BRPI0708930A2 - veÍculo de proteÍna do soro de leite para liberaÇço de agente ativo - Google Patents

Abstract

VEÍCULO DE PROTEÍNA DO SORO DE LEITE PARA LIBERAÇçO DE AGENTE ATIVO. A presente invenção refere-se a micelas de proteína do soro de leite, especialmente a seu uso como veículo de liberação de agentes ativos no campo de nutrição e/ou de cosmético.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VEICULO DEPROTEÍNA DO SORO DE LEITE PARA LIBERAÇÃO DE AGENTE ATIVO".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a micelas de proteínas do soro deleite, especialmente ao seu uso como veículo de liberação de agentes ativosno campo da nutrição e/ou cosmética.

Antecedentes

Sistemas de liberação são conhecidos na técnica e têm sidoamplamente utilizados para liberação direcionada de fármacos no corpo naindústria farmacêutica, por exemplo. Sistemas de liberação são freqüente-mente encontrados na forma de microcápsulas de processamento em ali-mento.

Nas aplicações em alimentos, o uso de sistemas de liberaçãopossibilitou que uma possível interação não desejada entre os componentesnutritivos e outros componentes adicionados no alimento ou em seu ambien-te pudesse ser evitada, além de permitir a manipulação do local liberação docomponente adicionado. A aplicação apropriada da tecnologia de sistemasde liberação permite o proveito máximo do alimento sem afetar o seu sabor,aroma ou textura. Estes sistemas podem conferir proteção a ingredientesalimentares sensíveis e aumentar o prazo de validade e estabilidade de ali-mentos enriquecidos.

Sistemas de liberação podem ser também uma das principaistecnologias com potencial para a liberação de compostos ativos dietéticose/ou de agentes cosméticos. Além disso, o sistema de liberação ideal devecorresponder à necessidade de liberação localizada específica no trato gas-trointestinal ou pele, cabelo, etc., dependendo da aplicação desejada.

O microencapsulamento tem sido freqüentemente utilizado paraessa finalidade. De fato, o encapsulamento de agentes de sabor e de outrosagentes ativos em matriz de polímero alimentar é um processo bem-conhecido.

Por exemplo, EP 0 180 441 B1 expõe o uso de proteínas de sorode leite para encapsular componentes voláteis de sabor. Leite hidrolisado éconcentrado por aquecimento e evaporação até teor de sólidos de 40 - 50%que resulta também no encapsulamento com as proteínas do soro de leite.

WO 96/38055 descreve o encapsulamento de agente de saborou ativo em matriz de proteína do soro de leite, produzindo uma composiçãoencapsulada que leva à liberação controlada do agente de sabor ou ativo eque pode ser incorporada em massa de farinha fermentada sem causar efei-to deletério sobre o crescimento da massa de farinha.

WO 2005/048998 refere-se a sistemas de liberação no trato gas-trointestinal, de acordo com a qual microcápsulas feitas de proteína e car-boidrato são utilizadas.

Um dos problemas encontrados na produção de produtos con-tendo proteínas globulares em geral, e proteína do soro de leite em particu-lar, é a sua processabilidade limitada. De fato, as moléculas de proteínaquando aquecidas, ou quando submetidas a um ambiente ácido ou alcalino,ou na presença de sais, tendem a perder a sua estrutura natural e a se rea-gruparem em diversas estruturas aleatórias, como géis, por exemplo.

Nos Procedimentos da Second International Whey Conference,Chicago, outubro de 1997, relatados na International Dairy Federation, 1998,189-196, Britten M. discute tratamentos por calor para melhorar as proprie-dades funcionais de proteínas do soro de leite. É descrito um processo paraproduzir dispersão de micropartículas de proteína do soro de leite a 95°C.

Sato et ai, na patente U.S. 5 882 705, obtiveram micelas de pro-teína do soro de leite ao submeterem uma solução de proteína do soro deleite hidrolisada a tratamento por calor. As micelas de proteína do soro deleite são caracterizadas por sua forma irregular.

Foi demonstrado que os sistemas de encapsulamento da técnicaanterior eram pouco eficientes na liberação controlada de agentes de saborou semelhantes, na medida em que consistiam parcialmente em proteínasglobulares e, por conseguinte, propensas a modificarem a estrutura quandoaquecidas, expostas a sais e/ou submetidas a um ambiente ácido ou alcalino.

Portanto, permanece havendo necessidade por uma composiçãode sistema de liberação que permita liberação controlada de um determina-do agente. Ademais, a tecnologia de ponta de alimentos e de cosméticosrequer produtos especialmente criados, de forma que os ingredientes ativoscontidos no sistema de liberação fiquem protegidos contra estresse ambien-tal, como radiação UV1 luz, oxigênio, umidade e temperatura.

De acordo com o mesmo, o objeto da presente invenção é me-lhorar a utilidade de proteínas do soro de leite como sistema de liberação emuma ampla variedade de aplicações.

Sumário da Invenção

De acordo com o mesmo, esse objetivo é atingido pela caracte-rização de acordo com as reivindicações independentes. As reivindicaçõesdependentes desenvolvem ainda a idéia central da presente invenção.

Para atingir esse objetivo, é proposto, em uma primeira caracte-rização, um método para o preparo de agregados formado por micelas pro-téicas e por um agente ativo, o qual compreende a primeira etapa de disper-são de micelas de proteínas do soro de leite e o agente ativo em um solven-te, e a segunda etapa de evaporação do solvente.

De acordo com uma segunda característica da invenção, é pro-vido um método compreendendo as etapas de dispersão de proteínas nati-vas do soro de leite e um agente ativo, em solução aquosa, a desnaturaçãodas proteínas do soro de leite até micelas de proteínas do soro de leite e aformação de agregado constituído por proteínas do soro de leite e o agenteativo.

Um método alternativo de preparo de agregados de proteína ede um agente ativo, compreendendo a etapa de mistura de micela de proteí-na do soro de leite em pó com um agente ativo, enquadra-se em uma outracaracterística da invenção.

Os agregados que podem ser obtidos por qualquer destes méto-dos fazem parte da invenção, de acordo com uma outra característica damesma.

De acordo com uma outra característica, a invenção provê agre-gados compreendendo micelas de proteínas do soro de leite e agente ativo,associado às referidas micelas de proteínas do soro de leite.

Produtos alimentícios ou cosméticos, contendo estes agregados,enquadram-se também em uma característica da presente invenção.

Além disso, o uso de micelas de proteínas do soro de leite comoveículo para liberação de agente ativo, e o uso das mesmas em aplicaçõesalimentícias e cosméticas constitui outras características da presente inven-ção.

Finalmente, um complexo para liberação de agente ativo, com-preendendo micelas de proteínas do soro de leite e o referido agente ativo, éprovido pela presente invenção.

Figuras

A presente invenção é descrita adiante nesta exposição em refe-rência a algumas concretizações, apresentadas nas figuras que a acompa-nha, em que:

A figura 1 apresenta o resultado de um experimento, demons-trando o efeito do pH e de tratamento por calor sobre a micelização de β-lactoglobulina.

A figura 2 mostra um meio para determinar o pH de micelizaçãode um preparado comercial (Bipro®, Lote JE032-1-420), empregando medi-das de turbidez a 500 nm.

A figura 3 é uma imagem micrográfica por Microscopia Eletrôni-ca de Transmissão de micelas de proteínas do soro de leite (2% em p, WPI95, Lactalis) em pH 7,4. A escala gráfica é de 200 nm.

A figura 4 exibe o resultado de um experimento que avalia o im-pacto da força iônica (Cloridrato de arginina) sobre a formação de micelasprotéicas em pH constante de 7,0.

A figura 5 mostra a estabilidade volumétrica (FVS) de espumaestabilizada por β-lactoglobulina micelar a 1% em peso (Davisco) em pH 7,0e na presença de cloridrato de arginina a 60 mM, comparada a de β-lactoglobulina não-micelizada.

A figura 6 mostra o diâmetro hidrodinâmico equivalente, baseadoem intensidade, de proteína do soro de leite obtida por tratamento térmico deuma dispersão de 1% em peso de β-lactoglobulina em peso total por 15 mina 85°C em pH variando de 2 a 8. Micelas de proteínas do soro de leite sãoobtidas em pH 4,25 (com carga positiva em potencial zeta em torno de+25mV) e em pH 6,0 (com carga negativa em potencial zeta em torno de -30mV). O diâmetro hidrodinâmico médio, calculado em função de Z, das mi-celas foi de 229,3 nm em pH 4,25 e de 227,2 nm em pH 6,0. São apresenta-das as imagens micrográficas correspondentes das micelas, obtidas porTEM após coloração negativa. A escala gráfica é de 1 pm.

A figura 7 apresenta uma estrutura altamente esquemática deuma micela de proteína do soro de leite.

A figura 8 apresenta uma imagem micrográfica por SEM (Mi-croscopia eletrônica de varredura) de uma micela de proteína do soro deleite em pó, obtida após secagem por atomização de uma dispersão de 20%de teor protéico após microfiltração.

Figura 9 é uma imagem micrográfica negativa de coloração emTEM de uma dispersão de micelas de proteínas do soro de leite, obtida em4% de teor protéico.

A figura 10 é uma imagem micrográfica negativa de coloraçãoem TEM de uma dispersão de micelas de proteínas do soro de leite, obtidacom 20% de teor protéico após microfiltração.

A figura 11 apresenta a estabilidade térmica de uma dispersãode micelas de proteína do soro de leite, obtida em 10% de teor protéico apósmicrofiltração em pH 7,0, na presença de NaCI, após aquecimento a 85°Cpor 15 min.

A figura 12 apresenta a estabilidade térmica de uma dispersãode micelas de proteína do soro de leite, obtida com 4% de teor protéico empH 7,0, na presença de NaCI, após aquecimento a 85°C por 15 min.

A figura 13 é uma imagem micrográfica negativa de coloraçãoem TEM de uma dispersão de 4% de micelas de proteínas do soro de leite àbase de micelas de proteína pura do soro de leite em pó seco por pulveriza-ção, após dispersão a 50°C em água deionizada.

A figura 14 é um gráfico exibindo a distribuição de tamanho demicelas obtidas pelo processo da invenção em proteína isolada do soro deleite a 4%, Prolacta 90, tratado em pH 5,9.

A figura 15 é uma imagem micrográfica em SEM, mostrando aestrutura interna após o corte de um grânulo de pó seco por pulverização,apresentado na figura 8.

A figura 16 é uma imagem micrográfica negativa de coloraçãoem TEM de uma dispersão de micelas de proteínas do soro de leite a 4% àbase de micelas de proteína pura do soro de leite micela em pó liofilizado,após permanecer em temperatura ambiente em água deionizada. A escalagráfica é de 0,5 micrometro.

A figura 17 é uma visão esquemática do revestimento de WPMpor SBO (oleato de butila sulfatado), ao ser aumentada a relação de misturaem pH 3,0. Círculo cinza: WPM com carga positiva na superfície. Frente +cauda preta: frente com carga negativa e cauda hidrofóbica do SBO.

A figura 18 é uma fotografia de concentrado de proteína do sorode leite em micelas a 20%, obtido após evaporação em que 4% de NaCI éadicionado.

A figura 19 é uma imagem micrográfica em microscopia emcampo de luz claro de corte semifino de micela de proteína do soro de leiteem pó, após coloração com azul de toluidina. A escala gráfica é de 50 mí-cron.

A figura 20 é uma imagem micrográfica em SEM da partículaoca de micela de proteína do soro de leite, após corte. Esquerda: estruturainterna. Direita: Detalhe da micela de proteína do soro de leite que compõe amatriz da partícula em pó. As escalas gráficas são 10 e 1 mícron, respecti-vamente.

