BRPI0706575A2 - métodos para avaliar e para tratar doença pulmonar, e para indentificar pacientes sob risco aumentado de rejeição de tecido de órgão transplantado, e de desenvolvimento de sìndrome de broquiolite obliterante, uso de pelo menos um composto que suprime a resposta autoimune e, kit para avaliar doença pulmonar, e, composto que suprime a resposta autoimune - Google Patents

Abstract

METODOS PARA AVALIAR DOENçA PULMONAR, E PARA IDENTifICAR PACIENTES SOB RISCO AUMENTADO DE REJEIçãO DE TECIDO DE óRGáO TRANSPLANTADO E DE DESENVOLVIMENTO DE SINDROME DE BRONQUIOLITE OBLITERANTE, USO DE PELO MENOS UM COMPOSTO QUE SUPRIME A RESPOSTA AUTOIMUNE, KIT PARA AVALIAR DOENçA PULMONAR, E, COMPOSTO QUE SUPRIME A RESPOSTA AUTOIMUNE. Várias modalidades incluem métodos para diagnosticar e tratarcondições médicas que envolvem uma resposta autoimune ao tecido conjuntivo, tal como colágeno encontrado em órgãos, tal como pulmão. Em um método, distúrbios e doença pulmonar, tal como Fibrose Pulmonar Idiopática (IPF), são diagnosticados pela análise de amostras de fluido ou de tecido obtidas de um paciente para evidência de uma resposta autoimune a vários tipos de colágeno incluindo, por exemplo, Tipo V. Um tipo de ensaio para evidência de uma resposta autoimune ao colágeno de Tipo V compreende as etapas de obter uma amostra de fluido ou de tecido de um paciente, contatar pelo menos uma porção da amostra com um antígeno para o anticorpo anti-colágeno de Tipo V e monitorar a mistura de amostra e antígeno para mudanças indicativas da presença de anti-colágeno e Tipo V na amostra. Outra modalidade inclui tratar doenças pulmonares tal como IPF pela administração de uma dose terapeuticamente efetiva de epítopos de vários colágenos incluindo colágeno de Tipo V.

Description

"MÉTODOS PARA AVALIAR E PARA TRATAR DOENÇA PULMONAR, EPARA IDENTIFICAR PACIENTES SOB RISCO AUMENTADO DEREJEIÇÃO DE TECIDO DE ÓRGÃO TRANSPLANTADO, E DEDESENVOLVIMENTO DE SÍNDROME DE BRONQUIOLITEOBLITERANTE, E, KIT PARA AVALIAR DOENÇA PULMONAR"

REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE

Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patenteprovisório U.S. de No. 60/759.195, depositado aos 13 de janeiro de 2006, queé aqui incorporado, como referência, em sua totalidade.

DECLARAÇÃO DE FINANCIAMENTO GOVERNAMENTAL

O Governo dos Estados Unidos da América tem certos direitosna presente invenção conforme o número de concessão federal HL60797 doNational Institute of Health (NIH).

CAMPO DA INVENÇÃO

Várias modalidades referem-se em geral aos testes e aostratamentos para doença pulmonar, alguns aspectos incluem identificação deevidência de uma resposta autoimune ao tecido conjuntivo de pulmão talcomo colágeno de Tipo V, ainda outros aspectos incluem modulação de umaresposta imune de paciente ao colágeno por dosagem de um paciente comuma quantidade terapeuticamente efetiva de colágeno e moléculassemelhantes a colágeno para tolerar o paciente, por exemplo, ao colágeno deTipo V.

FUNDAMENTOS

Patologias que envolvem uma resposta autoimune são bemconhecidas. Condições que envolvem dano feito ao tecido por um dadopróprio sistema imune do paciente animal ou humano incluem, por exemplo,diabetes de tipo 1 (juvenil), artrite reumatóide, esclerose múltipla, e algumascondições inflamatórias incluindo, por exemplo, psoríase. Tipicamente umaporção do próprio sistema imune do animal realiza um ataque a um antígenodo próprio tecido do animal. Como exemplificado pelas doenças imunesacima mencionadas os resultados podem ser catastróficos, variando de acriação de uma condição crônica embora manejável como diabetes, àcompleta incapacidade e morte prematura como muitas vezes ocorrem comesclerose múltipla.

Em adição às várias doenças especificamente ligadas a umaresposta autoimune, outras doenças também podem envolver uma respostaimune errante. Conseqüentemente, há profundo interesse no exame daetiologia de várias doenças para determinar qual, se houver, papel a própriaresposta imune do paciente pode desempenhar na progressão da doença.

Outra patologia que inclui um ataque sobre tecidoindispensável por um próprio sistema imune de paciente é rejeição dealoenxerto após transplante de tecido ou de órgão. Transplante de váriosórgãos incluindo coração, rim, fígado e pulmão muitas vezes resulta no ataquedo sistema imune do paciente transplantado contra o tecido transplantado.

Para minimizar a rejeição de aloenxerto grande cuidado é tomado para secombinar os doadores de órgãos aos pacientes receptores. Ainda,combinações perfeitas fora daquelas entre gêmeos idênticos são virtualmenteimpossíveis de serem feitas. Com o objetivo de manejar a resposta aloimunesubseqüente, os pacientes receptores de transplantes são em sua maioriatratados com compostos imunossupressores durante suas vidas com opropósito de controlar a resposta autoimune que poderia de outro mododestruir o tecido e/ou o órgão transplantado.

Rejeição de aloenxerto é especialmente problemática emtransplantes pulmonares entre indivíduos que são menos do que combinaçõesperfeitas de um em relação ao outro. É amplamente crido no campo detransplantações pulmonares que rejeição ocorre mais freqüentemente comtransplantes de pulmão do que com transplante da maioria dos outros órgãossólidos. De fato, a causa líder de morte em pacientes receptores de aloenxertopulmonar é rejeição crônica, conhecida como bronquiolite obliterante (BO)(Trulock, 1997; Westra et al., 1990). A patogênese de rejeição crônica éinsatisfatoriamente compreendida; contido, é crido que o risco dedesenvolvimento de rejeição crônica está correlacionado com episódios derejeição aguda repetidos.

Bronquiolite obliterante (BO) é uma forma de rejeição crônicaque é o impedimento maior para a aceitação do pulmão e sobrevivência delonga duração do paciente receptor de aloenxerto, afetando pelo menos 60%de sobreviventes de transplante pulmonar de 5 anos. A histopatologia de BOsugere que inflamação e resposta de lesão e inflamação leva a uma rotacomum final, o desenvolvimento de lesões associadas com obliteração de viaaérea pequena. E crido que antígenos HLA de doador ubíquo são alvo eestímulo da resposta de rejeição aguda. Contudo, a despeito dos agentesterapêuticos mais novos que têm reduzido a incidência de rejeição aguda, aincidência de BO é imutável, sugerindo que as respostas de hospedeiroresistente à droga aos antígenos específicos de tecido podem estar envolvidasno processo de rejeição crônica.

Rejeição de órgão, em muitos casos, é cogitado em seriniciado pelo reconhecimento de moléculas de complexo dehistocompatibilidade maior (MHC) alogeneico (doador) por linfócitos T dohospedeiro, acarretando imunidade humoral e celular supra-regulada. Váriostratamentos incluem administração de agentes imunossupressores para reduzira severidade da resposta imune ao órgão transplantado. Infelizmente, emmuitos casos estas terapias falham em prevenir os episódios de rejeiçãocontinuada, e portanto, o objetivo final de indução de aceitação indefinida doaloenxerto, conhecida como tolerância imunológica, permanece elusivo.

Moléculas MHC alogeneicas são o estímulo e o alvo daresposta imune durante rejeição. Portanto, peptídeos sintéticos ou peptídeosderivados de MHC que podem ser homólogos aos antígenos MHC têm sido ofoco de investigações tentando induzir tolerância imunológica aos aloenxertos(Krensky e Clayberger, 1997; Oluwole et al., 1993). Em adição, um estudomuito recente relata a indução de tolerância às múltiplas moléculas MHCalogeneicas in vitro por um peptídeo sintético não-polimórfico derivado demoléculas MHC (Murphy et al., 1999). Contudo, nenhuns destes relatóriosparecem ter resolvido os problemas de rejeição de aloenxerto, e, emparticular, rejeição de aloenxerto de pulmão.

Visto que reconhecimento de regiões polimórficas demoléculas MHC de doador é normalmente o estímulo para respostasaloimunes, tolerância imunológica induzida por peptídeos derivados do MHCde doador pode ser específica para o alelo das moléculas MHC de doador.Conseqüentemente, identificação de proteínas/peptídeos que sãoelevadamente conservados dentre os indivíduos e que também induzemtolerância imunológica através de múltiplos alelos de MHC podem ser degrande importância no desenvolvimento de terapias efetivas para tratarpacientes sofrendo de ou sob risco de desenvolvimento de rejeição dealoenxerto. Contudo, o uso de tais proteínas/peptídeos para indução etolerância imunológica aos aloenxertos de pulmão não tem sido totalmenteavaliado. Em adição, muito poucas(os) proteínas/peptídeos que são úteis paratal tolerância ainda têm sido identificadas(os).

Ademais, apesar da existência de técnicas diferentes para induzir tolerância aos aloenxertos de órgão sólido, tais como transfusão desangue específico de doador, injeção tímica com APC's derivados de doador,ou imunização sistêmica com peptídeos derivados de moléculas MHC dedoador antes do transplante (Krensky e Clayberger, 1997), para quaisquerdestas técnicas serem efetivas as moléculas de MHC de doador específicastêm que se conhecias várias semanas antes do transplante para permitir temposuficiente, i.e., semanas a meses, para indução de tolerância se desenvolver.Contudo, no cenário típico há apenas umas poucas horas entre a identificaçãode um doador potencial e a cirurgia de transplante, na maioria dos casos entãonão há tempo suficiente para induzir tolerância na maioria dos pacientesreceptores de transplante.

Pacientes receptores de transplante que já sofrem de umadoença autoimune, que em si mesmos podem necessitar de um transplante deórgão podem estar sob risco aumentado de rejeição catastrófica de órgãostransplantados. Conseqüentemente, há uma necessidade de identificar e talveztratar qualquer patologia baseada em autoimunidade subjacente, se não antes,certamente após um transplante. Também há várias doenças e distúrbios depulmão tal como Fibrose Pulmonar Idiopática (IPF) que são difíceis dediagnosticar e tratar e cuja etiologia subjacente é desconhecida,adicionalmente complicando o esforço para diagnosticá-las(os) e tratá-las(os).

Claramente então, há uma necessidade de métodos que possamser usados para identificar doenças autoimunes tal como IPF e para tratar oupelo menos manejar tais doenças. A necessidade é especialmente aguda nocaso de doenças onde um tratamento líder, transplante de pulmão, pode serem si mesmo severamente comprometido por uma resposta autoimunepatogênica existente. Vários aspectos e modalidades são direcionados(as) paradiagnosticar e tratar doenças que são causadas por, ou agravadas por, umaresposta autoimune indesejável ao componente do pulmão tal como tipos decolágeno variados e específicos.

SUMÁRIO

Uma modalidade é um método de avaliar distúrbios oudoenças pulmonares tal como IPF em um paciente animal ou humano. Umamodalidade compreende as etapas de obter uma amostra de fluido ou detecido de um paciente e analisar a amostra para determinar se qualquercomponente do sistema imune do paciente tem montado uma resposta imunea qualquer elemento de tecido conjuntivo encontrado em um órgão do corpodo paciente. Componentes de tecido conjuntivo típicos podem incluirqualquer tipo de colágeno e/ou compostos antigênicos de colágeno. Várioscolágenos que podem gerar uma resposta autoimune incluem, por exemplo,colágeno de Tipo I, colágeno de Tipo II, colágeno de Tipo III, colágeno deTipo IV, colágeno de Tipo V, e colágeno de Tipo VI. testes para avaliarcondições ou doenças pulmonares nestes pacientes podem compreender asetapas de obter uma amostra de fluido ou de tecido de um paciente, contatarpelo menos uma porção da amostra com pelo menos um componenteantigênico (epítopo) de colágeno de Tipo V e monitorar o teste para qualquersinal indicativo das presenças de pelo menos um anticorpo anti-colágeno deTipo V na amostra. Tais testes podem incluir a presença de qualquer tipo decomponente adicional que pode ser necessário ou benéfico para conduzir ostestes. Tais componentes incluem, mas não são limitados a, anticorpossecundários que se ligam nos anticorpos anti-Tipo V, átomos ou moléculasrepórter, superfícies para ligação do componente antigênico, tamponadores,estabilizadores, agentes antimicrobianos e semelhantes.

Um aspecto é um ensaio compreendendo as etapas de: obteruma amostra de fluido ou de tecido do pulmão ou fluido que estava emcontato com o pulmão, contatar pelo menos uma porção da amostra com pelomenos um epítopo de colágeno de Tipo V ou qualquer outra molécula quepreferivelmente se liga em anticorpo anti-colágeno de Tipo V, e detectar umamudança associada com a ligação ou anticorpo anti-Tipo V com pelo menosum epítopo de colágeno de Tipo V na amostra. Estes ensaios e suas variaçõespodem ser usados para ensaiar doenças pulmonares tal como IPF esemelhante ou qualquer outro tipo de distúrbio ou doença pulmonar que incluiuma resposta autoimune a pelo menos uma porção de colágeno de Tipo V.

Outra modalidade é um método de determinar se um pacientepossui autoimunidade a um componente de pulmão. Uma resposta autoimunetípica pode envolver imunidade quer humoral quer celular ou ambas. Taisrespostas incluem, por exemplo, resposta de hipersensibilidade de tiporetardado. Doenças pulmonares que podem ter uma dimensão autoimuneincluem, mas não são limitadas a, Fibrose Pulmonar Idiopática, Síndrome daAngústia Respiratória Aguda, Síndrome da Angústia Respiratória de Adulto,doença vascular de colágeno secundária, outras doenças de pulmão fibrótico esemelhantes.

Uma modalidade inclui triar pacientes para identificarpacientes ou grupos de pacientes específicos que possuem um risco elevadode desenvolvimento de condições ou doenças pulmonares que possuem umadimensão autoimune. Tais doenças ou condições incluem, mas não sãolimitadas a, Fibrose Pulmonar Idiopática (IPF), Síndrome da AngústiaRespiratória Aguda, Síndrome da Angústia Respiratória de Adulto, doençavascular de colágeno secundária, outras doenças de pulmão fibrótico esemelhantes, ou outras condições que são devido a pelo menos em parte auma reação autoimune ao tecido conjuntivo de pulmão tal como colágeno deTipo V. Testes para triar estes pacientes podem compreender as etapas deobter uma amostra de fluido ou de tecido de um paciente, contatar pelo menosuma porção da amostra com pelo menos um epítopo de colágeno de Tipo V emonitorar a mistura de amostra e antígeno para qualquer sinal indicativo daspresenças de pelo menos um tipo de anticorpo anti-colágeno de Tipo V naamostra.

Ainda outra modalidade inclui monitorar a progressão dadoença pulmonar em um paciente ou monitorar a eficácia de vários regimesde tratamento usados para tratar um paciente sofrendo de uma tal doença oudistúrbio do pulmão. Testes para monitor estes pacientes podem compreenderas etapas de obter uma amostra de fluido ou de tecido de um paciente,contatar pelo menos uma porção da amostra com pelo menos um epítopo decolágeno de Tipo V e monitorar o teste para qualquer sinal indicativo daspresenças de pelo menos um anticorpo anti-colágeno de Tipo V na amostra.

Uma modalidade inclui testes de diagnóstico para doenças talcomo IPF, em algumas modalidades o teste pode compreender as etapas deobter uma amostra de fluido ou de tecido do paciente, contatar pelo menosuma porção da amostra com pelo menos um epítopo de colágeno de Tipo V emonitorar a mistura para qualquer sinal indicativo das presenças de pelomenos um anticorpo anti-colágeno de Tipo V na amostra.

Ainda outra modalidade inclui avaliar candidatos detransplante de pulmão para identificar candidatos, que possuem um riscoelevado de desenvolvimento de BOS e.g., pacientes que testam positivo parauma resposta autoimune ao colágeno encontrado no pulmão tal comocolágeno de Tipo V. Métodos de avaliação destes candidatos podemcompreender as etapas de obter uma amostra de fluido ou de tecido docandidato, contatar pelo menos uma porção da amostra com pelo menos umepítopo de colágeno de Tipo V e monitorar a mistura de antígeno e amostrapara evidência de que o anticorpo anti-Tipo V na amostra tem sido ligado emantígeno. Testes para avaliação destes candidatos podem compreender asetapas de ligar o antígeno em uma superfície sólida, contatar a amostra com oantígeno, permitindo tempo para o antígeno se ligar no anticorpo para oantígeno presente na amostra, e lavar o complexo de anticorpo-antígenoligado para remover o excesso de anticorpo e/ou amostra. Etapas adicionaispodem incluir ligar um grupo repórter no complexo de antígeno-anticorpo emonitorar o sistema para qualquer mudança em sinal indicativo da presençade anticorpo ligado no antígeno. Em algumas modalidades o antígeno no testeé pelo menos um epítopo de colágeno de Tipo V.

Outra modalidade inclui métodos de teste para identificardoenças de pulmão que envolvem uma resposta autoimune ao tecidoconjuntivo no pulmão tal como colágeno de Tipo V. Alguns métodos de testepodem compreender as etapas de obter uma amostra de fluido ou de tecido deum dado paciente e ensaiar pelo menos uma porção da amostra para evidênciade uma resposta autoimune ao colágeno de Tipo V. Em uma modalidade aamostra é analisada para evidência de resposta de hipersensibilidade retardadaao colágeno de Tipo V ou um seu epítopo ou análogo antigênico. Em aindaoutra modalidade a amostra é analisada para a presença de anticorpo paracolágeno de Tipo V ou um seu epítopo ou análogo antigênico.

Ainda outra modalidade é um método para identificarpacientes com um risco aumentado de desenvolvimento de síndrome debronquiolite obliterante (BOS) e/ou monitorar a progressão da síndrome oueficácia da terapia usada para tratar a síndrome. Estes métodos geralmenteincluem as etapas de obter uma amostra de soro, sangue, fluido pulmonarintersticial, escarro, muco ou tecido de um paciente e ensaiar a amostra paraevidência de uma reação autoimune a um componente do tecido conjuntivodo pulmão. Em uma modalidade o paciente é um candidato para, ou oreceptor de, um transplante de pulmão e a amostra é ensaiada para evidênciade uma resposta imune de hospedeiro ao colágeno de Tipo V. Em umamodalidade a amostra é ensaiada para imunidade celular ao colágeno de TipoV. Em ainda outra modalidade a amostra é ensaiada para imunidade humoralao colágeno de Tipo V.

Outra modalidade compreende ensaiar uma amostra de fluidoou tecido para evidência de imunidade a um epítopo de colágeno de Tipo V,ou a um seu análogo, porção ou componente.

Ainda outra modalidade é um método para identificarpacientes receptores de transplante de pulmão prospectivo que estão sob riscoaumentado de rejeição de tecido transplantado devido a uma respostaautoimune ao colágeno de Tipo V ou às suas porções ou fragmentosantigênicos.

Ainda outra modalidade é um método de monitorar pacientesreceptores de transplante de tecido pulmonar para avaliar o risco continuadodeles de rejeição de tecido transplantado devido a uma resposta autoimune aocolágeno de Tipo V ou às suas porções ou fragmentos antigênicos.Ainda outra modalidade é um método para tratar um pacientecom uma doença ou distúrbio ou um paciente em um risco dedesenvolvimento de uma doença ou distúrbio que envolve uma respostaautoimune ao tecido conjuntivo, tal como a um colágeno de Tipo Vencontrado nos órgãos do paciente. Em uma modalidade o métodocompreende as etapas de proporcionar compostos imunossupressores, oucompostos que fazem o paciente tolerar a presença do antígeno tal comocolágeno de Tipo V e administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva decomposto a um dado paciente. Tais compostos incluem, mas não sãolimitados a, vários colágenos ou porções de colágeno, por exemplo, colágenode Tipo V ou epítopos ou análogos antigênicos dos mesmos. Componentes detecido conjuntivo típicos que podem induzir uma resposta autoimune incluem,mas não são limitadas a, qualquer tipo de colágeno e/ou componentesantigênicos (epítopos) de colágeno. Vários colágenos que podem gerar umaresposta autoimune incluem colágeno de Tipo I, colágeno de Tipo II,colágeno de Tipo III, colágeno de Tipo IV, colágeno de Tipo V, colágeno deTipo VI e vários componentes antigênicos dos mesmos.

Ainda outra modalidade é um método para tratar ou prevenir aprogressão de distúrbios ou doenças pulmonares tais como Fibrose PulmonarIdiopática, Síndrome da Angústia Respiratória de Adulto e outros distúrbiosde pulmão fibrótico, Síndrome da Angústia Respiratória Aguda, síndrome debronquiolite obliterante (BOS), e semelhantes, pela provisão de colágeno parasuprimir resposta autoimune do paciente ao colágeno ou compostosantigênicos de colágeno em um tecido de pulmão de paciente ou no tecido deum pulmão transplantado. Tal terapia pode incluir administrar uma dosesegura e efetiva de colágeno ou de um componente de colágeno ou de um seuanálogo a um paciente durante um período de tempo determinado pelacondição do sistema imune do paciente para melhor tolerar colágeno e parapelo menos parcialmente suprimir a resposta imune do paciente ao colágeno.Em uma modalidade o colágeno é colágeno de Tipo V ou um fragmentoantigênico ou análogo do mesmo.

Ainda outra modalidade compreende tratar uma forma dedoença de pulmão causada por ou agravada por uma resposta autoimune, quepode incluir atividade de célula-e resposta de hipersensibilidade de tiporetardado ao colágeno ou a uma porção antigênica de um colágeno. Em umamodalidade o colágeno administrado ao paciente é selecionado do grupoconsistindo de colágeno de Tipo I, colágeno de Tipo II, colágeno de Tipo III,colágeno de Tipo IV, colágeno de Tipo V, colágeno de Tipo VI e várioscomponentes antigênicos dos mesmos. Estes compostos podem seradministrados por uma variedade de meios incluindo, mas não limitados a,instilação intrapulmonar, oralmente, inalação, injeção subcutânea,gotejamento, injeção direta, ou semelhantes.

