BRPI0706575B1 - uso colágeno de tipo v ou um componente antigênico do mesmo, e, método para identificar um paciente em espera de transplante de pulmão para um risco aumentado de rejeição de tecido de órgão transplantado. - Google Patents

Abstract

metodos para avaliar doença pulmonar, e para identificar pacientes sob risco aumentado de rejeição de tecido de órgâo transplantado e de desenvolvimento de sindrome de bronquiolite obliterante, uso de pelo menos um composto que suprime a resposta autoimune, kit para avaliar doença pulmonar, e, composto que suprime a resposta autoimune. várias modalidades incluem métodos para diagnosticar e tratarcondições médicas que envolvem uma resposta autoimune ao tecido conjuntivo, tal como colágeno encontrado em órgãos, tal como pulmão. em um método, distúrbios e doença pulmonar, tal como fibrose pulmonar idiopática (ipf), são diagnosticados pela análise de amostras de fluido ou de tecido obtidas de um paciente para evidência de uma resposta autoimune a vários tipos de colágeno incluindo, por exemplo, tipo v. um tipo de ensaio para evidência de uma resposta autoimune ao colágeno de tipo v compreende as etapas de obter uma amostra de fluido ou de tecido de um paciente, contatar pelo menos uma porção da amostra com um antígeno para o anticorpo anti-colágeno de tipo v e monitorar a mistura de amostra e antígeno para mudanças indicativas da presença de anti-colágeno e tipo v na amostra. outra modalidade inclui tratar doenças pulmonares tal como ipf pela administração de uma dose terapeuticamente efetiva de epítopos de vários colágenos incluindo colágeno de tipo v.

Description

(54) Título: USO COLÁGENO DE TIPO V OU UM COMPONENTE ANTIGÊNICO DO MESMO, E, MÉTODO PARA IDENTIFICAR UM PACIENTE EM ESPERA DE TRANSPLANTE DE PULMÃO PARA UM RISCO AUMENTADO DE REJEIÇÃO DE TECIDO DE ÓRGÃO TRANSPLANTADO.

(73) Titular: INDIANA UNIVERSITY RESEARCH & TECHNOLOGY CORPORATION. Endereço: 518 INDIANA AVENUE, INDIANAPOLIS, IN 46020, USA., ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US) (72) Inventor: DAVID S. WILKES; MICHAEL J. KLEMSZ.

Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 11/12/2018, observadas as condições legais

Expedida em: 11/12/2018

Assinado digitalmente por:

Liane Elizabeth Caldeira Lage

Diretora de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados “USO COLÁGENO DE TIPO V OU UM COMPONENTE ANTIGÊNICO

DO MESMO, E, MÉTODO PARA IDENTIFICAR UM PACIENTE EM

ESPERA DE TRANSPLANTE DE PULMÃO PARA UM RISCO

AUMENTADO DE REJEIÇÃO DE TECIDO DE ÓRGÃO

TRANSPLANTADO”

REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE

Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente provisório U.S. de No. 60/759.195, depositado aos 13 de janeiro de 2006, que é aqui incorporado, como referência, em sua totalidade.

DECLARAÇÃO DE FINANCIAMENTO GOVERNAMENTAL

O Governo dos Estados Unidos da América tem certos direitos na presente invenção conforme o número de concessão federal HL60797 do National Institute of Health (NIH).

CAMPO DA INVENÇÃO

Várias modalidades referem-se em geral aos testes e aos tratamentos para doença pulmonar, alguns aspectos incluem identificação de evidência de uma resposta autoimune ao tecido conjuntivo de pulmão tal como colágeno de Tipo V, ainda outros aspectos incluem modulação de uma resposta imune de paciente ao colágeno por dosagem de um paciente com uma quantidade terapeuticamente efetiva de colágeno e moléculas semelhantes a colágeno para tolerar o paciente, por exemplo, ao colágeno de Tipo V.

FUNDAMENTOS

Patologias que envolvem uma resposta autoimune são bem conhecidas. Condições que envolvem dano feito ao tecido por um dado próprio sistema imune do paciente animal ou humano incluem, por exemplo, diabetes de tipo 1 (juvenil), artrite reumatóide, esclerose múltipla, e algumas condições inflamatórias incluindo, por exemplo, psoríase. Tipicamente uma porção do próprio sistema imune do animal realiza um ataque a um antígeno do próprio

Petição 870180128803, de 11/09/2018, pág. 7/9 próprio sistema imune do animal realiza um ataque a um antígeno do próprio tecido do animal. Como exemplificado pelas doenças imunes acima mencionadas os resultados podem ser catastróficos, variando de a criação de uma condição crônica embora manejável como diabetes, à completa incapacidade e morte prematura como muitas vezes ocorrem com esclerose múltipla.

Em adição às várias doenças especificamente ligadas a uma resposta autoimune, outras doenças também podem envolver uma resposta imune errante. Conseqüentemente, há profundo interesse no exame da etiologia de várias doenças para determinar qual, se houver, papel a própria resposta imune do paciente pode desempenhar na progressão da doença.

Outra patologia que inclui um ataque sobre tecido indispensável por um próprio sistema imune de paciente é rejeição de aloenxerto após transplante de tecido ou de órgão. Transplante de vários órgãos incluindo coração, rim, fígado e pulmão muitas vezes resulta no ataque do sistema imune do paciente transplantado contra o tecido transplantado. Para minimizar a rejeição de aloenxerto grande cuidado é tomado para se combinar os doadores de órgãos aos pacientes receptores. Ainda, combinações perfeitas fora daquelas entre gêmeos idênticos são virtualmente impossíveis de serem feitas. Com o objetivo de manejar a resposta aloimune subseqüente, os pacientes receptores de transplantes são em sua maioria tratados com compostos imunossupressores durante suas vidas com o propósito de controlar a resposta autoimune que poderia de outro modo destruir o tecido e/ou o órgão transplantado.

Rejeição de aloenxerto é especialmente problemática em transplantes pulmonares entre indivíduos que são menos do que combinações perfeitas de um em relação ao outro. É amplamente crido no campo de transplantações pulmonares que rejeição ocorre mais freqüentemente com transplantes de pulmão do que com transplante da maioria dos outros órgãos sólidos. De fato, a causa líder de morte em pacientes receptores de aloenxerto

Ο

ΊΙ pulmonar é rejeição crônica, conhecida como bronquiolite obliterante (BO) (Trulock, 1997; Westra et al., 1990). A patogênese de rejeição crônica é insatisfatoriamente compreendida; contido, é crido que o risco de desenvolvimento de rejeição crônica está correlacionado com episódios de rejeição aguda repetidos.

Bronquiolite obliterante (BO) é uma forma de rejeição crônica que é o impedimento maior para a aceitação do pulmão e sobrevivência de longa duração do paciente receptor de aloenxerto, afetando pelo menos «όΟ'Ά. de sobreviventes de transplante pulmonar de 5 anos. A histopatologia de BO sugere que inflamação e resposta de lesão e inflamação leva a uma rota comum final, o desenvolvimento de lesões associadas com obliteração de via r aérea pequena. E crido que antígenos HLA de doador ubíquo são alvo e estímulo da resposta de rejeição aguda. Contudo, a despeito dos agentes terapêuticos mais novos que têm reduzido a incidência de rejeição aguda, a incidência de BO é imutável, sugerindo que as respostas de hospedeiro resistente à droga aos antígenos específicos de tecido podem estar envolvidas no processo de rejeição crônica.

Rejeição de órgão, em muitos casos, é cogitado em ser iniciado pelo reconhecimento de moléculas de complexo de histocompatibilidade maior (MHC) alogeneico (doador) por linfócitos T do hospedeiro, acarretando imunidade humoral e celular supra-regulada. Vários tratamentos incluem administração de agentes imunossupressores para reduzir a severidade da resposta imune ao órgão transplantado. Infelizmente, em muitos casos estas terapias falham em prevenir os episódios de rejeição continuada, e portanto, o objetivo final de indução de aceitação indefinida do aloenxerto, conhecida como tolerância imunológica, permanece elusivo.

Moléculas MHC alogeneicas são o estímulo e o alvo da resposta imune durante rejeição. Portanto, peptídeos sintéticos ou peptídeos derivados de ME1C que podem ser homólogos aos antígenos MHC têm sido o foco de investigações tentando induzí]· tolerância imunológica aos aloenxertos (Krensky e Clayberger, 1997; Oluwole et al., 1993 ). Em adição, um estudo muito recente relata a indução de tolerância às múltiplas moléculas MHC alogeneicas in viíro por um peptídeo sintético não-polimórfíco derivado de moléculas MHC (Murphy et al., 1999). Contudo, nenhuns destes relatórios parecem ter resolvido os problemas de rejeição de aloenxerto, e, em particular, rejeição de aloenxerto de pulmão.

Visto que reconhecimento de regiões polimórficas de moléculas MHC de doador é normal mente o estímulo para respostas aloimunes, tolerância imunológica induzida por peptídeos derivados do MHC de doador pode ser específica para o alelo das moléculas MHC de doador. Conseqüentemente, identificação de proteínas/peptídeos que são elevadamente conseivados dentre os indivíduos e que também induzem tolerância imunológica através de múltiplos alelos de MHC podem ser de grande importância no desenvolvimento de terapias efetivas para tratar pacientes sofrendo de ou sob risco de desenvolvimento de rejeição de aloenxerto. Contudo, o uso de tais proteínas/peptídeos para indução e tolerância imunológica aos aloenxertos de pulmão não tem sido totalmente avaliado. Em adição, muito poucas(os) proteínas/peptídeos que são úteis para tal tolerância ainda têm sido identificadas! os).

Ademais, apesar da existência de técnicas diferentes para induzir tolerância aos aloenxertos de órgão sólido, tais como transfusão de sangue específico de doador, injeção tímica com APC's derivados de doador, ou imunização sistêmica com peptídeos derivados de moléculas MHC de doador antes do transplante (Krensky e Clayberger, 1997), para quaisquer destas técnicas serem efetivas as moléculas de MHC de doador específicas têm que se conhecias várias semanas antes do transplante para permitir tempo suficiente, i.e., semanas a meses, para indução de tolerância se desenvolver. Contudo, no cenário típico há apenas umas poucas horas entre a identificação de um doador potencial e a cirurgia de transplante, na maioria dos casos então não há tempo suficiente para induzir tolerância na maioria dos pacientes receptores de transplante.

Pacientes receptores de transplante que já sofrem de uma doença autoimune, que em si mesmos podem necessitar de um transplante de órgão podem estar sob risco aumentado de rejeição catastrófica de órgãos transplantados. Consequentemente, há uma necessidade de identificar e talvez tratar qualquer patologia baseada em autoimunidade subjacente, se não antes, certamente após um transplante. Também há várias doenças e distúrbios de pulmão tal como Fibrose Pulmonar Idiopática (IPF) que são difíceis de diagnosticar e tratar e cuja etiologia subjacente é desconhecida, adicionalmente complicando o esforço para diagnosticá-las(os) e tratá-Jaslos).

Claramente então, há uma necessidade de métodos que possam ser usados para identificar doenças autoimunes tal como IPF e para tratar ou pelo menos manejar tais doenças. A necessidade é especialmente aguda no caso de doenças onde um tratamento líder, transplante de pulmão, pode ser em si mesmo severamente comprometido por uma resposta autoimune patogênica existente. ÃTirios aspectos e modalidades são direcionados( as) para diagnosticar e tratar doenças que são causadas por, ou agravadas por, uma resposta autoimune indesejável ao componente do pulmão tal como tipos de colágeno variados e específicos.

SUMÁRIO

Uma modalidade é um método de avaliar distúrbios ou doenças pulmonares tal como IPF em um paciente animal ou humano. Uma modalidade compreende as etapas de obter uma amostra de fluido ou de tecido de um paciente e analisar a amostra para determinai· se qualquer componente do sistema imune do paciente tem montado uma resposta imune a qualquer elemento de tecido conjuntivo encontrado em um órgão do corpo do paciente. Componentes de tecido conjuntivo típicos podem incluir η

qualquer tipo de colágeno e/ou compostos antigènicos de colágeno. Vários colágenos que podem gerar uma resposta autoimune incluem, por exemplo, colágeno de Tipo I, colágeno de Tipo II, colágeno de Tipo III, colágeno de Tipo IV, colágeno de Tipo V, e colágeno de Tipo VI. testes para avaliar condições ou doenças pulmonares nestes pacientes podem compreender as etapas de obter uma amostra de fluido ou de tecido de um paciente, contatar pelo menos uma porção da amostra com pelo menos um componente antigênico (epítopo) de colágeno de Tipo V e monitorar o teste para qualquer sinal indicativo das presenças de pelo menos um anticorpo anti-colágeno de Tipo V na amostra. Tais testes podem incluir a presença de qualquer tipo de componente adicional que pode ser necessário ou benéfico para conduzir os testes. Tais componentes incluem, mas não são limitados a, anticorpos secundários que se ligam nos anticorpos anti-Tipo V, átomos ou moléculas repórter, superfícies para ligação do componente antigênico, tamponadores, estabilizadores, agentes antimicrobianos e semelhantes.

Um aspecto é um ensaio compreendendo as etapas de: obter uma amostra de fluido ou de tecido do pulmão ou fluido que estava em contato com o pulmão, contatar pelo menos uma porção da amostra com pelo menos um epítopo de colágeno de Tipo V ou qualquer outra molécula que preferivelmente se liga em anticorpo anti-colágeno de Tipo V, e detectar uma mudança associada com a ligação ou anticorpo anti-Tipo V com pelo menos um epítopo de colágeno de Tipo V na amostra. Estes ensaios e suas variações podem ser usados para ensaiar doenças pulmonares tal como IPF e semelhante ou qualquer outro tipo de distúrbio ou doença pulmonar que inclui uma resposta autoimune a pelo menos uma porção de colágeno de Tipo V.

Outra modalidade é um método de determinar se um paciente possui autoimunidade a um componente de pulmão. Uma resposta autoimune típica pode envolver imunidade quer humoral quer celular ou ambas. Tais respostas incluem, por exemplo, resposta de hipersensibilidade de tipo retardado. Doenças pulmonares que podem ter uma dimensão autoimune incluem, mas não são limitadas a, Fibrose Pulmonar Idiopática, Síndrome da

Angústia Respiratória Aguda, Síndrome da Angústia Respiratória de Adulto, doença vascular de colágeno secundária, outras doenças de pulmão fibrótico e semelhantes.

Uma modalidade inclui triar pacientes para identificar pacientes ou grapos de pacientes específicos que possuem um risco elevado de desenvolvimento de condições ou doenças pulmonares que possuem uma dimensão autoimune. Tais doenças ou condições incluem, mas não são limitadas a, Fibrose Pulmonar Idiopática (IPF), Síndrome da Angustia Respiratória Aguda, Síndrome da Angústia Respiratória de Adulto, doença vascular de colágeno secundária, outras doenças de pulmão fibrótico e semelhantes, ou outras condições que são devido a pelo menos em parte a uma reação autoimune ao tecido conjuntivo de pulmão tal como colágeno de Tipo V. Testes para triar estes pacientes podem compreender as etapas de obter uma amostra de fluido ou de tecido de um paciente, contatar pelo menos uma porção da amostra com pelo menos um epítopo de colágeno de Tipo V e monitorar a mistura de amostra e antígeno para qualquer sinal indicativo das presenças de pelo menos um tipo de anticoipo anti-colágeno de Tipo V na amostra.

Ainda outra modalidade inclui monitorar a progressão da doença pulmonar em um paciente ou monitorar a eficácia de vários regimes de tratamento usados para tratar um paciente sofrendo de uma tal doença ou distúrbio do pulmão. Testes para monitor estes pacientes podem compreender as etapas de obter umti amostra de fluido ou de tecido de um paciente, contatar pelo menos uma porção da amostra com pelo menos um epítopo de colágeno de Tipo V e monitorar o teste para qualquer sinal indicativo das presenças de pelo menos um anticorpo anti-colágeno de Tipo V na amostra.

Uma modalidade inclui testes de diagnóstico para doenças tal

S como IPF, em algumas modalidades o teste pode compreender as etapas de obter uma amostra de fluido ou de tecido do paciente, contatar pelo menos uma porção da amostra com pelo menos um epítopo de colágeno de Tipo V e monitorar a mistura para qualquer sinal indicativo das presenças de pelo menos um anticorpo anti-colágeno de Tipo V na amostra.

Ainda outra modalidade inclui avaliar candidatos de transplante de pulmão para identificar candidatos, que possuem um risco elevado de desenvolvimento de BOS e.g., pacientes que testam positivo para uma resposta autoimune ao colágeno encontrado no pulmão tal como colágeno de Tipo V. Métodos de avaliação destes candidatos podem compreender as etapas de obter uma amostra de fluido ou de tecido do candidato, contatar pelo menos uma porção da amostra com pelo menos um epítopo de colágeno de Tipo V e monitorar a mistura de antígeno e amostra para evidência de que o anticorpo anti-Tipo λ^ζ na amostra tem sido ligado em antígeno. Testes para avaliação destes candidatos podem compreender as etapas de ligar o antígeno em uma superfície sólida, contatar a amostra com o antígeno, permitindo tempo para o antígeno se ligar no anticorpo para o antígeno presente na amostra, e lavar o complexo de anticorpo-antígeno ligado para removei' o excesso de anticorpo e/ou amostra. Etapas adicionais podem incluir ligai^- um grupo repórter no complexo de antígeno-anticorpo e monitorar o sistema para qualquer mudança em sinal indicativo da presença de anticorpo ligado no antígeno. Em algumas modalidades o antígeno no teste é pelo menos um epítopo de colágeno de Tipo V.

Outra modalidade inclui métodos de teste para identificar doenças de pulmão que envolvem uma resposta autoimune ao tecido conjuntivo no pulmão tal como colágeno de Tipo V. Alguns métodos de teste podem compreender as etapas de obter uma amostra de fluido ou de tecido de um dado paciente e ensaiar pelo menos uma porção da amostra para evidência de uma resposta autoimune ao colágeno de Tipo V. Em uma modalidade a amostra é analisada para evidência de resposta de hipersensibilidade retardada ao colágeno de Tipo V ou um seu epítopo ou análogo antigenico. Em ainda outra modalidade a amostra é analisada para a presença de anticorpo para colágeno de Tipo V ou um seu epítopo ou análogo antigenico.

Ainda outra modalidade é um método para identificar pacientes com um risco aumentado de desenvolvimento de síndrome de bronquiolite obliterante (BOS) e/ou monitorar a progressão da síndrome ou eficácia da terapia usada para tratar a síndrome. Estes métodos geralmente incluem as etapas de obter uma amostra de soro, sangue, fluido pulmonar intersticial, escarro, muco ou tecido de um paciente e ensaiai’ a amostra para evidência de uma reação autoimune a um componente do tecido conjuntivo do pulmão. Em uma modalidade o paciente é um candidato para, ou o receptor de, um transplante de pulmão e a amostra é ensaiada para evidência de uma resposta imune de hospedeiro ao colágeno de Tipo V. Em uma modalidade a amostra é ensaiada para imunidade celular ao colágeno de Tipo V. Em ainda outra modalidade a amostra é ensaiada para imunidade humoral ao colágeno de Tipo V.

Outra modalidade compreende ensaiar uma amostra de fluido ou tecido para evidência de imunidade a um epítopo de colágeno de Tipo V, ou a um seu análogo, porção ou componente.

Ainda outra modalidade é um método para identificar pacientes receptores de transplante de pulmão prospectivo que estão sob risco aumentado de rejeição de tecido transplantado devido a uma resposta autoimune ao colágeno de Tipo V ou às suas porções ou fragmentos antigenicos.

Ainda outra modalidade é um método de monitorar pacientes receptores de transplante de tecido pulmonar para avaliar o risco continuado deles de rejeição de tecido transplantado devido a uma resposta autoimune ao colágeno de Tipo V ou às suas porções ou fragmentos antigênicos.

Ainda outra modalidade é um método para tratar um paciente com uma doença ou distúrbio ou um paciente em um risco de desenvolvimento de uma doença ou distúrbio que envolve uma resposta autoimune ao tecido conjuntivo, tal como a um colágeno de Tipo V encontrado nos órgãos do paciente. Em uma modalidade o método compreende as etapas de proporcionar compostos imunossupressores, ou compostos que fazem o paciente tolerar a presença do antígeno tal como colágeno de Tipo V e administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva de composto a um dado paciente. Tais compostos incluem, mas não são limitados a, vários colágenos ou porções de colágeno, por exemplo, colágeno de Tipo V ou epítopos ou análogos antigênicos dos mesmos. Componentes de tecido conjuntivo típicos que podem induzir uma resposta autoimune incluem, mas não são limitadas a, qualquer tipo de colágeno e/ou componentes antigênicos (epítopos) de colágeno. Vários colágenos que podem gerar uma resposta autoimune incluem colágeno de Tipo 1, colágeno de Tipo 11, colágeno de Tipo III, colágeno de Tipo IV, colágeno de Tipo V, colágeno de Tipo VI e vários componentes antigênicos dos mesmos.

Ainda outra modalidade é um método para tratai' ou prevenir a progressão de distúrbios ou doenças pulmonares tais como Fibrose Pulmonar Idiopática, Síndrome da Angústia Respiratória de Adulto e outros distúrbios de pulmão fibrótico, Síndrome da Angústia Respiratória Aguda, síndrome de bronquiolite obliterante ÍBOS), e semelhantes, pela provisão de colágeno para suprimir resposta autoimune do paciente ao colágeno ou compostos antigênicos de colágeno em um tecido de pulmão de paciente ou no tecido de um pulmão transplantado. Tal terapia pode incluir administrar uma dose segura e efetiva de colágeno ou de um componente de colágeno ou de um seu análogo a um paciente durante um período de tempo determinado pela condição do sistema imune do paciente para melhor tolerar colágeno e para pelo menos parcialmente suprimir a resposta imune do paciente ao colágeno.

Em uma modalidade o colágeno é colágeno de Tipo V ou um fragmento antigênico ou análogo do mesmo.

