BRPI0713317A2 - ferramenta molecular para otimizar toleráncia ao sal em um organismo - Google Patents

Abstract

FERRAMENTA MOLECULAR PARA OTIMIZAR TOLERáNCIA AO SAL EM UM ORGANISMO. A presente invenção refere-se a uma ferramenta molecular para otimizar tolerância ao sal é determinada. A invenção descreve marcadores genéticos ligados a transferrina (haplotipos de transferrina de microssatélite) em tilápia segregando com tolerância ao sal e mutantes funcionais (SNPs) no gene de transferrina, que coincidem com os haplotipos marcadores e consequentemente são considerados como mutantes funcionais firmemente ligados com tolerância ao sal nestas espécies. Além disso, demonstrou-se que transferrina é significativamente supra-regulada em tilápias expostas à água salgada. Conhecimento aumentado dos genes envolvidos em tolerância à água salgada facilitará seleção para este traço que é necessário na indústria em expansão de criação de tilápia com a demanda por instalações de criação em áreas costais. Um tal desenvolvimento pressupõe uma tilápia que tolere água salgada sem redução no desempenho de crescimento e saúde.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FERRAMEN- TA MOLECULAR PARA OTIMIZAR TOLERÂNCIA AO SAL EM UM ORGANISMO".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a uma ferramenta molecular para otimizar tolerância ao sal em um organismo. Mais especificamente, a inven- ção diz respeito à intensificação da tolerância ao sal em espécies importan- tes na aquacultura internacional. A invenção diz respeito aos marcadores genéticos ligados à transferrina (haplotipos de transferrina microssatélites) em um organismo, em que os marcadores genéticos se segregam com tole- rância ao sal, e ela também diz respeito aos mutantes funcionais (SNPs) no gene de transferrina, que coincidem com os haplotipos marcadores, e con- sequentemente são considerados como mutantes funcionais firmemente li- gados com tolerância ao sal.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Tilápias pertencem a um gênero de peixes dentro da família de ciclídeos e estão se tornando a espécie de aquacultura principal no mundo, com o tilápia-do-nilo (Oreochromis niloticus) na vanguarda (Bentsen et al., 1998; Kocher, 2002; Roderick, 1999; Trewavas, 1983).

Tilápias são facilmente criadas e colhidas, podem ser alimenta- das com uma dieta de algas abundantes e zooplâncton. As espécies e linha- gens comercialmente mais importantes são encontradas predominantemente em água doce. Uma vez que a disponibilidade de água doce está severa- mente limitada em muitos países, a exploração de áreas e instalações de água salgada, tipicamente criações de camarão litorais abandonadas, pode apresentar uma oportunidade para expandir a indústria de aquacultura de tilápia com investimentos modestos apenas (Yi et al., 2002). Porém, tal de- senvolvimento pressupõe uma tilápia que tolere água salgada sem redução no desempenho de crescimento e saúde. Conhecimento elevado dos genes envolvidos em tolerância à água salgada facilitará a seleção para este traço.

O gênero Oreochromis tolera água salgada, mas com uma gran- de variação entre as espécies. Oreochromis mossambicus e O. aureus (tilá- pia azul) apresentam um grau mais alto de tolerância ao sal que a tilápia-do- nilo (Avella et al., 1993; Cataldi et al., 1988; Doudet, 1992), fortemente indi- cando que a tolerância ao sal é controlada por fatores genéticos.

Transferrina é uma glicoproteína de ligação de ferro. Ela está em primeiro lugar envolvida em várias funções biológicas em uma gama exten- siva de organismos como um transportador de ferro. Transferrina tem um papel importante no sistema imune, uma vez que a ligação de ferro limita a disponibilidade de ferro para replicar patógenos (Cnaani et al., 2002; Stafford e Belosevic, 2003). Transferrina (TF) é expressa primariamente no fígado e transportada por toda parte no plasma provendo ferro para a maioria dos tecidos corporais, mas é também expressa em vários outros órgãos (Briggs et al., 1999). Experimentos mostram que o gene é expresso no cérebro do bacalhau do Atlântico (Gadus morhua) em contraste com salmão e outros vertebrados onde expressão cerebral não foi detectada (Denovan-Wright et al., 1996). Transferrina pertence a uma família de gene incluindo ovotrans- ferrina (OTF) e Iactotransferrina (LTF). OTF é codificada pelo gene de trans- ferrina aviário e é expressa em ovos e LTF é segregada no leite pela glându- la mamária impedindo a proliferação de micróbios invasores. Estas variantes de transferrina são acreditadas ser produzidas localmente (em mamíferos e aviário) não facilmente alcançadas através de transferrina plasmática (Briggs et al., 1999; Lambert et al., 2005).

Todos os membros na família de transferrina consistem em uma cadeia de polipeptídeo simples que se dobra em duas metades globulares referidas com lóbulos amino e carbóxi. Em TF, OTF e LTF, cada lóbulo coordena gação de ferro envolvendo quatro ligantes de aminoácidos (2 Tyr, 1 His e 1 Asp) com dois Iigantes adicionais fornecendo um ânion siner- gístico (Thr e Arg) (Lambert et al., 2005). Sugere-se que estes dois lóbulos originam-se de uma fusão e duplicação do gene de transferrina, uma vez que há similaridades em tamanho, segmentos de nucleotídeo e composição de aminoácidos entre os respectivos éxons nos dois lóbulos do gene (Park et al., 1985).

Os esforços para identificar genes associados com tolerância ao sal incluíram análise de expressão diferencial e uma estratégia de gene can- didato. Foi estabelecida uma hipótese que transferrina pudesse ser um gene candidato associado a tolerância à água salgada. Portanto, no estudo pre- sente, foi focalizada na expressão de transferrina em um experimento de água salgada e na estrutura do gene de transferrina de tilápia-do-nilo, nota- velmente revelando, a seqüência genômica. Somente fragmentos da se- qüência de outras espécies de tilápia {O. aureus e O. mossambicus) esta- vam disponíveis (Cnaani et al., 2002) até o estudo presente. Para verificar o efeito do gene de transferrina, foi executado um estudo funcional; uma análi- se de segregação de haplotipo entre os sobreviventes e não-sobreviventes após um desafio de água salgada, com base na genotipagem dos marcado- res polimórficos estritamente ligados à transferrina e SNPs detectados den- tro do gene, e por fim um estudo de expressão diferencial de transferrina no mesmo peixe.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os inventores da presente invenção mostraram que transferrina está envolvida em tolerância à água salgada. Um estudo de expressão em tilápias expostas à salinidade ascendente por vários dias foi executado. Transferrina mostrou uma suprarregulação significativa quando analisada por PCR de tempo real.

Fornecidos aqui, são também o haplotipo marcador de transfer- rina de tilápia tolerante a sal e um conjunto de mutantes funcionais (SNPs) no gene de transferrina que coincidem com os haplotipos marcadores e con- sequentemente são considerados como mutantes funcionais firmemente as- sociados com tolerância ao sal nestas espécies.

