MX2009000644A - Antagonistas de receptor-1 activado por proteasa (rap-1). - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona anticuerpos o moléculas de unión al antígeno que reconocen y antagonizan específicamente al receptor RAP1 humano. En la invención también se proporcionan polinucleotidos y vectores que codifican para tales moléculas, y células huésped que son portadoras de los polinucleotidos o vectores.

Description

ANTAGONISTAS DE RECEPTOR-1 ACTIVADO POR PROTEASA (PAR-1 ) REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional de E.U.A. No. 60/831 ,800, presentada el 18 de Julio del 2006, y la Solicitud de E.U.A. No. 11/778,924, presentada el 17 de Julio del 2007, las descripciones completas de las cuales se incorporan aquí por referencia para todos los propósitos.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a antagonistas de anticuerpo y de molécula de unión de antígeno del receptor-1 activado por proteasa (PAR-1 ).

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El receptor-1 activado por proteasa (PAR-1 ) es un receptor de trombina, el cual pertenece a la clase de receptores acoplados a la proteína G (GCPR). El PAR-1 es expresado en varios tejidos, por ejemplo, células endoteliales, células de músculo liso, fibroblasto, neuronas y plaquetas humanas. Está involucrado en respuestas celulares asociadas con hemostasis, proliferación, y daño a tejido.

La estimulación mediada por trombina de agregación de plaquetas a través de PAR-1 es un paso importante en la formación de coágulos y curación de heridas en vasos sanguíneos. La trombina activa PAR-1 a través de la remoción proteolítica de una porción del dominio N-terminal extracelular de PAR-1 y expone un nuevo N-término de PAR-1. Los primeros pocos aminoácidos (SFLLRN: SEC ID NO:37) del nuevo N-término de PAR-1 después actúa como un liga n do unido que se une a otra parte del receptor para iniciar la señalización a través de una proteína G asociada. PAR-1 también puede ser activado a través de otras proteasas involucradas en la coagulación. La modulación de actividades de señalización mediadas por PAR-1 tiene varias aplicaciones terapéuticas. La inhibición de PAR-1 es útil para tratar trastornos trombóticos y proliferativos vasculares, así como para inhibir la progresión de cánceres. Ver por ejemplo, Darmoul, et al., Mol Cáncer Res (2004) 2(9):514-22 y Salah. et ai., Mol Cáncer Res (2007) 5(3):229-40. Un inhibidor de PAR-1, que incluye un anticuerpo antagonista o molécula de unión de antígeno, tiene utilidad en el tratamiento de numerosas condiciones de enfermedad mediadas por la señalización intracelular de PAR-1. Por ejemplo, un inhibidor de PAR-1, incluyendo un anticuerpo antagonista o molécula de unión de antígeno, encuentra uso en la prevención o inhibición de trastornos inflamatorios intestinales crónicos, incluyendo enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), síndrome de intestino irritable (IBS) y colitis ulcerativa; y trastornos fibróticos, incluyendo fibrosis hepática y fibrosis del pulmón. Ver, por ejemplo, Vergnolle, et al., J. Clin Invest (2004) 114(10): 1444; Yoshida, et al., Aliment Pharmacol Ther (2006) 24(Supl 4):249; Mercer, et al., Ann NY Acad Sci (2007) 1096:86-88; Sokolova y Reiser, Pharmacol Ther (2007) P ID: 17532472. Un inhibidor de PAR-1 , incluyendo un anticuerpo antagonista o molécula de unión de antigeno, también encuentra uso en la prevención o inhibición de daño por isquemia-reperfusión, incluyendo daño al miocardio, renal, cerebral, y por i sq uem i a-re pe rf us ió n intestinal. Ver, por ejemplo. Strande, et al., Basic Res. Cardiol (2007) 102(4):350-8; Sevastos. et al., Blood (2007) 109 (2 ) : 577 -583 ; Junge, et al., Proc Nati Acad Sci USA (2003) 100(22):13019-24 y Tsuboi, et al., Arn J Physiol Gastrointest Liver Physiol (2007) 292(2): G678-83. La inhibición de señalización intracelular de PAR-1 también puede ser utilizada para inhibir infección de células por virus de herpes simple (HSV1 y HSV2). Ver, Sutherland, et al., J Thromb Haemost (2007) 5(5) : 1055-61.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En un aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos de antagonista monoclonales o moléculas de unión de antígeno contra el receptor-1 activado por proteasa humano (hPAR-1 ). Los anticuerpos o moléculas de unión de antígeno se unen a PAR-1 humano con el mismo carácter específico de unión como aquel de un segundo anticuerpo. El segundo anticuerpo tiene (i) una secuencia de región variable de cadena pesada de SEC ID N0:5 y una secuencia de región variable de cadena ligera de SEC ID N0:6, o (ii) una secuencia de región variable de cadena pesada de SEC ID NO:7 y una secuencia de región variable de cadena ligera de SEC ID NO:8 En algunas modalidades, los anticuerpos específicamente se unen a un epítopo de hPAR-1, que comprenden la secuencia de aminoácido SFLLRNPNDKYEPFWEDEENESGLTE (SEC ID IMO:38), o sus fragmentos, por ejemplo, un fragmento de por lo menos, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 aminoácidos contiguos. En algunas modalidades, los anticuerpos no se unen significativamente a (es decir, reaccionan en forma cruzada con) PAR-1 desde otra especie (por ejemplo, PAR-1 de ratón (mPAR-1)) o un subtipo de PAR-1 diferente de PAR-1m por ejemplo, receptor-2 activado por proteasa (PAR-2). Algunos de los anticuerpos o moléculas de unión de antígeno tienen una secuencia de región determinante de complementariedad (CDR) de cadena pesada de SEC ID NO:21, SEC ID NO:22, o SEC ID O: 23; o una secuencia de CDR de cadena ligera de SEC ID NO.24, SEC ID NO:25, o SEC ID NO:26. Algunas de estas moléculas tienen secuencias de CDR1. CDR2 y CDR3 de cadena pesada. SEC ID NO:21, SEC ID NO:22 y SEC ID NO:23, respectivamente: y secuencias de CDR 1 , CDR2 y CDR3, SEC ID NO:24, SEC ID N0 25, y SEC ID N0:26, respectivamente. Algunos de los anticuerpo o moléculas de unión de antígeno tienen una secuencia determinante de complementariedad (CDR) de cadena pesada de SEC ID N0:27, SEC ID N0.28, o SEC ID NO:29; o una secuencia de CDR de cadena ligera de SEC ID NO:30, SEC ID N 0 : 31 , o SEC ID NO:32. Algunas de estas moléculas tienen secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada, SEC ID NO:27, SEC ID NO:28 y SEC ID NO:29, respectivamente; y secuencias de CDR 1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera, SEC ID NO:30, SEC ID NO:31, y SEC ID NO:32, respectivamente. Algunos de los anticuerpos o moléculas de unión de antígeno tienen una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada que es por lo menos 85%, 90%. 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID NO:5, y una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera que es por lo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID NO:6. Algunos otros tienen una secuencia de aminoácido de región variables de cadena pesada que es por lo menos 85%. 90%, 95%, 96%, 97%. 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID NO:7. y una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera que es por lo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID NO:8. Algunas de las moléculas tienen una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada de SEC ID NO:5 y una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera de SEC ID NO:6. Algunos otros tienen una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada de SEC ID NO:7 y una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera de SEC ID NO:8. Algunos de los anticuerpos o moléculas de unión de antígeno tienen una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada que es por lo menos 85%. 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID NO:5 o SEC ID NO:7. Algunos de los anticuerpos o moléculas de unión de antígeno tienen una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera que es por lo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID NO:6 o SEC ID NO:8. Algunos de los anticuerpos anti-hPAR-1 o moléculas de unión de antígeno de la invención son anticuerpos de ratón. Algunos otros son anticuerpos quiméricos. Algunas de las moléculas anti-hPAR-1 son anticuerpos humanizados. Algunos otros son anticuerpos humanos. Algunos otros más son anticuerpos de cadena individual, fragmentos Fab, o monoanticuerpos con un andamio derivado de un dominio de tipo II de fibronectina humano. En otro aspecto, la invención proporción a polinucleótidos aislados o recom binantes, los cuales codifican a un polipéptido que contiene la región variable de la cadena pesada o la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-hPAR-1 o moléculas de unión de antígeno. Algunos de los polinucleótidos codifican un polipéptido que contiene la región variable de un anticuerpo humano. El polipéptido puede contener secuencias de CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada, SEC ID NO:21, SEC ID NO:22, y SEC ID NO:23, respectivamente; y secuencias de CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera, SEC ID NO:24, SEC ID NO:25, y SEC ID NO:26, respectivamente. El polipéptido también puede contener secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada, SEC ID NO:27, SEC ID ? ??:28, y SEC ID NO:29, respectivamente; y secuencias de CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera, SEC ID NO: 30, SEC ID NO:31. y SEC ID NO:32, respectivamente. Algunos de los po I i n u cleót i d o s codifican una secuencia de región variable de cadena pesada madura que es por lo menos 90% idéntica a la región madura de SEC ID NO:5, y/o una secuencia de región variable de cadena ligera madura que es por lo menos 90% idéntica a la región madura de SEC ID N0.6. Algunos otros codifican una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada que es por lo menos 90% idéntica a SEC ID NO:7. y/o una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera madura que es por lo menos 90% idéntica a SEC ID NO:8. Algunos de los polinucleótidos codifican una secuencia de región variable de cadena pesada madura que es idéntica a la región madura de SEC ID NO:5, y/o una secuencia de región variable de cadena ligera madura que es idéntica a la región madura de SEC ID NO:6. Algunos otros codifican una secuencia de región variable de cadena pesada madura que es idéntica a la región madura de SEC ID N 0 : 7 ; y/o una sec encia de región variable de cadena ligera madura que es idéntica a la región madura de SEC ID NO:8. En otro aspecto, la invención proporciona células huésped aisladas que alojan (1) un segmento de ADN recombinante que codifica una cadena pesada del anticuerpo anti-hPAR-1 o molécula de unión de antígeno de la invención; y (2) un segundo segmento de ADN recombinante que codifica una cadena ligera del anticuerpo o molécula de unión de antígeno. En algunas de las células huésped, los segmentos de ADN cada uno están operablemente enlazados a un promotor que es capaz de ser expresado en las células huésped. Algunas de las células huésped pueden expresar un anticuerpo anti-PAR-1 o molécula de unión de antígeno de origen humano. Algunas de las células huésped pueden expresar un anticuerpo anti-hPAR-1 o molécula de unión de antígeno que contenga secuencias de C D R 1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada, SEC ID NO:21, SEC ID NO:22, y SEC ID NO:23, respectivamente; y secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera, SEC ID NO:24, SEC ID NO:25. y SEC ID NO:26, respectivamente. Algunas otras expresan un anticuerpo anti-hPAR-1 o molécula de unión de antígeno que contenga secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada, SEC ID NO:27, SEC ID NO:28, y SEC ID NO:29, respectivamente: y secuencias de CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera, SEC ID NO:30, SEC ID NO.31, y SEC ID NO:32. respectivamente. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o molécula de unión de antígeno que específicamente se une a un epítopo de PAR-1 humano, en donde el epítopo comprende la secuencia de aminoácido SFLLRNPNDKYEPFWEDEENESGLTE (SEC ID NO:38), o sus fragmentos, y en donde el anticuerpo o molécula de unión de antígeno es un antagonista de PAR-1. Las modalidades de los anticuerpos y moléculas de unión de antígeno utilizados en las composiciones son como se describen aquí. Un método para mitigar los síntomas de una condición de enfermedad mediada por la señalización intracelular de PAR-1 que comprende administrar a un sujeto con la necesidad del mismo, un anticuerpo o molécula de unión de antígeno que específicamente se una a un epítopo de PAR-1 humano, en donde el epítopo comprende la secuencia de aminoácido SFLLRNPNDKYEPFWEDEENESGLTE (SEC ID NO:38), o sus fragmentos, y en donde el anticuerpo o molécula de unión de antígeno es una antagonista de PAR-1. Las modalidades de los anticuerpos y moléculas de unión de antígeno utilizados en los métodos son como se describen aquí. En algunas modalidades, la condición de enfermedad es mediada por la señalización intracelular aberrante a través de PAR-1. En algunas modalidades, la condición de la enfermedad es un trastorno trombótico o prolíferativo vascular. En algunas modalidades, la condición de enfermedad es un cáncer que expresa, en forma aberrante, PAR-1, por ejemplo, carcinomas o cánceres epiteliales, incluyendo, por ejemplo, cánceres de piel (incluyendo melanoma), cánceres gastrointestinales (incluyendo cáncer de colon), cáncer de pulmón y cáncer mamario (incluyendo cánceres de pecho y de ducto), cáncer prostático, cáncer endometrial, cáncer de ovario, adenocarcinoma, y similares. En algunas modalidades, la condición de enfermedad es un trastorno inflamatorio intestinal crónico, por ejemplo, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), síndrome de intestino irritable (IBS) y colitis ulcerativa. En algunas modalidades, la condición de enfermedad es un trastorno fibrótico. por ejemplo, fibrosís hepática y fíbrosis de pulmón.

En algunas modalidades, la condición de enfermedad es mediada a través de la señalización intracelular a través de PAR-1 que puede ser o no aberrante. En algunas modalidades, los métodos son dirigidos a inhibir o prevenir daño por isquemia-reperfusión. 5 incluyendo daño al miocardio, renal, cerebral y daño intestinal por isquemia-reperfusión. En algunas modalidades, los métodos son dirigidos a inhibir o prevenir infección de células por virus de herpes simple (HSV1 y HSV2). Un entendimiento más de la naturaleza y ventajas de la l() presente invención puede realizarse haciendo referencia a las porciones restantes de la especificación y reivindicaciones.

