ES2312788T3 - Procedimiento de diagnostico fotodinamico para enfermedades vasculares. - Google Patents

Procedimiento de diagnostico fotodinamico para enfermedades vasculares. Download PDF

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Abstract

El uso de un derivado de ácido aspártico iminoclorado de fórmula (I) (Ver fórmula) en la que Asp representa un residuo de ácido aspártico; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de queratosis inflamatoria mediante terapia fotodinámica (TFD).

Description

Procedimiento de diagnóstico fotodinámico para enfermedades vasculares.
Campo técnico
La presente invención se refiere a agentes terapéuticos concebidos para su uso en terapia fotodinámica (TFD) de queratosis inflamatoria, y que contienen como ingrediente activo un derivado de ácido aspártico iminoclorado o una sal de mismo farmacéuticamente aceptable.
Antecedentes de la técnica
Las terapias fotodinámicas (TFD) han emergido como una nueva forma de tratamiento de cáncer. En TDF, un derivado de porfirina determinado se inyecta intravenosamente y se deja que se acumule, de forma preferente, en los tejidos cancerosos (tumor). Posteriormente, se irradia con luz de láser para destruir selectivamente los tejidos cancerosos. La técnica aprovecha dos propiedades únicas de los derivados de porfirina: su capacidad para acumularse selectivamente en tejidos cancerosos y su capacidad fotosensibilizante.
Los presentes inventores han llevado a cabo estudios exhaustivos para desarrollar derivados de porfirina potentes para su uso en TFD y, hasta el momento, han propuesto varios derivados de porfirina de un único componente, que se eliminan rápidamente de los tejidos normales y que presentan una fototoxicidad reducida, a la vez que mantienen la capacidad de acumularse de forma selectiva y estable en los tejidos cancerosos.
Un ejemplo es un derivado de ácido aspártico iminoclorado, un derivado de porfirina que es adecuado para su uso con un láser de titanio zafiro (longitudes de onda de 600 nm o inferior y de 670 o superior) o un láser de diodo (670 nm) y tiene la estructura representada por la fórmula (I) siguiente:
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en la que Asp representa un residuo de ácido aspártico
Entre los derivados del ácido aspártico iminoclorados representados por la fórmula (I) y las sales de los mismos farmacéuticamente aceptables, una sal de sodio denominada ATX-S10.Na, muestra una selectividad particularmente alta por los tejidos cancerosos y las neovascularizaciones. Se ha comprobado que el compuesto es altamente efectivo como un agente de TFD para el tratamiento de tumores y degeneración macular relacionada con la edad, y se ha presentado ya una solicitud de patente que reivindica este aspecto del compuesto (WO 98/14453).
Distintas enfermedades van acompañadas por angiogénesis, incluyendo la artritis reumatoide y queratosis inflamatoria.
La artritis reumatoide es una enfermedad de colágeno caracterizada por inflamación vascular y se especula que está provocada por una respuesta inmune anormal. Las causas exactas de la enfermedad, sin embargo, no se conocen todavía y no se han establecido aún tratamientos efectivos. Los tratamientos actuales para la artritis reumatoide incluyen tratamientos con fármacos, tales como agentes anti-inflamatorios, esteroides y agentes anti-reumáticos, así como tratamientos quirúrgicos, tales como el reemplazo de una articulación por otra artificial. Sin embargo, ninguno de estos tratamientos es suficientemente efectivo para curar la enfermedad. Trauner et al., examinaron la posibilidad de usar TFD en el tratamiento de la artritis reumatoide y se ha concedido ya una patente a estos inventores (Patente de EE.UU. nº 5.368.841). No obstante, los fotosensibilizadores revelados en esta patente podrían presentar fototoxicidad debido a que los compuestos no son suficientemente selectivos para acumularse en un tejido particular, si no que permanecen en el cuerpo durante un periodo de tiempo prolongado.
