BRPI0609476A2 - agente antimicrobial compreendendo um composto de cisteìna covalentemente ligado a um substrato, em particular pela ligação através de uma ponte s-s via uma molécula espaçadora - Google Patents

Abstract

AGENTE ANTIMICROBIAL COMPREENDENDO UM COMPOSTO DE CISTEìNA COVALENTEMENTE LIGADO A UM SUBSTRATO, EM PARTICULAR PELA LIGAçãO ATRAVéS DE UMA PONTE S-S VIA UMA MOLéCULA ESPAçADORA. A invenção se refere a um agente antimicrobial onde um composto de cisteina é covalentemente ligado a um substrato, em particular pela ligação através de uma ponte S-S, via uma molécula espaçadora, ao substrato. O espaçador compreende uma cadeia de carbono, opcionalmente interrompida por um ou mais heteroátomos, por exemplo, O, S, N, P e Si; a cadeia é opcionalmente substituida com um ou mais grupos alquil, preferivelmente grupos alquil inferior com 1-5 átomos de carbono, grupos hidroxil ou grupos alcóxi. Também, a invenção se refere a um substrato que é revestido com o agente antimicrobial da invenção. O agente tem excelentes propriedades antimicrobiais, e pode ser usado para revestir superfícies e substratos de vários dispositivos, tais como dispositivos médicos ou dispositivos usados no manuseio de alimento, de modo a impedir ou inibir acúmulo e/ou crescimento e/ou proliferação e/ou a viabilidade de microorganismos e/ou formação de biofilme.

Description

"AGENTE ANTIMICROBIAL COMPREENDENDO UM COMPOSTO DE CISTEINA COVALENTEMENTE LIGADO A UM SUBSTRATO, EM PARTICULAR PELA LIGAÇÃO ATRAVÉS DE UMA PONTE S-S VIA UMA MOLÉCULA ESPAÇADORA"

Campo Técnico

A invenção se refere a agentes antimicrobiais ou dispositivos que vêm em contato com microorganismos, e/ou que é desejável para manter-se livre de acúmulo e/ou adesão de microorganismos. 0 substrato ou superfície do dispositivo exibe um agente antimicrobial da invenção*

Antecedente Técnico

Em várias situações e aplicações de, por exemplo, cuidado médico, manuseio de alimento e armazenamento de alimento, é muito importante que os dispositivos e produtos que são usados sej am mantidos livres de crescimento ou proliferação de microorganismos. No minimo isto é extremamente importante quando eles vêm nos dispositivos médicos que são trazidos em contato com pacientes em um hospital, visto que dispositivos contaminados podem participar no espalhamento de doença e microorganismos em um modo que podem afetar severamente a saúde de muitos pacientes.

Seria, por exemplo, muito vantajoso se os dispositivos e produtos que vêm em contato com microorganismos potencialmente perniciosos tivessem a capacidade de inibir ou matar bactéria e/ou outros microorganismos, tais comovirus e fungos, de modo a impedir o espalhamento de doenças.

O obj etivo é impedir a colonização inicial que subseqüentemente pode se desenvolver em um biofilme. A fase inicial de colonização pode ser suprimida por, ou inibição, ou matando-se os microorganismos.

De modo a obter-se uma proteção, é conhecido proporcionar uma superfície em um dispositivo com ions de metal, tais como ions dos elementos Ag e Ni. Freqüentemente, Ag é aplicada como uma liga com a proposta de liberar os ions Ag+ a uma taxa adequada para o ambiente, impedindo, desse modo, o acúmulo de microorganismos.

Contudo, um problema com esta solução é a adesão do metal ou liga à superfície em questão. Também, o efeito antimicrobial não é facilmente controlado, e, adicionalmente, a superfície revestida com ion de metal pode ter efeitos citotóxicos.

0 documento US-A-6.475.434 revela uma composição de penetração de biofilme para remoção de biofilmes formados e constituídos por microorganismos infecciosos, bem como para revestimento de dispositivos médicos de modo a impedir a formação de tais biofilmes. A composição compreende cisteina e análogos ou derivados desta a serem selecionados como um dos componentes. 0 papel da cisteina ou componente relacionado a cisteina não é claro, e notavelmente para aplicações de revestimento, eles são usados em combinação com agentes antimicrobiais conhecidos, tais como rifamicinas, tetraciclinas e penicilinas. Notavelmente,conforme mostrado nos exemplos 2 e 3 no documento US-A-6.475,343, o único componente de cisteina testado (que é N-Acetil Cisteina) não tem efeito, a menos que combinado com os antibióticos testados. Além disso, para proteção de biofilme, todos os componentes são aplicados pela impregnação do dispositivo ou mistura com o material do dispositivo durante manufaturamento. Os componentes, em seguida, tornam-se fisicamente ligados pela adesão e penetração no material do dispositivo, que significa que sua função a uma extensão maior ocorre após sua liberação para o ambiente. Particularmente na aplicação médica, tais conceitos requerem controle estrito do equilíbrio entre os efeitos antimicrobial, citotóxico e imunogênico. Desde que a difusão é dependente do tempo e da temperatura, o armazenamento e durabilidade dos dispositivos revestidos também tornam-se matérias de interesse sério.

Foi descrito por Olofsson e outros (Microbiologia Aplicada e Ambiental, Agosto de 2003; 69 (8), 4814-4822), que a N-Acetil Cisteina pode afetar o crescimento bacterial na solução. Outros efeitos da N-Acetil Cisteina foram diminuir a adesão de bactérias de multi-espécie nas superfícies de aço inoxidável, ou facilitar o destacamento de um biofilme nas superfícies de aço inoxidável.

Uma proposta principal da presente invenção é proporcionar um agente antimicrobial tendo a capacidade de impedir ou pelo menos substancialmente reduzir o acúmulo e/ou adesão de microorganismos individuais na superfície de um dispositivo em uma maneira estável e de longo prazo.Este proposta é alcançada pelos inventores em um primeiro aspecto da invenção, referindo-se a um agente antimicrobial compreendendo um substrato com um composto de cisteina covalentemente ligado.

Em particular, a invenção proporciona um agente antimicrobial, no qual o composto de cisteina é ligado através de uma ponte S-S, via uma molécula espaçadora, ao substrato. 0 espaçador compreende uma cadeia de carbono, opcionalmente interrompida por um ou mais heteroátomos, por exemplo, 0, S, N, P e Si; e a cadeia é opcionalmente substituída com um ou mais grupos alquil, preferivelmente grupos alquil inferior com 1-6 átomos de carbono, grupos hidroxil ou grupos alcóxi. Nos exemplos dados abaixo, o composto de cisteina está ligado em uma posição terminal do espaçador, via uma ponte S-S, que é uma concretização preferida da invenção. Contudo, também outras posições da cadeia do espaçador são possíveis, considerando-se que a função da cisteina é exposta ao ambiente.

De acordo com uma concretização da invenção, o ligante contendo cisteina ligado a um substrato tem a fórmula geral:

(1) Ri-X-L-S-S-(componente de cisteina), no qual

- Ri é um substrato solúvel ou insolúvel; por exemplo, uma superfície sólida, ou uma molécula orgânica solúvel, ou polímero.

- X é um grupo de ligação a partir da reação de acoplamento entre o substrato e L.- L é uma molécula espaçadora selecionada a partir do grupo compreendendo (CH2)m, onde m é 1-20, preferivelmente 1-12, 1-8, ou 1-6; (CH2CH20)n(CH2)p ou (CH (CH3) CH20) n (CH2) p, onde n é 1-1000, preferivelmente 1-100 ou 3-50, e p é 1-20, preferivelmente 1-12, 1-10 ou 1-6. O segmento (CH2)P é ligado à ponte de disulfito, mas pode, opcionalmente, também ocorrer entre os segmentos (CH2CH20)n e/ou (CH(CH3) CH20) n em um copolímero de bloqueio;

- O componente de cisteína é aqui referido como o resíduo de um composto de cisteína compreendendo cisteína, um análogo de cisteína, ou derivado de cisteína proporcionando atividade antimicrobial que é substancialmente a mesma, ou em um nível comparável àquele conferido pela cisteína. Tem sido notado que uma concretização da invenção onde o composto de cisteína é ligado, via uma ponte S-S, compreendendo um S a partir do grupo tiol de composto de cisteína, e um S a partir da molécula espaçadora, é de importância especial, pelo menos em algumas aplicações, devido a sua atividade antimicrobial superior.