Ainda outra modalidade compreende tratar uma forma de doença de pulmão causada por ou agravada por uma resposta autoimune, que pode incluir atividade de célula-e resposta de hipersensibilidade de tipo retardado ao colágeno ou a uma porção antigênica de um colágeno. Em uma modalidade o colágeno administrado ao paciente é selecionado do grupo consistindo de colágeno de Tipo I, colágeno de Tipo II, colágeno de Tipo III, colágeno de Tipo IV, colágeno de Tipo V, colágeno de Tipo VI e vários componentes antigênicos dos mesmos. Estes compostos podem ser administrados por uma variedade de meios incluindo, mas não limitados a, instilação intrapulmonar, oralmente, inalação, injeção subcutânea, gotejamento, injeção direta, ou semelhantes.

Ainda outra modalidade é um método para identificar pacientes com um risco aumentado de rejeição de tecidos e órgãos transplantados. Tipicamente este método compreende as etapas de coletar uma amostra de sangue, soros, fluido, escaiTO ou tecido de um paciente e analisar a amostra para determinar se qualquer componente do sistema imune do paciente tem montado uma resposta imune a qualquer elemento de tecido conjuntivo em um órgão do corpo do paciente. Órgãos típicos incluem, mas não são limitados a, pulmão, coração, fígado, rim, pâncreas, e componentes do olho. Componentes de tecido conjuntivo típicos podem incluir qualquer tipo de colágeno e/ou compostos antigênicos de colágeno. Vários colágenos que podem gerar uma resposta autoimune incluem colágeno de Tipo I, colágeno de Tipo II, colágeno de Tipo III, colágeno de Tipo IV, colágeno de Tipo V, e colágeno de Tipo VI.

Ainda outra modalidade é um kit para realizar testes para determinar se um dado paciente está sob risco de desenvolver uma patologia pulmonar baseada em autoimunidade, ou monitorar a saúde de um paciente já diagnosticado com uma tal condição. Em uma modalidade o kit inclui pelo menos um componente antigênico de colágeno, por exemplo, colágeno de Tipo V ou um epítopo, fragmento ou análogo do mesmo adequado para detectar evidência de uma autoimunidade humoral ou celular ao colágeno. Em uma modalidade o kit adicional mente inclui pelo menos um grupo repórter quer um átomo quer uma molécula que exibe uma mudança em sinal na presença de pelo menos molécula indicativa de uma resposta autoimune ao colágeno de Tipo V. Em ainda outra modalidade o kit adicionalmente inclui pelo menos um tamponador, estabilizador, conservante, composto antibacteriano, adjuvante ou semelhantes quer sei-ve para aumentar a meiavida, sensibilidade, e/ou confiabilidade do teste. Em uma modalidade um kit adicionalmente inclui adjuvante de Freund ou seus componentes ou análogos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

FIG. 1. Auto-reatividade de células T e B anti-col(V) em relação ao curso clínico de pacientes receptores de transplante de pulmão.

Painel A. Análise de Western blot de IgG purificada de amostras BAL de pacientes L3, L41, L31 testados contra col(H) ou col(V).

Painel B. Curso de tempo de autoimunidade anti-col(V) e fusão de enxerto nos mesmos 3 pacientes. FEV1 (linha sólida, eixo esquerdo) foi ajustado para 100?ó de máx (2,3 para L3, 2,4 para L41, e 2,8 para L31) para cada paciente. Nível 1 de BOS é representado por linha tracejada cinza (80% de FEVI máx). DTTI para col( V) (barras cheias, eixo direito) e col(II) (barras vazias) são mostrados com resposta de DTFI negativa (< 25 x IO'⁴ polegadas [<53,5 x 1O’^J milímetros]) representada por uma área sombreada. Resultados de Western (do painel A) são representados por retângulos próximos do topo dos gráficos. Episódios de rejeição aguda são representados por *.

Painel C. Compósito de curso clínico e reatividade anti-col(V) em 4 indivíduos adicionais com padrões de reatividade similares àquela vista em painel B. FEV1 Máx % (cada linha representa um paciente receptor de transplante individual ), Ab e /ou DTH positivo para col(V) (círculos cheios sobre a linha FEV1 de indivíduo dado) ou Ab e/ou DTH negativo para col(V) (triângulos vazios sobre as linhas FEV1) bem como morte de indivíduo (H-) são mostrados. Limite de BOS 1 (80¾. de FEV1 máx) é representado por linha tracejada cinza.

FIG. 2. Análise de Kaplan-Meier examinando o efeito de desenvolvimento de reatividade anti-colíV) sobre liberdade de BOS I. Pacientes com função de enxerto boa através do dia 32ó após transplante (painel A) ou dia 760 após transplante (painel B) foram divididos baseados em sua resposta ao col(V) antes daquele tempo. Em painel A, aqueles com uma resposta anti-col(V) positiva (linha tracejada) incluem e quer anticorpo/BAL quer DTI-I/sangue periférico-positivo; em painel B, resposta de DTH é o único critério usado para identificar pacientes com uma resposta anti-col(V) positiva anterior. Em ambos os painéis, pacientes com uma resposta anti-col(V) negativa anterior são indicados por linha sólida. A diferença entre o grupo não-reativo a col(V) e o grupo reativo a col( V) foi significativa (p=0,01, painel A; p=0,03, painel B ).

FIG. 3. Resposta de DTH ao col(V) em pacientes após transplante de pulmão é específica e não presente antes do transplante.

Painel A. Pacientes após transplante de pulmão (n=8, qualquer doença) ou pacientes renais com síndrome de Goodpasture (GPS, n=5) foram testados para resposta de DTH ao col(II) (barras vazias), col(W) (barras pontilhadas), ou col(V ) (barras cheias) expressada como inchamento médio ±

S.D.. A diferença entre as respostas de pacientes receptores de transplante de pulmão aos vários colágenos foi significativa (*, p=0,001) como foi a diferença entre as respostas de pacientes receptores de transplante renal com GPS.

Painel B. Pacientes não-transplantados com várias doenças de pulmão foram testados para resposta de DTH ao col(II) (barras vazias) ou col(V) (barras cheias) expressada como incitamento médio ± S.D. A diferença entre a resposta ao col(V) em pacientes com IPF e qualquer outra doença foi significativa (*, p=0,02).

Painel C. Análise de Kaplan-Meier de tempo para perda de enxerto para pacientes com diagnóstico pré-transplante de IPF ou qualquer outra doença. A diferença de sobrevivência de enxerto de 1 ano foi significativa (p=0,05). Sobrevivência de enxerto total pela análise de logpontos não foi significativamente diferente entre grupos.

FIG. 4. Fotomicrografia, de Imunoquímica de IgG, mostrando depósitos em um pulmão tendo sofrido de Rejeição Aguda. Criosseções de biopsia transbronquial (TBB) ou de tecido de pulmão normal foram fixadas em acetona e coradas pra depósitos de subtipo de IgG como descrito previamente (Wilkes et al. - Joumal of Immunology 1995). Painéis A, B, C, e D mostram imunocoloração de subclasses IgGl, lgG2, IgG3 e IgG4 de TBB obtida de um aloenxerto de pulmão sofrendo de rejeição aguda de grau 2 no dialOO após o transplante. Notar os depósitos de IgG2 nos tecidos conjuntivos peribronquiais subjacentes ao epitélio bronquial (seta). Em contraste, não houve depósitos de IgGl, IgG3 ou IgG4 detectados na mesma amostra. Depósitos de IgG2 na matriz sub-epitelial estiveram ausentes em pulmões normais e em aloenxertos com um estado de enxerto quiescente (dados não mostrados).

FIG. 5. Resposta de hipersensibilidade de tipo retardado ao colágeno de Tipo V em pacientes aguardando transplante de pulmão. A resposta de DTFI é um marcador para ativação de célula T e reflete o que temos relatado no modelo de transplante de pulmão de rato. Pacientes com IPF mas não com outras formas de doença de pulmão têm uma resposta de DTFI significativamente maior ao colágeno de Tipo V. Isto mostra que estes pacientes já têm células T ativadas contra este auto-antígeno.

FIG. 6. Fotomicrografias de mancha de tecido de pulmão mostrando os efeitos de patologia de isoenxertos de pulmão transplantados em rato WKY não tratado (A), um rato WKY previamente imunizado com Lisozima de Ovo de Galinha (B), ou um rato WKY previamente imunizado com colágeno de Tipo V (C). Os dados mostram que sensibilização anterior de col(V), mas não de ITEL, resulta em destruição do pulmão 30 dias após o transplante. Nenhuns ratos receberam drogas imunossupressoras ou outros tratamentos. Dados são representativos de 6 ratos cada para giupos ITEL e col( V) e mais do que ratos SO no grupo não tratado.

FIG. 7. Tabela 1, sumário de demografia de pacientes. Estas condições foram diagnosticadas em pacientes tendo sofrido procedimentos de transplante de pulmão correlacionados com várias patologias pós-operatórias.

FIG. 8. Tabela 2 sumário de dados de encalço de vários fatores associados com BOS. Fatores associados com BOS.

FIG. 9. Ilustração gráfica de dados coletados usando um ensaio baseado em glóbulo de anticorpo planejado para detectar níveis diferentes de anticorpos anti-colágeno \^z em amostras de soros. Deslocamentos de pico para a direita são indicativos de níveis altos de anticorpos anti-colágeno V. Os painéis da esquerda representam dados coletados de pacientes, painéis da direita representam controles nos quais vários níveis de anticoipos anticolágeno V foram usados nos soros.

FIG. 10. Redução de respostas de DTII aos alo-antígenos de doador, col(V), e alo-antígenos de terceira parte em receptores de aloenxerto de controle duas semanas após o transplante. Ratos WKY inexperientes foram controles. Animais receberam 10⁷ esplenócitos de terceira parte (BN), esplenócitos F344 derivados de doador irradiados (3.000 rad), ou 15pg de col(V) na aurícula direita e diluente na aurícula esquerda. A espessura da orelha foi medida com um micrômetro (Mitutoyo, Field Tool Supply, Chicago, 111.) em um modo cego imediatamente antes e 24 h após a injeção e

Inchamento Específico de Orelha foi calculado como descrito em Métodos. Dados representam a média ±SEM de Inchamento Específico de Orelha em mmxlO'^J de quatro ratos em cada grupo. [*p<0,0001 comparados com ratos WKY inexperientes desafiados com esplenócitos F344 ou col(V) e fp<0,0001 comparados com ratos WKY inexperientes desafiados com col(V) ou esplenócitos F344].

FIG. 11A, FIG. 11B e FIG. 11C. Histologia de pulmão em camundongos BALB/c após quatro instilações semanais de 1.5x1o³ células BAL (C57BL/6) alogênicas sozinhas, eol(II), ou col(XI) (50 pg cada) semanalmente por quatro semanas seguido por quatro instilações semanais de células C57BL/6 BAL. FIG. 11A mostra infiltrados de célula mononuclear peribronquiolar e perivascular em pulmões de camundongos BALB/c que receberam instilações de células BAL dos camundongos C57BL/6. Lesões patológicas similares foram observadas em pulmões de camundongos BALB/c que receberam instilações semanais de col(II) (FIG. 11B) ou col(XI).

FIG. 12. Contagens de células diferenciais de fluido BAL em pulmões WKY normais, pulmões de isoenxerto de controle, e pulmões de aloenxerto alimentados com col(V). Em duas semanas após o transplante, os pulmões transplantados sofreram BAL. Contagens de células diferenciais foram determinadas pela contagem de 300 células/campo sobre preparações de citospina utilizando microscopia de luz. Mac, macrófagos; Lym, linfócitos; PMN, células polimorfonucleares. Dados representam a média±SEM de quatro pulmões WKY normais, quatro isoenxertos de controle, cinco aloenxertos de controle, e cinco aloenxertos alimentados com col(V). (^1!p<0,03S para PMN's e *p<0,000001 para linfócitos comparados com pulmões de isoenxerto ou normais, p<0,023 para PMN's e p<0,0001 para linfócitos comparados com aloenxertos de controle).

FIG. 13A, FIG. 13B, e FIG. 13C. Raios-X de tórax seriais de receptores de transplante duas semanas após transplante. As linhas brancas curtas no campo de pulmão esquerdo (setas) representam os manguitos usados para anastomose vascular. Receptores de isoenxerto de controle mostram raios-X de tórax normais em FIG. 13A. Raios-X de receptores de aloenxerto de controle revelaram infiltrados severos e opacificação completa do aloenxerto indicativo de rejeição severa em FIG. 13B. Receptores de aloenxerto alimentado com Col(V)-mostram apenas infiltrados suaves duas semanas após o transplante em FIG. 13C Raios-X de tórax representativos de cinco camundongos em cada grupo.

FIG. 14A, FIG. 14B, FIG. 14C, FIG. 14D, FIG. 14E, e FIG. 14F. Painel superior: Anatomia macroscópica de pulmões de isoenxerto de controle FIG. 14A, pulmões de aloenxerto de controle FIG. 14B, e pulmões de aloenxerto alimentado com col(V) FIG. 14G duas semanas após o transplante (vista posterior). O pulmão esquerdo (L) é o pulmão transplantado e o direito (R) é o pulmão nativo em cada painel. O pulmão de aloenxerto de controle (L em painel b) foi de cor marrom escura, encolhido, e de consistência firme comparado com o pulmão nativo. Contudo, o pulmão de aloenxerto alimentado com col(V) (L em painel c) teve a aparência do pulmão de isoenxerto (L em painel a). Pulmões de isoenxerto de controle (FIG. 14A) não mostram lesões patológicas e são idênticos aos pulmões WKY. Fotografias representativas de cinco ratos em cada grupo. Painel inferior: Histologia de isoenxertos de controle FIG. 14D, aloenxertos de controle FIG. 14E, e aloenxertos alimentados com col(V) FIG. 14F duas semanas após o transplante. Isoenxertos de controle mostram estruturas vasculares e de vias aéreas normais (FIG. 14D). aloenxertos de controle mostram infiltrados extensivos de células mononucleares, alveolares, peribronquiais e perivasculares consistentes com rejeição severa (FIG. 14E). Em contraste, aloenxertos alimentados com col(V) mostram apenas infiltrados suaves a moderados de células mononucleares, peribronquiais e perivasculares (FIG. 14F). Fotomicrografias representativas de cinco ratos em cacla grupo (magnificação de lOOx).

FIG. 15. Tabela 3, graduação de patologia de rejeição. A

Tabela inclui dados dos controles e dos modelos animais para rejeição de transplante.

FIG. 16. Redução de respostas de DTIT aos alo-antígenos de doador por administração oral de col(V). Receptores de aloenxerto de controle e receptores de aloenxerto alimentado com col(V) duas semanas após o transplante foram desafiados na aurícula direita com 10 esplenócitos F344 irradiados (3.000 rad) derivados de doador, e diluente na aurícula esquerda. A espessura da orelha foi medida com um roicrômetro na aurícula esquerda. A espessura de orelha foi medida com um micrômetro (Mitutoyo, Field Tool Supply, Chicago, 111.) em um modo cego imediatamente antes e 24 horas após injeção e Inchamento Específico de Orelha. Dados representam a média iSEM de Inchamento Específico de Orelha em mmxlO’·’ de quatro ratos em cada grupo. (*p<0,02 comparados com aloenxertos de controle).

FIG. 17. Níveis de TGF-β em soro de ratos WKY normais, receptores de aloenxerto de controle, e receptores de aloenxerto alimentados com col(V). Níveis de TFG-β em soro foram determinados por ELISA. Dados representam média±SEM de quatro ratos em cada grupo. (*p<0,05 comparados com aloenxertos de controle).

FIG. 18. Neutralização de TGF-β restaura respostas de DTH aos alo-antígenos de doador em receptores de aloenxerto alimentados com col(V). Ratos WKY alimentados com col(V) foram desafiados na aurícula direita com 10^z esplenócitos F344 derivados de doador irradiados (3.000 rad) misturados com quer 5 pg de Ab policlonal anti-TGF-β quer de Ab anti-lL-4 ou IL-10 em PBS duas semanas após o transplante. A aurícula esquerda recebeu um volume igual de diluente mais esplenócitos, e serviu como o sítio de controle. Para controles negativos, um grupo separado de aloenxertos alimentados com col(V) recebeu imunoglobulinas de controle com esplenócitos na aurícula direita e um volume igual de diluente mais esplenócitos na aurícula esquerda. A espessura da orelha foi medida com um micrômetro em um modo cego imediatamente antes e 24 h após injeção e o Inchamento Específico de Orelha foi calculado como descrito abaixo. Spl, esplenócitos. Dados representam a média±SEM de Inchamento Específico de Orelha em mmxlO de quatro ratos em cada grupo [*p<0,03 e f, jp>0,05 comparados com aloenxertos alimentados com col(V) desafiados com antígenos misturados com imunoglobulina de controle], A restauração das respostas de DTH em aloenxertos alimentados com col(V) com anticorpos anti-TFG-β, anti-IL-4, e anti-IL-10 relativa aos aloenxertos de controle foi 75,7%, 24,3% e 39,9%., respectivamente.

FIG. 19. Respostas de DTH aos alo-antígenos de doador, col(Il), col(V), col(XI), e alo-antígenos de terceira parte em receptores de aloenxerto de controle dez semanas após transplante. Animais receberam 10⁷ esplenócitos de terceira parte (BN), esplenócitos F344 derivados de doador irradiados (3.000 rad), ou 15 pg de col(II), col(V), or col(XI) em aurícula direita e diluente em aurícula esquerda. A espessura da orelha foi medida com um micrômetro em um modo cego imediatamente antes e 24 h após injeção. O Inchamento Específico de Orelha foi calculado como descrito abaixo. Spl, esplenócitos. Dados representam a média±SEM de Inchamento Específico de Orelha em mmxlO’·’ de três ratos em cada grapo [*p<0,05 comparados com ratos WKY inexperientes desafiados com esplenócitos F344 ou col(V)].

FIG. 20. Reação de leucóeito misto. Razões variadas de esplenócitos F344 (estimulantes) tratados com 3x1linfócitos-T de linfonodo de ratos WKY (Normal), ou de ratos WKY que foram alimentados com col( V). Dezoito horas antes da completitude de uma incubação de 5 dias, as células foram pulsadas com ³F1 e proliferação foi determinada por r contagens/minuto (cpm) de incorporação de timidina. índice de estimulação é igual aos múltiplos de proliferação em linfócitos de linfonodo induzidos pela variação da quantidade de células estimuladoras em relação à proliferação de linfócitos de linfonodo sozinhos. Dados representativos de três experimentos.

FIG. 21 A, FIG. 21B, FIG. 21C, e FIG. 21D. Painel superior: anatomia macroscópica de pulmões de aloenxerto de controle FIG. 21 A, e pulmões de aloenxerto alimentado com col( V) FIG. 21B dez semanas após transplante. O pulmão esquerdo iL) é o pulmão transplantado e o direito (R) é o pulmão nativo em cada painel. O pulmão de aloenxerto de controle foi de cor marrom clara, encolhido, e de consistência firme comparado com o pulmão nativo. Contudo, o pulmão de aloenxerto alimentado com col(V) teve uma aparência quase nonnal com apenas ligeira descoloração. Painel inferior: Histologia de aloenxertos de controle FIG. 21C e aloenxertos alimentados com col( V) FIG. 21D dez semanas após transplante, aloenxertos de controle desenvolveram infiltrados extensivos de célula mononuclear intersticiais, fibrose, e obl iteração de vias aéreas pequenas por tecido de granulação, que são lesões patológicas de BO. Em contraste, aloenxertos alimentados com col(V) apenas tiveram infiltrados alveolares suaves, sem inflamação intersticial que descreve a patologia de rejeição aguda branda (grau A2). Fotomicrografías representativas de cinco ratos em cada grupo.

FIG. 22. Níveis de TGF-β em soro de ratos WKY normais, receptores de aloenxerto de controle, e receptores de aloenxerto alimentados com col(V) dez semanas após transplante. Níveis de TFG-β em soro foram determinados por ELISA. Dados representam médiaiSEM de três ratos em cada gmpo. (*p<0,05 comparados com aloenxertos de controle).

FIG. 23. Neutralização de TGF-β in em Resposta DITT. Ratos WKY alimentados com col(V) receberam 10⁷ esplenócitos F344 derivados de doador irradiados (3.000 rad) misturados com 5 pg de Ab policlonal de galinha anti- TFG-β de rato na aurícula direita e diluente na aurícula esquerda. Para controles negativos, um gmpo separado de aloenxertos alimentados com y col(V) recebeu 10 esplenócitos F344 derivados de doador irradiados (3.000 rad) misturados com 5 pg de imunoglobulinas de galinha de controle ou imunoglobulinas de cabra de controle na aurícula direita e diluente na auiícula esquerda. O Inchamento Específico de Orelha foi determinado como descrito.

FIG. 24. Respostas de DTH a BSA em ratos WKY inexperientes e alimentados com col(V). Ratos WKY inexperientes e alimentados com col(V) foram vacinados com injeção inicial s.c. de 100 pg de BSA em adjuvante e sete dias mais tarde foram desafiados com solução de BSA agregada por calor 2% na aurícula direita e diluente na esquerda. A espessura da orelha foi medida com um micrômetro em um modo cego imediatamente antes e 24 h após injeção e o Inchamento Específico de Orelha foi calculado como descrito acima. Ratos WKY não vacinados serviram como controles. Dados representam a média±SEM de Inchamento Específico de Orelha em mmxlO’ de quatro ratos em cada grupo (^!:p<0,018 comparados com ratos WKY inexperientes não vacinados e ^fp ? 0,05 comparados com ratos WKY vacinados).

FIG. 25. Tabela 4 é uma listagem de grupos experimentais usados em exemplo 6.

FIG. 26. Tabela 5 é um sumário dos resultados dos experimentos relatados em exemplo 8.

DESCRIÇÃO

Para os propósitos de promoção de um entendimento dos princípios da invenção, referência será agora feita às suas modalidades preferidas, e linguagem específica será usada para descrever a mesma. Contudo será entendido que nenhuma limitação do escopo da invenção é deste modo intencionada, tais alterações, modificações, e outras aplicações dos princípios da invenção sendo contempladas como normalmente ocorreríam para uma pessoa experiente na arte à qual a invenção se refere.

