os segmentos de gene V

(i) foram modificados na interface de Vl de modo a reduzir a hidrofilicidade e (ii) possuem mutações adicionais introduzidas para superar a instabilidade estrutural. Tais mutações adi- cionais podem ser benéficas, independente daquelas realizadas na interface de VL. A sele- ção dos segmentos V funcionais ocorre em camundongos transgênicos. Aperfeiçoamentos adicionais podem ser incorporados in vivo ao domínio Vh por seleção natural como resultado da maturidade por afinidade dependente de célula B, seguindo-se resposta ao antígeno. Portanto, a presente invenção provê um método para produzir um anticorpo apenas de ca- deia pesada compreendendo:

desafio com um antígeno de um mamífero não humano possuindo um local de ca- deia pesada que:

compreende vários segmentos de gene V, pelo menos um dos quais codifica uma ou mais mutações de aminoácido (i) na interface VL, de modo a reduzir a hidrofobicidade e

(ii) em outras posições, de modo a superar a instabilidade estrutural ou diminuir a hidrofobi- cidade;

compreende pelo menos um segmento de gene D e pelo menos um segmento de

gene J;

não contém quaisquer segmentos de gene codificando um domínio CH1; e

quando expresso em resposta ao desafio do antígeno, produz um anticorpo apenas de cadeia pesada possuindo um domínio Vh solúvel, codificado por um gene Vh que inclui um segmento de gene V preferido incorporado como resultado da redisposição de VDJ no dito gene VH.

Preferivelmente, o local da cadeia pesada compreende vários segmentos de gene V, vários dos mesmos codificando uma ou mais mutações de aminoácido conforme descri- tas em (i) e (ii) acima. O mamífero não humano pode ser obtido por: produção in vitro de um transgene in- cluindo o dito local; e introdução do dito transgene dentro de uma célula apropriada, da qual o dito mamífero não humano será obtido. A célula pode ser uma célula tronco embrionária ou um oócito.

Alternativamente, o dito mamífero não humano é obtido por recombinação homólo- ga onde vários segmentos de gene V mutados e, opcionalmente, segmentos de gene D e J1 substituem os segmentos de gene equivalentes em um local de cadeia pesada endógena no mamífero não humano.

Quando apenas um local estiver presente, preferivelmente todos os segmentos de gene V serão construídos geneticamente.

Preferivelmente, o mamífero não humano inclui múltiplos locais de cadeia pesada, pelo menos um dos quais sendo conforme definido acima e cada um dos quais estando em um cromossomo diferente. Caso desejado, os locais em cada cromossomo podem ser os mesmos. Alternativamente, os locais em cada cromossomo podem ser diferentes. Quando os locais forem diferentes, eles poderão compreender combinações de segmentos do gene V naturais ou construídos geneticamente. Alternativamente, alguns podem compreender segmentos de gene V naturais e alguns segmentos de gene V construídos geneticamente.

Preferivelmente, os segmentos de gene V are segmentos de gene V humanos, mu- tados.

Preferivelmente, o local inclui múltiplos segmentos de gene D.

Preferivelmente, o local inclui múltiplos segmentos de gene J.

Caso desejado, o local pode conter pelo menos um segmento de gene codificando uma região constante. Preferivelmente o local contém múltiplos segmentos de gene codifi- cando uma região constante. Preferivelmente cada segmento de gene codificando uma re- gião constante é humano.

Preferivelmente, cada segmento de gene V, D e J é humano.

Preferivelmente, cada segmento de gene V codifica uma proteína que possui uma mutação em uma das posições 37, 44, 45 e 47. Mais preferivelmente, cada segmento de gene V codifica uma proteína que possui mutações em todas as posições 37,44, 45 e 47.

Preferivelmente, o segmento de gene V codifica uma proteína, onde na posição 37, o resíduo é fenilalanina (F)1 na posição 44, o resíduo é ácido glutâmico (E)1 na posição 45, o resíduo é glutamina (Q) e/ou na posição 47, o resíduo é glicina (G). Preferivelmente, cada segmento de gene V codifica uma proteína que possui uma mutação em cada uma das po- sições 5 e 14. Mais preferivelmente, cada segmento de gene V codifica uma proteína que possui mutações em ambas as posições 5 e 14.

Preferivelmente, o segmento de gene V codifica uma proteína pelo que, na posição 5, o resíduo é glutamina (Q) e/ou na posição 14, o resíduo é alanina (A). Um "domínio VH" no contexto da presente invenção se refere a um produto de ex- pressão do segmento de gene V quando recombinado com o segmento de gene Deo seg- mento de gene J. Preferivelmente, o domínio Vh conforme usado neste documento perma- nece em solução e é ativo em um meio fisiológico e a temperatura fisiológica nos mamífe- ros, sem a necessidade de outro qualquer outro fator para manter a solubilidade. Opcional- mente, a solubilidade e estabilidade do domínio Vh podem ser aperfeiçoadas por mutação somática seguindo a recombinação de VDJ. Não existe evidência da presença do laço de CDR3 aumentado presente nos domínios VHh, porém não nos domínios Vh produzidos pelas espécies camelídeas. O domínio Vh é capaz de se ligar ao antígeno como um monômero e, quando expresso com uma região constante efetora, pode ser produzido nas formas mono- específica, biespecífica, multiespecífica, bivalente ou multivalente, dependendo da escolha e construção genética das moléculas efetoras empregadas (por exemplo, IgG, IgA1 IgM, etc.) ou mecanismos alternativos de dimerização e multimerização. Qualquer probabilidade de ligação com um domínio Vl quando expresso como parte de um complexo de anticorpo a- penas de cadeia pesada solúvel foi eliminada devido à ausência de um domínio CH1 [16].

As propriedades do domínio Vh podem ser alteradas ou aperfeiçoadas por seleção ou construção genética de segmentos de gene V, D e/ou J que codificam seqüências com as características necessárias. Preferivelmente, o domínio Vh terá solubilidade aperfeiçoada. Os métodos preferidos de aperfeiçoamento da solubilidade de um domínio Vh incorporam projeto racional com base em uma estrutura tridimensional conhecida [18], seguido por in- corporação dos segmentos V construídos geneticamente em um local de cadeia pesada, permitindo a expressão, maturação por afinidade e seleção dos anticorpos apenas de ca- deia pesada solúveis das células B ativadas em um mamífero não humano de escolha. Os segmentos DeJ preferidos, se naturais ou construídos geneticamente, podem também ser incorporados ao local.

O método da presente invenção provê uma ferramenta ideal pra seleção dos seg- mentos de gene V que são capazes de produzir domínios Vh solúveis. Utilizando o método da presente invenção, um anticorpo apenas de cadeia pesada Vh apenas será produzido se o domínio VH, traduzido dos segmentos de gene V, D e J recombinados, somaticamente mutados, for solúvel. As células B que não produzem anticorpos solúveis não sobreviverão, enquanto aquelas que produzem sofrerão seleção natural adicional in vivo, através de matu- ração por afinidade e a incorporação de mutações favoráveis no gene Vh seguindo-se a re- disposição de VDJ. Os anticorpos resultantes serão ambos solúveis e mostrarão especifici- dade antigênica alta. Portanto, o método permite a seleção dos domínios Vh mutados, mais preferivelmente, domínios Vh humanos mutados, que são solúveis. Uma vez que é evidente que várias mutações sinergísticas podem ser necessárias para se obter este resultado e que estas podem diferir dependendo do segmento de gene V expresso, as mutações preferidas são introduzidas nos segmentos V selecionados antes da sua incorporação em um local de cadeia pesada. A incorporação de outras mutações benéficas e seleção podem então ocor- rer como resultado da maturação por afinidade in vivo. Alternativamente, um segmento de gene V construído geneticamente dentro do local pode codificar parte de um domínio Vh que mostra solubilidade e estabilidade na ausência de maturação por afinidade adicional. Assim, a maturidade por afinidade contribuirá para a especificidade de ligação do antígeno e afini- dade sozinha.

Estes domínios Vh solúveis podem ser analisados por seqüenciamento dos domí- nios Vh encontrados nas células B produzindo anticorpos de alta afinidade e solúveis. Isto permitirá a identificação de mutações somáticas adicionais no segmento de gene V que for- necerão solubilidade aumentada. Uma vez identificadas, estas mutações podem ser incor- poradas aos segmentos de gene V novos. Estas podem novamente ser incorporadas em um local de cadeia pesada, que pode então ser expresso nos mamíferos não humanos transgê- nicos e o processo de seleção de domínios Vh solúveis repetido. As mutações somáticas benéficas nos segmentos DeJ podem ser identificadas.

