BRPI0710065A2 - modificações enzimáticas em uma coluna de leito carregado regenerado continuamente - Google Patents

Abstract

<B>MODIFICAçõES ENZIMáTICAS EM UMA COLUNA DE LEITO CARREGADO REGENERADO CONTINUAMENTE<D>A presente invenção refere-se a um processo para a modificação de um substrato que compreende passar o substrato através de uma coluna de leito carregado de um volume específico de enzima imobilizada, em que o substrato entra na coluna na ou próximo a uma extremidade da coluna (a "extremidade de entrada") e o substrato modificado sai na ou proximo à extremidade oposta da coluna (a "extremidade de saída"), uma parte do volume da enzima imobilizada é periodicamente removida na ou próximo à extremidade de entrada da coluna, e uma parte equivalente da enzima mobilizada é periodicamente adicionada na ou próximo à extremidade de saída da coluna.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MODIFICA-ÇÕES ENZIMÁTICAS EM UMA COLUNA DE LEITO CARREGADO RE-GENERADO CONTINUAMENTE".

As reações enzimáticas são usadas de forma crescente para oprocessamento de materiais em uma escala industrial. Uma etapa comercialimportante foi o desenvolvimento de enzimas imobilizadas, isto é, enzimasque estejam fisicamente anexadas a um suporte sólido tanto através de ab-sorção ou por ligações químicas - para facilitar a separação da enzima a par-tir da solução de reação. A imobilização também permite o uso múltiplo ourepetitivo das enzimas e quase sempre aumenta a estabilidade das enzimas.

Vários tipos de reatores são usados em conjunto com as enzi-mas imobilizadas: reatores de leito carregado (também referidos como reato-res de leito fixo), reatores de leito fluidificado, reatores de batelada agitada,reatores de tanque continuamente agitado, e reatores de membrana. Naprodução em grande escala, os reatores de leito carregado são comumenteusados para aplicações específicas. Em tais reatores, a enzima imobilizadaé embalada em uma coluna ou um leito plano enquanto correntes de subs-trato e de produto são bombeadas para dentro e para fora do reator, respec-tivamente. As vantagens principais deste tipo de reator são a adaptação fácila grandes escalas, alta eficiência, baixos custos, facilidade de operação etambém uma área de superfície aumentada por unidade de volume quandocomparado a reatores de sistemas de membrana (conforme W.M. Willis eA.G. Marangoni, Enzymatic Interesterification, em: Food Lipids - Chemistry,Nutrition, e Biotechnology, editado por CC. Akoh and D.B. Min, páginas 839a 875).

Um tipo de reação na qual o uso de enzimas como catalisadoresse tornou crescentemente importante, em anos recentes na indústria de ó-Ieos e de gorduras é a interesterificação. A interesterificação é a troca degrupos de acila entre um éster e um ácido (acidólise), um éster e um álcool(alcoólise) ou entre dois ésteres (trans esterificação). As enzimas capazesde reações de interesterificação são as lípases tais como as hidrolases doéster de glicerol (EC 3.1.1.3). Essas enzimas são obtidas predominantemen-te a partir de origens bacteriana, de levedura e de fungos. Esses micro-orga-nismos secretam a Iipase em seu ambiente para a digestão de materiais delipídio para a subsequente absorção. Em um ambiente aquoso a Iipase cata-lisa a hidrólise de triglicerídios para a produção de diaglicerídios, monoacil-glicerídios, glicerol e ácidos graxos livres. No entanto, sob condições de limi-tação de água, também pode ser conseguida a reação reversa, a síntese deésteres. Por esse motivo, a direção da reação pode ser manipulada atravésde regular a atividade da água. Em concentrações de água muito baixaspredomina a síntese de ésteres, acima de um conteúdo de água de mais doque uns poucos porcentuais a hidrólise é a reação que prevalece, e entreelas, usualmente em um conteúdo de água de menos do que 1% (p/v) atrans-esterificação é mais eficaz.

Owusu-Ansar descreveu em 1994 o uso de lípases imobilizadasem um reator de tanque agitado para a produção em grande escala de equi-valentes de manteiga de cacau através da interesterificação catalisada pelalipase (em: B.S. Carmail and Y. Kakuda (eds.) Technological Advances inImproved and Alternative Sources of Lipids, páginas 360 a 389).

Um processo de esterificação em leito carregado foi descrito noWO 83/03844 no qual triacilglicerídios são dissolvidos em um solvente polarorgânico. A Iipase foi imobilizada através de precipitação sobre partículas dekieselguhr, hidroxiapatita ou alumina.