Descrição Detalhada da Invenção

De acordo com a presente invenção, é provido um método parao preparo de agregados formados por proteína e agente ativo, sendo queeste agregado pode constituir um sistema de liberação no campo da nutriçãoe/ou cosmética. Os agregados da presente invenção são resultantes de as-sociação de micelas de proteínas do soro de leite com um agente ativo.As micelas de proteínas do soro de leite, utilizadas no método dapresente invenção, estão representadas esquematicamente na Figura 7, emque as proteínas do soro de leite estão arranjadas de maneira que as suaspartes hidrofílicas estão orientadas em direção à parte externa do aglomera-do, e as suas partes hidrofóbicas estão orientadas em direção ao "núcleo"interno da micela. Essa configuração energeticamente favorável oferece boaestabilidade a essas estruturas em ambiente hidrofílico.

A estrutura específica da micela pode ser observada a partir dasfiguras, especialmente as figuras 3, 9, 10, 13 e 15, em que as micelas utili-zadas na presente invenção consistem essencialmente em aglomeradosesféricos de proteína do soro de leite desnaturada. As micelas da presenteinvenção são caracterizadas especialmente por sua forma regular esférica.

Graças a seu atributo duplo (hidrofílico e hidrofóbico), esse esta-do desnaturado da proteína aparentemente possibilita a interação com umafase hidrofóbica, por exemplo, uma gotícula de gordura ou ar, e uma fasehidrofílica. As micelas da proteína do soro de leite possuem, por conseguin-te, propriedades emulsificantes e espumantes perfeitas.

Além disso, as micelas podem ser produzidas de maneira quepossuam distribuição extremamente exata de tamanho (consultar a figura14), de forma que não mais do que 80% das micelas produzidas possuirãotamanho inferior a 1 mícron, de preferência, entre 100 nm e 900 nm, maispreferivelmente entre 100-770 nm e, o mais preferível, entre 200 e 400 nm.

O diâmetro médio das micelas pode ser determinado com Mi-croscopia Eletrônica de Transmissão (TEM). Para tanto, as amostras de mi-celas líquidas são encapsuladas em tubos contendo ágar gel. A fixação érealizada por imersão em solução de glutaraldeído a 2,5% em tampão decacodilato a 0,1 M, pH 7,4 , e pós-fixação com tetróxido de ósmio a 2% nomesmo tampão, contendo as duas soluções o corante vermelho de rutênio a0,04%. Após desidratação com etanol em graduação em série (etanol a 70,80, 90, 96 e 100%), as amostras são embebidas em resina Spurr(Spurr/etanol 1:1, 2:1, 100%). Após polimerização da resina (70°C, 48 ho-ras), são efetuados cortes semifinos e ultrafinos com ultramicrótomo Leicaultracut UCT. Os cortes ultrafinos, corados com uranil-acetato aquoso e ci-trato de chumbo, são analisados, em seguida, por microscopia eletrônica detransmissão (Philips CM12, 80 kV).

Sem estar preso à teoria, acredita-se que durante a sua forma-ção, as micelas alcancem a micela atinge um tamanho "máximo", em decor-rência de sua carga eletrostática final que repele qualquer molécula adicionalde proteína, de forma que as micelas não são capazes de aumentar mais detamanho. Esse fato pode é responsável pela estreita distribuição de tamanhoobservada (conforme a figura 14).

As micelas descritas acima podem ser produzidas por um pro-cesso que é descrito detalhadamente abaixo.

Como a proteína do soro de leite a ser utilizada para a produçãode micelas de proteínas do soro de leite, é possível utilizar qualquer concen-trado ou proteína isolada do soro de leite à disposição no mercado, ou seja,proteína do soro de leite obtida por qualquer processo conhecido na técnica,destinado ao preparo de proteína do soro de leite, bem como frações de pro-teína do soro de leite, preparadas a partir dos mesmos, ou proteínas comoβ-lactoglobulina (BLG), α-lactalbumina e albumina sérica. Em especial, sorodoce, obtido como subproduto na fabricação de queijo, soro ácido, obtidocomo subproduto na fabricação de caseína ácida, soro natural, obtido pormicrofiltração de leite ou coalho obtido como subproduto na produção decaseína de coalho podem ser utilizados como a proteína do soro de leite. Aproteína do soro de leite pode ser proveniente de uma única fonte ou de mis-turas de quaisquer fontes. De preferência, a proteína do soro de leite nãodeve ser submetida a qualquer etapa, incluindo hidrólise, antes que as mice-las sejam formadas. Portanto, a proteína do soro de leite não é submetida atratamento enzimático antes que a micelização. De acordo com a invenção,é importante que a proteína do soro de leite seja utilizada no processo deformação de micelas e não hidrolisados da mesma.

A fonte de proteína do soro de leite para a produção de micelasnão se restringe a isolados de soro de leite de origem bovina, podendo serisolados de todas as espécies de mamíferos, como ovelha, cabras, éguas efêmeas de camelo. Ademais, o processo de produção aplica-se a prepara-dos de soro de leite mineralizados, desmineralizados ou ligeiramente mine-ralizado. Por "ligeiramente mineralizado", pretende-se significar qualquerpreparado de soro de leite após eliminação de minerais livres que são diali-sáveis ou diafiltráveis, porém que mantenha minerais associados ao mesmopor mineralização natural após preparação do concentrado ou de proteínasisoladas do soro de leite, por exemplo. Estes preparados de proteína do sorode leite "ligeiramente mineralizados" não possuem mineral especificadamen-te enriquecido.

As proteínas do soro de leite são uma fonte excelente de amino-ácidos essenciais (AA) (45%). Comparadas à caseína (contendo 0,3 g decisteína/100 g de proteína), proteínas de soro doce contêm 7 vezes maiscaseína e soro ácido, 10 vezes mais cisteína. A cisteína é o aminoácido quelimita a taxa de síntese de glutationa (GSH), tripeptídeo formado por gluta-mato de cisteína e glicina e que possui funções primárias importantes nadefesa do corpo em caso de estresse. As necessidades deste aminoácidopodem aumentar em caso de estresse e em pessoas idosas. Além disso, foidemonstrado que a complementação oral de glutationa com proteína do sorode leite aumenta níveis plasmáticos de GSH de pacientes infectados por HIV(Eur. J. Clin. Invest. 2001; 31, 171 -178).

Outros benefícios à saúde proporcionados por proteínas do sorode leite incluem aumento do desenvolvimento e constituição da massa mus-cular, bem como manutenção da massa muscular em crianças, adultos oupessoas idosas, aumento da função imune, melhora da função cognitiva,controle da glicose sangüínea de forma que estas sejam adequadas paradiabéticos, controle de peso e nível de saciedade, efeitos antiinflamatórios,cicatrização de feridas e reparo cutâneo, diminuição da pressão arterial, etc.

As proteínas do soro de leite exibem melhor coeficiente de eficá-cia protéica (PER = 118), em comparação ao da caseína (PER = 100). PERé uma medida de qualidade de proteína, avaliado pela determinação do nívelde ganho de peso em relação à quantidade de proteína ingerida. Ele podeser calculado pela seguinte fórmula:PER = ganho de peso corporal (g) / peso ingerido de proteína(g)·

Exemplos: PER % de Caseína

caseína 3,2 100

Ovo 3,8 118

Sorodeleite 3,8 118

Soja integral 2,5 78

Glúten de trigo 0,3 9

Para o processo de micelização, a quantidade presente de pro-teínas do soro de leite, em solução aquosa, pode ser de 0,1% a 12% do pe-so total, de preferência, variando de 0,1% a 8% do peso total, mais preferi-velmente, variando de 0,2% a 7% do peso total, ainda mais preferivelmentede 0,5% a 6% do peso total e, o mais preferível, variando de 1% a 4% dopeso total, com base no peso total da solução.

A solução aquosa do preparado de proteína do soro de leite,conforme existente antes que a etapa de micelização, pode compreendertambém compostos adicionais, como subprodutos dos respectivos proces-sos de produção de proteína do soro de leite, outras proteínas, gomas oucarboidratos. A solução pode conter também ingredientes alimentícios (gor-dura, carboidratos, extratos vegetais, etc). A quantidade destes compostosadicionais de preferência não excede 50% em peso, preferivelmente, 20%em peso e, mais preferivelmente, não excede 10% em pt do peso total dasolução.

A proteína do soro de leite, bem como as frações e/ou as princi-pais proteínas destas podem ser utilizadas em forma purificada ou na formade produto bruto. De preferência, o teor de cátions divalentes na proteína dosoro de leite para o preparo de concentrado de micelas de proteínas do sorode leite é inferior a 2,5%, mais preferivelmente, inferior a 2%, ainda mais pre-ferivelmente, inferior a 0,2%. O mais preferível é que as proteínas do soro deleite estejam completamente desmineralizadas.

O pH e força iônica são fatores importantes na micelização deproteínas do soro de leite. Dessa forma, foi constatado que, em relação aamostras extensamente dialisadas, virtualmente desprovidas ou depletadasde cátions livres como Ca, K, Na, Mg, submetidas a aquecimento duranteum período de tempo de 10 segundos a 2 horas em pH abaixo de 5,4, é ob-tida uma coalhada, enquanto que em pH acima de 6,8, este tratamento re-sulta em proteína solúvel do soro de leite (consultar a Figura 1). Portanto,somente neste intervalo bastante estreito de pH serão obtidas micelas deproteínas do soro de leite com diâmetro inferior a 1 μιη. A carga final destasmicelas será negativa. A mesma forma de micela pode ser obtida tambémsimetricamente abaixo do pH isoelétrico, ou seja, de 3,5 a 5,0, mais preferi-velmente, de 3,8 a 4,5, resultando em micelas com carga positiva (consultara Figura 6).

Por conseguinte, para serem obtidas micelas com carga positiva,a micelização de proteínas do soro de leite pode ser efetuada em soluçãolivre de sal em um valor de pH ajustado entre 3,8 e 4,5, dependendo do teormineral da fonte protéica.

De preferência, as micelas obtidas possuirão carga final negati-va. Portanto, o pH é ajustado para um valor que varia entre 6,3 a 9,0, paraum teor de cátions divalentes incluído entre 0,2% e 2,5%, presente na prote-ína do soro de leite em pó.

Mais especificamente, para serem obtidas micelas com carganegativa, o pH é ajustado para um valor que varia de 5,6 a 6,4, mais preferi-velmente, de 5,8 a 6,0 para um teor baixo de cátion divalente (por exemplo,inferior a 0,2% da proteína do soro de leite inicial em pó). O pH pode seraumentado até 8,4, dependendo do teor mineral contido na fonte da proteínado soro de leite (concentrado ou isolado). Em particular, o pH pode variarentre 7,5 a 8,4, de preferência, entre 7,6 a 8,0, para que micelas com carganegativa possam ser obtidas na presença de quantidades grandes de mine-rais livres, e o pH pode variar entre 6,4 a 7,4, de preferência, entre 6,6 a 7,2para serem obtidas micelas com carga negativa na presença de quantidadesmoderadas de minerais livres. De regra geral, quanto mais alto o teor de cál-cio e/ou magnésio na proteína do soro de leite inicial em pó, tanto mais altoo pH de micelização.A fim de padronizar as condições para formação das micelas deproteínas do soro de leite, pode ser mais preferível efetuar a desmineraliza-ção por qualquer técnica conhecida apropriada (diálise, ultrafiltração, osmo-se reversa, cromatografia por troca iônica...), de qualquer fonte de proteínaslíquidas naturais do soro de leite com concentração protéica variando entreaquela de soro doce, de permeado de leite ou soro ácido microfiltrado (0,9%de teor protéico), àquela de um concentrado com 30% de teor protéico. Adiálise pode ser efetuada contra água (destilada, deionizada ou doce), po-rém como esta possibilitará somente a retirada de íons fracamente ligadosàs proteínas do soro, é preferível efetuar a diálise contra ácido em pH abaixode 4,0 (orgânico ou inorgânico) para controlar melhor a composição iônicadas proteínas do soro de leite. Com isso, o pH de formação de micelas dasproteínas do soro de leite será menor do que 7,0, de preferência entre 5,8 a 6,6.