Assim, a invenção utiliza, primeiro, informações deduzidas das estruturas de cristal das regiões Vh clássicas e VHh de camelídeos e informações de domínios Vh solúveis co- nhecidos encontrados na natureza e, em segundo lugar, utiliza mamíferos não humanos transgênicos para selecionar os domínios Vh solúveis resultantes da redisposição de VDJ nas células B, seguindo-se estimulação do antígeno. Os segmentos do gene V construídos geneticamente preferidos podem então ser utilizados para gerar um mamífero não humano transgênico adicional portando um local de cadeia pesada que incorpore segmentos de ge- ne V que fornecem domínios Vh com características de solubilidade superiores, como resul- tado do desafio do antígeno.

Neste documento, nós descrevemos a geração de anticorpos apenas de cadeia pe- sada completamente humanos em mamíferos não humanos transgênicos. O problema prin- cipal na geração de tais anticorpos é a baixa solubilidade dos domínios Vh de não camelí- deos (por exemplo, humanos, coelhos, camundongos) na ausência de interação com VL. O domínio Vh possui uma superfície hidrófoba grande que normalmente interage com uma região semelhante do domínio variável de cadeia leve (Vl) em anticorpos tetraméricos nor- mais, provendo um complexo solúvel. Contudo, quando dissociada do VL, esta região hidró- foba é responsável pelos problemas de solubilidade algumas vezes encontrados nos domí- nios Vh isolados.

A presente invenção provê a introdução de uma ou mais substituições de aminoáci- do nos domínios Vh de camelídeos e não camelídeos, especificamente através do segmento de gene V codificando parte do domínio Vh humano, de modo a superar o problema de so- lubilidade, enquanto mantendo ou reforçando a estrutura tridimensional do domínio Vh mu- tado. Os segmentos de gene V mutados são então incorporados a um local contendo os segmentos de gene da região constante D e J. O local pode incluir quaisquer elementos reguladores intragênicos necessários, e a Ig LCR1 conforme descrito anteriormente [16]. Tal local, ou preferivelmente tais locais conforme descritos acima, são então introduzidos em um mamífero não humano, tal como, camundongo, por exemplo por microinjeção ou qualquer outra técnica apropriada. Os mamíferos não humanos, transgênicos, portando este local respondem ao desafio do antígeno, resultando na redisposição do local nas células da li- nhagem Bea produção de anticorpos apenas de cadeia pesada solúveis como resultado da imunização e maturação in vivo. Assim, é provido um método para produção de mutações em não camelídeos, es-

pecificamente seres humanos, domínios VH, de modo a superar o problema de solubilidade por produção de um local de cadeia pesada Vh não camelídeo consistindo nos segmentos de gene V construídos geneticamente não camelídeos, bem como, segmentos de gene D, J e opcionalmente C e elementos reguladores, tais como, melhoradores de Ig e a Ig LCR1 in- traduzindo tal local em um mamífero não humano e desafiando o mamífero transgênico por- tando este local com antígeno, resultando na redisposição do local nas células da linhagem Bea produção de anticorpos apenas de cadeia pesada solúveis como resultado da imuni- zação e maturação in vivo.

Preferivelmente, o segmento de gene V construído geneticamente codifica uma ou mais substituições de aminoácido na interface Vl e substituições de aminoácido adicionais a fim de manter a estabilidade estrutural tridimensional. Tais mutações adicionais podem tam- bém ser benéficas, independente de qualquer outra mutação por aumento da hidrofobicida- de.

Como exemplo, nós descrevemos mutações introduzidas em 8 regiões de Vh da subfamília 3 humana, uma subfamília 1 da região Vh e 1 subfamília 5 da região Vh (vide figu- ra 1) como resultado das interações estruturais com base no conhecimento tridimensional dos domínios Vh humanos e VHh de camelídeos (www.rcsb.org/pdbl). A família 3 é preferida em razão de seus domínios Vh possuírem similaridades em relação aos domínios VHh de camelídeo, porém a abordagem pode ser usada para gerar características de solubilidade aperfeiçoada em qualquer domínio de Vh (figura 1).

Especificamente, duas mutações na sequencia humana são realizadas com base nos dados obtidos com as regiões VHh de camelídeos, especificamente em duas posições: uma fenilalanina (F) na posição 37, substituindo uma isoleucina (I) ou valina (V); e um ácido glutâmico (E) na posição 44 substituindo uma glicina (G). Nas sequencias de camelídeos, a posição 45 é um aminoácido carregado. A Ieuci-

na 45 na sequencia humana não é substituída com um aminoácido carregado, porém com uma glutamina (Q, isto é, diferente do camelídeo), porque ela estabelece uma ponte de hi- drogênio com o grupo carbonila da glicina 116, estabelecendo uma estrutura semelhante aquela observada no VHh do camelídeo, ao redor de 116 e fornece empilhamento. Além dis- so, uma glicina (G) substitui o triptofano (W) ou tirosina (Y) na posição 47 para estabelecer uma interação com a tirosina (Y) na posição 58.

Estas quatro alterações de aminoácido são introduzidas em todas as sequencias Vh humanas mostradas na figura 3.

Além disso, duas outras substituições são introduzidas tanto em conjunto nas se- quencias de Vh 3-11, 3-23 e 5-23, quanto individualmente apenas nas sequencias de Vh 3- 23. Na posição 5, uma glutamina (Q) é introduzida para uma valina (V) ou Ieucina (L) de modo a aumentar a hidrofilicidade da superfície da região de VH. A prolina (P) na posição 14 é substituída por uma alanina (A) para estabelecer uma interação com o aminoácido 127 na região DJ e fortalecer a estrutura do domínio VH. Tal interação não acontece com P normal na posição 14.

As mutações feitas nos segmentos de gene V são projetada para manter um equilí- brio entre a solubilidade aumentada e estabilidade total diminuída do domínio Vh através da hidrofilicidade de superfície aumentada. A presente invenção também contempla o uso de quaisquer outras mutações que venham a obter o equilíbrio necessário de solubilidade aper- feiçoada, enquanto mantendo estabilidade estrutural tridimensional.

Os segmentos de gene V são incorporados à cabeça e cauda no local descrito an- teriormente [16], combinando os segmentos V humanos construídos geneticamente, preferi- velmente, os segmentos de gene D, J e da região constante opcional. Neste exemplo, de- zessete segmentos V humanos construídos geneticamente (figura 3) são incorporados com segmentos DeJ humanos dentro de um local contendo a região constante de cadeia pesa- da Cy não possuindo a região CH1. Alternativamente, vários locais podem ser introduzidos nos camundongos cada um contendo um subconjunto diferente de segmentos V construídos geneticamente com as mesmas regiões constantes ou diferentes. Devido à exclusão alélica (vide PCT/IB2007/001491), apenas um destes locais será escolhido como o local produtivo in vivo.

Preferivelmente, os mamíferos não humanos, transgênicos, são imunizados com um amplo espectro de antígenos para produzir uma variedade de anticorpos apenas de ca- deia pesada (embora a produção de anticorpos ocorra inevitavelmente devido à exposição aos antígenos ambientais). As sequencias de domínio Vh dos anticorpos assim produzidos são então comparadas à outra para identificar mutações comuns. Tais mutações comuns são mais provavelmente, aquelas que aperfeiçoam a solubilidade. Os domínios Vh derivados de tais anticorpos mostram solubilidade e estabilidade sob condições fisiológicas e não pos- suem natureza "aglutínante" dos domínios Vh isolados do fago e bibliotecas de exibição al- ternativas. Opcionalmente, os domínios Vh compreendem apenas sequencias humanas e assim não possuem antigenicidade de domínios Vh derivados de camelídeo, quando usadas como terapêuticos nos seres humanos. Vantajosamente, estas mutações são construídas em novos locais para a produção de anticorpos apenas de cadeia pesada, estáveis, solú- veis, seguindo-se o desafio com antígenos específicos.

O mamífero não humano transgênico é preferivelmente um roedor, tal como coelho, porquinho da índia, rato ou camundongo. Os camundongos são especificamente preferidos. Mamíferos alternativos, tais como, cabras, carneiros, gatos, cães e outros animais podem também ser empregados. Preferivelmente, o mamífero é um camundongo.