O WO 97/01632 está direcionado a outro processo para a imobi-lização de uma enzima, especificamente, uma Iipase ou uma fosfolipase,para o processamento de óleos de triglicerídios.

A Unilever descreve também um processo em duas etapas paraa produção de equivalentes da manteiga de cacau e Betapol com a utiliza-ção de colunas de leito carregado ((P. Quinlan & S. Moore, Inform 4, 580-585 (1993); A. Rozendaal & A.R. Macrae, in: F.D. Gansdone & F.B. Padlee(eds.) Lipid Technologies and Applications, 1997, páginas 223 a 263).

X. Xu descreve outros processos com Iipases imobilizadas, entreos mesmos um reator de leito empacotado com uma capacidade de 10 kgpor dia (em U.T. Bornscheuer, Enzymes in Lipid Modiciation, 2000, páginas190 a 215).

Os reatores de leito carregado existentes sofrem de um proble-ma de uma diminuição na taxa de conversão com o correr do tempo. Embo-ra algumas enzimas tais como as Iipases são bastante estáveis, a eficácia dos mesmos cai com o passar do tempo, o que resulta em taxas de reaçãomais baixas e qualidade de produto não uniforme. Esse abaixamento daqualidade pode ser contra-atacado através da diminuição da velocidade defluxo aumentando PE meio disso o tempo de permanência dos reagentes noreator. Uma tal redução na velocidade de fluxo, no entanto, leva a uma taxa de produção não uniforme e embora ela possa reduzir as flutuações na qua-lidade do produto, ela não pode impedir as mesmas completamente. Alemdo mais, esse processo quase sempre usa uma quantidade de reatores se-parados em série o que requer um controle de fluxo complexo com a finali-dade de operar e manter o sistema. A presente invenção resolve esse e ou- tros problemas relacionados através da utilização de um novo tipo de pro-cesso de coluna de leito carregado para a modificação enzimática de umsubstrato.

Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se a um processo para a modifica- ção de um substrato que compreende a passagem do substrato através deuma coluna de leito carregado de um volume específico de enzima imobili-zada com um fluxo de substrato em uma direção e uma troca periódica daenzima imobilizada na direção oposta. O substrato entra na coluna no, oupróximo a uma das suas extremidades finais (a "extremidade de entrada") e o substrato modificado é descarregado no ou próximo a outra extremidade (a"extremidade de saída"). Uma parte do volume da enzima imobilizada é pe-riodicamente removida a partir da extremidade de entrada da coluna, en-quanto uma porção equivalente de enzima imobilizada é periodicamente adi-cionada na extremidade de saída, criando por meio disso um fluxo de enzi- ma imobilizada na direção oposta do fluxo do substrato.

Sempre que, neste pedido de patente, é feita referência a "pró-ximo à extremidade de entrada" ou "próximo à extremidade de saída", o ter-mo "próximo" é destinado a implicar que material (como por exemplo, subs-trato, substrato modificado, enzima imobilizada) é carregado ou é descarre-gado a partir do reator (através de uma aberturam válvula ou similar) dentrode uma distância razoável a partir da referida extremidade, como determina-do por uma pessoa versada na técnica. Essa pode ser, por exemplo, de 1 a5% ou 10% do comprimento de uma coluna medido a partir da extremidadereal da coluna referida. Ainda mais, expressões tais como "na extremidade"deve ser entendida como incluindo "na ou próximo a extremidade" quandousada com referência a coluna, a não ser que especificada de outra forma.

Descrição Detalhada da Invenção

A partir daqui, neste pedido de patente, os termos "substrato" e"solução de substrato" são usados como sinônimos para a descrição de umcomposto líquido ou uma mistura de compostos ou uma solução líquida deum composto ou de uma mistura de compostos, que estão destinados a rea-gir na presença da enzima imobilizada. Por meio disso, é produzido umcomposto líquido ou uma mistura de compostos, que é referida como "produ-to" ou "substrato modificado" sinonimamente.

A invenção se refere a um processo para a modificação enzimá-tica de um substrato através da passagem do substrato através de uma co-luna de leito carregado de enzima imobilizada. O substrato entra na colunade leito carregado na ou próximo a uma extremidade da coluna (a partir da-qui, neste pedido de patente referida como a "extremidade de entrada") epassa através da coluna na direção da outra extremidade (a partir daqui,neste pedido de patente referida como a "extremidade de saída"), onde osubstrato sai da coluna.