Antes de efetuar o aquecimento da solução aquosa contendo aproteína do soro de leite, o pH é ajustado geralmente pela adição de ácido,de preferência de grau alimentar, como ácido clorídrico, ácido fosfórico, áci-do acético, ácido cítrico, ácido glucônico ou ácido láctico. Quando o teor mi-neral é alto, o pH é ajustado geralmente pela adição de solução alcalina, depreferência de grau alimentar, como de hidróxido de sódio, hidróxido de po-tássio ou de hidróxido de amônia.

Alternativamente, se a etapa de ajuste de pH não for desejada, épossível ajustar a força iônica do preparado de proteína do soro de leitemantendo-se, ao mesmo tempo, o pH constante. Em seguida, a força iônicapode ser ajustada de maneira que permita a micelização em valor constantede pH igual a 7. A Figura 4 mostra que as micelas podem ser formadas emvalor constante de pH igual a 7,0 , enquanto que a força iônica varia pelaadição de cloridrato de arginina em concentração de 70-80 mM.

Um tampão pode ser ainda adicionado à solução aquosa paraevitar que o valor de pH altere muito durante o aquecimento da proteína dosoro de leite. Em princípio, o tampão pode ser selecionado entre qualquersistema de tampão de grau alimentar, ou seja, ácido acético e seus sais,como, por exemplo, acetato de sódio ou acetato de potássio, ácido fosfóricoe sais do mesmo, por exemplo, NaH2PO4, Na2HPO4, KH2PO4, K2HPO4, ouácido cítrico ou sais do mesmo, etc.

O ajuste do pH e/ou da força iônica da solução aquosa resultaem um processo controlado, levando à formação de micelas cujo tamanhovaria entre 100 nm -900 nm, de preferência entre 100 - 700 nm e, mais pre-ferivelmente, entre 200 - 400 nm. De preferência, a distribuição de micelascom dimensões entre 100 - 700 nm é acima de 80%, quando se conduz oprocesso de micelização aqui descrito (consultar a Figura 14).

É preferível que a proteína do soro de leite não passe por qual-quer etapa de hidrólise anterior à formação de micelas. Dessa forma, a pro-teína do soro de leite não é submetida a qualquer tratamento enzimático an-terior à micelização. De acordo com a invenção, é importante que a proteínado soro de leite seja utilizada na formação de micelas e não hidrolisadosdestas.

Em uma segunda etapa, a solução aquosa inicial de proteína dosoro de leite é, então, submetida a tratamento térmico. A esse respeito, foiconstatado que para se obter micelas de proteínas do soro de leite, é impor-tante manter a temperatura em uma faixa de aproximadamente 70 a abaixode 95°C, de preferência de aproximadamente 82 a aproximadamente 89°C,mais preferivelmente, de aproximadamente 84 a aproximadamente 87°C e, omais preferível, em aproximadamente 85°C. Foi constatado também que emescala industrial, é importante que a temperatura seja, de preferência, inferi-or a 95°C, mais preferivelmente, entre 80°C e 90°C e, o mais preferível, a-proximadamente 85°C.

Uma vez tendo sido atingida a temperatura desejada, a soluçãoinicial de proteína do soro de leite é mantida nesta temperatura por, no mí-nimo, 10 segundos e no máximo por 2 horas. De preferência, o período detempo durante o qual a solução aquosa de proteína do soro de leite é manti-da na temperatura desejada varia de 12 a 25 minutos, mais preferivelmente,de 12 a 20 minutos ou, o mais preferível, aproximadamente 15 minutos.

O tratamento térmico pode ser realizado também em forno demicro-ondas ou em qualquer equipamento semelhante que permita o aque-cimento por micro-ondas com relação tempo/quantidade de 10 s/10 ml parasolução de proteína a 4% em pt, aquecida em aparelho de 1500 W até atemperatura de ebulição (98°C em altitude de 833 m). Pode ser utilizadotambém processo contínuo por adição de 8 ou mais magnetrons em torno detubo de vidro, potencialmente prolongado por um tubo de suporte para au-mentar o tempo de incubação.

Conforme apresentado na Figura 2, as medições de turbidez sãoindicativas de formação de micelas. A turbidez média por absorvência a 500nm pode ser de pelo menos 3 unidades de absorvência para solução de 1%de proteína, porém pode atingir 16 unidades de absorvência quando o ren-dimento de micelização é acima de 80% (consultar a Figura 2).

Para ilustrar mais ainda o efeito de formação de micelas de umaperspectiva físico-química, uma dispersão a 1% peso de Bipro® foi aquecidapor 15 minutos a 85°C em pH 6,0 e 6,8 em água MilliQ. O diâmetro hidrodi-nâmico dos agregados obtidos após tratamento térmico foi medido por espa-Ihamento dinâmico de luz. O peso molecular aparente dos agregados foi de-terminado por espalhamento estático de luz, empregando o assim chamadográfico de Debye. A hidrofobicidade de superfície foi sondada com a sondahidrofóbica ANS e os grupos tiol livremente acessíveis, pelo método deDTNB, usando cisteína como o aminoácido padrão. Finalmente, a morfologiados agregados foi analisada por coloração negativa por TEM. Os resultadossão apresentados na Tabela 1.<table>table see original document page 16</column></row><table>A partir da Tabela 1, é evidente que as micelas da proteína dosoro de leite que foram formadas em pH 6,0 permitem que a proteína dimi-nua sua hidrofobicidade específica da superfície ANS por um fator de 2,comparado à proteína do soro de leite não micelar, aquecida na mesmacondição, porém em pH 6,8. A formação de micelas pode ser observadatambém no peso molecular muito alto de 27 χ 106 g.mol"1, comparado a 0,64X 106 g.mol'1 de proteína não micelar, indicando condensação muito grandeda matéria no interior da micela (teor baixo de água). Curiosamente, o po-tencial ζ das micelas é ainda mais negativo do que o das proteínas não- micelares, mesmo se as últimas tiverem sido formadas em pH mais básicodo que as micelas. Esse fato é resultante de uma superfície mais hidrofílicadas micelas que estão sendo expostas ao solvente. Finalmente, cabe obser-var que a reatividade do tiol das micelas é muito mais baixa do que o dasproteínas não-micelares em virtude de pH diferente do tratamento por calor.

Foi constatado que o rendimento da conversão de proteína ori-ginal do soro de leite para micelas diminui quando a concentração protéicainicial é aumenta antes de ajuste de pH e tratamento por calor. Por exemplo,quando o material inicial é proteína isolada do soro de leite Prolacta 90 (lote673 da Lactalis), o rendimento da formação de micelas de proteína do sorode leite decresce de 85% (quando se inicia com proteínas a 4%) para 50%(quando se inicia com 12% de proteínas). A fim de maximizar a formação demicelas de proteínas do soro de leite (>85% do teor protéico inicial), é me-lhor iniciar com solução aquosa de proteína do soro de leite com concentra-ção protéica abaixo de 12%, de preferência, abaixo de 4%. Dependendo dasaplicações finais pretendidas, a concentração protéica é ajustada antes queo tratamento por calor para ser obtido o melhor rendimento de micelas deproteínas do soro de leite.

As micelas das proteínas do soro de leite, obtidas de acordocom o processo descrito acima, com diâmetro inferior a 1μιτι, de preferência,de 100 a 990 nm, mais preferivelmente, de 100 a 700 nm e, o mais preferí-vel, de 200-400nm.

Dependendo da aplicação desejada, o rendimento de micelas éde pelo menos 50%, de preferência, de pelo menos, 80% e os agregadossolúveis residuais ou teor de proteínas solúveis é, de preferência, abaixo de20%. O tamanho médio das micelas é caracterizado por índice polidispersibi-lidade abaixo de 0,200. Foi observado que micelas de proteínas do soro deleite poderiam formar agregados em pH em torno de 4,5, sem, contudo, sinalmacroscópico de separação de fase após, pelo menos, 12 horas a 4°C.

A pureza das micelas de proteínas do soro de leite, que podemser produzidas de acordo com o processo aqui descrito, pode ser obtida pordeterminação da quantidade de proteínas solúveis residuais. As micelas sãoeliminadas por centrifugação a 20°C e 26900 g por 15 min. O sobrenadanteé utilizado para determinar o teor protéico em cubetas de quartzo a 280 nm(comprimento do percurso da luz de 1 cm). Os valores são expressos empercentual do valor inicial, antes que o tratamento térmico.

Proporção de micelas = (Quantidade de proteínas iniciais -quantidade de proteínas solúveis) / Quantidade de proteínas iniciais

As micelas de proteínas do soro de leite, obtidas de acordo comum processo aqui descrito, não foram submetidas a qualquer estresse me-cânico que conduza à redução do tamanho de partículas durante a sua for-mação. O processo induz micelização espontânea das proteínas do soro deleite durante tratamento térmico, na ausência de cisalhamento.

Micelas de proteínas do soro de leite, utilizadas na presente in-venção, podem ser produzidas de acordo com o processo de micelizaçãodescrito acima, porém não se limitam ao mesmo.

De acordo com uma concretização da presente invenção, o pro-cesso completo de micelização descrito acima pode ser conduzido em dis-persão de proteína natural do soro de leite e agente ativo, de tal forma que,ao serem formadas micelas, é produzido um agregado de proteína do sorode leite micela e agente ativo.

Dessa forma, o método compreende as etapas de dispersão deproteína natural do soro de leite e de um agente ativo em solução aquosa, edesnaturação da proteína do soro de leite em micelas de proteínas do sorode leite e formação de um agregado de micelas de proteínas do soro de leitee do agente ativo. A micelização pode ser conduzida de acordo com um pro-cesso descrito acima. De preferência, a micelização é conduzida por ajustedo pH da solução aquosa da proteína natural para um intervalo entre 5 e 8 eaquecimento da referida solução em temperatura entre 80°C e 95°C, de pre-ferência, abaixo de 95°C, mais preferivelmente, entre 80°C e 90°C e, o maispreferível, aproximadamente 85°C, por pelo menos 10 s.

De acordo com o mesmo, a quantidade de agente ativo presentena dispersão, anterior à micelização, é entre 0,1% e 50%.

Segundo um outro método da presente invenção, o agente ativoé disperso em solvente com micelas de proteínas do soro de leite. As mice-Ias de proteínas do soro de leite podem ser utilizadas no estado ou na formade concentrados e/ou pós das mesmas. Além disso, as micelas de proteínasdo soro de leite podem ser revestidas com emulsificante, como fosfolipídios,por exemplo, outros agentes de revestimento, como proteína, peptídeo, hi-drolisado protéico ou goma, como goma acácia, para modular a funcionali-dade das micelas de proteínas do soro de leite. Quando uma proteína é utili-zada como agente de revestimento, ela pode ser selecionada entre quais-quer proteínas que tenham ponto isoelétrico significativamente mais alto oumais baixo do que o da proteína do soro de leite. Estas incluem, por exem-pio, protamina, Iactoferrina e algumas proteínas de arroz. Quando um hidro-Iisado protéico é utilizado como agente de revestimento, este é de preferên-cia um hidrolisado de proteínas como protamina, lactoferrina, de arroz, case-ína, de soro de leite, trigo, proteína de soja ou misturas destas. De preferên-cia, o revestimento é feito com emulsificante selecionado entre oleato debutila sulfatado, ésteres de ácido diacetiltartárico de mono e diglicerídeos,ésteres de ácido cítrico de monoglicerídeos e misturas destes. A figura 17 éuma representação esquemática deste tipo de revestimento com oleato debutila sulfatado. Ademais, o processo de co-secagem por atomização, con-forme descrito ainda neste pedido, pode resultar também em revestimentodas micelas de proteínas do soro de leite.

Concentrados de micelas podem ser produzidos por evapora-ção, centrifugação, sedimentação, ultrafiltração e/ou microfiltração, por e-xemplo.

A evaporação pode ser conduzida nas micelas por alimentaçãoda suspensão das micelas obtidas após tratamento térmico em um evapora-dor sob vácuo, com temperatura entre 50°C e 85°C. O concentrado das mi-celas de proteínas do soro de leite, obtido por evaporação, tende a exibirtextura cremosa semi-sólida (conforme apresentado na Figura 18) e podeser utilizado nos métodos da presente invenção.

