BRPI0617806A2 - combinação de inibidores de histona desacetilase com radiação - Google Patents

Abstract

<B>COMBINAçãO DE INIBIDORES DE HISTONA DESACETILASE COM RADIAçãO<D>A presente invenção refere-se a compostos orgânicos de fórmu em particular, a composições farmacêuticas para uso em combinação com radiação ionizante para o retardo de progressão ou tratamento de uma doença proliferativa, especialmente uma doença de tumor sólido.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMBINA-ÇÃO DE INIBIDORES DE HISTONA DESACETILASE COM RADIAÇÃO".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a compostos orgânicos, em parti-cular, a composições farmacêuticas para uso em combinação com radiaçãoionizante para retardar a progressão ou para tratamento de uma doençaproliferativa, especialmente uma doença de tumor sólido.Sumário da Invenção

Foi verificado que certos inibidores de desacetilase, isto é,HDACs, são eficazes quando usados em combinação com radiação ionizan-te para retardar a progressão ou para tratamento de uma doença proliferati-va, especialmente uma doença de tumor sólido.Descrição Detalhada dos Desenhos

A figura 1 ilustra a fração média de sobrevivência e erro padrãopara cada tratamento usando LBH589 e 0-6 Gy em análise clonogênica decélulas de linhagens H460.

A figura 2 ilustra os resultados de análise citométrica de fluxocom Anexina V-FITC/PI do efeito na apopt-ose da inibição de HDAC por L-BH589.

A figura 3 ilustra a percentagem média e erro padrão de núcleospicnóticos determinados por coloração com DAPI para confirmar a capaci-dade de LBH589 de sensibilizar linhagens de células de câncer de pulmãohumano.

A figura 4 ilustra os Western imunoblots para caspase 3 clivadae actina. 'LBH589 induziu clivagem de caápase 3 para verificar o papel daapoptose em células tratadas com LBH589 e radiação.

A figura 5 ilustra o aumento expresso em número de vezes novolume de tumor (A) e o retardamento do crescimento do tumor (B) paracada grupo de tratamento com LBH589.

A figura 6A ilustra fotografias representativas da linhagem decélulas H23 tratadas com combinações de LBH589 e IR.

A figura 6B ilustra o número de focos γ-Η2ΑΧ presentes 24 horas após IR.

A figura 7 ilustra fotografias representativas da linhagem de cé-lulas H460 testada com anticorpos anti-HDAC4 e anticorpos secundáriosrotulados com rodamina então tratada com contracorante DAPI.

Descrição Detalhada da Invenção

Assim, a invenção provê um método para retardar a progressãoou para tratamento de uma doença proliferativa, espepialmente uma doençade tumor sólido em um paciente com necessidade de tratamento que incluiadministrar ao paciente um montante eficaz de um HDAC de fórmula (I):

<formula>formula see original document page 3</formula>

em que

Ri é H; halo; ou uma C1-C6alquila de cadeia reta, especialmentemetila, etila ou n-propila, sendo que os substituintes metila, etila e n-propilasão não substituídos ou substituídos por um ou mais substituintes descritosabaixo para substituintes^ãlquila;

R2 é selecionado entre H; C1-C10alquila, preferivelmente C1-C6alquila, por exemplo, metila, etila ou -CH2CH2-OH; C4-C9cicloalquila; C4-C9heterocicloalquila; C4-C9 heterocicloalquilalquila; cicloalquilalquila, por exem-plo, ciclopropilmetila; arila; heteroarila; arilalquila, por exemplo, benzila; hete-roarilalquila, por exemplo, piridilmetila; -(CH2)nC(O)R6; -(CH2)nOC(O)R6; ami-no acila; H0N-C(0)-CH=C(Ri)-aril-alquil-; e -(CH2)nR7;

R3 e R4 são iguais ou diferentes e, independentemente, H; C1-C6alquila, acila; ou acilamino, ou

R3 e R4, junto com o carbono ao qual eles estão ligados, repre-sentam C=O, C=S ou C=NR8; ou

R2, junto com o nitrogênio ao qual ele está ligado, e R3, juntocom o carbono ao qual ele está ligado, podem formar uma C4-Cg heteroci-cloalquila; uma heteroarila; uma polieteroarila; um polieterociclo não aromá-tico; ou um anel polieterocíclico misto de arHa e não arila;R5 é selecionado entre H; C1-C6alquila; C4-C9cicloalquila; C4-C9heterocicloalquila; acila; arila; heteroarila; arilalquila, por exemplo, benzila;heteroarilalquila, por exemplo, piridilmetila; policiclos aromáticos; policiclosnão aromáticos; policiclos mistos de arila e não arila; polieteroarila; poliete-rociclos não aromáticos; e polieterociclos mistos de arila e não arila;

n, ni, n2 e n3 são iguais ou diferentes e independentemente se-lecionados na faixa de 0-6, quando ni é 1 -6, cada átomo de carbono podeser opcional e independentemente substituído com R3 e/ou R4;

XeY são iguais ou diferentes e independentemente seleciona-dos entre H; halo; Ci-C4alquila, tais como CH3 e CF3; NO2; C(O)Ri; OR9;SR9; CN; e NR10R11;

R6 é selecionado entre H; CrC6alquila; C4-C9CiCloaIquiIa; C4-C9heterocicloalquila; cicloalquilalquila, por exemplo, ciclopropilmetila; arila; he-teroarila; arilalquila, por exemplo, benzila e 2-feniletenila; heteroarilalquila,por exemplo, piridilmetila; ORi2; e NR13R14;

R7 é selecionado entre OR15; SR15; S(O)R16; SO2R17; NR13Ri4; eNR12SO2R6;

R8 é selecionado entre H; OR15; NR13R14; C1-C4alquila; C4-C9cicloalquila; C4-C9heterocicloalquila; arila; heteroarila; arilalquila, por exem-plo, benzila; e heteroarilalquila, por exemplo, piridilmetila;

R9 é selecionado entre C1-C4BlquiIa, por exemplo, CH3 e CF3;C(0)-alquila, por exemplo, C(O)CH3; e C(O)CF3;

R1O e R11 são iguais ou diferentes e independentemente selecio-nados entre H; CrC4alquila; e -C(0)-alquila;

R12 é selecionado entre H; CrC6alquila; C4-C9cicloalquila; C4-C9heterocicloalquila; C4-C9heterocicloalquilalquila; arila; policiclos mistos dearila e não arila; heteroarila; arilalquila, por exemplo, benzila; e heteroarilal-quila, por exemplo, piridilmetila;

R13 e R14 são iguais ou diferentes e independentemente selecio-nados entre H; C1-C6alquila; C4-C9cicloalquila; C4-C9heterocicloalquila; arila;heteroarila; arilalquila, por exemplo, benzila; heteroarilalquila, por exemplo,piridilmetila; amino acila, ouR13 e R14, junto com o nitrogênio ao qual eles estão ligados, sãoC4-C6heterocicloalquila; heteroarila; polieteroarila; polieterociclo não aromá-tico; ou polieterociclo misto de arila e não arila;

R15 é selecionado entre H; C1-C6alquila; C4-C6cicloalquila; C4-C6heterocicloalquila; arila; heteroarila; arilalquila; heteroarilalquila; e(CH2)mZR12;

R16 é selecionado entre C1-C6alquila; C}4-C6cicloalquila; C4-C6heterocicloalquila; arila; heteroarila; polieteroarila; arilalquila; heteroarilalqui-la; e (CH2)mZR12;

R17 é selecionado entre C1-C6alquila; C4-C6cicloalquila; C4-C6heterocicloalquila; arila; policiclos aromáticos; heteroarila; arilalquila; hetero-arilalquila; polieteroarila e NR1SR14;

m é um inteiro selecionado entre 0-6; e

Z é selecionado entre O; NR13; S; e S(O)1

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

Como apropriado, "não substituído" significa que não há ne-nhum substituinte ou que os únicos substituintes são hidrogênio.

Substituintes de halo são selecionados entre flúor, cloro, bromoe iodo, preferivelmente flúor ou cloro.

Substituintes alquila incluem C1-Ce alquila de cadeia reta ou ra-mificada, a não ser que indicado o contrário. Exemplos de substituintesC1-Cealquila de cadeia reta ou ramificada incluem metila, etila, n-propila,2-propila, n-butila, sec-butila, t-butila e similares. A não ser que indicado ocontrário, os substituintes alquila incluem tanto grupos alquila não substituí-dos quanto grupos alquila que são substituídos por. um ou mais substituifitesadequados, incluindo insaturação, isto é, há uma ou mais duplas ou triplasC-C; acila; cicloalquila; halo; oxialquila; alquilamino; aminoalquila; acilamino;e OR15, por exemplo, alcóxi. Substituintes preferidos para grupos alquila in-cluem halo, hidróxi, alcóxi, oxialquila, alquilamino e aminoalquila.

