BRPI0711751A2 - processo para produÇço de bio-combustÍvel a partir de materiais de plantas - Google Patents

Abstract

PROCESSO PARA PRODUÇçO DE BIO-COMBUSTÍVEL A PARTIR DE MATERIAIS DE PLANTAS É apresentado um processo integrado para a produção de etanol a partir de material de planta de madeira, o processo sendo composto de: Contato de um fluxo contínuo do material de planta com um fluxo continuo em contracorrente de uma solução aquosa de etanol em temperatura e pressão elevadas para produzir um material de planta isento de lignina; a remoção do etanol do material de planta isento de lignina; o contato de um fluxo contínuo do material de planta isento de lignina com água em temperatura e pressão elevadas para solubilizar a xilose dentro do material da planta; e a hidrólise da celulose presente no material da planta para formar glicose, a qual, por seu lado, é fermentada para a produção de etanol.

Description

"PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE BIO-COMBUSTÍVEL A PARTIR DE MATERIAIS DE PLANTAS"

REFERÊNCIA A SOLICITAÇÕES RELACIONADAS

Esta solicitação reivindica prioridade para a solicitação provisória de patente ameri- cana número 60/746.682 depositada em 8 de maio de 2006 e a solicitação provisória de patente americana número 60/869.057 depositada em 7 de dezembro de 2006.

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção atual apresenta métodos e aparelhos para a produção de bio- combustível a partir de materiais de plantas. Mais especificamente, a invenção atual apre- senta um processo integrado para a produção de biomassa de planta, como Salix spp. e a sua conversão em etanol e outros produtos valiosos.

ANTECEDENTES

A biomassa de madeira pode ser utilizada como uma fonte sustentável de energia e é uma alternativa valiosa para combustíveis fósseis. Mais especificamente, o bio-refino de material de Iignocelulose em etanol combustível e materiais de Iignina tem o potencial de fornecer uma quantidade de petróleo e de materiais com base oleosa. É possível que, com a exaustão das reservas globais de petróleo e a conscientização crescente de problemas de segurança ambiental e nacional associados com a dependência ao combustível fóssil, a biomassa se tornará um recurso chave para a produção de combustíveis para transporte na maior parte do mundo.

A conversão da biomassa lignocelulósica em etanol combustível poderá oferecer a solução ideal, devido ao rápido crescimento de culturas de rotatividade curta, tais como ar- bustos de salgueiro (Salix spp.). Dois dos principais componentes de madeira, celulose e hemicelulose, são polímeros de açúcares simples que podem ser convertidos em etanol e/ou outros produtos químicos através de fermentação. Este etanol pode ser usado como um combustível para transporte por si próprio ou em mistura de etanol-gasolina. As misturas de etanol-gasolina com até 10% de etanol podem ser utilizadas sem qualquer modificação no motor ou perda no desempenho do motor (Hunt, V. D. (1981) The Gasohol Handbook, New York, Industrial Press). A lignina, o terceiro componente principal da madeira, é uma matéria-prima principal para a produção de plásticos, adesivos e resinas (Lora and Glasser (2002) J. Polymers Environ. 10: 39 - 47). O uso de lignina em produtos de alto valor, ao in- vés de combustível para caldeira, compensará os altos custos associados tradicionalmente com o processamento de madeira e a produção de etanol.

As plantações de biomassa de salgueiro podem ser facilmente e eficientemente es- tabelecidas a partir de galhos dormentes, utilizando-se sistemas mecânicos. Os arbustos de salgueiro respondem pelo crescimento de mato depois da primeira estação de cultivo atra- vés da produção prolífica do crescimento de hastes novas na segunda estação de cultivo. A biomassa de madeira acima do solo é colhida durante a estação dormente. Durante a pri- mavera que se segue a cada colheita, a porção restante da planta de salgueiro, conhecida como o resíduo, responde através da produção de numerosas hastes novas, iniciando um novo ciclo de crescimento que pode ser colhido em outros dois a quatro anos. Este ciclo pode ser repetido durante seis a oito colheitas antes dos resíduos necessitarem ser substitu- ídos.

A Iignocelulose é um substrato complexo composto de uma mistura de polímeros de carboidratos (especificamente celulose e hemicelulose) e lignina. A conversão da bio- massa lignocelulósica em etanol depende principalmente da separação eficiente destes componentes de parede de célula para permitir a hidrólise do polímero de carboidratos em açúcares fermentáveis. A maioria dos processos que utilizam temperatura ou pressão ele- vadas com ácidos, bases ou solventes orgânicos, são capazes de produzirem um substrato de celulose que pode ser convertido quimicamente ou enzimaticamente em glicose fermen- tável (Wyman et ai. (2005) Bioresource Technology 96: 2026 - 2032; Mosier et al. (2005) Bioresource Technology 96: 673 - 86). Em geral, o rendimento e a velocidade da hidrólise de celulose aumenta quando a biomassa é fracionada em condições de alta temperatura e ex- tremos de pH. Nestas condições severas, no entanto, a recuperação total de carboidratos é comprometida, devido à degradação extensa dos açúcares de hemicelulose (principalmente xilose em madeira dura), que constitue uma fração significativa da matéria-prima Iignocelu- lósica (madéira dura: Rughani and McGinnis (1989) Biotechnol. Bioeng. 33: 681 - 686; Bak- ker et al. "Biofuel production from acid-impregnated willow and switchgrass"; 2nd World Con- ference on Biomass for Energy, Industry and Climate Protection, 10-14 May 2004, Rome, ltaly; Li et al. (2005) Appl. Biochem. Biotechnol. 125: 175 - 88; Sassner et al. (2005) Appl. Biochem. Biotechnol. 121 - 124: 1101 - 17; Pan et al. (2005) Biotechnol. Bioeng. 90: 473 - 81; madeira macia: Boussaid et al. (1999) Biotechnol. Bioeng. 64: 284 - 9; Yang and Wyman (2004) Bioresourse Technol. 86: 88 - 95; Knauf and Moniruzzaman (2004) Intl. Sugar J. 106: 147 - 50; Mosier et al. (2005) Ibid). Também os produtos de degradação gerados pela hidró- lise extensiva (fenol, furanos e ácido carboxílico) podem inibir potencialmente outras etapas de fermentação (Palmquis et al. (1999) Biotechnol. Bioeng. 63 (1): 46 - 55; Klinke et al. (2004) Appl. Microbiol. Biotechnol. 66:10 - 26). Além disso, condições severas de pré- tratamento, incluindo o uso de catalisadores ácidos, podem alterar quimicamente a natureza da lignina recuperada. Uma conseqüência disto é uma redução na adequação da lignina para algumas aplicações de alto valor (Lignin Institute Dialogue Newsletter (2001) 9 (1); Lora and Glasser (2002) Ibid; Matsushita and Yasuda (2003) J. Wood Sei. 49:166 - 171).

Quando a água é utilizada como o único agente de fracionamento, a maioria dos açúcares de hemicelulose pode ser recuperada através de auto-hidrólise (Garrote and Para- jo (2002) Wood Science Technol. 36: 111- 123). No entanto, devido à deslignificação inefici- ente, esta maximização do rendimento do açúcar de hemicelulose usualmente é feita às custas da conversão enzimática celulose/glicose (Negro et al. (2003) Appl. Biochem. Bio- technol. 65: 87 -100; Chung et al. (2005) Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 947 - 961; Kim and Lee (2006) Bioresource Biotechnol. 97: 224 - 232). O uso de um segundo estagio de trata- mento oxidativo mostrou melhorar a conversão de celulose/sacarose após o tratamento com água quente mas nem sempre como resultado da remoção eficiente de Iignina (Brownell and Saddler (1987) Biotechnol. Bioeng. 29: 228 - 35; Wyman et al. (2005) Bioresource Technol. 96: 1959 - 1966; Kim and Holtzapple (2006) Bioresource Technol. 97: 583 - 591).

A remoção eficiente de Iignina em condições suaves pode ser obtida com o proces- so OrganoSolv®. este tipo de pré-tratamento envolve o uso de um solvente orgânico aquo- so, usualmente etanol, para se conseguir a remoção simultânea do açúcar de hemicelulose e lignina em correntes separadas. O custo associado com o uso de um solvente de etanol é reduzido através da produção local de etanol e a reciclagem eficiente do mesmo, conforme é ensinado, por exemplo, pela patente americana de número 5.788.812. A velocidade de conversão da fração sólida de celulose produzida pelo pré-tratamento de etanol aquoso é afetada principalmente pela remoção ineficiente do açúcar de hemicelulose quando são utili- zadas relações menores de água/solvente para a maximização da recuperação de Iignina (Holtzapple and Humphrey (1984) Biotechnol. Bioeng. 26: 670 - 676; Chum et al., (1988) Biotechnol. Bioeng. 31: 643 - 649). O aumento da relação água/etanol, ou a adição de um catalisador químico no solvente, aumenta a remoção de açúcar de hemicelulose mas é as- sociado com uma redução na remoção de Iignina e uma degradação aumentada do açúcar de hemicelulose (Holtzapple and Humphrey (1984) lbid; Rughani and McGinnis (1989) Ibid; Pan et al. (2005) Ibid).

