BRPI0617317A2 - método para preparação de composição incluindo pelo menos uma cultura de bolor ou esporo isenta de glúten, composição, método para preparação de produto laticìnio de marmoreamento azul - Google Patents

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Abstract

MéTODO PARA PREPARAçãO DE COMPOSIçãO INCLUINDO PELO MENOS UMA CULTURA DE BOLOR OU ESPORO ISENTA DE GLúTEN, COMPOSIçãO, MéTODO PARA PREPARAçãO DE PRODUTO LATICìNIO DE MARMORAMENTO AZUL. A presente invenção refere-se a cultura de esporo ou bolor "isenta de glúten" do gênero Penicillium do particular da espécie Penicillium roqueforti para marmoramento azul de queijos destinados a pessoas afetadas por doença celíaca. Além disso, o objetivo da presente invenção é um método para a preparação das culturas que prevê o uso de um substrato analérgico em associação a um tratamento enzimático subseqüente.

Description

MÉTODO PARA PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÃO INCLUINDO PELO MENOS UMA
CULTURA DE BOLOR OU ESPORO ISENTA DE GLÚTEN, COMPOSIÇÃO,MÉTODO PARA PREPARAÇÃO DE PRODUTO LATICÍNIO DE MARMOREAMENTOAZUL
DESCRIÇÃO
A presente invenção refere-se a culturas de esporo oubolor "isentas de glúten" do gênero Penicillium, emparticular da espécie Penicillium roqueforti, para omarmoreamento azul de queijos destinados a pessoas afetadaspor doença celiaca.
o objetivo da presente invenção é um método para apreparação de culturas isentas de glúten que prevê o uso deum substrato de cultura analérgica isento de glúten,possivelmente em associação a um tratamento enzimáticosubseqüente apropriado para a total eliminação de residuos deglúten, caso haja, derivando de contaminações acidentais enão intencionais (contaminações de cruzamento).
A doença celiaca é uma doença inflamatória imuno-mediada, crônica, enteropática, que se origina da ingestão deglúten, uma proteína de "armazenagem" contida naturalmente emalguns cereais. Essa intolerância de alimento afeta pessoasgeneticamente predispostas, de qualquer idade, tendo umsistema imune que responde em um modo anormal à ingestão defrações proteínicas típicas do glúten de trigo, espelta (umtipo de trigo) , kamut e spel (um tipo de trigo) , cevada,centeio, triticale (um cruzamento entre trigo e centeio) eseus derivados. Alguns indivíduos também apresentamintolerância às proteínas de marmoreamento. Tecnicamente, otermo "glúten" se aplica à combinação da prolamínica simples(rica em prolina), denominada "gliadinas", e glutelínica(rica em glutamina), denominada "gluteninas", proteínas doscereais acima mencionados. No contexto da doença celiaca, otermo "glúten" é freqüentemente utilizado com referência atodos os tipos de proteínas contidas nos cereais, mesmo seentre as diferentes frações proteínicas que formam o glúten,a gliadina parece ser a mais prejudicial.A doença celiaca pode ocorrer em múltiplas formasclínicas, nem sempre em uma forma manifesta; na realidade, hásintomas latente ou em potencial, clinicamente silenciosos esem evidência, formas mono-sintomáticas, ou com um sintoma clínico total, intestinal e extra-intestinal.
A inflamação crônica leva ao aumento dos linfócitosintra-epiteliais intestinais, à hipertrofia de glândulas eachatamento progressivo e desaparecimento dos vilosintestinais do intestino delgado, em particular a mucosaduodenal, com perda conseqüente da capacidade de absorver assubstâncias nutritivas e ocorrência de sintomas como diarréiacrônica, distensão abdominal, inapetência, diminuição depeso, anemia e deficiências de vitaminas. Nos casos maisgraves, contramarcado com um diagnóstico tardio, osteoporose,infertilidade, abortos repetidos, altura baixa nas pessoasjovens, diabetes mellitus, tireoidite auto-imune, alopecia,epilepsia com calcificações cerebrais e o temido linfomaintestinal podem ocorrer. Nas pessoas celíacas, a ingestão deglúten também em pequenas quantidades, é capaz de causar a resposta anormal do sistema imune: a transglutaminase, umaenzima que existe no tecido de mucosa intestinal, se liga àgliadina e através da desamidação transforma a mesma em umamolécula capaz de ativar as células T (células do sistemaimune capazes de mediar todas as respostas imunes em direçãoaos antígenos proteínicos), com produção conseqüente deantitransglutaminase IgG e IgA e imunoglobulinas IgAantiendomise. Em um primeiro estágio, um aumento das célulasT ativadas intestinais intra-epiteliais ocorre, enquanto como avanço da doença o aumento se refere tanto aos linfócitos como as células de plasma infiltradas da própria lâmina, comuma produção de metaloproteinases responsáveis peloencurtamento dos vilos e, portanto o dano à mucosaintestinal.
