BRPI0709829A2

BRPI0709829A2 - composiÇço lÍquida que compreende uma protease aspÁrtica

Info

Publication number: BRPI0709829A2
Application number: BRPI0709829-4A
Authority: BR
Inventors: Andre De Haan; Mylene Causette; Margot Elisabeth Francoise Schooneveld-Bergmans
Original assignee: Dsm Ip Assets Bv
Priority date: 2006-04-13
Filing date: 2007-04-12
Publication date: 2011-07-26
Also published as: MX2008013182A; WO2007118838A1; ES2478872T3; EA025412B1; EP2333056B1; NZ571699A; JP2009533036A; JP5557242B2; PL2333056T3; EP2333056A1; DK2333056T3; CN101421397A; US20100009033A1; EP2004820A1; EA200802140A1

Abstract

COMPOSIÇçO LÍQUIDA QUE COMPREENDE UMA PROTEASE ASPARTICA A presente invenção fornece uma composição líquida compreendendo: (i) uma protease aspártica; e (ii) um sal inorgânico e/ou poliálcool, onde a composição: a concentração total de sorbato, benzoato e alquil ésteres de para-hidroxibenzoato é menor do que 0,010 mol/l; a contagem de placa padrão <243> 100 em 1 ml; a contagem de levedura <243>10 em ml; e a contagem de bolores 10 em 1 ml. A composição pode ser utilizada como coagulante na produção de queijo.

Description

COMPOSIÇÃO LÍQUIDA QUE COMPREENDE UMA PROTEASE ASPÁRTICADescrição da invenção

A presente invenção refere-se a uma composição liquidacompreendendo uma protease aspártica.

É bem sabido que a preparação de queijo envolve o usode uma protease aspártica. A protease aspártica faz com queo leite coagule, resultando em um coalho sólido que éadicionalmente processado em queijo.

Proteases aspárticas podem ser recuperadas a partir deanimais, por exemplo, a partir do estômago de vitelo,camelo e foca. Também podem ser produzidas pormicrorganismos, por exemplo, Rhizomucor, Cryphonectria, oucepas hospedeiras como Aspergillus ou Kluyveromyces.

Na indústria de fabricação de queijo, composiçõeslíquidas compreendendo a protease aspártica sãofreqüentemente utilizadas. Tais composições líquidascontêm, tipicamente, certos aditivos para obter umaestabilidade desejada. Pode-se distinguir entreestabilidade enzimática e estabilidade microbiana. Aestabilidade enzimática é uma medida para a taxa na qual aatividade da enzima diminui. A estabilidade microbiana éuma medida para a taxa na qual os microrganismos podemproliferar e crescer na composição.

As propriedades microbianas de uma composição podemser expressas pela contagem de placa padrão, número deleveduras e número de fungos utilizando procedimentospadrão bem definidos. Por exemplo, a contagem de placapadrão pode ser ≤ 100 em 1 ml, a contagem de levedura podeser ≤ 10 em 1 ml, e a contagem de bolores pode ser ≤ 10 em1 ml. Como as composições são freqüentemente armazenadasantes do uso, é desejável que a contagem de placa, númerode leveduras e número de fungos permaneça abaixo de certosvalores de limite, por exemplo, os valores mencionadosacima, por um período prolongado, por exemplo, por umperíodo de pelo menos 3 meses.

É bem conhecido o uso de sorbato ou benzoato comoconservante para obter uma estabilidade microbianadesejada. Parabéns (alquil ésteres de para-hidroxibenzoato)também podem ser utilizados.

Por exemplo, a US-A-3763010 revela uma composição quecompreende uma protease aspártica, e sorbato de potássio ebenzoato de sódio. WO-A-9015865 e WO-A-9529999 revelam quebenzoato de sódio é utilizado em composições contendo umaprotease aspártica. Composições comerciais compreendendouma protease aspártica e entre 3 e 5 g/l (entre 0,02 e0,035 mol/1) de benzoato de sódio são conhecidas.

Entretanto, há um desejo por produtos que nãocontenham ou contenham quantidades menores de sorbatos,benzoatos e parabéns.

O objetivo da invenção é fornecer uma composição quetenha boa estabilidade microbiana na ausência de sorbatos,benzoatos e parabéns.

A invenção provê composições que podem ter umaestabilidade microbiana surpreendentemente elevada, mesmona ausência desses compostos ou na presença dessescompostos em quantidades menores do que as conhecidas noestado da técnica. Além disso, as composições podem ter umaestabilidade enzimática surpreendentemente elevada. Ascomposições, de acordo com a invenção, podem ter uma vidade armazenagem mais longa do que esperado.De acordo com um primeiro aspecto da invenção, éfornecida uma composição liquida que compreende (i) umaprotease aspártica; e (ii) um sal inorgânico e/oupoliálcool, em cuja composição:

A concentração total de sorbato, benzoato e alquilésteres de para-hidroxibenzoato é menor do que 0,010 mol/l;A contagem de placa padrão ≤ 100 em 1 ml;A contagem de levedura ≤ 10 em ml; eA contagem de bolores ≤ 10 em 1 ml.

Será entendido que ácido sórbico bem como sais deácido sórbico contribuem para a concentração de sorbato.Ácido benzóico bem como sais de ácido benzóico contribuempara a concentração de benzoato. Alquil ésteres de para-hidroxibenzoato podem ou não estar na forma de um sal. Porconseguinte, como utilizado aqui, a concentração total desorbato, benzoato e alquil ésteres de para-hidroxibenzoatose refere à concentração total de ácido sórbico, sais deácido sórbico, ácido benzóico, sais de ácido benzóico,alquil ésteres de para-hidroxibenzoato e sais de alquilésteres de para-hidroxibenzoato na composição. Os exemplosde sais de ácido sórbico são sorbato de sódio, sorbato depotássio, e sorbato de cálcio. Os exemplos de sais de ácidobenzóico são benzoato de sódio, benzoato de potássio ebenzoato de cálcio. Os exemplos de alquil ésteres de para-hidroxibenzoatos são metil-p-hidroxibenzoato, etil-p-hidroxibenzoato e propil-p-hidroxibenzoato. Os exemplos desais de alquil ésteres de para-hidroxibenzoatos são sal desódio de metil-p-hidroxibenzoato, o sal de sódio de etil-p-hidroxibenzoato e o sal de sódio de propil-p-hidroxibenzoato.Como utilizado aqui, a contagem de placa padrão édeterminada de acordo com ISO 4833:1991 (E) (Microbiology -General guidance for the enumeration of micro-organisms -Colony count technique at 30°C).