DEFINICIONES 15 A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado comúnmente entendido por aquellos expertos en la técnica a la cual pertenece esta invención. Las siguientes referencias proporcionan a un experto una definición general de muchos de los términos utilizados en esta 20 invención: Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Smith et al. (eds.), Oxford University Press (edición revisada. 2000); Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Singleton et al. (Eds.), John Wiley & Sons (ed. 3PrdP. 2002); y A Dictionary of Biology (Oxford Paperback Reference), Martin y Hiñe (Eds.). Oxford 25 University Press (ed. 4PthP, 2000). Además, las siguientes definiciones se proporcionan para ayudar al lector en la práctica de la invención . El término "anticuerpo" y "molécula de unión de antígeno" se utiliza para denotar una cadena(s) de polipéptido que exhibe una fuerte unión monovalente, bivalente o polivalente a una epítopo o epítopos dados. A menos que se indique otra cosa, los anticuerpos o moléculas de unión de antígeno de la invención pueden tener secuencias derivadas de cualquier especie de vertebrado, mamífero, camélido, ave. o peces Pueden ser generados utilizando cualquier tecnología adecuada, por ejemplo, tecnología de hibridoma, presentación de ribosoma, presentación de fago, bibliotecas de entremezclado de gen, bibliotecas semi-sintéticas o totalmente sintéticas, o combinaciones de los mismos. Como se detalla aquí, los anticuerpos o moléculas de unión de antígeno de la invención incluyen anticuerpos intactos, cadenas de polipéptido de unión de antígeno y otros anticuerpos de diseño (ver, por ejemplo, Serafini, J Nucí Med. 34:533-6, 1993). Un "anticuerpo" intacto típicamente comprende por lo menos dos cadenas pesadas (H) (aproximadamente 50-70 kD) y dos cadenas ligeras (L) (aproximadamente 25 kD) interconectadas a través de enlaces de disulfuro. Los genes de inmunoglobulina reconocidos que codifican cadenas de anticuerpo incluyen kappa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon, y genes de región constante mu, así como una miríada de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican ya sea como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gama, mu, alfa, delta, o épsilon, los c ales a su vez definen las clases de ¡nmunoglobulina. IgG, Ig , IgA, I g D e ! g E , respectivamente. Cada cadena pesada de un anticuerpo está compuesta de una región variable de cadena pesada (abreviado aquí como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta de tres dominios. CH1. CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta de una región variables de cadena ligera (abreviado aquí como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta de un dominio, CL. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactúa con un antigeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la ¡nmunoglobulina a tejidos huéspedes o factores, incluyendo varias células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico. Las regiones VH y VL de un anticuerpo además pueden subdividirse en regiones de hípervariabilidad, también denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDRs), las cuales están intercaladas con las regiones de estructura más conservadas (FRs). Cada VH y VL está compuesta de tres CDRs y cuatro FRs, arregladas desde el término amino hasta el término carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2. FR3, CDR3, FR4. Las ubicaciones de las regiones CDR y FR y un sistema de numeración han sido definidos por. por ejemplo. Kabat et al.. Sequences of Proteins of Immulogical Interest, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Goverment Printing Office (1987 y 1991). Los aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, maduras de las inmunoglobulinas se designan, respectivamente, como Hx y Lx, en donde x es un número que designa la posición de un aminoácido de acuerdo con el esquema de Kabat et al., supra. Kabat et al., listan muchas secuencias de aminoácido para anticuerpos para cada sub-grupo, y listan el aminoácido de existencia más común para cada posición de residuo en ese sub-grupo para generar una secuencia de consenso. Kabat et al., utilizan un método para asignar un número de residuo a cada aminoácido en una secuencia listada, y esta método para asignar números de residuo se ha vuelto estándar en el campo. El esquema de Kabat es extensible a otros anticuerpos no incluidos en su compendio alineando el anticuerpo en cuestión con una de las secuencias de consenso en Kabat et al., haciendo referencia a aminoácidos conservados. El uso del sistema de numeración de Kabat fácilmente identifica aminoácidos en posiciones equivalentes en diferentes anticuerpos. Por ejemplo, un aminoácido en la posición L50 de un anticuerpo humano ocupa la posición equivalente a una posición L50 de aminoácido de un anticuerpo de ratón. Asimismo, los ácidos nucleicos que codifican cadenas de anticuerpo se alinean cuando las secuencias de aminoácido codificadas por los ácidos nucleicos respectivos se alinean de acuerdo con la convención de numeración de Kabat. El anticuerpo o molécula de unión de antigeno también incluye fragmentos de anticuerpo que contienen las porciones de unión de antígeno de un anticuerpo intacto que retienen la capacidad de unión del antígeno cognado. Ejemplos de dichos fragmentos de anticuerpo incluyen, (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1 ; ( i i ) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados a través de un puente de disulfuro en la región de gozne; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y C H 1 ; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo; (v) un fragmento dAb (Ward et al , Nature 341:544-546, 1989), el cual consiste de un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad aislada (CDR). Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, pueden ser unidos, utilizando métodos recombinantes, a través de un enlazador sintético que permiten que se hagan como una cadena de proteína individual en donde el par de regiones VL y VH forma moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena individual (scFv); ver. por ejemplo, Bird et al., Science 242:423-426, 1988; y Huston et al., Proc. Nati. Acad. Scí. USA 85:5879-5883, 1988. Los anticuerpos o moléculas de unión de antígeno de la invención además incluyen una o más cadenas de inmunoglobulina que químicamente se conjugan a, o se expresan como, proteínas de fusión con otras proteínas. También incluye un anticuerpo biespecífico. Un anticuerpo biespecífico o bifuncional en un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares diferentes de cadena pesada/ligera y dos sitios diferentes de unión. Otros fragmentos de unión de antígeno o porciones de anticuerpo de la invención incluyen scFv bivalente (diacuerpo), anticuerpos scFv biespecí fieos en donde la molécula de anticuerpo reconoce dos diferentes epítopos, dominios de unión individuales (dAbs); y min i - cuerpos. Los varios anticuerpos o fragmentos de unión de antígeno descritos aquí pueden ser producidos a través de modificación enzimática o química de los anticuerpos intactos, o sintetizarse de nuevo utilizando metodologías de ADN recombinante (por ejemplo. Fv de cadena individual), o identificarse utilizando bibliotecas de presentación de fago (ver, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990). Por ejemplo, se pueden generar mini-cuerpos utilizando los métodos descritos en la técnica, por ejemplo. Vaughan y Sollazo, Comb Chem High Throughput Screen. 4:417-20 2001. Los anticuerpos biespecíficos pueden ser producidos a través de una variedad de métodos. incluyendo fusión de hibridomas o enlazamiento de fragmentos Fab. Ver, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990): Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992). Los anticuerpos de cadena individual pueden ser identificados utilizando bibliotecas de presentación de fago o bibliotecas de presentación de ribosoma. bibliotecas de gen entremezclado. Dichas bibliotecas pueden ser construidas a partir de fuentes sintéticas, semi-sintéticas o de cubo o inmunocompetentes. Un "anticuerpo quimérico" es una molécula de anticuerpo en donde (a) la región constante, o una porción de la misma, está alterada, reemplazada o intercambiada de manera que el sitio de unión de antigeno (región variable) está enlazado a una región constante de una clase diferente o alterada, función efectora y/o especie, o una molécula totalmente diferente que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, por ejemplo, una enzima, toxina, hormona, factor de crecimiento, fármaco, etc., o (b) la región variable, o una porción de la misma, está alterada, reemplazada o intercambiada con una región variable que tiene un carácter específico diferente o alterado. Por ejemplo, como se muestra en los Ejemplos más adelante, un anticuerpo anti-hPAR-1 de ratón puede ser modificado reemplazando su región constante con la región constante de una inmunoglobulina humana. Debido al reemplazo con una región constante humana, el anticuerpo quimérico puede retener su carácter específico para reconocer PAR-1 humano mientras tiene una antigenicidad reducida en el ser humano según comparado con el anticuerpo de ratón original. Un anticuerpo "humanizado" es un anticuerpo que retine la reactividad de un anticuerpo no humano mientras es menos inmunogénico en seres humanos. Esto puede lograrse, por ejemplo, reteniendo las regiones VDR no humanas y reemplazando las partes restantes del anticuerpo con sus contrapartes humanas (es decir, la región constante así como las porciones de estructura de base de la región variable). Ver, por ejemplo, Morrison et al., Proc. Nati, Acad. Sci. USA 81:6851 -6855, 1984; Morrison y Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991; y Padlan, Molec. Immun., 31: 169.217, 1994. El término "molécula de unión de antígeno" o "ligando no anticuerpo" se refiere a un imitador de anticuerpo que utiliza andamios de proteína de no inmunoglobulina, incluyendo adnectinas, avímeros, moléculas de unión a polipéptido de cadena individual, y peptidomiméticos de unión de tipo anticuerpo. El término "antagonista", como se utiliza aquí, se refiere a un agente que es capaz de unir específicamente e inhibir la señalización a través de un receptor para bloquear completamente o inhibir detectablemente una respuesta mediada por el receptor. Por ejemplo, un antagonista de PAR-1 específicamente se une al receptor y total o parcialmente inhibe la señalización mediada por PAR-1. En algunos casos, un antagonista de PAR-1 puede ser identificado por su habilidad para unirse a PAR-1 y para inhibir flujo de calcio inducido por trombina o producción de IL-8 inducida por trombina subsecuente a la señalización intracelular a partir de PAR-1 (por ejemplo, según medido en un ensayo de FipR, o a través de ELISA). Ensayos adicionales se describen por Kawabata, et al., J Pharmacol Exp Ther. (1999) 288(1 ):358-70. La inhibición ocurre cuando la señalización intracelular de PAR-1. según medida por ejemplo, por el flujo de calcio o producción de IL-8. de un PAR-1 expuesto a un antagonista de la invención es por lo menos aproximadamente 10% menos, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 25%, 50%, 75% menos, o totalmente inhibido, en 5 comparación con la señalización intracelular a partir de un PAR-1 de control no expuesto a un antagonista. Un PAR-1 de control puede ser expuesto a un no anticuerpo o molécula de unión de antígeno, un anticuerpo o molécula de unión de antígeno que específicamente se une a otro antígeno, o un anticuerpo anti-PAR-1 o molécula de unión l() de antígeno conocida por no funcionar como un antagonista. Un "antagonista de anticuerpo" se refiere a la situación en donde el antagonista es un anticuerpo inhibidor. El término "receptor-1 activado por proteasa". "receptor-1 activado por proteinasa", o "PAR-1" intercambiablemente se refieren 15 a un receptor acoplado a la proteína G que es activado por la escisión de trombina exponiendo asi un ligando unido N-terminal. PAR-1 también es conocido como "receptor de trombina" y "precursor de receptor de factor II de coagulación". Ver, por ejemplo. Vu et a I . : Cell (1991 ) 64(6 ): 1057-68 ; Coughlin. et al., J Clin Invest (1992) 20 89(2):351 -55; y GenBank No. Acceso NM_001992. La unión intramolecular del ligando unido al dominio extracelular de PAR-1 produce señalización intracelular y flujo de calcio. Ver, por ejemplo, Traynelis y Trejo, Curr Opin Hematol (2007) 14(3):230-5; y Hollenberg, et al., Can J Physiol Pharmacol. (1997) 75(7):832-41. 25 Las secuencias de nucleótido y aminoácido de PAR-1 son conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Vu et al., Cell (1991 ) 64(6): 1057-68; Coughlin et al., J Clin Invest (1992) 89(2):351 -55; y GenBank No. Acceso N M_001992. La secuencia de ácido nucleico de PAR-1 humano está publicada como GenBank No. Acceso NM_001992 (ver también, M62424.1 y gi45036369). La secuencia de aminoácido de PAR-1 humano está publicada como NP-001983 y AAA36743. Como se utiliza aquí, un polipéptido de PAR-1 es funcional mente un receptor acoplado a la proteina G que es activado por trombina, y produce señalización intracelular y flujo de calcio después de la unión del ligando unido N-terminal. Estructuralmente, una secuencia de aminoácido de PAR-1 comparte por lo menos aproximadamente 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%. 99% ó 100% de identidad de secuencia con el aminoácido de GenBank Nos. Acceso NP_001983y AAA36743 o M62424.1. Estructuralmente, una secuencia de ácido nucleótido de PAR-1 comparte por lo menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%. 96%, 97%. 98%, 99% ó 100% de identidad de secuencia con el aminoácido de GenBank Nos. Acceso NM_001992 o M62424.1. El carácter específico de unión de un anticuerpo o molécula de unión de antígeno se refiere a la habilidad del sitio de combinación de un anticuerpo individual o molécula de unión de antígeno para reaccionar con solo un determinante antigénico. El sitio de combinación de un anticuerpo típico está localizado en la porción Fab de la molécula y está construido a partir de las regiones hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras. En algunas modalidades, el carácter especifico se refiere a un epitopo particular dentro de un polipéptido de PAR-1 (por ejemplo, SFLLRNPNDK YEPFWEDEENESGLTE, o sus fragmentos) preferencialmente unido a través del anticuerpo de la invención. Los anticuerpos que comparten el carácter específico para un epitopo particular y competitivamente se unirán a ese epitopo. Los anticuerpos que competitivamente se unen a un epitopo común puede desplazar a otros de la unión al epitopo común, según medido utilizando cualquier ensayo de unión conocido en la técnica, por ejemplo, radio-inmunoensayo de fase sólida (SPRIA), en donde el primer anticuerpo competitivo o el segundo anticuerpo competitivo está marcado con un radioisótopo. Los anticuerpos competitivos que comparten un carácter específico no necesitan unirse para interactuar con epítopos idénticos, pero pueden unirse a epítopos traslapantes que permiten el desplazamiento competitivo en los ensayos de unión. En algunas modalidades, el carácter específico se refiere al subtipo de PAR-1 (por ejemplo, PAR-1 contra PAR-2 u otro subtipo de PAR, por ejemplo, PAR-3 o PAR-4) preferencialmente unido a través del anticuerpo de la invención. La afinidad de unión es la resistencia de la reacción entre un determinante antigénico individual y un sitio de combinación individual en el anticuerpo o molécula de unión de antigeno. Es la suma de las fuerzas de atracción y de repulsión que operan entre el determinante antigénico y el sitio de combinación. La afinidad es la constante de equilibrio que describe la reacción de antígeno- anticuerpo. La frase "específicamente (o selectivamente) se une a" se refiere a una reacción de unión preferencial entre un anticuerpo o molécula de unión de antígeno (por ejemplo un anticuerpo anti-hPAR-1 ) y un antígeno cognado (por ejemplo, un polipéptído de PAR-1 humano) en una población heterogénea de proteínas u otros biológicos. Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se utilizan intercambiablemente con el término "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno". Se reconoce que cierto grado de interacción no específica puede ocurrir entre un anticuerpo y epítopo sin objetivo. Sin embargo, la unión específica puede ser distinguida según mediada a través de reconocimiento específico del epitopo objetivo. Típicamente, la unión específica da como resultado una asociación mucho más fuerte entre la molécula suministrada y una entidad (por ejemplo, una cavidad de ensayo o una célula) que lleva el epítopo objetivo que entre el anticuerpo unido y una entidad (por ejemplo, una cavidad de ensayo o una célula) que carece del epitopo objetivo. La unión específica típicamente da como resultado más de aproximadamente 10 veces y muy preferiblemente más de 100 veces de un incremento en una cantidad de anticuerpo de antí-PAR-1 unido (por unidad de tiempo) a una célula o tejido que lleva el epítopo objetico según comparado con una célula o tejido que carece del epítopo objetivo. La unión específica entre dos entidades generalmente significa una afinidad de por lo menos 106M" 1. Las afinidades mayores que 108M'' son preferidas. La unión especifica puede ser determinada utilizando cualquier ensayo para unión de anticuerpo conocido en la técnica, incluyendo Tinción Western, ELISA, citometría de flujo, inmunohistoquímica. El término "epítopo" significa un determinante de proteína capaz de unión específica a un anticuerpo. Los epitopos usualmente consisten de agrupaciones de moléculas de superficie química activa tal como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y usualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específica. Los epitopos de conformación y no conformación se distinguen porque la unión al primero, pero no al último, se pierde en presencia de solventes de desnaturalización. El término "ácido nucleico" se utiliza aquí intercambiablemente con el término "polinucleótido" y se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y sus polímeros en forma ya sea de estructura de cadena individual o doble. El término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótido o residuos de estructura modificada o enlaces, que son sintéticos, de existencia natural, o de existencia no natural, que tienen propiedades de unión similares como el ácido nucleico de referencia, y que son metabolizados en una forma similar a los nucleótidos de referencia. Ejemplos de dichos análogos incluyen, sin limitación, fósforotioatos, fosoforamídatos, fosfonatos de metilo, fosfonatos de metilo quiral. 2-O-metil ribonucleótidos. péptido-ácidos nucleicos (PNAs).