Ainda outra modalidade é um método para identificarpacientes com um risco aumentado de rejeição de tecidos e órgãostransplantados. Tipicamente este método compreende as etapas de coletaruma amostra de sangue, soros, fluido, escarro ou tecido de um paciente eanalisar a amostra para determinar se qualquer componente do sistema imunedo paciente tem montado uma resposta imune a qualquer elemento de tecidoconjuntivo em um órgão do corpo do paciente. Órgãos típicos incluem, masnão são limitados a, pulmão, coração, fígado, rim, pâncreas, e componentesdo olho. Componentes de tecido conjuntivo típicos podem incluir qualquertipo de colágeno e/ou compostos antigênicos de colágeno. Vários colágenosque podem gerar uma resposta autoimune incluem colágeno de Tipo I,colágeno de Tipo II, colágeno de Tipo III, colágeno de Tipo IV, colágeno deTipo V, e colágeno de Tipo VI.

Ainda outra modalidade é um kit para realizar testes paradeterminar se um dado paciente está sob risco de desenvolver uma patologiapulmonar baseada em autoimunidade, ou monitorar a saúde de um paciente jádiagnosticado com uma tal condição. Em uma modalidade o kit inclui pelomenos um componente antigênico de colágeno, por exemplo, colágeno deTipo V ou um epítopo, fragmento ou análogo do mesmo adequado paradetectar evidência de uma autoimunidade humoral ou celular ao colágeno. Emuma modalidade o kit adicionalmente inclui pelo menos um grupo repórterquer um átomo quer uma molécula que exibe uma mudança em sinal napresença de pelo menos molécula indicativa de uma resposta autoimune aocolágeno de Tipo V. Em ainda outra modalidade o kit adicionalmente incluipelo menos um tamponador, estabilizador, conservante, compostoantibacteriano, adjuvante ou semelhantes quer serve para aumentar a meia-vida, sensibilidade, e/ou confiabilidade do teste. Em uma modalidade um kitadicionalmente inclui adjuvante de Freund ou seus componentes ou análogos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

FIG. 1. Auto-reatividade de células TeB anti-col(V) emrelação ao curso clínico de pacientes receptores de transplante de pulmão.

Painel A. Análise de Western blot de IgG purificada deamostras BAL de pacientes L3, L41, L31 testados contra col(II) ou col(V).

Painel B. Curso de tempo de autoimunidade anti-col(V) efusão de enxerto nos mesmos 3 pacientes. FEVl (linha sólida, eixo esquerdo)foi ajustado para 100% de máx (2,3 para L3, 2,4 para L41, e 2,8 para L31)para cada paciente. Nível 1 de BOS é representado por linha tracejada cinza(80% de FEVl máx). DTH para col(V) (barras cheias, eixo direito) e col(II)(barras vazias) são mostrados com resposta de DTH negativa (< 25 χ IO"4polegadas [63,5 χ IO*3 milímetros]) representada por uma área sombreada.Resultados de Western (do painel A) são representados por retângulospróximos do topo dos gráficos. Episódios de rejeição aguda são representadospor *.

Painel C. Compósito de curso clínico e reatividade anti-col(V)em 4 indivíduos adicionais com padrões de reatividade similares àquela vistaem painel Β. FEVl Máx % (cada linha representa um paciente receptor detransplante individual), Ab e /ou DTH positivo para col(V) (círculos cheiossobre a linha FEVl de indivíduo dado) ou Ab e/ou DTH negativo para col(V)(triângulos vazios sobre as linhas FEV1) bem como morte de indivíduo (+)são mostrados. Limite de BOS 1 (80% de FEVl máx) é representado porlinha tracejada cinza.

FIG. 2. Análise de Kaplan-Meier examinando o efeito dedesenvolvimento de reatividade anti-col(V) sobre liberdade de BOS I.

Pacientes com função de enxerto boa através do dia 326 após transplante(painel A) ou dia 760 após transplante (painel B) foram divididos baseadosem sua resposta ao col(V) antes daquele tempo. Em painel A, aqueles comuma resposta anti-col(V) positiva (linha tracejada) incluem e queranticorpo/BAL quer DTH/sangue periférico-positivo; em painel B, respostade DTH é o único critério usado para identificar pacientes com uma respostaanti-col(V) positiva anterior. Em ambos os painéis, pacientes com umaresposta anti-col(V) negativa anterior são indicados por linha sólida. Adiferença entre o grupo não-reativo a col(V) e o grupo reativo a col(V) foisignificativa (p=0,01, painel A; p=0,03, painel B).

FIG. 3. Resposta de DTH ao col(V) em pacientes apóstransplante de pulmão é específica e não presente antes do transplante.

Painel A. Pacientes após transplante de pulmão (n=8, qualquerdoença) ou pacientes renais com síndrome de Goodpasture (GPS, n=5) foramtestados para resposta de DTH ao col(II) (barras vazias), col(IV) (barraspontilhadas), ou col(V) (barras cheias) expressada como inchamento médio ±S.D.. A diferença entre as respostas de pacientes receptores de transplante depulmão aos vários colágenos foi significativa (*, p=0,001) como foi adiferença entre as respostas de pacientes receptores de transplante renal comGPS.

Painel B. Pacientes não-transplantados com várias doenças depulmão foram testados para resposta de DTH ao col(II) (barras vazias) oucol(V) (barras cheias) expressada como inchamento médio ± S.D. A diferençaentre a resposta ao col(V) em pacientes com IPF e qualquer outra doença foisignificativa (*, p=0,02).

Painel C. Análise de Kaplan-Meier de tempo para perda deenxerto para pacientes com diagnóstico pré-transplante de IPF ou qualqueroutra doença. A diferença de sobrevivência de enxerto de 1 ano foisignificativa (p=0,05). Sobrevivência de enxerto total pela análise de Iog-pontos não foi significativamente diferente entre grupos.

FIG. 4. Fotomicrografia, de Imunoquímica de IgG, mostrandodepósitos em um pulmão tendo sofrido de Rejeição Aguda. Criosseções debiopsia transbronquial (TBB) ou de tecido de pulmão normal foram fixadasem acetona e coradas pra depósitos de subtipo de IgG como descritopreviamente (Wilkes et al. - Journal of Immunology 1995). Painéis A, B, C, eD mostram imunocoloração de subclasses IgGl5 IgG2, IgG3 e IgG4 de TBBobtida de um aloenxerto de pulmão sofrendo de rejeição aguda de grau 2 nodialOO após o transplante. Notar os depósitos de IgG2 nos tecidos conjuntivosperibronquiais subjacentes ao epitélio bronquial (seta). Em contraste, nãohouve depósitos de IgGl, IgG3 ou IgG4 detectados na mesma amostra.Depósitos de IgG2 na matriz sub-epitelial estiveram ausentes em pulmõesnormais e em aloenxertos com um estado de enxerto quiescente (dados nãomostrados).

FIG. 5. Resposta de hipersensibilidade de tipo retardado aocolágeno de Tipo V em pacientes aguardando transplante de pulmão. Aresposta de DTH é um marcador para ativação de célula T e reflete o quetemos relatado no modelo de transplante de pulmão de rato. Pacientes comIPF mas não com outras formas de doença de pulmão têm uma resposta deDTH significativamente maior ao colágeno de Tipo V. Isto mostra que estespacientes já têm células T ativadas contra este auto-antígeno.FIG. 6. Fotomicrografias de mancha de tecido de pulmãomostrando os efeitos de patologia de isoenxertos de pulmão transplantados emrato WKY não tratado (A), um rato WKY previamente imunizado comLisozima de Ovo de Galinha (B), ou um rato WKY previamente imunizadocom colágeno de Tipo V (C). Os dados mostram que sensibilização anteriorde col(V), mas não de HEL5 resulta em destruição do pulmão 30 dias após otransplante. Nenhuns ratos receberam drogas imunossupressoras ou outrostratamentos. Dados são representativos de 6 ratos cada para grupos HEL ecol(V) e mais do que ratos SO no grupo não tratado.

FIG. 7. Tabela 1, sumário de demografia de pacientes. Estascondições foram diagnosticadas em pacientes tendo sofrido procedimentos detransplante de pulmão correlacionados com várias patologias pós-operatórias.

FIG. 8. Tabela 2 sumário de dados de encalço de vários fatoresassociados com BOS. Fatores associados com BOS.

FIG. 9. Ilustração gráfica de dados coletados usando um ensaiobaseado em glóbulo de anticorpo planejado para detectar níveis diferentes deanticorpos anti-colágeno V em amostras de soros. Deslocamentos de picopara a direita são indicativos de níveis altos de anticorpos anti-colágeno V. Ospainéis da esquerda representam dados coletados de pacientes, painéis dadireita representam controles nos quais vários níveis de anticorpos anti-colágeno V foram usados nos soros.

FIG. 10. Redução de respostas de DTH aos alo-antígenos dedoador, col(V), e alo-antígenos de terceira parte em receptores de aloenxertode controle duas semanas após o transplante. Ratos WKY inexperientes foramcontroles. Animais receberam IO7 esplenócitos de terceira parte (BN),esplenócitos F344 derivados de doador irradiados (3.000 rad), ou 15μg decol(V) na aurícula direita e diluente na aurícula esquerda. A espessura daorelha foi medida com um micrômetro (Mitutoyo, Field Tool Supply,Chicago, Il 1.) em um modo cego imediatamente antes e 24 h após a injeção eInchamento Específico de Orelha foi calculado como descrito em Métodos.Dados representam a média ±SEM de Inchamento Específico de Orelha emmmxlO"3 de quatro ratos em cada grupo. [*p<0,0001 comparados com ratosWKY inexperientes desafiados com esplenócitos F344 ou col(V) e fp<0,0001comparados com ratos WKY inexperientes desafiados com col(V) ouesplenócitos F344].

FIG. 1 IA, FIG. IlB e FIG. 11C. Histologia de pulmão emcamundongos BALB/c após quatro instilações semanais de 1.5x105 célulasBAL (C57BL/6) alogênicas sozinhas, col(II), ou col(XI) (50 μg cada)semanalmente por quatro semanas seguido por quatro instilações semanais decélulas C57BL/6 BAL. FIG. IlA mostra infiltrados de célula mononuclearperibronquiolar e perivascular em pulmões de camundongos BALB/c quereceberam instilações de células BAL dos camundongos C57BL/6. Lesõespatológicas similares foram observadas em pulmões de camundongosBALB/c que receberam instilações semanais de col(II) (FIG. 11B) ou col(XI).

FIG. 12. Contagens de células diferenciais de fluido BAL empulmões WKY normais, pulmões de isoenxerto de controle, e pulmões dealoenxerto alimentados com col(V). Em duas semanas após o transplante, ospulmões transplantados sofreram BAL. Contagens de células diferenciaisforam determinadas pela contagem de 300 células/campo sobre preparaçõesde citospina utilizando microscopia de luz. Mac, macrófagos; Lym, linfócitos;PMN, células polimorfonucleares. Dados representam a média±SEM dequatro pulmões WKY normais, quatro isoenxertos de controle, cincoaloenxertos de controle, e cinco aloenxertos alimentados com col(V).(*p<0,038 para PMN1S e *p<0,000001 para linfócitos comparados compulmões de isoenxerto ou normais, p<0,023 para PMN1S e p<0,0001 paralinfócitos comparados com aloenxertos de controle).

FIG. 13A, FIG. 13B, e FIG. 13C. Raios-X de tórax seriais dereceptores de transplante duas semanas após transplante. As linhas brancascurtas no campo de pulmão esquerdo (setas) representam os manguitos usadospara anastomose vascular. Receptores de isoenxerto de controle mostramraios-X de tórax normais em FIG. 13A. Raios-X de receptores de aloenxertode controle revelaram infiltrados severos e opacificação completa doaloenxerto indicativo de rejeição severa em FIG. 13B. Receptores dealoenxerto alimentado com Col(V)-mostram apenas infiltrados suaves duassemanas após o transplante em FIG. 13C Raios-X de tórax representativos decinco camundongos em cada grupo.

FIG. 14A, FIG. 14B, FIG. 14C, FIG. 14D, FIG. 14E, e FIG.14F. Painel superior: Anatomia macroscópica de pulmões de isoenxerto decontrole FIG. 14A, pulmões de aloenxerto de controle FIG. 14B, e pulmõesde aloenxerto alimentado com col(V) FIG. 14C duas semanas após otransplante (vista posterior). O pulmão esquerdo (L) é o pulmão transplantadoe o direito (R) é o pulmão nativo em cada painel. O pulmão de aloenxerto decontrole ("L" em painel b) foi de cor marrom escura, encolhido, e deconsistência firme comparado com o pulmão nativo. Contudo, o pulmão dealoenxerto alimentado com col(V) ("L" em painel c) teve a aparência dopulmão de isoenxerto ("L" em painel a). Pulmões de isoenxerto de controle(FIG. 14A) não mostram lesões patológicas e são idênticos aos pulmõesWKY. Fotografias representativas de cinco ratos em cada grupo. Painelinferior: Histologia de isoenxertos de controle FIG. 14D, aloenxertos decontrole FIG. 14E, e aloenxertos alimentados com col(V) FIG. 14F duassemanas após o transplante. Isoenxertos de controle mostram estruturasvasculares e de vias aéreas normais (FIG. 14D). aloenxertos de controlemostram infiltrados extensivos de células mononucleares, alveolares,peribronquiais e perivasculares consistentes com rejeição severa (FIG. 14E).Em contraste, aloenxertos alimentados com col(V) mostram apenas infiltradossuaves a moderados de células mononucleares, peribronquiais eperivasculares (FIG. 14F). Fotomicrografias representativas de cinco ratos emcada grupo (magnificação de IOOx).

FIG. 15. Tabela 3, graduação de patologia de rejeição. ATabela inclui dados dos controles e dos modelos animais para rejeição detransplante.

FIG. 16. Redução de respostas de DTH aos alo-antígenos dedoador por administração oral de col(V). Receptores de aloenxerto decontrole e receptores de aloenxerto alimentado com col(V) duas semanas apóso transplante foram desafiados na aurícula direita com IO7 esplenócitos F344irradiados (3.000 rad) derivados de doador, e diluente na aurícula esquerda. Aespessura da orelha foi medida com um micrômetro na aurícula esquerda. Aespessura de orelha foi medida com um micrômetro (Mitutoyo, Field ToolSupply, Chicago, 111.) em um modo cego imediatamente antes e 24 horasapós injeção e Inchamento Específico de Orelha. Dados representam a média±SEM de Inchamento Específico de Orelha em mmxlO" de quatro ratos emcada grupo. (*p<0,02 comparados com aloenxertos de controle).

FIG. 17. Níveis de TGF-β em soro de ratos WKY normais,receptores de aloenxerto de controle, e receptores de aloenxerto alimentadoscom col(V). Níveis de TFG-β em soro foram determinados por ELISA. Dadosrepresentam média±SEM de quatro ratos em cada grupo. (*p<0,05comparados com aloenxertos de controle).

FIG. 18. Neutralização de TGF-β restaura respostas de DTHaos alo-antígenos de doador em receptores de aloenxerto alimentados comcol(V). Ratos WKY alimentados com col(V) foram desafiados na aurículadireita com 10 esplenócitos F344 derivados de doador irradiados (3.000 rad)misturados com quer 5 μg de Ab policlonal anti-TGF-β quer de Ab anti-IL-4ou IL-10 em PBS duas semanas após o transplante. A aurícula esquerdarecebeu um volume igual de diluente mais esplenócitos, e serviu como o sítiode controle. Para controles negativos, um grupo separado de aloenxertosalimentados com col(V) recebeu imunoglobulinas de controle comesplenócitos na aurícula direita e um volume igual de diluente maisesplenócitos na aurícula esquerda. A espessura da orelha foi medida com ummicrômetro em um modo cego imediatamente antes e 24 h após injeção e oInchamento Específico de Orelha foi calculado como descrito abaixo. Spl,esplenócitos. Dados representam a média±SEM de Inchamento Específico deOrelha em mmxlO"3 de quatro ratos em cada grupo [*p<0,03 e f, $p>0,05comparados com aloenxertos alimentados com col(V) desafiados comantígenos misturados com imunoglobulina de controle]. A restauração dasrespostas de DTH em aloenxertos alimentados com col(V) com anticorposanti-TFG-β, anti-IL-4, e anti-IL-10 relativa aos aloenxertos de controle foi75,7%, 24,3% e 39,9%, respectivamente.

FIG. 19. Respostas de DTH aos alo-antígenos de doador,col(II), col(V), col(XI), e alo-antígenos de terceira parte em receptores dealoenxerto de controle dez semanas após transplante. Animais receberam 10esplenócitos de terceira parte (BN), esplenócitos F344 derivados de doadorirradiados (3.000 rad), ou 15 μg de col(II), col(V), or col(XI) em aurículadireita e diluente em aurícula esquerda. A espessura da orelha foi medida comum micrômetro em um modo cego imediatamente antes e 24 h após injeção.O Inchamento Específico de Orelha foi calculado como descrito abaixo. Spl,esplenócitos. Dados representam a média±SEM de Inchamento Específico deOrelha em mmxlO" de três ratos em cada grupo [*p<0,05 comparados comratos WKY inexperientes desafiados com esplenócitos F344 ou col(V)].

FIG. 20. Reação de leucócito misto. Razões variadas deesplenócitos F344 (estimulantes) tratados com 3x105 linfócitos-T delinfonodo de ratos WKY (Normal), ou de ratos WKY que foram alimentadoscom col(V). Dezoito horas antes da completitude de uma incubação de 5 dias,as células foram pulsadas com 3H e proliferação foi determinada porcontagens/minuto (cpm) de incorporação de timidina. índice de estimulação éigual aos múltiplos de proliferação em linfócitos de linfonodo induzidos pelavariação da quantidade de células estimuladoras em relação à proliferação delinfócitos de linfonodo sozinhos. Dados representativos de três experimentos.

FIG. 21A, FIG. 21B, FIG. 21C, e FIG. 21D. Painel superior:anatomia macroscópica de pulmões de aloenxerto de controle FIG. 2IA, epulmões de aloenxerto alimentado com col(V) FIG. 2IB dez semanas apóstransplante. O pulmão esquerdo (L) é o pulmão transplantado e o direito (R) éo pulmão nativo em cada painel. O pulmão de aloenxerto de controle foi decor marrom clara, encolhido, e de consistência firme comparado com opulmão nativo. Contudo, o pulmão de aloenxerto alimentado com col(V) teveuma aparência quase normal com apenas ligeira descoloração. Painel inferior:Histologia de aloenxertos de controle FIG. 2IC e aloenxertos alimentadoscom col(V) FIG. 2ID dez semanas após transplante, aloenxertos de controledesenvolveram infiltrados extensivos de célula mononuclear intersticiais,fibrose, e obliteração de vias aéreas pequenas por tecido de granulação, quesão lesões patológicas de BO. Em contraste, aloenxertos alimentados comcol(V) apenas tiveram infiltrados alveolares suaves, sem inflamaçãointersticial que descreve a patologia de rejeição aguda branda (grau A2).Fotomicrografias representativas de cinco ratos em cada grupo.

FIG. 22. Níveis de TGF-β em soro de ratos WKY normais,receptores de aloenxerto de controle, e receptores de aloenxerto alimentadoscom col(V) dez semanas após transplante. Níveis de TFG-β em soro foramdeterminados por ELISA. Dados representam média±SEM de três ratos emcada grupo. (*p<0,05 comparados com aloenxertos de controle).

FIG. 23. Neutralização de TGF-β in em Resposta DHT. RatosWKY alimentados com col(V) receberam 10 esplenócitos F344 derivados dedoador irradiados (3.000 rad) misturados com 5 μg de Ab policlonal degalinha anti- TFG-β de rato na aurícula direita e diluente na aurícula esquerda.Para controles negativos, um grupo separado de aloenxertos alimentados comcol(V) recebeu 10 esplenócitos F344 derivados de doador irradiados (3.000rad) misturados com 5 μg de imunoglobulinas de galinha de controle ouimunoglobulinas de cabra de controle na aurícula direita e diluente na aurículaesquerda. O Inchamento Específico de Orelha foi determinado como descrito.

FIG. 24. Respostas de DTH a BSA em ratos WKYinexperientes e alimentados com col(V). Ratos WKY inexperientes ealimentados com col(V) foram vacinados com injeção inicial s.c. de 100 μgde BSA em adjuvante e sete dias mais tarde foram desafiados com solução deBSA agregada por calor 2% na aurícula direita e diluente na esquerda. Aespessura da orelha foi medida com um micrômetro em um modo cegoimediatamente antes e 24 h após injeção e o Inchamento Específico de Orelhafoi calculado como descrito acima. Ratos WKY não vacinados serviram comocontroles. Dados representam a média±SEM de Inchamento Específico deOrelha em mmxlO" de quatro ratos em cada grupo (*p<0,018 comparadoscom ratos WKY inexperientes não vacinados e 1P ? 0,05 comparados comratos WKY vacinados).

FIG. 25. Tabela 4 é uma listagem de grupos experimentaisusados em exemplo 6.

FIG. 26. Tabela 5 é um sumário dos resultados dosexperimentos relatados em exemplo 8.

DESCRIÇÃO

Para os propósitos de promoção de um entendimento dosprincípios da invenção, referência será agora feita às suas modalidadespreferidas, e linguagem específica será usada para descrever a mesma.Contudo será entendido que nenhuma limitação do escopo da invenção édeste modo intencionada, tais alterações, modificações, e outras aplicaçõesdos princípios da invenção sendo contempladas como normalmenteocorreriam para uma pessoa experiente na arte à qual a invenção se refere.

Numerosas explanações e experimentos são proporcionadospor meio de explanação e não de limitação. Nenhuma teoria de como ainvenção opera é para ser considerada limitante, proferida em virtude quer dadescrição, comparação, explanação quer do exemplo.

As composições e metodologias aqui descritas e implicadassão úteis para ambas as aplicações em humano e outro animal inferior (e.g.,animais de estimação, de zoológico, ou dométicos). Conseqüentemente, osseguintes exemplos e discussão são apresentados por meio de orientação eexplicação e não de limitação.

Como aqui usado o termo 'avaliar' como usado, por exemplo,na frase 'avaliar um paciente para ...' inclui, mas não é limitado adiagnosticar, triar, estimar, monitorar e semelhantes para qualquer parâmetrodiscernível que como mostrado se correlaciona com uma dada doença,distúrbio ou condição, e semelhantes. O termo avaliar como aqui usado inclui,mas não é limitado a, pelo menos uma das seguintes atividades: diagnosticarpacientes para determinar se possuem uma condição médica geral ouespecífica; monitorar pacientes com uma condição médica conhecida oususpeita para acompanhar o progresso da doença ou a eficácia de um regimede tratamento; triar pacientes para estimar a possibilidade de que elesdesenvolverão uma dada condição médica; estimar a probabilidade de que umdado paciente possui ou está sob risco de desenvolver uma dada doença oucondição médica; detectar a presença de ou a propensão ou a suscetibilidadepara desenvolver uma doença, síndrome, ou condição; e prever o prognósticode duração curta ou longa para desenvolvimento e/ou recuperação de umadada condição médica, doença, distúrbio ou semelhantes.