Preferivelmente, os animais não humanos transgênicos são gerados usando tecno- logia de injeção de oócito estabelecida e, quando estabelecida, a tecnologia de célula tronco embrionária (ES) ou clonagem.

Alternativamente, um local codificando anticorpos apenas de cadeia pesada (isento de regiões CH1) seria introduzido nos camundongos por substituição do local de cadeia pe- sada de camundongo endógeno através de recombinação homóloga. Isto seria obtido de várias formas conhecidas pelos versados na técnica.

Por exemplo, empregando recombinação homóloga, poderíamos inserir sítios de recombinação Iox ou frt em cada extremidade do local empregando tecnologia de recombi- nação padrão nas células ES (vide, por exemplo, www.ncrr.nih.gov/newspub/KOMP Llovd 1-18-2007.ppt). Após tratamento das células de ES recombinadas com recombinase cre (atuando nos sítios lox) ou flp (atuando nos sítios frt), respectivamente, o local total do murino seria removido.

A fim de introduzir as sequencias humanas no lugar do local do camundongo, pode- ríamos introduzir as sequencias de extremidade 5' do local do camundongo na extremidade 5' do local humano e a extremidade 3' do local do camundongo na extremidade 3' do local humano. Isto é realizado de modo mais eficiente pela recombinação de BACs ou PACs con- tendo o local humano normal ou construído geneticamente. Este novo local contendo as sequencias de camundongo em cada extremidade é recombinado através destas sequenci- as de camundongo na posição onde o local do camundongo estava nas células ES recom- binadas Como resultado, o local do murino é substituído pelo local humano.

Inúmeras variações são possíveis no esquema acima. A recombinação homóloga de locais muito grandes não é eficiente e consequentemente a construção genética pode ser realizada em várias etapas menores, cada vez substituindo partes do local com uma nova parte humana. Ao invés de BACs ou PACs, YACs e recombinação na levedura poderiam ser usados para introduzir os sítios Iox no local humano. A recombinação seria realizada em posições diferentes do local de murino, por exemplo, o local humano pode não conter a LCR humana quando o sítio Iox 3' for introduzido ao lado 5' da LCR de murino. Inúmeras varian- tes nos procedimentos de recombinação são possíveis nas células ES e a construção de BACs faria uso de técnicas de recombinação, tais como, clonagem Gateway™ (InVitrogen). Um exemplo desta abordagem é o camundongo transgênico Regeneron Veloclmmune (www.Reqeneron.com).

Alternativamente, a recombinação seria realizada em uma célula somática de muri- no, ao invés das células ES. Após recombinação e substituição dos locais de murino por humanos, o núcleo da célula recombinante seria usado para gerar camundongos usando clonagem de transferência nuclear empregando procedimentos padrão conhecidos dos ver- sados na técnica (http://www.liebertonline.eom/toc/clo/9/1). Obviamente, as células somáti- cas hospedeiras seriam de qualquer origem de mamífero e seriam usadas para apagar seu local de imunoglobulina e uso do núcleo para uma clonagem mediada por transferência nu- clear daquele mamífero.

Em todos estes procedimentos, o local a ser recombinado e substituição do local endógeno seriam de um mamífero que não ser humano para produzir anticorpos daquelas espécies específicas. Inúmeras variações são possíveis no esquema acima usando recom- binação homóloga para recombinação de local, especificamente nas espécies hospedeiras que não possuem tecnologia de célula ES.

É conhecida a geração dos camundongos transgênicos compreendendo locais de cadeia pesada e leve em uma base de camundongo onde as regiões V, D e J da cadeia pesada de murino e as regiões VeJ dos locais de cadeia leve de murino foram construídos geneticamente, tal que estas regiões compreendem os segmentos de gene humano equiva- lentes ou sequencias (vide EP1399575 e www.Regeneron.com). Embora uma abordagem esmerada, a estratégia idêntica pode ser usada para gerar um local de cadeia pesada fun- cional nos mamíferos transgênicos. Assim, os locais de cadeia pesada do hospedeiro são seletivamente construídos geneticamente, de modo que os segmentos de gene V naturais ou construídos geneticamente das espécies de escolha substituam os segmentos V da ca- deia pesada do hospedeiro. Os segmentos DeJ hospedeiros são substituídos de modo semelhante e as regiões constantes de cadeia pesada do hospedeiro são tanto substituídas por regiões constantes de escolha (isentas de CH1) quanto os domínios CH1 são deletados dos locais de cadeia pesada do hospedeiro. Preferivelmente, as sequencias inseridas de escolha são sequencias gênicas humanas, opcionalmente construídas geneticamente para otimizar as características físicas dos domínios Vh derivados subseqüentemente em respos- ta ao desafio do antígeno. A vantagem desta abordagem é que os elementos reguladores de hospedeiro residindo fora das sequencias de codificação são retidos, assim maximizando a probabilidade de função molecular e celular normal in vivo na resposta ao desafio do antíge- no. Vantajosamente, o hospedeiro é um roedor, preferivelmente um rato ou camundongo, permitindo a aplicação das técnicas molecular e celular laboratoriais padrão para caracteri- zação dos anticorpos resultantes. O hospedeiro pode ser potencialmente qualquer mamífe- ro, por exemplo, carneiro, porco, vaca, cabra, coelho, cavalo, gato ou cachorro. Vantajosa, porém não essencialmente, locais de cadeia pesada e opcionalmente leve de anticorpo en- dógenos para mamíferos são deletados ou silenciados quando um anticorpo apenas de ca- deia pesada é expresso de acordo com os métodos da invenção. Operacionalmente, os lo- cais de anticorpo de cadeia pesada são introduzidos à base preferivelmente de camundongo e então reticulados em uma base onde os genes endógenos são deletados ou silenciados, de modo que apenas os locais de cadeia pesada transgênicos respostam ao desafio do an- tígeno na segunda geração, conduzindo a ativação da célula B e circulação de anticorpos apenas de cadeia pesada no sangue. Os métodos de geração de anticorpos apenas de ca- deia pesada conforme descritos acima podem ser de uso especifico na geração de anticor- pos para uso terapêutico humano, uma vez que, freqüentemente, a administração dos anti- corpos a uma espécie de vertebrados que é de origem diferente da fonte dos anticorpos resulta no início de uma resposta imune contra aqueles anticorpos administrados. Os anti- corpos produzidos pelo método da invenção possuem vantagem em relação aos da técnica anterior, pelo que eles são de uma classe substancialmente simples ou conhecida e preferi- velmente de origem humana.

Consequentemente, um aspecto adicional da invenção provê um mamífero não humano, transgênico compreendendo um ou mais locais de cadeia pesada Vh heterólogos conforme definido acima. O mamífero não humano transgênico pode ser construído geneti- camente para ter uma capacidade reduzida de produzir anticorpos que incluam cadeias le- ves.

As células de produção de anticorpo podem ser derivadas de mamíferos não hu- manos transgênicos, conforme definido e usado neste documento, por exemplo, na prepara- ção de hibridomas para a produção de anticorpos de cadeia apenas pesada, conforme defi- nido neste documento. Além disto ou alternativamente, as seqüências de ácido nucléico podem ser isoladas destes mamíferos não humanos transgênicos e usadas para produzir anticorpos de cadeia apenas de cadeia pesada do domínio Vh ou complexos biespecífi- cos/bifuncionais dos mesmos, usando técnicas de DNA recombinante que são familiares aos versados na técnica.

Alternativamente ou, além disso, os anticorpos apenas de cadeia pesada específi- cos de antígenos podem ser gerados por imunização de um mamífero não humano transgê- nico, conforme definido neste documento.

Consequentemente, a invenção também provê um método para produção de anti- corpos apenas para cadeia pesada, em resposta ao desafio do antígeno de um mamífero não humano transgênico, conforme definido acima. Esta pode ser uma resposta direta ao antígeno ambiental (por exemplo, agente patogênico) ou um resultado da imunização com um antígeno alvo. Os anticorpos e fragmentos do mesmo podem ser isolados, caracteriza- dos e fabricados usando métodos bem estabelecidos e conhecidos dos versados na técnica. Estes anticorpos são de uso especifico nos métodos descritos no PCT/GB2005/00292.

A invenção é descrita agora, apenas como exemplo, na descrição detalhada que se segue, que se refere às figuras que se seguem.