A menos que se indique otra cosa, una secuencia de ácido nucleico particular también implícitamente abarca sus variantes conservativamente modificadas (por ejemplo, substituciones de codón de degeneración) y secuencias complementarias, así como la secuencia explícitamente indicada. Especifícame n te, como se describe más adelante, las substituciones de codón de degeneración pueden ser obtenidas generando secuencias en donde la tercera posición de uno o más codones (o todos) seleccionados está substituida con residuos mezclados de base y/o de desoxi-inosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 , 1991 : Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; y Rossolíni et al., Mol. Cell. Probes 8:91 -98, 1994). El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de existencia natural y sintéticos, así como análogos de aminoácido y mi m éticos de aminoácido que funcionan en una forma similar a los aminoácidos de existencia natural. Los aminoácidos de existencia natural son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que son posteriormente modificados, por ejemplo, hidroxíprolina, y-carboxiglutamato, y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica como un aminoácido de existencia natural, es decir, un .alfa, carbono que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R. por ejemplo, hemoserina. norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfonio. Dichos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o estructuras de péptido modificadas, pero retienen la misma estructura química básica como la de un aminoácido de existencia natural. Los miméticos de aminoácido se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona en una forma similar a un aminoácido de existencia natural. Los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan intercambiablemente aquí para referirse a un polímero de residuos de aminoácido. Los términos se aplican a polímeros de aminoácido en donde uno o más residuos de aminoácido son un mimético químico artificial de un aminoácido de existencia natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácido de existencia natural y polímero de aminoácido de existencia no natural. A menos que se indique otra cosa, una secuencia de polipéptido particular también implícitamente abarca sus variantes conservativamente modificadas. El término "variante conservativamente modificada" se aplica tanto a secuencias de aminoácido como de ácido nucleico. Con respecto a secuencias de ácido nucleico particulares, variantes conservativamente modificadas se refiere a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácido idénticas o esencialmente idénticas, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifica cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU todos codifican el aminoácido, alanina. De esta manera, en cada posición en donde una alanina es especificada por un codón, ei codón puede ser alterado a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", las cuales son una especie de variaciones conservativamente modificadas. Cada secuencia de ácido nucleico de la presente que codifica un polipéptido, también describe cada variación silenciosa posible del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG. el cual es ordinariamente el único codón para metionina. y TGG, el cual ordinariamente es el único codón para triptófano) puede ser modificado para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido es implícita en cada secuencia descrita. Para secuencias de polipéptido, "variantes conservativamente modificadas" incluyen substituciones, eliminaciones o adiciones individuales a una secuencia de polipéptido, lo cual da como resultado la substitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. En la técnica son bien conocidas las tablas de substitución conservadora que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares. Dichas variantes conservativamente modificadas son, además, y no excluyen variantes polimórficas, homólogos entre especies, y alelos de la invención. Los siguientes Ocho grupo contienen aminoácidos que son substituciones conservadoras entre sí: 1) Alanina (A). Glicina (G); 2) Acido Aspártico (D), Acido Glutámico (E): 3) Asparagina (N). Glutamina (Q); 4) Arginina ®, Lisina (K); 5) Isoleucina (I). Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T): y 8) Cisteina (C), Metionina (M) (ver, por ejemplo, Creighton Proteins (1984)). Los términos "idéntico(a)" o porciento de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptido, se refieren a dos o más secuencias o sub-secuencias que son las mismas. Dos secuencias son "substancialmente idénticas" si las dos secuencias tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácido o nucleótidos que son los mismos (es decir, 60% de identidad, opcionalmente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%. ó 99% de identidad sobre una región específica, o, cuando no se especifica, sobre toda la secuencia), cuando se compara y se alinea para correspondencia máxima sobre una ventana de comparación, o región diseñada según medido utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o a través de alineación manual o inspección visual. Opcionalmente, la identidad existe sobre una región que es tiene una longitud de por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos (o 10 aminoácidos), o muy preferiblemente sobre una región que tiene una longitud de 100 a 500 ó 1000 o más nucleótidos (ó 20. 50. 200 ó más aminoácidos). Para comparación de secuencia, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la cual se comparan secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencia, se introducen secuencias de prueba y de referencia en una computadora, se designan coordenadas de sub-secuencia, si es necesario, y se designan parámetros de programa de algoritmo de secuencia. Se pueden utilizar parámetros de programa predeterminados, o se pueden designar parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencia después calcula el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias de prueba con relación a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros de programa. Una "ventana de comparación", como se utiliza aquí, incluye referencia a un segmento de cualquier número de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste de 20 a 600, usualmente alrededor de 50 a 200, más usualmente alrededor de 100 a 150 en donde la secuencia puede ser comparada con una secuencia de referencia del mismo número posiciones contiguas después de que las dos secuencias son óptimamente alineadas. En la técnica son conocidos los métodos de alineación de secuencia para comparación. Se puede conducir alineación óptima de secuencias para comparación, por ejemplo, a través del algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482c, 1970; a través del algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; a través de la búsqueda para método de similitud de Pearson y Lipman, Proc. N a t ? , Acad. Scí. USA 85:2444, 1988; a través de implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete de Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, Wl); o a través de alineación manual e inspección visual (ver. por ejemplo, Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons. Inc. (ringbou e d . , 2003)). Dos ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, los cuales se describen por Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977; y Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 403-410, 1990, respectivamente El software para realizar los análisis de BLAST está públicamente disponible a través de National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo involucra primero identificar pares de secuencia de alta marca (HSPs) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que tanto hace coincidir como satisface alguna marca T de umbral de valor positivo cuando se alinea con una palabra de alguna longitud en una secuencia de base de datos. T se refiere al umbral de marca de palabra vecina (Altschul et al., supra). Estos golpes de palabra vecina inicial actúan como semillas para inicia búsquedas para encontrar HSPs más largos que los contienen. Los golpes de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia a medida que la marca de alineación acumulativa se incrementa. Las marcas acumulativas se calculan utilizando, para secuencias de nucleótido, los parámetros M (marca de retribución para un par de residuos coincidentes; siempre > 0 ) y N (marca de penalidad para residuos disparejos; siempre <0). Para secuencias de aminoácido, se utiliza una matriz de marca para calcular la marca acumulativa. La extensión de los golpes de palabra en cada dirección se detiene cuando: la marca de alineación acumulativa cae por una cantidad X desde su valor máximo logrado; la marca acumulativa va de cero o más abajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuo de marca negativa; o al final de cualquier secuencia alcanzada. Los parámetros del algoritmo BLAST, W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótido) utiliza como puntos por omisión, una longitud de onda (W) de 11 , una expectativa (E) de 10, M = 5, N = 4 y una comparación de amabas cadenas. Para secuencias de aminoácido, el programa BLASTP utiliza como puntos por omisión una longitud de onda de 3, una expectativa (E) de 10. y las alineaciones (B) de matriz de marca BLOSU 62 (ver Henikoff y Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = 4, y una comparación de ambas estructuras de cadena. El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993). Una medida de similitud provista por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), la cual proporciona una indicación de la probabilidad a través de la cual una coincidencia entre dos secuencias de nucleótido o aminoácido podría ocurrir por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0.2, de preferencia menor que aproximadamente 0.01, y muy preferiblemente menor que aproximadamente 0.001. Otro porcentaje de la identidad de secuencia observada anteriormente, otra indicación que dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos son substancialmente idénticas, es que el polipéptido codificado por el primer aminoácido reacciona inmunológicamente en forma cruzada con los anticuerpos surgidos contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe más adelante. De esta manera. un polipéptido es típica y substancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando dos péptidos difieren solo por substituciones conservadoras. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son substancialmente idénticas es que las dos moléculas o sus complementos hibridizan entre sí bajo condiciones severas, como se describe más adelante. Aún otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son substancialmente idénticas es que se pueden utilizar los mismos iniciadores para amplificar la secuencia. El término "operablemente enlazado(a)" se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos de polinucleótido (por ejemplo, ADN). Típicamente, se refiere a la relación funcional de una secuencia reguladora de transcripción con una secuencia transcrita. Por ejemplo, un promotor o secuencia mejoradora es operablemente enlazada a una secuencia de codificación si estimula o modula la transcripción de la secuencia de codificación en una célula huésped apropiada u otro sistema de expresión. En general, las secuencias reguladoras de transcripción de promotor que operablemente son enlazadas a una secuencia transcrita son físicamente contiguas a la secuencia transcrita, es decir, actúan como cis. Sin embargo, algunas secuencias reguladoras de transcripción, tales como mej oradores, no necesitan ser físicamente contiguas o localizadas muy cerca de las secuencias de codificación cuya transcripción pueden mejorar. El término "vector" pretende referirse a una molécula de polinucleótido capaz de transportar otro polinucleótido al cual se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido', el cual se refiere a un bucle de ADN de estructura de cadena doble, circular, en el cual se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde se pueden ligar segmentos de ADN adicionales al genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicacíón autónoma en una célula huésped en donde son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicacíón y vectores de mamífero episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episomales) pueden ser integrados al genoma de una célula huésped después de la introducción a la célula huésped, y de esta manera se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están operativamente enlazados. Dichos vectores son denominados aquí como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están por lo regular en la forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" pueden ser utilizados intercambiablemente aunque el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formar de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo. retrovirus defectuosos de replicación, adenovirus y virus adeno-asociados), los cuales sirven para funciones equivalentes. El término "célula huésped recombinante" (o simplemente "célula huésped") se refiere a una célula en la cual un vector de expresión recombinante ha sido introducido. Se debe entender que dichos términos pretenden referirse no solo a la célula particular objetivo de dicha célula. Ya que pueden ocurrir ciertas modificaciones en generaciones subsiguientes debido a la mutación o a influencias ambientales, de manera que la progenie no puede, de hecho, ser idéntica a la célula de origen, pero se sigue incluyendo dentro del alcance del término "célula huésped" como se utiliza aquí.