De preferência, a coluna é uma coluna vertical com a sua extre-midade de entrada no fundo e a sua extremidade de saída no topo da colu-na. Nessa modalidade, o substrato irá entrar no leito primeiro ou próximo àsua parte mais baixa e sair da coluna, ou próximo da sua parte mais alta.

Vantajosamente, as correntes do substrato e do substrato modi-ficado podem ser essencialmente contínuas. Isso significa que, enquanto ascorrentes do substrato e do substrato modificado possam ser paradas parapermitir a mudança periódica de uma parte do volume de enzima imobiliza-da, não é necessário um tempo de parada prolongado. Isso diferencia o pre-sente processo dos métodos existentes por meio dos quais períodos prolon-gados de parada são necessários entre outras coisas para a troca do volumetotal da enzima imobilizada. Isso não somente reduz os custos em si, porémtambém podem evitar as flutuações de custos.

De acordo com a presente invenção, somente uma parte defini-da da enzima imobilizada é periodicamente removida da coluna. Isso podeser conseguido, a título de ilustração somente, com o processo que se se-gue. O fluxo contínuo de substrato é parado, uma válvula de descarga naextremidade de entrada da coluna é aberta e uma parte definida da suspen-são que contém o material de enzima imobilizada a partir da extremidade dofundo da coluna é liberada. Depois que uma quantidade definida desta sus-pensão é descarregada, a válvula de descarga é fechada e uma válvula dealimentação é aberta, permitindo, dessa forma, a entrada de uma suspensãofresca do material de enzima imobilizado para o interior da coluna a partir dorecipiente de suprimento.

A suspensão de enzima imobilizada pode ser formada atravésda adição de uma quantidade definida do substrato modificado para o interi-or do recipiente de suprimento. Se necessário, para aumentar a misturaçãoe para melhorar o umidecimento dos poros da enzima imobilizada, o recipi-ente pode estar equipado com um dispositivo de agitação e/ou pode ser ope-rado sob vácuo. Quando uma carga fresca de enzima está para ser adicio-nada ao reator, o recipiente de suprimento pode ser desaerado e a suspen-são, ou uma parte da mesma, esvaziada para o interior da coluna. A válvulade alimentação e em seguida fechada permitindo que a suspensão fresca seassente na extremidade do leito carregado. Finalmente, as válvulas que re-gulam as correntes do substrato e do produto são reabertas.

O reator pode ser operado sob vácuo. No entanto, e de prefe-rência, ele será operado sob uma pressão determinada ("pressão de proje-to"). A pressão de projeto deve ser escolhida para permitir uma queda má-xima da pressão sobre todo o comprimento da coluna. A queda da pressãoirá depender das características das partículas da enzima imobilizada (comopor exemplo, a distribuição do tamanho de partícula), a velocidade do fluxodo substrato e a altura do leito. Somente a título de exemplo, uma pressãode projeto adequada em um leito de enzima relativamente alto e com umavelocidade de fluxo de substrato relativamente alta pode ser de cerca de 1MPa (10 Bar). Com uma altura de leito mais baixa e uma velocidade de fluxomais lenta, aquele valor pode ser mais aproximado de 0,6 MPa (6 Bar). Apressão de projeto apropriada para qualquer determinado reator poderá serdeterminada com facilidade por uma pessoa versada na técnica.

Para assegurar que a pressão de projeto não seja excedida pelapressão de alimentação, as bombas de alimentação não devem ter uma ca-pacidade acima da pressão de projeto. Além disso, as estradas do reatordevem ser equipadas com válvulas de não-retorno, válvulas de fechamentoe abertura e dispositivos de controle da taxa de fluxo.

De forma ideal, a descarga da enzima gasta e a adição da enzi-ma fresca irão ocorrer ao mesmo tempo ou substancialmente ao mesmotempo. Por isso, é significado que a descarga e a adição devem der execu-tadas durante o mesmo tempo de parada, Também é de preferência quesubstancialmente a mesma quantidade de material de enzima seja descar-regado como a que é adicionada, assegurando dessa forma que o reatormantenha as suas características de leito carregado. Pode ocorrer uma ex-ceção a ambas essas regras, por exemplo, depois da partida inicial do reatordevido a uma determinada quantidade de compactação na coluna. Pode porcerto ser necessário nessa situação, a adição de um pouco mais de suspen-são do que for descarregada ou mesmo a adição de suspensão sem qual-quer descarga.

Através da repetição dessa troca de uma parte do material doleito, é assegurado um fluxo gradual da enzima imobilizada a partir do topopara o fundo da coluna. Por conseqüência, a solução de substrato irá primei-ro entrar em contato com a maioria do matéria de enzima já exaurido e nofinal com a enzima mais fresca.