Substituintes cicloalquila incluem grupos C3-C6cicloalquila, comociclopropila, ciclobutila, ciclopentila, cicloexila e similares, a não ser que es-pecificado o contrário. A não ser que indicado o contrário, substituintes ci-cloalquila incluem tanto grupos cicloalquila não substituídos quanto gruposcicloalquila que são substituídos por um ou mais substituintes adequados,incluindo CrCeaIquiIa, halo, hidróxi, aminoalquila, oxialquila, alquilamino eOR15, como alcóxi. Substituintes preferidos para grupos cicloalquila incluemhalo, hidróxi, alcóxi, oxialquila, alquilamino e aminoalquila.

A discussão acima de substituintes alquila e cicloalquila tambémse aplica às porções alquila de outros substituintes, como, sem limitação,alcóxi, alquil aminas, alquil cetonas, arilalquila, heteroarilalquila, alquilsulfoni-la, alquil éster e similares.

Substituintes heterocicloalquila incluem anéis alifáticos de 3 a 9membros, como anéis alifáticos de 4 a 7 membros, contendo de 1-3 hetero-átomos selecionados entre nitrogênio, enxofre, oxigênio. Exemplos de subs-tituintes heterocicloalquila adequados incluem pirrolidila, tetraidrofurila, te-traidrotiofuranila, piperidila, piperazila, tetraidropiranila, morfilino, 1,3-diaze-pam, 1,4-diazepam, 1,4-oxazepam e 1,4 -oxatiapam. A não ser que indicadoo contrário, os anéis são não substituídos ou substituídos nos átomos decarbono com um ou mais substituintes adequados, incluindo CrC6alquila;C4-C9cicloalquila; arila; heteroarila; arilalquila, por exemplo, benzila; heteroa-rilalquila, por exemplo, piridilmetila; halo; amino; alquil amino e OR15, porexemplo, alcóxi. A não ser que indicado o contrário, heteroátomos nitrogêniosão não substituídos ou substituídos por H, CrC4alquila; arilalquila, por e-xemplo, benzila; heteroarilalquila, por exemplo, piridilmetila; acila; aminoaci-la; alquilsulfonila; e arilsulfonila.

Substituintes cicloalquilalquila incluem compostos de fórmula-(CH2)n5-cicloalquila, em que n5 é um número de Substituintes alquilci-cloalquila adequados incluem ciclopentilmetila, ciclopentiletila, cicloexilmetilae similares. Tais substituintes não são substituídos ou são substituídos naporção alquila ou porção cicloalquila por um substituinte adequados, incluin-do aqueles listados acima para alquila e cicloalquila.

Substituintes arila incluem fenila não substituída e fenila substi-tuída com um ou mais substituintes adequados incluindo C1-C6alquila; ciclo-alquilalquila, por exemplo, ciclopropilmetila; O(CO)alquila; oxialquila; halo;nitro; amino; alquilamino; aminoalquila; alquil cetonas; nitrila; carboxialquila;alquilsulfonila; aminossulfonila; arilsulfonila e OR15, como alcóxi. Substituin-tes preferidos incluem C1-C6alquila; cicloalquila, por exemplo, ciclopropilme-tila; alcóxi; oxialquila; halo; nitro; amino; alquilamino; aminoalquila; alquil ce-tonas; nitrila; carboxialquila; alquilsulfonila; arilsulfonila e aminossulfonila.Exemplos de grupos arila adequados incluem C1-C4alquilfenila, C1-C4alcoxi-fenila, triflúormetilfenila, metoxifenila, hidroxietilfenila, dimetilaminofenila,aminopropilfenila, carbetoxifenila, metanossulfonilfenila e tolilsulfonilfenila.

Policiclos aromáticos incluem naftila, e naftila substituída por umou mais substituintes adequados incluindo C1-C6alquila; alquilcicloalquila,por exemplo, ciclopropilmetila; oxialquila; halo; nitro; amino; alquilamino; a-minoalquila; alquil cetonas; nitrila; carboxialquila; alquilsulfonila; arilsulfonila;aminossulfonila e OR15, como alcóxi.

Substituintes heteroarila incluem compostos com um anel aro-mático de 5 a 7-membros contendo um ou mais heteroátomos, por exemplo,de 1 -4 heteroátomos, selecionados entre N1OeS. Substituintes heteroarilaadequados incluem furila, tienila, pirrol, pirazol, triazol, tiazol, oxazol, piridina,pirimidina, isoxazolila, pirazina e similares. A não ser que indicado o contrá-rio, substituintes heteroarila não são substituídos ou são substituídos em umátomo de carbono com um ou mais substituintes adequados incluindo alqui-la, os substituintes alquila identificados acima, e outro substituinte heteroari-la. Átomos de nitrogênio são não substituídos ou substituídos por exemplopor R13; substituintes de N especialmente úteis incluem H, C1-C4alquila, aci-la, aminoacila e sulfonila.

Substituintes arilalquila irícluem grupos da fórmula -(CH2)n5-arila,-(CH2)n5-1-(CH-aril)-(CH2)n5-arila ou -(CH2)n5-1CH(aril)(arila), em que arila en5 são definidos acima. Esses substituintes arilalquila incluem benzila, 2-feniletila, 1-feniletila, tolil-3-propila, 2-fenilpropila, difenilmetila, 2-difeniletila,5,5-dimetil-3-fenilpentila e similares. Substituintes arilalquila são não substi-tuídos ou substituídos na porção alquila ou na porção arila ou em ambascomo descrito acima para substituintes alquila e arila.

Substituintes heteroarilalquila incluem grupos de fórmula -(CH2)nS-heteroarila, em que heteroarila e ns são definidos acima e o grupo ponte éligado a um carbono ou um nitrogênio da porção heteroarila, como 2-, 3- ou4-piridilmetila, imidazolilmetila, quinoliletila e pirrolilbutila. Substituintes hete-roarila são não substituídos ou substituídos como discutido acima para subs-tituintes heteroarila e alquila.

Substituintes amino acila incluem grupos da fórmula -C(O)-(CH2)n-C(H)(NRi3Ri4)-(CH2)n-Rs, em que n, R13, Ri4 e R5 são descritos aci-ma. Substituintes aminoacila adequados incluem aminoácidos naturais enão naturais, como glicinila, D-triptofanila, L-lisinila, D- ou L-homoserinila, 4-aminobutírico acila e ± -3-amin-4-hexenoíla.

Substituintes policíclicos não aromáticos incluem sistemas deanéis fundidos bicíclicos e tricíclicos onde cada anel pode ter 4 a 9 membrose cada anel pode conter zero, uma ou mais duplas e/ou triplas ligações.Exemplos adequados de policíclicos não aromáticos incluem decalina, oc-taidroindeno, peridrobenzocicloepteno e peridrobenzo-[f]-azuleno. Tais subs-tituintes são não substituídos ou substituídos como descrito acima para gru-pos cicloalquila.

Substituintes policíclicos mistos arila e não arila incluem siste-mas de anel fundidos bicíclicos e tricíclicos onde cada anel pode ter 4 a 9membros e pelo menos um anel é aromático. Exemplos adequados de poli-ciclos mistos arila e não arila incluem metilenodioxifenila, bis-metilenodio-xifenila, 1,2,3,4-tetraidronaftaleno, dibenzossuberano, diidroantraceno e 9H-flúoreno. Esses substituintes são não substituídos ou substituídos por nitroou como descrito acima para grupos cicloalquila. Substituintes polieteroarila incluem sistemas de anéiS fundidosbicíclicos e tricíclicos onde cada anel pode independentemente ter 5 ou 6membros e conter um ou mais heteroátomos, por exemplo, 1, 2, 3 ou 4 hete-roátomos, escolhidos entre O, N ou S de modo que o sistema de anel fundi-do seja aromático. Exemplos adequados de sistemas de anel de polieteroa-rila incluem quinolina, isoquinolina, piridopirazina, pirrolopiridina, furopiridina,indol, benzofurano, benzotiofurano, benzindol, benzoxazol, pirroloquinolina esimilares. A não ser que indicado o contrário, substituintes polieteroarila sãonão substituídos ou substituídos em um átomo de carbono por um ou maissubstituintes adequados, incluindo alquila, os substituintes alquila identifica-dos acima e um substituinte da fórmula -0-(CH2CH=CH(CH3)(CH2))i-3H. Á-tomos de nitrogênio são não substituídos ou substituídos, por exemplo, porR13; substituintes de N especialmente úteis incluem H1 Ci-C4alquila, acila,aminoacila e sulfonila.

