BRPI0714667A2 - conjugado molecular e respectivo uso - Google Patents

Abstract

"CONJUGADO MOLECULAR E RESPECTIVO USO". São proporcionados conjugados moleculares antimicrobianos para o tratamento e preveção de doenças infecciosas causadas por microorganismos patogênicos em pessoas humanas e animais. A chave para estes conjugados é um espaçador especial que conecta pelo menos um fotossensibilizador a um receptor de microorganismo(vetor) que, por sua vez, se liga seletivamente à superfície de um microorganismo provocando a fotodestruição por irradiação. Os espaçadores de estrutura hidrofílica tal como unidades de etilenoglicol e unidades de etilenoglicol revestidas no término por amino carboxil devem ser usados para ligar o vetor ao fotossensibilizador. Numa modalidade preferida, um espaçador teria pelo menos 3 unidades de etilenoglicol e seria revestido no término com um grupo carboxil e um grupo amino no outro témino. A presente invenção funciona efetivamente para combater a infecção bacteriana nos ambientes reais relacionados com pacientes em que o sangue, soro e outros fluidos de corpo estão sempre presentes ou pelo menos na vizinhança.Os espaçadores de comprimento e estrutura selecionados, em modalidades preferidas, são usados para ligar o vetor ao fotossensibilizador.Estes conjugados são constatados serem muito efetivos no combate à infecção bacteriana nos ambientes reais relacionados com pacientes em que o sangue, o soro e outros fluidos de corpo estão sempre presentes ou pelo menos na vizinhança. É também proporcionado um método de uso.

Description

"Conjugado Molecular e Respectivo Uso" Relatório Descritivo Antecedentes da Invenção Prioridade

Este Pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US 60/833.836, depositado em 27 de julho de 2006, e do Pedido US 11/880.974, depositado em 25 de julho de 2007, ambos os quais são aqui incorporados por referência.

1 - Campo da invenção

A presente invenção relaciona-se em geral com a terapia fotodinâmica e, particularmente, com conjugados moleculares para o tratamento e prevenção de doenças infecciosas microbianas em pessoas humanas e animais. Um conjugado molecular da presente invenção compreende um espaçador especial para conectar pelo menos um fotossensibilizador, com um vetor.

2 - Declaração de Revelação da Invenção

A terapia fotodinâmica (PDT) é uma modalidade de tra- tamento relativamente nova para o câncer e outras doenças. São administrados sistematicamente fotossensibilizadores, local ou topica- mente, e acumulam-se no tumor ou outra lesão; Iluminando a área com energia luminosa para excitar os sensibilizadores, que, na presença de oxigênio, produzem efeitos citotóxicos nas células. Outra aplicação importante do PDT é o tratamento de doenças infecciosas causadas por microorganismos patogênicos. A terapia antimicrobiana fotodinâmica é um método mui- to promissor para combater a infecção bacteriana mesmo para cepas resistentes. Felizmente, nenhuma resistência à destruição fotodinâmica foi reportada ter sido adquirida pelas bactérias nem isto é provável, visto que a 'espécie mortal' é oxigênio. As células bacterianas tratadas com fotossensibilizadores foram mostradas terem sido mortas com sucesso por fotoiluminação. Nenhum dos conhecidos fotossensibiliza- dores e conjugados fotossensibilizadores é efetivo contra todas as bactérias, visto que a atividade depende principalmente de sua estrutu- ra química. A efetividade do fotossensibilizador depende também da parede da célula bacteriana uma vez que se torna o fator limitativo para a penetração do sensibilizador. No caso de bactérias Gram-negativas, a sua estrutura de membrana exterior de camada dupla é o obstáculo principal.

As estruturas celulares de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas são diferentes e são diferenciadas por suas característi- cas de coloração Gram. A parede de célula Gram-positiva é caracteriza- da pela presença de uma camada muito espessa de peptidoglicano. Embutidos na parede da célula Gram-positiva estão poliálcoois chama- das ácidos teicoicos, alguns dos quais são lípidos ligados para formar ácidos lipoteicoicos. Os ácidos teicoicos dão à parede da célula Gram- positiva uma carga negativa global devido à presença de ligações fosfo- diéster entre monômeros de ácido teicoico . Embora a parede da célula bacteriana Gram-negativa contenha uma camada fina de peptidoglicano adjacente à membrana citoplásmica, além disto, ela tem outra mem- brana exterior composta por fosfolipídios e lipopolissacarídeos. A natureza altamente carregada dos lipopolissacarídeos confere uma carga negativa global à parede da célula bacteriano Gram-negativa. A estrutura química dos lipopolissacarídeos da membrana exterior é freqüentemente única para as cepas bacterianas específicas (isto é, sub- espécies) e é responsável por muitas das propriedades antigênicas destas cepas.

