JP5483023B2 - がん細胞運動およびがん細胞浸潤抑制剤 - Google Patents
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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Description
(1)PAR1(プロテアーゼ活性化受容体1)に特異的に結合してMMP1(マトリックスメタロプロテアーゼ1)による切断を阻害し、がん細胞の運動活性および浸潤活性を阻害する抗体、または該抗体と同様の性質を保持する該抗体のフラグメント;
(2)PAR1(プロテアーゼ活性化受容体1)のMMP1(マトリックスメタロプロテアーゼ1)による切断部位(Arg41とSer42の間)を含む領域をエピトープとして特異的に結合し、がん細胞の運動活性および浸潤活性を阻害する(1)記載の抗体、または該抗体と同様の性質を保持する該抗体のフラグメント;
(3)該エピトープのアミノ酸配列が配列番号:1で示されるものである(2)記載の抗体、または該抗体と同様の性質を保持する該抗体のフラグメント;
(4)独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターから受託番号FERM BP−11105を付与されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である、(3)記載の抗体、または該抗体と同様の性質を保持する該抗体のフラグメント;
(5)キメラ化またはヒト化されている、(1)〜(4)のいずれかに記載の抗体、または該抗体と同様の性質を保持する該抗体のフラグメント;
(6)モノクローナル抗体である(1)〜(5)いずれかに記載の抗体;
(7)ポリクローナル抗体である(1)〜(3)または(5)のいずれかに記載の抗体;
(8)(1)〜(7)のいずれかに記載の抗体またはフラグメントを含む、がん細胞の運動活性および浸潤活性を阻害するための組成物;
(9)(1)〜(7)のいずれかに記載の抗体またはフラグメントを含む、がん治療用医薬組成物;
(10)(1)〜(7)のいずれかに記載の抗体またはフラグメントを含む、医薬組成物の有効量を治療を必要とする対象に投与することを含むがんの治療方法;
(11)がんを治療するための医薬の製造における(1)〜(7)のいずれかに記載の抗体またはフラグメントの使用;
(12)(1)〜(7)のいずれかに記載の抗体またはフラグメントを、対象から得た試料と接触させ、試料中の腫瘍細胞と結合させることを特徴とする、試料中の腫瘍細胞のイメージング方法または腫瘍の検出方法;
(13)(1)〜(7)のいずれかに記載の抗体またはフラグメントを含む、腫瘍細胞イメージング剤;
(14)(1)〜(7)のいずれかに記載の抗体または抗体フラグメントを対象に投与して、体内の腫瘍組織と本発明の抗体または抗体フラグメントとの結合を調べることを特徴とする、腫瘍の診断方法;
(15)配列番号:1で示されるアミノ酸配列からなるペプチド;
(16)配列番号:1で示されるアミノ酸配列からなるペプチドおよびキャリア蛋白からなる抗原性ペプチド;
(17)(15)記載のペプチドまたは(16)記載の抗原性ペプチドを用いることを特徴とする、PAR1に特異的に結合してMMP1による切断を阻害する抗体、または該抗体と同様の性質を保持する該抗体のフラグメントの作製方法;
(18)(15)記載のペプチドまたは(16)記載の抗原性ペプチドを用いることを特徴とする、PAR1に特異的に結合してMMP1による切断を阻害する抗体、または該抗体と同様の性質を保持する該抗体のフラグメントの精製方法;
(19)(15)記載のペプチドまたは(16)記載の抗原性ペプチドを含む、がん細胞の運動活性および浸潤活性を阻害するための組成物
を提供するものである。