A possibilidade de evitar o desenvolvimento outratamento da doença celiaca não existe até o presente,portanto uma dieta isenta de glúten, estritamente realizadapor toda vida é a única terapia capaz de assegurar às pessoasafetadas pela doença celiaca uma saúde perfeita. As pessoasceliacas devem eliminar também os menores resíduos de farinhados cereais perigosos, porque a ingestão de glúten, também emquantidades mínimas, pode descontrolar a resposta auto-imune.Como a razão da quantidade de glúten ingerido para o efeitotóxico induzido no nível intestinal não foi ainda definido, otermo "resíduos", a partir do ponto de vista quantitativo,tem uma importância prática fundamental no tratamento dadoença celiaca e implicações no plano de legislação sobrealimentos, porque os "resíduos" são relacionados ao limitemáximo de glúten "aceitável" (limite) nos produtosapropriados para a dieta da pessoa celiaca. Todas as pessoasversadas acordam que uma dose de 100 mg por dia de gliadina,igual a 200 mg de glúten, isto é aproximadamente 3 g de pão,é suficiente para causar, na maioria das pessoas celiacas, oaumento dos linfócitos intra-epiteliais intestinais, um sinalprematuro de inflamação intestinal persistente.
Com referência ao limite mínimo, alguns trabalhoscientíficos realizados até o presente pareceriam mostrar quea ingestão até 10 miligramas por dia de gliadina (igual a 20partes por milhão de glúten) não é capaz de danificar deforma sensível à mucosa intestinal, porém pode determinar, emuma minoria dos casos, a ocorrência de sintomasgastroentéricos.
No nível legislativo internacional, o antigo padrão"Codex Standard for gluten-free foods", ainda em vigor,mostra, como o teor máximo de glúten nos produtosterapêuticos de dieta, 0,05 de nitrogênio por 100 g deproduto seco (com referência a amido de trigo) , quecorresponde a uma fração de glúten igual a aproximadamente500 ppm. Entretanto, uma revisão correta e adequada dadiretriz acima mencionada está ocorrendo, que parece preverque os alimentos isentos de glúten resultando de ingredientesnaturalmente isentos de glúten não contêm mais de 20 ppm deglúten, enquanto os alimentos isentos de glúten, que derivamde cereais com glúten, podem ter um limite máximo de 200 ppmde glúten.
Na França, Grã-Bretanha e Holanda, esperando pelarevisão da diretriz acima mencionada, eles consideram, como olimite máximo para os produtos isentos de glúten, 200 partespor milhão. Na Itália, uma lei (Decreto legislativo n°109/1992) entrará em vigor, que estabelece que, se nacomposição do produto alimentício, ou naquele de um ou maisingredientes (aromatizantes, aditivos ou coadjuvantes) que formam o mesmo, estiverem presentes cereais contendo glútenou substâncias que derivam a partir do mesmo e/ou se a partirdo processo produtivo uma quantidade de glúten, determinadaanaliticamente como mais elevada do que 20 partes por milhão,pode derivar no produto final tal produto terá de mostrar no rótulo, ao pé da lista de ingredientes e em um modo bemvisível, as palavras "produto contendo glúten".
Portanto, para assegurar para as pessoas celíacasinformações precisas sobre a ausência de glúten nosalimentos, será obrigatório, também nos queijos, mostrar norótulo a presença de possíveis resíduos de glúten.
Para a indústria de laticínios especializada na produçãode queijos de marmoreamento azul, esse novo aspecto deregulação envolve um dano comercial sério que deriva dadiminuição do círculo potencial de compradores consumidores. A exclusão completa de glúten a partir da dieta não é,entretanto, fácil de realizar, considerando que fenômenos decontaminação cruzada de cereais e derivados (amidos,farinhas, farinha de amido, etc.) naturalmente isentos deglúten, já no nível de indústria de moagem, podem ocorrer.