Um dos importantes problemas para o uso de PDT anti- microbiano é uma ação de bloqueio dos componentes do sangue cuja presença diminui a atividade de fotossensibilizadores. Este efeito é exemplificado na Figura 1 demonstrando a inativação fotodinâmica de Staphylococcus aureus (bactéria Gram-positiva), Pseudomonas aerugi- nosa e Eschenehia eoli com o conhecido fotossensibilizador (bactéria Gram-negativa) Safranina O que existe em duas formas tautoméricas.

Safranina O

Como visto a partir da Figura 1, a Safranina exibe eleva- da atividade de exibições fotodinâmica bactericida em tampão PBS a qual diminuiu de modo notável, quando é adicionado soro sangüíneo ou sangue. Particularmente, a adição de mesmo 10% de soro de cavalo ou plasma humano ou até sangue inteiro poderia bloquear praticamente a atividade fotodinâmica deste sensibilizador contra a Pseudomonas aeruginosa. O efeito antibacteriano depende fortemente do gênero de células bacterianas. Enquanto as células Gram-positivas de Staphylo- coecus aureus poderiam ser mortas de modo suficiente, as células Gram-negativas de Pseudomonas aeruginosa ou Escherichia eoli são mais resistentes ao extermínio por PDT.

Uma dos possíveis abordagens futuras para aumentar a especificidade de fotossensibilizadores e a efetividade do PDT contra a infecção bacteriana é conjugar um fotossensibilizador com um vetor ligante, que liga especificamente a receptores na superfície de uma célula alvo. Na técnica anterior, diferentes métodos têm sido usados para alvejar de modo efetivo as células patogênicas ou infectadas.

Na P.atente US 6.977075 para Hasan e colaboradores, é descrito um método de exterminar patógeno intracelular usando antibi- óticos e PDT. Os patógenos intracelulares são alvejados usando fotos- sensibilizadores conjugados. O grupamento alvo usado são moléculas ou uma estrutura macromolecular que alveja macrófagos ou que interage com um patógeno. Não é descrita a efetividade do conjugado contra Gram-negativos e em ambiente complexo.

Na Patente US 6.573.258 para Bommer e colaboradores, ela descreve porfirinas carregadas positivamente que conseguem alvejar efetivamente tanto bactérias Gram-positivas como Gram-negativas, quando presentes em concentrações muito mais baixas e em tempos de irradiação muito menores. As porfirinas inovativas têm uma cauda hidrofóbica que consiste em pelo menos uma cadeia de hidrocarbonetos entre 6 e 22 carbonos de comprimento. O alvo bacteriano depende do comprimento da cadeia de carbono e não é muito efetivo.

Na Patente US 6.462.070 para Hasan e colaboradores, descreve-se um fotossensibilizador conjugado para a polilisina que é ligado a um grupamento alvo de histatina para tratar desordem da cavidade oral infetada por microorganismos. Os diferentes tipos de grupamento alvo aqui descritos incluem um polipeptídio membro não par, pequeno peptídeo antimicrobiano, lipoproteína de baixa densidade etc. Não é aqui descrita a efetividade dos conjugados sobre ambiente complexo tal como sangue, soro etc..

A Patente US 5.466.681 descreve uma variedade de con- jugados úteis para o tratamento de doenças infecciosas devido a micro- organismos patogênicos. Os conjugados incluem pelo menos um agente acoplado a um receptor de microorganismo - um vetor de carboidrato; o referido vetor pode ligar-se de modo seletivo a um microorganismo. O agente é um antibiótico de penicilina e o citado vetor é um asialogangli- osídeo ou outra cadeia de carboidrato. Os conjugados são administra- dos para o tratamento de infecções bacterianas, particularmente, causadas por Estreptococo pneumoniae e por Helicobacter pylori.

