BRPI0714873A2 - antagonistas de receptor-1 ativado por protease (par-1) - Google Patents

Abstract

ANTAGONISTAS DE RECEPTOR-1 ATIVADO POR PROTEASE (PAR-1). A presente invenção refere-se a anticorpos ou moléculas Iigantes de antÍgeno que especificamente reconhecem e antagonizam receptor PAR-1 humano. Também são proporcionados, pela invenção, polinucleotídeos e vetores que codificam tais moléculas e células hospedeiras que abrigam os polinucleotídeos e vetores.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTAGO- NISTAS DE RECEPTOR-1 ATIVADO POR PROTEASE (PAR-1)".

REFERÊNCIAS CRUZADAS A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US 60/831.800, depositado em 18 de julho de 2006 e do Pedido US 11/778.924, depositado em 17 de julho de 2007, cuja inteira descrição dos mesmos é aqui incorporada a título de referência para todos os propósitos. CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a anticorpo e antagonistas de mo- léculas Iigantes dé antígeno de receptor-1 de protease ativada (PAR1). ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O receptor 1 ativado por protease (PAR1) é um receptor de trombina que pertence à classe de receptores de proteína G (GCPR). PAR1 é expresso em vários tecidos, por exemplo, células endoteliais, células da musculatura lisa, fibroblastos neurônicos e plaquetas humanas. Ele está en- volvido em respostas celulares associadas com hemóstase, proliferação, e lesão tecidual. Estimulação mediada por trombina de agregação plaquetária via PAR1 é uma etapa importante na formação de coágulo e cicatrização de ferimentos em vasos sangüíneos. A trombina ativa PAR1 por remoção pro- teolítica de uma porção do domínio N-terminal extracelular de PAR1 e expõe um novo N-terminal de PAR1. Os poucos primeiros aminoácidos (SFLLRN; SEQ ID NO:37) do novo N-terminaL de PAR1 então agem como um Iigante preso que se liga a uma outra parte do receptor para iniciar a sinalização por uma proteína G associada. PAR1 pode ser também ativado por outras serina proteases envolvidas na coagulação do sangue.

A modulação das atividades de sinalização mediada por PAR1 tem várias aplicações terapêuticas. A inibição de PAR1 é de ajuda para o tratamento de distúrbios proliferativos trombóticos e vasculares, bem como para inibir a progressão de cânceres. Vide, por exemplo, Darmoul, et aí., Mol Câncer Res (2004) 2(9):514-22 e Salah, et a/, Mol Câncer Res (2007) 5(3):229-40. Um inibidor de PAR1, incluindo um anticorpo antagonista ou molécula Iigante de antígeno, tem utilidade no tratamento de numerosas condições de doença mediadas por sinalização intracelular de PAR1. Por exemplo, um inibidor de PAR1, incluindo um anticorpo antagonista ou molé- cula Iigante de antígeno, tem uso na prevenção ou inibição de distúrbios in- flamatórios intestinais crônicos, incluindo doença intestinal inflamatória (IBD)1 síndrome do intestino irritável (IBS), e colite ulcerativa; e distúrbios fibróticos, inclusive fibrose do fígado e fibrose do pulmão. Vide, por exemplo, Vergnol- le, et al., J Clin Invest (2004) 114(10):1444; Yoshida, et a/, Aliment Pharma- col Ther (2006) 24(Suppl 4):249; Mercer, et al., Ann NY Acad Sci (2007) 1096:86-88; Sokolova e Reiser, Pharmacol Ther (2007) PMID: 17532472. Um inibidor de PAR1, incluindo um anticorpo antagonista ou molécula Iigante de antígeno, também é útil para prevenção ou inibição de lesão por isquemia- reperfusão. Vide, por exemplo, Strande, et al., Basic Res. Cardiol (2007) 102(4):350-8; Sevastos, et al., Blood (2007) 109(2):577-583; Junge, et al., Proc Natl Aead Sei USA. (2003) 100(22): 13019-24 e Tsuboi, et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol (2007) 292(2):G678-83. Inibição de sinali- zação intracelular de PAR1 pode ser usada também para inibir vírus do her- pes simples (HSV1 e HSV2) de células. Vide, Sutherland et al., J Thromb Haemost (2007) 5(5): 1055-61. BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a presente invenção proporciona anticorpos antagonistas monoclonais ou moléculas Iigantes de antígeno contra recep- tor-1 ativado por protease humana (hPAR1). Os anticorpos ou moléculas Iigantes de antígeno se ligam ao PAR1 humano com a mesma especificida- de que aquela de um segundo anticorpo. O segundo anticorpo tem (i) uma seqüência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO:5 e uma se- qüência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 7 e uma seqüência da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 8.

Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam especifica- mente a um epítopo de hPAR1 que compreende a seqüência de aminoáci- dos SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE (SEQ ID NO:38), ou fragmen- tos desta, por exemplo, um fragmento de pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos contíguos. Em algumas modalidades, os anticorpos não se ligam significantemente ao (isto é, reticulam com) PAR1 de uma outra espécie (por exemplo, PAR1 de camundongo (mPAR1) ou um subtipo de PAR diferente de PAR1, por exemplo, receptor-2 ativado por protease (PAR2).

Alguns dos anticorpos ou moléculas Iigantes de antígenos têm

uma seqüência de região determinante de complementaridade (CDR) de cadeia pesada de SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 ou SEQ ID NO:23 ou uma seqüência de CDR de cadeia leve de SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, ou SEQ ID NO:26, respectivamente. Algumas dessas moléculas têm sequên- cias de CDR1, CDR2, e CDR3 da cadeia pesada, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 e SEQ ID NO:23, respectivamente; e seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 da cadeia leve, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, e SEQ ID NO:26, res- pectivamente.

Alguns dos anticorpos ou moléculas Iigantes de antígeno têm uma seqüência de região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada de SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28 ou SEQ ID NO:29; ou uma seqüência de CDR da cadeia leve de SEQ ID N0:30, SEQ ID NO:31, ou SEQ ID NO:32. Algumas dessas moléculas compreendem seqüências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada, SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:28, e SEQ ID NO:29, respectivamente; e seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 da cadeia leve, SEQ ID N0:30, SEQ ID NO:31, e SEQ ID NO:32, respectiva- mente.

Alguns dos anticorpos ou moléculas Iigantes de antígeno têm uma seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada que é pelo menos, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO:5 e uma seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia leve que é pelo menos, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO:6. Algumas outras têm uma seqüência de aminoácidos da re- gião variável da cadeia pesada que é pelo menos, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO:7 e uma seqüência de ami- noácidos da região variável da cadeia leve que é pelo menos, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO:8. Algumas das moléculas têm uma seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO:5 e uma seqüência de aminoácidos da região variá- vel da cadeia leve SEQ ID NO:6. Algumas outras têm um seqüência de ami- noácidos da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 7 e uma se- quência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO:8.

Alguns dos anticorpos ou moléculas Iigantes de antígeno têm uma seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada que é pelo menos, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:7. Alguns dos anticorpos ou moléculas Iigantes de antígeno têm uma seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia leve que é pelo menos, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% i- dêntica à SEQ ID NO:8.

Alguns dos anticorpos anti-hPAR1 ou moléculas Iigantes de an- tígeno da invenção são anticorpos de camundongo. Alguns outros são anti- corpos quiméricos. Algumas das moléculas anti-hPAR1 são anticorpos hu- I manizados. Algumas outras são anticorpos humanos. Ainda algumas outras

são anticorpos de cadeia simples, fragmentos Fab, ou monocorpos com uma estrutura temporária derivado de um domínio de fibronectina tipo Ill humana.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona polinucleotídeos isolados ou recombinantes que codificam um polipeptídeo que contém a re- gião variável da cadeia pesada ou a região variável da cadeia leve do anti- corpo anti-hPAR1 ou moléculas Iigantes de antígeno. Alguns dos polinucleo- tídeos codificam um polipeptídeo contendo a região variável de um anticorpo humano. O polipeptídeo pode conter seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia pesada, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 e SEQ ID NO:23, respec- tivamente; e seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia leve, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, e SEQ ID NO:26, respectivamente; ou seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia pesada, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28 e SEQ ID NO:29, respectivamente; e seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia leve, SEQ ID N0:30, SEQ ID NO:31, e SEQ ID NO:32, respectiva- mente.

Alguns dos polinucleotídeos codificam uma seqüência da região variável da cadeia pesada madura que é pelo menos 90% idêntica à região madura da SEQ ID NO:5, e/ou uma seqüência da região variável da cadeia leve madura que é pelo menos 90% idêntica à região madura da SEQ ID NO:6. Alguns outras codificam uma seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada madura que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:7 e/ou uma seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia leve madura que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:8. Alguns dos polinu- cleotídeos codificam uma seqüência de região variável da cadeia pesada madura que é idêntica à região madura da SEQ ID NO:5, e/ou uma sequên- cia de região variável de cadeia leve madura que é idêntica à região madura da SEQ ID NO:6. Alguns outros codificam uma seqüência da região variável da cadeia pesada madura que é idêntica à região madura da SEQ ID NO:7 e/ou uma seqüência da região variável da cadeia leve madura que é idêntica à região madura da SEQ ID NO:8. Em um outro aspecto, a invenção proporciona células hospedei-

ras isoladas que compreendem (1) um segmento de DNA recombinante que codifica uma cadeia pesada do anticorpo anti-PAR1 ou molécula Iigante de antígeno; e (2) um segundo segmento de DNA recombinante que codifica uma cadeia leve do anticorpo ou molécula Iigante de antígeno. Em algumas das células hospedeiras, os segmentos de DNA são cada um operavelmente ligados a um promotor e são capazes de serem expressos nas células hos- pedeiras. Algumas das células hospedeiras podem expressar um anticorpo anti-hPAR1 ou molécula Iigante de antígeno de origem humana. Algumas das células hospedeiras podem expressar um anticorpo anti-hPAR1 ou mo- lécula Iigante de antígeno que contém seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia pesada, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 e SEQ ID NO:23, respec- tivamente; e seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia leve, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, e SEQ ID NO:26, respectivamente. Algumas outras expressam um anticorpo anti-hPAR1 ou molécula Iigante de antígeno que contém seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia pesada, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28 e SEQ ID NO:29, respectivamente; e seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia leve, SEQ ID N0:30, SEQ ID NO:31, e ν

SEQ ID ΝΟ:32, respectivamente.

Uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo ou molécula Iigante de antígeno que se liga especificamente a um epítopo de PAR1 humano, em que o epítopo compreende a seqüência de aminoáci- dos SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE (SEQ ID NO:38), ou um frag- mento desta, e em que o anticorpo ou molécula Iigante de antígeno é um antagonista de PAR1. As modalidades dos anticorpos e moléculas Iigantes de anticorpo usados na composição são conforme descrição aqui.

Um método para atenuar os sintomas de uma condição de do- ença mediada por sinalização intracelular aberrante através de PAR1, que compreende administrar a um paciente que necessite deste um anticorpo ou molécula Iigante de antígeno que se liga especificamente a um epítopo de PAR1 humano, em que o epítopo compreende a seqüência de aminoácidos SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE (SEQ ID NO:38), ou um fragmento deste e em que o anticorpo ou molécula Iigante de antígeno é um antagonis- ta de PAR1. As modalidades dos anticorpos e moléculas Iigantes de anticor- po usados nos métodos são como descritas aqui.

Em algumas modalidades, a condição de doença é mediada por sinalização intracelular aberrante através de PAR1. Em algumas modalida- des, a condição de doença é um distúrbio proliferativo trombótico ou vascu- lar. Em algumas modalidades, a condição de doença é um câncer que ex- pressa de modo aberrante o PAR1, por exemplo, carcinomas ou cânceres epiteliais, incluindo, por exemplo, cânceres de pele (inclusive melanoma), cânceres gastrintestinais (inclusive câncer do cólon), câncer do pulmão e câncer mamário (inclusive câncer da mama e cânceres ductais), câncer da próstata, câncer do endométrio, câncer do ovário, adenocarcinoma, e simila- res. Em algumas modalidades, a condição da doença é um distúrbio inflama- tório intestinal crônico, por exemplo, doença inflamatória do intestino (IBD), doença do intestino irritável (IBS), e colite ulcerativa. Em algumas modalida- des, a condição da doença é um distúrbio fibrótico, por exemplo, fibrose do fígado e fibrose do pulmão.

Em algumas modalidades, a condição da doença é mediada por sinalização intracelular através do PAR1 que pode ser aberrante ou não. Em algumas modalidades, os métodos são direcionados à inibição ou prevenção da lesão por isquemia-reperfusão, incluindo lesão por isquemia-reperfusão do miocárdio, do rim, do cérebro, e do intestino. Em algumas modalidades, os métodos são direcionados para inibir ou prevenir infecção das células por vírus do herpes simples (HSV1 e HSV2).

Um outro entendimento da natureza e vantagens da presente invenção pode ser realizado por referência às partes remanescentes do rela- tório descritivo e das reivindicações. DEFINIÇÕES

A menos que definidos de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado tal como comumente en- tendido por aqueles de conhecimento ordinário da técnica à qual esta inven- ção pertence. As seguintes referências proporcionam ao técnico uma defini- ção geral de muitos dos termos usados nesta invenção: Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Smith et al. (eds.), Oxford University Press (revisado e editado em 2000); Dictionary of Microbiology and Molecu- lar Biology, Singleton et al. (Eds.), John Wiley & Sons (3a edição, 2002); e A Dictionary of Biology (Oxford Paperback Reference), Martin and Hine (Eds.), Oxford University Press (4a edição, 2000). Além disso, as seguintes defini- ções são fornecidas para auxiliar o leitor na prática da invenção.

Os termos "anticorpo" e "molécula Iigante de antígeno" são usa- dos aqui para significar cadeia(s) de polipeptídeo que exibem uma forte liga- ção monovalente, bivalente ou polivalente a um dado epítopo ou epítopo. A menos que de outro modo indicado, os anticorpos ou moléculas Iigantes de antígeno da invenção podem ser seqüências derivadas de qualquer espécie de vertebrados, mamíferos, camelídeos, aves ou peixes. Eles podem ser gerados usando qualquer tecnologia adequada, por exemplo, tecnologia do hibridoma, display de ribossomos, bibliotecas de embaralhamento de genes, bibliotecas semi-sintéticas ou inteiramente sintéticas ou combinações des- tes. Como detalhados aqui, os anticorpos ou as moléculas Iigantes de antí- geno incluem anticorpos, cadeias de polipeptídeos Iigantes de antígeno e outros anticorpos para projetos (vide, por exemplo, Serafini, J Nucl Med. 34:533-6, 1993).

Um "anticorpo" intacto compreende tipicamente pelo menos du- as cadeias pesadas (H) (cerca de 50 a 70 kD) e duas cadeias leves (L)(cerca de 25kD) interconectadas por ligações dissulfídicas. Os genes de imunoglobulina reconhecidos que codificam cadeias de anticorpo incluem genes da região constate capa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon, e mu, bem como a miríade de genes da região variável da imunoglobulina. Cadei- as leves são classificadas ou como capa ou como lambda. As cadeias pesa- das são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, que, por sua vez, definem as classes de imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respec- tivamente.

Cada cadeia pesada de um anticorpo é compreendida de uma região variável da cadeia pesada (abreviada aqui como HCVR ou VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada é compreendida de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é com- preendida de uma região variável da cadeia leve (abreviada aqui como LC- VR ou VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve é compreendida de um domínio, CL. As regiões variáveis das cadeias pesadas e das cadeias leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores hospedeiros, in- cluindo várias células do sistema imunológico (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (CIq) do sistema de complemento clássico.

As regiões VH e VL de um anticorpo podem ser ainda subdividi- das em regiões de hipervariabilidade, também denominadas regiões deter- minantes de complementaridade (CDRs), que são interspersas com as regi- ões da estrutura conservadas (FRs). Cada VH e VL é composto das três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir do amino-terminal ao carboxila- terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As localizações das regiões de CDR e FR e um sistema de numeração foram definidos por, por exemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immuno- Iogical Interest, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Go- vernment Printing Office (1987 e 1991).

Aminoácidos das regiões variáveis das cadeias pesadas e leves das imunoglobulinas são designados de Hx e Lxl respectivamente, onde χ é um número que designa a posição de um aminoácido de acordo com o es- quema de Kabat et a!., acima. Kabat et al. listam várias seqüências de ami- noácidos para anticorpos, para cada grupo, e listam o aminoácido que ocor- re mais comumente para cada posição do resíduo naquele subgrupo para gerar uma seqüência de consenso. Kabat et al. usam um método para de- signar um membro de resíduo para cada aminoácido em uma seqüência lis- tada, e este método para designar um número de resíduo para cada amino- ácido em uma seqüência listada, e este método para designar números de resíduo se tornou padrão na área. O esquema de Kabat é estendível a ou- tros anticorpos não incluídos neste compêndio por alinhar o anticorpo em questão com uma das seqüências de consenso de Kabat et al. por referên- cia aos aminoácidos conservados. O uso de um sistema de numeração de Kabat identifica aminoácidos em posições equivalentes em anticorpos dife- rentes. Por exemplo, um aminoácido na posição L50 de um anticorpo huma- no ocupa a posição equivalente a uma posição L50 de aminoácido de um anticorpo de camundongo. Igualmente, os ácidos nucléicos que codificam cadeias de anticorpo são alinhados quando as seqüências de aminoácidos codificadas pelos ácidos nucléicos respectivos são alinhadas de acordo com a convenção de numeração de Kabat.

Anticorpo ou molécula Iigante de antígeno inclui também frag- mentos de anticorpos que contêm porções Iigantes de antígeno de um anti- corpo intacto que retêm a capacidade de se ligarem ao antígeno cognato. Exemplos de tais fragmentos de anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo em domínios VI, VH, CL e CHI; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por ponte dissulfídica na região hinge; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios de VH e CH1; (iv) um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um braço simples de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989), que consiste em um domínio VH; e (vi) uma região determinante de complementaridade isolada (CDR). Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codi- ficados por genes separados, eles podem unidos, usando-se métodos re- combinantes, por um Iigante sintético que permite que eles sejam feitos co- mo uma cadeia de proteína simples, na qual as regiões VL e VH pareiam para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia sim- ples (scFV); vide, por exemplo, Bird et al., Science 242:423-426, 1988; e Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883, 1988.