DESENHOS

Figura 1: Um modelo tridimensional de um domínio Vh mostrando as posições das mutações

Uma estrutura cristalográfica é obtida de uma base de dados pública PDB (vide tex- to). A posição das alterações do aminoácido construído geneticamente são mostradas de normal > construído geneticamente, a seta indica a posição da alteração na estrutura tridi- mensional. As seqüências lineares dos segmentos Vh transformados geneticamente são mostradas na figura 3.

Figura 2: Estratégia com base na PCR para introduzir alterações de aminoácido de- sejadas nos domínios Vh humanos Este esquema mostra a estratégia básica para introduzir as mutações desejadas

por uma primeira rodada de PCR usando iniciadores das extremidades 5' e 3' para ampliar o segmento de Vh desejado (linha superior iniciadores 1 e 2). A metade de 5' e a metade de 3' são então ampliadas separadamente usando iniciadores de sobreposição contendo as mu- tações (indicadas por uma estrela nos iniciadores 3 e 4, segunda linha). Em seguida, as me- tades 5' e 3' mutadas são misturadas, desnaturadas e renaturadas (linha 3). Os iniciadores 1 e 2 são adicionados e todo o segmento de gene V é ampliado contendo as mutações (li- nha 4). A estratégia é repetida com outros iniciadores se mais mutações forem geradas (vi- de texto).

Figura 3: Local apenas de cadeia pesada humana contendo 17 segmentos Vh mu-

tados

Os números que precedem as sequencias de segmento de gene V na parte superi- or do painel indicam sua ordem conforme mostrado pelos números na parte inferior do pai- nel. A sombra cinza claro indica alterações de aminoácido que foram geradas em todos os segmentos de gene V pelo aminoácido indicado acima da sombra (posição 37:F; posição 44:E; posição 45:W e posição 47:G). Os aminoácidos sombreados de cinza escuro são substituídos pelo aminoácido indicado acima, os aminoácidos sombreados de cinza escuro (posição 5: Q, posição 14:A). Estes últimos aminoácidos foram gerados nos segmentos de gene V que foram modificados primeiro nas posições cinza claro centrais.

Figura 4: Southern blot hibridizado de 8 linhas transgênicas construtoras (A-H) con- tendo as regiões 17VH.

O Southern blot foi hibridizado com uma sonda VH23. C-wt é um controle de ca- mundongo não transgênico e MDS é um controle de linhagem de camundongo transgênico reportado em [16].

Figura 5: Western blot do soro da linhagem A de camundongo transgênico 17VH.

Western blot mostrando a expressão do anticorpo apenas de cadeia pesada huma- no (HAb) no soro de camundongo transgênico contendo o local 17VH sob condições de re- dução (isto é, mostrando cadeias simples ao invés de diméricas embora os dímeros sejam visíveis). A raia marcadora mostra faixas de peso molecular, a raia de soro humano contém IgG humano normal. Pesos moleculares são indicados, HAb possui o tamanho previsto de aproximadamente 45Kd.

Figura 6: Sequencias da extremidade 5' das diferentes regiões de VH. As sequencías na extremidade 5' das diferentes regiões de Vh usadas na constru-

ção 17VH. Incompatibilidades com a sequencia VH3 de consenso são indiadas por sombre- amento branco.

Figura 7: Produtos da PCR de DNAc preparados de camundongo transgênico por- tando um local com 17VH. O DNAc foi ampliado usando tanto o iniciador VHaII quanto uma combinação de to-

dos os iniciadores à frente (vide texto acima) e ambos os iniciadores reversos pra Cy2 e Cy3 (vide texto). A combinação de iniciador a frente usada é indicada acima das raias. Os mar- cadores de tamanho na raia marcadora são mostrados na esquerda. Os números na parte inferior das raias indicam quantidade relativa de DNAc na reação da PCR. Figura 8: Exemplo de eletroforese de gel dos inserções derivadas do camundongo

transgênico 17VH.

Minipreparações de DNA de plasmídeo foram obtidas por métodos padrão e cliva- das por EcoRI. As 12 preparações na esquerda são derivadas da síntese de DNAc e ampli- ação com iniciadores à frente VH3all, as 12 preparações de DNA na direita com o VH3all mais os outros iniciadores a frente (vide texto. O tamanho da faixa marcadora relevante é indicado à esquerda).

Figura 9: Exemplos de domínios Vh construídos geneticamente compreendendo segmentos de Vh humanos mutados e segmentos DeJ naturais.

Exemplos de inserções seqüências da figura 8, mostrando que as regiões de sub- classe Vh construídas geneticamente e regiões Vh diferentes construídas geneticamente dentro de uma subclasse são usadas na produção das redisposições de VDJ. O resultado também mostra que o uso de J4 é mais empregado como em humano. Conforme esperado, a diversidade é criada primariamente pela redisposição de VDJ.

EXEMPLOS

O trabalho descrito nos exemplos que se seguem tem como base o trabalho descri-

to em [16]. Portanto, é necessário que se leia [16] a fim de se entender completamente os exemplos que se seguem. A revelação de [16] é incorporada neste documento como refe- rência.

Exemplo 1

Construção de camundongo não humano, transgênico contendo locais de gene a - penas de cadeia pesada funcional.

Em uma modalidade preferida do primeiro aspecto da invenção, vários segmentos

de gene V humanos são clonados em um local humano múltiplo, modificado contendo toda a região D, toda a região J, as regiões Cp, Cy2, 0γ3 e Ca e a 3'LCR usando estes métodos descritos em [16] e mostrados na técnica.

Todos os segmentos de gene V humanos se encontram disponíveis em um cro- mossoma artificial de levedura (YAC). Os segmentos de gene V humanos funcionais são clonados em conjuntos no local descrito em [16], isto é, compreendendo o D humano mais J e Cp, Cy2, Cy3, cada um isento de CH1 mais 3'LCR. A região Ca mais regiões de comuta- ção podem ser clonadas com sítios Iox (o CH1 seria removido por recombinação homóloga).

Os segmentos de gene V funcionais podem ser clonados em conjunto com qual- quer múltiplo em cada local. Inicialmente, s segmentos de gene V humanos funcionais serão cada um clonados. A cada uma destas construções iniciais, um segundo gene seria adicio- nado por metodologia convencional (por exemplo, quando do emprego de digestão/ligação de restrição de Xhol-Sall, a ligação de sítios Xhol e Sall compatíveis destrói ambos).

Uma segunda rodada de clonagem pode ser realizada onde os genes de cada se- gundo clone serão adicionados aos do clone precedente, por exemplo, os dois genes do clone 2 serão adicionados aos 2 genes do clone 1, os dois genes do clone 4 serão adiciona- dos aos dois genes do clone 3 e assim por diante. A segunda rodada de clonagem resultará em 9 clones de 4 genes, etc.

O processo acima pode ser terminado em qualquer ponto para se obter o número desejado de segmentos de gene V. D, J e regiões constantes serão adicionados aos seg- mentos de gene V. Estes locais finais podem então ser introduzidos no camundongo trans- gênico conforme descrito em [16].

Uma estratégia semelhante pode ser usada para incorporar segmento de gene V natural, diverso, tal como aqueles derivados da família de receptor de célula T humana ou cadeias leves de imunoglobulina. A origem do material não precisa estar limitada ao ser hu- mano, porém o mesmo pode ser derivado de qualquer fonte incluindo mamíferos e tubarão, contanto que a redisposição VDJ ocorra com maturação por afinidade associada em respos- ta ao desafio do antígeno em uma maneira específica para célula B. Outras vias para cons- trução de locais apenas de cadeia pesada funcionais compreendendo os genes e elementos reguladores descritos em [16] serão familiares aos versados na técnica (por exemplo, substi- tuição das seqüencias de gene hospedeiro por recombinação homóloga). Os hospedeiros não humanos preferidos são roedores, especificamente camundongos, porém os versados na técnica, por exemplo de porcos, gado, carneiro e cabras transgênicos apreciarão que tais construções de gene descritas acima podem ser prontamente adaptadas, incorporadas e expressas no genoma do hospedeiro escolhido.

Não é necessária a provisão de hospedeiros mamíferos não humanos que não possuam genes de imunoglobulina endógenos funcionais. Os mamíferos não humanos transgênicos selecionados compreendendo locais de gene de cadeia pesada funcional po- dem ser cruzados em um estágio posterior com mamíferos não humanos que não possuem expressão gênica de imunoglobulina endógena funcional para produzir mamíferos não hu- manos transgênicos com locais de cadeia pesada funcionais que secretem apenas anticorpo apenas de cadeia pesada funcional dentro do plasma em um modo dependente da célula B.