Conseqüentemente, um agente antimicrobial é provido, que é covalentemente fixado à superfície do dispositivo, e que, devido aos efeitos surpreendentemente vantajosos da cisteína covalentemente ligada, tem um efeito alto e de longo prazo; ver os exemplos abaixo, nos microorganismos individuais, impedindo ou inibindo substancialmente, desse modo, a adesão e acúmulo de microorganismos individuais. Desse modo, a presente invenção oferece um potencial muitogrande para todas as aplicações onde é de se j ável que uma superfície ou substrato exibam propriedades

antimicrobiais/antibacteriais. Uma vantagem adicional e essencial da invenção, é que foi mostrado pelos inventores que o agente da invenção parece carecer de efeitos cititóxicos, que o torna utilizável em muitas aplicações diferentes.

Em um aspecto da presente invenção, vários dispositivos que são desejáveis para manter livre de acúmulo e/ou adesão de microorganismos são completamente ou parcialmente revestidos com um agente antimicrobial de acordo com a invenção.

Em outro aspecto, a presente invenção se refere ao uso de um agente antimicrobial da invenção para impedir crescimento e/ou proliferação de microorganismos em um substrato e/ou uma superfície de um dispositivo.

Em contraste ao documento US-A-6.475.434 , a presente invenção proporciona um método para ter a cisteina ou componente relacionado a cisteina covalentemente ligado a um substrato. Um uso maior para a invenção é proporcionar um revestimento antimicrobial para um dispositivo sólido. Por este conceito, os agentes antimicrobiais são permanentemente fixados à superfície, e o efeito antimicrobial ocorre após contato superficial preferivelmente do que a partir da reação com agentes liberados que diminuirão grandemente o risco de efeitos adversos em um ambiente biológico. Isto é uma diferença maior comparada aos métodos da técnica anterior onde acisteina é provida tal como um agente de liberação. Também pela fixação covalente, a superfície pode ser feita mais especificada em termos de concentração superficial e estrutura química. Desse modo, não somente a cisteina ou o próprio componente relacionado a cisteina ligados à superfície, mas pelo menos em algumas aplicações, também a ligação de di sul fito pela qual ela está ligada à superfície, é uma das características da invenção do presente conceito com relação ao efeito antimicrobial. Além disso, a fixação covalente proporciona uma superfície, que, in situ, bem como no armazenamento, é superior em consistência e durabilidade, comparada às superfícies onde difusão e vazamento dos agentes ativos são de maior interesse.

"Um agente antimicrobial" compreende um substrato que tenha sido modificado para exibir um componente de cisteina covalentemente ligado, e tem o efeito de impedir, ou pelo menos substancialmente impedir acúmulo, crescimento e/ou proliferação de pelo menos um microorganismo especifico. Este efeito pode, por exemplo, ser observado por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, pelos métodos usados na seção de exemplo desta revelação.

Um "componente de cisteina" compreende o resíduo de cisteina, um análogo de cisteina, ou derivado de cisteina, tendo efeito antimicrobial, por exemplo, homocisteina ou cisteinas N-substituidas, tais como N-acetil-L-cisteina e cisteinas N-alquilatadas."Substrato" (Ri) compreende qualquer artigo, dispositivo, molécula ou polimero, solúvel ou insolúvel, que pode ser funcionalizado para obter-se propriedades antimicrobiais pela ligação de um componente de cisteina. De especial interesse são artigos sólidos similares a dispositivos médicos a serem usados no interior ou em contato com o corpo humano ou animal, em particular tecidos sensíveis e fluidos corpóreos. Esta lista de aplicações potenciais é extensiva, ver adicionalmente abaixo, e incluem implantes, cateteres de drenagem de tubos, etc, a serem usados em, por exemplo, aplicações extra corpóreas, drenagem (por exemplo, orelha ou hidrocéfalo), diálise, lente de contato, lentes intra-oculares, peles artificiais, equipamentos de diálise, máquinas de coração e pulmão, materiais de sutura, dispositivos de cuidado de ferimento, administração parenteral, distribuição de droga, stents, bombas (por exemplo, para insulina), dispositivos de auxilio de audição, seringas, materiais de sutura, marca-passos, etc.

"Prevenção" ou winibição" compreende a capacidade de cessar ou substancialmente reduzir o crescimento, e/ou proliferação, e/ou acúmulo, e/ou reduzir substancialmente a viabilidade de microorganismos em uma posição onde o agente da invenção está presente.

0 potencial principal da presente invenção é oferecer a possibilidade de proporcionar uma superfície antimicrobial em um dispositivo sólido, que potencialmente vem em contato com microorganismos, e que é desejávelmanter livre de acúmulo e/ou proliferação demicroorganismos, e/ou servir como um reservatório para microorganismos viáveis. 0 grande número de dispositivos a serem usados na medicina, bem como aplicações de manuseio de alimento onde a presença de microorganismos pode ser mais ou menos perigosa, ilustra o potencial desta invenção. De modo a tornar isto possível, os inventores têm usado com sucesso a substância cisteina, que os inventores têm mostrado terem inesperadamente forte efeito antimicrobial quando ligado covalentemente conforme descrito e reivindicado aqui. Os efeitos antimicrobiais têm sido mostrados para análogos de cisteina e derivados também, similares a N-acetilcisteina e homocisteina.

Polímeros ou oligômeros de oxido de etileno e oxido de propileno, isto é, poli(oxido de etileno) ou poli(etileno glicol), são prontamente solúveis em água, e, adicionalmente, poli(oxido de etileno) tem propriedades repelentes de proteína, que podem ser adicionados à função antimicrobial desta invenção, especialmente quando usados em conjunto com as superfícies. Dependendo do componente de cisteina, as seguintes estruturas são exemplos de ligantes adequados a serem usados:

<formula>formula see original document page 10</formula><formula>formula see original document page 11</formula>

Na fórmula (2) , os substituintes R2, R3 podem serhidrogênio ou alquil com 1 a 2 0, preferivelmente de 1 a 12,mais pref erivelmente 1 a 6 átomos de carbono, em qualquercombinação de R2 e R3, e q pode ter a mesma variação como me p para os constituintes de metileno do segmento Lconforme anteriormente descrito, isto é, de 1 a 20,pref erivelmente de 1 a 12, mais pref erivelmente de la 6.Quando q=l, e R2 = R3 = H, o componente de cisteina torna-se um residuo de cisteina que, similar aos homólogos ederivados de cisteina, é acoplado via seu grupo triol quecontribui com um enxofre para a ligação de disulfito. Emadição a alquilação direta do grupo amino cisteina, R2 e R3alquis podem ser ligados via uma ligação de amidacompreendendo o nitrogênio do componente de cisteina, porexemplo, quando R2 é hidrogênio e R3 é metil, o componentede cisteina torna-se acetilcisteina.

Na fórmula (3), R2, R3, R4 são substituintes alquil quedão um grupo amino quaternário positivamente carregado.Neste caso, o número de átomos de carbono nas cadeiasalquil dos substituintes R2, R3, R4 pode variar entre 1 e25, preferivelmente de 1 a 18 em qualquer combinação.Adicionalmente, q pode ter a mesma variação como m e p paraos constituintes de metileno do segmento L, conformeanteriormente descrito, isto é, de 1 a 20, preferivelmentede 1 a 12, mais preferivelmente de 1 a 6.

Dependendo do pH, grupos iônicos carregados podemtambém ocorrerem como grupos aminos protonizados em (2) , egrupos carboxilatados em (2) e (3).

