BRPI0618350B1 - método para triagem de uma substância que confere kokumi - Google Patents

Abstract

método para triagem de uma substância que confere kokumi, agente que confere kokumi, composição de alimento, método para produzir alimento ou bebida conferido(a) com kokumi, alimento ou bebida conferido(a) com kokumi, e, composto um método para triagem de uma substância que confere kokumi, que utiliza atividade de receptor de cálcio como um índice, um agente que confere kokumi contendo uma substância que confere kokumi obtida pelo método de triagem como um ingrediente ativo, um método para produzir alimento ou bebida tal como alimento. tempero, e bebida conferido(a) com kokumi, e alimento ou bebida conferido(a) com kokumi.

Description

“MÉTODO PARA TRIAGEM DE UMA SUBSTÂNCIA QUE CONFERE KOKUMI” Descrição Campo Técnico Este pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente Japonesa de No. 2005-325300 depositado aos 9 de novembro de 2005, Pedido de Patente Japonesa de No. 2006-188458 depositado aos 7 de julho de 2006, Pedido Provisório de Patente US de No. 60/738562 depositado aos 22 de novembro de 2005, Pedido Provisório de Patente US de No. 60/807831 depositado aos 20 de julho de 2006, que são por meio deste aqui incorporados como referências. A presente invenção refere-se a um método para triagem de uma substância que confere kokumi, um agente que confere kokumi contendo uma substância que confere kokumi obtida pelo método de triagem como um ingrediente ativo, um método para produzir alimento ou bebida tal como alimento, tempero, e bebida conferido(a) com kokumi, e alimento ou bebida conferido(a) com kokumi. Técnica Anterior O receptor de cálcio também é chamado do receptor sensorial de cálcio (CaSR), e é um receptor consistindo de 1078 aminoácidos, e é classificado na classe C de sete receptores de transmembrana (receptor acoplado em proteína G; GPCR). Clonagem do gene para este receptor de cálcio foi relatada em 1993 (Documento de não-patente 1), e é sabido que causa várias respostas celulares através de elevação do nível de cálcio intracelular etc., quando é ativado com cálcio etc. A seqüência de gene do receptor de cálcio de humano é registrada com o No. de Acesso no GenBank de NM_000388, e está bem conservada em animais. O receptor de cálcio acima mencionado pode atuar para promover ou suprimir funções biológicas. Portanto, no momento, agentes terapêuticos que podem atuar como atívadores e inibidores do receptor de cálcio são apropriadamente usados no tratamento de doenças neurológicas, doenças hepáticas, doenças cardiovasculares, doenças de sistema digestivo, e outras doenças, dependendo das condições patológicas. Por exemplo, o receptor de cálcio é capaz de detectar nível de cálcio sanguíneo aumentado na paratireóide, e de suprimir a secreção do hormônio de paratireóide (PTH) para corrigir o nível de cálcio sanguíneo. Portanto, é esperado um efeito de redução do nível de cálcio sanguíneo para um ativador de receptor de cálcio. Tem sido realmente clarificado que quando um ativador de receptor de cálcio é usado para tratar hiperparatiroidismo secundário em um paciente de hemodiálise, ele reduz o nível de PTH sem elevar os níveis de cálcio e de fósforo.

Visto que análise funcional do receptor de cálcio tem sido conduzida principalmente para homeostácia de cálcio, as pesquisas aplicadas portanto se ocupam até agora principalmente das doenças metabólicas de osso nas quais a regulação de cálcio está envolvida. Contudo, tem se tomado claro que o receptor de cálcio está amplamente distribuído em corpos vivos diferentes da paratireóide e dos rins dos resultados de análises de expressão genética etc. (Documentos de não-patente 2 e 3), e suas possibilidades para estarem envolvidos em várias funções biológicas e causas de doenças têm sido propostas. Por exemplo, é estimado que o receptor de cálcio está envolvido na funções do fígado, coração, pulmão, canal alimentar, linfócito,e pâncreas. Os inventores da presente invenção também têm confirmado que ele é expressado em uma ampla variedade de tecidos em corpos vivos por análises baseadas em RT-PCR usando RNAs extraídos de tecidos de rato. Dos pontos de vista acima mencionados, os valores de ativadores e de inibidores do receptor de cálcio estão presentemente rapidamente aumentando para as aplicações.

Além disso, cátions diferentes de cálcio, tal como cátion gadolínio, peptídeos básicos tal como poliarginina, poliamina tal como espermina, aminoácidos tal como fenílalanina, e assim por diante têm sido relatados como ativadores de receptor de cálcio (Documento de não-patente 4)· Embora muitos ativadores específicos tenham sido desenvolvidos até agora como ativadores de receptor de cálcio como descrito acima, há poucos compostos existindo em corpos vivos dentre eles, e as atividades dos compostos existindo em corpos vivos são muito baixas. Portanto, agentes terapêuticos para várias doenças contendo estes ativadores têm sérios problemas concernentes a reação colateral, permeabilidade e atividade. Por exemplo, embora seja sabido que aminoácidos atuam sobre os receptores de cálcio, é considerado que a sua aplicação real como os ativadores é difícil porque a atividade é muito fraca. Além disso, embora macromoléculas tal como poliarginina tenham sido relatadas como o ativador como descrito acima, é estimado que as funções são baseadas nas ações como cátions polivalentes possuindo estruturas irregulares. Isto é, não é sabido que um peptídeo possuindo uma estrutura específica é útil como um ativador de receptor de cálcio.

Ao mesmo tempo, no campo de gêneros alimentícios, substâncias de gosto têm sido aplicadas por muitos anos. Em particular, substâncias possuindo os cinco gostos básicos, a saber, gosto doce, gosto salgado, gosto ácido, gosto amargo, e umami (gosto delicioso), e substâncias intensificadoras destes têm sido amplamente usadas como temperos. Como um conceito de gosto que não pode ser expressado com os gostos acima mencionados, há “kokumi”. Kokumi significa um gosto que não pode ser expressado com os cinco gostos básicos, e significa um gosto que intensifica não apenas os gostos básicos mas também gostos marginais dos gostos básicos, tais como espessura, crescimento (enchimento da boca), continuidade, e harmonia. Vários métodos para conferir kokumi têm sido relatados até agora, e glutationa (Documento de Patente 1), produtos aquecidos de gelatina e tropomiosina (Documento de Patente 2), compostos contendo grupo sulfona (Documento de Patente 3), um peptídeo contendo a seqüência Asn-His (Documento de Patente 4), e assim por diante têm sido relatados.

Embora o desenvolvimento de várias substâncias que conferem kokumi tenha sido tentado como descrito acima, e a comercialização tenha sido feita principalmente para extratos de produtos naturais, há presentemente muitos poucos exemplos de isolamento de um componente de kokumi puro de um extrato de produto natural, tal como glutationa e N-(4-metil-5-oxo-l-imidazolin-2-il-sarcosina.

Portanto, o desenvolvimento de substâncias que conferem kokumi elevadamente efetivas, seguras e baratas é desejado, e um método conveniente e elevadamente sensível para a triagem de uma substância que confere kokumi é necessário para este propósito.

[Documento de não-patente 1] Nature, 1993 Dec 9;366(6455):575-80 [Documento de não-patente 2] J. Endocrinol., 2000 May, 165(2):173-7 [Documento de não-patente 3] Eur. J. Pharmacol., 2002 Jul. 5, 447(2-3):271-8 [Documento de não-patente 4] Cell Calcium., 2004 Mar., 35(3):209-16 [Documento de Patente 1] Patente Japonesa de No. 1464928 [Documento de Patente 2] Publicação Publicada de Patente Japonese (KOKAI) de No. 10-276709 [Documento de Patente 3] Publicação Publicada de Patente Japonese (KOKAI) de No. 8-289760 [Documento de Patente 4] W02004/096836 Descrição da Invenção [Problemas a serem solucionados pela invenção] Um objetivo da presente invenção é proporcionar um método conveniente e elevadamente sensível para triagem de uma substância que confere kokumi, um agente que confere kokumi elevadamente efetivo, seguro e barato, um método para produzir alimento ou bebida tal como alimento, tempero, e bebida conferido(a) com kokumi, e alimento ou bebida conferido(a) com kokumi.

[Meio para solucionar os problemas] Como um resultado de uma pesquisa de ativadores do receptor de cálcio, os inventores da presente invenção verificaram que peptídeos de peso molecular baixo, incluindo glutationa, são capazes de ativar o receptor de cálcio. Além disso, visto que glutationa é conhecidamente uma substância que confere kokumi, eles avaliam se os peptídeos de pelo molecular baixo como ativadores do receptor de cálcio conferido com kokumi, e verificaram que os peptídeos de peso molecular baixo conferiram kokumi. A presente invenção foi realizada baseado nestas descobertas.