Os anticorpos ou moléculas Iigantes de antígeno da invenção incluem adicionalmente uma ou mais cadeias de imunoglobulina que são quimicamente conjugadas, ou expressadas, como proteínas de fusão com outras proteínas. Também inclui anticorpo biespecífico. Um anticorpo bies- pecífico ou bifuncional é um anticorpo híbrido artificial tendo dois pares de cadeia pesada/leve e dois sítios de ligação diferentes. Outros fragmentos Iigantes de anticorpo ou porções de anticorpo da invenção incluem scFv bi- valente (diacorpo), anticorpo scFv biespecífico em que a molécula de anti- corpo reconhece dois epítopos diferentes, domínios de ligação simples (dAbs), e minicorpos.

Os vários anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno des- critos aqui podem ser produzidos por modificação enzimática ou química dos anticorpos intactos, ou sintetizados usando metodologias de novo de DNA recombinante (por exemplo, Fv de cadeia simples), ou identificados usando- se bibliotecas de dispositivo de fago (vide, por exemplo, McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990). Por exemplo, minicorpos podem ser gerados usando-se métodos descritos na técnica, por exemplo, Vaughan e Sollazzo, Comb Chem High Throughput Screen. 4:417-30 2001. Anticorpos biespecífi- cos podem ser produzidos por uma variedade de métodos, incluindo fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab'. Vide, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Im- munol. 148, 1547-1553 (1992). Anticorpos de cadeia simples podem ser i- dentificados usando-se bibliotecas de dispositivo de fago ou bibliotecas de dispositivo de ribossomo, bibliotecas de genes embaralhados. Tais bibliote- cas podem ser construídas de fontes sintéticas, semi-sintéticas ou nave e imunocompetentes.

Um "anticorpo quimérico" é uma molécula de anticorpo, na qual (a) as regiões constantes, ou uma parte destas, são alteradas, substituídas ou trocadas de modo que o sítio de ligação de antígeno (região variável) é ligado a uma região constante de uma classe diferente, ou alterada, função efetora e/ou espécies, ou uma molécula inteiramente diferente que confere novas propriedades ao anticorpo quimérico, por exemplo, uma enzima, toxi- na, hormônio, fator de crescimento, fármaco, etc.; ou (b) a região variável ou porção desta é alterada, substituída ou trocada com uma região variável tendo uma especificidade para antígeno diferente ou alterada. Por exemplo, como mostrado nos Exemplos abaixo, um anticorpo anti-hPAR1 de camun- dongo pode ser modificado por substituição de sua região constante com a região constante de uma imunoglobulina humana. Devido à substituição com uma região constante humana, o anticorpo quimérico pode reter sua especi- ficidade em reconhecer PARI humano, ao mesmo tempo tendo antigenicida- de em humano reduzida em comparação com o anticorpo de camundongo original.

Um anticorpo "humanizado" é um anticorpo que retém a reativi- dade de um anticorpo não-humano sendo, ao mesmo tempo, menos imuno- gênico em humanos. Isso pode ser obtido, por exemplo, por retenção das regiões de CDR não humanas e substituição das partes remanescentes do anticorpo com seus equivalentes humanos (isto é, a região constante bem como a porções da estrutura da região variável). Vide, por exemplo, Morri- son et al., Proc. NatL Acad. Sei. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison e Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991; e Padlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994.

O termo "molécula Iigante de anticorpo" ou "ligante de não- anticorpo" refere-se a miméticos de anticorpo que usam estruturas temporá- ria de proteína de não-imunoglobulina, incluindo adnectinas, avímeros, mo- léculas Iigantes de polipeptídeo de cadeia simples, e peptidomiméticos Iigan- tes anticorpo-símile.

O termo "antagonista", como usado aqui, refere-se a um agente que é capaz de se ligar especificamente e inibir a sinalização através de um receptor para bloquear totalmente ou inibir detectavelmente uma resposta mediada pelo receptor. Por exemplo, um antagonista de PAR1 se liga espe- cificamente ao receptor e inibe total ou parcialmente a sinalização mediada por PAR1. Em alguns casos, um antagonista de PAR1 pode ser identificado por sua capacidade de se ligar ao PAR1 e inibir o fluxo de cálcio induzido por trombina ou a produção de IL-8 induzida por trombina subsequente à sinalização intracelular de um PAR1 (por exemplo, conforme medição em um ensaio FlipR, ou por ELISA). Ensaios adicionais são descritos por Kawa- bata, et al., J Pharmacol Exp Ther. (1999) 288(1 ):358-70. A inibição ocorre quando a sinalização intracelular de PAR1, conforme mediada, por exemplo, pelo fluxo de cálcio ou pela produção de IL-8, de um PAR1 exposto a um antagonista da invenção é pelo menos cerca de 10% menor, por exemplo, pelo menos cerca de 25%, 50%, 75% menor, ou totalmente inibida, em com- paração com a sinalização intracelular de um PAR1 de controle não exposto a um antagonista. Um PAR1 de controle pode ser exposto a um não- anticorpo ou molécula Iigante de antígeno, um anticorpo anti-PAR1 ou molé- cula Iigante de antígeno que se liga especificamente a um outro antígeno, ou um anticorpo anti-PAR1 ou molécula Iigante de antígeno conhecida como por não funcionar como um antagonista. Um "antagonista de anticorpo" refe- re-se à situação em que o antagonista é um anticorpo inibidor.

O termo "receptor-1 ativado por protease", "receptor-1 ativado por proteinase", ou "PAR1" referem-se intercambiavelmente a um receptor acoplado à proteína G que é ativado por clivagem da trombina expondo um Iigante preso N-terminal. PAR1 é também conhecido como "receptor de trombina" e "precursor de receptor de fator Il de coagulação". Vide, por e- xemplo, Vu, et al., Cell (1991) 64(6): 1057-68; Coughlin, et al., J Clin Invest (1992) 89(2):351 -55; e GenBank Número de Acesso NM_001992. Ligação intramolecular do Iigante preso ao domínio extracelular de PAR1 elicita a sinalização intracelular e o fluxo de cálcio. Vide, por exemplo, Traynelis and Trejo, Curr Opin Hematol (2007) 14(3):230-5; e Hollenberg, et ai, Can J Physiol Pharmacoi (1997) 75(7):832-41. As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos de PAR1 são conhecidas da técnica. Vide, por exemplo, Vu1 et ai, Cell (1991) 64(6): 1057-68; Coughlin, et ai, J Clin Invest (1992) 89(2):351- 55; e GenBank Número de Acesso NM_001992. A seqüência de ácidos nu- cléicos de PAR1 humano está publicada como Número de Acesso NM_001992 (vide, por exemplo, M62424.1 e gi4503636). A seqüência de aminoácidos do PAR1 humano está publicada como NP-001983 e AA- A36743. Como usado aqui, um polipeptídeo de PAR1 é funcionalmente um receptor acoplado à proteína G que é ativada por trombina, e elicita a sinali- zação intracelular e fluxo de cálcio mediante ligação do Iigante preso N- terminal. Estruturalmente, uma seqüência de aminoácidos de PAR1 compar- tilha pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência com os aminoácidos do GenBank Números de Acesso NP_001983 ou M62424.1.

A especificidade de ligação de um anticorpo ou molécula Iigante de antígeno refere-se à capacidade do sítio de combinação de um anticorpo ou molécula Iigante de antígeno individual de reagir com apenas um deter- minante de antígeno. O sítio de combinação de um anticorpo típico está lo- calizado na porção do Fab da molécula e é construído a partir das regiões hipervariáveis das cadeias pesadas e leves. Em algumas modalidades, a especificidade de ligação se refere a um epítopo particular dentro de um po- lipeptídeo de PAR1 (por exemplo, SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE, ou fragmentos deste) preferencialmente ligado pelo anticorpo da invenção. Anticorpos que compartilham especificidade de ligação para um epítopo parti- cular ligar-se-ão competitivamente àquele epítopo. Anticorpos que se ligam competitivamente a um epítopo comum podem se deslocar um do outro da ligação ao epítopo comum, como medida usando qualquer ensaio de ligação conhecido da técnica, por exemplo, radioimunoensaio de fase sólida (SPRIA) em que o primeiro anticorpo competitivo ou o segundo anticorpo competitivo é marcado com um radioisótopo. Anticorpos competitivos que compartilham especificidade de ligação não precisam se ligar a epítopos idênticos, mas podem se ligar a epítopos em sobreposição que permitem o deslocamento competitivo nos ensaios de ligação. Em algumas modalidades, a especifici- dade de ligação refere-se ao subtipo de PAR (por exemplo, PAR1 versus PAR2 ou um outro subtipo de PAR, por exemplo, PAR3 ou PAR4) preferen- cialmente ligado pelo anticorpo da invenção.

Afinidade de ligação é a resistência da reação entre um determi- nante antigênico simples e um sítio de combinação simples sobre o anticor- po ou a molécula Iigante de antígeno. Ela é a soma das forças atrativas e repulsivas que operam entre o determinante antigênico e o sítio de combina- ção. A afinidade é a constante de equilíbrio que descreve a reação de antí- geno-anticorpo.

A frase "especificamente (ou seletivamente) se ligar a" refere-se a uma reação de ligação preferencial entre um anticorpo ou molécula Iigante de antígeno (por exemplo, um anticorpo anti-hPAR1) e um antígeno cognato (por exemplo, um polipeptídeo PAR1 humano) em uma população heterogê- nea de proteínas e outros produtos biológicos. As frases "um anticorpo que reconhece um antígeno" e "um anticorpo específico para um antígeno" são usadas intercambiavelmente aqui com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno". É reconhecido que certo grau de interação não específica pode ocorrer entre um anticorpo e um epítopo não alvo. En- tretanto, a ligação específica pode ser distinguida conforme mediada através do reconhecimento do epítopo alvo. Ligação tipicamente específica resulta em uma associação muito mais forte entre a molécula distribuída e uma en- tidade (por exemplo, um poço de ensaio ou uma célula) contendo o epítopo alvo que entre o anticorpo ligado e uma entidade (por exemplo, um poço de ensaio ou uma célula) que carece do epítopo alvo. A ligação específica re- sulta tipicamente em mais que cerca de 10 vezes e, mais preferivelmente, mais que 100 vezes de aumento da quantidade do anticorpo anti-PAR1 liga- do (por tempo unitário) a uma célula ou tecido contendo o epítopo alvo em comparação com uma célula ou tecido carecendo do epítopo alvo. Ligação específica entre duas entidades geralmente significa uma afinidade de pelo menos 106 M"1. Afinidades maiores que 108 IVT1 são preferidas. A ligação es- pecífica pode ser determinada usando-se qualquer ensaio para ligação de anticorpo conhecida da técnica, incluindo Western blot, ELISA, citometria de fluxo, imuno-hístoquímica.

O termo "epítopo" significa um determinante de proteína capaz de se ligar especificamente a um anticorpo. Epítopos consistem usualmente em grupamentos de moléculas de superfície quimicamente ativa tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e têm usualmente características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específica. Epítopos conformacionais e não conformacionais são distingui- dos em que a ligação ao primeiro, mas não ao último, é perdida em presen- ça de solventes de desnaturação.

O termo "ácido nucléico" é usado aqui intercambiavelmente com o termo "polinucleotídeo" e refere-se aos desoxirribonucletídeos ou ribonu- cleotídeos e polímeros destes tanto na forma de fita simples como de forma dupla. O termo engloba ácidos nucléicos contendo análogos de nucleotídeos conhecidos ou resíduos com cadeia principal modificada ou ligações, que são sintética, naturais ou não naturais, que têm propriedades de ligação si- milares como o ácido nucléico de referência, e que são metabolizados de um modo similar aos nucleotídeos de referência. Exemplos de tais análogos in- cluem, sem limitação, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metila, fosfonatos de metila quiral, 2-O-metil-ribonucleotídeos, ácido peptídeo- nucléicos (PNAs).

A menos que de outro modo indicado, uma particular seqüência de ácidos nucléicos também engloba implicitamente variantes conservativa- mente modificadas destes (por exemplo, substituições de códon degenera- das) e seqüências complementares, bem como a seqüência explicitamente indicada. Especificamente, conforme detalhado abaixo, substituições de có- don degeneradas podem ser obtidas gerando-se seqüências, nas quais a terceira posição de um ou mais códons (ou todos) selecionados é substituída com resíduos de base mista e/ou de desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; e Rossolini et al., Moi Ce//. Probes 8:91-98, 1994).

0 termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos naturais ou sinté- ticos, bem como análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que funcionam de um modo similar aos aminoácidos naturais. Aminoácidos natu- rais são aqueles codificados pelo código genético, bem como aqueles ami- noácidos que são mais tarde modificados, por exemplo, hidroxiprolina, γ- carboxiglutamato, e O-fosfosserina. Os análogos de aminoácidos referem-se a compostos que têm a mesma estrutura química básica que um aminoácido natural, isto é, um alfa-carbono que é ligado a um hidrogênio, um grupo car- boxila, um grupo amino, e um grupo R, por exemplo, homosserina, norleuci- na, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfônio. Tais análogos têm gru- pos R modificados (por exemplo, norleucina) ou cadeias principais de peptí- deo modificadas, mas retêm a mesma estrutura química básica que um ami- noácido natural. Miméticos de aminoácidos referem-se a compostos quími- cos que têm uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funciona de um modo similar a um aminoácido natural.

Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são usados aqui de modo intercambiável com referência a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos se aplicam aos polímeros de aminoácidos, nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são um mimético químico artificial de um aminoá- cido natural correspondente, bem como polímeros de aminoácidos naturais e polímeros de aminoácidos não naturais. A menos que de outro modo indica- do, uma particular seqüência de polipeptídeos engloba implicitamente vari- antes conservativamente modificadas desta.

O termo "variante conservativamente modificada" se aplica a ambas as seqüências de aminoácidos e de ácidos nucléicos. Com respeito às seqüências de ácidos nucléicos particulares, variantes conservativamente modificadas referem-se àqueles ácidos nucléicos que codificam seqüências de aminoácidos ácidas idênticas ou essencialmente idênticas, ou em que o ácido nucléico não codifica uma seqüência de aminoácidos, para seqüências essencialmente idênticas. Devido à degenerescência do código genético, um grande número de ácidos nucléicos idênticos codifica qualquer dada proteí- na. Por exemplo, os códons GCA, GCC1 GCG e GCU codificam todo o ami- noácido alanina. Assim, em cada posição onde uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para quaisquer códons correspon- dentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácidos nucléicos são "variações silenciosas", que são uma espécie de varia- ções conservativamente modificadas. Cada seqüência de ácidos nucléicos aqui que codifica um polipeptídeo descreve também cada variação silencio- sa possível do ácido nucléico. Um técnico reconhecerá que cada códon em um ácido nucléico (exceto AUG, que é ordinariamente o códon único para triptofano) pode ser modificado para render uma molécula funcionalmente idêntica. Por conseguinte, cada variante silenciosa de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo está implícita em cada seqüência descrita.

Para seqüências de polipeptídeos, "variantes conservativamente modificadas" incluem substituições individuais, deleções ou adições a uma seqüência de polipeptídeos que resultam na substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente similar. Tabelas de substituições conser- vativas que fornecem aminoácidos funcionalmente similares são bem co- nhecidas da técnica. Tais variantes conservativamente modificadas são, a- lém de e não excluem variantes polimórficas, interespécies, homólogos, e alelos da invenção. Os oito grupos a seguir contêm aminoácidos que são substituições conservativas um para outro: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Á- cido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N)1 Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lysine (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L)1 Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S)1 Treonina (T); e 8) Cisteína (C), Metionina (M) (vide, por exemplo, Creighton, Proteins (1984)).

Os termos "idêntico" e "identidade" percentual, no contexto de duas ou mais seqüências de ácidos nucléicos ou de polipeptídeos, referem- se a duas ou mais seqüências ou subsequências que são as mesmas. Duas seqüências são "substancialmente idênticas" se duas seqüências têm uma percentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são as mesmas (isto é, 60% de identidade, opcionalmente, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99% de identidade sobre uma região especificada, ou, quando não especificada, sobre a seqüência inteira), quando compara- das e alinhadas para correspondência máxima sobre uma janela de compa- ração, ou região designada conforme medida usando-se um dos seguintes algoritmos de comparação de seqüências ou por alinhamento manual e ins- peção visual. Opcionalmente, a identidade existe sobre uma região que é pelo menos cerca de 50 nucleotídeos (ou 10 aminoácidos) de comprimento, ou, mais preferivelmente, sobre uma região que é de 100 a 500 ou 1.000 ou mais nucleotídeos (ou 20, 50, 200 ou mais aminoácidos) de comprimento.

Para comparação de seqüências, uma seqüência age tipicamen- te como uma seqüência de referência, à qual as seqüências de teste são comparadas. Quando se usa um algoritmo de comparação de seqüência, as seqüências de teste e de referências são inseridas em um computador, co- ordenadas de subsequências são designadas, se necessário, e parâmetros de programa de algoritmos de seqüências são designados. O algoritmo de comparação de programa padrão pode ser usado, ou parâmetros podem ser designados. O algoritmo de comparação de seqüências então calcula as identidades de seqüência em percentagem para as seqüências de teste rela- tivas à seqüência de referência, com base nos parâmetros do programa.

Uma "janela de comparação", como usada aqui, inclui referência a um segmento de qualquer uma das várias posições contíguas seleciona- das do grupo que consiste em de 20 a 600, usualmente de cerca de 50 a cerca de 200, mais usualmente de cerca de 100 a cerca de 150 em que uma seqüência pode ser comparada a uma seqüência de referência do mesmo número de posições contíguas depois que as duas seqüências são otima- mente alinhadas. Métodos de alinhamento de seqüências para comparação são bem conhecidas da técnica. O alinhamento ótimo das seqüências pode ser conduzido, por exemplo, do algoritmo de homologia local de Smith e Wa- terman, Adv. Appl. Math. 2:482c, 1970; pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; pela busca por método de similaridade de Pearson e Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 85:2444, 1988; por implementações computadorizadas destes algorit- mos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Pacote de Software da Wiscon- sin Genetics , Genetics Computer Group, Madison, Wl); ou por alinhamento manual e inspeção visual (vide, por exemplo, Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou ed., 2003)).