Numerosas explanações e experimentos são proporcionados por meio de explanação e não de limitação. Nenhuma teoria de como a invenção opera é para ser considerada limitante, proferida em virtude quer da descrição, comparação, explanação quer do exemplo.

As composições e metodologias aqui descritas e implicadas são úteis para ambas as aplicações em humano e outro animal inferior (e.g., animais de estimação, de zoológico, ou dométicos). Conseqüentemente, os seguintes exemplos e discussão são apresentados por meio de orientação e explicação e não de limitação.

Como aqui usado o termo ‘avaliar’’ como usado, por exemplo, na frase ‘avaliar um paciente para inclui, mas não é limitado a diagnosticar, triar, estimar, monitorar e semelhantes para qualquer parâmetro discernível que como mostrado se correlaciona com uma dada doença, distúrbio ou condição, e semelhantes. O teimo avaliar como aqui usado inclui, mas não é limitado a, pelo menos uma das seguintes atividades: diagnosticar pacientes para determinar se possuem uma condição médica geral ou específica; monitorar pacientes com uma condição médica conhecida ou suspeita para acompanhar o progresso da doença ou a eficácia de um regime de tratamento; triar pacientes para estimar a possibilidade de que eles desenvolverão uma dada condição médica; estimar a probabilidade de que um dado paciente possui ou está sob risco de desenvolvei· uma dada doença ou condição médica; detectar a presença de ou a propensão ou a suscetibilidade para desenvolver uma doença, síndrome, ou condição; e prever o prognóstico de duração curta ou longa para desenvolvimento e/ou recuperação de uma dada condição médica, doença, distúrbio ou semelhantes.

Como aqui usado o termo ‘condição médica’ inclui síndromes, doenças, condições e semelhantes.

Estudos no modelo de transplante de pulmão em rato têm mostrado que o pulmão é rejeitado devido a umti resposta autoimune específica anti-colágeno de Tipo V. Para discussão adicional veja: Publicação de Pedido de Patente US de No. 2003/007S20SA baseado em Pedido de

Patente US de No. 10/243,797 depositado aos 13 de setembro de 2003 por

David S. Wilkes e aqui incorporado como referência em sua totalidade; e,

Type V Colagen Modulates Alloantigen-Induced Pathology and

Immunology in the Lung, por Davic C. Mares et. al., em Am. J Respir, Cell

Mol. Biol, Vol. 23, pp. 62-70, 2000.

Colágeno Tipo V [col( V)] é um colágeno menor presente no pulmão (Madri e Furthmayr, 1980) e está localizado nos tecidos conjuntivos peribronquiolar (Madri e Furthmayr, 1979), interstício alveolar (Konomi et al., 1984), e membranas basais capilares ( Madri e Furthmayr, 1979). A cadeia a-1 de al(V) é quase 76% homóloga à cadeia a2 de Tipo XI colágeno [a2(XI)j (Cremer et al., 1994), e o gene para a2(XI) está localizado em loci de MHC de classe II de camundongos e humanos (Hanson et al., 1989), e compartilha seqüências de aminoácidos com MHC de classe II (Wilson et al.,

1995). Peptídeos derivados de MHC têm sido utilizados para induzir tolerância em aloenxertos diferentes de pulmão. Os presentes inventores selecionaram col(V) para modular respostas imunes em aloenxertos de pulmão devido à possível presença de seqüências MI-IC-semelhantes em col(V).

Referindo-se agora aos resultados de exemplo 1 (apresentado abaixo), pacientes de transplante de pulmão com uma resposta imune aumentada ao colágeno parecem estar sob um risco mais alto para rejeição de transplante. De acordo com estas e outras observações, uma modalidade é um método para prever e/ou seguir a progressão de rejeição de transplante de pulmão pela medição de resposta autoimune quer celular quer humoral ao colágeno em um paciente aguardando ou tendo sofrido um transplante de pulmão. Em uma modalidade o biomarcador para rejeição de transplante de pulmão seguido é autoimunidade ao colágeno de Tipo V e/ou epítopos de colágeno de Tipo V.

Tem sido relatado na literatura médica que auto-antígenos, tal como proteínas de choque térmico e miosina podem se tomar o alvo de respostas imunes durante rejeição de aloenxerto de pele ou cardíaco (Fedoseyeva, et al., 1999; Duquesnoy, et al., 1999; Birk, 1999). Também tem sido relatado que rejeição de aloenxerto de pulmão em roedores está associada com respostas de célula T ao colágeno Tipo V (Mares, et al., 2000), um colágeno menor encontrado no pulmão e na pele que é essencial para aquiescência e elasticidade de tecido (Schwarze, et al., 2000). Fragmentos de col(V) são liberados para dentro de fluido de lavagem broncoalveolar (BAL) após transplante de pulmão e transferência adotiva de células T col(V)específicas induz patologia “rejeição-semelhante” em isoenxertos de pulmão transplantados (Hague, et al., 2002). Tolerância oral induzida por alimentação de col( V) a ratos antes de transplante de pulmão aboliu rejeição agida e o início de BO (Yasufuku et al., 2001; Yasufuku et al., 2002).

Uma possibilidade formal é que pacientes que recebem um transplante de pulmão podem desenvolver imunidade celular e/ou humoral ao col(V), e que esta resposta autoimune aumenta seu risco de desenvolvimento de BO. Alguns dos resultados de exemplo 2 (apresentado abaixo) são consistentes com desenvolvimento de imunorreatividade a col(V) após transplante de pulmão e representam um fator de risco maior para síndrome de bronquiolite obliterante (BOS).

A histopatologia de BO sugere que inflamação e resposta à lesão resultam em uma rota comum final, o desenvolvimento de lesões levando à falha do enxerto. A raridade desta síndrome fora do ambiente de transplante de pulmão indica que mecanismos aloimunes desempenham um papel central neste processo. Contudo, o fato de que rejeição aguda e ligação inespecífíca de MHC necessariamente não levaram à BOS sugere que outros fatores imunes podem ser importantes. Os resultados de exemplo 2 (apresentado abaixo) sugerem que transplante de pulmão pode induzir o desenvolvimento de autoimunidade de novo a um auto-antígeno, colágeno

Tipo V (Estenne, et al., 2002). De fato, o risco relativo transmitido por autoimunidade ao col(V) após transplante de pulmão observado neste estudo foi da ordem de S-10 vezes maior do que fatores tal como incidência de episódios de rejeição aguda, previamente identificados como um risco de póstransplante para BOS (Sharples, et al., 2002).

Análise preliminar de células T responsáveis pela reatividade DTH ao col(V) no sangue periférico de receptores de transplante de pulmão indica que a maioria é CD4' , embora um papel para células efetoras T CDS+ col(V)-específicas não possa ser excluído (Burlingham, W., Rodriguez, D. e Jankowska-Gan, E., não publicado). Em modelo de rato, um clone de célula T CD4-!- restrito a MIIC de classe II derivado por cultura in viíro de um transplante de pulmão rejeitado foi capaz de mediar patologia de rejeição de pulmão em um isoenxerto de pulmão esquerdo, com alguma patologia se dissemiliando para o pulmão direito nativo ( ITague, et al., 2002). Não foi visto dano nos pulmões nativos quando o mesmo clone foi injetado em um rato normal, estes resultados sugerem que lesão de reperfusão e isquemia acompanhando o procedimento de isoenxerto foram requeridas para iniciar a imunopatologia. Nem todos os clones de células T isolados dos aloenxertos de rejeição foram patogênicos, e alguns parecem sei' protetores (D. Wilkes, não publicado), sugerindo que células regulatórias T CD4 específicas para col(V) ou outros antígenos de tecido podem desempenhar um papel em reprimir a patologia autoimune. De fato, a progressão rápida para perda de enxerto após início de BOS em paciente L3, e a estabilização de função em alguns pacientes com autoimunidade anti-col(V) (FIG. 1B, painel esquerdo e 1C, painel do meio), estiveram coiTelacionadas com perda e ganho de uma resposta de DTH regulada aos antígenos do doador (W. Burlingham e E. Jankowska-Gan, não publicado) um fenômeno previamente descrito em transplante de rim em humanos ( VanBuskirk, et al, 199S: Burlingham, et al., 2000, Cai, et al., 2004), e primatas não-humanos (Torrealba, et al., 2004).

Ligação inespecífica de HLA DR é um fator de risco bem conhecido para rejeição aguda precoce de transplantes de órgãos (Ayoub, et al., 1982). Isto poderia parcialmente explicar o motivo de ligação inespecífica DR estar associada com BOS (van den Berg, et al., 2001). Também é possível que ligação inespecífica de HLA DR desempenhe um papel benéfico em transplante de pulmão pelo estabelecimento de condições para regulação autoimune direcionada para auto-antígenos e antígenos de doador (Rodriguez, et al., 2004).

Há uma conexão bem estabelecida entre autoimunidade de célula B ao colágeno Tipo IV e à síndrome de Goodpasture (Hudson et al., 2003 ), que foi confiimado no presente estudo em nível de célula T usando o ensaio trans-vivo DTH (FIG 3B). Liberação de colágeno IV do rim devido à lesão mediada por célula T predispõe o sistema à imunidade de célula B local e deposição de IgG de membrana basal anti-glomerular em um modelo desta doença em rato. Similarmente, liberação de col( V) do transplante de pulmão isquemicamente lesionado no contexto de alorreatividade pode ativar células T efetoras colfV )-específicas, promovendo resposta de célula B col(V)específíca local e deposição de IgG C'-fixadora na matriz sub-epitelial.

Um resultado de exemplo 2, aqui relatado, é a descoberta de que autoimunidade col(V)-específica pré-existente existe em pacientes com IPF. A etiologia de 1PF permanece um mistério, do mesmo modo o motivo do prognóstico insatisfatório destes pacientes após transplante de pulmão (REF). Se células T anti-col (V)-específicas contribuem ou não para o processo fibrótico subjacente a esta doença de pulmão, ou para os resultados precoces insatisfatórios em transplante de pulmão para IPF, permanece para ser determinado, embora estes dados sejam claramente consistentes com uma conexão entre estes fenômenos.

Os resultados surpreendentes de exemplo 2 sugerem tratamento de pacientes diagnosticados com ou sob risco de desenvolvimento de IPF pela restauração ou pelo reforço de auto-tolerância ao col(V) antes do transplante. Uma modalidade é um método de tratamento de IPF pela administração de col(V) quer por terapia oral (Yasufuku et al, 2001; Yasufuku, et al., 2002) intersticialmente para dentro do pulmão quer por outras estratégias de dessensibilização em um regime de dosagem planejado para aumentar a tolerância do paciente aos colágenos incluindo, mas não necessariamente limitados ao colágeno Tipo V e seus componentes e variantes antigênicos.

Ainda outra modalidade é um ensaio baseado em anticorpo para diagnosticar ou monitorar doenças que incluem uma resposta autoimune.

Detecção da presença de anticorpos para colágeno de acordo com algumas modalidades pode ser realizada usando qualquer um de numerosos procedimentos de imunoensaio, tais como por procedimentos de ELISA. Uma ampla variedade de técnicas de imunoensaio está disponível como pode sei· visto por referências aos livros-texto padrão de imunoensaio que incluem, mas não são limitados aos ensaios de sítio único e de dois sítios ou “de sanduíche” dos tipos não-competitivos, bem como aos ensaios de ligação competitiva tradicionais.

Ensaios de sanduíche estão entre os métodos de ensaio baseado em anticoipo mais úteis e comumente usados e podem ser utilizados para praticar várias modalidades. Há numerosas variações da técnica de ensaio de sanduíche, e todas são intencionadas para serem incluídas nas várias modalidades. Resumidamente, em um ensaio típico para detectar anticoipos em uma amostra, um antígeno não marcado é imobilizado sobre uma superfície sólida e a amostra a ser testada é contatada com a molécula de antígeno ligada. Após um período adequado de incubação, i.e. por um período de tempo suficiente para permitir a formação de um completo de anticorpoantígeno, um segundo anticorpo tal como IgG de anti-humano, marcado com uma molécula repórter capaz de produzir um sinal detectável, é então

2S adicionado e incubado, pennitindo tempo suficiente para a fonuação de um anticorpo-antígeno-anticorpo marcado. Qualquer material não reagido é removido por lavagem, e a presença do anticorpo a ser detectado na amostra é determinada pela observação de um sinal produzido peJa molécula repórter. Os resultados podem sei’ quer qualitativos, e.g,, por simples observação do sinal visível, quer podem ser quantificados por comparação do sinal gerado por uma amostra de interesse com uma amostra de controle contendo quantidades conhecidas de anticorpo a ser detectado. Variações neste ensaio incluem um ensaio simultâneo, no qual ambos a amostra e o anticoipo marcado são adicionados simultaneamente no antígeno ligado. Estas técnicas são bem conhecidas, incluindo variações menores como será prontamente evidente para aquelas pessoas na arte.

No típico ensaio de sanduíche, o antígeno é imobilizado, por exemplo ao ser covalente ou passivamente ligado em uma superfície sólida. Em algumas modalidades a superfície sólida é tipicamente vidro ou um polímero, os polímeros mais comumente usados sendo celulose, poliacrilamida, náilon, poliestireno, poliícloreto de vinila) ou polipropileno. Os suportes sólidos podem estar na forma de tubos, glóbulos, discos, ou microplaca, ou qualquer outra superfície adequada para conduzir um imunoensaio. Vários processos de ligação são bem conhecidos na arte e geralmente consistem de reticulação, ligação covalente ou adsorção física do antígeno em uma dada superfície. O antígeno imobilizado é então lavado em preparação para a adição da amostra de teste. Uma alíquota da amostra a ser testada é então contatada com o antígeno imobilizado e incubada por um período de tempo suficiente (e.g. 2-40 minutos) e sob condições adequadas (e.g. 25°C) para permitir ligação de qualquer anticorpo no colágeno presente na amostra. A duração real do tempo de contato, condições de tamponador, temperaturas e semelhantes são parâmetros prontamente ajustáveis e são tipicamente prontamente alcançados em um dado teste. Após o período de incubação, o antígeno imobilizado incluindo qualquer corpo ligado é lavado e seco, e incubado com um segundo anticorpo específico para o anticorpo ligado, por exemplo TgG anti-humano. <3 segundo anticorpo é ligado em uma molécula repórter que é usada pai a indicar a ligação de segundo anticorpo no complexo de anticorpo-antígeno imobilizado.

O termo grupo como aqui usado inclui moléculas, átomos, grupos funcionais químicos, e semelhantes.

O termo molécula repórter como usado no presente relatório descritivo, inclui moléculas que, por sua natureza química, proporcionam um sinal analiticamente identificável que pennite a detecção de anticorpo ligado em antígeno. Detecção pode ser quer qualitativa quer quantitativa. As moléculas repórter mais comumente usadas neste tipo de ensaio incluem enzimas, fluoróforos ou moléculas contendo radionuclídeo (i.e. radioisótopos), moléculas quimioluminescentes e semelhantes. No caso de um imunoensaio de enzima (EIA), uma enzima é conjugada no anticorpo secundário, geralmente por meio de glutaraldeído ou periodato. Como será prontamente reconhecido, contudo, há uma ampla variedade de técnicas de conjugação diferentes, que estão prontamente disponíveis na arte e condições ótimas ou quase-ótimas para testes e ensaios específicos podem ser prontamente alcançadas com experimentação apenas mínima. Enzimas repórter comumente usadas nestes tipos de ensaios incluem, mas não são limitadas a, peroxidase de rábano, glicose oxidase, beta-galactosidase e fosfatase alcalina, dentre outras. Üs substratos a serem usados com enzimas específicas são geralmente escolhidos para a produção, sob hidrólise pela enzima correspondente, de uma mudança detectável em um dado sinal associado com a presença de átomo ou molécula repórter. Também é possível empregar substratos fluorogenicos, que dão um produto fluorescente em vez de substratos cromogênicos observados acima. Na maioria dos casos, o anticorpo marcado com enzima é adicionado no complexo de primeiro anticorpo - antígeno, permitido ligai', e então o reagente em excesso é removido por lavagem. Uma solução contendo o substrato apropriado é então adicionado no complexo de anticorpo-antígeno-anticorpo marcado. O substrato reagirá com a enzima ligada no anticorpo secundário, produzindo um sinal visual detectável, que pode ser depois quantificado, normalmente usando um instrumento espectrofotométrico, para dar indicação da quantidade de anticorpo que estava presente na amostra. O termo molécula repórter também se estende ao uso de aglutinação ou inibição de aglutinação de células, tais como glóbulos de látex ou de vidro, e semelhantes. Adicionalmente, o repórter pode ser um átomo ou grupo radioativo cuja presença é detectada, por exemplo, por contagem de cintilação.

Altemativamenle, compostos fluorescentes tais como fluoresceína e rodamina, podem ser quimicamente copulados em anticorpos sem significativamente alterar sua capacidade de ligação. Quando ativados por iluminação com luz de um comprimento de onda particular, os anticorpos marcados com fluorocromo absorve energia luminosa, induzindo um estado de excitabilidade na molécula, seguido por emissão de luz em uma cor característica, em algumas modalidades o sinal emitido é visualmente detectável com um microscópio de luz enquanto que em outras modalidades o sinal pode estar fora do espectro visível. Como em EIA, o anticoipo fluorescentemente marcado é permitido se ligar no complexo de primeiro anticorpo-antígeno. Após remoção por lavagem do reagente não ligado, o complexo terciário restante é então exposto à luz de comprimento de onda apropriado e a fluorescência obsei-vada indica a presença do anticoipo de interesse. Ambas as técnicas de EIA e de imunofluorescência estão bem estabelecidas na arte e são prontamente adaptáveis para uso cora várias modalidades aqui descritas. Em adição, outras molécula repórter, tais como radioisótopo, moléculas quimioluminescentes, fluorescentes ou bioluminescentes e semelhantes, também podem ser empregadas.

Com o objetivo de praticar algumas modalidades pode ser necessário obter colágeno puro ou parcialmente puro ou um seu epítopo ou porção antigênica. Estes materiais por exemplo colágeno de Tipo V ou suas porções antigênicas podem ser prontamente obtidos por uma variedade de meios incluindo mas não limitados a fontes animais, cadáveres humanos, ou meios recombinantes para nomear alguns. Métodos adicionais incluem digeridos parciais de colágeno tal como colágeno de Tipo V.

Um aspecto compreende diagnosticar doenças tal como Fibrose Pulmonar Idiopática por identificação de evidência de uma resposta autoimune ao tecido conjuntivo de pulmão tal como colágeno de Tipo V. Evidência de tecido conjuntivo pode incluir colágeno de Tipo V e epítopos do mesmo. Como claramente ilustrado em exemplo 3, uma abordagem que pode ser usada para identificar e ou seguir pacientes com IPF ou sob um risco aumentado para desenvolvimento de IPF ou BQ ou BOS é medir o nível de anticorpo anti-colágeno de Tipo V em fluidos corporais de paciente.

Outro aspecto inclui tratamento de pacientes diagnosticados com condições médicas, ou considerados em terem condições médicas, ou considerados sob risco aumentado para desenvolvimento de condições médicas relacionadas com rejeição autoimune de colágeno encontrado em tecido de pulmão pela administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva e segura de um composto tal como colágeno de Tipo V e vários compostos antigênicos de colágeno de Tipo V e/ou seus análogos. Estes compostos podem ser administrados por qualquer meio conhecido no campo incluindo alimentação oral, instilação intrapulmonar, inalação, injeção e semelhantes. A quantidade efetiva do composto terapêutico e a duração do tratamento provavelmente dependerá de cada paciente e podem ser prontamente calibradas para induzirem um efeito terapêutico, e.g., pelo menos uma supressão parcial de uma resposta autoimune de paciente aos colágenos tal como colágeno de Tipo V ou algum seu fragmento.

Discussões gerais adicionais do valor terapêutico do uso de epítopos MCH para tratai- doenças ou condições médicas envolvendo o sistema imune podem ser encontradas em, por exemplo, Patente U.S. de No. 6.911.220, publicada por Sachs aos 28 de junho de 2005 e Publicação de Patente US de No. 2003/0078208 Al (Wilkesj publicada aos 24 de abril de 2003, ambas as quais são aqui incorporadas como referências em suas totalidades.

Em uma modalidade pacientes diagnosticados com, ou considerados sofrendo de, uma doença ou distúrbio ]?ulmonar que inclui ou é causado por uma resposta autoimune podem ser tratados com drogas imunossupressoras, incluindo, por exemplo, Ciclosporina. Para uma discussão geral adicional de Ciclosporina incluindo uma discussão de alguns de seus efeitos sobre o sistema imune o leitor é direcionado às Patentes U.S. de Nos. 6.410.696 publicada por, et al. aos 25 de junho de 2005 e 5.990.274 publicada por Wang aos 23 de novembro de 1999, ambas as quais são aqui incorporadas como referências em suas totalidades.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Para determinar se pacientes de pós-transplante de pulmão também estavam desenvolvendo autoimunidade específica para colágeno de Tipo V, realizamos ensaios de hipersensibilidade de tipo retardado (DTIT) usando leucócitos de 8 receptores de transplante de pulmão e de 5 receptores de transplante renal (que têm síndrome de Goodpasture, uma autoimunidade a colágeno (col) de Tipo IV) e três colágenos diferentes. Como mostrado em FIG. 3 Painel A, células T dos receptores de transplante de pulmão responderam ao col(V), mas não ao col(lV) ou coli II), enquanto que células T dos pacientes com síndrome de Goodpasture. tiveram respostas de DTIT significativamente mais altas ao col(IV) sem respostas ao to col(V) ou col( II). Esta descoberta chave mostra que pacientes de transplante de pulmão possuem autoimunidade anti-eolágeno de Tipo V.