O acoplamento - X - entre o substrato Ri e o ligante éobtido por reações químicas entre grupos funcionais em Ri eo respectivo ligante. Se Ri tem uma funcionalidade química Ye uma funcionalidade de ligante Z que sob reação dá X, areação de acoplamento principal onde sub-produtos sãoomitidos pode ser escrita como:

(4) Ri-Y + Z- L- S-S- (Componente de cisteina) -»-»Ri-X-L-S-S - (Componente de cisteina)

Dependendo da escolha de Y e Z e das condições dereação, o grupo X obtido pode ser amida, amina secundária,éster, éter, hidrazina, uretano, uréia, carbonato e outros.Um grande número de reações especificas e eficientes sãodisponíveis que são bem estabelecidos na química orgânica.Os grupos Y, Z e X, bem como as reações dadas aqui são,portanto, exemplos e não limitam a invenção.

Tabela 1 <table>table see original document page 13</column></row><table>

Os grupos Y e Z nos exemplos (a) a (p) podem serintercambeados entre Ri e o ligante para dar a mesmaligação X embora invertida entre Rx e o ligante. Porexemplo, quando os grupos funcionais em (a) sãointercambeados para Y = NH2 e Z = COOH, a ligação X torna-se HNOC. Nos exemplos (e) e (f) , a imina inicialmenteobtida geralmente conhecida como uma base Schiff é reduzidapara a ligação de amina secundária com NaCNBH3.Freqüentemente, etapas intermediárias são usadas paraaumentar a seletividade e o rendimento. Exemplos bemconhecidos são ativação do grupo carboxilico (Y) em (a) comuma carbodiimida e/ou N-hidroxisuccinic imida antes daformação de amida com o grupo amino (Z) . Os grupos aminapodem ser ativados com disuccinimidil carbonato, paraformar ligação de uréia com outro grupo amina.

Em adição aos grupos carboxilico e amino, os gruposhidroxilicos são também úteis em um grande número dereações de acoplamento:

- após derivatização em carbonatos dando o grupo Z em(h) onde <p denota um anel benzeno ou em grupos trisilatadoscomo em (m) e (n);

- após ativação dos grupos hidroxilicos porderivatização em grupos carbonatos tosil- ou succinimidil,ou tratamento com BR2 ou CNBr para reações de acoplamentocom núcleofiles similares a aminas e/ou tióis;

- dois grupos hidroxilicos pode estar ligados juntoscom fosgene, para formarem uma ligação de carbonato.

Revisões compreensivas na quimica de acoplamento comas reações mencionadas aqui, bem como reações deacoplamento adicionais, são encontradas na literatura (Ref.Herman S. e outros, J. Biocat. Compat. Pol. 1995, 10, 145-187) .

No exemplo (s) na Tabela 1, Ri» simboliza um substratosólido com radicais livres acessíveis para reação com umgrupo insaturado exemplificado, mas não limitado a ligaçõesduplas etilênicas, acrílicas ou metacrilicas. Pelo uso demonômeros que têm o ligante -L-S-S- (componente decisteina) fixado às ligações de carbono-carbono reativas,cadeias oligoméricas ou poliméricas podem ser obtidas, quesão covalentemente ligadas ao substrato, e que têm oligante como grupos laterais. A concentração destes gruposlaterais nas cadeias oligoméricas ou poliméricas pode sercontrolada por copolimerização com monômeros adequadosexemplificados por, mas não limitado a, ácidos acrilico oumetacrilico, ou ésteres, ou acrilamida. Outra rota seriausar monômeros similares a ácido malêico, anidrido malêico,ácido tiglico ou alil amina, que se ligam prontamente a umradical livre, proporcionando superfície, mas tempropagação de cadeia fortemente reduzida. Os gruposfuncionais dados por estes monômeros, isto é, anidrido,carboxil ou amina, portanto, se tornarão confinados a umacamada superficial muito fina no substrato. Por esta rota,cada acoplamento de ligante ocorrerá essencialmente porfixação terminal diretamente aos grupos funcionais nasuperfície, proporcionando, desse modo, uma estruturadiferente, conforme comparada àquela obtida quando osligantes tomam parte na polimerização de enxerto.

A reação de acoplamento com Ri - Y pode ocorrer deacordo com (4), provido que o grupo Y reage seletivamentecom o grupo Z do ligante, e não com grupos amino oucarboxilico no componente de cisteina.Nos casos onde o grupo Y pode não reagirexclusivamente com o grupo Z do ligante representado por:

(5) Z-L-S-S- (Componente de cisteina)

mas também com o grupo amino e/ou carboxilico do componentede cisteina, estes grupos podem, se requerido, seremprotegidos por substituição ou esterificação,respectivamente.

O grupo amino pode ser protegido pelos substituintesexemplificados por butiloxicarbonil terciario (t-BuO). Istoé naturalmente somente necessário quando o grupo amino nãoé alquilatado em aminas terciaria ou quaternária, conformedefinido nas equações (2) e (3). 0 grupo carboxil docomponente de cisteina pode ser protegido por metilação.Após a reação de acoplamento entre Ri-Y e o Z-ligante paraobter-se o ligante ligado X como na equação (4), o t-BuO eos grupos éster metil podem ser removidos por hidróliseácida e alcalina, respectivamente e, desse modo,restaurando a estrutura original do ligante Z. Com estasopções, o ligante Z, conforme definido na equação (2)-(4) epela fórmula (5) , e, além disso, disponível com váriasfuncionalidades Z, é um item separado desta invenção a serusado como um componente de kit para modificação de etapasimples de superfícies funcionalizadas. Este aspecto dainvenção também cobre os exemplos anteriormente descritosonde a funcionalidade Y do substrato é um radical livre, ea funcionalidade Z do ligante é uma ligação carbono-carbonoreativa insaturada.Quando o grupo funcional Y é ligado a um substratosólido, o ligante pode ser sintetizado in si tu nasuperfície do substrato. Isto tem a vantagem que os gruposY não-reagidos, bem como sub-produtos, são eliminados emetapas intermediárias.

Por este procedimento, a primeira etapa será reagir asuperfície Ri - Y com um composto tendo a composição geral

(6) Z-L-S-S-R5

onde L tem a mesma definição como antes, e onde osubstituinte R5 é facilmente substituído após reação comtióis para dar uma nova ligação de disulf ito com umcomposto de tiol.

A primeira etapa de acoplamento pode ser expressa

como:

(7) R1-Y+Z-L-S-S-R5-^Ri-X-L-S-S-Rs

e a seguinte etapa:

(8) R!-X-L-S-S-R5+HS- Componente decisteina -*

-+R1-X-L-S-S- Componente de cisteina

( + R5HS)

Um exemplo comum de R5 é piridinil, mas dansil étambém usado. Alternativamente, a ligação de disulfito em(6) pode pertencer a um grupo tiosulfato que também daráuma ligação de disulfito após reação com um tiol.

Em adição, existe uma rota alternativa para obtençãoessencialmente da mesma estrutura química, e que estátambém dentro do escopo desta invenção. Neste caso, umsegmento de tiol ou grupo - L - SH é ligado a Rlf via ogrupo de acoplamento X, e onde L e X são definidos comoantes, e -SH é um grupo tiol terminal. Este pode reagirexclusivamente com o grupo tiol do componente de cisteinana presença de oxidantes para formar a ligação de disulfitocom o componente de cisteina:

(9) Ri - X - L - SH + HS - (componente de cisteina) ->

-►Ri-X-L-S-S - (componente de cisteina)+ (H2 ou sub-produto contendo hidrogênio).

Quando finalmente o componente de cisteina é acopladode acordo com a fórmula (9), um ligante antimicrobial éobtido, que é covalentemente ligado a Ri, conformeesquematicamente mostrado na fórmula (9) .