Dois exemplos de algoritmos que são adequados para determi- nar a porcentagem de identidade de seqüência e similaridade de seqüência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos por Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977; e Altschul et al., J. Mol. Bioi 215:403- 410, 1990, respectivamente. O software para realizar as análises por BLAST está disponível ao público através do National Center for Biotechnology In- formation. Esse algoritmo envolve primeiramente identificar pares de se- qüência de alta classificação (HSPs) por identificação de palavras curtas de comprimento W na seqüência de indagação, que ou correspondem ou satis- fazem alguma classificação de limite T de valor positivo com uma palavra do mesmo comprimento em uma seqüência de base de dados. T é referido co- mo o limite de classificação de palavra da vizinhança (Altschul et al., supra). Essa palavra da vizinhança, inicial, age como sementes para iniciar buscas para encontrar HSPs mais longos contendo os mesmos. Os acertos de pala- vras são estendidos em ambas as direções ao longo de cada seqüência até onde a classificação de alinhamento cumulativa pode ser aumentada. Classi- ficações cumulativas são calculadas usando, para seqüências de nucleotí- deos, os parâmetros M (classificação de recompensa para resíduos corres- pondentes, sempre > 0) e N (classificação de punição para resíduos de pareamento errôneo; sempre < 0). Para seqüências de aminoácidos, uma matriz de classificação é usada para calcular a classificação cumulativa. A extensão dos acertos de palavras em cada direção é interrompida quando: a classificação de alinhamento cumulativa diminui da quantidade X de seu va- lor máximo obtido; a classificação cumulativa vai de zero ou abaixo, devido à acumulação de um ou mais alinhamentos de resíduos de classificação nega- tiva; ou o final de qualquer seqüência é atingido. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para seqüência de nucleotídeos) usa como padrões um comprimento de palavra (W) de 11, um expectativa (E) de 10, M=5, N=4 e uma comparação de ambas as fitas. Para seqüências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrões um comprimento de palavra de 3, e expectativa (E) de 10, e os alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4 da matriz de classificação BLOSUM62 (vide Henikoff e Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915, 1989), e uma comparação de ambas as fitas.

O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade entre duas seqüências (vide, por exemplo, Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5787, 1993). Uma medição de similari- dade proporcionada pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma corres- pondência entre duas seqüências de nucleotídeos ou de aminoácidos ocor- reria por acaso. Por exemplo, um ácido nucléico é considerado similar a uma seqüência de referência se a menor probabilidade de soma em uma compa- ração do ácido nucléico de teste com o ácido nucléico de referência for me- nor que cerca de 0,2, mais preferivelmente menor que cerca de 0,01, e mais preferivelmente menor que cerca de 0,001.

Diferentemente da percentagem de identidade da seqüência ci- tada acima, uma outra indicação de que duas seqüências de ácidos nucléi- cos ou de polipeptídeos são substancialmente idênticas é que o polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucléico é imunologicamente de reatividade cruzada com os anticorpos produzidos contra o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucléico, conforme descrição abaixo. Assim, um polipeptídeo é típica e substancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exem- plo, se os dois peptídeos diferem somente por substituições conservativas. Uma outra indicação de que duas seqüências de ácidos nucléicos são subs- tancialmente idênticas é que as duas moléculas ou seus complementos hi- bridizam um com ou outro sob condições estringentes, conforme descrição abaixo. Ainda uma outra indicação de que as duas seqüências de ácidos nucléicos são substancialmente idênticas é que os mesmos iniciadores po- dem ser usados para amplificar a seqüência. O termo "operavelmente ligado" refere-se a uma relação funcio- nal entre dois ou mais segmentos de polinucleotídeo (por exemplo, DNA). Tipicamente, refere-se à relação funcional de uma seqüência reguladora transcricional para uma seqüência transcrita. Por exemplo, uma seqüência de promotores ou de intensificadores é operavelmente ligada a uma seqüên- cia de codificação se esta estimular ou modular a transcrição da seqüência de codificação em uma célula hospedeira apropriada ou outro sistema de expressão. Geralmente, seqüências de reguladores transcricionais de pro- motor que estão operavelmente ligadas a uma seqüência transcrita estão fisicamente contíguas à seqüência transcrita, isto é, elas são de cis-ação. Contudo, algumas seqüências de reguladores transcricionais, tais como de intensificadores, não precisam estar fisicamente contíguas ou localizadas em proximidade às seqüências de codificação cuja transcrição elas intensificam.

O termo "vetor" significa uma molécula de polinucleotídeo capaz de transportar um outro polinucleotídeo ao qual ela foi ligada. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circu- lar, na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Um outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autôno- ma em uma célula hospedeira na qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo origem bacteriana de replicação e vetores mamí- feros epissômicos). Outros vetores (por exemplo, vetores mamíferos epis- sômicos) podem ser integrados ao genoma de uma célula hospedeira medi- ante introdução na célula hospedeira, e assim são replicados juntamente com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de dire- cionarem a expressão de genes aos quais eles estão operativamente liga- dos. Tais vetores são referidos aqui como "vetores de expressão recombi- nantes" (ou simplesmente, "vetores de expressão"). Em geral, vetores de expressão de utilidade nas técnicas de DNA recombinante estão freqüente- mente na forma de plasmídeos. No presente relatório descritivo, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados intercambiavelmente já que o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente usada. Contudo, a invenção tem o objetivo de incluir outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, retrovírus, adenovírus e vírus adeno-associados de replicação defeituosa), que servem a funções equivalentes.

O termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira") refere-se a uma célula na qual um vetor de expressão recombinante foi introduzido. Deve ser entendido que tais termos têm o obje- tivo de se referirem não somente à célula do paciente em particular, mas a toda progênie de tal célula. Devido ao fato de certas modificações poderem ocorrer em gerações sucessoras por causa de mutação ou a influências am- bientais, tal progênie pode não ser de fato idêntica à célula parente, mas está ainda dentro do escopo do termo "célula hospedeira", como usado aqui.

Termo "indivíduo" inclui animais humanos e não humanos. Ani- mais não humanos incluem todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, carneiro, cachorro, vaca, galinhas, anfíbios, e répteis. Exceto qmndo indicados, os termos "paciente" e "indivíduo" são usados intercambiavelmente.

O termo "tratar" inclui a administração de compostos ou agentes para prevenir ou prolongar o início dos sintomas, complicações, ou indícios bioquímicos de uma doença (por exemplo, um tumor), aliviar os sintomas ou interromper ou inibir ainda o desenvolvimento da doença, condição, ou dis- túrbio. O tratamento pode ser profilático (para prevenir ou prolongar o início da doença, ou para prevenir a manifestação de sintomas clínicos ou subclí- nicos desta) ou supressão ou alívio terapêutico depois da manifestação da doença.

A frase "via de transdução de sinal" ou "via de sinalização" (por exemplo, a via de sinalização de PAR1) refere-se a pelo menos uma reação bioquímica, porém mais comumente uma série de reações bioquímicas, que resultam da interação de uma célula com um composto ou agente estimula- dor. Assim, a interação de um composto estimulador (por exemplo, trombina) com uma célula gera um "sinal" que é transmitido através de uma via de transdução de sinal, resultando, por último, em uma resposta celular. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 mostra seqüências de nucleotídeos de regiões variá- veis de clones de anticorpo anti-hPAR1 de camundongo 7.J14.L16 e 6E11.H6.A9 (SEQ ID NOS:1-4). Regiões de CDR estão indicadas por resí- duos sublinhados. As regiões de estrutura são designadas pelos outros resí- duos.

A figura 2 mostra seqüências de aminoácidos de regiões de clo- nes de anticorpo anti-hPAR1 4E7.J14.L16 e 6E11.H6.A9 (SEQ ID NOS:5-8). Seqüências sublinhadas significam regiões CDR1 enquanto as outras por- ções de seqüências indicam regiões de estrutura.

A figura 3 mostra que a secreção estimulada por trombina de IL- 8 por células HUVEC é inibida por clone de anticorpo anti-hPAR1 de camun- dongos 4E7.J14.L16 ou 6E11 .H6.A9.

A figura 4 ilustra a forte atividade antagonista do clone 4E7.J14, conforme medida por ensaio de fluxo de cálcio (FlipR).

A figura 5 ilustra a forte atividade antagonista do clone 6E11.H6, conforme medida em um ensaio de fluxo de cálcio (FlipR). DESCRIÇÃO DETALHADA

1. Introdução

A presente invenção se baseia, em parte, no desenvolvimento pelos presentes inventores de anticorpos antagonistas ou moléculas Iigantes de antígenos contra PAR1 humano. Os anticorpos anti-hPAR1 gerados em anticorpos anti-hPAR1 de camundongo ou quiméricos criados in vitro foram capazes de se ligarem especificamente a um polipeptídeo de PAR1 humano. Além disso, foi constatado que os anticorpos eram capazes de inibir ativida- des mediadas por sinalização de PAR1, por exemplo, secreções de interleu- cina mediadas por trombina. Assim, esses anticorpos são úteis como agen- tes terapêuticos ou profiláticos em numerosas doenças e condições, por e- xemplo, síndrome do intestino irritável ou fibrose do fígado. As seguintes seções proporcionam orientação para fabricação e uso das composições da invenção.

2. Anticorpos Antagonistas ou Moléculas Liqantes de Antíqeno de PAR1 Humano a. Visão Geral

A invenção proporciona anticorpos ou moléculas Iigantes de an- tígeno que se ligam especificamente ao PAR1 humano. Esses agentes anti- hPAR1 são capazes de antagonizarem atividades de sinalização mediada por PAR1, por exemplo, secreção de interleucina mediada por PAR1 con- forme descrição nos Exemplos abaixo. Métodos gerais para a preparação de anticorpos monoclonais ou policlonais são bem conhecidos da técnica. Vide, por exemplo, Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1998; Ko- hler & Milstein, Nature 256:495-497, 1975; Kozbor et al., Immunology Today 4:72, 1983; e Cole et al., pp. 77-96 em Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, 1985.

Preferivelmente, os anticorpos anti-hPAR1 da invenção são anti- corpos monoclonais similar ao clone de anticorpo anti-hPAR1 4E7.J14.L16 ou clone 6E11.H6.A9 descritos nos Exemplos abaixo. Seqüências de polinu- cleotídeos e seqüências de aminoácidos das regiões variáveis destes dois anticorpos monoclonais anti-PAR1 exemplificados estão mostrados nas figu- ras 1 e 2, respectivamente. Anticorpos monoclonais referem-se a anticorpos derivados de um único clone. Qualquer técnica para produzir anticorpo mo- noclonal pode ser empregada para produzir anticorpos anti-hPAR1 da inven- ção, por exemplo, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B. Um sis- tema animal para preparar hibridomas é o sistema murínico. A produção de hibridomas no camundongo é um procedimento muito bem estabelecido. Conforme ilustrado nos Exemplos abaixo, anticorpos anti-hPAR1 monoclo- nais podem ser gerados por imunização de um animal não humano (por e- xemplo, camundongo) com um polipeptídeo de hPAR1, ou um fragmento, proteína de fusão, ou variante destes. Células B isoladas do animal são en- tão fundidas às células de mieloma para gerarem hibridomas produtores de anticorpos. Os anticorpos anti-hPAR1 de camundongos, monoclonais, po- dem ser obtidos por seleção dos hibridomas em ensaio ELISA usando um polipetídeo de hPAR1 ou proteína de fusão. Os protocolos de imunização e técnicas para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhe- cidos da técnica. Parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma de murino) e procedimentos de fusão são também bem conhecidos da técnica, por exemplo, Harlow & Lane, supra.

As seqüências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve dos anticorpos anti-PAR1 de camundongo exempli- ficativos (clones 4E7.J14.L16 ou 6E11.H6.A9) descritos nos Exemplos abai- xo são mostrados nas SEQ ID NOS:5-8. As seqüências de CDR da região variável da cadeia pesada do clone 4E7.J14.L16 são DYYMN (CDR1; SEQ ID NO:21), VIDPHNGRSRYNQMFKG (CDR2; SEQ ID NO:22), e DDGP- SHWYFDV (CDR3; SEQ ID NO:23). As seqüências de CDR da região variá- vel da cadeia leve são RSSQNIVHSNGNTYLE (CDR1; SEQ ID NO:24), KVSNRFS (CDR2; SEQ ID NO:25), e FQGSHVPFT (CDR3; SEQ ID NO:26). As seqüências de CDR da região variável da cadeia pesada do clone 6E11.H6.A9 são DHTFH (CDR1; SEQ ID NO:27), YIFPRDGSTKYNEKFKG (CDR2; SEQ ID NO:28), e HYYGSFEY (CDR3; SEQ ID NO:29). As seqüên- cias de CDR de sua região variável da cadeia leve são RSSQSLVHSNGNT- YLH (CDR1; SEQ ID N0:30), KVSNRFS (CDR2; SEQ ID N0:31), e SQST- HLPLT (CDR3; SEQ ID NO:32).

Um anticorpo intacto típico interage predominantemente com antígeno alvo predominantemente através de resíduos de aminoácidos que estão localizados nas seis regiões determinantes de complementaridade da cadeia pesada e leve (CDRs). Tipicamente, os anticorpos anti-hPAR1 da invenção têm pelo menos uma de suas seqüências de CDR da cadeia pesa- da ou seqüências de CDR da cadeia leve idêntica às seqüências de CDR correspondentes do clone de anticorpo anti-PAR1 4E7.J14.L16 ou 6E11.H6.A9. Alguns desses anticorpos anti-hPAR1 da invenção têm a mes- ma especificidade de ligação, e, portanto, competem com um anticorpo de referência, por um epítopo dentro do Iigante preso N-terminal de PAR1, por exemplo, dentro da seqüência de aminoácidos SFLLRNPNDKYEPFWEDE- EKNESGLTE (SEQ ID NO:38), ou fragmentos desta, por exemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 aminoácidos contíguos dentro da seqüência de amino- ácidos acima. Alguns anticorpos anti-hPAR1 da invenção têm todas as se- quências de CDT em suas regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve, respectivamente, idênticas às seqüências de CDR correspondentes do clone de anticorpo anti-PAR1 4E7.J14.L16 ou 6E11.H6.A9. Assim, esses anticorpos anti-hPAR1 podem ter três seqüências de CDR de cadeia pesa- da, respectivamente, idênticas às SEQ ID N0:21, SEQ ID NO:22, e SEQ ID NO:23, e as três seqüências de CDR de cadeia leve, respectivamente, idên- ticas às SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, e SEQ ID NO:26. Eles podem ter também as três seqüências de CDR de cadeia pesada, respectivamente, idênticas às SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, e SEQ ID NO:29, e as três se- quências de CDR de cadeia leve, respectivamente, idênticas às SEQ ID N0:30, SEQ ID NO:31, e SEQ ID NO:32.

Alguns dos anticorpos anti-hPAR1 da invenção têm suas se- qüências de região variável de cadeia pesada e leve, inteiras, respectiva- mente, idênticas às seqüências de região variável do clone de anticorpo de camundongo 4E7.J14.L16 ou 6E11.H6.A9. Em algumas outras modalidades, de modo diferente das seqüências de CDR, os anticorpos contêm resíduos de aminoácidos nas porções de estrutura das regiões variáveis que são dife- rentes dos resíduos de aminoácidos correspondentes de clone de anticorpo anti-PAR1 4E7.J14.L16 ou 6E11.H6.A9 (por exemplo, alguns dos anticorpos anti-hPAR1 humanizados descritos abaixo). No entanto, esses anticorpos têm tipicamente suas seqüências da região variável que são substancial- mente idênticas (por exemplo, 75%, 85%, 90%, 95%, ou 99%) às seqüên- cias da região variável do clone de anticorpo anti-PAR1 de camundongo 4E7.J14.L16 ou 6E11.H6.A. Os anticorpos anti-hPAR1 da invenção podem ser um anticorpo

intacto que contém duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Eles podem ser também moléculas Iigantes de antígeno de um anticorpo intacto ou anti- corpos de cadeia simples. Os anticorpos anti-hPAR1 da invenção incluem anticorpos produzidos em um animal não humano (por exemplo, o clone de anticorpo anti-hPAR1 de camundongo 4E7.J14.L16 ou 6E11.H6.A). Eles in- cluem também anticorpos modificados que são formas modificadas do clone de anticorpo anti-hPAR1 de camundongo 4E7.J14.L16 ou 6E11.H6.A. Fre- quentemente, os anticorpos modificados são anticorpos recombinantes, que têm propriedades similares ou aperfeiçoadas em relação àquelas do anticor- po de camundongo não exemplificado. Por exemplo, o anticorpo anti-PAR1 de camundongo exemplificado nos Exemplos abaixo pode ser modificado por deleção da região constante e substituição dela com uma região cons- tante diferente que pode levar à meia-vida aumentada, por exemplo, meia- vida do soro, estabilidade ou afinidade do anticorpo. Os anticorpos modifica- dos podem ser criados, por exemplo, por construção de vetores de expres- são que incluem seqüências de CDR do anticorpo de camundongo em se- qüências de estrutura de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (Jones et al., 1986, Nature 321, 522-525). Tais seqüências de estrutura po- dem ser obtidas de bases de dados de DNA (por exemplo, de www.kabatdatabase.com).

Alguns dos anticorpos modificados são anticorpos quiméricos que contêm seqüências de imunoglobulina humana parciais (por exemplo, regiões constantes) e seqüências de imunoglobulina (por exemplo, seqüên- cias de região variável de anticorpo anti-hPAR1 de camundongo de clone de anticorpo anti-PAR1 de camundongo 4E7.J14.L16 ou 6E11.H6.A). Alguns outros anticorpos modificados são anticorpos humanizados. Geralmente, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzi- dos nele de uma fonte que não é humana. Métodos para humanização de anticorpos não humanos são bem conhecidos da técnica, por exemplo, Pa- tentes US 5.585.089 e US 5.693.762; Jones et al., Nature 321: 522-25, 1986; Riechmann et al., Nature 332: 323-27, 1988; e Verhoeyen et al., Science 239: 1534-36, 1988. Esses métodos podem ser prontamente empregados para gerar anticorpos anti-hPAR1 humanizados da invenção pela substitui- ção das regiões correspondentes de um anticorpo humano por pelo menos uma porção de uma CDR proveniente de um anticorpo anti-PAR1 não hu- mano. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-hPAR1 humanizados da invenção têm todas as três CDRs em cada cadeia de imunoglobulina do clo- ne de anticorpo anti-hPAR1 de camundongos 4E7.J14.L16 ou 6E11.H6.A 5 enxertadas nas regiões de estrutura correspondentes humanas. Os anticorpos anti-hPAR1 descritos acima podem sofrer substi- tuições, adições ou deleções de aminoácidos, não críticas, em ambas as regiões variáveis e constantes sem perda de especificidade de ligação ou funções efetoras, ou redução intolerável da afinidade de ligação. Usualmen- te, os anticorpos que incorporam tais alterações exibem substancial identi- dade de seqüências para um anticorpo de referência (por exemplo, o clone de anticorpo anti-hPAR1 de camundongo 4E7.J14.L16 ou 6E11.H6.A) do qual eles são derivados. Por exemplo, regiões variáveis de cadeia leve ma- dura de alguns dos anticorpos anti-hPAR1 da invenção têm pelo menos 75% ou pelo menos 85% de identidade de seqüência para a seqüência da região variável da cadeia leve madura dos anticorpos anti-hPAR1 de camundongo exemplificados. Similarmente, as regiões variáveis de cadeia pesada madura dos anticorpos mostram tipicamente pelo menos 75% ou pelo menos 85% de identidade de seqüência para a seqüência da região variável da cadeia pesada madura dos anticorpos anti-hPAR exemplificados. Alguns dos anti- corpos anti-hPAR1 modificados têm a mesma especificidade e afinidade aumentada em comparação com os anticorpos anti-hPAR1 de camundongo exemplificados. Usualmente, a afinidade dos anticorpos anti-hPAR1 está dentro de um fator de 2, 5, 10 ou 50 do anticorpo anti-hPAR1 de camundon- go de referência.

b. Anticorpos Anti-hPAR1 Quiméricos e Humanizados Alguns dos anticorpos anti-hPAR1 da invenção são anticorpos quiméricos (por exemplo, de camundongo/humano), que são feitos de regi- ões de um antagonista de anticorpo anti-hPAR1 não humano juntamente com regiões humanas de anticorpos. Por exemplo, uma cadeia H quimérica pode compreender a região de ligação de antígeno da região variável da cadeia pesada do anticorpo anti-PAR1 de camundongo exemplificado aqui (por exemplo, SEQ ID NO: 5 ou 7) ligada a pelo menos uma porção de uma região constante da cadeia pesada humana. Essa cadeia pesada quimérica pode ser combinada com uma cadeia L quimérica que compreende a região de ligação de antígeno da região variável da cadeia leve do anticorpo anti- hPAR1 de camundongo exemplificado (por exemplo, SEQ ID NO:6 ou 8) ligada a pelo menos uma porção da região constante da cadeia pesada leve humana.