Substituintes polieterocíclicos não aromáficos incluem sistemasde anel fundidos bicíclicos e tricíclicos onde cada anel pode ter 4 a 9 mem-bros, contêm um ou mais heteroátomos, por exemplo, 1,2,3 ou 4 héteroá-tomos, escolhidos entre O, N ou S e contêm zero ou uma ou mais duplas outriplas ligações C-C. Exemplos adequados de polieterociclos não aromáticosincluem hexitol, cis-peridro-cicloepta[t»]piridinila, decaidro-benzo[/)[1,4] oxa-zepinila, 2,8-dioxabiciclo[3.3.0]octano, hexaidro-tieno[3,2-£>]tiofeno, peridro-pirrolo[3,2-£>]pirrol, peridronaftiridina, peridro-1/-/-diciclopenta[b,e]pirano. Anão ser que indicado o contrário, substituintes polieterocíclicos não aromáti-cos são não substituídos ou substituídos em um átomo de carbono com umou mais substituintes, incluindo alquila e os substituintes de alquila identifi-cados acima. Átomos de nitrogênio são não substituídos ou substituídos porexemplo, por R13; substituintes de N especialmente úteis incluem H, C1-C4alquila, acila, aminoacila e sulfonila.

Polieterociclos mistos arila e não arila incluem sistemas de anéisfundidos bicíclicos e tricíclicos onde cada anel pode ter 4 a 9 membros, con-têm um ou mais heteroátomos escolhidos entre O, N ou S, sendo que pelomenos um dos anéis deve ser aromático. Exemplos adequados de poliete-rodeios mistos arila e não arila incluem 2,3-díídroindol, 1 ./2,3,4-tetraidro-quinolina, 5,11-diidro-10/-/-dibenz[b,e][1,4]diazepina, 5H-dibenzo[b,e][1,4]diazepina, 1,2-diidropirrolo[3,4-/?][1,5]benzodiazepina, 1,5-diidro-pirido[2,3-b][1,4]diazepin-4-ona, 1,2,3,4,6,11 -hexaidro-benzo[b]pirido[2,3-e][1,4]diazepin-5-ona. A não ser que indicado o contrário, substituintes polieterocíclicos mis-tos arila e não arila são não substituídos ou substituídos em um átomo decarbono com um ou mais substituintes adequados incluindo -N-OH, =N-OH1alquila e os substituintes alquila identificados acima. Átomos de nitrogêniosão não substituídos ou substituídos, por exemplo, por Ri3; substituintes deN especialmente adequados incluem H, C1-C4alquila, acila, aminoacila esulfonila.

Substituintes amino incluem aminás primárias, secundárias eterciárias e em forma salina, aminas quaternárias. Exemplos de substituintesamino incluem mono- e di-alquilamino, mono- e diaril amino, mono- e diari-lalquil amino, aril-arilalquilamino, alquil-arilamino, alquil-arilalquilamino e si-milares.

Substituintes sulfonila incluem alquilsulfonila e arilsulfonila, porexemplo, metano sulfonila, benzeno sulfonila, tosila e similares.

Substituintes acila incluem grupos de fórmula -C(O)-W, -OC(O)-W,-C(O)-O-W Ou -C(O)NR13R14l onde W é R16, H ou cicloalquilalquila.

Substituintes acilamino incluem substituintes de fórmula-N(R12)C(O)-W, -N(R12)C(O)-O-W e -N(R12)C(O)-NHOH e R12 e W são defi-nidos acima.

O substituinte R2 HON-CÍOJ-C^RO-aril-alquila- é um grupo defórmula

<formula>formula see original document page 10</formula>

Preferências para cada um dos substituintes incluem as seguin-tes:

R1 é H, halo ou uma CrC^IquiIa de cadeia reta;

R2 é selecionada entre H, C1-C6alquila, C4-C9ciclòalquila, C4-C9 heterocicloalquila, cicloalquilalquila, arila, heteroarila, arilalquila, heteroari-lalquila, -(CH2)nC(O)R6, amino acila e -(CH2)nR7;

R3 e R4 são iguais ou diferentes e independentemente selecio-nados entre H e C1-C6alquila, ou

R3 e R4, junto com o carbono ao qual eles estão ligados, repre-sentam C=O, C=S ou C=NR8;

R5 é selecionado entre H, C1-CeaIquiIa, C4-C9cicloalquila, C4-C9heterocicloalquila, arila, heteroarila, arilalquila, heteroarilalquila, um policicloaromático, um policiclo não aromático, um policiclo misto arila e não arila,polieteroarila, um polieterociclo não aromático, e um polieterociclo misto dearila e não arila;

n, n1, n2 e n3 são iguais ou diferentes e independentemente se-lecionados entre 0-6, quando nt é 1-6, cada carbono é não substituído ouindependentemente substituído com R3 e/ou R4; (

XeY são iguais ou diferentes e independentemente seleciona-dos entre H, halo, Ci-C4alquila, CF3, NO2, C(O)Ri, OR9, SR9, CN e NR10Rn;

R6 é selecionado entre H, CrC6alquila, C4-C9CiCloaIquiIa, C4-C9heterocicloalquila, alquilcicloalquila, arila, heteroarila, arilalquila, heteroarilal-quila, ORi2 e NRi3Ri4;

R7 é selecionado entre OR15, SRi5, S(O)R16, SO2R17, NR13Ri4 e

NR12SO2R6;

R8 é selecionado entre H, OR15, NR13R14, CrC6alquila, C4-C9cicloalquila, C4-C9heterocicloalquila, arila, heteroarila, arilalquila e heteroari-lalquila;

R9 é selecionado entre C1-C^lquilme C(0)-alquila;

R10 e R11 são iguais ou diferentes e independentemente selecio-nados entre H, C1-C^lquila e -C(0)-alquila;

R12 é selecionado entre H, CrC6alquila, C4-C9cicloalquila, C4-C9heterocicloalquila, arila, heteroarila, arilalquila e heteroarilalquila;

R13 e R14 são iguais ou diferentes e independentemente selecio-nados entre H, C1-Cealquila, C4-C9CicIoaIquiIa, C4-C9heterocicloalquila, arila,heteroarila, arilalquila, heteroarilalquila e amino'acila;

Ri5 é selecionado entre H, CfC6alquila, C4-C9cicloalquila, C4-C9heterocicloalquila, arila, heteroarila, arilalquila, heteroarilalquila e (C2)mZRi2;

Ri6 é selecionado entre CrC6alquila, C4-C9cicloalquila, C4-C9heterocicloalquila, arila, heteroarila, arilalquila, heteroarilalquila e (C2)mZRi2;

R-I7 é selecionado entre CrCeaIquiIa, C4-Cgcicloalquila, C4-C9heterocicloalquila, arila, heteroarila, arilalquila, heteroarilalquila e NRi3R14;

m é um inteiro selecionado entre 0-6; eZ é selecionado entre O, NRi3, S e S(O);ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

Compostos úteis de fórmula (I) incluem aqueles em que cadaum entre R1, X, Y, R3 e R4 é H, incluindo aqueles em que um entre n2 e n3 éO e o outro é 1, especialmente aqueles em que R2 é H ou -C2-C2-OH.

Um gênero adequado de compostos de hidroxamato é aquelede fórmula (Ia):

<formula>formula see original document page 12</formula>

em que

n4 é 0-3;

R2 é selecionado entre H, C1-C6alquila, C4-C9cicloalquilal C4-C9 heterocicloalquila, cicloalquilalquila, arila, heteroarila, arilalquila, heteroari-lalquila, -(C2)nC(O)R6, amino acila e -(C2)nR7; e

R5 é heteroarila; heteroarilalquila, por exemplo, piridilmetila;policiclos aromáticos; policiclos não-aromáticos; policiclos mistos arila e nãoarila; polieteroarilas ou arilas mistas; e polieterociclos não arila;

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

Outro gênero adequado de compostos de hidroxamato são a-queles de fórmula (Ia):

<formula>formula see original document page 12</formula>

em que

n4 é 0-3;

R2 é selecionado entre H, C1-C6alquila, C4-C9cicloalquila, C4-C9heterocicloalquila, cicloalquilalquila, arila, heteroarila, arilalquila, heteroari-lalquila, -(CH2)nC(O)R6, amino acila e -(C2)nR7;

R5 é arila; arilalquila; policiclos aromáticos; policiclos não a-romáticos e arila mistos; e policiclos não-arila, especialmente arila, como p-flúorfenila, p-clorofenila, p-0-CrC4alquilfenila, como p-metoxifenila, e p-CrC4 alquilfenila; e arilalquila, como benzila, orto-, meta- ou para-flúorbenzila,orto-, meta- ou para-clorobenzila, orto-, meta- ou para-mono, di- ou tri-O-CrC4alquilbenzila, como orto-, meta- ou para-metoxibenzila, m.p-dietoxibenzila,o,m,p-trimetoxibenzila e orto-, meta- ou para-mono, di- ou tri-Ci-C4 alquilfeni-la, como p-metila, m,m-dietilfenila;

ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

Outro gênero interessante é dos compostos de fórmula (Ib):

(Ib)<formula>formula see original document page 13</formula>

em que

R2 é selecionado entre H; C1-C6alquila; C4-C6cicloalquila; ciclo-alquilalquila, por exemplo, ciclopropilmetila; (CH2)2 4OR2I, onde R2I é H, me-tila, etila, propila e i-propila; e