Uma ampla variedade de moléculas naturais e sintéticas reconhecidas por células alvo poderia ser usada como vetores. O uso de oligopeptídeos e grandes moléculas de proteína, incluindo lectinas, fatores de crescimento e especialmente anticorpos para antígenos de células de tumores específicos é conhecido na técnica. A Patente '681 descreve um conjugado que compreende pelo menos um agente que é antiinfeccioso acoplado a um receptor de microorganismos. São men- cionados agentes tais como antibióticos, drogas e esteróides sintéticos. Visto que os fotossensibilizadores por si não interagem com micróbios, não são considerados agentes conforme descrito na Patente '681 e não foram aqui descritos.

uPolicationicos photosensieonjugates: effeets of ehain Ieng- th and Gram classification on tke photoinativação of bactéria", Michael R. Hamblin, David A. O 'Donnell, Naveen Murthy, Krishanan Rajagopalan, Norman Michaud, Margaret E. Sherwood e Tayyaba Hasan, Journal of Antimierobial Chemotherapy 49 (2002) pp. 941-951; nesta publicação, a relação entre o tamanho da cadeia da polilisina e a sua efetividade para mediar o extermínio de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. O resultado do presente estudo implica que, no caso de conjugados fotossensibilizadores policatiônicos, é necessário que o fotossensibiliza- dor ganhe acesso através da barreira de permeabilidade da membrana exterior. A eficiência com que isto ocorre depende do tamanho da cadeia policatiônica. Conjugados com 8, 37 lisinas e clorina eç> livre usado no estudo foram constatados serem efetivos contra a infecção bacteriana mas apenas os conjugados de lisina-37 exterminaram as bactérias. O PDT antimicrobiano é efetivo principalmente contra bactérias Gram-positivas, quando comparado com as bactérias Gram negativas. Conseqüentemente, existe um requisito urgente para desen- volver um conjugado molecular que consiga ativamente alvejar tanto as bactérias Gram-positivas como Gram-negativas. Também precisa funcionar na condição in vivo onde estão presentes tipica ou freqüente- mente sangue e outros fluidos de corpo, para uso com pacientes para ajudar diretamente a protege-los de microorganismos danosos.

Objetivos e Breve Sumário da Invenção

É um objetivo da presente invenção proporcionar um conjugado molecular para alvejar microorganismo patogênico que cause doenças infecciosas.

É outro objetivo da presente invenção desenvolver um método fotodinâmico para a inativação/redução de bactérias (tanto Gram-positivas como Gram-negativas) em ambiente complexo, tal como sangue, soro e saliva.

E ainda outro objetivo da presente invenção usar um es- paçador especial para ligar um vetor, que alveje especificamente micro- organismos selecionados.

Também é ainda outro objetivo da presente invenção proporcionar um espaçador hidrofílico que ligue um fotossensibilizador hidrofóbico a um vetor de alvejamento de microorganismos.

Resumidamente dito, a presente invenção proporciona conjugados moleculares antimicrobianos para o tratamento e prevenção de doenças infecciosas causadas por microorganismos patogênicos em pessoas humanas e animais. A chave para estes conjugados é um espaçador especial que conecta pelo menos um fotossensibilizador a um receptor de microorganismo (vetor) que, por sua vez, se liga seletiva- mente à superfície de um microorganismo provocando fotodestruição por irradiação. Os espaçadores tendo estrutura hidrofílica tal como unidades de etilenoglicol e unidades de etilenoglicol de extremidades de aminocarboxil revestidas devem ser usadas para ligar o vetor ao fotos- sensibilizador. Numa modalidade preferida, um espaçador teria pelo menos 3 unidades de etilenoglicol, com um máximo de 45 átomos na cadeia de esqueleto e ser de extremidade revestida com um grupo carboxil numa extremidade e um grupo amino na outra extremidade. A presente invenção funciona efetivamente para combater a infecção bacteriana nos ambientes reais relacionados com pacientes em que o sangue, soro e outros fluidos de corpo estão sempre presentes ou pelo menos próximo. Espaçadores de comprimento e estrutura seleciona- dos, em modalidades preferidas, são usados para ligar o vetor ao fotossensibilizador. Estes conjugados são constatados serem muito efetivos para combater a infecção bacteriana nos ambientes reais relacionados com pacientes onde o sangue, soro e outros fluidos de corpo estão sempre presentes ou um menos perto. É também provido um método de uso.