A seguir determinamos se uma resposta imune anti-colágeno de Tipo V poderia ser vista em quaisquer pacientes aguardando um transplante de pulmão, refletindo assim uma condição pré-existente que poderia predispor certos pacientes à função de pulmão insatisfatória e à rejeição. Uma análise da resposta de DTH anti-col(V) em 23 pacientes com várias doenças de pulmão de estágio final aguardando transplante de pulmão mostrou que um grupo específico não possui uma resposta autoimune anticolágeno de Tipo V. Como mostrado em FIG. 5, pacientes com Fibrose Pulmonar ldiopática (IPF) exibiram uma resposta de DTFI anti-col( V) que foi o dobro daquela vista em pacientes com qualquer outra doença. Esta descoberta chave mostra que IPF pode ser causada por uma resposta autoimune ao colágeno de Tipo V.

Para adicionalmente confirmar esta descoberta, pacientes aguardando transplante de pulmão devido a várias causas diferentes foram testados para sua resposta autoimune a qualquer um de col(V) ou col(II). Como mostrado em FIG. 3 Painel B, apenas células T dos pacientes com IPF exibiram uma resposta autoimune que foi específica para colágeno de Tipo λ^ζ . Também é interessante mostrar que os pacientes com IPF transplantados na University of Wisconsin tiveram sobrevivência de enxerto significativamente menor do que 1 ano (p=0,05) (FIG. 3 Painel C), o que sugere que uma resposta autoimune pré-existente ao colágeno de Tipo V pode resultar em uma perda mais rápida de função de pulmão e morte. Os resultados mostrados em FIG.s 3 e 5 indicam que IPF pode ser causada por uma resposta autoimune ao colágeno de Tipo V, que estes pacientes rejeitarão seus pulmões em uma velocidade mais rápida devido a esta resposta autoimune, e que isto representa um grupo adicional de pacientes que responderão à terapia de tolerância oral com colágeno de Tipo V.

Para confirmar a idéia de que uma resposta autoimune pré existente ao colágeno de Tipo V, como vista em pacientes com IPF, resultaria em destruição de pulmão usamos nosso modelo de transplante em rato. Ratos WKY são imunizados quer com nada (FIG. 6a), lisozima de ovo de galinha (ITEL) (FIG. 6b) quer com colágeno de Tipo V (FIG. 6c) e então transplantados com um pulmão de isoenxerto. Como visto, ratos imunizados quer com nada quer com HEL mostraram patologia de pulmão normal. Em contraste, ratos com uma resposta imune ativa ao colágeno de Tipo V destmíram seu pulmão de isoenxerto dentro de 30 dias. Estes dados estão adicionalmente consistentes com uma resposta autoimune ao colágeno de Tipo V indicando um risco maior de rejeição de tecido de pulmão ou de pulmão transplantado do que o esperado em receptores de transplante de pulmão que não exibem uma resposta imune ao colágeno de Tipo V.

Exemplo 2

Síndrome de bronquiolite obliterante (BOS) é a causa líder de perda, de enxerto após transplante de pulmão. Colágeno Tipo V (col(V)), um colágeno menor da matriz extracelular de pulmão, tem estado implicado na patogenese de rejeição de aloenxerto de pulmão de rato. Para testar a hipótese de que autoimunidade ao col(V) após transplante de pulmão de humano predispõe à BOS, analisamos respostas de hipersensibilidade de tipo retardado (DTFI) nas respostas de anticorpo e de sangue periférico na lavagem broncoalveolar (BAL).

De 19SS-Junho de 2003, todos os transplantes de pulmão realizados na University of Wisconsin (11=229) foram analisados retrospectivamente para o risco de predisposição à BOS. DTFI ou anticorpos para col(V) ou col(II) foram medidos em 56 destes receptores, 10 controles normais, e 25 pacientes aguardando transplante.

Todos os indivíduos consentiram em usar procedimentos de consentimento informados aprovados por IRB na University of Wisconsin e Indiana University School of Medicine. Dos 229 pacientes recebendo transplantes de pulmão primários na University of Wisconsin Hospital and

Clinics de 1988-Junho 2003, 3 foram excluídos da análise devido às falhas técnicas.

Todos os pacientes sofreram lavagem broncoalveolar (BAL) de protocolo e biopsia transbronquial (TBB) a 0,5, 1, 3,6, 9 e 12 meses após transplante, e mais tarde quando clinicamente indicado. Tecido de TBB foi triado para inclusões de citomegalovírus (CMV) e infiltrados celulares. Os pacientes de estudo de col(V) (n=56) incluíram 29 arrolados em um protocolo de estudo DHT de pós-transplante iniciado em 2000, 23 pacientes dos quais BAL annazenada foram testados retrospectivamente para anticoipo para col( V), e 4 pacientes foram testados apenas para DTH começando no ano 3-6 após transplante. De outro modo, amostras de sangue foram retiradas para o ensaio DTH a aproximadamente 6, 12, e 18 meses, e anualmente depois. Doadores de sangue adultos não fumantes, e voluntários sofreram broncoscopia e coleta de fluido de BAL, serviram como um grupo de controle negativo. Cinco pacientes após transplante de rim para síndrome de Goodpasture também foram recrutados como doadores de sangue de controle em testes DTH.

BOS de nível I, o ponto final de estudo primário, foi diagnosticada por uma queda sustentada em FEV1 para <80% do valor de pós-transplante máximo pelo menos 90 dias após transplante (9).

IgG foi purificada por afinidade do fluido de BAL de pacientes e controles pela passagem em uma coluna Protein G Sepharose comercialmente preparada (Pharmacia, Piscataway, NJ) de acordo com o protocolo do fabricante. Todas as frações eluídas foram congeladas a -S0°C até o uso.

Anticorpos para col(V) foram analisados usando uma técnica de westem-blotting como descrito previamente (6), exceto que anticorpos específicos para isotipo de IgG de cabra anti-humano foram usados para detecção. Col(II) e col(V) de bovino (Collaborative Biomedical ProductsBectonDickinson, Bedford MA) ou col(V) extraído de placenta de humano (10) foram usados como antígenos alvo.

Camundongos CB-17 SC1D foram comprados de Harlan Sprague Dawley, Inc (Indianapolis, IN) ou foram localmente procriados. Todos os animais foram alojados e tratados de acordo com as diretrizes NIH.

O ensaio trans-vivo DTH foi realizado por co-transferência de antígenos e PBMC de humano nas patas de camundongos SO1D como descrito previamente (ii). Col(V), col(lV) de humano (Fluka, Inc., Buchs, Suíça) ou col(II) de bovino (5 pg/injeção; Southem Biotech, Birmingham, AL) foram os antígenos de teste. Espessura de para foi medida antes e 24 horas após injeção usando um medidor de espessura de mostrador. Inchamento de fundo, devido ao PBMC com tamponador apenas, foi subtraído para determinar a resposta específica para antígeno. Respostas de inchamento de > 25 x 10'⁴ polegadas [63,5 x 10' milímetros] sobre fundo foram consideradas positivas (12).

Taxas de sobrevivência livres de BC>S foram estimadas usando os métodos de Kaplan e Meier e comparadas entre grupos usando um teste de classificação em log. Os critérios para tuna resposta de Ab ou DTFI col(V) negativa foi estringente - pacientes com uma banda anti-Col(V) fracamente positiva sobre Western blot ou uma resposta de DTFI minimamente positiva (25 x 10’⁴ polegadas [63,5 x 10' milímetros]) foram consideradas positivas, até mesmo se todos os instantes de tempo foram negativos. Modelo de perigos proporcionais de Cox foi usado para avaliar a associação entre fatores de risco suspeitos, alguns dos quais foram de tempo variado, e sobrevivência livre de BOS. Valores de p < 0,05 foram considerados significativos. Todas as análises foram realizadas usando programa de computador SAS statistical de versão 6.12, SAS Institute Inc. (Cary, NC). Respostas de DTH a col(V) de pré-transplante foram comparadas entre um subgrupo de pacientes com IPF e outros grupos usando um teste de Kruskal-Wallis.

Referindo-se agora à Tabela 1 (FIG. 7), aqui sumariadas são a demografia e a incidência de BOS em 226 receptores de transplante de pulmão na University of WI, Madison. BOS desenvolveu em 86 (38⁰.}) pacientes. Houve mais transplantes de pulmão simples (n=133) em comparação com transplantes de pulmão bilateral (n= 93). O período de acompanhamento médico médio foi de 3,7 anos. A composição da população geral e aquela do subconjunto de estudo de col(V) foram similares com respeito à incidência de BOS, ao tempo de acompanhamento médico médio, e proporção de pacientes em cada categoria de doença.

Temos previamente relatado que produção de IgG2 foi seletivamente aumentada em fluido de BAL durante episódios de rejeição de aloenxerto de pulmão (10). Como ilustrado em FIG. IA, anticorpos lgG isolados de BAL de pacientes de transplante de pulmão L3 (perda de enxerto BOS de nível III) e L41 ( sem BOS) se ligaram fortemente em col(V), mas não em col( ll) em Western blot. Col(V) tanto de bovino quanto de humano foram reconhecidos igualmente por BAL IgG (dados não mostrados), indicando que o epítopo alvo está conservado através das espécies. Em contraste aos L3 e L41, ligação fraca ou ausente em col(V) foi observadas em amostras de BAL de L31, que não desenvolveu BOS (FIG.1A); resultados negativos também foram vistos com IgG isolada de BAL de voluntários normais (n=10; dados não mostrados).

A seguir examinamos a relação de autoimunidade anti-col(V) na periferia, usando o teste trans-vivo DTII, e localmente, por análise de anticorpo BAL, para o desenvolvimento de BOS. O curso clínico, dos mesmos três pacientes, é mostrado em FIG. 1B. Paciente L3 teve uma reatividade DTFI anti-col(V) forte e específica no tempo inicial após o transplante testado (180 d.), quando FEV-1 ainda estava em um nível máximo. Uma resposta forte de anticorpo para col(V) também foi detectada imediatamente antes do desenvolvimento de BOS (retângulo preto), quando valores de FEV-1 estavam oscilando ao redor de 80% de máximo. Ambas respostas de DTFI e de anticorpo ao col(V) foram detectadas usando o início de BOS, mas reatividade DTI-I foi perdida no estágio final de BOS (grau III) no dia 450.

Paciente L41 e um exemplo de um paciente com respostas iniciais fortes ao col(V), mas nenhuma queda sustentada em função de aloenxerto. Anticorpo (2+) anti-col(V) foi detectado nos dias 48 a 213 e todas as amostras PBMC obtidas dos dias 188 a 460 foram DTH-positivas para col(V). E>esde d.500 a resposta de DTFI anti-col(V) tem sido variável e geralmente declinando. Após um episódio de rejeição aguda no dia 90, função pulmonar foi estabelecida a aproximadamente 82% de FEV1 máximo, imediatamente antes de interrupção para BOS-1.

Paciente L31 teve uma resposta de anticorpo fraca ao col(V) no dia 49 e uma resposta de DTFI anti-col(V) resposta minimamente positiva no dia 400, mas nunca desenvolveu reatividade autoimune forte. O paciente tem mantido excelente função de enxerto por > 5 anos, e na amostra PBMC mais recente (dia 1600) permanece negativo para resposta de DTFI anticol(V).

Estes três padrões de respostas de col(V) e função de aloenxerto são representativos daqueles vistos no subgrupo de estudo de 56 pacientes. FIG. 1C mostra o curso de tempo de pós-transplante de 4 pacientes adicionais em cada categoria. Cada linha representa % de FEV1 máx para um único paciente e cada símbolo vermelho representa um teste positivo para col(V) (quer anticorpo em BAL quer inchamento de pata líquido > 25 x 10’⁴ polegadas [63,5 x 10'^J milímetros] no ensaio DTH). Cada símbolo verde indica um teste com um resultado de anti-col( V) negativo.

Todos os quatro pacientes na primeira categoria (anti-col(V) +, BOS+), como paciente L3, mostraram um resultado de teste de anticorpo ou

DTIT positivo antes da perda da função de enxerto. Pacientes na terceira categoria (anti-col(V) BOS-) raramente tiveram uma resposta ao col(V) e todos continuaram livres de BOS com acompanhamento médico de 3-6 anos. Os pacientes na categoria do meio são talvez os mais interessantes porque todos eles manejaram para manter excelente função de enxerto 1-3 anos após o transplante a despeito dos testes positivos repetidos para resposta anticol(V).

Os resultados de uma análise retrospectiva de fatores de risco associados com BOS ou perda de enxerto ou BOS sozinha como o ponto final são mostrados em Tabela 2 (FIG. S). Fatores de pré-transplante de predisposição para um risco significativamente mais alto (p<0,05) de BOS na

DR com o doador (RR=1,64 vs. 0 ou ligação inespecífíca de 1DR), e possuindo uma categoria de doença de doença pulmonar obstrutiva crônica, COPD (RR - 1,7) ou outra (RR=1,9). Fatores de pré-transplante de predisposição para uma incidência menor de BOS ou de perda de enxerto incluíram uma doença original de fibrose cística (CF) ou tendo recebido um transplante de pulmão bilateral, o tratamento principal para esta categoria de doença (ambos RR=0,35). Fatores de risco de pós-transplante para BOS também foram avaliados. Como esperado, a incidência de episódios de rejeição aguda foi associada com um risco 1,4 a 1,5 maior de BOS que foi elevadamente significativo. Contudo, nem um pulmão de doador CMV·!· em um receptor CMV-, nem CMV provado por biopsia no período de póstransplante, esteve significativamente associado com BOS.

Referindo de novo à FIG. S, Tabela 2 sumariza a análise de função insatisfatória (BOS I ou perda de enxerto) ou desenvolvimento de BOS I em 56 receptores de transplante de pulmão analisados para respostas ao col(V) usando um modelo de perigos proporcionais de Cox. Neste subconjunto de pacientes, rejeição aguda foi de novo risco para função insatisfatória. RR mais alto para função de enxerto insatisfatória (12,3) foi verificado em pacientes com uma DTH positiva ao col(V) no instante de tempo próximo ao início de BOS. Resposta de DTH ao col(II) de controle não mostrou correlação com desenvolvimento de BOS (RR = 1,0) indicando que a resposta de DTH ao col(V) é um marcador específico de risco de BOS. 2 demonstra graficamente a associação de respostas de DTH ao colfV) com desenvolvimento de BOS. Pacientes com função de pulmão boa (>S0% de FEV1 máx) no dia 370 (painel de topo) e no dia 760 após transplante (painel de fundo) foram divididos em respondedores col(V)-l- vs. col(V)- baseado em análise de anticoipo e/ou DTFI e análise de Kaplan-Meier foi realizada com tempo para BOS I como o ponto final. Mais do que metade dos pacientes com reatividade anti-col(V) ante do instante de tempo desenvolveu BOS dentro dos 2 anos seguintes, enquanto que pacientes com resposta negativa ao col( V) foram predominantemente livres de BOS.

O nível de anticorpos anti-col(V) em BAL esteve significativamente associado com o desenvolvimento de BOS ou perda de enxerto de qualquer causa (RR = 2,3), e com o risco de apenas BOS (RR = 2,0S). Quando os dois indicadores, DTH ou anticorpo para col(V), foram combinados, o RR para BOS ou perda de enxerto foi 12,7 e aquele para BOS não pode ser calculado porque todos os pacientes que desenvolveram BOS tiveram resposta de anticorpo ou DTH positiva ao col(V) em algum instante de tempo prévio Tabela 2, (FIG. S).

Com o objetivo de determinar se respostas anti-col(V) vistas em pacientes de pós-transplante de pulmão são simplesmente uma reflexão de uma condição pré-existente que podería predispor certos pacientes à função insatisfatória (isto é pacientes com COPD teriam respostas anti-col(VO de pré-tratamento mais altas enquanto que aqueles com CF teriam respostas mais baixas), analisamos a resposta de DTFI anti-col(V) em 23 pacientes com várias doenças de pulmão de estágio final aguardando transplante de pulmão.

Como mostrado em FIG. 3 Painel A, pacientes com doença de pulmão no estado mais final não possuem respostas de DTH anti-col(V) que são significativamente diferentes daquela vista em indivíduos normais sem doença de pulmão conhecida. A exceção é pacientes com IPF. A resposta de DTH anti-col(V) nestes pacientes foi o dobro daquela vista em pacientes com qualquer outra doença. O interessante e que pacientes com IPF transplantados na University of Wisconsin tiveram sobrevivência de enxerto significativamente menor de 1 ano (p=0,05, dados não mostrados), mas sobrevivência similar de 5 anos e taxa de desenvolvimento de BOS (Tabela 1).

Em um esforço para determinar se o desenvolvimento de autoiraunidade ao colágeno em pacientes de pós-transplante de pulmão foi específico para colágeno de Tipo V, realizamos ensaios DTH usando col(Il), col(IV), e col(V) em S receptores de transplante de pulmão e 5 receptores de transplante renal com síndrome de Goodpasture (autoimunidade a colágeno de Tipo IV). Como mostrado em FIG. 3 Painel B, receptores de transplante de pulmão responderam ao col( V), mas não ao col(IV) ou col(II), enquanto que pacientes com síndrome de Goodpasture tiveram respostas de DTH ao coJ(IV) significativamente mais altas sem respostas ao coJ(V) ou col(II).

Exemplo 3

Ensaio de glóbulo para detecção de respostas imunes mediadas por anticorpo ou humorais contra colágeno de Tipo V. Este ensaio detectará anticorpos para colágeno de Tipo V como podem estar presentes em soro e/ou fluido de lavagem de pulmão dos pacientes que têm uma resposta autoimune ao colágeno de Tipo V. Glóbulos revestidos com colágeno de Tipo V juntamente com reagentes de dicção necessários são proporcionados para este ensaio. O usuário final pode proporcionar soro e/ou fluido de lavagem de pulmão, e reagentes comuns tal como PBS ou estes reagentes podem ser montados em um kit, para realizar o ensaio. Resumidamente, um ensaio típico é como segue:

1) Glóbulos revestidos com estreptavidina ( 5 um, capacidade de ligação de 10-20 pg/L x 10/7 glóbulos (Polyscience, Wamngton, PA)) foram lavados duas vezes com PBS estéril. Glóbulos (1 x 10/7) foram suspensos em 100 pL de PBS com 40 pg de colágeno de Tipo V de humano e incubados por 60 minutos a 4'^:'C.

2) Um controle positivo foi gerado pelos seguintes procedimentos em 1 acima, usando 20 pm de anticorpo de coelho para anticorpo anti-colágeno V de humano (bioten) (Abeam, Cambridge, MA).

3) Para cada ensaio, 1 χ 10⁶ glóbulos conjugados foram lavados duas vezes em PBS, e incubados em 100 pL de PBS mais 50 pL de soro de fluido de lavagem de pulmão. Após incubação por 30-minutos na temperatura ambiente, os glóbulos foram lavados três vezes com PBS contendo 10/% FCS.

4) Os glóbulos foram suspensas em 100 pL de PBS estéril +10% FBS e incubados por cerca de 30 minutos na temperatura ambiente com anticorpo secundário. Tipicamente, 5 pL de anticorpo IgG anti-humano conjugado com R-PE foram usados (Sigma, Saint Louis). Os glóbulos foram lavados três vezes em PBS contendo 10% FCS, suspenso em 300 pL de solução de PBS/FCS e analisados usando um citômetro de fluxo. Os resultados de um exemplo deste ensaio são sumarizados em FIG. 9.

Para o controle positivo, quantidades crescentes de anti-soros anti-colágeno-V foram adicionadas no ensaio de glóbulo. Como os painéis no lado direito de FIG. 9 ilustram, quantidades aumentadas de anticorpos anticolágeno V resultam em um deslocamento significativo para a direita do canal fluorescente médio. Assim, este método pode detectar quantidades diferentes de anticorpos presentes em um soro de paciente. Referindo ainda à FIG. 9, os painéis da esquerda ilustram a detecção de anticorpos anti-colágeno V do soro de quatro pacientes comparado com amostras de soro de indivíduos humanos saudáveis. Como ilustrado pelos traços, uma amostra do paciente #457 mostra o deslocamento maior para a direita, sugerindo que este paciente possui o nível mais alto de anticorpos anti-colágeno V. Pacientes #458 e 420 mostram deslocamentos pequenos indicativos de níveis menores de anticorpo do que o paciente #457, enquanto que, paciente 519 não parece ter quaisquer anticorpos que reagem neste ensaio.

Como mostrado pelos resultados sumariados em FIG. 9, paciente #457 mostra o deslocamento mais alto para a direita sugerindo que este paciente particular possui o nível mais elevado de anticoipos anti-col(V). Em contraste, amostras coletadas dos pacientes #458 e #42(> ilustram apenas deslocamentos pequenos em pico fluorescente; enquanto que, paciente #595 não parece ter quaisquer anticoipos nesta amostra particular. Estes dados são ilustrativos de um método para detectar a presença de doença pulmonar idiopática (IPD) ou outra doença ou distúrbio de pulmão baseada em autoimunidade e/ou avaliar a possibilidade de que um dado paciente sofrendo de um transplante de pulmão provavelmente rejeitará o órgão transplantado. Este método de diagnosticar doença de pulmão ou de avaliar uma possibilidade de dado paciente para desenvolver BOS geralmente envolve coleta de uma amostra de fluido corporal, por exemplo, soros ou fluido intersticial ou tecido do paciente e análise da amostra para a presença de anticorpo anti-colágeno de Tipo V.

Exemplo 4

Indução de tolerância oral, em animais de teste, de um modelo para modulação de uma resposta imune de paciente humano ou animal ao colágeno ou um componente antigênico de colágeno. Ratos machos jMHC (RT1 j-incompatíveis, livres de patógeno utilizados foram: ratos Fischer 344 (F344, RT1^1V1) Brown Norway (BN, RT lⁿ⁾, e Wistar Kyoto (WKY, RT1¹) (250-300 g) no momento do transplante, comprados do Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, Incl.) ou Taconic (Germantown, N.Y.) e alojados no

Laboratory Animal Resource Center at Indiana University School of Medicine (Indianapolis, Ind.) de acordo com diretrizes da instituição.

Resumidamente, colágeno de Tipo V foi preparado como segue. Colágeno de Tipo V de humano purificado [col( V)] foi diluído em ácido acético 0,005 M (0,5 mg/mL) e armazenado a 4°C até ser usado no ensaio. A quantidade de col(V) foi avaliada pela, determinação do conteúdo de hidróxi-prolina nas amostras (Woessner, 1961).