Avanços bem sucedidos na tecnologia de produção de enzima resultaram em um custo menor da enzima hidrolítica requerida para a obtenção de uma alta taxa de conversão de celulose em glicose. No entanto, como a atividade de hidrólise enzimática é fortemente inibida pelos produtos de hidrólise (sacarose e celulose de cadeia curta), a fermentação si- multânea do açúcar liberado (SSF para a sacarificação e fermentação simultânea) pode me- lhorar grandemente a conversão geral de celulose/etanol utilizando uma carga menor de enzima. Várias tecnologias são agora disponíveis, as quais permitem o uso mais amplo da biomassa com um custo menor sob várias condições menos limitantes (revistas em Lin and Tanaka (2006) Appl. Microbiol. Biotechnol. 69: 627 - 642).

Enquanto a fermentação de glicose pode ser executada por vários organismos, a bio-conversão da fração de pentoses (xilose e arabinose) apresenta um desafio. Tem sido dada por tanto bastante atenção a famílias engenheiradas geneticamente, que podem utili- zar eficientemente a pentose e converter as mesmas em compostos úteis, tais como etanol (revisto em Aristidou and Pentila (2000) Curr. Opin. Biotechnol. 11: 187 - 198). Alternativa- mente, a fração de pentose, que é predominantemente xilose nas espécies de madeira dura, tais como Salix, pode ser recuperada da corrente de água e convertida em xilitol para uso como um aditivo valioso de produto alimentício. Correntes de subprodutos deste processo (furfural, ácido acético, ácido para-hidroxibenzóico e vanilina) poderão também ser fraciona- dos, dependendo preço de mercado. O furfural, o subproduto mais fácil de ser comercializa- do, pode ser obtido através de destilação da mesma fração. O ácido acético poderá também ser recuperado para produzir ácido peroxiacético para polpa.

A Iignina solúvel em etanol é considerada como tendo um valor mais elevado por causa da sua facilidade de recuperação e a sua adequação para uma larga faixa de aplica- ções industriais, em comparação com a Iignina solúvel em água, como aquela recuperada do processo Kraft, com freqüência utilizado pela indústria de polpa e papel. A extração de Iignina Kraft requer grandes volumes de solvente e tem uma das faixas mais estreita de utilização ( Funaoka et al. (1995) Biotechnol. Bioeng. 46: 545 - 552; Lora and Glasser (2002) J. Polymers Environ. 10: 39 - 47; Kubo and Kadla (2004) Macromol. 37: 6904 - 6911; Lawoko et al. (2005) Biomacromol. 6: 3467 - 3473).

A Iignina extraída utilizando-se o processo OrganoSolv® é significativamente dife- rente daquela extraída através do processo Kraft. A Iignina OrganoSolv® tem um peso mo- lecular de 700 a 1.550 g/mol, baixa polidispersão, uma temperatura de transição de vidro de 70 a 170 ° C, uma quantidade relativamente elevada de grupos hidroxila fenólicos, e um baixo grau de modificação química (Lora and Glasser (2002) lbid; Kubo and Kadla (2004) lbid; Lawoko et al. (2005) Ibid). Esta Iignina pode ser usada na fabricação de compostos de moldagem, e resinas de epoxi uretana e formaldeído, antioxidantes e agentes de liberação controlada.

A Iignina solúvel em etanol de madeiras duras é recuperada pela diluição do efluen- te aquoso de pré-tratamento de etanol com água e ácido para formar uma solução com um pH de 1,5 a 2,7 e um teor de álcool de 30% (v/v) (ou uma relação entre o efluente de etanol aquoso e de água acidulada de 0,35 a 0,70). Depois da secagem, a Iignina precipitada é obtida na forma de um pó. (patente americana de número 5.788.812).

O processo de formação de polpa OrganoSolv® foi desenvolvido originalmente por Theodor Kleinert como o uma alternativa ambientalmente preferida ao processo de forma- ção de polpa Kraft (patente americana de número 3.585.104). Posteriormente foi descoberto que uma variação das condições de operação poderia converter muito eficientemente o ma- terial lignocelulósico em açúcares e lignina. Nos anos 80 foi construída uma planta piloto de reator de fluxo contínuo de 16 litros que processou bagaço para a produção de açúcares (Dedini, Brasil). Uma solução concentrada de acetona com uma pequena quantidade de ácido foi utilizada para a solubilização do componente lignocelulósico do bagaço (patente americana de número 4.409.032). se/glicose. A recuperação de produto em condições suaves é ainda mais melhorada através da aplicação de um pré-tratamento de uma forma contínua (Nagle et al. (2002) Biotechnol. Prog. 18: 734 - 738; Yang and Wyman (2004) Ibid ; Wyman et al. (2005) lbid; Liu and Wyman (2005) Bioresour. Technol. 96: 1978 - 1985). Além de melhorar o rendimento de cada corrente de produto, a economia do processo de pré-tratamento da invenção é melho- rado através de evitar-se a adição de catalisadores químicos que são dispendiosos, reque- rem neutralização das frações sólidas, modificam quimicamente e reduzem o valor da ligni- na recuperável, e são dispendiosos de serem removidos da corrente líquida.

Em uma realização, o processo da invenção utiliza madeira dura, de preferência, Salix spp, apesar de outros materiais de plantas, tais como palha de trigo, poderem também ser processados efetivamente utilizando-se os métodos apresentados aqui. Como matéria- prima para a biomassa, o Salix spp. oferece as vantagens de requerer um baixo consumo de energia em relação à biomassa produzida, sendo fácil de se proliferar a partir de cortes sem a raiz, tendo uma diversidade genética e um ciclo curto de criação, tendo boa resistên- cia ao inverno, sendo barato de ser colhido e cortado e crescendo vigorosamente outra vez depois de cada colheita. Além disso, o crescimento do Salix requer significativamente me- nos pesticidas do que a agricultura tradicional, menos uso de herbicidas do que várias cultu- ras e poderá ser cultivado para a restauração do ecossistema (Kuzovkina and Quigley (2005) Water, Air, and Soil Pollution 162: 183 - 204).Como o Salix pode crescer com facili- dade em terrenos marginais, ele é especialmente adequado para a restauração de terrenos de fazendas de criação já utilizados (Wilkinson (1999) Biomass Bioenergy 16: 263 - 275) . A cultura do Salix pode contribuir para a redução da lixiviação de nutrientes, acidulação do solo e erosão, e mostrou que melhora o equilíbrio de nitrogênio e aumenta a fertilidade do solo (Hasselgren (1998) Biomass Bioenergy 15: 71 - 74; Borjesson (1999) Biomass Bioe- nergy 16: 137 - 154; Roygard et al. (2001) J. Environ. Qual 29: 1419 - 1432). Além disso, como a maioria das culturas de madeira, a produção de Salix é nula em dióxido de carbono e portanto é estrategicamente importante nos esforços para a redução do aquecimento glo- bal (Lemus and Lal (2005) Crit. Rev. Plant Sei. 24: 1-21).

O processo utiliza um solvente com baixo ponto de ebulição, de preferência, etanol, para a fácil recuperação de Iignina e a reciclagem do solvente. O etanol também oferece a vantagem de ser um produto do processamento de celulose e portanto pode ser rapidamen- te reciclado como parte do processo de bio-refino. O pré-tratamento de etanol sem a utiliza- ção de um catalisador ácido é preferido para se obter uma alta recuperação da Iignina natu- ral quimicamente não modificada, com potenciais maiores de receitas e também para au- mentar a recuperação e a integridade do polímero xilano no tratamento subseqüente com água quente. O processo apresentado, que em certas realizações utiliza um processamento contínuo, também reduz a recondensação de lignina, com freqüência vista em um reator de Um processo OrganoSolv® utilizando etanol aquoso para a produção de um bio- combustível limpo para geradores de turbina foi desenvolvido pela universidade de Pensil- vânia e pela companhia General Electric nos anos 70. Uma modificação subseqüente pela indústria de polpa e papel canadense resultou no processo de produção de polpa Alcell® (patente americana de número 4.100.016). A viabilidade econômica a longo prazo do pro- cesso Alcell® foi significativamente melhorada utilizando tecnologia para a recuperação dos subprodutos Iignina e furfural do licor orgânico de formação de polpa (patentes americanas e de número 4.764.596, 5.681.427 e 5.788.812). Em 1989 foi estabelecida em New Bruns- wick, Canada, uma planta de produção de polpa comercial Alcell® para o processamento de 30 toneladas métricas por dia de madeira dura. A planta foi operada durante vários anos mas eventualmente foi desativada devido a fatores econômicos externos. Mais recentemen- te, foi publicada uma solicitação de patente relacionada com uma operação integrada para o processamento de cana de açúcar, que combina os processos OrganoSolv® e Alcell® de produção de polpa e de fermentação, para a redução dos custos de capital e de operação através do fornecimento de um alto grau de reciclagem interna do processo (publicação de patente americana número US 2002/0069987).

Permanece uma necessidade na arte por um processo para a produção de etanol de biomassa de madeira que possa ser estabelecido com um custo relativamente baixo e ser rentável através da maximização do rendimento e da recuperação de subprodutos valio- sos, tais como Iignina natural e xilose.

RESUMO DA INVENÇÃO

A invenção atual apresenta um processo integrado que permite a rápida produção de volumes elevados de biomassa, e o uso eficiente e efetivo em custo de biomassa para a produção de etanol, Iignina natural, xilose e outros subprodutos. O processo utiliza um pré- tratamento otimizado que permite o fracionamento eficiente de Iignina e hemicelulose sem comprometer o rendimento do etanol. Devido aos altos custos associados com a produção de biomassa, a utilização ótima de todos os componentes lignocelulósicos da matéria-prima como produtos comercializados é essencial para se obter etanol a um preço comercialmente competitivo. Devido à natureza complexa dos componentes lignocelulósicos e as dificulda- des técnicas associadas com a sua separação e conversão, é requerido o compromisso da recuperação de todos os componentes valiosos para a redução do custo de produção de açúcares a partir de biomassa de madeira.