La queratosis inflamatoria, por otra parte, es una enfermedad de la piel en la que tiene lugar "inflamación", una afección provocada cuando se expanden los vasos sanguíneos epidérmicos permitiendo que los linfocitos y otros leucocitos se infiltren en la piel, junto con "queratosis", un engrosamiento de la epidermis y la córnea. Los tratamientos para la enfermedad incluyen agentes anti-inflamatorios tales como esteroides, inhibidores del crecimiento epidérmico tales como los retinoides, y tratamientos con luz UV (por ejemplo, PUVA), pero ninguno ofrece una cura
decisiva.
En "Trends Biotechnol"., vol. 13 (1), 1995, p. 14-18, se revela que la psoriasis se puede tratar por TFD.
Recientemente, la aplicación de TFD usando clorhidrato del ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) ha emergido como un tratamiento efectivo. Se conoce que el precursor de la biosíntesis de protoporfirina IX, 5-ALA, presenta algunas propiedades químicas de la protoporfirina IX: no se acumula fácilmente en las neovascularizaciones y sólo puede absorber luz a las longitudes de onda de 630 nm, como máximo. Estas propiedades limitan los efectos terapéuticos del tratamiento con 5-ALA.
Al mismo tiempo, los presentes inventores dirigieron su atención a la capacidad del derivado de ácido aspártico iminoclorado de fórmula (I) y de las sales del mismo farmacéuticamente aceptables, para acumularse selectivamente en las neurovasculizaciones, y llevaron a cabo investigaciones exhaustivas para examinar la posibilidad de utilizar estos compuestos como agentes terapéuticos potenciales para TFD. Estos esfuerzos condujeron, finalmente, al descubrimiento de que ATX-S10.Na, una sal del sodio del compuesto, presenta una capacidad superior para acumularse en las células inflamatorias responsables de la angiogénesis, no sólo cuando se usa en estados de enfermedad tales como cánceres o trastornos oftálmicos, sino también en otros estados de enfermedad,. Los presentes inventores han descubierto también que cuando se usa en TFD, ATX-S10.Na puede funcionar como una cura altamente efectiva para distintas enfermedades de la piel, tales como la queratosis inflamatoria (dermatitis tal como
psoriasis).
Entre los derivados del ácido aspártico iminoclorados, representados por la fórmula (I), y a las sales de los mismos farmacéuticamente aceptables, ATX-S10.Na, una sal de sodio, es conocida por emitir luz fluorescente roja a 670 nm, cuando se irradia con luz con una longitud de onda de excitación apropiada (por ejemplo, 400 nm) y se puede usar, de esta forma, para proporcionar un diagnóstico definitivo de la localización de un tumor. Estos son hechos ya
revelados.
En las operaciones quirúrgicas para eliminar tumores, una determinación precisa de la localización del tumor ayuda a evitar una eliminación innecesaria de tejidos normales y mejora la calidad de vida de los pacientes al reducir su carga.
La cirugía del cáncer está acompañada, frecuentemente, de quimioterapia para reducir el riesgo de metástasis. Sin embargo, la quimioterapia va acompañada, normalmente, de efectos secundarios y es preferible evitarla si es posible.
Para determinar la presencia de metástasis, recientemente se está realizando la biopsia de los nódulos linfáticos centinelas. Los nódulos linfáticos centinelas (que se pueden referir como "SN" de aquí en adelante) son los primeros nódulos linfáticos que reciben drenaje desde un cáncer. Si los resultados de la biopsia SN no indican la presencia de metástasis, se podría evitar la eliminación de los nódulos linfáticos de alrededor y, de esta forma, se podría reducir el riesgo de complicaciones, tales como una actividad inmune disminuida, así como la probabilidad de quimioterapia post-operativa.
Las técnicas de tinción con colorantes y las técnicas de radioisótopos se utilizan actualmente para determinar la localización del SN. Sin embargo, los tejidos grasos del cuerpo y los vasos linfáticos delgados hacen difícil llevar a cabo estas técnicas sin una destreza significativa y, de este modo, dificultan la localización exacta del SN.