Uma análise de haplotipo entre os sobreviventes e não- sobreviventes após o desafio de água salgada foi executada, com base na genotipagem dos marcadores polimórficos estritamente ligados à transferrina e SNPs detectados dentro do gene. Peixe de duas famílias em um experi- mento de água salgada, incluindo os sobreviventes em salinidade acima de 30ppt e aqueles morrendo a uma concentração de sal baixa, foram genoti- pados com os marcadores estritamente ligados TF-A e TF-B. A genotipagem dos dois marcadores devolveu dois haplotipos, e os resultados mostraram uma distorção de segregação significativa (Tabela 1). O peixe tolerante a sal teve uma maior parte de haplotipo 2 e o peixe menos tolerante a sal uma maior parte de haplotipo 1. A distorção de segregação dos dois marcadores, TF-A e TF-B, estritamente ligados ao gene de transferrina, fortemente indi- cou que transferrina pudesse estar envolvida na tolerância à água salgada. Por conseguinte, os pais e descendência no experimento de desafio de água salgada foram verificados (= sequenciados) para procurar mutações funcio- nais potenciais (SNPs) que mostrassem uma distorção de segregação na descendência. Estes estudos mostraram que um haplotipo com vários SNPs cossegregaram-se com os microssatélites TF-A e TF-B. Um destes haploti- pos, haplotipo 2, foi fortemente associado com tolerância ao sal aumentada.

14 dos SNPs detectados dentro do gene de transferrina resulta- ram em alterações de aminoácidos e fortemente implicam que estas altera- ções na proteína de transferrina em algumas tilápias-do-nilo são funcional- mente associadas à tolerância à água salgada melhorada.

Os dois marcadores microssatélites ligados à transferrina, TF-A e TF-B1 retornaram as variantes de haplotipo, 287-184 e 289-188, junto com as mutações expressas acompanhantes (SNPs) na transferrina, que revela efeito diferencial na tolerância ao sal no experimento da invenção, podem ser usados para adaptar os indivíduos a vários ambientes definidos pela va- riação na salinidade. Isto pode ser alcançado mediante procriação seletiva, através de outros regimes de intensificação genética ou poderia ser obtido através de procedimentos que influenciam a expressão da transferrina ou outros genes ligados com transferrina. O potencial para ganhos genéticos empregando os marcadores em uma seleção assistida por marcador é evi- dente do fato que a sobrevivência é 63% no grupo com o haplotipo 2 de transferrina e apenas 38% em tilápia com haplotipo 1. A sobrevivência atri- buível ao haplotipo 2 nesta população de peixe é 11% (sobrevivência geral 49%, sobrevivência em peixe de haplotipo 1 = 38%; 49%-38%=11%). Pelo uso de seleção sistemática, deve ser possível também aumentar a freqüên- cia do haplotipo 2 lentamente para 100%, e espera-se que isto possa dire- tamente aumentar a sobrevivência em 14% (0,63-0,49=14%). Além disso, a invenção pode também descobrir haplotipos de transferrina novos com uma sobrevivência até mais alta. O potencial para usar a informação da invenção para alterar a tolerância ao sal de um indivíduo através das vias reguladoras pode ser prognosticado da possibilidade que os elementos reguladores e os polimorfismos potenciais de tais (não descritos nesta invenção) poderiam ser ligados ou em modo de via associados com os haplotipos descritos da in- venção e consequentemente podem ser usados como ferramenta alternativa para melhorias ou customização, ainda desenvolvidos com base na presente invenção.

Qualquer variação do gene de transferrina, ligada ou não-ligada com o haplotipo da invenção, que esteja associada com a tolerância ao sal e tenha sido revelada com ajuda desta invenção, pode ser usada para alcan- çar a meta desta invenção; uma ferramenta molecular nova para otimizar tolerância ao sal.

A invenção mostra que tilápia com genótipos de transferrina dife- rentes e haplotipos de transferrina diferentes têm sobrevivência diferente em água salgada. A invenção também sugere usar haplotipagem de transferrina como uma ferramenta para seleção assistida com marcador para melhorar resistência à água salgada em peixe. A invenção pode ser, portanto usada para investigar e comparar os indivíduos com variantes de transferrina dife- rentes, tanto em tilápia e outras espécies de peixe, com o propósito de de- tectar haplotipos de transferrina novos, não ainda detectados, para obter um aumento na resistência à água salgada usando haplotipos de transferrina alternativos que o descrito. Qualquer sítio marcado de seqüência (marcador anônimo ou expressado) do genoma vertebrado ou em tilápia, ligado com transferrina, com o haplotipo da invenção ou com qualquer outro polimorfis- mo detectado com base na invenção e associado com tolerância ao sal pode ser usado para alcançar a meta desta invenção; uma ferramenta molecular nova para otimizar tolerância ao sal. Tais marcadores polimórficos ou sítios associados com tolerância ao sal poderiam ser firme ou livremente ligados com as estruturas polimórficas genômicas da invenção. Há exemplos, que ligações bastante soltas podem ser úteis para alterar a composição genética na direção desejada. Um dos exemplos mais bem-conhecido disso é a alte- ração na freqüência do lócus de sensibilidade de halotano (depois descober- to como o gene do receptor de Ryanodin) usando haplotipos marcadores ligados ao lócus (Doize et al., 1990). A invenção pode ser, portanto usada para desenvolver testes genéticos com base em Ioci ligados em vez da in- venção per se.

Qualquer sítio marcado de seqüência/marcador genômico poli- mórfico (marcador anônimo ou expressado) do genoma vertebrado ou em tilápia, não ligado com transferrina, nem com o haplotipo da invenção, mas que seja associado à tolerância ao sal e que tenha sido revelado através da ajuda da invenção, pode ser usado para alcançar a meta desta invenção; uma ferramenta molecular nova para otimizar tolerância ao sal. Este pode ser obtido usando a invenção, para estabelecer materiais com os mesmos haplotipos de transferrina ou para estatisticamente controlar a variação de transferrina, como um meio para detectar outros fatores genéticos que influ- enciam na resistência à água salgada ou desempenho em água salgada.

Qualquer estudo de expressão usando expressão de transferrina ou expressão de outros genes estritamente ligados à transferrina pode ser usado para indiretamente identificar o haplotipo de transferrina e assim for- necer informação acerca da resistência à água salgada associada à inven- ção. O estudo de reguladores de genes ligados ou não-ligados como promo- tores, intensificadores ou elementos reguladores nos mesmos cromossomos ou outros, pode direta ou indiretamente ser usado para encontrar outros ge- nes, polimorfismos ou padrões de expressão que sejam associados à invenção.