A centrifugação é conduzida com taxa alta de aceleração (acimade 2000 g) ou baixa (abaixo de 500 g), após acidificação da dispersão demicelas de proteína do soro de leite micela em pH abaixo de 5, de preferên-cia, 4,5.

A sedimentação espontânea pode ser conduzida também nadispersão de micelas de proteína do soro de leite por acidificação. De prefe-rência, o pH será 4,5 e o tempo de sedimentação, acima de 12 horas.

Alternativamente, as micelas de proteínas do soro de leite po-dem ser concentradas por microfiltração da suspensão das micelas, obtidaapós tratamento térmico. Essa técnica de enriquecimento não só permitirconcentrar micelas de proteínas do soro de leite pela retirada do solvente,porém permite também a retirada de proteína não-micelizada (como de pro-teínas naturais ou agregados solúveis). Portanto, o produto final é constituí-do somente de micelas (conforme pode ser verificado por Microscopia Ele-trônica de Transmissão - cf. figuras 9 e 10). Nesse caso, o fator de concen-tração possivelmente obtido após a vazão inicial do permeado através damembrana diminui para 20% de seu valor inicial.

O concentrado de proteína do soro de leite, obtido por microfil-tração, pode exibir concentração protéica de pelo menos 12%. Ademais, oconcentrado pode conter, pelo menos, 50%, de preferência, pelo menos80% da proteína sob a forma de micelas.

É interessante observar que o concentrado, se o teor protéico forajustado para 10%, possui a capacidade de suportar tratamento térmicosubseqüente a 85°C por 15 min em pH 7,0, na presença, por exemplo, decloreto de sódio em até 0,15 M, conforme apresentado na Figura 11. A títulode comparação, uma dispersão de proteína natural do soro de leite (Prolac-ta90, lote 500658 da Lactalis) forma um gel na presença de cloreto de sódioa 0,1 M, em concentração protéica de somente 4% (cf. a Figura 12). Essedado confirma a alta estabilidade a fatores externos das micelas de proteí-nas do soro de leite utilizadas na presente invenção.

Na presente invenção, as micelas podem ser providas sob aforma de micelas de proteínas do soro de leite ou de concentrado de micelasde proteínas do soro de leite em forma líquida como em dispersão, em formasemi-sólida ou em forma seca. O concentrado de micelas de proteínas dosoro de leite pode ser utilizado no estado ou diluído, dependendo da aplica-ção.

É possível obter micelas em forma seca por quaisquer técnicasconhecidas, como secagem por atomização, liofilização, secagem em tam-bor rotativo, etc, as quais podem ser conduzidas nas micelas de proteínasdo soro de leite ou em concentrados destas. De acordo com o meso, a se-cagem pode ser conduzida com ou sem adição de outros ingredientes.

A Figura 8 apresenta um pó obtido por secagem por atomizaçãosem adição de quaisquer outros ingredientes com tamanho médio de diâme-tro de partícula acima de 1 mícron pela agregação das micelas que ocorredurante a secagem por atomização. Estes pós têm como mediana, tipica-mente, do diâmetro médio volumétrico (D43) entre 45 e 55 mícrons, de prefe-rência, 51 mícrons. A mediana do diâmetro superficial (D32) destes pós é depreferência entre 3 e 4 mícrons, mais preferivelmente, sendo de 3,8 mícrons.

Nestes pós, o teor de umidade após secagem por atomização é,de preferência inferior a 10%, mais preferivelmente inferior a 4%.

Micelas de proteína do soro de leite micela em pó podem serutilizadas na presente invenção. De preferência, estes pós serão "puros"."Pó puro" significa um pó compreendendo, pelo menos, 90% de proteína dosoro de leite. As referidas micelas de proteínas do soro de leite em pó sãocaracterizadas por fluidez bastante alta. Estes pós comportam-se quase co-mo líquidos e apresentam as vantagens de fácil utilização e transferibilidade.O ângulo de repouso destes pós é de preferência abaixo de 35°, mais prefe-rivelmente, abaixo de 30°. Este ângulo pequeno de repouso permite que ospós possam ser utilizados como agentes de fluidez em aplicações cosméti-cas ou aplicações alimentícias, por exemplo.

Ademais, as micelas de proteínas do soro de leite em pó possu-em alta capacidade de ligação a solventes como água, glicerol, etanol, óleo,solventes orgânicos, etc. A capacidade de ligação dos pós a óleo é de pelomenos 30%, a água, de pelo menos 50%, de preferência, pelo menos 90%e, o mais preferível, de pelo menos 100%. Em relação a solventes como gli-cerol e etanol, a capacidade de ligação é de pelo menos 50%. Essa proprie-dade das micelas de proteína do soro de leite micela em pó permite que es-tas sejam pulverizadas ou preenchidas com outros agentes ativos, selecio-nados do grupo constituído por peptídeos, extratos vegetais, hidrolisadosprotéicos, bioativos, vitaminas, minerais, substâncias farmacêuticas, compo-nentes cosméticos, etc. e misturas destes. O complexo formado por atuar,então, como agente de liberação, de acordo com a presente invenção.

Uma característica importante de micelas de proteínas do sorode leite é a de que a estrutura básica micelar das proteínas do soro de leite éconservada no processamento ou reconstituição em solventes. A Figura 15apresenta um corte de grão de micela de proteína do soro de leite em pó eno qual micelas individualizadas de proteínas do soro de leite podem serobservadas. Ademais, a estrutura micelar pode ser facilmente reconstituídaem solventes. Foi demonstrado que os pós, obtidos de concentrado de mice-las de proteína do soro de leite, podem voltar facilmente a se dispersaremem água em temperatura ambiente ou a 50°C. O tamanho e estrutura dasmicelas de proteínas do soro de leite estão totalmente conservados, emcomparação ao concentrado inicial. Por exemplo, na Figura 13, o concentra-do de proteína do soro de leite que foi seco por pulverização em concentra-ção protéica de 20% voltou a ser disperso em água deionizada a 50°C emconcentração protéica de 50%. A estrutura das micelas foi sondada por TEMe pode ser comparada à da Figura 10. Foi obtida forma semelhante de mice-las. O diâmetro das micelas encontrado foi de 315 nm, por espalhamentodinâmico de luz com índice de polidispersibilidade de 0,2. A Figura 16 exibetambém a dispersão de micelas de proteína do soro de leite em pó Iiofiliza-do, em que as micelas são reconstituídas.

Micelas de proteínas do soro de leite, concentrados ou pós dasmesmas em qualquer forma podem ser utilizados para conduzir o método dapresente invenção. Elas podem estar em suspensão, em forma semi-sólidaou em forma seca. Dessa forma, em uma primeira etapa, é formada disper-são compreendendo micelas de proteínas do soro de leite e um agente ativo,em solvente. O solvente pode ser qualquer um. Por exemplo, pode ser água,solventes orgânicos, etanol, glicerol, óleos, etc.

Agentes ativos podem ser qualquer um selecionado entre vita-minas, minerais, antioxidantes, ácidos graxos poliinsaturados, peptídeos,extratos vegetais, hidrolisados protéicos, bioativos, aromatizantes, adoçan-tes, açúcares, polissacarídeos, sacarose, complementos, substâncias far-macêuticas, fármacos, componentes cosméticos, componentes sensíveis acalor, radiação UV, luz, oxigênio, metais, umidade, temperatura, etc. Podemser compostos instáveis como polifenóis (provenientes de café, chá verde,etc.), Iicopeno e outros carotenóides. Podem incluir compostos como cafeí-na, hesperidinas, sais solúveis ou insolúveis, bactérias probióticas, corantes,maltodextrinas, gorduras, emulsificantes, ligantes.

Os agentes ativos podem ser também minerais como Mg2+, Fe2+,Mn2+, etc. cuja liberação é controlada por consumo do produto alimentícioe/ou a aplicação da composição farmacêutica ou cosmética.

O agente ativo provido pode ser um único agente ou misturas deagentes ativos. Sua quantidade pode variar de 0,1% a 50% do peso total doagregado.

Os agentes ativos podem estar em forma seca que é adicionadaà dispersão de micelas de proteínas do soro de leite em solvente.

Alternativamente, o agente ativo pode estar em forma líquidaque é pulverizada diretamente sobre as micelas de proteínas do soro de Iei-te. A forma líquida pode ser a forma real do agente ativo ou pode resultar desua dissolução ou suspensão em um líquido. O referido líquido pode ser i-gual ao solvente no qual as micelas de proteínas do soro de leite e o agenteativo são dispersos de acordo com o método da presente invenção. Podetambém ser diferente.

Alternativamente, o agente ativo em forma líquida pode ser mis-turado a micelas de proteína do soro de leite micela em pó.

A evaporação do solvente da dispersão, para dar origem aosagregados, é conduzida em seguida. A evaporação pode ser realizada porqualquer tratamento específico, conhecido na técnica. De acordo com umaconcretização, a evaporação pode ser conduzida por secagem por atomiza-ção de forma que os agregados após a secagem por atomização estão emforma de pó misturado, compreendendo as micelas de proteínas do soro deleite agregadas ao agente ativo. Os agregados resultantes da mistura demicelas de proteína do soro de leite compreendem as micelas de proteínasdo soro de leite e agentes ativos em relação de peso que varia de 1:1 a1:1000.

Esta secagem por atomização concomitante resulta em pós quesão constituídos por micelas de proteínas do soro de leite aglomeradas ourevestidas com um ingrediente adicional.

As micelas de proteína do soro de leite em pó, obtidas pela pre-sente invenção, são caracterizadas por estrutura interna composta princi-palmente por esferas ocas, porém também colabadas (cf. a figura 19). A es-trutura em esferas ocas pode ser facilmente explicada pela formação da go-tícula de vapor no interior da gotícula do concentrado de WPM durante asecagem. Quando a gotícula de vapor sai da gotícula de WPM, em decor-rência de temperatura acima de 100°C, uma esfera oca permaneceu. A"forma em osso" é decorrente de evaporação da água, proveniente da gotí-cula, combinada à pressão externa na gotícula.

A estrutura interna das esferas ocas esféricas foi investigada porSEM após corte da partícula próximo a seu diâmetro (Figura 20, esquerda).A espessura da parede das partículas foi em torno de 5 pm e parecia muitolisa, enquanto que a estrutura interna exibia aspecto mais granuloso. O au-mento em magnitude revelou que este aspecto granuloso era de fato decor-rente da presença da WPM inicial que se fundiu para formar a matriz internada partícula em pó. Curiosamente, a forma esférica das micelas foi mantidadurante a secagem por atomização, bem como a distribuição homogênea dotamanho das partículas (Figura 20, direita).

Por tanto, microscopicamente, as micelas de proteína do soro deleite em pó são caracterizadas por morfologia granular única de esferas ocasou colabadas, contendo micelas intactas e individualizadas de proteínas dosoro de leite.

A evaporação pode ser evitada ao serem utilizadas micelas deproteína do soro de leite em pó, graças à capacidade destes pós de absor-verem o solvente em certa medida, enquanto ainda permanecem sob a for-ma de pó. De acordo com o mesmo, é provido um método para o preparo deagregados de micelas de proteína do soro de leite e agente ativo, segundo oqual o agente ativo é misturado a micelas de proteína do soro de leite em pó.De preferência, o pó conterá, pelo menos, 50% de micelas de proteínas dosoro de leite.

As micelas de proteínas do soro de leite em pó possuem altacapacidade de ligação a solventes, como água, solventes orgânicos, glicerol,etanol, óleos, etc. A capacidade de ligação das micelas de proteínas do sorode leite em pó a óleo é, pelo menos, de 30%, a água, de pelo menos, 50%,de preferência, de pelo menos 90% e o mais preferível de pelo menos 100%.Em relação a solventes como glicerol e etanol, a capacidade de ligação é depelo menos 50%.