A funcionalização superficial de materiaispoliméricos, tais como plásticos, borracha, celulósicos,etc, pode ser alcançada por enxerto ou adsorção decompostos conduzindo grupos funcionais, tais como, porexemplo, carboxil ou amina. 0 enxerto que dá uma ligaçãocovalente ao substrato requer funcionalização dasuperfície. Os compostos que podem reagir com radicaislivres são enxertados durante ou após ativação com UV,feixe de elétrons, ou irradiação gama, ou plasma de gás.Por estes métodos, radicais livres podem ser gerados emsubstratos poliméricos que podem iniciar a polimerização deenxerto em tais substratos. Estes métodos de modificaçõessuperficiais para substratos poliméricos sólidos sãorepresentados pelo exemplo (q) na Tabela 1. Neste processo,o enxerto usualmente envolve propagação de cadeia a partirda superfície de substrato conhecida como polimerização deenxerto.

Monômeros que são freqüentemente usados napolimerização de enxerto de radical livre são compostosacrílicos, similares a ácido acrílico, ácido metacrílico eseus ésteres, ou acril amida, bem como vinil pirrolidona.Por polimerização de enxerto de tais monômeros contendogrupos funcionais, por exemplo, carboxil, amino,halogênios, etc, uma superfície sólida pode ser provida comgrupos funcionais ligados covalentemente para fixaçãocovalente do ligante antimicrobial. Uma aplicação especialde polimerização de enxerto também compreendida pelapresente invenção foi anteriormente descrita, onde oligante antimicrobial, conforme representado na fórmula(6), pode ser polimerizado por enxerto quando Z é um gruporeativo de radical livre contendo ligações de carbono-carbono insaturadas reativas. Isto daria ligantesantimicrobiais como grupos laterais nas cadeiaspolimerizadas por enxerto, a concentração e localização dasquais podendo , ser controladas por co-polimerização deenxerto com monômeros vinilicos ou acrílicos adequados.Contudo, conforme foi também anteriormente descrito, oligante antimicrobial pode ser terminalmente fixadodiretamente ao substrato. Neste caso, a funcionalização dosubstrato é feita em uma primeira etapa por enxertomonomolecular com composto insaturados tendo propagação decadeia insignificante, similar a anidrido malêico, ácidoma lêico e ácido triflico, ou um monômero de auto-terminaçãosimilar a alil amina. Por este procedimento, gruposfuncionais podem ser gerados na superfície para fixaçãoterminal direta do ligante antimicrobial por acoplamentoquimico. Também nos casos quando um ligante vinilico ouacrílico na fórmula (6) não polimeriza, por exemplo, porrazões estéricas, ele se fixaria diretamente pela reaçãoterminal com radicais livres no substrato.

Nos casos onde o substrato, tal como um materialplástico hidrolizável, similar a poliéster (PET), poliamida(Nylon™, Nomex™, Kevlar™) , ou superfície de poliacrilato(PMMA), funcionalização pode ser obtida por hidrólise emuma solução ácida ou básica. Os poliésteres dariam gruposcarboxilicos e hidroxilicos e grupos poliamidascarboxilicos e amina, que podem ser usados em modificaçõessubseqüentes por acoplamento ou adsorção.

Substratos metálicos similares a aço inoxidável podemser superfície funcionalizada com grupos carboxilicos porradiação e tratamento de plasma. Artigos metálicossimilares a stents são carboxilatados pela exposição aplasma de gás de ácido . silano e acrílico. Superfícies deouro e prata podem ser enxertadas pelo uso de suareatividade para o tiol e compostos de disulfito, quetambém conduziriam outros grupos similares a carboxil ouamina- Também para substratos metálicos, enxerto de radicallivre de superfícies pode ser obtido por polarizaçãocatódica dos substratos condutivos durante exposição àmonômeros capazes de formar ligações covalentes após reaçãocom radicais livres. O enxerto da superficie é análogoàquele para substratos poliméricos sólidos em termos deiniciação, propagação e monômeros, e é também representadopelo exemplo (s) na tabela 1.

Quando a modificação superficial dos substratospoliméricos é produzida através de adsorção do substrato,imprimadura é freqüentemente produzida por oxidaçãoquimica, tratamento de coroa ou plasma de gás oxidativo,para obter-se grupos hidrofilicos e iônicos na camadasuperficial. Um exemplo é a adsorção de polietileno iminanos substratos poliméricos que foram oxidados compermanganato ou persulfato. As superfícies de amino obtidaspodem ser usadas para reações de acoplamento quimico, bemcomo adsorção de polímeros negativamente carregadossimilares a ácido poliacrilico, sulfato de dextrano, ouheparina em pH adequado. Freqüentemente, taispolieletrólitos em seus estados ionicamente carregados sãoadsorvidos em camadas alternantes com as propriedades deinteresse na camada mais externa. Especialmentecarboxilação de superfícies metálicas é freqüentementeproduzida por adsorção de ácido poliacrilico oupolimetacrilico* Conforme descrito acima, elas podem, emseguida, serem aminizadas por acoplamento quimico, ou poradsorção iônica de, por exemplo, polietileno imina oupolialilamina.

Outro modo de obter-se adsorção, que não necessita dequalquer funcionalização primária do substrato, é usarpolímeros de bloqueio tendo ambos blocos ou segmentoshidrofóbicos e hidrofilicos que adsorverão seletivamente efuncionalizarão a superfície do substrato. Tipicos taiscopolimeros de bloqueio são polietileno glicol -polipropileno (Pluronics) e policrilatos - poliestireno,poliacrilatos - polietileno, polibutadienos - poliestirenoe outros que possam também conter funcionalidades amino oucarboxilicas.

Por definição, o ligante antibacterial -L-S-S-(componente de cisteina) desta invenção é semprecovalentemente ligado a um substrato Ri.

Contudo, desde que a definição de Ri inclui compostosorgânicos e polimericos, Ri também cobrirá polímeros quesubseqüentemente são capazes de se ligarem a um substratosólido por ligação covalente ou adsorção.

As opções para ligação covalente do agenteantibacterial desta invenção em um substrato sólido sãoenfatizadas pela definição de Rlf compreendendo aquelafixação do agente antimicrobial a um substrato sólido poradsorção. Neste caso, Ri é um substrato solúvel,exemplificado por, por exemplo, polímeros ionizáveissimilares a polietileno imina ou ácido poliacrilico oucopolimeros de bloco com blocos hidrofóbico/hidrofilicosimilares a polietileno glicol-polipropileno glicol oupoliacrilatos em copolimeros de bloco com poliestireno,polietileno e outros. 0 componente de cisteina écovalentemente ligado a um substrato solúvel que, em umaetapa adicional, é imobilizado em um substrato sólidoconforme descrito aqui.Desse modo, as modificações superficiais, bem como oacoplamento químico subseqüente ou adsorção, para fixar osagentes antibacteriais, podem ser realizados por muitasrotas diferentes. Em adição, os substratos podem sermateriais orgânico ou inorgânico compreendendo polímerossintético ou natural, bem como metais e minerais. Portanto,os métodos, reações químicas, e substratos, que estãopresentes aqui e nos exemplos abaixo, são somentedescritivos e não limitativos, para obtenção de agentesantibacteriais e superfícies cobertas pela invenção.

A concentração superficial do agente da invenção, talcomo L-cisteina, está no intervalo de IO"11 a 10~4 mole/cm2,e preferivelmente de 10~9 a 10~5 mole/cm2.

De modo a obter-se inibição de microorganismos clinicaou tecnicamente importantes, uma inibição de 100 vezes épreferivelmente alcançada de acordo com a invenção comrelação a bactéria viável aderente que pode ser liberadacom o ensaio, começando com uma grande exposição (titulo de400 000 cfu/ml na cultura de partida) . Isto podeparcialmente ser dependente do organismo especifico e dograu/titulo de exposição. As condições testadas excedemvastamente o que pode ser esperado na situação clinicaatual.