Los presentes inventores, interesados por la capacidad del derivado de ácido aspártico iminoclorado y de las sales del mismo farmacéuticamente aceptables, para emitir fluorescencia, han realizado un esfuerzo para desarrollar un agente de diagnóstico que permita la determinación de la localización del SN y el diagnóstico de la presencia de metástasis cancerosas. Los presentes inventores descubrieron posteriormente que estos compuestos pueden funcionar como agentes de diagnóstico altamente efectivos para la localización del SN y para el diagnóstico de la presencia de metástasis cancerosas.
De acuerdo con esto, un objetivo de la presente invención es proporcionar un agente terapéutico para su uso en una terapia fotodinámica (TFD) de queratosis inflamatoria
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Revelación de la invención
Un aspecto esencial de la presente invención se refiere a un agente terapéutico para su uso en una terapia fotodinámica (TFD) de queratosis inflamatoria. Este agente contiene, como un ingrediente activo, un ácido aspártico iminoclorado, representado por la fórmula (I) siguiente, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable:
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en la que Asp representa un residuo de ácido aspártico.
Específicamente, el aspecto esencial de la presente invención es particular debido a que la capacidad del derivado de ácido aspártico iminoclorado de fórmula (I) y a las sales del mismo farmacéuticamente aceptables, para acumularse en neovacularizaciones o células tumorales, se aprovecha para la realización de TFD.
Un ejemplo de enfermedad provocada por angiogénesis es la queratosis inflamatoria. La queratosis inflamatoria es una enfermedad de la piel caracterizada por enrojecimiento y queratinización, un síntoma notable de inflamación. La enfermedad incluye psoriasis y parapsoriasis, el tratamiento de las cuales requiere agentes fuertes tales como esteroides. Sin embargo, el derivado de ácido aspártico iminoclorado de fórmula (I), o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, se acumula de forma efectiva en las células inflamatorias sub-epidérmicas cuando se administra de forma percutánea, y mediante la exposición de la células a irradiación por láser para realizar TFD, la enfermedad se puede tratar de forma efectiva.
De esta forma, la presente invención se refiere a un medicamento para el tratamiento efectivo de la queratosis inflamatoria. El medicamento comprende el derivado de ácido aspártico iminoclorado de fórmula (I), o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, para su uso en TFD para inducir necrosis de las células inflamatorias sub-epidérmicas. Esta forma de realización se refiere también a un agente terapéutico para su uso en TFD de queratosis inflamatoria (incluye enfermedades de la piel tales como psoriasis) que contiene como un ingrediente activo al derivado de ácido aspártico iminoclorado de fórmula (I), o a una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
La presente invención ha revelado que, entre los derivados del ácido aspártico iminoclorado de fórmula (I) y de las sales del mismo farmacéuticamente aceptables, es particularmente efectiva una sal de sodio conocida como ATX-S10.Na. Así, la presente invención se refiere a un medicamento para su uso en TFD de queratosis inflamatoria y a un agente terapéutico para su uso en TFD de queratosis inflamatoria; en el que el derivado de ácido aspártico iminoclorado de fórmula (I), o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, comprende ATX-S10.Na, una sal de sodio.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es una gráfica que muestra la viabilidad de HUVEC en TFD usando la sal ATX-S10.Na de la presente invención.
La Figura 2 comprende fotografías que muestran la apariencia visual de un modelo de ratón en el que se inyectó colágeno de tipo II para inducir artritis y no se proporcionó irradiación con láser en TFD (grupo control).
La Figura 3 comprende fotografías que muestran la apariencia visual de un modelo de ratón en el que se inyectó colágeno de tipo II para inducir artritis y se irradió con láser en TFD (grupo bajo análisis). Las fotografías muestran al ratón 7 días después de la irradiación por láser.
La Figura 4 comprende microfotografías que muestran un corte de tejido de la articulación de un modelo de de ratón que padece artritis inducida por colágeno de tipo II, sin proporcionar irradiación por láser en TFD (grupo control).