"R11 é 1H-indol-3-ila, benzofuran-3-ila ou quinolin-3-ila não substi-tuídos, ou 1H-indol-3-ila substituído, como 5-flúor-1H-indol-3-ila ou 5-metóxi-1H-indol-3-ila, benzofuran-3-ila ou quinolin-3-ila;

ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

Outro gênero interessante de compostos de hidroxamato são oscompostos de fórmula (Ic):

<formula>formula see original document page 13</formula>

em que

o anel contendo Z1 é aromático ou não aromático, sendo osanéis não aromáticos saturados ou insaturados,Z1 é O, S ou N-R20;

R18 é H; halo; C1-C6alquila (metila, etila, t-butila); C3-C7 cicloal-quila; arila, por exemplo, fenila não substituída ou fenila substituída por 4-OC3 ou 4-CF3; ou heteroarila, como 2-furanila, 2-tiofenila ou 2-, 3- ou 4-pi-ridila;

R20 é H; C1-C6alquila; C1-Cealquil-C3-Cgcicloalquila, por exem-plo, ciclopropilmetila; arila; heteroarila; arilalquila, por exemplo, benzila; hete-roarilalquila, por exemplo, piridilmetila; acila, por exemplo, acetila, propionilae benzoíla; ou sulfonila, por exemplo, metanossulfonila, etanossulfonila,benzenossulfonila e toluenossulfonila;

A1 é 1, 2 ou 3 substituintes que são independentemente H;C1-Cealquila; -OR19; halo; alquilamino; aminoalquila; halo; ou heteroarilalqui-la, por exemplo, piridilmetila;

R19 é selecionado entre H; C1-C6alquila; C4-C9cicloalquila; C4-C9 heterocicloalquila; arila; heteroarila; arilalquila, por exemplo, benzila; hete-roarilalquila, por exemplo, piridilmetila e -(CH2CH=CH(CH3)(CH2))1-SH;

R2 é selecionado entre H, C1-Cealquila, C4-C9cicloalquila, C4-C9 heterocicloalquila, cicloalquilalquila, arila, heteroarila, arilalquila, heteror-ri-lalquila, -(CH2)nC(O)R6, amino acila e -(CH2)nR7;

v é O, 1 ou 2;

p é 0-3; e

q é 1-5 e r é O, ou

q é O e r é 1-5;

ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Os outrossubstituintes variáveis são como definido àcima.

Compostos especialmente úteis de fórmula (Ic), são aqueles emque R2 é H, ou -(CH2)pCH2OH, em que pé 1-3, especialmente aqueles emque R1 é H; como aqueles em que R1 é H e X e Y são, cada um, H, e emque q é 1-3 e r é O ou em que q é O e r é 1-3, especialmente aqueles em queZ1 é N-R20. Entre estes compostos R2 é preferivelmente H ou -CH2-CH2-OHe a soma de q com r é preferivelmente 1.

Outro gênero interessante de compostos de hidroxamato são oscompostos de fórmula (Id):

<formula>formula see original document page 15</formula>

em que

Z1 é O1 S ou N-R20;

R-18 é H; halo; C1-Cealquila (metila, etila, t-butila); C3-C7 cicloal-quila; arila, por exemplo, fenila não substituída ou fenila substituída com 4-OCH3 ou 4-CF3; ou heteroarila;

R2O é H; CrC6alquila, Ci-Cealquil-C3-Cgcicloalquila, por exemplo,ciclopropilmetila; arila; heteroarila; arilalquila, por exemplo, benzila; heteroa-rilalquila, por exemplo, piridilmetila; acila, por exemplo, acetila, propionila ebenzoíla; ou sulfonila, por exemplo, metanossulfonila, etanossulfonila, ben-zenossulfonila, toluenossulfonila);

Ai é 1, 2 ou 3 substituintes que são independentemente H, C1-C6alquila,-OR19 ou halo;

R19 é selecionado entre H; CrC6alquila; C^CgCidoalquila; C4-C9heterocicloalquila; arila; heteroarila; arilalquila, por exemplo, benzila; e hete-roarilalquila, por exemplo, piridilmetila;ρ é 0-3; eq é 1-5 e r é O, ouq é O e ré 1-5;

ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Os outrossubstituintes variáveis são como definido acima.

Compostos especialmente úteis de fórmula (Id), são aqueles emque R2 é H ou -(CH2)pCH2OH, em que pé 1-3, especialmente aqueles emque R1 é H; como aqueles em que R1 é H e X e Y são, cada um H, e em queq é 1 -3 e r é O ou em que q é O e r é 1 -3. Entre estes compostos R2 é prefe-rivelmente H ou -C2-C2-OH e a soma de q com r é preferivelmente 1.

A presente invenção refere-se adicionalmente a compostos deformula (le):

<formula>formula see original document page 16</formula>

ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Os substituintes variá-veis são como definido acima.

Compostos especialmente úteis de fórmula (le), são aqueles emque R18 é H, flúor, cloro, bromo, um grupo C1-C4alquila, um grupo C1-C4 al-quila substituído, um grupo C3-C7ciclo alquila, fenila não substituído, fenilasubstituído na posição para, ou um anel heteroarila, por exemplo, piridila.

Outro grupo de compostos úteis de fórmula (le), são aqueles emque R2 é H ou -(CH2)pCH2OH, em que pé 1-3, especialmente aqueles emque R1 é H; como aqueles em que R1 e H e X e Y são, cada um, H, e emque q é 1-3 e r é 0 ou em que q é 0 e r é 1-3. Entre estes compostos R2 épreferivelmente H ou -CH2-CH2-OH e a soma de q com r é preferivelmente1. Entre estes compostos ρ é preferivéiínente 1 e R3 é R4 são preferivelmen-te H.

Outro grupo de compostos úteis de fórmula (le), são aqueles emque R18 é H, metila, etila, t-butila, triflúormetila, cicloexila, fenila, 4-metoxife-nila, 4-triflúormetilfenila, 2-furanila, 2-tiofenila, ou 2-, 3- ou 4-piridila em queos substituintes 2-furanila, 2-tiofenila e 2-, 3- ou 4-piridila são não substituí-dos ou substituídos como descrito acima para anéis heteroarila; R2 é H ou -(CH2)pCH2OH, em que ρ é 1-3; especialmente aqueles em que R1 é H e X eY são, cada um, H, e em que q é 1-3 e r é 0 ou em que q é 0 e r é 1-3. Entreestes compostos R2 é preferivelmente H ou -CH2-CH2-OH e a soma de q e ré preferivelmente 1.

Esses compostos de fórmula (le), em que R20 é H ou C1-C6 al-quila, especialmente H1 são membros importantes de cada um dos subgêne-ros de compostos de fórmula (Ie) descritos acima.

N-hidróxi-3-[4-[[(2-hidroxietil)[2-(1H-indol-3-il)etil]-amino]metil]fenil]-2E-2-propenamida, /V-hidróxi-3-[4-[[[2-(1 H-indol-3-il)etil]-amino]metil] fe-nil]-2E-2-propenamida e A/-hidróxi-3-[4-[[[2-(2-metil-1 H-indol-3-il)-etil]-amino]metil]fenil]-2E-2-propenamida ou um sal farmaceuticamente aceitável dosmesmos são importantes compostos de fórmula (le).

A presente invenção refere-se adicionalmente aos compostos deformula (lf):

<formula>formula see original document page 17</formula>

ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Os substituintes variá-veis são como definido acima.

Compostos úteis de fórmula (If), incluem aqueles em que R2 é Hou -(CH2)pCH2OHlOm que pé 1-3, especialmente aqueles em que Ri é H;como aqueles em que Ri é H e X e Y são, cada um, H, e em que q é 1-3 e ré 0 ou em que q é O e r é 1 -3. Entre estes compostos R2 é preferivelmente Hou -CH2-CH2-OH e a soma de q e r é preferivelmente 1.

N-hidróxi-3-[4-[[[2-(benzofur-3-il)-etil]-amino]metil]fenil]-2E-2-pro-penamida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é um compos-to importante de fórmula (If).

Os compostos descritos acima são freqüentemente usados naforma de um sal farmaceuticamente aceitável. Sais farmaceuticamente acei-táveis incluem, quando apropriado, sais de adição de base e sais de adiçãode ácido farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, sais metálicos, comosais de metais alcalinos e sais de metais alcalino terrosos, sais de amônio,sais de adição de amina orgânica e sais de adição de aminoácido e sais sul-fonato. Sais de adição de ácido incluem sais de adição de ácido inorgânico,como cloridrato, sulfato e fosfato; e sais de adição de ácido orgânico, comoalquil sulfonato, arilsulfonato, acetato, maleato, fumarato, tartarato, citrato elactato. Exemplos de sais metálicos são sais de metais alcalinos, como salde lítio, sal de sódio e sal de potássio; sais de metais alcalino terrosos, co-mo sal de magnésio e sal de cálcio, sal de alumínio e sal dé zinco. Exem-plos de sais de amônio são sal de amônio e sal de tetrametilamônio. Exem-plos de sais de adição de amina orgânica são sais com morfolina e piperidi-na. Exemplos de sais de adição de aminoácido são sais com glicina, fenila-lanina, ácido glutâmico e lisina. Sais sulfonato incluem mesilato, tosilato esais de ácido benzenossulfônico.