Isto é, a presente invenção proporciona os seguintes. (1) Um método para triagem de uma substância que confere kokumi, que utiliza atividade de receptor de cálcio como um índice. (2) O método de triagem de acordo com (l), no qual a substância que confere kokumi intensifica pelo menos um de gosto salgado, umami, gosto doce, ou gosto ácido. (3) O método de triagem de acordo com (1) ou (2), que compreenda primeira etapa de reagir um receptor de cálcio e uma substância de teste e detectar atividade de receptor de cálcio, e a segunda etapa de medir o efeito de conferir kokumi das substâncias de teste para as quais a atividade de ativação de receptor de cálcio é detectada na primeira etapa. (4) Um agente que confere kokumi, que compreende uma substância que confere kokumi obtenível pelo método de acordo com qualquer um de (1) a (3) como um ingrediente ativo. (5) O agente que confere kokumi de acordo com (4), que compreende um ou mais tipos de substâncias selecionadas de γ-Glu-X-Gly (X representa um aminoácido ou resíduo de aminoácido exceto para Cys), y-Glu-Val-Y (Y representa um aminoácido ou resíduo de aminoácido), γ-Glu-Ala, y-Glu-Gly, y-Glu-Cys, γ-Glu-Met, γ-Glu-Thr, γ-Glu-Val, y-Glu-Om, Asp-Gly, Cys-Gly, Cys-Met, Glu-Cys, Gly-Cys, Leu-Asp, D-Cys, y-Glu-Met(O), y-Glu-y-Glu-Val, y-Glu-Val-NH2, γ-Glu-Val-ol, y-Glu-Ser, γ-Glu-Tau, y-Glu-Cys(S-Me)(0), γ-Glu-Leu, y-Glu-Iíe, γ-GIu-t-Leu e y-Glu-Cys(S-Me). (6) O agente que confere kokumi de acordo com (5), no qual o X é Cys(SNO), Cys(S-alil), Gly, Cys(S-Me), Abu, ou Ser, e o Y é Gly, Vai, Glu, Lys, Phe, Scr, Pro, Arg, Asp, Met, Thr, Ilis, Om, Asn, Cys, ou Gin. (7) O agente que confere kokumi de acordo com qualquer um de (4) a (6), que intensifica gosto salgado, umami, gosto doce, ou gosto ácido. (8) Uma composição de alimento contendo um ou mais tipos de substâncias selecionadas do agente que confere kokumi de acordo com qualquer um de (4) a (7) e um ou mais tipos de substâncias selecionadas de outros compostos possuindo atividade de ativação de receptor de cálcio. (9) A composição de alimento de acordo com (6), na qual os outros compostos possuindo atividade de ativação de receptor de cálcio são cálcio, protamina, poliarginina, espermina, polilisina, glutationa, e cinacalcet. (10) Um método para produzir alimento ou bebida conferido(a) com kokumi, que compreende adicionar um ou mais tipos do agente que confere kokumi de acordo com qualquer um de (4) a (7) no alimento ou na bebida de modo que o alimento ou a bebida contenha 1 ppb em massa a 99,9% em massa do agente que confere kokumi. (11) Um método para produzir alimento ou bebida conferido(a) com kokumi, que compreende adicionar um tempero contendo 1 ppb em massa a 99,9% em massa de um ou mais tipos do agente que confere kokumi de acordo com qualquer um de (4) a (7) no alimento ou na bebida de modo que o alimento ou a bebida contenha 0,01 a 10% em massa do tempero. (12) Um alimento ou uma bebida conferido(a) com kokumi obtenível pelo método de acordo com (9) ou (10). (13) Uma composição contendo 1 ppb em massa a 99,9% cm massa de γ-Glu-Val-Gly e 1 ppb em massa a 99,9% em massa de um ou mais tipos de substâncias selecionadas de cálcio, protamina, poliargínina, espermina, polilisina, glutationa, e cinacalcet. (14) Uma composição compreendendo 1 ppb em massa a 99,9% em massa de um ou mais tipos de substâncias selecionadas de glutationa, protamina, polilisina, GABA e aquelas formas de sal, e 1 ppb em massa a 99,9% em massa de cálcio ou uma sua fomia de sal. (15) Um composto representado pela seguinte fórmula: γ-Glu-X-Gly (X representa Asn, Gin, His, Lys, Om ou Arg), ou γ-Glu-Val-Y (Y representa Leu, Ile, Ser, Thr, Met, Cys, Asp, Asn, Gin, Lys, Orn, Arg, Phe, Tyr, Pro, Hyp, Trp, His, ou Abu). (16) Uso de uma substância que confere kokumi obtenível pelo método de acordo com qualquer um de (1) a (3) como um agente que confere kokumi. (17) Um método para conferir kokumi a alimento ou bebida compreendendo adicionar uma substância que confere kokumi obtenível pelo método de acordo com qualquer um de (1) a (3) no alimento ou na bebida. Efeito da Invenção De acordo com a presente invenção, são proporcionados um método conveniente e elevadamente sensível para triagem de uma substância que confere kokumi, um agente que confere kokumi elevadamente efetivo, seguro e barato, que é obtenível pelo método de triagem, um método para produzir alimento ou bebida tal como alimento, tempero, e bebida conferido(a) com kokumi, e alimento ou bebida conferido(a) com kokumi. Breve Descrição dos Desenhos [Fig. 1] Desenho mostrando uma ação de cálcio sobre o receptor de cálcio. O cRNA de receptor de cálcio de humano foi introduzido em oócitos de Xenopus laevis por microinjeçâo. Foram registrados os valores de correntes de resposta intracelular que fluíram quando uma solução de cloreto de cálcio foi adicionada em uma concentração arbitrária. Os valores máximos de comentes intracelulares foram considerados valores de corrente de resposta. Foi confirmado que nenhuma resposta foi observada em oócitos introduzidos com água destilada por microinjeçâo como um controle.

[Fig. 2] Desenho mostrando uma ação de L-aminoácidos sobre o receptor de cáicio. O cRNA de receptor de cálcio de humano foi introduzido em oócitos de Xenopus laevis por microinjeçâo. Foram registrados os valores de correntes de resposta intracelular que fluíram quando uma solução de L-aminoácido 10 nrM foi adicionada. Os valores máximos de correntes intracelulares foram considerados valores de corrente de resposta. Foi confirmado que nenhuma resposta foi observada em oócitos introduzidos com água destilada por microinjeçâo como um controle.

[Fig. 3] Desenho mostrando uma ação de D-aminoácidos sobre o receptor de cálcio. O cRNA de receptor de cálcio de humano foi introduzido em oócitos de Xenopus laevis por microinjeçâo. Foram registrados os valores de correntes de resposta intracelular que fluíram quando uma solução de D-aminoácido 10 mM foi adicionada. Os valores máximos de correntes intracelulares foram considerados valores de corrente de resposta. Foi confirmado que nenhuma resposta foi observada em oócitos introduzidos com água destilada por microinjeção como um controle.

[Fig. 4] Desenho mostrando uma ação de peptídeos sobre o receptor de cálcio. O cRNA de receptor de cálcio de humano foi introduzido em oócitos de Xenopus laevis por microinjeção. Foram registrados os valores de correntes de resposta intracelular que fluíram quando uma solução de peptídeo foi adicionada em uma concentração arbitrária. Os valores máximos de correntes intracelulares foram considerados valores de corrente de resposta. Foi confirmado que nenhuma resposta foi observada em oócitos introduzidos com água destilada por microinjeção como um controle.

Melhor Modo dc Realizar a Invenção Daqui em diante, a presente invenção será explicada em detalhe.

Neste relatório descritivo, o “receptor de cálcio” também é chamado do receptor sensorial de cálcio (CaSR), e pertence à classe C de sete receptores de transmembrana. Neste relatório descritivo, a “atividade de receptor de cálcio” significa a ligação no acima mencionado receptor de cálcio para ativar a proteína ligante de nucleotídeo guanina e deste modo transmitir sinais. Ademais, neste relatório descritivo, o “ativador de receptor de cálcio” é uma substância que atua sobre o acima mencionado receptor de cálcio para ativar o receptor de cálcio e controlar as funções de células expressando o receptor de cálcio.

Neste relatório descritivo, “kokumi” significa um gosto que não pode ser expressado pelos cinco gostos básicos, gosto doce, gosto salgado, gosto ácido, gosto amargo, e umami, no qual, não apenas os gostos básicos, mas gostos marginais dos gostos básicos, tais como espessura, crescimento (enchimento de boca), continuidade, e harmonia são intensificados. Ademais, o “agente que confere kokumi” ou “substância que confere kokumi” refere-se a um agente ou a uma substância que pode intensificar os cinco gostos básicos, gosto doce, gosto salgado, gosto ácido, gosto amargo, e umami, e conferir gostos marginais dos gostos básicos, tais como espessura, crescimento (enchimento de boca), continuidade, e harmonia acompanhando os gostos básicos. Portanto, o agente que confere kokumi da presente invenção também pode ser usado como um agente intensificador de gosto doce, um agente intensificador de gosto salgado, um agente intensificador de gosto ácido, um agente intensificador de gosto amargo, ou um agente intensificador de umami. Como para a intensidade de kokumi, “gosto primeiro e intermediário” significa o gosto que é sentido durante o período dc 0 a 4 segundos após comer, e “gosto restante” significa o gosto que é sentido após 5 segundos após comer.

Neste relatório descritivo, todos os aminoácidos e os resíduos de aminoácido constituindo os peptídeos são L-isômeros, a não ser que sejam especificados de outro modo. <1> Método para triagem de substância que confere kokumi O método para triagem de uma substância que confere kokumi da presente invenção (daqui em diante também referido como o método de triagem da presente invenção) é caracterizado pelo uso da atividade de receptor de cálcio como um índice. Especificamente, o método de triagem da presente invenção compreenda primeira etapa de reagir um receptor de cálcio e uma substância de teste e detectar atividade de receptor de cálcio, e a segunda etapa de medir o efeito de conferir kokumi das substâncias de teste para as quais a atividade de ativação de receptor de cálcio é detectada na primeira etapa.