Neste teste particular o colágeno de Tipo V foi administrado oralmente a ratos machos WKY. Os animais (180-200 g) foram alimentados quer com 10 pg quer com 50 pg de solução de col(V), col(Il) ou col(XI) dissolvidos em 0,5 mL de solução salina por uma gavagem gástrica utilizando agulha de alimentação de animal de aço inoxidável de ponta de bola de calibre 16 (Braintree Scientific, Braintree, Mass) como previamente descrito (Stark e Ostrow, 1990). Como um controle animais similares foram alimentados com apenas diluente. Animais foram alimentados dia sim, dia não, para oito ou quatro alimentações. Sete dias após a última alimentação, estes ratos receberam aloenxertos de pulmão F344 por transplante ortotópico. Enxertos de pulmão WKY transplantados em receptores WKY (isoenxertos) foram usados como controles.

Respostas de hipersensibilidade de tipo retardado (DTH) foram determinadas por uma modificação dos procedimentos descritos por Sayegh et al., 1992; Yoshino et al., 1995; e Yamagami et al., 1999. Em resumo, duas semanas após o transplante de pulmão, ratos WKY de controle ou alimentados com WKY receberam 10 esplenócitos F344 derivados de doador irradiados (3.000 rad) ou de terceira parte (BN) em 30 pL de PBS na aurícula direita por injeção subcutânea (s.c.) usando uma agulha de calibre 26. A aurícula esquerda recebeu um volume igual de diluente para servir como o sítio de controle. Um grupo separado de ratos WKY receptores de aloenxerto ou inexperientes foi testado com 15 pg de col(V) em volume de 30 pL injetado na aurícula direita e diluente na esquerda. Ratos WKY inexperientes foram usados como controles negativos. A espessura da orelha foi medida com um micrômetro (Mitutoyo, Field Tool Supply, Chicago, 111.) em um modo cego imediatamente antes e 24 h após injeção. Resposta de DTH antígeno-específico foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: Inchamento Específico de Orelha = (espessura de orelha direita (g) 24 h espessura de orelha direita @ 0 h) - (espessura de orelha esquerda (â), 24 h espessura de orelha esquerda (â), 0 h) x 10’³ mm (Yamagami et al., 1999). Todos os dados relatados como a média de medições triplicadas.

O transplante ortotópico de isoenxertos de pulmão esquerdo (WKY^-WKY), ou aloenxeitos (F344 —>WKY) foi realizada como previamente descrito (Sekine et al., 1997), utilizando um procedimento inicialmente descrito por (Marek et al., 1983 e Prop et al., 1985). Similar ao relatório anterior dos inventores (Sekine et al., 1997), sobrevivência ultrapassou 90% em todos os grupos de transplante. Nenhuma terapia imunossupressora foi dada em qualquer tempo durante o período experimental.

Pulmões transplantados foram monitorados por radiografias de tórax seriais nos dias 1, 6, e 13 após transplante. As mudanças radiográficas foram graduadas como segue: grau 1, normal; grau 2, infiltrados suaves; grau 3, infiltrados moderados; e grau 4, infiltrados severos ou opacificação completa.

Cinco gmpos de transplante foram estudados: pulmões de ratos WKY transplantados em receptores WKY (WKY—> WKY, isoenxertos de controle); pulmões F344 transplantados em receptores WKY alimentados com diluente (F344—>WKY, aloenxertos de controle); pulmões F344 transplantados em receptores WKY alimentados com col(V) (F344—> WKY alimentado com col(V), aloenxertos alimentados com col(V)); pulmões F344 transplantados em receptores WKY alimentados com col(IJ) (F344—> WKY alimentado com col(II), aloenxertos alimentados com col(II)); e pulmões F344 transplantados em receptores WKY alimentados com colíXI) (F344—:>WKY alimentado com col(XI), aloenxertos alimentados col(XI)). Experimentos preliminares demonstraram que alimentação de diluente não teve efeito sobre o desenvolvimento de patologia de aloenxerto, contagens de células diferenciais de lavagem broncoalveolar (BAL), ou respostas de DTIT comparados com aloenxertos transplantados em ratos WKY não alimentados.

Fluido de BAL foi coletado de receptores de transplante de pulmão anestesiados com cetamina uma e duas semanas após transplante. Em resumo, BAL de pulmões nativos e transplantados foram realizadas por canulação seletiva de brônquios principais direito e esquerdo com um cateter de calibre 16 seguro por sutura. Durante um período de tempo no qual os brônquio contralateral foi preso por presilha de 3 mL de PBS estéril (37°C) foram instiladas para dentro de cada brônquio principal e aspiradas. Sobrenadantes de BAL livres de célula obtidos dos espécimes centrifugados foram armazenados a -70°C até serem usados. Contagens de células diferenciais de fluido de BAL foram realizadas utilizando microscopia de luz para contar 300 células por campo de energia alta sobre preparações de citospina para determinar a quantidade de macrófagos, linfócitos, e células polimorfonucleares ( PMN) na amostra.

Com o objetivo de detectar a presença de patologia nos pulmões, os pulmões transplantados de cada grupo foram colhidos, fixados por uma instilação intratraqueal de glutaraldeído 4%, seccionados, corados com hematoxilina e eosina, examinados sob microscopia de luz, e graduados de acordo com os critérios histológicos estabelecidos pelo Lung Rejection Study Group (Yousem et al., 1996) em um modo cego sem conhecimento prévio do grupo de transplante.

.Análise estatística de contagens de linfócitos e de PMN em fluido de BAL foram realizadas inicialmente por ANOVA para determinar se diferenças estavam presentes dentre os grupos. Se diferenças foram verificadas então uma análise post hoc utilizando um teste de StudentNewman-Keuls foi realizada para determinar qual grupo foi diferente. Valores de p <0,05 foram determinados como significativos. Visto que dados para DTH em ratos WKY inexperientes e de aloenxerto de controle com antígenos diferentes foram encontrados não-nonnal mente distribuídos, uma ANOVA bivariada de soma de pontos com interação foi utilizada para determinar diferenças dentre os giupos. Valores de p <0,05 foram determinados como significativos. Diferenças em respostas de DTH aos alo-antígenos de doador entre aloenxertos de controle e aloenxertos alimentados com col(V) foram determinadas utilizando um teste U de Mann-Whitney. Valores de p <0,05 foram determinados como significativos. Diferenças entre resultados patológicos vasculares e de via aérea foram determinados inicialmente utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido por uma análise post hoc utilizando o teste U de Mann-Whitney. Valores de p <0,03 foram determinados como significativos.

Os inventores têm previamente mostrado que coh V) é um alvo da resposta imune local aos alo-antígenos de pulmão em camundongos. A seguir demonstraram que coh V) é reconhecido como um antígeno durante rejeição de aloenxerto de pulmão. Tem sido relatado que respostas de DTH estão correi acionadas com a extensão de rejeição em vários modelos de transplante de órgão diferente de pulmão em roedores (VanBuskirk et al., 1998; Lowry et al., 1985; Joo et al., 1995 ). Como um teste vivo da resposta imune celular, a resposta DHT sistêmica ao alo-antígeno foi realizada. Foram examinadas as respostas de DTF1 aos esplenócitos F344, colÇVk ^e esplenócitos BN (terceira parte) em ratos WKY duas semanas após recebimento de aloenxertos de pulmão F344 e em ratos WKY inexperientes não-transplantados. FIG. 10 ilustra que ratos WKY que receberam aloenxertos F344 tiveram respostas de DTH significativas aos esplenócitos

F344 [p<0,0001 comparados com ratos WKY inexperientes testados quer com esplenócitos F344 quer com col(V)]. Ratos WKY que receberam aloenxertos F344 também tiveram respostas de DTH significativas ao col(V) |p <0,0001 comparados com ratos WKY inexperientes testados quer com esplenócitos F344 quer com col(V)] (FIG. 11). Estatisticamente, não houve diferenças entre as respostas de DTFI de aloenxertos de controle aos esplenócitos F344 e col(V ) (p>0,05). Dados mostrando que ratos WKY que receberam aloenxertos de pulmão F344 não tiveram resposta de DTH aos aloantígenos de terceira parte (esplenócitos BN, RTlⁿ) demonstram que a resposta imune aos aloenxertos F344 também é alo-específica. Em adição estes dados são consistentes com col(V) sendo reconhecido como um antígeno durante a rejeição de aloenxerto de pulmão.

Relatórios anteriores têm mostrado que a administração oral de antígenos que são alvos de resposta imune durante rejeição de aloenxertos, diferente de pulmão, induz tolerância ao órgão doador (Ishido et al., 1999). Para detenninar se administração oral de col(V) a receptores de aloenxerto de pulmão antes de transplante induz tolerância imunológica ao pulmão de doador, receptores WKY foram alimentados com col(V) antes do transplante como descrito acima. Experimentos preliminares demonstraram que oito alimentações de 10 pg de col(V) dia sim, dia não (dose total de 80 pg) seguidas por transplante ortotópico de pulmão esquerdo sete dias após a última alimentação tiveram o efeito mais alto sobre contagens de células de BAL e patologia de rejeição neste modelo. Portanto, este regime de alimentação foi utilizado para todos os estudos subseqüentes. Receptores alimentados com col(V) sofreram transplante de pulmão esquerdo e foram colhidos na completitude do período experimental como descrito acima.

FIG. 12 ilustra as contagens de células diferenciais em fluido de BAL dos pulmões transplantados de receptores de isoenxerto WKY de controle, receptores de aloenxerto WKY de controle, e receptores de aloenxerto WKY alimentado com col(V) duas semanas após transplante, e ratos WKY normais. Não houve diferenças em contagens de células diferenciais de BAL em pulmões normais em comparação com pulmões de isoenxerto. Similar a (Yagyu et al, 1990), PMN's e linfócitos foram 5 sig.nificativamente aumentados em BAL de aloenxerto de controle comparado com pulmões de isoenxerto ou normais (p<0,039 para PMN's e p<0,00001 para linfócitos). Em contraste, alimentação de col(V) antes do transplante resultou em uma redução significativa em linfócitos e PMN’s de BAL comparados com aloenxertos de controle (p<0,023 para PMN's e p<0,0001 10 para linfócitos). Rejeição aguda de aloenxerto está nonnalmente associada com um aumento de contasens de células totais em fluido de BAL de aloenxerto (ITirt et al., 1999). Contudo, duas semanas após o transplante, os pulmões de aloenxerto WKY de controle estão normalmente sofrendo de rejeição severa e devido à destruição do aloenxerto, BAL suficiente não pôde 15 ser realizada confiadamente para determinar as contagens de células totais de

BAL. Em contraste, receptores de aloenxerto alimentados com col(V) mostraram rejeição menos severa que permite BAL mais fácil resultando em contagens de células mais altas. Por estes motivos, comparação de contagens de células totais entre os grupos não puderam ser feitas. Coletivamente, estes 20 dados demonstram que imunização oral com col(V) está associada com menos PMN's e linfócitos em fluido de BAL de aloenxerto durante rejeição aguda.

Para determinar se alimentação com col(V) diminuiu as respostas de DTH aos alo-antígenos, receptores de aloenxerto WKY de 25 controle e receptores de aloenxerto WKY alimentados com col(V) foram desafiados na aurícula direita com esplenócitos alogeneicos (F344) e PBS na aurícula esquerda. A resposta de DTH foi medida 24 mais tarde e o Inchamento Específico de Orelha foi determinado. Como mostrado em FIG. 10, receptores de aloenxerto WKY de controle não tratados sofrendo rejeição aguda tiveram uma resposta de DTII forte após desafio com antígeno de doador. Em contraste, receptores de aloenxerto WKY alimentados com col(V) que tiveram rejeição de aloenxerto menos severa também tiveram uma redução significativa da resposta de DTH aos antígenos de doador.

A resposta imune enfraquecida ao alo-antígeno induzida por col(V) pôde ter sido devido à hiporresponsividade imune global (Faria e Weiner 1999), e não tolerância. Portanto, para determinai· se ratos WKY alimentados com col(V) poderíam responder aos outros antígenos, estes ratos receberam lipopolissacarídeo (LPS) (Sigma, St. Louis, MO.) quer intratraquealmente (200 pg/kg a 1 mg/kg) quer intravenosamente (1-5 mg/kg), que são doses conhecidas em induzirem reações inflamatórias severas no pulmão e sistemicamente 24 a 48 h após injeção ou instilação (Delclaux et al. 1999). Ratos foram desafiados uma semana após sua última alimentação de col(V). A doença induzida é análoga à pneumonia e sepse causadas por bactérias gram-negativas. Similar aos ratos WKY normais, instilação de LPS em pulmões ou injetados I.V. em ratos WKY alimentados com col(V) induziu doença severa (pêlo desordenado e prostração) e inflamação em pulmões de receptor. Estes dados mostram que alimentação com col(V) antes de transplante preveniu rejeição de aloenxerto por indução de tolerância, e não hiporresponsividade imune global, aos antígenos de doador.

Coletivamente, estes dados ilustram que col(V), mas não col(Il) ou col(XI), infra-regula a rejeição de aloenxerto de pulmão por indução de tolerância oral e não por hiporresponsividade imune global. Ademais, tolerância oral induzida por col(V) infra-regula respostas de DTH aos alo-antígenos de doador.

Contagens diminuídas de PMN e linfócito em fluido de BAL de aloenxerto estão associadas com lesões histológicas e radiográficas menos severas durante rejeição aguda de aloenxerto de pulmão. Para determinar a taxa de progressão de infiltrados de pulmão, receptores de transplante foram monitorados por radiografias de tórax seriais nos dias 1, 6, e 13 após transplante e graduados como descrito acima. Isoenxertos de controle não possuíram quaisquer infiltrados pulmonares em todos os instantes de tempo monitorados (FIG. 12A). Nos aloenxertos de controle os raios-X seriais revelaram desenvolvimento gradual de infiltrados no pulmão esquerdo 6 após transplante que resultou em infiltrados severos e completa opacifícação do aloenxerto pelo final da segunda semana (FIG. 12B ). Contudo em aloenxertos alimentados com col(V) o desenvolvimento meio de extração infiltrados foi muito menor comparado com controles. Os raios-X foram normais no dia 6 e infiltrados apenas suaves estiveram presentes duas semanas após o transplante (FIG. 12C).

Referindo-se agora à FIG. 13 os painéis superiores mostram a anatomia macroscópica de pulmões WKY de isoenxerto e nativo, e os pulmões de isoenxerto e nativo de ratos de aloenxerto de controle de aloenxerto alimentados com col(V) colhidos duas semanas após o transplante. FIG. 13A mostra que o pulmão de isoenxerto (esquerdo-L) e o pulmão nativo (direito-R) de receptor rato WKY são de aparência normal. Em contraste, o pulmão de aloenxerto esquerdo no grupo de aloenxerto de controle foi de cor marrom escura, encolhido, e de uma consistência firme comparado com o pulmão nativo (FIG. 13B). Como um resultado de inflamação e rejeição, fusão da pleura parietal e visceral foi normalmente observada em pulmões de aloenxerto de controle, O pulmão esquerdo transplantado em receptores de aloenxerto alimentados com colÇV) (FIG. 13C) teve a aparência do pulmão de isoenxerto ou nativo (de controle) (FIG. 13A) e sem adesões pleurais.

Menos PMN's e linfócitos em fluido de BAL de aloenxerto, infiltrados menos severos nos aloenxertos nos raios-X de tórax, e anatomia macroscópica preservada sugeriram que alimentação com col(V) antes do transplante infra-regulou o desenvolvimento de patologia de rejeição. Os painéis inferiores de FIG. 14 mostram histologia representativa de isoenxertos de controle, aloenxertos de controle, e aloenxertos alimentados com colíV) duas semanas após o transplante. Similar ao relatório anterior (Prop et al., 1985), todos os pulmões de isoenxerto de controle tiveram histologia normal sem sinais de rejeição (FIG. 14D). aloenxertos de controle revelaram infiltrados extensivos de células mononucleares perivasculares, peribronquiais, e alveolares consistentes com rejeição aguda severa (FIG. 14E). Em contraste, infiltração perivascular e peribronquial apenas suave a moderada foi detectada em pulmões de aloenxerto alimentados com col(V) (FIG. 14F).

Tabela 3 em FIG. 15 mostra a graduação de patologia de rejeição duas semanas após transplante usando critérios padrão. Rejeição vascular aguda foi graduada em A0-A4 de acordo com a presença e extensão de infiltrados de células mononucleares perivasculares, e rejeição aguda de via aérea graduada B0-B4 de acordo com a extensão e a intensidade da inflamação da via aérea (Yousem et al. 1996). Todos os pulmões de controle de isoenxerto revelaram estrutura normal do pulmão (A0±0, BOiO). Os aloenxertos WKY de controle tiveram rejeição severa vascular e de via aérea (A3,8+0,2, B4±.O, respectivamente). Em contraste, aloenxertos WKY alimentados com col(V) mostraram rejeição suave a moderada vascular e de via aérea (A2,8+0,2, B2,6±0,2, respectivamente), aloenxertos alimentados como col( II) e col(XI) tiveram patologia de rejeição similar à dos aloenxertos não tratados (FIG. 15). Estes dados mostram que aloenxertos WKY alimentados com col(V) tiveram patologia de rejeição menos severa do que todos os outros aloenxertos (p<0,028 para resultados de A e p<0,009 para resultados de B).

Estes dados mostram que alimentação com col(V ) infra-regula a rejeição de aloenxerto de pulmão indicando que receptores de aloenxerto de pulmão tomados oralmente tolerantes devem possuir uma resposta de DTIT diminuída após re-desafio com alo-antígenos de doador. Para determinar se alimentação com col(V) diminuiu respostas imunes aos alo-antígenos, os receptores de aloenxerto de controle e receptores de aloenxerto alimentados com col(V) foram desafiados na aurícula direita com esplenócitos F344 alogeneicos totais e com PBS na aurícula esquerda. A resposta de DTH foi medida 24 h mais tarde e o Inchamento Específico de Orelha foi determinado. Como mostrado em FIG. 14, receptores de aloenxerto de controle não tratados sofrendo rejeição aguda severa tiveram uma resposta de DTH forte após desafio com antígeno de doador (mesmos dados para aloenxertos de controle mostrados em FIG. 10). Em contraste, os receptores de aloenxerto alimentados com col(V) tiveram uma resposta de DTH significativamente reduzida ao antígeno de doador ('p<0,02 comparados com aloenxerto de doador). Estes dados indicam que alimentação com col(V) antes do transplante preveniu rejeição de aloenxerto pela indução de tolerância aos antígenos de doador.

Duas semanas após o transplante, o tempo de início de rejeição severa (grau 4), pulmões de aloenxerto sofreram BAL para determinação de contagens de células diferenciais, e coleta de soro. Pulmões nativos e de transplante foram colhidos em bloco, fixados, seccionados, corados, e graduados para patologia de rejeição usando critéiios padrão (Yousem et al.

1996). Todas as interpretações e graduação de patologia de rejeição foram realizadas por Oscar W. Cummings, M.D., patologista pulmonar, que estava cego para os gmpos de tratamento, como previamente relatado (Wilkes et al.

1998). FIG. 14 mostra a anatomia macroscópica de pulmões WKY de isoenxerto e de pulmões de aloenxerto e nativos dos aloenxertos WKY de controle, e receptores de aloenxerto WKY alimentado com col(V) colhidos duas semanas após transplante. Em animais de aloenxerto WKY de controle, FIG. 14B mostra que o pulmão transplantado (esquerdo) foi de cor marrom escura, e encolhido comparado com o pulmão nativo. Em contraste, o pulmão esquerdo transplantado em receptores de aloenxerto WKY alimentados com col(V) (FIG. 14C) teve a aparência do pulmão nativo (normal) ou de isoenxerto (FIG. 14A). A aparência macroscópica dos pulmões de aloenxerto em ratos WKY alimentados com col(II), ou col(XI) foi similar à dos pulmões de aloenxertos não tratados. Como esperado, pulmões de isoenxerto parecerem normais (FIG. 14A).

FIG. 14 também ilustra histologia de isoenxertos de WKY de controle, aloenxertos de WKY de controle, e aloenxertos WKY alimentados com col(V) duas semanas após o transplante. Pulmões de isoenxerto WKY tiveram histologia normal (FIG. 14D). aloenxertos WKY de controle revelaram infiltrados extensivos de células mononucleares perivasculares, peribronquiais, e alveolares consistentes com rejeição aguda severa (FIG. 11E). Em contraste, infiltração apenas suave a moderada perivascular e bronquial foi detectada nos pulmões WKY alimentados com col(V) (FIG. 14F). Pulmões de aloenxerto em ratos WKY alimentados com col(II) ou colfXJ) tiveram patologia similar à de pulmões de aloenxerto não tratados (veja FIG. 15).

Embora, tenha sido mostrado que tolerância oral é benéfica em infra-regulação de alorreatividade em órgãos diferentes de pulmão (Ishido et al., 1999), tolerância oral em transplante de pulmão foi primeiro relatada em Wilkes Pedido de Patente U.S. de No. 10/243.797, depositado aos 13 de setembro de 2002. Utilizando um modelo de transplante de pulmão em rato, dados na presente invenção mostram que administração oral de col(V) a receptores de aloenxerto de pulmão antes do transplante de pulmão inffaregula as respostas de rejeição. Análises imunológica, radiológica, e histológica de receptores alimentados com col(V) comparados com receptores de aloenxerto de controle mostram que alimentação de coli V) está associada com contagens diminuídas de PMN e de linfócito em fluido de BAL de aloenxerto, infiltrados menos severos nos aloenxertos em raios-X de tórax, preservação de anatomia macroscópica do aloenxerto, e redução de patologia de rejeição. Finalmente, receptores de aloenxerto tomados oralmente tolerantes têm respostas de DTH diminuídas aos alo-antígenos de doador.