Compostos HDAI adicionais inseridos no escopo de fórmula (I)1e suas sínteses, são divulgados em WO 02/22577 publicada em 21 de mar-ço de 2002, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Doiscompostos preferidos incluídos no escopo de WO 02/22577 são /V-hidróxi-3-[4-[(2-hidroxietil){2-(1H-indol-3-il)etil]-amino]metil]fenil]-2E-2-propenamida, defórmula (II):

<formula>formula see original document page 18</formula>

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e

N-hidróxi-3-[4-[[[2-(2-metil-1H-indol-3-il)-etil]-amino]metil]fenil]-2E-2-propenamida (LBH589), de fórmula (III):

<formula>formula see original document page 18</formula>

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

Além disso, a invenção provê o uso de um composto de fórmula(I), ou sal ou éster pró-fármaco farmaceuticamente aceitável do mesmo, pa-ra preparação de um medicamento para uso em combinação com radiaçãoionizante no tratamento de uma doença proliferativa.

Em um aspecto adicional, a invenção provê o uso de um HDACde fórmula (I), ou sal ou éster pró-fármaco farmaceuticamente aceitável domesmo, em combinação com radiação ionizante para o tratamento de umadoença proliferativa, especialmente um tumor sólido.

Em ainda outro aspecto, a invenção provê um HDAC de fórmula(I), ou sai ou éster pró-fármaco farmaceuticamente aceitável do mesmo,como ingrediente ativo para uso em combinação com radiação ionizantepara o tratamento de uma doença proliferativa, especialmente um tumor só-lido.

Em ainda outro aspecto adicional, a invenção provê uma emba-lagem contendo um HDAC de fórmula (I), ou sal ou éster pró-fármaco far-maceuticamente aceitável do mesmo, junto com instruções para uso emcombinação com radiação ionizante para o tratamento de uma doença proli-ferativa, especialmente um tumor sólido.

O termo "retardo de progressão", neste contexto, significa que aadministração da combinação a pacientes é feita em uma fase precoce dadoença proliferativa a ser tratada.

O termo "doença de tumor sólido", neste contexto, inclui, masnão se restringe a glioma, câncer de tireóide, câncer de mama, câncer deovário, câncer de cólon e geralmente do trato Gl, câncer de cérvice.,· câncerde pulmão, em particular, câncer de pulmão de células pequenas, e câncerde pulmão de células não pequenas, câncer de cabeça e pescoço, câncerde bexiga, câncer de próstata ou sarcoma de Kaposi. Em uma modalidadepreferida da invenção, a doença de tumor é glioma, câncer de próstata oucâncer de tireóide. A presente combinação inibe o crescimento de tumoressólidos, mas também de tumores líquidos. Além disso, dependendo do tipode tumor e da combinação particular usada, uma redução do volurrrè do tu-mor pode ser obtida. As combinações aqui divulgadas são também adequa-das para evitar o espalhamento metastático de tumores e o crescimento oudesenvolvimento de micrometástases.

Combinação refere-se à administração de um montante deHDAC de fórmula (I) em combinação com a administração de um montantede radiação ionizante de modo que haja um efeito sinérgico que não é obti-do se um HDAC de fórmula (!) é administrado sem a administração separa-da, simultânea ou seqüencial de radiação ionizante. Em que a administraçãode radiação ionizante pode ser contínua, seqüencial ou esporádica. Ou umefeito que não pode ser obtido se é administrada radiação ionizante sem aadministração separada, simultânea ou seqüencial de um derivado deHDAC de fórmula (I), em que a administração pode ser contínua, seqüencialou esporádica.

Preferivelmente a combinação refere-se a administração de ummontante de HDAC de fórmula (I) em combinação com a administração deum montante de radiação ionizante de modo a haver um efeito sinérgico an-tiproliferativo e/ou um efeito de eliminação de células clonogênicas que nãoé obtido se :

1) O HDAC de fórmula (I) é administrado sem a administraçãoanterior, simultânea ou subseqüente de radiação ionizante, podendo a ad-ministração ser contínua, seqüencial ou esporádica;

2) Há administração de radiação ionizante sem a administraçãopode anterior, simultânea ou subseqüente de um HDAC de fórmula (I), emque a administração pode ser contínua, seqüencial ou esporádica.

O termo "radiação ionizante", referidn acima e abaixo, significaradiação ionizante que ocorre como raios eletromagnéticos (como raios X eraios gama) ou partículas (como partículas alfa e beta). Radiação ionizante éfornecida, sem, no entanto, ser limitada a isso, na terapia com radiação e éconhecida na arte [vide Hellman, Principies of Radiation Therapy, Câncer(Princípios de Terapia de Radiação, Câncer,), em Principies and Practice ofOncology, pp. 248-275, Devita et al., Ed., 4th Edition, Vol. 1 (1993)).

Uma combinação que inclui:

(a) um HDAC de fórmula (I), que pode estar presente em for-ma livre ou na forma de um sal farmaceuticamente aceitá-vel e opcionalmente pelo menos um portador farmaceuti-camente aceitável; e

(b) radiação ionizante, será referida a partir daqui como umaCombinação da Invenção.

A natureza de doenças proliferativas como doenças de tumoressólidos é multifatorial. Em certas circunstâncias, fármacos com diferentesmecanismos de ação podem ser combinados. Entretanto, somente conside-rar qualquer combinação de fármacos tendo modo diferente de ação nãoleva necessariamente a combinações com efeitos vantajosos.

Na combinação da invenção, HDACs de fórmula (I), e sais e de-rivados pró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis, são preferivelmenteusados na forma de preparações farmacêuticas que contêm o montante te-rapeuticamente eficaz relevante de ingrediente ativo opcionalmente juntocom ou em mistura com portadores inorgânicos ou orgânicos, sólidos oulíquidos farmaceuticamente aceitáveis que sejam adequados para adminis-tração.

Em uma modalidade alternativa, a radiação ionizante é fornecidacomo um pré-tratamento, isto é, antes que o tratamento com a Combinaçãoda Invenção seja iniciado; a radiação ionizante sozinha é administrada aopaciente por um período definido de tempo, por exemplo, administração diá-ria da radiação ionizante sozinha por dois ou três dias ou semanas.

As composições farmacêuticas HDAC podem ser, por exemplo,composições para administração enteral, como oral, retal, inalação com ae-rossol ou administração nasal, composições para administração parenteral,como intravenosa ou subcutânea, ou composições para administraçãotransdérmica (por exemplo, passiva ou iontoforética), ou composições paraadministração tópica.

Preferivelmente, as composições farmacêuticas de HDAC sãoadaptadas para administração oral.

As composições farmacêuticas de acordo com a invenção po-dem ser preparadas de uma maneira conhecida em si e são aquelas ade-quadas para administração enteral, como oral ou retal, e administração pa-renteral a mamíferos (animais de sangue quente), incluindo o homem, inclu-indo um montante terapeuticamente eficaz de pelo menos um componentefarmacologicamente ativo da combinação sozinho ou em combinação comum ou mais portadores farmaceuticaménte aceitáveis, especialmente ade-quados para aplicação enteral ou parenteral.A nova composição farmacêutica contém, por exemplo, de cercade 10% a cerca de 100%, preferivelmente de cerca de 20% a cerca de 60%,dos ingredientes ativos. Preparações farmacêuticas para a terapia de com-binação para administração enteral ou parenteral são, por exemplo, aquelasem formas de dosagem unitárias, como comprimidos revestidos com açúcar,comprimidos, cápsulas ou supositórios, além de ampolas. Se não indicado ocontrário, estes são preparados de maneira conhecida em si, por exemplo,por meio de processos convencionais de mistura, granulação, revestimentocom açúcar, dissolução ou liofilização. Será avaliado que o teor unitário deum componente da combinação contido em uma dose individual de cadaforma de dosagem não precisa em si constituir um montante efetivo já que omontante efetivo necessário pode ser alcançado por administração de váriasdosagens unitárias.

Na preparação das composições para forma de dosagem oral,quaisquer dos meios farmacêuticos usuais podem ser empregados, como,por exemplo, água, glicóis, óleos, alcoóis, agente flavorizantes, conservan-tes, agentes colorantes; ou portadores, como amidos, açúcares, celulosemicrocristalin,a, diluentes, agentes de granulação, lubrificantes, ligantes, a -gentes de desintegração e similares no caso de preparações orais sólidas,como, por exemplo, pós, cápsulas e comprimidos, com as preparações oraissólidas sendo preferidas em relação às preparações líquidas. Por causa dafacilidade de administração, comprimidos e cápsulas representam a formaunitária de dosagem oral mais vantajosa, caso em que portadores farmacêu-ticos sólidos são obviamente empregados.