As etapas de processo específicas do método de triagem da presente invenção são exemplificadas abaixo. Contudo, as etapas do método de triagem da presente invenção não são limitadas a estas etapas. 1) Uma substância de teste é adicionada em um sistema de medição da atividade de receptor de cálcio para medir a atividade de receptor de cálcio, c a atividade de receptor de cálcio é medida. 2) São comparadas a atividade de receptor de cálcio obtida com a adição da substância de teste e a atividade de receptor de cálcio obtida sem a adição da substância de teste. 3) É escolhida uma substância de teste mostrando uma atividade estimulante mais alta de receptor de cálcio quando a substância de teste é adicionada. 4) É medido o efeito de conferir kokumi da substância de teste escolhida,c uma substância de teste possuindo um efeito que confere kokumi é escolhida. A atividade de receptor de cálcio é medida pelo uso de, por exemplo, um sistema de medição usando células expressando o receptor de cálcio. As células podem ser células endogenamente expressando o receptor de cálcio, ou células recombinantes introduzidas com um gene estranho de receptor dc cálcio. Como o mencionado acima sistema de medição de atividade de receptor de cálcio, qualquer sistema pode ser usado sem limitação particular desde que seja escolhido um sistema com o qual um ligante (ativador) extracelular específico para o receptor de cálcio seja adicionado nas células expressando o receptor de cálcio, a ligação (reação) do ativador e o receptor de cálcio possa ser detectada, ou um sinal detectável seja transmitido para dentro das células em resposta à ligação (reação) do ativador e o receptor de cálcio. Quando a reação do composto testado resulta em atividade de receptor de cálcio; tal composto testado é determinado como possuindo atividade de ativação de atividade de ativação de receptor de cálcio e composto que confere kokumi. O acima mencionado efeito que confere kokumi pode ser confirmado por um teste de gosto por um humano, ou semelhante. Ademais, a substância de teste usada para a triagem não é particularmente limitada, e compostos de peso molecular baixo, sacarídeos, peptídeos, proteínas, e assim por diante podem ser usados.

Como o acima mencionado receptor de cálcio, o receptor de cálcio de humano codificado pelo gene de receptor de cálcio de humano registrado com o Número de Acesso no GenBank de NM_000388 pode ser exemplificado como um exemplo preferido. Em adição, o receptor de cálcio não é limitado à proteína codificada pelo gene da seqüência acima mencionada, e pode ser uma proteína codificada por um gene possuindo uma homologia de 60% ou mais, preferivelmente 80% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais, em relação à seqüência acima mencionada, desde que a proteína possua a função de receptor de cálcio. O receptor GPRC6A e o receptor 5.24 receptor também são conhecidos como subtipos do receptor de cálcio, e podem ser usados na presente invenção. A função de receptor de cálcio pode ser examinada pela expressão de um gene de interesse em uma célula e pela medição das mudanças na corrente elétrica, ou na concentração de íon cálcio intracelular no momento da adição de cálcio. A fonte do receptor de cálcio não é particularmente limitada, e exemplos incluem, além do acima mencionado receptor de cálcio de humano, receptores de cálcio derivados de animais tais como camundongo, rato, e cão.

Como descrito acima, a atividade de receptor de cálcio pode ser confirmada pelo uso de células vivas que expressam um receptor de cálcio ou um seu fragmento, membranas celulares que expressam um receptor de cálcio ou um seu fragmento, um sistema in.vitro contendo uma proteína de um receptor de cálcio ou um seu fragmento, ou semelhante.

Um exemplo usando células vivas é mostrado abaixo. Contudo, confirmação da atividade de receptor de cálcio não é limitada a este exemplo. O receptor de cálcio pode ser expressado em células cultivadas tais como oócitos de Xenopus laevis, células de ovário de hamster, e células de rim de feto de humano. O receptor de cálcio pode ser expressado por clonagem de um gene de receptor de cálcio em um plasmídeo que pode conter um gene estranho e introdução do plasmídeo ou cRNA obtido pelo uso do plasmídeo como um modelo. Para detectar a reação, técnicas eletrofisiológicas, reagentes indicadores fluorescentes que indicam a elevação de nível de cálcio intracelular cálcio, e assim por diante, podem ser usados.

Expressão do receptor de cálcio é primeiro confirmada baseado sobre a resposta ao cálcio ou um ativador específico. Oócitos que mostraram corrente intracelular com cálcio em uma concentração de cerca de 5 mM ou células cultivadas que mostraram fluorescência do reagente indicador fluorescente com cálcio em uma concentração de cerca de 5 mM são usados. Dependência da concentração de cálcio é determinada pela mudança da concentração de cálcio. Então, uma substância de teste tal como um peptídeo é preparada para uma concentração de cerca de 1 μΜ a 1 mM, e adicionada nos oócitos ou células cultivadas, e é medida a atividade de receptor de cálcio da substância de teste tal como o peptídeo acima mencionado. <2> Agente que confere kokumi O agente que confere kokumi da presente invenção compreende uma substância que confere kokumi obtenível pelo método de triagem da presente invenção como um ingrediente ativo, O agente que confere kokumi da presente invenção contém, por exemplo, um ou mais tipos de substâncias selecionadas de γ-Glu-X-Gly (X representa um aminoácido ou resíduo dc aminoácido exceto para Cys), γ-Glu-Val-Y (Y representa um aminoácido ou resíduo de aminoácido), γ-Glu-Ala, γ-Glu-Gly, γ-Glu-Cys, y-Glu-Met, γ-Glu-Thr, γ-Glu-Val, γ-Ghi-Om, Asp-Gly, Cys-GIy, Cys-Met, Glu-Cys, Gly-Cys, Leu-Asp, D-Cys, y-Glu-Met(O), y-Glu-y-Glu-Val, y-Glu-Val-NH2, γ-Glu-Val-o), γ-Glu-Ser, γ-Glu-Tau, y-Glu-Cys(S-Me)(0), y-Glu-Leu, y- Glu-Ile, γ-Glu-t-Leu e y-Glu-Cys(S-Me) (daqui em diante também referidos como “peptídeos e aminoácidos usados na presente invenção”) como um ingrediente ativo. Estes peptídeos e aminoácidos também podem ser obtidos pelo método de triagem mencionado acima. Aqui, ‘aminoácido” significa, mas não é limitado a, aminoácidos neutros tais como Gly, Ala, Vai, Leu, Ile, Ser, Thr, Cys, Met, Asn, Gin, Pro e Hyp, aminoácidos ácidos tais como Asp e Glu, aminoácidos básicos tais como Lys, Arg e His, aminoácidos aromáticos tais como Phe, Tyr, Trp, e outros aminoácidos tais como Homoserina, Citrulina, Omítina, Ácido alfa-Amino-butílico, Norvalina, Norleucina e Taurina.

No presente relatório descritivo, abreviações para resíduos de aminoácido são as seguintes: (1) Gly: Glicina (2) Ala: Alanina (3) Vai: Valina (4) Leu: Leucina (5) Ile: Isoleucina (6) Met: Metionina (7) Phe: Fenilaíanina (8) Tyr: Tirosina (9) Trp: Triptofano (10) His: Histidina (11) Lys: Lisina (12) Arg: Argínina (13) Ser: Serina (14) Thr: Treonina (15) Asp: Ácido Aspártico (16) Glu: Ácido Glutâmico (17) Asn: Asparagina (18) Gin: Glutamina (19) Cys: Cisteína (20) Pro: Prolina (21) Om: Omitina (22) Sar: Sarcosina (23) Cit: Citrulina (24) N-Val: Norvalina (25) N-Leu: Norleucina (26) Abu: ácido alfa-Amino-butílico (27) Tau: Taurina (28) Hyp: Hidróxi-prolina (29) t-Leu: terc-leucina Ademais, “resíduo de aminoácido” significa vários tipos de derivados de amínoácidos acima mencionados, aqueles podem ser exemplificados como, mas não são limitados a, aminoácidos incomuns, amínoácidos não-naturais, aminoálcoois, aminoácidos substituídos cuja cadeia lateral de aminoácido, tais como grupo carbonila, grupo amino e grupo tiol, está substituído com vários substituintes. Tais substituintes incluem grupos alquila, grupo acila, grupo hidroxila, grupo amino, grupo alquil-amino, grupo nitro, grupo sulfonila e vários grupos de proteção. Tais aminoácidos substituídos incluem, por exemplo, Arg (NO2): N-y-nitro-argínina, Cys (SNO): S-nitro-cisteína, Cys (S-Me): S-metil-cisteína, Cys (S-alil): S-alil-cisteína, Val-NH2: valinamida, Val-ol: valinol (2-amino-3-metil-I-butanol).

No presente relatório descritivo, y-Glu-Cys(SNO)-Gly possui a seguinte fómiula estrutural, e o “(0)” nas fórmulas y-Glu-Met(O) e y-Glu-Cys(S-Me)(0) indica uma estrutura de sulfóxido. Ο “(γ)” nas fórmulas y-Glu indica que ácido glutâmico se liga em outro aminoácido via posição y do grupo carboxila no ácido glutâmico. S-nitrosojlutatíxjjia (GNSO) γ-Glu-X-Gly (X representa um aminoácido ou resíduo de aminoácido exceto para Cys), γ-Glu-Val-Y (Y representa um aminoácido ou resíduo de aminoácido), γ-Glu-AIa, γ-Glu-Gly, γ-Glu-Cys, y-Glu-Met, y-Glu-Thr, γ-Glu-Val, y-Glu-Om, Asp-Gly, Cys-Gly, Cys-Met, Glu-Cys, GJy-Cys, Leu-Asp, D-Cys, y-Glu-Met(O), y-Glu-y-Glu-Val, y-Glu-Val-NH2, y-Glu-Val-ol, y-Glu-Scr, γ-Glu-Tau, y-Glu-Cys(S-Me)(0), y-Glu-Leu, y-Glu-Ile, y-Glu-t-Leu, e y-Glu-Cys(S-Me) conferem kokumi. Portanto, y-Glu-X-Gly (X representa um aminoácido ou resíduo de aminoácido exceto para Cys), y-Glu-Val-Y (Y representa um aminoácido ou resíduo de aminoácido), γ-Glu-Ala, y-Glu-Gly, y-Glu-Cys, γ-Glu-Met, y-Glu-Thr, γ-Glu-Val, y-Glu-Om, Asp-Gly, Cys-Giy, Cys-Met, Glu-Cys, Gly-Cys, Leu-Asp, D-Cys, y-Glu-Met(O), y-Glu-y-Glu-Val, y-Glu-Val-NH2, y-Glu-Val-ol, y-Glu-Ser, γ-Glu-Tau, y-Glu-Cys(S-Me)(0), γ-Glu-Leu, y-GIu-lle, y-Glu-t-Leu e y-Glu-Cys(S-Me) (daqui em diante também referidos como “peptídeos e aminoácidos usados na presente invenção”) podem ser usados como agentes que conferem kokumi. Os peptídeos e aminoácidos usados na presente invenção podem ser independentemente usados, ou podem ser usados como uma mistura de dois ou mais tipos arbitrários dos mesmos. Dentre estes, compostos possuindo uma fórmula estrutural: y-Glu-X-Gly (X representa Cys(SNO), Cys(S-alil), Gly, Cys(S-Me), Abu, ou Ser), ou γ-Glu-Val-Y (Y representa Gly, Vai, Glu, Lys, Phe, Ser, Pro, Arg, Asp, Met, Thr, His, Om, Asn, Cys, ou Gin) são preferidos.