(A)PAR1の切断部位(R41とS42の間)をまたぐような配列(N35ATLDPRSFLL45)(配列番号:1)、および(B)PAR1の切断部位(R41とS42の間)よりも内側に位置する配列(45LRNPNDKYEPFWEDEEKKNES64)(配列番号:22)を標的として選択し、(A)配列のN末および(B)配列のC末にCを付加したC−N35ATLDPRSFLL45(配列番号:2)ペプチドおよびL45RNPNDKYEPFWEDEEKKNES64−C(配列番号:23)ペプチドを合成した。CのSH基を用いて合成ペプチドをKLHと架橋し、これを抗原としてマウスを免疫し、11種のハイブリドーマを得た。これらのハイブリドーマを、それぞれPAR1 N2−1〜PAR1 N2−11およびPAR1 N3−1〜PAR1 N3−11と命名し、そのうち、ハイブリドーマの培養上清を用いたマトリゲルアッセイから効果が最も強力であったPAR1 N2−11および配列番号:23に非常に強い結合活性を示したPAR1 N3−1を選択し、抗体特異性および抗体効果の解析を行った。PAR1 N2−11により産生される抗体をN2−11、PAR1 N3−1により産生される抗体をN3−1と命名した。このうち、N2−11抗体を産生するハイブリドーマは、PAR1 N2−11と命名し、ブタペスト条約の下、平成20年(2008年)3月18日より、日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6の、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM BP−11105の受託番号で寄託してある。N2−11抗体およびN3−1抗体のクラス決定を行った結果、IgG1のクラスに属することが判明した。
本発明のN2−11抗体の抗原認識部位を以下のように決定した。PAR1の部分アミノ酸配列A26RRPESKATNATLDPRSFLLRNPNDKYEP54(配列番号:3)に基づき12個のアミノ酸のペプチドを18種類作製し(以下、本明細書においてペプチド(1)〜(18)という)、ELISA法によるエピトープマッピングを行った。ペプチド(1)〜(18)のアミノ酸配列は以下のとおりであった。
ペプチド(1)ARRPESKATNAT(配列番号:4)
ペプチド(2)RRPESKATNATL(配列番号:5)
ペプチド(3)RPESKATNATLD(配列番号:6)
ペプチド(4)PESKATNATLDP(配列番号:7)
ペプチド(5)ESKATNATLDPR(配列番号:8)
ペプチド(6)SKATNATLDPRS(配列番号:9)
ペプチド(7)KATNATLDPRSF(配列番号:10)
ペプチド(8)ATNATLDPRSFL(配列番号:11)
ペプチド(9)TNATLDPRSFLL(配列番号:12)
ペプチド(10)NATLDPRSFLLR(配列番号:13)
ペプチド(11)ATLDPRSFLLRN(配列番号:14)
ペプチド(12)TLDPRSFLLRNP(配列番号:15)
ペプチド(13)LDPRSFLLRNPN(配列番号:16)
ペプチド(14)DPRSFLLRNPND(配列番号:17)
ペプチド(15)PRSFLLRNPNDK(配列番号:18)
ペプチド(16)RSFLLRNPNDKY(配列番号:19)
ペプチド(17)SFLLRNPNDKYE(配列番号:20)
ペプチド(18)FLLRNPNDLYEP(配列番号:21)
本発明のN3−1抗体の抗原認識部位を以下のように決定した。PAR1の部分アミノ酸配列A36TLDPRSFLLRNPWEDEEKNESGLTEYRLVS73(配列番号:24)に基づき12個のアミノ酸のペプチドを27種類作製し(以下、本明細書においてPAR1−N3−(1)〜(27)という)、ELISA法によるエピトープマッピングを行った。PAR1−N3−(1)〜(27)のアミノ酸配列は以下のとおりであった。
PAR1−N3−(1)ATLDPRSFLLRN(配列番号:25)
PAR1−N3−(2)TLDPRSFLLRNP(配列番号:26)
PAR1−N3−(3)LDPRSFLLRNPN(配列番号:27)
PAR1−N3−(4)DPRSFLLRNPND(配列番号:28)
PAR1−N3−(5)PRSFLLRNPNDK(配列番号:29)
PAR1−N3−(6)RSFLLRNPNDKY(配列番号:30)
PAR1−N3−(7)SFLLRNPNDKYE(配列番号:31)
PAR1−N3−(8)FLLRNPNDKYEP(配列番号:32)
PAR1−N3−(9)LLRNPNDKYEPF(配列番号:33)
PAR1−N3−(10)LRNPNDKYEPFW(配列番号:34)
PAR1−N3−(11)RNPNDKYEPFWE(配列番号:35)
PAR1−N3−(12)NPNDKYEPFWED(配列番号:36)