La Figura 5 comprende microfotografías que muestran un corte de tejido de la articulación de un modelo de de ratón que padece artritis inducida por colágeno de tipo II, después de irradiación por láser en TFD (grupo bajo análisis).
La Figura 6 es una gráfica que muestra los efectos citotóxicos de TFD utilizando la sal ATX-S10.Na de la presente invención en queratinocitos cultivados. Se añadieron 50 \mug/ml de la sal ATX-S10.Na de la presente invención al cultivo celular. Después de un periodo de cultivo predeterminado, las células se lavaron con PBS y se irradiaron con láser a 10 J/cm^{2}. La viabilidad de los queratinocitos se determinó 1, 2, 3, 6, 12 y 24 horas después de la irradiación y se representó en una gráfica.
La Figura 7 comprende imágenes de fluorescencia de un modelo de ratón que tiene dermatitis, tomadas 3 horas después de la aplicación de una pomada hidrófila, con o sin ATX-S10.Na. Las fotografías corresponden (a) con una pomada hidrófila que contenía ATX-S10.Na, y (b) con una pomada hidrófila que no contenía ATX-S10.Na.
La Figura 8 comprende microfotografías de secciones de tejido de piel obtenidas a partir de un modelo de dermatitis de ratón. Las fotografías se tomaron 3 horas después de la aplicación de una pomada hidrófila, que contenía 1% de ATX-S10.Na, a piel tratada con TFD. Las fotografías corresponden (a) con irradiación por láser, y (b) sin irradiación por láser.
La Figura 9 comprende imágenes de fluorescencia tomadas después de la administración de fotofrina. Las dos fotografías superiores muestran 5 minutos (izquierda) y 10 minutos después de la administración. Las fotografías en el medio muestran 15 minutos (izquierda) y 20 minutos después de la administración. Las fotografías inferiores muestran 25 minutos (izquierda) y 30 minutos después de la administración.
La Figura 10 comprende imágenes de fluorescencia tomadas después de la administración de la sal ATX-S10.Na de la presente invención. Las dos fotografías superiores muestran 5 minutos (izquierda) y 10 minutos después de la administración. Las fotografías en el medio muestran 15 minutos (izquierda) y 20 minutos después de la administración. Las fotografías inferiores muestran 25 minutos (izquierda) y 30 minutos después de la administración.
Forma mejor para llevar a cabo la invención
Se describirán ahora en detalle formas de realización individuales de la presente invención, en referencia a los Ejemplos bajo análisis.
Se puede producir un derivado de ácido aspártico iminoclorado de fórmula (I) y sales del mismo farmacéuticamente aceptables, mediante, por ejemplo, un procedimiento descrito en el documento WO 98/14453. Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de sodio, sales de potasio y sales de calcio. Entre éstas, son particularmente preferidas las sales de sodio y una sal de sodio de un derivado de ácido aspártico iminoclorado de fórmula (I) determinado, se denominó ATX-S10.Na.
Análisis 1 (análisis in vitro): Efectos de la TFD en las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC)
Como una primera etapa, los autores de la memoria determinaron si se podía inducir muerte celular de HUVEC inflamadas por TFD.
Las HUVEC se sembraron en medio de cultivo a 1,0 x 10^{-4} células/pocillo. Después de un periodo de cultivo determinado previamente, se añadieron IL-1\beta (1 ng/ml) y TNF\alpha (10 ng/ml) para estimular a las células y, así, provocar inflamación de las células. Después de un periodo de estimulación de 1 hora, las células se dividieron en dos grupos, y se añadieron 25 \mug/ml de la sal ATX-S10.Na de la presente invención a un grupo y 50 \mug/ml de ATX-S10.Na al otro. Posteriormente, las células se incubaron a 37ºC durante 24 horas.
Después del periodo de incubación, las células cultivadas se irradiaron por láser (cada grupo de dosificación se dividió en cinco sub-grupos, que se irradiaron a 0, 15, 30, 50 y 100 J/cm^{2}). Veinticuatro horas después de la irradiación, se determinó la viabilidad de HUVEC mediante un ensayo MTT.