Como aqui usado o termo 'condição médica' inclui síndromes,doenças, condições e semelhantes.

Estudos no modelo de transplante de pulmão em rato têmmostrado que o pulmão é rejeitado devido a uma resposta autoimuneespecífica anti-colágeno de Tipo V. Para discussão adicional veja: Publicaçãode Pedido de Patente US de No. 2003/0078208A baseado em Pedido dePatente US de No. 10/243,797 depositado aos 13 de setembro de 2003 porDavid S. Wilkes e aqui incorporado como referência em sua totalidade; e,"Type V Colagen Modulates Alloantigen-Induced Pathology andMol. Biol, Vol 23, pp. 62-70, 2000.

Colágeno Tipo V [col(V)] é um colágeno menor presente nopulmão (Madri e Furthmayr, 1980) e está localizado nos tecidos conjuntivosperibronquiolar (Madri e Furthmayr, 1979), interstício alveolar (Konomi etal., 1984), e membranas basais capilares (Madri e Furthmayr, 1979). A cadeiaa-1 de a I(V) é quase 76% homóloga à cadeia al de Tipo XI colágeno[a2(XI)] (Cremer et al., 1994), e o gene para a2(XI) está localizado em Iocide MHC de classe II de camundongos e humanos (Hanson et al., 1989), ecompartilha seqüências de aminoácidos com MHC de classe II (Wilson et al.,1995). Peptídeos derivados de MHC têm sido utilizados para induzirtolerância em aloenxertos diferentes de pulmão. Os presentes inventoresselecionaram col(V) para modular respostas imunes em aloenxertos depulmão devido à possível presença de seqüências MHC-"semelhantes" emcol(V).

Referindo-se agora aos resultados de exemplo 1 (apresentadoabaixo), pacientes de transplante de pulmão com uma resposta imuneaumentada ao colágeno parecem estar sob um risco mais alto para rejeição detransplante. De acordo com estas e outras observações, uma modalidade é ummétodo para prever e/ou seguir a progressão de rejeição de transplante depulmão pela medição de resposta autoimune quer celular quer humoral aocolágeno em um paciente aguardando ou tendo sofrido um transplante depulmão. Em uma modalidade o biomarcador para rejeição de transplante depulmão seguido é autoimunidade ao colágeno de Tipo V e/ou epítopos decolágeno de Tipo V.

Tem sido relatado na literatura médica que auto-antígenos, talcomo proteínas de choque térmico e miosina podem se tornar o alvo derespostas imunes durante rejeição de aloenxerto de pele ou cardíaco(Fedoseyeva, et al., 1999; Duquesnoy, et al., 1999; Birk5 1999). Também temsido relatado que rejeição de aloenxerto de pulmão em roedores estáassociada com respostas de célula T ao colágeno Tipo V (Mares, et al., 2000),um colágeno menor encontrado no pulmão e na pele que é essencial paraaquiescência e elasticidade de tecido (Schwarze, et al., 2000). Fragmentos decol(V) são liberados para dentro de fluido de lavagem broncoalveolar (BAL)após transplante de pulmão e transferência adotiva de células T col(V)-específicas induz patologia "rejeição-semelhante" em isoenxertos de pulmãotransplantados (Hague, et al., 2002). Tolerância oral induzida por alimentaçãode col(V) a ratos antes de transplante de pulmão aboliu rejeição agida e oinício de BO (Yasufuku et al., 2001; Yasufuku et al., 2002).

Uma possibilidade formal é que pacientes que recebem umtransplante de pulmão podem desenvolver imunidade celular e/ou humoral aocol(V), e que esta resposta autoimune aumenta seu risco de desenvolvimentode BO. Alguns dos resultados de exemplo 2 (apresentado abaixo) sãoconsistentes com desenvolvimento de imunorreatividade a col(V) apóstransplante de pulmão e representam um fator de risco maior para síndromede bronquiolite obliterante (BOS).

A histopatologia de BO sugere que inflamação e resposta àlesão resultam em uma rota comum final, o desenvolvimento de lesõeslevando à falha do enxerto. A raridade desta síndrome fora do ambiente detransplante de pulmão indica que mecanismos aloimunes desempenham umpapel central neste processo. Contudo, o fato de que rejeição aguda e ligaçãoinespecífica de MHC necessariamente não levaram à BOS sugere que outrosfatores imunes podem ser importantes. Os resultados de exemplo 2(apresentado abaixo) sugerem que transplante de pulmão pode induzir odesenvolvimento de autoimunidade de novo a um auto-antígeno, colágenoTipo V (Estenne, et al., 2002). De fato, o risco relativo transmitido porautoimunidade ao col(V) após transplante de pulmão observado neste estudofoi da ordem de 8-10 vezes maior do que fatores tal como incidência deepisódios de rejeição aguda, previamente identificados como um risco de pós-transplante para BOS (Sharples, et al., 2002).

Análise preliminar de células T responsáveis pela reatividadeDTH ao col(V) no sangue periférico de receptores de transplante de pulmãoindica que a maioria é CD4+, embora um papel para células efetoras T CD8+col(V)-específicas não possa ser excluído (Burlingham, W., Rodriguez, D. eJankowska-Gan, E., não publicado). Em modelo de rato, um clone de célula TCD4+ restrito a MHC de classe II derivado por cultura in vitro de umtransplante de pulmão rejeitado foi capaz de mediar patologia de rejeição depulmão em um isoenxerto de pulmão esquerdo, com alguma patologia sedisseminando para o pulmão direito nativo (Hague, et al., 2002). Não foi vistodano nos pulmões nativos quando o mesmo clone foi injetado em um ratonormal, estes resultados sugerem que lesão de reperfusão e isquemiaacompanhando o procedimento de isoenxerto foram requeridas para iniciar aimunopatologia. Nem todos os clones de células T isolados dos aloenxertos derejeição foram patogênicos, e alguns parecem ser protetores (D. Wilkes, nãopublicado), sugerindo que células regulatórias T CD4+ específicas para col(V)ou outros antígenos de tecido podem desempenhar um papel em reprimir apatologia autoimune. De fato, a progressão rápida para perda de enxerto apósinício de BOS em paciente L3, e a estabilização de função em algunspacientes com autoimunidade anti-col(V) (FIG. 1B, painel esquerdo e 1C,painel do meio), estiveram correlacionadas com perda e ganho de umaresposta de DTH regulada aos antígenos do doador (W. Burlingham e E.Jankowska-Gan, não publicado) um fenômeno previamente descrito emtransplante de rim em humanos (VanBuskirk, et al, 1998: Burlingham, et al.,2000, Cai, et al., 2004), e primatas não-humanos (Torrealba, et al., 2004).Ligação inespecífica de HLA DR é um fator de risco bemconhecido para rejeição aguda precoce de transplantes de órgãos (Ayoub, etal., 1982). Isto poderia parcialmente explicar o motivo de ligação inespecíficaDR estar associada com BOS (van den Berg, et al., 2001). Também é possívelque ligação inespecífica de HLA DR desempenhe um papel benéfico emtransplante de pulmão pelo estabelecimento de condições para regulaçãoautoimune direcionada para auto-antígenos e antígenos de doador (Rodriguez,et al., 2004).

Há uma conexão bem estabelecida entre autoimunidade decélula B ao colágeno Tipo IY e à síndrome de Goodpasture (Hudson et al.,2003), que foi confirmado no presente estudo em nível de célula T usando oensaio trans-vivo DTH (FIG 3B). Liberação de colágeno IV do rim devido àlesão mediada por célula T predispõe o sistema à imunidade de célula B locale deposição de IgG de membrana basal anti-glomerular em um modelo destadoença em rato. Similarmente, liberação de col(V) do transplante de pulmãoisquemicamente lesionado no contexto de alorreatividade pode ativar célulasT efetoras col(V)-específicas, promovendo resposta de célula B col(V)-específica local e deposição de IgG C-fixadora na matriz sub-epitelial.

Um resultado de exemplo 2, aqui relatado, é a descoberta deque autoimunidade col(V)-específica pré-existente existe em pacientes comIPF. A etiologia de IPF permanece um mistério, do mesmo modo o motivo doprognóstico insatisfatório destes pacientes após transplante de pulmão (REF).Se células T anti-col (V)-específicas contribuem ou não para o processofibrótico subjacente a esta doença de pulmão, ou para os resultados precocesinsatisfatórios em transplante de pulmão para IPF, permanece para serdeterminado, embora estes dados sejam claramente consistentes com umaconexão entre estes fenômenos.

Os resultados surpreendentes de exemplo 2 sugeremtratamento de pacientes diagnosticados com ou sob risco de desenvolvimentode IPF pela restauração ou pelo reforço de auto-tolerância ao col(V) antes dotransplante. Uma modalidade é um método de tratamento de IPF pelaadministração de col(V) quer por terapia oral (Yasufuku et al, 2001;Yasufuku, et al., 2002) intersticialmente para dentro do pulmão quer poroutras estratégias de dessensibilização em um regime de dosagem planejadopara aumentar a tolerância do paciente aos colágenos incluindo, mas nãonecessariamente limitados ao colágeno Tipo V e seus componentes evariantes antigênicos.

Ainda outra modalidade é um ensaio baseado em anticorpopara diagnosticar ou monitorar doenças que incluem uma resposta autoimune.

Detecção da presença de anticorpos para colágeno de acordocom algumas modalidades pode ser realizada usando qualquer um denumerosos procedimentos de imunoensaio, tais como por procedimentos deELISA. Uma ampla variedade de técnicas de imunoensaio está disponívelcomo pode ser visto por referências aos livros-texto padrão de imunoensaioque incluem, mas não são limitados aos ensaios de sítio único e de dois sítiosou "de sanduíche" dos tipos não-competitivos, bem como aos ensaios deligação competitiva tradicionais.

Ensaios de sanduíche estão entre os métodos de ensaiobaseado em anticorpo mais úteis e comumente usados e podem ser utilizadospara praticar várias modalidades. Há numerosas variações da técnica deensaio de sanduíche, e todas são intencionadas para serem incluídas nas váriasmodalidades. Resumidamente, em um ensaio típico para detectar anticorposem uma amostra, um antígeno não marcado é imobilizado sobre umasuperfície sólida e a amostra a ser testada é contatada com a molécula deantígeno ligada. Após um período adequado de incubação, i.e. por um períodode tempo suficiente para permitir a formação de um completo de anticorpo-antígeno, um segundo anticorpo tal como IgG de anti-humano, marcado comuma molécula repórter capaz de produzir um sinal detectável, é entãoadicionado e incubado, permitindo tempo suficiente para a formação de umanticorpo-antígeno-anticorpo marcado. Qualquer material não reagido éremovido por lavagem, e a presença do anticorpo a ser detectado na amostra édeterminada pela observação de um sinal produzido pela molécula repórter.

Os resultados podem ser quer qualitativos, e.g., por simples observação dosinal visível, quer podem ser quantificados por comparação do sinal geradopor uma amostra de interesse com uma amostra de controle contendoquantidades conhecidas de anticorpo a ser detectado. Variações neste ensaioincluem um ensaio simultâneo, no qual ambos a amostra e o anticorpomarcado são adicionados simultaneamente no antígeno ligado. Estas técnicassão bem conhecidas, incluindo variações menores como será prontamenteevidente para aquelas pessoas na arte.

No típico ensaio de sanduíche, o antígeno é imobilizado, porexemplo ao ser covalente ou passivamente ligado em uma superfície sólida.

Em algumas modalidades a superfície sólida é tipicamente vidro ou umpolímero, os polímeros mais comumente usados sendo celulose,poliacrilamida, náilon, poliestireno, poli(cloreto de vinila) ou polipropileno.

Os suportes sólidos podem estar na forma de tubos, glóbulos, discos, oumicroplaca, ou qualquer outra superfície adequada para conduzir umimunoensaio. Vários processos de ligação são bem conhecidos na arte egeralmente consistem de reticulação, ligação covalente ou adsorção física doantígeno em uma dada superfície. O antígeno imobilizado é então lavado empreparação para a adição da amostra de teste. Uma alíquota da amostra a sertestada é então contatada com o antígeno imobilizado e incubada por umperíodo de tempo suficiente (e.g. 2-40 minutos) e sob condições adequadas(e.g. 25°C) para permitir ligação de qualquer anticorpo no colágeno presentena amostra. A duração real do tempo de contato, condições de tamponador,temperaturas e semelhantes são parâmetros prontamente ajustáveis e sãotipicamente prontamente alcançados em um dado teste. Após o período deincubação, o antígeno imobilizado incluindo qualquer corpo ligado é lavado eseco, e incubado com um segundo anticorpo específico para o anticorpoligado, por exemplo IgG anti-humano. O segundo anticorpo é ligado em umamolécula repórter que é usada para indicar a ligação de segundo anticorpo nocomplexo de anticorpo-antígeno imobilizado.

O termo "grupo" como aqui usado inclui moléculas, átomos,grupos funcionais químicos, e semelhantes.

O termo "molécula repórter " como usado no presente relatóriodescritivo, inclui moléculas que, por sua natureza química, proporcionam umsinal analiticamente identificável que permite a detecção de anticorpo ligadoem antígeno. Detecção pode ser quer qualitativa quer quantitativa. Asmoléculas repórter mais comumente usadas neste tipo de ensaio incluemenzimas, fluoróforos ou moléculas contendo radionuclídeo (i.e.radioisótopos), moléculas quimioluminescentes e semelhantes. No caso de umimunoensaio de enzima (EIA), uma enzima é conjugada no anticorposecundário, geralmente por meio de glutaraldeído ou periodato. Como seráprontamente reconhecido, contudo, há uma ampla variedade de técnicas deconjugação diferentes, que estão prontamente disponíveis na arte e condiçõesótimas ou quase-ótimas para testes e ensaios específicos podem serprontamente alcançadas com experimentação apenas mínima. Enzimasrepórter comumente usadas nestes tipos de ensaios incluem, mas não sãolimitadas a, peroxidase de rábano, glicose oxidase, beta-galactosidase efosfatase alcalina, dentre outras. Os substratos a serem usados com enzimasespecíficas são geralmente escolhidos para a produção, sob hidrólise pelaenzima correspondente, de uma mudança detectável em um dado sinalassociado com a presença de átomo ou molécula repórter. Também é possívelempregar substratos fluorogênicos, que dão um produto fluorescente em vezde substratos cromogênicos observados acima. Na maioria dos casos, oanticorpo marcado com enzima é adicionado no complexo de primeiroanticorpo - antígeno, permitido ligar, e então o reagente em excesso éremovido por lavagem. Uma solução contendo o substrato apropriado é entãoadicionado no complexo de anticorpo-antígeno-anticorpo marcado. Osubstrato reagirá com a enzima ligada no anticorpo secundário, produzindoum sinal visual detectável, que pode ser depois quantificado, normalmenteusando um instrumento espectrofotométrico, para dar indicação da quantidadede anticorpo que estava presente na amostra. O termo "molécula repórter "também se estende ao uso de aglutinação ou inibição de aglutinação decélulas, tais como glóbulos de látex ou de vidro, e semelhantes. Adicionalmente, o repórter pode ser um átomo ou grupo radioativo cujapresença é detectada, por exemplo, por contagem de cintilação.

Alternativamente, compostos fluorescentes tais comofluoresceína e rodamina, podem ser quimicamente copulados em anticorpossem significativamente alterar sua capacidade de ligação. Quando ativadospor iluminação com luz de um comprimento de onda particular, os anticorposmarcados com fluorocromo absorve energia luminosa, induzindo um estadode excitabilidade na molécula, seguido por emissão de luz em uma corcaracterística, em algumas modalidades o sinal emitido é visualmentedetectável com um microscópio de luz enquanto que em outras modalidades osinal pode estar fora do espectro visível. Como em EIA, o anticorpofluorescentemente marcado é permitido se ligar no complexo de primeiroanticorpo-antígeno. Após remoção por lavagem do reagente não ligado, ocomplexo terciário restante é então exposto à luz de comprimento de ondaapropriado e a fluorescência observada indica a presença do anticorpo deinteresse. Ambas as técnicas de EIA e de imunofluorescência estão bemestabelecidas na arte e são prontamente adaptáveis para uso com váriasmodalidades aqui descritas. Em adição, outras molécula repórter, tais comoradioisótopo, moléculas quimioluminescentes, fluorescentes oubioluminescentes e semelhantes, também podem ser empregadas.Com o objetivo de praticar algumas modalidades pode sernecessário obter colágeno puro ou parcialmente puro ou um seu epítopo ouporção antigênica. Estes materiais por exemplo colágeno de Tipo V ou suasporções antigênicas podem ser prontamente obtidos por uma variedade demeios incluindo mas não limitados a fontes animais, cadáveres humanos, oumeios recombinantes para nomear alguns. Métodos adicionais incluemdigeridos parciais de colágeno tal como colágeno de Tipo V.

Um aspecto compreende diagnosticar doenças tal comoFibrose Pulmonar Idiopática por identificação de evidência de uma respostaautoimune ao tecido conjuntivo de pulmão tal como colágeno de Tipo V.Evidência de tecido conjuntivo pode incluir colágeno de Tipo V e epítopos domesmo. Como claramente ilustrado em exemplo 3, uma abordagem que podeser usada para identificar e ou seguir pacientes com IPF ou sob um riscoaumentado para desenvolvimento de IPF ou BO ou BOS é medir o nível deanticorpo anti-colágeno de Tipo V em fluidos corporais de paciente.

Outro aspecto inclui tratamento de pacientes diagnosticadoscom condições médicas, ou considerados em terem condições médicas, ouconsiderados sob risco aumentado para desenvolvimento de condiçõesmédicas relacionadas com rejeição autoimune de colágeno encontrado emtecido de pulmão pela administração de uma quantidade terapeuticamenteefetiva e segura de um composto tal como colágeno de Tipo V e várioscompostos antigênicos de colágeno de Tipo V e/ou seus análogos. Estescompostos podem ser administrados por qualquer meio conhecido no campoincluindo alimentação oral, instilação intrapulmonar, inalação, injeção esemelhantes. A quantidade efetiva do composto terapêutico e a duração dotratamento provavelmente dependerá de cada paciente e podem serprontamente calibradas para induzirem um efeito terapêutico, e.g., pelo menosuma supressão parcial de uma resposta autoimune de paciente aos colágenostal como colágeno de Tipo V ou algum seu fragmento.Discussões gerais adicionais do valor terapêutico do uso deepítopos MCH para tratar doenças ou condições médicas envolvendo osistema imune podem ser encontradas em, por exemplo, Patente U.S. de No.6.911.220, publicada por Sachs aos 28 de junho de 2005 e Publicação dePatente US de No. 2003/0078208 Al (Wilkes) publicada aos 24 de abril de2003, ambas as quais são aqui incorporadas como referências em suastotalidades.

Em uma modalidade pacientes diagnosticados com, ouconsiderados sofrendo de, uma doença ou distúrbio pulmonar que inclui ou écausado por uma resposta autoimune podem ser tratados com drogasimunossupressoras, incluindo, por exemplo, Ciclosporina. Para uma discussãogeral adicional de Ciclosporina incluindo uma discussão de alguns de seusefeitos sobre o sistema imune o leitor é direcionado às Patentes U.S. de Nos.6.410.696 publicada por, et al. aos 25 de junho de 2005 e 5.990.274 publicadapor Wang aos 23 de novembro de 1999, ambas as quais são aqui incorporadascomo referências em suas totalidades.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Para determinar se pacientes de pós-transplante de pulmãotambém estavam desenvolvendo autoimunidade específica para colágeno deTipo V, realizamos ensaios de hipersensibilidade de tipo retardado (DTH)usando leucócitos de 8 receptores de transplante de pulmão e de 5 receptoresde transplante renal (que têm síndrome de Goodpasture, uma autoimunidade acolágeno (col) de Tipo IV) e três colágenos diferentes. Como mostrado emFIG. 3 Painel A, células T dos receptores de transplante de pulmãoresponderam ao col(V), mas não ao col(IV) ou col(II), enquanto que células Tdos pacientes com síndrome de Goodpasture tiveram respostas de DTHsignificativamente mais altas ao col(IV) sem respostas ao to col(V) ou col(II).

Esta descoberta chave mostra que pacientes de transplante de pulmãopossuem autoimunidade anti-colágeno de Tipo V.

A seguir determinamos se uma resposta imune anti-colágenode Tipo V poderia ser vista em quaisquer pacientes aguardando umtransplante de pulmão, refletindo assim uma condição pré-existente quepoderia predispor certos pacientes à função de pulmão insatisfatória e àrejeição. Uma análise da resposta de DTH anti-col(V) em 23 pacientes comvárias doenças de pulmão de estágio final aguardando transplante de pulmãomostrou que um grupo específico não possui uma resposta autoimune anti-colágeno de Tipo V. Como mostrado em FIG. 5, pacientes com FibrosePulmonar Idiopática (IPF) exibiram uma resposta de DTH anti-col(V) que foio dobro daquela vista em pacientes com qualquer outra doença. Estadescoberta chave mostra que IPF pode ser causada por uma respostaautoimune ao colágeno de Tipo V.

Para adicionalmente confirmar esta descoberta, pacientesaguardando transplante de pulmão devido a várias causas diferentes foramtestados para sua resposta autoimune a qualquer um de col(V) ou col(II).Como mostrado em FIG. 3 Painel B, apenas células T dos pacientes com IPFexibiram uma resposta autoimune que foi específica para colágeno de Tipo V.

Também é interessante mostrar que os pacientes com IPF transplantados naUniversity of Wisconsin tiveram sobrevivência de enxerto significativamentemenor do que 1 ano (p=0,05) (FIG. 3 Painel C), o que sugere que umaresposta autoimune pré-existente ao colágeno de Tipo V pode resultar emuma perda mais rápida de função de pulmão e morte. Os resultados mostradosem FIG.s 3 e 5 indicam que IPF pode ser causada por uma resposta autoimuneao colágeno de Tipo V, que estes pacientes rejeitarão seus pulmões em umavelocidade mais rápida devido a esta resposta autoimune, e que isto representaum grupo adicional de pacientes que responderão à terapia de tolerância oralcom colágeno de Tipo V.