Exemplos de microorganismos, para qual a invenção podeser usada para impedir crescimento e/ou proliferação, sãobactérias anaeróbicas e aeróbicas que envolvem ambasbactérias Gram-positiva diferentes escolhidas a partir de,mas não limitadas a, espécies diferentes de Staphylococci,tais como S. aureus, S. epidermis e outro staphylococcicoagulase-negativo, S . saphrophyticus, sp. Enterococcus,Nesseriae (Meningococci, Gonococci) , Streptococci

(Viridans, grupo B e D S hemolitico e não-hemolitico, S.pneumoniae), Chlostridia (perfringens, botulinum), Bacillusmegaterium, bem como espécies Gram-negativa diferentesescolhidas a partir de, mas não limitadas a, sp.Enterobacter diferentes, Escherichia coli, sp. Klebsiella,Proteus, Campylobacter, Yersinia, Shigella, Salmonella,Hemophilus (gripe), Bacteriodes (fragilis, bivius),Pseudomonas (aeruginosa, cepacia), Legionella

(pneumophilia). Também incluídas estão espécies micopiasmadiferentes e espécies cândida e fungos diferentes. Exemplospreferidos de bactérias são bactéria Gram-positivaStaphylococcus aureus, a bactéria Gram-negativa Escherichiacoli, ou a bactéria Gram-positiva Bacillus megaterium.

A invenção pode ser usada para impedir ou inibircrescimento de microorganismos em superfícies de aplicaçõesdiferentes que podem causar um problema devido acolonização ou infecção. Tem sido mostrado aqui ser efetivocontra ambas bactérias Gram positiva e Gram negativa (abactéria Gram negativa Escherichia coli, ou a bactéria Grampositiva Staphylococcus aureus e Bacillus megaterium).Vários microorganismos diferentes foram descritos emrelação a colonização e infecção de catéter no setor decuidado de saúde e ambiente hospitalar. Estesmicroorganismos incluem, mas não estão limitados a,bactérias Gram positiva e Gram negativa listadas abaixo.24/53Também fungos diferentes são um problema freqüente,especialmente em pacientes imuno-comprometidos (quesuportam transplantes, ou, de outro modo, terapiaimunosupressiva, etc) . A invenção pode ser utilizada ondeinfecção, colonização e formação de biofilme emdispositivos artificiais (catéteres, tubos detraquiostomia, etc) podem ser um problema no cuidado dasaúde. Exemplos de microorganismos conhecidos ou descritospara serem suporte de cateter, e contra quais a invençãopode ser usada, são (mas não estão limitados a) : sp.

Staphylococci (tais como S. aureus, S. epidermides e outroStaphylococci coaguIase-negativa similar a S.saprophyticus); sp. Streptococci (viridans, grupo B e Dhemolitico e não-hemolitico, S. pneumoniae; sp.Enterococcus, S. facealis; Chlostridia (perfringens,botulinum); Sp. Enterobacter diferentes, similares aEscherichia coli, sp. Klebsiella, (pneumonia) , Enterobactercloace, aerogenes, Proteus, (mirabilis) , Campylobacter,Yersinia, Shigella, Salmonella, Hemophilus (gripe),Neisseriae (meningococcus e gonococcus), Bacteriodes (Sp.Bacteróides e fusobacterium), Pseudomonas (aeruginosa,cepacia), Legionella (pneumophilia), Serratia marcenens,sp. Acinetobacter, Morganella morganii, Stenotrophomonas,sp. Citrobacter, sp. Corynebacterium, Burkholder Cepafia,sp. Acinetobacter; Espécies Micoplasma diferentes (M. aviane outras); e também fungos tais como sp.cândida, C.tropicales, C. parapsilosis, Cryptococcus neoformans,Arpergillus fumigatus, Tricosporun, Blastoschizomyces,Stenotrophomonas maltophilia, Malassezia, Bukholderiacepafia, aspergillus.

Em muitas aplicações da presente invenção, o substratoé uma parte de um dispositivo, um aparelho e/ou umasuperfície escolhida a partir de (a) dispositivos médicos,tais como dispositivos médicos extra corpóreos, que sãoaplicáveis no exterior do corpo humano ou animal, oudispositivos médicos intracorpóreos, que são aplicáveis nointerior do corpo humano ou animal, (b) dispositivos demercearia, e (c) outros dispositivos. Os exemplos deaplicações listados abaixo são somente para demonstrar opotencial da invenção, sem, de qualquer modo, limitá-la.

Os dispositivos médicos (a) compreendem aplicaçõesescolhidas a partir de:

- pele artificial ou cobertura para ferimentos porqueimadura;

- diálise (tubos a partir de e para o dispositivo dediálise);

- drenagem de orelha (drenagem a partir de umacavidade, ferimento ou abscesso, ou dentro do interior daorelha);

- implantes de orelha (implantes dentro do interior daorelha);

- dispositivo de auxilio de audição (dispositivo deorelha interiormente colocado);

- tubos de máquina de coração e pulmão (tubos a partirde e para o dispositivo de máquina de coração e pulmão);- drenagem hidrocéfala (drenagem a partir da região docérebro/ventriculos);

- seringa (seringas disponiveis);

- estomia(dispositivos de estomia);

- materiais de sutura (dispositivos de sutura);

- cuidado de ferimento (dispositivos de cuidado deferimento, tais como emplastros);

cateteres (dispositivos de cateter disponiveis epermanentes, por exemplo, cateteres venosos centrais (CVC),cateteres venosos periféricos (PVC), cateteres centraisperifericamente inseridos, cateteres urinarios, e cateteresperitoneais);

- produtos dentais (produtos implantados na região daboca);

- implantes no corpo (ossos, pró-paradontite (produtosimplantados na região da boca));

- bomba de insulina (tubos a partir de e para da bombade insulina);

diretrizes de nervo (dispositivo de guia paranervos);

marca-passo (marca-passo e seus dispositivoscircundantes);

drenagem pós-operatória (dispositivos de drenagemsubseqüentes a cirurgia);

- drenagem de regiões e/ou órgãos e cavidades dentrodo corpo humano (abscesso, nefrostomia e similar);

- stentes intracorpóreos/intraluminal (stents usadospara manter lúmen diferente aberto, por exemplo, no sistemavascular e vasos, em órgãos e tecido, no sistemaintestinal, dutos de bile, etc);

tubo ou equipamento usado para administraçãoparentera1 de líquidos, soluções, infusões, distribuição dedroga.

Os dispositivos de mercearia (b) compreendemaplicações escolhidas a partir de:

superfícies de contato para alimento fresco, ousubstratos, ou dispositivos, usados no processamento dealimento (superfícies que podem estar em contato com fontesbacteriais);

- acondicionamentos de droga (para manter a aberturalivre de bactérias) (acondicionamento para drogassensíveis);

- dispositivos de ordenha (dispositivos submetidos afontes bacteriais durante operações de ordenha);

dispositivos de irrigadores de aspersão(dispositivos de irrigador de aspersão e outrosdispositivos de transporte de água que podem sercolonizados por microorganismos, tais como bocal emmercearia);

cilindro de aço dentro da indústria de pesca(cilindros usados na indústria da pesca de modo a aumentara produção de produtos de peixe).

Os dispositivos mistos (c) compreendem aplicaçõesescolhidas a partir de:

- lentes de contato (lentes de contato ordinárias);

- lentes intraoculares;produtos de acondicionamento de cosmético(acondicionamentos para produtos cosméticos diferentes);

- tanques de água (tanques de água que contém água detorneira água recirculante);

tubos de água (tubos que transportam água detorneira ou água recirculante);

- condicionamento de ar, dispositivos de arrefecimentode ar e água;

- outros dispositivos para armazenamento de produtosou materiais onde crescimento bacterial nas superfieies domaterial de armazenamento é indesejado.

Em todas estas aplicações, o agente antimicrobial dainvenção é acoplado a uma superfície do dispositivo,conforme discutido acima, de modo a conferir o efeitoantimicrobial.