Em particular, um montante terapeuticamente eficaz de caqlacomponente da Combinação da Invenção pode ser administrado simultane-amente ou seqüencialmente e em qualquer ordem, e os componentes po-dem ser administrados separadamente ou como uma combinação fixa. Porexemplo, o método de retardo de progressão ou tratamento de uma doençaproliferativa de acordo com a invenção pode incluir:

(i) administração do primeiro componente da combinação; e

(ii) administração do segundo componente da combinação,em que a administração de um componente da combinação pode ser simul-tânea ou seqüencial em qualquer ordem em montantes conjuntos terapeuti-camente eficazes, preferivelmente em montantes sinergicamente eficazes,por exemplo, em dosagens diárias ou semanais correspondentes aos mon-tantes aqui descritos. Os componentes individuais da Combinação da Inven-ção podem ser administrados separadamente em ocasiões diferentes duran-te o curso da terapia ou simultaneamente. Além disso, o termo administra-ção também abrange o uso de um pró-fármaco de um HDAC de fórmula (I)que converte in vivo ao componente da combinação como tal. A presenteinvenção deve portanto ser entendida como abrangendo todos esses regi-mes de tratamento simultâneo ou alternado e o termo "administração" deveser interpretado de acordo.

A dosagem de radiação ionizante e de um HDAC de fórmula (I)uma em relação a outra se dá preferivelmente em uma proporção sinérgica.

Se o animal de sangue quente é um ser humano, a dosagem deum composto de fórmula (I) é preferivelmente uma dosagem apropriada nafaixa de 100-1.500 mg diariamente, por exemplo, 200-1.000 mg/dia, como200, 400, 500, 600, 800, 900 ou 1.000 mg/dia, administradas em uma ouduas doses diárias. Dosagens apropriadas e a freqüência de administraçãodo Iigante de receptor de morte dependerão de tais fatores, como natureza egravidade da indicação sendo tratada, a resposta desejada, a condição dopaciente, etc..

G modo de administração particular e a dosagem de um com-posto de fórmula (I) podem ser selecionados pelo médico encarregado docaso levando em conta as particularidades ds paciente, especialmente ida-de, peso, estilo de vida, nível de atividade, etc.

A dosagem de um HDAC de fórmula (I) pode depender de váriosfatores como eficácia e duração da ação do ingrediente ativo, modo de ad-ministração, eficácia e duração da ação da radiação ionizante e/ou sexo,idade, peso e condição individual do paciente a ser tratado.

A dosagem de radiação ionizante pode depender de vários fato-res como eficácia e duração da ação da radiação ionizante, modo de admi-nistração, localização da administração, eficácia e duração da ação doHDAC de fórmula (I) e/ou sexo, idade, peso e condição individual do pacien-te a ser tratado.

A dosagem de radiação ionizante é geralmente definida em ter-mos de dose, tempo e fração, de radiação absorvida, e deve ser cuidado-samente definida pelo médico encarregado do caso.

Em uma modalidade preferida da invenção a combinação incluiradiação ionizante e hidróxi-3-[4-[[[2-(2-metil-1/-/-indol-3-il)-etil]-amino]metil]fenil]-2E-2-propenamida, de fórmula (III) acima ou um sal farmaceuticamen-te aceitável do mesmo.

Além disso, a presente invenção refere-se a um método de tra-tamento de um animal de sangue quente portando uma doença proliferativaque inclui administrar ao animal uma Combinação da Invenção em uma ma-neira que é, em conjunto, terapeuticamente eficaz contra uma doença proli-ferativa, e em que os componentes da combinação podem também estarpresentes na forma de seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Além disso, a presente invenção refere-se ao uso de uma Com-binação da Invenção para retardo da progressão ou tratamento de uma do-ença proliferativa e para preparação de um medicamento para o retardo deprogressão ou tratamento de uma doença proliferativa.

O seguinte exemplo é meramente ilustrativo e não pretende limi-tar, de qualquer maneira, o escopo da presente invenção.Exemplo 1

Modelo de tumor. Linhagens de células LLC, H450 e H23 sãoobtidas na ATTC. Estas linhagens de células formam tumorés em ratos nusapós injeção s.c. em qualquer membro posterior. Células são tripsinizadas econtadas por hemocitômetro. Células são lavadas em meio completo, e 106células serão injetadas s.c. no membro posterior ou na abertura dorsal dapele pele dorsal (dorsal skin fold window).

Western Imunoblots. Células LLC, H450 e H23 são privadas desoro de um dia para o outro em meio DMEM/F-12 (Gibco). As células sãoentão tratadas com 10 μΜ de Composto Ill por 1 hora e/ou irradiadas com 3Gy. Células são lavadas duas vezes com PBS e tampão de Iise (20 nM Tris,150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM Na PP, 1 mM de flúo-reto de fenilmetilsulfonila, e 1 pg/mL de leupeptina) é adicionado. Concen-tração de proteína é quantificada pelo método Bio-Rad. Vinte (20) pg de pro-teína total são carregados em cada poço e separados por 7% ou 10% SDS-PAGE gel, dependendo do tamanho da proteína alvo que está sendo inves-tigada. As proteínas são transferidas para membranas de nitrocelulose (Hy-bond ECL; Amersham, Arlington Heights, IL) e testadas com anticorpos pri-mários para caspase3, caspase3 clivada, fosfo-Akt, Akt, PDGFR α e β (sina-lização celular; 1:1000). Células são lavadas e testadas com anticorpo se-cundário de cabra anticoelho (Sigma; 1:1000).

Quantificação de Apoptoses. Análise morfológica de apoptoseem células LLC é realizada com microscópio usando coloração com iodetode propídio. Células apoptóticas são identificadas de acordo com sua con-densação nuclear e fragmentação. Em suma, células LLC são tratadas com3 Gy e N-hidróxi-3-[4-[[[2-(2-metil-1 H-indol-3-il)-etil]-amino]metil]fenil]-2E-2-propenamida (LBH589) (100 nM) ou ambos os agentes. Após 24 horas, cé-lulas são lavadas com PBS várias vezes, permeabilizadas.com metanol 30%e coradas com iodeto de propídio em PBS. Células apoptóticas e não apop-tóticas são contadas em múltiplos campos selecionados aleatoriamente, edados são apresentados como percentagem de células apoptóticas. Apop-tose é verificada com o uso de análise de western blot de caspase3 total eclivada.

Avaliação de volume de tumor. Células LLC, H450 e H23 sãoimplantadas em ratos;de linhagem G57BL8'e nus, respectivamente. 106 cé-lulas viáveis suspensas em 0,1 mL de meio de células são injetadas s.c. nomembro posterior. Cada grupo de ratos é composto de 12 ratos que são di-vididos em dois grupos para aproximadamente criar o mesmo volume médiode tumor. O volume médio dos tumores em ratos na ocasião do tratamento(dia 0) com radiação, controle, irradiado, LBH589 sozinho e LBH589 é deaproximadamente 200 mm3. Ratos irradiados são imobilizados com 140 μLde cetamina, e o corpo inteiro é protegido com chumbo, exceto o membrotraseiro portador do tumor. Uma dose total de 21 Gy é administrada em setedoses fracionadas nos dias 0-4, 7 e 8. O grupo de LBH589 recebeu LBH589administrado p.o. via injeção esofágica nos dias -1 e 6.

Grupos de Tratamento.

<table>table see original document page 26</column></row><table>

Doze ratos nus implantados com células H450 E H23 da mesmamaneira descrita acima para LLC. O volume médio dos tumores em ratos naocasião do tratamento (dia 0) com radiação em controle, irradiados, LBH589e LBH589 com radiação é de 200 mm3.

Volumes de tumor foram medidos nos dias 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14,16, 18, 20 e 22 usando paquímetros de pele. Volumes de tumor foram calcu-lados com a fórmula (atx b χ c/2) que é derivada da fórmula para um elipsói-de (nd3/6). Dados foram calculados como percentagem do volume de tumororiginal (dia 0) e indicados em gráfico como volume fracional do tumor ± SDpara cada grupo de tratamento.

Seções Histológicas do Tumor. Ratos C57BL6 são injetadoscom 106 células LLC suspensas em 0,1 mL de meios de células s.c. nomembro posterior direito. Tumores são deixados se desenvolver durante umperíodo de quatorze dias. Três ratos são tratados com LBH589 e três ralossão controles não tratados. Uma hora após o tratamento os ratos são sacri-ficados e tumores são coletados, fixados em formaldeído e seccionados.Seções de ratos tratados com LBH589 e controles são, então, testados comanticorpo de fosfo-Akt (sinalização celular 1:1000). Coloração de TUNEL érealizada como descrito.