Para confirmar a idéia de que uma resposta autoimune pré-existente ao colágeno de Tipo V, como vista em pacientes com IPF, resultariaem destruição de pulmão usamos nosso modelo de transplante em rato. RatosWKY são imunizados quer com nada (FIG. 6a), lisozima de ovo de galinha(HEL) (FIG. 6b) quer com colágeno de Tipo V (FIG. 6c) e entãotransplantados com um pulmão de isoenxerto. Como visto, ratos imunizadosquer com nada quer com HEL mostraram patologia de pulmão normal. Emcontraste, ratos com uma resposta imune ativa ao colágeno de Tipo Vdestruíram seu pulmão de isoenxerto dentro de 30 dias. Estes dados estãoadicionalmente consistentes com uma resposta autoimune ao colágeno deTipo V indicando um risco maior de rejeição de tecido de pulmão ou depulmão transplantado do que o esperado em receptores de transplante depulmão que não exibem uma resposta imune ao colágeno de Tipo V.

Exemplo 2

Síndrome de bronquiolite obliterante (BOS) é a causa líder deperda de enxerto após transplante de pulmão. Colágeno Tipo V (col(V)), umcolágeno menor da matriz extracelular de pulmão, tem estado implicado napatogênese de rejeição de aloenxerto de pulmão de rato. Para testar a hipótesede que autoimunidade ao col(V) após transplante de pulmão de humanopredispõe à BOS, analisamos respostas de hipersensibilidade de tipo retardado(DTH) nas respostas de anticorpo e de sangue periférico na lavagembroncoalveolar (BAL).

De 1988-Junho de 2003, todos os transplantes de pulmãorealizados na University of Wisconsin (n=229) foram analisadosretrospectivamente para o risco de predisposição à BOS. DTH ou anticorpospara col(V) ou col(II) foram medidos em 56 destes receptores, 10 controlesnormais, e 25 pacientes aguardando transplante.

Todos os indivíduos consentiram em usar procedimentos deconsentimento informados aprovados por IRB na University of Wisconsin eIndiana University School of Medicine. Dos 229 pacientes recebendotransplantes de pulmão primários na University of Wisconsin Hospital andClinics de 1988-Junho 2003, 3 foram excluídos da análise devido às falhastécnicas.

Todos os pacientes sofreram lavagem broncoalveolar (BAL)de protocolo e biopsia transbronquial (TBB) a 0,5, 1, 3,6, 9 e 12 meses apóstransplante, e mais tarde quando clinicamente indicado. Tecido de TBB foitriado para inclusões de citomegalovírus (CMV) e infiltrados celulares. Ospacientes de estudo de col(V) (n=56) incluíram 29 arrolados em um protocolode estudo DHT de pós-transplante iniciado em 2000, 23 pacientes dos quaisBAL armazenada foram testados retrospectivamente para anticorpo paracol(V), e 4 pacientes foram testados apenas para DTH começando no ano 3-6após transplante. De outro modo, amostras de sangue foram retiradas para oensaio DTH a aproximadamente 6, 12, e 18 meses, e anualmente depois.Doadores de sangue adultos não fumantes, e voluntários sofrerambroncoscopia e coleta de fluido de BAL, serviram como um grupo de controlenegativo. Cinco pacientes após transplante de rim para síndrome deGoodpasture também foram recrutados como doadores de sangue de controleem testes DTH.

BOS de nível I, o ponto final de estudo primário, foidiagnosticada por uma queda sustentada em FEVl para <80% do valor depós-transplante máximo pelo menos 90 dias após transplante (9).

IgG foi purificada por afinidade do fluido de BAL de pacientese controles pela passagem em uma coluna Protein G Sepharosecomercialmente preparada (Pharmacia, Piscataway, NJ) de acordo com oprotocolo do fabricante. Todas as frações eluídas foram congeladas a -80°Caté o uso.

Anticorpos para col(V) foram analisados usando uma técnicade western-blotting como descrito previamente (6), exceto que anticorposespecíficos para isotipo de IgG de cabra anti-humano foram usados paradetecção. Col(II) e col(V) de bovino (Collaborative Biomedical Products-BectonDickinson, Bedford MA) ou col(V) extraído de placenta de humano(10) foram usados como antígenos alvo.

Camundongos CB-17 SClD foram comprados de HarlanSprague Dawley, Inc (Indianapolis, IN) ou foram localmente procriados.Todos os animais foram alojados e tratados de acordo com as diretrizes NIH.

O ensaio trans-vivo DTH foi realizado por co-transferência deantígenos e PBMC de humano nas patas de camundongos SOlD comodescrito previamente (ii). Col(V), col(IV) de humano (Fluka, Inc., Buchs,Suíça) ou col(II) de bovino (5 μg/injeção; Southern Biotech, Birmingham,AL) foram os antígenos de teste. Espessura de para foi medida antes e 24horas após injeção usando um medidor de espessura de mostrador.Inchamento de fundo, devido ao PBMC com tamponador apenas, foisubtraído para determinar a resposta específica para antígeno. Respostas deinchamento de > 25 χ IO"4 polegadas [63,5 χ IO"3 milímetros] sobre fundoforam consideradas positivas (12).

Taxas de sobrevivência livres de BOS foram estimadas usandoos métodos de Kaplan e Meier e comparadas entre grupos usando um teste declassificação em log. Os critérios para uma resposta de Ab ou DTH col(V)negativa foi estringente - pacientes com uma banda anti-Col(V) fracamentepositiva sobre Western blot ou uma resposta de DTH minimamente positiva(25 χ IO"4 polegadas [63,5 χ IO"3 milímetros]) foram consideradas positivas,até mesmo se todos os instantes de tempo foram negativos. Modelo de perigosproporcionais de Cox foi usado para avaliar a associação entre fatores de riscosuspeitos, alguns dos quais foram de tempo variado, e sobrevivência livre deBOS. Valores de ρ < 0,05 foram considerados significativos. Todas asanálises foram realizadas usando programa de computador SAS statistical deversão 6.12, SAS Institute Inc. (Cary, NC). Respostas de DTH a col(V) depré-transplante foram comparadas entre um subgrupo de pacientes com IPF eoutros grupos usando um teste de Kruskal-Wallis.

Referindo-se agora à Tabela 1 (FIG. 7), aqui sumariadas são ademografia e a incidência de BOS em 226 receptores de transplante depulmão na University of WI, Madison. BOS desenvolveu em 86 (38%)pacientes. Houve mais transplantes de pulmão simples (n=133) emcomparação com transplantes de pulmão bilateral (n= 93). O período deacompanhamento médico médio foi de 3,7 anos. A composição da populaçãogeral e aquela do subconjunto de estudo de col(V) foram similares comrespeito à incidência de BOS, ao tempo de acompanhamento médico médio, eproporção de pacientes em cada categoria de doença.

Temos previamente relatado que produção de IgG2 foiseletivamente aumentada em fluido de BAL durante episódios de rejeição dealoenxerto de pulmão (10). Como ilustrado em FIG. IA, anticorpos IgGisolados de BAL de pacientes de transplante de pulmão L3 (perda de enxerto -BOS de nível III) e L41 (sem BOS) se ligaram fortemente em col(V), mas nãoem col(II) em Western blot. Col(V) tanto de bovino quanto de humano foramreconhecidos igualmente por BAL IgG (dados não mostrados), indicando queo epítopo alvo está conservado através das espécies. Em contraste aos L3 eL41, ligação fraca ou ausente em col(V) foi observadas em amostras de BALde L31, que não desenvolveu BOS (FIG.IA); resultados negativos tambémforam vistos com IgG isolada de BAL de voluntários normais (n=10; dadosnão mostrados).

A seguir examinamos a relação de autoimunidade anti-col(V)na periferia, usando o teste trans-vivo DTH, e localmente, por análise deanticorpo BAL, para o desenvolvimento de BOS. O curso clínico, dosmesmos três pacientes, é mostrado em FIG. 1B. Paciente L3 teve umareatividade DTH anti-col(V) forte e específica no tempo inicial após otransplante testado (180 d.), quando FEV-I ainda estava em um nívelmáximo. Uma resposta forte de anticorpo para col(V) também foi detectadaimediatamente antes do desenvolvimento de BOS (retângulo preto), quandovalores de FEV-I estavam oscilando ao redor de 80% de máximo. Ambasrespostas de DTH e de anticorpo ao col(V) foram detectadas usando o iníciode BOS, mas reatividade DTH foi perdida no estágio final de BOS (grau III)no dia 450.

Paciente L41 é um exemplo de um paciente com respostasiniciais fortes ao col(V), mas nenhuma queda sustentada em função dealoenxerto. Anticorpo (2+) anti-col(V) foi detectado nos dias 48 a 213 e todasas amostras PBMC obtidas dos dias 188 a 460 foram DTH-positivas paracol(V). Desde d.500 a resposta de DTH anti-col(V) tem sido variável egeralmente declinando. Após um episódio de rejeição aguda no dia 90, funçãopulmonar foi estabelecida a aproximadamente 82% de FEVl máximo,imediatamente antes de interrupção para BOS-1.

Paciente L31 teve uma resposta de anticorpo fraca ao col(V)no dia 49 e uma resposta de DTH anti-col(V) resposta minimamente positivano dia 400, mas nunca desenvolveu reatividade autoimune forte. O pacientetem mantido excelente função de enxerto por > 5 anos, e na amostra PBMCmais recente (dia 1600) permanece negativo para resposta de DTH anticol(V).

Estes três padrões de respostas de col(V) e função dealoenxerto são representativos daqueles vistos no subgrupo de estudo de 56pacientes. FIG. IC mostra o curso de tempo de pós-transplante de 4 pacientesadicionais em cada categoria. Cada linha representa % de FEVl máx para umúnico paciente e cada símbolo vermelho representa um teste positivo paracol(V) (quer anticorpo em BAL quer inchamento de pata líquido > 25 χ IO"4polegadas [63,5 χ 10" milímetros] no ensaio DTH). Cada símbolo verdeindica um teste com um resultado de anti-col(V) negativo.

Todos os quatro pacientes na primeira categoria (anti-col(V) +,BOS+), como paciente L3, mostraram um resultado de teste de anticorpo ouDTH positivo antes da perda da função de enxerto. Pacientes na terceiracategoria (anti-col(V) BOS-) raramente tiveram uma resposta ao col(V) etodos continuaram livres de BOS com acompanhamento médico de 3-6 anos.Os pacientes na categoria do meio são talvez os mais interessantes porquetodos eles manejaram para manter excelente função de enxerto 1-3 anos apóso transplante a despeito dos testes positivos repetidos para resposta anti-col(V).

Os resultados de uma análise retrospectiva de fatores de riscoassociados com BOS ou perda de enxerto ou BOS sozinha como o ponto finalsão mostrados em Tabela 2 (FIG. 8). Fatores de pré-transplante depredisposição para um risco significativamente mais alto (p<0,05) de BOS napopulação inteira de pacientes incluíram tendo uma ligação inespecífica de 2DR com o doador (RR= 1,64 vs. O ou ligação inespecífica de 1DR), epossuindo uma categoria de doença de doença pulmonar obstrutiva crônica,COPD (RR = 1,7) ou "outra" (RR= 1,9). Fatores de pré-transplante depredisposição para uma incidência menor de BOS ou de perda de enxertoincluíram uma doença original de fibrose cística (CF) ou tendo recebido umtransplante de pulmão bilateral, o tratamento principal para esta categoria dedoença (ambos RR=O,35). Fatores de risco de pós-transplante para BOStambém foram avaliados. Como esperado, a incidência de episódios derejeição aguda foi associada com um risco 1,4 a 1,5 maior de BOS que foielevadamente significativo. Contudo, nem um pulmão de doador CMV+ emum receptor CMV-, nem CMV provado por biopsia no período de pós-transplante, esteve significativamente associado com BOS.

Referindo de novo à FIG. 8, Tabela 2 sumariza a análise defunção insatisfatória (BOS I ou perda de enxerto) ou desenvolvimento deBOS I em 56 receptores de transplante de pulmão analisados para respostas aocol(V) usando um modelo de perigos proporcionais de Cox. Nestesubconjunto de pacientes, rejeição aguda foi de novo risco para funçãoinsatisfatória. RR mais alto para função de enxerto insatisfatória (12,3) foiverificado em pacientes com uma DTH positiva ao col(V) no instante detempo próximo ao início de BOS. Resposta de DTH ao col(II) de controle nãomostrou correlação com desenvolvimento de BOS (RR = 1,0) indicando que aresposta de DTH ao col(V) é um marcador específico de risco de BOS. 2demonstra graficamente a associação de respostas de DTH ao col(V) comdesenvolvimento de BOS. Pacientes com função de pulmão boa (>80% deFEVl máx) no dia 370 (painel de topo) e no dia 760 após transplante (painelde fundo) foram divididos em respondedores col(V)+ vs. col(V)- baseado emanálise de anticorpo e/ou DTH e análise de Kaplan-Meier foi realizada comtempo para BOS I como o ponto final. Mais do que metade dos pacientes comreatividade anti-col(V) ante do instante de tempo desenvolveu BOS dentrodos 2 anos seguintes, enquanto que pacientes com resposta negativa ao col(V)foram predominantemente livres de BOS.

O nível de anticorpos anti-col(V) em BAL estevesignificativamente associado com o desenvolvimento de BOS ou perda deenxerto de qualquer causa (RR = 2,3), e com o risco de apenas BOS (RR =2,08). Quando os dois indicadores, DTH ou anticorpo para col(V), foramcombinados, o RR para BOS ou perda de enxerto foi 12,7 e aquele para BOSnão pôde ser calculado porque todos os pacientes que desenvolveram BOStiveram resposta de anticorpo ou DTH positiva ao col(V) em algum instantede tempo prévio Tabela 2, (FIG. 8).

Com o objetivo de determinar se respostas anti-col(V) vistasem pacientes de pós-transplante de pulmão são simplesmente uma reflexão deuma condição pré-existente que poderia predispor certos pacientes à funçãoinsatisfatória (isto é pacientes com COPD teriam respostas anti-col(VO depré-tratamento mais altas enquanto que aqueles com CF teriam respostas maisbaixas), analisamos a resposta de DTH anti-col(V) em 23 pacientes comvárias doenças de pulmão de estágio final aguardando transplante de pulmão.Como mostrado em FIG. 3 Painel A, pacientes com doença de pulmão noestado mais final não possuem respostas de DTH anti-col(V) que sãosignificativamente diferentes daquela vista em indivíduos normais semdoença de pulmão conhecida. A exceção é pacientes com IPF. A resposta deDTH anti-col(V) nestes pacientes foi o dobro daquela vista em pacientes comqualquer outra doença. O interessante e que pacientes com IPF transplantadosna University of Wisconsin tiveram sobrevivência de enxertosignificativamente menor de 1 ano (p=0,05, dados não mostrados), massobrevivência similar de 5 anos e taxa de desenvolvimento de BOS (Tabela 1).

Em um esforço para determinar se o desenvolvimento deautoimunidade ao colágeno em pacientes de pós-transplante de pulmão foiespecífico para colágeno de Tipo V, realizamos ensaios DTH usando col(II),col(IV), e col(V) em 8 receptores de transplante de pulmão e 5 receptores detransplante renal com síndrome de Goodpasture (autoimunidade a colágenode Tipo IV). Como mostrado em FIG. 3 Painel B, receptores de transplante depulmão responderam ao col(V), mas não ao col(IV) ou col(II), enquanto quepacientes com síndrome de Goodpasture tiveram respostas de DTH ao col(IV)significativamente mais altas sem respostas ao col(V) ou col(II).

Exemplo 3

Ensaio de glóbulo para detecção de respostas imunes mediadaspor anticorpo ou humorais contra colágeno de Tipo V. Este ensaio detectaráanticorpos para colágeno de Tipo V como podem estar presentes em soro e/oufluido de lavagem de pulmão dos pacientes que têm uma resposta autoimuneao colágeno de Tipo V. Glóbulos revestidos com colágeno de Tipo Vjuntamente com reagentes de dicção necessários são proporcionados para esteensaio. O usuário final pode proporcionar soro e/ou fluido de lavagem depulmão, e reagentes comuns tal como PBS ou estes reagentes podem sermontados em um kit, para realizar o ensaio. Resumidamente, um ensaio típicoé como segue:

1) Glóbulos revestidos com estreptavidina (5 um, capacidadede ligação de 10-20 μg/L χ 10/7 glóbulos (Polyscience, Warrington, PA))foram lavados duas vezes com PBS estéril. Glóbulos (1 χ 10/7) foramsuspensos em 100 μΐ, de PBS com 40 μg de colágeno de Tipo V de humano eincubados por 60 minutos a 4°C.

2) Um controle positivo foi gerado pelos seguintesprocedimentos em 1 acima, usando 20 μπι de anticorpo de coelho paraanticorpo anti-colágeno V de humano (bioten) (Abeam, Cambridge, MA).

3) Para cada ensaio, 1 χ IO6 glóbulos conjugados foramlavados duas vezes em PBS5 e incubados em 100 \iL de PBS mais 50 μι desoro de fluido de lavagem de pulmão. Após incubação por 30-minutos natemperatura ambiente, os glóbulos foram lavados três vezes com PBScontendo 10/% FCS.

4) Os glóbulos foram suspensas em 100 μΐ. de PBS estéril+10% FBS e incubados por cerca de 30 minutos na temperatura ambientecom anticorpo secundário. Tipicamente, 5 μΐ, de anticorpo IgG anti-humanoconjugado com R-PE foram usados (Sigma, Saint Louis). Os glóbulos foramlavados três vezes em PBS contendo 10% FCS, suspenso em 300 μΐ, desolução de PBS/FCS e analisados usando um citômetro de fluxo. Osresultados de um exemplo deste ensaio são sumarizados em FIG. 9.

Para o controle positivo, quantidades crescentes de anti-sorosanti-colágeno-V foram adicionadas no ensaio de glóbulo. Como os painéis nolado direito de FIG. 9 ilustram, quantidades aumentadas de anticorpos anti-colágeno V resultam em um deslocamento significativo para a direita do canalfluorescente médio. Assim, este método pode detectar quantidades diferentesde anticorpos presentes em um soro de paciente. Referindo ainda à FIG. 9, ospainéis da esquerda ilustram a detecção de anticorpos anti-colágeno V do sorode quatro pacientes comparado com amostras de soro de indivíduos humanossaudáveis. Como ilustrado pelos traços, uma amostra do paciente #457 mostrao deslocamento maior para a direita, sugerindo que este paciente possui onível mais alto de anticorpos anti-colágeno V. Pacientes #458 e 420 mostramdeslocamentos pequenos indicativos de níveis menores de anticorpo do que opaciente #457, enquanto que, paciente 519 não parece ter quaisqueranticorpos que reagem neste ensaio.

Como mostrado pelos resultados sumariados em FIG. 9,paciente #457 mostra o deslocamento mais alto para a direita sugerindo queeste paciente particular possui o nível mais elevado de anticorpos anti-col(V).

Em contraste, amostras coletadas dos pacientes #458 e #420 ilustram apenasdeslocamentos pequenos em pico fluorescente; enquanto que, paciente #595não parece ter quaisquer anticorpos nesta amostra particular. Estes dados sãoilustrativos de um método para detectar a presença de doença pulmonaridiopática (IPD) ou outra doença ou distúrbio de pulmão baseada emautoimunidade e/ou avaliar a possibilidade de que um dado paciente sofrendode um transplante de pulmão provavelmente rejeitará o órgão transplantado.

Este método de diagnosticar doença de pulmão ou de avaliar umapossibilidade de dado paciente para desenvolver BOS geralmente envolvecoleta de uma amostra de fluido corporal, por exemplo, soros ou fluidointersticial ou tecido do paciente e análise da amostra para a presença deanticorpo anti-colágeno de Tipo V.

Exemplo 4

Indução de tolerância oral, em animais de teste, de um modelopara modulação de uma resposta imune de paciente humano ou animal aocolágeno ou um componente antigênico de colágeno. Ratos machos MHC(RTl)-incompatíveis, livres de patógeno utilizados foram: ratos Fischer 344(F344, RTllvl) Brown Norway (BN, RT ln), e Wistar Kyoto (WKY, RTl1)(250-300 g) no momento do transplante, comprados do Harlan SpragueDawley (Indianapolis, Ind.) ou Taconic (Germantown, N.Y.) e alojados noLaboratory Animal Resource Center at Indiana University School ofMedicine (Indianapolis, Ind.) de acordo com diretrizes da instituição.

Resumidamente, colágeno de Tipo V foi preparado comosegue. Colágeno de Tipo V de humano purificado [col(V)] foi diluído emácido acético 0,005 M (0,5 mg/mL) e armazenado a 4°C até ser usado noensaio. A quantidade de col(V) foi avaliada pela determinação do conteúdo dehidróxi-prolina nas amostras (Woessner, 1961).

Neste teste particular o colágeno de Tipo V foi administradooralmente a ratos machos WKY. Os animais (180-200 g) foram alimentadosquer com 10 μg quer com 50 μg de solução de col(V), col(II) ou col(XI)dissolvidos em 0,5 mL de solução salina por uma gavagem gástrica utilizandoagulha de alimentação de animal de aço inoxidável de ponta de bola decalibre 16 (Braintree Scientific, Braintree, Mass) como previamente descrito(Stark e Ostrow, 1990). Como um controle animais similares foramalimentados com apenas diluente. Animais foram alimentados dia sim, dianão, para oito ou quatro alimentações. Sete dias após a última alimentação,estes ratos receberam aloenxertos de pulmão F344 por transplante ortotópico.Enxertos de pulmão WKY transplantados em receptores WKY (isoenxertos)foram usados como controles.

Respostas de hipersensibilidade de tipo retardado (DTH)foram determinadas por uma modificação dos procedimentos descritos porSayegh et al., 1992; Yoshino et al., 1995; e Yamagami et al., 1999. Emresumo, duas semanas após o transplante de pulmão, ratos WKY de controleou alimentados com WKY receberam 10 esplenócitos F344 derivados dedoador irradiados (3.000 rad) ou de terceira parte (BN) em 30 μΐ, de PBS naaurícula direita por injeção subcutânea (s.c.) usando uma agulha de calibre 26.A aurícula esquerda recebeu um volume igual de diluente para servir como osítio de controle. Um grupo separado de ratos WKY receptores de aloenxertoou inexperientes foi testado com 15 μg de col(V) em volume de 30 μιinjetado na aurícula direita e diluente na esquerda. Ratos WKY inexperientesforam usados como controles negativos. A espessura da orelha foi medidacom um micrômetro (Mitutoyo, Field Tool Supply, Chicago, 111.) em ummodo cego imediatamente antes e 24 h após injeção. Resposta de DTHantígeno-específico foi calculada de acordo com a seguinte fórmula:Inchamento Específico de Orelha = (espessura de orelha direita @ 24 h -espessura de orelha direita @ O h) - (espessura de orelha esquerda @ 24 h -espessura de orelha esquerda @ O h) χ IO"3 mm (Yamagami et al., 1999).Todos os dados relatados como a média de medições triplicadas.