Em uma concretização preferida, o agente antimicrobialé acoplado a uma superfície de cateter, proporcionando,desse modo, um cateter sendo capaz de impedir crescimentoe/ou proliferação de microorganismos. Normalmente, asuperfície interna e/ou externa do cateter é revestida como agente da invenção. 0 processo de revestimento dasuperfície do cateter pode adicionalmente ser incorporadodurante ou após a extrusão do cateter, ou como uma etapaseparada, antes ou após a montagem do cateter especifico.Para amostras de cateter tratadas, o efeito microbial temsido mostrado para permanecer após vários anos dearmazenamento sob condições ambientes. Os cateteres quepodem ser usados na invenção são providos a partir defornecedores comerciais de canais de cateter, por exemplo,Rehau, Habia, Vygon, Teknofluor, Optinova, Baxter, etc.

Em ainda outro aspecto, a invenção se refere a um kitde partes para uso no tratamento de uma superfície com umagente antimicrobial, compreendendo, em compartimentosseparados, (a) um precursor para o agente antimicrobial dareivindicação 1, o precursor tendo a fórmula:

Z-L-S-S- (componente de cisteina)no qual L, me componente de cisteina é conforme definidoacima, e Z é uma funcionalidade de ligante conformedefinida acima que pode reagir com um composto químico Y,conforme definido acima, para dar o composto químico X,conforme definido acima, e (b) reagentes necessários demodo a ligar covalentemente o precursor a uma superfície,no qual o kit compreende adicionalmente instruções para usodo kit. Os regentes necessários podem compreender quaisquerreagentes que são necessários para realizar uma reação deacoplamento de Y e Z para obter X (conforme esboçadoacima), e dependeria da identidade especifica de Y e Z. 0técnico no assunto conheceria quais reagentes que seriamnecessários em cada situação.

Desse modo, um kit é provido, que pode ser usado paratratar qualquer superfície desejada com o agenteantimicrobial da invenção, de modo a dar as propriedadesantimicrobiais da superfície.

A invenção será agora adicionalmente ilustrada pormeio de exemplos. Estes exemplos são de propostailustrativa somente, e não devem estar relacionados comolimitando o escopo da invenção de qualquer modo.

Seção de Exemplo

Métodos

Análise de Inibidores de crescimento bacterial emsuperfícies modificadas

Cepas de Bactérias

A seguinte análise foi realizada com três (3) cepas diferentes de bactérias, mas as aplicações não estãolimitadas a estas: Um isolado clinico (de um paciente comsepsia) de bactéria Gram positiva Staphylococcus aureus,(um isolado clinico B5381), a bactéria Gram positivaBacillus megaterium (cepa Bmll), a bactéria Gram negativaEscherichia coli (cepa D21). Esta seleção de bactériascompreende ambas bactérias Gram positiva e Gram negativa,incluindo bactérias que são de problemas clinicamentesignificantes.

Preparação de cultura bacterial para determinar titulo

A seguinte descrição objetiva, mas não é limitada a,determinar um titulo de cerca de 400 000 - 800 000 cfu/mlde culturas bacteriais diferentes, usadas como fonte deexposição para avaliar a inibição de crescimento bacterialem superfícies funcionais. 0 meio LB (caldo de Luria Bertani) foi inoculado com cepa bacterial especifica, masnão limitado a este meio. A cepa selecionada foi preparadaem lâmina em uma placa agar de meio selecionado um diaantes, e permitida crescer durante a noite a 37°C. Váriascolônias foram raspadas da placa e usadas para inocular omeio que subseqüentemente foi permitido se desenvolver auma densidade ótica de 0,4. A cultura foi diluida com omeio LB idêntico a um titulo inicial de aproximadamente 4 00000 - 800 000 cfu/ml. O número de bactérias foi determinadopor diluições em série da preparação de lâmina, e contando-se as colônias nas diluições apropriadas. (Um númeroapropriado de bactérias para se contar em uma placa é entre30-300 como uma referência geral).

Pré-tratamento de discos

Os discos foram pré-tratados em casos selecionados porincubação em:

a) Salina tamponada com fosfato (PBS);

b) Soro de Bezerro Fetal (FCS);

c) Meio LB Estéril;

durante períodos de tempo diferentes: 1 h, 1,5 h, 2,5 h,uma noite, 2 dias ou 7 dias, conforme citado nos exemplosabaixo. As incubações foram feitas por rotação (2 00 rpm) a37°C em tubos eppendorf estéreis.

Exposição de superfícies funcionais a cepas bacteriaisdiferentes

Substratos modificados de superfície, na forma dediscos circulares, foram colocados em tubos eppendorfestéreis. Cada disco (5 ou 9 mm de diâmetro) foi colocadoem um volume especificado (500 ou 1000 \i, respectivamente)da cultura inicial. Estes tubos são denotados "tubo 1". Osdiscos nas culturas iniciais foram incubados durante 2,5horas a 37°C por rotação (200 rpm).Um volume idêntico da cultura inicial foi incubado emparalelo como uma amostra de referência (denotada "culturade pós-incubação) . Esta foi usada para determinar a quaisniveis o titulo da cultura de partida (a cultura que osdiscos eram para serem incubados) se desenvolveria, quandonão exposto aos discos * As amostras de controle (mesmosdiscos conforme usados para comparar o nivel de inibição)foram incubadas com meio LB estéril, e subseqüentemente,manuseadas do mesmo modo, como um controle negativo paraexcluir contaminação.

Ensaio para análise de aderência de bactérias viáveisem superfícies funcionais

Subseqüente à incubação (no caso descritopresentemente: 2,5 horas), o disco foi removido a partir decada tubo, usando-se um par estéril de pinças. A cultura naqual o disco foi incubado foi transferida em paralelo paraum tubo eppendorf estéril separado, e seu titulo foideterminado conforme descrito. As pinças e o disco forammergulhados em um tubo com cerca de 4 ml de solução de PBSestéril, e o disco foi, em seguida, colocado em um segundotubo com PBS, denotado "tubo 2". O disco foi, em seguida,removido com um par estéril de pinças a partir do tubo 2.Este procedimento foi realizado de modo a eliminar gotas desuspensão bacterial em excesso resultante a partir dacultura bacterial que o disco foi incubado, e,conseqüentemente, para remover quaisquer bactérias que nãoestavam diretamente aderentes às superfícies do disco. 0disco lavado foi colocado em um tubo eppendorf - denotado"tubo 3" - com 1 ml de PBS, e foi sacudido abruptamente emum rotor de vórtice durante 10 minutos. As bactériasviáveis aderentes - que não foram removidas nas etapasanteriores - são agora destacadas a partir da superfície nasolução de PBS.

Esta solução é denotada "lavagem 1", e seu titulo foideterminado.

O disco é, em seguida, removido com um par estéril depinças, via mergulho em um tubo com cerca de 4 ml de PBSestéril, e, em seguida, colocado em outro tubo com cerca de2 ml de PBS estéril, do mesmo modo conforme descrito acima.O disco é removido imediatamente com um par esterilizado depinças, e transferido para um novo tubo eppendorf, a qual éadicionado 1 ml de PBS estéril, e o procedimento de vórticeé repetido.

A solução de PBS é transferida para um tubo eppendorfestéril - denotado "lavagem 2" - e seu titulo foideterminado.

O disco foi brevemente colocado em um rascador Kleenexestéril, para remover excesso de gotas de lavagem 2, e,subseqüentemente, colocado em uma placa agar estéril demeio LB, que foi incubada durante a noite a 37 °C. Oaparecimento de colônias bacteriais, o crescimentobactéria1 envolvendo as bordas do disco, foi monitorado.

Determinação de titulo bacterial nas culturasdiferentes e soluções de lavagemAs diluições foram realizadas no meio LB, e asdiluições selecionadas (ver abaixo), onde as colônias foramanalisadas e contadas.