PAR1−N3−(13)PNDKYEPFWEDE(配列番号:37)
PAR1−N3−(14)NDKYEPFWEDEE(配列番号:38)
PAR1−N3−(15)DKYEPFWEDEEK(配列番号:39)
PAR1−N3−(16)KYEPFWEDEEKN(配列番号:40)
PAR1−N3−(17)YEPFWEDEEKNE(配列番号:41)
PAR1−N3−(18)EPFWEDEEKNES(配列番号:42)
PAR1−N3−(19)PFWEDEEKNESG(配列番号:43)
PAR1−N3−(20)FWEDEEKNESGL(配列番号:44)
PAR1−N3−(21)WEDEEKNESGLT(配列番号:45)
PAR1−N3−(22)EDEEKNESGLTE(配列番号:46)
PAR1−N3−(23)DEEKNESGLTEY(配列番号:47)
PAR1−N3−(24)EEKNESGLTEYR(配列番号:48)
PAR1−N3−(25)EKNESGLTEYRL(配列番号:49)
PAR1−N3−(26)KNESGLTEYRLV(配列番号:50)
PAR1−N3−(27)NESGLTEYRLVS(配列番号:51)
N2−11抗体およびN3−1抗体が、トロンビンに依存する細胞浸潤活性をどの程度阻害できるのかを調べるために、マトリゲルアッセイを用いて、抗体の浸潤阻害効果を試験した。第1に、アッセイを用いる細胞を調製するため、低浸潤性乳がん培養細胞KPL−4(PAR1低発現株)にPAR1−GFPを安定発現させた細胞株(以下、本明細書においてPAR1発現KPL−4という)を作製した。1.5x105細胞のPAR1発現KPL−4細胞をトリプシン処理により浮遊させ、PBSで洗浄した。3および10μMのN2−11抗体または10μMのN3−1抗体またはコントロール抗体である3および10μMのマウスIgGを添加し、37℃で90分間保温した。次いで、セルカルチャーインサート(BD バイオサイエンス社)に細胞を蒔き、37℃で45時間培養した。インサートを浸す誘引物質溶液には、10%FBS含有2.5U/mlトロンビン(WAKO社)溶液を用い、45時間後にメンブレンフィルターの底面に移動してきた浸潤細胞をHE染色し、浸潤細胞数をカウントした。浸潤細胞数のカウントは、フィルター内のランダムな地点を0.66mmX0.66mmの大きさでスキャンし、その平均細胞数を算出した。次いで、マウスIgGで処理した場合の浸潤細胞数を100%としたときのN2−11抗体およびN3−1抗体処理時の浸潤細胞数の割合を図3に示す。なお、10μMのマウスIgGで処理した場合の浸潤細胞数は、約2.4x103細胞であった。図3において、(a)は3μM N2−11抗体(n=30)処理時、(b)は10μM N2−11抗体(n=80)処理時、および(c)は10μM N3−1抗体(n=40)処理時の細胞数の割合を示す。
10μMの抗体濃度において、N2−11抗体は40%の阻害効果を有することが判明したが、N3−1抗体にはこのような活性はみられなかった(図3(b)および(c)参照)。このため、PAR1の52番目のTyrから56番目のTrpを含む配列をエピトープとする抗体は、細胞浸潤能を阻害しないことが分かる。
N2−11抗体が細胞表面のPAR1を特異的に認識できるかを評価するため、PAR1発現KPL−4を作製し、次いで、KPL−4およびPAR1発現KPL−4に対するN2−11抗体の特性について以下の(A)〜(D)により検討した:
(A)KPL−4細胞をトリプシン処理により浮遊させ、FBS不含L−15溶液(GIBCO社)で洗浄した。2μM マウスIgG(SIGMA社)含有L−15培地を添加し、37℃で15分間保温し、ブロッキングを行い、さらに40nMのN2−11抗体−QDプローブを添加し、37℃で30分間保温した。次いで、N2−11抗体−QDプローブをL−15培地で洗浄し、0.5%FBS含有L−15培地を添加し、ガラスボトムディシュに細胞を蒔き、細胞の観察および解析を行った。なお、N2−11抗体−QDプローブは、N2−11抗体と高輝度の蛍光性ナノ粒子(QD705(Invitrogen社))を結合させたプローブである。