Os objetos, características e vantagens acima e outros da presente invenção ficarão evidentes a partir da descrição seguinte lida em conjunção com os desenhos anexos.

Breve Descrição das Figuras

O gráfico da Figura 1 mostra a inativação fotodinâmica de Staphylococcus aureus DSMl 104, Pseudomonas aeruginose DSMl 117 e Escheriehia eoli DSM8698 pelo uso de Safranins O como fotossensibili- zador.

O gráfico da Figura 2 mostra a inativação fotodinâmica de Staphylococcus aureus DSMl 104, Pseudomonas aeruginose DSMl 117 e Eseheriehia eoli DSM8698Staphyloeoecus aureus DSMl 104 pelo uso de compostos 1, 3a, 3b, 3c, 3d e 3e como fotossensibilizadores. Descrição Detalhada de Modalidades Preferidas

Na presente invenção, é descrito um método fotodinâmico para a inativação/redução de bactérias em ambiente complexo. Com- bater a infecção bacteriana no meio complexo presente in vivo, tal como soro, plasma ou sangue é a parte mais difícil, como visto no estado da técnica. Aqui, nesta invenção, a terapia fotodinâmica antimicrobiana é usada para alvejar microorganismos patogênicos usando fotossensibili- zadores conjugados para tratar várias doenças infecciosas e também para induzir a fotodestruição no meio complexo normalmente encontra- do in vivo para pacientes reais. Nesta presente invenção, um conjugado molecular descrito é projetado para alvejar tanto as bactérias Gram- positivas como Gram-negativas, mesmo as suas cepas resistentes. O conjugado molecular compreende um fotossensibilizador ligado a um vetor (peptídeo antimicrobiano) via uma molécula espaçadora especial- mente selecionada cuja presença na estrutura de um conjugado entre o vetor e o fotossensibilizador exerce influência crítica na atividade do conjugado, assim como também a estrutura do espaçador.

Na presente invenção, são usados peptídeos antimicrobi- anos de variados comprimentos e estruturas como vetor que podem melhorar a capacidade de alvejamento do fotossensibilizador e também facilitar a permeabilidade da membrana na parede da célula bacteriana, em razão da capacidade dessas seqüências de peptídeos se associarem às membranas microbianas. Os vetores de peptídeos usados na presen- te invenção incluem os fragmentos de oligopeptídeos de peptídeos de permeabilização de células ou derivados de lipopolissacarídeos que ligam a proteínas mas não são limitadas a isso. A seletividade de grupamentos de alvo permite o alvejamento aumentado de fotossensibi- lizadores usando o conjugado da presente invenção, minimizando, deste modo, a dosagem e o efeito colateral adverso.

20

25

30 A aplicabilidade de conjugados entre o vetor e o fotossen-

sibilizador da presente invenção e a importância do grupamento espa- çador é demonstrada por nós nos Exemplos de conjugados 3a-e em que o composto 3a não tem nenhum espaçador na sua estrutura e outros compostos (3b-e) têm o espaçador de comprimento e hidrofobicidade variados. A preparação dos produtos 3a-e a partir da meso pirofeofor- bida-a (1) é demonstrado nos Exemplos 1-6. A preparação do conjuga- do 3a (nenhum espaçador na estrutura) compreende a ligação direta do grupamento vetor ao composto 1 por métodos de fase sólida e líquida convencionais conhecidos na técnica e exemplificados abaixo.

clui a primeira ligação do espaçador apropriado ao composto 1 e junção adicional ao vetor por métodos de fase sólida e líquida convencionais conhecidos na técnica e exemplificados abaixo.