Em uma realização, o processo de pré-tratamento, que é baseado em uma combi- nação de um tratamento OrganoSolv®, ou etanol/água (por exemplo, 50% a 80% de etanol em água) e uma lavagem com água quente, é utilizado pelo fracionamento de Salix, e me- lhora a utilização geral de biomassa através da maximização da recuperação de lignina, assim como a recuperação geral de carboidratos, sem comprometer a conversão de celulo- batelada, permitindo a remoção do solvente quando ainda em temperaturas bem acima do ponto de ebulição normal do solvente.

Em uma realização, o processo apresentado aqui inclui as seguintes etapas:

(a) o contato de um fluxo contínuo de material de planta, como lascas de madeira, com um fluxo contínuo em contracorrente de uma solução aquosa de etanol (de preferência, composta de 50% a 80% de etanol) em temperatura e pressão elevadas (por exemplo, em uma temperatura entre 170 ° C e 210 ° C e uma pressão entre 19-30 barg (2000 a 3100 kPa)) durante um período de tempo suficiente para produzir Iignina solúvel em etanol e ma- terial de polpa de plantas, onde o material de polpa de planta é isento de Iignina e tem uma concentração elevada de celulose;

(b) a separação do etanol do material de polpa de planta e a recuperação da Iignina solúvel em etanol do etanol;

(c) o contato do material de polpa de planta com água em temperatura e pressão elevadas (por exemplo, em uma temperatura entre 160 ° C e 220 0 Ce uma pressão entre 12-25 barg (1300 e 2600 kPa)) e durante um período de tempo suficiente para a remoção dos açúcares de hemicelulose e do material de polpa de plantas;

(d) a separação da água do material de polpa de plantas e a recuperação dos açú- cares solúveis em água, ácido acético e/ou furfural da água; e

(e) o contato do material resultante de polpa de planta com: (i) uma solução aquosa composta de celulose, β-glicosidase e uma levedura tolerante à temperatura, (ii) meio de crescimento de levedura, e (iii) solução tampão, onde a celulose presente no material de polpa de planta é hidrolisado em glicose.

A glicose resultante poderá então ser fermentada para a produção de etanol, que por seu lado é recuperado através de destilação e desidratação, por tecnologias tais como o uso de uma peneira molecular.

O pré-tratamento de etanol (etapa (a)) poderá ser executado substancialmente na ausência de um catalisador ácido. Por exemplo, a mistura da reação poderá conter menos de 1% de um catalisador ácido. Em certas realizações, o pré-tratamento do etanol é execu- tado em um pH na faixa de 3 a 9,5. Da mesma forma, em certas realizações, o tratamento com água quente (etapa (c)) é executado em um pH na faixa de 2 a 7.

São também apresentados aqui métodos de propagação de plantas de uma espé- cie Salix. Em certas realizações, esses métodos são compostos de:

(a) a cultura pelo menos de um galho de uma primeira planta escolhida do grupo consistindo da espécie Salix e a colheita pelo menos de um corte do galho, onde o corte contém pelo menos um nó;

(b) o cultivo do corte em uma composição durante um período de tempo suficiente para formar uma segunda planta, onde a composição é composta de benziladenina, carvão ativo e pelo menos um meio escolhido do grupo consistindo de: meio Murashige e Skoog e meio de planta de madeira McCown;

(c) a obtenção pelo menos de um corte subseqüente da segunda planta, onde o corte subseqüente contém pelo menos um nó; e

(d) o cultivo do corte subseqüente no meio da planta de madeira McCown durante um período de tempo suficiente para formar um arbusto subseqüente.

As plantas que poderão ser propagadas efetivamente utilizando tais métodos inclu- em, mas não são limitadas a, S. viminalis e S. shwerinii "Kinuyanagi".

Estas e outras características adicionais da invenção atual e a forma de obtenção dos mesmos ficarão aparentes, e a invenção será melhor entendida, através de referência à seguinte descrição mais detalhada e aos desenhos anexos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A figura 1 é um esquema do primeiro estágio (extração de etanol) do processo inte- grado apresentado para a produção de bio-combustível a partir de lascas de madeira.

A figura 2 é um esquema do segundo estágio (tratamento com água quente) do processo integrado apresentado para a produção de bio-combustível a partir de lascas de madeira.

A figura 3 é um esquema do terceiro estágio (sacarificação e fermentação simultâ- neas) do processo integrado apresentado para a produção de bio-combustível a partir de lascas de madeira.

A figura 4 é um esquema do quarto estágio (separação/purificação do produto) do processo integrado apresentado para a produção de bio-combustível a partir de lascas de madeira.

A figura 5 é um esquema de um digestor experimental de 100 ml para o pré- tratamento de biomassa.

A figura 6 mostra um esquema de um digestor experimental de leito com recheio de 3 litros para o tratamento de biomassa.

A figura 7 é um esquema de um digestor experimental em batelada de 40 litros para o pré-tratamento de biomassa.

A figura 8 é um gráfico mostrando o efeito do tempo sobre a DM (massa seca) re- movida das lascas de Salix com o solvente de etanol a 70% em três escalas diferentes ( 100 ml, 3 litros e 40 litros), expresso como percentagem da DM inicial carregada.

A figura 9A e B mostra a relação entre a DM e a Iignina removidas das lascas de Salix com etanol a 70% e expresso como uma percentagem da DM inicial carregada. A figu- ra 9A mostra os resultados obtidos com o digestor de 3 litros, e a figura 9B mostra os resul- tados de experiências individuais no digestor de batelada de 40 litros.

A figura 10 é um gráfico mostrando o efeito do tempo sobre a DM removida das lascas de Salix com o solvente água aplicado como o tratamento principal ou após um tra- tamento com o etanol em duas escalas diferentes (100 ml, 3 litros), e expresso como per- centagem da DM inicial carregada.

A figura 11 é um gráfico mostrando a proporção de Iignina na DM removida das Ias- cas de Salix com etanol a 70% em três escalas diferentes (100 ml, 3 litros e 40 litros), e ex- presso como percentagem da DM total removida.

A figura 12 é um gráfico mostrando a proporção de Iignina total disponível recupe- rada após o pré-tratamento das lascas de Salix com metanol a 70% nos digestores de 100 ml, 3 litros e40 litros, expresso como percentagem do teor de Iignina nas lascas não trata- das.

A figura 13 mostra a relação de DM e de Iignina que foram removidos das lascas de Salix com água quente aplicada como o tratamento principal ou, após um tratamento com etanol a 70% nos digestores de 100 ml e 3 litros, expresso como percentagem da DM inicial carregada.

A figura 14 é um gráfico mostrando a conversão de celulose recuperada após o tra- tamento OrganoSolv®/ água quente líquida de lascas de Salix em glicose, por intermédio de hidrólise enzimática, comparado com celulose pura obtida comercialmente e recuperação de celulose das lascas de Salix não tratadas.

A figura 15 é um gráfico mostrando a acumulação de xilose, furfural, ácido acético e glicose durante o tratamento de lascas de Salix com água quente e com etanol a 70% no digestor de 3 litros.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Conforme discutido acima, a invenção atual apresenta um processo integrado viá- vel economicamente para o bio-refino de material lignocelulósico de plantas, tais como Salix spp., para a produção de etanol e de Iignina natural. Outros tipos de matérias-primas que poderão ser utilizados efetivamente no processo apresentado, incluem biomassa de madeira de alta rotatividade ou de ervas (por exemplo, arbustos Miscanthus), resíduos de madeira e agrícolas (por exemplo, palha de trigo, palha de arroz, folha de milho ou bagaço de cana de açúcar) e culturas dedicadas à produção de energia. Em certas realizações, o material da planta é escolhido do grupo consistindo de: Salix, Poplar, Eucalyptus, arbustos, miscanthus, bagaço de cana de açúcar, folhas de soja, folha de milho, palha de arroz, palha de cevada, palha de trigo, fibra de milho, fibra de madeira, e combinações dos mesmos.

Em uma realização, o processo utiliza um digestor de fluxo contínuo no mesmo sentido ou em contracorrente. O uso de tal digestor resulta em velocidades mais rápidas de processamento, produção aumentada e eficiência aumentada. Como tais digestores operam continuamente, eles requerem menos manutenção e menos mão-de-obra do que os digesto- res em batelada. Além disso, o deslocamento da polpa de madeira produzida é mais eficien- te do que os processos em batelada e são possíveis tempos de reação diferentes.

As culturas de Salix são recolhidas, secadas ao ar e empilhadas em estoque. Se é desejada a redução do tamanho da partícula da Salix colhida antes do processamento, isto pode ser feito utilizando-se um equipamento de corte ou dispositivo semelhante. Em uma realização, as partículas de Salix com aproximadamente 5 mm a 5 cm de tamanho são utili- zadas no processo apresentado aqui.

O primeiro estágio do processo apresentado aqui é uma extração OrganoSolv®, ou de etanol (ilustrada esquematicamente na figura 1). Isto envolve o contato contínuo das las- cas de madeira com um fluxo em contracorrente de uma solução de até 70% de etanol em água, em uma temperatura de aproximadamente 170 ° Ca 210 ° Ce uma pressão de 19 - 30 barg (2000-3100 kPa). Em uma realização, o digestor é um contator em parafuso ope- rando com lascas de madeira sendo alimentado e descarregado através de orifícios de pressão em cone e na forma de xícara, ou parafusos de alimentação. O solvente passa con- tra o fluxo de sólidos, de forma que as lascas que saem da máquina são expostas à solução fresca de etanol (isenta de soluto), enquanto que as lascas que entram no digestor, que têm o teor mais elevado extraível, são expostas à solução de solvente mais carregada de soluto. O solvente que entra no digestor é bombeado sob pressão para manter a pressão de opera- í ção dentro do mesmo e para produzir a força hidráulica para passar contra o fluxo de lascas.