De forma vantajosa, a mudança periódica de uma parte da en-zima imobilizada pode ser grandemente automatizada, limitando dessa for-ma o envolvimento do operador, reduzindo os custos associados e restrin-gindo a probabilidade de quaisquer maus funcionamentos.

Este sistema pode ser comparado com múltiplos reatores pe-quenos básicos separados em série. Em comparação a essa série, a com-plexidade da presente invenção é grandemente reduzida, especificamente aquantidade de válvulas de entrada e de saída. Além do mais, a solução pro-cessada não terá que ser transportada entre os múltiplos reatores. Isso éespecificamente importante quando a solução do substrato e/ou do produtotem que ser mantida em uma temperatura determinada ou quando elas têmuma alta viscosidade. Além disso, um sistema de pequenos reatores requerque um ou mais dos reatores esteja periodicamente fora de serviço enquan-to a enzima gasta é removida e a enzima fresca é adicionada. Essa é umaoperação manual intensa e durante esse tempo a eficiência de todo o siste-ma é grandemente reduzida. Por conseqüência, os custos totais de capital ede operação com relação a esse sistema não são os ideais. O que é mais, osistema da presente invenção irá permitir uma gradação quase infinita daatividade da enzima a partir da enzima fresca para a enzima gasta. Isso nãopode ser conseguido mesmo com um grande número de reatores separa-dos.

O processo da invenção permite uma taxa de fluxo contínua namedida em que, basicamente todo o substrato encontra a mesma quantida-de de atividade da enzima durante a passagem do mesmo através do reator.Na medida em que a atividade da enzima imobilizada varia com a idade ecom o uso, o contato uniforme do substrato com a enzima nas diversas eta-pas de atividade é decisivo para assegurar uma qualidade de produto maisconstante. Por esse motivo, pode ser aplicada uma taxa de fluxo constante.

A freqüência com a qual o material de enzima é substituído irádepender, entre outras coisas, da redução da taxa de atividade da enzimacom o passar do tempo e do tempo de permanência desejado da solução desubstrato no leito carregado de enzima. O volume do material de enzimatrocado e a duração dos intervalos entre essas trocas podem ser adaptadoscom facilidade às necessidades do processo e/ou do substrato. Além disso,irá existir uma relação entre a freqüência com a qual a enzima é refrescadae o volume de enzima que é refrescado. Com todas as outras variáveis doprocesso permanecendo constantes, uma pequena quantidade de enzimapode ser refrescada com freqüência ou uma grande quantidade de enzimaser refrescada com menos freqüência. De preferência, uma porcentagemfixa de todo o volume da coluna será refrescada em uma base diária. Demodo ideal, a percentagem será de menos do que 35% do volume total daenzima imobilizada. De preferência, ela será de menos do que 25%, de maispreferência de menos do que 10%, ainda de mais preferência de menos doque 5%. De acordo com uma modalidade possível, entre cerca de 0,3% ecerca de 3% do volume total da enzima imobilizada será refrescada em umabase diária.

Depois de passar através da coluna de leito carregado de enzi-ma imobilizada, deve ser alcançada uma conversão suficiente do substrato.No topo da coluna, a saída do produto pode ser facilitada através de peque-nas telas de filtro de conformação cilíndrica. Essas telas regulam o fluxo desaída do produto enquanto o material de enzima imobilizado é mantido nointerior do reator. Existem dois tipos de telas: telas de saída para o ar e te-las-padrão. Embora as telas padronizadas sejam usadas para o fluxo princi-pal do produto, as telas de saída para o ar ficam mais altas na coluna e faci-litam o fluxo de ar ou de gás durante a drenagem e o reenchimento.

As bombas que regulam a entrada e a saída das suspensões domaterial de enzima devem ser projetadas de tal forma que elas não rompama enzima imobilizada criando finos adicionais. Isso irá auxiliar um fluxo uni-forme e impedir que os finos passem através dos dispositivos de filtragemsubsequentes.

A enzima descarregada será uma suspensão de enzima imobili-zada usada (ou "gasta") e uma solução do substrato. Essa suspensão podeser separada e a solução do substrato pode ser reintroduzida para o interiordo tanque que proporciona a entrada do substrato para a coluna de reação.A enzima usada pode ser descartada. No entanto, e de preferência, ela seráprocessada para uso posterior.