Tais produtos são então utilizados pela indústriaalimentícia na preparação de alimentos complexos com base emmúltiplos ingredientes tecnológicos, aditivos e coadjuvantesde diferente origem e natureza. Uma pesquisa recente mostrouque até 6% dos produtos "teoricamente" isentos de glúten, com base nos ingredientes reportados, na realidade contêm mais de30 mg de gliadina por 100 g de produto final, igual a 600 ppmde glúten. Para fins de excluir uma possível contaminação deglúten, é portanto necessário considerar, para cada produtoalimentício comercializado, não somente todos os ingredientesutilizados e o processamento, porém também toda a cadeiaprodutiva de cada ingrediente único.
Entre os "alimentos em risco", como também sinalizadopela Italian Association of Celiac persons, os queijos "demarmoreamento azul e com uma película mofada" sãoadicionalmente incluídos, uma vez que a partir deinvestigações experimentais, realizadas também a Itália,resulta que alguns "queijos de marmoreamento azul e com umapelícula mofada" podem conter glúten que deriva dos meios decultura de crescimento de esquizomicetos (bolores eleveduras) utilizados como culturas de partida para obter o típico marmoreamento azul do queijo azul (Penicilliumroqueforti), o revestimento de feltro branco de queijos comoBrie, Camembert e Carré de l'Est, Tomme blanche (Penicilliumcandidium) e/ou o refinamento de muitos outros tipos dequeijo (Kluyveromices, Debaromyces genera).
De acordo com a regra que entrará em vigor, feita parasatisfazer a necessidade das pessoas celíacas de umainformação precisa sobre a ausência de glúten nos alimentos,se tais queijos contiverem resíduos de glúten, ou foremfabricados com ingredientes contendo glúten tecnológico oucoadjuvantes, será obrigatório mostrar o mesmo no rótulo.
Portanto, permanece a necessidade intensa de ser capazde fornecer produtos de laticínios de marmoreamento azul"isentos de glúten".
Também no caso no qual o processo de fabricação dasculturas de Penicillium não prevê o uso de qualqueringrediente ou substância contendo glúten, é entretantopossível que, devido a contaminações cruzadas nãointencionais e acidentais, alguns componentes utilizados noprocesso produtivo carreguem resíduos de glúten.
Portanto, todos os operadores de setor concordam que,até o presente, permanece uma necessidade muito forte defornecer um método para a preparação de meios de culturasapropriados para o crescimento de esquizomicetos (bolores ouleveduras), utilizados como culturas de partida para se obtero marmoreamento azul dos queijos, capazes de utilizar um substrato não baseado em pão, e simultaneamente, capazes dereduzir as contaminações cruzadas, não intencionais eacidentais, caso ocorram.
Em particular, permanece a necessidade de fornecer ummétodo para a preparação de meios de culturas de crescimento dos esquizomicetos (bolores e leveduras), utilizados comoculturas de partida para obter o marmoreamento azul dosqueijos, que prevê um nivel de segurança dupla em relação àausência de glúten.
Um objetivo da presente invenção é fornecer um método para a preparação de meios de cultura capazes de superar oslimites da técnica conhecida e ser capaz de ser destinado apessoas afetadas por doença celiaca em um modo seguro.
Esses e outros objetivos, que se tornarão evidentes apartir da seguinte descrição detalhada, foram obtidos pelo requerente, que aperfeiçoou uma metodologia que inclui umnivel de segurança duplo referente à ausência de glúten nosmeios de cultura.
Em particular, o requerente estabeleceu uma metodologiaque prevê: um primeiro processo para a preparação de culturas de bolor ou esporo desenvolvidas em um substrato de culturanaturalmente isento de glúten selecionado, capaz de protegertotalmente a atividade biológica dos esporos de bolor eportanto, a capacidade de assegurar marmoreamento azul ótimoe a seguir, um segundo processo que prevê um tratamento enzimático das culturas.
Bolores pertencendo à espécie Penicillium roqueforti,preferivelmente selecionado do grupo depositado peloRequerente a/c Collection Centre DSMZ (Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH; Braunsweig - Alemanha)em 21.12.2005 formam um tema da presente invenção, no qual ogrupo consiste nos microorganismos identificados pelo Centro,com os números de acessão reportados na Tabela 1 a seguir:
Tabela 1
<table>table see original document page 8</column></row><table>
Como reportado a seguir.