El término "sujeto" incluye seres humano y animales que no son seres humanos. Los animales que no son seres humanos incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, oveja, perro, vaca, pollos, anfibios, y reptiles. Excepto cuando se observe, los términos "paciente" o "sujeto" se utilizan aquí intercambiablemente. El término "tratar" incluye la administración de compuestos o agentes para prevenir o retrasar el inicio de los síntomas, complicaciones, o indicios bioquímicos de una enfermedad (por ejemplo, un tumor), aliviar los síntomas o detener o inhibir más el desarrollo de la enfermedad, condición o trastorno. El tratamiento puede ser profiláctico (para prevenir o retrasar el inicio de la enfermedad, o para prevenir la manifestación de sus síntomas clínicos o subclínícos) o supresión terapéutica o alivio de síntomas después de la manifestación de la enfermedad. La frase "trayectoria de transducción de señal" o "trayectoria de señalización" (por ejemplo, la trayectoria de señalización de PAR-1) se refiere a por lo menos una reacción bioquímica, pero m s comúnmente una serie de reacciones bioquímicas, que resultan de la interacción de una célula con un compuesto o agente estimulador. De esta manera, la interacción de un compuesto estimulador (por ejemplo, trombina) con una célula genera una "señal" que es transmitida a través de la trayectoria de transducción de señal, finalmente dando como resultado una respuesta celular.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra secuencias de nucleótido de regiones variables de clones de anticuerpo anti-hPAR-1 de ratón, 4E7.J14.L6 y 6E11.H6.A9 (SEC ID NOS:1-4). Las regiones CDR están indicadas a través de residuos subrayados. Las regiones de estructura se denotan a través de otros residuos. La Figura 2 muestra secuencias de aminoácido de regiones variables de clones de anticuerpo anti-hPAR-1 de ratón, 4E7.J14.L6 y 6E11.H6.A9 (SEC ID NOS:5-8). Las secuencias subrayadas denotan las regiones CDE, mientras que las otras porciones de secuencia indican regiones de estructura. La Figura 3 muestra que la secreción de IL-8 estimulada por trombina a través de células HUVEC es inhibida a través del clon de anticuerpo anti-hPAR-1 de ratón, 4E7.J14.L6 o 6E11.H6.A9. La Figura 4 ilustra la fuerte actividad antagonista del clon 4E7.J14, según medida en un ensayo de flujo de calcio (FlipR) La Figura 5 ilustra la fuerte actividad antagonista del clon 6E11.H6, según medida en un ensayo de flujo de calcio (FlipR).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION 1. Introducción La presente invención está fundada en parte en el desarrollo, por los inventores de la presente, de anticuerpos antagonistas o moléculas de unión de antígeno contra PAR-1 humano. Los anticuerpos anti-hPAR-1 generados en anticuerpos anti-hPAR-1 de ratón o quiméricos creados in vitro, fueron capaces de unirse específicamente a un polipéptido PAR-1 humano. Además, se encontró que los anticuerpos son capaces de inhibir actividades mediadas por la señalización de PAR-1 , por ejemplo, secreciones de interleucina mediadas por trombina. De esta manera, estos anticuerpos son útiles como agentes terapéuticos o profilácticos en un número de enfermedades o trastornos mediados por o asociados con actividades de señalización de PAR-1. por ejemplo, síndrome de intestino irritable o fibrosis hepática. Las siguientes secciones proporcionan una guía para hacer y utilizar las composiciones de la invención . 2. Anticuerpos Antagonistas o Moléculas de unión de antigeno de PAR-1 Humano a. Vista General La invención proporciona anticuerpos o moléculas de unión de antígeno que específicamente se unen a PAR-1 humano. Estos agentes antí-hPAR-1 son capaces de antagonizar actividades de señalización mediadas por PAR-1 , por ejemplo, secreción de interleucina mediada por PAR-1 como se describe en los Ejemplos más adelante. En la técnica son bien conocidos métodos generales para la preparación de anticuerpos monoclonales o policlonales. Ver, por ejemplo, Harlow & Lañe, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1998; Kohler & Milstein, Nature 256:495-497, 1975: Kozbor et al., Immunology Today 4:72, 1983; y Colé et al., pp. 77-96 en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, 1985. Preferiblemente, los anticuerpos anti-hPAR-1 de la invención son anticuerpos monoclonales como el clon de anticuerpo anti-hPAR-1 4E7.J14.L16 o el clon 6E11.H6.A9 descritos en los Ejemplos más adelante. Las secuencias e polinucleótido y secuencias de aminoácido de las regiones variables de estos dos anticuerpos monoclonales anti-hPAR-1 ejemplificados se muestran en las Figuras 1 y 2, respectivamente. Los anticuerpos monoclonales se refieren a anticuerpos derivados de un clon individual. Cualquier técnica para producir un anticuerpo monoclonal puede ser empleada para producir anticuerpos anti-hPAR-1 de la invención, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de linfocitos B. Un sistema de animal para preparar hibridomas es el sistema de murino. La producción de hibridoma en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Como se ilustra en los Ejemplos más adelante, los anticuerpos monoclonales ant-hPAR-1 pueden ser generados inmunizando un animal no humano (por ejemplo, ratón) con un polipéptido hPAR-1 , o un fragmento, proteína de fusión, o variante del mismo. Después se fusionaron células B aisladas del animal a células de mieloma para generar hibridomas de producción de anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales anti-hPAR-1 de ratón pueden ser obtenidos clasificando los hibridomas en un ensayo de ELISA utilizando un polipéptido de hPAR-1 o proteina de fusión. Los protocolos de inmunización y técnicas para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para fusión son conocidas en la técnica. Los patrones de fusión (por ejemplo, células de mieloma de murino) y procedimientos de fusión también son bien conocidos en la técnica, ver, Harlow & Lañe, supra. Las secuencias de aminoácido de las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de los anticuerpos anti-PAR-1 de ratón ilustrativos (clones 4E7.J14.L16 y 6E11.H6.A9) descritas en los Ejemplos más adelante se muestran en SEC ID NOS:5-8. Las secuencias de CDR de la región variable de cadena pesada del clon 4E7.J14.L16 son DYYMN (CDR 1 ; SEC ID NO:21). VIDPHNGRSRUNQMFKG (CDR2; SEC ID NO:22), y DDGPSHWYFDV (CDR3; SEC ID NO:23). Las secuencias de CDR de sus región variable de cadena ligera son RSSQNI VHSNGNTYLE (CDR 1 ; SEC ID NO:24), KVSNRFS (CDR2; SEC ID NO.25), y FQGSHVPFT (CDR3; SEC ID NO:26). Las secuencias de CDR de la región variable de cadena pesada del clon 6E11.H6.A9 son DHTFH (SEC ID NO:27); YIFPRDGSTKYNEKFKG (CDR2; SEC ID NO:28), y HYYGSFEY (CDR3; SEC ID NO:29). Las secuencias de CDR de su región variable de cadena ligera son RSSQSLVHSNGNTYLH (CDR1; SEC ID NO:30), KVSNRFS (CDR2; SEC ID NO:31), y SQSTHLPLT (CDR3; SEC ID NO:32). Un anticuerpo intacto típico interactúa con el antígeno objetivo predominantemente a través de residuos de aminoácido que están localizados en las seis regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada y ligera (CDR's). Típicamente, los anticuerpos anti-hPAR-1 de la invención tienen por lo menos una de las secuencias de CDR de cadena pesada o secuencias de CDR de cadena ligera idénticas a las secuencias de CDR correspondientes del clon 4E7.J14.L16 o 6 E 11. H 6. A 9 del anticuerpo anti-PAR-1. Algunos de estos anticuerpos anti-hPAR-1 de la invención tienen el mismo carácter especifico de unión, y por lo tanto compiten con un anticuerpo de referencia, para un epítopo dentro del ligando unido N-terminal de PAR-1, por ejemplo, dentro de la secuencia de aminoácido SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE (SEC ID NO:38), o sus fragmentos, por ejemplo, 8, 9. 10. 11, 12, 13, 14. ó 15 aminoácidos contiguos dentro de la secuencia de aminoácido anterior. Algunos de los anticuerpos anti-hPAR-1 de la invención tienen todas las secuencias de CDR en sus regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera, respectivamente, idénticas a las secuencias de CDR correspondientes del clon 4E7.J14.L16 o 6E11.H6.A9 del anticuerpo anti-PAR-1. De esta manera, estos anticuerpos anti-hPAR-1 pueden tener las tres secuencias de CDR de cadena pesada respectivamente idénticas a SEC ID NO:22 y SEC ID NO:23, y las tres secuencias de CDR de cadena ligera, respectivamente, idénticas a SEC ID NO:24, SEC ID NO:25 y SEC ID NO:26. También pueden tener las tres secuencias de CDR de cadena pesada, respectivamente, idénticas a SEC ID NO:27, SEC ID NO:28, y SEC ID NO:29, y las tres secuencias de CDR de cadena ligera, respectivamente, idénticas a SEC ID NO:30, SEC ID NO:31 y SEC ID NO:32. Algunos de los anticuerpos anti-hPAR-1 de la invención tienen sus secuencias de región variable de cadena pesada y cadena ligera completas, respectivamente, idénticas a las secuencias de región variable correspondientes del clon 4E7.J14.L16 o 6E11.H6.A9 del anticuerpo de ratón. En algunas otras modalidades, distintas a las secuencias de CDR idénticas, los anticuerpos contienen residuos de aminoácido en las porciones de estructura de las regiones variables que son diferentes de los residuos de aminoácido correspondientes del clon 4E7.J14.L16 o 6E11.H6.A9 del anticuerpo anti-PAR-1 de ratón (por ejemplo, algunos de los anticuerpos antí-hPAR-1 humanizados descritos más adelante). Sin embargo. estos anticuerpos típicamente tienen sus secuencias de región variable completas que son substancialmente idénticas (por ejemplo, 75%, 85%, 90%, 95%, ó 99%) a las secuencias de región variable correspondientes del clon 4E7.J14.L16 o clon 6E11.H6.A9 del anticuerpo anti-PAR-1 de ratón. Los anticuerpos anti-hPAR-1 de la invención pueden ser un anticuerpo intacto que contiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. También pueden ser moléculas de unión de antigeno de un anticuerpo intacto o anticuerpos de cadena individual. Los anticuerpos anti-hPAR-1 de la invención incluyen anticuerpos producidos en un animal no humano (por ejemplo, el clon 4E7.J14.L16 o 6E11.H6.A9 del anticuerpo anti-PAR-1 de ratón). También incluyen anticuerpos modificados que son formas modificadas del clon 4E7.J14.L16 o 6E11.H6.A9 del anticuerpo anti-PAR-1 de ratón. Por lo general, los anticuerpos modificados son anticuerpos recombinantes que tienen propiedades similares o mejoradas con relación a aquellas del anticuerpo de ratón ejemplificado. Por ejemplo, el anticuerpo anti-hPAR-1 de ratón ejemplificado en los Ejemplos más adelante puede ser modificado eliminando la región constante y reemplazándola con una región constante diferente que pueda conducir a una vida media 5 incrementada, por ejemplo, vida media en suero, estabilidad o afinidad del anticuerpo. Los anticuerpos modificados pueden ser creados, por ejemplo. construyendo vectores de expresión que incluyen las secuencias de CDR del anticuerpo de ratón injertado sobre secuencias de estructura de un anticuerpo diferente con l() diferentes propiedades (Jones et al., 1986. Nature 321, 522-525). Dichas secuencias de estructura pueden ser obtenidas de bases de datos de ADN públicas (por ejemplo, de www.kabatdatabase.com). Algunos de los anticuerpos modificados son anticuerpos quiméricos, los cuales contienen secuencias de inmunoglobuima 15 humana parciales (por ejemplo, regiones constantes) y secuencias de ¡nmunoglobulina no humana parciales (por ejemplo, las secuencias de región variable de anticuerpo anti-hPAR-1 de ratón del clon 4E7.J14.L16 o 6E11.H6.A9 del anticuerpo anti-hPAR-1 de ratón). Algunos otros anticuerpos modificados son anticuerpos humanizados. 20 Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en él a partir de una fuente que es no humana. Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, patentes de E.U.A Nos. 5,585,089 y 5,693,762; Jones et al., Nature 321:522-25. 1986; 25 Riechmann et al., Nature 332: 323-27, 1988; y Verhoeyen et al., Science 239: 1534-36, 1988. Estos métodos pueden ser fácilmente empleados para generar anticuerpos anti-hPAR-1 humanizados de la invención substituyendo por lo menos una porción de una CDR de un anticuerpo anti-hPAR-1 no humano para las regiones correspondientes de un anticuerpo humano. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-hPAR-1 humanizados de la invención tienen las tres CDRs en cada cadena de i n m u n og I o b u I i n a del clon 4E7.J14.L16 o 6E11.H6.A9 del anticuerpo anti-hPAR-1 de ratón injertado en las regiones de estructura humanas correspondientes. Los anticuerpos anti-hPAR-1 descritos anteriormente pueden experimentar substituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácido no críticas en las regiones tanto constantes como variables sin perder el carácter especifico de unión o funciones efectoras, o reducción intolerable de afinidad de unión. Usualmente, los anticuerpos que incorporan dichas alteraciones exhiben identidad de secuencia substancial a un anticuerpo de referencia (por ejemplo, el clon 4E7.J14.L16 o 6E11.H6.A9 del anticuerpo anti-hPAR-1 de ratón) a partir del cual se derivan. Por ejemplo, las regiones variables de cadena ligera maduras de algunos de los anticuerpos anti-hPAR-1 de la invención tienen por lo menos 75% o al menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia de la región variable de cadena ligera madura de los anticuerpos anti-hPAR-1 de ratón. Similarmente, las regiones variables de cadena pesada maduras de los anticuerpos típicamente muestran por lo menos 75% o por lo menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia de la región variable de cadena pesada madura de los anticuerpos anti-hPAR-1 ejemplificados Algunos de los anticuerpos anti-hPAR-1 modificados tienen el mismo carácter específico y una afinidad incrementada, según comparado con los anticuerpos anti-hPAR-1 de ratón ejemplificados. Usualmente. la afinidad de los anticuerpos anti-hPAR-1 modificados está dentro de un factor de 2, 5. 10 ó 50 del anticuerpo anti-hPAR-1 de ratón de referencia. b. Anticuerpos Anti-hPAR-1 Quiméricos y Humanizados Algunos de los anticuerpos anti-hPAR-1 de la invención son anticuerpos quiméricos (por ejemplo, ratón/humano), los cuales está formados de regiones de un antagonista de anticuerpo anti-hPAR-1 no humano junto con regiones de anticuerpos humanos. Por ejemplo, una cadena H quimérica puede comprender la región de unión de antígeno de la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-hPAR-1 de ratón ejemplificado aquí (por ejemplo, SEC ID NO: 5 ó 7) enlazada a por lo menos una porción de una región constante de cadena pesada humana. Esta cadena pesada quimérica puede ser combinada con una cadena L quimérica que comprende la región de unión de antígeno de la región variable de cadena ligera del anticuerpo anti-hPAR-1 de ratón ejemplificado (por ejemplo, SEC ID NO:6 u 8) enlazada a por lo menos una porción de la región constante de cadena ligera humana. Los anticuerpos anti-hPAR-1 quiméricos de la invención pueden ser producidos de acuerdo con la descripción de los Ejemplos, más adelante, asi como en métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un gen que codifica la cadena pesada o cadena ligera de un anticuerpo anti-hPAR-1 de murino o molécula de unión de antigeno puede se digerido con enzimas de restricción para remover la región Fe de murino, y substituido con la porción equivalente de un gen que codifica una región constante FC humana. Los vectores de expresión y células huésped adecuados para la expresión de anticuerpos recombinantes y anticuerpos humanizados en particular, son bien conocidos en la técnica. Los vectores que expresa genes quiméricos que codifican cadenas de inmunoglobulína de anti-hPAR-1 pueden ser construidos utilizando técnicas recombinantes estándares, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press (3a. Ed., 2001 ; y Brent et al., Current Protocols i n Molecular Biology, John Willey & Sons, Inc. (ringbou ed., 2003). Las secuencias de región constante humanas pueden ser seleccionadas de varias fuentes de referencia, incluyendo, pero no limitándose a, aquellas listadas en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. Edición, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Goverment Printing Office, 1991. En la técnica también se han enseñado técnicas más específicas para producir anticuerpos quiméricos a través de recombinación de ADN, por ejemplo, Robinson et al., Publicación de Patente Internacional PC Y/US86/02269; Akira, et al., Solicitud de Patente Europea 184,187; Taniguchi. M., Solicitud de Patente Europea 171 ,496; Morrison et al., Solicitud de Patente Europea 173,494; Neuberger et al., Solicitud Internacional WO/8601533; Cabilly et al., Patente de E.U.A. No. 4,816,567; Cabilly et al., Solicitud de Patente Europea 125,023; Better et al., Science 240:1041 -1043, 1988; Liu et al., PNAS 84:3439-3443, 1987; Liu et al.. J. Immunol. 139:3521 -3526; Sun et al., PNAS 84:214-218, 1987; Nishimura et al., Canc. Res. 47:999-1005, 1987; Wood et al., Nature 314:446-449, 1985; Shaw et al., J. Nati. Cáncer Inst. 80:1553-1559, 1988. Los anticuerpos quiméricos que tienen regiones variables completas de un anticuerpo no humano pueden ser además humanizados para reducir la antigenicidad del anticuerpo en el humano. Esto típicamente se logra reemplazando ciertas secuencias o residuos de aminoácido en las regiones variables Fv (regiones de estructura o regiones que no son CDR) con secuencias equivalentes o residuos de aminoácido de regiones variables FV humanas. Estas secuencias o residuos de aminoácido adicionalmente substituidos en general no están directamente involucrados en la unión de antigeno. Con más regularidad, la humanización de un anticuerpo no humano prosigue substituyendo solo las CDRs de un anticuerpo no humano (por ejemplo, los anticuerpos anti-hPAR-1 de ratón ejemplificados aquí) para las CDRs en un anticuerpo humano. En algunos casos, esto es seguido reemplazando algunos residuos adicionales en las regiones de estructura humanas con los residuos correspondientes del anticuerpo donador no humano. Dicho injerto adicional por lo general es necesario para mejorar la unión al antígeno. Esto es porque los anticuerpos humanizados que solo tienen CDRs injertadas de un anticuerpo no humano, pueden tener menos actividades de unión perfectas según comparado con aquellas del anticuerpo donador no humano. De esta manera, además de las CDRs. los anticuerpos anti-hPAR-1 humanizados de la invención por lo general pueden tener algunos residuos de aminoácido en la región de estructura humana reemplazados con residuos correspondientes del anticuerpo donador no humano (por ejemplo, el anticuerpo de ratón ejemplificado aquí). Los métodos para generar anticuerpos humanizados a través de substitución de CDR, incluyendo criterios para seleccionar residuos de estructura para reemplazo, son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, además de la técnica observada anteriormente con relación a producir anticuerpos quiméricos, se proporcionan enseñanzas adicionales para hacer anticuerpos humanizados en, por ejemplo, Winter et al., Solicitud de Patente UK GB 2188638A (1987), Patente de E.U.A. 5.225.539; Jones et al., Nature 321:552-525, 1986; Verhoeyan et al., Science 239:1534, 1988; y Beidler et al., J. Immunol. 141:4053-4060, 1988. Las substituciones de CDR también pueden ser realizadas utilizando mutagénesis dirigida al sitio de oligonucleótido como se describe en. por ejemplo, WO 94/10332. intitulada "Humanized Antibodies to Fe Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes". Los anticuerpos anti-hPAR-1 quiméricos o humanizados de la invención pueden ser ¡nmunoglobu linas monovalentes, divalentes, o polivalentes. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico monovalente es un dímero (HL) formado a través de una cadena H quimérica asociada a través de puentes de disulfuro con una cadena L quimérica como se observó anteriormente. Un anticuerpo quimérico divalente es un tetrámero (H2 L2) formado a través de dos dimeros HL asociados a través de por lo menos un puente de disulfuro. Un anticuerpo quimérico polivalente se basa en una agregación de cadenas. c. Anticuerpos Anti-hPAR-1 Humanos Además de los anticuerpos anti-hPAR-1 quiméricos o humanizados, también se incluyen en la invención, anticuerpos totalmente humanos que exhiben el mismo carácter específico de unión y una afinidad de unión comparable o mejor. Por ejemplo, los anticuerpos anti-hPAR-1 humanos pueden tener las mismas características de unión o unas mejoras (por ejemplo, carácter específico y/o afinidad de unión) con relación a aquellas de un anticuerpo anti-PAR-1 no humano de referencia, por ejemplo, el clon 4E7.J14.L16 o 6E11.H6.A9 del anticuerpo anti-hPAR-1 de ratón. El anticuerpo no humano de referencia puede ser el anticuerpo anti-hPAR-1 de ratón, el cual contiene una secuencia de región variable de cadena pesada de SEC ID NO:5 y una secuencia de región variable de cadena ligera de SEC ID NO:6. También el anticuerpo anti-hPAR-1 de ratón que contiene una secuencia de región variable de cadena pesada de SEC ID NO:7 y una secuencia de región variable de cadena ligera de SEC ID NO:8. Comparados con los anticuerpos quiméricos o humanizados, los anticuerpos anti-hPAR-1 humanos de la invención además tiene antigenicidad reducida cuando se administran a seres humanos. Los anticuerpos anti-hPAR-1 humanos pueden ser generados utilizando métodos que son conocidos en la técnica. Por ejemplo, un método in vivo para reemplazar una región variable de anticuerpo no humano con una región variable humana en un anticuerpo mientras mantiene o proporciona nuevas mismas características de unión con relación a aquellas del anticuerpo no humano se ha descrito en la Solicitud de Patente de E.U.A. Serie No. 10/778,726 (Publicación No. 20050008625). El método replica en un reemplazado guiado por epítopo de regiones variables de un anticuerpo de referencia no humano con un anticuerpo totalmente humano. El anticuerpo humano resultante en general no está relacionado estructuralmente con el anticuerpo no humano de referencia, pero se une el mismo epítopo en el mismo antígeno como el anticuerpo de referencia. En resumen, el aspecto de reemplazo de complementariedad guiado por epítopo en serie se habilita estableciendo una competencia en las células entre un "competidor" y una biblioteca de diversos híbridos del anticuerpo de referencia ("anticuerpos de prueba") para unirse a cantidades limitantes de antígeno en presencia de un sistema de reporte, el cual responde a la unión del anticuerpo de prueba al antígeno. El competidor puede ser el anticuerpo de referencia o su derivado tal como un fragmento Fv de cadena individual. El competidor también puede ser un ligando natural o artificial, el cual se une al mismo epitopo como el anticuerpo de referencia. Los únicos requerimientos del competidor son que se una al mismo epitopo como el anticuerpo de referencia, y que compita con el anticuerpo de referencia para la unión de antigeno. Los anticuerpos de prueba tienen una región V de unión de antígeno en común a partir del anticuerpo de referencia no humano, y la otra región V seleccionada en forma aleatoria a partir de una fuente diversa tal como una biblioteca de repertorio de anticuerpos humanos. La región V común del anticuerpo de referencia sirve como una guía, colocando a los anticuerpos de prueba en el mismo epitopo en el antígeno. y en la misma orientación, de manera que la selección es desviada hacia la fidelidad de unión de antígeno más alta al anticuerpo de referencia . Muchos tipos de sistema de repertorio pueden ser utilizados para detectar interacciones deseadas entre anticue pos de prueba y antígeno. Por ejemplo, los fragmentos de reporte de complemento pueden ser enlazados al antígeno y anticuerpo de prueba, respectivamente, de manera que la activación de reporte por la complementación de fragmento solo ocurra cuando el anticuerpo de prueba se una al antígeno. Cuando las fusiones de anticuerpo de prueba- y antígeno-fragmento de reporte son co-expresadas con un competidor, la activación de reporte se hace dependiente de la habilidad del anticuerpo de prueba para competir con el competidor, el cual es proporcional a la afinidad del anticuerpo de prueba para el antígeno. Otros sistemas de reporte que pueden ser utilizados incluyen el reactivador de un sistema de reactivación de reporte auto-inhibido (RAIR) como se describe en la Solicitud de Patente de E.U.A. Serie No. 10/208,730 (Publicación No. 200301198971). o sistema de activación competitivo descrito en la Solicitud de Patente de E.U.A. Serie No. 10/076,845 (Publicación No. 20030157579). Con el sistema de reemplazo de complementariedad guiado por epítopo en serie, la selección se hace para identificar células que expresan un anticuerpo de prueba individual junto con el competidor, antigeno y componentes de reporte. En estas células, cada anticuerpo de prueba compite uno-a-uno con el competidor para unión a una cantidad limitante de antigeno. La actividad del reporte es proporcional a la cantidad de antigeno unido al anticuerpo de prueba, lo cual a su vez es proporcional a la afinidad del anticuerpo de prueba para el antigeno y la estabilidad del anticuerpo de prueba. Los anticuerpos de prueba son inicialmente seleccionados con base en su actividad relativa a aquella del anticuerpo de referencia cuando se expresa como el anticuerpo de prueba. El resultado de la primera ronda de selección es un grupo de anticuerpos "híbridos", cada uno de los cuales está compuesto de la misma región V no humana del anticuerpo de referencia y una región V humana de la biblioteca, y cada uno de los cuales se une al mismo epítopo en el antigeno como el anticuerpo de referencia. Uno o más de los anticuerpo híbridos seleccionados en la primera ronda tendrá una afinidad para el antigeno comparable con o mayor que aquella del anticuerpo de referencia.