Dentre estes, compostos possuindo uma fórmula estrutural·, γ-Glu-X-Gly (X representa Asn, Gin, His, Lys, Om ou Arg), e γ-Glu-Val-Y (Y representa Leu, Ile, Ser, Thr, Met, Cys, Asp, Asn, Gin, Lys, Om, Arg, Phe, Tyr, Pro, Hyp, Trp, His, ou Abu) são substâncias novas recém-sintetizadas pelos inventores da presente invenção, e a presente invenção inclui a invenção destes compostos. Ademais, dentre estas substâncias novas, γ-Glu-X-Gly (X representa Asn, Gin, His, Lys, Om ou Arg) e γ-Glu-Val-Y (Y representa Ser, Thr, Met, Cys, Asp, Asn, Gin, Lys, Om, Arg, Pro ou His) são preferidas.

Embora as concentrações limites (concentrações mínimas permitindo sentir o gosto) de peptídeos de teste conhecidos sejam cerca de 0,2% (1/10 da concentração limite de MSG), e portanto a sua praticabilidade seja insatisfatória (J. Agr. Food Chem., vol. 23, No.l, 49-53 (1975)), os compostos da presente invenção mostram atividade intensificadora de kokumi de uma concentração extremamente baixa de cerca de 0,0001 a 0,1%, e assim são compostos extremamente úteis que possuem atividade extremamente elevada.

Como os peptídeos e amínoácídos mencionados acima usados na presente invenção, se estiverem disponíveis como produtos comerciais, aqueles poderão ser usados. Ademais, os peptídeos podem ser obtidos pelo uso adequado de uma técnica conhecida tal como (1) um método de síntese química deles, ou (2) um método de síntese deles por uma reação enzímática. Visto que o número de resíduos dos resíduos de aminoácido contidos dos peptídeos usados na presente invenção é comparativamente tão pequeno quanto 2 ou 3 resíduos, um método de síntese química deles é conveniente. Quando são quimicamente sintetizados, os oligopeptídeos podem ser sintetizados ou semi-sintetizados pelo uso de um sintetizador de peptídeos. Exemplos do método de síntese química deles incluem, por exemplo, um método de síntese de peptídeo em fase sólida. Os peptídeos sintetizados como descrito acima podem ser purificados por meios normais, por exemplo, cromatografía de troca iônica, cromatografía líquida de desempenho alto em fase reversa, cromatografía de afinidade, e assim por diante. Um tal método de síntese de peptídeo em fase sólida e a seguinte purificação de peptídeo são bem conhecidos neste campo técnico.

Ademais, os peptídeos usados na presente invenção também podem ser preparados por uma reação enzimática. Por exemplo, o método descrito na Publicação de Patente Internacional W02004/011653 pode ser usado. Isto é, também podem ser preparados pela reação de um aminoácido ou dipeptídeo cuja terminação carboxila é esterificada ou amidada e um aminoácido possuindo um grupo amino livre (por exemplo, um aminoácido cujo grupo carboxila está protegido) na presença de uma enzima produtora de peptídeo, e purificação do dipeptídeo ou tripeptídeo produzido. Exemplos de enzima produtora de peptídeo Incluem cultura de microorganismos possuindo uma capacidade para produzir peptídeos, células microbianas separadas de tal cultura, produto produzido de células de tais microorganismos, enzimas produtoras de peptídeo derivadas de tais microorganismos, e assim por diante.

Os peptídeos e aminoácidos usados na presente invenção também incluem aqueles na forma de um sal. Quando os peptídeos e aminoácidos usados na presente invenção estão na forma de um sal, podem ser sais farmacologicamente aceitáveis. Exemplos de um sal com um grupo ácido tal como um grupo carboxila na fórmula incluem sais de amônio, sais com metais alcalinos tais como sódio, e potássio, sal com metais alcalino-terrosos tais como cálcio, e magnésio, sais de alumínio, sais de zinco, sais com aminas orgânicas tais como trietil-amina, ctanol-amina, morfolina, pirrolidina, piperidina, piperazina, e dicliclo-hexil-amina, e sais com aminoácidos básicos tais como arginina, e lisina. Exemplos de sais com um grupo básico no caso de um grupo básico existir na fórmula incluem sais com ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido sulfurico, ácido fosfórico, ácido nítrico, e ácido bromídrico, sais como ácidos carboxílicos orgânicos tais como ácido acético, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido maleico, ácido fiimárico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido tânico, ácido butírico, ácido hibenzóico, ácido pamóico, ácido etanóíco, ácido decanóico, ácido teóclíco, ácido salicílico, ácido lático, ácido oxálico, ácido mandélico, e ácido málico, e sais com ácidos sulfônicos orgânicos tais como ácido metano-sulfômco, ácido benzeno-sulfônico e ácido p-tolueno-sulfônico. O método para usar substâncias que conferem kokumi obtida pelo método de triagem da presente invenção, e agentes que conferem kokumi contendo um ou mais tipos de substâncias selecionadas dos peptídeos e aminoácidos usados na presente invenção como um ingrediente ativo não é particularmente limitado, e podem ser usados pela adição deles em alimento ou bebida tais como temperos, alimentos, e bebidas.

As substâncias que conferem kokumi obtidas pelo método de triagem da presente invenção podem ser usadas pela adição em alimento ou bebida tais como temperos, alimentos, e bebidas independentemente ou em combinação com outros vários aditivos etc..

Ademais, o agente que confere kokumi da presente invenção pode consistir de, por exemplo, apenas um ou mais tipos de substâncias selecionadas dos peptídeos e aminoácidos acima mencionados usados na presente invenção; adicionalmente, também pode ser constituído com os compostos existentes possuindo atividade que confere kokumi (tais como glutationa e alanina) ou outros vários aditivos etc. arbitrariamente adicionados. Além disso, o agente que confere kokumi da presente invenção pode conter um ou mais tipos de compostos existentes possuindo atividade de ativação de receptor de cálcio, e uma tal composição também cai dentro do escopo da presente invenção.

Exemplos dos compostos existentes acima mencionados possuindo atividade de ativação de receptor de cálcio incluem cátions tais como cátions cálcio e gadolínio, peptídeos básicos tais como poliarginina e polilisina, poliaminas tal como putrescina, espermina e espermidina, proteínas tal como protamina, aminoácidos tais como fenilalanína e glutationa, cinacalcet, e assim por diante. Estes compostos também podem estar em qualquer sua forma de sal aceitável. A propósito, foi verificado pelos presentes inventores que glutationa possui atividade de ativação de receptor de cálcio.

Também, os presentes inventores também têm verificado que as atividade que conferem kokumi daqueles compostos existentes possuindo atividade que confere kokumi tal como glutationa bem como o agente que confere kokumi da presente invenção também podem ser melhoradas quando formuladas em uma composição com compostos possuindo atividade de ativação de receptor de cálcio; isto é, uma tal composição também caí dentro do escopo da presente invenção.

Como os aditivos mencionados acima, qualquer um daqueles conhecidos como sendo capazes de serem adicionados e misturados com alimento ou bebida tais como temperos, alimentos, e bebidas podem ser usados sem limitação particular. Exemplos de tais aditivos incluem, por exemplo, perfumes, sacarídeos, edulcorantes, fibras dietéticas, vitaminas, aminoácidos tal como glutamato de sódio(MSG), ácidos nucleicos tal como inosina-monofosfato (IMP), sais inorgânicos tal como cloreto de sódio, água, e assim por diante. A quantidade de substância que confere kokumi que é obtida no método de triagem da presente invenção ou de agente que confere kokumi da presente invenção usado com respeito ao alimento ou à bebida pode ser uma quantidade efetiva para conferir kokumi, e é adequadamente ajustada dependendo do propósito. Contudo, é por exemplo, no caso de tempero, alimento, ou bebida, pode ser de 1 ppb em massa a 99,9% em massa, preferivelmente 10 ppb em massa a 99,9% em massa, mais preferivelmente 10 ppm em massa a 10% em massa com respeito ao tempero, gênero alimentício, ou bebida, em termos de quantidade total de agente que confere kokumi da presente invenção, ou substância que confere kokumi.

Portanto, pela adição de um ou mais tipos de substâncias que conferem kokumi obtidas pelo método de triagem da presente invenção, ou de agentes que conferem kokumi da presente invenção em alimento ou bebida de modo que o alimento ou a bebida deve conter aproximadamente 1 ppb em massa a 99,9% em massa, preferivelmente 10 ppb em massa a 99,9% em massa, mais preferivelmente 10 ppm em massa a 10% em massa de substâncias ou agentes, alimento ou bebida conferido(a) com kokumi podem ser produzidos.