Previamente tem sido mostrado que col(V) é um alvo de resposta imune local aos alo-antígenos em camundongos. Colágeno de Tipo (V) é um colágeno de Tipo menor presente no pulmão, localizado nos tecidos conjuntivos peribronquiais, interstício alveolar, e membrana basal capilar. Tem sido mostrado que estes tecidos são sítios de lesões patológicas em resposta aos alo-antígenos nos modelos murinos de inventor (Wilkes et al.,

1999) e são sítios de atividade de rejeição em receptores de aloenxerto de pulmão de humano (Trulock, 1997).

Administração oral de antígenos é um método efetivo de indução de tolerância à célula-T periférica. Este fenômeno muitas vezes referido à tolerância oral, tem sido bem estudado em vários modelos de doenças autoimunes em animais incluindo encefalomielite, uveíte, diabetes, miaslenia grave, e artrite. Contudo, os mecanismos para induzir tolerância não são completamente entendidos. Todos os mecanismos conhecidos para indução de tolerância, incluindo anergia clonal, deleção clonal, e regulação por supressão ativa mediada por IL-4, IL-10, ou TGF-β podem ter um papel em tolerância oral ( Faria e Weiner, 1999). Geralmente, é relatado que doses maiores de antígeno induzem anergia ou deleção clonal (Chen et al., 1995; Whitacre et al., 1991), enquanto que doses baixas induzem regulação de citocina e supressão de ativação (Faria e Weiner, 1999; Chen et al., 1994). No modelo de transplante cardíaca em animal, tem sido mostrado que a administração oral de esplenócitos alogeneicos é efetiva em indução de tolerância pelo desvio da ativação de Thl e estimulação seletiva de indução de citoninas inibitórias derivadas de Th-2 tal como IL-4 (Ishido et al., 1999).

Ratos WKY (RT1¹) e F344 (RTlV) machos, MFIC (RT1)incompatíveis (250-300 g), livres de patógeno, naturais, foram utilizados para cirurgia de transplante. Todos os ratos foram adquiridos de Flarlan Sprague

Dawley (Indianapolis, Ind.). O transplante ortotópico de aloenxertos de pulmão esquerdo foi realizada como previamente relatado (Sekine et al.

1997), e utilizou um procedimento descrito por Marck e colegas (1983). Ratos não receberam qualquer imunossupressão. Patologia de rejeição foi graduada em vários instantes de tempo após o transplante. C> modelo de transplante F344->WKY está associado com o desenvolvimento de rejeição aguda suave (grau 1) no final da primeira semana, rejeição moderada a severa (grau 2-3) no final da 2^a semana, e rejeição severa de grau 4 no final da 3^a semana após o transplante (Matsumura et al. 1995). Em adição, o modelo F344—»WKY é o único modelo em animal de transplante de pulmão que desenvolve bronquiolite obliterante (BO) reprodutivamente (Flirt et al. 1999). Portanto, este modelo oferece a oportunidade única para estudar a patogênese se rejeição aguda e crônica.

Regimes de alimentação diferentes foram testados para observar quaisquer diferenças na indução de tolerância oral. Dados mostram que as alimentações múltiplas de dose baixa de col(V) (10 pg) foram mais supressivas de episódios de rejeição comparadas como doses maiores ( 50 pg). Assim, no modelo de tolerância oral aqui usado, regulação por citocinas Th2 (IL-4, IL-10) ou supressão ativada mediada por TGF-β também parece desempenhar um papel importante em indução de tolerância.

A indução de tolerância de transplante tem se tomado um objetivo maior da pesquisa de transplante, e no passar dos anos técnicas diferentes têm sido utilizadas para induzir tolerância de transplante. Tem sido mostrado que transfusão de sangue específica de doador (Zheng et al., 1999), transplante de medula óssea (Fluang et al., 2000), rejeição tímica de células alogeneicas (Garrovillo et al., 1999), ou imunização sistêmica com peptídeos derivados de MFIC de doador (Sayegh e Krensky, 1996) induzem tolerância de transplante em vários modelos animais. Contudo, estas técnicas teriam utilidade limitada no receptor de aloenxerto de pulmão potencial devido ao fato de que as células de doador utilizadas para indução de tolerância não estariam disponíveis em tempo suficiente para induzir tolerância antes do transplante. Em modelos autoimunes experimentais de tolerância oral de dose baixa, células regulatórias após implantação de tolerância oral são ativadas em um modo específico de antígeno mas suprimem em um modo nãoespecífíco de antígeno. Portanto, pode não ser necessário, oralmente administrar uma proteína capaz de induzir células regulatórias que secretam citocinas supressoras (Faria e Weiner, 1999). O modelo de tolerância oral em transplante de pulmão aqui usado mostra que col(V) oralmente administrado, que não é específico de doador, é capaz de suprimir alorreatividade e induzir tolerância de transplante. Os inventores preveem que o tratamento oral de receptores de transplante com col(V) antes do transplante proporcionará terapia para prevenção de rejeição em transplante de pulmão e para tratamento de doenças conhecidas ou consideradas em serem causadas por uma reação autoimune ao colágeno de Tipo V e ou seus componentes antigênicos. Para discussão adicional dos resultados, relatados em exemplos 4 a 10 incluindo figuras e referências lá citadas o leitor é direcionado para Pedido de Patente U.S. 10/243.792 depositado aos 13 de setembro de 2002, de Wilkes, que agora é Publicação de Patente U.S. de No. 2003/007S20S Al, que é aqui incorporada como referência em sua totalidade.

Exemplo 5

Elucidação de colágenos e peptídeos MHC-“semelhantes” adicionais úteis para a prevenção de rejeição de aloenxerto e para tomarem animais tolerantes aos colágenos e moléculas semelhantes a colágeno. Ratos machos, MHC ( RT1 j-incompatíveis, livres de patógeno, foram utilizados para o estudo: ratos Wistar Kyoto (WKY, RT1¹), Fischer 344 (F344, RTl^lv1) e Brown Norway (BN, RTlⁿ) (250-300 g no momento do transplante). Todos os ratos foram adquiridos de Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, Ind.) e alojados no Laboratory /Animal Resource Center at Indiana University School of Medicine (Indianapolis, Ind.) de acordo com as diretrizes institucionais.

Colágeno Tipo II [col(II)] para uso no experimento foi isolado de cartilagem canina como previamente relatado (Maves et al. 2000), ou adquirido de Collaborative Biomedical Products, Bedford, Mass. Ambas as preparações foram solubilizadas em ácido acético 0,005 M e dialisadas para dar uma concentração final de 0,5 mg/mL.

Colágeno bovino de Tipo XI |col(XI)] de cartilagem fetal bovina (Morris e Bachinger 1987) foi adquirido de Biogenesis, Sandown, N.H. e diluído em ácido acético 0,005 M (0,5 mg/mL) e armazenado a 4°C até ser usado.

Colágeno de Tipo V de humano [col(V)J, extraído de placenta de humano e purificado pro precipitação diferencia] por NaCl (Mares et al.

2000), foi presente de Dr. .Terome Seyer (VA Hospital, Hampton, Va.). Em resumo, tecidos de placenta foram cominuídos, lavados, e suspensos em ácido acético 0,5 M contendo NaCl 0,5 M, e digeridos por pepsina a 4°C. Sobrenadantes foram aspirados dos espécimes centrifugados, a pelota foi coletada e o procedimento de extração foi repetido. Os sobrenadantes foram combinados de dois digeridos, e col(V) foi purificado dos sobrenadantes por precipitação diferencial por NaCl do ácido acético 0,5 M (Maves et al. 2000). O col(V) intacto foi diluído em ácido acético 0,005 M (0,5 mg/mL) até o uso. A quantidade de colágenos foi avaliada por determinação do conteúdo de hidróxi-prolina nas amostras como previamente relatado (Mares et al. 2000).

Colágeno como preparado conforme descrito acima foi administrado oral mente a ratos WKY. Os ratos foram alimentados com 10 pg de col(II), col(V), ou col(XI) dissolvidos em 0,5 mL de solução salina por uma gavagem gástrica utilizando uma agulha de alimentação de animal de aço inoxidável de ponta de bola de calibre 16 (Braintree Scientific, Braintree, Mass.). /Animais de controle foram alimentados com diluente sozinho. Animais foram alimentados dia sim, dia não por oito alimentações. Sete dias após a última alimentação, estes ratos foram utilizados como receptores de aloenxertos de pulmão ( descrito abaixo).

O transplante ortotópico de isoenxertos de pulmão esquerdo (WKY—>WKY), ou de aloenxertos (F344—>WKY) foi realizada como previamente descrito (Sekine et al. 1997), utilizando um procedimento previamente descrito, e (Prop et al. 1985). Em resumo, após os ratos doadores (F344 ou WKY) terem sido anestesiados com uma injeção i.m. de cetamina (40 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg), o pêlo do tórax foi raspado, incisão de esternotomia foi feita, e o coração e os pulmões foram removidos em bloco. O pulmão esquerdo foi ressecado e solução de Ringer lactada heparinizada foi adicionada por infusão na artéria pulmonar. O pulmão do doador foi envolvido em gaze estéril com solução salina e deixado sobre selo (4^C'C) em um bécher estéril até transplante.

Ratos receptores foram anestesiados com uma injeção s.c. de atropina (0,05 mg/kg), seguida por uma inalação de halotano 2%. A via aérea foi canulada com um cateter de Teflon de calibre 14 e o rato foi mecanicamente ventilado usando um ventilador de roedor (Analytical Specialties Co., St. Louis, Mo.) utilizando oxigênio 100%, e a inalação de isoflurano 1,5-2% para manutenção de anestesia. Uma vez feita a incisão de toracotomia no 4° espaço intercostal esquerdo, e hemostatos posicionados no brónquio e vasos pulmonares esquerdos, o pulmão esquerdo foi ressecado. Os vasos pulmonares do pulmão do doador foram ligados por anastomose no receptor por um manguito de plástico e suturas de seda 7-0 (Kono, Chiba, Japão). Os brónquios de doador e de receptor foram suturados utilizando suturas Prolene 8-0 s (Ethicon, Sommerville, N.J.). Imediatamente após a completitude da anastomose do brónquio, o hemostato foi removido e ventilação foi restaurada. Após o fechamento da incisão de toracotomia esquerda sobre um tubo de tórax de calibre 16 e utilizando sutura de seda 3-0 (Ethicon), manutenção de anestesia foi descontinuada e o animal foi permitido se recuperai·. Uma vez continuada a respiração espontânea, a cânula foi removida da via aérea, e o tubo de tórax foi removido. O tempo isquêmico do pulmão de doador foi de aproximadamente 1 h e o tempo de operação total para colheita e transplante do pulmão de doador foi de aproximadamente 2 h. Todos os procedimentos de transplante foram realizados por K. Y. sob um microscópico de cirurgia e (Micro Tech, Colorado Springs, CO.) sob condições estéreis. O modelo de transplante F344-»WKY está associado com o desenvolvimento de rejeição aguda suave no final da primeira semana e rejeição agida moderada a severa no final da segunda semana (Matsumura et al. 1995). Sobrevivência ultrapassou 90% em todos os grupos de transplante. Terapia de imunossupressão não foi dada em nenhum tempo durante o período experimental.

Pulmões transplantados foram monitorados por radiografias de tórax seriais nos dias 1, 6, e 13 após transplante. As mudanças radiográficas foram graduadas como segue: grau 1, normal; grau 2, infiltrados suaves; grau 3, infiltrados moderados; e grau 4, infiltrados severos ou opacificação completa.

Cinco grupos de transplante foram estudados: pulmões de ratos WKY transplantados em receptores WKY [isoenxertos de controle]; pulmões F344 transplantados em receptores WKY alimentados com diluente [aloenxertos de controle]; pulmões F344 transplantados em receptores WKY alimentados com col(V)- [aloenxertos alimentados com col(V)]; pulmões F344 transplantados em receptores WKY alimentados com col(II) [aloenxertos alimentados com col(II)]; e pulmões F344 transplantados em receptores WKY alimentados com col(XI)- [aloenxertos alimentados com col(XI)].

Fluido de lavagem broncoalveolar (BAL) foi coletado dos receptores de transplante de pulmão anestesiados com cetamina duas semanas após o transplante como previamente relatado (Sekine et al. 1997). Em resumo, BAL de pulmões nativo e transplantado foram realizadas por canulação seletiva de brônquios principais direito e esquerdo com cateter de calibre 16 seguro por sutura. A amostra foi coletada enquanto se prendia com grampo o brônquio contraiateral, alíquotas de 3 mL de PBS estéiil (37°C) foram instiladas em cada brônquio principal e aspiradas. Sobrenadantes de BAL livres de células obtidos dos espécimes centrifugados foram armazenados a -70^c'C até serem usados. Contagens de células diferenciais de fluido de BAL foram realizadas utilizando microscopia de luz para contar 300 células por campo de energia alta sobre preparações de citospina para detenninar a quantidade de macrófagos, linfócitos, e células polimorfonucleares (PMN).

Respostas de hipersensibilidacle de tipo retardado (DTH) foram determinadas por uma modificação de um procedimento descrito por (Yamagami et al. 1999). Em resumo, duas semanas após transplante de pulmão, ratos WKY alimentados com col(V) e de controle receberam 10⁷ esplenócitos de terceira parte (BN) ou esplenócitos F344 derivados de doador irradiados (3.000 rad) em 30 pL de PBS na aurícula direita por injeção por s.c. usando uma agulha de calibre 26. A aurícula esquerda recebeu um volume igual de diluente, e serviu como o sítio de controle. Ratos WKY inexperientes foram controles negativos. Um grupo separado de ratos WKY inexperientes ou receptores de aloenxerto foi testado com 15pg de col(Il), col(V), ou col(Xl) em volume de 30 pL injetado na aurícula direita e diluente na esquerda. A espessura da orelha foi medida com um micrometro (Mitutoyo, Field TooJ Supply, Chicago, 111.) em um modo cego imediatamente antes e 24 h após injeção. Resposta de DTH específica de antígeno foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: Inchamento Específico de Orelha = (espessura de orelha direita @ 24 h - espessura de orelha direita @ 0 h) (espessura de orelha esquerda @ 24 h - espessura de orelha esquerda @ 0 h) x 10’ mm (Yamagami et al., 1999). Todos os dados relatados como a média de medições triplicadas.

Em experimentos separados, ratos WKY inexperientes ou alimentados com col(V) foram inicialmente vacinados com 100 pg de albumina de soro bovino (BSA) baixa em endotoxina (Sigma, St. Louis) dissolvidos em 100 pL de uma emulsão de adjuvante (Titermax, CytRx Corp., Norcross, Ga.). Cada rato foi inicialmente vacinado s.c. com a emulsão na base da cauda. Sete dias mais tarde os ratos foram desafiados com solução de BAS agregada por calor a 2% na aurícula direita e diluente na esquerda (Henningsen et al. 1984). Ratos não v vacinados foram controles para estes estudos. A espessura de orelha foi medida imediatamente antes e 24 h após injeção e o Inchamento Específico de Orelha foi calculado como descrito acima.

Neutralização de TGF-β no sítio DTFI foi realizada por uma modificação de um procedimento descrito (Bickerstaff et al. 2000). Em resumo, duas semanas após o transplante de pulmão, cratos WKY alimentados com col(V) receberam 10⁷ esplenócitos F344 derivados de doador irradiados (3.000 rad) misturados com 5pg de Ab policlonal de galinha anti-TGF-β de rato, ou 5pg de Ab policlonal de cabra anti-IL-4 ou IL10 de rato (all R&D Systems, Minneapolis, Minn.) em 30 pL de PBS na aurícula direita por injeção s.c. usando uma agulha de calibre 26. A aurícula esquerda recebeu um volume igual de diluente, e seiviu como o sítio de controle. Para controles negativos, um grupo separado de aloenxertos alimentados com col(V) recebeu 10 esplenócitos F344 derivados de doador irradiados (3.000 rad) misturados com 5 pg de imunoglobulinas de galinha de controle ou imunoglobulinas de cabra de controle (R&D Systems, Minneapolis, Minn.) na aurícula direita e diluente na esquerda. O Inchamento Específico de Orelha foi deteiminado como descrito acima. Imunoglobulinas de controle não tiveram efeito sobre a resposta de DTH.

Como um modelo de lesão aguda de pulmão instilação alveolar ou intravenosa de lipopolissacarídeo (LPS) (Sigma, St. Louis, MO) foi realizada por uma modificação de um procedimento descrito por (O’Leary et al. 1997). Resumidamente, ratos WKY normais ou WKY alimentados com col(V), uma semana após a última alimentação, foram anestesiados com uma injeção s.c. de atropina (0,05 mg/kg), seguida por uma inalação de halotano 2%. A via aérea foi canulada com um cateter de Teflon de calibre 14eo rato foi mecanicamente ventilado com um ventilador de roedor (Analytic-al Specialties Co., St. Louis, Mo.) utilizando oxigênio 100%, e a inalação de isoflurano 1,5-2° o para manutenção de anestesia. Após desaparecimento de respiração espontânea, LPS (1 mg/kg a 1 mg/mL) foi instilado na via aérea e esta foi mecanicamente ventilada por 10 minutos. Manutenção de anestesia foi descontinuada e o animal foi permitido retornar à consciência. Uma vez continuada a respiração espontânea, a cânula foi removida da via aérea. Em experimentos separados, ratos foram injetados intravenosamente nas veias da cauda com LPS (4 mg/kg a 1 mg/mL). 24 h após o desafio, BAL foi realizada e os pulmões foram colhidos para avaliação de patologia.

Níveis de TGF-β em soro dos grupos experimentais foram quantificados por ELISA utilizando o sistema de imunoensaio TGF-|31 (Promega, Madison, Wis.) de acordo com o protocolo do fabricante. Níveis de IL-4 e IL-10 em soro foram quantificados por ELISA utilizando kits de imunoensaio Cytoscreen (BioSouree Intemationai, Camarillo, Calif.) de acordo com o protocolo do fabricante. As sensibilidades dos ensaios de TGFβ, IL-4, e IL-10 foram 32, 2, e 5 pg/mL, respectivamente.

Patologia foi avaliada pelo exame de pulmões nativos e transplantados de cada grupo. Amostras de pulmão foram colhidas, fixadas, seccionadas, coradas, e graduadas para patologia de rejeição usando critérios padrão (Yousem et al. 1996) por um patologista (O. W. C. ) em um modo cego sem conhecimento prévio do grupo de transplante como previamente relatado (Sekine et al. 1997).

.Análise estatística de contagens de linfócitos e de PMN em fluido de BAL foram realizadas inicialmente por ANOVA para determinar se diferenças estavam presentes entre os grupos. Se diferenças foram verificadas então uma análise post hoc utilizando um teste de Student-Newman-Keuls foi realizada para determinar qual grupo foi diferente. Valores de p <0,05 foram detenninados como significativos, Âfisto que dados para DTH em ratos WKY inexperientes e de aloenxerto de controle com antígenos diferentes foram encontrados não-normalmente distribuídos, uma ANOVA bivariada de soma de pontos com interação foi utilizada para determinar diferenças entre os grupos. Valores de p <0,05 foram determinados como significativos. Diferenças em respostas de DTH aos alo-antígenos de doador entre aloenxertos de controle e aloenxertos alimentados com col(V) foram determinadas utilizando um teste 1J de Mann-Whitney. Valores de p <0,05 foram determinados como significativos. Diferenças entre resultados patológicos vasculares e de via aérea foram detenninados inicialmente utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido por uma análise post hoc utilizando o teste L) de Mann-Whitney. X^alores de p <0,03 foram determinados como significativos. O teste t de Student para comparações múltiplas foi utilizado para a análise de citocinas. Valores de p < 0,05 foram determinados como significativos.

Respostas de DTH aos antígenos de doador, um teste in vivo de imunidade celular, tem sido relatadas como correlacionadas com a extensão de rejeição em vários modelos de transplante de órgão diferente de pulmão em roedor (VanBuskirk et al. 1998; Lowry et al. 1985). O presente inventor tem relatado que col(V) é um alvo da resposta imune local aos aloantígenos de pulmão em camundongos (Mares et al. 2000). Portanto, foi determinado que a respostas de DTH sistêmicas ao alo-antígeno em ratos inexperientes e receptores de aloenxerto de pulmão para determinar se col(V) é reconhecido como um antígeno durante rejeição de aloenxerto de pulmão.

Também foi determinado se receptores de aloenxerto de pulmão desenvolvem uma resposta de DTTI ao col(V). Respostas de DTH aos esplenócitos F344 (doador) e ao col(V) foram examinadas em ratos WKY duas semanas após recepção de aloenxertos de pulmão F344, o tempo no qual rejeição aguda severa começa a se desenvolver (Matsumura et al. 1995), e em ratos WKY inexperientes, não-transplantados. Para determinar a especificidade de resposta de DTFI aos alo-antígenos e ao col(V), foram determinadas respostas de DTFI ao col(II), col(XI), e antígenos de terceira parte, esplenócitos BN. Col(Il), um componente maior da cartilagem articulai , não está presente no pulmão, e não é homólogo ao col(V) (Smith et al. 19S5). Em contraste col(XI) possui homologia ao col(V) (Morris e Bachinger 1987), mas similar ao col(II), é verificado em cartilagem articular e não está presente no pulmão. Por estes motivos, col(II) e col(XI) serviram como controles para col(V).

Utilização de Inchamento Específico de Orelha como uma medição de respostas de DTH, FIG. 10 mostra que receptores de aloenxerto de controle desenvolveram respostas de DTFI significativas aos esplenócitos F344 e col(V) duas semanas após o transplante [fp<0,0001 comparados com ratos WKY inexperientes desafiados com esplenócitos F344 ou col(V), e fp<0,0001 comparados com ratos WKY inexperientes desafiados com col(V) ou esplenócitos F344] (FIG. 10). Em contraste, aloenxertos de controle não tiveram respostas de DTH aos antígenos de terceira parte (BN), col(H), ou col(XI) (FIG. 8). Ratos WKY inexperientes não tiveram respostas de DTH ao col(IÍ), ou col(XI). Estes dados confirmam outros estudos mostrando que respostas de DTFI são indicativas de ativação imune durante rejeição de aloenxerto, que é específica ao doador, mas não aos alo-antígenos de terceira parte (VanBuskirk et al. 1998). Em adição, conforma que os resultados de presente inventor em camundongos (Mares et al. 2000) que col(V), mas não col(II) ou col(XI), é um alvo da resposta imune aos alo-antígenos de pulmão.