O transplante ortotópico de isoenxertos de pulmão esquerdo(WKY-»WKY), ou aloenxertos (F344 ->WKY) foi realizada comopreviamente descrito (Sekine et al., 1997), utilizando um procedimentoinicialmente descrito por (Marek et al., 1983 e Prop et al., 1985). Similar aorelatório anterior dos inventores (Sekine et al., 1997), sobrevivênciaultrapassou 90% em todos os grupos de transplante. Nenhuma terapiaimunossupressora foi dada em qualquer tempo durante o períodoexperimental.

Pulmões transplantados foram monitorados por radiografias detórax seriais nos dias 1, 6, e 13 após transplante. As mudanças radiográficasforam graduadas como segue: grau 1, normal; grau 2, infiltrados suaves; grau3, infiltrados moderados; e grau 4, infiltrados severos ou opacificaçãocompleta.

Cinco grupos de transplante foram estudados: pulmões deratos WKY transplantados em receptores WKY (WKY—>WKY, isoenxertosde controle); pulmões F344 transplantados em receptores WKY alimentadoscom diluente (F344—»WKY, aloenxertos de controle); pulmões F344transplantados em receptores WKY alimentados com col(V) (F344—> WKYalimentado com col(V), aloenxertos alimentados com col(V)); pulmões F344transplantados em receptores WKY alimentados com col(II) (F344—>· WKYalimentado com col(II), aloenxertos alimentados com col(II)); e pulmõesF344 transplantados em receptores WKY alimentados com col(XI)(F344—»WKY alimentado com col(XI), aloenxertos alimentados col(XI)).

Experimentos preliminares demonstraram que alimentação de diluente nãoteve efeito sobre o desenvolvimento de patologia de aloenxerto, contagens decélulas diferenciais de lavagem broncoalveolar (BAL), ou respostas de DTHcomparados com aloenxertos transplantados em ratos WKY não alimentados.

Fluido de BAL foi coletado de receptores de transplante depulmão anestesiados com cetamina uma e duas semanas após transplante. Emresumo, BAL de pulmões nativos e transplantados foram realizadas porcanulação seletiva de brônquios principais direito e esquerdo com um cateterde calibre 16 seguro por sutura. Durante um período de tempo no qual osbrônquio contralateral foi preso por presilha de 3 mL de PBS estéril (37°C)foram instiladas para dentro de cada brônquio principal e aspiradas.

Sobrenadantes de BAL livres de célula obtidos dos espécimes centrifugadosforam armazenados a -70°C até serem usados. Contagens de célulasdiferenciais de fluido de BAL foram realizadas utilizando microscopia de luzpara contar 300 células por campo de energia alta sobre preparações decitospina para determinar a quantidade de macrófagos, linfócitos, e célulaspolimorfonucleares (PMN) na amostra.

Com o objetivo de detectar a presença de patologia nospulmões, os pulmões transplantados de cada grupo foram colhidos, fixadospor uma instilação intratraqueal de glutaraldeído 4%, seccionados, coradoscom hematoxilina e eosina, examinados sob microscopia de luz, e graduadosde acordo com os critérios histológicos estabelecidos pelo Lung RejectionStudy Group (Yousem et al., 1996) em um modo cego sem conhecimentoprévio do grupo de transplante.

Análise estatística de contagens de linfócitos e de PMN emfluido de BAL foram realizadas inicialmente por ANOVA para determinar sediferenças estavam presentes dentre os grupos. Se diferenças foramverificadas então uma análise post hoc utilizando um teste de Student-Newman-Keuls foi realizada para determinar qual grupo foi diferente. Valoresde ρ <0,05 foram determinados como significativos. Visto que dados paraDTH em ratos WKY inexperientes e de aloenxerto de controle com antígenosdiferentes foram encontrados não-normalmente distribuídos, uma ANOVAbivariada de soma de pontos com interação foi utilizada para determinardiferenças dentre os grupos. Valores de ρ <0,05 foram determinados comosignificativos. Diferenças em respostas de DTH aos alo-antígenos de doadorentre aloenxertos de controle e aloenxertos alimentados com col(V) foramdeterminadas utilizando um teste U de Mann-Whitney. Valores de ρ <0,05foram determinados como significativos. Diferenças entre resultadospatológicos vasculares e de via aérea foram determinados inicialmenteutilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido por uma análise post hocutilizando o teste U de Mann-Whitney. Valores de ρ <0,03 foramdeterminados como significativos.

Os inventores têm previamente mostrado que col(V) é um alvoda resposta imune local aos alo-antígenos de pulmão em camundongos. Aseguir demonstraram que col(V) é reconhecido como um antígeno duranterejeição de aloenxerto de pulmão. Tem sido relatado que respostas de DTHestão correlacionadas com a extensão de rejeição em vários modelos detransplante de órgão diferente de pulmão em roedores (VanBuskirk et ai.,1998; Lowry et ai., 1985; Joo et al., 1995). Como um teste vivo da respostaimune celular, a resposta DHT sistêmica ao alo-antígeno foi realizada. Foramexaminadas as respostas de DTH aos esplenócitos F344, col(V), eesplenócitos BN (terceira parte) em ratos WKY duas semanas apósrecebimento de aloenxertos de pulmão F344 e em ratos WKY inexperientesnão-transplantados. FIG. 10 ilustra que ratos WKY que receberamaloenxertos F344 tiveram respostas de DTH significativas aos esplenócitosF344 [p<0,0001 comparados com ratos WKY inexperientes testados quercom esplenócitos F344 quer com col(V)]. Ratos WKY que receberamaloenxertos F344 também tiveram respostas de DTH significativas ao col(V)[p <0,0001 comparados com ratos WKY inexperientes testados quer comesplenócitos F344 quer com col(V)] (FIG. 11). Estatisticamente, não houvediferenças entre as respostas de DTH de aloenxertos de controle aosesplenócitos F344 e col(V) (p>0,05). Dados mostrando que ratos WKY quereceberam aloenxertos de pulmão F344 não tiveram resposta de DTH aos alo-antígenos de terceira parte (esplenócitos BN, RTln) demonstram que aresposta imune aos aloenxertos F344 também é alo-específica. Em adiçãoestes dados são consistentes com col(V) sendo reconhecido como umantígeno durante a rejeição de aloenxerto de pulmão.

Relatórios anteriores têm mostrado que a administração oral deantígenos que são alvos de resposta imune durante rejeição de aloenxertos,diferente de pulmão, induz tolerância ao órgão doador (Ishido et ai., 1999).

Para determinar se administração oral de col(V) a receptores de aloenxerto depulmão antes de transplante induz tolerância imunológica ao pulmão dedoador, receptores WKY foram alimentados com col(V) antes do transplantecomo descrito acima. Experimentos preliminares demonstraram que oitoalimentações de 10 μg de col(V) dia sim, dia não (dose total de 80 μg)seguidas por transplante ortotópico de pulmão esquerdo sete dias após aúltima alimentação tiveram o efeito mais alto sobre contagens de células deBAL e patologia de rejeição neste modelo. Portanto, este regime dealimentação foi utilizado para todos os estudos subseqüentes. Receptoresalimentados com col(V) sofreram transplante de pulmão esquerdo e foramcolhidos na completitude do período experimental como descrito acima.

FIG. 12 ilustra as contagens de células diferenciais em fluidode BAL dos pulmões transplantados de receptores de isoenxerto WKY decontrole, receptores de aloenxerto WKY de controle, e receptores dealoenxerto WKY alimentado com col(V) duas semanas após transplante, eratos WKY normais. Não houve diferenças em contagens de célulasdiferenciais de BAL em pulmões normais em comparação com pulmões deisoenxerto. Similar a (Yagyu et al, 1990), PMN1S e linfócitos foramsignificativamente aumentados em BAL de aloenxerto de controle comparadocom pulmões de isoenxerto ou normais (p<0,039 para PMN's e p<0,00001para linfócitos). Em contraste, alimentação de col(V) antes do transplanteresultou em uma redução significativa em linfócitos e PMN' s de BALcomparados com aloenxertos de controle (p<0,023 para PMN1S e p<0,0001para linfócitos). Rejeição aguda de aloenxerto está normalmente associadacom um aumento de contagens de células totais em fluido de BAL dealoenxerto (Hirt et al., 1999). Contudo, duas semanas após o transplante, ospulmões de aloenxerto WKY de controle estão normalmente sofrendo derejeição severa e devido à destruição do aloenxerto, BAL suficiente não pôdeser realizada confiadamente para determinar as contagens de células totais deBAL. Em contraste, receptores de aloenxerto alimentados com col(V)mostraram rejeição menos severa que permite BAL mais fácil resultando emcontagens de células mais altas. Por estes motivos, comparação de contagensde células totais entre os grupos não puderam ser feitas. Coletivamente, estesdados demonstram que imunização oral com col(V) está associada commenos PMN's e linfócitos em fluido de BAL de aloenxerto durante rejeiçãoaguda.

Para determinar se alimentação com col(V) diminuiu asrespostas de DTH aos alo-antígenos, receptores de aloenxerto WKY decontrole e receptores de aloenxerto WKY alimentados com col(V) foramdesafiados na aurícula direita com esplenócitos alogeneicos (F344) e PBS naaurícula esquerda. A resposta de DTH foi medida 24 mais tarde e oInchamento Específico de Orelha foi determinado. Como mostrado em FIG.10, receptores de aloenxerto WKY de controle não tratados sofrendo rejeiçãoaguda tiveram uma resposta de DTH forte após desafio com antígeno dedoador. Em contraste, receptores de aloenxerto WKY alimentados com col(V)que tiveram rejeição de aloenxerto menos severa também tiveram umaredução significativa da resposta de DTH aos antígenos de doador.

A resposta imune enfraquecida ao alo-antígeno induzida porcol(V) pôde ter sido devido à hiporresponsividade imune global (Faria eWeiner 1999), e não tolerância. Portanto, para determinar se ratos WKYalimentados com col(V) poderiam responder aos outros antígenos, estes ratosreceberam lipopolissacarídeo (LPS) (Sigma, St. Louis, MO.) querintratraquealmente (200 μg/kg a 1 mg/kg) quer intravenosamente (1-5mg/kg), que são doses conhecidas em induzirem reações inflamatórias severasno pulmão e sistemicamente 24 a 48 h após injeção ou instilação (Delclaux etai. 1999). Ratos foram desafiados uma semana após sua última alimentaçãode col(V). A doença induzida é análoga à pneumonia e sepse causadas porbactérias gram-negativas. Similar aos ratos WKY normais, instilação de LPSem pulmões ou injetados I.V. em ratos WKY alimentados com col(V) induziudoença severa (pêlo desordenado e prostração) e inflamação em pulmões dereceptor. Estes dados mostram que alimentação com col(V) antes detransplante preveniu rejeição de aloenxerto por indução de tolerância, e nãohiporresponsividade imune global, aos antígenos de doador.

Coletivamente, estes dados ilustram que col(V), mas nãocol(II) ou col(XI), infra-regula a rejeição de aloenxerto de pulmão porindução de tolerância oral e não por hiporresponsividade imune global.Ademais, tolerância oral induzida por col(V) infra-regula respostas de DTHaos alo-antígenos de doador.

Contagens diminuídas de PMN e linfócito em fluido de BALde aloenxerto estão associadas com lesões histológicas e radiográficas menosseveras durante rejeição aguda de aloenxerto de pulmão. Para determinar ataxa de progressão de infiltrados de pulmão, receptores de transplante forammonitorados por radiografias de tórax seriais nos dias 1, 6, e 13 apóstransplante e graduados como descrito acima. Isoenxertos de controle nãopossuíram quaisquer infiltrados pulmonares em todos os instantes de tempomonitorados (FIG. 12A). Nos aloenxertos de controle os raios-X seriaisrevelaram desenvolvimento gradual de infiltrados no pulmão esquerdo 6 apóstransplante que resultou em infiltrados severos e completa opacificação doaloenxerto pelo final da segunda semana (FIG. 12B). Contudo em aloenxertosalimentados com col(V) o desenvolvimento meio de extração infiltrados foimuito menor comparado com controles. Os raios-X foram normais no dia 6 einfiltrados apenas suaves estiveram presentes duas semanas após o transplante(FIG. 12C).

Referindo-se agora à FIG. 13 os painéis superiores mostram aanatomia macroscópica de pulmões WKY de isoenxerto e nativo, e ospulmões de isoenxerto e nativo de ratos de aloenxerto de controle dealoenxerto alimentados com col(V) colhidos duas semanas após o transplante.FIG. 13 A mostra que o pulmão de isoenxerto (esquerdo-L) e o pulmão nativo(direito-R) de receptor rato WKY são de aparência normal. Em contraste, opulmão de aloenxerto esquerdo no grupo de aloenxerto de controle foi de cormarrom escura, encolhido, e de uma consistência firme comparado com opulmão nativo (FIG. 13B). Como um resultado de inflamação e rejeição,fusão da pleura parietal e visceral foi normalmente observada em pulmões dealoenxerto de controle. O pulmão esquerdo transplantado em receptores dealoenxerto alimentados com col(V) (FIG. 13C) teve a aparência do pulmão deisoenxerto ou nativo (de controle) (FIG. 13 A) e sem adesões pleurais.

Menos PMN's e linfócitos em fluido de BAL de aloenxerto,infiltrados menos severos nos aloenxertos nos raios-X de tórax, e anatomiamacroscópica preservada sugeriram que alimentação com col(V) antes dotransplante infra-regulou o desenvolvimento de patologia de rejeição. Ospainéis inferiores de FIG. 14 mostram histologia representativa de isoenxertosde controle, aloenxertos de controle, e aloenxertos alimentados com col(V)duas semanas após o transplante. Similar ao relatório anterior (Prop et ai.,1985), todos os pulmões de isoenxerto de controle tiveram histologia normalsem sinais de rejeição (FIG. 14D). aloenxertos de controle revelaraminfiltrados extensivos de células mononucleares perivasculares,peribronquiais, e alveolares consistentes com rejeição aguda severa (FIG.14E). Em contraste, infiltração perivascular e peribronquial apenas suave amoderada foi detectada em pulmões de aloenxerto alimentados com col(V)(FIG. 14F).

Tabela 3 em FIG. 15 mostra a graduação de patologia derejeição duas semanas após transplante usando critérios padrão. Rejeiçãovascular aguda foi graduada em A0-A4 de acordo com a presença e extensãode infiltrados de células mononucleares perivasculares, e rejeição aguda devia aérea graduada B0-B4 de acordo com a extensão e a intensidade dainflamação da via aérea (Yousem et al. 1996). Todos os pulmões de controlede isoenxerto revelaram estrutura normal do pulmão (A0±0, B0±0). Osaloenxertos WKY de controle tiveram rejeição severa vascular e de via aérea(A3,8±0,2, B4±.0, respectivamente). Em contraste, aloenxertos WKYalimentados com col(V) mostraram rejeição suave a moderada vascular e devia aérea (A2,8±0,2, B2,6±0,2, respectivamente), aloenxertos alimentadoscomo col(II) e col(XI) tiveram patologia de rejeição similar à dos aloenxertosnão tratados (FIG. 15). Estes dados mostram que aloenxertos WKYalimentados com col(V) tiveram patologia de rejeição menos severa do quetodos os outros aloenxertos (p<0,028 para resultados de A e p<0,009 pararesultados de B).

Estes dados mostram que alimentação com col(V) infra-regulaa rejeição de aloenxerto de pulmão indicando que receptores de aloenxerto depulmão tornados oralmente tolerantes devem possuir uma resposta de DTHdiminuída após re-desafio com alo-antígenos de doador. Para determinar sealimentação com col(V) diminuiu respostas imunes aos alo-antígenos, osreceptores de aloenxerto de controle e receptores de aloenxerto alimentadoscom col(V) foram desafiados na aurícula direita com esplenócitos F344alogeneicos totais e com PBS na aurícula esquerda. A resposta de DTH foimedida 24 h mais tarde e o Inchamento Específico de Orelha foi determinado.

Como mostrado em FIG. 14, receptores de aloenxerto de controle não tratadossofrendo rejeição aguda severa tiveram uma resposta de DTH forte apósdesafio com antígeno de doador (mesmos dados para aloenxertos de controlemostrados em FIG. 10). Em contraste, os receptores de aloenxertoalimentados com col(V) tiveram uma resposta de DTH significativamentereduzida ao antígeno de doador (p<0,02 comparados com aloenxerto dedoador). Estes dados indicam que alimentação com col(V) antes dotransplante preveniu rejeição de aloenxerto pela indução de tolerância aosantígenos de doador.

Duas semanas após o transplante, o tempo de início de rejeiçãosevera (grau 4), pulmões de aloenxerto sofreram BAL para determinação decontagens de células diferenciais, e coleta de soro. Pulmões nativos e detransplante foram colhidos em bloco, fixados, seccionados, corados, egraduados para patologia de rejeição usando critérios padrão (Yousem et ai.1996). Todas as interpretações e graduação de patologia de rejeição foramrealizadas por Oscar W. Cummings, M.D., patologista pulmonar, que estavacego para os grupos de tratamento, como previamente relatado (Wilkes et ai.1998). FIG. 14 mostra a anatomia macroscópica de pulmões WKY deisoenxerto e de pulmões de aloenxerto e nativos dos aloenxertos WKY decontrole, e receptores de aloenxerto WKY alimentado com col(V) colhidosduas semanas após transplante. Em animais de aloenxerto WKY de controle,FIG. 14B mostra que o pulmão transplantado (esquerdo) foi de cor marromescura, e encolhido comparado com o pulmão nativo. Em contraste, o pulmãoesquerdo transplantado em receptores de aloenxerto WKY alimentados comcol(V) (FIG. 14C) teve a aparência do pulmão nativo (normal) ou deisoenxerto (FIG. 14A). A aparência macroscópica dos pulmões de aloenxertoem ratos WKY alimentados com col(II), ou col(XI) foi similar à dos pulmõesde aloenxertos não tratados. Como esperado, pulmões de isoenxertoparecerem normais (FIG. 14A).

FIG. 14 também ilustra histologia de isoenxertos de WKY decontrole, aloenxertos de WKY de controle, e aloenxertos WKY alimentadoscom col(V) duas semanas após o transplante. Pulmões de isoenxerto WKYtiveram histologia normal (FIG. 14D). aloenxertos WKY de controlerevelaram infiltrados extensivos de células mononucleares perivasculares,peribronquiais, e alveolares consistentes com rejeição aguda severa (FIG.11E). Em contraste, infiltração apenas suave a moderada perivascular ebronquial foi detectada nos pulmões WKY alimentados com col(V) (FIG.14F). Pulmões de aloenxerto em ratos WKY alimentados com col(II) oucol(XI) tiveram patologia similar à de pulmões de aloenxerto não tratados(veja FIG. 15).

Embora, tenha sido mostrado que tolerância oral é benéfica eminfra-regulação de alorreatividade em órgãos diferentes de pulmão (Ishido etai., 1999), tolerância oral em transplante de pulmão foi primeiro relatada emWilkes Pedido de Patente U.S. de No. 10/243.797, depositado aos 13 desetembro de 2002. Utilizando um modelo de transplante de pulmão em rato,dados na presente invenção mostram que administração oral de col(V) areceptores de aloenxerto de pulmão antes do transplante de pulmão infra-regula as respostas de rejeição. Análises imunológica, radiológica, ehistológica de receptores alimentados com col(V) comparados com receptoresde aloenxerto de controle mostram que alimentação de col(V) está associadacom contagens diminuídas de PMN e de linfócito em fluido de BAL dealoenxerto, infiltrados menos severos nos aloenxertos em raios-X de tórax,preservação de anatomia macroscópica do aloenxerto, e redução de patologiade rejeição. Finalmente, receptores de aloenxerto tornados oralmentetolerantes têm respostas de DTH diminuídas aos alo-antígenos de doador.

Previamente tem sido mostrado que col(V) é um alvo deresposta imune local aos alo-antígenos em camundongos. Colágeno de Tipo(V) é um colágeno de Tipo menor presente no pulmão, localizado nos tecidosconjuntivos peribronquiais, interstício alveolar, e membrana basal capilar.

Tem sido mostrado que estes tecidos são sítios de lesões patológicas emresposta aos alo-antígenos nos modelos murinos de inventor (Wilkes et al.,1999) e são sítios de atividade de rejeição em receptores de aloenxerto depulmão de humano (Trulock, 1997).

Administração oral de antígenos é um método efetivo deindução de tolerância à célula-T periférica. Este fenômeno muitas vezesreferido à tolerância oral, tem sido bem estudado em vários modelos dedoenças autoimunes em animais incluindo encefalomielite, uveíte, diabetes,miastenia grave, e artrite. Contudo, os mecanismos para induzir tolerância nãosão completamente entendidos. Todos os mecanismos conhecidos paraindução de tolerância, incluindo anergia clonal, deleção clonal, e regulaçãopor supressão ativa mediada por IL-4, IL-10, ou TGF-β podem ter um papelem tolerância oral (Faria e Weiner, 1999). Geralmente, é relatado que dosesmaiores de antígeno induzem anergia ou deleção clonal (Chen et al., 1995;Whitacre et al., 1991), enquanto que doses baixas induzem regulação decitocina e supressão de ativação (Faria e Weiner, 1999; Chen et al., 1994). Nomodelo de transplante cardíaca em animal, tem sido mostrado que aadministração oral de esplenócitos alogeneicos é efetiva em indução detolerância pelo desvio da ativação de Thl e estimulação seletiva de induçãode citoninas inibitórias derivadas de Th-2 tal como IL-4 (Ishido et al., 1999).

Ratos WKY (RTl1) e F344 (RTl1V1) machos, MHC (RTl)-incompatíveis (250-300 g), livres de patógeno, naturais, foram utilizados paracirurgia de transplante. Todos os ratos foram adquiridos de Harlan SpragueDawley (Indianapolis, Ind.). O transplante ortotópico de aloenxertos depulmão esquerdo foi realizada como previamente relatado (Sekine et al.1997), e utilizou um procedimento descrito por Marck e colegas (1983). Ratosnão receberam qualquer imunossupressão. Patologia de rejeição foi graduadaem vários instantes de tempo após o transplante. O modelo de transplanteF344-»WKY está associado com o desenvolvimento de rejeição aguda suave(grau 1) no final da primeira semana, rejeição moderada a severa (grau 2-3)no final da 2a semana, e rejeição severa de grau 4 no final da 3a semana após otransplante (Matsumura et al. 1995). Em adição, o modelo F344-»WKY é oúnico modelo em animal de transplante de pulmão que desenvolvebronquiolite obliterante (BO) reprodutivamente (Hirt et al. 1999). Portanto,este modelo oferece a oportunidade única para estudar a patogênese serejeição aguda e crônica.