Anticorpos anti-hPAR1 quiméricos da invenção podem ser pro- duzidos de acordo com o exposto nos Exemplos abaixo bem como nos mé- todos conhecidos da técnica. Por exemplo, um gene que codifica a cadeia pesada ou a cadeia leve de um anticorpo anti-hPAR1 de murino ou molécula Iigante de antígeno pode ser digerido com enzimas de restrição para remo- ver a região Fc de murino, e substituído com a porção equivalente de um gene que codifica uma região constante de Fc humano. Vetores de expres- são e células hospedeiras adequadas para expressão de anticorpos recom- binantes e anticorpos humanizados em particular são bem conhecidos da técnica. Vetores que expressam genes quiméricos que codificam cadeias de imunoglobulina anti-hPAR1 podem ser construídos usando técnicas recom- binantes padrão, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labo- ratory Manual, Cold Spring Harbor Press (3a ed., 2001); e Brent et al., Cur- rent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou ed., 2003). Seqüências de região constante humanas podem ser selecionadas de várias fontes de referência, incluindo, mas sem limitação, àquelas listadas por Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edição, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1991. Ensinamentos mais específicos para produzir anticorpos qui- méricos por recombinação de DNA foram também ensinados na técnica, por exemplo, Robinson et al., Publicação do Pedido de Patente PCT/US86/02269; Akira, et al., Pedido de Patente EP 184.187; Taniguchi, M., Pedido de Paten- te EP 171.496; Morrison et al., Pedido de Patente EP 173.494; Neuberger et al., Pedido Internacional WO 86/01533; Cabilly et al., Patente US 4.816.567; Cabilly et al., Pedido de Patente EP 125,023; Better et al., Science 240:1041-1043, 1988; Liu et al., PNAS 84:3439-3443, 1987; Liu et al., J. Im- munol. 139:3521-3526, 1987; Sun et al., PNAS 84:214-218, 1987; Nishimura et al., Canc. Res. 47:999-1005, 1987; Wood et al., Nature 314:446-449, 1985; Shawet al., J. Nati Câncer Inst. 80:1553-1559, 1988.

Anticorpos quiméricos, que têm as regiões variáveis inteiras de um anticorpo não humano, podem ser ainda humanizados para reduzir anti- genicidade do anticorpo em humano. Isso é tipicamente obtido por substitui- ção de certas seqüências ou de resíduos de aminoácidos nas regiões variá- veis de Fv (regiões de estrutura ou regiões de não CDR) com seqüências equivalentes ou resíduos de aminoácidos de regiões variáveis de Fv huma- no. Essas seqüências adicionalmente substituídas ou resíduos de aminoáci- dos não estão usualmente diretamente envolvidos na ligação de antígeno. Mais freqüentemente, a humanização de um anticorpo não humano é acon- tece pela substituição das CDRs em um anticorpo humano por somente as CDRs de um anticorpo não humano (por exemplo, os anticorpos anti-PAR1 de camundongos exemplificados aqui). Em alguns casos, isso é obtido por substituição alguns resíduos adicionais nas regiões da estrutura humana com os resíduos correspondentes do anticorpo doador não humano. Tal en- xerto adicional é freqüentemente necessário para aperfeiçoar a ligação ao antígeno. Isso é porque os anticorpos humanizados que têm somente CDRs enxertadas de um anticorpo não humano podem ter menos atividades de ligação perfeitas em comparação com aquelas do anticorpo doador não hu- mano. Assim, além das CDRs1 anticorpos anti-hPAR1 humanizados da in- venção podem ter freqüentemente alguns resíduos de aminoácidos na regi- ão de estrutura humana substituídos com resíduos correspondentes do anti- corpo doador não humano (por exemplo, o anticorpo de camundongo, e- xemplificado aqui). Os métodos para gerar anticorpos humanizados por substituição de CDR, incluindo critérios para selecionar resíduos de estrutura para substituição, são bem conhecidos da técnica. Por exemplo, além da técnica indicada acima referente à produção de anticorpos quiméricos, ensi- namentos adicionais na fabricação de anticorpos humanizados são propor- cionados, por exemplo, por, Winter et al., Pedido de Patente GB 2188638A (1987), Patente US 5.225.539; Jones et al., Nature 321:552-525, 1986; Ve- rhoeyan et al., Science 239:1534, 1988; e Beidler et al., J. Immunol. 141:4053-4060, 1988. A substituição de CDR pode ser também efetuada usando-se mutagênese sítio-direcionada de oligonucleotídeos conforme descrita em, por exemplo, WO 94/10332 intitulado "Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes".

Os anticorpos anti-hPAR1 quiméricos ou humanizados da inven- ção podem ser imunoglobulinas monovalentes, divalentes, ou polivalentes. Por exemplo, um antígeno quimérico monovalente é um dímero (HL) forma- do por uma cadeia H quimérica associado através de pontes de dissulfeto a uma cadeia L quimérica, como citado acima. Um anticorpo quimérico diva- Iente é um tetrâmero (H2 L2) formado por dois dímeros HL associados atra- vés de pelo menos uma ponte de dissulfeto. Um anticorpo quimérico poliva- Iente é baseado em uma agregação de cadeias.

c. Anticorpos Anti-hPAR1 Humanos

Além dos anticorpos anti-hPAR1 quiméricos ou humanizados, também incluídos na invenção estão anticorpos totalmente humanos que exibem especificidade de ligação igual e afinidade de ligação comparável, ou melhor. Por exemplo, os anticorpos anti-hPAR1 humanos podem ter as mes- mas ou melhores características de ligação (por exemplo, especificidade de ligação e/ou afinidade de ligação) em relação às de um anticorpo anti-PAR1 não humano de referência, por exemplo, clone de anticorpo anti-hPAR1 de camundongo 4E7.J14.L16 ou 6E11.H6.A. O anticorpo não humano de refe- rência pode ser o anticorpo anti-PAR1 de camundongo, que contém uma seqüência de região variável da cadeia pesada de SEQ ID N0:5 e um se- qüência de região variável da cadeia leve de SEQ ID N0:6. Ele pode ser também o anticorpo anti-PAR1 de camundongo que contém uma seqüência de região variável da cadeia pesada da SEQ ID N0:7 e um seqüência de região variável da cadeia leve de SEQ ID N0:8. Em comparação com os anticorpos quiméricos ou humanizados, os anticorpos anti-hPAR1 humanos da invenção têm ainda antigenicidade reduzida quando administrados a pa- cientes humanos.

Os anticorpos anti-hPAR1 humano podem ser gerados usando- se métodos que são conhecidos da técnica. Por exemplo, um método in vivo para substituir uma região variável do anticorpo não humano com uma regi- ão variável humana em um anticorpo enquanto as mesmas características ou melhores características de ligação em relação ao do anticorpo não hu- mano são mantidas ou proporcionadas foi descrito no Pedido de Patente US 10/778.726 (Publicação N0 20050008625). O método replica na substituição guiada por epítopo de regiões variáveis de um anticorpo de referência de não humano com um anticorpo totalmente humano. O anticorpo humano resultante está geralmente estruturalmente não relacionado ao anticorpo não humano de referência, mas se liga ao mesmo epítopo no mesmo antígeno que o anticorpo de referência. Em breve, a abordagem de substituição de complementaridade guiada por epítopo em série é feita por estabelecimento de uma competição em células entre um "competidor" e uma biblioteca de híbridos diversos do anticorpo de referência ("anticorpos de teste") para liga- ção às quantidades Iimitantes do antígeno em presença de um sistema re- ceptor que responde à ligação do anticorpo de teste ao antígeno. O compe- tidor pode ser o anticorpo de referência ou derivado deste tal como um frag- mento Fv de cadeia simples. O competidor pode ser também um Iigante na- tural ou artificial do antígeno que se liga ao mesmo apítopo que o anticorpo de referência. As únicas exigências do competidor são aquelas em que ele se liga ao mesmo competidor que o anticorpo de referência, e em que ele compete com o anticorpo de referência para a ligação de antígeno. Os anti- corpos de teste têm uma região V de ligação de antígeno em comum do an- ticorpo de referência não humano, e a outra região V selecionada de uma fonte diversa tal como um biblioteca de repertório de anticorpos humanos. A região V comum proveniente do anticorpo serve como um guia, posicionan- do os anticorpos de teste no mesmo epítopo no antígeno, e na mesma orien- tação, de modo que a seleção tende para fidelidade de ligação de antígeno mais alta ao anticorpo de referência.

Muitos tipos do sistema repórter podem ser usados para detectar interações desejadas entre os anticorpos de teste de antígeno. Por exemplo, fragmentos repórter de complementação podem ser ligados ao antígeno e ao anticorpo de teste, respectivamente, de modo que a ativação de repórter por complementação de fragmento ocorre somente quando o anticorpo de teste se liga ao antígeno. Quando as fusões de fragmento de anticorpo e antígeno repórter são coexpressadas com o competidor, a ativação de repór- ter se torna dependente da capacidade do anticorpo de teste de competir com o competidor, que é proporcional à afinidade do anticorpo de teste para o antígeno. Outros sistemas repórter que podem ser usados incluem o reati- vador de um sistema de reativação de repórter auto-inibido (RAIR) conforme descrição no Pedido de Patente US 10/208.730 (Publicação N0 20030198971), ou sistema de ativação competitivo descrito no Pedido de Patente US 10/076.845 (Publicação N0 20030157579).

Com o sistema de substituição de complementaridade guiada por epítopo em série, a seleção é feita para identificar células que expres- sam um anticorpo de teste simples juntamente com o competidor, antígeno, e componentes de repórter. Nessas células, cada anticorpo de teste compe- te um a um com o competidor para se ligar a uma quantidade Iimitante de antígeno. A atividade do repórter é proporcional à quantidade de antígeno ligada ao anticorpo de teste, que por sua vez é proporcional à afinidade do anticorpo de teste para o antígeno e a estabilidade do anticorpo de teste. Os anticorpos de teste são inicialmente selecionados com base em sua ativida- de relativa àquela do anticorpo de referência quando expresso no anticorpo de teste. O resultado da primeira rodada de seleção é um conjunto de anti- corpos "híbridos", cada um dos quais é compreendido da mesma região em V não humana do anticorpo de referência e uma região em V não humana da biblioteca, e cada um dos quais se liga ao mesmo epítopo no antígeno que o anticorpo de referência. Um ou mais dos anticorpos híbridos selecio- nados na primeira rodada terão afinidade com o antígeno comparável a ou maior que aquela do anticorpo de referência.

Na segunda etapa de substituição da região V, as regiões V hu- manas selecionadas na primeira etapa usadas como guia para a seleção de substituições humanas para a região V do anticorpo de referência não hu- mano remanescente com uma biblioteca diversa das regiões V humanas cognatas. Os anticorpos híbridos selecionados na primeira rodada podem ser também usados como competidores para a segunda rodada da seleção. O resultado da segunda rodada de seleção é um conjunto de anticorpos to- talmente humanos, que diferem estruturalmente do anticorpo de referência, mas que competem com o anticorpo de referência por ligação com o mesmo antígeno. Alguns dos anticorpos humanos selecionados se ligam ao mesmo epítopo no mesmo antígeno que o anticorpo de referência. Dentre os anti- corpos humanos selecionados, um ou mais se ligam ao mesmo epítopo com afinidade que seja comparável a ou maior que àquela do anticorpo de refe- rência.

Usando um dos anticorpos anti-hPAR1 de camundongo ou qui- méricos descritos acima como o anticorpo de referência, este método pode ser prontamente empregado para gerar anticorpos humanos que se ligam ao PAR1 humano com a mesma especificidade de ligação e com afinidade de ligação igual, ou melhor. Além disso, tais anticorpos anti-hPAR1 humanos podem ser também comercialmente obtidos de companhias que costumei- ramente produzem anticorpos humanos, por exemplo, KaIoBios, Inc. (Moun- tain View, CA). Para obter anticorpos humanos com afinidades iguais ou me- lhores por um epítopo específico que um anticorpo não humano específico de partida (por exemplo, anticorpo anti-PAR1 de camundongo), as tecnolo- gias da KaIoBios, Inc. empregam uma biblioteca de anticorpo "aceptor" hu- mano. É gerada uma biblioteca direcionada ou focada em epítopos de anti- corpos humanos que se ligam ao epítopo idêntico como o anticorpo não hu- mano, embora com afinidades variáveis. Os anticorpos na biblioteca focada em epítopos são então selecionados quanto à afinidade similar ou mais alta. d. Outros Tipos de Anticorpos Anti-hPAR1 Os anticorpos anti-hPAR1 ou moléculas Iigantes de antígeno da invenção incluem também anticorpos de cadeia simples, anticorpos biespe- cíficos e anticorpos multiespecíficos. Em algumas modalidades, os anticor- pos da invenção são anticorpos de cadeia simples. Anticorpos de cadeia simples contêm em uma cadeia simples de polipeptídeo dobrada estavel- mente as regiões de ligação de antígeno de ambas as cadeia pesada e a cadeia leve. Assim, os anticorpos de cadeia simples retêm tipicamente a es- pecificidade de ligação e afinidade dos anticorpos monoclonais, mas são de tamanho consideravelmente pequeno em relação às imunoglobulinas clássi- cas. Para certas aplicações, os anticorpos de cadeia anti-hPHR1 de cadeia simples da invenção podem proporcionar muitas propriedades vantajosas em comparação com um anticorpo anti-hPAR1 intacto. Essas incluem, por exemplo, uma depuração mais rápida do corpo, maior penetração tecidual para ambos o imageamento diagnóstico e terapia, e um decréscimo signifi- cante da imunogenicidade em comparação com anticorpos com base em camundongo. Outros benefícios potenciais do uso de anticorpos de cadeia simples incluem capacidades de seleção intensificadas em métodos de sele- ção de alto rendimento e o potencial para aplicação não parenteral.

Anticorpos anti-hPAR1 de cadeia simples podem ser preparados usando-se métodos que foram descritos na técnica. Exemplos de tais técni- cas incluem aquelas descritas nas Patentes US 4.946.778 e US 5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88, 1991; Shu et al., Proc. Na- tl. Acad. Sei. USA 90:7995-7999, 1993; e Skerra et al., Science 240:1038- 1040, 1988.

Em algumas modalidades, a invenção proporciona anticorpos anti-hPAR1 derivatizados ou ligados a uma outra molécula funcional para gerar uma molécula biespecífica ou multiespecífica que se liga aos sítios de ligação múltiplos ou epítopos alvo. A molécula funcional inclui um outro pep- tídeo ou proteína (por exemplo, uma citocina, um agente citotóxico, um a- gente imunoestimulante ou agente inibidor, um fragmento Fab' ou outro fragmento de Iigante de anticorpo conforme discutido acima). Por exemplo, um anticorpo anti-hPAR1 ou porção de ligação de antígeno deste pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genéti- ca, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais de outras moléculas ligantes, tais como um outro anticorpo, um fragmento de anticor- po, peptídeo ou mimétíco de ligação. Assim, os anticorpos anti-hPAR1 bies- pecíficos e multiespecíficos da invenção compreendem pelo menos um anti- corpo anti-hPAR1 monoclonal ou molécula Iigante de antígeno deste com uma primeira especificidade de ligação para PAR1 humano e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epítopo alvo. O segundo epítopo alvo pode ser um receptor Fc, por exemplo, receptor FcyRI ou um receptor Fcy humano. Portanto, a invenção inclui moléculas biespecíficas e multies- pecíficas capazes de se ligarem, ambas, às células efetoras que expressam FcyRI, FcyR ou FCsR (por exemplo, monócitos, macrófagos ou células poli- morfonucleares (PMNs)), e a células alvo que expressam PAR1 humano (por exemplo, células cancerosas). Essas moléculas multiespecíficas (por exemplo, biespecíficas ou multiespecíficas) alvejam células que expressam PAR1 humano para células efetoras, e desencadeiam atividades de células efetoras mediadas por receptor de Fc, tal como fagocitose de células que expressam PAR1 humano, citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), liberação de citocina, ou geração de anion de superóxido.

Moléculas anti-hPAR1 biespecíficas e multiespecíficas da pre- sente invenção podem ser feitas por métodos que foram descritos na técni- ca. Essas incluem técnicas químicas (vide, por exemplo, Kranz et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:5807, 1981), técnicas de polidoma (vide, por exem- plo, a Patente US 4.474.893), ou técnicas de DNA recombinante. Moléculas biespecíficas e multiespecíficas da presente invenção podem ser também preparadas por conjugação das especificidades de ligação constituintes, por exemplo, as especificidades de ligação anti-FcR e anti-hPAR1, usando-se métodos conhecidos da técnica conforme descritos aqui. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica e multiespecífica pode ser gerada separadamente e então conjugada uma com a outra. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, uma variedade de agentes de acoplamento ou de reticulação podem ser usados para a conju- gação covalente. Exemplos de agentes de reticulação incluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), N-succinimidil-3-(2- piridilditio)propionato (SPDP), e 4-(N-maleimidometil)cicloexano-1-carboxi- Iato de sulfossuccinimidila (sulfo-SMCC). Quando as especificidades de liga- ção são anticorpos (por exemplo, dois corpos humanizados), eles podem ser conjugados via ligação de sulfidrila das regiões hinge da terminação C das duas cadeias pesadas. A região hinge pode ser modificada para conter um número ímpar de resíduos sulfidrila, por exemplo, um, antes da conjugação.