A síntese de conjugados de braços espaçadores 3b-e in-

(i)

(2a) R= St-

o

o

O

O

15 (3a) R =S nenhum

ρ

(3b) R= A^^^v^níA (3c) R= (3d) Ro (3e) R=

Na modalidade preferida, o tratamento antibacteriano in- clui a administração de fotossensibilizadores a um ambiente contendo bactérias e é deixado incubar durante um período suficiente de tempo, proporcionando, deste modo, a acumulação do fotossensibilizador nas células bacterianas. O tempo de incubação varia, dependendo de muitos fatores. Neste experimento, é incubado durante 30 minutos antes de ser irradiado com laser de 665 nm a 100 J/cm2 para iniciar a fotodestruição de células bacterianas. O fotossensibilizador pode ser administrado por aplicação sistêmica ou injeção local na área afetada. Para infecção na pele ou próximo pode ser administrado topicamente.

Os dados na Figura 2 mostram claramente que a presen- ça do espaçador e de sua estrutura é crítica para a atividade fotodinâ- mica do conjugado na presença de sangue. Deste modo o conjugado sem espaçador (composto 3a), assim como também os conjugados 3b e 3c tendo espaçadores de ácido aminocaprônico hidrofóbico (espaçador de 7 átomos) e ácido aminocaprônico dimérico (espaçador de 14 átomos) não são ativos contra as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas na presença de sangue. Pelo contrário, os conjugados 3d e 3e demons- tram elevada atividade fotodinâmica nestas condições contra ambos os tipos de bactérias e de modo semelhante contra fungos incluindo Candida albicans (dados não mostrados na Figura 2).

A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes Exemplos, mas não fica limitada a eles.

Exemplos

Os exemplos seguintes são apresentados para prover a- quelas pessoas de capacidade ordinária na técnica com uma revelação e descrição completa e ilustrativa de como preparar o conjugado entre o vetor de peptídeo e fotossensibilizador com braço de espaçador e não se pretende limitar o âmbito do que os inventores consideram como invenção. Foram desenvolvidos esforços para assegurar precisão com respeito aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura etc.), mas alguns erros e divergências experimentais devem ser tidos em conta.

Os Exemplos 1-4 ilustram a preparação do espaçador com comprimentos de cadeia variados a serem usados nesta invenção

Exemplo 1 Preparação de Amida 2c (procedimento típico)

A mesopirofeoforbida-α (1) (237 mg, 0,443 mmol, prepa- rada como descrita na Patente 6.777.402) foi dissolvida em 20 mL de diclorometano, depois, 0,3 mL (2,22 mmol, ~5 eq.) de trietilamina foram adicionados seguidos de adição de 0,1 mL (0,576 mmol, 1,3 eq.) de pentafluorfenil trifluoracetato. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 20 minutos, lavada com água, concentrada e dissol- vida numa mistura de 2 mL de diclorometano e 12 mL de dioxano. A esta mistura foi adicionada uma solução do composto 2 [200 mg (0,965 mmol, 2,17 eq.), produto de GlycoSense AG, Jena, Alemanha] numa mistura de 5 mL de MeOH, 1,2 mL de água e 0,25 mL de KOH 6N. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 30 minutos, diluída com diclorometano, depois, lavada com água e ácido sulfúricos a 5%, seca e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografla flash em sílica gel. A eluição com MeOH - diclorometano (2—>15%) deu 282 mg (88%) de amida 4.

fc

Exemplo 2 Preparação de Amida 2a

Preparou-se amida 2a com um rendimento de 92% por aco- plamento do composto 1 e ácido aminocaprônico, de acordo com o procedi- mento típico, conforme descrito no Exemplo 1.

Exemplo 3 Preparação de Amida 2b

Preparou-se amida 2b com um rendimento de 79%, por aco- plamento de 2a e do ácido aminocaprônico, de acordo com o procedimento típico, conforme descrito no Exemplo 1. Exemplo 4

Preparação de Amida 2d

Preparou-se amida 2d com um rendimento de 86% por aco- plamento do composto 1 e ácido amino 5 (produto de GlycoSense AG, Jena, Alemanha) de acordo com o procedimento típico, conforme descrito no Exemplo 1.

Os Exemplos 5 e 6 ilustram a preparação de conjugado de fo- tossensibilizador-vetor-espaçador para um do composto de exemplo.