Exemplo 2

Geração de um local de cadeia pesada humana funcional compreendendo 17 seg- mentos de gene V construídos geneticamente na produção de anticorpo apenas de cadeia pesada solúvel em camundongos transgênicos.

Os locais de anticorpo são gerados por "casseteamento" dos segmentos de gene V humano mutados em um local contendo todas as regiões D humanas, todas as regiões J humanas e qualquer uma (ou mais) das regiões constantes humanas das quais o domínio CH1 foi removido e a LCR de imunoglobulina. A remoção do domínio CH1 garante que a ex- pressão do local resulte na produção de imunoglobulinas apenas de cadeia pesada ([16]) e o exemplo acima. A inclusão da LCR além dos elementos melhoradores intragênicos maxi- miza a regulação do gene especifico de célula B e supera os efeitos da posição devido à natureza aleatória da integração dos locais de cadeia pesada de imunoglobulina no genoma hospedeiro.

Este exemplo descreve a geração de um local completamente humano contendo 17 segmentos de gene V (figura 1 a seguir). Este local é conforme descrito em [16] com exce- ção de que os 2 segmentos de gene VHh de origem da Ihama foram substituídos por 17 segmentos de gene V humanos de diferentes subclasses contendo as mutações definidas. A escolha do segmento de gene V não é limitante. Contudo, neste exemplo, segmentos de gene V da subclasse 3 foram escolhidos por serem mais provavelmente segmentos de gene Vhh e ser esperado que produzam domínios Vh que sejam mais solúveis que o de outras subclasses. Acredita-se que os próximos domínios de Vh mais solúveis sejam os das sub- classes 1 e 5 que foram também incluídas. Em seguida, várias mutações são introduzidas nos segmentos de gene V clonados por procedimentos à base de PCR de rotina, onde as mutações de nucleotídeo desejadas são construídas nos iniciadores, para gerar várias mu- tações que, com base na análise estrutural, seriam previstas como aumentando a solubili- dade, enquanto mantendo a estabilidade das regiões VH. As mutações preferidas são deri- vadas de um estudo das estruturas cristalográficas (figura 1) e sequencias de aminoácido primárias das bases de dados públicas (especificamente nas estruturas de base de dados públicas PDB1 IDEE1 humanas, e IQDO1 de lhamas. As alterações do aminoácido são (vide figuras 1 e 3):

uma alteração de I ou V para F na posição 37, que é uma mutação favorável, inde- pendente de outras mutações;

uma alteração de G para E na posição 44;

uma alteração de L para Q na posição 45; e

uma alteração de W para G na posição 47.

As últimas três mutações são realizadas em combinação e adicionam carga (solubi- lidade), além de aperfeiçoarem a estabilidade do empilhamento em τ em uma parte impor- tante do domínio VH.

Uma alteração também é realizada de P para A na posição 14, o que seria favorá- vel independente de outras mutações, uma vez que provê interação com a região DJ da molécula (posição 127 nas estruturas cristalográficas na base de dados pública PDB).

Uma alteração também é realizada de V ou L para Q na posição 5, o que é favorá- vel, independente de outras mutações, uma vez que aperfeiçoa a hidrofilicidade da superfí- cie.

Os segmentos de gene V individuais foram primeiro mutados para introduzir as alte- rações F, E1 e G na parte central dos segmentos de gene V (figura 3, superior). Em seguida, as regiões VH3-23p, 3-11p e 3-53p foram adicionalmente mutadas para introduzir em cada uma a alteração para A na posição 14 ou a alteração para Q na posição 5 ou uma combina- ção de ambas conforme mostrado na figura 3.

Os segmentos de gene V individuais foram todos clonados entre os sítios Sall e Xhol o que permite a geração de casssetes. A cada vez que duas regiões V foram ligadas em conjunto, um Sall e Xhol serão ligados em conjunto destruindo ambos os sítios. Como resultado, os 2 segmentos de gene V novamente terão um sítio Sall e um sítio Xhol, permi- tindo outra rodada de casseteamento, etc. No caso de 17 segmentos de gene V, eles foram clonados como cassetes de quatro, quatro, quatro, três e dois para chegar aos dezessete finais. O casseteamento foi realizado dentro de um sítio Sall clonado entre dois sítios Pspl. Os 17 segmentos de gene V finais foram isolados como um fragmento de Pspl e clonados em um sítio PsPI de um PAC contendo as regiões D, J e Ογ2, Cy3 e LCR (vide [16] com a exceção de que o local não contém sítios lox). O sítio Pspl foi introduzido em PAC por mani- pulação rotina.

Produção de segmentos de gene V construídos geneticamente

Novas mutações (figura 2) são introduzidas do mono como se segue por síntese com base em PCR usando oligonucleotídeos mutados como iniciadores para introduzir as mutações desejadas. Duas mutações são realizadas com base nos dados obtidos com regiões VHh de camelídeo, especificamente, uma fenilalanina (F) na posição 37 e um ácido glutâmico (E) na posição 44.

Leucina 45 é substituída com uma glutamina (Q, isto é, diferente do camelídeo), uma vez que isto estabelece uma ponte de hidrogênio com o grupo carbonila de glicina 116, estabelecendo uma estrutura semelhante aquela observada no VHh de camelídeo por volta do resíduo 116 e provê empilhamento. Além disso, a glicina (G) substitui o triptofano (W) ou tirosina (Y) na posição 47 para estabelecer uma interação com a tirosina (Y) na posição 58.

Estas 4 alterações de aminoácido são introduzidas em todas as sequencias gênicas de V humanas mostradas na figura 2 (parte superior).

Além disso, duas outras substituições são introduzidas tanto em conjunto, nas se- quencias de gene V 3-11, 3-23 e 3-53 ou individualmente apenas na sequencia Vh 3-23. Na posição 5, uma valina (V) ou Ieucina (L) é substituída por uma glutamina (Q) para aumentar a hidrofilicidade da superfície da região VH. A prolina (P) na posição 14 é substituída por uma alanina (A) para estabelecer uma interação com o aminoácido 127 na região DJ e re- forçar a estrutura do domínio VH. Tal interação não acontece com P normal na posição 14.

Mutaqênese de segmentos de gene V primariamente usando VH3-23 como o e-

xemplo

Uma estratégia PCR de sobreposição de rotina foi empregada para introduzir as al- terações de aminoácido desejadas nos domínios Vh humanos (figura 2). No exemplo a se- guir, alterações de 6 aminoácidos através de mutações foram introduzidas em duas etapas de PCR de sobreposição. Os segmentos de gene V foram isolados por PCR do DNA huma- no genômico usando iniciadores 1 e 2 para prover o material de partida para mutagênese.

Etapas:

Iniciadores 3 e 4 continham todas as alterações de base para as alterações de ami-

noácidos 37I ou 37V a F, G44 a E1 L45 a Q e W47 a G. O iniciador 1 e o iniciador 4 foram usados para modificar a metade 5' do segmento de gene V enquanto os iniciadores 2 e 3 foram usados para modificar a metade 3'. Os iniciadores 3 e 4 são diferentes para segmen- tos de gene V diferentes, por exemplo, VH3-11 possui uma isoleucina I (DNA sequencia ATC), considerando-se que VH3-23 possui uma valina V (DNA sequencia GTC), necessi- tando de iniciadores 3 e 4 diferentes. Os iniciadores são removidos por cromatografia (Qia- gen kit).

Os fragmentos resultantes contendo as mutações são misturados, desnaturados, renaturados e ampliados com PCR. O produto longo resultante possui as alterações de nu- cleotídeo desejadas para a conversão dos 4 aminoácidos alvo para F, E, Q e G.

Este fragmento foi usado para introdução das mutações adicionais empregando ini- ciadores 5 e 6. Estes continham as alterações de base de DNA necessárias para a conver- são de Ieucina (L) ou valina (V) na posição 5 em glutamina (Q) e prolina (P) em alanina (A) na posição 14. Os iniciadores 1 e 6 foram usados para obter a metade 5'. Os iniciadores 2 e foram usados para obter a metade 3'. Os iniciadores foram removidos por cromatografia (Qiagen kit).

As duas metades foram combinadas em uma reação de PCR conforme descrito na

etapa 2. Os fragmentos longos resultantes tinham as alterações de códon QeA desejadas, além das alterações descritas acima.