A ligação das moléculas biespecíficas e multiespecíficas aos seus alvos específicos pode ser confirmada por ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), um radioimunoensaio (RIA), ou um ensaio Western Blot. Cada um desses ensaios geralmente detecta a presença de complexos de proteína-anticorpo de interesse particular empregando um reagente mar- cado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse.

Por exemplo, os complexos de FcR-anticorpo podem ser detectados usan- do-se, por exemplo, um anticorpo ligado a enzima ou fragmento de anticorpo que reconhece e se liga especificamente aos complexos de anticorpo-FcR. Alternativamente, os complexos podem ser detectados usando-se qualquer variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, o anticorpo pode ser mar- cado radioativamente e usado em um radioimunoensaio (RIA) (vide, por e- xemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, março de 1986). O isótopo radioativo pode ser detectado por tais meios como o uso de contador gama ou contador de cintilação ou por autorradiografia. Anticorpos anti-hPAR1 ou moléculas Iigantes de antígeno da

invenção incluem também unidades de ligação de antígeno de domínio sim- ples, que têm uma estrutura temporária de camelídeo. Animais da família de camelídeos incluem camelos, lhamas, e alpacas. Os camelídeos produzem anticorpos funcionais isentos de cadeias leves. O domínio variável da cadeia pesada (VH) se dobra de modo autônomo e funciona independentemente como uma unidade de ligação de antígeno. Sua superfície de ligação envol- ve somente três CDRs em comparação com as seis CDRs em moléculas Iigantes de antígeno clássicas (Fabs) ou fragmentos variáveis de cadeia simples (scFvs). Anticorpos de camelídeo são capazes de atingirem afinida- des de ligação comparáveis àquelas dos anticorpos convencionais. Molécu- las anti-PAR1 com base em estrutura temporária de camelídeo com especi- ficidades de ligação dos anticorpos anti-PA1 de camundongo exemplificados aqui podem ser produzidas usando-se métodos bem conhecidos da técnica, por exemplo, Dumoulin et al., Nature Struct. Biol. 11:500-515, 2002; Gha- hroudi et al., FEBS Letters 414:521-526, 1997; e Bond et al., J Mol Biol. 332:643-55, 2003.

e. Liqantes de Não Anticorpos que se Ligam Especificamente ao hPAR1

Os anticorpos anti-PAR1 ou moléculas Iigantes de antígeno da invenção incluem também monocorpos que são pequenos miméticos de an- ticorpos usando uma estrutura temporária de um domínio de fibronectina tipo Ill (FN3). A fibronectina é uma proteína grande que desempenha papéis es- senciais na formação da matriz extracelular e interações célula-célula. Ela consiste em várias repetições de três tipos (I, Il e III) de domínios pequenos. A própria FN3 é o paradigma de uma subfamília grande (família de FN3 ou família de imunoglobulina do tipo s) da superfamília de imunoglobulina. A família de FN3 inclui molécula de adesão de célula, hormônio de superfície de célula e receptores de citocina, chaperoninas, e domínios de ligação de carboidrato. Estrutura temporária de FN3 funciona como uma estrutura efi- caz sobre a qual alças para funções de construção específicas podem ser enxertadas. Existem 15 unidades de repetição da FN3 em fibronectina hu- mana. Tipicamente, tais moléculas Iigantes de antígeno da invenção utilizam a décima unidade de FN3 da fibronectina humana como estrutura temporá- ria. Ela é pequena, monomérica, e não tem ligações de dissulfeto. Moléculas Iigantes de antígeno com base em FN3, que exibem a mesma especificidade que os anticorpos anti-PAR1 de camundongo exemplificados aqui, podem ser preparadas usando-se os métodos conhecidos da técnica, por exemplo, Koide et al., J. Mol. Biol. 284: 1141-1151, 1998; Koide et al., Proc. Natl A- cad. Sei. USA 99:1253-1258, 2002; e Batori et al., Protein Eng. 15:1015-20, 2002. Vide também as Patentes US 6.818.418 e US 7.115.396.

Algumas outras moléculas Iigantes de antígeno da invenção em- pregam uma estrutura temporária derivado de domínios A. Os domínios A ocorrem como fios de domínios múltiplos em vários receptores de superfície de célula. Os domínios desta família se ligam a muitos alvos conhecidos, incluindo moléculas pequenas, proteínas e vírus. Análise de truncamento tem mostrado que um alvo é tipicamente contatado por domínios A múltiplos, com cada domínio se ligando independentemente ao um epítopo único. A avidez gerada pela combinação de domínios de ligação múltiplos é uma a- bordagem poderosa para aumentar a afinidade e especificidade. Tais molé- cuias Iigantes de antígeno que se ligam ao PAR1 com as especificidades de ligação dos anticorpos anti-PAR1 de camundongo exemplificados aqui po- dem ser geradas usando os métodos descritos, por exemplo, por Gliemann et al., Bioi Chem. 379:951-964, 1998; Koduri et al., Biochemistry 40:12801 - 12807, 2001 e Silverman et al., NatBiotechnoI. 23:1556-61, 2005.

Outros compostos foram desenvolvidos que alvejam e se ligam a alvos de um modo similar aos anticorpos. Certos desses "miméticos de anti- corpo" usam estrutura temporárias de proteína de não imunoglobulina como estruturas de proteína alternativas para as regiões variáveis de anticorpos.

Por exemplo, Ladner et al. (Patente US 5.260.203) descrevem moléculas Iigantes de cadeia de polipeptídeo simples com especificidade de ligação similar àquela da região variável da cadeia leve ou pesada de anti- corpos, agregada, mas molecularmente separada. As moléculas Iigantes de cadeia simples contêm os sítios Iigantes de antígeno de ambas as regiões variáveis pesadas e leves de um anticorpo conectado por um Iigante de pep- tídeo e se dobrarão em uma estrutura similar àquela do anticorpo de dois peptídeos. A molécula Iigante de cadeia simples exibe várias vantagens so- bre os anticorpos convencionais, incluindo tamanho menor, estabilidade maior e é mais facilmente modificada.

Ku et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 92(14):6552-6556 (1995)) descreve uma alternativa para anticorpos com base em citocroma b562. Kut et al. (1995) geraram uma biblioteca, na qual duas das alças do citocromo b562 foram aleatorizados e selecionados para ligação contra albumina séri- ca bovina. Foi verificado que os mutantes individuais se ligam seletivamente com BSA similarmente com anticorpos anti-BSA.

Beste et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 96(5): 1898-1903 (1999)) descrevem um mimético de anticorpo sobre uma estrutura temporá- ria de Iipocalina (Anticalin®). Lipocalinas são compostas de um β-barrel com quatro alças hipervariáveis na terminação da proteína. Beste (1999) subme- teu as alças à mutagênese aleatória e selecionou para ligação com, por e- xemplo, fluoresceína. Três variantes exibiram ligação específica com fluo- resceína, com uma variante mostrando ligação similar àquela de um anticor- po anti-fluoresceína. Outra análise revelou que todas as posições aleatoriza- das são variáveis, indicando que Anticalin® seria adequada para ser usada como alternativa para anticorpos.

Anticalin® compreende peptídeos de cadeia simples e pequena, tipicamente entre 160 e 180 resíduos, que proporciona várias vantagens so- bre os anticorpos, incluindo custos de produção reduzidos, estabilidade au- mentada durante a armazenagem e reação imunológica diminuída.

Hamilton et al. (Patente US 5.770.380) descreve um mimético de anticorpo sintético usando a estrutura temporária orgânico, não peptídico, rígido de calixareno, ligado com alças de peptídeo variáveis e múltiplas usa- das como sítios de ligação. As alças do peptídeo, todas elas, se projetam do mesmo lado geometricamente do calixareno, com respeito uma a outra. Por causa dessa confirmação geométrica, todas as alças ficam disponíveis para ligação, aumentando a afinidade de ligação a um ligante. Contudo, em com- paração com os outros miméticos de anticorpo, o mimético de anticorpo com base em calixareno não consiste exclusivamente em um peptídeo, e, portan- to, ele é menos vulnerável ao ataque das enzimas de protease. Nem o estru- tura temporária consiste puramente em um peptídeo, DNA ou RNA, signifi- cando que este mimético do anticorpo é relativamente estável em extremas condições ambientes e tem uma expectativa de vida longa. Ainda, já que o mimético de anticorpo com base em calixareno é relativamente pequeno, ele tem menor probabilidade de produzir uma resposta imunogênica.

Murali et al. (Ce//. Mol. Biol. 49(2):209-216 (2003)) discute uma metodologia para reduzir os anticorpos a peptidomiméticos menores, eles são denominados "peptidomiméticos Iigantes anticorpo-símile" (ABiP), que podem ser úteis também como uma alternativa para anticorpos.

3. Polinucleotídeos, Vetores e Células Hospedeiras para Produ- zir Anticorpos Anti-hPAR1

A invenção proporciona polinucleotídeos substancialmente puri- ficados (DNA ou RNA) que codificam polipeptídeos compreendendo seg- mentos ou domínios das cadeias do anticorpo anti-hPAR1 ou das moléculas Iigantes de antígeno descritas acima. Alguns dos polinucleotídeos da inven- ção compreendem a seqüência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada na SEQ ID NO:1 ou 3 e/ou a seqüência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO:2 ou 4. Alguns outros poli- nucleotídeos da invenção compreendem seqüências de nucleotídeos que são substancialmente idênticas (por exemplo, pelo menos 65%, 80%, 95% ou 99%) a uma das seqüências de nucleotídeos nas SEQ ID NOS: 1-4. Quando expressos de vetores de expressão apropriados, os polipeptídeos codificados por esses polinucleotídeos são capazes de exibirem capacidade de ligação ao antígeno.

São também proporcionados na invenção polinucleotídeos que codificam pelo menos uma região CDR e usualmente todas as três regiões CDR da cadeia pesada ou leve dos anticorpos anti-hPAR1 de camundongo descritos nos Exemplos abaixo. Alguns outros polinucleotídeos codificam toda ou substancialmente toda a seqüência de região variável e/ou da ca- deia leve dos anticorpos anti-hPAR1 de camundongo. Por exemplo, alguns desses polinucleotídeos codificam a seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada mostrada nas SEQ ID N0S:5 ou 7 e/ou a seqüên- cia de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO:6 ou 8. Por causa da degenerescência do código, uma variedade de se- qüências de ácidos nucléicos codificará cada uma das seqüências de ami- noácidos da imunoglobulina.

Os polinucleotídeos da invenção podem codificar somente a se- qüência da região variável de um anticorpo anti-hPAR1. Eles podem codifi- car também tanto uma região variável como uma região constante do anti- corpo. Algumas das seqüências de polinucleotídeos dos ácidos nucléicos da invenção codificam uma seqüência de região variável da cadeia pesada ma- dura que é substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos 80%, 90%, ou 99%) à seqüência da região variável da cadeia pesada madura mostrada na SEQ ID NO: 5 ou 7. Algumas outras seqüências de polinucleotídeos codi- ficam uma seqüência da região variável da cadeia leve madura que é subs- tancialmente idêntica à seqüência da região variável da cadeia leve madura mostrada na SEQ ID NO:6 ou 8. Algumas das seqüências de polinucleotí- deos codificam um polipeptídeo que compreende regiões variáveis tanto da cadeia pesada como da cadeia leve de um anticorpo anti-PAR1 de camun- dongo exemplificado. Alguns outros polinucleotídeos codificam dois segmen- tos de polipeptídeos que são respectivamente substancialmente idênticos às regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve de um dos anticorpos de camundongo.

As seqüências de polinucleotídeos podem ser produzidas pela síntese de novo de DNA em fase sólida ou por mutagênese por PCR de uma seqüência existente (por exemplo, seqüências conforme descritas nos E- xemplos abaixo) codificando um anticorpo anti-hPAR1 ou seu fragmento de ligação. Síntese química direta de ácidos nucléicos pode ser efetuada por métodos conhecidos da técnica, tal como o método de fosfotriéster de Na- rang et al., Meth. Enzymol. 68:90, 1979; o método de fosfodiéster de Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979; o método de dietilfosforamidita de Be- aucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981; e o método em suporte sólido da Patente US 4.458.066. Introdução de mutações a uma seqüência de polinu- cleotídeos por PCT poder ser realizada conforme descrita em, por exemplo, PCR Technology: Principies and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Me- thods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; e Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991.

A invenção proporciona também vetores de expressão e células hospedeiras para produzir os anticorpos anti-hPAR1 descritos acima. Vários vetores de expressão podem ser empregados para expressar os polinucleo- tídeos que codificam as cadeias de anticorpo anti-hPAR1 ou fragmentos de ligação. Tanto os vetores de expressão com base em vírus como os não vi- rais podem ser usados para produzir os anticorpos em uma célula hospedei- ra mamária. Vetores e sistemas não virais incluem plasmídeos, vetores epis- sômicos, tipicamente com um cassete de expressão para expressar uma proteína ou RNA, e cromossomos artificiais humanos (vide, por exemplo, Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997). Por exemplo, vetores não virais úteis para expressão dos polinucleotídeos anti-hPAR1 e polipeptídeos em células mamíferas (por exemplo, humanas) incluem pThioHis A, B & C1 pcDNA3.l/His, pEBVHis A, B & C (Invitrogen, San Diego, CA), vetores de MPSV, e numerosos outros vetores conhecidos da técnica para expressão de outras proteínas. Vetores virais úteis incluem vetores com base em retro- vírus, adenovírus, vírus adenoassociados, vírus do herpes, vetores com ba- se no SV40, vírus do papiloma, vírus de Epstein Barr em HPB1 vetores de vírus da vacínia e vírus de Semliki Forest (SFV). Vide Brent et al., supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; e Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992.

A escolha do vetor de expressão depende das células hospedei- ras pretendidas, nas quais o vetor é para ser expresso. Tipicamente, os ve- tores contêm um promotor e outras seqüências reguladoras (por exemplo, de intensificadores) que são operavelmente ligadas aos polinucleotídeos que codificam uma cadeia de anticorpo anti-hPAR1 ou fragmento. Em algumas modalidades, um promotor induzível é empregado para prevenir a expressão de seqüências inseridas sob condições indutoras. Promotores induzíveis incluem, por exemplo, arabinose, IacZ, promotor de metalotioneína ou um promotor de choque térmico. Culturas de organismos transformados podem ser expandidas sob condições não indutoras sem predispor a população a codificar seqüências cujos produtos de expressão são melhores tolerados pelas células hospedeiras. Além dos promotores, outros elementos regula- dores podem ser também requeridos ou desejados para expressão eficaz de uma cadeia de anticorpo anti-hPAR1 ou fragmento. Esses elementos inclu- em tipicamente um códon de iniciação de ATG e sítio de ligação de ribosso- mo adjacente ou outras seqüências. Além disso, a eficácia de expressão pode ser intensificada pela inclusão de intensificadores apropriados para o sistema de célula em uso (vide, por exemplo, Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; e Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987). Por exemplo, o intensificador de SV40 ou o intensificador de CMV podem ser usados para aumentar a expressão das células hospedeiras mamíferas.

Os vetores de expressão podem proporcionar também uma po- sição de seqüência de sinal de secreção para formar uma proteína de fusão com polipeptídeos codificados por seqüências de anticorpo anti-hPAR1 inse- ridas. Mais freqüentemente, as seqüências anti-hPAR1 inseridas são ligadas a seqüências de sinal antes da inclusão no vetor. Os vetores a serem usa- dos para receberem seqüências que codificam os domínios variáveis da ca- deia leve e da cadeia pesada do anticorpo anti-hPAR1 também codificam, algumas vezes, regiões constantes ou partes destas. Tais vetores permitem a expressão das regiões variáveis como proteínas de fusão com as regiões constantes, levando, assim, à produção de anticorpos intactos ou fragmen- tos destes. Tipicamente, tais regiões constantes são humanas.

As células hospedeiras para conter e expressar as cadeias de anticorpo anti-hPAR1 podem ser tanto procarióticas como eucarióticas. E. coli é um hospedeiro procariótico para clonar e expressar os polinucleotí- deos da presente invenção. Outros hospedeiros microbianos adequados pa- ra uso incluem bacilos, tal como Bacillus subtilis, e outras enterobacteriá- ceas, tais como Salmonela, Serratia, e várias espécies de Pseudomonas. Nessas células procarióticas, podem ser feitos vetores de expressão que contêm tipicamente seqüências de controle de expressão compatíveis com a célula hospedeira (por exemplo, uma origem de replicação). Além disso, qualquer número de uma variedade de promotores bem conhecidos apre- sentará, tal como o sistema promotor de lactose, um sistema de promotor de triptofano (trp), um sistema promotor de beta-lactamase, ou um sistema promotor de fago lambda. Os promotores controlam, tipicamente, a expres- são, opcionalmente com uma seqüência de operador, e têm seqüências de sítio de ligação de ribossomo e similares, para imitar e completar a transcri- ção e tradução. Outros micróbios, tal como levedura, podem ser também empregados para expressarem polipeptídeos anti-hPAR1 da invenção. Célu- las de insetos em combinação com vetores de baculovírus podem ser usa- das também.