Relatórios anteriores têm mostrado que administração oral de antígenos que são alvos da resposta imune durante rejeição de aloenxertos, diferentes de pulmão, induz tolerância ao órgão do doador (Ishido et al.

1999). Para determinar se administração orai de colágenos aos receptores de aloenxerto de pulmão antes do transplante induz tolerância imunológica ao pulmão de doador, receptores WKY foram alimentados com col(II), col(V), ou col(XI) antes do transplante como descrito acima, seguido por uma avaliação de raios-X de tórax seriais, contagens de células diferenciais de

BAL de aloenxerto, graduação patológica, e respostas de DTH aos antígenos de doador.

FIG. 12 mostra as contagens de células diferenciais em fluido de BAL dos grupos experimentais duas semanas após o transplante, o tempo de início de rejeição aguda severa (Matsumura et al. 1995), e em ratos WKY normais. Não houve diferenças em contagens de células diferenciais de BAL em pulmões nonnais comparados com pulmões de isoenxerto. Similar aos relatórios anteriores (Prop et al. 19S5; Yagyu et al. 1990), PMN's e linfócitos foram significativamente aumentados em BAL de aloenxerto de controle comparado com pulmões nonnais ou de isoenxerto (*p<0,00001 para linfócitos e fp<0,03S para PMNs comparados com pulmões normais ou de isoenxerto) (FIG. 12). Em contraste, alimentação de col(V) antes do transplante resultou em uma redução significativa em PMNs e linfócitos de BAL comparados com aloenxertos de controle (tp <0,0001 para linfócitos e p<0,023 para PMNs comparados com aloenxertos de controle) (FIG. 12).

Rejeição de aloenxerto aguda está normalmente associada com um aumento de contagens de células totais em fluido de BAL de aloenxerto (Matsumura et al. 1995). Contudo, duas semanas após o transplante, os pulmões de aloenxerto WKY de controle estão normalmente sofrendo rejeição severa e devido à destruição do aloenxerto, BAL suficiente não podería ser realizada confíadamente para determinar as contagens de células totais de BAL. Em contraste, receptores de aloenxerto alimentados com (57 col(V) mostram rejeição menos severa que permite BAL mais fácil resultando em contagens de células mais altas. Por estes motivos, comparação de contagens de células totais entre os grupos não pôde ser feita. Coletivamente, estes dados demonstram que imunização oral com col(V) está associada com menos PMN's e linfócitos em fluido de BAL de aloenxerto durante rejeição aguda.

Em rejeição aguda de aloenxerto de pulmão contagens diminuídas de PMN e linfócitos em fluido de BAL de aloenxerto estão normalmente associadas com lesões histolósicas e radioaráficas menos severas. Para determinar a velocidade de progressão de infiltrados de pulmão, receptores de transplante foram monitorados por radiografias de tórax seriais nos dias 1, (5, e 13 após transplante e graduados como descrito acima. Como mostrado em FIG. 13, isoenxertos de controle não possuíram quaisquer infiltrados pulmonares em todos os instantes de tempo monitorados (grau 1) (FIG. 13A). Nos aloenxertos de controle raios-X seriais revelaram desenvolvimento gradual de infiltrados suaves (grau 2) no pulmão esquerdo (5 dias após transplante (dados não mostrados), que resultou em infiltrados severos e opacificação completa (grau 4) no final da segunda semana (FIG. 13B). Contudo em aloenxertos alimentados com col(V), o desenvolvimento de infiltrados foi muito menor comparado com controles. Os raios-X foram normais (grau 1) no dia 6 e apenas infiltrados suaves (grau 2) estiveram presentes duas semanas após o transplante (FIG. 13C).

Os painéis superiores de FIG. 14 mostram a anatomia macroscópica dos pulmões WKY de isoenxerto e nativos, e os pulmões de isoenxerto e nativos dos ratos de aloenxerto de controle e de aloenxerto alimentado com col(V) colhidos duas semanas após o transplante. O isoenxerto (esquerdo-L) e o pulmão nativo (direito-R) foram normais em aparência (FIG. 14A). O pulmão transplantado em receptores de aloenxerto de controle foi de cor marrom escura e encolhido comparado com o pulmão nativo (FIG. 14B). Em contraste, o pulmão esquerdo transplantado em receptores de aloenxerto alimentados com col(V) (FIG. 14C) teve a aparência do pulmão nativo ( normal) ou de isoenxerto (FIG. 14A).

Menos PMN's e linfócitos em fluido de BAL de aloenxerto, infiltrados menos severos em aloenxertos nos raios-X de tórax, e anatomia macroscópica preservada sugeriram que alimentação de col(V) antes do transplante infra-regulou o desenvolvimento de patologia de rejeição. Os painéis inferiores de FIG. 14 mostram a histologia representativa de isoenxertos de controle, e aloenxertos alimentados com col(V) duas semanas após o transplante. Todos os pulmões de isoenxerto de controle tiveram histologia normal sem sinais de rejeição (FIG. 14D). aloenxertos de controle revelaram infiltrados extensivos de células mononucleares perivasculares, peribronquiais, e alveolares consistentes com rejeição aguda severa (FIG. 14E). Em contraste, infiltração apenas suave a moderada perivascular e peribronquial foi detectada em pulmões de aloenxerto alimentados com col(V) (FIG. 14F).

Os dados em FIG. 15 ilustram a graduação da patologia de rejeição duas semanas após o transplante. Rejeição aguda foi A0-A4 de acordo com a presença e a extensão de infiltrados de células mononucleares intensidade da inflamação da via aérea (Yousem et al. 1996). Todos os pulmões de isoenxerto de controle revelaram histologia normal do pulmão ( A OiO, B OiO). Üs aloenxertos de controle tiveram rejeição vascular e de via aérea severa ( A 3,S±0,2, B 4±0, respectivamente). Em contraste, aloenxertos alimentados com colíV) mostraram rejeição suave a moderada vascular e de via aérea (A 2,8±0,2, B 2,6±0,2, respectivamente) (^;:p<0,028 para resultados A e tp<0,009 para resultados B comparados com aloenxertos de controle) (FIG. 15, Tabela 3). Experimentos mostraram que alimentação com col(II) ou col(Xl) não teve efeito sobre desenvolvimento de patologia de aloenxerto comparados com aloenxertos de controle (FIG 15, Tabela 3). Estes dados mostram que alimentação com col(V) inffa-regulou patologia de rejeição aguda.

Dados mostrando que alimentação de col(V) infra-regula rejeição de aloenxerto de pulmão sugeriram que receptores de aloenxerto de pulmão tornados oralmente tolerantes devem ter respostas de DTFI diminuídas aos alo-antígenos de doador. Para determinar se alimentação de col(V) diminuiu respostas imunes aos alo-antígenos, receptores de aloenxerto de controle e receptores de aloenxerto alimentados com col(V) foram desafiados na aurícula direita com esplenócitos alogeneicos F344 e PBS na aurícula esquerda e respostas de DTH foram determinadas. Como mostrado em FIG. 16 e previamente mostrado em FIG. 10, receptores de aloenxerto de controle não tratados tiveram uma resposta de DTI-I mais forte após desafio com antígeno de doador. Em contraste, comparados com receptores de aloenxerto de controle, as resposta de DTH ao antígeno de doador foi reduzida signifícativamente em receptores de aloenxerto alimentados com col(V) (*p<0,02) (FIG. 16).

A resposta imune enfraquecida ao alo-antígeno induzida por col(V) pôde ter sido devido à hiporresponsividade imune global (Faria e Weiner 1999), e não à tolerância imune. Portanto, para detenninar se ratos WKY alimentados com col(V) respondem aos outros antígenos, estes ratos receberam LPS quer intratraquealmente (1 mg/kg) quer intravenosamente (4 mg/kg) que são doses que conhecidamente induzem reações inflamatórias severas no pulmão e sistemicamente 24 horas após desafio (O’Leary et al. 1997). A doença induzida é análoga à pneumonia e sepse causadas por bactérias gram-negativas. Similar aos ratos WKY normais, instilação de LPS em pulmões e injetado i.v. em ratos WKY alimentados com col(V ) induziu doença severa (pêlo desordenado e prostração ) e influxo massivo de PMN’s e linfócitos para dentro do pulmão como observado em contagens de células diferenciais de BAL e patologia (dados não mostrados).

Com o objetivo de adicionalmente investigar se a resposta imune enfraquecida induzida pela alimentação de col(V) foi especifica para antígeno, determinamos se alimentação de col(V) afetou as respostas de DTH a um antígeno nominal não relacionado, BSA, um antígeno dependente de linfócito-T em ratos (ITenningsen et al. 1984). Ratos WKY inexperientes e alimentados com col(V) foram vacinados por injeção s.c. de 100 pg de BSA em adjuvante e sete dias depois foram desafiados com Solução de BSA agregada por calor a 2% na aurícula direita e diluente na esquerda. Respostas de DTH foram determinadas 24 h após injeção. Ratos WKY não vacinados serviram como controles para estes estudos. Como mostrado em FIG. 24, injeção de BSA na aurícula de ratos não vacinados não induziu inchamento de orelha significativo. Em contraste, injeção de BSA em ratos WKY vacinados não alimentados induziu inchamento de orelha significativo (*p<0,01S comparado com ratos WKY inexperientes não vacinados) (FIG. 19). Contudo alimentação de col(V) não afetou as respostas de DTH à BSA tp>0,05 comparado com ratos WKY vacinados) (FIG. 24). Coletivamente, estes dados mostram que supressão induzida por cc»l(V) de rejeição de aloenxerto de pulmão é mediada por tolerância imune, e não por hiporresponsividade imune global.

Produção sistêmica de TGF-β, IL-4, e IL-10 é citada freqüentemente como citocinas responsáveis pela supressão de respostas imunes em tolerância oral (Faria e Weiner 1999). Portanto, a seguir foi determinado se tolerância oral induzida por col(V) está associada com produção supra-regulada de TGF-β, IL-4, e IL-10 durante rejeição de aloenxerto de pulmão. LTtilizando ELlSA's comerciais, TGF-β, IL-4, e IL-10 foram quantificados em soro de grupos experimentais. FIG. 17 mostra os níveis de TGF-β em soro em ratos WKY normais, aloenxertos de controle, e aloenxertos alimentados com col(V) duas semanas após o transplante. Como esperado, níveis baixos de TGF-β estavam presentes no soro de ratos WKY normais (Ying e Sanders 1998). Houve um aumento ligeiro de TGF-β em aloenxertos de controle. Em contraste, níveis de TGF-β foram marcantemente supra-regulados em soro de aloenxertos alimentados com col( V) (*p<0,05 comparado com receptores de aloenxerto de controle) (FIG. 17). Nem IL-4 nem IL-10 foram detectáveis em soro de mesmos ratos (dados não mostrados).

Embora 1L-4 e IL-10 não fossem detectadas no soro, isto não impede sua atividade sistemicamente em infra-regulação de respostas imunes celulares aos alo-antígenos de doador. Para determinar se TGF-β, IL-4, ou IL10 teve um papel na supressão de respostas imunes aos alo-antígenos, utilizamos anticorpos neutralizadores para estas citocinas no ensaio DTFI para os antígenos de doador. Utilizando uma modificação de um procedimento relatado por (Bickerstaff et al. 2000), duas semanas após o transplante de pulmão, ratos WKY alimentados com col(V) receberam 10 esplenócitos F344 derivados de doador irradiados (3.000 rad) misturados com 5pg de Ab policlonal anti-TGF-β ou 5pg de Ab policlonal anti IL-4 ou IL-10 em PBS na aurícula direita. A aurícula esquerda recebeu um volume igual de diluente mais esplenócitos, e serviu como um sítio de controle. Para controles negativos, um grupo separado de aloenxertos alimentados com col(V) recebeu imunoglobulinas de controle com esplenócitos na aurícula direita e um volume igual de diluente mais esplenócitos na aurícula esquerda. Como mostrado em FIG. IS e previamente mostrado em FIG. 10 e FIG. 16, receptores de aloenxerto de controle não tratados tiveram uma resposta de DTFI forte após desafio com antígeno de doador que foi reduzida significativamente em receptores de aloenxerto alimentados com col(V). Contudo, aloenxertos alimentados com col(V) significativamente recuperaram respostas de DTH quando anticorpos anti-TGF-β foram misturados com esplenócitos de doador e injetados na aurícula das orelhas [*p<0,03 comparado com aloenxertos alimentados com col(V) desafiados com antígenos misturados com imunoglobulina de controle] (FIG. 18). Em contraste, misturação de esplenócitos de doador com anticorpos de neutralização para IL-4 ou IL-10 foi menos efetiva em restauração de respostas de DTH aos antígenos de doador [^:j:p>0,05 comparado com aloenxertos alimentados com col(V) desafiados com antígenos misturados com imunoglobulina de controle] (FIG. 18). A restauração das respostas de DTH em aloenxertos alimentados com col(V) com anticorpos anti-TGF-β, anti-IL-4, e anti-IL-10 em relação aos aloenxertos de controle foi 75,7%, 24,3%, e 39,9%, respectivamente (FIG. 18).

Exemplo 6

O efeito de col(V) em tolerância oral sobre desenvolvimento de rejeição aguda de aloenxerto de pulmão é dependente de dose. Ratos machos F344 (RTl^lvl) e WKY (RT1¹) (200-250g) são adquiridos de Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, Ind.). Todos os aloenxertos (F344) ou isoenxertos (WKY) de pulmão esquerdo são transplantados ortotopicamente em receptores WKY como previamente descrito (Sekine et al. 1997 ).

Referindo-se agora à FIG. 25, Tabela 4, que inclui um sumário dos dados coletados neste exemplo, colágeno de Tipo V foi isolado quer de placenta de humano de nascimentos normais, quer de espécimes de tecido de pulmão normais obtidos no momento de ressecação de câncer de pulmão. Gerald N. Smith Jr., Ph.D., com perícia extensiva em bioquímica de colágeno, proporcionaram colágeno de Tipo V purificado para estes estudos.

Ratos WKY são imunizados com colágeno antes da cirurgia de transplante usando gavagem gástrica como relatado em dados preliminares e manuscrito apresentado. Todos os ratos são alimentados dia sim, dia não quer por 4 quer por 8 dias como descrito na Tabela. Similares aos dados preliminares, após um período de recuperação de uma semana após a alimentação, o pulmão esquerdo de ratos F344 (aloenxertos) ou ratos WKY (isoenxertos) é transplantado ortotopicamente em receptores WKY. Os ratos neste experimento não receberam drogas imunossupressoras. \^z'inte ralos são incluídos em cada grupo de alimentação para cada tipo de colágeno.

Referindo-se agora à FIG. 25, Tabela 4 inclui uma explicação dos grupos experimentais em Exemplo aqui relatado.

Vinte e quatro horas antes do final de um período de duas semanas após transplante, que é o tempo para rejeição severa se desenvolver (Matsumura et al. 1995 ), 10 ratos receptores são testados para respostas de DTH aos antígenos de doador, seguido por colheita de órgãos torácicos. BAL é realizada no pulmão nativo e de aloenxerto por canulação seletiva dos brônquios principais direito e esquerdo, respectivamente, e instilação de um total de 5 mL. de PBS a 37°C (Sekine et al. 1997). BAL livre de células é obtida de espécimes de centrifugação e sobrenadantes são armazenados a S0'^:'C. Sangue é coletado via veia cava e punção cardíaca, espécimes são centrifugados para separar soro, e armazenados a -S0^c'C.

Estudos de respostas de hipersensibilidade de tipo retardado (DTI-I) são realizados por injeção de do esplenócitos de doador (F344) irradiados para dentro da orelha direita de ratos WKY 24 h antes da completitude do período pós-operatório de duas semanas como relatado em dados preliminares e manuscrito (Yasufuku et al. Submitted). Dados são relatados como “inchamento específico de orelha”. Estudos preliminares têm confirmado outros relatórios mostrando que a resposta de DTH máxima ocorre 24 h após a injeção na orelha (Yamagami et al. 1999), e, portanto, todas as medições de DTLI serão realizadas 24 h após injeção na orelha. Estudos preliminares confirmaram que teste de DTH não tem efeito sobre respostas humorais ou celulares sistêmicas. Por comparação das respostas de DTH aos antígenos de doador em receptores de controle de aloenxerto e isoenxerto comparados com ratos WKY alimentados com colágeno, pode ser determinado se doses diferentes de col(V) têm efeitos diferentes sobre resposta de DTIT aos antígenos de doador.

Após eutanásia, os órgãos torácicos são removidos em bloco e estudados histologicamente. Resumidamente as amostras dos órgãos torácicos foram fixadas por instilação intratraqueal de glutaraldeído 4%, embebidas em parafina, seccionadas a 5-7 pm, e coradas com hematoxilina e eosina (H&E) para estudos histológicos por microscopia de luz. As lesões histológicas são graduadas por critérios histológicos padrão para rejeição de aloenxerto de pulmão de humano (Yousem et al. 1996) em uma maneira cega (Wilkes et al. 1995 ). Rejeição aguda é caracterizada por intensidade variada de infiltrados de células mononucleares peri vasculares e peribronquiolares (Yousem et al. 1996). Visto que diferenças em infiltrados celulares entre grupos podem ser mais sutis do que considerado nos critérios aceitos de rejeição agpda, infiltrados também serão quantificados por contagem de células mononucleares perivasculares e peribronquiolares presentes em seções de tecido corado com H&E digitalizado (células/pm²) utilizando Sigma Scan software (Jandel Scientifíc, Chicago, 111.). Os procedimentos de digitalização estão cúirentemente em uso em nossos laboratórios.

Linfócitos-Τ citotóxicos possuem papéis chave na patogênese de rejeição de aloenxerto de pulmão (Trulock 1997 ), e tem sido mostrado que citotoxicidade celular enfraquecida é um mecanismo chave pelo qual tolerância oral previne atividade de doença (Faria e Weiner 1999; Mayer 2000; Garside e Mowat 1997). Para determinar se atividade de rejeição diminuída em receptores de aloenxerto de pulmão tomados tolerantes com col(V) está associada com citotoxicidade celular anti-doador enfraquecida, células de linfonodo periféricas são isoladas de ratos F344 (doador) normais, carregados com ^:,1Cr (New England Nuclear, Boston, Mass.), e aplicadas em placas de fundo plano de 96 cavidades (células alvo, 5 x 107cavidade) em meios completos. Células efetoras (linfócitos-T esplênicos de ratos WKYreceptores em cada grupo) são incubadas em razões variadas com alvos (razões E/T de 1:1, 5:1, 10:1. e 100:1) a 37°C por 4 horas. Células-T esplênicas puras (>95% puras) são isoladas utilizando glóbulos magnéticos anti-CD3 (Dynal Corp, Lake Success, N.Y.), e confirmadas por citometria de fluxo. Citotoxicidade é determinada por liberação específica de ⁵¹Cr induzida por células efetoras em cada razão E/T comparado com liberação de células alvo carregadas, sozinhas.

Outros investigadores têm confirmado que rejeição de aloenxerto de pulmão em ratos e humanos está associada com apoptose em células presentes em tecidos alveolar, vascular, e bronquiolar, e que apoptose é detectada não freqüentemente durante aceitação de aloenxerto (Blankenberg, et al. 2000). Também tem sido previamente mostrado que a resposta imune total aos alo-antígenos inclui indução de apoptose em endotélio vascular e epitélio bronquiolar em camundongos. Em adição, imunização com col(V), que induz anergia aos antígenos de doador, previne apoptose induzida por alo-antígeno neste modelo.

Com o objetivo de determinar a capacidade de tolerância oral induzida por col(V) para prevenir apoptose em aloenxertos de pulmão, kits de ensaio TdT-mediated dUTP Nick End Labeling (TÚNEL) (In Situ Cell Death

Detection Kit, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.j são utilizados para detectar apoptose em seções de tecido de aloenxerto de pulmão duas semanas após transplante. A quantidade de células apoptóticas em tecidos perivascular e peribronquiolar é quantificada em seções contra-coradas com eosina digitalizadas (células/μπΓ) usando programa de computador Sigma Scan (Jandel Scientifíc, Chicago, II1. ).

Para determinar a produção de IL-4, IL-10, TGF-β, CTGF, e óxido nítrico, todos os mediadores potenciais de supressão imune induzida por col( V), bem como o curso de tempo de síntese após transplante, a dose de coh V) que é mais efetiva na prevenção de patologia de rejeição é usadti para alimentar outro grupo de ratos. Em resumo, ratos de controle de aloenxerto e

7<5 receptores de aloenxerto alimentados com col(V) são mortos 2, 4, 6, S, 10, 12, e 14 dias após o transplante, e níveis em soro de IL-4, IL-10, TGF-β são quantificados por ELISA (R&D Systems, Minneapolis, Minn.) conforme o protocolo do fabricante (n=5 cinco ratos em cada instante de tempo). Ensaios de proteções de RNase (Phanningen, San Diego, Calif.) são utilizados para detectar mRNA para estas citocinas em esplenócitos e linfonodos periféricos. Controles são soro, linfonodos e esplenócitos dos ratos WKY nonnais.

Níveis de CTGF em soro de aloenxertos de controle, aloenxertos alimentados com col(V), e ratos nonnais são detenninados por ELISA por Dr. George Martin, Ph.D., Scientific Director of Fibrogen, San Francisco, Calif., o perito líder na estrutura e na função de CTFG. Northern blotting é utilizado para detectar mRNA para CTGF em linfonodos periféricos, e baço utilizando sondas fornecidas por Dr. Martin. Expressão de proteína e de mRNA é ensaiada nos mesmos instantes de tempo descritos para IL-4,1L-10, e TGF-β.

Níveis de óxido nítrico em soro são detectados em vários instantes de tempo descritos acima em aloenxertos de controle e aloenxertos alimentados com col(V) em vários instantes de tempo após transplante descritos acima, bem como em ratos WKY normais. Produção de nitratos e nitrilas metabólicos estáveis em soro é determinada por reação de Greiss utilizando análise espectrofotométrico de soro (Kallio et al. 1997).