Os segmentos de gene V mutados foram digeridos com Sall na extremidade 5' e Xhol na extremidade 3' e clonados em Bluescript para análise da sequencia. As alterações desejadas foram confirmadas por análise da sequencia. As sequen-

cias dos iniciadores usados eram:

Seqüência de VH3-23 por volta da posição 50 do aminoácido. A linha superior mos- tra a sequencia mutada, onde os resíduos alterados são sublinhados e a linha inferior mos- tra a sequencia de partida. TCTG G ATTC ACCTTT AG CAG CTATG CC ATG AG CTG GTTCCG CCAGGCTCCAG-

GGAAGGAG (SEQ ID NO: 1)

TCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAG- GGAAGGGG (SEQ ID NO: 2)

CAG G AG GGG GTCTCAG CT ATT AGTG GTAGTG GTG GTAG CACAT ACTACG CA- GACTCCGTG (SEQ ID NO: 1)

CTGGAGTGGGTCTCAGCT ATT AGTGGT AGTGGTGGTAGCACATACT ACGCA- GACTCCGTG (SEQ ID NO: 2)

Iniciador 3 à frente VH3-23/FEQG

5'CTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCAGGAGGGGGTC (SEQ ID NO:3) Iniciador 4 reverso VH3-23/FEQG

5'GACCCCCTCCTGCTCCTTCCCTGGAGCCTGGCGGTACCAG (SEQ ID N0:4) Seqüência de VH3-23 por volta da posição 10 do aminoácido. A linha superior mos- tra a sequencia mutada, onde os resíduos alterados são sublinhados e a linha inferior mos- tra a sequencia de partida. AGTTTCTGACCAGGGTTTC Illll GTT

GCAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGCAGGA (SEQ ID NO: 5)

AGTTTCTGACCAGGGTTTC I I I I IGTTT CAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGTTGGA (SEQ ID NO: 6) GTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGGCTGG GGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGG (SEQ ID NO: 5) GTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGGCTG GGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGG (SEQ ID NO: 6) Iniciador 5 à frente VH3-23/5+14

5'CAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGGCTGGG (SEQ ID N0:7)

Iniciador 6 reverso VH3-23/5+14

5'CCCAGCCTGTACCAAGCCTCCCCCAGACTCCTGCAGCTG (SEQ ID NO:8)

Iniciador 1 a frente IGHV3-23F

5'GTGGTCGACGATGGAAAGATAGATACCAACATG (SEQ ID N0:9)

Inieiador reverso IGHV3-23R

5'GTGCTCGAGCATCTCTGTAAGCGTCAATCTGC (SEQ ID NO: 10)

Os iniciadores para obter as alterações de aminoáeido nas posições 5 e 14 foram também sintetizados separadamente usando o gabarito que já tinha as alterações FEQG (após a etapa 2 acima).

Para a alteração na posição 5, os iniciadores 5 e 6 na figura tinham a mesma se- quencia diferente.

Para L>Q na posição 5:

Iniciador 5 à frente VH3-23/5L-Q 5'GGTGCAGCTGCAGGAGTCTGG (SEQ ID N0:11) Iniciador 6 reverso VH3-23/5L-Q 5'CCAGACTCCTGCAGCTGCACC (SEQ ID NO: 12) Para P>A na posição 14 Iniciador 5 à frente VH3-23/14P-A 5'CTTGGTACAGGCTGGGGGGTC (SEQ ID NO: 13) Iniciador 6 à frente VH3-23/14P-A 5'GACCCCCCAGCCTGTACCAAG (SEQ ID NO: 14) Iniciadores diferentes 5 e 6 foram usados para os segmentos de gene V di- ferentes que possuíam uma sequencia diferente nas áreas relevantes.

Todas as alterações desejadas para os segmentos de gene V diferentes foram clonadas e sequenciadas.

A próxima fase para a construção é a inserção dos segmentos de gene V dentro do local de cadeia pesada humana. Isto consiste em várias etapas:

1. Este local é, em princípio, o mesmo conforme descrito em [16] com duas diferen- ças. O local não contém os sítios Iox ou frt e ao invés das regiões VHh de lhama, o mesmo contém um sítio de meganuclease Pspl. Estes locais foram construídos com sucesso.

2. Uma construção BAC separada foi realizada, a mesma contendo um sítio Xhol simples flanqueado em cada lado por um sítio de meganuclease pspl.

3. Cada segmento de gene V modificado é removido do Bluescript por digestão de Sall e Xhol e clonado no sítio Xhol de BAC3.6 modificado. Isto restaura o sítio Xhol na ex- tremidade 3' do segmento de gene V, porém destrói Sall na extremidade 5' do segmento de gene V. 4. A construção resultante é cortada em seu sítio Xhol único e o próximo segmento de gene V é clonado dentro do sítio, novamente deixando um Xhol único na extremidade 3' de agora um dímero de segmento de gene V.

5. Este ciclo é repetido até o multímero desejado dos segmentos de gene V ser ob- tido.

6. O multímero é removido de BAC3.6 e clonado no sítio Pspl único do local descri- to na etapa 1.

7. O local apenas de cadeia pesada completamente humana resultante é microinje- tado em ovos fertilizados para obter camundongos transgênicos para imunização.

Todo local é digerido do PAC por uma digestão Notl [16], purificado por procedi- mentos de rotina e injetado dentro de ovos de camundongo fertilizados por procedimentos padrão para obter camundongos transgênicos portando o local côo parte de seu genoma [16]. Não é necessário usar cepas de camundongo nas quais os genes de imunoglobulina de murino endógenos foram deletados ou a expressão reprimida, uma vez que a exclusão alélica determina qual local (endógeno ou transgene) resultará em uma expressão produzi- da. Nossa estratégia preferida é cruzar os camundongos portando transgenes funcionais dentro de uma base sem expressão gênica endógena ou minimizada e usar a progênie deri- vada desses cruzamentos para a geração de anticorpos apenas de cadeia pesada contra antígenos alvo. Este local específico foi injetado em ambos os tipos. Os resultados mostra- dos a seguir são de injeções em ovos fertilizados wt.

Uma abordagem alternativa e mais trabalhosa para a geração de anticorpo apenas de cadeia pesada humana é empregar estratégicas de recombinação homólogas para subs- tituir os segmentos V, D, e J do hospedeiro de mamífero não humano (neste caso, o ca- mundongo) com segmentos V construídos geneticamente e/ou naturais humanos, segmen- tos D e J humanos e substituir as regiões constantes com as regiões constantes de cadeia pesada humana isentas de CH1. Se forem necessários apenas domínios Vh humanos, os segmentos de gene da região constante de hospedeiro isentos de CH1 serão suficientes.

Empregando a tecnologia de injeção de oócito estabelecida, os camundongos são mostrados como sendo transgênicos por procedimentos padrão, tais como, análise PCR de rotina das diferentes regiões ou por Southern blotting que detecta as regiões diferentes do local transgênico (figura 4).

Se os locais de cadeia pesada humana introduzidos forem funcionais e o anticorpo solúvel expresso, nós poderemos esperar que os transgenes respondam como parte da resposta de hospedeiro ao seu ambiente natural. O anticorpo apenas de cadeia pesada hu- mana estaria presente no plasma e o RNAm de anticorpo apenas de cadeia pesada humana estaria presente nas células B em circulação. Análise de sequencia do RNAm clonado iden- tificará (i) mutações introduzidas preferidas e (ii) quaisquer mutações somáticas que resul- tam na presença de anticorpo apenas de cadeia pesada humana.

Para mostrar que os anticorpos apenas de cadeia pesada humana e que o RNAm de cadeia pesada humana são produzidos dos transgenes, o sangue é coletado e o soro e os leucócitos recuperados. Western blotting usando qualquer anticorpo que detecte especifi- camente IgG humana (IgG anti-humano de cabra da Sigma acoplado à peroxidase, figura 5) demonstra que o anticorpo apenas de cadeia pesada humana está presente no plasma.

RT-PCR de RNA preparado das células na mesma amostra de sangue usando os iniciadores que se seguem mostra a presença das transcrições de RNAm esperadas.

O RNA sofreu transcrição reversa (oligodT) e foi fabricado dentro do DNAc, usando os iniciadores a frente derivados da região de códon de partida ATG dos diferentes segmen- tos de gene V ilustrados a seguir (figura 6).