Um método para a preparação de uma cultura de bolor ouesporo isenta de glúten, selecionada do grupo acimamencionado, uma composição incluindo pelo menos uma dasculturas e o uso de pelo menos uma das culturas para a preparação de um produto laticínio de marmoreamento azuldestinado a pessoas com doença celiaca formam então umobjetivo da presente invenção, tendo as características comoreportado nas reivindicações apensas.
o marmoreamento azul, isto é os marmoreamentos com umacor verde mais ou menos intensa típica do Gorgonzola(Itália), Roquefort, Bresse Blue, Blue d'Auvergne, Sassenagee outro (França), Stilton (Inglaterra), Danablue (Dinamarca),Cabrales (Espanha) e Bluecheese (EUA), é obtido pelocrescimento de um bolor que pertence ao gênero Penicillium(espécie Penicillium roqueforti) , que é voluntariamenteadicionado ao leite no momento do processamento, juntamentecom enzimas de leite e coalho. As cepas de bolor, asquantidades de esporos e as técnicas de processamento variamde queijo para queijo, porém todas as tipologias sãocaracterizadas por um tipo de coagulação de láctico-coalho,com uma natureza láctica tardia predominante, com umacoagulação úmida e particularmente macia e com fendas, comdrenagem lenta e progressiva. A ação enzimática de uma microflora misturada (bactérias lácticas, bolor efreqüentemente leveduras) permite a obtenção em temposrelativamente curtos, de pastas muito proteolisadas (com umcoeficiente de maturação de aproximadamente 65%)caracterizado pela presença de várias substâncias aromáticaspara a ação lipolitica realizada pelo Penicillium na gordura.As fendas, indispensáveis para o crescimento do bolor, sãouma conseqüência tanto da acidificação realizada pelasenzimas lácticas como desenvolvimento de dióxido de carbonoproduzido por bactérias ou levedura hetero-fermentada.
Durante a maturação as formas são submetidas, em doisestágios diferentes, à perfuração das duas faces com agulhasadequadas. A operação tem a finalidade de permitir que ar e,portanto entrada de oxigênio nas fendas existentes na pasta.
Somente em um ambiente aerado, os esporos de Penicilliumsão capazes de se desenvolverem, pela formação primeiramentede um entrelaçamento de hifas (micélio) que invadem os furose as fendas e subseqüentemente produzem conidióforos quetransportam os esporos, com uma cor verde/azul mais ou menosintensa.
É a cor dos esporos que caracteriza o aspecto típico doGorgonzola e todos os outros queijos de marmoreamento azul,enquanto as ações proteolíticas e lipolitica do bolor causama maturação do queijo e a formação dos aspectos sensóriospeculiares.
As culturas de esporo das diferentes cepas dePenicillium roqueforti utilizadas no processamento sãopreparadas por laboratórios especializados, em uma formalíquida ou liofilizada, de acordo com a técnica conhecidapara a pessoa versada na técnica.
Realmente, a preparação de uma cultura intermediária éexecutada, que prevê semeadura dos esporos da cepaPenicillium (a partir de um tubo do Working Cell Bank) em ummeio de cultura ágar adequado (por exemplo, batata ágar,batata-dextrose ágar, extrato de malte de ágar) e subseqüenteincubação a 22-28°C por 5-10 dias, para fins de aumentar onúmero do mesmo.
Após o crescimento e a formação de esporos da culturaintermediária (normalmente uma semana) em um dos meios decultura acima descrito terminar, com uma pipeta estéril osesporos são removidos e coletados a partir da superfície domeio de ágar.
Em uma modalidade particularmente preferida, a culturaintermediária é obtida pelo crescimento de esporos quepertencem à espécie Penicillium roqueforti, selecionada dogrupo acima descrito e reivindicado na reivindicaçãoindependente apensa.
Os esporos foram isolados de um habitat natural,preferivelmente de essências de forragem.
Os esporos da cultura intermediária, após suspensão emum meio líquido estéril adequado (solução fisiológica ou ospróprios caldos de cultura acima descritos na formulação semágar) a partir do inóculo para a produção da cultura final.
O Requerente verificou ser útil utilizar, como substratode crescimento, pelo menos um substrato naturalmente isentode glúten de origem vegetal.