Em algumas modalidades preferidas, células hospedeiras mamí- feras são usadas para expressarem e produzirem os polipeptídeos anti- hPAR1 da presente invenção. Por exemplo, elas podem ser uma linhagem de célula de hibridoma que expressa genes de imunoglobulina endógena (por exemplo, os clones de hibridoma de mieloma, conforme descritos nos Exemplos) ou uma linhagem de célula mamífera que contém um vetor de expressão exógeno (por exemplo, as células de mieloma SP2/0 exemplifica- das abaixo). Essas incluem qualquer célula, animal ou humana, mortal nor- mal ou normal ou imortal anormal. Por exemplo, várias linhagens de células hospedeiras adequadas para secretar imunoglobulinas intactas foram de- senvolvidas, incluindo linhagens de célula CHO, linhagens de célula Cos, células HeLA1 linhagens de célula de mieloma, células B transformadas e hibridomas. O uso de cultura de célula tecidual mamífera para expressar polipeptídeos é discutido genericament em, por exemplo, Winnacker1 From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N. Y., 1987. Vetores de expressão para células hospedeiras mamíferas podem incluir seqüências de controle, tais como uma origem de replicação, um promotor, e um intensificador (vide, por exemplo, Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986), e sítios de infor- mação de processamento necessários, tais como sítios de ligação de ribos- somo, sítios de união de RNA, sítios de poliadenilação, e seqüências de terminador transcricional. Esses vetores de expressão contêm usualmente promotores derivados de genes mamíferos ou de vírus mamíferos. Promoto- res adequados podem ser constitutivos, específicos para o tipo de célula, específico do estágio, e/ou moduláveis ou reguláveis. Promotores úteis in- cluem, mas sem limitação, o promotor de metalotioneína, o promotor tardio principal do adenovírus constitutivo, o promotor de MPSV induzível por de- xametasona, o promotor de SV40, o promotor de MRPpollll, o promotor de MPSV constitutivo, o promotor de CMV induzível por tetraciclina (tal como o promotor de CMV precoce, imediato, humano), o promotor de CMV constitu- tivo, e combinações de promotor-intensificador conhecidas da técnica.

Métodos para introduzir vetores de expressão contendo as se- qüências de polinucleotídeos de interesse variam dependendo do tipo do hospedeiro celular. Por exemplo, transfecção com cloreto de cálcio é comu- mente utilizada para células procarióticas, ao passo que o tratamento com fosfato de cálcio ou eletroporação pode ser usado para outros hospedeiros celulares (vide geralmente Sambrook et a!., supra). Outros métodos incluem, por exemplo, eletroporação, tratamento com fosfato de cálcio, transformação mediada por lipossomo, injeção e microinjeção, métodos balísticos, virosso- mos, imunolipossomos, conjugados de policátion:acido nucléico, DNA nu, vírions artificiais, fusão à proteína estrutural do vírus do herpes VP22 (Elliot e 0'Hare, Cell 88:223, 1997), absorção intensificada por agente de DNA, e transdução ex vivo. Para a produção de alto rendimento e de longo prazo de proteínas recombinantes, a expressão estável será freqüentemente deseja- da. Por exemplo, linhagens de células que expressam estavelmente cadeias de anticorpo anti-hPAR1 ou fragmentos de ligação podem ser preparadas usando-se vetores de expressão da invenção, que contêm origens virais de elementos de replicação ou de expressão endógena e um gene marcador selecionável. Depois da introdução do vetor, a células podem ser deixadas crescerem por 1 a 2 dias em um meio enriquecido antes de serem transferi- das para meios seletivos. A finalidade do marcador selecionável é conferir resistência à seleção, e sua presença permite o crescimento de células que expressam com sucesso as seqüências introduzidas nos meios seletivos. Células transfectadas, estavelmente resistentes, podem ser proliferadas u- sando-se técnicas de cultura tecidual apropriada para o tipo de célula. 4. Propriedades de Anticorpos Anti-hPAR1 ou Moléculas Liqarv

tes de Antíqeno

Uma vez que um anticorpo anti-hPAR1 ou molécula Iigante de antígeno descrita acima seja sintetizada ou expressa de um vetor de expres- são em uma célula hospedeira ou de modo endógeno em um hibridoma, e- Ies podem ser prontamente purificados de, por exemplo, meios de cultura ou de células hospedeiras. Usualmente, as cadeias de anticorpos são expres- sas com seqüências de sinal e são assim liberadas para os meios de cultura. Contudo, se as cadeias do anticorpo não são naturalmente secretadas por células hospedeiras, as cadeias do anticorpo podem ser liberadas por trata- mento com detergente moderado. As cadeias do anticorpo podem ser então purificadas por métodos convencionais que incluem precipitação com sulfato de amônio, cromatografia por afinidade para alvo imobilizado, cromatografia em coluna, eletroforese em gel, e similares. Esses métodos são bem conhe- cidos e rotineiramente praticados na técnica, por exemplo, Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY1 1982; e Harlow & Lane, supra.

A título de exemplo, hibridomas selecionados que expressam anticorpos anti-hPAR1 da invenção podem ser crescidos em frascos com rotor para purificação de anticorpo monoclonal. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados por cromatografia de afinidade com colunas de proteína A-sefarose e proteína G-sefarose. Moléculas de IgG eluídas das colunas podem ser examinadas por eletroforese em gel e cromatografia Ii- quida de alto desempenho para assegurar pureza. A solução de tampão po- de ser trocada para PBS, e concentração pode ser determinada por leitura de OD280. Os anticorpos monoclonais podem ser formados em alíquotas e armazenados a -80°C.

Independente de seu modo de preparação, os anticorpos anti- hPAR1 ou moléculas Iigantes de antígeno da presente invenção se ligam especificamente ao hPAR1 ou a um fragmento antigênico deste. Ligação específica existe quando a constante de dissociação para o anticorpo que se liga ao hPAR1 ou fragmento antigênico deste é < 1 μΜ, preferivelmente <100 μΜ, e mais preferivelmente < 1 nM. A capacidade de um anticorpo de se ligar ao hPAR1 pode ser detectada por marcação do anticorpo de interes- se diretamente, ou o anticorpo pode estar não marcado e a ligação detecta- da indiretamente usando-se vários tipos de ensaio de sanduíche. Vide, por exemplo, Harlow & Lane, supra. Os anticorpos tendo tal especificidade de ligação têm probabilidade maior de compartilhar as propriedades vantajosas exibidas pelos anticorpos anti-hPAR1 de camundongo ou quiméricos discuti- dos nos Exemplos abaixo. Tipicamente, os anticorpos anti-PAR1 ou molécu- las Iigantes de antígeno se ligam a um polipeptídeo de PAR1 ou ao fragmen- to do antígeno com uma constante de associação de equilíbrio (Ka) de pelo menos 1 χ 107 M"1, 108 M"1, 109 M"1, ou 1010 M"1. Além disso, eles têm tam- bém uma constante de dissociação cinética (kd) de cerca de 1 χ 10~3 s~1, 1 χ 10~4 s"1, 1 χ IO"5 S1 ou menor, e se ligam ao PAR1 humano com uma afini- dade que é pelo menos duas vezes maior que sua afinidade para ligação a um antígeno não específico (por exemplo, BSA).

Em algumas modalidades, os anticorpos anti-hPAR1 ou molécu- la Iigante de antígeno da invenção bloqueiam ou competem com a ligação de um anticorpo anti-hPAR1 de referência a um polipeptídeo de hPAR1. O anticorpo anti-hPAR1 de referência pode ter seqüências de região variável da cadeia pesada ou da cadeia leve mostradas nas SEQ ID NOS:5 e 6 ou nas SEQ ID NOS:7 e 8, por exemplo, os anticorpos anti-PAR1 de camun- dongo ou quiméricos destes descritos nos Exemplos abaixo. Esses podem ser anticorpos anti-hPAR1 totalmente humanos, descritos acima. Eles po- dem ser também outros anticorpos anti-hPAR1 de camundongo, quiméricos ou humanizados, que se ligam ao mesmo epítopo como o anticorpo de refe- rência. A capacidade de bloquear ou competir com a ligação do anticorpo de referência ao hPAR1 indica que um anticorpo anti-hPAR1 ou molécula Iigan- te de antígeno em teste se liga ao mesmo epítopo ou similar àquele definido pelo anticorpo de referência, ou a um antígeno que está suficientemente proximal ao epítopo ligado pelo anticorpo anti-hPAR1 de referência. Tais anticorpos são especialmente prováveis de compartilhar as propriedades vantajosas identificadas para o anticorpo de referência. A capacidade de bloquear ou de competir com o anticorpo de referência pode ser determina- da, por exemplo, por um ensaio de ligação por competição. Com um ensaio de ligação por competição, o anticorpo de teste é examinado quanto à capa- cidade de inibir a ligação específica do anticorpo de referência para um antí- geno comum (por exemplo, um polipeptídeo de PAR1) ou epítopo sobre o antígeno. Um anticorpo de teste compete com o anticorpo de referência para ligação específica ao antígeno ou epítopo se um excesso do anticorpo de teste inibir substancialmente a ligação do anticorpo de referência. Inibição substancial significa que o anticorpo de teste reduz a ligação específica do anticorpo de referência em pelo menos 10%, 25%, 50%, 75%, ou 90%.

Existem numerosos ensaios de ligação de competição conheci- dos que podem ser usados para avaliação de competição de um anticorpo anti-hPAR1 de teste ou a molécula Iigante de antígeno com o anticorpo anti- hPAR1 quanto à ligação para o PAR1 humano. Esses incluem, por exemplo, radioimunoensaio (RIA) direto ou indireto em fase sólida, imunoensaio enzi- mático (EIA) direto ou indireto em fase sólida, ensaio de competição sanduí- che (vide Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253, 1983); EIA de bio- tina-avidina direto em fase sólida (vide Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614- 3619, 1986); ensaio marcado direto em fase sólida, ensaio sanduíche mar- cado, direto, em fase sólida (vide Harlow & Lane, supra); RIA, marcado, dire- to em fase sólida usando o marcador l-125(vide Morei et al., Molec. Immu- nol. 25:7-15, 1988); EIA direto de avidina-biotina em fase sólida (Cheung et al., Virology 176:546-552, 1990); e RIA direto marcado (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82, 1990). Tipicamente, tal ensaio envolve o uso de antígeno purificado ligado a uma superfície sólida ou células que contêm o antígeno, um anticorpo anti-PAR1 de teste não marcado e um anticorpo de referência marcado. A inibição competitiva é medida por determinação da quantidade de marcador ligado à superfície sólida ou células na presença do anticorpo de teste. Usualmente, o anticorpo de teste está presente em ex- cesso. Os anticorpos identificados por ensaio de competição (anticorpos competindo) incluem anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que o anti- corpo de referência, e os anticorpos que se ligam a um epítopo adjacente e suficientemente proximal ao epítopo ligado pelo anticorpo de referência para que o impedimento estérico ocorra.

Para determinar se um anticorpo anti-PAR1 de teste ou molécula Iigante de antígeno e um anticorpo anti-PAR1 de referência se ligam aos epítopos únicos, cada anticorpo pode ser biotinilado usando reagentes co- mercialmente disponíveis (por exemplo, reagentes de Pierce, Rockford, IL). Estudos de competição usando anticorpos monoclonais não marcados e an- ticorpos monoclonais biotinilados podem ser realizados usando placas ELI- SA revestidas com polipeptídeo de PAR1. Ligação de MAb biotinilado pode ser detectada com a sonda de estreptavidina-fosfatase alcalina. Para deter- minar o isótipo de um anticorpo anti-PAR1 purificado, ELISAs de isótipo po- dem ser realizados. Por exemplo, poços de placas de microtitulação podem ser revestido com 1 μg/mL de IgG anti-humano durante a noite, a 4°C. De- pois de bloqueio com BSA a 1%, as placas são reagidas com 1 μg/mL ou menos do anticorpo anti-hPAR1 monoclonal ou controles de isótipos purifi- cados, à temperatura ambiente por um ou duas horas. Os poços podem ser então reagidos com as sondas conjugadas de fosfatase alcalina específico de IgGI humano ou IgM humano. As placas são então reveladas e analisa- das de modo que o isótipo do anticorpo purificado pode ser determinado.

Para demonstrar a ligação dos anticorpos anti-hPAR1 monoclo- nais ou moléculas Iigantes de antígeno a células vivas que expressam um polipeptídeo de hPAR1, pode ser usada a citometria de fluxo. Em resumo, as linhagens de células que expressam hPAR1 (crescidas sob condições de crescimento padrão) podem ser misturadas com várias concentrações de um anticorpo anti-hPAR1 em PBS contendo BSA a 0,1% e soro de bezerro fetal a 10%, e incubadas a 37°C, por 1 hora. Depois da lavagem, as células são reagidas com o anticorpo IgG anti-humano marcado com fluoresceína sob as mesmas condições que a coloração do anticorpo primário. As amostras po- dem ser analisadas por instrumento FACScan usando luz e propriedades dispersoras laterais para penetrar nas células simples. Um ensaio alternativo usando microscopia de fluorescência pode ser empregado além de ou no lugar do ensaio de citometria de fluxo. As células podem ser coloridas con- forme descrição acima e examinadas por microscopia de fluorescência. Os anticorpos anti-hPAR1 da invenção podem ser ainda testa-

dos quanto à reatividade com um polipeptídeo de hPAR1 ou fragmento anti- gênico por imunomanchamento. Em resumo, polipeptídeos de hPAR1 purifi- cados ou proteínas de fusão, ou extratos celulares de células que expres- sam PAR1 podem ser preparados e submetidos a eletroforese em dodecil sulfato de sódio-gel de poliacrilamida. Depois da eletroforese, os antígenos separados são transferidos para as membranas de nitrocelulose, bloqueados com soro de bezerro fetal a 10%, e explorados com os anticorpos monoclo- nais a serem testados. A ligação de IgG humana pode ser detectada usando fosfatase alcalina de IgG anti-humana e revelada com comprimidos de subs- trato de BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).

5. Aplicações Terapêuticas e Composições Farmacêuticas Os anticorpos anti-hPAR1 ou moléculas Iigantes de antígeno descritos aqui podem ser empregados em muitas aplicações terapêuticas ou profiláticas por inibição das atividades de sinalização de PAR1. Em aplica- ções terapêuticas, uma composição que compreende um anticorpo antago- nista anti-hPAR1 ou molécula Iigante de antígeno (por exemplo, um anticor- po anti-hPAR1 humanizado) é administrada a um paciente já afetado por uma doença ou condição mediada, causada ou associada à sinalização de PAR1. A composição contém o anticorpo ou molécula Iigante de antígeno em uma quantidade suficiente para inibir, parcialmente interromper, ou ace- lerar detectavelmente a progressão da condição, e suas complicações.

Em aplicações profiláticas, as composições contendo os anticor- pos anti-hPAR1 ou moléculas Iigantes de antígeno são administradas a um paciente não que não esteja ainda sofrendo de um distúrbio relacionado à sinalização de PAR1. Mais especificamente, elas são direcionadas a um pa- ciente que está em risco de, ou tem uma predisposição de, desenvolver tal distúrbio. Tais aplicações permitem que o paciente aumente a resistência do paciente ou retarde a progressão de um distúrbio mediado por sinalização do PAR1.

Numerosas condições de doença são mediadas por sinalização intracelular mediada por PAR1 aberrante e anormalmente alta. Sinalização intracelular mediada por PAR1 anormalmente alta pode se causada, por e- xemplo, por exposição de o receptor às concentrações anormalmente altas de uma protease ativadora (por exemplo, trombina) ou níveis de expressão anormalmente altos de PAR1 na superfície da célula. A inibição de PAR1 é de ajuda no tratamento de distúrbios proliferativos trombóticos e vasculares bem como na inibição de progressão de cânceres, Vide, por exemplo, Dar- moul, et al., Mol Câncer Res (2004) 2(9):514-22 e Salah, et al, Mol Câncer Res (2007) 5(3):229-40. A inibição de PAR1 tem também uso na prevenção ou inibição dos distúrbios inflamatórios intestinais crônicos (IBD), síndrome do intestino irritável (IBS) e colite ulcerativa; e distúrbios fibróticos, incluindo fibrose do fígado e fibrose do pulmão. Vide, por exemplo, Vergnolle1 et al., J Clin Invest (2004) 114(10):1444; Yoshida, et al, Aliment Pharmacol Ther (2006) 24(Suppl 4):249; Mercer, et al., Ann NYAcad Sci (2007) 1096:86-88; Sokolova e Reiser, Pharmacol Ther (2007) PMID: 17532472.

Cânceres que podem ser inibidos ou prevenidos pelos anticor- pos anti-PAR1 ou moléculas Iigantes de antígeno da invenção incluem, sem limitação, cânceres epiteliais incluindo carcinomas; gliomas, mesoteliomas, melanomas, linfomas, leucemias, adenocarcinomas, câncer da mama, cân- cer do ovário, câncer cervical, glioblastoma, leucemia, linfoma, câncer da próstata, e linfoma de Burkitt, câncer da cabeça e do pescoço, câncer do cólon, câncer colorretal, câncer do pulmão de não pequena célula, câncer do pulmão de pequena célula, câncer do esôfago, câncer do estômago, câncer pancreático, câncer hepatobiliar, câncer da vesícula biliar, câncer do intesti- no delgado, câncer retal, câncer do rim, câncer da bexiga, câncer da prósta- ta, câncer do pênis, câncer da uretra, câncer dos testículos, câncer cervical, câncer vaginal, câncer uterino, câncer do ovário, câncer da tireóide, câncer da paratireóide, câncer adrenal, câncer endócrino pancreático, câncer carci- nóide, câncer do osso, retinoblastomas, mielomas múltiplos, linfoma de Hodgkin e linfoma de não Hodgkin (vide, CANCER:PRINCIPLES AND PRACTICE (DeVita, V.T. et al. Edição de 1997) para cânceres adicionais).

Inibição do PAR1 também é útil na prevenção ou inibição das condições de doença que podem ser ou não mediadas por expressão de PAR1 aberrante ou anormalmente alta ou sinalização intracelular. Por e- xemplo, inibição do PAR1 é útil na prevenção ou inibição da lesão por is- quemia-reperfusão, incluindo isquemia-reperfusão do miocárdio, renal, cere- bral e intestinal. Vide, por exemplo, Strande, et al., Basic Res. Cardiol (2007) 102(4):350-8; Sevastos, et al., Blood (2007) 109(2):577-583; Junge1 et al., Proc Natl Acad Sci USA. (2003) 100(22): 13019-24 e Tsuboi, et al., Am J Physiol Gastrointest LiverPhysioI (2007) 292(2):G678-83. A inibição da sina- lização intracelular de PAR1 pode ser também usada para inibir infecção de células por vírus do herpes simples (HSV1 e HSV2). Vide, Sutherland, et al., J Thromb Haemost (2007) 5(5): 1055-61.

A invenção proporciona composições farmacêuticas que com- preendem os anticorpos anti-hPAR1 ou moléculas Iigantes de antígeno for- muladas juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável. As com- posições podem conter adicionalmente outros agentes terapêuticos que são adequados para o tratamento ou a prevenção de um dado distúrbio. Veícu- los farmaceuticamente aceitáveis melhoram ou estabilizam a composição, ou facilitam a preparação da composição. Veículos farmaceuticamente acei- táveis incluem solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes anti- bacterianos ou antifúngicos, agentes isotônicos, e agentes retardadores de absorção, e similares, os quais são fisiologicamente compatíveis.

Uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada por uma variedade de métodos conhecidos da técnica. A via e/ou modo de administração variam dependendo dos resultados desejados. É preferido que a administração seja intravenosa, intramuscular, intraperito- neal, ou subcutânea, ou administração proximal ao sítio do alvo. O veículo farmaceuticamente aceitável deve ser adequado para administração intrave- nosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinal ou epidérmica (por e- xemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo, isto é, anticorpo, molécula biespecífica ou multiespecífica, pode ser revestido de um material para proteger o composto da ação dos ácidos e de outras condições naturais que podem inativar o composto.

Em algumas modalidades, a composição é estéril ou fluida. A fluidez própria pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Em muitos casos, é preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tal como manitol ou sorbitol, e cloreto de sódio na composição. Absorção de longo prazo das composições injetáveis pode ser efetuada por inclusão na composição de um agente que retarde a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio ou gelatina.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser prepara- das de acordo com os métodos conhecidos e rotineiramente praticados na técnica. Vide, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Phar- macy, Mack Publishing Co., 20a Edição, 2000; e Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., New York, 1978. As composições farmacêuticas são preferivelmente fabri- cadas sob condições GMP. Tipicamente, uma dose terapeuticamente eficaz ou efetiva do anticorpo anti-hPAR1 é formulada em formas de dosagem far- maceuticamente eficazes por métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Regimes de dosagem são ajustados para proporcionar a resposta desejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um bolo único pode ser administrado, várias doses divididas podem ser adminis- tradas com o tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou au- mentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É es- pecialmente vantajoso formular composições parenterais em forma unitária de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma unitária de dosagem conforme usada aqui se refere a unidades fisi- camente separadas como dosagens unitárias para os pacientes a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada do compos- to ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico requerido.

Níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composi- ções farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a se obter uma quantidade do ingrediente ativo desejado que seja eficaz para obter a resposta terapêutica desejada para um particular paciente, composi- ção, e modo de administração, sem ser tóxica para o paciente. O nível de dosagem selecionado depende de uma variedade de fatores farmacocinéti- cos incluindo a atividade das composições particulares empregadas da pre- sente invenção, ou o éster, sal ou amida deste, da via de administração, do tempo de administração, da taxa de excreção do composto particular que está sendo empregado, da duração do tratamento, de outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições par- ticulares empregadas, da idade, sexo, peso, condição, saúde geral e históri- co médico anterior do paciente que está sendo tratado e fatores similares. Um médico ou veterinário pode iniciar doses dos anticorpos da

invenção empregados na composição farmacêutica em níveis inferiores à- queles requeridos para alcançar o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até que o efeito desejado seja atingido. Em geral, doses eficazes das composições da presente invenção variam dependendo de muitos fatores diferentes, incluindo a doença ou condição específica a ser tratada, meios de administração, sítio alvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente é um ser humano ou um animal, outras medicações administra- das e se o tratamento é profilático ou terapêutico. As dosagens de tratamen- to precisam ser tituladas para otimizar a segurança e eficácia. Para adminis- tração com um anticorpo, a dosagem varia de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e mais usualmente de 0,01 a 5 mg/kg, do peso corpóreo do recipiente. Por exemplo, as dosagens podem ser de 1 mg/kg de peso corpóreo ou 10 mg/kg de peso corpóreo ou dentro da faixa de 1 a 10 mg/kg. Um regime de trata- mento exemplar possibilita a administração uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês e uma vez a cada 3 a 6 meses.

O anticorpo é usualmente administrado em ocasiões múltiplas. Os intervalos entre as dosagens simples podem ser semanais, mensais, ou anuais. Os intervalos podem ser também irregulares conforme indicados por medição dos níveis no sangue do anticorpo anti-hPAR1 no paciente. Em al- guns métodos, a dosagem é ajustada para obtenção de um concentração plasmática do anticorpo de 1 a 1.000 μg/mL e em alguns métodos de 25 a 300 μg/mL. Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado como uma formulação de liberação constante, em cujo caso administração menos fre- qüente é requerida. A dosagem e freqüência variam dependendo da meia- vida do anticorpo no paciente. Em geral, os anticorpos humanizados mos- tram uma meia-vida mais longa que aquela dos anticorpos quiméricos e dos anticorpos não humanos. A dosagem e freqüência de administração podem variar dependendo se o tratamento é profilático ou terapêutico. Nas aplica- ções profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em inter- valos relativamente não freqüentes durante um longo período de tempo. Al- guns pacientes continuam a receber o tratamento para o resto de suas vi- das. Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta em inter- valos relativamente curtos é algumas vezes requerida até que a progressão da doença seja reduzida ou terminada, e preferivelmente até que o paciente mostre alívio parcial ou completo dos sintomas da doença. Depois disso, ao

paciente pode ser administrado um regime profilático.

EXEMPLOS

Os exemplos seguintes são proporcionados para ainda ilustrar a invenção, mas não para limitar o seu escopo. Outras variantes da invenção tornar-se-ão prontamente aparentes para aquele com conhecimento ordiná- rio da técnica e são englobados pelas reivindicações apensas. Exemplos 1 Desenvolvimento de anticorpos antaqonistas de anti-hPAR1 de camundonqo

Este Exemplo descreve o desenvolvimento de anticorpos anta- gonistas anti-hPAR1 de camundongo. Camundongos Bc12 Wehi22 foram imunizados com PAR1 humano (AA #27-102)/proteína de fusão tiorredoxina. A imunização foi efetuada 8 vezes durante 18 dias. As células B foram isola- das de Iinfonodos periféricos e fundidas às células de mieloma FO (ATCC, Manassas, VA). A produção de anticorpos foi selecionada por ELISA contra hPAR1/proteína de fusão tiorredoxina. Dez clones totais foram produzidos, os quais produzem anticorpos que reconhecem especificamente hPAR1. A ligação dos anticorpos hPAR1 ao PAR1 da superfície celular foi analisada usando ELISA de células em células HT29 (positivas para PAR1) e células colo205 (negativas para PAR1). Em resumo, as células foram incubadas com sobrenadantes de cultura de hibridoma seguido por IgG anti- camundongo conjugado a HRP. Substrato TMB (KPL, Gaithersburg, MD) foi adicionado, 20 minutos depois os poços foram acidificados com ácido sulfú- rico (2N) e a cor foi medida em 450 nm. Os resultados mostraram que 5 clo- nes de hibridoma de 10 clones foram capazes de se ligarem ao receptor da superfície celular.

O anticorpo monoclonal (mAb) de cada um dos clones positivos para ligação celular foi purificado. Em resumo, meio condicionado isento de soro foi purificado sobre resina de Proteína G (Amersham Biosciences, Pis- cataway, NJ). Além disso, os 10 clones produtores de anticorpo foram sub- clonados por diluição limitativa, e os clones resultantes foram avaliados quanto à ligação ao PAR1 via ELISA e ELISA de célula. Os subclones fun- cionais foram também avaliados quanto à funcionalidade conforme descrição abaixo.

Um ensaio de fluxo de cálcio dependente de hPAR1 foi empre- gado para selecionar anticorpos antagonistas de hPAR1 funcionais. Trombi- na é conhecida por clivar o domínio N-terminal de PAR1, removendo apro- ximadamente 15 aminoácidos. O domínio N-terminal remanescente, referido como o Iigante preso, é responsável pela iniciação da sinalização mediada por PAR1. Essa clivagem do PAR-1 por trombina que resulta em um fluxo de cálcio rápido e transitório nas células pode ser medida usando os reagentes comercialmente disponíveis (Molecular Devices). Especificamente, os anti- corpos purificados foram avaliados em células HT-29, HCT-116 e DU145 quanto a sua capacidade de inibir o fluxo de cálcio depois do tratamento com trombina. As células em corante FIipR (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) foram pré-incubadas com anticorpos purificados com proteína G por 1 hora, e o fluxo de Ca2+ foi induzido com trombina em várias concentrações. Os resultados indicam que um subclone de cada um dos dois clones (4E7.H14 & 6E11-H6) mostram forte atividade antagonista. O ensaio FIipR foi também realizado nos clones funcionais usando ambas as células DU 145 e HCT116. Ambas as linhagens de células confirmaram a atividade dos antagonistas de anticorpos funcionais.

De modo a avaliar o mecanismo dos antagonistas, os anticorpos foram também examinados quanto à sua capacidade de se ligar ao receptor PA1 depois da clivagem por trombina. O PAR1/tiorredoxina foi clivado até a completude com trombina. Depois da neutralização da trombina, uma porção igual de PAR1 de comprimento inteiro/tiorredoxina foi adicionada. Os anti- corpos foram ligados à Proteína G, e os anticorpos imobilizados foram usa- dos para imunoprecipitar a mistura de PAR1 clivado/de comprimento inteiro- proteína de fusão. A resina foi isolada, lavada, e as proteínas capturadas identificadas por SDS-PAGE. Três dos clones avaliados foram capazes de se ligarem à porção de PAR1 adjacente à proteína de fusão tiorredoxina, incluindo os dois clones funcionais 4E7 e 6E11. Esse domínio de PAR1 é representativo do Iigante preso que permanece sobre a superfície da célula depois da clivagem da trombina. Os resultados indicam também que os anti- corpos que bloquearam a clivagem da trombina do PAR1, mas falharam na ligação ao Iigante preso, eram muito menos potentes nos ensaios FlipR. As- sim, parece que a ligação ao Iigante preso é necessária, embora não sufici- ente para atividade funcional.

Regiões das duas cadeia pesada (VH) e cadeia leve (VL) do an- ticorpo funcional foram clonadas por RT-PCR. Seqüências dos iniciadores usados para identificação de regiões variáveis das cadeias pesadas e leves para ambos os clones (4E7.J14.L16 & 6E11.H6.A9) era iguais e são como a seguir. Os iniciadores para VH são: (1)

HV1:GGGTCTAGACACCATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT (SEQ ID NO:33) e (2) Constante H: GCGTCTAGAAYCTCCACACACAGGRRCCAG TGGATAGAC (SEQ ID NO:34). Iniciadores para VL são: (1) LV5: GGGTC- TAGACACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGDNA (SEQ ID NO:35) e (2) Constante L: GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG (SEQ ID NO:36).

Em resumo, RNA total foi isolado. RT-PCR foi efetuada com ini- ciadores de avanço contra seqüência de sinal das regiões variáveis da ca- deia pesada ou leve. Produtos da PCR foram clonados em pCR Il ou pcD- NA3.1A/5-His-TPOP-TA para sequenciamento. Seqüências de polinucleotí- deos das seqüências de regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia le- ve destes clones de anticorpos foram então determinadas (Figura 1). As se- qüências de aminoácidos das regiões variáveis são mostradas na figura 2. Estão também indicadas na figura 2 as regiões de CDR e as regiões de es- truturas deduzidas de acordo com o sistema de numeração de Kabat et al., supra.

Exemplo 2 Geração de anticorpos anti-hPAR1 quiméricos

Este Exemplo descreve a geração e caracterização dos anticor- pos anti-hPAR1 quiméricos. Os anticorpos quiméricos contêm regiões variá- veis do anticorpo anti-hPAR1 de camundongo mencionado acima e as regi- ões constantes das imunoglobulinas.

Para a geração dos anticorpos quiméricos, as regiões variáveis do anticorpo de camundongo contra o clone de PAR1 humano foram resub- metidas à PCR com iniciadores projetados para clonagem em vetores de cassete. Elas foram então clonadas respectivamente em vetores de cassete que contêm fusões na estrutura (in-frame) com seqüência líder de imunoglo- bulina humana, segmentos J e sinais doadores de splicer. As seqüências foram então transferidas para vetores de expressão de mamíferos contendo região constante de imunoglobulina humana, seleção de neomicina na ca- deia pesada, seleção de dhfr na cadeia leve, e amplificação de gene usando metotrexato.

Plasmídeos de DNA de cadeia pesada e cadeia leve capa de IgG humana fora coeletroporadas em células de mieloma SP2/0. As células foram selecionadas com geneticina, e então cultivadas e expandidas em meio de crescimento contendo geneticina e metotrexato. As células foram adaptadas para meio isento de soro para purificação do anticorpo. Anticor- pos de IgGI quiméricos secretados das células SP2/0 foram purificados. A atividade antagonista dos anticorpos de IgGI quiméricos podem ser similar- mente examinados no ensaio FIipR como os anticorpos anti-hPAR1 de ca- mundongo. O teste podia revelar que os anticorpos anti-hPAR1 quiméricos exibem atividade antagonista similar como àquela do anticorpo de IgGI hu- mana.

Exemplo 3 Anticorpo anti-hPAR1 exibe secrecão de IL-8 mediada por trom- bina

Este Exemplo descreve a inibição da secreção de IL-8 mediada por trombina de HUVECs pelos anticorpos antagonistas anti-hPAR1. As cé- lulas foram expostas à trombina durante a noite, que resultou na elevação da IL-8 secretada nos meios. Os anticorpos foram adicionados 1 hora antes do tratamento com trombina. Os resultados conforme medidos por ELISA são mostrados na figura 3. Conforme demonstrado na figura, os dois anticorpos anti-hPAR1 de camundongo foram capazes de inibirem o aumento da secre- ção de IL-8 das HUVECs que foram tratadas com trombina. É entendido que os exemplos e as modalidades descritas aqui

são para fins tão-somente ilustrativos e que várias modificações ou altera- ções à luz destes serão sugeridas para aqueles versados na técnica e de- vem ser incluídas no espírito e no limites desta invenção e escopo das rei- vindicações apensas. Todas as publicações, patentes, e pedidos de patente citados são aqui incorporados a título de referência na íntegra para todos os propósitos. Listagem de seqüência

<110> Cohen, Steve B. Nasoff, Marc IRM LLC

<120> Antagonistas de receptor-1 ativado por protease (PARI) <130> 021288-005510PC

<140> WO PCT/US07/Nenhum já desligado

<141> Nenhum já desligado

<150> US 60/831,800

<151> 2006-07-18

<150> US 11/778,924

<151> 2007-07-17

<160> 38

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

<211> 360

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220> <223>

clone 4E7.J14.L16 da região variável de cadeia longa de anti-corpo antihumano de receptor-1 ativado por protease ((PARI)

<4 00> 1

gaggtccagc

tcctgtgagg

catggaaaga

aaccagatgt

atggagctca

ggtccatccc

tgcaacagtc cttctggata gccttgagtg tcaagggcaa acaacctgac actggtactt

tggacctgtg cacattcact gattggagtt ggccacaatg atctaaagac cgatgtctgg

ctggtgaagc gactactata attgatcctc actgttgaca tctgcagtct ggcacaggga

ctggggcttc tgaactgggt acaacggccg agtcctccag attactgtgc ccacggtcac

agtgaagatg 60 gaagcagagc 120 ttctaggtac 180 cacagcctac 240 aagcgatgat 300 cgtctcctca 360

<210> 2

<211> 336

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<223> clone 4E7.J14.L16 da região variável de cadeia curta de anticorpo antihumano de receptor-1 ativado por protease (PARI)

<400> 2

gatgttttga tgacccaaac tccactctcc atctcttgca gatctagtca gaacattgta tacctgcaga caccaggcca gtctccaaag tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt agcagagtgg aggctgagga tctgggaatt ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa

ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120 ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 tattactgtt ttcaaggttc acatgttcca 300 ataaaa 336

<210> 3

<211> 350

<212> DNA

<213> Mus musculus <22 0>

<223> clone 6Ε11.Η6.Α9 da região variável de cadeia longa de anti-corpo antihumano de receptor-1 ativado por protease ((PARI)

<4 00> 3

caggttcagc tgcaacagtc tgacgctgag ttggtgaaac ctggagcttc agtgaagata 60

tcctgcaagg tttctggcta caccttcact gaccatactt ttcactggat gaatcagagg 120

cctggacagg gcctggaatg gattggatat atttttccta gagatggtag tactaagtac 180

aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcagctca gcagcctaac gtctgtggac tctgcagtct atttctgtgc aagccattac 300

tacggtagtt 'ttgagtactg gggccaaggc accactctca cagtcgcctc 350

<210> 4

<211> 336

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<223> clone 6E11.H6.A9 da região variável de cadeia curta de anticorpo antihumano de receptor-1 ativado por protease (PARI)

<400> 4

gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc atctcttgca gatctagtca gagccttgta tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag

ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120

ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180

ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

tatttctgct ctcaaagtac acatcttccg 300 ctgaaa 336

<210> 5

<211> 120

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<223> clone 4E7.J14.L16 da região variável de cadeia longa de anti-corpo antihumano de receptor-1 ativado por protease ((PARI)

<4 00> 5

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Gly Ala 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 40 45

Gly Val Ile Asp Pro His Asn Gly Arg Ser Arg Tyr Asn Gln Met Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Asn Asn Leu Thr Ser Lys Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Ser Asp Asp Gly Pro Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr 100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6

<211> 112

<212> PRT

<213> Mus musculus

<22 0>

<223> clone 4E7.J14.L16 da região variável de cadeia curta de anticorpo antihumano de receptor-1 ativado por protease (PARI)

<400> 6

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Thr Pro Gly Gln Ser 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95

Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 7

<211> 116

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<223> clone 6E11.H6.A9 da região variável de cadeia longa de anti—corpo antihumano de receptor-1 ativado por protease ((PARI)

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His 25 30

Thr Phe His Trp Met Asn Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 40 45

Gly Tyr Ile Phe Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Ser His Tyr Tyr Gly Ser Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110

Leu Thr Val Ala 115 <210> 8

<211> 112

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<223> clone 6Ε11.Η6.Α9 da região variável de cadeia curta de anticorpo antihumano de receptor-1 ativado por protease (PARI)

<400> 8

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95

Thr His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 HO

<210> 9

<211> 15

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Descrição da seqüência artificial: clone 4E7. J14. L16 da região variável de cadeia longa de anticorpo antihumano de receptor-1 (PARI) ativado por protease complementário do determinante da região 1 (CDRl)

<400> 9

gactactata tgaac 15

<210> 10

<211> 51

<212> DNA

<213> Seqüência

artificial

<220>

<223> Descrição da seqüência artificial: clone 4E7. J14. L16 da região variável de cadeia longa de anticorpo antihumano de receptor-1 (PARI) ativado por protease complementário do determinante da região 2 (CDR2)

<4 00> 10

gttattgatc ctcacaacgg ccgttctagg tacaaccaga tgttcaaggg c 51

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: clone 4E7 . J14. L16 da região variável de cadeia longa de anticorpo antihumano de receptor-1 (PARI) ativado por protease complementário do determinante da região 3 (CDR3)