O solvente proveniente do interior do digestor é recirculado através de aquecedores exter- nos, por exemplo, aquecedores a vapor, em uma base contínua, para trazer rapidamente as lascas de madeira para a temperatura de operação e para manter a temperatura. As condi- ções de operação (como o tempo, o perfil de temperatura, a pressão e a relação sóli- do/liquido) dentro do digestor são utilizadas para produzirem a remoção máxima de Iignina insolúvel em água das lascas de madeira. Quando as lascas de madeira passam pelo diges- tor e são expostas a pressões menores, uma porção do teor de solvente nas mesmas se evaporará, resultando no resfriamento das lascas de madeira.

Em uma realização alternativa, as lascas de madeira são deslocadas no digestor u- tilizando-se a gravidade em um gradiente descendente. O solvente que entra no digestor é bombeado para cima passando contra o fluxo de sólidos.

As lascas descarregadas deste primeiro estágio do processo ainda conterão algum etanol que deve ser removido antes da extração subseqüente de água. Isto é feito por in- termédio de uma operação de estripagem a vapor. Os vapores são recuperados desta ope- ração e da evaporação por expansão dos sólidos despressurizados mencionada acima, e são reutilizados diretamente com a corrente fresca de solvente. Desta forma é recuperado o teor de calor latente dos vapores.

As lascas isentas de Iignina e de solvente então passam para o segundo estágio de extração (ilustrado esquematicamente na figura 2) executado em equipamento comparável e de uma forma semelhante à extração de etanol descrita acima, com a diferença sendo que a água quente em alta pressão ( de preferência, em uma pressão de aproximadamente 12 a 25 barg (1300 a 2600 kPa) e a uma temperatura de aproximadamente 180°C a 220°C) é utilizada para a solubilização da fração de xilose das lascas.

Quando os sólidos saem do digestor de água quente e a pressão é reduzida, ocor- rerá a evaporação por expansão do vapor. Este é recuperado para reutilização direta com água quente fresca qué entra como solvente de extração fresco na extremidade de descar- ga de sólidos do digestor. As lascas serão resfriadas como resultado desta evaporação por expansão.

O que permanece das lascas iniciais de madeira depois dos dois estágios de extra- ção serão principalmente celulose em uma polpa hidrolisável. Este material é transferido para um de uma série de vasos SSF de batelada (sacarificação e fermentação simultânea), juntamente com uma levedura tolerante a temperatura, meio de crescimento de levedura, celulase, β-glicosidase, solução tampão e água para diluir os sólidos para a relação sóli- do/líquido requerida (ilustrada esquematicamente na figura 3). Nestes casos, a celulose é hidrolisada para produzir glicose, a qual, por seu lado, é fermentada para produzir etanol. São mantidos níveis baixos de etanol no fermentador através da remoção contínua do eta- nol produzido, para evitar a inibição da fermentação. O processo é utilizado para a hidrólise e a fermentação máxima da celulose em etanol. Os teores do vaso no final da fermentação em batelada serão descarregados através de um filtro e os sólidos retidos serão recupera- dos para descarte como alimentação para gado. Componentes residuais nesta fração pode- rão também ser recuperados.

O filtrado, consistindo principalmente de etanol e água, é concentrado para produzir etanol hidratado e/ou anidro conforme seja desejado, utilizando-se métodos bem conhecidos por aqueles adestrados na arte. Uma porção do produto de etanol tratado é reutilizada no primeiro estágio de extração de etanol.

Produtos adicionais são separados e purificados conforme ilustrado esquematica- mente na figura 4 e discutidos em detalhes abaixo.

Recuperação de Iiqnina

O licor preto (solução de etanol/água/lignina) que sai do digestor de etanol no pri- meiro estágio é despressurizado antes de passar para um vaso de resfriamento por expan- são no qual o solvente (principalmente etanol) é evaporado. Mais etanol é então estripado a vapor do licor antes da transferência para um de uma série de vasos em batelada nos quais é promovida a precipitação de lignina do licor por diluição (3 a 4 vezes) com água e redução do pH (<3) pela adição de ácido. O precipitado de Iignina resultante é então separado por filtração e secado como uma corrente bruta de produto. O filtrado aquoso é combinado com a corrente de água quente para a recuperação de xilose e de produto solúvel em água. Recuperação de xilose

A corrente de produto de extração em água quente do segundo estágio contendo principalmente xilose (com alguma Iignina de baixo peso molecular, alguma glicose, e outros açúcares C5 e C6) é despressurizada antes do resfriamento por evaporação da expansão de água. Quando a temperatura é reduzida, os compostos e moléculas de baixo peso mole- cular precipitam da solução. Estes são então separados por filtração.

O filtrado da filtração de baixo peso molecular contém a fração de xilose assim co- mo uma faixa de outros componentes, incluindo furfural, ácido acético, ácido para- hidroxibenzóico e vanilina. Um módulo adicional executa as etapas de concentração, retira- da de cor, desionização e de cromatografia, e produz xilose pura.

Reciclagem de solvente

As correntes de etanol e de água podem ser recicladas através da biomassa de polpa para aumentar a concentração de produto, ou processadas para a recuperação do produto. Dependendo das condições de processamento durante as duas operações de ex- tração, diferentes graus pelo menos de ácido acético e/ou furfural serão contidos na corrente que passa para o concentrador de etanol. Estas frações da destilação de etanol/água po- dem ser concentradas e recuperadas utilizando-se métodos bem conhecidos na arte.

Os exemplos seguintes são oferecidos para fins de ilustração e não para fins de li- mitação.

Exemplo 1

Bio-refino da biomassa Salix

Preparação e análise das composição de biomassa Salix não tratada

Hastes de Salix iminalis ou de Salix Schwerinii "Kinuyanagi" foram cortadas com um cortador de jardim. As lascas de madeira foram secadas a 40 ° C durante 24h e peneiradas manualmente entre 2 peneiras para peneiragem do teste britânico com aberturas de 2,8 e 4 mm. A composição das lascas de Salix peneiradas e não peneiradas foram avaliadas, com os resultados sendo mostrados na tabela 1. A composição mássica foi avaliada utilizando-se procedimentos analíticos de laboratório (LAPs) desenvolvidos pelo National Renewable E- nergy Laboratory (NREL, Golden, VO). Os valores são expressos como gramas de compo- nente por 100 gramas de lascas secas não tratadas. O material extraído foi isolado utilizan- do-se um extrator Soxhlet, secado e pesado. As concentrações de Iignina foram determina- das depois de hidrólise química das lascas de Salix (4horas com ácido sulfúrico a 72% a 102 ° C). A Iignina solúvel em ácido foi medida por densitometria a 320 nm e a concentração da Iignina não solúvel em ácido foi medida pelo peso sem as cinzas. A percentagem de glu- cano e xilano presente nas amostras foi determinada depois da hidrólise química (4h com ácido sulfúrico a 72% a 102 ° C). O açúcar solúvel em ácido foi medido através de HPLC utilizando-se a faixa apropriada de padrões de xilose e glicose. Tabela 1: Composição de biomassa de Salix não tratado (*= material peneirado)

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Pré-tratamento da biomassa Salix

O pré-tratamento das lascas de Salix foi testado em um digestor experimental de 100 ml e um digestor experimental com leito com recheio de 3 litros que foram capazes de processar 6 g e 300 gramas de lascas de madeira secas, respectivamente. O projeto destes dois digestores é ilustrado na figura 5 (digestor de 100 ml) e na figura 6 (digestor de leito com recheio de 3 litros). Foi também projetado e testado um digestor de 40 litros para a re- cuperação de Iignina natural da biomassa Salix em uma escala maior (figura 7). Este diges- tor de 40 litros é capaz de processar 6 kg de biomassa seca. Descrição do diqestor experimental de 100 ml (figura 5)

O digestor 1 de pré-tratamento experimental com 100 ml de capacidade consistia de um tubo de 1 polegada 10 com uma serpentina externa de resfriamento 11 e isolamento em fibra de vidro 19. O tubo 10 foi ligado a uma tampa terminal Swagelok® 12 a qual por seu lado foi ligada a um transmissor de pressão soldado 13 por intermédio de um tubo 14 com 1/3 polegadas e a uma conexão para termopar 15. A outra extremidade do tubo 10 foi ligada a uma válvula de agulha com haste integral de 1 polegada ligada a um tubo de reco- lhimento 17 com o mesmo comprimento, o qual por seu lado foi ligado a uma válvula de agulha com haste integral de 1/4 polegadas 20. A temperatura foi controlada pelo termopar 18 colocado por baixo da serpentina de aquecimento e ligado a um controlador 21. Esta configuração facilitou a remoção de solvente em uma temperatura bem acima do ponto de ebulição do solvente.