A contagem de levedura é determinada de acordo com ISO7954: 1987 (E) (Microbiology - General guidance forenumeration of yeasts and moulds - Colony count techniqueat 25°C) .

A contagem de bolores é determinada de acordo com ISO7954: 1987 (E) (Microbiology - General Guidance forenumeration of yeasts and moulds - Colony count techniqueat 25°C) .

De acordo com um segundo aspecto da invenção, éfornecida uma composição líquida, que compreende umaprotease aspártica e um composto selecionado entre formato,acetato, lactato, propionato, malato ou fumarato. Essescompostos podem contribuir para a estabilidade microbiana.Será entendido que esses compostos são os ânions dos ácidosorgânicos correspondentes (ácido fórmico, ácido acético,ácido láctico, ácido propiônico ácido málico e ácidofumárico), e que esses compostos podem ser suplementadospara a composição como o ácido orgânico ou o sal do mesmo.O sal pode, por exemplo, ser um sal de potássio, um sal desódio ou um sal de cálcio.

O ácido orgânico e/ou sal do mesmo pode ser empregadoem qualquer concentração apropriada. Em uma modalidadepreferida, a concentração de formato, acetato, lactato,propionato, malato ou fumarato ou combinação dos mesmos nacomposição é pelo menos 0,02 mol/1, por exemplo, pelo menos0,05 mols/1, por exemplo, pelo menos 0,1 mols/1, porexemplo, pelo menos 0,2 mols/1. Será entendido que épossível que pelo menos um desses compostos esteja presenteem uma concentração preferida como definido aqui. Também épossível que uma combinação de dois ou mais dessescompostos esteja presente em uma concentração preferidacomo definido aqui. Se uma combinação for empregada, aconcentração se refere à concentração total dessescompostos. Não há limite superior específico para aconcentração. A concentração de formato, acetato, Iactato,propionato, malato ou fumarato ou combinação dos mesmospode ser menor do que 2 mols/1, por exemplo, menor do que 1mol/1.

Em uma modalidade preferida, a composição compreendeacetato. Preferivelmente, a composição compreende pelomenos 0,02 mols/1 de acetato, por exemplo, pelo menos 0,05mols/1, por exemplo, pelo menos 0,1 mols/1, por exemplo,pelo menos 0,2 mols/1 de acetato. Não há limite superiorespecífico para a concentração de acetato. A composiçãopode, por exemplo, compreender menos de 2 mols/1, porexemplo, menos de 1 mol/1 de acetato.

De acordo com um terceiro aspecto da invenção, éfornecida uma composição líquida que compreende (i) umaprotease aspártica; (ii) um sal inorgânico, e (iii) umpoliálcool.

De acordo com um quarto aspecto da invenção, éfornecida uma composição líquida que compreende umaprotease aspártica e um sal inorgânico, em cuja composiçãoa concentração de sal inorgânico é menor do que 180 g/l,preferivelmente menor do que 17 0 g/l, mais preferivelmentemenor do que 160 g/l. Será entendido que a composição podeconter um ou mais sais inorgânicos. Os valores para oslimites superiores preferidos da concentração de salinorgânico se referem à concentração total dos saisinorgânicos na composição.

De acordo com um quinto aspecto da invenção, éfornecida uma composição líquida que compreende umaprotease aspártica e um poliálcool, onde a composição temuma atividade de água menor do que 0,83, por exemplo, menordo que 0,80.

De acordo com um sexto aspecto da invenção, éfornecida uma composição líquida que compreende umaprotease aspártica e glicerol.

De acordo com um sétimo aspecto da invenção, éfornecida uma composição líquida que compreende umaprotease aspártica, onde a composição tem uma atividade deágua de pelo menos 0,80, por exemplo, pelo menos 0,85.

De acordo com um oitavo aspecto da invenção, éfornecida uma composição líquida que compreende umaprotease aspártica, onde a composição tem um pH entre 4 e7.

De acordo com um nono aspecto da invenção, é fornecidoum processo para preparar uma composição líquidacompreendendo uma protease aspártica, o processocompreendendo:

a) fornecer um caldo de fermentação, o caldo defermentação contendo (i) microrganismos que produziram aprotease e (ii) sobrenadante contendo a protease;

b) separar, por separação sólido-líquido, osobrenadante a partir do caldo de fermentação;

c) purificar o sobrenadante separado, para obter umasolução purificada;

d) opcionalmente adicionar um ou mais aditivos àsolução purificada, onde pelo menos um de um ou maisaditivos é um sal inorgânico, um poliálcool, ou um compostoselecionado entre formato, acetato, lactato, propionato,malato ou fumarato; e

e) filtrar a solução purificada, opcionalmentecontendo um ou mais aditivos.

De acordo com um décimo aspecto da invenção, éfornecida uma composição que pode ser obtida pelo processode acordo com o nono aspecto.

Modalidades preferidas serão descritas a seguir, e sãoaplicáveis à invenção em todos os seus aspectos. Seráadicionalmente apreciado que a presente invenção incluiainda qualquer combinação dos vários aspectos da invençãoe/ou características preferidas.