A invenção descreve um método para identificar novos genes também associados à tolerância à água salgada. Um aumento gradual no conteúdo de água salgada aumentará a tolerância à água salgada de algum peixe ou uma espécie diferente. Um estudo de expressão diferencial pode ser depois realizado comparado com peixe ou uma espécie diferente em água doce para identificar genes novos. As melhorias ou customizações relacionadas à tolerância ao sal que poderiam ser alcançadas com base na invenção podem não ser restrin- gidas à criação ou melhorias de peixe/animal ou planta, mas podem também ser aplicáveis à farmacologia humana e bem-estar. O estudo da expressão de água salgada mostra que a expressão de transferrina em um organismo pode ser facilmente alterada e que isto pode melhorar a saúde/sobrevivência e adaptação à mudança e várias condições ambientais. Por exemplo, sele- ção de porcos/porquinhos com expressão de transferrina aumentada/ótima resultará em expressão de transferrina aumentada/alterada no intestino para ajustar o nível de transferrina/ferro e melhorar a resistência a doenças infec- ciosas. Ou seleção de gado com expressão de transferrina aumentada/ótima pode resultar em expressão de transferrina aumentada/alterada nas glându- las mamárias para melhorar a resistência à infecção da glândula mamária.

Ajuste/otimização indireta da expressão de transferrina pode também ser possível mediante criação de tilápia, salmão, peixes, animais e plantas para o propósito de alteração sistemática do ótimo nível dos genóti- pos de transferrina ou nível de expressão para o propósito de melhorar a saúde/resistência, sobrevivência, desempenho, longevidade.

A produção de animais ou produtos/consumíveis (leite, carne, plantas, extratos ou outros itens) através da seleção dos animais com ótima expressão de transferrina (resultando em ótima concentração em produtos) para o propósito de comercializar estes como produtos de saúde, para so- brevivência aumentada, saúde, bem-estar para ser humano, peixe, animal, plantas.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1. MATERIAL BIOLÓGICO

Um experimento de tolerância à água salgada foi executado em uma população de tilápia-do-nilo. Concentração de sal foi aumentada gradu- almente de 0-30ppt em três dias nos recipientes mantendo parentescos to- tais de cinco famílias diferentes. Foram colhidas 23 descendências sobrevi- ventes à concentração de sal final para comparar com 24 não-sobreviventes de uma família (família no. 1) além dos 37 sobreviventes e 40 não- sobreviventes de uma segunda família (família no. 2). Cortes de barbatana foram armazenados em 96% de etanol.

DNA foi extraído com o kit de DNA MagAttract M48 (Qiagen) como recomendado. Os fragmentos da barbatana foram dissolvidos em tampão de Iise e proteinase K durante noite a 37°C. O isolamento automati- zado foi completado em uma Estação de Trabalho BioRobot M96 (Qiagen) e o DNA foi eluído em volumes de 50 μ;.

RNA total das brânquias e cérebros de tilápia-do-nilo, preserva- dos em RNAIater® (Ambion) a -20°C, foi isolado com kit de RNeasy Midi (Qiagen) após protocolo padrão. Os órgãos foram adicionados à quantidade apropriada de tampão de RLT (lise) e homogeneizados por um laminador em sacos plásticos estéreis (Seaward, Stomacher) e homogeneização adicional foi realizada passando o lisado através de uma seringa estéril 19G. RNA foi eluído duas vezes com 150 μl de água livre de RNase e precipitado com e- tanol após procedimento padrão para aumentar as concentrações. As con- centrações foram medidas em um Lambda EZ 201 (Perkin Elmer) e os ór- gãos agrupados. O RNA total foi depois tratado com DNA-free™ (Ambion), como recomendado pelo protocolo, para remover o DNA contaminante do RNA extraído.

EXEMPLO 2. SEQUENCIACÃO DE TRANSFERRINA

Com base nas seqüências de transferrina publicadas das espé- cies de tilápia O. aureus e O. mossambicus de éxon 7, 9 e 10 (no. de acesso AJ318861 e AJ312311), os iniciadores foram construídos para caminhamen- to de gene direto e reverso. Caminhamento de gene foi executado usando o kit DNA Walking SpeedUp™ (Seegene, Inc.). O processo de caminhamento de gene consiste em várias etapas de PCRs usando um conjunto de inicia- dores de PCR universais fornecido com o kit em combinação com os inicia- dores de PCR projetados TF-específicos em ambas as direções.

O perfil de temperatura e organização da reação foram seguidos como recomendado no protocolo. Os produtos foram testados em 1% de gel de agarose e purificados com ExoSAP-IT antes das amostras selecionadas serem sequenciadas após protocolo padrão com Kit de Sequenciação de Ciclo BigDye® Terminator (ν3.1) (Applied Biosystems) com 0,25 μl 10 μl de iniciador Universal (Seegene, Inc.) e 0,5 μl 5 μl dos iniciadores respectiva- mente aninhados e 2.aninhados projetados, em um Analisador Genético ABI PRISM® 3100 (Applied Biosystems).

Como um suplemento para o caminhamento do gene foi usada tecnologia RACE e RT-PCR em RNA total para amplificar os dados de se- qüência de cDNA.

A tecnologia RACE foi realizada como recomendado pelo Manu- al do Kit de cDNA GeneRacer™ RACE Ready (Invitrogen). Iniciadores espe- cíficos de gene (GSP), direto, reverso e aninhados, foram construídos com base na seqüência existente, com base nas recomendações do protocolo. Todas as etapas foram executadas como recomendado pelo protocolo. Os produtos de PCR foram purificados por ExoSAP-IT (Amersham Biosciences) e depois sequenciados após o protocolo padrão com o Kit de Sequenciação de Ciclo BigDye® Terminator (v3.1) (Applied Biosystems) e os respectivos iniciadores de PCR, reverso e direto, em um Analisador Genético ABI PRISM® 3100 (Applied Biosystems).

O protocolo de duas etapas de Ready-to-go-RT-PCR Beads (A- mersham Biosciences) foi executado como recomendado. Os produtos de PCR foram purificados por ExoSAP-IT (Amersham Biosciences) e depois sequenciados como descrito acima.

Iniciadores novos foram construídos para passar por PCR ao longo dos íntrons, com base nas seqüências de éxon obtidas. Condições de PCR foram como segue: 2 μl de 10x tampão de PCR incluindo 15 mM de MgCI2 (Applied Biosystems), 2 μl de dNTP (2 mM), 0,5 μl de MgCI2 (25 mM), -75 ng de DNA, 1 μl de iniciador de PCR, direto e reverso (5 pmol/μl), 0,2 μl de AmpliTaq® DNA Polymerase (5U/μl, Applied Biosystems) e água para um volume total de 20 μl. Temperatura de anelamento foi 58°C por 1 minuto e a PCR foi executada com 35 ciclos. Os produtos de PCR foram sequenciados pelo método descrito acima. Depois as sequencias de DNA e cDNA foram alinhadas por Sequencher 4.1.4 (Gene Codes Co.) para revelar os limites de éxon-íntron. Alinhamentos foram também executados através de blastn (Ba- sic Local AlignmentSearch Tool para nucleotídeos) e através de bl2seq (ali- nhamento de duas seqüências) em NCBI. A seqüência de transferrina de medaka japonês (Oryzias Iatipes) (no. de acesso: D64033) foi usada como a seqüência de referência.