Exemplo 7

O efeito de dose de Col(V) para tolerância oral sobre desenvolvimento de rejeição crônica de aloenxerto de pulmão (Bronquioliie obliterante). Ratos machos, MHC (RT^-incompatíveis, livres de patógenos, foram utilizados para o estudo: ratos Fischer 344 (F344, RTlV) Brown Norway (BN, RT1) e Wistar Kyoto ( WKY, RT1¹) (250-300g no momento do transplante). Todos os ratos foram adquiridos de Flarlan Sprague Dawley (Indianapolis, Ind.) e alojados em Laboratory Animal Resource Center at

Indiana University School of Medicine (Indianapolis, Ind.) de acordo com as diretrizes da instituição.

Colágeno de Tipo II [colíll)] foi isolado de cartilagem canina como previamente relatado. Colágeno de Tipo V de humano purificado [col( V)] e colágeno de Tipo XI [col(XI)] foram um presente de Dr. Jerome Seyer (VA Hospital, Hampton, Va.). Colágenos foram diluídos em ácido acético 0,005 M ( 0,5 mg/mL) e armazenados a 4°C até seu uso.

Ratos WKY foram alimentados oralmente cora 10 pg de col(V) dissolvido em 0,5 mL de solução salina por uma gavagem gástrica utilizando uma agulha de alimentação de animal de aço inoxidável de ponta de bola de calibre 16 (Braintree Scientifíc, Braintree, Mass.) como previamente relatado. Animais de controle foram alimentados com diluente sozinho. Animais foram alimentados dia sim, dia não com oito alimentações.Sete dias após a última alimentação, estes ratos foram utilizados como receptores de aloenxertos de pulmão.

O transplante ortotópico de isoenxertos de pulmão esquerdo (WKY—> WKY), ou aloenxertos (F344—>WKY) foi realizada como previamente relatado, utilizando um procedimento inicialmente descrito por (Marek et al. 19S3, e Prop et al. 1985). (3 modelo de transplante F344—>WKY está associado com o desenvolvimento de rejeição aguda severa no fim da segunda semana. Em adição, este modelo é o único modelo em animal de transplante de pulmão que desenvolve bronquiolite obliterante (BO) reprodutivamente. Sobrevivência ultrapassou 90% em todos os grupos de transplante. Terapia imunossupressora não foi dada em nenhum momento durante o período experimental.

Três grupos de transplante foram estudados: pulmões de ratos WKY transplantados em receptores WKY [isoenxertos de controle]; pulmões F344 transplantados em receptores WKY alimentados com diluente [aloenxertos de controle]; e pulmões F344 transplantados em receptores WLY alimentados com col(V) [aloenxertos alimentados com col(V)]. Receptores foram mortos duas a 10 semanas após transplante.

Respostas de hipersensibilidade de tipo retardado DTIT foram determinadas como acima, por uma modificação de um procedimento inicialmente descrito por ÍSayegh et al. 1994, e Yamagami et al. 1999). Em resumo, 10 semanas após transplante de pulmão, ratos WKY de controle e WKY alimentados com col(V) receberam 10 esplenócitos de terceira parte (BN) ou esplenócitos F344 derivados de doador irradiados (3.000 rad) em 30 pL de PBS na aurícula direita por injeção s.c. usando uma agulha de calibre 2(5. A aurícula esquerda recebeu ura volume igual de diluente, e serviu como um sítio de controle. Ratos WKY inexperientes foram controles negativos. Um grupo separado de ratos WKY receptores de aloenxerto ou inexperientes foi restado com 15pg de col(ll), col(V), ou col(Xl) em 30 pL de volume injetado na aurícula direita e diluente na esquerda. A espessura da orelha foi medida com um micrômetro (Mitutoyo, Field Tool Supply, Chicago, 111. ) em um modo cego imediatamente antes e 24 h após injeção. O Inchamento Específico de Orelha = (espessura de orelha direita (ãi 24 h - espessura de orelha direita (g! 0 h) - (espessura de orelha esquerda (g> 24 h - espessura de orelha esquerda (g) 0 h) x 10' mm ( Yamagami et al., 1999). Todos os dados relatados como a média de medições triplicadas.

Neutralização de TGF-β no sítio de DTH foi realizada como previamente relatado por uma modificação de um procedimento descrito por (Bickerstaff et al. 2000). Em resumo, 10 semanas após transplante de pulmão, ratos WKY alimentados com col(V) receberam 10⁷ esplenócitos F344 derivados de doador irradiados (3.000 rad) misturados com 5pg de Ab policlonal de galinha anti-TGF-β de rato (R&D Systems, Minneapolis, Minn.) em 30pl de PBS na aurícula direita. A aurícula esquerda recebeu um volume igual de diluente, e serviu como um sítio de controle. Para controles negativos, um grupo separado de aloenxertos alimentados com col(V) recebeu

107 esplenócitos F344 derivados de doador irradiados (3.000 rad) misturados com 5pg de imunoglobulinas de galinha de controle ou de imunoglobulinas de cabra de controle (R&D Systems, Minneapolis, Minn.) na aurícula direita e diluente na esquerda. O Inchamento Específico de Orelha foi determinado como descrito acima. Imunoglobulinas de controle não tiveram efeito sobre a resposta de DTEI.

Reação de leucócito misto foi realizada por uma modificação de um procedimento previamente descrito. Em resumo, esplenócitos F344 (estimulantes) que foram usados como uma fonte de células apresentando antígeno (APCs), foram tratados com mitomicina C (Sigma, St. Louis, Mo.) e co-cultivadas em razões variadas com linfócitos TI de linfonodo (respondedores) de ratos WKY (3 x 10⁵/cavidade) em 200 pL de meio (RPMJ, L-Glutamina 2 mM, 2-mercapto-etanol 5 x 10‘^J M, 100 U/mL de penicilina, 100 pL/ml de estreptomicina, 10% de soro fetal bovino inativado por calor) em placas de microtítulo de fundo plano de 96 cavidades (Gostar, Cambridge, Mass.). Dezoito horas antes da completitude de uma incubação de 5 dias a 37°C (5% de CO₂), 1 pCi/mL de ³II (Amersham Corp., Arlington Heights,

111.) foi adicionado em cada cavidade. Culturas foram colhidas com um colhedor de células automático (Brandel, Gaithersburg, Md.) e analisadas em um contador de cintilação líquida (Beckman, Arlington Heights, 111.). Proliferação celular foi determinada como a média de contagens por minuto de incorporação de [^JH] timidina em culturas triplicadas e relatada como índice de estimulação. Em experimentos separados o mesmo ensaio foi realizado usando esplenócitos de ratos WKY do grupo experimental como o estimulante e linfócitos T de linfonodo de ratos F344 como respondedores.

Níveis de TGF-β em soro dos grupos experimentais foram quantificados por ELISA utilizando o sistema de imunoensaio TGF-βΙ (Promega, Madison, Wis.) conforme o protocolo do fabricante. Níveis de IL-4 e IL-10 em soro foram quantificados por ELISA utilizando kits de

S0 imunoensaio Cytoscreen (BioSource International, Camarillo, Calif.) de acordo com o protocolo do fabricante. A sensibilidade dos ensaios de TGF-β,

IL-4, e IL-10 foram, respectivamente 32, 2, e 5 pg/mL.

Com o objetivo de avaliar a patologia pulmões nativos e transplantados de cada grupo foram colhidos, fixados, seccionados, corados, e graduados para patologia de rejeição usando critérios padrão por um patologista (O. W. C.) em um modo cego sem conhecimento anterior do grupo de transplante como previamente relatado.

Visto que dados para DTH em ratos WKY de aloenxerto de controle e inexperientes desafiados com antígenos diferentes foi verificado como não normalmente distribuídos, uma ANOVA bivariada de soma de pontos com interação foi utilizada parti determinar diferenças entre grupos. Diferenças em respostas de DTH aos alo-antígenos de doador entre aloenxertos de controle e aloenxertos alimentados com col(V) foram determinadas utilizando um teste U de Mann-Whitney U. O teste t de Student para comparações múltiplas foi utilizado para análise de MLR e citocinas. Valores de p < 0,05 foram detenninados como significativos.

Tem sido demonstrado que rejeição aguda de aloenxerto de pulmão está associada com resposta imune aos antígenos de doador bem como ao col(V). Contudo, estudos recentes têm sugerido que respostas imunes aos antígenos de doador podem diminuir no decorrer do tempo. Para determinar se resposta imune aos antígenos de doador e col(V) estão presentes por longa duração após transplante de pulmão, respostas de DTH aos esplenócitos F344 (doador) esplenócitos e ao col(V) foram examinadas em ratos WKY 10 semanas após transplante de aloenxertos de pulmão F344. FIG. 19 mostra que receptores de aloenxerto de controle possuem respostas de DTH significativas aos antígenos de doador (esplenócitos F344) e ao col(V) comparados com ratos WKY inexperientes (^!i!p<0,05). Significativamente, as respostas de DTH ao antígeno de doador e ao col(V) em 10 semanas foram similares àquela obseivada durante rejeição aguda (duas semanas após transplante). Col(II) ou col(XI) (controles) não induziu respostas de DTH em receptores de aloenxerto de pulmão em cada instante de tempo.

Indução de tolerância oral usando antíaeno derivado de doador tem sido efetiva na supressão de respostas imunes celulares aos antígenos de doador a até duas semanas após o transplante. Em adição, apresentação de antígeno deficiente tem sido relatada em ser outro mecanismo pelo qual tolerância pode modular respostas imunes. A seguir foi determinado se alimentação de col( V) infra-regulou respostas imunes celulares aos antígenos de doador de longa duração, e examinado se o efeito de tolerância oral induzida por col(V) afetou a apresentação de antígeno. Como descrito acima, ratos não alimentados e WKY que foram alimentados com colíV) receberam aloenxertos de pulmão F344. Duas semanas (tempo de rejeição aguda) e dez semanas (tempo de início de BO) após transplante, ratos foram mortos, linfócitos de linfonodo foram isolados e estimulados com antígenos de doador (esplenócitos F344). FIG. 19 mostra que linfócitos de linfonodo de ratos WKY normais ou linfócitos isolados de ratos WKY duas ou dez semanas após transplante de aloenxertos de pulmão F344 tiveram respostas proliferativas comparáveis aos antígenos de doador. Em contraste, comparados como aloenxertos de controle ou normais, tolerância oral induzida por col(V) causou reduções significativas em respostas proliferativas aos antígenos de doador em ambos instantes de tempo (* p<0,05). Em adição, respostas proliferativas aos linfócitos dos receptores de aloenxerto de pulmão alimentados com col(V) foram menores em 10 semanas comparadas com duas semanas (*p<0,05, FIG. 20).

A seguir determinamos se tolerância oral induzida por col(V) afetou a apresentação de antígeno. Em resumo, esplenócitos (fonte de células apresentadoras de antígeno) foram isolados de ratos WKY normais, ou ratos WKY alimentados com col(V) duas e 10 semanas após transplante de aloenxertos de pulmão F344, e examinados para sua capacidade de induzir linfócitos de linfonodo F344 para proliferarem em um MLR. FIG. 19 mostra que esplenócitos isolados de receptores de aloenxerto alimentados com col(V) em duas e dez semanas induziram proliferação comparável com a de esplenócitos isolados de ratos WKY normais.

Tem sido relatado que respostas de DTFI aos antígenos de doador se correlacionam com a atividade de rejeição em vários modelos de transplante de órgão em roedor. Portanto, dados mostrando respostas de DTFI diminuídas aos antígenos de doador em receptores de aloenxerto de pulmão alimentados com col(V) em dez semanas sugeriram patologia de rejeição reduzida nos aloenxertos. FIG. 21 mostra a anatomia macroscópica e a histologia de aloenxertos de pulmão colhidos de ratos WKY que receberam aloenxertos de pulmão F344 (aloenxertos de controle), e ratos WKY alimentados com col(V) que receberam aloenxertos de pulmão F344 10 semanas após transplante, aloenxertos de controle foram marrons escuros, encolhidos, e formes (FIG. 21 A). Em contraste, aloenxertos de ratos WKY alimentados com col( V) tiveram aparência quase normal com apenas ligeira descoloração (FIG. 2JB). Em 10 semanas após transplante, todos os aloenxertos de controle desenvolveram infiltrados de célula mononuclear extensivos, fibrose, e obliteração de vias aéreas pequenas por tecido de granulação que são lesões patológicas de BO ín=5, FIG. 21C). Em contraste, aloenxertos colhidos de ratos alimentados com col(V) apenas tiveram infiltrados alveolares suaves, sem inflamação intersticial que descreve a patologia de rejeição aguda suave ( grau A2, n=5, FIG. 21 D).

Produção sistêmica de IL-4, IL-10, ou TGF-β tem sido relatada comumente como o mecanismo de supressão imune induzida por tolerância oral. Níveis séricos de TGF-β em três grupos experimentais 10 semanas após transplante são mostrados em FIG. 22. Ratos WKY normais possuem níveis baixos de TGF-β em soro, e níveis de TGF-β aumentados, suaves, mas não significativos em ratos WKY que receberam aloenxertos de pulmão F344 (aloenxertos de controle - FIG. 22). Contudo, alimentação com col(V) antes do transplante de pulmão resultou em níveis séricos significativamente aumentados de TGF-β (FIG. 25, *p<0,05). Alimentação com col(V), sozinho, sem transplante de pulmão não aumentou os níveis séricos de TGF-β (dados não mostrados). Tanto IL-4 quanto IL-10 não foram detectadas em soro de qualquer giupo.

Dados mostrando infra-regulação de respostas de linfócito ao alo-antígeno e apresentação intacta de alo-antígenos in vitro, sugerem que tolerância oral induzida por col(V) também deve estar associada com respostas de DTFI suprimidas aos antígenos de doador in vivo. Como esperado, FIG. 23 mostra que receptores de aloenxerto de controle possuem respostas de DTH fortes aos antígenos de doador. Contudo, alimentação de col(V) antes do transplante resulta em respostas de DTH significativamente diminuídas aos antígenos de doador (FIG. 26, *p<0,05). Para determinar se níveis séricos aumentados de TGF-β estavam contribuindo para tolerância oral induzida por col(V), a resposta de DTH aos antígenos de doador foi repetida usando anticorpos neutra!izadores para TGF-β como relatado previamente. FIG. 23 mostra que neutralização de TGF-β resultou em uma recuperação significativa de respostas de DTH aos antígenos de doador (*p<0,05, e 75% de resposta de DTFI obseivada em aloenxertos de controle). Exemplo 8

Referindo-se agora à FIG. 26, Tabela 5 lista os grupos experimentais usados em Exemplo 8, a determinação de se peptídeos presentes em digeridos de brometo de cianogênio de cadeias-α de Col(V) previnem o desenvolvimento de rejeição aguda. Resumidamente, estes grupos experimentais são como segue: aloenxerto de Controle, alimentado com col(V) intacto, alimentado com 1(V), alimentado com 2(V). Colágeno de Tipo V é isolado de pulmões de humano obtidos em autópsia. Após tecidos de pulmão serem moídos, lavados, e suspensos em ácido acético 0,5 M contendo

NaCl 0,2 M, e digeridos por pepsina, os sobrenadantes são aspirados dos espécimes centrifugados, e a pelota é coletada e o procedimento de extração é repetido. Os sobrenadantes dos dois digeridos são combinados, e armazenados a -70 C. Colágeno de Tipo V é purificado dos sobrenadantes por precipitação diferencial por NaCl de ácido acético 0,5 M (Piez et al. 1963). O ciclo de solubilização em ácido acético e precipitação por NaCl é repetido até que uma preparação de Tipo V com uma razão de cadeia-α de al (V)/a2(V) de aproximadamente 2 seja obtida conforme determinada por eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS (Woodbuiy et al. 1989). Separação de al(V) de a2(V) é realizada por cromatografia em DEAE-celulose (Chiang et al. 1980). As cadeias al(V) e a2(V) são aluídas da coluna, e quantificadas por determinação do conteúdo de hidróxi-prolina no efluente.

As cadeias α de colágeno Tipo V são adicionalmente ffacionadas por digestão com brometo de cianogênio, que cliva o colágeno em resíduos de metionina (Miller et al. 1971). Na completitude da digestão, as amostras são diluídas 50 vezes e liofilizadas para remover o brometo de cianogênio.

A extensão da digestão é selecionada em geles de poliacrilamida. Peptídeos individuais são isolados por uma combinação de cromatografia de troca iônica e de peneira molecular.

λ/inte ratos WKY receberam col(V) intacto, ou peptídeos reunidos de al(V), ou α2( V) por gavagem gástrica. A dosagem e o regime de alimentação para peptídeos ou col( V) intacto neste Exemplo são iguais aos determinados para col(V) intacto em Exemplo 5. Duas semanas após o transplante, os ratos em cada grupo são mortos e o pulmão é colhido. Exemplo 9

Os dados aqui apresentados sugerem que os métodos da presente invenção serão efetivos para prevenir ou diminuir episódios de rejeição aguda ou crônica em receptores de transplante humanos, terapia similar, se não idêntica, também deve ser um tratamento efetivo para Doença pulmonar Idiopática ou qualquer outro tipo de doença ou distúrbio pulmonar r que envolve uma resposta imune ao colágeno encontrado em pulmões. E contemplado que quando um indivíduo humano é posto em uma lista para recebei· um transplante, o indivíduo começará a receber doses efetivas de uma molécula que suprime as respostas aloimunes, tais como compostos de colágeno como aqui descritos. Pacientes sofrendo tratamento receberão os compostos por administração oral, preferivelmente quer por alimentação oral quer por instilação intra para dentro do receptor.

A dosagem será determinada por numerosos fatores que serão conhecidos pelo técnico experiente. O indivíduo receberá pelo menos três doses dos compostos por mês a partir da hora na qual o indivíduo é posto na lista de transplante até a hora do transplante. Em alguns tempos cases, as dosagens serão administradas de dois em dois dias por quatro dias com o objetivo de receber pelo menos três doses do composto por mês. Em outros casos, o indivíduo receberá compostos pelo menos uma vez por semana desde a hora na qual o indivíduo é posto na lista de transplante até a hora do transplante. Dependendo do indivíduo, os compostos podem ser administrados pelo menos duas vezes por semana desde a hora na qual o indivíduo é posto na lista de transplante até a hora do transplante.

Exemplo 10 f

E adicionalmente contemplado que o tratamento de um indivíduo humano que tem recebido um transplante ou que está sofrendo de uma doença ou distúrbio pulmonar que envolve autoimunidade ao colágeno por exemplo colágeno de Tipo V com uma molécula que suprime respostas aloimunes, preferivelmente um composto de colágeno, prevenirá ou diminuirá o início de patologia aguda ou crônica no indivíduo. Como acima, administração dos compostos pode ser administrada por vários meios, incluindo, quer por administração oral quer por instilação intrapulmonar ou intravenosa para dentro do receptor ( paciente).

Só

De novo, as quantidades de dosagem serão determinadas pelo técnico experiente baseado no número de fatores conhecidos pelo técnico. Na maioria dos casos um dado paciente provavelmente receberá pelo menos três doses dos compostos por mês por pelo menos dois meses ou até os sintomas da doença ou do distúrbio melhorarem. Estas dosagens podem tomar a forma de uma dose a cada dois dias por quatro dias, como acima, de ti*ês doses por mês. No mês seguinte, o indivíduo de transplante receberá outra rodada de uma dose a cada dois dias por quatro dias. Este procedimento pode ser repetido conforme a necessidade como determinado pelo técnico experiente. Altemativamente, o indivíduo pode receber uma dose a cada dois dias por oito dias, por um total de cinco doses por mês, durante os meses, após o transplante. Em outros aspectos, o indivíduo pode receber as dosagens em incrementos semanais ou duas vezes pro semana, etc., como determinado pelo técnico experiente.

Embora a invenção tenha sido ilustrada e descrita em detalhe nas figuras e na descrição precedente, a mesma é para sei· considerada como ilustrativa e não restritiva em caráter, sendo entendido que apenas as modalidades preferidas têm sido mostradas e descritas e que todas as mudanças e modificações que caem dentro do espírito da invenção são desejadas para serem protegidas. Também, embora a invenção tenha sido ilustrada usando exemplos específicos, argumentos teóricos, considerações, e ilustrações, estas ilustrações e a discussão acompanhante de nenhuma maneira devem ser interpretadas como limitantes da invenção. Todas as patentes, pedidos de patente, e referências aos textos, tratados científicos, publicações, e semelhantes referidos neste pedido são aqui incorporados como referências em suas totalidades.

REFERÊNCIAS

As seguintes referências, na medida em que proporcionam procedimento experimental ou outros detalhes suplementares àqueles aqui descritos, são especificamente aqui incorporadas como referências.

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Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Uso de colágeno de Tipo V ou um componente antigênico do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de um medicamento para tratar Fibrose Pulmonar Idiopática em um paciente possuindo autoimunidade a colágeno de tipo V presente em um pulmão.
2. 2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para instilação intrapulmonar.
3. 3. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para alimentação oral.
4. 4. Método para identificar um paciente em espera de transplante de pulmão para um risco aumentado de rejeição de tecido de órgão transplantado, caracterizado pelo fato de compreender:

   contatar pelo menos uma porção de uma amostra de um paciente em espera de transplante de pulmão com colágeno de Tipo V ou um componente antigênico do mesmo; e medir a resposta imune específica a colágeno de Tipo V;

   em que a presença de resposta imune específica a colágeno de Tipo V indica um risco elevado de rejeição a pulmão transplantado.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a citada amostra é selecionada do grupo consistindo de: sangue, soros, fluido pulmonar intersticial, escarro, muco e tecido.

   Petição 870180128803, de 11/09/2018, pág. 8/9

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   Inchamento líquido [10-4 polegadas, 25,4 x 10-4 milímetros] o CM CO 'Tf'

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   Anos após transplante

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   DTH negativo para col(V) (n=8)

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   DTH positivo para col(V) (n=16) p=0.03

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   1 2 3 4 5

   Anos após transplante