En el segundo paso de reemplazo de región V, las regiones V humanas seleccionadas en el primer paso se utilizan como guia para la selección de reemplazos humanos para la región V de anticuerpo de referencia no humano con una biblioteca diversa de regiones V humanas cognadas. Los anticuerpos híbridos seleccionados en la primera ronda también pueden ser utilizados como competidores para la segunda ronda de selección. El resultado de la segunda ronda de selección es un grupo de anticuerpos totalmente humanos, los cuales difieren estructuralmente del anticuerpo de referencia, pero los cuales compiten con el anticuerpo de referencia para unirse al mismo antígeno. Algunos de los anticuerpos humanos seleccionados se unen al mismo epitopo en el mismo antígeno como el anticuerpo de referencia. Entre estos anticuerpos humanos seleccionados, uno o más se une al mimo epitopo con una afinidad que es comparable con o mayora que aquella del anticuerpo de referencia. Al utilizar uno de los anticuerpos anti-hPAR-1 de ratón o quiméricos descritos anteriormente como el anticuerpo de referencia, este método puede ser fácilmente empleado para generar anticuerpos humanos que se unan a PAR-1 humano con el mismo carácter específico de unión y la misma o una mejor afinidad de unión. Además, dichos anticuerpos anti-hPAR-1 humanos también pueden ser comercialmente obtenidos de compañías que produzcan por costumbre anticuerpos humano, por ejemplo, KaloBios, Inc. (Mountain Víew, CA). Para obtener anticuerpos humanos con las mismas afinidades o unas mejores para un epitopo específico que un anticuerpo no humano de partida (por ejemplo, un anticuerpo anti-hPAR-1 de ratón), las tecnologías de KaloBios, Inc., emplean una biblioteca de anticuerpo "aceptor" humano. Una biblioteca dirigida o enfocada a epítopo de anticuerpos humanos que se unen al epítopo idéntico como el anticuerpo humano, aunque con afinidades variables, entonces es generada. Los anticuerpos en la biblioteca enfocada al epítopo después se selecciona para afinidad similar o mayor que aquella del anticuerpo no humano de partida. Los anticuerpos humanos identificados después son sometidos a análisis adicional para afinidad e identidad de secuencia. d. Otros Tipos de Anticuerpos Anti-hPAR-1 Los anticuerpos anti-hPAR-1 o moléculas de unión de antígeno de la invención también incluyen anticuerpos de cadena individual, anticuerpos biespecíf icos y anticuerpos multi-especificos. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención son anticuerpos de cadena individual. Los anticuerpos de cadena individual contienen, en una cadena de polipéptido establemente doblada individual, las regiones de unión de antígeno tanto de la cadena pesada como de la cadena ligera. Como tales, los anticuerpos de cadena individual típicamente retienen el carácter específico de unión y la afinidad de anticuerpos monoclonales pero son de un tamaño considerablemente pequeño que las inmunoglobulinas clásicas. Para ciertas aplicaciones, los anticuerpos anti-hPAR-1 de cadena individual de la invención pueden proporcionar muchas propiedades ventajosas según comparado con un anticuerpo anti-hPAR-1 intacto. Estas incluyen, por ejemplo, eliminación más rápida del cuerpo, mayor penetración de tejido tanto para formación de imagen para diagnóstico como para terapia, y una reducción significativa en el inmunogenicidad cuando se compara con anticuerpos a base de ratón. Otros beneficios potenciales de utilizar anticuerpos de cadena individual incluyen capacidades de clasificación mejoradas en métodos de clasificación de alta producción y el potencial para aplicación no parenteral. Los anticuerpos anti-hPAR-1 de cadena individual de la invención pueden ser preparados utilizando métodos que han sido descritos en la técnica. Ejemplos de dichas técnicas incluyen aquellas descritas en las Patentes de E L). A. Nos. 4,946,778 y 5,258,498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88, 1991; Shu et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:7995-7999, 1993; y Skerra et al., Science 240:1038-1040, 1988. En algunas modalidades, la invención proporciona anticuerpos anti-hPAR-1 derivatizados o enlazados a otra molécula funcional para generar una molécula biespecifica o multiespecifica, la cual se une a múltiples sitios de unión o epítopos objetivo. La molécula funcional incluye otro péptido o proteina (por ejemplo, una citocina, un agente citotóxico, un agente estimulante o inhibidor inmune, un fragmento Fab u otro fragmento de unión de anticuerpo como se describió anteriormente). Por ejemplo, un anticuerpo anti-hPAR-1 o una porción de unión de antigeno del mismo puede ser funcionalmente enlazado (por ejemplo, a través de acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más moléculas de unión, tal como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de unión. De esta manera, los anticuerpos anti-hPAR-1 biespecificos o multiespecíficos de la invención comprenden por lo menos un anticuerpo anti-hPAR-1 monoclonal o su fragmento de unión de antígeno del mismo con un primer carácter especifico de unión para PAR-1 humano y un segundo carácter específico de unión para un segundo epítopo objetivo. El segundo epítopo o bj etico puede ser un receptor Fe, por ejemplo, FcyRI o un receptor Fcy humano. Por lo tanto, la invención incluye moléculas biespecíf ¡cas y muitiespecíf ¡cas capaces de unión a células efectoras que expresan tanto FcyRI, FcyR como FccR (por ejemplo, monocitos, macrófagos o células polimorfonucleares (PMNs)), a células objetivo que expresan PAR-1 humano (por ejemplo, células cancerosas). Estas células que expresan PAR-1 humano objetivo de moléculas multiespecíficas (por ejemplo, biespecíf ¡cas o multiespecíficas) a células efectoras, y disparan actividades de célula efectora mediadas por receptor Fe, tales como fagocitosis de células que expresan PAR-1 humano, citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC), liberación de citocina, o generación del anión de superóxido. Las moléculas anti-hPAR-1 biespecíficas y multiespecíficas de la presente invención pueden hacerse a través de métodos que han sido descritos en la técnica. Estos incluyen técnicas químicas (ver, por ejemplo, Kranz et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:5807, 1981), técnicas de polidoma (ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 4,474,893), técnicas de ADN recombinante. Las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la presente invención también pueden ser preparadas conjugando los caracteres específicos de unión constituyentes, por ejemplo, los caracteres específicos de unión anti-Fcr y anti-hPAR-1, utilizando métodos conocidos en la técnica y como se describe aquí. Por ejemplo, cada carácter específico de unión de la molécula biespecífíca y multiespecífica puede ser generado separadamente y después conjugado entre sí. Cuando los caracteres específicos de unión son proteínas o péptidos, se puede utilizar una variedad de agentes de acoplamiento o de entrelazamiento cruzado para la conjugación covalente. Ejemplos de agentes de entrelazamiento cruzado incluyen proteína A. carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA). N-succinimidil-3-(2-pirídilditio)propionato (SPDP), y sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexan-l -carboxilato (sulfo-S CC). Cuando los caracteres específicos son anticuerpos (por ejemplo, dos anticuerpos humanizados), éstos pueden ser conjugados a través de enlace de sulfhidrílo de las regiones de gozne de término C de las dos cadenas pesadas. La región de gozne puede ser modificada para contener un número impar de residuos sulfhidrílo, por ejemplo, uno, antes de la conjugación. La unión de las moléculas biespecíficas y multiespecíficas a sus objetivos específicos puede ser confirmada a través del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), o un Ensayo de Tinción Western. Cada uno de estos ensayos generalmente detecta la presencia de complejos de proteína-anticuerpo de interés particular empleando un reactivo etiquetado (por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés. Por ejemplo, los complejos de FcR-antícuerpo pueden ser detectados utilizando, por ejemplo, un anticuerpo ligado a enzimas o fragmento de anticuerpo, el cual reconoce y específicamente se une a los complejos de anticuerpo-FcR. Alternativamente, los complejos pueden ser detectados utilizando cualquiera de una variedad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser radioactivamente marcado y utilizado en un radioinmunoensayo (RIA) (ver, por ejemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, Marzo 1986). El isótopo radioactivo puede ser detectado a través de medios tales como el uso de un contador gama o un contador de cíntiiación o a través de auto-radiografía. Los anticuerpos anti-hPAR-1 o moléculas de unión de antígeno de la invención también incluyen unidades de unión de antígeno de dominio individual, las cuales tienen un andamio de camélidos. Los animales en la familia de camélidos incluyen camellos, llamas, y alpacas. Los camélidos producen anticuerpos funcionales libres de cadenas ligeras. El dominio variable de cadena pesada (VH) se dobla autónomamente y funciona independientemente como una unidad de unión de antígeno. Su superficie de unión involucra solo tres CDRs según comparado con las seis CDRs en las moléculas de unión de antígeno clásicas (Fabs) o fragmentos variables de cadena individual (scFvs). Los anticuerpos de camélidos son capaces de conseguir afinidades de unión comparable con aquellas de anticuerpos convencionales. Las moléculas anti-PAR-1 a base de andamio de camélido con caracteres específicos de unión de los anticuerpos anti-hPAR-1 de ratón ejemplificados aquí pueden ser producidas utilizando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo. Dumoulin et al., Nature Struct. Biol. 11 :500-515, 2002; Ghahroudi et al., FEBS Letters 414:521-526, 1997; y Bond et al., j Mol Biol. 332:643-55, 2003. e. Liqandos de No Anticuerpo que Específicamente Unen hPAR-1 Los anticuerpos anti-PAR-1 o moléculas de unión de antígeno de la invención también incluyen monocuerpos, los cuales son mímicos de anticuerpo pequeños que utilizan el andamio de un dominio de fibronectina de tipo III (FN3). La fibronectina es una proteína grande que juega papeles esenciales en la formación de la matriz extracelular e interacciones de célula-célula. Consiste de muchas repeticiones de tres tipos (I, II y III) de pequeños dominios. La misma FN3 es el paradigma de una sub-familia grande (familia FN3 o familia de inmunoglobulina de tipo s) de la súper-familia de inmunoglobulína. La familia FN3 incluye moléculas de adhesión de célula, hormona de superficie de célula y receptores de citocina, proteínas chaperonas, y dominios de unión de carbohidrato. El andamio de FN3 funciona como una estructura de trabajo efectiva en donde bucles para funciones de construcción específicos pueden ser injertados. Existen 15 unidades de repetición de FN3 en la fibronectina humana. Típicamente, dichas moléculas de unión de antígeno de la invención utilizan la décima unidad FN3 de la fibronectina humana como andamio. Es pequeña, monomérica, y no tiene enlaces de disulfuro. Las moléculas de unión de antígeno a base de FN3, las cuales exhiben el mismo carácter específico como los anticuerpos anti-PAR-1 de ratón ilustrados aquí, pueden ser preparadas utilizando métodos descritos en la técnica, por ejemplo, Koide et al., J. Mol. Biol. 284:1141-1151, 1998; Koide et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA 99:1253-1258, 2002; y Batori et al., Protein Eng. 15:1015-20, 2002. Ver también Patentes de E.U.A. Nos. 6,818,418 y 7,115,396. Algunas otras moléculas de unión de antígeno de la invención emplean un andamio derivado de dominios A. Los dominios A ocurren como cadenas de múltiples dominios en varios receptores de superficie de célula. Los dominios de esta familia unen muchos objetivos conocidos, incluyendo moléculas pequeñas, proteínas y virus. El análisis de truncamiento ha mostrado que un objetivo típicamente se pone en contacto a través de múltiples dominios A, cada dominio uniéndose independientemente a un epitopo único. La fuerza generada al combinar múltiples dominios de unión es un aspecto poderoso para incrementar la afinidad y el carácter específico. Dichas moléculas de unión de antígeno que se unen a PAR-1 con los caracteres específicos de unión de los anticuerpos anti-PAR-1 de ratón ilustrados aquí pueden ser generadas utilizando métodos descritos en, por ejemplo, Gliemann et al., Biol. Chem. 379:951 -964, 1998; Koduri et al., Biochemistry 40:12801 -12807, 2001 y Silverman et al., Nat Biotechnol. 23:1556-61, 2005. Se han desarrollado otros compuestos que activan y se unen a objetivos en una forma similar a anticuerpos. Ciertos de estos "mímicos de anticuerpo" utilizan andamios de proteína que no son inmunoglobulína como estructuras de proteína alternativas para las regiones variables de anticuerpos. Por ejemplo, Ladner et al. (Patente de E.U.A. No. 5,260,203) describen moléculas de unión de cadena de polipéptído individual con carácter específico de unión similar a aquel de la región variable agregada, pero molecularmente separada, de cadena ligera y pesada de anticuerpos. La molécula de unión de cadena individual contiene los sitios de unión de antígeno de las regiones variables tanto pesadas como ligeras de un anticuerpo conectado a través de un enlazador de péptido y se doblarán a una estructura similar a aquella de los dos anticuerpos de péptido. La molécula de unión de cadena individual presenta varias ventajas sobre los anticuerpos convencionales, incluyendo, tamaño más pequeño, mayor estabilidad y son más fácilmente modificados. Ku et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 92( 14) :6552-6556 (1995)) describen una alternativa a anticuerpos basados en el citocromo b562. Ku et al. (1995) generaron una biblioteca en donde dos de los bucles del citocromo b562 fueron aleatorizados y seleccionados para unión contra albúmina de suero de bovino. Se encontró que los mutantes individuales se unieron selectivamente con BSA en forma similar con anticuerpos anti-BSA. Beste et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. U S A. 96(5): 1898-1903 (1999)) describen un mímico de anticuerpo basado en un andamio de lipocalina (Anticalin®). Las lipocalinas están compuestas de un ß-barril con cuatro bucles hipervariables en el término de la proteína. Beste (1999) sometió los bucles a mutagénesis aleatoria y seleccionó para unión con, por ejemplo, fluoresceína. Tres variantes exhibieron unión específica con fluoresceína, una variante mostrando unión similar a aquella de un anticuerpo anti-fluoresceina. Otro análisis reveló que todas las posiciones aleatorizadas son variables, indicando que Anticalin® pudiera ser adecuado para ser utilizado como una alternativa a anticuerpos. Las Anticalins® son péptidos pequeños, de cadena individual, típicamente de entre 160 y 180 residuos, que proporcionan varias ventajas sobre los anticuerpos, incluyendo costo reducido de producción, estabilidad incrementada en almacenamiento y reacción inmunológica reducida. Hamilton et al. (Patente de E.U.A. No. 5,770,380) describen un mímico de anticuerpo sintético que utiliza el andamio de calixareno orgánico de no péptido, rígido, unido con múltiples bucles de péptido variables usados como sitios de unión. Los bucles de péptido todos se proyectan desde el mismo lado geométricamente desde el calixareno, con respecto uno al otro. Debido a su confirmación geométrica, todos los bucles están disponibles para unión, incrementando la afinidad de unión a un ligando. Sin embargo, en comparación con otros mímicos de anticuerpo, el mímico de anticuerpo a base de calixareno no consiste exclusivamente de un péptido, y, por lo tanto, es menos vulnerable a ataque por enzimas de proteasa. Tampoco el andamio consiste puramente de un péptido. ADN o ARN, dando a entender que este mímico de anticuerpo es relativamente estable en condiciones ambientales extremas y tiene una larga vida. Además, ya que el mímico de anticuerpo a base de calixareno es relativamente pequeño, es menos probable que produzca una respuesta inmunogénica. Murali et al. (Cell. Mol. Biol. 49(2) : 209-216 (2003)) discuten una metodología para reducir anticuerpos a peptidomiméticos más pequeños, denominados "peptidomiméticos de unión de tipo anticuerpo" (ABiP), los cuales también pueden ser útiles como una alternativa a anticuerpos. 3. Polinucleótidos, Vectores y Células Huésped para Producir Anticuerpos Anti-hPAR-1 La invención proporciona polinucleótidos substancialmente purificados (ADN o ARN), los cuales codifican polipéptidos que comprenden segmentos o dominios de las cadenas del anticuerpo anti-hPAR-1 o moléculas de unión de antígeno descritos anteriormente. Algunos de los polinucleótidos de la invención comprenden la secuencia de nucleótido de la región variable de cadena pesada mostrada en SEC ID NO:1 ó 3, y/o la secuencia de nucleótido de la región variable de cadena ligera mostrada en SEC ID NO:2 ó 4. Algunos otros polinucleótidos de la invención comprenden secuencias de nucleótido que son substancialmente idénticas (por ejemplo, por lo menos 65, 80%, 95%, ó 99%) a una de las secuencias de nucleótido mostradas en SEC ID NOS:1-4. Cuando se expresan a partir de vectores de expresión apropiados, los polipéptidos codificados por estos polinucleótidos son capaces de exhibir capacidad de unión de antígeno. En la invención también se proporciona polinucleótidos, los cuales codifican por lo menos una región CDR y usualmente las tres regiones CDR de la cadena pesada o ligera de los anticuerpos anti-hPAR-1 de ratón descritos en los Ejemplos más adelante. Algunos otros polinucleótidos codifican toda o substancialmente toda la secuencia de región variable de la cadena pesada y/o la cadena ligera de los anticuerpos anti-hPAR-1 de ratón. Por ejemplo, algunos de estos polinucleótidos codifican la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena pesada mostrada en SEC ID NO:5 ó 7, y/o la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera mostrada en SEC ID NO:6 u 8. Debido a la degeneración del código, una variedad de secuencias de ácido nucleico codificarán cada una de las secuencias de aminoácido de inmunoglobulina. Los polinucleótidos de la invención pueden codificar solo la secuencia de región variable de un anticuerpo anti-hPAR-1. También pueden codificar tanto una región variable como una región constante del anticuerpo. Algunas de las secuencias de polinucleótido de la invención, ácidos nucleicos, codifican una secuencia de región variable de cadena pesada madura que es substancialmente idéntica (por ejemplo, por lo menos 80%, 90%. Ó 99%) a la secuencia de región variable de cadena pesada madura mostrada en SEC ID NO:5 ó 7. Algunas otras secuencias de polinucleótido codifican una secuencia de región variables de cadena ligera madura que es substancialmente idéntica a la secuencia de región variable de cadena ligera madura mostrada en SEC ID NO:6 u 8. Algunas de las secuencias de polinucleótido codifican un polipéptido que comprende regiones variables tanto de cadena pesada como de cadena ligera de un anticuerpo anti-PAR-1 de ratón ilustrado. Algunos otros polinucleótidos codifican dos segmentos de polipéptido que, respectivamente, son substancialmente idénticos a las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera de uno de los anticuerpos de ratón. Las secuencias de polinucleótido pueden ser producidas a través de síntesis de ADN de fase sólido de novo o través de mutagénesis de PCR de una secuencia existente (por ejemplo, secuencias descritas en los Ejemplos más adelante) que codifica un anticuerpo anti-hPAR-1 o su fragmento de unión. La síntesis química directa de ácidos nucleicos puede ser lograda a través de métodos conocidos en la técnica, tales como el método de fosfotriéste r de Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90, 1979; el método de fosfodiéster de Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979; el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al., Tetra. Lett.. 22:1859, 1981; y el método de soporte sólido de la Patente de E.U.A. No. 4,458,066. La introducción de mutaciones a una secuencia de polinucleótido a través de PCR puede realizarse como se describe en, por ejemplo, PCR Technology: Principies and Applications for DNA Am p I if i cat i on , H.A. Erlich (ed.), Freeman Press, NY, NY 1992; PCR Protocols; A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; y Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17. 1991. En la invención también se proporciona vectores de expresión y células huésped para producir los anticuerpos anti-hPAR-1 descritos anteriormente. Varios vectores de expresión pueden ser empleados para expresar los polinucleótidos que codifican las cadenas del anticuerpo anti-PAR-1 o fragmentos de unión. Se pueden utilizar vectores de expresión tanto de base viral como no viral para producir los anticuerpos en una célula huésped de mamífero. Los vectores no virales y sistemas incluyen plásmidos, vectores episomales, típicamente con un cásete de expresión para expresar una proteína o ARN, y cromosomas artificiales humanos (ver, por ejemplo, Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997). Por ejemplo, los vectores no virales útiles para la expresión de los polinucleótidos anti-hPAR-1 y polipéptidos en células de mamífero (por ejemplo, ser humano) incluyen pThioHis, A, B % C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B & C(lnvitrogen, San Diego, CA), vectores MPSV, y numerosos otros vectores conocidos en la técnica para expresar otras proteínas. Los vectores virales útiles incluyen vectores a base de retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados, virus de herpes, vectores a base de SV40, virus de papiloma, virus HBP de Epstein Barr. vectores de virus de vacuna y virus Semliki Forest (SFV). Ver. Brent et al., supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; y Rosenfeld et al.. Cell 68:143, 1992. La elección del vector de expresión depende de las células huésped pretendidas en donde el vector va a ser expresado. Típicamente, los vectores de expresión contienen un promotor y otras secuencias reguladoras (por ejemplo, mejoradores) que están operablemente enlazadas a los polinucleótidos que codifican una cadena o fragmento de anticuerpo anti-hPAR-1. En algunas modalidades, un promotor inducible es empleado para prevenir la expresión de secuencias insertadas excepto bajo condiciones de inducción. Los promotores inducibles incluyen, por ejemplo, arabinosa, lacZ, promotor de metaiotioneina o un promotor de choque térmico. Los cultivos de organismos transformados pueden ser expandidos bajo condiciones de no inducción sin desviar la población para codificar secuencias cuyos productos de expresión son mejor tolerados por las células huésped. Además de los promotores, otros elementos reguladores también pueden ser requeridos o deseados para una expresión eficiente de una cadena o fragmento de anticuerpo anti-hPAR-1- estos elementos típicamente incluyen un codón de inicio ATG y un sitio de unión de ribosoma adyacente u otras secuencias. Además, la eficiencia de expresión puede sr mejorada a través de la inclusión de mejoradores apropiados al sistema de célula en uso (ver, por ejemplo, Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; y Bittner et al.. Meth. Enzymol., 153:516, 1987). Por ejemplo, el mejorador SV40 o mejorador CMV pueden ser utilizados para incrementar la expresión en células huésped de mamífero. Los vectores de expresión también pueden proporcionar una posición de secuencia de señal de secreción para formar una proteína de fusión con polipéptidos codificados por secuencias de anticuerpo anti-hPAR-1 insertadas. Más regularmente, las secuencias de anticuerpo anti-hPAR-1 insertadas están enlazadas a secuencias de señal antes de la inclusión en el vector. Los vectores que serán utilizados para recibir secuencias que codifican dominios variables de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo anti-hPAR-1 algunas veces también codifican regiones constantes o sus partes. Dichos vectores permiten la expresión de las regiones variables como proteínas de fusión con las regiones constantes, llevando así a la producción de anticuerpos intactos o sus fragmentos. Típicamente, dichas regiones constantes son humanas. Las células huésped para alojar y expresar las cadenas de anticuerpo anti-hPAR-1 pueden ser ya sea procarióticas o eucarióticas. E. coli es un huésped procariótico útil para clonar y expresar los polinucleótidos de la presente invención. Otros huéspedes microbianos adecuados para usarse incluyen bacilli, tales como Bacillus subtilis, y otras enterobacteriaceae, tales como Salmonella, Serratia, y varias especies de Pseudomonas. En estos huéspedes procarióticos, uno también puede hacer vectores de expresión, los cuales típicamente contienen secuencias de control de expresión compatibles con la célula huésped (por ejemplo, un origen de replicación). Además, cualquier número de una variedad de promotores bien conocidos estará presente, tal como el sistema promotor de lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp). un sistema promotor de beta-lactamasa, o un sistema promotor de fago lambda. Los promotores típicamente controlan la expresión, opcionalmente con una secuencia de operador, y tienen secuencias de sitio de unión de ribosoma y similares, para iniciar y completar la transcripción y traducción. Otros microbios, tales como levaduras, también pueden ser empleados para expresar polípéptidos anti-hPAR-1 de la invención. También se pueden utilizar células de insecto en combinación con vectores de baculovirus. En algunas modalidades preferidas, las células huésped de mamífero se utilizan para expresar y producir los polípéptidos antí-hPAR-1 de la presente invención. Por ejemplo, pueden ser ya sea una línea de célula de hibridoma que expresa genes de inmunoglobulina endógenos (por ejemplo, los clones de hibridoma de mieloma como se describe en los Ejemplo) o una línea de célula de mamífero que aloja un vector de expresión exógeno (por ejemplo, las células de mieloma SP2/0 ilustradas más adelante). Estas incluyen cualquier célula de animal o humana mortal normal o inmortal normal o anormal. Por ejemplo, se ha desarrollado un número de líneas de célula huésped adecuadas capaces de secretar inmunoglobulinas intactas, incluyendo las líneas de célula CHO, varías líneas de célula COS, células HeLa, líneas de célula de mieloma, células B transformadas e hibrídomas. El uso de cultivo de célula de tejido de mamífero para expresar polipéptidos se discute en general en, por ejemplo, Winnacker, From Genes to Clones. VCH Publíshers, N.Y., N.Y., 1987. Los vectores de expresión para células huésped de mamífero pueden incluir secuencias de control de expresión, tales como un origen de replicación, un promotor, y un mejorador (ver, por ejemplo, Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986), y sitios de información de procesamiento necesarios, tales como sitios de unión de ribosoma, sitios de empalme de ARN, sitios de poliadenilación, y secuencias de termínador de transcripción. Estos vectores de expresión usualmente contienen promotores derivados de genes de mamífero o de virus de mamífero. Los promotores adecuados pueden ser constitutivos, de tipo de célula específico, de etapa específica, y/o que se pueden modular o que se pueden regular. Los promotores útiles incluyen, pero no se limitan a, el promotor de metalotioneina, el promotor posterior mayor de adenovirus constitutivo, el promotor MMTV inducible con dexametasona , el promotor SV40, el promotor MRP p o I ] ] ] , el promotor MOSV constitutivo, el promotor CMV inducible con tetraciclina (tal como el promotor CMV inmediato-temprano humano), el promotor CMV constitutivo, y combinaciones de promotor-mejorador conocidos en la técnica. Los métodos para introducir vectores de expresión que contienen las secuencias de polinucleótido de interés varían dependiendo del tipo de huésped celular. Por ejemplo. la transfección de cloruro es comúnmente utilizada para célula procarióticas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio o electroporación se puede utilizar para otros huéspedes celulares (ver, en general, Sambrook et al., supra). Otros métodos incluyen, por ejemplo, electroporación, tratamiento con fosfato de calcio, transformación mediada por liposoma, inyección y micro-inyección, métodos balísticos, virosomas, inmunoliposomas, conjugados de policatión:ácído nucleico, ADN desnudo, viriones artificiales, fusión a la proteína estructural del virus de herpes VP22 (Elliot and 0!Hare, Cell 88:223, 1997), consumo de ADN mejorado por agente, y transducción ex vivo. Para una producción de alto rendimiento, a largo plazo de proteínas recombínantes, por lo regular se deseará la expresión estable. Por ejemplo, las líneas de célula que expresan establemente cadenas de anticuerpo anti-hPAR-1 o fragmentos de unión pueden ser preparadas utilizando vectores de expresión de la invención, los cuales contienen orígenes virales de replicación o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable. Después de la introducción del vector, las células pueden dejarse desarrollar durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de que se cambien a medios selectivos. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a selección, y su presencia permite el desarrollo de células que expresan exitosamente las secuencias introducidas en medios selectivos. Se pueden hacer proliferar células resistentes, establemente transfectadas utilizando técnicas de cultivo de tejido apropiadas al tipo de célula. 4. Propiedades de Anticuerpos Anti-hPAR-1 o Moléculas de Unión de Antígeno Una vez que un anticuerpo anti-hPAR-1 o molécula de unión de antígeno. descrita anteriormente, es sintetizado o expresado a partir de un vector de expresión en una célula huésped o endógenamente e un hibridoma, puede ser fácilmente purificado de, por ejemplo, medios de cultivo y células huésped. Usualmente, las cadenas de anticuerpo son expresadas con secuencias de señal y de esta manera son liberadas al medio de cultivo. Sin embargo, si las cadenas de anticuerpo no son naturalmente excretadas por células huésped, las cadenas de anticuerpo pueden ser liberadas a través de tratamiento con detergente moderado. Las cadenas de anticuerpo después pueden ser purificadas a través de métodos convencionales incluyendo precipitación de sulfato de amonio, cromatografía de afinidad para objetivo inmovilizado, cromatografía de columna, electroforesis de gel y similares. Estos métodos son bien conocidos y por rutina se practican en la técnica, por ejemplo, Scopes, Protein Puríf ¡catión , Springer-Verlag, NY, 1982; y Harlow & Lañe, supra. A manera de ejemplo, los hibridomas seleccionados que expresan anticuerpos anti-hPAR-1 de la invención pueden desarrollarse en matraces giratorios para purificación de anticuerpo monoclonal. Los sobrenadantes pueden ser purificados y concentrados a través de cromatografía de afinidad con columnas de proteína A-sepharose o proteína G-sepharose. Las moléculas de IgG eluidas de las columnas pueden ser examinadas a través de electroforesis de gel y cromatografía en líquido de alto rendimiento para asegurar una pureza. La solución reguladora de pH puede ser intercambiada a PBS, y la concentración puede ser determinada a través de lectura de OD280. Los anticuerpos monoclonales pueden formarse a alícuotas y almacenarse a -80°C. Sin tomar en cuenta su método de preparación, los anticuerpos anti-hPAR-1 o moléculas de unión de antígeno de la presente invención se unen específicamente a hPAR-1 o un fragmento antigéníco del mismo. La unión específica existe cuando la constante de disociación para la unión de anticuerpo a hPAR-1 o un fragmento antigéníco del mismo es ± 1 µ?, de preferencia 100 µ?, y muy preferiblemente <_ 1 nM. La habilidad de un anticuerpo para unirse a hPAR-1 puede ser detectada marcando el anticuerpo de interés directamente, o el anticuerpo puede ser no marcado y la unión detectada indirectamente usando varios formatos de ensayo de emparedado. Ver, por ejemplo, Harlow & Lañe, supra. Los anticuerpos que tienen dicho carácter específico más probablemente son para compartir las propiedades ventajosas exhibidas por los anticuerpos anti-hPAR-1 de ratón o quiméricos discutidos en los Ejemplos más adelante. Típicamente, los anticuerpos anti-PAR-1 o moléculas de unión de antígeno de la invención se unen a un polipéptido PAR-1 o fragmento antigénico con una constante de asociación de equilibrio (KA) de por lo menos 1 x 10' "1, 108M'\ 109M'1, ó 1010M'\ Además, también tienen una constante de disociación cinética (kd) de aproximadamente 1 x 10"3s"'. 1 x 10" s"1, 1 x 10" 35 s ~ 1 , o menos, y se une a PAR-1 humano con una afinidad que es por lo menos dos veces mayor que sus afinidad para unión a un antigeno no específico (por ejemplo, BSA). En algunas modalidades, los anticuerpos anti-hPAR-1 o moléculas de unión de antígeno de la invención bloquean o compiten con la unión de un anticuerpo anti-hPAR-1 de referencia a un polipéptido hPAR-1. El anticuerpo anti-hPAR-1 de referencia puede tener secuencias de región variable de cadena pesada y cadena ligera mostradas en SEC ID NO:5 y 6 o SEC ID NO:7 y 8, por ejemplo, los anticuerpos anti-PAR-1 de ratón o anticuerpo quiméricos de los mismos descritos en los Ejemplos más adelante. Estos pueden ser anticuerpos anti-hPAR-1 totalmente humanos descritos anteriormente. También pueden ser otros anticuerpos anti-hPAR-1 de ratón, quiméricos o humanizados, los cuales se unen al mismo epítopo como el anticuerpo de referencia. La capacidad para bloquear o competir con el anticuerpo de referencia que se une a hPAR-1 indica que un anticuerpo anti-hPAR-1 o molécula de unión de antígeno bajo prueba se une al mismo epítopo o uno similar ya que ese se define por el anticuerpo de referencia, o a un epítopo, el cual esté suficientemente cerca del epítopo unido por el anticuerpo anti- hPAR-1 de referencia. Dichos anticuerpos especial y probablemente son para compartir las propiedades ventajosas identificadas para el anticuerpo de referencia. La capacidad para bloquear o competir con el anticuerpo de referencia puede ser determinada, por ejemplo, a través de un ensayo de unión de competencia. Con un ensayo de unión de competencia, el anticuerpo bajo prueba es examinado para su habilidad para inhibir la unión específica del anticuerpo de referencia a un antígeno común (por ejemplo, un polipéptido PAR-1) 0 epítopo en el antígeno. Un anticuerpo de prueba compite con el anticuerpo de referencia para la unión específica al antígeno o epítopo si un exceso del anticuerpo de prueba substancialmente inhibe la unión del anticuerpo de referencia. Inhibición substancial significa que el anticuerpo de prueba reduce la unión específica en el anticuerpo de referencia usualmente por al menos 10%, 25%, 50%, 75%, ó 90%. Existe un número de ensayos de unión de competencia que pueden ser utilizados para determinar la competencia de un anticuerpo anti-hPAR-1 de prueba o molécula de unión de antígeno con el anticuerpo anti-hPAR-1 de referencia para la unión a PAR-1 humano. Estos incluyen, por ejemplo, radioinmunoensayo directo o indirecto de fase sólida (RIA), inmunoensayo de enzima directo o indirecto de fase sólida (EIA), ensayo de competencia de emparedado (ver, Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253, 1983); EIA de biotina-avidina directo de fase sólida (ver Kirklanda et al., J. Immunol. 137:3614-3619, 1986): ensayo marcado directo de fase sólida, ensayo emparedado marcado directo de fase sólida (ver Harlow & Lañe, supra); RIA directo de fase sólida utilizando la etiqueta 1-125 (ver Morel et al., Molec. Immunol. 25:7-15, 1988); El A de biotina-avidina directo de fase sólida (Cheung et al., Virology 176:546-552, 1990); y RIA directo ( M o I d e n h a u e r et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82, 1990). Típicamente, dicho ensayo involucra el uso de antígeno purificado unido a una superficie sólida o células que llevan antígeno, un anticuerpo anti-hPAR-1 de prueba no marcado y un anticuerpo de referencia marcado. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de marca o etiqueta unida a la superficie sólida o células en presencia del anticuerpo de prueba. Usualmente, el anticuerpo de prueba está presente en exceso. Los anticuerpos identificados por el ensayo de competencia (anticuerpos de competencia) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epitopo como el anticuerpo de referencia y anticuerpos que se unen a un epitopo adyacente suficientemente cerca al epitopo unido por el anticuerpo de referencia para que ocurra obstrucción esférica.