A seqüência de DNA completa do gene de transferrina revelado em tilápia-do-nilo, com informação detalhada dos limites de éxon e íntron, também estará disponível no GenBank (no. de acesso: DQ272465) após depósito do pedido de patente. O gene consiste em 7010 pares de base, com 17 éxons separados por 16 íntrons, incluindo partes das regiões de 5' e 3'UTR. (SEQ ID NO: 1) A seqüência de domínio de codificação completa (CDS) é composta por 2085 bp (SEQ ID NO: 2).

A proteína de transferrina de tilápia-do-nilo consiste em 694 a- minoácidos. Um BLAST de proteína-proteína (blastp) deu pareamento de similaridade mais alta com a seqüência de proteína de transferrina de meda- ka com contagem de identidade de 77% seguida por brema-vermelha e pre- ta e truta-marrom com 73, 72 e 67% de identidade, respectivamente. Uma visão geral detalhada desta comparação de proteína é dada na Figura 1 que mostra várias regiões altamente conservadas e algumas regiões com ami- noácidos divergindo entre todas as espécies. Também observado é uma inserção de três aminoácidos na seqüência de proteína de tilápia apenas.

Os resíduos de ligação de ferro e ânion nos dois lóbulos da pro- teína são encontrados conservados como descrito por (Lambert et al., 2005) nas cinco espécies de peixe comparadas, com exceção de um resíduo onde a tilápia tem um ácido aspártico em vez da histidina conservada no lóbulo N da proteína.

EXEMPLO 3. GENOTIPAGEM DE MICROSSATÉLITES ESTRITAMENTE LIGADOS À TRANSFERRINA

Microssatélites ligados à transferrina foram identificados triando uma biblioteca de BAC com fundo de tilápia disponível (Katagiri et al., 2001) para um clone de BAC contendo o gene, por amplificação de PCR com inici- adores projetados da seqüência disponível do gene (Cnaani et alM 2002). Um kit de DNA Clone BAC (Princeton Separations) foi usado para isolar o clone de BAC seguindo o protocolo recomendado. O clone foi depois frag- mentado por uma enzima de restrição adequada e os fragmentos de DNA, de 500-1000 bp, foram purificados por um Kit de Extração em Gel Strata- Prep® (Stratagene).

Os fragmentos de DNA de BAC foram ligados aos vetores de DNA de Plasmídeo pUC19 (Sigma-AIdrich Co) e transformados em Células Ultracompetentes XLIO-Golde (Stratagene) seguindo as instruções dadas; Técnicas de hibridação foram realizadas através de métodos tradicionais (Sambrook, 1989) usando membranas de náilon Colony/Plaque Screen™ (NEF 990A, Perkin Elmer NEN) para estimulação de colônia. Sondas gtio e ct10 foram marcadas na extremidade a 37°C por 40 min, 95°C por 10 min e 15 min em gelo, em uma solução de 4 μl de sonda gt10, (1 pg/μl, MGW), 4 μl de sonda Ct10 (1 Mg/μl, MGW), 6 μl de T4 Polinucleotídeo Cinase 10 U/μl (NEB), 12 μl de Tampão de Reação de T4 Polinucleotídeo Cinase 10X (NEB), 5 μl [γ32Ρ] ATP 500 [uCi, (Amersham Biosciences) e 44 μl de H2O.

As sondas marcadas foram acrescentadas à solução de pré- hibridação, e os filtros foram hibridados durante a noite de acordo com os métodos padrão. Os filtros foram lavados e depois cobertos em Saran Wrap e expostos a Hyperfilm MP (Amersham Biosciences) durante a noite a -70°C antes dos filmes serem desenvolvidos. Colônias positivas foram identificadas e uma triagem secundária foi executada como descrita para as primeiras etapas de triagem.

Os clones positivos foram escolhidos e plasmídeos de DNA puri- ficados com Kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN) como recomendado pelo protocolo. As inserções de vetor foram sequenciadas para encontrar os mi- crossatélites potenciais, após o protocolo padrão para o Kit de Sequenciação de Ciclo BigDye® Terminator v3.1 (Applied Biosystems), com iniciadores de M13, em Analisador Genético ABI PRISM® 3100 (Applied Biosystems).

Para verificar que o clone de BAC escolhido incluía o gene cor- reto, o clone de BAC isolado foi amplificado por PCR com o mesmo par de iniciadores usado para encontrar o clone específico na biblioteca de BAC. O produto de PCR foi depois sequenciado como descrito acima, agora com os respectivos iniciadores de PCR. Os resultados foram subseqüentemente passados por BLAST e daquele modo verificando que a seqüência pareou o gene correto (Rengmark et al., 2006).

Foram identificados dois marcadores microssatélites no clone de BAC contendo o gene de transferrina. TF-A consistiu em uma seqüência re- petida de (GT)io (SEQ ID NO: 3) e TF-B da seqüência repetida de (GT)i4 (SEQ ID NO: 4).

Os dois microssatélites ligados estritamente à transferrina, TF-A e TF-B, foram genotipados nas tilápias sobreviventes e não-sobrevivente da família 1 e 2 no experimento de tolerância à água salgada. Condições de PCR foram como relatadas acima, mas com uma temperatura de anelamen- to de 55°C durante 45 segundos e 32 ciclos. Os iniciadores de PCR usados para genotipar o marcador TF-A foram SEQ ID NO: 5 e 6 e para o marcador TF-B: SEQ ID NO: 7 e 8. As amostras foram passadas em um ABI PRISM® 3100 e os resultados foram analisados por GeneMapper ν 3.0 (Applied Bi- osystems).

HAPLOTIPOS DE TILÁPIA TOLERANTE A SAL

Os dois loci foram herdados como um bloco de haplotipo. Haplo- tipo 1 consistiu nos alelos 287 e 184 e haplotipo 2 nos alelos 289 e 188, re- presentados pelos marcadores TF-A e TF-B, respectivamente. Os pais tes- tados eram heterozigotos para ambos os marcadores, exceto o antepassado na família 2, que era homozigoto para ambos os loci com os respectivos ale- los 287 e 184. Os haplotipos e distribuição χ2 são apresentados na Tabela 1. Observou-se que peixes tolerantes a sal mostraram uma tendência de pos- suir haplotipo 2 e os peixes menos tolerantes a sal tiveram uma maior parte de haplotipo 1. A distorção de segregação foi significativa em ρ < 0,025 e 0,05. Tabela 1. DISTRIBUIÇÃO y? DOS DOIS HAPLOTIPOS EM DUAS FAMÍLIAS DE QTL MOSTRA QUE SAL OS INDIVÍDUOS TOLERANTES POSSUEM HAPLOTIPO 2.