Exemplo 5

Preparação de Conjugado de Peptídeo- Fotossensibilizador 3d (Procedimento Típico, Condições de Homo-Fase)

O derivado ácido 2c (40 mg, 0,055 mmol, 2,97 eq.) foi dissolvido em 5 mL de diclorometano, depois, foi adicionado 0,1 mL (excesso) de trietilamina seguido de adição de 0,05 mL (excesso) de pentafluorfenil trifluoracetato. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 20 minutos, lavada com água, concentrada e dissol- vida em 2 mL de piridina. Esta mistura foi adicionada a uma solução de decapeptídeo 6 [50 mg, pureza de 67% (0,0185 mmol), produto de Biosyntan GmbH, Berlim, Alemanha] numa mistura de 2 mL de piridina e 0,04 mL de 40% solução aquosa de hidróxido de amônio tetra-n-butil. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 2 h, diluída com diclorometano, depois, lavada com ácido sulfúrico a 5%, seca e concen- trada. O resíduo foi purificado em sílica gel e eluição de gradiente com MeOH - CH2Cl2 (0->15%) para dar 29 mg do conjugado protegido (40 mg). Este derivado foi tratado com 2 mL de HCl conc. à temperatura ambiente durante 25 minutos, evaporado à secura e purificado via MPLC em coluna Lobar-RP 18 (tamanho B) e eluição de gradiente com acetonitrila-água (+0.1% TFA) (0->50%) para dar 29mg (56%) de conju- gado puro 3d.

Exemplo 6

Preparação de Conjugado Peptídeo- Fotossensibilizador 3d

(Procedimento Típico, Condições de Fase Sólida)

Usou-se o procedimento convencional de síntese de pep-

tídeo em fase sólida compreendendo, primeiro, juntar seletivamente esqueleto de decapeptídeo N-bloqueado (corresponde à seqüência de peptídeo KFFKFFKFFK, como no bloco 6) e subseqüente adição de grupamento de meso pirofeoforbida-α conjugado com espaçador por tratamento com o derivado ácido 2c na presença de reagentes de condensação padrão e remoção subseqüente dos conjugados corres- pondentes da resina para produzir o produto cru 3d. A sua purificação adicional por cromatografia foi realizada conforme descrito acima no Exemplo 5 para dar 3d puro. Exemplo 7

Inativação Fotodinâmica de Suspensão de Células Bacterianas Usando os Fotossensibilizadores 3a-e

Os organismos usados em nossos estudos foram três membros da microflora dos ferimentos: Staphylococcus aureus DSMl 104, Gram-positivas; Eschenehia eoli DSM8698, Gram-negativas; Pseudomonas aeruginosa DSMl 117, Gram-negativas.

Vários estudos demonstraram que as bactérias Gram- positivas (por exemplo, Staphylococcus aureus) são particularmente suscetíveis à inativação fotodinâmica, ao passo que as bactérias Gram- negativas (por exemplo, Escherichia eoli, Pseudomonas aeruginosa) são significativamente mais resistentes a muitos fotossensibilizadores comumente usados. Além disso, foi constatado que tanto as células bacterianas Gram-positivas como Gram-negativas em meios complexos (por exemplo, sangue, plasma, soro de sangue, saliva) são muito menos suscetíveis aos conjugados fotossensibilizadores padrão.

As células cultivadas são suspensas em solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) ou PBS estéril suplementado com 10% de soro estéril de sangue de cavalo, 10% de plasma humano ou 10% de sangue humano, respectivamente. A OD final (densidade óptica) a 600 nm, 1 cm em todos os casos, foi de 0,03. As suspensões bacteri- anas são colocadas em placas estéreis de poços pretos de fundos claros. As concentrações de fotossensibilizador 1 e conjugado fotossensibiliza- dor 3a (sem espaçador) e 3b, 3c, 3d, 3e (com espaçador) usadas no estudo são como se segue: ΙΟΟμΜ, ΙμΜ, 10 μΜ e 100 μΜ .

Depois de incubação as amostras foram expostas a luz de laser de 665 nm, com a potência ajustada para 0,5 W e tempo de irradiação de 85 segundos. Com o tempo de irradiação, a fluência de

energia resultante foi de mais ou menos 100 J/cm2. As placas de controle ficam contidas no fotossensibilizador e não são expostas à luz de laser. As amostras de controle para toxicidade às escuras são apenas expostas ao fotossensibilizador (concentração final de 100 mm) sem qualquer iluminação.

Depois da irradiação, as amostras são removidas e sus- pensas novamente no meio de cultura. Os números de unidades formadoras de colônias (CFU/ml) são enumerados depois de incubação adequada.