(B)PAR1発現KPL−4をトリプシン処理により浮遊させ、FBS不含L−15溶液(GIBCO社)で洗浄した。2μM マウスIgG(SIGMA社)含有L−15培地を添加し、37℃で15分間保温し、ブロッキングを行い、さらに40nMのN2−11抗体−QDプローブを添加し、37℃で30分間保温した。次いで、N2−11抗体−QDプローブをL−15培地で洗浄し、0.5%FBS含有L−15培地を添加し、ガラスボトムディシュに細胞を蒔き、細胞の観察および解析を行った。
(C)PAR1発現KPL−4をトリプシン処理により浮遊させ、FBS不含L−15溶液(GIBCO社)で洗浄した。50nM MMP1(SIGMA社)を添加し、37℃で60分間保温した。2μM マウスIgG(SIGMA社)含有L−15培地を添加し、37℃で15分間保温し、ブロッキングを行い、さらに40nMのN2−11抗体−QDプローブを添加し、37℃で30分間保温した。次いで、N2−11抗体−QDプローブをL−15培地で洗浄し、0.5%FBS含有L−15培地を添加し、ガラスボトムディシュに細胞を蒔き、細胞の観察および解析を行った。
(D)PAR1発現KPL−4をトリプシン処理により浮遊させ、FBS不含L−15溶液(GIBCO社)で洗浄した。2μM マウスIgG(SIGMA社)含有L−15を添加し、37℃で15分間保温し、ブロッキングを行い、さらに40nMのN2−11抗体−QDプローブを添加し、37℃で30分間保温した。次いで、N2−11抗体−QDプローブをL−15培地で洗浄し、50nM MMP1を添加し、37℃で60分間保温した。さらに、L−15培地で洗浄し、0.5%FBS含有L−15培地を添加し、ガラスボトムディシュに細胞を蒔き、細胞の観察および解析を行った。
上記(A)〜(D)により得られた細胞およびそのデータに基づく定量的解析結果を図4に示す。なお、(A)〜(D)の結果は図中のカラム1〜4にそれぞれ対応している。細胞を観察した結果、KPL−4細胞ではPAR1の発現量が少ないことから、N2−11抗体−QDが僅かしか反応していなかったこと(カラム1)、PAR1発現KPL−4ではN2−11抗体−QDによる標識により、「細胞膜上のPAR1」および「細胞内に取り込まれたPAR1」がドット状に強く標識されていたこと(カラム2)、MMP1で細胞膜上のPAR1が切断されているため、N2−11抗体がPAR1を認識できず、N2−11抗体−QDで標識されなかったこと(カラム3)、ならびにPAR1発現KPL−4をN2−11抗体−QDで標識した後にMMP1で処理した場合には、N2−11抗体がカラム2と同程度細胞に結合していたこと(カラム4)が示された。また、定量的解析の右パネルにより、PAR1発現KPL−4に結合するN2−11抗体の量はKPL−4に結合する量の約6倍であること、PAR1発現KPL−4を50nM MMP1で処理した場合には、N2−11抗体の結合量はKPL−4と同レベルになること、ならびにN2−11抗体で標識後にMMP1処理した場合には、N2−11抗体がMMP1未処理の場合とほぼ同程度結合していることが示された。
PAR1発現KPL−4細胞は、MMP1処理によりPAR1が活性化し、細胞浸潤能が促進される。そこで、PAR1発現KPL−4の細胞運動の経時的コマ撮り撮影(Time−laps)観察およびその運動軌跡解析を行い、N2−11抗体がMMP1依存的な細胞運動能を阻害するかを検討した。7x104細胞のPAR1発現KPL−4細胞をトリプシン処理により浮遊させ、PBSで洗浄した。10μMのN2−11抗体またはコントロール抗体であるマウスIgGを添加し、37℃で60分間保温した。次いで、2.5nM MMP1を含む10%FBS含有L−15培地を添加し、ガラスボトムデッシュに細胞を蒔いた。細胞運動の経時的コマ撮り撮影画像を2分ごとに取得し、細胞運動の軌跡を追跡した。経時的コマ撮り撮影観察開始後、2−13時間の間の1時間当たりの平均運動速度を算出した。細胞運動の軌跡では、核の重心位置を指標とし、データに偏りが出ないように追跡可能な全ての細胞を解析した。また、コントロール実験として、KPL−4細胞およびMMP1未処理のPAR1発現KPL−4細胞についても同様に解析を行った。
N2−11抗体の算出された平均運動速度を図5に示し、その算出値を表1に示す。