Na prática, o Requerente verificou ser útil utilizar,como substrato de crescimento um ou mais substratosselecionados do grupo que inclui: arroz naturalmente isentode glúten, milho, batata, mandioca, tapioca, castanhas,ervilhas, feijão fava e legumes, na forma de grãos sopradosou explodidos (como milho de pipoca), ou na forma de farinhascomo se encontra e/ou pré-cozidas.
Com referência aos tubérculos (batata, tapioca emandioca), os mesmos foram previamente cortados em pequenoscubos ou tiras, dependendo da possibilidade; entretanto,também é possível utilizar suas farinhas, tanto como seencontram como pré-cozidos. Ao contrário, os legumes (porexemplo, feijão fava, ervilhas, feijões e grão-de-bico) sãoutilizados como se encontram ou em uma forma seca) .Entretanto, é possível utilizar qualquer mistura dasmatérias-primas listadas até aqui. Vantajosamente, osubstrato é selecionado de arroz e/ou milho; preferivelmentena forma de um substrato soprado ou explodido ou na forma defarinha, utilizada individualmente e/ou em todas ascombinações previsíveis simples e/ou complexas.
O substrato preferido, consistindo em arroz soprado e/ou milho explodido é introduzido em garrafas de vidro de pirexcom uma abertura grande, que são subseqüentemente fechadascom um algodão bacteriológico e esterilizadas em autoclave a121°C por 20 minutos.
Cada garrafa é então inoculada com uma suspensão deesporos da cultura Penicillium e colocada para a incubação,juntamente com muitas outras suspensões idênticas formando umúnico lote de produção, em termostatos com uma temperaturacontrolada que varia de 20 a 28 °C, como uma função das cepasutilizadas.
A natureza de substrato de cultura e as condições deincubação permitem a passagem da forma de esporo quiescentepara a forma vegetativa; o esporo germina e a partir de cada,células (hifas), que produzem enzimas capazes de transformaras substâncias complexas que existem no substrato acimamencionado em moléculas mais simples que são absorvidas pelascélulas e determinam um crescimento rápido das mesmas, sãoformadas.
Cada hifa estende-se e se segmenta ocasionando duascélulas filhas que perpetram o mecanismo, dando origem emalguns dias a filamentos longos.
A partir do entrelaçamento mais ou menos estreito dashifas, um tipo de feltro de cor branca acinzentada é formada(micélio), o qual, quanto atinge um nível de crescimento bempreciso e quando as condições ambientais são vantajosas,produz hifas específicas na forma de uma "escova"(conidióforos) com os corpos de frutos que, por sua vez,carregam os esporos com uma cor verde/azul ou mais ou menosintensa.
O tempo necessário para a manutenção dos esporos muda decepa para cepa, porém genericamente, utilizando pão comosubstrato, o ciclo termina após 12-21 dias a partir doinóculo.
Quando o crescimento é concluído, um ou mais substratosda presente invenção, totalmente invadido e revestido demicélio e esporos verdes, são removidos a partir da garrafacom a ajuda de uma solução estéril de água, sal e ágar esubmetida à trituração, homogeneização e filtração em plantasadequadas para a extração de esporos. Ao término do processo,um liquido de cor verde/azul é obtido, no qual os esporos dacepa produzida Penicillium são suspensos.
A etapa de extração é seguida por uma etapa depadronização de título de esporos, um objetivo que é obtidoatravés da adição de uma fração adicional de solução estérilem água, sal e ágar até que a mesma densidade óptica de umaamostra de referência da cepa avaliada por comparaçãonefelométrica, é atingido.
O método descrito até o presente já permite certificar acultura de Panicillium desse modo fabricado como uma cultura"isento de glúten", tendo usado em qualquer etapa do processoprodutivo nenhum ingrediente, excipiente ou substância quecontenha naturalmente glúten.
Não obstante, para assegurar um nível de segurançaadicional, o Requerente tem associado vantajosamente com essametodologia de produção um tratamento com enzimasproteolíticas capazes de degradar o glúten, caso haja, vindode contaminações cruzadas acidentais como sendo realizada nasuspensão de esporos obtida dos substratos acima descritos.
Portanto, com a presente invenção o Requerente é capazde fornecer uma metodologia que prevê um nível de segurançaduplo, capaz de eliminar também o risco possível devido àpresença de resíduos de glúten devido a contaminaçõescruzadas que ocorreram ao longo da cadeia de produção dasmatérias-primas utilizadas.