<table>table see original document page 14</column></row><table>

* Família 1: Ambos os pais com haplotipo heterozigoto 1/2

** Família 2: Um pai com haplotipo heterozigoto 1/2, o outro com haplotipo homozigoto 1/1

EXEMPLO 4. IDENTIFICAÇÃO DOS SNPs NO GENE DE TRANSFERRINA

Pares de iniciadores adicionais foram projetados para encontrar SNPs potenciais na parte expressa do gene. PCRs padrões foram executa- das primeiro nos pais da família 2, depois sequenciados pelos Sistemas de Análise de DNA MegaBACE™ 1000 (Amersham Biosciences) usando o kit DYEnamic™ ET Dye Terminador (Amersham Biosciences). Condições de reação foram como segue: 4 μΙ de pré-mistura do reagente ET, 4,5 μl de H2O, 1 μl de produto de PCR e 0,5 μl de iniciador (5 μΜ) com a etapa se- guinte repetida 28 vezes: 95°C, 15 segundos, 58°C, 10 segundos, 60°C, 1 minuto. A limpeza pós-reação foi executada como recomendado pelo proto- colo com etanol e 7,5 M de acetato de amônio. SNPs foram identificados alinhando e comparando os dados de seqüência por Sequencher 4.1.4 (Ge- ne Codes Co.). Se SNPs fossem detectados, os dois grupos de descendên- cia na família (sobreviventes e não-sobreviventes em água salgada) foram depois sequenciados nos SNPs determinados para definir seus genótipos.

SNPs DETECTADOS NO GENE DE TRANSFERRINA

25 SNPs heterozigotos foram identificados no gene de transfer- rina, 15 destes ficam localizados no éxon 7, 8, 14, 15 e 16. Quatorze destes resultaram em uma alteração de aminoácido (Tabela 2).

Observou-se que todos os SNPs, genotipados na descendência da família 2, segregaram-se como dois blocos de haplotipo que também in- cluem os dois microssatélites. A distribuição dos haplotipos é mostrada em detalhes na Tabela 1 e a distorção de ligação implica fortemente que os indi- víduos que possuem o haplotipo 2 são mais tolerantes a sal. Uma visão ge- ral completa dos haplotipos é dada na Tabela 3.

Os resíduos de ligação de ferro e ânion são todos conservados com exceção de um (Figura 1). O resíduo de histidina no lóbulo N codifica para um ácido aspártico (GAC) em tilápia-do-nilo (posição 258). Todas as outras espécies de peixe têm His nesta posição (CAC ou CAT). Lambert et al. (2005) relata que esta posição His é o resíduo mais variante no lóbulo N e Asp nesta posição é também encontrado em insetos diferentes como mosca- das-frutas e térmita. De forma interessante, esta posição no éxon 7 contém um SNP (vide Tabela 2) no aminoácido vizinho bem a montante para Asp resultando em uma alteração de aminoácido de alanina para glicina no grupo sobrevivente de peixe. TABELA 2. SNPs DETECTADOS NO GENE DE TRANSFERRINA. LISTA- DOS SÃO LOCALIZAÇÃO NO GENE. NÚMERO DE PARES DE BASE (CORRESPONDEM COM A SEQÜÊNCIA NO GENBANK. NO. DE ACES- SO: DQ272465). GENÓTIPO NO TIPO SELVAGEM E SNP1 ALTERAÇÃO DE AMINOÁCIDO. SE HOUVER, E A POSIÇÃO DE AMINOÁCIDO (VIDE TAMBÉM FIGURA 1 ONDE ESTAS POSIÇÕES ESTÃO SUBLINHADAS).

<table>table see original document page 16</column></row><table> <table>table see original document page 17</column></row><table> Tabela 3

<table>table see original document page 18</column></row><table> EXEMPLO 5. ESTUDO DA EXPRESSÃO EM TRANSFERRINA

Um experimento de água salgada paralelo foi realizado para o estudo de expressão. Um total de 200 tilápias-do-nilo de quatro famílias dife- rentes é usado neste experimento. O comprimento médio do corpo era 10 cm e teve uma distribuição aproximadamente igual dos sexos. Vinte e cinco peixes de cada família foram agrupados em dois tanques com ambientes físicos idênticos. A concentração de sal em um dos tanques foi gradualmen- te aumentada em cada segundo dia de 0-32ppt durante um período de dez dias, e os peixes foram mantidos durante outros cinco dias nesta condição salina. Todos os peixes foram depois mortos e dissecados. Cérebros e brânquias foram diretamente transferidos e preservados em RNAlatei® (Ambion) a -20°C.

Os cérebros e brânquias de cada tratamento foram agrupados em recipientes separados e RNA total foi extraído como recomendado pelo kit RNeasy Maxi (Qiagen). Quantidades iguais dos isolamentos de cérebros e brânquias foram misturadas para dar um fundo geral de água salgada e doce respectivamente. A intenção do agrupamento de órgãos foi revelar uma expressão total do metabolismo de tolerância ao sal.

Transferrina foi analisada por RT-PCR em um Sistema de De- tecção de Seqüência ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems). RNA total foi tratado com DNA-free™ (Ambion) para remover DNA contaminante, como recomendado pelo protocolo. Uma RT-PCR de duas etapas foi executada com um kit de RT-PCR TaqMan® Gold (Applied Biosystems) com reagentes de PCR e condições de ciclização como recomendado. Esta RT-PCR de duas etapas inclui a adição de AmpErase UNG1 que pode impedir contami- nação de transporte dos produtos de PCR. Iniciadores e sondas de Taq- Man® específicos foram construídos de acordo com o protocolo. Várias dilu- ições incrementais foram feitas com antecedência para testar as melhores concentrações de MgCI2, iniciador e sonda para condições ótimas de RT- PCR. Desvios-padrões para cada amostra foram medidos com base em três operações paralelas.

RT-PCRs com sucesso foram executadas em fundo geral de RNA total dos cérebros e brânquias de tilápia, além das brânquias sozinhas. Isto estabelece que transferrina é expressada nas brânquias e indica ex- pressão também no cérebro, que até o momento não tinha sido detectado em outros vertebrados que bacalhau do Atlântico (Denovan-Wright et al., 1996). Transferrina mostrou uma suprarregulação significativa quando anali- sada por RT-PCR.

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

SEQ ID NO: 1

A seqüência de DNA completa do gene de transferrina em tilá- pia-do-nilo, com informação detalhada dos limites de éxon e íntron e infor- mação dos aminoácidos, é dada no no. de acesso do GenBank: DQ272465