Essa alta capacidade apresenta a vantagem de que o agenteativo pode ser adicionado à micela de proteína do soro de leite em pó emforma líquida por mistura, pulverização, etc., e a de que os agregados resul-tantes estão em forma de pó, sem requerer processamento posterior.

A quantidade incluída do agente ativo, na micela de proteína dosoro de leite em pó, pode variar de 0,1-50%, de preferência 2-20%. Portanto,o pó pode atuar como veículo de liberação para aqueles agentes ativos.

Graças ao seu caráter duplo hidrofóbico e hidrofílico, as micelasde proteínas do soro de leite são capazes de absorver compostos hidrofóbi-cos, além de hidrofílicos e solventes.Os agregados da presente invenção são aqueles que compre-endem pelo menos um agente ativo associado às micelas de proteínas dosoro de leite. Podem estar em forma de matriz de proteína do soro de leitecom pelo menos um agente ativo incorporado. A referida matriz de proteínado soro de leite pode estar em forma de polímero amorfo.

A presente invenção provê, portanto, um complexo de liberaçãode agente ativo que compreende micelas de proteínas do soro de leite e osreferidos agentes ativos.

Os agregados podem ser utilizados em aplicações nas quais aliberação lenta de ingredientes ativos é desejada. As micelas de proteínasdo soro de leite de fato apresentam a vantagem de possibilitar liberação con-trolada do agente ativo. Ademais, as micelas de proteínas do soro de leitepodem atuar como um veículo de liberação versátil que pode melhorar a bi-odisponibilidade de agentes ativos. As micelas podem de fato atuar comoveículo de liberação de lipídeos para vitaminas lipossolúveis, antioxidantes,ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa. Além disso, por um lado, elaspermitem a estabilização de compostos solúveis em água, como catequinas,polifenóis, etc., pela liberação de antioxidantes lipossolúveis. Por outro lado,podem estabilizar também compostos lipossolúveis, como ácidos graxospoliinsaturados de cadeia longa, vitamina E, etc., pela liberação de antioxi-dantes solúveis em água. Essa versatilidade apresenta uma grande vanta-gem sobre os sistemas de liberação já conhecidos.

Outras vantagens oferecidas pelos agregados da presente in-venção incluem a sua capacidade de modular percepção de sabor. Por e-xemplo, a percepção amarga da cafeína é reduzida quando esta é associa-da, como agente ativo, à micela de proteína do soro de leite de acordo coma presente invenção, e utilizada em barras nutritivas cafeinadas, por exem-plo. Por outro lado, estes agregados podem aumentar percepção de gostosalgado/doce.

Além disso, graças à presença de proteínas do soro de leite emmicelas, os agregados da presente invenção são também idealmente ade-quados para uso como emulsificante, substituto de gordura, substituto decaseína micelar ou agente espumante, uma vez que estes são capazes deestabilizar gordura e/ou ar em sistema aquoso por período prolongado.

A estabilidade da espuma é apresentada na Figura 5 que com-para o uso de proteína do soro de leite não-micelizada versus a proteína dosoro de leite micelizada da presente invenção.

Dessa forma, os agregados da presente invenção podem serutilizados como agente emulsificante, para o qual o material é idealmenteadequado, uma vez que o seu sabor é neutro, não sendo criado sabor estra-nho pelo uso deste material. Podem ser utilizados também como substitutode caseína micelar.

Adicionalmente, os presentes agregados estão ainda em condi-ção de servirem como agente branqueador, de forma que com um únicocomposto, várias funções são preenchidas. Como o soro de leite é um mate-rial de grande disponibilidade, o uso do mesmo reduz o custo de um produtoque requeira agente emulsificante, diluente, branqueador ou espumante.Quando utilizados em aplicações nutritivas, os agregados, portanto, contri-buem também para o valor nutritivo do alimento ao qual foram adicionados.

Além disso, o Coeficiente de Eficiência Protéica dos agregadosde micelas de proteína do soro de leite equivalente ao da proteína do sorode leite inicial é de pelo menos 100, de preferência pelo menos 110, o queos torna importantes ingredientes nutritivos.

De acordo com o mesmo, os agregados, obtidos de acordo comqualquer método da presente invenção, podem ser utilizados para prepararqualquer tipo de produto que requeira estabilização de emulsão ou espuma,como, por exemplo, mousse ou sorvete, café mocha, além de também emlaticínios de baixo teor ou essencialmente livres de gordura, ou tambémquando puderem ser aplicados como substitutos de caseína. Em aplicaçõescosméticas, podem ser utilizados em espumas, géis de cabelo, creme corpo-ral, pomadas, xampus, etc.

Além do mais, os agregados isoladamente ou junto a outros ma-teriais, como polissacarídeos (por exemplo, goma acácia ou carragenas)podem ajudar a estabilizar matrizes e, por exemplo, matrizes de espumaLáctea. Graças ao seu sabor neutro, o seu poder branqueador e a sua esta-bilidade, estes agregados podem ser utilizados para aumentar a brancura esensação na boca de leite desnatado.

Além de aumentar o poder branqueador de laticínios com omesmo teor de proteínas totais, o teor de gordura em matrizes alimentíciaspode ser reduzido empregando os agregados da presente invenção. Por po-derem ser utilizados como substitutos de gordura, ao mesmo tempo em quemantendo as propriedades estruturais, texturais e organolépticas, é possívelobter uma variedade mais ampla de produtos com baixo teor de gordura comos agregados de micelas de proteínas do soro de leite.

A presente invenção provê, portanto, um sistema pelo qual todasas vantagens descritas acima são oferecidas, ao mesmo tempo em que ain-da proporcionando o fornecimento e liberação de agentes ativos. Essa com-binação de efeitos apresenta uma vantagem imensa sobre os sistemas deliberação conhecidos da técnica. Ademais, o sistema de liberação da pre-sente invenção pode ser utilizado no campo da nutrição, farmacêutico e decosméticos.

Conseqüentemente, os agregados da presente invenção podemser utilizados em uma ampla gama de aplicações. Por exemplo, produtos deconsumo com alto teor de proteínas, contendo agentes ativos, como choco-late, barras nutritivas esportivas, barras energéticas, chiclete, etc., podemser produzidos com os agregados de proteína do soro de leite micelar.

Além disso, os agregados da presente invenção podem estarcontidos em qualquer tipo de produto alimentar e/ou cosmético e/ou compo-sições farmacêuticas como, por exemplo, laticínios, maionese, molhos desalada, leite UHT pasteurizado, leite condensado, iogurte, leites fermenta-dos, molhos, molhos com baixo teor de gordura, como molho béchamel, porexemplo, produtos fermentados à base de leite, achocolatados, mousses,espumas, emulsões, sorvetes, produtos à base de cereal fermentado, leiteem pó, alimentos/bebidas instantâneas em pó, leite para bebês, fortificantesdietéticos, ração para animais, comprimidos, xaropes, cremes, pomadas,sprays, produtos de cuidado corporal, suspensões bacterianas líquidas,complemento oral desidratado, complemento oral líquido, etc.

Outras aplicações incluem produtos para cuidado com a pele ebucal, como pasta de dente, chiclete ou agente de limpeza em goma, porexemplo.

Na presente invenção, qualquer lista exposta de ingredientesdestina-se a apresentar possíveis combinações dos referidos ingredientes,em qualquer relação possível.

Os exemplos seguintes ilustram a presente invenção e não pre-tendem limitar a mesma.

Exemplos

A invenção é definida ainda por referência aos exemplos seguin-tes que descrevem detalhadamente o preparo das micelas da presente in-venção. A abrangência da invenção descrita e reivindicada neste pedido nãoé limitada pelas concretizações específicas aqui expostas, uma vez que es-tas concretizações destinam-se apenas a ilustrar várias características dainvenção. Quaisquer concretizações equivalentes destinam-se a serem a-brangidas por esta invenção. De fato, várias modificações da invenção, alémdaquelas mostras e descritas neste pedido de patente se tornarão evidentespara os versados na técnica a partir da descrição precedente. Estas modifi-cações destinam-se também a se enquadrarem na abrangência de acordocom as reivindicações anexadas.

Exemplo 1: Micelização de β-Lactoglobulina

β-Lactoglobulina (lote JE002-8-922, 13-12-2000) foi obtida daDavisco (Le Sueur, MN, EUA). A proteína foi purificada de soro doce por ul-trafiltração e cromatografia por troca iônica. A composição do pó é 89,7% deproteína, 8,85% de umidade, 1,36% de cinzas (0,079% de Ca2+, 0,013% deMg2+, 0,097% de K+, 0,576% de Na+, 0,050% de Cl"). Todos os outros rea-gentes utilizados foram de grau analítico (Merck Darmstadt, Alemanha).

A solução protéica foi preparada em 0,2% de concentração porsolvatação de β-lactoglobulina em água MilliQ® (MiIIipore) e agitação a 20°Cpor 2 h. em seguida, o pH de alíquotas foi ajustado para 5,0; 5,2; 5,4; 5,6;5,8; 6,0; 6,2; 6,4; 6,6; 6,8 e 7,0 por adição de HCI. As soluções foram enva-sadas em frascos de 20 ml de vidro (Agilent Technologies) e lacradas comcápsulas de alumínio contendo lacre de silicone/PTFE. As soluções foramaquecidas a 85°C por 15 min (tempo para atingir a temperatura de 2,30 -3,00 min). Após o aquecimento, as amostras foram resfriadas em água gela-da até 20°C.

O aspecto visual dos produtos (Figura 1) indica que o pH ótimode micelização é 5,8.

Exemplo 2: Micelização de proteína a do soro de leite

Proteína isolada do soro de leite (WPI) (Bipro®, Lote JE032-1-420) foi obtida da Davisco (Le Sueur, MN, EUA). A composição do pó é a-presentada na Tabela 2.

A solução protéica foi preparada em 3,4% de proteína por solva-tação de proteína do soro de leite em pó em água MilliQ® (MiIIipore) e agita-ção a 20°C por 2 h. O pH inicial foi 7,2. Em seguida, o pH das alíquotas foiajustado para 5,6; 5,8; 6,0; 6,2; 6,4 e 6,6 por adição de HCI a 0,1 N.

As soluções foram colocadas em frascos de 20 ml de vidro (Agi-lent Technologies) e lacradas com cápsulas de alumínio com lacre de silico-ne/PTFE. As soluções foram aquecidas a 85°C por 15 min (tempo para atin-gir a temperatura de 2,30 - 3,00 min). Após o aquecimento, as amostras fo-ram resfriadas em água gelada até 20°C.

A turbidez das proteínas do soro de leite aquecidas foi determi-nada em 500 nm e 25°C, as amostras foram diluídas para permitir a mediçãoentre 0,1 - 3 unidades Abs (Espectrofotômetro Uvikon 810, Kontron Instru-ment). Foram calculados valores para a concentração inicial de proteínas a 3,4%.

O pH de micelização foi considerado quando a absorvência me-dida em 500 nm estabilizou-se (variação inferior a 5% do valor inicial), emintervalo de 10 minutos para a mesma amostra, conforme ilustrado pela figu-ra 2. Para esse produto, o pH ótimo de micelização foi de 6,0 a 6,2. Paraeste pH ajustado antes que o tratamento térmico, a turbidez estável foi de21% e a da proteína solúvel residual, avaliada por absorvência em 280 nmapós centrifugação, foi de 1,9%. É possível concluir que 45% das proteínasiniciais foram transformadas em micelas em pH de 6,0.Tabela 2: Composição de WPI e características da amostra após miceliza-ção

<table>table see original document page 31</column></row><table>

Exemplo 3: Observação microscópica de micelas

Produção de micelas:

Foi preparada uma solução protéica com 2% de proteínas porsolvatação de proteína do soro de leite em pó (WPI 90 lote 989/2, Lactalis,Retier, França) em água MilliQ® (Millipore), e agitada a 20°C por 2 h. O pHdas alíquotas foi ajustado, em seguida, com NaCI a 0,1 N ou NaOH a 0,1 N.