De acordo com a invenção o uso de benzoato, sorbato oupara-hidroxibenzoato não é necessário ou benzoato, sorbatoou para-hidroxibenzoato pode ser utilizado em quantidadesmenores. Em uma modalidade preferida, a composição deacordo com a invenção compreende menos de 0,010 mol/1 debenzoato, preferivelmente menos de 0,005 mol/1,preferivelmente menos de 0,002 mol/1, preferivelmente menosde 0,001 mol/1, preferivelmente menos de 0,0005 mol/1,preferivelmente menos de 0,0001 mol/1, preferivelmentemenos de 0,00005 mol/1, preferivelmente menos de 0,00001mol/1, preferivelmente nenhuma quantidade detectável. Emuma modalidade preferida adicional, a concentração total desorbato, benzoato e alquil ésteres de para-hidroxibenzoatosna composição, de acordo com a invenção, é menor do que0,010 mol/1, preferivelmente menor do que 0,0005 mol/1,preferivelmente menor do que 0,002 mol/1, preferivelmentemenor do que 0,001 mol/1, preferivelmente menor do que0,0005 mol/1, preferivelmente menor do que 0,0001 mol/1,preferivelmente menor do que 0,00005 mol/1, preferivelmentemenor do que 0,00001 mol/1, preferivelmente nenhumaquantidade detectável. É sabido que benzoato, sorbato epara-hidroxibenzoato podem ser utilizados para matar osmicrorganismos após fermentação. Por conseguinte,quantidades pequenas desses compostos podem estar presentesna composição resultando dessa etapa de extermínio.

Em outra modalidade da invenção, a concentração totalde conservantes na composição de acordo com a invenção émenor do que 0,010 mol/1, preferivelmente menor do que0,005 mol/1, preferivelmente menor do que 0,002 mol/1,preferivelmente menor do que 0,001 mol/1, preferivelmentemenor do que 0,0005 mol/1, preferivelmente menor do que0,0001 mol/1, preferivelmente menor do que 0,00005 mol/1,preferivelmente menor do que 0,00001 mol/1, preferivelmentenenhuma quantidade detectável. 0 termo conservante é bementendido pela pessoa versada na técnica, e, como utilizadoaqui, se refere a um composto que inibe o crescimento demicrorganismos e/ou evita a germinação de espórios e/oumata células vegetativas e/ou espórios. No contexto dapresente invenção, essa definição de conservante nãoabrange polialcoóis ou sais inorgânicos.

Preferivelmente, a composição líquida é uma composiçãoaquosa, por exemplo, uma. solução aquosa. Como utilizadoaqui, uma composição aquosa ou solução aquosa abrangequalquer composição ou solução que compreende água, porexemplo, pelo menos 20% em peso de água, por exemplo, pelomenos 4 0% em peso de água.

Em uma modalidade preferida, a composição de acordocom a invenção, tem uma atividade de água abaixo de 0,95,por exemplo, abaixo de 0,92, por exemplo, abaixo de 0,9,por exemplo, abaixo de 0,85, por exemplo, abaixo de 0,8.Como utilizado aqui, a atividade de água se refere ao valormedido a 25°C. Uma atividade de água relativamente baixapode contribuir para obter uma estabilidade microbianadesejada. A atividade de água pode ser influenciada pelaadição de sal inorgânico e/ou polialcoóis. A atividade deágua pode estar acima de 0,7, por exemplo, acima de 0,8,por exemplo, acima de 0,83, ou acima de 0,85 ou acima de0,86. Verificou-se surpreendentemente que uma composiçãotendo uma atividade de água acima desses valores pode teruma estabilidade microbiana mais elevada do que esperado.Em uma modalidade preferida, a atividade de água está entre0, 85 e 0,95.

Em uma modalidade preferida, a composição de acordocom a invenção compreende um sal inorgânico. 0 salinorgânico pode funcionar para diminuir a atividade de águada composição. Qualquer sal inorgânico apropriado pode serutilizado. 0 sal inorgânico pode, por exemplo, ser um salque compreende um cátion selecionado a partir do grupo queconsiste em (CH3)4N+, NH4+, K+, Na+, Ca2+ e Ba2+ e um ânionselecionado a partir do grupo que consiste em SO42", Cl",Br", NO3", CiO4" e SCN". Sais inorgânicos preferidos sãoNaCl, KCl, Na2SO4 ou (NH4)2SO4. A composição pode conter umou mais sais inorgânicos.

Em uma modalidade preferida, a composição compreendepelo menos 8 0 g/l de um sal inorgânico ou de uma combinaçãode sais inorgânicos, preferivelmente pelo menos 100 g/l,mais pref erivelmente pelo menos 120 g/l, maispreferivelmente pelo menos 140 g/l. Uma concentraçãoaumentada de sal tem o efeito de que a atividade de água dacomposição é aumentada, o que pode auxiliar a obter umaestabilidade microbiana desejada. Será entendido que épossível que pelo menos um sal inorgânico esteja presenteem uma concentração preferida como definido aqui. Também épossível que uma combinação de sais inorgânicos estejapresente em uma concentração como definido aqui. Se umacombinação de sais inorgânicos for empregada, aconcentração se refere à concentração total de saisinorgânicos. Em uma modalidade preferida, a composiçãocompreende pelo menos 80 g/l de NaCl, preferivelmente pelomenos 100 g/l, mais preferivelmente pelo menos 120 g/l,mais preferivelmente pelo menos 140 g/l.

Em uma modalidade preferida, a concentração de salinorgânico na composição é menor do que 200 g/l,preferivelmente menor do que 190 g/l, preferivelmente menordo que 180 g/l, preferivelmente menor do que 170 g/l, porexemplo, menor do que 160 g/l. Em uma modalidade preferida,a composição compreende menos de 200 g/l, preferivelmentemenos de 190 g/l, preferivelmente menos de 180 g/l,preferivelmente menos de 170 g/l, por exemplo, menos de 160g/l de NaCl. A diminuição da concentração de sal inorgânicopode contribuir para a estabilidade enzimática. A invençãopermite o uso de concentrações relativamente baixas de saisinorgânicos, que pode auxiliar a obter uma combinação deuma estabilidade enzimática elevada e microbiana elevada.Será entendido que a composição pode conter um ou mais saisinorgânicos. Os valores para os limites superiorespreferidos da concentração de sal inorgânico se referem àconcentração total dos sais inorgânicos na composição.