Um volume de 100 jal de diluições seriais das seguintessuspensões foi difundido:

1. Cultura inicial antes da diluição para cultura deincubação (OD ca 0,4):

2. A cultura de incubação inicial (estimada a 400 000- 800 000 cfu/ml); 1:100, 1:1000 e 1:10000.

3. Culturas de pós-incubação (ambas referência eincubada com discos); 1:1000, 1:10000, 1:100000.

4. Controle negativo (meio sem cultura bacterialinicial).

5. Lavagem 1:1:10 e 1:100.

6. Lavagem 2: 1:1.

Exemplo 1

Policaprolactona (PCL; UC 787) na forma de amostrasplanas de 1 mm de espessura com um diâmetro de 5 mm, forampré-irradiadas com um gerador de pulso (6,5MeV/7,5Hz/4pseg/60mA) a uma dose de 1 Mrad. As amostraspodem, em seguida, serem enxertadas diretamente conformedescrito abaixo, ou armazenadas em nitrogênio liquido antesdo enxerto.

Subseqüente à irradiação, alternativamente apósarmazenamento intermitente em nitrogênio liquido, asamostras de PCL são introduzidas em uma solução aquosa deácido acrílico (20 peso%) e 0,1 peso% de sal de Mohr,aquecidas a 30 °C. A solução foi livrada de oxigênio porpurga de gás inerte que também age como agitação. Após 2minutos na solução de ácido acrílico, as amostras foramlavadas com grandes quantidade de água de torneira de cercade 30 °C, e são adicionalmente armazenadas em águadeionizada antes de se suceder modificação superficial. Umnúmero de amostras, tendo uma área total de 5 cm2 eamostras de referência não enxertadas foram depositadasdurante 6 horas com uma quantidade especificada de NaOH0,01M à temperatura ambiente. Após titulaçãopotenciométrica, uma concentração superficial de (1,8±0,2)x 10"5 moles de COOH/cm2 foi determinada.

Exemplo 2

Soluções separadas de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid (EDC) e N-hidroxi-succinimida (NHS) (Sigma)em água deionizada foram misturadas a 0°C, estabelecendouma solução com concentração de 0,3 M de EDC e 0,075 M deNHS, respectivamente.

Amostras de PLC enxertadas de ácido acrilico, deacordo com o exemplo 1, foram lavadas em tampão HEPES (pH7,4), e imersas em 20 ml da solução de EDC/NHS. Após 10minutos de agitação por sacudimento, as amostras foramenxaguadas em água deionizada, e foram adicionadas com umasolução de 2-(2-piridinilditio)-etilamina-hidroklorid(PEDA) 0,04M em um tampão borat 0,1M (pH 8,5). Após 15minutos de agitação, as amostras foram enxaguadas em águadeionizada, e adicionadas com uma solução de L-cisteina0,5M (Sigma) em tampão format 0,1M (pH 4,3) com NaCl 1M.Após lavagem com NaCl 1M e água deionizada, as amostrasforam deixadas secar e mantidas em um excitador. A análisesuperficial com ESCA (XPS) mediu um valor de 6,8 átomo% denitrogênio.

Exemplo 3

Amostras de polietileno de baixa densidade (LDPE)foram pré-irradiadas com uma dose de 2,5 Mrad, de acordocom o exemplo 1. Subseqüente ao enxerto com ácido acrílicoa 50°C durante 4 minutos, e todas outras condiçõesidênticas como no exemplo 1, um valor de carboxilação de(2,7+0,2) x IO"5 moles de COOH/cm2, foi detectado. Reaçõesde acoplamento de PDEA e L-cisteina ao LDPE enxertado comácido acrilico foram realizadas do mesmo modo como para PCLno Exemplo 2, e produziram um valor de nitrogênio de 6,0atômico%, de acordo com a análise superficial com ESCA.

Exemplo 4

Cateteres de poliuretano (Vygon®), tendo um diâmetrointerno de 2 mm, foram cortados em comprimentos de 20 mm, epré-irradiados, de acordo com o exemplo 1, a uma dose de 1Mrad. O enxerto foi realizado de acordo com o exemplo 2.

Exemplo 5

O acoplamento em uma superfície funcional de aminaserá similar ao procedimento no exemplo 2. A diferença éque o grupo amina no interior do PDEA é substituído com umgrupo carboxilico para obter-se 2- (2-piridil ditio)-etilácido carboxilico (PDEC). Quando se reage este composto comos grupos amina em uma superfície, o grupo carboxilico éativado separadamente com EDC/NHS antes da reação com asuperfície de amina. 0 acoplamento subseqüente com L-cisteina será, em seguida, produzido como no exemplo 2.

Exemplo 6

Superfícies de referência foram produzidas de acordocom os exemplos 1 e 2 com a distinção que L-cisteina foiacoplada diretamente à superfície de PCL carboxilatada apósativação com EDC/NHS, via o grupo amina dentro da cisteina,isto é, a etapa de acoplamento com PDEA foi excluída,eliminando, desse modo, a ligação de disulfito obtidaquando do acoplamento com PDEA, como no Exemplo 2.

Exemplo 7

Superfícies de referência foram produzidas de acordocom os exemplos 1 a 3, diferindo em que acetilcisteina, aoinvés de L-cisteina, foi acoplada de acordo com oprocedimento descrito no exemplo 2.

Exemplo 8

Superfícies de referência foram produzidas de acordocom os exemplos 1 a 3, diferindo em que homocisteina, aoinvés de L-cisteina, foi acoplada de acordo com oprocedimento descrito no exemplo 2.Exemplo 9

Inibição de crescimento bacterial em uma cultura dabactéria Gram negativa Escherichia coli (cepa D21) foitestada com discos de PLC em 500 \i de meio de cultura, paradiscos acoplados com:

a) L-cisteina acoplada a PLC enxertada com ácidoacrílico como nos Exemplos 1 e 2 (designada "Cis-discos") ;

b) PLC enxertada com ácido acrílico como no Exemplo 1.

O titulo inicial da cultura foi 513 000 cfu/ml e otitulo de pós-incubação da cultura (referência, se, disco)foi 28 000 000 cfu/ml.

A cultura incubada com Cis-discos mostrou inibição de125 vezes de crescimento no meio de cultura duranteincubação, comparada à cultura de pós-incubação (com nenhumdisco presente). Nenhuma incubação foi detectada na culturaincubada com discos de ácido acrilico, comparada a culturade pós-incubação (com nenhum disco presente).

O teste de bactérias aderentes, Cis-discos, mostrouuma inibição de 100 vezes de número de bactérias viáveis,comparado aos discos com ácido acrilico somente, analisandoa aderência de bactérias viáveis para discos.

O crescimento bacterial envolvendo as bordas do disco,colocado em LB agar, foi observado para discos com ácidoacrilico somente, e não para Cis-discos.

Exemplo 10Inibição de crescimento bacterial na cultura deStaphylococcus aureus (B5381, um isolado clinico) foitestada com discos de PE em 1000 ]il de cultura bacterial.

As superfícies funcionais nos discos foram:

a) L-cisteina acoplada a discos enxertados com ácidoacrilico de acordo com o Exemplo 3 (pré-lavados/pré-incubados por 1,5 horas em PBS) ;

b) L-cisteina acoplada a discos enxertados com ácidoacrilico de acordo com o Exemplo 3 (pré-lavados/pré-incubados por 2 dias em PBS);

c) L-cisteina acoplada a discos enxertados com ácidoacrilico de acordo com o Exemplo 3 (pré-lavados/pré-incubados por 7 dias em PBS);

d) Discos enxertados com ácido acrilico de acordo como Exemplo 3.

O titulo inicial de cultura de incubação foi 400 000cfu/ml, e o titulo de pós-incubação foi 10 000 000 cfu/ml.

A cultura incubada com Cis-discos pré-lavados por 1,5horas exibiu inibição de 25 vezes de crescimento bacterial;a cultura incubada com Cis-discos pré-lavados por 7 diasrevelou inibição de 17 vezes de crescimento bacterial.

Cis-discos pré-lavados por 2 dias e 7 dias semostraram aproximadamente 50 vezes de bactérias viáveis doque discos de ácido acrilico quando testados para aderênciade bactérias.