O resultado do estudo acima é mostrado na Figura 2 em que é claramente mostrado que a presença do espaçador e da sua estrutura é crítica para a terapia fotodinâmica na presença de sangue ou outros fluidos corpóreos. Pode ser claramente visto a partir da Figura 2 que o composto fotossensibilizador 1, o composto conjugado 3a (sem espaçador), o conjugado 3b (com espaçadores de ácido amino- caprônico hidrofóbico de 7 átomos) e conjugado 3c (com espaçadores de ácido aminocaprônico hidrofóbico de 14 átomos) não são ativos contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas na presença de sangue. Os conjugados 3d e 3e com espaçador demonstram elevada atividade fotodinâmica contra tanto as bactéria Gram-positivas como Gram- negativas na presença de sangue.

Tendo descrito modalidades preferidas da invenção com referência aos desenhos anexos, deve ficar entendido que a invenção não está limitada às modalidades precisas e que várias mudanças e modificações podem ser nela efetuadas por pessoa qualificada na técnica sem sair do âmbito ou espírito da invenção conforme definida nas Reivindicações anexadas.

Claims (12)

"Conjugado Molecular e Respectivo Uso"

1. - Conjugado Molecular, para a inativação ou redução de microorga- nismos em ambientes complexos,-caracterizado por que compreende: um fotossensibilizador hidrofóbico baseado em porfirina; um espaçador hidrofílico; um vetor alvo; em que o referido conjugado é capaz de destruir tanto os microorganismos Gram-negativos como Gram-positivos por irradiação; e em que o citado espaçador hidrofílico tem uma cadeia de esqueleto composta de C, O e N.

2. - Conjugado Molecular, de acordo com a Reivindicação 1, caracteri- zado por que o referido espaçador hidrofílico tem pelo menos duas unidades de etilenoglicol e é revestido no término por grupos funcionais amino e carboxil.

3. - Conjugado Molecular, de acordo com a Reivindicação 1, caracteri- zado por que a referida cadeia de esqueleto do citado espaçador não tem comprimento maior do que 45 átomos.

4. - Conjugado Molecular, de acordo com a Reivindicação 1, caracteri- zado por que o referido ambiente complexo compreende saliva, sangue, soro e plasma.

5. - Conjugado Molecular, de acordo com a Reivindicação 1, caracteri- zado por que o referido vetor alvo é um peptídio antimicrobiano.

6. - Conjugado Molecular, de acordo com a Reivindicação 5, caracteri- zado por que o referido peptídio antimicrobiano é escolhido a partir do grupo que consiste em fragmentos de oligopeptídios de peptídios de permeabilização de células e proteínas de ligação de lipossacarídeos.

7. - Uso de Conjugado Molecular, que compreende um fotossensibili- zador hidrofóbico baseado em porfirina, um espaçador hidrofílico e um vetor alvo, caracterizado por que é no fabrico de medicamento para tratamento de inativação ou redução de microorganismos em ambientes complexos, compreendendo o tratamento a administração de medica- mento e irradiação dos microorganismos alvejados usando radiação a laser de comprimento de onda apropriado para ativar o referido conju- gado molecular e destruir os microorganismos alvejados, depois de permitir um tempo para que o citado conjugado molecular se acumule nos microorganismos alvejados.

8. - Uso de Conjugado Molecular, de acordo com a Reivindicação 7, caracterizado por que o referido espaçador hidrofílico compreende uma cadeia de esqueleto feita de C,0 e N.

9. - Uso de Conjugado Molecular, de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por que o referido espaçador hidrofílico compreende ainda pelo menos duas unidades de etilenoglicol e é revestido no térmi- no por grupos funcionais amino e carboxil.

10. - Uso de Conjugado Molecular, de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por que a cadeia de esqueleto do citado espaçador hidrofílico não tem comprimento maior do que 45 átomos.

11. - Uso de Conjugado Molecular, de acordo com a Reivindicação 7, caracterizado por que os referidos microorganismos compreendem microorganismos Gram-negativos e Gram-positivos.

12. - Uso de Conjugado Molecular, de acordo com a Reivindicação 7, caracterizado por que o referido ambiente complexo compreende saliva, sangue, soro e plasma.