A enzima removida a partir da coluna pode por certo ser subme-tida à reciclagem. Por exemplo, em alguns casos a enzima removida a partirda coluna ainda tem alguma atividade residual, que pode ser acessada se omaterial imobilizado for quebrado em partículas menores, revelando pormeio disso sítios ativos da enzima que não estavam anteriormente totalmen-te ou quase restritamente acessíveis ao substrato (isso é conhecido como"reativação"). De forma alternativa, a enzima pode ser regenerada e reutili-zada. Desse modo, em uma modalidade de preferência do processo de a-cordo com a invenção, o material de enzima descarregado a partir da colunaé regenerado ou reativado e reutilizado, por exemplo, para o pré-tratamentodo substrato antes da entrada do mesmo na coluna ou sendo adicionada aotanque que supre a entrada de enzima imobilizada. Ela também pode serreutilizada em outros sistemas como modificação por batelada.

O processo da presente invenção pode ser operado em umaúnica coluna ou através da passagem através de duas ou mais colunas deenzima imobilizada dispostas em paralelo. A expressão "enzima imobilizada"toma o seu significado normal na técnica, isto é, aquele de uma enzima queestá fisicamente fixada a um suporte sólido. Os suportes de preferência in-cluem os suportes de sílica e de resina. A enzima imobilizada pode estarpresente na forma de grânulos, partículas aglomeradas ou qualquer outraforma considerada adequada por uma pessoa versada na técnica.

A escolha da enzima irá depender, por certo, do tipo de reação aser executada, isto é, da natureza do substrato e da sua modificação dese-jada. Ela pode ser qualquer oxirredutase, trasnferase, hidrolase, lisase, iso-merase ou Iigase disponível na técnica. A título de ilustração, as hidrolasesadequadas podem incluir as hidrolases de éster carboxílico (EC-3.3.3) taiscomo esterases de carboxila, Iipases de triglicerol, fosfolipase A2, esterasesde esterol, Iipases de acilglicerol, fosfolipase A1, e hidrolases de éster decera; e hidrolases de diéster fosfóricos (EC-3.1.4), tais como a fosfolipase Ce a fosfolipase D. Essas enzimas podem ser usadas, por exemplo, para ca-talisar a hidrólise, alcoólise ou a conversão reversa correspondente (con-densação). Outras enzimas adequadas serão do conhecimento da pessoaversada na técnica, dependendo da modificação específica a ser executada.

O substrato será qualquer material ou substância capaz de seratuado através de uma enzima. Ele pode incluir, por exemplo, um ou maislipidios, uma ou mais proteínas, um ou mais carboidratos ou uma misturados mesmos. O Termo "lipídio" na forma usada aqui, neste pedido de paten-te, se refere não somente aos óleos em bruto ou processados e as fraçõesdos mesmos, porém também aos triaglicerídios, diaglicerídios, monoacilgli-cerídios, fosfolipídios, ácidos graxos livres, ésteres de ácidos graxos e asmisturas dos mesmos. O Termo "proteína" pode se referir, entre outras, aambos os polipeptídios complexos e simples, estejam eles no estado de do-brados ou desnaturados, a seqüências curtas de peptídios e amino ácidosisolados. O termo "carboidrato" se refere, por exemplo, a unidades isoladasde monossacarídios, dissacaridios, oligossacarídios e polissacarídios taiscomo amido, celulose e assim por diante. O substrato pode estar misturadocom outros reagentes (tais como um álcool ou água), ou com um solvente senecessário. Se desejado, o substrato pode ser refinado antes de ser introdu-zido na coluna. O refino se refere à remoção das impurezas tais como osresíduos e produtos secundários e irá contribuir para prolongar a duraçãodas enzimas imobilizadas.

Como declarado acima, o processo da presente invenção podeser usado para a execução de qualquer tipo de reação enzimática. Não obs-tante, uma quantidade de modalidades possíveis irá ser descrita a seguir emmaior detalhe a título de ilustração. Essas modalidades não devem ser inter-pretadas de qualquer modo como limitando o âmbito da invenção. Ao contrá-rio, as suas informações devem ser entendidas, quando apropriado, para aaplicação da invenção como um todo.Interesterificação.

Esta modalidade diz respeito à interesterificação de óleos. A in-teresterificação muda o perfil de acil-glicerol do óleo ou da mistura de óleospor meio da modificação das propriedades físicas do mesmo.

De acordo com esta modalidade, a enzima de escolha é umalipase. Ela irá ser imobilizada de forma ideal sobre um suporte de sílica. Umaenzima imobilizada adequada é a Iipase Lypozyme TL IM da Novozymes.