Quatro iniciadores foram sintetizados:

VH3all GGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATT (SEQ ID NO: 15) que sintetiza- rá V3-11, 66, 74, 53, 64, 48;

VH3-51 CCGCCATCCTCGCCCTCCTCCTGGCTGTT (SEQ ID NO: 16) reconhe- cendo V5-51;

VH3-46 CCTGGAGGGTCTTCTGCTTGCTGGCTGTA (SEQ ID N0:17) reconhe- cendo V1-46; e

VH3-23 GGCTGAGCTGGC Illll CTTGTGGCTATT (SEQ ID NO:18) reconhecen- do V3-23.

O DNAc resultante foi subseqüentemente ampliado por PCR usando os mesmos i- niciadores à frente e os iniciadores reversos que são idênticos aos descritos em [16] especí- ficos para regiões constantes Cy2 e Cy3.

Ampliação da PCR das diferentes amostras usando uma combinação de iniciadores à frente e reverso mostra que o fragmento de tamanho apropriado (cerca de 390 pares de base) é produzido com os diferentes conjuntos de iniciadores (figura 7). A polimerase na reação da PCR era uma PFU polimerase (polimerase a prova de leitura para impedir muta- ções) seguido por adição de A (isto é, não outra rodada de PCR) usando uma polimerase diferente daquela a prova de leitura (para permitir clonagem em PGMTeasy).

De modo importante, fica claro que o fragmento é algo difuso, indicando que ele contém produtos de PCR diferentes de comprimentos ligeiramente diferentes, como seria esperado do processo de recombinação e mutação de VDJ. Assim, o local é expresso e resulta na produção de anticorpo.

A fim de identificar mutações introduzidas preferidas derivadas dos segmentos de gene V e identificar mutações adicionais presentes no domínio Vh devido à maturação por afinidade e seleção por camundongo, os produtos da PCR (figura 7) foram clonados por clonagem AT padrão em pGEMTeasy e DNA preparado por métodos padrão. Estas amos- tras de DNA foram clivadas com EcoRI e analisadas por eletroforese de gel. Isto mostra que elas possuem inserções de tamanhos diferentes (figura 8), consequentemente recombina- ções/mutações diferentes são realizadas no camundongo.

Os plasmídeos com inserções simples são subseqüentemente sequenciados. Isto, na realidade, confirma que recombinações e mutações diferentes são geradas pelo sistema imune do camundongo (figura 9) usando segmentos de gene V humano para melhorar a solubilidade e estabilidade. A presença do anticorpo apenas de cadeia pesada circulando no plasma sob condições fisiológicas indica que o solúvel derivado de transgene e anticorpo apenas de cadeia pesada humana estável é sintetizado e secretado pelas células B. Os domínios de Vh humano expressos e clonados fornecem uma fonte de proteínas para estu- dos físicos comparativos de modo a identificar a(s) mutação(ões) somática(s) introduzida(s) in vivo, que fornece(m) solubilidade e estabilidade aperfeiçoadas em relação aos domínios Vh que não possuem estas mutações.

Exemplo 3

No exemplo 2 nós ensinamos: a previsão de novas mutações para conferir solubili- dade e estabilidade aperfeiçoadas aos domínios VH; a introdução de segmentos de gene V construídos geneticamente em um local de cadeia pesada; a análise da expressão transgê- nica; a identificação dos segmentos de gene V mutados preferidos presentes nos domínios Vh como resultado da redisposição de VDJ conduzindo à presença de anticorpo apenas de cadeia pesada solúvel e estável circulando em condições fisiológicas no plasma.

Em um terceiro exemplo, várias mutações preferidas adicionais deduzidas in silico (vide exemplo 1) são introduzidas nos segmentos de gene V humano (para exemplos de sequencias vide Figura 1). Neste exemplo, as mutações são tais que um aminoácido carre- gado é criado na posição 45 em analogia à presença de um aminoácido carregado naquela posição nas regiões VHh de camelídeos, de modo a aperfeiçoar a solubilidade e mutações sinergísticas adicionais são introduzidas em qualquer ponto, de modo a manter a estabilida- de de VH.

Assim, (vide a figura 3 para as sequencias e bases de dados públicas PDB):

L é alterado para R (ou outro aminoácido carregado ou C) na posição 45 com uma alteração para E ou S ou A (E>S>A) na posição 44 que é favorável para estabilizar a posi- ção do laço na posição 45 com τ empilhando com Y na posição 95 e W na posição 118;

Uma alteração para R na posição 52 que estabilizaria através de uma interação com a cadeia principal de VH. Isto seria favorável, independente de outras mutações.

Uma alteração de R na posição 45 é também favorável, combinada com uma alte- ração na posição 61 para K. Esta mutação também seria favorável, independente de 45.

Alterações em 37 (para F) e 5 (para Q) ainda seriam favoráveis conforme descrito no exemplo 1.

O laço GHG na sequencia de Ihama partindo na posição 25 e terminando em 38 (35 no Vh humano) seria favorável se transplantado para Vh humano em combinação com um R (ou S) na posição 27, uma vez que isto aumenta a hidrofilicidade e poderia fornecer estabili- zação se um contato fosse feito com a posição 77 por alteração da mesma para T.

Os segmentos de gene V humanos construídos geneticamente (independente da subclasse) podem então ser introduzidos em um local apenas de cadeia pesada humana expresso como um transgene e mutações construídas geneticamente preferidas e quaisquer mutações preferidas adicionais resultando de maturação por afinidade identificadas confor- me descrito no exemplo 2 acima.

Transgenes adicionais podem ser gerados com base nos princípios descritos aci- ma, os quais combinam mutações na interface VH/VL, assim, aperfeiçoando a solubilidade, enquanto mutações distais adicionais com base em análise in silico da mutação introduzida na interface VH/VL são introduzidas para manter a estabilidade de VH. Os processos de sele- ção e maturação natural in vivo resultam na secreção no soro de anticorpos apenas de ca- deia pesada que seja solúveis e estáveis sob condições fisiológicas.

REFERÊNCIAS

[1] Kabat1 E., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesman, K. S., e Foeller, C. (1991) United States Public Health Services Publication No. 91-3242, National Institutes of Health, Be- thesda, MD.

[2] Jaton e outros, Recovery of antibody activity upon reoxidation of completely re- duced polyalanyl heavy chain and its Fd fragment derived from anti-2,4-dinitrophenyl anti- body. (1968) Biochemistry, 7, 4185-4195

[3]] Xu JL, Davis MM. Diversity in the CDR3 region of V(H) is sufficient for most an- tibody specificities. Immunity 13, 37-45 (2000).

[4] Hendershot e outros, Assembly and secretion of heavy chains that do not asso- ciate posttranslationally with immunoglobulin heavy chain-binding protein (1987) J. Cell Biol., 104, 761-767.

[5] Brandt e outros, Loss of a consensus splice signal in a mutant immunoglobulin gene eliminates the CH1 domain exon from the mRNA. (1984) Mol. Cell. Biol, 4, 1270-1277.

[6] Hamers-Casterman e outros, Naturally occurring antibodies devoid of Iight chains. (1993) Nature, 363, 446-448.

[7] Stanfield e outros, Crystal structure of a shark single-domain antibody V region in complex with lysozyme. (2004) Science, 305, 1770-1773.

[8] Desmyter e outros, Crystal structure of a camel single-domain VH antibody frag- ment in complex with lysozyme. (1996) Nat. Struct. Biol., 3, 803-811.

[9] Riechmann, L. & Muyldermans, S. Single domain antibodies: comparison of camel VH and camelised human VH domains. J Immunol Methods 231, 25-38 (1999).

[10] Ward e outros, Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin vari- able domains secreted from Escherichia coli. (1989) Nature1 341, 544-546

[11] De Genst E, Silence K, Ghahroudi M, Decanniere K, Loris R, Kinne J, Wyns L & Muyldermans S. Strong in vivo maturation compensates for structurally restricted H3 Ioops in

antibody repertoires. J Biol Chem. 280, 14114-21 (2005)

[12] Davies, J and Rieehmann L. Bioteehnology (1995) vol 13, 475-479 Antibody VH domains as small recognition units.

[13] de Genst e outros, Antibody repertoire development in camelids. Dev Comp Immunol. 2006;30:187-98

[14] Davies, J and Riechmann, L. Single antibody domains as small recognition units: design and in vitro antigen selection of camelized, human VH domains wíth improved protein stability. Protein Eng. 9, 531-7 (1996).

[15] Lutz and Muyldermans, Single domain antibodies: comparison of camel VH and camelised human VH domains. (1999) J. Immuno. Methods, 231, 25-38.