Ademais, alimento ou bebida conferido(a) com kokumi também pode ser preparado(a) pela adição de um tempero contendo 1 ppb em massa a 99,9% em massa de um ou mais tipos de substâncias que conferem kokumi obtidas pelo método de triagem da presente invenção, ou de agentes que conferem kokumi da presente invenção em alimento ou bebida de modo que o alimento ou a bebida deve conter 0,01 a 10% em massa, preferivelmente 0,1 a 10% em massa, de tempero.

Forma da substância que confere kokumi obtida pelo método de triagem da presente invenção ou do agente que confere kokumi da presente invenção no momento de sua adição em alimento ou bebida pode ser pó seco, pasta, solução, ou semelhante, e as suas propriedades físicas não são particularmente limitadas.

Exemplos Daqui em diante, a presente invenção será mais especificamente explicada com referência aos exemplos. Contudo, o escopo da presente invenção não é limitado a estes exemplos. <Exemplo 1> <Preparação de gene (cRNA)> O gene do receptor de cálcio foi preparado como segue. Sobre a base da seqüência de DNA registrada em NCBI (receptor de cálcio: NM 000388), oligoDNAs sintéticos (iniciador direto (N) e iniciador inverso (C)) usados para PCR foram planejados (Tabela 1, SEQ ID NOS: 1 e 2). Tabela 1 OligoDNAs sintéticos (iniciador direto (N) e iniciador inverso (C), h: humano) Pelo uso de cDNA de rim de humano (Clontech) como um material, os iniciadores mostrados em Tabela 1 (hCASR_N (SEQ ID NO: 1) e hCASRC (SEQ ID NO: 2)) foram sintetizados, e PCR foi realizada pelo uso de Pfü ultra DNA Polimerase (Stratagene) sob as seguintes condições. Após uma reação a 94°C por 3 minutos, um ciclo de reação a 94°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos, e 72°C por 2 minutos foi repetido 35 vezes, e então uma reação foí interrompida a 72°C por 7 minutos. Se amplificação foi alcançada por PCR foi detectada pela realização de eletroforese em agarose, coloração com um reagente de coloração de DNA, e irradiação de ultravioleta. Os comprimentos de cadeia dos produtos de PCR foram confirmados pela comparação com marcadores de DNA de tamanhos conhecidos simultaneamente submetidos à eletroforese. O vetor plasmídeo pBR322 (Takara) foi digerido com a enzima de restrição EcoRV. O fragmento de gene amplificado por PCR foi ligado no sítio de divagem do plasmídeo pelo uso de Kit de Ligação (Promega). A cepa DH5a de Escherichia coli foi transformada com cada solução de reação de ligação, e um transformante hospedando o plasmídeo no qual o produto de amplificação por PCR foi clonado foi selecionado. O produto de amplificação por PCR foi confirmado por análise de seqüência de DNA. Pelo uso deste plasmídeo recombinante como um modelo juntamente com um kit de preparação de cRNA (Ambion), cRNA do gene de receptor de cálcio foi preparado. <ExempIo 2> <Preparação de várias amostras>

Como amostras de L-aminoácido, 23 tipos de aminoácidos de grau especial, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, valina, ornitina, taurina (todos estes de Ajinomoto), e hidróxi-prolina (Nakarai Tesque), foram usados. Como D-Cys e D-Trp (Nakarai Tesque) e cloreto de . cálcio, aqueles de grau especial foram usados. Ademais, as amostras de peptídeo, γ-Glu-Cys-Gly (Sigma Aldrich Japan), y-Glu-Cys(SNO)-Gly (Dojin Chemical Laboratory), γ-Glu-Ala (Bachem Feinchemikalíen AG), γ-Glu-Gly (Bachem Feinchemikalíen AG), γ-Glu-Cys (Sigma Aldrich Japan), γ-Glu-Met (Bachem Feinchemikalíen AG), γ-Glu-Abu-Gly (Abu: ácido a-amino-butírico, Bachem Feinchemikalien AG), γ-Glu-Thr (Kokusan Chemical), y-Glu-Val (Kokusan Chemical), γ-Glu-Leu (produto manufaturado sob contrato), γ-Glu-Ile (produto manufaturado sob contrato), γ-Glu-Om (Kokusan Chemical), Asp-Gly (produto manufaturado sob contrato), Cys-Gly (produto manufaturado sob contrato), Cys-Met (produto manufaturado sob contrato), Glu-Cys (produto manufaturado sob contrato), Gly-Cys (produto manufaturado sob contrato), Leu-Asp (produto manufaturado sob contrato), y-Glu-Val-Val (produto manufaturado sob contrato), γ-Glu-Val-Glu (produto manufaturado sob contrato), γ-Glu-Val-Lys (produto manufaturado sob contrato), y-Glu-y-Glu-Val (produto manufaturado sob contrato), y-Glu-Gly-Gly (produto manufaturado sob contrato), γ-Ghi-Val-Phe (produto manufaturado sob contrato), γ-Glu-Val-Ser (produto manufaturado sob contrato), y-Glu-Val-Pro (produto manufaturado sob contrato) y-Glu-Val-Arg(produto manufaturado sob contrato), y-Glu-Val-Asp(produto manufaturado sob contrato), y-Glu-Val-Met(produto manufaturado sob contrato), y-Glu-Val-Thr(produto manufaturado sob contrato), y-Glu-Val- His(produto manufaturado sob contrato), γ-Glu- Vai-A sn(p ro duto manufaturado sob contrato), y-Glu-Val-Gln(produto manufaturado sob contrato), y-Glu-Val-Cys(produto manufaturado sob contrato), γ-Glu-Val-Om(produto manufaturado sob contrato) e y-Glu-Ser-Gly(produto manufaturado sob contrato) foram usados. Glutamina e cisteína foram preparados sob uso, e as outras amostras foram armazenadas a -20°C após preparação. Como os peptídeos, aqueles possuindo uma pureza de 90% ou mais alta foram usados. Como apenas para γ-Glu-Cys, um possuindo uma pureza de 80% ou mais alta foi usado. Quando a solução de dissolução de cada amostra mostrou um pH ácido ou alcalino, a solução foi ajustada para um pH aproximadamente neutro pelo uso de NaOH ou HC1. A solução usada para dissolução de aminoácidos e peptídeos, preparação de oócitos de Xenopus laevis, e cultura dos oócitos teve a seguinte composição: NaCl 96 mM, KC12 mM, MgCl21 mM, CaCl21,8 mM, Hepes 5 mM, pH 7,2. <Exemplo 3> <Síntese de y-Glu-VaI-Gly>

Boc-Val-OH (8,69 g, 40,0 mmol) e Gly-OBzl*HCl (8,07 g, 40,0 mmol) foram dissolvidos em cloreto de metileno (100 ml), e a solução foi mantida a 0°C. Trietil-amina (6,13 ml, 44,0 mmol), HOBt (1-hidróxi-benzol-triazol, 6,74 g, 44,0 mmol), e WSC*HC1 cloridrato de (l-etil-3-(3-dimetil-amino-propíl j-carbodiimida, 8,44 g, 44,0 mmol) foram adicionados na solução, e a mistura foi agitada durante a noite na temperatura ambiente. A mistura reacional foi concentrada sob pressão reduzida, e o resíduo foi dissolvido em acetato de etila (200 ml). A solução foi lavada com água (50 ml), solução aquosa de ácido cítrico a 5% (50 ml x duas vezes), salmoura saturada (50 ml), solução aquosa de hidrogeno-carbonato de sódio a 5% (50 ml x duas vezes), e salmoura saturada (50 ml). A camada orgânica foi seca sobre sulfato de magnésio anidro, sulfato de magnésio foi removido por filtração, e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi recristalizado em acetato de etila/n-hexano para obter Boc-Val-Gly-OBzl (13,2 g, 36,2 mmol) como cristais brancos.

Boc-Val-Gly-OBzl (5,47 g, 15,0 mmol) foi adicionado em solução de dioxano/HCl 4 N (40 ml), e a mistura foi agitada na temperatura ambiente por 50 minutos. Dioxano foi removido por concentração sob pressão reduzida, n-hexano (30 ml) foi adicionado no resíduo, e a mistura foi concentrada sob pressão reduzida. Este procedimento foi repetido 3 vezes para quantitativamente obter H-Val-Gly-OBzl*HCl.