Em uma modalidade preferida, a composição compreendeum poliálcool. 0 poliálcool pode funcionar para diminuir aatividade de água da composição. A diminuição da atividadede água pode auxiliar a obter uma estabilidade microbianadesejada. Qualquer poliálcool apropriado pode serutilizado. 0 poliálcool pode, por exemplo, ser etilenoglicol (etanodiol), propileno glicol (propanodiol),glicerol, eritritol, xilitol, manitol, sorbitol, inositol,galactitol. Preferivelmente, o poliálcool é glicerol,sorbitol ou propanodiol, mais preferivelmente glicerol oupropanodiol. A composição pode compreender um ou maispolialcoóis.

Em uma modalidade preferida, a composição compreendepelo menos 40 g/l de um poliálcool ou de uma combinação depolialcoóis, preferivelmente pelo menos 80 g/l. Seráentendido que é possível que pelo menos um poliálcoolesteja presente em uma concentração preferida como definidoaqui. Também é possível que uma combinação de polialcoóisesteja presente em uma concentração como definido aqui. Seuma combinação de polialcoóis for empregada, a concentraçãose refere à concentração total de sais inorgânicos.

Em uma modalidade da invenção, a concentração depoliálcool na composição é menor do que 300 g/l, porexemplo, menor do que 200 g/l, por exemplo, menor do que150 g/l. Entretanto, concentrações inferiores, por exemplo,concentrações menores do que 100 g/l, por exemplo, menoresdo que 50 g/l, por exemplo, menos de 10 g/l ou mesmo 0 g/lpode ser também utilizado. Os limites superiores se referemà concentração total de polialcoóis na composição.

Na modalidade, a composição compreende entre 90 e 120g/l de um poliálcool ou de uma combinação de polialcoóis,e, preferivelmente entre 140 e 180 g/l de NaCl.

A composição pode ter qualquer pH apropriado. Em umamodalidade preferida, a composição tem um pH menor do que7, pref erivelmente menor do que 6. Preferivelmente, o pH épelo menos 3, preferivelmente pelo menos 4, preferivelmentepelo menos 5. 0 pH pode, por exemplo, estar entre 4,8 e5,5.

Em uma modalidade preferida, a composição compreendeum agente redutor, preferivelmente metionina.15 Preferivelmente, a composição compreende pelo menos 1 g/lde metionina, preferivelmente pelo menos 2 g/l, maispreferivelmente pelo menos 5 g/l, por exemplo, menor do que100 g/l, por exemplo, menor do que 30 g/l.

Em uma modalidade preferida, a atividade de enzima épelo menos 100 IMCU por ml de composição, pref erivelmentepelo menos 200 IMCU por ml de composição, pref erivelmentepelo menos 500 IMCU por ml de composição. Não há limitesuperior específico para a atividade de enzima. A atividadede enzima pode estar abaixo de 5000 IMCU por ml decomposição, por exemplo, menos de 2000 IMCU por ml, porexemplo, menos de 1000 IMCU por ml de composição. IMCU serefere a International Milk Clotting Unit (unidade decoagulação de leite internacional), definida pelaInternational Dairy Federation (IDF), protocolo 176: 1996.

Em uma modalidade preferida, a composição de acordocom a invenção tem contagem de placa padrão < 100 em 1 ml.Pref erivelmente, a contagem de levedura < 10 em 1 ml.Preferivelmente, a contagem de bolores é < 10 em 1 ml.

A composição, de acordo com a invenção, tem umaestabilidade microbiana mais elevada do que esperado. Emuma modalidade da invenção, a contagem de placa padrãopermanece < 100 em 1 ml, a contagem de levedura permanece <10 em 1 ml e a contagem de bolores permanece < 10 em 1 mldurante um período de pelo menos 4 meses, preferivelmentepelo menos 6 meses, preferivelmente pelo menos 9 meses,preferivelmente pelo menos 12 meses, preferivelmente pelomenos 18 meses, preferivelmente pelo menos 24 meses, quandoa composição é armazenada em um recipiente fechado em umatemperatura de 4°C no escuro.

Em uma modalidade da invenção, a contagem de placapadrão permanece < 100 em 1 ml, a contagem de levedurapermanece < 10 em 1 ml e a contagem de bolores permanece <10 em 1 ml durante um período de pelo menos 4 meses,preferivelmente pelo menos 6 meses, preferivelmente pelomenos 9 meses, preferivelmente pelo menos 12 meses,preferivelmente pelo menos 18 meses, preferivelmente pelomenos 24 meses, quando a composição é armazenada em umrecipiente fechado em uma temperatura de 3 0°C no escuro.

Em uma modalidade da invenção, a atividade enzimáticadiminui no máximo 5% durante um período de pelo menos 4meses, preferivelmente pelo menos 6 meses, preferivelmentepelo menos 9 meses, preferivelmente pelo menos 12 meses,preferivelmente pelo menos 18 meses, preferivelmente pelomenos 24 meses, quando a composição é armazenada em umrecipiente fechado em uma temperatura de 40C no escuro.Em uma modalidade da invenção, a atividade enzimáticadiminui no máximo 5% durante um período de pelo menos 4meses, preferivelmente pelo menos 6 meses, preferivelmentepelo menos 9 meses, preferivelmente pelo menos 12 meses,preferivelmente pelo menos 18 meses, preferivelmente pelomenos 24 meses, quando a composição é armazenada em umrecipiente fechado em uma temperatura de 30°C no escuro.

Como recipiente fechado para esses testes pode seutilizar uma garrafa, que é esterilizada antes doenchimento, e que é fechada com uma rosca. Garrafas comvolume de 50 ml podem ser utilizadas que são cheias com 20ml da composição a ser testada.