Análise estatística. Análise estatística é realizada usando pro-grama SPSS e R para calcular valores de ρ usando o teste t de Student e odesvio padrão de pontos de dados individuais.

Resultados. LBH589 sensibiliza NSCLC aos efeitos citotóxicosde radiação ionizante. Análise clonogênica de linhagens de células H460 foirealizada usando LBH589 e 0-6 Gy. A figura 1 mostra a fração média de so-brevivência e o erro padrão de cada grupo de tratamento (n=3). Células fo-ram suspensas, contadas com um hemocitômetro, e plaqueadas em densi-dades de células específicas. Uma vez fixadas, células foram tratadas comLBH589 por 1 hora ou 18 horas seguido por 0, 2, 4, ou 6 Gy. Os meios fo-ram trocados após IR e as células foram deixadas proliferar por 10 dias. Sãomostrados a média e o erro padrão das frações relativas de colônias (n=3).

Células de controle não tratadas demonstraram radiorresistênciasubstancial, com 6 Gy resultando em somente uma redução Iog na sobrevi-vência. Uso de LBH589 1 hora e 18 horas antes de IR resultou em uma re-dução sinérgica na sobrevivência da colônia em comparação com célulasnão tratadas como é evidente por um aumento na inclinação negativa dacurva de resposta a dose. Tratamento com LBH589 sozinho por 18 horasresultou em uma eficiência de cultura em placa significativamente reduzidaenquanto tratamento por 1 hora sozinho não apresentou eficiência de cultu-ra em placa reduzida em comparação com o controle. Estes dados mostramque LBH589 aumenta os efeitos citotóxicos da radiação ionizante em linha-gens de células NSCLC.

LBH589 aumenta a apoptose induzida por radiação. Para estu-dar o efeito da inibição de HDAC por LBH589 na apoptose foram realizadostrês experimentos in vitro. A figura 2 mostra resultados de análise de apop- tose põr citometria de fluxo com Anexina V-FITC/PI. Linhagens de célulasH23 e H460 foram tratadas com LBH589 25 nM por 18 horas, e então irradi-adas com 3 Gy. Vinte (20) horas mais tarde, células foram coletadas, colori-das com Anexina-FITC e PI, e analisadas por citometria de fluxo. É mostra-do o número de células apoptóticas e o erro padrão (n=3) para cada condi-ção de tratamento. *P<0,05 em comparação com o controle.

Uso de LBH589 25 nM antes de 3 Gy aumentou significativa-mente o número de células apoptóticas de 7% para 30% para linhagem decélulas H23 (Ρ < 0,001) e de 6 para 25% para linhagem de células H460(P = 0,003) em comparação com o controle. Uso de IR sozinho ou LBH589sozinho produziu somente um aumento mínimo e o efeito do tratamentocombinado foi superior ao que seria previsível por um efeito aditivo.

Para confirmar a capacidade de LBH589 de sensibilizar linha-gens de células de câncer de pulmão humano à apoptose induzida por radi-ação, foram realizados estudos de morfologia nuclear. A figura 3 mostra apercentagem média e o erro padrão de núcleos picnóticos determinados porcoloração com DAPI. Coloração com DAPI de células tratadas com LBH589e IR. Células foram subcultivadas sobre lâminas e tratadas com LBH589 25nM por 18 horas seguido por 3 Gy. Dezoito (18) horas mais tarde célulasforam fixadas e coloridas com DAPI. É mostrada a percentagem de núcleospicnóticos e erro padrão (n=3) determinado por contagens manuais do mi-croscópio. *P<0,05 em comparação com o controle.

Uso de LBH589 25 nM 18 horas antes de 3 Gy aumentou signi-ficativamente a percentagem de núcleos picnóticos a mais de 10% para li-nhagens de células H23 (P < 0,001) e H460 (P=0,042). Células H23 e H460nãp tratadas tinham menos de 1% de núcleos apoptóticos, células ^23 eH460 tratadas com 3 Gy tinham 3% e 2% de núcleos apoptóticos, e célulasH23 e H460 tratadas com LBH589 sozinho tinham 4% e 2% de núcleos a-poptóticos, respectivamente.

Clivagem de caspase 3 foi analisada para verificar o papel deapoptose em células tratadas com LBH589 e radiação. Análise de Westernblot foi realizada em Iisados totais de célula H23 e H460. A figura 4 mostraos Western imunoblots para caspa&e 3 clivada;.e actina. LBH589 irtduziuclivagem de caspase3. Células H23 e H460 foram tratadas com LBH589 25nM por 18 horas e então irradiadas com 3 Gy. Seis horas mais tarde, proteí-na foi extraída, quantificada, processada em um gel 12% SDS-poliacri-lamida, transferida, e testada com anticorpos para caspase3 clivada e acti-na. São mostrados os imunoblots de caspase3, caspase3 clivada, e actinade linhagens de células H23 e H460.

Um aumento na clivagem de caspase3 foi evidente tanto na Ii-nhagem de células H23 quanto na de H460 após tratamento com LBH589.Uso de LBH589 antes de IR aumentou os níveis de clivagem de caspase3em células H460. Este aumento, no entanto, não foi tão proeminente na li-nhagem de células H23.

LBH589 aumenta o retardamento do crescimento do tumor invivo. Células H460 foram injetadas no membro posterior de ratos. Após for-mação do tumor os ratos foram tratados com duas doses orais de 40 mg deLBH589 e/ou cinco frações de 3 Gy durante sete dias. A figura 5 mostra oaumento em número de vezes do volume do tumor (A) e o retardo no de-senvolvimento do tumor (B) para cada grupo de tratamento. Uso de LBH589sozinho resultou em um retardo modesto, mas significativo, no desenvolvi-mento do tumor, de dois dias (P<0,001). IR sozinho atrasou o crescimentoem aproximadamente 4 dias (P<0,001). O tratamento combinado atrasousignificativamente o crescimento do tumor em aproximadamente 20 dias(P<0,001) indicando que a inibição de HDAC aumenta os efeitos de IR nocrescimento de tumor NSCLC. Além disso, os ratos recebendo LBH589 a-presentaram sinais mínimos de toxicidade durante o curso do estudo, con-forme monitoração de perda de peso e mobilidade.

A figura 5B mostra o efeito de LBH589 e radiação ionizante nomodelo de tumor de xenoenxerto. Células H460 foram injetadas no membroposterior de ratos nus e deixadas se desenvolver por uma semana. Os ratosforam divididos em quatro grupos: controle, 3 Gy, LBH589 40 mg, LBH 40mg + 3 Gy. LBH589 foi administrado via gavagem oral 1 hora antes da IR.Os ratos foram tratados com duas doses de LBH589 e 5 frações de 3 Gydurante os primeiros'sete dias. A, mostrado é o aumento médio em númerode vezes no volume do tumor e o erro padrão para cada grupo de tratamen-to (n=5). B, mostrado é o retardo médio no crescimento do tumor e o erropadrão calculado usando um crescimento de 10 vezes no volume do tumorcomo referência.

LBH589 prolonga a duração de focos γ-Η2ΑΧ induzidos por ra-diação. Imunocoramento foi realizado para estudar focos de γ-Η2ΑΧ presen-tes em quebras de fita dupla de DNA. A figura 6A mostra fotografias repre-sentativas da linhagem de células H23 tratadas com combinações de L-BH589 e IR. O coramento vermelho de focos de γ-Η2ΑΧ e coramento azuldo contracorante DAPI são mostrados. Focos de γ-Η2ΑΧ induzidos por 3 Gyem um tempo tão rápido quanto 30 minutos após o tratamento. Estes focosdesapareceram em cerca de 6 horas nas linhagens de células tratadas so-mente com IR. Uso de LBH589 sozinho por 20 horas resultou em um au-mento modesto nos focos de γ-Η2ΑΧ. Em comparação, LBH589 adicionado18 horas antes da IR prolongou a duração de focos de γ-Η2ΑΧ por até 24horas após IR (42 horas após administração de LBH589). Além disso, focosde γ-Η2ΑΧ foram vistos 18 horas e 24 horas após IR em células em proces-so de apoptose (setas). Um fato interessante, foi que não havia focos de γ-H2AX presentes em células em processo de apoptose após tratamento comradiação sem inibição de HDAC. Resultados similares foram vistos na linha-gem de células H460 (Figura S1 Suplementar).