Los resultados indican que no se observó muerte celular en los grupos no irradiados mientras que la viabilidad de HUVEC estuvo en el intervalo entre aproximadamente el 10 y el 20% en cada uno de los grupos irradiados (los grupos irradiados a 15, 30, 50 y 100 J/cm^{2}). Cada uno de los grupos a los que se suministró 25 \mug/ml de ATX-S10.Na mostró una viabilidad comparable a la del grupo correspondiente a los que se había suministrado 50 \mug/ml (Figura 1).
Estos resultados sugieren que ATX-S10.Na, cuando se usan en TFD, induce muerte celular de HUVEC inflamadas.
A continuación, usando un modelo de ratón real con artritis inducida por colágeno de tipo II, los autores de la memoria realizaron el análisis siguiente para examinar los efectos que la TFD tiene en artritis, usando ATX-S10.Na.
Análisis de referencia 2 (análisis in vivo): Efectos de la TFD en un modelo de ratón de artritis inducida por colágeno de tipo II
Se usaron ratones macho DBA/1, de 6 a 8 semanas edad y que pesaban de 15 a 18 g. La artritis se indujo por colágeno de tipo II según el protocolo siguiente.
En el Día 0, se inyectaron intraperitonealmente 2 mg de una mezcla de anticuerpos anti-colágeno tipo II. En el Día 1, se inyectaron de nuevo intraperitonealmente 2 mg de la mezcla de anticuerpos anti-colágeno tipo II. En el Día 2 y Día 3, se inyectaron intraperitonealmente 50 \mug de lipopolisacárido (LPS) para inducir la artritis por colágeno de tipo II.
En el Día 5, se confirmó la inducción de la artritis por colágeno de tipo II. Se inyectaron intravenosamente 5 mg/kg de ATX-S10.Na a un grupo bajo análisis de 5 animales y un grupo control de 3 animales. El grupo bajo análisis se expuso a irradiación por láser (dosis: 30 J/cm^{2}) 3 horas después de la administración de ATX-S10.Na. En el Día 14, se observó la presencia de efectos clínicos en cada uno de los animales, medida por un sistema de calificación de artritis clínica (Terato et al., 1995). Cada uno de los animales se sometió a fijación por perfusión, se recogió tejido de las articulaciones y se tiñó con Safranina 0. La muestra de tejido descalcificada resultante se sometió a un análisis histológico.
Los resultados del análisis revelaron que el grupo control no irradiado presentaba síntomas de artritis de forma continua, y tenía una calificación de artritis de 4 (Figura 2), mientras que no se observaron síntomas artríticos, o se observaron pocos, en el grupo bajo análisis irradiado, lo que indicaba una calificación de artritis de 0 ó 1
(Figura 3).
En el análisis histológico, se observó una infiltración significativa de células sinoviales en el grupo control (Figura 4), mientras que la infiltración se suprimió en el grupo bajo análisis (Figura 5).
Estas observaciones demuestran que ATX-S10.Na, un derivado de ácido aspártico iminoclorado de la presente invención, es altamente eficiente cuando se usa en TFD para tratar artritis reumatoide.
Los derivados de porfirina convencionales están acompañados de fotosensibilidad y otros efectos secundarios debido a que tienen una capacidad relativamente baja para acumularse de forma selectiva en un tejido particular y se metabolizan lentamente en tejidos normales. Así, los tratamientos con estos derivados de porfirina se deben llevar a cabo en un ambiente oscuro. En contraste con esto, ATX-S10.Na, el derivado de ácido aspártico iminoclorado de la presente invención, tiene una alta capacidad para acumularse de forma selectiva en células inflamadas y tumores, a la vez que se metaboliza rápidamente en tejidos normales. Así, el ATX-S10.Na provoca, si es que provoca alguno, efectos secundarios reducidos tales como fotosensibilidad. Además, el compuesto absorbe luz con una longitud de onda que penetra más profundamente en el tejido (670 nm) y, de esta forma, se puede usar en terapias en las que se usan fuentes externas de luz de láser.