Operação do diqestor de pré-tratamento experimental de 100 ml Para o pré-tratamento de etanol, o digestor da figura 5 foi carregado com 6,54 g de lascas de madeira secas e 83,5 ml de etanol (50 a 70%). O digestor foi selado em todas as conexões Swagelok® e a válvula de agulha com haste prolongada foi fechada. O digestor foi então aquecido até a temperatura de processo escolhida (170 °C - 195 °C) enquanto era agitado manualmente para assegurar que o processo alcançasse o equilíbrio rapidamente. Tão logo a temperatura desejada foi alcançada, a reação foi deixada prosseguir durante 60 minutos com agitação manual periódica. No final do tempo da reação, o digestor foi invertido e a válvula de agulha com haste prolongada foi aberta para permitir que o solvente fosse drenado no tubo de recolhimento. Uma peneira fina, colocada no digestor contra a válvula, reteve a fração sólida no vaso de reação. O conteúdo do digestor foi resfriado e o solvente foi removido do tubo de recolhimento.

Para o tratamento com água quente, o digestor foi cheio com 90 mililitros de água de lavagem, selado e aquecido até uma temperatura especificada na faixa de 180 a 220 °C. Depois do tempo de incubação desejado na temperatura visada, a água quente foi removida utilizando-se o mesmo método descrito para a remoção de solvente. A polpa restante foi secada e submetida a hidrólise.

Descrição do diqestor de leito com recheio de 3 litros (figura 6)

O digestor 23 de leito com recheio de 3 litros mostrado na figura 6 consistia de uma câmara de digestão de aço inoxidável 25 que continha uma cesta de amostra de tela 27 selada com acessórios de tampas terminais Swagelok® 26. Haviam 4 saídas e 2 entradas na câmara de digestão 25. Um tubo de saída de 1/4 " 24 ligado na câmara de digestão 25 as o transmissor de pressão 32. Um tubo de 1/2" de saída da válvula de alívio de pressão 28 continha um termopar 39 de medição da pressão na câmara de digestão 25, e foi ligado a uma válvula de alívio de pressão de 50 barg (5100 kPa) 38 e a uma saída do tanque de á- gua 54. Uma entrada de fluido de circulação de tubo de 3/4" permitia a recirculação de flui- dos para dentro da câmara de digestão 25 e a aplicação de pressão do cilindro de nitrogênio pressurizado através de um conector de cilindro de nitrogênio 44. Uma saída de fluido de circulação de tubo de 1" 40 permitia a recirculação do fluido circulante para fora da câmara de digestão 25 e uma entrada de termopar de tubo de 1/8" 55 media a temperatura dentro da câmara de digestão 25. Um termopar 56 ligado em um tubo de fluido circulante 45 media a temperatura do fluido circulante no tubo de fluido circulante.

Um motor 34 fazia girar um eixo 46 contido em um tubo 48 de 2 " que estava ligado a uma bomba com velocidade variável 31 contendo quatro rotores 47 e selada utilizando-se vários selos rotativos ECOFLON2. As peças em T do eixo da bompa 49 mantinham o tubo 48 de 2" no seu lugar. Quando o eixo 46 é girado em uma velocidade de 1400 - 2800 rpm, o fluido é forçado através da bomba 31 e é circulado através do circuito de aquecimento 29 contendo uma construção de aquecimento 35, e através da câmara de digestão 25 para permitir um fluxo contínuo na mesma direção ou em contracorrente.

Uma peça em T 51 da linha de reciclagem foi ligada a uma válvula de agulha 36 e a uma garrafa 37 de 10 ml para permitir a retirada de amostras do fluido circulante quando o digestor está operando. Para retirar uma amostra do fluido circulante, a válvula 36 foi aberta e a garrafa 37 foi cheia. A válvula 36 foi então fechada, e a garrafa 37 foi resfriada e removi- da para análise da amostra.

A construção do aquecédor 35 consistia de um tubo de aquecimento de 3/4" 52 com 6 elementos de aquecimento elétrico 53 selados no mesmo com cimento condutor. Os elementos de aquecimento 53 foram ligados a um controlador 41, o qual foi ligado a um ter- mopar de controle 42 medindo a temperatura do fluido circulante no meio do circuito de a- quecimento 29, e um controlador de excesso de temperatura 43 foi ajustado a 250 ° C me- dindo a temperatura do fluido circulante próxima de uma saída 50 do circuito de aquecimen- to 29. O tubo de aquecimento 52 foi isolado com fibra de vidro.

Operação do digestor de leito com recheio de 3 litros

O digestor de leito com recheio de 3 litros mostrado na figura 6 funcionou sob o mesmo princípio do digestor de 100 ml, com exceção de que a câmara de digestão 25 con- tinha a biomassa dentro de uma cesta de amostra de malha 27 e o solvente foi circulado dentro do circuito de aquecimento 29 através de uma bomba de velocidade variável 31. O solvente foi aquecido eletricamente para assegurar que a temperatura visada da digestão fosse alcançada. A cinética do processo de extração foi determinada recolhendo-se amos- tras do solvente móvel por intermédio de uma válvula de agulha 36 e da garrafa de 10 ml 37 situada a jusante da bomba.

A alimentação de madeira em lascas (até 300 g) foi colocada na cesta de amostra de malha 27, que foi fixada dentro do vaso. O vaso com a cesta de amostra foi cheio com até 3 litros de solvente, e o reator foi selado firmemente com acessórios Swagelok®. O cir- cuito de reciclo foi cheio com líquido adicionando-se água através da entrada do tanque de água 54. Quando o reator foi selado completamente, os controladores do circulador e de temperatura foram ligados. O transmissor de pressão 32, os termopares 39 e 55 no reator, e o termopar 56 na superfície do tubo 61 foram monitorados utilizando-se um registrador Pi- coLog (Pico Technology, Cambridge, UK).

Descrição e operação do diqestor em batelada de 40 litros (figura 7) O digestor de leito com recheio de 40 litros mostrado na figura 7 foi fabricado a par- tir de uma seção de tubo de aço macio de alta pressão de 210 mm que constituía um vaso reator 64. Um tubo de 300 mm ao redor do mesmo formou uma serpentina de aquecimento 63 que foi dividido por uma antepara em espiral de aço em um canal de fluxo em espiral. O vaso reator 64 e a serpentina de aquecimento 63 foram envolvidos pelo isolamento de fibra de vidro 62. A serpentina de aquecimento 63 foi ligada a um circuito de aquecimento de óleo 76 e o óleo dentro do circuito de aquecimento de óleo 76 foi aquecido por um aquecedor 69 acionado por elementos de aquecimento elétrico de 6 kw. O óleo foi circulado através do circuito de aquecimento de óleo 76 por intermédio de uma bomba 68, e poderia também ser desviado por duas válvulas do circuito 71 para um circuito de resfriamento 72 imerso em um banho de água 77 para permitir o resfriamento mais rápido do vaso reator 64. O aquecedor e a bomba foram controlados por um termostato 71 e um controlador de processo 67. Um reservatório de óleo 73 ligado no circuito de aquecimento de óleo 76 foi utilizado para aco- modar a expansão térmica do óleo. Em operação, o vaso reator 64 foi cheio com cerca de 6 kg de biomassa Salix e 30 a 40 litros de etanol a 70% através de um funil 57 e uma válvula de esfera superior 58. O vaso reator 64 foi então selado e aquecido, levando 3 a 4h para alcançar a temperatura de operação (185°C). A temperatura foi monitorada através de um sensor de temperatura 61 e a pressão através de um manômetro de pressão 59. O manô- metro de pressão foi ligado a uma válvula de alívio de pressão 60. Uma conexão de amostra 66 foi ligada a uma válvula de esfera inferior 65 no vaso reator 64. Para permitir que amos- tras em cada tempo da fase líquida sejam retiradas durante a etapa de extração, pode ser ligada uma válvula de amostragem de líquido (não mostrada) na conexão de amostragem 66. Depois do tempo apropriado de residência, a circulação de óleo foi desviada para o cir- cuito de resfriamento 72 por intermédio das válvulas do circuito 71 e o vaso reator 64 foi deixado resfriar-se. Depois da remoção da válvula de amostragem de líquido 74, a biomassa tratado na forma de licor negro contendo lignina foi drenada do vaso reator 64 por intermé- dio da válvula de esfera inferior 65 e da conexão de amostragem 66, e foi lavada com etanol a 70% e água para a remoção de mais lignina. Alternativamente, a ligação de uma válvula de explosão de vapor (não mostrada) na conexão de amostragem 66 permitiu que fosse executada uma etapa de explosão de vapor na biomassa quando ela estava ainda em tem- peratura e pressão elevadas.

Resultados

Balanço de massa

Utilizando-se os digestores da experiência conforme descrito acima, a biomassa Salix foi dividida em duas frações: 1) uma fração de etanol e/ou solúvel em água (hidrolizato, hidratado), e 2) uma fração sólida (polpa). A tabela 2 representa a separação de massa das lascas de Salix depois de várias seqüências de pré-tratamento. Os tratamentos foram feitos com etanol a 70% de 170°C a 190°C durante 60 minutos antes ou após os tratamentos com água executados durante 30 minutos de 170°C a 190°C. Neste exemplo, todas as experiências de pré-tratamento foram iniciadas com 6,54 g de lascas de Salix secas (n=3-5) no digestor de 100 ml. A massa no hidrolizato representa a massa seca (DM) recuperada depois da evaporação do hidrolizato, e a massa na fração de polpa corresponde à DM do material insolúvel residual produzido após cada pré-tratamento. Estes resultados mostram que a adição de um segundo pré-tratamento aumentou o deslocamento da massa em 10% na direção do hidrolizato e que a seqüência na qual os dois tratamentos são executados não tem um grande impacto na quantidade final da massa deslocada.