As soluções foram colocadas em frascos de vidro de 20 ml (Agi-lent Technologies) que foram lacrados com cápsulas de alumínio contendoum lacre de silício/PTFE. As soluções foram aquecidas a 85°C por 15 min(tempo para atingir a temperatura: 2min30 - 2min50). Após o tratamentotérmico, as amostras foram resfriadas em água gelada até 20°C. Para esteproduto, o pH ótimo de micelização foi 7,4.

Observações microscópicas:

Amostras de micelas líquidas foram encapsuladas em tubos deágar gel. A fixação foi obtida por imersão em solução de 2,5% de glutaralde-ido em tampão de cacodilato a 0,1 M e pH 7,4, e após a fixação, com tetró-xido de ósmio a 2% no mesmo tampão, as duas soluções contendo verme-lho de rutênio a 0,04%. Depois de desidratação em etanol em grau em série(etanol a 70, 80, 90, 96 e 100%), as amostras foram embebidas em resinaSpurr (Spurr/etanol 1:1, 2:1, 100%). Após polimerização da resina (70°C, 48horas), foram feitos cortes semifinos e ultrafinos com ultramicrótomo Leicaultracut UCT. Os cortes ultrafinos, corados com uranil-acetato aquoso e ci-trato de chumbo, foram examinados em microscopia eletrônica de transmis-são (Philips CM12, 80 kV).

A imagem micrográfica em TEM é apresentada na figura 3. Asmicelas obtidas apresentam forma esférica com diâmetro de 200 nm.

Distribuição de Tamanho de Partículas

As distribuições de tamanho das micelas, baseadas em intensi-dade, foram medidas para as micelas obtidas por tratamento térmico de dis-persão de β-lactoglobulina a 1% em peso total por 15 min a 85°C em pH de4,25 (com carga positiva em potencial zeta em torno de +25 mV) e em pH6,0 (com carga negativa em potencial zeta em torno de -30 mV). O diâmetrohidrodinâmico médio, calculado em função de Z, das micelas foi de 229,3 nmem pH 4,25 e de 227,2 nm em pH 6,0. As formações de agregados de β-LGe proteína do soro de leite foi acompanhada com espalhamento dinâmico deluz. Foi utilizado um aparelho Nanosizer ZS (Malvem Instruments, Reino U-nido), equipado com emissor de laser a 633 nm e 4,0 mW de energia. O ins-trumento foi utilizado na configuração de retro-espalhamento, em que a de-tecção é realizada em ângulo de espalhamento de 173°. Isso permite redu-ção considerável dos múltiplos sinais de espalhamento, presentes em amos-tras turvas. As amostras foram colocadas em uma célula de quartzo quadra-da (Hellma, comprimento de percurso de 1 cm). O comprimento do percursodo feixe de luz foi automaticamente configurado pelo aparelho, em função daturbidez da amostra (atenuação). A função de autocorrelação foi calculada apartir da flutuação da intensidade espalhada. Os resultados são apresenta-dos na figura 6. Estes resultados mostram que a partícula, em média, é ca-racterizada por índice de polidispersibilidade muito estreito (<0,200).Exemplo 4: Micelização de β-lactoglobulina em pH constante

O método descrito no exemplo 1 foi repetido com a condição deser utilizada uma solução aquosa contendo 2% de β-lactoglobulina. O pHdesta solução foi ajustado para 7,0, após adição de soluções de cloridrato dearginina para ser obtida concentração final de sal variando de 5 a 200 mM econcentração final de β-lactoglobulina de 1%. Foi conduzido, subseqüente-mente, tratamento térmico (80°C, 10 min, aproximadamente 2 min para au-mentar o calor) para produção de micelas.

Os resultados são apresentados na figura 4 e indicam claramen-te que apenas no intervalo de força iônica em torno de 50 a 70 mM, é possí-vel observar turbidez substancial, indicando a presença de micelas de prote-ínas do soro de leite.

Exemplo 5: Preparo de agente branqueador

Proteínas naturais do soro de leite (WPI 95 lote 848, Lactalis;solução aquosa de 8% em peso) foram tratadas de acordo com o exemplo 2.A clareza resultante do produto (L) foi medida em modo transreflectânciacom aparelho MacBeth CE-XTH D65 10 SCE, equipado com célula de medi-ção de 2 mm. A clareza resultante foi L = 74,8, valor que poderia ser compa-rado àquele de L = 74,5 de leite integral.

Exemplo 6: Preparo de café mocha

Proteínas naturais do soro de leite (Bipro®, lote JE 032-1-420,solução aquosa a 0,5% em peso) foram misturadas a 50°C com óleo depalma parcialmente hidrogenada a 10% em peso, 14% peso de maltodextri-na (DE 21) e na presença de tampão fosfato-citrato a 50 mM, ajustado parao pH de micelização de 6,0 para este Bipro®. A mistura foi homogeneizadasob 400/50 bars, utilizando homogeneizador Rannie, e submetida a trata-mento térmico, subseqüentemente, por 15 minutos a 85°C.

A emulsão obtida exibiu alta estabilidade por um período detempo de pelo menos um mês, sob condições de armazenamento a 4°C,fornecendo uma brancura de L = 78, comparado ao café mocha líquido dereferência (Crème à Café, Emmi, Suíça), contendo 15% de teor de gordura eclareza de L = 75,9.Exemplo 7: Preparo de espuma aquosa

β-lactoglobulina natural (Biopure, Davisco1 lote JE 002-8-922,solução aquosa a 2% em peso) foi misturada com uma solução de cloridratode arginina a 120 mM, de forma que a concentração final de β-lactoglobulinafosse de 1% em peso e a do cloridrato de arginina 60 mM. O pH foi ajustadoem seguida para 7,0 por adição de HCI a 1 Ν. A mistura foi submetida, en-tão, a tratamento térmico a 80°C por 10 minutos, para que 90% da β-Iactoglobulina inicial fosse convertida em micelas com diâmetro médio calcu-lado em função de Z de 130 nm. Nesse caso, o diâmetro das micelas foi de-terminado com aparelho Nanosizer ZS (Malvern Instruments, Reino Unido).A amostra foi despejada em cubeta de quartzo e variações da luz espalhadaforam registradas automaticamente. A função de autocorrelação obtida foiadequada com o método de acumulação, de forma que o coeficiente de difu-são das partículas pudesse ser calculado e, posteriormente, obtida a médiaem função de Z, empregando a lei de Stokes-Einstein. Para essa determina-ção, foi utilizado 1,33 como o índice de refração do solvente e 1,45 como odas micelas. Em seguida, 50 ml da dispersão resultante de β-lactoglobulinamicelar são convertidos em espuma por injeção de nitrogênio através de fritade vidro, gerando bolhas de 12-16 pm para produzir 180 cm3 em volume deespuma com o aparelho padronizado Foamscan™ (ITConcept). A estabili-dade volumétrica da espuma foi acompanhada, em seguida, a 26°C por aná-lise de imagem e comparada à estabilidade da espuma obtida com β-lactoglobulina tratada sob as mesmas condições, porém sem cloridrato dearginina, quando não houve formação de micelas. A figura 5 revela que aestabilidade volumétrica da espuma é melhora bastante pela presença demicelas de β-lactoglobulina.

Exemplo 8: Laticínios fermentados à base de soro de leite - testes de fermentação

Material

Proteína isolada de soro de leite (WPI) (Bipro®) obtida da Davis-co (Le Sueur, MN, EUA) (concentração protéica: 92,7%).

Soro de leite permeado seco por pulverização (Variolac 836):Concentração de lactose: 83% - Minerais: 8%

Ácido láctico a 50%

Lactose comestível (LactaIis)

Água deionizada

Método

Bipro® em pó foi dissolvido em água deionizada para ser obtidaconcentração protéica de 4,6%, ou seja, para 3 litros da solução: 154,5 g deWPI em pó e 2845,5 g de água. O tempo para hidratação foi de 3 horas. A-pós a hidratação, esta solução foi dividida em amostras de 200 ml em prepa-ração para os diferentes testes:

Tabela 3

<table>table see original document page 35</column></row><table>

Foi adicionado ácido láctico a 50 % a cada solução para ajustedo pH, antes do aquecimento.

As amostras foram aquecidas com a caldeira dupla até 85°C emantidas nesta temperatura durante 15 minutos. Após o aquecimento, assoluções foram resfriadas a 40°C e inoculadas com Lactobacillus bulgaricuse Streptococcus thermophilus. As amostras permaneceram 5h30 em sala devapor a 41°C antes de serem colocadas em sala gelada a 6°C.

Os resultados são apresentados na Tabela 4.Tabela 4

<table>table see original document page 36</column></row><table>

Exemplo 9: Sorvete injetado com proteína do soro de leite com teor de gor-dura reduzidoMaterial

Proteína isolada do soro de leite (WPI1 Prolacta90® da Lactalis,Rétiers, França) com 90% de teor protéico

Leite magro em pó com 35% de teor protéicoSacarose

Maltodextrinas DE39

Nata anidra

Emulsificante

Água deionizada

Ácido clorídrico comestível a 1M

Método

Foi efetuada a dispersão, em um tanque de 80 litros de revesti-mento duplo, de Prolacta90® em pó a 50°C em água deionizada e concen-tração protéica de 9,67% em peso, sob agitação leve para evitar a formaçãode espuma, ou seja, 3,3 kg de Prolacta90® foram dispersos em 31,05 kg deágua deionizada. Após 1 hora de dispersão, foi efetuado ajuste para o pH demicelização por adição de HCI. A temperatura da dispersão foi aumentadapara 85°C e mantida por 15 minutos para gerar as micelas de proteínas dosoro de leite. Após 15 minutos, a temperatura foi diminuída para 50°C e osoutros ingredientes foram adicionados em seqüência à dispersão das mice-las (ou seja, leite magro em pó, maltodextrinas DE39, sacarose, emulsifican-te e nata anídrica). A quantidade final da mistura foi 50 kg com teor de sóli-dos totais de 39,5% e teor de gordura de 5% em peso. Após 30 minutos dehidratação, a mistura foi homogeneizada em duas etapas (80/20 bars) e pas-teurizada (86°C/30 s) antes de envelhecer durante a noite.

No dia seguinte, a mistura de sorvete foi congelada em 100% devolume de incorporação de ar com o equipamento Hoyer MF50 e endurecidaa -40°C, antes de ser armazenada a -20°C. O sorvete final continha 8% empeso de proteínas (20% de caseínas, 80% de proteínas do soro de leite) e5% em peso de gordura na base para mistura do sorvete.

Exemplo 10: Micelas de proteínas do soro de leite em pó obtidas por seca-gem por atomização

Material

Proteína isolada do soro de leite (WPI, Prolacta90® da Lactalis,Rétiers, França) com 90% de teor protéico

Lactose comestívelMaltodextrinas DE39Água deionizadaÁcido clorídrico comestível a 1 M

Método

Foi efetuada a dispersão, em tanque de 100 litros de revestimen-to duplo, de Prolacta90® em pó a 50°C em água deionizada e concentraçãoprotéica de 10% em peso, sob agitação leve para evitar a formação de es-puma, ou seja, 11 kg de Prolacta90® foram dispersos em 89 kg de águadeionizada. Após 1 hora de dispersão, foi efetuado ajuste para o pH de mi-celização (em torno de 6,3 neste caso) por adição de HCI. A temperatura dadispersão foi aumentada para 85°C e mantida por 15 minutos para gerar asmicelas de proteínas do soro de leite. Após 15 minutos, a temperatura foidiminuída para 50°C e a dispersão de micelas de proteínas do soro de leite a10% em peso foi dividida em dois lotes de 50 kg. Em um primeiro teste, 20kg de Iactose foram dispersos em 50 kg da dispersão de micelas a 50°C eagitados por 30 min. Da mesma forma, 20 kg de maltodextrinas DE39 foramadicionados aos demais 50 kg da dispersão de micelas de proteínas do sorode leite.