Regimes de alimentação diferentes foram testados paraobservar quaisquer diferenças na indução de tolerância oral. Dados mostramque as alimentações múltiplas de dose baixa de col(V) (10 μg) foram maissupressivas de episódios de rejeição comparadas como doses maiores (50 μg).Assim, no modelo de tolerância oral aqui usado, regulação por citocinas Th2(IL-4, IL-10) ou supressão ativada mediada por TGF-β também parecedesempenhar um papel importante em indução de tolerância.

A indução de tolerância de transplante tem se tornado umobjetivo maior da pesquisa de transplante, e no passar dos anos técnicasdiferentes têm sido utilizadas para induzir tolerância de transplante. Tem sidomostrado que transfusão de sangue específica de doador (Zheng et al., 1999),transplante de medula óssea (Huang et al., 2000), rejeição tímica de célulasalogeneicas (Garrovillo et al., 1999), ou imunização sistêmica com peptídeosderivados de MHC de doador (Sayegh e Krensky, 1996) induzem tolerânciade transplante em vários modelos animais. Contudo, estas técnicas teriamutilidade limitada no receptor de aloenxerto de pulmão potencial devido aofato de que as células de doador utilizadas para indução de tolerância nãoestariam disponíveis em tempo suficiente para induzir tolerância antes dotransplante. Em modelos autoimunes experimentais de tolerância oral de dosebaixa, células regulatórias após implantação de tolerância oral são ativadasem um modo específico de antígeno mas suprimem em um modo não-específico de antígeno. Portanto, pode não ser necessário, oralmenteadministrar uma proteína capaz de induzir células regulatórias que secretamcitocinas supressoras (Faria e Weiner, 1999). O modelo de tolerância oral emtransplante de pulmão aqui usado mostra que col(V) oralmente administrado,que não é específico de doador, é capaz de suprimir alorreatividade e induzirtolerância de transplante. Os inventores prevêem que o tratamento oral dereceptores de transplante com col(V) antes do transplante proporcionaráterapia para prevenção de rejeição em transplante de pulmão e paratratamento de doenças conhecidas ou consideradas em serem causadas poruma reação autoimune ao colágeno de Tipo V e ou seus componentesantigênicos. Para discussão adicional dos resultados, relatados em exemplos 4a 10 incluindo figuras e referências lá citadas o leitor é direcionado paraPedido de Patente U.S. 10/243.792 depositado aos 13 de setembro de 2002, deWilkes, que agora é Publicação de Patente U.S. de No. 2003/0078208 Al, queé aqui incorporada como referência em sua totalidade.

Exemplo 5

Elucidação de colágenos e peptídeos MHC-"semelhantes"adicionais úteis para a prevenção de rejeição de aloenxerto e para tornaremanimais tolerantes aos colágenos e moléculas semelhantes a colágeno. Ratosmachos, MHC (RTl)-incompatíveis, livres de patógeno, foram utilizados parao estudo: ratos Wistar Kyoto (WKY, RTl1), Fischer 344 (F344, RTllvl) eBrown Norway (BN, RTln) (250-300 g no momento do transplante). Todosos ratos foram adquiridos de Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, Ind.) ealojados no Laboratory Animal Resource Center at Indiana University Schoolof Medicine (Indianapolis, Ind.) de acordo com as diretrizes institucionais.

Colágeno Tipo II [col(II)] para uso no experimento foi isoladode cartilagem canina como previamente relatado (Maves et ai. 2000), ouadquirido de Collaborative Biomedical Products, Bedford, Mass. Ambas aspreparações foram solubilizadas em ácido acético 0,005 M e dialisadas paradar uma concentração final de 0,5 mg/mL.

Colágeno bovino de Tipo XI [col(XI)] de cartilagem fetalbovina (Morris e Bachinger 1987) foi adquirido de Biogenesis, Sandown,N.H. e diluído em ácido acético 0,005 M (0,5 mg/mL) e armazenado a 4°Caté ser usado.

Colágeno de Tipo V de humano [col(V)], extraído de placentade humano e purificado pro precipitação diferencial por NaCl (Mares et al.2000), foi presente de Dr. Jerome Seyer (VA Hospital, Hampton, Va.). Emresumo, tecidos de placenta foram cominuídos, lavados, e suspensos em ácidoacético 0,5 M contendo NaCl 0,5 M, e digeridos por pepsina a 4°C.Sobrenadantes foram aspirados dos espécimes centrifugados, a pelota foicoletada e o procedimento de extração foi repetido. Os sobrenadantes foramcombinados de dois digeridos, e col(V) foi purificado dos sobrenadantes porprecipitação diferencial por NaCl do ácido acético 0,5 M (Maves et al. 2000).O col(V) intacto foi diluído em ácido acético 0,005 M (0,5 mg/mL) até o uso.A quantidade de colágenos foi avaliada por determinação do conteúdo dehidróxi-prolina nas amostras como previamente relatado (Mares et al. 2000).

Colágeno como preparado conforme descrito acima foiadministrado oralmente a ratos WKY. Os ratos foram alimentados com 10 μgde col(II), col(V), ou col(XI) dissolvidos em 0,5 mL de solução salina poruma gavagem gástrica utilizando uma agulha de alimentação de animal de açoinoxidável de ponta de bola de calibre 16 (Braintree Scientific, Braintree,Mass.). Animais de controle foram alimentados com diluente sozinho.Animais foram alimentados dia sim, dia não por oito alimentações. Sete diasapós a última alimentação, estes ratos foram utilizados como receptores dealoenxertos de pulmão (descrito abaixo).

O transplante ortotópico de isoenxertos de pulmão esquerdo(WKY—»WKY), ou de aloenxertos (F344->WKY) foi realizada comopreviamente descrito (Sekine et al. 1997), utilizando um procedimentopreviamente descrito, e (Prop et al. 1985). Em resumo, após os ratos doadores(F344 ou WKY) terem sido anestesiados com uma injeção i.m. de cetamina(40 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg), o pêlo do tórax foi raspado, incisão deesternotomia foi feita, e o coração e os pulmões foram removidos em bloco. Opulmão esquerdo foi ressecado e solução de Ringer lactada heparinizada foiadicionada por infusão na artéria pulmonar. O pulmão do doador foienvolvido em gaze estéril com solução salina e deixado sobre gelo (4°C) emum bécher estéril até transplante.

Ratos receptores foram anestesiados com uma injeção s.c. deatropina (0,05 mg/kg), seguida por uma inalação de halotano 2%. A via aéreafoi canulada com um cateter de Teflon de calibre 14 e o rato foimecanicamente ventilado usando um ventilador de roedor (AnalyticalSpecialties Co., St. Louis, Mo.) utilizando oxigênio 100%, e a inalação deisoflurano 1,5-2% para manutenção de anestesia. Uma vez feita a incisão detoracotomia no 4o espaço intercostal esquerdo, e hemostatos posicionados nobrônquio e vasos pulmonares esquerdos, o pulmão esquerdo foi ressecado. Osvasos pulmonares do pulmão do doador foram ligados por anastomose noreceptor por um manguito de plástico e suturas de seda 7-0 (Kono, Chiba,Japão). Os brônquios de doador e de receptor foram suturados utilizandosuturas Prolene 8-0 s (Ethicon, Sommerville, N.J.). Imediatamente após acompletitude da anastomose do brônquio, o hemostato foi removido eventilação foi restaurada. Após o fechamento da incisão de toracotomiaesquerda sobre um tubo de tórax de calibre 16 e utilizando sutura de seda 3-0(Ethicon), manutenção de anestesia foi descontinuada e o animal foipermitido se recuperar. Uma vez continuada a respiração espontânea, a cânulafoi removida da via aérea, e o tubo de tórax foi removido. O tempo isquêmicodo pulmão de doador foi de aproximadamente Iheo tempo de operação totalpara colheita e transplante do pulmão de doador foi de aproximadamente 2 h.

Todos os procedimentos de transplante foram realizados por Κ. Y. sob ummicroscópico de cirurgia e (Micro Tech, Colorado Springs, CO.) sobcondições estéreis. O modelo de transplante F344->WKY está associado como desenvolvimento de rejeição aguda suave no final da primeira semana erejeição agida moderada a severa no final da segunda semana (Matsumura etal. 1995). Sobrevivência ultrapassou 90% em todos os grupos de transplante.Terapia de imunossupressão não foi dada em nenhum tempo durante operíodo experimental.

Pulmões transplantados foram monitorados por radiografias detórax seriais nos dias 1, 6, e 13 após transplante. As mudanças radiográficasforam graduadas como segue: grau 1, normal; grau 2, infiltrados suaves; grau3, infiltrados moderados; e grau 4, infiltrados severos ou opacificaçãocompleta.

Cinco grupos de transplante foram estudados: pulmões deratos WKY transplantados em receptores WKY [isoenxertos de controle];pulmões F344 transplantados em receptores WKY alimentados com diluente[aloenxertos de controle]; pulmões F344 transplantados em receptores WKYalimentados com col(V)- [aloenxertos alimentados com col(V)]; pulmõesF344 transplantados em receptores WKY alimentados com col(II)[aloenxertos alimentados com col(II)]; e pulmões F344 transplantados emreceptores WKY alimentados com col(XI)- [aloenxertos alimentados comcol(XI)].

Fluido de lavagem broncoalveolar (BAL) foi coletado dosreceptores de transplante de pulmão anestesiados com cetamina duas semanasapós o transplante como previamente relatado (Sekine et al. 1997). Emresumo, BAL de pulmões nativo e transplantado foram realizadas porcanulação seletiva de brônquios principais direito e esquerdo com cateter decalibre 16 seguro por sutura. A amostra foi coletada enquanto se prendia comgrampo o brônquio contralateral, alíquotas de 3 mL de PBS estéril (37°C)foram instiladas em cada brônquio principal e aspiradas. Sobrenadantes deBAL livres de células obtidos dos espécimes centrifugados foramarmazenados a -70°C até serem usados. Contagens de células diferenciais defluido de BAL foram realizadas utilizando microscopia de luz para contar 300células por campo de energia alta sobre preparações de citospina paradeterminar a quantidade de macrófagos, linfócitos, e célulaspolimorfonucleares (PMN).

Respostas de hipersensibilidade de tipo retardado (DTH)foram determinadas por uma modificação de um procedimento descrito por(Yamagami et al. 1999). Em resumo, duas semanas após transplante depulmão, ratos WKY alimentados com col(V) e de controle receberam 10esplenócitos de terceira parte (BN) ou esplenócitos F344 derivados de doadorirradiados (3.000 rad) em 30 μι de PBS na aurícula direita por injeção pors.c. usando uma agulha de calibre 26. A aurícula esquerda recebeu um volumeigual de diluente, e serviu como o sítio de controle. Ratos WKY inexperientesforam controles negativos. Um grupo separado de ratos WKY inexperientesou receptores de aloenxerto foi testado com 15μg de col(II), col(V), oucol(XI) em volume de 30 injetado na aurícula direita e diluente naesquerda. A espessura da orelha foi medida com um micrômetro (Mitutoyo,Field Tool Supply, Chicago, 111.) em um modo cego imediatamente antes e24 h após injeção. Resposta de DTH específica de antígeno foi calculada deacordo com a seguinte fórmula: Inchamento Específico de Orelha =(espessura de orelha direita @ 24 h - espessura de orelha direita @ 0 h) -(espessura de orelha esquerda @ 24 h - espessura de orelha esquerda @ 0 h) χ10"3 mm (Yamagami et al., 1999). Todos os dados relatados como a média demedições triplicadas.

Em experimentos separados, ratos WKY inexperientes oualimentados com col(V) foram inicialmente vacinados com 100 μg dealbumina de soro bovino (BSA) baixa em endotoxina (Sigma, St. Louis)dissolvidos em 100 μι de uma emulsão de adjuvante (Titermax, CytRx Corp.,Norcross, Ga.). Cada rato foi inicialmente vacinado s.c. com a emulsão nabase da cauda. Sete dias mais tarde os ratos foram desafiados com solução deBAS agregada por calor a 2% na aurícula direita e diluente na esquerda(Henningsen et al. 1984). Ratos não ν vacinados foram controles para estesestudos. A espessura de orelha foi medida imediatamente antes e 24 h apósinjeção e o Inchamento Específico de Orelha foi calculado como descritoacima.

Neutralização de TGF-β no sítio DTH foi realizada por umamodificação de um procedimento descrito (Bickerstaff et al. 2000). Emresumo, duas semanas após o transplante de pulmão, cratos WKYalimentados com col(V) receberam IO7 esplenócitos F344 derivados dedoador irradiados (3.000 rad) misturados com 5μg de Ab policlonal degalinha anti-TGF-β de rato, ou 5μg de Ab policlonal de cabra anti-IL-4 ou IL-10 de rato (ali R&D Systems, Minneapolis, Minn.) em 30 μι de PBS naaurícula direita por injeção s.c. usando uma agulha de calibre 26. A aurículaesquerda recebeu um volume igual de diluente, e serviu como o sítio decontrole. Para controles negativos, um grupo separado de aloenxertosalimentados com col(V) recebeu 10 esplenócitos F344 derivados de doadorirradiados (3.000 rad) misturados com 5 μg de imunoglobulinas de galinha decontrole ou imunoglobulinas de cabra de controle (R&D Systems,Minneapolis, Minn.) na aurícula direita e diluente na esquerda. O InchamentoEspecífico de Orelha foi determinado como descrito acima. Imunoglobulinasde controle não tiveram efeito sobre a resposta de DTH.

Como um modelo de lesão aguda de pulmão instilaçãoalveolar ou intravenosa de lipopolissacarídeo (LPS) (Sigma, St. Louis, MO)foi realizada por uma modificação de um procedimento descrito por (O'Learyet al. 1997). Resumidamente, ratos WKY normais ou WKY alimentados comcol(V), uma semana após a última alimentação, foram anestesiados com umainjeção s.c. de atropina (0,05 mg/kg), seguida por uma inalação de halotano2%. A via aérea foi canulada com um cateter de Teflon de calibre 14 e o ratofoi mecanicamente ventilado com um ventilador de roedor (AnalyticalSpecialties Co., St. Louis, Mo.) utilizando oxigênio 100%, e a inalação deisoflurano 1,5-2% para manutenção de anestesia. Após desaparecimento derespiração espontânea, LPS (1 mg/kg a 1 mg/mL) foi instilado na via aérea eesta foi mecanicamente ventilada por 10 minutos. Manutenção de anestesiafoi descontinuada e o animal foi permitido retornar à consciência. Uma vezcontinuada a respiração espontânea, a cânula foi removida da via aérea. Emexperimentos separados, ratos foram injetados intravenosamente nas veias dacauda com LPS (4 mg/kg a 1 mg/mL). 24 h após o desafio, BAL foi realizadae os pulmões foram colhidos para avaliação de patologia.

Níveis de TGF-β em soro dos grupos experimentais foramquantificados por ELISA utilizando o sistema de imunoensaio TGF-β 1(Promega, Madison, Wis.) de acordo com o protocolo do fabricante. Níveis deIL-4 e IL-IO em soro foram quantificados por ELISA utilizando kits deimunoensaio Cytoscreen (BioSource International, Camarillo, Calif.) deacordo com o protocolo do fabricante. As sensibilidades dos ensaios de TGF-β, IL-4, e IL-IO foram 32, 2, e 5 pg/mL, respectivamente.

Patologia foi avaliada pelo exame de pulmões nativos etransplantados de cada grupo. Amostras de pulmão foram colhidas, fixadas,seccionadas, coradas, e graduadas para patologia de rejeição usando critériospadrão (Yousem et al. 1996) por um patologista (O. W. C.) em um modo cegosem conhecimento prévio do grupo de transplante como previamente relatado(Sekine et al. 1997).Análise estatística de contagens de linfócitos e de PMN emfluido de BAL foram realizadas inicialmente por ANOVA para determinar sediferenças estavam presentes entre os grupos. Se diferenças foram verificadasentão uma análise post hoc utilizando um teste de Student-Newman-Keuls foirealizada para determinar qual grupo foi diferente. Valores de ρ <0,05 foramdeterminados como significativos. Visto que dados para DTH em ratos WKYinexperientes e de aloenxerto de controle com antígenos diferentes foramencontrados não-normalmente distribuídos, uma ANOVA bivariada de somade pontos com interação foi utilizada para determinar diferenças entre osgrupos. Valores de ρ <0,05 foram determinados como significativos.Diferenças em respostas de DTH aos alo-antígenos de doador entrealoenxertos de controle e aloenxertos alimentados com col(V) foramdeterminadas utilizando um teste U de Mann-Whitney. Valores de ρ <0,05foram determinados como significativos. Diferenças entre resultadospatológicos vasculares e de via aérea foram determinados inicialmenteutilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido por uma análise post hocutilizando o teste U de Mann-Whitney. Valores de ρ <0,03 foramdeterminados como significativos. O teste t de Student para comparaçõesmúltiplas foi utilizado para a análise de citocinas. Valores de ρ < 0,05 foramdeterminados como significativos.

Respostas de DTH aos antígenos de doador, um teste in vivode imunidade celular, tem sido relatadas como correlacionadas com aextensão de rejeição em vários modelos de transplante de órgão diferente depulmão em roedor (VanBuskirk et al. 1998; Lowry et al. 1985). O presenteinventor tem relatado que col(V) é um alvo da resposta imune local aos alo-antígenos de pulmão em camundongos (Mares et al. 2000). Portanto, foideterminado que a respostas de DTH sistêmicas ao alo-antígeno em ratosinexperientes e receptores de aloenxerto de pulmão para determinar se col(V)é reconhecido como um antígeno durante rejeição de aloenxerto de pulmão.Também foi determinado se receptores de aloenxerto de pulmão desenvolvemuma resposta de DTH ao col(V). Respostas de DTH aos esplenócitos F344(doador) e ao col(V) foram examinadas em ratos WKY duas semanas apósrecepção de aloenxertos de pulmão F344, o tempo no qual rejeição agudasevera começa a se desenvolver (Matsumura et al. 1995), e em ratos WKYinexperientes, não-transplantados. Para determinar a especificidade deresposta de DTH aos alo-antígenos e ao col(V), foram determinadas respostasde DTH ao col(II), col(XI), e antígenos de terceira parte, esplenócitos BN.Col(II), um componente maior da cartilagem articular, não está presente nopulmão, e não é homólogo ao col(V) (Smith et al. 1985). Em contraste col(XI)possui homologia ao col(V) (Morris e Bachinger 1987), mas similar aocol(II), é verificado em cartilagem articular e não está presente no pulmão.

Por estes motivos, col(II) e col(XI) serviram como controles para col(V).

Utilização de Inchamento Específico de Orelha como umamedição de respostas de DTH, FIG. 10 mostra que receptores de aloenxertode controle desenvolveram respostas de DTH significativas aos esplenócitosF344 e col(V) duas semanas após o transplante [fp<0,0001 comparados comratos WKY inexperientes desafiados com esplenócitos F344 ou col(V), efp<0,0001 comparados com ratos WKY inexperientes desafiados com col(V)ou esplenócitos F344] (FIG. 10). Em contraste, aloenxertos de controle nãotiveram respostas de DTH aos antígenos de terceira parte (BN), col(II), oucol(XI) (FIG. 8). Ratos WKY inexperientes não tiveram respostas de DTH aocol(II), ou col(XI). Estes dados confirmam outros estudos mostrando querespostas de DTH são indicativas de ativação imune durante rejeição dealoenxerto, que é específica ao doador, mas não aos alo-antígenos de terceiraparte (VanBuskirk et al. 1998). Em adição, conforma que os resultados depresente inventor em camundongos (Mares et al. 2000) que col(V), mas nãocol(II) ou col(XI), é um alvo da resposta imune aos alo-antígenos de pulmão.

Relatórios anteriores têm mostrado que administração oral deantígenos que são alvos da resposta imune durante rejeição de aloenxertos,diferentes de pulmão, induz tolerância ao órgão do doador (Ishido et al.1999). Para determinar se administração oral de colágenos aos receptores dealoenxerto de pulmão antes do transplante induz tolerância imunológica aopulmão de doador, receptores WKY foram alimentados com col(II), col(V),ou col(XI) antes do transplante como descrito acima, seguido por umaavaliação de raios-X de tórax seriais, contagens de células diferenciais deBAL de aloenxerto, graduação patológica, e respostas de DTH aos antígenosde doador.

FIG. 12 mostra as contagens de células diferenciais em fluidode BAL dos grupos experimentais duas semanas após o transplante, o tempode início de rejeição aguda severa (Matsumura et al. 1995), e em ratos WKYnormais. Não houve diferenças em contagens de células diferenciais de BALem pulmões normais comparados com pulmões de isoenxerto. Similar aosrelatórios anteriores (Prop et al. 1985; Yagyu et al. 1990), PMN1S e linfócitosforam significativamente aumentados em BAL de aloenxerto de controlecomparado com pulmões normais ou de isoenxerto (*p<0,00001 paralinfócitos e fp<0,038 para PMN's comparados com pulmões normais ou deisoenxerto) (FIG. 12). Em contraste, alimentação de col(V) antes dotransplante resultou em uma redução significativa em PMN1S e linfócitos deBAL comparados com aloenxertos de controle (Jp <0,0001 para linfócitos ep<0,023 para PMN1S comparados com aloenxertos de controle) (FIG. 12).

Rejeição de aloenxerto aguda está normalmente associada comum aumento de contagens de células totais em fluido de BAL de aloenxerto(Matsumura et al. 1995). Contudo, duas semanas após o transplante, ospulmões de aloenxerto WKY de controle estão normalmente sofrendorejeição severa e devido à destruição do aloenxerto, BAL suficiente nãopoderia ser realizada confiadamente para determinar as contagens de célulastotais de BAL. Em contraste, receptores de aloenxerto alimentados comcol(V) mostram rejeição menos severa que permite BAL mais fácil resultandoem contagens de células mais altas. Por estes motivos, comparação decontagens de células totais entre os grupos não pôde ser feita. Coletivamente,estes dados demonstram que imunização oral com col(V) está associada commenos PMN's e linfócitos em fluido de BAL de aloenxerto durante rejeiçãoaguda.

Em rejeição aguda de aloenxerto de pulmão contagensdiminuídas de PMN e linfócitos em fluido de BAL de aloenxerto estãonormalmente associadas com lesões histológicas e radiográficas menosseveras. Para determinar a velocidade de progressão de infiltrados de pulmão,receptores de transplante foram monitorados por radiografias de tórax seriaisnos dias 1, 6, e 13 após transplante e graduados como descrito acima. Comomostrado em FIG. 13, isoenxertos de controle não possuíram quaisquerinfiltrados pulmonares em todos os instantes de tempo monitorados (grau 1)(FIG. 13A). Nos aloenxertos de controle raios-X seriais revelaramdesenvolvimento gradual de infiltrados suaves (grau 2) no pulmão esquerdo 6dias após transplante (dados não mostrados), que resultou em infiltradosseveros e opacificação completa (grau 4) no final da segunda semana (FIG.13B). Contudo em aloenxertos alimentados com col(V), o desenvolvimentode infiltrados foi muito menor comparado com controles. Os raios-X foramnormais (grau 1) no dia 6 e apenas infiltrados suaves (grau 2) estiverampresentes duas semanas após o transplante (FIG. 13C).