[16] Rick Janssens, Sylvia Dekker, Rudi W. Hendriks, George Panayotou, Alexan- dra van Remoortere, John Kong-a San, Frank Grosveld and Dubravka Drabek, Generation of heavy chain only antibodies in mice, Proc. Natl Aead USA 2006, Oet 10; 103:15130-5.

[17] Guglielmi L, Le Bert M, Comte I, Dessain ML, Drouet M, Ayer-Le Lievre C, Cogne M, Denizot Y Combination of 3' and 5' IgH regulatory elements mimics the B- specific

endogenous expression pattern of IgH genes from pro-B cells to mature B cells in a trans- genic mouse model. Biochim Biophys Acta. 21 de outubro de 2003; 1642(3): 181-90.

[18] Spinelli S, Frenken L, Bourgeois D, de Ron L, Bos W, Verrips T, Anguille C, Cambillau C, Tegoni M. The crystal structure of a Ilama heavy chain variable domain. Nat

Struct Biol. 3 de setembro de 1996(9):752-7. Listagem de Seqüência <no> Erasmus University Medicai Center Rotterdam

<120> "MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO"

<130> P044839WC)

<150> 0618345.3

<151> 18/09/2006

<160> 18

<170> SeqWin99, versão 1.02

<210> 1

<211> 120

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400 > 1

tctggattca cctttagcag ctatgccatg agctggttcc gccaggctcc agggaaggag 60 caggaggggg tctcagctat tagtggtagt ggtggtagca catactacgc agactccgtg 12

<210 > 2

<211> 120

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

tctggattca cctttagcag ctatgccatg agctgggtcc gccaggctcc agggaagggg 60 ctggagtggg tctcagctat tagtggtagt ggtggtagca catactacgc agactccgtg 12

<210 > 3

<211> 40

<212> DNA

<213 > Seqüência Artificial

<220>

<223 > IniciadordaPCR <400> 3

ctggttccgc caggctccag ggaaggagca ggagggggtc 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

< 213 > Seqüência Artificial

<220 >

<223 > IniciadordaPCR

<4 00 > 4

gaccccctcc tgctccttcc ctggagcctg gcggtaccag 40

<210 > 5

<211> 120

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

agtttctgac cagggtttct ttttgtttgc aggtgtccag tgtgaggtgc agctgcagga 60 gtctggggga ggcttggtac aggctggggg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg 120

<210> 6

<211> 120

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

agtttctgac cagggtttct ttttgtttgc aggtgtccag tgtgaggtgc agctgttgga 60 gtctggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg 120

<210 > 7

<211> 39

<212> DNA

< 213 > Seqüência Artificial

<220>

<223 > IniciadordaPCR

<400>

7 cagctgcagg agtctggggg aggcttggta caggctggg <210> 8

<211> 39

<212> DNA

< 213 > Seqüência Artificial

<220>

<223 > IniciadordaPCR

<400> 8

cccagcctgt accaagcctc ccccagactc ctgcagctg

<210> 9

<211> 33

<212 > DNA

< 213 > Seqüência Artificial

<220>

<223> Homo sapiens

<4 00 > 9

gtggtcgacg atggaaagat agataccaac atg

<210 > 10

<211> 32

<212> DNA

<213 > Seqüência Artificial

<220>

<223> IniciadordaPCR

<400> 10

gtgctcgagc atctctgtaa gcgtcaatct gc

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213 > Seqüência Artificial

<220> <223 > IniciadordaPCR <400> 11

ggtgcagctg caggagtctg g

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

< 213 > Seqüência Artificial

<220>

<223 > IniciadordaPCR

< 4 0 0 > 12

ccagactcct gcagctgcac c

<210 > 13

<211> 21

<212> DNA

<213 > Seqüência Artificial

<220>

<223 > IniciadordaPCR

<4 00> 13

cttggtacag gctggggggt c

<210 > 14

<211> 21

<212> DNA

< 213 > Seqüência Artificial

<220>

<223> InieiadordaPCR

<400 > 14

gaccccccag cctgtaccaa g

<210> <211> <212 >

15 29 DNA < 213 > Seqüência Artificial <220>

<223 > IniciadordaPCR

<400> 15

ggctgagctg ggttttcctt gttgctatt

<210 > 16

<211> 29

<212> DNA

<213 > Seqüência Artificial

<220 >

<223 > IniciadordaPCR

<400 > 16

ccgccatcct cgccctcctc ctggctgtt

<210 > 17

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223 > IniciadordaPCR

<400 > 17

cctggagggt cttctgcttg ctggctgta

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213 > Seqüência Artificial

<220>

<223 > Iniciador da PCR

<4 0 0> 18

ggctgagctg gctttttctt gtggctatt

Claims (23)

1. Método para produção de um anticorpo apenas de cadeia pesada, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: desafio com um antígeno de um mamífero não humano possuindo um local de ca- deia pesada que: compreende vários segmentos de gene V, que codificam uma ou mais mutações de aminoácido (i) na interface VL, de modo a reduzir a hidrofobicidade e (ii) em outras posições, de modo a superar a instabilidade estrutural; compreende pelo menos um segmento de gene D e pelo menos um segmento de gene J; não contém segmentos de gene codificando um domínio Ch1 ou foi construído ge- neticamente para impedir a expressão de um domínio CH1 funcional; e quando expresso em resposta ao desafio do antígeno, produz um anticorpo apenas de cadeia pesada isento de CH1, possuindo um domínio Vh solúvel, codificado por um gene Vh que inclui um segmento de gene V preferido incorporado como resultado da redisposi- ção de VDJ e dita maturação por afinidade nos ditos genes VH.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o segmento de gene V preferido e opcionalmente os segmentos DeJ preferidos são adicio- nalmente modificados com maturação por afinidade resultando na estabilidade e solubilida- de melhoradas do domínio VH resultante incorporado no anticorpo apenas de cadeia pesa- da.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito mamífero não humano é produzido por: produção in vitro de um transgene incluindo o local; e introdução do transgene em uma célula apropriada, a partir da qual o mamífero não humano deverá ser obtido.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula é uma célula tronco embrionária ou um oócito.

5. Método de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito mamífero não humano é produzido por recombinação homóloga, on- de os vários segmentos de gene V mutados e, opcionalmente os ditos segmentos de gene D e J substituem os segmentos de gene equivalentes em um local de cadeia pesada endóge- no, os ditos locais de cadeia pesada não possuindo funcionalidade CH1 no mamífero não humano.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o mamífero não humano inclui múltiplos locais de ca- deia pesada pelo menos um dos quais é conforme definido na reivindicação 1 e cada um dos quis se encontra em um cromossoma diferente.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais locais compreendem segmentos de gene V naturais e o restante compreende um ou mais segmentos de gene V construídos geneticamente.

8. Método de acordo com a reivindicação 6 ou reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que os locais em cada cromossomo são diferentes.

9. Método de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que os locais em cada cromossomo são os mesmos.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que os segmentos de gene V são segmentos de gene V humanos, mutados.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o local inclui múltiplos segmentos de gene D.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o local inclui múltiplos segmentos de gene J.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o local contém pelo menos um segmento de gene codi- ficando uma região constante.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o local contém múltiplos segmentos de gene codificando regiões constantes.

15. Método de acordo com a reivindicação 13 ou reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que os segmentos de gene codificando uma região cons- tante são humanos.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que cada segmento de gene D e J é humano.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que cada segmento de gene V codifica uma proteína que possui uma mutação em uma ou mais posições 37, 44, 45 e 47.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que cada segmento de gene V codifica uma proteína que possui mutações em todas as posições37, 44, 45 e 47.

19. Método de acordo com a reivindicação 17 ou reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o segmento de gene V codifica uma proteína pelo que, na posição 37, o resíduo é fenilalanina, na posição 44, o resíduo é ácido glutâmico, na posi- ção 45, o resíduo é glutamina e/ou na posição 47, o resíduo é glicina.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, CARACTERIZADO pelo fato de que cada segmento de gene V codifica uma proteína que possui uma mutação em cada uma das posições 5 e 14.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que cada segmento de gene V codifica uma proteína que possui mutações em ambas as posi- ções 5 e 14.

22. Método de acordo com a reivindicação 20 ou reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o segmento de gene V codifica uma proteína pelo que, na posição 5, o resíduo é glutamina e/ou na posição 14, o resíduo é alanina.

23. Anticorpo apenas de cadeia pesada, CARACTERIZADO pelo fato de que pos- sui um domínio Vh codificado em parte por qualquer um dos segmentos de gene V estabele- cidos na figura 3.