As duas misturas foram secadas por pulverização em seguidaem uma torre NIRO SD6.3N em vazão de 15 l/h. A temperatura de entradado ar era 140°C e a de saída, 80°C. O teor hídrico do material em pó obtidofoi inferior a 5%.

O tamanho das micelas de proteínas do soro de leite foi deter-minado em presença de Iactose e maltodextrina (DE39) em água por espa- Ihamento dinâmico de luz antes e após a secagem por atomização. A con-centração de proteínas totais foi estabelecida em 0,4% em peso por diluiçãoda dispersão antes de secagem por atomização ou reconstituição do pó paraque o regime de viscosidade do material diluído fosse o de micelas de prote-ínas do soro de leite. Foi utilizado um aparelho Nanosizer ZS (Malvern Ins-truments) e a média do diâmetro calculada a partir de 20 medições.

O diâmetro de partícula determinado para micelas de proteínasdo soro de leite na presença de Iactose e maltodextrinas (DE39) foi de 310,4nm e 306,6, respectivamente. Após reconstituição dos pós, os diâmetroscorrespondentes encontrados foram 265,3 nm e 268,5, respectivamente.Essas medições confirmam que as micelas de proteínas do soro de leite e-ram fisicamente estáveis com referência à secagem por atomização. Os re-sultados foram corroborados por observações microscópicas em TEM dis-persões de micelas de proteínas do soro de leite a 0,1% em peso com colo-ração negativa na presença de ácido fototungstênico a 1% em pH 7. Foi uti-lizado um microscópio eletrônico de transmissão CM12 da Philips, operandoem 80 kV. Micelas de proteínas do soro de leite foram observadas em solu-ção antes de secagem por desidratação e após a reconstituição do pó secopor pulverização. Nenhuma diferença de morfologia e estrutura pode ser de-tectada.

Exemplo 11: Concentração por evaporação

Foi efetuada a reconstituição de proteína isolada do soro de lei-te, Prolacta 90 da Lactalis (lote 500648), a 15°C em água doce e concentra-ção protéica de 4%, para ser obtido o tamanho final de lote de 2500 kg. OpH foi ajustado por adição de ácido clorídrico a 1 M, de forma que o valorfinal do pH fosse de 5,90. A dispersão de proteína do soro de leite foi bom-beada através de um permutador de calor de placas para mistura dé APVem vazão de 500 l/h. O preaquecimento a 60°C foi seguido por tratamentotérmico de 85°C por 15 minutos. A formação de micelas de proteínas do sorode leite foi verificada por medição de tamanho de partícula com espalhamen-to dinâmico de luz, bem como medição de turbidez a 500 nm. A dispersãoobtida contendo 4% de micelas de proteínas do soro de leite foi caracteriza-da por raio hidrodinâmico de partículas de 250 nm, índice de polidispersibili-dade de 0,13 e turbidez de 80. A dispersão de micelas de proteína do sorode leite foi utilizada em seguida para alimentar um evaporador Scheffers emvazão de 500 l/h. A temperatura e vácuo no evaporador foram adaptados deforma que em torno de 500 kg de concentrado de micelas de proteínas dosoro de leite com 20% de concentração protéica foram produzidos e resfria-dos para 4°C.

Exemplo 12: Enriquecimento por microfiltração

Foi efetuada a reconstituição de proteína isolada do soro de lei-te, Prolacta 90 da Lactalis (lote 500648), a 15°C em água doce e concentra-ção protéica de 4% para ser obtido tamanho final de lote de 2500 kg. O pHfoi ajustado por adição de ácido clorídrico a 1M, de forma que o valor final depH fosse de pH 5,90. A dispersão de proteína do soro de leite foi bombeadaatravés de um permutador de calor de placas para mistura de APV em vazãode 500 l/h. O preaquecimento a 60°C foi seguido por tratamento térmico de85°C por 15 minutos. A formação de micelas de proteínas do soro de leite foiverificada por medição de tamanho de partícula com espalhamento dinâmicode luz, bem como medição de turbidez a 500 nm. A dispersão obtida con-tendo 4% de micelas de proteínas do soro de leite foi caracterizada por raiohidrodinâmico de partículas de 260 nm, índice de polidispersibilidade de 0,07e turbidez de 80. A forma micelar da proteína foi verificada também por TEM,e estruturas micelares com diâmetro médio de 150-200 nm puderam ser vis-tas claramente (figura 9). A dispersão de micelas de proteína do soro de leitepode ser resfriada a 4°C para armazenamento, ou utilizada diretamente paraalimentar uma unidade de filtração equipada com membrana M14 Carbosepde 6,8 m2em vazão de 180 l/h. Nesse caso, as micelas de proteína do sorode leite foram concentradas em temperatura de 10 a 70°C, até que a vazãodo atingisse 70 l/h. Nesse caso, o concentrado final de proteína do soro deleite continha 20% de proteínas. A estrutura das micelas no concentrado foiverificada por TEM, e claramente nenhuma alteração significativa foi visível,comparado à dispersão de proteína do soro de leite a 4%, antes que a mi-crofiltração (figura 10).

Exemplo 13: Micelas de proteínas do soro de leite em pó compreendendopelo menos 90% de proteína do soro de leite.

200 kg de um concentrado de micelas de proteína do soro deleite, obtido por microfiltração, com 20% de proteínas (consultar o exemploacima) foram injetados em uma torre Niro SD6.3N por bocal de atomização(0 = 0,5 mm, ângulo de pulverização = 65°, pressão = 40 bars) em vazão doproduto de 25 kg/h. A temperatura de entrada do produto era 150°C e a desaída, 75°C. O fluxo de ar na torre era de 150 m3/h. O teor de umidade no póera inferior a 4%, sendo o pó caracterizado por fluidez muito alta. A micros-copia eletrônica de varredura do pó exibiu partículas muito esféricas comdiâmetro aparente variando de 10 a 100 pm (figura 8).

Exemplo 14: Micelas de proteína misturada do soro de leite em pó

20 kg de concentrado de micelas de proteína do soro de leiteforam misturados com 1,7 kg de maltodextrínas com DE 39, para que a rela-ção final entre micela de proteína do soro de leite e maltodextrina em pó fos-se de 70/30. Esta mistura foi injetada em uma torre Niro SD6.3N por bocalde atomização (0 = 0,5 mm, ângulo de pulverização = 65°, pressão = 40bars) em vazão do produto de 25 kg/h. A temperatura de entrada do produtoera de 150°C e a de saída, 75°C. O fluxo de ar na torre era de 150 m3/h. Oteor de umidade no pó foi inferior a 4% e o pó caracterizado por fluidez muitoalta.

Os pós dos exemplos 13 e 14, quando reconstituídos em água,compreendem essencialmente micelas com a mesma estrutura e morfologiado concentrado de micelas de proteína do soro de leite.Exemplo 15: Micelas de proteína do soro de leite em pó, obtidas por Iiofiliza-ção

Material

Concentrado de micelas de proteína do soro de leite de 20% de proteína,produzido por microfiltração no exemplo 12, com 90% de teor protéicoMétodo

100g de concentrado de micelas de proteínas do soro de leiteforam introduzidos em um béquer de plástico e congelados a -25°C por umasemana. Este béquer foi colocado, em seguida, no Iiofilizador Virtis de esca-la laboratório, equipado com bomba de vácuo. A amostra foi deixada por 7dias até que a pressão no Iiofilizados permanecesse constante em aproxi-madamente 30 mbars. Cerca de 20 g de micelas Iiofilizadas de proteínas dosoro de leite foram recuperados.

Exemplo 16: Chocolate negro enriquecido com proteína do soro de leite semsacarose

Material

<table>table see original document page 41</column></row><table>Método

Licor de cacau é misturado com manteiga de cacau, gordura demanteiga, micelas de proteína do soro de leite em pó, sucralose, vanilina elecitina. Essa mistura é acondicionada em conchas que permanecem emrepouso durante a noite a 65°C até ser obtida uma pasta homogênea. Essamassa de chocolate é moldada, em seguida, em tabletes de chocolate e res-friada. O chocolate negro é caracterizado por teor final de proteína do sorode leite de 45-50%.

Exemplo 17: Chocolate branco enriquecido com proteína do soro de leiteMaterial

<table>table see original document page 42</column></row><table>

Método 1

É efetuada a mistura de micelas proteínas do soro de leite, sorode leite em pó, sacarose e de vanilina, seguida por trituração até ser obtida adistribuição de tamanho de partícula desejada. Esta mistura é acondiciona-da, em seguida, em conchas que permanecem em repouso durante a noite a65°C, junto com manteiga de cacau, nata anídrica e lecitina até ser obtidauma pasta homogênea. Essa massa de chocolate é moldada, em seguida,em barras de chocolate e resfriada. Este chocolate branco é caracterizadopor 20% de teor final de proteína do soro de leite

Método 2

É efetuada a mistura de proteínas do soro de leite, soro de leiteem pó, sacarose e de vanilina, seguida por trituração até ser obtida a distri-buição de tamanho de partícula desejada. Esta mistura é acondicionada emconchas que permanecem em repouso durante a noite a 65°C, junto commanteiga de cacau, nata anídrica e lecitina, até ser obtida uma pasta homo-gênea. Essa massa de chocolate é moldada, em seguida, em barras de cho-colate e resfriada. Este chocolate branco é caracterizado por 30% de teorfinal de proteína do soro de leite.

Método 3

É efetuada a mistura de proteínas do soro de leite, sacarose ede vanilina, seguida por trituração até ser obtida a distribuição de tamanhode partícula desejada. Esta mistura é acondicionada em conchas que per-manecem em repouso durante a noite a 65°C, junto com manteiga de cacau,nata anídrica e lecitina, até ser obtida uma pasta homogênea. Essa massade chocolate é moldada, em seguida, em barras de chocolate e resfriada.

Este chocolate branco é caracterizado por 30-35% de teor final de proteínado soro de leite.

Exemplo 18: Dispersão aquosa de micelas de proteínas do soro de leite re-vestidas com oleato de butila sulfatado (SBO) ou qualquer outro emulsifican-te de carga negativa

Material

Micelas de proteína do soro de leite micela (WPM) em pó do e-xemplo 13 com 90% de teor protéico

SBO

Ácido clorídrico (1M)

Método

WPM em pó, descritas no exemplo 13, são dispersas em águaMilliQ para ser atingida 0,1% em peso de concentração protéica final do pe-so total. Essa dispersão é filtrada em filtros de 0,45 μm para remoção depossíveis agregados de WPM. O pH desta dispersão de WPM foi diminuídoaté 3,0 por adição de ácido clorídrico a 1M. É preparada uma dispersão de1 % de SBO do peso total em pH 3,0.

O raio hidrodinâmico e potencial zeta destas WPM foram determinados com o aparelho Nanosizer ZS (Malvern Instruments Ltd.). O diâme-tro foi 250 nm e a mobilidade eletroforética + 2,5 pm.cm.V1.s"1. O raio hidro-dinâmico e mobilidade eletroforética da dispersão de SBO em pH 3,0 são 4nm e - 1,5/-2,0 pm.cm.vVs"1, respectivamente.

Após ter sido conduzida essa caracterização preliminar, a dis-persão de SBO é utilizada para titular a de WPM, ao mesmo tempo em quese acompanha a evolução do raio hidrodinâmico e da mobilidade eletroforé-tica da mistura. Foi observado que o rádio hidrodinâmico permaneceu cons-tante em torno de 250 - 300 nm, até ser atingida a relação de peso da mistu-ra WPM/SOB de 5:1. Nesse ponto, o raio hidrodinâmico desvia radicalmentepara 20000 nm, sendo observada precipitação de complexos WPM-SOB. Aoser adicionado mais SBO, em uma relação de mistura acima de 5:1, o rádiohidrodinâmico diminuiu progressivamente até 250 nm, conforme observadoinicialmente para WPM, nivelando a partir da relação de 4:1 em diante. Emseguida, foi observado que a mobilidade eletroforética da mistura diminuíaao ser adicionado SBO, atingindo valor zero para relação de mistura de 5:1.Depois, continuou a diminuir ao ser adicionado SBO, começando a nivelarem - 3,0 pm.cm.V"1.s"\ a partir da relação de 4:1 em diante.