Los reumatismos articulares, en particular, los sinoviocitos intratables resistentes al tratamiento con fármacos, se tratan generalmente por inyección intraauricular de esteroides, por sinovectomía artroscópica y por sinovectomía abierta. La administración de esteroides se asocia con el riesgo a infección y es invasiva. También, algunos esteroides son inapropiados para la administración repetitiva en las articulaciones. La sinovectomia abierta o artroscópica requiere hospitalización, es invasiva y requiere, algunas veces, una rehabilitación considerable.
En comparación con esto, la aplicación de TFD para tratar artritis reumatoide implica la inyección intravenosa del fotosensibilizador que se acumula de forma selectiva en las articulaciones inflamadas, y la posterior irradiación externa con láser de las articulaciones para inducir necrosis de las células sinoviales y, de ese modo, suprimir la destrucción de las articulaciones. Por tanto, el procedimiento ofrece una terapia no invasiva, altamente efectiva.
Una segunda forma de realización de la presente invención se refiere a un procedimiento TFD para el tratamiento de queratosis inflamatoria (psoriasis y otras enfermedades de la piel) y a un agente terapéutico para su uso en TFD de queratosis inflamatoria. El procedimiento TFD o el agente terapéutico, comprende como un ingrediente activo un derivado de ácido aspártico iminoclorado de fórmula (I), o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en particular ATX-S10.Na, una sal de sodio del compuesto.
La queratosis inflamatoria es una enfermedad de la piel caracterizada por enrojecimiento y queratinización, un síntoma notable de inflamación. La enfermedad incluye psoriasis y parapsoriasis con sus características clínicas particulares, que incluyen eritrodermia psoriatica, psoriasis artropática y psoriasis pustular.
Los presentes inventores aprovecharon la capacidad del derivado de ácido aspártico iminoclorado de fórmula (I), o de una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en particular ATX-S10.Na, para acumularse de forma efectiva en células inflamadas, y prepararon una pomada hidrófila que contenía ATX-S10.Na y una base de pomada hidrófila, descrita en Japanese Pharmacopoeia. Posteriormente, los inventores aplicaron la pomada a la piel, la eliminaron de la piel mediante lavado y obtuvieron una imagen de fluorescencia, que confirmó que ATX-S10.Na se acumulaba en la piel.
Mediante irradiación por láser en esta etapa para realizar TFD, se puede inducir necrosis de las células inflamadas y, de esta forma, la queratosis inflamatoria se debería tratar de forma efectiva. Los inventores realizaron el análisis siguiente para verificar esta teoría.
Análisis 3 (análisis in vitro): Citotoxicidad frente a queratinocitos cultivados
Los queratinocitos de obtuvieron a partir de un paciente con queratosis inflamatoria y se cultivaron a 37ºC durante 24 horas. Se añadieron 50 \mug/ml de la sal ATX-S10.Na de la presente invención y las células se cultivaron adicionalmente bajo las mismas condiciones. Posteriormente, las células se aclararon con PBS, se irradiaron con láser a 10 J/cm^{2} y se observó su viabilidad a lo largo del tiempo.
Asumiendo que el número inicial de células viables en el medio de cultivo antes de la irradiación por láser era el 100%, la viabilidad de las células se determinó a 1, 2, 3, 6, 12 y 24 horas después de la irradiación. Los resultados se muestran en la Figura 6. Como se muestra, el 75% de los queratinocitos incubados con ATX-S10.Na murieron 6 horas después de la irradiación por láser.
Los inventores realizaron el siguiente análisis, usando un modelo de dermatitis en ratón, para examinar los efectos de TFD usando ATX-S10.Na en la enfermedad.