O tratamento enzimático, tema da presente invenção, foidefinido após ter avaliado múltiplas enzimas proteoliticas,tanto proteases como peptidases e suas misturas, comotriprina, quimiotripsina, pancreatina, pepsina, papaina ebrorr - laína.
Vantajosamente, pepsina e bromelaina são utilizados, oumist iras das duas enzimas em uma razão de 1:10 a 10:1 dasmesmas; preferivelmente em uma razão em peso de 1:5 a 5:1.
A pepsina é uma enzima contida no suco gástrico quepromove a digestão dos alimentos. A pepsina é uma proteaseque trabalho melhor em um ambiente ácido e é capaz de romperas proteínas em muitos pontos diferentes e em desordem. Suaação hidrolítica é devido a um sítio ativo que contém doisresíduos de ácido aspártico. É extraído, em particular, damuccsa gástrica de suínos, ou do quarto estômago dosruminantes, em particular bovinos. É comercialmentedisponível tanto em forma líquida como em pó com um títulodiferente, expresso em Unidades enzimáticas, ou para o tipobovino, utilmado na indústria de laticínios para coagular oleite e afetar a maturação do queijo, em MCU (Unidades decoao nlação de leite).
bromelaina é uma mistura de proteinase complexaextrn.ída genericamente da haste de abacaxi, mesmo se enzimassimilares e· · Lverem também presentes em sua polpa. Abroj-elaína é disponível em pó com uma atividade enzimáticaexpr nsa em 1JDU (Unidades de digestão de gelatina) ou MCU(Uni .?.des de coagulação de leite). 1 MCU é equivalente aaprc nmadamerr e 2/3 GDU.
hidrolise de glúten ocorre em uma faixa de
tem; - raturas bem ampla, de 5 a 60°C; preferivelmente, de 30 a50°. 0 valor de pH está entre 1 e 7; preferivelmente de 4 a5. F oarti c ·. r, o pH para a pepsina está entre 1,8 e 6,0 epara η brome■ : ína o pH está entre 3,5 e 6,5.'anta j c aente, a temperatura está entre 30 e 40°C;
pre - rivelmer.: e é 37°C para a pepsina. Vantajosamente, atemparatura stá entre 40 e 50°C; preferivelmente, é 45°Cpari bromeirina.
o tempo de hidrólise está entre 5 e 60 horas;preferivelmente de 15 a 50 horas.
para a o finição das condições de trabalho com as quaiso Ttamentc enzimático, apropriado para eliminar todapre ça de glúten nas culturas de bolor produz comsub.c rncias naturalmente isentas de glúten, tem de serrea-1ada, experimentações foram conduzidas, nas quais paratais cultur s quantidades conhecidas de glúten foramvolu ariaraee adicionadas, de modo a trazer a concentraçãofine em υ intervalo variável de 3 a 20 ppm. Taiscone rtraçõe de glúten estimulam a situação mais séria quepoda ocorrer após contaminações cruzadas ocorridas na cadr de p dução dos alimentos naturalmente isentos deglút e bstâncias, utilizados como substratos decrê.mento bolor.
a s Θλ ρ o rimentações, realizadas para fins de hidrolisaro en volrntariamente adicionado, pepsina liquida com um .títu entre 300 e 800 MCU, vantajosamente com um tituloigu. a 500 ' :C foi utilizado, e bromelaina em pó com umtíti entre 1500 e 3000 GDU, vantajosamente com um tituloigur . a 2.200 GDU.
ários Lestes foram realizados, variando de tempo para temr a crcentração final das enzimas, utilizadasind-νidualmene em mistura, ou as condições de trabalho dehid ise (ter peratura, pH do bolor e tempo de ação).
Λ ror.o. -ro completa da quantidade máxima de glútenadi cr nado nal a 20 ppm, foi pref erivelmente realizada como us si mu It de pepsina (com um titulo igual a 500 MCU) ebre ina m um titulo igual a 2.200 MCU), para umcom: or.to ial de 20 - 28 horas, por exemplo 24 horas, comuma r-mperotrj_a entre 24 e 30°C em um pH controlado entre 4 es o tamento enzimático e aprovação do lote pelo
Con Lo cie alidade, a embalagem em garrafas estéreis éexe ia.com base na regra européia que entrará em vigor no finalde . só· . r.te um queijo de marmoreamento azul produzidocom ores bricado com a tecnologia da presente invençãodar/ :-.rar.ti-. absoluta sobre a ausência de glúten no mesmo.