A explicação para esses resultados é que WPM com carga posi-tiva são, em uma primeira etapa, revestidas eIetrostaticamente com a pontanegativa do SBO até ser atingida completa neutralização da carga (relaçãode mistura de 5:1). Nesse ponto, as caudas hidrofóbicas do SBO são capa-zes de auto-associarem-se, conduzindo à hiperagregação com diâmetro hi-drodinâmico muito grande e precipitação de complexos. Ao ser adicionadomais SBO, as caudas hidrofóbicas associam-se mais ainda formando umduplo revestimento e expondo os seus pontos negativos ao solvente. O re-sultado é que WPM com carga negativa e duplo revestimento de SBO (con-sultar a figura 17) é comparável a Iipossoma constituído por núcleo protéico.

Resultados semelhantes foram obtidos com outros Emulsifican-tes ácidos de grau alimentar como DATEM, CITREM, SSL (da Danisco), emsolução aquosa em pH 4,2, quando estes são mantidos principalmente emsua forma aniônica (em função do grupamento químico -COO').Exemplo 19: Molho béchamel enriquecido com proteínaMaterial

Mistura de micelas de proteína do soro de leite em pó do exem-plo 14 com 70% de teor protéicoManteiga

FarinhaLeite magroSal

Método

30 g de proteínas misturadas do soro de leite em pó são disper-sos em 1 litro de leite magro sob aquecimento. 30 g de manteiga e 80 g defarinha são adicionados, em seguida, junto com 2,85 g de sal. A mistura éfervida, em seguida, para produzir molho béchamel com teor protéico de pro-teína do soro de leite em torno de 3 g/100 g.

Exemplo 20: Base para barra energética enriquecida com proteína do sorode leiteMaterial

Ingredientes PercentualMistura de micelas de proteína do soro de leite em pó do exemplo 13 com 90% de teor protéico (umidade: 3,5%) 40-50%Xarope de arroz integral 35-45%Maltitol 5-10%Glicerol 10-15%

Método

Xarope de arroz integral é misturado com maltitol e glicerol a25°C. Micelas de proteína do soro de leite em pó são adicionadas, em se-guida, e misturadas por 10 minutos. É obtida, em seguida, uma base parabarra energética enriquecida com proteína do soro de leite que pode ser mis-turada a outros ingredientes (minerais, vitaminas, sabores). Este preparadocontém mais proteínas do que o leite (38%).

Exemplo 21: Determinação de ângulo de repouso para micelas de proteínado soro de leite em pó seco por pulverização, misturas de micelas de proteí-na do soro de leite em pó, proteína isolada do soro de leite em pó e leitemagro de baixo aquecimento em pó

Material

Micelas de proteína do soro de leite em pó do exemplo 12 com90% de teor protéico (umidade: 3,5%)

Mistura de micelas de proteína do soro de leite em pó do exem-plo 13 com 90% de teor protéico (Umidade:3,5%)

Proteína isolada do soro de leite em pó, Prolacta 90 (lote 500658da Lactalis, França; umidade: 4%)

Leite magro de baixo aquecimento em pó (lote 334314 da Emmi,Suíça; Umidade: 3,5%)

Medidor descrito para medir ângulo de repouso de pós, de acor-do com a norma ISO 4324

Método

O pó é colocado em um funil com diâmetro do tubo de 99 mm eforçado a escoar com o agitador. O pó cai em um recipiente plástico transpa-rente com 100 mm de diâmetro e 25 mm de altura. O ângulo de repouso, Φ,é medido a partir da seguinte equação:

Ângulo de repouso Φ = ARCTAN (2h/100)

Quando h é a altura máxima do cone do pó que pode ser obtido,toda a superfície do recipiente de plástico é coberta com pó.

Resultados do teste de ângulo de repouso (os valores são a mé-dia de 3 medições e o desvio padrão é indicado).

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Os resultados do teste revelam claramente que o ângulo de re-pouso de micelas de proteína do soro de leite micela em pó, misturadas commaltodextinas ou puras, é significativamente menor do que o do pó inicialcontendo proteínas do soro de leite ou até mesmo o do leite magro em pó.Ângulo de repouso abaixo de 35° é característico de pós muito fluídos.Exemplo 22: Receita para se obter veículo de liberação de extrato de cháverde.

Método 1

5ml de solução de extrato de chá verde a 20% foram despejadossobre 10g de pó puro de micelas de proteína do soro de leite e, em seguida,agitados vigorosamente em um béquer. O pó absorveu toda a fase líquida. Aágua residual foi eliminada por secagem a 60°C em estufa durante 18 horas.O produto final contém 9% de extrato de chá verde.

Método 2

30 ml de extrato alcoólico de chá verde foram despejados sobre70g de pó puro de micelas de soro de leite e, em seguida, agitados. O pro-duto final apresentava cor verde muito suave. O etanol foi evaporado emtemperatura ambiente.

Exemplo 23: Receita para se obter veículo de liberação de cafeína.

10ml de cafeína a 2% foram despejados sobre 10g de pó purode micelas de proteína do soro de leite e, em seguida, agitados vigorosa-mente em um béquer. O pó absorveu toda a fase líquida. A secagem a 60°Cem estufa, durante 18 horas, eliminou a água residual. O produto final con-tém 1,7% de cafeína. O produto final compacto foi triturado manualmente etestado. O produto era crocante e não se percebeu acidez, apesar deste teoralto de cafeína.

Exemplo 24: Receita para se obter veículo de liberação de extrato de café.

5ml de solução contendo 20% de extrato de café solúvel foramdespejados sobre 10g de pó puro de micelas de proteína do soro de leite e,em seguida, agitados vigorosamente em um béquer. O pó absorveu toda afase líquida. A secagem a 60°C em estufa durante 18 horas eliminou a águaresidual. O produto final continha 9% de extrato de café solúvel, era muitocrocante e exibiu sabor forte de café.

Exemplo 25: Receita para se obter veículo de liberação de licopeno.

30 ml de extrato alcoólico saturado de licopeno foram despeja-dos sobre 70g de pó puro micelar e, em seguida, agitados. O produto finalapresentou cor laranja muito suave. O etanol evaporou em temperatura am-biente.

Claims (33)

1. Método para preparo de agregados de micelas de proteínas eagente ativo, o método compreendendo as etapas de:- dispersão de micelas de proteína do soro de leite e do agenteativo em um solvente, e- evaporação do solvente.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o solvente éselecionado entre água, solventes orgânicos, etanol, glicerol e óleos.

3. Método de acordo com as reivindicações 1 a 3, em que o agenteativo está presente em forma seca antes de dispersão em um solvente.

4. Método de acordo com as reivindicações 1 a 3, em que o agenteativo está presente em forma líquida antes de dispersão em um solvente.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o agenteativo é atomizado sobre as micelas de proteína do soro de leite.

6. Método de acordo com qualquer uma de acordo com as rei-vindicações precedentes, em que a evaporação é realizada por secagem poratomização.

7. Método de preparo de agregados de proteínas e um agenteativo, o método compreendendo as etapas de:- dispersão da proteína de soro de leite natural e de um agenteativo em solução aquosa, e- desnaturação da proteína do soro de leite até micelas de prote-ína do soro de leite e formação de um agregado constituído por micelas deproteína do soro de leite e o agente ativo.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que a desnatu-ração é realizada por ajuste do pH da solução aquosa até um intervalo entre-5 e 8, e aquecimento da referida solução em uma temperatura entre 80°C e-98°C por, pelo menos, 10 segundos.

9. Método de preparo de agregados de proteína e um agenteativo, o método compreendendo a etapa de:mistura de micelas de proteína do soro de leite em pó com umagente ativo.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o agenteativo está em um solvente antes de ser misturado.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o solven-te pode ser água, solventes orgânicos, etanol, glicerol e óleos.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 11, em que as micelas de proteína do soro de leite em pó possuem ca-pacidade de ligação de, pelo menos, 30% para o solvente.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 12, em que as micelas de proteína do soro de leite em pó compreendem,pelo menos, 50% de micelas.

14. Método de acordo com qualquer uma de acordo com as rei-vindicações precedentes, em que o agente ativo é selecionado entre vitami-nas, minerais, antioxidantes, ácidos graxos poliinsaturados, peptídeos, extra-tos de plantas, hidrolisados de proteína, bioativos, aromatizantes, adoçantes,áçucares, polissacarídeos, sacarose, complementos, agentes farmacêuticos,fármacos, componentes cosméticos, polifenóis, por exemplo, provenientesde café ou chá verde, etc., licopeno, carotenóides, cafeína, hesperidinas,sais solúveis e insolúveis, bactérias probióticas, corantes, maltodextrinas,gorduras, emulsificantes, Iigantes e quaisquer misturas destes.

15. Método de acordo com qualquer uma de acordo com as rei-vindicações precedentes, em que o agente ativo é selecionado entre com-ponentes sensíveis a calor, radiação UV, luz, oxigênio, metais, umidade,temperatura.

16. Método de acordo com qualquer uma de acordo com as rei-vindicações precedentes, em que a proporção entre micelas e o agente éentre 1:1 a 1:1000.

17. Método de acordo com qualquer uma de acordo com as rei-vindicações precedentes, em que os agregados compreendem, pelo menos,um agente ativo associado a micelas de proteína do soro de leite.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que os agre-gados estão presentes em uma matriz de micelas de proteína do leite com,pelo menos, um agente ativo incorporado.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que a matriz éum polímero amorfo.

20. Método de acordo com qualquer uma de acordo com as rei-vindicações precedentes, em que a quantidade do agente ativo compreendi-do no agregado é de 0,1 a 50%.

21. Agregado obtido por um método de acordo com qualqueruma de acordo com as reivindicações precedentes.

22. Agregados compreendendo micelas de proteína do soro deleite e, pelo menos, um agente ativo associado às micelas de proteína dosoro de leite.

23. Agregados de acordo com a reivindicação 22, em que osagregados são uma matriz de micelas de proteína do soro de leite com, pelomenos, um agente ativo incorporado.

24. Agregados de acordo com a reivindicação 23, em que a ma-triz é um polímero amorfo.

25. Agregados de acordo com qualquer uma de acordo com asreivindicações 21 a 24, em que o agente ativo é selecionado entre vitaminas,minerais, antioxidantes, ácidos graxos poliinsaturados, peptídeos, extratosde plantas, hidrolisados de proteínas, bioativos, aromatizantes, adoçantes,açúcares, polissacarídeos, sacarose, complementos, agentes farmacêuticos,fármacos, componentes cosméticos, polifenóis, por exemplo, provenientesde café ou chá verde, etc., licopeno, carotenóides, cafeína, hesperidinas,sais solúveis ou insolúveis, bactérias probióticas, corantes, maltodextrinas,gorduras, polissacarídeos, como gomas, etc., emulsificantes, Iigantes equaisquer misturas destes.

26. Alimento ou produto cosmético compreendendo agregadoscomo definidos em qualquer uma de acordo com as reivindicações 21 a 25.

27. Uso de micelas de proteína do soro de leite como veículopara liberação de agente ativo.

28. Uso de micelas de proteína do soro de leite como veículo deliberação de lipídeos.

29. Uso de acordo com a reivindicação 28, em que o lipídeo éselecionado entre vitaminas lipossolúveis, antioxidantes ou ácidos graxospoliinsaturados de cadeia longa.

30. Uso de micelas de proteína do soro de leite como estabili-zante de compostos solúveis em água.

31. Uso de micelas de proteína do soro de leite como estabili-zante de compostos lipossolúveis.

32. Uso de acordo com qualquer uma de acordo com as reivindi-cações 27 a 31 para finalidades alimentícias ou cosméticas.

33. Complexo para liberação de agente ativo, compreendendomicelas de proteína do soro de leite e o referido agente ativo.