A composição pode compreender qualquer proteaseaspártica apropriada. Preferivelmente, a protease aspárticaé uma enzima de coagulação de leite. Enzimas de coagulaçãode leite podem ser caracterizadas por terem especificidadepara a ligação de peptídeo entre resíduo 105 fenil alaninae resíduo 106 metionina em uma ligação adjacente àquela emkappa-caseína.

A protease aspártica pode ser de origem animal.Preferivelmente, a protease aspártica é produzida por ummicrorganismo (uma protease aspártica produzida de formamicrobiana).

O microrganismo pode, por exemplo, ser Rhizomucor, porexemplo, Rhizomucor miehei ou Rhizomucor pusslius ouCryphonectria, por exemplo, Cryphonectria parasitica. Omicrorganismo pode ser selecionado também a partir dosgêneros de Aspergillus, Triehodermal Penicilliuml Fusarium,Humieola ou Kluyveromyces. Esses microrganismos podem, porexemplo, ser utilizados como cepa hospedeira. Em umamodalidade preferida o microrganismo é Aspergillus niger,Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Kluyveromyceslactis ou Escherichia coli.

Em uma modalidade da invenção, a protease aspartica éuma protease aspártica Rhizomucor miehei. O termo "proteaseaspártica Rhizomueor miehei" abrange a protease aspárticaproduzida de forma homologa em Rhizomueor miehei. Umprocesso para a preparação da enzima via fermentação édescrito em US-A-3.988.207. O termo "protease aspárticaRhizomueor miehei" também abrange uma protease aspárticaRhizomueor miehei recombinante, por exemplo, uma proteaseaspártica Rhizomueor miehei produzida em um organismohospedeiro (por exemplo, diferente de Rhizomueor miehei)transformado com codificação de DNA para a proteaseaspártica Rhizomueor miehei. Um método para a produção deuma protease aspártica Rhizomucor miehei recombinante em umorganismo hospedeiro é descrito em EP-A-700253.

Em outra modalidade da invenção a protease aspártica équimosina. Quimosina pode, por exemplo, ser extraída apartir do estômago de um vitelo, camelo ou foca. Em umamodalidade preferida da invenção a quimosina é produzidapor um microrganismo, por exemplo, via tecnologia de DNArecombinante em bactérias, por exemplo, Eseheriehia coli,levedura, por exemplo, Kluyveromyces lactis, ou fungosfilamentosos, por exemplo, em Aspergillus niger.

A composição de acordo com a invenção pode seracondicionada em qualquer recipiente fechado apropriado.Por conseguinte, a invenção provê ainda um recipientefechado e/ou vedado contendo a composição de acordo com ainvenção.A composição, de acordo com a invenção pode serpreparada utilizando um processo para preparar umacomposição líquida compreendendo uma protease aspártica, oprocesso compreendendo:

a) fornecer um caldo de fermentação, o caldo de

fermentação contendo (i) microrganismos que produziram aprotease e (ii) sobrenadante contendo a protease;

c) purificar o sobrenadante separado, para obter umasolução purificada;

e) filtrar a solução purificada, opcionalmentecontendo um ou mais aditivos.

A etapa (a) pode ser realizada em qualquer modoapropriado e pode envolver cultivar um microrganismo sobcondições apropriadas para produzir a protease, resultandoem um caldo de fermentação contendo o microrganismo esobrenadante contendo a protease. Um processo apropriado é,por exemplo, descrito em EP-A-1365019.

A etapa (b) pode ser realizada em qualquer modoapropriado, e preferivelmente envolve centrifugação e/oufiltração. A etapa (b) pode envolver filtração utilizandouma prensa de filtro de membrana ou um filtro de polimento.

As funções da etapa (c) podem envolver qualquer etapaque resulte em um aumento da concentração da enzima emrelação aos outros componentes. Preferivelmente, a etapa(c) envolve cromatografia ou ultrafiltração. Processospreferidos para executar cromatografia são descritos em WO-A-03100048 e WO-A-0250253, cujos teores são, pela presente,incorporados a título de referência.

A etapa (d) envolve a adição de um ou mais aditivos àsolução purificada, onde pelo menos um de um ou maisaditivos é um sal inorgânico, um poliálcool ou um compostoselecionado entre formato, acetato, lactato, propionato,malato ou fumarato. Outros aditivos também podem seradicionados. Preferivelmente, nenhum composto selecionadode benzoato, sorbato ou éster de alquila de para-hidroxibenzoato é adicionado à solução de purificação.

A etapa (e) envolve, preferivelmente, filtração depolimento ou filtração estéril. A filtração de polimento ébem conhecida por si. A filtração de polimento na etapa (e)funciona para remover quantidades residuais de partículasnão dissolvidas, por exemplo, resíduos de células, e/oumicrorganismos contaminantes. Filtros de polimento têm,tipicamente, um raio relativamente pequeno dos poros defiltro (faixa de micrômetro) e uma profundidade rasa dacamada de filtro ativo (faixa de milímetro a centímetro).

Preferivelmente a solução filtrada que resulta de (e)tem as seguintes propriedades: contagem de placa padrão <100 em 1 ml; contagem de levedura < 10 em 1 ml; e contagemde bolores < 10 em 1 ml.

Preferivelmente, o equipamento que é contatado com asolução filtrada resultando de (e) é contatado com vaporantes do contato do equipamento com a solução filtrada.Isso evita contaminação.Em uma modalidade do processo de acordo com ainvenção, uma ou mais etapas (a), (b), (c), (d) ou (e) sãorealizadas em uma temperatura menor do que 10°C,preferivelmente menor do que 5°C.