Par- ;.~se :;ieijo, portanto, qualquer menção no rótuloref- .=lice à nresença de glúten será desnecessária.)ora, relação às matérias-primas utilizadas como
subs . os d crescimento, um número suficiente de dados játen"; e ido reportado, algumas modalidades preferidasref- es a tratamento enzimático são listadas abaixo comoexe; rio simples que não limita a importância da presenteinvencao.
Nessas modalidades preferidas, as condições de trabalhosão tais que a atividade biológica dos esporos de bolor, epor: η to sua capacidade de assegurar um marmoreamento azulótimo e maturação dos queijos azuis são protegidas.
Por exemplo, em uma modalidade preferida é utilizado:i, concentração de bromelaina: de 0,1 a 0,4 g/litro debole (igual a 220-880 GDU/1) : hidrólise pH 4,4 - 4,6;temperatura de hidrólise: 22 - 28°C (por exemplo, 24°C);ext. --S.-:o de hidrólise: 24 - 48 horas.
Por exemplo, em outra modalidade preferida é utilizado:,) concentração de pepsina: de 0,2 a 0,4 g/litro debolo (igual a 100 - 200 MCU/1) : hidrólise pH: 4,4 - 4,6;tem; ratura de hidrólise: 22 - 28°C (por exemplo, 24°C);ext· εΊο de hidrólise: 24 - 48 horas. Por exemplo, ainda emout: ..odalidade preferida é utilizado:
.) concentração de bromelaina: de 0,05 a 0,2 g/litro debole (igual a 110-440 GDU/1); concentração de pepsina: de0, 1 : 0, 2 ml/litro de bolor (igual a 50 - 100 MCU/1);hic ι Lse pH 4,4 - 4,6; temperatura de hidrólise: 22 - 28°C(po: .emplo, 24°C); extensão de hidrólise: 24 - 48 horas.
' mtajosamente, com o método da presente invenção, aqua1 L-Jade final de glúten determinada com o teste maissen . y--j 1 atualmente comercialmente disponível, sempre resultaem " determinável. Nesse caso, é possível assegurar ade glúten nas culturas produzidas com a metodologiada isente invenção. Os controles analíticos referentes àscon· itrações de glúten foram realizados com o kit deGli -ina ELISA RIDASCREEN® da R-Biopharm A, Darmstadt,para a análise quantitativa da gliadina ecorrespondentes. A partir do periódico "Approachestoestablish thresholds for major Food allergens and forin food" - Draft report da US Food and Drugstration de junho de 2005, pode ser ordenado que o kitana" ico utilizado para determinar a concentração de glútenpoucos confirmados, mais sensíveis, quantitativos epara as gliadinas diferentes.

Claims (18)

1. Método para preparação de composição incluindo pelomenc uma cultura de bolor ou esporo isenta de glúten, acult ra sendo do gênero Penicillium roqueforti e sendo obtidapor substrato de cultura isenta de glúten, caracterizadopelo fato de que a composição é adicionalmente submetida a umtrat. :nento enzimático para remover resíduos de glútenexistmetes na mesma.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que os esporos ou bolores sãoselecionados do grupo dos 16 microorganismos seguintes:Denicillium roqueforti DSM 17815, Penicillium roquefortiDSM 17816, Penicillium roqueforti DSM 17817, Penicilliumroqv zorti DSM 17818, Penicillium roqueforti DSM 17819,Peni -illium roqueforti DSM 17820, Penieillium roqueforti DSM-178 1, Penieillium roqueforti DSM 17822, Penieilliumroq:: .fortí DSM 17823, Penieillium roqueforti DSM 17824,Pen:. Lllium roqueforti DSM 17825, Penieillium roqueforti DSM-178/, Penieillium roqueforti DSM 17827, Penieilliumroqι. -zorti DSM 17828, Penieillium roqueforti DSM 17829,Per. Ilium roqueforti DSM 17830.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1,car·= erizado pelo fato de que o substrato de cultura isentode c· iten é selecionado daqueles de origem vegetal.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3,car :arizado pelo fato de que o substrato de cultura deori;. α vegetal é selecionado do grupo que inclui: arroznat:. ! Imente isento de glúten, milho, batata, mandioca,tap: ;a, castanhas, ervilhas, feijão fava, feijões e legumesou . is misturas.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4,car erizado pelo fato de que o substrato de cultura é umamis' a que inclui arroz e milho.