O substrato que pode ser usado em um estado refinado ou nãorefinado dependendo das exigências, irá compreender tipicamente um glice- rídio de acila tal como um triacilglicerídio, um diacilglicerídio, um monoacilgli-cerídio ou uma mistura de dois ou mais dos mesmos. Ele pode ser derivadoa partir de uma origem vegetal, animal, peixe, algas ou células simples. Depreferência, ele será derivado a partir de uma origem vegetal. Os substratosadequados, por esse motivo, irão incluir, porém não estão limitados a, óleode babaçu, óleo de palma, óleo de coco, óleo de oliva, óleo se sementes decolza, óleo de canola, óleo se sementes de linho, óleo de amendoim, óleo desoja, óleo de sementes de algodão, óleo de sementes de girassol, óleo desementes de abóbora, óleo de milho, óleo de mamona e misturas de dois oumais dos mesmos. O substrato pode incluir óleos totais e/ou frações de óleotais como as estearinas ou oleínas.

De acordo com uma modalidade, o substrato será composto porestearina de palma, óleo de coco, óleo de babaçu, ou uma mistura de doisou mais dos mesmos. De preferência o substrato irá compreender uma mis-tura de estearina de palma mais óleo de coco ou uma mistura de estearina de palma mais óleo de babaçu. Ainda de mais preferência, a mistura irá in-cluir de 50 a 80% em peso de estearina de palma e de 50 a 20% em peso deóleo de coco e/ou óleo de babaçu, com base no peso total do substrato. Demodo ideal, a mistura irá incluir de 65 a 75% em peso de estearina de palmae de 35 a 25% em peso de óleo de coco ou de 60 a 70% em peso de estea- rina de palma e de 40 a 30% em peso de óleo de babaçu. De acordo comuma modalidade de maior preferência, o substrato da presente invenção iráconsistir nessa mistura.

O substrato será bombeado através da uma ou mais colunas emparalelo cheias com a enzima imobilizada. O substrato e o material de enzi- ma imobilizada irão fluir em direções opostas com a entrada do óleo na oupróximo ao fundo da coluna e o material de enzima fresca sendo adicionadono ou próximo ao topo da coluna. Periodicamente, uma parte da enzima i-mobilizada Será trocada com material de enzima fresca. Por esse motivo, aenzima na coluna deverá ter um perfil de qualidade quase constante. A en-zima imobilizada no topo da coluna será em sua maioria fresca com aproxi-madamente atividade total e a enzima imobilizada próxima do fundo da colu-na estará aproximadamente exaurida de atividade. Por conseqüência, have-rá uma gradação de atividade ao longo do comprimento da coluna.

A reação de interesterificação seve ser executada em uma tem-peratura definida. Esta temperatura será escolhida com uma quantidade defatores em consideração:

- como a maioria dos óleos e gorduras inter esterificadas produ-zidas de acordo com este processo serão destinadas para produtos nutricio-nais, o processo será de preferência isento de solventes orgânicos. Comotal, o processo deve ser executado em uma temperatura que garanta de osóleos ou as gorduras permaneçam em um estado líquido;

- a temperatura deve ser alta o bastante para permitir uma altataxa de reação que, por sua vez, irá permitir tempos de permanência maiscurtos;

- a temperatura deve ser baixa o bastante para não afetar a es-tabilidade e a atividade da enzima. As Iipases microbianas são um tanto es-táveis à temperatura e a imobilização foi considerada como aumentando a-inda mais a estabilidade dessas enzimas de tal modo que as temperaturaspara muitas das Iipases varia a partir de 30°C até 62°C ((W.M. Willis andA.G. Marangoni, em Enzymatic lnteresterification, Food Lipids - Chemistry,Nutrition, and Biotechnology, editado por CC. Akoh and D.B. Min). AlgumasIipases permitem ainda temperaturas de 60°C até 75°C (WO 97/01632). Odesenvolvimento futuro das enzimas poderá incluir ainda variedades maisresistentes à temperatura, como por exemplo, resistentes a 80°C, 90°C,100°C ou acima. Nessas temperaturas, a maioria dos triacilglicerídios, mes-mo os totalmente saturados, irão estar em um estado líquido.

Levando esses fatores em conta, a pessoa versada na técnicaserá capaz de determinar a temperatura ideal para a reação.

A título de exemplo, a interesterificação da estearina de palmacom óleo de coco pela Lypozyme TL IM (Novozymes) será executada, depreferência, a cerca de 70°C.