Os acima H-VaI-Gly-OBzl»HCl e Z-Gíu-OBzl (5,57 g, 15,0 mmol) foram dissolvidos em cloreto de metileno (50 ml), e a solução foi mantida a 0°C. Trietil-amina (2,30 ml, 16,5 mmol), HOBt (1-hidróxi-benzol-triazol, 2,53 g, 16,5 mmol), e WSOHC1 cloridrato de (1 -etil-3-(3 -dimetil-amino-propil)-carbodiimida, 3,16 g, 16,5 mmol) foram adicionados na solução, e a mistura foi agitada na temperatura ambiente por 2 dias. A mistura reacional foi concentrada sob pressão reduzida, e o resíduo foi dissolvido em acetato de etila aquecido (1500 ml). A solução foi lavada com água (200 ml), solução aquosa de ácido cítrico a 5% (200 ml x duas vezes), salmoura saturada (150 ml), solução aquosa de hidrogeno-carbonato de sódio a 5% (200 ml x duas vezes), e salmoura saturada (150 ml). A camada orgânica foi seca sobre sulfato de magnésio anidro, sulfato de magnésio foi removido por filtração, e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. Os cristais depositados foram coletados por filtração, e secos sob pressão reduzida para obter Z-Glu(Val-Gly-OBzl)-OBzl (6,51 g, 10,5 mmol) como cristais brancos. O acima Z-Glu(Val-Gly-OBzl)-OBzl (6,20 g, 10,03 mmol) foi suspenso em etanol (200 ml), e adicionado com paládio 10% / carbono (1,50 g), e a reação de redução foi realizada a 55°C por 5 horas sob uma atmosfera de hidrogênio. Durante a reação, 100 ml no total de água foram gradualmente adicionados. O catalisador foi removido por filtração usando um funil Kiriyama, e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para a metade do volume. A mistura reacional foi adicionalmente filtrada através de um filtro de membrana, e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em um volume pequeno de água, e adicionado com etanol para depositar cristais, e os cristais foram coletados por fíltração, e secos sob pressão reduzida para obter pó branco de v-Glu-Val-Gly (2,85 g, 9,40 mmol). ESí-MS:(M+H)+= 304,1 Ή-NMR (400 MHz, D20) ô (ppm): 0,87 (3H, d, J=6,8 Hz), 0,88 (3H, d, J=6,8 Hz), 1,99-2,09 (3H, m), 2,38-2,51 (2H, m) 3,72 (1H, t, J=6,35 Hz), 3,86 (1H, d, J=17,8 Hz), 3,80 (1H, d, M7,8 Hz), 4,07 (1H, d, J=6,8 Hz) <Exemplo 4> <Síntese de y-Glu-Cys(S-Me)-GIy [Cys(S-Me): S-metil-cisteína]>

Glutationa reduzida (15,0 g, 48,8 mmol) foi adicionada em água (45 ml), e hidróxido de sódio (4,52 g, 2,2 equivalentes, 107 mmol) foi adicionada em porções na mistura enquanto a mistura era borbulhada com nitrogênio. Iodeto de metila (4,56 ml, 1,5 equivalentes, 73 mmol) foi adicionado na mistura, e a mistura foi vedada e agitada na temperatura ambiente por 2 horas. A mistura reacional foi ajustada para pH 2 a 3 com ácido clorídrico concentrado, adicionado com etanol (150 ml), e armazenada durante a noite em um refrigerador. Quando matéria oleosa foi separada, o sobrenadante foi removido. Quando a matéria oleosa restante foi dissolvida em água e gradualmente adicionada com etanol, a matéria oleosa parcialmente cristalizada foi depositada. Portanto, o líquido sobrenadante foi removido de novo. O resíduo foi dissolvido em água (300 ml), adsorvido em uma resina de troca iônica (Dowex 1-acetato, 400 ml) uma coluna foi cheia com a mesma, e após lavagem com água, ela eluída com solução aquosa de ácido acético 1 N. O eluato foi concentrado sob pressão reduzida, e precipitado em água/etanol para obter um pó branco de y-Glu-Cys(S-Me)-Gly (5,08 g, 15,8 mmol). FAB-MS: (MH-1)+ = 322 ^-NMR (400 MHz, D,0) δ (ppm): 2,14 (3H, s), 2,15-2,22 (2H, m), 2,50-2,58 (2H, m), 2,86 (1H, dd, J=9,0 Hz, J=14,0 Hz), 3,03 (1H, dd, 3=5,0 Hz, 3=14,0 Hz), 3,84 (1H, t, J=6,5 Hz), 3,99 (2H, S), 4,59 (1H, dd, J=5,0 Hz, J=9,0 Hz) <ExempIo 5> <Síntese de outros peptídeos> y-Glu-Met(O), y-Glu-Val-NH2, γ-Glu-Val-ol, γ-Glu-Ser, y-Glu-Tau, y-Glu-Cys(S-Me)(0), y-Glu-t-Leu, y-Glu-Cys(S-alil)-Gly, e y-Glu-Cys(S-Me) foram sintetizados em uma maneira similar àquelas dos Exemplos 3 e 4. <Exemp!o 6> <Avaliação da atividade de ativação de receptor de cálcio>

Para avaliação da atividade de ativação de receptor de cálcio, foi usado um método de medição da corrente iônica de Cl dependente da concentração de íon Ca usando um sistema de expressão de oócito de Xenopus laevis. Se cada ativador é adicionado nos oócitos de Xenopus laevis expressando o receptor de cálcio, aumenta os íons Ca intracelulares. Então, o canal de Cl dependente de concentração de íon Ca abre, e o valor de corrente intracelular muda como uma corrente iônica. Pela medição da mudança neste valor de corrente intracelular, pode ser conhecido se a atividade de ativação de receptor de cálcio está ou não presente.

Especifícamente, o abdome de Xenopus laevis foi aberto, e uma batelada de ovos foi retirada e tratada com solução de colagenase 1% a 20°C por 2 horas para obter oócitos individuais. Nos oócitos, foram introduzidos 50 nl de cDNA de receptor 1 pg/μΐ ou 50 nl de água esterilizada por um oócito pelo uso de um microcapilar de vidro, e os oócitos foram cultivados a Í8°C por 2 ou 3 dias. Para a cultura, foi usada uma solução obtida pela adição de ácido pirúvico 2 mM, 10 U/ml de penicilina, e 10 pg/nil de estreptomicina na solução mencionada no Exemplo 2. Após a cultura, uma solução de teste foi adicionada nos oócitos introduzidos com cRNA ou água esterilizada. Medição eletrofísiológica foi realizada pelo uso de um amplificador, Geneclamp500 (Axon), e programa de computador de gravação, AxoScope 9,0 (Axon). Os oócitos foram clampados por voltagem a -70 mV pelo método de clampagem por voltagem de eletrodo duplo, e a corrente intracelular foi medida via o canal de íon Cl dependente da concentração de íon Ca. O valor máximo da corrente intracelular foi considerado como o valor de corrente de resposta. <Exemplo 7> <Avaliaçao da ativação de receptor de cálcio de cáício> A atividade de ativação de receptor de cálcio de cálcio foi medida pelo uso do método descrito Exemplo 6. Isto é, oócitos introduzidos com cRNA do receptor de cálcio ou água esterilizada foram preparados, e clampados por voltagem a -70 mV pelo método de clampagem por voltagem de eletrodo duplo. Nos oócitos clampados por voltagem, cálcio foi adicionado (2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM), e foi medida a corrente de resposta de Cl dependente de concentração de íon Ca. Os resultados são mostrados em Fig. 1. Destes resultados, foi confirmado que cRNA do receptor de cálcio introduzido nos oócitos foi funcionalmente expressado. Ademais, visto que os oócitos introduzidos com água não responderam até mesmo ao cálcio em concentração alta, foi confirmado que o receptor de cálcio não é expressado nos próprios oócitos. <Exemplo 8> <Avaliação da atividade de ativação de receptor de cálcio de L-aminoácidos>

Atividade de ativação de receptor de cálcio de L-aminoácidos foi avaliada pelo uso do método descrito em Exemplo 6. Isto é, oócitos introduzidos com cRNA do receptor de cálcio ou água esterilizada foram preparados, e clampados por voltagem a -70 mV pelo método de clampagem por voltagem de eletrodo duplo. Nos oócitos clampados por voltagem, foi adicionada(o) alanína (10 mM), arginina(10 mM), asparagina (10 mM), ácido aspártico (10 mM), cisteína (10 mM), glutamina (10 mM), ácido glutâmico (10 mM), glicina (10 mM), histidina (10 mM), isoleucina (10 mM), leucina (10 mM), lisina (10 mM), mctionina (10 mM), fenilalanina (10 mM), prolina (10 mM), serina (10 mM), treonina (10 mM), triptofano (10 mM), tirosina (10 mM), valina (10 mM), omitina (10 mM), taurina (10 mM), ou hidróxi-prolina (10 mM), e foi medida a corrente de resposta de Cl dependente da concentração de íon Ca. Os resultados são mostrados em Fig. 2. Por estes resultados, foi demonstrado que cisteína, histidina, fenilalanina, triptofano, e tirosina tiveram atividade definida de ativação de receptor de cálcio. Como para os aminoácidos acima mencionados, a atividade de ativação foi relatada em Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000 Abril 25,97(9):4814-9. <Exemplo 9> <Avaliação da atividade de ativação de receptor de cálcio de D-cisteína>

Atividade de ativação de receptor de cálcio de D-cisteína foi avaliada pelo uso do método descrito em Exemplo 6. Isto é, oócitos introduzidos com cRNA do receptor de cálcio ou água esterilizada foram preparados, e clampados por voltagem a -70 mV pelo método de clampagem por voltagem de eletrodo duplo. Nos oócitos clampados por voltagem, foi adicionada(o) D-cisteína (10 mM), L-cisteína (10 mM), D-triptofano (10 mM), ou L-triptofano (10 mM), e foi medida a corrente de resposta de Cl dependente da concentração de íon Ca. Os resultados são mostrados em Fig. 3. Por estes resultados, foi demonstrado que D-cisteína tiveram atividade definida de ativação de receptor de cálcio. <Exemplo 10> <Avaliação da atividade de ativação de receptor de cálcio de peptídeos>