Análisis 4 (análisis in vivo): Inducción de dermatitis en piel de ratón mediante el tratamiento con acetato de tetradecanoil forbol (TPA) y los efectos terapéuticos de TFD después de la aplicación de una pomada con ATX-S10.Na 1) Preparación de la pomada con ATX-S10.Na
Usando una base de pomada hidrófila, descrita en Japanese Pharmacopoeia, se prepararon dos pomadas hidrófilas, una que contenía un 1% de ATX-S10.Na y la otra un 10% del compuesto, mediante una técnica farmacéutica común.
2) Inducción de dermatitis inflamatoria
Se afeitaron ratones macho DBA/1, de 6 a 8 semanas edad y que pesaban de 15 a 18 g, con unas tijeras y una cuchilla de afeitar. Posteriormente, se aplicó TFD en la piel para inducir dermatitis.
3) Se aplicó una pomada hidrófila que contenía un 1% de ATX-S10.Na al grupo bajo análisis. La pomada se aplicó en la región de la piel en la que se había inducido dermatitis y se aclaró después de 3 horas. Se aplicó una pomada hidrófila sin ATX-S10.Na al grupo control y también se aclaró después de la aplicación. Las imágenes de fluorescencia obtenidas 3 horas después de la aplicación mostraron una fluorescencia rojiza en el grupo bajo análisis, pero no en el grupo control, lo que indicaba la presencia de ATX-S10.Na acumulada en la piel (Figura 7).
4) Irradiación con láser en TFD
El grupo bajo análisis se dividió posteriormente en dos subgrupos: un grupo se irradió con un láser a 100 J/cm^{2} y el otro grupo no se irradió. Se observó la histología de la piel de cada animal.
Los resultados indican que la dermatitis provocada por TFD (región inflamada) se mantuvo en el grupo no irradiado mientras que se observó una disminución significativa en la región inflamada en el grupo irradiado. Esto demuestra que cuando se usa TFD, la sal ATX-S10.Na de la presente invención, funciona para aliviar la dermatitis de forma significativa.
Las microfotografías de secciones transversales de los tejidos de piel con y sin irradiación con láser se muestran en la Figura 8.
De esta forma, se ha demostrado que el derivado de ácido aspártico iminoclorado de fórmula (I), o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en particular ATX-S10.Na, se acumula de forma efectiva en las células inflamadas. Las células se exponen posteriormente a irradiación por láser en TFD para inducir necrosis de las células inflamadas y, de ese modo, tratar la queratosis inflamatoria de forma efectiva.
Análisis de referencia 5: Determinación de la localización del nódulo linfático centinela y de metástasis cancerosas en la almohadilla de la pata de ratón
Se usaron ratones macho DBA/1, de 6 a 8 semanas edad y que pesaban de 15 a 18 g. Se inocularon células cancerosas Meth-A en la almohadilla de la pata de cada animal, y se inyectaron 0,02 mg/20 \mul de ATX-S10.Na, como compuesto bajo análisis, en la región del tumor. Mediante el uso de un sistema de imagen de fluorescencia, se identificó la localización del SN y se determinó la presencia de metástasis cancerosas durante el periodo de los 30 minutos siguientes.
Como compuesto control, también se inyectó intravenosamente un compuesto porfirina, la fotofrina.
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones respecto al uso del sistema de imagen de fluorescencia son como sigue:
Cámara: Cámara de color ICCD
Lentes: Micro-Nikkor f55 mm (F 2,8)
Filtros para cortar la luz de excitación: Y52*2
Campo de visión: 39 mm
Luz de excitación: unidad de la fuente de luz (L7212), lentes (E5147-06);
fibras ópticas (A2873)
Filtros: XYZ*2 + B39 + B37
Distancia de proyección: 145 mm
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones respecto a la captura de imagen son como sigue:
Ajustes estándar S-VHS \rightarrow DV \rightarrow DV Raptor (video DV)
Tamaño de imagen: Marco 640x480 Formato DV
(Brillo = 128, contraste = 199, espesor del color = 192, tinta = 128, agudeza = 1)
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 9 muestra las imágenes obtenidas para fotofrina (denominada simplemente PF de aquí en adelante) como compuesto control, y la Figura 10 muestra imágenes obtenidas para la sal ATX-S10.Na de la presente invención (denominada simplemente S10 de aquí en adelante).