Depois do aquecimento dos óleos para a temperatura desejadae mistura, se necessária, eles são direcionados para a válvula de entrada oupara próximo da extremidade de entrada do reator. O reator será de prefe-rência projetado para operar sob vácuo e até uma pressão adequada.

A enzima imobilizada fresca é suprida no topo da coluna em in-tervalos regulares. Uma quantidade definida de produto de óleo interesterifi-cado pode ser bombeada para dentro do recipiente de suprimento e mistu-rada com a enzima imobilizada para a produção de uma suspensão de fluxolivre. Para aumentar a misturação e melhorar a umidificação dos poros daenzima imobilizada, pode ser aplicado um vácuo para impedir a oxidação doóleo.

Quando uma carga fresca de enzima for para ser adicionada àcoluna, o recipiente de suprimento é des-aerado, se aplicável, e a suspen-são ou uma parte da mesma é esvaziada para dentro do reator. Se necessá-rio, o recipiente e as tubulações podem ser descarregados com um determi-nado volume do produto de óleo para assegurar o esvaziamento completodo recipiente. De preferência, o recipiente de suprimento estará situado aci-ma do reator para facilitar o carregamento da enzima.

O processo desta modalidade será de preferência essencialmen-te contínuo. A única parada será os poucos momentos que duram para atroca de uma parte da enzima a partir da coluna. Essa parada é somenteuma fração muito pequena do tempo total de operação do processo.Alcoólise

A não ser que declarado de outra forma, os detalhes desta mo-dalidade são os mesmos como os da reação de interesterificação descritosacima.

O substrato será uma mistura adequadamente agitada de um oumais óleos e um ou mais alcoóis. Os alcoóis adequados incluem porem nãoestão limitados a metanol, etanol, glicerol, monopropileno glicol, etileno gli-col, butano diol, eritritol, pentaeritritol, sorbitol, esteróis, estanóis, tocoferóis,polifenóis, ésteres de tais alcoóis e as misturas de dois ou mais dos mes-mos. A enzima imobilizada será de preferência a lipase.

A reação será executada de preferência a 50 a 70°C. Depois deserem recolhidos na saída do reator, os produtos (ésteres de ácidos graxose glicerol) podem ser isolados. O isolamento pode ser executado através deresfriamento para uma temperatura na qual a separação de fases ocorraseguida pelo isolamento da fase de éster do ácido graxo e uma etapa desecagem. O álcool pode ser recuperado através de evaporação diretamentea partir da mistura ou depois do isolamento dos ésteres do ácido graxo.

Glicerólise

A glicerólise é um tipo específico de alcoólise, como descrita a-cima. O substrato é uma mistura de um ou mais óleos e glicerol. A enzima éuma lipase imobilizada sobre um veículo que seja inerte contra o glicerol.

O substrato é preparado através da mistura ou da dissolução doglicerol dentro do óleo ou dos óleos na temperatura de reação ou ligeiramen-te acima. A quantidade de glicerol misturado com o óleo pode ser aumenta-da através da adição de um emulsificante. Dependendo da proporção deglicerol-óleo, a enzima mais próxima à extremidade de entrada do reator iráatuar tanto como um purificador do substrato como para ajustar a concentra-ção de equilíbrio do glicerol no substrato.

A reação será executada de preferência a 50 a 70°C. O produtorecuperado depois da modificação irá depender da proporção de glicerol pa-ra o óleo no substrato.

Hidrólise

Nesta modalidade - que se segue a modalidade de interesterifi-cação descrita acima, a não ser que indicado ao contrário - o substrato éuma Iecitina ou uma solução de Iecitina que possa ser bombeada. Uma so-lução de Iecitina pode ser obtida através da mistura de Iecitina com um sol-vente tal como hexano e água.

A enzima será uma lipase ou uma fosfolipase. Dependendo daenzima, podem ser obtidos produtos diferentes. Desse modo, se for usadauma lipase, o produto será uma mistura de fosfolipídios e mono- e/ou di-glicerídios. Com a utilização de uma fosfolipase A ou B, em uma temperaturade reação de preferência de 20 a 70°C, irá levar a produção de lisofosfolipí-dios. Com a utilização da fosfolipase C1 em uma temperatura de reação depreferência de 20 a 50°C, irá levar a produção de di- e/ou triglicerídios. Coma utilização da fosfolipase D, em uma temperatura de reação de preferênciade 20 a 70°C, irá levar a produção de ácido fosfatídico. Se necessário, podeser usada uma mistura de enzimas diferentes para ser obtido o produto de-sejado.