Em uma modalidade preferida, a concentração total desorbato, benzoato e alquil ésteres de para-hidroxibenzoatona solução filtrada resultando de (e) é menor do que 0,010mol/1, preferivelmente menor do que 0,005 mol/1,preferivelmente menor do que 0,002 mol/1, preferivelmentemenor do que 0,001 mol/1, preferivelmente menor do que0,0005 mol/1, preferivelmente menor do que 0,0001 mol/1,preferivelmente menor do que 0,00005 mol/1, preferivelmentemenor do que 0,00001 mol/1, preferivelmente nenhumaquantidade detectável.

A invenção provê ainda a composição de uso, de acordocom a invenção, como um coagulante na produção de queijo.

A invenção provê ainda um processo para a preparaçãode queijo, compreendendo (i) suplementar leite com umacomposição, de acordo com a invenção, para efetuarcoagulação do leite, em que se obtém um coalho; e (ii)processar o coalho em queijo.

A invenção será elucidada agora com referência aosseguintes exemplos sem ser, entretanto, limitada aosmesmos.

EXEMPLOS

EXEMPLOS 1-5

Uma cultura de Rhizomucor miehei foi cultivada comodescrito em EP-A-1365019. Ao término da fermentação o caldofoi resfriado, o fungo exterminado e separado a partir doliquido utilizando uma prensa de filtro de membrana efiltração de polimento. A protease de coagulação de leitefoi subseqüentemente purificada utilizando cromatografiacomo descrito em W003/100048. O eluato de coluna, contendoa protease de coagulação de leite foi formulado por adiçãode NaCl, acetato de sódio, metionina (10 g/l), eopcionalmente benzoato de sódio, e por ajuste do pH (vide atabela 1) . As condições foram especificamente selecionadasde tal modo que a contaminação foi evitada o que incluiusubmeter cubas e tubulação a vapor.

Tabela 1. Formulações de protease de coagulação deleite a partir de Rhizomucor miehei.

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A atividade de água foi determinada utilizando umThermoconstanter TH-200 (Novasina, Axair Ltd., Suíça) a25°C, e calibrado com 6 sais de calibração de 11, 33, 53,75, 90 e 98% de umidade relativa, como fornecido pelofabricante.

Teste de estabilidade

Amostras (20 ml) foram armazenadas em um incubadorpré-ajustado em 30 0C em garrafas fechadas com um topo derosca. Em vários intervalos de tempo (0, 1, 2, 4 semanas,2, 8 meses) a contagem de placa padrão foi determinada, deacordo com ISO 4833:1991 (E) (Microbiology - Generalguidance for the enumeration of micro-organisms - Colonycount technique at 30°C), bem como a contagem de levedura econtagem de bolores, de acordo com ISO 7954: 1987 (E)(Microbiology - General guidance for enumeration of yeastsand moulds - Colony count technique at 25°C). Além dessasdeterminações - que foram executadas utilizando um meio decultura sem NaCl - determinações também foram executadas domesmo modo, porém com a diferença de que um meio de culturacom 5% de NaCl foi utilizado.

Em todas as amostras contagens de colônia eram < 10por ml para bactérias, leveduras e fungos, quer ascontagens de células fossem executadas em placas com ou semNaCl.

Esse teste de estabilidade mostra que em todas asformulações sem benzoato a contagem de placa padrãopermanece ≤ 100 em 1 ml; leveduras permanecem ≤ 10 em 1 ml;e fungos permanecem ≤ 10 em 1 ml, quando uma amostra éarmazenada a 30°C durante um período de pelo menos 8 meses.

A contagem de placa padrão permanece ≤ 1Ò0 em 1 ml;leveduras permanecem ≤ 10 em 1 ml; e fungos permanecem ≤ 10em 1 ml, quando uma amostra é armazenada a 4°C durante umperíodo de pelo menos 12 meses.

Teste de desafio

As 5 formulações da protease de coagulação de leite apartir de Rhizomucor miehei foram submetidas a testes dedesafio, nos quais microrganismos selecionados de bactériasxerotolerantes, leveduras e fungos foram inoculados.Verificou-se que todas as formulações têm uma boaresistência a microrganismos.Durante esse período de armazenagem a atividadeenzimática da protease de coagulação de leite, comodeterminado em IMCU (International Milk Clotting Unit,definida pela International Dairy Federation (IDF),protocolo 176: 1996) diminuiu menos de 0,5% por mês nasformulações 1, 2 e 3. Nas formulações 4 e 5 a diminuiçãofoi maior.

Exemplos 6-9

Uma protease aspártica Rhizomucor miehei foi produzidacomo descrito nos exemplos 1-5. O produto foi formuladocomo fornecido na tabela 2. A atividade inicial de enzimafoi de 760 IMCU/ml.

Tabela 2. Formulações de protease de coagulação deleite a partir de Rhizomucor miehei.

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Teste de estabilidade

As amostras (50 ml) foram armazenadas em um incubadorajustado em 200C em garrafas fechadas com um topo de rosca.Em vários intervalos de tempo (0, 1, 2, 4 e a partir daí acada 4 semanas até 8 meses) a contagem de placa padrão foideterminada como descrito nos exemplos 1-5. Além dessasdeterminações - que foram executadas utilizando um meio decultura sem NaCl - determinações também foram executadas domesmo modo, porém com a diferença de que um meio de culturacom 10% de NaCl foi utilizado. A contagem de placa padrãosem 10% de NaCl no meio mostrou < 10 unidades de formaçãode colônia por ml a partir do início através de todo operíodo de armazenagem, ao passo que para as formulações 8e 9 sem acetato e benzoato esse nível foi atingido após 2semanas de armazenagem, e então permaneceu constante portodo o período de armazenagem. A contagem de placa padrãocom 10% de NaCl no meio mostrou para todas as formulações apartir do início até o final do período de armazenagem < 10unidades de formação de colônia por ml.

Esse teste de estabilidade mostrou que acetato forneceboa estabilidade microbiana, mesmo na ausência de benzoato.