Como se muestra, la localización de SN se indicó claramente mediante la inyección de ATX-S10.Na.
Posteriormente, se recogió el SN y se puso en un tubo de análisis. Se añadieron 500 \mul de 0,3% de ácido tricloroacético/60% de una disolución acuosa de MeOH y el tejido se sonicó a temperatura ambiente durante 10 minutos. El producto sonicado se transfirió a un tubo eppendorf y se centrifugó (8000 x g, 10 minutos, 4ºC). Se añadieron 200 \mul del sobrenadante a una placa de 96 pocillos de fondo plano (Nalge Nunc 167008) y se determinó la fluorescencia mediante un lector de fluorescencia de placas (CytoFluor 2350, Millipore). La fluorescencia se midió a una longitud de onda de excitación de 420 nm y una longitud de onda de emisión de 645 nm. Se determinó que el nivel de ATX-S10.Na en el SN era una cantidad traza de 10 a 20 ng/mg, lo que prueba la alta sensibilidad del procedimiento.
De esta forma, se puede determinar la localización del SN mediante el uso de un derivado de ácido aspártico iminoclorado de fórmula (I) de la presente invención. Una vez que se ha localizado el SN, se lleva a cabo una biopsia para determinar si el cáncer ha metastatizado.
La determinación de metástasis cancerosas en el SN hace posible determinar si el cáncer ha metastatizado hacia el sistema linfático completo y, de esta forma, ofrece una dirección para el diagnóstico y tratamientos futuros.
Aplicabilidad industrial
Como se ha establecido, aprovechando la alta capacidad del derivado de ácido aspártico iminoclorado de fórmula (I), en particular de ATX-S10.Na, una sal de sodio del compuesto, para acumularse en células inflamadas, la presente invención proporciona un agente terapéutico para su uso en TFD de queratosis inflamatoria.
Respecto a los agentes terapéuticos para la queratosis inflamatoria, ninguno de los agentes anti-inflamatorios, inhibidores del crecimiento epidérmico o terapias UV (por ejemplo, PUVA) convencionales, proporciona un tratamiento decisivo. La aplicación de TFD usando clorhidrato del ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) no proporciona tampoco efectos terapéuticos suficientes, debido a la baja capacidad del compuesto para acumularse en las neovascularizaciones y a la longitud de absorción máxima del compuesto (630 nm). Contrastando con esto, los agentes terapéuticos de la presente invención, que se pueden acumular de forma efectiva en las células inflamatorias subepidérmicas, cuando se administran de forma percutánea, se pueden usar en TFD, técnica por la que los compuestos acumulados se exponen a irradiación por láser para tratar de forma efectiva la enfermedad.

Claims (6)

1. El uso de un derivado de ácido aspártico iminoclorado de fórmula (I)
3
en la que Asp representa un residuo de ácido aspártico;
o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de queratosis inflamatoria mediante terapia fotodinámica (TFD).
2. El uso según la reivindicación 1, en el que el derivado de ácido aspártico iminoclorado de fórmula (I), o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, es una sal de sodio.
3. Un agente terapéutico para su uso en TFD de queratosis inflamatoria, que comprende como un ingrediente activo el derivado de ácido aspártico iminoclorado de fórmula (I) de la reivindicación 1, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
4. El agente terapéutico según la reivindicación 3, en el que el derivado de ácido aspártico iminoclorado de fórmula (I), o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, es una sal de sodio.
5. El uso del derivado de ácido aspártico iminoclorado de fórmula (I) de la reivindicación 1, o de una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, para la preparación de un medicamento para su uso en TFD de queratosis inflamatoria.
6. El uso según la reivindicación 5, en el que el derivado de ácido aspártico iminoclorado de fórmula (I), o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, es una sal de sodio.
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