Para determinar si una anticuerpo anti-PAR-1 de prueba o molécula de unión de antígeno y un anticuerpo anti-PAR-1 de referencia se unen a epítopos únicos, cada anticuerpo puede ser biotinilado utilizando reactivos comercialmente disponibles (por ejemplo, reactivos de Pierce, Rockford, IL). Se pueden realizar estudios de competencia utilizando anticuerpos monoclonales no marcados y anticuerpos monoclonales biotinilados utilizando placas de ELISA cubiertas con polipéptido PAR-1. La unión de MAb biotinilado puede ser detectada con una sonda de estrep-avidina-fosfatasa alcalina. Para determinar el isotipo de un anticuerpo a n t i -PAR-1 purificado, se pueden realizar ELISAs de isótopo. Por ejemplo, las cavidades de placas de microtitulación pueden ser cubiertas con 1 pg/ml de I g G anti-humana durante la noche a 4°C. después de bloquear con 1% de BSA, las placas se hicieron reaccionar con 1 pg/ml o menos del anticuerpo anti-hPAR-1 monoclonal o controles de isotipo purificado, a temperatura ambiente durante una a dos horas. Las cavidades después se hicieron reaccionar ya sea con I g G 1 humana o sondas conjugadas con I g M -fosfatasa alcalina específica. Las placas después se desarrollaron y se analizaron de manera que el isótopo del anticuerpo purificado puede ser determinado. Para demostrar la unión de anticuerpos anti-hPAR-1 monoclonales o moléculas de unión de antígeno a células vivas que expresan un polipéptido hPAT-1 , se puede utilizar citometría de flujo. En resumen, las líneas de célula que expresan hPAR-1 (desarrolladas bajo condiciones de crecimiento estándares) pueden ser mezcladas con varias concentraciones de un anticuerpo anti-hPAR-1 en PBS conteniendo 0.1 % de BSA y 10% de suero de bovino fetal, e incubarse a 37°C durante 1 hora. Después del lavado, las células se hicieron reaccionar con el anticuerpo de I g G anti-humano marcado con fluoresceína bajo las mismas condiciones como la tinción de anticuerpo primario. Las muestras pueden ser analizadas a través del instrumento FACScan utilizando propiedades de difusión de luz y lateral para abrir células individuales. Se puede utilizar un ensayo alternativo usando microscopio de fluorescencia (además de o en lugar de) del ensayo de citometría de flujo. Las células pueden ser teñidas como se describió anteriormente y se examinaron a través de microscopio de fluorescencia. Los anticuerpos anti-hPAR-1 de la invención además pueden ser probados para reactividad con un polipéptido hPAR-1 o fragmento antigénico a través de ¡nmunotinción. En resumen, los polipéptidos hPAR-1 purificados o proteínas de fusión, o extractos de célula de células que expresan PAR-1 pueden ser preparados y sometidos a electrof oresis de gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio. Después de la electroforesis, los antígenos separados son transferidos a membranas de nitrocelulosa, bloqueados con 10% de suero de bovino fetal, y sondeados con los anticuerpos monoclonales que serán probados. La unión de IgG humana puede ser detectada utilizando fosfatasa alcalina de IgG anti-humana y desarrollada con tabletas de substrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co. St. Louis, MO). 5. Aplicaciones Terapéuticas y Composiciones Farmacéuticas Los anticuerpos anti-hPAR-1 o moléculas de unión de antígeno descritos aquí pueden ser empleados en muchas aplicaciones terapéuticas o profilácticas inhibiendo las actividades de señalización de PAR-1. En aplicaciones terapéuticas, una composición que comprende un anticuerpo antagonista anti-hPAR-1 o molécula de unión de antígeno (por ejemplo, un anticuerpo anti- hPAR-1 humanizado) es administrada a un sujeto ya afectado por una enfermedad o condición mediada por, causada por o asociada con la señalización de PAR-1. La composición contiene el anticuerpo 0 molécula de unión de antígeno en una cantidad suficiente para inhibir, parcialmente detener, o detectablemente reducir la progresión de la condición, y sus complicaciones. En aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los anticuerpos anti-hPAR-1 o moléculas de unión de antigeno se administran a un paciente que todavía no sufre un trastorno relacionado con la señalización de PAR-1. Más bien, están dirigidas a un sujeto que está en riesgo de, o tiene una predisposición, a desarrollar dicho trastorno. Dichas aplicaciones permiten al sujeto mejorar la resistencia del paciente o retrasar la progresión de un trastorno mediado por la señalización de PAR-1. Numerosas condiciones de enfermedad son mediadas por la señalización intracelular mediada por PAR-1 aberrante o anormalmente alta. La señalización intracelular mediada por PAR-1 anormalmente alta puede ser causada por, por ejemplo, la exposición del receptor a concentraciones anormalmente altas de una proteasa de activación (por ejemplo, trombina) o niveles de expresión de PAR- 1 en superficie de célula, anormalmente altos. La inhibición de PAR-1 es útil para tratar trastornos proliferati vos trombóticos o vasculares, así como para inhibir la progresión de cánceres. Ver, por ejemplo, Darmoul et al., Mol Cáncer Res (2004) 2(9):514-22 y Salah et al., Mol Cáncer Res (2007) 5(3):229-40. La inhibición de PAR-1 también encuentra uso en prevenir o inhibir trastornos inflamatorios intestinales crónicos, incluyendo enfermedad inflamatoria de intestino (IBD), síndrome de intestino irritable (IBS) y colitis ulcerativa; y trastornos fibróticos, incluyendo fibrosis hepática y fibrosis de pulmón. Ver, por ejemplo, Vergnolle et al.. J Clin Invest (2004) 114(10): 1444; Yoshida, et al., Aliment Pharmacol Ther (2006) 24(Supl 4):249; Mercer, et al., Ann NY Acad Sci (2007) 1096:86-88: Sokolova y Reiser, Pharmacol Ther (2007) PMID: 17532472. Los cánceres que pueden ser inhibidos o prevenidos por los anticuerpos anti-PAR-1 o moléculas de unión de antígeno de la invención incluyen, sin limitación, cánceres epiteliales incluyendo carcinomas; gliomas, mesoteliomas, melanomas, linfomas, leucemias, adenocarcinomas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer cervical, glioblastoma, leucemia, linfoma, cáncer de próstata, y linfoma de Burkitt, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de colon, cáncer colorectal, cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer pancreático, cáncer hepatobiliar, cáncer de vesícula biliar, cáncer del intestino delgado, cáncer rectal, cáncer de riñon, cáncer de vejiga, cáncer próstata, cáncer de pene, cáncer uretral, cáncer testicular, cáncer cervical, cáncer vaginal, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer de tiroides, cáncer de paratiroides, cáncer adrenal, cáncer endocrino pancreático, cáncer carcinoide, cáncer de huesos, cáncer de piel, retinoblastomas, mielomas múltiples, linfoma de Hodgkin, y linfoma de no Hodgkin (ver, C AN C E R : P R I N C I P LE S AND PRACTICE (DeVita, V.T. et al., eds. 1997) para cánceres adicionales). La inhibición de PAR- también encuentra uso en prevenir o inhibir condiciones de enfermedad que pueden o no ser mediadas por una expresión de PAR-1 aberrante o anormalmente alta o señalización intracelular. Por ejemplo, la inhibición de PAR-1 es útil para prevenir o inhibir daño por isquemia-reperfusión, incluyendo daño al miocardio, renal, cerebral e isquemia-reperfusión intestinal. Ver, por ejemplo, Strande, et al., Basic Res. Cardiol (2007) 102(4):350-8; Sevastos, et al., Blood (2007) 109(2):577-583; Junge, et al., Proc Nati Acad Sci USA (2003) 100(22): 13019-24 y Tsuboi, et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol (2007) 292(2):G678-83. La inhibición de señalización intracelular de PAR-1 también puede ser utilizada para inhibir infección de células por el virus de herpes simple (HSV1 y HSV2). Ver, Sutherland, et al., J Thromb Haemost (2007) 5(5): 1055-61. La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos anti-hPAR-1 o moléculas de unión de antígeno formuladas junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones además pueden contener otros agentes terapéuticos que son adecuados para tratar o prevenir un trastorno dado. Los vehículos farmacéuticamente aceptables mejoran o estabilizan la composición, o facilitan la preparación de la composición. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. Una composición farmacéutica de la presente invención puede ser administrada a través de una variedad de métodos conocidos en la técnica. La ruta y/o modo de administración varían dependiendo de los resultados deseados. Se prefiere que la administración sea intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, o subcutánea, o se administra al sitio del objetivo. El vehículo farmacéuticamente aceptable debe ser adecuado para administración intravenosa. intramuscular, subcutánea, parenteral. espinal o epidérmica (por ejemplo, a través de inyección o infusión). Dependiendo de la ruta de administración, el compuesto activo, es decir, anticuerpo, molécula biespecífíca y multiespecífica, puede ser cubierto con un material para proteger al compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que puedan inactivar el compuesto. En algunas modalidades, la composición es estéril y fluida. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo, a través del uso de recubrimiento tal como lecitina, a través del manteniendo del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y a través del uso de agentes tensoactivos. En muchos casos, se prefiere incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol o sorbitol, y cloruro de sodio en la composición. La absorción a largo plazo de las composiciones inyectables puede producirse incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser preparadas de acuerdo con métodos bien conocidos y rutinariamente practicados en la técnica. Ver, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20° ed., 2000; y Sustained and Controlled Reléase Drug Delibery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978. Las composiciones farmacéuticas preferiblemente se fabrican bajo condiciones GMP. Típicamente, una dosis terapéuticamente efectiva o dosis eficaz del anticuerpo anti-hPAR-1 se emplea en las composiciones farmacéuticas de la invención. Los anticuerpos anti-hPAR- son formulados en formas de dosis farmacéuticamente aceptables a través de métodos convencionales conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los regímenes de dosis son ajustados para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un bolo individual, se pueden administrar varias dosis divididas durante un tiempo o la dosis puede ser proporcionalmente reducida o incrementada según se indique en las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosis unitaria para facilitar la administración y uniformidad de dosis. La forma de dosis unitaria como se usa aquí se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos que serán tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Los niveles de dosis reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser variados con el fin de obtener una cantidad del ingrediente activo, el cual es efectivo para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, composición, y modo de administración, sin ser tóxica para el paciente. El nivel de dosis seleccionado depende de una variedad de factores farmacocinéticos incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o el éster, sal o amida de la misma, la ruta de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular empleado, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud en general e historia médica anterior del paciente que se está tratando, y factores similares. Un médico o veterinario puede iniciar con dosis de los anticuerpos de la invención empleados en la composición farmacéutica a niveles menores que aquellos requeridos para obtener el efecto terapéutico deseado y gradualmente incrementar la dosis hasta que se logre el efecto deseado. En general, las dosis efectivas de las composiciones de la presente invención varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo la enfermedad específica o condición que será tratada, medios de administración, sitio objetivo, estado fisiológico del paciente, si el paciente es un ser humano o animal, otros medicamentos administrados, y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Las dosis de tratamiento necesitan ser tituladas para optimizar la seguridad y eficacia. Para la administración con un anticuerpo, la dosis varía de aproximadamente 0.0001 a 100 mg/kg, y más usualmente de 0.01 a 5 mg/kg, del peso del cuerpo huésped. Por ejemplo, las dosis pueden ser 1 mg/kg del peso del cuerpo o 10 mg/kg del peso del cuerpo o dentro de la escala de 1-10 mg/kg. Un régimen de tratamiento ilustrativo permite la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. El anticuerpo usualmente es administrado en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosis individuales pueden ser semanalmente, mensualmente o anualmente. Los intervalos también pueden ser irregulares según indicado midiendo los niveles del anticuerpo ant¡-hPAR-1 en la sangre del paciente. En algunas métodos, la dosis se ajusta para obtener una concentración del anticuerpo en el plasma de 1-1000 pg/ml y en algunos métodos, 23-500 pg/ml. Alternativamente, el anticuerpo puede ser administrado como una formulación deliberación sostenida, en ese caso se requiere una administración menos frecuente. La dosis y frecuencia varían dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanizaos muestran una vida media más larga que aquella de anticuerpos quiméricos y anticuerpos no humanos. La dosis y frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, una dosis relativamente baja es administrada a intervalos relativamente no frecuentes durante un periodo largo de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento para el reto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, una dosis relativamente alta a intervalos relativamente cortos es algunas veces requerida hasta que la progresión de la enfermedad se reduce o termina, y de preferencia hasta que el paciente muestra mitigación, parcial o completa, de síntomas de la enfermedad. Después, al paciente se le puede administrar un régimen profiláctico.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar más la invención pero no limitan su alcance. Otras variantes de la invención serán fácilmente evidentes para algún experto en la técnica y están abarcadas por las reivindicaciones anexas.