Testes de desafio

As 4 formulações da protease aspártica de Rhizomucormiehei, como fornecidas na Tabela 2, foram inoculadas comuma mistura de microrganismos xerotolerantes (umMicrococcus halofílico, Torulopsis candida e Hansenulaanômala) em aproximadamente 2E+3 unidades de formação decolônia por ml. As amostras foram armazenadas em umincubador definido a 20°C, em garrafas fechadas com um topode rosca. Verificou-se que as formulações dos exemplos 6 &7 (contendo benzoato ou acetato) têm uma resistênciaaperfeiçoada a microrganismos em comparação com o exemplo 8que não contém benzoato ou acetato. Embora fosse verificadoque a formulação do exemplo 9 tema boa resistência contramicrorganismos, verificou-se que o uso de acetato permite ouso de concentrações mais baixas de sal o que pode melhorara estabilidade enzimática.

No geral, o teste tanto de estabilidade como dedesafio demonstra o efeito conservante eficiente deacetato, mesmo na ausência de benzoato.Exemplos 10-11

Uma protease aspártica Rhizomucor miehei foi produzidacomo descrito nos exemplos 1-5. O produto foi formuladocomo fornecido na Tabela 3, incluindo 10 g/l de metionina.

Após correção de pH, e adição dos vários compostos, oproduto formulado foi novamente submetido a uma filtraçãode polimento. Antes da filtração de polimento cubas etubulação, que contatam o produto filtrado, foramsubmetidos a vapor. O produto filtrado foi entãoacondicionado em tambores de 20 litros, vedados.

Tabela 3. Formulações de protease aspártica Rhizomucormiehei

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Teste de estabilidade

As amostras foram armazenadas em tambores fechados de20 1 em incubadores ajustados em 50C ou 20°C. Um tambor deformulação 10 e três tambores de formulação 11 foramutilizados nesse teste de estabilidade. A estabilidademicrobiana dessas amostras foi verificada em intervalos detempo regulares até 8 meses pela contagem de placa padrão.

Em todos os recipientes, tanto em 5 como em 20 °C nenhumcrescimento pode ser detectado de bactérias, levedura oufungos, como determinado pelos métodos para contagem deplaca padrão ou contagem de leveduras e fungos comodescrito nos exemplos 1-5.

A estabilidade microbiana dessas formulações sembenzoato foi boa durante todo o período de armazenagem de 8meses.

Teste de desafio

De cada formulação uma amostra (50 ml) foi inoculadacom uma mistura de microrganismos xerotolerantes (umMicrococcus halofílico, Torulopsis candida e Hansenulaanômala) em aproximadamente 2E+3 unidades de formaçao decolônia por ml. Essas amostras foram armazenadas em umagarrafa com topo de rosca em um incubador ajustado a 20°C.As duas formulações mostraram uma boa resistência contramicrorganismos.

Tanto o teste de estabilidade como o de desafiodemonstram que as formulações sem de benzoato, que contêmacetato, têm efeito conservante eficiente.

Exemplos 12-15

Uma amostra de quimosina foi obtida a partir de umprocesso de fermentação de uma cepa hospedeiraKluyveromyces, geneticamente modificada; como descrito emEP0301670. Após fermentação o microrganismo foiexterminado, a quimosina foi ativada por tratamento em pH 2e então recuperada a partir do caldo por filtração ediafiltração. A quimosina foi formulada como fornecido naTabela 4. As condições foram especificamente selecionadasde tal modo que a contaminação foi evitada, o que incluiusubmeter cubas e tubulação a vapor. A atividade inicial deenzima foi 645 IMCU/ml.

Tabela 4. Formulações de quimosina, produzidas porKluyveromyces lactis<table>table see original document page 25</column></row><table><table>table see original document page 26</column></row><table>

Teste de estabilidade

A contagem de placa padrão das 4 formulações é < 100unidades de formação de colônia por ml, e a contagem delevedura e bolores é < 10 unidades de formação de colôniapor ml.

Teste de desafio

Amostras (50 ml) foram inoculadas com uma mistura demicrorganismos xerotolerantes (um Micrococcus halofílico,Torulopsis candida e Hansenula anômala) em aproximadamente2E+3 unidades de formação de colônia por ml. As amostrasforam armazenadas em um incubador ajustado em 20°C, emgarrafas fechadas com um topo de rosca.

Verificou-se que as formulações dos exemplos 12, 14,15 (contendo benzoato ou propanodiol) têm resistênciaaperfeiçoada a microrganismos em comparação com aformulação do exemplo 13 que não contém benzoato oupropanodiol.

Esse experimento mostra claramente que as formulaçõessem benzoato, incluindo propanodiol, têm boa estabilidademicrobiana e resistência evidente a microrganismos.

Claims

1. Composição líquida caracterizada pelo fato decompreender:(i) uma protease aspártica; e(ii) um sal inorgânico e/ou poliálcool,onde a composição:a concentração total de sorbato, benzoato e alquilésteres de para-hidroxibenzoato é menor do que 0,010 mol/1;a contagem de placa padrão < 100 em 1 ml;a contagem de levedura <10 em ml; ea contagem de bolores < 10 em 1 ml.

2. Composição líquida, de acordo com a reivindicação-1, caracterizada por compreender uma protease aspártica eum composto selecionado entre formato, acetato, Iactato,propionato, malato ou fumarato.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de que a concentração de formato,acetato, lactato, propionato, malato ou fumarato oucombinação dos mesmos é de pelo menos 0,05 mol/1.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 2 ou 3,caracterizada por compreender acetato.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato de que a concentração de acetato éde pelo menos 0,05 mols/l.

6. Composição líquida, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizada porcompreender (i) uma protease aspártica, (ii) um salinorgânico, e (iii) um poliálcool.

7. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizada porcompreender:pelo menos 8 0 g/l de um sal inorgânico ou umacombinação de sais inorgânicos; epelo menos 4 0 g/l de um poliálcool ou de umacombinação de polialcoóis.

8. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizada pelofato de que pode ser obtida pelo processo de qualquer umadas reivindicações 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 ou 43.

9. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizada pelofato de que a concentração de benzoato é menor do que 0,010mol/1.

10. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 6, caracterizadapelo fato de que a concentração total de sorbato, benzoatoe alquil ésteres de para-hidroxibenzoato é menor do que0,010 mol/1.

11. Composição, dé acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10,caracterizada pelo fato de que tem uma atividade de águaabaixo de 0,95.

12. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11,caracterizada pelo fato de que tem uma atividade de águaentre 0,85 e 0,95.

13. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12,caracterizada por compreender um sal inorgânico.

14. Composição, de acordo com a reivindicação 13,caracterizada pelo fato de que o sal inorgânico é NaCl,KCl, Na2SO4 OU (NH4)2SO4.

15. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou-14, caracterizada por compreender pelo menos 80 g/l de umsal inorgânico ou de uma combinação de sais inorgânicos.

16. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14 ou 15, caracterizada por compreender pelo menos 80 g/lde NaCl.

17. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, ou 16, caracterizada pelo fato de que aconcentração de sal inorgânico é menor do que 180 g/l.

18. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16 ou 17, caracterizada por compreender menos de180 g/l de NaCl.

19. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17 ou 18, caracterizada por compreender umpoliálcool.

20. Composição, de acordo com a reivindicação 19,caracterizada pelo fato de que o poliálcool épropilenoglicol, glicerol, ou sorbitol.

21. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20, caracterizada por compreenderpelo menos 4 0 g/l de um poliálcool ou de uma combinação depolialcoóis.

22. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21, caracterizada por ter umpH entre 4 e 6.

23. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ou 22, caracterizada pelofato de que compreende ainda metionina.

24. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23, caracterizadapelo fato de que a protease aspártica é uma enzima decoagulação de leite.

25. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24, caracterizadapelo fato de que a atividade de enzima é pelo menos 1000IMCU por ml de composição.

26. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25,caracterizada pelo fato de que a protease aspártica foiproduzida por um microrganismo.

27. Composição, de acordo com a reivindicação 26,caracterizada pelo fato de que o microrganismo éRhizomucor.

28. Composição, de acordo com a reivindicação 26,caracterizada pelo fato de que o microrganismo éCryphonectria.

29. Composição, de acordo com a reivindicação 26,caracterizada pelo fato de que o microrganismo éAspergillus, Kluyveromyces ou Escherichia coli.

30. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28ou 29, caracterizada pelo fato de que a protease aspárticaé quimosina.

31. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28ou 29, caracterizada pelo fato de que a protease aspárticaé uma protease aspártica Rhizomucor miehei.

32. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,-29, 3 0 ou 31, caracterizada pelo fato de que a contagem deplaca padrão permanece < 100 em 1 ml, a contagem delevedura permanece < 10 em 1 ml e a contagem de bolorespermanece < 10 em 1 ml durante um período de pelo menos 6meses, quando a composição é armazenada em um recipientefechado em uma temperatura de 40C no escuro.

33. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,-29, 30, 31 ou 32, caracterizada pelo fato de que aatividade enzimática diminui no máximo 5% durante umperíodo de pelo menos 6 meses, quando a composição éarmazenada em um recipiente fechado em uma temperatura de-4°C no escuro.

34. Recipiente fechado caracterizado por compreender acomposição de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4,-5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,-21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33.

35. Processo para preparar uma composição líquidacompreendendo uma protease aspártica caracterizado porcompreender:a) fornecer um caldo de fermentação, o caldo defermentação contendo (i) microrganismos que produziram aprotease e (ii) sobrenadante contendo a protease;b) separar, por separação sólido-líquido, osobrenadante a partir do caldo de fermentação;c) purificar o sobrenadante separado, para obter umasolução purificada;d) adicionar um ou mais aditivos à solução purificada,onde pelo menos um de um ou mais aditivos é um salinorgânico, um poliálcool, ou um composto selecionado entreformato, acetato, lactato, propionato, malato ou fumarato;ee) filtrar a solução purificada, opcionalmentecontendo um ou mais aditivos.

36. Processo, de acordo com a reivindicação 35,caracterizado pelo fato de que (e) é por filtração depolimento ou filtração estéril.

37. Processo, de acordo com a reivindicação 35 ou 36,caracterizado pelo fato de que o equipamento que écontatado com a solução filtrada resultante de (e) écontatado com vapor antes do contato do equipamento com asolução filtrada.

38. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 35, 36 ou 37, caracterizado pelo fato de que(c) envolve cromatografia ou ultrafiltração.

39. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 35, 36, 37 ou 38, caracterizado pelo fato deque (b) envolve filtração utilizando uma prensa de filtrode membrana ou um filtro de polimento.

40. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 35, 36, 37, 38 ou 39, caracterizado pelofato de que uma ou mais das etapas (a) , (b) , (c) , (d) ou(e) são realizadas em uma temperatura menor do que 10°C,preferivelmente menor do que 5°C.

41. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 35, 36, 37, 38, 39 ou 40, caracterizado pelofato de que a solução filtrada resultante de (e) tem asseguintes propriedades: contagem de placa padrão < 100 em 1ml; contagem de levedura ≤ 10 em 1 ml; e contagem debolores ≤ 10 em 1 ml.

42. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 35, 36, 37, 38, 39, 40 ou 41, caracterizadopelo fato de que nenhum composto selecionado entrebenzoato, sorbato ou éster de alquila de para-hidroxibenzoato é adicionado ã solução purificada.

43. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 ou 42,caracterizado pelo fato de que a concentração total desorbato, benzoato e alquil ésteres de para-hidroxibenzoatona solução filtrada resultando a partir de (e) é menor doque 0,010 mol/l.

44. Uso de uma composição de qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 caracterizado pelofato de ser como um coagulante na produção de queijo.

45. Processo para preparar queijo caracterizado porcompreender (i) suplementar leite com uma composição dequalquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,-10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,-25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33, para efetuarcoagulação do leite, em que se obtém um coalho; e (ii)processar o coalho em queijo.