Depois da conversão as misturas de produtos podem ser usadascomo estão ou depois de processos de purificação adicionais (como por e-xemplo, lavagem, secagem, evaporação, fracionamento, etc.).Isomerização

Outra reação possível que pode ser executada de acordo com oprocesso da presente invenção é a isomerização. Um exemplo típico de i-somerização é a conversão da glicose para frutose. Desse modo, de acordocom uma modalidade, o substrato será de preferência a glicose (ou um xa-rope de glicose) e a enzima imobilizada será de preferência uma isomerasede glicose (EC 5.3.1.5). A reação deve ser executada idealmente entre 55 a75°C. O produto será um xarope que contém ambas a glicose e a frutose. Sedesejado, o conteúdo de frutose pode ser ainda aumentado através de puri-ficação ou pela divisão da glicose e da frutose em produtos separados.

Claims (23)

1. Processo para a modificação de um substrato que compreen-de a passagem do substrato através de uma coluna de leito carregado deum volume específico de enzima imobilizada, em que:(a) o substrato entra na coluna na, ou próximo a uma extremida-de da coluna (a "extremidade de entrada") e o substrato modificado sai naou próximo a extremidade oposta da coluna (a "extremidade de saída"),(b) uma parte do volume da enzima imobilizada é periodicamen-te removida na ou próximo a extremidade de entrada da coluna, e(c) uma parte da enzima imobilizada é periodicamente adiciona-da na ou próximo a extremidade de saída da coluna.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a coluna ésubstancialmente vertical com a sua extremidade de entrada, ou próxima dofundo da coluna e a sua extremidade de saída, ou próxima do topo da colu-na.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação-2, em que o processo é essencialmente um processo contínuo.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, em que a parte da enzima imobilizada que é removida a partirda coluna é de menos do que 35% do volume total.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, em que a parte da enzima imobilizada que é removida a partirda coluna é substancialmente equivalente em volume a parte da enzima i-mobilizada que é adicionada.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, em que as etapas de remoção da enzima imobilizada a partirda e a adição da enzima imobilizada para a coluna ocorre substancialmentede modo concorrente.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, em que a parte removida da enzima imobilizada é usada parao pré-tratamento do substrato antes que ele entre na coluna.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que a parteremovida da enzima imobilizada é regenerada ou reativada antes de ser u-sada para o pré-tratamento do substrato.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, em que a modificação é uma condensação ou inclui etapas decondensação.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 8, em que no qual a modificação é uma interesterificação.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 8, em que no qual a modificação é uma isomerização.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 10, em que a enzima é uma hidrolase.

13. Processo de acordo com a reivindicação 12, em que a enzi-ma é uma Iipase ou uma enzima de modificação de lipídio e o substratocompreende um ou mais óleos em bruto, um ou mais óleos processados ouuma mistura dos mesmos.

14. Processo de acordo com a reivindicação 12, em que o subs-trato compreende um ou mais triacilglicerídios, diacilglicerídios, monoacilgli-cerídios, fosfolipídios, ácidos graxos livres, ésteres de ácidos graxos ou asmisturas de dois ou mais dos mesmos.

15. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que o subs-trato ainda compreende um álcool.

16. Processo de acordo com a reivindicação 15, em que o álcoolé selecionado a partir de: metanol, etanol, glicerol, monopropileno glicol, eti-leno glicol, butano diol, eritritol, pentaeritritol, sorbitol, esteróis, estanóis, to-coferóis, polifenóis, ésteres de tais alcoóis e as misturas de dois ou mais dosmesmos.

17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações-14 a 16, em que o substrato também compreende água.

18. Processo de acordo com a reivindicação 13, em que o subs-trato compreende um ou mais óleos com base em plantas ou frações de ó-leos com base em plantas.

19. Processo de acordo com a reivindicação 18, em que o subs-trato compreende estearina de palma, óleo de coco, óleo de babaçu ou umamistura de dois ou mais dos mesmos.

20. Processo de acordo com a reivindicação 19, em que o subs-trato compreende de 50% a 80% em peso de estearina de palma e de 50% a-20% em peso de óleo de coco.

21. Processo de acordo com a reivindicação 20, em que o subs-trato compreende de 65 a 75% em peso de estearina de palma e de 35 a-35% em peso de óleo de coco.

22. Processo de acordo com a reivindicação 19, em que o subs-trato compreende de 50% a 80% em peso de estearina de palma e de 50% a-20% em peso de óleo de babaçu.

23. Processo de acordo com a reivindicação 22, em que o subs-trato compreende de 60% a 70% em peso de estearina de palma e de 40% a-30% em peso de óleo de babaçu.