A figura 6B mostra o número de focos de γ-Η2ΑΧ presentes 24horas após IR. LBH589 prolonga a duração de focos de γ-Η2ΑΧ em célulasde câncer de pulmão irradiadas. Linhagem de células H23 receberam o tra-tamento indicado de LBH589 25 nM e/ou 3 Gy... Anticorpo anti-y-H2AX foiusado para imunocoramento com anticorpo secundário rotulado com coran-te vermelho rodamina (vermelho). Células foram tratadas com contracoranteDAPI (azul). São mostradas fotografias representativas da linhagem de célu-las H23 (A) nos pontos de tempo após IR indicados. Setas indicam célulasapoptóticas. B, mostrado é a média e o erro padrão de células com focosnucleares de γ-Η2ΑΧ . *P<0,05 em comparação com o controle. Tratamentocom 3 Gy sozinho e LBH589 "sozinho resultou em rápida resolução de γ-H2AX (<5% em 24 horas). Uso de LBH589 antes de IR retardou significati-vamente a resolução de focos de γ-Η2ΑΧ com 60% de focos residuais emambas as linhagens de células em 24 horas (P<0,001). A duração aumenta-da de focos de γ-Η2ΑΧ após tratamento com LBH589 e IR indica que inibi-ção de HDAC rompe o processo de reparo do DNA e este mecanismo sen-sibiliza potencialmente NSCLC aos efeitos citotóxicos da radiação.

Translocação nuclear de HDAC4 em linhagens de células decâncer de pulmão irradiadas.

Imunocoramento de HDAC4 foi realizado em linhagens de célu-las H23 e H460 para identificar o efeito de LBH589 na compartimentalizaçãode HDAC4. A figura 7 mostra fotografias representativas da linhagem decélulas H460 testada com anticorpos anti-HDAC4 e anticorpos secundáriosrotulados com rodamina (vermelho) e então tratada com contracorante DAPI(azul). Células não tratadas e células tratadas com LBH589 sozinho mostra-ram coramento de fundo de HDAC4 no citoplasma e no núcleo. Quando cé-lulas H460 foram tratadas com 3 Gy, HDAC4 se localizou no núcleo em 2horas e um mínimo de HDAC4 ficou no citoplasma. No entanto, LBH589 a-dicionado antes da IR limitou marcantemente a localização nuclear doHDAC4. Um efeito similar foi observado na linhagem de células H23. Estesresultados foram confirmados na linhagem de células H460 usando anticor-pos anti-HDAC4 para análise de Western blot de proteínas citoplásmicas enucleares.

Claims (10)

1. Método para tratamento de uma doença proliferativa em umpaciente com necessidade de tal tratamento, incluindo administrar:(a) um HDAC de formula (I):<formula>formula see original document page 32</formula>em queR1 é H; halo; ou uma C1-C6alquila de cadeia reta, especialmentemetila, etila ou n-propila, sendo que os substituintes metila, etila e n-propilasão não substituídos ou substituídos por um ou mais substituintes descritosabaixo para substituintes alquila;R2 é selecionado entre H; C1-C10alquila, preferivelmente C1-C6alquila, por exemplo, metila, etila ou -CH2CH2-OH; C4-Cgcicloalquila; C4-C9heterocicloalquila; C4-C9 heterocicloalquilalquila; cicloalquilalquila, por exem-plo, ciclopropilmetila; arila; heteroarila; arilalquila, por exemplo, benzila; hete-roarilalquila, por exemplo, piridilmetila; -(CH2)nC(O)R6; -(CH2)nOC(O)R6; ami-no acila; HON-C(O)-CH=C(R1)-BriI^IquiI-; e -(CH2)nR7;R3 e R4 são iguais ou diferentes e, independentemente, H; C1-C6alquila, acila; ou acilamino, ouR3 e R4, junto com o carbono ao qual eles estão ligados, repre-sentam C=O, C=S ou C=NR8; ouR2, junto com o nitrogênio ao qual ele está ligado, e R3, juntocom o carbono ao qual ele está ligado, podem formar urrâ C4-C9 heteroci-cloalquila; uma heteroarila; uma polieteroarila; um polieterociclo não aromá-tico; ou um anel polieterocíclico misto de arila e não arila;R5 é selecionado entre H; C1-C6alquila; C4-C9cicloalquila; C4-C9heterocicloalquila; acila; arila; heteroarila; arilalquila, por exemplo, benzila;heteroarilalquila, por exemplo, piridilmetila; policiclos aromáticos; policiclosnão aromáticos; policiclos mistos de arila e não arila; polieteroarila; poliete-rociclos não aromáticos; e polieterociclos mistos de arila e não arila;n, n1, n2 e n3 são iguais ou diferentes e independentemente se-lecionados na faixa de 0-6, quando ni é 1-6, cada átomo de carbono podeser opcional e independentemente substituído com R3 e/ou R4;X e Y são iguais ou diferentes e independentemente seleciona-dos entre H; halo; C1-C4alquila, como CH3 e CF3; NO2; C(O)R1; OR9; SR9;CN; e NR10R11;R6 é selecionado entre H; C1-C6alquila; C4-C9cicloalquila; C4-C9heterocicloalquila; cicloalquilalquila, por exemplo, ciclopropilmetila; arila; he-teroarila; arilalquila, por exemplo, benzila e 2-feniletenila; heteroarilalquila,por exemplo, piridilmetila; OR12; e NR13R14;R7 é selecionado entre OR15; SR15; S(O)R16; SO2R17; NR13R14; eNR12SO2R6;R6 é selecionado entre H; OR15; NR13R14; C1-C6alquila; C4-C9cicloalquila; C4-C9heterocicloalquila; arila; heteroarila; arilalquila, por exem-pio, benzila; e heteroarilalquila, por exemplo, piridilmetila;R9 é selecionado entre C1-C4alquila, por exemplo, CH3 e CF3;C(O)-alquila, por exemplo, C(O)CH3; e C(O)CF3;R10 e R11 são iguais ou diferentes e independentemente selecio-nados entre H; C1-C4alquila; e -C(O)-alquila;R12 é selecionado entre H; CrC6alquila; C4-C9cicloalquila; C4-C9heterocicloalquila; C4-C9heterocicloalquilalquila; arila; policiclos mistos dearila e não arila; heteroarila; arilalquila, por exemplo, benzila; e heteroarilal-quila, por exemplo, piridilmetila;Ri3 e R14 são iguais ou diferentes e independentemente selecio-nados entre H; C1-C6alquila; C4-C9cicloalquila; C4-C9heterocicloálquila; arilá;heteroarila; arilalquila, por exemplo, benzila; heteroarilalquila, por exemplo,piridilmetila; amino acila, ouR13 e R14, junto com o nitrogênio ao qual eles estão ligados, sãoC4-C9heterocicloalquila; heteroarila; polieteroarila; polieterociclo não aromá-tico; ou polieterociclo misto de arila e não arila;R15 é selecionado entre H; C1-6alquila; C4-C9cicloalquila; C4-C9heterocicloalquila; arila; heteroarila; arilalquila; heteroarilalquila; e(CH2) ZRi2;R16 é selecionado entre C1-C6alquila; C4-C9cicloalquila; C4-C9heterocicloalquila; arila; heteroarila; polieteroarila; arilalquila; heteroarilalqui-la; e (CH2)mZR-2;R17 é selecionado entre C1-C6alquila; C4-C9cicloalquila; C4-C9heterocicloalquila; arila; policiclos aromáticos; heteroarila; arilalquila; hetero-arilalquila; polieteroarila è NR13R14;m é um inteiro selecionado entre 0-6; eZ é selecionado entre O; NR13; S; e S(O),ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em combinação com(b) radiação ionizante.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, que inclui adminis-trar :(a) um composto de fórmula (I), em combinação com(b) radiação ionizante.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, que inclui ad-ministrar :(a) N-hidróxi-3-[4-[[[2-(2-metil-lH-indol-3-il)-etil]-amino]metil]fe-nil]-2E-2-propenamida, de fórmula (III):<formula>formula see original document page 34</formula>ou um sal farmaceuticamente aceitavel da mesma, em combinacao com(b) radiação ionizante.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3 em que opaciente é um animal de sangue quente tendo uma doença proliferativa in-cluindo administrar ao animal uma combinação de acordo com qualqueruma das reivindicações 1, 2 ou 3 de maneira a ser, em conjunto, terapeuti-camente eficaz contra a doença proliferativa.

5. Método de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 4que inclui administrar uma quantidade que é, em conjunto, terapeuticamenteeficaz contra uma doença proliferativa, de um composto de fórmula (I) e pelomenos um portador farmaceuticamente aceitável para uso em combinaçãocom radiação ionizante.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, 2, 3, 4 ou 5 pararetardo de progressão de uma doença proliferativa em um paciente com ne-cessidade desse tratamento.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, 2, 3, 4 ou 5 para otratamento de uma doença proliferativa.

8. Uso de um composto de fórmula (I) para retardo de progres-são ou tratamento de uma doença proliferativa como definido na reivindica-ção 1, 2 ou 3 para preparação de um medicamento para uso em combina-ção com radiação ionizante.

9. Método como definido na reivindicação 6, 7 ou 8 em que adoença proliferativa é um tumor sólido.

10. Embalagem contendo um composto de fórmula (I) em formafarmaceuticamente aceitável, junto com instruções para o uso em combina-ção com radiação ionizante para o tratamento de uma doença proliferativa.