6.Método, de acordo com a reivindicação 3,car :.erizado pelo fato de que o substrato de cultura tem afor de grãos soprados ou explodidos ou na forma de farinhascorr -e encontram e/ou pré-cozidos.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, incluindopelraenos uma etapa na qual o substrato de cultura éinclinaado com uma suspensão de esporo intermediário daespecie Penicillium roqueforti, caracterizado pelo fato deque inoculação é realizada por um tal tempo e sob taiscorões de temperatura que a maturação dos esporos épeida.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que uma etapa de separação de umasolvido liquida, contendo a cultura de esporo, a partir dosubracto utilizado é adicionalmente prevista.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8,caractizado pelo fato de que uma etapa de desidratação dasol o liquida para obter a cultura de esporos em uma formalieizada, pulverizada ou em pó é prevista adicionalmente.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracerizado pelo fato de que os resíduos de glútenexi ates na composição a ser submetida ao tratamentoenzrtico derivam de contaminações cruzadas acidentais, nãointionais.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1,car erizado pelo fato de que o tratamento enzimático prevêde pelo menos uma enzima proteolítica, a enzimapre lítica sendo selecionada do grupo que inclui proteasese dases, as proteases e peptidases sendo selecionadas dogru que inclui: tripsina, quimiotripsina, pancreatina,papaína e bromelaina.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11,car erizado pelo fato de que as proteases e peptidases sãose: onadas de pepsina e/ou bromelaina.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1,car erizado pelo fato de que o tratamento enzimático ocorreem /alor de pH entre 1 e 7; em uma temperatura entre 5cC e-60° o em um tempo entre 5 e 60 horas.
14. Métocio, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que o tratamento enzimático érealizado com pepsina e/ou bromelaina sob as seguintescondições: pH entre 4,4 e 4,6; temperatura entre 22°C e 28°C;e um tempo entre 2 4 e 48 horas.
15. Composição, caracterizada pelo fato de incluir pelomenos uma cultura de bolor ou esporo isento de glúten obtidode acordo com o método como definido na reivindicação 1.
16. Composição, de acordo com a reivindicação 15,caracterizada pelo fato de que os esporos ou bolores sãoselecionados do grupo dos 16 microorganismos a seguir:Penicillivm roqueforti DSM 17815, Penicillium roquefortiDSM 17816, Penicillium roqueforti DSM 17817, Penicilliumroqueforti DSM 17818, Penieillium roqueforti DSM 17819,Penieillium roqueforti DSM 17820, Penieillium roqueforti DSM- 17821, Penicillium roqueforti DSM 17822, Penieilliumroqueforti DSM 17823, Penieillium roqueforti DSM 17824,Penieillium roqueforti DSM 17825, Penieillium roqueforti DSM- 17826, Penicillium roqueforti DSM 17827, Penieilliumroqueforti DSiA 17828, Penieillium roqueforti DSM 17829,Penieillium roqueforti DSM 17830.
17. Método para preparação de produto laticínio demarmoreamento azul, caracterizado pelo fato de incluir pelomenos uma etapa na qual uma composição incluindo pelo menosuma cultura de bolor ou esporo isenta de glúten como definidana reivindicação 15 é utilizada.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado polo fato de que os esporos ou bolores sãoselecionados do grupo dos 16 microorganismos a seguir:Penicillium roqueforti DSM 17815, Penieillium roquefortiDSM 17816, Penicillium roqueforti DSM 17817, Penieilliumroqueforti DS17818, Penieillium roqueforti DSM 17819,Penieillium roqueforti DSM 17820, Penicillium roqueforti DSM- 17821, Penicillum roqueforti DSM 17822, Penieilliumroqueforti DSl-/ 17823, Penieillium roqueforti DSM 17824,Penieillium roqueforti DSM 17825, Penieillium roqueforti DSM- 17826, Penicilium roqueforti DSM 17827, Penieilliumroqueforti DS?â 17828, Penicillium roqueforti DSM 17829,Penicillium roc, -eforti DSM 17830.
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