Tabela 2: Balanço de massa da biomassa Salix pré-tratada

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A cinética da remoção de massa durante o tratamento principal com etanol a 70% foi estudada no digestor de leito com recheio de 3 litros. A figura 10 apresenta a quantidade média de DM removida (expressa como percentagem da DM inicial carregada) em um con- junto de cinco experiências executadas do digestor de leito com recheio de 3 litros com eta- nol a 70% durante 60 a 480 minutos em uma temperatura variando entre 175°C e 195°C. Este conjunto de dados obtidos do pré-tratamento de 250 g de lascas secas de Salix, foi comparado com a percentagem de massa removida com etanol a 70% utilizando-se os di- gestores menores (100 ml; 6,54 g) ou maiores (batelada de 40 litros; 30 a 40 kg) em vários momentos.

A figura 8 mostra que foi requerida uma incubação três vezes mais longa utilizando- se o digestor de leito com recheio de 3 litros para a remoção de quantidades comparáveis de material seco que o digestor menor de 100 ml em 60 minutos. Assim sendo, foram tes- tados tempos de incubação variáveis entre 200 e 400 minutos em relação à remoção ótima de massa no digestor maior de 40 litros. Conforme mostrado na figura 8, nesta faixa de tem- po de incubação, 20 a 30% da alimentação de DM foi removida eficientemente com etanol a 70% na escala de 40 litros. A figura 9 ilustra a relação de material seco e Iignina removidos pelo etanol a 70% como a percentagem de DM adicionada, com os resultados para o diges- tor de 3 litros sendo mostrados na figura 9A e os resultados para o digestor de batelada de 40 litros sendo mostrados na figura 9B. A DM média removida em 22 extrações com etanol a 70% no digestor de batelada de 40 litros (figura 9B) era de 25% ± 3 em um tempo de cor- rida variando entre 200 e 400 minutos com uma relação inicial de carga líquida (iLLR; litro de solvente/kg de iDM).

A figura 10 apresenta a relação de DM removida quando as lascas de Salix seco e as lascas de Salix seco pré-tratadas com etanol a 70% foram tratadas com água quente (170 °C a 195 °C) nos digestores de 100 ml e de 3 litros. Conforme visto anteriormente com o tratamento de etanol a 70%, a relação de DM removida era menor quando se utilizou o leito com recheio de 3 litros, quando comparado com o digestor menor de 100 ml. A figura também mostra que um tempo aumentado de incubação das lascas não tratadas na á- gua quente não resultou em um aumento da DM removida como aconteceu em uma incuba- ção mais longa no etanol a 70% (mostrado na figura 8). Da mesma forma que no digestor de 100 ml, quando o tratamento com água quente das lascas Salix que foram previamente tra- tadas com etanol a 70% foi executado no digestor de leito com recheio de 3 litros, foi obtida uma remoção adicional de DM de 10%.

Composição da massa

A seqüência de OrganoSolv®/água quente produziu uma recuperação ótima de Iig- nina e açúcar. A tabela 3 abaixo mostra a composição representativa do hidrolizato e da fração de polpa obtida após o tratamento seqüencial de 6,54 g, 250 g ou 35 kg de lascas de Salix com etanol a 70% de 175 ° C a 195 °C durante 60 a 345 minutos seguido pelo trata- mento com água de 170 ° C a 195 ° C durante 30 a 375 minutos.

A composição da Salix comparativa não tratada era a media da análise das varie- dades Salix não tratadas descritas na tabela 1. A concentração de Iignina na amostra de hidrolizato foi determinada depois da precipitação aquosa ácida da lignina, da separação, secagem e pesagem da lignina precipitada. Esta medição de peso da concentração de ligni- na mostrou ser correlacionada com a medição obtida por cromatografia de exclusão de ta- manho da mesma lignina precipitada e a interpretação do tempo de retenção com referência aos padrões apropriados de peptídeos da pré- corrida. A concentração de glicose e de xila- no no hidrolizato foi diretamente medida por HPLC utilizando-se a faixa apropriada de pa- drões. A composição da polpa foi avaliada conforme descrito anteriormente para as lascas de Salix não tratadas.

Recuperação de lignina

Em todas as escalas (100 ml, leito com recheio de 3 litros, e batelada de 40 litros), o tratamento em seqüência com etanol a 70% e água quente resultou na remoção de mais de 30% do teor total de Iignina das lascas não tratadas (tabela 3 abaixo). A maior parte da lignina (28 a 32%) foi solubilizada durante o tratamento principal com o solvente etanol a 70% e um adicional de 3 a 8% da Iignina inicial foi removido no tratamento subseqüente com água.

Conforme mostrado na figura 11, a relação entre lignina e DM removidos pelo tra- tamento com etanol a 70% alcançou a 35% na primeira hora de tratamento em uma tempe- ratura de 170 ° C a 190 ° C utilizando-se os digestores de 100 ml e de leito com recheio de 3 litros. A composição de lignina da DM removida no digestor de leito com recheio de 3 litros durante a segunda hora de tratamento aumentou em 5% e alcançou 50% depois de 4h. De- pois de 8h, o conteúdo de Iignina da DM removida aumentou somente mais 10% para atingir 60%. A figura 11 também mostra que, no digestor de batelada de 40 litros, a proporção entre lignina e DM removida varia entre 30 a 48% quando as lascas secas de Salix foram tratadas com o solvente etanol a 70%. A figura 12 ilustra a proporção do teor total de Iignina nas las- cas não tratadas que foi recuperada no solvente etanol a 70% utilizando cada um dos três digestores. A maior recuperação de Iignina (32% ± 3) em 60 minutos, utilizando o digestor menor de 100 ml, reflete a velocidade maior de remoção de DM obtida com este digestor.

Com o digestor de 3 litros de leito com recheio, foi obtida uma recuperação semelhante den- tro de 200 a 240 minutos de tratamento. A quantidade de Iignina recuperada utilizando o digestor de batelada de 40 litros variou entre 22 e 44% do teor inicial de Iignina das lascas de Salix, correspondendo a 6 a 13% da carga inicial de DM.

A figura 13 mostra a relação entre DM e lignina removida pelo tratamento com água quente utilizando os digestores de leito com recheio de 100 ml e 3 litros, expresso como uma percentagem da DM carregada. Quando foi aplicada água quente como um tratamento principal, até 3% da DM inicial foi rapidamente recuperada como lignina no solvente de água (dentro dos primeiros 30 minutos de tratamento, correspondendo a 10% da Iignina total dis- ponível). Quando a água quente foi aplicada depois do tratamento com etanol a 70%, não mais do que 1% da DM inicial foi recuperada como lignina no solvente de água (3% da Iigni- na total disponível nas lascas de Salix não tratadas).

A lignina precipitada do hidrolizato de etanol pela adição de água acidulada tinha um peso molecular médio de aproximadamente 2000 Daltons e foi estimado que eram poli- meros pequenos pentaméricos a decaméricos com uma relação de unidades guaiacihsiringil de 1:4 conforme mostrado pela análise de espectroscopia NMR. A análise NMR também mostrou que a lignina do Salix sofreu uma pequena modificação sob condições ótimas de pré-tratamento (etanol a 70% a 195°C durante 60 minutos).

A tabela 3 mostra a composição das lascas de madeira tratada de Salix depois do pré-tratamento com etanol a 70% de 175°C a 195°C (60 minutos em digestor de 100 ml, 180 minutos no digestor de leito com recheio de 3 litros e 345 minutos no digestor de batelada de 40 litros) seguido pelo tratamento com água de 70°C a 190°C (30 minutos no digestor de 100 ml, 180 minutos no digestor de leito com recheio de 3 litros e 375 minutos no digestor de batelada de 40 I), comparado com as lascas de madeira não tratadas de Salix.

Tabela 3

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Recuperação de glicose e fermentação em etanol

O pré-tratamento das lascas de Salix produziu a maior parte da celulose na polpa, conforme mostrado pela recuperação de mais de 98% do total de glucanos alimentados nes- ta fração em cada uma das escalas testadas de digestor (digestores de 100 ml, 3 litros ou 40 litros, tabela 3). Conforme mostrado na figura 15 e na tabela 4, a conversão completa da celulose recuperada em glicose foi obtida depois de um tratamento standard de 5h com ce- lulose (Trichoderma reesei (Celluclast, Novozyme, Denmark)) a 80 pfu por grama de gluca- nos (teórico) e 0,05% de beta glucosidase (Aspergillus niger (Novozyme 188 )) conforme recomendado pelo fabricante da enzima. Este resultado também indicou que a Iignina e a xilose residuais na polpa, com uma relação de carga de celulose de 1%, não interferiu com a atividade da enzima (tabelas 3 e 4). Isto produziu um substrato de glicose em uma concen- tração de 10 a 12 g por litro para fermentação em etanol.

Tabela 4: Eficiência da digestão enzimática de lascas pré- tratadas de Salix com uma carga constante de enzima (80 pfu/ g de celulose)

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O efeito do tratamento com água quente na hidrólise das lascas tratadas com eta- nol a 70% foi observado quando a reação enzimática foi executada utilizando-se uma con- centração maior de celulose (relação de carga de celulose > 4). Conforme mostrado na ta- bela 4, mais de 20% de glicose foi produzida com uma carga equivalente de celulose de 4 - 5%, quando as lascas pré-tratadas com etanol a 70% também foram tratadas com água quente. Esta melhoria da digestão de celulose em uma proporção maior de carga provavel- mente refletiu o menor teor de Iignina e xilose observado na polpa produzida depois do tra- tamento com água quente.