1 tgatccggag accccaccgc ccaacatgaa gcctctcctc ctagtgacgt ctcttggtga 61 tccggagacc ccaccgccca acatgaagcc tctcctccta gtggcgctgc ttggactgct 121 cggtaaaagc ttttcagccc cgcactacga agtaggcaaa gagttcgctg cacccggctc 181 tcagaaggtg aaatggtgcg tcaagtcaga ccaagaattg cgtaaatgtt cagatctcgc 241 cgctgcgatt ccttgcgtca tctgtgtgaa aaaagaaaac accctagagt gcattgttgc 301 cattaaggtg agcgcttttt acgtccagag caccaaatta accacaaatg ctcaataaca 361 gactttgacc tgggcaattg ttataaacgt aacawttctg ataarcgtat aartgtaact 421 gaagtgcttc acaggtgctc tgcttattct gaaatgttac ttaagtaaaa ataagtgaat 481 gtaatgactt cattttattg ttttttttct tcactttctt cgagtaggtt catactcgaa 541 ctactactaa aacgtatcta aagtaaagat aaattaactg tatctgctgt ggagtgttct 601 agaaaaattg agtagagtta aaaatattaa aaaaaattaa atccgaacca aatgcttttt 661 taactatttc aattgcatct aaatattcaa tttaatttgg ttacataaat acaatttaaa 721 tgttacattt aatggaagct tgtcaaataa aatgtatttg attggcatgg attcagttta 781 taccaagcac attttccttg attattattt agctcattaa agaaacattt gattttatat 841 atttcagctt tactcacttt actcagaatk attacatcat gtttgstgag gatgaataat 901 tttttttaaa cccttttaag yatttaatgt ggggaaaaaa ctaccaatgc cttcaactca 961 ttcagtgaaa ttctctgtaa aaatgacttg acctcagtca tacaacaaat actctcgggc 1021 aggctggtga agcagatgcc attactgtgg acggtgggga catttacact gctggcttga 1081 acaactacga cctccatccc atcattgctg aggactacgg caccggtatg tccactcatc 1141 agctgtcatt agtagcctaa tgaaataagc tcaagcaaga acatgtttac cgttttatgt 1201 gaatgtgatt tagctgtttc aataatatgt atccattttc atcattcatt cagcttcgga 1261 cacctgctac tacgctgttg ctgtggcaaa gaagaatact ggatttggct tcagagatct 1321 cagggggaag aaatcatgcc acactggttt ggggaaatct gcaggctgga acattcccat 1381 aggatctctg gtgtccatga atgttattga gtggggtggc attgaagaca aacctttgga 1441 ggaaggtgag ggactttttt ttctggtgag ctcataacat ttgacagctt tagtgcatgt 1501 atggtcgaag gacgataaga tcagaccttt ttatgagnaa ctggacgcct gagaaacaat

1561 taaacacact tatttgcttt actgacgaga atttattgat gggatcaaaa ctacaggaaa 1621 agtagaaaca gacagggaag gggctaccta gcttcttttt tattagtcat ttatttaacc

1681 aggtaaaaaa atcctcattg agattaaaaa tctctttcca agagagacct tgcttctgcc

1741 cagggattat aaaatcctgt gcctgtcagc acttcttatc acttataaca cttccttttg

1801 ttaaatataa ttaactgaag ttcaaaaact agggcgtttt agactagtta ggccctgtta

1861 gacagattga acaaatcaat atccatccat cttcttctaa ccaaccaccg gacacgacag

1921 gggctggagg cttgcctctc agtgctgaga ggggggaaag gtcgccagcc atgtactcac

1981 attcgtacat atggtcagtt tagaactgac aattaaccta acatgaaaga aactggtgta

2041 tccagtatcc catggatgca aactctgcac acacaggata atatgaaact tctaaatgtt

2101 aaaaatgcat atgggaactt taatatttgt ctttaaaggc agacagtggt gacactctgg

2161 ctcttctgtc agtgttttgg ttttcttttc taaattatga ctgtggcctt gtttgatttt 2221 gttatgcagc ggtgagcacc ttcttccatg ccagctgtgc ccctggggca gcaagaggca 2281 gcaagctgtg tgaactgtgc aagggagact gctccaggtc ccagagggag ccttactatg 2341 actacaatgg agcctttcag tcagtgtcca ctttttaatg cttctcatta gtgaacataa

2401 acttctacac atttagccga accttttatc tgtaataata tgacttttgt aacaggtgtt 2461 tggccgaggg agctggagat gtggcttttg tgaagcatct cactgtgcca ggtcagtatc

2521 acaacaacct ttatccattc gaacatataa agaagcactg catcatagca ttgtcaggtt 2581 ttattcatca aaaacgagcc tcaccgagat taaaaatttc attttgaaaa gcgactggga 2641 caagaaggga cctgatgaac atgcatgaca tacaaataca actgttgcac actgcacaag 2701 tcaaggacaa gtcaagcaga atttcaaagc aaatttcaga gcaatcacat tgaccaagag 2761 tgtcattttc tcaaatgatt aaatggtctt aaacaccctg aaacttctac aaatatggga 2821 aagaataact gtgaaaaaca ctgatgtaaa acctgtgtca tgtcacactt ccagaatcgg 2881 ataagccaat gtacgagcta ctgtgcaagg acaacaccag agcacctatt gacaactata 2941 acacctgctt cctggccaga gtgccagctg acgctgttat tactcgcaag gatccacagc 3001 tggccgactt tatctgggag acccttgacc gagttcagac tgaccacgta ggaagtccac 3061 tgaataacat ctcatttcaa cgtattctga ttctttgtgt ttcagcagcc tcattgcttt 3121 cctaatgaat catctcactt gctgcctttt cagagcttta acctcttctc atctgaagcc 3181 tacgcgcccg ccaagaacct gatgttcaaa