Atividade de ativação de receptor de cálcio de peptídeos foi avaliada pelo uso do método descrito em Exemplo 6. Isto é, oócitos introduzidos com cRNA do receptor de cálcio ou água esterilizada foram preparados, e clampados por voltagem a -70 mV pelo método de clampagem por voltagem de eletrodo duplo. Nos oócitos clampados por voltagem,foi adicionada(o) y-GIu-Cys-Gly (50 μΜ), y-Glu-Cys(SNO)-G)y (50 μΜ), γ-Glu-Ala (50 μΜ), γ-Glu-Gly (500 μΜ), γ-Glu-Cys (50 μΜ), γ-Glu-Met (500 μΜ), γ-Glu-Thr (50 μΜ), γ-Glu-Val (50 μΜ), y-Glu-Om (500 μΜ), Asp-Gly (1 mM), Cys-GIy (1 mM), Cys-Met (1 mM), Glu-Cys (50 μΜ), Gly-Cys (500 μΜ), ou Leu-Asp (1 mM), e foi medida a corrente de resposta de Cl dependente da concentração de íon Ca. Os resultados são mostrados em Fig. 4. Por estes resultados, foi demonstrado que os peptídeos acima mencionados tiveram atividade definida de ativação de receptor de cálcio. <Exemplo 11> <Avaliação da atividade de ativação de receptor de cálcio de peptídeos>

Atividade de ativação de receptor de cálcio de peptídeos foi avaliada na mesma maneira que aquela do Exemplo 10. Cada um dos peptídeos mostrados em Tabela 2 foi adicionado nos oócitos clampados por voltagem a 1.000 μΜ, 300 μΜ, 100 μΜ, 30 μΜ, 10 μΜ, 3 μΜ, 1 μΜ, 0,3 μΜ, e 0,1 μΜ, e foi medida a corrente de resposta de Cl dependente da concentração de íon Ca. A concentração mais baixa com a qual a corrente foi detectada foi mostrada em Tabela 2 como a atividade. Destes resultados, tomou-se claro que 32 tipos de peptídeos tiveram atividade de ativação de receptor de cálcio.

Tabela 2 <Exemplo 12> <Atividade que confere kokumi dos peptídeos e dos aminoácidos usados na presente invenção>

Exemplos típicos são selecionados dos peptídeos e aminoácidos, cuja atividade de ativação de receptor de cálcio foi confirmada: γ-Glu-X-Gly (X representa Cys(SNO), Cys(S-alil), Gly, Cys(S-Me), Abu, ou Ser), γ-Glu-Val-Y (Y representa Gly, Vai, Glu, Lys, Phe, Ser, Pro, Arg, Asp, Met, Thr, His, Om, Asn, Cys, ou Gin), γ-Glu-Ala, y-Glu-Gly, γ-Glu-Cys, y-Glu-Met, γ-Glu-Thr, γ-Glu-Val, γ-Glu-Om, Asp-Gly, Cys-Gly, Cys-Met, Glu- Cys, Gly-Cys, Leu-Asp, D-Cys, y-GIu-Met(O), y-Glu-y-Glu-Val, y-Glu-Val-NH2, y-Glu-Val-ol, y-Glu-Ser, γ-Glu-Tau, y-Glu-Cys(S-Me)(0), y-Glu-Leu, y-Glu-Zle, γ-Glu-t-Leu e y-Glu-Cys(S-Me), e se possuem ou não atividade que confere kokumi foi determinado por um teste de avaliação sensorial. O teste de avaliação sensorial foi realizado como segue. Um água destilada contendo glutamato de sódio (0,05 g/dl), inosina-monofosfato (0,05 g/dl), e cloreto de cálcio (1 mM), aliina (S-alil-cisteína sulfóxido: experimento de controle de atividade que confere kokumi) , y-Glu-Cys-Gly, y-Glu-Cys, γ-Glu-Ala, ou γ-Glu-Val foi misturado como uma amostra em uma quantidade de 0,2 g/dl, e se tinham ou não uma atividade que confere kokumi foi determinado. Soluções de amostra que se tomaram ácidas após a dissolução nas amostras foram ajustadas para pH 6,8 a 7,2 com NaOH antes do uso. Os resultados são mostrados em Tabela 3.

Tabela 3 Atividade que confere kokumi de ativadores de receptor de cálcio <Exemplo 13> <Atividadc que confere kokumi de peptídeos usados na presente invenção> A intensidade da atividade conferente kokumi de cada peptídeo, cuja atividade de ativação de receptor de cálcio foi confirmada, foi medida por um teste de avaliação sensorial quantitativo. O teste de avaliação sensorial quantitativo foi realizado como segue. Em água destilada contendo glutamato de sódio (0,05 g/dl), inosina-monofosfato (0,05 g/dl), e cloreto de sódio (0,5 g/dl), y-Glu-Cys-Gly (glutationa), γ-Glu-Ala, γ-GJu-Met, ou γ-Glu-Val foi misturado como uma amostra em uma quantidade de 0,1 g/dl, e a intensidade da atividade que confere kokumi foi medida. Soluções de amostra que se tomaram ácidas após a dissolução nas amostras foram ajustadas para pH 6,8 a 7,2 com NaOH antes do uso. Avaliação foi representada com escores de avaliação sensorial sobre a amostra de controle (0 ponto) e a amostra adicionada com glutationa (3 pontos), e o teste foi realizado com n = 3. Os resultados são mostrados em Tabela 4.

Tabela 4 <Exemplo 14> <Atividade que confere kokumi de peptídeos usados na presente invenção> A intensidade da atividade que confere kokumi de cada peptídeo, cuja atividade de ativação de receptor de cálcio foi confirmada, foi medida por um teste de avaliação sensorial quantitativo. O teste de avaliação sensorial quantitativo foi realizado como segue. Em água destilada contendo glutamato de sódio (0,05 g/dl), inosina-monofosfato (0,05 g/dl), e cloreto de sódio (0,5 g/dl), γ-Glu-Cys-Gly (glutationa), γ-Glu-Cys, γ-Glu-Val, ou γ-Glu-Val-Gly foi misturado como uma amostra em uma quantidade de 0,1 g/dl, ou 0,01 g/dl como requerido, e a intensidade da atividade que confere kokumi foi medida. Soluções de amostra que se tomaram ácidas após a dissolução nas amostras foram ajustadas para pH 6,8 a 7,2 com NaOH antes do uso. Avaliação foi representada com escores de avaliação sensorial sobre a amostra de controle (0 ponto) e a amostra adicionada com glutationa (3 pontos), e o teste foi realizado com n = 5. Os resultados são mostrados em Tabela 5.

Tahpla ^ *Não-mensurável: Atividade que confere kokumi foi muito forte e não pôde ser medida pela avaliação sensorial <Exemplo 15> <Atividade que confere kokumi de peptídeos usados na presente invcnçâo> A intensidade da atividade que confere kokumi de cada peptídeo, cuja atividade de ativação de receptor de cálcio foi confirmada, foi medida por um teste de avaliação sensorial quantitativo. O teste de avaliação sensorial quantitativo foi realizado como segue. Em água destilada contendo glutamato de sódio (0,05 g/dl), inosina-monofosfato (0,05 g/dl), e cloreto de sódio (0,5 g/dl), γ-Glu-Cys-Gly (glutationa), γ-Glu-Abu-Gly, ou γ-Glu-Val-Gly foi misturado como uma amostra em uma quantidade de 0,1 g/dl ou 0,01 g/dl, e a intensidade da atividade que confere kokumi foi medida. Soluções de amostra que se tomaram ácidas após a dissolução nas amostras foram ajustadas para pH 6,8 a 7,2 com NaOH antes do uso. Avaliação foi representada com escores de avaliação sensorial sobre a amostra de controle (0 ponto) e a amostra adicionada com glutationa (3 pontos), e o teste foi realizado com n = 12. Os resultados são mostrados em Tabela 6.

Tabela 6 <Exemplo 16> <Àtividade de peptídeos usados na presente invenção sobre gostos básicos> A intensidade da atividade sobre gostos básicos de cada peptídeo, cuja atividade de ativação de receptor de cálcio foi confirmada, foi medida por um teste de avaliação sensorial quantitativo. O teste de avaliação sensorial quantitativo foi realizado como segue. Em água destilada contendo glutamato de sódio (0,2 g/dl) como uma solução padrão de umami, sacarose (5 g/dl) como uma solução padrão de gosto doce, cloreto de sódio (0,7 g/dl) como uma solução padrão de gosto salgado, ou ácido cítrico (0,05 g/dl) como uma solução padrão de gosto ácido, γ-Glu-Cys-Gly (glutationa) ou γ-Glu-Val-Gly foi misturado como uma amostra em uma concentração de 0,0001 a 1 g/dl, e a intensidade da atividade sobre gostos básicos foi medida para cada amostra.

Soluções de amostra que se tomaram ácidas após a dissolução das amostras com respeito às soluções padrão sem as amostras foram ajustadas com NaOH para pH não menor ou maior em 0,2 do que o pH das soluções padrão antes do uso. Avaliação foi representada com os seguintes escores de avaliação sensorial: 0 ponto para amostra de controle, 1 ponto para atividade razoavelmente intensa comparada com controle, e 2 pontos para atividade intensa comparada com controle, e o teste foi realizado com n = 12. As amostras mostraram atividade intensificadora de gosto básico em concentrações dentro da faixa de concentração larga acima mencionada. Os resultados para concentrações típicas são mostradas em Tabela 7.