A capacidade de digestão da celulose produzida pelo tratamento com etanol a 70% e com água quente foi ainda mais melhorada por agitação, utilizando-se rolos ao invés de se utilizar um agitador de frasco durante a reação enzimática (tabela 4).

A glicose foi fermentada em etanol utilizando-se 64 ml de hidrolizato e 4,5 ml de "Stíll Spirits Temperature Tolerant Turbo Yeast" (Brewcraft USA, Portland, OR) em 6,4 ml de 10 χ meio YP (meio YP: 100 g por litro de extrato de levedura e 200 g por litro de peptona). A reação foi deixada prosseguir a 40°C com agitação a 200 rpm até que a curva de cres- cimento da levedura alcançou um platô, determinado pela medição do OD600 das amostras temporárias. A quantidade de etanol e de glicose restante no meio foi determinada por HPLC. O rendimento de etanol da celulose digerida de Salix utilizando-se Saccharomyces cerevisae era de 0,32 g de etanol/g de glicose, representando 62% do rendimento teórico de 0,51 g de etanol/g de glicose.

Recuperação de xilose

Como foram detectadas quantidades muito pequenas de xilose e de ácido acético no solvente etanol a 70% após o pré-tratamento das lascas de Salix (Tabela 3), nós conclu- ímos que o tratamento com etanol a 70% tinha pouco efeito na degradação da hemicelulose. A recuperação de açúcares da hemicelulose variou de acordo com as condições de pré- tratamento com água quente.

Quando foi executado um tratamento curto com água quente (30 minutos) nas Ias- cas de Salix pré-tratadas com etanol a 70% no digestor de 100 ml, a xilose residual na fra- ção de polpa (4,6% de carga de DM = 46% de xilose disponível; tabela 3) indicou uma de- composição incompleta da hemicelulose.

A figura 15 mostra o nível de acumulação de xilose e de furfural na água quente a- plicada após o pré-tratamento com etanol a 70% no digestor de leito com recheio de 3 litros. O nível de xilose alcançou um pico a 2,4% da carga de DM ( 24% da xilose total disponível) depois de 120 minutos, em cujo tempo o nível de produção de furfural aumentou, indicando uma degradação adicional da xilose produzida através da eficiente hidrólise do açúcar de hemicelulose. Como resultado, a polpa de celulose que foi produzida depois do pré- tratamento com etanol a 70% e do tratamento mais longo com água quente continha níveis grandemente reduzidos de xilose (tabela 3, < 0,1% de carga de DM). Outra indicação da eficiente hidrólise da hemicelulose durante o tratamento com água quente foi a formação de ácido acético como conseqüência da desacetilação do radical acetilado de hemicelulose (figura 15). A figura 15 também mostra que a quantidade de glicose foi mantida em um baixo nível durante todos os tempos, indicando que o tratamento com água quente não resultou na hidrólise da celulose.

A importância da recuperação de xilose com a aplicação do tratamento com água quente após o pré-tratamento com etanol a 70% foi adicionalmente demonstrado no digestor da escala em batelada de 40 litros. Não foi detectada nenhuma xilose na polpa de celulose produzida após o tratamento com etanol a 70% e água quente, enquanto que níveis de xilo- se de até 70% de carga de DM (70% da xilose total) foram medidos na polpa de celulose produzida pelo tratamento com etanol a 70%.

Exemplo 2

Biorefino de palha de trigo

A tabela 5 mostra a composição mássica da palha de trigo não tratada da composi- ção de hidrolizato e polpa produzida durante o pré-tratamento com etanol-água da mesma palha de trigo. O pré-tratamento foi aplicado conforme descrito acima para o pré-tratamento com etanol-água das lascas de Salix no digestor de batelada de 40 litros.

Conforme visto na tabela 5, foi removido somente 27% do material inicial seco du- rante a extração em seqüência com etanol a 70% e água quente. Assim sendo, foi recupe- rada menos Iignina no solvente etanol do que quando as lascas de Salix foram tratadas da mesma forma. Foi também descoberta uma proporção maior de Iignina na polpa de palha de trigo. Isto poderá refletir o tipo diferente de Iignina na palha de trigo. Com relação ao pré- tratamento de Salix, o pré-tratamento da palha de trigo com etanol e água resultou na recu- peração de toda a glicose disponível na polpa.

Tabela 5

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Quando a polpa foi submetida à hidrólise enzimática conforme descrito anterior- mente para a polpa de Salix extraída com água-etanol (relação de carga de celulose de 5 e carga de celulose de 80 fpu por grama), a celulose na polpa de trigo foi completamente hi- drolisada (100%) dentro de 6 dias de reação agitada utilizando rolos.

Exemplo 3

Micro-propagação da spp Salix

A técnica da micro-propagação foi utilizada para desenvolver rapidamente grandes quantidades de arbustos clonais de Salix spp. a baixo custo. Foram produzidos lotes de S. viminalis e S. schwerinii "Kinuyanagi" através de micro-propagação como se segue.

Para estabelecer culturas de brotos in vitro, arbustos da espécies Salix com um ano de idade cultivados no campo foram recolhidos no inverno e cortados em pedaços com 25 e 35 cm de comprimento. Os pedaços foram lavados com água, esterilizados em solução de branqueamento comercial a 15% durante 15 minutos e rinsados 3 vezes em água. Os pedaços cortados foram então colocados em um becher contendo água. Quatro a seis se- manas mais tarde, novos brotos (comprimento de 5 a 10 cm) foram produzidos a partir dos cortes. Os novos brotos foram coletados e esterilizados em solução de branqueamento a 15% depois da remoção das folhas. Os brotos esterilizados foram rinsados 3 vezes em água estéril em uma estufa de cultura de tecido estéril. Os brotos foram então cortados em micro- cortes com 0,5 a 1 cm de comprimento contendo dois nódulos em cada um deles. Os micro- cortes foram colocados em meio MS (Murashige and Skoog) (Sigma, St Louis MO; Murashi- ge and Skoog, Physiol. Plant. 15: 473 - 497,1962) ou McCown Woody Plant médium (Duchefa, Haarlem, Netherlands; Lloyd and McCown, Proc. Int. Plant Prop. Soe. 30: 421 - 427,1981) suplementado com 0,1 a 1,0 mg / litro de BA (benziladenina) e 0,1 a 1,0 g/litro de carvão ativo, e incubados em uma sala de cultivo de planta a 24° C com um foto-período de 16h. Quatro semanas mais tarde, foi produzido um arbusto (2 - 4 cm de comprimento) e vá- rias raízes de cada micro-corte para formar um arbusto. Os arbustos foram cortados outra vez em micro-cortes e cultivados em meio McCown Woody Plant para aumentar a quantida- de de arbustos. Este processo poderá ser repetido a cada quatro semanas. Os arbustos foram então transplantados para um misturador em células de 25 ml.

Após a transferência de solo, os arbustos foram mantidos em câmara de cresci- mento contendo 100% de umidade durante uma semana antes de serem expostos às condi- ções normais de umidade. Quatro semanas após a transferência para os misturadores, os arbustos de 10 - 15 cm de altura foram cortados em segmentos de 3 - 5 cm (contendo pelo menos dois nódulos) que foram plantados outra vez em vasos de mistura em células de 25 ml para aumentar ainda mais a quantidade de arbustos. Alternativamente, os arbustos po- dem ser transplantados para o campo 7 semanas após a transferência inicial do meio de cultura para o pote de mistura, ou após 3 semanas quando o arbusto foi produzido a partir de outro arbusto no pote de mistura. A composição do meio McCown Woody Plant usada nestes estudos era como se segue:

Micro elementos:

CuS04.5H20 0,2 mg/l

FeNaEDTA 36,70 mg/l

H3BO3 6,20 mg/l

MnSO4-H2O 22,30 mg/l

Na2Mo04.2H20 0,25 mg/l

ZnSO4JH2O 8,60 mg/l

Macro elementos:

CaCI2 72,5 mg/l

Ca(NO3)2 386,80 mg/l

KH2PO4 170,00 mg/l

K2SO4 990,00 mg/l

MgSO4 180,54 mg/l

NH4NO3 400,00 mg/l

Vitaminas

Glicina 2,00 mg/l

Mio-inositol 100,00 mg/l

Ácido nicotínico 0,50 mg/l

Piridoxina HCI 0,50 mg/l

TiaminaHCL 1,00 mg/l

A composição de meio Murashige and Skood usada nestes estudos era como se segue:

Nitrato de amônio 1,650 mg/l

Ácido bórico 6,2 mg/l

Cloreto de cálcio 440 mg/l

Cloreto de cobalto 0,025 mg/l

Sulfato de magnésio 370 mg/l

Sulfato cúprico 0,025 mg/l

Fosfato de potássio 170 mg/l

Sulfato ferroso 27,8 mg/l

Nitrato de potássio 1,099 mg/l

Sulfato de manganês 22,3 mg/l <table>table see original document page 27</column></row><table>

Exemplo 4

Teste de campo da spp Salix

Foram executados testes no local para a determinação das espécies Salix e dos regimes de cultivo adequados para locais dentro da represa do lago Taupo na Nova Zelân- dia. Salix viminalis (um clone macho) e Salix schwerinii "Kinuyanagi" (Um clone macho não fértil) foram escolhidos como as espécies preferidas. Estes cultivos foram escolhidos inicial- mente com base no fato dos viveiros comerciais considerarem os mesmos como sendo de alta produção e resistentes a pestes de insetos, tais como "sawfly". Os testes foram execu- tados utilizando-se cortes de caule dormente com 20 a 33 cm plantados em uma quantida- de de 10 a 12.000 caules por hectare. Os parâmetros que foram avaliados para a produção ótima de biomassa incluíram a densidade da plantação, o comprimento da área da cultura, os métodos de preparação do solo, o regime de fertilização, o controle de insetos e pragas, e o método de colheita.