Ejemplo 1 Desarrollo de anticuerpos antagonistas anti-hPAR-1 de ratón Este Ejemplo describe el desarrollo de anticuerpos antagonistas anti-hPAR-1 de ratón. Se inmunizaron ratones Bcl2 Wehi22 con PAR-1 humano/proteina de fusión tioredoxina. La inmunización se realizó 8 veces durante 18 días. Se aislaron células B de ganglios linfáticos periféricos y se fusionaron a células de mieloma F0 (ATCC, Manassas, VA). La producción de anticuerpo se clasificó a través de ELISA contra hPAR-1 /proteína de fusión tioredoxina. Se obtuvo un total de 10 clones, los cuales produjeron anticuerpos que específicamente reconocieron hPAR-1. La unión de anticuerpos hPAR-1 a PAR-1 de superficie de célula se analizó utilizando ELISA de célula en células HT29 (PAR-1 positivo) y células colo205 (PAR-1 negativo). En resumen, las células se incubaron con sobrenadantes de cultivo de hibridoma seguido por IgG de anti-ratón conjugada con HRP. Se agregó substrato de TMB (KPL, Gaithersburg, MD), 20 minutos después de que las cavidades se acidificaron con ácido sulfúrico (2N) y se medió el color a 450 nm. Los resultados mostraron que 5 clones de hibridoma de 10 clones fueron capaces de unirse al receptor de superficie de célula. El anticuerpo monoclonal (mAb) de cada uno de los clones positivos a unión de célula se purificó. En resumen, se purificó un medio acondicionado libre de suero en resina de Proteína G (Amersham Biosciences, Piscataway , Y). Además, los 10 clones de producción de anticuerpo se subclonaron a través de dilución limitante, y los clones resultantes se evaluaron para la unión de PAR-1 a través de ELISA y ELISA de célula. También se evaluaron los subclones funcionales para funcionalidad como se describe más adelante. Se empleó un ensayo de flujo de calcio dependiente de hPAR-1 para clasificar anticuerpos antagonistas de hPAR-1 funcionales. Se sabe que la trombina divide el dominio N-terminal de PAR-1 , removiendo aproximadamente 15 aminoácidos. El dominio N-terminal restante, denominado como ligando unido, es responsable de la iniciación de señalización mediada por PAR-1. Esta escisión de PAR-1 a través de trombina da como resultado un flujo de calcio rápido y pasajero en células puede ser medida utilizando reactivos comercialmente disponibles (Molecular Devices). Específicamente, se evaluaron anticuerpos purificados en células HT-29, HCT-116 y DU145 para su habilidad para inhibir el flujo de calcio después de tratamiento con trombina. Las células en colorante FlipR (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) fueron pre-i ncubadas con anticuerpos purificados con proteína G durante 1 hora, y se indujo el flujo Ca2 + con trombina a varias concentraciones. Los resultados indican que un subclon de cada uno de los dos clones (4E7.J14 & 6E11.H6) mostró fuerte actividad antagonista. El ensayo de FlipR también se corrió en los clones funcionales utilizando células tanto DU145 como HCT116. Ambas líneas de célula confirmaron la actividad de los antagonistas de anticuerpo funcional. Con el fin de evaluar el mecanismo de los antagonistas, los anticuerpos también fueron examinados para su habilidad para unirse al receptor PAR-1 después de la escisión a través de trombina. El PAR-1 /tioredoxina se dividió a completarse con trombina. Después de neutralizar la trombina, se agregó una porción igual de PAR-1 de longitud completa/proteína tioredoxina. Los anticuerpos se unieron a la Proteína G, y los anticuerpos inmovilizados se utilizaron para inmunoprecípitar la mezcla de proteína de fusión dividída/PAR-1 de longitud completa. La resina se aisló, se lavó, y las proteínas capturadas se identificaron a través de SDS-PAGE. Tres de los clones evaluados fueron capaces de unirse a la porción de PAR-1 adyacente a la proteína de fusión tioredoxina incluyendo los dos clones funcionales 4E7 y 6 E 11. Este dominio de PAR-1 es representativo del ligando unido que permanece en la superficie de célula después de la escisión de trombina. Los resultados también indican que los anticuerpos que bloquearon la escisión de trombina de PAR-1 pero fallaron para unirse al ligando unido fueron mucho menos potentes en ensayos de FlipR. De esta manera, parece que la unión al ligando unido es necesaria, aunque no suficiente para la actividad funcional. Las regiones de los anticuerpos funcionales de cadena pesada (VH) y cadena ligera (VL) fueron clonadas a través de RT-PCR. Las secuencias de los iniciadores utilizadas para la identificación de regiones variables de las cadenas pesada y ligera para ambos clones (4E7.J14.L16 & 6E11.H6.A9) fueron las mismas, y son como siguen. Iniciadores para VH son: (1) HV1 :GGGTCTAGACACCATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT (SEC ID NO:33) y (2) H-Constante: GCGTCTAGAAYCTCCACACACAGG RRCCAGTGGATAGAC (SEC ID NO:34). Iniciadores para VL son: (1) LV5: GGGTCTAGACACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGDNA (SEC ID NO:35) y (2) L-Constante: GCGTCTAG AACTGG ATGGTGGG AAG ATGG (SEC ID NO:36). En resumen, se aisló ARN total. Se realizó RT-PCR con S7 iniciadores de avance contra secuencia de señal de regiones variables ya sea de cadena pesada o ligera, e iniciadores inversor contra región de cadena pesada CH1 i región constante kappa de cadena ligera. Los productos de PCR fueron clonados en el vector pCR ]] pcDNA3.1 /V5-HÍS-TROP-TA para secuenciación . Después se determinaron secuencias de polinucleótido de las secuencias de región variable de cadena pesada y cadena ligera de estos clones de anticuerpo (Figura 1). Las secuencias de aminoácido correspondientes de las regiones variables se muestran en la Figura 2. También en la Figura 2 se indican las regiones CDR y las regiones de estructura deducidas de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat et al. , supra.