PAR1発現KPL−4細胞は、MMP1処理によりPAR1が活性化し、細胞浸潤能が促進される。そこで、N2−11抗体存在下でPAR1発現KPL−4のマトリゲルアッセイを行い、N2−11抗体がMMP1依存的な細胞浸潤能を阻害するかを検討した。1.5x105細胞のPAR1発現KPL−4細胞をトリプシン処理により浮遊させ、PBSで洗浄した。3および10μMのN2−11抗体またはコントロール抗体であるマウスIgGを添加し、37℃で90分間保温した。次いで、セルカルチャーインサートに細胞を蒔き、37℃で45時間培養した。インサートを浸す誘引物質溶液には、10%FBS含有2.5nM MMP1溶液を用い、45時間後にメンブレンフィルターの底面に移動してきた浸潤細胞をHE染色し、浸潤細胞数をカウントした。浸潤細胞数のカウントは、フィルター内のランダムな地点を0.66mmX0.66mmの大きさでスキャンし、その平均細胞数を算出した。次いで、マウスIgGで処理した場合の浸潤細胞数を100%としたときのN2−11抗体処理時の浸潤細胞数の割合を求めた。
実施例5と同様のN2−11抗体−QDをプローブに用いて、独自のインビボイメージング法により腫瘍組織の生体染色を行い、上記により調製された抗体が腫瘍組織のPAR1に対し特異的であるかを検討した。SCIDマウスに1x106細胞のPAR1発現KPL−4細胞を皮下注入した。次いで、4週間飼育しPAR1発現KPL−4細胞由来の腫瘍を作製した。腫瘍を露出させて観察用の小窓を作製した後、N2−11抗体−QDプローブを血中濃度10nMで尾静脈より注入した。次いで、独自のイメージング装置を用いて、生きたマウスの腫瘍組織を観察した。
N2−11抗体−QDが腫瘍細胞に特異的に反応している像を図7に示す。図7より、マウス生体内において、N2−11抗体が腫瘍細胞に対し特異的であることが示された。したがって、濃度や結合能(結合定数)を高めることにより、N2−11抗体が生きた腫瘍細胞のPAR1活性を阻害する可能性を示唆している。
PAR1の切断部位(R41とS42の間)をまたぐような配列(N35ATLDPRSFLL45)(配列番号:1)を標的として選択し、この配列のN末にCを付加したCN35ATLDPRSFLL45(配列番号:2)ペプチドを合成した。CのSH基を利用して合成ペプチドをKLHと架橋し、これを抗原としてウサギを免役し、PAR1に対する抗血清を調製した。次いで、抗血清のアフィニティー精製を行うため、抗原に用いたペプチドとSulfoLinkカップリングゲル(PIERCE社)を用いてカラムを作製した。カラムに抗血清をアプライした後、カラム体積の5倍以上のPBS(pH7.2)でカラムの洗浄を行った。その後、3M MgCl2でPAR1ポリクローナル抗体の溶出を行った。溶出後はPBSにて透析を行い、精製PAR1抗体とした(10mlの抗血清から約0.4mgの精製抗体を得た)。ポリクローナル抗体の細胞浸潤活性を、モノクローナル抗体のアッセイと同様の方法でマトリゲルを用いて検討した。コントロールとして300nMのウサギIgGを用いた。
条件(a)の平均浸潤細胞数を100%とした場合におけるPAR1ポリクローナル抗体処理時の浸潤細胞数割合を図8に示し、その算出値を以下の表3に示す。
Claims (7)
- 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターから受託番号FERM BP−11105を付与されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体、またはアミノ酸配列が配列番号:1で示されるものであるエピトープに特異的に結合する該抗体のフラグメント。
- キメラ化またはヒト化されている、請求項1記載の抗体、またはアミノ酸配列が配列番号:1で示されるものであるエピトープに特異的に結合する該抗体のフラグメント。
- 請求項1または2記載の抗体またはフラグメントを含む、がん細胞の運動活性および浸潤活性を阻害するための組成物。
- 請求項1または2記載の抗体またはフラグメントを含む、がん治療用医薬組成物。
- がんを治療するための医薬の製造における請求項1または2記載の抗体またはフラグメントの使用。
- 請求項1または2記載の抗体またはフラグメントを、対象から得た試料と接触させ、試料中の腫瘍細胞と結合させることを特徴とする、試料中の腫瘍細胞のイメージング方法または腫瘍細胞の検出方法。
- 請求項1または2記載の抗体またはフラグメントを含む、腫瘍細胞イメージング剤。
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