Os painéis superiores de FIG. 14 mostram a anatomiamacroscópica dos pulmões WKY de isoenxerto e nativos, e os pulmões deisoenxerto e nativos dos ratos de aloenxerto de controle e de aloenxertoalimentado com col(V) colhidos duas semanas após o transplante. Oisoenxerto (esquerdo-L) e o pulmão nativo (direito-R) foram normais emaparência (FIG. 14A). O pulmão transplantado em receptores de aloenxerto decontrole foi de cor marrom escura e encolhido comparado com o pulmãonativo (FIG. 14B). Em contraste, o pulmão esquerdo transplantado emreceptores de aloenxerto alimentados com col(V) (FIG. 14C) teve a aparênciado pulmão nativo (normal) ou de isoenxerto (FIG. 14A).

Menos PMN's e linfócitos em fluido de BAL de aloenxerto,infiltrados menos severos em aloenxertos nos raios-X de tórax, e anatomiamacroscópica preservada sugeriram que alimentação de col(V) antes dotransplante infra-regulou o desenvolvimento de patologia de rejeição. Ospainéis inferiores de FIG. 14 mostram a histologia representativa deisoenxertos de controle, e aloenxertos alimentados com col(V) duas semanasapós o transplante. Todos os pulmões de isoenxerto de controle tiveramhistologia normal sem sinais de rejeição (FIG. 14D). aloenxertos de controlerevelaram infiltrados extensivos de células mononucleares perivasculares,peribronquiais, e alveolares consistentes com rejeição aguda severa (FIG.14E). Em contraste, infiltração apenas suave a moderada perivascular eperibronquial foi detectada em pulmões de aloenxerto alimentados comcol(V) (FIG. 14F).

Os dados em FIG. 15 ilustram a graduação da patologia derejeição duas semanas após o transplante. Rejeição aguda foi A0-A4 deacordo com a presença e a extensão de infiltrados de células mononuclearesperivasculares e intersticiais, e B0-B4 de acordo com a extensão e aintensidade da inflamação da via aérea (Yousem et al. 1996). Todos ospulmões de isoenxerto de controle revelaram histologia normal do pulmão (A0±0, B 0±0). Os aloenxertos de controle tiveram rejeição vascular e de viaaérea severa (A 3,8±0,2, B 4±0, respectivamente). Em contraste, aloenxertosalimentados com col(V) mostraram rejeição suave a moderada vascular e devia aérea (A 2,8±0,2, B 2,6±0,2, respectivamente) (*p<0,028 para resultadosA e |p<0,009 para resultados B comparados com aloenxertos de controle)(FIG. 15, Tabela 3). Experimentos mostraram que alimentação com col(II) oucol(XI) não teve efeito sobre desenvolvimento de patologia de aloenxertocomparados com aloenxertos de controle (FIG 15, Tabela 3). Estes dadosmostram que alimentação com col(V) infra-regulou patologia de rejeiçãoaguda.

Dados mostrando que alimentação de col(V) infra-regularejeição de aloenxerto de pulmão sugeriram que receptores de aloenxerto depulmão tornados oralmente tolerantes devem ter respostas de DTHdiminuídas aos alo-antígenos de doador. Para determinar se alimentação decol(V) diminuiu respostas imunes aos alo-antígenos, receptores de aloenxertode controle e receptores de aloenxerto alimentados com col(V) foramdesafiados na aurícula direita com esplenócitos alogeneicos F344 e PBS naaurícula esquerda e respostas de DTH foram determinadas. Como mostradoem FIG. 16 e previamente mostrado em FIG. 10, receptores de aloenxerto decontrole não tratados tiveram uma resposta de DTH mais forte após desafiocom antígeno de doador. Em contraste, comparados com receptores dealoenxerto de controle, as resposta de DTH ao antígeno de doador foireduzida significativamente em receptores de aloenxerto alimentados comcol(V) (*p<0,02) (FIG. 16).

A resposta imune enfraquecida ao alo-antígeno induzida porcol(V) pôde ter sido devido à hiporresponsividade imune global (Faria eWeiner 1999), e não à tolerância imune. Portanto, para determinar se ratosWKY alimentados com col(V) respondem aos outros antígenos, estes ratosreceberam LPS quer intratraquealmente (1 mg/kg) quer intravenosamente (4mg/kg) que são doses que conhecidamente induzem reações inflamatóriasseveras no pulmão e sistemicamente 24 horas após desafio (0'Leary et ai.1997). A doença induzida é análoga à pneumonia e sepse causadas porbactérias gram-negativas. Similar aos ratos WKY normais, instilação de LPSem pulmões e injetado i.v. em ratos WKY alimentados com col(V) induziudoença severa (pêlo desordenado e prostração) e influxo massivo de PMN's elinfócitos para dentro do pulmão como observado em contagens de célulasdiferenciais de BAL e patologia (dados não mostrados).

Com o objetivo de adicionalmente investigar se a respostaimune enfraquecida induzida pela alimentação de col(V) foi específica paraantígeno, determinamos se alimentação de col(V) afetou as respostas de DTHa um antígeno nominal não relacionado, B SA, um antígeno dependente delinfócito-T em ratos (Henningsen et ai. 1984). Ratos WKY inexperientes ealimentados com col(V) foram vacinados por injeção s.c. de 100 μg de BSAem adjuvante e sete dias depois foram desafiados com Solução de BSAagregada por calor a 2% na aurícula direita e diluente na esquerda. Respostasde DTH foram determinadas 24 h após injeção. Ratos WKY não vacinadosserviram como controles para estes estudos. Como mostrado em FIG. 24,injeção de BSA na aurícula de ratos não vacinados não induziu inchamento deorelha significativo. Em contraste, injeção de BSA em ratos WKY vacinadosnão alimentados induziu inchamento de orelha significativo (*p<0,018comparado com ratos WKY inexperientes não vacinados) (FIG. 19). Contudoalimentação de col(V) não afetou as respostas de DTH à BSA tp>0,05comparado com ratos WKY vacinados) (FIG. 24). Coletivamente, estes dadosmostram que supressão induzida por col(V) de rejeição de aloenxerto depulmão é mediada por tolerância imune, e não por hiporresponsividade imuneglobal.

Produção sistêmica de TGF-β, IL-4, e IL-10 é citadafreqüentemente como citocinas responsáveis pela supressão de respostasimunes em tolerância oral (Faria e Weiner 1999). Portanto, a seguir foideterminado se tolerância oral induzida por col(V) está associada comprodução supra-regulada de TGF-β, IL-4, e IL-10 durante rejeição dealoenxerto de pulmão. Utilizando ELISAs comerciais, TGF-β, IL-4, e IL-10foram quantificados em soro de grupos experimentais. FIG. 17 mostra osníveis de TGF-β em soro em ratos WKY normais, aloenxertos de controle, ealoenxertos alimentados com col(V) duas semanas após o transplante. Comoesperado, níveis baixos de TGF-β estavam presentes no soro de ratos WKYnormais (Ying e Sanders 1998). Houve um aumento ligeiro de TGF-β emaloenxertos de controle. Em contraste, níveis de TGF-β foram marcantementesupra-regulados em soro de aloenxertos alimentados com col(V) (*p<0,05comparado com receptores de aloenxerto de controle) (FIG. 17). Nem IL-4nem IL-IO foram detectáveis em soro de mesmos ratos (dados nãomostrados).

Embora IL-4 e IL-IO não fossem detectadas no soro, isto nãoimpede sua atividade sistemicamente em infra-regulação de respostas imunescelulares aos alo-antígenos de doador. Para determinar se TGF-β, IL-4, ou IL-10 teve um papel na supressão de respostas imunes aos alo-antígenos,utilizamos anticorpos neutralizadores para estas citocinas no ensaio DTH paraos antígenos de doador. Utilizando uma modificação de um procedimentorelatado por (Bickerstaff et al. 2000), duas semanas após o transplante depulmão, ratos WKY alimentados com col(V) receberam IO7 esplenócitosF344 derivados de doador irradiados (3.000 rad) misturados com 5μg de Abpoliclonal anti-TGF-β ou 5μg de Ab policlonal anti IL-4 ou IL-10 em PBS naaurícula direita. A aurícula esquerda recebeu um volume igual de diluentemais esplenócitos, e serviu como um sítio de controle. Para controlesnegativos, um grupo separado de aloenxertos alimentados com col(V) recebeuimunoglobulinas de controle com esplenócitos na aurícula direita e umvolume igual de diluente mais esplenócitos na aurícula esquerda. Comomostrado em FIG. 18 e previamente mostrado em FIG. 10 e FIG. 16,receptores de aloenxerto de controle não tratados tiveram uma resposta deDTH forte após desafio com antígeno de doador que foi reduzidasignificativamente em receptores de aloenxerto alimentados com col(V).Contudo, aloenxertos alimentados com col(V) significativamente recuperaramrespostas de DTH quando anticorpos anti-TGF-β foram misturados comesplenócitos de doador e injetados na aurícula das orelhas [*p<0,03comparado com aloenxertos alimentados com col(V) desafiados comantígenos misturados com imunoglobulina de controle] (FIG. 18). Emcontraste, misturação de esplenócitos de doador com anticorpos deneutralização para IL-4 ou IL-IO foi menos efetiva em restauração derespostas de DTH aos antígenos de doador [^Jp>0,05 comparado comaloenxertos alimentados com col(V) desafiados com antígenos misturadoscom imunoglobulina de controle] (FIG. 18). A restauração das respostas deDTH em aloenxertos alimentados com col(V) com anticorpos anti-TGF-β,anti-IL-4, e anti-IL-10 em relação aos aloenxertos de controle foi 75,7%,24,3%, e 39,9%, respectivamente (FIG. 18).

Exemplo 6

O efeito de col(V) em tolerância oral sobre desenvolvimentode rejeição aguda de aloenxerto de pulmão é dependente de dose. Ratosmachos F344 (RTllvl) e WKY (RTl1) (200-250g) são adquiridos de HarlanSprague Dawley (Indianapolis, Ind.). Todos os aloenxertos (F344) ouisoenxertos (WKY) de pulmão esquerdo são transplantados ortotopicamenteem receptores WKY como previamente descrito (Sekine et ai. 1997).

Referindo-se agora à FIG. 25, Tabela 4, que inclui um sumáriodos dados coletados neste exemplo, colágeno de Tipo V foi isolado quer deplacenta de humano de nascimentos normais, quer de espécimes de tecido depulmão normais obtidos no momento de ressecação de câncer de pulmão.Gerald N. Smith Jr., Ph.D., com perícia extensiva em bioquímica de colágeno,proporcionaram colágeno de Tipo V purificado para estes estudos.

Ratos WKY são imunizados com colágeno antes da cirurgia detransplante usando gavagem gástrica como relatado em dados preliminares emanuscrito apresentado. Todos os ratos são alimentados dia sim, dia não querpor 4 quer por 8 dias como descrito na Tabela. Similares aos dadospreliminares, após um período de recuperação de uma semana após aalimentação, o pulmão esquerdo de ratos F344 (aloenxertos) ou ratos WKY(isoenxertos) é transplantado ortotopicamente em receptores WKY. Os ratosneste experimento não receberam drogas imunossupressoras. Vinte ratos sãoincluídos em cada grupo de alimentação para cada tipo de colágeno.Referindo-se agora à FIG. 25, Tabela 4 inclui uma explicação dos gruposexperimentais em Exemplo aqui relatado.

Vinte e quatro horas antes do final de um período de duassemanas após transplante, que é o tempo para rejeição severa se desenvolver(Matsumura et al. 1995), 10 ratos receptores são testados para respostas deDTH aos antígenos de doador, seguido por colheita de órgãos torácicos. BALé realizada no pulmão nativo e de aloenxerto por canulação seletiva dosbrônquios principais direito e esquerdo, respectivamente, e instilação de umtotal de 5 mL de PBS a 37°C (Sekine et al. 1997). BAL livre de células éobtida de espécimes de centrifugação e sobrenadantes são armazenados a -80°C. Sangue é coletado via veia cava e punção cardíaca, espécimes sãocentrifugados para separar soro, e armazenados a -80°C.

Estudos de respostas de hipersensibilidade de tipo retardado(DTH) são realizados por injeção de do esplenócitos de doador (F344)irradiados para dentro da orelha direita de ratos WKY 24 h antes dacompletitude do período pós-operatório de duas semanas como relatado emdados preliminares e manuscrito (Yasufuku et al. Submitted). Dados sãorelatados como "inchamento específico de orelha". Estudos preliminares têmconfirmado outros relatórios mostrando que a resposta de DTH máximaocorre 24 h após a injeção na orelha (Yamagami et al. 1999), e, portanto,todas as medições de DTH serão realizadas 24 h após injeção na orelha.Estudos preliminares confirmaram que teste de DTH não tem efeito sobrerespostas humorais ou celulares sistêmicas. Por comparação das respostas deDTH aos antígenos de doador em receptores de controle de aloenxerto eisoenxerto comparados com ratos WKY alimentados com colágeno, pode serdeterminado se doses diferentes de col(V) têm efeitos diferentes sobreresposta de DTH aos antígenos de doador.

Após eutanásia, os órgãos torácicos são removidos em bloco eestudados histologicamente. Resumidamente as amostras dos órgãos torácicosforam fixadas por instilação intratraqueal de glutaraldeído 4%, embebidas emparafina, seccionadas a 5-7 μηι, e coradas com hematoxilina e eosina (H&E)para estudos histológicos por microscopia de luz. As lesões histológicas sãograduadas por critérios histológicos padrão para rejeição de aloenxerto depulmão de humano (Yousem et al. 1996) em uma maneira cega (Wilkes et al.1995). Rejeição aguda é caracterizada por intensidade variada de infiltradosde células mononucleares perivasculares e peribronquiolares (Yousem et al.1996). Visto que diferenças em infiltrados celulares entre grupos podem sermais sutis do que considerado nos critérios aceitos de rejeição aguda,infiltrados também serão quantificados por contagem de célulasmononucleares perivasculares e peribronquiolares presentes em seções detecido corado com H&E digitalizado (células/μηι ) utilizando Sigma Scansoftware (Jandel Scientific, Chicago, Ill.). Os procedimentos de digitalizaçãoestão correntemente em uso em nossos laboratórios.

Linfócitos-T citotóxicos possuem papéis chave na patogênesede rejeição de aloenxerto de pulmão (Trulock 1997), e tem sido mostrado quecitotoxicidade celular enfraquecida é um mecanismo chave pelo qualtolerância oral previne atividade de doença (Faria e Weiner 1999; Mayer2000; Garside e Mowat 1997). Para determinar se atividade de rejeiçãodiminuída em receptores de aloenxerto de pulmão tornados tolerantes comcol(V) está associada com citotoxicidade celular anti-doador enfraquecida,células de linfonodo periféricas são isoladas de ratos F344 (doador) normais,carregados com 51Cr (New England Nuclear, Boston, Mass.), e aplicadas emplacas de fundo plano de 96 cavidades (células alvo, 5 χ 103/cavidade) emmeios completos. Células efetoras (linfócitos-T esplênicos de ratos WKY-receptores em cada grupo) são incubadas em razões variadas com alvos(razões E/T de 1:1, 5:1, 10:1. e 100:1) a 37°C por 4 horas. Células-Tesplênicas puras (>95% puras) são isoladas utilizando glóbulos magnéticosanti-CD3 (Dynal Corp, Lake Success, N.Y.), e confirmadas por citometria defluxo. Citotoxicidade é determinada por liberação específica de 51Cr induzidapor células efetoras em cada razão E/T comparado com liberação de célulasalvo carregadas, sozinhas.

Outros investigadores têm confirmado que rejeição dealoenxerto de pulmão em ratos e humanos está associada com apoptose emcélulas presentes em tecidos alveolar, vascular, e bronquiolar, e que apoptoseé detectada não freqüentemente durante aceitação de aloenxerto(Blankenberg, et al. 2000). Também tem sido previamente mostrado que aresposta imune total aos alo-antígenos inclui indução de apoptose emendotélio vascular e epitélio bronquiolar em camundongos. Em adição,imunização com col(V), que induz anergia aos antígenos de doador, previneapoptose induzida por alo-antígeno neste modelo.

Com o objetivo de determinar a capacidade de tolerância oralinduzida por col(V) para prevenir apoptose em aloenxertos de pulmão, kits deensaio TdT-mediated dUTP Nick End Labeling (TÚNEL) (In Situ Cell DeathDetection Kit, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.) são utilizados paradetectar apoptose em seções de tecido de aloenxerto de pulmão duas semanasapós transplante. A quantidade de células apoptóticas em tecidos perivasculare peribronquiolar é quantificada em seções contra-coradas com eosinadigitalizadas (células/μηι ) usando programa de computador Sigma Scan(Jandel Scientific, Chicago, Il 1.).

Para determinar a produção de IL-4, IL-10, TGF-β, CTGF, eóxido nítrico, todos os mediadores potenciais de supressão imune induzidapor col(V), bem como o curso de tempo de síntese após transplante, a dose decol(V) que é mais efetiva na prevenção de patologia de rejeição é usada paraalimentar outro grupo de ratos. Em resumo, ratos de controle de aloenxerto ereceptores de aloenxerto alimentados com col(V) são mortos 2, 4, 6, 8, 10, 12,e 14 dias após o transplante, e níveis em soro de IL-4, IL-10, TGF-β sãoquantificados por ELISA (R&D Systems, Minneapolis, Minn.) conforme oprotocolo do fabricante (n=5 cinco ratos em cada instante de tempo). Ensaiosde proteções de RNase (Pharmingen, San Diego, Calif.) são utilizados paradetectar mRNA para estas citocinas em esplenócitos e linfonodos periféricos.Controles são soro, linfonodos e esplenócitos dos ratos WKY normais.

Níveis de CTGF em soro de aloenxertos de controle,aloenxertos alimentados com col(V), e ratos normais são determinados porELISA por Dr. George Martin, Ph.D., Scientific Director of Fibrogen, SanFrancisco, Calif., o perito líder na estrutura e na função de CTFG. Northernblotting é utilizado para detectar mRNA para CTGF em linfonodosperiféricos, e baço utilizando sondas fornecidas por Dr. Martin. Expressão deproteína e de mRNA é ensaiada nos mesmos instantes de tempo descritos paraIL-4,IL-10,e TGF-β.

Níveis de óxido nítrico em soro são detectados em váriosinstantes de tempo descritos acima em aloenxertos de controle e aloenxertosalimentados com col(V) em vários instantes de tempo após transplantedescritos acima, bem como em ratos WKY normais. Produção de nitratos enitrilas metabólicos estáveis em soro é determinada por reação de Greissutilizando análise espectrofotométrico de soro (Kallio et al. 1997).

Exemplo 7

O efeito de dose de Col(V) para tolerância oral sobredesenvolvimento de rejeição crônica de aloenxerto de pulmão (Bronquioliteobliterante). Ratos machos, MHC (RTl)-Incompativeis, livres de patógenos,foram utilizados para o estudo: ratos Fischer 344 (F344, RTl1V1) BrownNorway (BN, RTl") e Wistar Kyoto (WKY, RTl1) (250-300g no momentodo transplante). Todos os ratos foram adquiridos de Harlan Sprague Dawley(Indianapolis, Ind.) e alojados em Laboratory Animal Resource Center atIndiana University School of Medicine (Indianapolis, Ind.) de acordo com asdiretrizes da instituição.

Colágeno de Tipo II [col(II)] foi isolado de cartilagem caninacomo previamente relatado. Colágeno de Tipo V de humano purificado[col(V)] e colágeno de Tipo XI [col(XI)] foram um presente de Dr. JeromeSeyer (VA Hospital, Hampton, Va.). Colágenos foram diluídos em ácidoacético 0,005 M (0,5 mg/mL) e armazenados a 4°C até seu uso.

Ratos WKY foram alimentados oralmente com 10 μg decol(V) dissolvido em 0,5 mL de solução salina por uma gavagem gástricautilizando uma agulha de alimentação de animal de aço inoxidável de pontade bola de calibre 16 (Braintree Scientific, Braintree, Mass.) comopreviamente relatado. Animais de controle foram alimentados com diluentesozinho. Animais foram alimentados dia sim, dia não com oitoalimentações.Sete dias após a última alimentação, estes ratos foram utilizadoscomo receptores de aloenxertos de pulmão.

O transplante ortotópico de isoenxertos de pulmão esquerdo(WKY—»WKY), ou aloenxertos (F344-»WKY) foi realizada comopreviamente relatado, utilizando um procedimento inicialmente descrito por(Marek et al. 1983, e Prop et al. 1985). O modelo de transplante F344->WKYestá associado com o desenvolvimento de rejeição aguda severa no fim dasegunda semana. Em adição, este modelo é o único modelo em animal detransplante de pulmão que desenvolve bronquiolite obliterante (BO)reprodutivamente. Sobrevivência ultrapassou 90% em todos os grupos detransplante. Terapia imunossupressora não foi dada em nenhum momentodurante o período experimental.

Três grupos de transplante foram estudados: pulmões de ratosWKY transplantados em receptores WKY [isoenxertos de controle]; pulmõesF344 transplantados em receptores WKY alimentados com diluente[aloenxertos de controle]; e pulmões F344 transplantados em receptores WLYalimentados com col(V) [aloenxertos alimentados com col(V)]. Receptoresforam mortos duas a 10 semanas após transplante.

Respostas de hipersensibilidade de tipo retardado DTH foramdeterminadas como acima, por uma modificação de um procedimentoinicialmente descrito por (Sayegh et al. 1994, e Yamagami et al. 1999). Emresumo, 10 semanas após transplante de pulmão, ratos WKY de controle eWKY alimentados com col(V) receberam 10^7 esplenócitos de terceira parte(BN) ou esplenócitos F344 derivados de doador irradiados (3.000 rad) em 30uL de PBS na aurícula direita por injeção s.c. usando uma agulha de calibre26. A aurícula esquerda recebeu um volume igual de diluente, e serviu comoum sítio de controle. Ratos WKY inexperientes foram controles negativos.Um grupo separado de ratos WKY receptores de aloenxerto ou inexperientesfoi restado com 15μ§ de col(II), col(V), ou col(XI) em 30 μl, de volumeinjetado na aurícula direita e diluente na esquerda. A espessura da orelha foimedida com um micrômetro (Mitutoyo, Field Tool Supply, Chicago, Il 1.) emum modo cego imediatamente antes e 24 h após injeção. O InchamentoEspecífico de Orelha = (espessura de orelha direita @ 24 h - espessura deorelha direita @ 0 h) - (espessura de orelha esquerda @ 24 h - espessura deorelha esquerda @ 0 h) χ 10" mm (Yamagami et al., 1999). Todos os dadosrelatados como a média de medições triplicadas.