<400> 11

gatgatggtc catcccactg gtacttcgat gtc 33

<210> 12

<211> 48

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Descrição da seqüência artificial: clone 4E7.J14.L16 da região variável de cadeia curta de anticorpo antihumano de receptor-1

(PARI)ativado por protease complentária ao determinante da região 1 (CDRl)

<4 00> 12

agatctagtc agaacattgt acatagtaat ggaaacacct atttagaa 48

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<22 0>

<223> Descrição da seqüência artificial: clone 4E7.J14.L16 da região variável de cadeia curta de anticorpo antihumano de receptor-1

(PARI)ativado por protease complentária ao determinante da região 2 (CDR2)

<4 00> 13

aaagtttcca accgattttc t 21

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Descrição da seqüência artificial: clone 4E7.J14.L16 da região variável de cadeia curta de anticorpo antihumano de receptor-1 (PARI)ativado por protease complentária ao determinante da região 3 (CDR3)

<4 00> 14

tttcaaggtt cacatgttcc attcacg 27

<210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Descrição da seqüência

variável de cadeia longa de anticorpo antihumano de receptor-1 (PARI) ativado por protease complementário do determinante da região 1 (CDRl) <4 00> 15 gaccatactt ttcac

15

<210> 16

<211> 51

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220> <223>

Descrição da seqüência artificial: clone 6E11.H6.A9 da região variável de cadeia longa de anticorpo antihumano de receptor-1 (PARI) ativado por protease complementário do determinante da região 2 (CDR2)

<4 00> 16

tatatttttc ctagagatgg tagtactaag tacaatgaga agttcaaggg c

51

<210> 17 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: clone 6E11.H6.A9 da região variável de cadeia longa de anticorpo antihumano de receptor-1 (PARI) ativado por protease complementário do determinante da região 3 (CDR3)

<4 00> 17

cattactacg gtagttttga gtac 24

<210> 18 <211> 48 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: clone 6E11.H6.A9 da região variável de cadeia curta de anticorpo antihumano de receptor-1 (PARI)ativado por protease complentária ao determinante da região 1 (CDRl)

<4 00> 18

agatctagtc agagccttgt acacagtaat ggaaacacct atttacat 48

<210> 19 <211> 21 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: clone 6E11.H6.A9 da região variável de cadeia curta de anticorpo antihumano de receptor-1 (PARI)ativado por protease complentária ao determinante da região 2 (CDR2)

<4 00> 19

aaagtttcca accgattttc t 21

<210>

20 <211> 27 <212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220> <223>

Descrição da seqüência artificial: clone 6E11.H6.A9 da região variável de cadeia curta de anticorpo antihumano de receptor-1 (PARI)ativado por protease complentária ao determinante da região 3 (CDR3)

<400> 20

tctcaaagta cacatcttcc gctcacg

27

<210> 21 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: clone 4E7.J14.L16 da região variável de cadeia longa de anticorpo antihumano de receptor-1 (PARI) ativado por protease complementário do determinante da região 1 (CDRl)

<4 00> 21 Asp Tyr Tyr Met Asn 1 5

<210> 22 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: clone 4E7.J14.L16 da região variável de cadeia longa de anticorpo antihumano de receptor-1 (PARI) ativado por protease complementário do determinante da região 2 (CDR2)

<4 00> 22

Val Ile Asp Pro His Asn Gly Arg Ser Arg Tyr Asn Gln Met Phe Lys 10 15

Gly

<210> 23

<211> 11

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220> <223>

Descrição da seqüência artificial: clone 4E7.J14.L16 da região variável de cadeia longa de anticorpo antihumano de receptor-1 (PARI) ativado por protease complementário do determinante da região 3 (CDR3)

<4 00> 23

Asp Asp Gly Pro Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10

<210> 24 <211> 16 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: clone 4E7.J14.L16 da região variável de cadeia curta de anticorpo antihumano de receptor-1 (PARI)ativado por protease complentária ao determinante da região 1 (CDRl)

<400> 24

Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 10 15

<210> 25 <211> 7 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: clone 4E7.J14.L16 da região variável de cadeia curta de anticorpo antihumano de receptor-1 (PARI)ativado por protease complentária ao determinante da região 2 (CDR2)

<400> 25

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5

ião

<210> 26 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: clone 4E7.J14.L16 da regií variável de cadeia curta de anticorpo antihumano de receptor-1 (PARI)ativado por protease complentária ao determinante da região 3 (CDR3)

<400> 26

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr 1 5

<210> 27 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: clone 6E11.H6.A9 da região variável de cadeia longa de anticorpo antihumano de receptor-1 (PARI) ativado por protease complementário do determinante da região 1 (CDRl)

<4 00> 27 Asp His Thr Phe His 1 5

<210> 28

<211> 17

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: clone 6E11.H6.A9 da região variável de cadeia longa de anticorpo antihumano de receptor-1 (PARI) ativado por protease complementário do determinante da região 2 (CDR2)

<4 00> 28

Tyr Ile Phe Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 10 15

Gly

<210> 29 <211> 8 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: clone 6E11.H6.A9 da região variável de cadeia longa de anticorpo antihumano de receptor-1 (PARI) ativado por protease complementário do determinante da região 3 (CDR3)

<4 00> 29

His Tyr Tyr Gly Ser Phe Glu Tyr 1 5

<210> 30 <211> 16 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: clone 6E11.H6.A9 da região variável de cadeia curta de anticorpo antihumano de receptor-1 (PARI)ativado por protease complentária ao determinante da região 1 (CDRl)

<400> 30

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His 10 15

<210> 31 <211> 7 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Descrição da seqüência artificial: clone 6E11.H6.A9 da região variável de cadeia curta de anticorpo antihumano de receptor-1 (PARI)ativado por protease complentária ao determinante da região 2 (CDR2)

<4 00> 31

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 32

<211> 9

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: clone 6E11.H6.A9 da região variável de cadeia curta de anticorpo antihumano de receptor-1 (PARI)ativado por protease complentária ao determinante da região 3 (CDR3)

<400> 32 Ser Gln Ser Thr His 1 5

Leu Pro Leu Thr

<210> 33

<211> 39

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Iniciador HVl da região variável de cadeia longa (VH) de RT-PCR

<4 00> 33

gggtctagac accatggrat gsagctgkgt matsctctt 39

<210> 34

<211> 39

<212> DNA

<213> Seqüência

artificial

<220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Iniciador LV5 da região variável de cadeia curta (VL) de RT-PCR

<4 00> 34

gcgtctagaa yctccacaca caggrrccag tggatagac 39

<210> 35

<211> 40

<212> DNA

<213> Seqüência

artificial

<220>

<223> Descrição da seqüência artificial:: iniciador LV5 da região variável de cadeia curta (VL) de RT-PCR

<220>

<221> base modificada <222> (39)

<223> η = g, a, c or t <4 00> 35

gggtctagac accatgaagt tgcctgttag gctgttgdna 40

<210> 36

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Iniciador L-contante da região constante de cadeia curta de RT-PCR <400> 36

gcgtctagaa ctggatggtg ggaagatgg 29

<210> 37

<211> 6

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: novo N-terminal PARI após remoção da porção do domínio extra celular N-terminal proteolítico

<4 00> 37

Ser Phe Leu Leu Arg Asn 1 5

<210> 38

<211> 27

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> Descrição da seqüência artificial: anticorpo anti-PARl ou epítopo de molécula ligante de antigeno sem ligante PARI preso ao N-terminal

<4 00> 38

Ser Phe Leu Leu Arg Asn Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp Glu 10 15

Asp Glu Glu Lys Asn Glu Ser Gly Leu Thr Glu 25

Claims (38)

1. Anticorpo ou molécula Iigante de antígeno que se liga especi- ficamente a um epítopo de PAR1 humano, em que o epítopo compreende a seqüência de aminoácidos SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE (SEQ ID N0: 38), e em que o anticorpo ou molécula Iigante de antígeno é um anta- gonista de PAR1.

2. Anticorpo ou molécula Iigante de antígeno, de acordo com a reivindicação 1, que compreende uma seqüência de região determinante de complementaridade (CDR) de cadeia pesada de SEQ ID N0: 21, SEQ ID N0: 22 ou SEQ ID N0: 23 ou uma seqüência de CDR de cadeia leve de SEQ ID N0: 24, SEQ ID N0: 25, ou SEQ ID N0: 26.

3. Anticorpo ou molécula Iigante de antígeno, de acordo com a reivindicação 1, que compreende seqüências de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada, SEQ ID N0: 21, SEQ ID N0: 22 e SEQ ID N0: 23, respectiva- mente; e seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia leve, SEQ ID N0: 24, SEQ ID N0: 25, e SEQ ID N0: 26, respectivamente.

4. Anticorpo ou molécula Iigante de antígeno, de acordo com a reivindicação 1, que compreende uma seqüência de região determinante de complementaridade (CDR) de cadeia pesada de SEQ ID N0: 27, SEQ ID N0: 28 ou SEQ ID N0: 29; ou uma seqüência de CDR de cadeia leve de SEQ ID N0: 30, SEQ ID N0: 31, ou SEQ ID N0: 32.

5. Anticorpo ou molécula Iigante de antígeno, de acordo com a reivindicação 1, que compreende seqüências de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada, SEQ ID N0: 27; SEQ ID N0: 28, e SEQ ID N0: 29, respectiva- mente; e seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia leve, SEQ ID N0: 30, SEQ ID N0: 31, e SEQ ID N0: 32, respectivamente.

6. Anticorpo ou molécula Iigante de antígeno, de acordo com a reivindicação 1, que compreende (i) uma seqüência de aminoácidos da regi- ão variável da cadeia pesada que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID N0: 5 e uma seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia leve que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID N0: 6, ou (ii) um seqüência de aminoáci- dos da região variável da cadeia pesada que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID N0: 7 e uma seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia leve que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID N0: 8.

7. Anticorpo ou molécula Iigante de antígeno, de acordo com a reivindicação 1, que compreende (i) uma seqüência de aminoácidos da regi- ão variável da cadeia pesada de SEQ ID N0: 5 e uma seqüência de aminoá- cidos da região variável da cadeia leve SEQ ID N0: 6, ou (ii) um seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de SEQ ID N0: 7 e uma seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de SEQ ID N0:8.

8. Anticorpo ou molécula Iigante de antígeno, de acordo com a reivindicação 1, que é um anticorpo de camundongo.

9. Anticorpo ou molécula Iigante de antígeno, de acordo com a reivindicação 1, que é um anticorpo monoclonal.

10. Anticorpo ou molécula Iigante de antígeno, de acordo com a reivindicação 1, que é um anticorpo quimérico.

11. Anticorpo ou molécula Iigante de antígeno, de acordo com a reivindicação 10, que compreende uma região constante da cadeia pesada humana e uma região constante da cadeia leve humana.

12. Anticorpo ou molécula Iigante de antígeno, de acordo com a reivindicação 1, que é um anticorpo humanizado.

13. Anticorpo ou molécula Iigante de antígeno, de acordo com a reivindicação 1, que é um anticorpo humano.

14. Anticorpo ou molécula Iigante de antígeno, de acordo com a reivindicação 1, que é um anticorpo simples.

15. Anticorpo ou molécula Iigante de antígeno, de acordo com a reivindicação 1, que é um fragmento Fab.

16. Anticorpo ou molécula Iigante de antígeno, de acordo com a reivindicação 1, que é um monocorpo com uma estrutura temporária deriva- do de um domínio tipo Ill de fibronectina humana.

17. Polinucleotídeo isolado ou recombinante, que codifica um anticorpo ou molécula Iigante de antígeno que se liga especificamente a um epítopo de PAR1 humano, em que o epítopo compreende a seqüência de aminoácidos SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE (SEQ ID N0: 38), e em que o anticorpo ou molécula Iigante de antígeno é um antagonista de PAR1.

18. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 17, em que o anticorpo ou molécula Iigante de antígeno é um anticorpo humano.

19. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 17, em que o anticorpo ou molécula Iigante de antígeno compreende (i) seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia pesada, SEQ ID N0: 21, SEQ ID N0: 22 e SEQ ID N0: 23, respectivamente; e seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia leve, SEQ ID N0: 24, SEQ ID N0: 25, e SEQ ID N0: 26, respectivamen- te; ou (ii) seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia pesada, SEQ ID N0: 27, SEQ ID N0: 28 e SEQ ID N0: 29, respectivamente; e seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia leve, SEQ ID N0: 30, SEQ ID N0: 31, e SEQ ID N0: 32, respectivamente.

20. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 17, em qu3 o anticorpo ou molécula Iigante de antígeno compreende (i) uma seqüência da região variável da cadeia pesada madura que é pelo menos 90% idêntica à região madura da SEQ ID N0: 5, e uma seqüência da região variável da ca- deia leve madura que é pelo menos 90% idêntica à região madura da SEQ ID N0: 6; ou (ii) uma seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada madura que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID N0: 7 e uma se- qüência de aminoácidos da região variável da cadeia leve madura que é pe- lo menos 90% idêntica à SEQ ID N0: 8.

21. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 17, em que o anticorpo ou molécula Iigante de antígeno compreende (i) uma seqüência de região variável da cadeia pesada madura que é idêntica à região madura da SEQ ID N0: 5, e uma seqüência de região variável de cadeia leve madura que é idêntica à região madura da SEQ ID N0: 6; ou (ii) uma seqüência da região variável da cadeia pesada madura que é idêntica à região madura da SEQ ID N0: 7 e uma seqüência da região variável da cadeia leve madura que é idêntica à região madura da SEQ ID N0: 8.

22. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 17, que é um DNA.

23. Célula hospedeira isolada, que compreende (1) um segmen- to de DNA recombinante que codifica uma cadeia pesada do anticorpo ou molécula Iigante de antígeno conforme definida na reivindicação 1, e (2) um segundo segmento de DNA recombinante que codifica uma cadeia leve do anticorpo ou molécula Iigante de antígeno; em que os ditos segmentos de DNA são respectiva e operavelmente ligados a um primeiro e a um segundo promotor, e são capazes de serem expressos na dia célula hospedeira.

24. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 23, em que o anticorpo ou molécula Iigante de antígeno é um anticorpo monoclonal humano.

25. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 23, em que o anticorpo ou molécula Iigante de antígeno compreende (i) seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia pesada, SEQ ID N0: 21, SEQ ID N0: 22 e SEQ ID N0: 23, respectivamenta; e seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia leve, SEQ ID N0: 24, SEQ ID N0: 25, e SEQ ID N0: 26, respectiva- mente; ou (ii) seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia pesada, SEQ ID N0: 27, SEQ ID N0: 28 e SEQ ID N0: 29, respectivamente; e seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia leve, SEQ ID N0: 30, SEQ ID N0: 31, e SEQ ID N0: 32, respectivamente.

26. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 23, em que o anticorpo ou molécula Iigante de antígeno compreende (i) uma se- qüência da região variável da cadeia pesada madura que é pelo menos 90% idêntica à região madura da SEQ ID N0: 5, e uma seqüência da região variá- vel da cadeia leve madura que é pelo menos 90% idêntica à região madura da SEQ ID N0: 6; ou (ii) uma seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada madura que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID N0: 7 e uma seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia leve madura que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID N0: 8.

27. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 23, em que o anticorpo ou molécula Iigante de antígeno compreende (i) uma se- qüência de região variável da cadeia pesada madura que é idêntica à região madura da SEQ ID N0: 5, e uma seqüência de região variável de cadeia leve madura que é idêntica à região madura da SEQ ID N0: 6; ou (ii) uma se- qüência da região variável da cadeia pesada madura que é idêntica à região madura da SEQ ID N0: 7 e um seqüência da região variável da cadeia leve madura que é idêntica à região madura da SEQ ID N0: 8.

28. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 23, que é uma linhagem de célula mamária não humana.

29. Composição farmacêutica, que compreende um anticorpo ou molécula de antígeno que especificamente se liga a um epítopo de PAR1 humano, em que o epítopo compreende a seqüência de SFLLRNPNDK- YEPFWEDEEKNESGLTE (SEQ ID N0: 38), e em que o anticorpo ou molécu- la Iigante de antígeno é um antagonista de PAR1.

30. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 29, que compreende um anticorpo que compreende as seqüências de C- DR1, CDR2, e CDR3 de cadeia pesada, SEQ ID N0: 21, SEQ ID N0: 22 e SEQ ID N°: 23, respectivamente; e seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia leve, SEQ ID N0: 24, SEQ ID NO;25, e SEQ ID N0: 26, respectiva- mente.

31. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 30, que compreende um anticorpo que contêm seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia pesada, SEQ ID N0: 27, SEQ ID N0: 28 e SEQ ID N0: 29, respectivamente; e seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia leve, SEQ ID N0: 30, SEQ ID N0: 31, e SEQ ID N°: 32, respectivamente.

32. Método para atenuar os sintomas de uma condição de doen- ça mediada por sinalização intracelular aberrante através de PAR1, que compreende administrar a um paciente que necessite deste um anticorpo ou molécula Iigante de antígeno que se liga especificamente a um epítopo de PAR1 humano, em que o epítopo compreende a seqüência de aminoácidos SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE (SEQ ID N0: 38), e em que o anti- corpo ou molécula Iigante de antígeno é um antagonista de PAR1.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, que compreende administrar um anticorpo que contém seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia pesada, SEQ ID N0: 21, SEQ ID N0: 22 e SEQ ID N0: 23, respecti- vamente; e seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia leve, SEQ ID N0: 24, SEQ ID N0: 25, e SEQ ID N0: 26, respectivamente.

34. Método, de acordo com a reivindicação 32, que compreende administrar um anticorpo que contêm seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia pesada, SEQ ID N0: 27, SEQ ID N0: 28 e SEQ ID N0: 29, respecti- vamente; e seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia leve, SEQ ID N0: 30, SEQ ID N0: 31, e SEQ ID N0: 32, respectivamente.

35. Método, de acordo com a reivindicação 32, em que a condi- ção de doença mediada por sinalização celular aberrante através de PAR1 é uma doença inflamatória intestinal crônica.

36. Método, de acordo com a reivindicação 32, em que a condi- ção de doença mediada por sinalização intracelular aberrante através de PAR1 é um distúrbio fibrótico.

37. Método, de acordo com a reivindicação 32, em que a condi- ção de doença mediada por sinalização intracelular aberrante através de PAR1 é um câncer que superexpressa PAR1.

38. Método, de acordo com a reivindicação 32, em que a condi- ção de doença mediada por sinalização intracelular aberrante através de PAR1 é uma lesão da isquemia-reperfusão.