O teste consistiu de 32 lotes (16 por espécie), preparação do local do teste com corte comparado com nenhum corte. Comprimentos cortados com 20, 25 e 33 cm foram testados. Um controle da praga utilizando Gardoprim® (Orion Crop Protection Ltd, Auckland, New Zealand) foi aplicado em todos os lotes. Não foi aplicado nenhum fertilizante, devido à necessidade de análise comparativa do solo e da folhagem no primeiro ano. O lote designa- do de medição com 40 árvores foi avaliado em maio de 2006. Foram registrados a altura do arbusto dominante, o número dos mais altos de 50 cm de cada corte e o número de cortes vivos convertidos em mudas (caules/ hectare) (tabela 6)

Conforme visto na tabela 6, não haviam diferenças significativas na altura e no nú- mero de caules mais altos entre o Salix viminalis e o Salix schwerinii "Kinuyanagi," um ano após o plantio. Ambas as espécies estavam bem estabelecidas no seu local específico (solo Taupo com base em pedra pomes leve) independentemente do método de preparação do local. Deve-se notar que seria requerido o arranque dos arbustos se os cortes fossem plan- tados mecanicamente. Houve um aumento de produtividade com o corte de 25 cm, compa- rado com o corte de 20 cm, mas outros aumentos do comprimento do corte (de 25 para 33) não tiveram nenhum impacto nas quantidades plantadas e na altura média do arbusto domi- nante.

Tabela 6: Medição do teste local após um ano

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A densidade básica da madeira, o teor de umidade do Salix schwerinii "Kinuyanagi" e do Salix viminalis foram calculados (tabela 7). As amostras foram recolhidas para análise da biomassa de quatro plantas por lote onde a sobrevivência média foi registrada (2 lotes por espécie).

Tabela 7: Análise de biomassa

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Embora a invenção atual tenha sido descrita com referência às realizações especí- ficas da mesma, deve ser entendido por aqueles adestrados na arte que várias alterações poderão ser feitas e os equivalentes poderão ser substituídos sem se afastarem do espírito real e do escopo da invenção. Além disso, várias modificações poderão ser feitas para a adaptação de uma situação, material, composição do material, método, etapa ou etapa do método, específicos para uso na prática da invenção atual. Todas essas modificações se destinam a ser incluídas no escopo das reivindicações anexas.

Todas as publicações, solicitações de patente e patentes citadas nesta solicitação são incorporadas aqui como referência na sua integridade com a mesma extensão de cada publicação individual, solicitação de patente ou patente que foi especificamente e individu- almente indicada para ser incorporada como referência na sua integridade.

Claims (24)

1. Processo para o tratamento de material de planta, CARACTERIZADO pelo fato de ser composto por: (a) contato de um fluxo contínuo do material da planta com um fluxo contínuo no mesmo sentido ou em contra-corrente de uma solução aquosa de etanol em uma primeira temperatura e pressão elevadas durante um período de tempo suficiente para a produção de material de polpa da planta e uma mistura composta de etanol, Iignina solúvel em etanol e água, onde o material de polpa de planta é isento de Iignina e tem uma concentração ele- vada de celulose; (b) separação do material e da pouca da planta da mistura e recuperação da Iignina solúvel em etanol da mistura; (c) contato do material de polpa de planta com água em uma segunda temperatura e pressão elevadas durante um período de tempo suficiente para a remoção dos açúcares de hemicelulose do material de polpa de planta; (d) separação da água do material de polpa de planta e recuperação dos açúcares solúveis em água, ácido acético e/ou furfural da água; e (e) contato do material de polpa de planta resultante com: (i) uma solução aquosa composta de celulase, β-glucosidase e levedura tolerante a temperatura, (ii) meio de cres- cimento de levedura, e (iii) solução tampão, onde a celulose presente no material de polpa de planta é hidrolisada em glicose.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de ser ainda composto da fermentação de glicose para a produção de etanol.

3. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 2, CARACTERIZADO pelo fato do material de planta ser um material lignocelulósico escolhido do grupo consistin- do de: madeira ou materiais de ervas, e resíduos agrícolas ou de florestas, e culturas dedi- cadas à produção de energia.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato do mate- rial de planta ser escolhido do grupo consistindo de: Salix, Poplar, eucalipto, "switch grass", "miscanthus", bagaço de cana de açúcar, folha de feijão de soja, folha de milho, palha de arroz, palha de cevada, palha de trigo, fibra de milho, fibra de madeira, e combinações dos mesmos.

5. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 1-3, CARACTERIZADO pe- lo fato do material de planta ser de uma planta escolhida do grupo consistindo de: espécies Salix e trigo.

6. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 1-5, CARACTERIZADO pe- lo fato da solução aquosa de etanol ser composta de 50% a 80% de etanol.

7. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 1-6, CARACTERIZADO pe- Io fato da etapa (a) ser executada substancialmente na ausência de um catalisador ácido.

8. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 1-7, CARACTERIZADO pe- lo fato da primeira temperatura elevada ser entre 170 ° C e 210 ° C.

9. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 1-8, CARACTERIZADO pe- Io fato da primeira pressão elevada ser entre 19-30 barg (2000 - 3100 kPa).

10. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 1-9, CARACTERIZADO pelo fato da segunda temperatura elevada ser entre 160 ° C e 220 ° C.

11. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 1-10, CARACTERIZADO pelo fato da segunda pressão elevada ser entre 12 - 25 barg (1300 - 2600 kPa).

12. Processo integrado para o tratamento de um material de planta, CARACTERIZADO pelo fato de ser composto de: (a) contato do material de planta com uma solução aquosa de etanol em uma pri- meira temperatura e pressão elevadas e durante um período de tempo suficiente para pro- duzir material de polpa de planta e uma mistura composta de etanol, Iignina solúvel em eta- nol e água, onde o material de polpa de planta é isento de Iignina e tem uma concentração elevada de celulose; (b) a separação do material de polpa de planta da mistura e a recuperação da Iigni- na solúvel em etanol da mistura; (c) o contato do material de polpa de planta com água em uma segunda temperatu- ra e pressão elevadas durante um período de tempo suficiente para a remoção dos açúca- res de hemicelulose do material de polpa de planta; e (d) a separação da água do material de polpa de planta e a recuperação do açúcar solúvel em água, ácido acético e/ou furfural, da água.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato do ma- terial de planta ser um material lignocelulósico escolhido do grupo consistindo de: materiais de madeira ou de ervas, resíduos agrícolas ou de florestas, e culturas dedicadas à produção de energia.

14. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 12 e 13, CARACTERIZADO pelo fato do material de planta ser escolhido do grupo consistindo de Salix, Poplar, eucalipto, "switch grass", "miscanthus", bagaço de cana de açúcar, folha de feijão de soja, folha de milho, palha de arroz, palha de cevada, palha de trigo, fibra de milho, fibra de madeira, e combinações dos mesmos.

15. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 12 e 13, CARACTERIZADO pelo fato do material de planta ser de uma planta escolhida do grupo consistindo de: espécies Salix e trigo.

16. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 12 - 15, CARACTERIZADO pelo fato da solução aquosa de etanol ser composta de 50% a 80% de etanol.

17. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 12 - 16, CARACTERIZADO pelo fato da primeira temperatura elevada estar entre 170 ° C e 210 ° C e a primeira pressão elevada estar entre 19-30 barg (2000 - 3100 kPa).

18. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 12 - 17, CARACTERIZADO pelo fato da etapa (a) ser executada substancialmente na ausência de um catalisador ácido.

19. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 12-18, CARACTERIZADO pelo fato da segunda temperatura elevada estar entre 160 ° C e 220 ° C, e a segunda pres- são elevada estar entre 12- 25 barg (1300-2600 kPa).

20. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 12 - 19, CARACTERIZADO pelo fato de ser ainda composto do contato do material de polpa de planta da etapa (d) com (i) uma solução aquosa composta de celulase, ^-glucosidase e le- vedura tolerante a temperatura, (ii) meio de crescimento de levedura, e (iii) solução tampão, durante um período de tempo suficiente para hidrolisar a celulose presente no material de polpa de planta em glicose.

21. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 12 - 20, CARACTERIZADO pelo fato de ser ainda composto da fermentação da glicose para produ- zir etanol.

22. Método para a propagação de plantas da espécie Salix, o método sendo CARACTERIZADO pelo fato de ser composto de: (a) cultura pelo menos de um arbusto de uma primeira planta escolhida do grupo consistindo de espécies Salix e a coleta pelo menos de um pedaço do arbusto, onde o corte contém pelo menos um nódulo; (b) cultivo do corte em uma composição durante um período de tempo suficiente para formar uma segunda planta, onde a composição é composta de benziladenina, carvão ativo e pelo menos um meio escolhido do grupo consistindo de: meio Murashige and Skoog e meio McCown Woody Plant.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de ser ainda composto de: (a) obtenção pelo menos de um corte subseqüente da segunda planta, onde o corte subseqüente contém pelo menos um nódulo; e (b) o cultivo do corte subseqüente em meio McCown Woody Plant durante um perí- odo de tempo suficiente para formar um arbusto subseqüente.

24. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 22 e 23, CARACTERIZADO pelo fato da planta ser escolhida do grupo consistindo de: Salix viminalis e Salix schwerinii "Kinuyanagi".