Tabela 7 <Exemplo 17> <Atividade de peptídeos usados na presente invenção para conferir kokumi à sopa de caldo de carne> A intensidade da atividade para conferir kokumi à sopa de caldo de carne de cada peptídeo, para o qual a atividade de ativação de receptor de cálcio foi confirmada, foi medida por um teste de avaliação sensorial quantitativo. O teste de avaliação sensorial quantitativo foi realizado como segue. Sopa de caldo de carne foi preparada pela dissolução de pó de sopa de caldo de came (35% de cloreto de sódio, 18% de glutamato de sódio, 0,2% de inosina-monofosfato, 0,3% de pó de pimenta branca, 0,5% de pó de pimenta preta, 8,0% de pó de extrato de came bovina, 3,0% de pó de vinho branco, 2,0% de pó de aipo, 8,0% de pó de extrato de repolho chinês, 2,5% de pó de extrato de cebola, 25,5% de lactose) em uma concentração de 5 g/dl. Nesta sopa de caldo de came, γ-Glu-Cys-Gly (glutationa) ou γ-Glu-Val-Gly foi misturado como uma amostra em uma concentração de 0,0001 a 1 g/dl, e a intensidade da atividade que confere kokumi foi medida para cada amostra. A sopa de caldo de came com as amostra que se tomaram ácidas após dissolução das amostras com respeito à sopa de caldo de came sem as amostras foram ajustadas com NaOH para pH não menor ou maior em 0,2 do que o pH da sopa de caldo de came sem as amostras antes do uso. Avaliação foi representada com os seguintes escores de avaliação sensorial: 0 ponto para amostra de controle, 3 pontos para atividade intensa comparada com controle, e 5 pontos para atividade extremamente intensa comparada com controle, e o teste foi realizado com n = 12. As amostras mostraram atividade que confere kokumi em concentrações dentro da faixa de concentração larga acima mencionada, Os resultados para concentrações típicas são mostradas em Tabela 8.

Tabela 8 <ExempIo 18> <Atividade de peptídeos usados na presente invenção para conferir kokumi à sopa clara japonesa> A intensidade da atividade para conferir kokumi à sopa clara de cada peptídeo, para o qual a atividade de ativação de receptor de cálcio foi confirmada, foi medida por um teste de avaliação sensorial quantitativo. O teste de avaliação sensorial quantitativo foi realizado como segue. Sopa clara japonesa foi preparada pela adição de 0,5 g/dl de molho de soja e 0,6 g/dl de cloreto de sódio em estoque alga marinha bonito (solução obtida pela adição de 5 g de alga marinha seca em 3 L de água, aquecimento da água, adição de 25 g de flocos de bonito secos imediatamente antes da fervura, e então filtração da água contendo alga marinha e flocos de bonito). Nesta sopa clara, γ-Glu-Cys-Gly (glutationa) ou γ-Glu-Val-Gly foi misturado como uma amostra em uma concentração de 0,0001 a 1 g/dl, e a intensidade da atividade que confere kokumi foi medida para cada amostra. A sopa clara com as amostras que se tomaram ácidas após dissolução das amostras com respeito à sopa clara sem as amostras foram ajustadas com NaOH para pH não menor ou maior em 0,2 do que o pH da sopa clara sem as amostras antes do uso. Avaliação foi representada com os seguintes escores de avaliação sensorial: 0 ponto para amostra de controle, 3 pontos para atividade intensa comparada com controle, e 5 pontos para atividade extremamente intensa comparada com controle, e o teste foi realizado com n = 12. As amostras mostraram atividade que confere kokumi em concentrações dentro da faixa de concentração larga acima mencionada. Os resultados para concentrações típicas são mostradas em Tabela 9.

Tabela 9 <Excmplo 19> <Atividade de peptídeos usados na presente invenção para conferir kokumi à sopa de milho> A intensidade da atividade para conferir kokumi à sopa de milho de cada peptídeo, para o qual atividade de ativação de receptor de cálcio foi confirmada, foi medida por um teste de avaliação sensorial quantitativo. O teste de avaliação sensorial quantitativo foi realizado como segue. Em sopa de milho comercialmente disponível, γ-Glu-Cys-Gly (glutationa) ou γ-Glu-Val-Gly foi misturado como uma amostra em uma concentração de 0,0001 a 1 g/dl, e a intensidade da atividade que confere kokumi foi medida para cada amostra. A sopa de milho com as amostras que se tomaram ácidas após dissolução das amostras com respeito à sopa de milho sem as amostras foram ajustadas com NaOH para pH não menor ou maior em 0,2 do que o pH da sopa de milho sem as amostras antes do uso. Avaliação foi representada com os seguintes escores de avaliação sensorial: 0 ponto para amostra de controle, 3 pontos para atividade intensa comparada com controle, e 5 pontos para atividade extremamente intensa comparada com controle, e o teste foi realizado com n = 12. As amostras mostraram atividade que confere kokumi em concentrações dentro da faixa de concentração larga acima mencionada. Os resultados para concentrações típicas são mostradas em Tabela 10.

Tabela 10 <Exemplo 20> <Atividadc de peptídeos usados na presente invenção para conferir kokumi ao molho de caril> A intensidade da atividade para conferir kokumi ao molho de caril de cada peptídeo, para o qual a atividade de ativação de receptor de cálcio foi confirmada, foi medida por um teste de avaliação sensorial quantitativo. 0 teste de avaliação sensorial quantitativo foi realizado como segue. Em molho de caril foi preparado em uma maneira convencional pelo uso de mistura de farinha gorda de caril comercialmente disponível, γ-Glu-Cys-Gly (glutationa) ou γ-Glu-Val-Gly foi misturado como uma amostra em uma concentração de 0,0001 a 1 g/dl, e a intensidade da atividade que confere kokumi foí medida para cada amostra. Os molhos de caril com as amostras que se tomaram ácidas após dissolução das amostras com respeito à sopa de caril sem as amostras foram ajustados com NaOH para pH não menor ou maior em 0,2 do que o pH de da sopa de caril sem as amostras antes do uso. Avaliação foi representada com os seguintes escores de avaliação sensorial: 0 ponto para amostra de controle, 3 pontos para atividade intensa comparada com controle, e 5 pontos para atividade extremamente intensa comparada com controle, e o teste foi realizado com n = 12. As amostras mostraram atividade que confere kokumi em concentrações dentro da faixa de concentração larga acima mencionada. Os resultados para concentrações típicas são mostradas em Tabela 11.

Tabela 11 <Exemplo 21> <Atividade que confere kokumi observada quando peptídeos usados na presente invenção e aditivos tais como ativadores de receptor de cálcio conhecidos foram usados em combinação A intensidade da atividade que confere kokumi de cada peptídeo para o qual a atividade de ativação de receptor de cálcio foi confirmada, usado com um aditivo tal como ativadores de receptor de cálcio conhecidos em combinação foi medida por um teste de avaliação sensorial quantitativo. O teste de avaliação sensorial quantitativo foi realizado como segue. Em água destilada contendo glutamato de sódio (0,05 g/dl), inosina-monofosfato (0,05 g/dl), e cloreto de sódio (0,5 g/dl), 0,0001 a 1 g/dl de y-Glu-Cys-Gly (glutationa) ou y-Glu-Val-Gly, ou qualquer um destes peptídeos e outro ativador de receptor de cálcio (lactato de cálcio, protamina ou polilisína) ou GABA (concentração de adição: 0,0001 a 1 g/dl) foram misturados, e a intensidade da atividade que confere kokumi foi medida. Soluções de amostra que se tomaram ácidas após a dissolução nas amostras foram ajustadas para pH 6,8 a 7,2 com NaOH antes do uso. Avaliação foi representada com os seguintes escores de avaliação sensorial: 0 ponto para amostra de controle, 3 pontos para intensa atividade (como intensidade de 0,05 g/dl γ-Glu-Cys-Gly e 0,005 g/dl y-Glu-Val-Gly), e 6 pontos para atividade extremamente intensa (as o dobro da intensidade de 0,05 g/dl y-Glu-Cys-Gly e 0,005 g/dl y-Glu-Val-Gly) , e o teste foi realizado com n = 12. As amostras mostraram atividade que confere kokumi em concentrações dentro da faixa de concentração larga acima mencionada. Os resultados para concentrações típicas são mostradas em Tabela 12. Como um resultado, composto existente possuindo atividade que confere kokumi, glutationa, também mostra atividade que confere kokumi melhorada bem como agente que confere kokumi da presente invenção quando usado com ativador de receptor de cálcio existente ou semelhante tal como cálcio.

Tabela 12 Aplicabilidade Industrial Pela presente invenção, tem se tomado claro que os aminoácidos e peptídeos específicos possuindo atividade de ativação de receptor de cálcio também são úteis como substâncias que conferem kokumi. Em particular, como mostrado em Exemplos 12 to 21, vários tipos de dipeptídeos e tripeptídeos foram recém-descobertos como substâncias que conferem kokumi, e porque são peptídeos, podem ser usados no campo de gêneros alimentícios no qual segurança alta é demandada. Em adição, visto que um método para triagem de uma substância que confere kokumi utilizando ativação de receptor de cálcio como um índice tem sido desenvolvido, a denominada triagem de produtividade alta pode ser usada, e assim o desenvolvimento de uma substância de kokumi ainda mais elevadamente eficiente tem se tomado possível.

Embora a invenção tenha sido descrita em detalhe com referência às suas modalidades preferidas, será evidente para uma pessoa experiente na técnica que várias modificações podem ser feitas, e equivalentes empregados, sem se desviarem do escopo da invenção. Todas as referências aqui citadas são incorporadas como parte deste pedido como referências.

Claims (2)

1. Método para triagem de uma substância que confere kokumi, caracterizado pelo fato de utilizar atividade de receptor de cálcio como um índice, e em que o referido método compreende a primeira etapa de reagir um receptor de cálcio e uma substância de teste e detectar atividade de receptor de cálcio da substância de teste pela adição da substância de teste a um sistema de medição da atividade de receptor de cálcio expressando um receptor de cálcio e comparação da atividade de receptor dc cálcio obtida com a adição da substância de teste e da atividade de receptor de cálcio sem a adição da substância de teste, e a segunda etapa de medir o efeito de conferir kokumi das substâncias de teste para as quais a atividade de ativação de receptor de cálcio é detectada na primeira etapa pelo sistema de avaliação sensorial.

2, Método para triagem de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a substância que confere kokumi intensifica pelo menos um de gosto salgado, umami, gosto doce, ou gosto ácido.