Neutralização de TGF-β no sítio de DTH foi realizada comopreviamente relatado por uma modificação de um procedimento descrito por(Bickerstaff et al. 2000). Em resumo, 10 semanas após transplante de pulmão,ratos WKY alimentados com col(V) receberam IO7 esplenócitos F344derivados de doador irradiados (3.000 rad) misturados com 5μg de Abpoliclonal de galinha anti-TGF-β de rato (R&D Systems, Minneapolis, Minn.)em 30μ1 de PBS na aurícula direita. A aurícula esquerda recebeu um volumeigual de diluente, e serviu como um sítio de controle. Para controlesnegativos, um grupo separado de aloenxertos alimentados com col(V) recebeu107 esplenócitos F344 derivados de doador irradiados (3.000 rad) misturadoscom 5μg de imunoglobulinas de galinha de controle ou de imunoglobulinasde cabra de controle (R&D Systems, Minneapolis, Minn.) na aurícula direita ediluente na esquerda. O Inchamento Específico de Orelha foi determinadocomo descrito acima. Imunoglobulinas de controle não tiveram efeito sobre aresposta de DTH.

Reação de leucócito misto foi realizada por uma modificaçãode um procedimento previamente descrito. Em resumo, esplenócitos F344(estimulantes) que foram usados como uma fonte de células apresentandoantígeno (APCs), foram tratados com mitomicina C (Sigma, St. Louis, Mo.) eco-cultivadas em razões variadas com linfócitos Tl de linfonodo(respondedores) de ratos WKY (3 χ 105/cavidade) em 200 μί de meio (RPMI,L-Glutamina 2 mM, 2-mercapto-etanol 5 χ IO"5 Μ, 100 U/mL de penicilina,100 μΙ7ιη1 de estreptomicina, 10% de soro fetal bovino inativado por calor)em placas de microtítulo de fundo plano de 96 cavidades (Costar, Cambridge,Mass.). Dezoito horas antes da completitude de uma incubação de 5 dias a37°C (5% de CO2), 1 μα/mL de 3H (Amersham Corp., Arlington Heights,111.) foi adicionado em cada cavidade. Culturas foram colhidas com umcolhedor de células automático (Brandel, Gaithersburg, Md.) e analisadas emum contador de cintilação líquida (Beckman, Arlington Heights, Ill.).

Proliferação celular foi determinada como a média de contagens por minutode incorporação de [ H] timidina em culturas triplicadas e relatada comoíndice de estimulação. Em experimentos separados o mesmo ensaio foirealizado usando esplenócitos de ratos WKY do grupo experimental como oestimulante e linfócitos T de linfonodo de ratos F344 como respondedores.

Níveis de TGF-β em soro dos grupos experimentais foramquantificados por ELISA utilizando o sistema de imunoensaio TGF-β 1(Promega, Madison, Wis.) conforme o protocolo do fabricante. Níveis de IL-4e IL-10 em soro foram quantificados por ELISA utilizando kits deimunoensaio Cytoscreen (BioSource International, Camarillo, Calif.) deacordo com o protocolo do fabricante. A sensibilidade dos ensaios de TGF-β,EL-4, e IL-IO foram, respectivamente 32, 2, e 5 pg/mL.

Com o objetivo de avaliar a patologia pulmões nativos etransplantados de cada grupo foram colhidos, fixados, seccionados, corados, egraduados para patologia de rejeição usando critérios padrão por umpatologista (O. W. C.) em um modo cego sem conhecimento anterior dogrupo de transplante como previamente relatado.

Visto que dados para DTH em ratos WKY de aloenxerto decontrole e inexperientes desafiados com antígenos diferentes foi verificadocomo não normalmente distribuídos, uma ANOVA bivariada de soma depontos com interação foi utilizada para determinar diferenças entre grupos.Diferenças em respostas de DTH aos alo-antígenos de doador entrealoenxertos de controle e aloenxertos alimentados com col(V) foramdeterminadas utilizando um teste U de Mann-Whitney U. O teste t de Studentpara comparações múltiplas foi utilizado para análise de MLR e citocinas.Valores de ρ < 0,05 foram determinados como significativos.

Tem sido demonstrado que rejeição aguda de aloenxerto depulmão está associada com resposta imune aos antígenos de doador bemcomo ao col(V). Contudo, estudos recentes têm sugerido que respostasimunes aos antígenos de doador podem diminuir no decorrer do tempo. Paradeterminar se resposta imune aos antígenos de doador e col(V) estãopresentes por longa duração após transplante de pulmão, respostas de DTHaos esplenócitos F344 (doador) esplenócitos e ao col(V) foram examinadasem ratos WKY 10 semanas após transplante de aloenxertos de pulmão F344.FIG. 19 mostra que receptores de aloenxerto de controle possuem respostas deDTH significativas aos antígenos de doador (esplenócitos F344) e ao col(V)comparados com ratos WKY inexperientes (*p<0,05). Significativamente, asrespostas de DTH ao antígeno de doador e ao col(V) em 10 semanas foramsimilares àquela observada durante rejeição aguda (duas semanas apóstransplante). Col(II) ou col(XI) (controles) não induziu respostas de DTH emreceptores de aloenxerto de pulmão em cada instante de tempo.

Indução de tolerância oral usando antígeno derivado de doadortem sido efetiva na supressão de respostas imunes celulares aos antígenos dedoador a até duas semanas após o transplante. Em adição, apresentação deantígeno deficiente tem sido relatada em ser outro mecanismo pelo qualtolerância pode modular respostas imunes. A seguir foi determinado sealimentação de col(V) infra-regulou respostas imunes celulares aos antígenosde doador de longa duração, e examinado se o efeito de tolerância oralinduzida por col(V) afetou a apresentação de antígeno. Como descrito acima,ratos não alimentados e WKY que foram alimentados com col(V) receberamaloenxertos de pulmão F344. Duas semanas (tempo de rejeição aguda) e dezsemanas (tempo de início de BO) após transplante, ratos foram mortos,linfócitos de linfonodo foram isolados e estimulados com antígenos de doador(esplenócitos F344). FIG. 19 mostra que linfócitos de linfonodo de ratosWKY normais ou linfócitos isolados de ratos WKY duas ou dez semanas apóstransplante de aloenxertos de pulmão F344 tiveram respostas proliferativascomparáveis aos antígenos de doador. Em contraste, comparados comoaloenxertos de controle ou normais, tolerância oral induzida por col(V)causou reduções significativas em respostas proliferativas aos antígenos dedoador em ambos instantes de tempo (* p<0,05). Em adição, respostasproliferativas aos linfócitos dos receptores de aloenxerto de pulmãoalimentados com col(V) foram menores em 10 semanas comparadas com duassemanas (*p<0,05, FIG. 20).

A seguir determinamos se tolerância oral induzida por col(V)afetou a apresentação de antígeno. Em resumo, esplenócitos (fonte de célulasapresentadoras de antígeno) foram isolados de ratos WKY normais, ou ratosWKY alimentados com col(V) duas e 10 semanas após transplante dealoenxertos de pulmão F344, e examinados para sua capacidade de induzirlinfócitos de linfonodo F344 para proliferarem em um MLR. FIG. 19 mostraque esplenócitos isolados de receptores de aloenxerto alimentados com col(V)em duas e dez semanas induziram proliferação comparável com a deesplenócitos isolados de ratos WKY normais.

Tem sido relatado que respostas de DTH aos antígenos dedoador se correlacionam com a atividade de rejeição em vários modelos detransplante de órgão em roedor. Portanto, dados mostrando respostas de DTHdiminuídas aos antígenos de doador em receptores de aloenxerto de pulmãoalimentados com col(V) em dez semanas sugeriram patologia de rejeiçãoreduzida nos aloenxertos. FIG. 21 mostra a anatomia macroscópica e ahistologia de aloenxertos de pulmão colhidos de ratos WKY que receberamaloenxertos de pulmão F344 (aloenxertos de controle), e ratos WKYalimentados com col(V) que receberam aloenxertos de pulmão F344 10semanas após transplante, aloenxertos de controle foram marrons escuros,encolhidos, e formes (FIG. 2IA). Em contraste, aloenxertos de ratos WKYalimentados com col(V) tiveram aparência quase normal com apenas ligeiradescoloração (FIG. 21B). Em 10 semanas após transplante, todos osaloenxertos de controle desenvolveram infiltrados de célula mononuclearextensivos, fibrose, e obliteração de vias aéreas pequenas por tecido degranulação que são lesões patológicas de BO (n=5, FIG. 21C). Em contraste,aloenxertos colhidos de ratos alimentados com col(V) apenas tiveraminfiltrados alveolares suaves, sem inflamação intersticial que descreve apatologia de rejeição aguda suave (grau A2, n=5, FIG. 21D).

Produção sistêmica de IL-4, IL-10, ou TGF-β tem sido relatadacomumente como o mecanismo de supressão imune induzida por tolerância oral.Níveis séricos de TGF-β em três grupos experimentais 10 semanas apóstransplante são mostrados em FIG. 22. Ratos WKY normais possuem níveisbaixos de TGF-β em soro, e níveis de TGF-β aumentados, suaves, mas nãosignificativos em ratos WKY que receberam aloenxertos de pulmão F344(aloenxertos de controle - FIG. 22). Contudo, alimentação com col(V) antes dotransplante de pulmão resultou em níveis séricos significativamente aumentadosde TGF-β (FIG. 25, *p<0,05). Alimentação com col(V), sozinho, sem transplantede pulmão não aumentou os níveis séricos de TGF-β (dados não mostrados).Tanto JL-4 quanto IL-IO não foram detectadas em soro de qualquer grupo.

Dados mostrando infra-regulação de respostas de linfócito aoalo-antígeno e apresentação intacta de alo-antígenos in vitro, sugerem quetolerância oral induzida por col(V) também deve estar associada comrespostas de DTH suprimidas aos antígenos de doador in vivo. Comoesperado, FIG. 23 mostra que receptores de aloenxerto de controle possuemrespostas de DTH fortes aos antígenos de doador. Contudo, alimentação decol(V) antes do transplante resulta em respostas de DTH significativamentediminuídas aos antígenos de doador (FIG. 26, *p<0,05). Para determinar seníveis séricos aumentados de TGF-β estavam contribuindo para tolerânciaoral induzida por col(V), a resposta de DTH aos antígenos de doador foirepetida usando anticorpos neutralizadores para TGF-β como relatadopreviamente. FIG. 23 mostra que neutralização de TGF-β resultou em umarecuperação significativa de respostas de DTH aos antígenos de doador(*p<0,05, e 75% de resposta de DTH observada em aloenxertos de controle).

Exemplo 8

Referindo-se agora à FIG. 26, Tabela 5 lista os gruposexperimentais usados em Exemplo 8, a determinação de se peptídeospresentes em digeridos de brometo de cianogênio de cadeias-α de Col(V)previnem o desenvolvimento de rejeição aguda. Resumidamente, estes gruposexperimentais são como segue: aloenxerto de Controle, alimentado comcol(V) intacto, alimentado com I(V), alimentado com 2(V). Colágeno de TipoV é isolado de pulmões de humano obtidos em autópsia. Após tecidos depulmão serem moídos, lavados, e suspensos em ácido acético 0,5 M contendoNaCl 0,2 Μ, e digeridos por pepsina, os sobrenadantes são aspirados dosespécimes centrifugados, e a pelota é coletada e o procedimento de extração érepetido. Os sobrenadantes dos dois digeridos são combinados, earmazenados a -70 C. Colágeno de Tipo V é purificado dos sobrenadantes porprecipitação diferencial por NaCl de ácido acético 0,5 M (Piez et ai. 1963). Ociclo de solubilização em ácido acético e precipitação por NaCl é repetido atéque uma preparação de Tipo V com uma razão de cadeia-α de al (V)/a2(V)de aproximadamente 2 seja obtida conforme determinada por eletroforese emgel de poliacrilamida-SDS (Woodbury et al. 1989). Separação de αI(V) dea2(V) é realizada por cromatografia em DEAE-celulose (Chiang et al. 1980).

As cadeias αI(V) e a2(V) são aluídas da coluna, e quantificadas pordeterminação do conteúdo de hidróxi-prolina no efluente.

As cadeias α de colágeno Tipo V são adicionalmente fracionadaspor digestão com brometo de cianogênio, que cliva o colágeno em resíduos demetionina (Miller et al. 1971). Na completitude da digestão, as amostras sãodiluídas 50 vezes e liofilizadas para remover o brometo de cianogênio.

A extensão da digestão é selecionada em geles depoliacrilamida. Peptídeos individuais são isolados por uma combinação decromatografia de troca iônica e de peneira molecular.

Vinte ratos WKY receberam col(V) intacto, ou peptídeosreunidos de α I(V), ou a2(V) por gavagem gástrica. A dosagem e o regime dealimentação para peptídeos ou col(V) intacto neste Exemplo são iguais aosdeterminados para col(V) intacto em Exemplo 5. Duas semanas após otransplante, os ratos em cada grupo são mortos e o pulmão é colhido.

Exemplo 9

Os dados aqui apresentados sugerem que os métodos dapresente invenção serão efetivos para prevenir ou diminuir episódios derejeição aguda ou crônica em receptores de transplante humanos, terapiasimilar, se não idêntica, também deve ser um tratamento efetivo para Doençapulmonar Idiopática ou qualquer outro tipo de doença ou distúrbio pulmonarque envolve uma resposta imune ao colágeno encontrado em pulmões. Écontemplado que quando um indivíduo humano é posto em uma lista parareceber um transplante, o indivíduo começará a receber doses efetivas de umamolécula que suprime as respostas aloimunes, tais como compostos decolágeno como aqui descritos. Pacientes sofrendo tratamento receberão oscompostos por administração oral, preferivelmente quer por alimentação oralquer por instilação intra para dentro do receptor.

A dosagem será determinada por numerosos fatores que serãoconhecidos pelo técnico experiente. O indivíduo receberá pelo menos trêsdoses dos compostos por mês a partir da hora na qual o indivíduo é posto nalista de transplante até a hora do transplante. Em alguns tempos cases, asdosagens serão administradas de dois em dois dias por quatro dias com oobjetivo de receber pelo menos três doses do composto por mês. Em outroscasos, o indivíduo receberá compostos pelo menos uma vez por semana desdea hora na qual o indivíduo é posto na lista de transplante até a hora dotransplante. Dependendo do indivíduo, os compostos podem seradministrados pelo menos duas vezes por semana desde a hora na qual oindivíduo é posto na lista de transplante até a hora do transplante.

Exemplo 10

E adicionalmente contemplado que o tratamento de umindivíduo humano que tem recebido um transplante ou que está sofrendo deuma doença ou distúrbio pulmonar que envolve autoimunidade ao colágenopor exemplo colágeno de Tipo V com uma molécula que suprime respostasaloimunes, preferivelmente um composto de colágeno, prevenirá ou diminuiráo início de patologia aguda ou crônica no indivíduo. Como acima,administração dos compostos pode ser administrada por vários meios,incluindo, quer por administração oral quer por instilação intrapulmonar ouintravenosa para dentro do receptor (paciente).De novo, as quantidades de dosagem serão determinadas pelotécnico experiente baseado no número de fatores conhecidos pelo técnico. Namaioria dos casos um dado paciente provavelmente receberá pelo menos trêsdoses dos compostos por mês por pelo menos dois meses ou até os sintomasda doença ou do distúrbio melhorarem. Estas dosagens podem tomar a formade uma dose a cada dois dias por quatro dias, como acima, de três doses pormês. No mês seguinte, o indivíduo de transplante receberá outra rodada deuma dose a cada dois dias por quatro dias. Este procedimento pode serrepetido conforme a necessidade como determinado pelo técnico experiente.

Alternativamente, o indivíduo pode receber uma dose a cada dois dias poroito dias, por um total de cinco doses por mês, durante os meses, após otransplante. Em outros aspectos, o indivíduo pode receber as dosagens emincrementos semanais ou duas vezes pro semana, etc., como determinado pelotécnico experiente.

Embora a invenção tenha sido ilustrada e descrita em detalhenas figuras e na descrição precedente, a mesma é para ser considerada comoilustrativa e não restritiva em caráter, sendo entendido que apenas asmodalidades preferidas têm sido mostradas e descritas e que todas asmudanças e modificações que caem dentro do espírito da invenção sãodesejadas para serem protegidas. Também, embora a invenção tenha sidoilustrada usando exemplos específicos, argumentos teóricos, considerações, eilustrações, estas ilustrações e a discussão acompanhante de nenhuma maneiradevem ser interpretadas como limitantes da invenção. Todas as patentes,pedidos de patente, e referências aos textos, tratados científicos, publicações,e semelhantes referidos neste pedido são aqui incorporados como referênciasem suas totalidades.REFERÊNCIAS

As seguintes referências, na medida em que proporcionamprocedimento experimental ou outros detalhes suplementares àqueles aquidescritos, são especificamente aqui incorporadas como referências.

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Claims (27)

1. Método para avaliar doença pulmonar, caracterizado pelofato de compreender as etapas de:obter uma amostra de um paciente; eensaiar a citada amostra para evidência de autoimunidade apelo menos um tipo de colágeno presente em pelo menos um pulmão decitado paciente.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o citado colágeno é selecionado do grupo consistindo de: colágenode Tipo V, pelo menos um epítopo de colágeno de Tipo V, e pelo menos umfragmento antigênico de colágeno de Tipo V.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que a citada doença pulmonar é selecionada do grupo consistindo de:Fibrose Pulmonar Idiopática, Síndrome da Angústia Respiratória de Adulto,Síndrome da Angústia Respiratória Aguda, secundária à doença vascularpulmonar e qualquer forma de doença pulmonar fibrótica.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a citada doença é Bronquiolite obliterante.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a citada etapa de ensaiar inclui:proporcionar pelo menos um componente antigênico decolágeno de Tipo V; econtatar pelo menos uma porção de citada amostra com ocitado pelo menos um componente antigênico de colágeno de Tipo V.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que a citada etapa de ensaiar adicionalmente inclui monitorar um sinalproduzido quando o citado componente antigênico interage com pelo menosum anticorpo para o citado pelo menos um componente antigênico decolágeno de Tipo V.

7. Método para tratar doença pulmonar, caracterizado pelo fatode compreender as etapas de:identificar um paciente possuindo autoimunidade a pelo menosum tipo de colágeno presente em um pulmão;proporcionar pelo menos um composto que suprime a respostaautoimune; eadministrar uma quantidade terapeuticamente efetiva de citadocomposto ao citado paciente.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de que o citado colágeno é selecionado do grupo consistindo de colágenode Tipo I, colágeno de Tipo II, colágeno de Tipo III, colágeno de Tipo IV, ecolágeno de Tipo VI.

9. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de que o citado colágeno é colágeno de Tipo V.

10. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que a citada doença é selecionada do grupo consistindo deFibrose Pulmonar Idiopática, Síndrome da Angústia Respiratória de Adulto,Síndrome da Angústia Respiratória Aguda, doença vascular secundária àcolágeno, qualquer forma de doença pulmonar fibrótica.

11. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que o citado composto é selecionado do grupo consistindo deciclosporina, moléculas regulatórias de sistema imune e anticorpos paracomponentes do sistema imune.

12. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que o citado composto é pelo menos um componente antigênicode colágeno de Tipo V.

13. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que o citado composto é administrado a um paciente porinstilação intrapulmonar.

14. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que o citado composto é administrado a um paciente poralimentação oral.

15. Método para identificar pacientes sob risco aumentado derejeição de tecido de órgão transplantado, caracterizado pelo fato decompreender as etapas de:obter uma amostra de um paciente; eensaiar a citada amostra para evidência de uma reaçãoautoimune a pelo menos um tipo de colágeno presente em um pulmão.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que a citada amostra é selecionada do grupo consistindo de:sangue, soros, fluido pulmonar intersticial, escarro, muco, tecido esemelhantes.

17. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que o citado colágeno é selecionado do grupo consistindo decolágeno de Tipo I, colágeno de Tipo II, colágeno de Tipo III, colágeno deTipo IV, e colágeno de Tipo VI.

18. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que o citado colágeno é colágeno de Tipo V.

19. Método para identificar pacientes sob risco aumentado dedesenvolvimento de Síndrome de Bronquiolite Obliterante, caracterizado pelofato de compreender as etapas de:obter uma amostra de sangue de um paciente; eensaiar a citada amostra de sangue para evidência de umareação autoimune a pelo menos um tipo de colágeno encontrado em umpulmão.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que o citado colágeno é selecionado do grupo consistindo decolágeno de Tipo I, colágeno de Tipo II, colágeno de Tipo III, colágeno deTipo IV, e colágeno de Tipo VI.

21. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que o citado colágeno é colágeno de Tipo V.

22. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que citado teste é um ensaio baseado em anticorpo, no qual ocitado ensaio compreende as etapas de:contatar pelo menos uma porção de citada amostra comantígeno para anticorpo para pelo menos um componente antigênico decolágeno;ligar o citado antígeno em pelo menos um anticorpo para ocitado antígeno no qual o citado anticorpo está presente na citada amostra;monitorar pelo menos um sinal indicativo de ligação de citadoanticorpo em citada amostra no citado antígeno.

23. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que o citado antígeno é selecionado do grupo consistindo de:colágeno de Tipo V, um componente antigênico de colágeno de Tipo V, e umanálogo antigênico de pelo menos um componente antigênico de colágeno deTipo V.

24. Kit para avaliar doença pulmonar, caracterizado pelo fatode compreender:pelo menos um componente antigênico de colágeno de Tipo V;epelo menos um grupo que produz um sinal quando o citadopelo menos um componente antigênico se liga em pelo menos um anticorpoanti-Tipo V.

25. Kit de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelofato de que o citado kit adicionalmente inclui uma superfície no qual a citadasuperfície é adequada para ligação de citado pelo menos um componenteantigênico.

26. Kit de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelofato de que a citada superfície é parte de um objeto selecionado do grupoconsistindo de: filtros, glóbulos, placas, membranas, lascas, lâminas, esemelhantes.

27. Kit de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelofato de que o citado kit adicionalmente inclui pelo menos um dos seguintescompostos selecionados da lista consistindo de: moléculas repórter, átomosrepórter, anticorpos para anticorpos ligados em antígenos no kit,tamponadores, estabilizadores, antimicrobianos, e um adjuvante.