3241 ccaaacacag actccttcct gtatctgggt

3301 aaaaaaggta aagaacacaa gcaagacaga

3361 ggcttatgtc taagtctttt tcccgtctct

3421 cattaggtgg tgtgctgtgg gccatgctga

3481 cagtgtgtct gatgacaccg cctccattga

3541 cctgaagaag attatggtaa actcagtagg

3601 ttgactccac tctgtgacgt tcatctctgc

3661 acgcagtcgc cgtggatgga ggtcaggtgt

3721 tcatggtgga gcagtatgac caaggtagat

3781 cctgtgtcgt atttcacctt ttctatatga

3841 agagatgtgc ggcaactcta atggtagtaa

3901 tctggacaaa ttttttaaaa agcctcttga

3961 gatgacctgt tgtgctgatg acaagatttg

4021 actctactac tacaactaca actataattt

4081 ttattcatta gtaacccctt agttcatcct

4141 aacaggtgga tggagcttgt cttcattata

4201 caaacaacca agatttttaa aaactacaaa

4261 tggagaccta gcatttagct cattggcatt

4321 ccggttttgt aagtatccac gattttaatg

4381 taagcagccg taaacagagt agatttatat

4441 atgtctactt cccgtatcca ctctcagccc

4501 taaagaaggg ttcaggggtg acctgggaga

4561 gcatcggcag aactgctggc tggaacatcc

4621 actgtgactt cagtgagtga ctgcgagctt

4681 aaagccaccc acagaaatca tacaactccc 4741 actcatgtga ttaatctata tttaaacaaa

4801 gagaggtttg ctgattgttg agctctttct

4861 cagtagcggc tgtgcccccg gagcagagcc 4921 cagcggtaaa gctgtgggag acgaggccaa

4981 cggttatgct ggagccttta ggtacagcaa 5041 gtataaggag aaagttagca aagagacagg

gattcaacag tgaggctctt gagggtgccc

gctaactaca tgagcatcgt ccattccctt

cagaaacaat tgttagtcag gtgtcggtct

agagcaggca tcagacgttg catcccctgc

gactgctaag tgtgacacgt ggagcatcaa

atgccagagc gcccctacag ttgaagattg

aaatatcgaa atctgttact ttattatttt

tttgaatcgc cccgcagcgt aaagaggctg

ttacggctgg aaagtgtggc ctggttcctg

aacaagaaga agaaataaca cacacacaat

gtaatatttg ttcattttgt cttctctcgc

actttcatct ttttcctcct ctttttatga

agtgcatcat tttaattgta acacagcttc

tattttatat ttgtatcctt ggactctacc

atatgaacaa ccagttcaag gaatccttat

ctgaaacaaa cctctgcgga agctttgaac

tattaaggat atagtctctt tatggcttta

aaaattccaa attgagcatt tacataaatc

gcttgtacat tgtctaaatt tttagtggct

atagattacc tttaaaaagt ggattaattt

gaacgtctct ctccagttga atcatctgaa

cagcctcctc atactatgct gttgctgtgg

atctgaaggg caagaagtct tgccacacag

ccatgggtct aatctacaac agagaacatg

cttccttctt ttaccaacag aaagaaattt

ctttttctaa aaaaaaagtt tgtttagatg

agccacaatc ttccattaac cttgacaaaa

gcatctcttc ctctcctcag ctaagttctt

cacctctccg ttctgttctc tgtgtgtcgg

atgcaaagcc agcgctgatg agaagtacta

gamacagaat ggcatcgcat acaagtttgt

aagcactgga aaacaacaga accagctctt 5101 ctsaatsttg gcagctactg ttatgttttt 5161 agaatgtgtc aagagctgaa gcatgttttc 5221 ttaaattgtt gtgaacttta gcaatgatga 5281 ccccaacttc actctttgtc tccaaagtca 5341 gttgagggtg gtggtgatgt tgccttcgtt 5401 ggtaagagga ctgcactgat ctgcactacc 5461 gtttactcca cctctcttta ccgaaggtaa 5521 gtctgattac cagctcatct gccctgggaa 5581 ttgtaacttg gctcaggcgc ctgcacacgc 5641 ggtggtccgc atccttcagg aacagcaggt 5701 atgaaataag agsttaaaat aaaattgttg 5761 aaatctkaca tcrmggttca acttttctag 5821 agcatcctgt cattacagaa gctgcataca 5881 aatgaatttt taacagattt tccaaatagt 5941 tccctttgta ggggctacat ctaagactct 6001 agcttatgac agcagaatta gaaaaagact 6061 gccgcttctc tctacagaga acatggcagc 6121 caaaccaaga gacttctgga acaatgttcg 6181 tgaaaatcaa acatagcata ttcgcacaaa 6241 ttgatttggg cttcttttac agcaacgtgg 6301 ttgattctac ttgctactga atcatggagt 6361 ctgtgaaaac tttctttttg atatgactgt 6421 tggcaattca aaaaccaata gtgacttctg 6481 aaagtaacca gtgtaataga aatctaaaaa 6541 tcataggcca gatttggaaa cgctgggact 6601 aatggaaaga accttctctt ccaagactcc 6661 agaacctatg agcagttttt gggagaagct 6721 tgcagcgata ctgcttcagg tttgtactac 6781 ttttatacca tcttgtacca gataaaataa 6841 tgtttgcctc tcttcccaac agatctggaa 6901 ggctaatgga gatgtagaca acacagtgat 6961 ttacccaaac atagtgtttc tcctcttctg

tttcttatat atttcatttg taaacagcca ctcctaaaac caggactttt taatcttttt ggtgtaattt ttaattggtt agccatttac tgatgtatgg catatcatta caggtgtctg aaacacacaa ctgtgacaga aaacagcgat tgctccgatg acattacaac agcttctaaa cggtccagac tgggctcgta atctgagatc gggaccagtg gagatcagtg attatgccac tgtggtgact cgcccagaaa gccacagtaa ttgtgataaa gtctaagaga gcyacttgaa ttgtttcaaa gcactgaatt cctagtgcaa ctgacacaga tgctgagtct gaaatagaga gtttgtttgg cattctgctt tgagcacaac tgccaattaa ctctgacaac tttaacattg acaggcctca gttaacatgt taaatgttaa gagcaaatgt agcttgtttg gaaagaaaaa acagcttttg tttgcagagt tgcatctgaa tctggcctta atgtacagga ccacgtttgt cacctcatag aaactggtgg tggaggggtg cacaaacatt tcaagttact gctcccaaag gtacttagtt tgtcacaact gcatagagtc acttgcactt gatctcaagt ggggggacct tttttctaca ttctgccggt ttcaatgagt ttaaataact gcttcaaacc taaattttgt gatccttcat tcagaatgtt ccagtcagag actaagtgtc tccaggaggt accagaggaa tacatggatg ccatgaaggc actgagacat tgcagaaatt acttagcatt taaatgataa cattcatgct cgatattctc caattgtttt aagtcttgca cattccatgc ctgccagcaa tcagccatct tacccactta cttcctgcac atcttactat agactataga SEQ ID NO: 2

SEQÜÊNCIA DE AMINOÁCIDO DE TRANSFERRINA: /tradução=" IYKPLLLVALLGLLGKEFAAPGSQKVKWCVKSDQELRKCSDLAAA IPCVICVKK ENTLECIVAIKAGEADAITVDGGDIYTAGLNNYDLHPIIAEDYGTASDT CYYAVAVAKKNTGFGFRDLRGKKSCHTGLGKSAGWNIPIGSLVSMNVIEWGGIEDKPL EEAVSTFFHASCAPGAARGSKLCELCKGDCSRSQREPYYDYNGAFQCLAEGAGDVAFV KHLTVPESDKPMYELLCKDNTRAPIDNYNTCFLARVPADAVITRKDPQLADFIWETLD RVQTDHSFNLFSSEAYAPAKNLMFKDSTVRLLRVPPNTDSFLYLGANYMSIVHSLKKE QASDVASPAIRWCAVGHAETAKCDTWSINSVSDDTASIECQSAPTVEDCLKKIMRKEA DAVAVDGGQVFTAGKCGLVPVMVEQ YDQ EMCGNSNAPASSYYAVAWKKGSGVTWENL KGKKSCHTGIGRTAGWNIPMGLIYNREHDCDFTKFFSSGCAPGAEPTSPFCSLCVGSG KAVGDEAKCKASADEKYYGYAGAFRCLVEGGGDVAFVKHTTVTENSDGNGPDWARNLR SSDYQLICPGKGPVEISDYATCNLAQAPAHAWTRPESHSKWRILQEQQARFGNAGT DPSFRMFQSENGKNLLFQDSTKCLQEVPEERTYEQFLGEAYMDAMKALRHCSDTASDL EKSCTFHACQQG

SEQ ID NO: 3

SEQÜÊNCIA DE MARCADOR MICROSSATÉLITE TF-A:

TCCGC TATTC AAAGTGAGTC ATTATC TGGAAC AAC AC TAAGC TGATATC TT

TAACTC TTTTACGGTGTTTTAAAAAAGCGCATTTGAGTACTTACATTTCCA

TCACAGCTGGGACATGATGTTGCTGAGTAGACTGTGATTAGCCTCTTGTTG

CAGAAAACAATGACGTTAGCTTAATTTTATTTTACTGCATCGCGTTTGATT

GGGAATATGATCATTTCTGTTTATTTAATGTTAATCTGTTTAATATCTTGAA

ATAAGCACTAATGTATCTGATATTAATTTTAGTTGTTTAACAAAGCAGTAG

TATGGG AAT ATAGTACAGTACTGAGCGAAAGTCTCAAGCCATTCCTCATA

TACATACATACATACGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCAAGCATTCATGG

AAATAAAGTATATACCATTCCCATT' GTCTITAGAGTCACTGTCCTGGTTGA

AAATGAAGCCGATGCCAATGGAATGCTTTCCAGGTGGTATTGCATGGTAG

ATCAATGGATCAGTCCCTTCACCACTGGCTGAAATG

SEQ ID NO: 4

SEQÜÊNCIA DE MARCADOR MICROSSATÉLITE TF-B:

TAGAGCGAGTTAATTAGAAGCGCAGTTACACATGTGGCTGTTATTATCGT AGGTGCTAATTAGCAGCATTTGTCAGATGTAAAAATAAAAAAAATTAAAA AGGGGGGTGGGGATGGCAATCAGGAAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT GTGTGTGCGCGCACGCTTAAAAGCACCTCACGTAATTAACTGCTCC AGAG A

SEQ ID NO: 5

Iniciador direto de PCR para marcador microssatélite TF-A: TTTTACTGCATCGCGTTTGA SEQ ID N0:6

Iniciador reverso de PCR para marcador microssatélite TF-A: ATCGGCTTCATTTTCAACCA SEQ ID NO:7

Iniciador direto de PCR para marcador microssatélite TF-B:

GCGAGTTAATTAGAAGCGCAGT

SEQ ID NO:8

Iniciador reverso de PCR para marcador microssatélite TF-B: TGGAGCAGTTAATTACGTGAGG LISTAGEM DE REFERÊNCIAS

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Claims (29)

1. Uso de haplotipagem de transferrina como uma ferramenta para seleção assistida com marcador para melhorar a resistência à água salgada em peixe.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, em que o peixe é tilápia.

3. Uso de haplotipos de transferrina de microssatélite 1 e 2 de acordo com a Tabela 3 para o desenvolvimento de ferramentas ou critérios em um regime de seleção ou gerenciamento para adaptar um organismo a ambientes definidos pelo nível de salinidade.

4. Uso de polimorfismos de SNP de transferrina de acordo com a Tabela 2 e 3 para o desenvolvimento de ferramentas ou critérios em um re- gime de seleção ou gerenciamento para adaptar um organismo a ambientes definidos pelo nível de salinidade.

5. Uso de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que o dito or- ganismo é uma espécie aquática, vertebrada ou invertebrada.

6. Uso de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que o dito or- ganismo é uma espécie terrestre, vertebrada ou invertebrada.

7. Uso de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que o dito or- ganismo é um vertebrado, terrestre ou aquático.

8. Uso de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que o dito or- ganismo é uma espécie de peixes teleósteos.

9. Uso de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que o dito or- ganismo é uma espécie pertencendo à família dos ciclídeos.

10. Uso de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que o dito organismo é uma espécie pertencendo ao gênero Oreochromis.

11. Uso de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que o dito organismo é Oreochromis niloticus (tilápia-do-nilo).

12. Uso de marcadores microssatélites ligados a transferrina TF- A (SEQ ID NO: 3) e TF-B (SEQ ID NO: 4) para adaptar indivíduos a vários ambientes definidos por variação na salinidade.

13. Uso de SNPs de acordo com a Tabela 2 ou Tabela 3 para adaptar indivíduos a vários ambientes definidos por variação na salinidade.

14. Uso de acordo com a reivindicação 12 ou 13, em que a a- daptação dos indivíduos é por procriação seletiva, através de outros regimes de otimização genética ou através de procedimentos que influenciam a ex- pressão de transferrina ou outros genes ligados com transferrina.

15. Iniciador de PCR em que a seqüência de nucleotídeo do ini- ciador de PCR compreende ou consiste na seqüência dada em qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 5, 6, 7 ou 8.

16. Molécula de ácido nucléico em que a seqüência de nucleotí- deo da molécula de ácido nucléico compreende ou consiste na seqüência de nucleotídeo dada em SEQ ID NO: 1.

17. Molécula de ácido nucléico em que a seqüência de nucleotí- deo da molécula de ácido nucléico compreende ou consiste na seqüência de nucleotídeo dada em SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4.

18. Polipeptídeo em que a seqüência de aminoácido do polipep- tídeo compreende ou consiste na seqüência de aminoácido dada em SEQ ID NO: 2.

19. Método de produzir um animal ou produção de animais ou produtos/consumíveis por meio de seleção de animais com ótima expressão de transferrina.

20. Método de detectar em um organismo pelo menos um mar- cador genético que está geneticamente ligado e co-segregando com o gene de transferrina, o dito método compreendendo analisar a região informativa do gene de transferrina no genoma do organismo para a presença do mar- cador genético.

21. Método da reivindicação 20, em que o marcador genético é TF-A e/ou TF-B de acordo com SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, respectiva- mente.

22. Método da reivindicação 20, o dito método adicionalmente compreendendo usar como uma sonda qualquer uma dentre SEQ ID NOs: -5-8, ou uma sonda com 80% ou mais de identidade de seqüência com quaisquer destas seqüências de ácido nucléico, para detectar a presença do marcador genético.

23. Método de detectar em um organismo pelo menos um gene polimórfico que está geneticamente ligado e co-segregando com o gene de transferrina, em que os polimorfismos resultam em uma variação quantitativa na expressão, onde cada nível médio de expressão está associado a um genótipo específico deste gene, em que o método pode ser usado para indi- retamente definir e/ou selecionar para o haplotipo de transferrina ligado atra- vés da análise de expressão do gene ligado.

24. Uso de informação acerca dos elementos reguladores para expressão de transferrina para manipular a expressão do gene de transferrina.

25. Uso de acordo com a reivindicação 24, em que os elementos reguladores para expressão de transferrina são elementos reguladores Iiga- dos ou não-ligados.

26. Fármaco ou aditivo de alimentação que podem ajustar ex- pressão de transferrina, em um modo que melhora a resistência à água sal- gada.

27. Fator ambiental que afeta e aumenta a expressão de trans- ferrina que por sua vez melhora a resistência à água salgada.

28. Método de selecionar indivíduos com tolerância alta para água salgada, o dito método compreendendo medir os níveis de expressão de transferrina nos indivíduos, para uso comercial ou similar.

29. Método para obter uma indicação da tolerância ao sal de um peixe, o método compreendendo determinar a presença ou ausência em uma amostra de ácido nucléico que foi obtida do peixe de um ou mais SNPs como definidos na Tabela 2 e 3 no gene de transferrina de peixe, em que a presença de um ou mais SNPs de Haplotipo 2 como definidos na Tabela 3 é indicativo de um peixe tendo uma tolerância ao sal aumentada comparado a um peixe tendo um ou mais SNPs de Haplotipo 1 como definidos na Tabela 3.