Ejemplo 2 Generación de anticuerpos anti-hPAR-1 quiméricos Este ejemplo describe la generación y caracterización de anticuerpos anti-hPAR-1 quiméricos. Los anticuerpos quiméricos contienen regiones variables del anticuerpo anti-hPAR-1 de ratón observado anteriormente y regiones constantes de inmunoglobulinas humanas. Para la generación de los anticuerpos quiméricos, las regiones variables del anticuerpo de ratón contra el clon PAR-1 humano fueron re-PCRred con iniciadores designados para clonar en vectores de cásete. Después se clonaron respectivamente en vectores de cásete, los cuales contienen fusiones en marco con secuencias lectoras de inmunoglobulina humana, segmentos J y señales de empalme-donador. Las secuencias después fueron transferidas a vectores de expresión de mamífero conteniendo la región constante de inmunoglobulina humana, selección de Neomicina en cadena pesada, selección de dhfr en cadena ligera, y amplificación de gen utilizando metotrexato. Los plásmidos de ADN de cadena pesada I g G 1 quimérica y cadena ligera kappa se co-electroforearon en células de mieloma SP2/0. Las células se seleccionaron con geneticina, y después se cultivaron y expandieron en un medio de crecimiento conteniendo geneticina y metotrexato. Las células se adaptaron en un medio libre de suero para purificación de anticuerpo. Se purificaron los anticuerpos I g G 1 quiméricos a partir de células SP2/0 transfectadas. La actividad antagonista de los anticuerpos I g G quiméricos purificados pueden ser similarmente examinados en el ensayo FlipR como anticuerpos anti-hPAR-1 de ratón. La prueba pudo revelar que los anticuerpos anti-hPAR-1 quiméricos exhiben una actividad antagonista similar a aquella del anticuerpo I g G 1 de ratón.

Ejemplo 3 Anticuerpo anti-hPAR-1 inhibe la secreción de IL-8 mediada por trombina Este Ejemplo describe la inhibición de secreción de IL-8 mediada por trombina a partir de HUVECs a través de los anticuerpos antagonistas anti-hPAR-1. Las células se expusieron a trombina durante la noche, lo cual dio como resultado la elevación de IL-8 secretada en el medio. Los anticuerpos se agregaron 1 hora antes del tratamiento con trombina. Los resultados, según medidos por ELISA, se muestran en la Figura 3. Según se demuestra en la Figura, los dos anticuerpos anti-hPAR-1 de ratón fueron capaces de inhibir el incremento en la secreción de IL-8 a partir de HUVECs que fueron tratadas con trombina. Se entiende que los ejemplos y modalidades descritas aquí son solo para propósitos ilustrativos y que varias modificaciones o cambios a la luz de la misma serán sugeridos por aquellos expertos en la técnica y se van a incluir dentro del espíritu y vista de esta solicitud y alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes, y solicitudes de patente citadas aquí se incorporan aquí por referencia para todos los propósitos.

Claims (38)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o molécula de unión de antígeno que específicamente se une a un epítopo de PAR-1 humano, en donde el epítopo comprende la secuencia de aminoácido SFLLRNPNDKYEPFWEDEENESGLTE (SEC ID NO:38), y en donde el anticuerpo o molécula de unión de antígeno es un antagonista de PAR-1.

2. El anticuerpo o molécula de unión de antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, el cual comprende una región determinante de complementariedad (CDR) de cadena pesada de SEC ID NO.21 , SEC ID NO:22 ó SEC ID NO:23; o una secuencia de CDR de cadena ligera de SEC ID NO:24, SEC ID NO:25, ó SEC ID NO:26.

3. El anticuerpo o molécula de unión de antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, el cual comprende secuencias de CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada, SEC ID NO:21 , SEC ID NO:22 y SEC ID NO:23, respectivamente; y secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera, SEC ID N0.24, SEC ID NO:25. y SEC ID NO:26, respectivamente.

4. El anticuerpo o molécula de unión de antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, el cual comprende una región determinante de complementariedad (CDR) de cadena pesada de SEC ID NO:27, SEC ID NO:28 o SEC ID NO:29; o una secuencia de CDR de cadena ligera de SEC ID NO:30, SEC ID NO:31 , o SEC ID NO:32.

5. El anticuerpo o molécula de unión de antígeno de acuerdo con la reivindicación 1 , el cual comprende secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada, SEC ID NO:27. SEC ID NO:28 y SEC ID NO:29, respectivamente; y secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera, SEC ID NO:30, SEC ID NO:31, y SEC ID NO:32, respectivamente.

6. El anticuerpo o molécula de unión de antigeno de acuerdo con la reivindicación 1, el cual comprende (i) una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada que es por lo menos 85% idéntica a SEC ID NO:5 y una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera que es por lo menos 85% idéntica a SEC ID NO:6, o (ii) una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada que es por lo menos 85% idéntica a SEC ID NO:7 y una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera que es por lo menos 85% idéntica a SEC ID NO:8.

7. El anticuerpo o molécula de unión de ant i geno de acuerdo con la reivindicación 1 , el cual comprende (i) una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada de SEC ID NO:5, y una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera de SEC ID NO:6, o (i¡) una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada de SEC ID NO:7 y una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera de SEC ID NO:8.

8. El anticuerpo o molécula de unión de antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, el cual es un anticuerpo de ratón.

9. El anticuerpo o molécula de unión de antígeno de acuerdo con la reivindicación 1 , el cual es un anticuerpo monoclonal.

10. El anticuerpo o molécula de unión de antígeno de acuerdo con la reivindicación 1 , el cual es un anticuerpo quimérico.

11. El anticuerpo o molécula de unión de antígeno de acuerdo con la reivindicación 10, el cual comprende una región constante de cadena pesada humana y una región constante de cadena ligera humana .

12. El anticuerpo o molécula de unión de antígeno de acuerdo con la reivindicación 1 , el cual es un anticuerpo humanizado.

13. El anticuerpo o molécula de unión de antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, el cual es un anticuerpo humano.

14. El anticuerpo o molécula de unión de antígeno de acuerdo con la reivindicación 1 , el cual es un anticuerpo de cadena individual.

15. El anticuerpo o molécula de unión de antígeno de acuerdo con la reivindicación 1 , el cual es un fragmento Fab.

16. - El anticuerpo o molécula de unión de antigeno de acuerdo con la reivindicación 1 , el cual es un monocuerpo con un andamio derivado de un dominio de tipo II de fibronectina humana.

17. Un polinucleótido aislado o recombinante, el cual codifica un anticuerpo o molécula de unión de antígeno que específicamente se une a un epítopo de PAR-1 humano, en donde el epítopo comprende la secuencia de aminoácido SFLLRNPNDKYEPFWEDEENESGLTE (SEC ID NO:38), y en donde el anticuerpo o molécula de unión de antígeno es un antagonista de PAR-1.

18. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 17. en donde el anticuerpo o molécula de unión de antigeno es un anticuerpo humano

19. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el anticuerpo o molécula de unión de antigeno comprende (i) secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada, SEC ID NO:21, SEC ID NO:22 y SEC ID NO:23, respectivamente; y secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera, SEC ID NO:24, SEC ID NO:25, y SEC ID NO:26, respectivamente; o (ii) secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada, SEC ID NO;27, SEC ID NO:28 y SEC ID NO:29, respectivamente; y secuencias de CDR1. CDR2 y CDR3 de cadena ligera, SEC ID NO:30. SEC ID NO:31 , y SEC ID NO:32, respectivamente.

20. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el anticuerpo o molécula de unión de antígeno comprende (i) una secuencia de región variable de cadena pesada madura que es por lo menos 90% idéntica a la región madura de SEC ID NO:5, y una secuencia de región variable de cadena ligera madura que es por lo menos 90% idéntica a la región madura de SEC ID NO:6; o (ii) una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada madura que es por lo menos 90% idéntica a SEC ID NO:7 y una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera madura que es por lo menos 90% idéntica a SEC ID NO:8.

21. - El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el anticuerpo o molécula de unión de antígeno comprende (i) una secuencia de región variable de cadena pesada madura que es idéntica a la región madura de SEC ID N0 5, y una secuencia de región variable de cadena ligera madura que es idéntica a la región madura de SEC ID N0:6; o (ii) una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada madura que es idéntica a la región madura de SEC ID NO:7 y una secuencia de región variable de cadena ligera madura que idéntica a la región variable de SEC ID NO:8.

22. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 17, el cual es un ADN.

23. Una célula huésped aislada que comprende (1) un segmento de ADN recombinante que codifica una cadena pesada del anticuerpo o molécula de unión e antígeno de la reivindicación 1 , y (2) un segundo segmento de ADN recombinante que codifica una cadena ligera del anticuerpo o molécula de unión de antígeno; en donde dichos segmentos de ADN están respectiva y operativamente enlazados a un primer y un segundo promotor, y son capaces de ser expresados en dicha célula huésped.

24. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 23, en donde el anticuerpo o molécula de unión de antigeno es un anticuerpo monoclonal humano.

25. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 23, en donde el anticuerpo o molécula de unión de antígeno comprende (i) secuencias de CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada, SEC ID NO:21, SEC ID NO:22, y SEC ID NO:23, respecti amente; y secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera, SEC ID NO:24, SEC ID NO:25, y SEC ID NO:26, respectivamente; o (ii) secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada, SEC ID NO:27, SEC ID NO:28 y SEC ID NO:29, respectivamente; y secuencias de CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera, SEC ID NO:30, SEC ID NO:31, y SEC ID NO:32, respectivamente.

26. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 23, en donde el anticuerpo o molécula de unión de antígeno comprende (i) una secuencia de región variable de cadena pesada madura que es por lo menos 90% idéntica a la región madura de SEC ID NO:5, y una secuencia de región variable de cadena ligera madura que es por lo menos 90% idéntica a la región madura de SEC ID NO:6; o (ii) una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada madura que es por lo menos 90% idéntica a SEC ID NO:7, y una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera madura que es por lo menos 90% idéntica a SEC ID NO:8.

27. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 23, en donde el anticuerpo o molécula de unión de antigeno comprende (i) una secuencia de región variable de cadena pesada madura que es idéntica a la región madura de SEC ID NO:5 y una secuencia de región variable de cadena ligera madura que es idéntica a la región madura de SEC ID NO:6; o (ii) una secuencia de región variable de cadena pesada madura que es idéntica a la región madura de SEC ID NO:7, y una secuencia de región variable de cadena ligera madura que es idéntica a la región madura de SEC ID NO: 8.

28. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 23, la cual es una línea de célula de mamífero no humana.

29. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o molécula de unión a antígeno que específicamente se une a un epítopo de PAR-1 humano, en donde el epítopo comprende la secuencia de aminoácido SFLLRNPNDKYEPFWEDEENESGLTE (SEC ID NO:38), y en donde el anticuerpo o molécula de unión de antígeno es un antagonista de PAR-1.

30. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 29, que comprende un anticuerpo que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada, SEC ID NO:21, SEC ID NO:22, y SEC ID NO:23, respectivamente; y secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera, SEC ID NO:24, SEC ID NO:25 y SEC ID NO:26, respectivamente.

31. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 30, que comprende un anticuerpo que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada, SEC ID NO:27, SEC ID NO:28 y SEC ID NO:29, respectivamente; y secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera, SEC ID NO:30, SEC ID NO:31, y SEC ID NO:32, respectivamente.

32. Un método para mitigar los síntomas de una condición de enfermedad mediada por señalización intracelular aberrante a través de PAR-1, que comprende administrar a un sujeto con la necesidad del mismo, un anticuerpo o molécula de unión de antígeno que específicamente se une a un epítopo de PAR-1 humano, en donde el epítopo comprende la secuencia de aminoácido SFLLRNPNDKYEPFWEDEENESGLTE (SEC ID NO:38), y en donde el anticuerpo o molécula de unión de antigeno es un antagonista de PAR-1.

33. El método de acuerdo con la reivindicación 32, que comprende administrar un anticuerpo que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada, SEC ID NO:21, SEC ID NO:22 y SEC ID NO:23, respectivamente; y secuencias de CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera, SEC ID NO:24. SEC ID NO:25, y SEC ID NO:26, respectivamente.

34. El método de acuerdo con la reivindicación 32. que comprende administrar un anticuerpo que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada, SEC ID NO:27, SEC ID NO:28 y SEC ID NO:29, respectivamente; y secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera, SEC ID NO:30, SEC ID NO:31. y SEC ID NO:32, respecti amente.

35. El método de acuerdo con la reivindicación 32, en donde la condición de enfermedad mediada por señalización intracelular aberrante a través de PAR-1 es un trastorno inflamatorio intestinal crónico.

36. El método de acuerdo con la reivindicación 32, en donde la condición de enfermedad mediada por señalización intracelular aberrante a través de PAR-1 es un trastorno fibrótico.

37. El método de acuerdo con la reivindicación 32, en donde la condición de enfermedad mediada por señalización intracelular aberrante a través de PAR-1 es un cáncer que sobre-expresa PAR-1.

38. El método de acuerdo con la reivindicación 32, en donde la condición de enfermedad mediada por señalización intracelular aberrante a través de PAR-1 es daño por isquemia-reperfusión.