Para resumir, a inibição devido ao cis-acoplamento éconsiderada como permanente sobre pelo menos 7 dias.Exemplo 11

Inibição de crescimento bactéria1 em uma cultura dabactéria Gram positiva Staphylococcus aureus (B5381, umisolado clinico) foi testada com discos de polietileno (PE)em 1000 pl de cultura de meio LB. As superfícies funcionaisforam:

a) L-cisteina acoplada a discos enxertados com ácidoacrilico de acordo com o Exemplo 3 (designados "Cis-discos");

b) Discos enxertados com ácido acrilico de acordo como Exemplo 3 (designados discos acrílicos);

c) Discos irradiados com feixe de elétrons somente, deacordo com o Exemplo 3 (designados "discos EB").

Em paralelo, dois experimentos de controle com L-cisteina dissolvida na cultura foram analisados: 50 pg/ml e5 ug/ml.

A cultura inicial foi aj ustada 10 vezes mais alta(excedendo 4 milhões cfu/ml) do que descrita noprocedimento de ensaio, que permite avaliação do efeito deadesão de bactérias viáveis a uma exposição extrema abactérias.

A cultura de Cis-discos demonstrou 8 vezes menoscrescimento comparado a cultura de pós-incubação. Os discosde EB não exibiram redução significante comparado a culturade pós-incubação.

Nenhuma inibição foi vista para as culturas com L-cisteina dissolvida.Os Cis-discos mostraram 25 a 4 0 vezes menos bactériasaderentes viáveis, comparados aos discos de ácido acrilico,e 21 a 27 vezes, comparados aos discos de EB em análisepara aderência de bactérias.

O crescimento bacterial envolvendo as bordas do discofoi somente visto para discos de ácido acrilico e de EB.

O efeito de Cis-acoplamento de bactérias Staph. aureusviáveis nos discos é ainda evidente e significante, apesarque o sistema foi temperado.

Exemplo 12

Inibição de crescimento bacterial na cultura deEscherichia coli (cepa D21) foi examinada com discos de PEem 1000 pl de cultura de meio LB bacterial. As superfíciestestadas foram:

a) L-cisteina acoplada a discos enxertados com ácidoacrilico de acordo com o Exemplo 3 (designados "Cis-discos");

b) N-acetil-cisteina acoplada a discos enxertados comácido acrilico de acordo com os Exemplos 3 e 7 (designados"Acetil-Cis-discos");

c) Discos enxertados com ácido acrilico de acordo como Exemplo 3 denotados Discos de "Ácido acrilico". Todos osdiscos foram pré-incubados em PBS toda noite.

O titulo inicial da cultura foi 1 000 000 cfu/ml, e otitulo de pós-incubação de cultura (sem disco) foi 50 000000 cfu/ml.Os eis-discos revelaram 4 5 vezes inibição decrescimento no meio de cultura, comparados a cultura depós-incubação (sem disco presente) durante a incubação. Osacetil-cis-discos mostraram 10 vezes inibição no meio decultura. Nenhuma exibição foi detectada na cultura comdisco de ácido acrílico presente.

Os cis-discos mostraram 70 vezes bactérias menosviáveis do que os discos de ácido acrilico, enquanto osdiscos de acetil cisteina mostraram 7 vezes bactérias menosviáveis do que os discos de ácido acrilico quandoinvestigados para aderência bacterial.

O crescimento bacterial que envolve as bordas do discofoi detectado ao redor de todos os discos de ácidoacrilico, parcialmente ao redor do Acetil-Cis-discos,enquanto que bactérias não foram observadas ao redor dosCis-discos.

Exemplo 13

Inibição de crescimento bacterial em uma cultura deEscherichia coli (cepa D21) foi testada com discos de PE em1000 yil de cultura bacterial, para discos acoplados com

a) L-cisteina acoplada a discos enxertados com ácidoacrilico de acordo com o Exemplo 3 (designados "Cis-discos" ) ;

b) L-cisteina acoplada a discos de PE enxertados comácido acrilico de acordo com os Exemplos 3 e 6 (designados"Cis-discos acoplados a amino");c) Discos enxertados com ácido acrilico de acordo como Exemplo 3 (designados "discos de ácido acrilico") .

Todos os discos foram pré-incubados em meio LB estériltoda noite.

0 titulo inicial da cultura foi 680 000 cfu/ml, e otitulo de pós-incubação de cultura (sem disco) foi 32 000000 cfu/ml.

Os Cis-discos revelaram 26 vezes inibição decrescimento bacterial no meio de cultura, comparados acultura de pós-incubação (sem disco presente) durante aincubação. Nem os Cis-discos acoplados a amino, nem o discode ácido acrilico mostraram inibição no meio de cultura.

Os Cis-discos mostraram 100 a 140 vezes bactériasaderentes menos viáveis do que os discos de ácido acrilico,enquanto os Dis-discos acoplados a amino não exibiramredução no número de bactérias aderentes viáveis,comparados aos discos de ácido acrilico, conforme testadospara aderência de bactéria.

0 crescimento bacterial significante que envolve asbordas do disco, analisado nas placas de LB agar após osprocedimentos de lavagem, foi detectado para todos osdiscos acoplados a amino e discos de ácido acrilico, masnão para Cis-discos.

Exemplo 14

Inibição de crescimento bacterial em uma cultura deStaphylococcus aureus (B5381, um isolado clinico) foitestada com discos de PE em 1000 pl de cultura bacterial demeio LB com concentrações bacteriais extremas.

As superfieies funcionais nos discos foram:

a) L-cisteina acoplada a discos enxertados com ácidoacrilico de acordo com o Exemplo 3 (designados "Cis-discos");

b) Homocisteina acoplada a discos enxertados com ácidoacrilico de acordo com o Exemplo 3 (designados "discos deHomocisteina");

c) Discos enxertados com ácido acrilico de acordo como Exemplo 3 (designados "discos de ácido acrilico") .

O titulo inicial da cultura foi 4 000 000 cfu/ml, e otitulo de pós-incubação de cultura (sem disco) foi 80 000000 cfu/ml.

Os Cis-discos revelaram 13 vezes inibição decrescimento no meio de cultura, comparados a cultura depós-incubação sem disco presente. Os discos de Homocisteinamostraram 20 vezes inibição no meio de cultura.

Os cis-discos mostraram aproximadamente 4 a 10 vezesbactérias menos viáveis, comparados aos discos de ácidoacrilico, e os discos de Homocisteina revelaram 2 a 4 vezescomparados aos discos de ácido acrilico, quando testadospara aderência de bactérias viáveis sob condições deexposição extremas. Um efeito detectável foi obtido apesardas condições temperadas para ambos os discos de cisteina ehomocisteina.

Exemplo 15A duração de longo prazo e estabilidade do efeitoantibacterial foi testada pelo uso de cateteres modificadosde superficie armazenados por mais de 3 anos.

Inibição de crescimento bacterial na cultura deEscherichia coli D21 foi testada com cateteres depoliuretano Vygon (Exemplo 4) em 1000 jil de culturabacterial de meio LB. Estas amostras de cateter modificadasde cisteina foram armazenadas por 3 anos sob condiçõesambientes j untas com superfícies de referência (EBirradiado e enxertado de ácido acrilico de acordo com oExemplo 4). Antes do experimento, estes cateteres (20 mm decomprimento) foram cortados na metade, gerando peças de 10mm de comprimento. As superfícies funcionais nos discosforam:

d) L-cisteina acoplada a cateteres Vygon enxertadoscom ácido acrilico de acordo com o Exemplo 4, denotadosCis-catéteres (pré-lavados/pré-incubados por 2 horas emPSB) ;

e) Cateteres Vygon irradiados com EB (parte do exemplo1 e exemplo 4) (pré-lavados/pré-incubados por 2 horas em PSB) .

O titulo inicial da cultura de incubação foi 264 000cfu/ml, e o titulo de pós-incubação foi 52 000 000 cfu/ml,quando nenhuma amostra de cateter estava presente.

A cultura incubada com Cis-cateteres (pré-lavados por2 horas) exibiu 34 vezes inibição de crescimento bacterial,comparada com pós-cultura sem disco.A cultura incubada com Cateteres Vygon irradiados deEB (pré-lavados por 2 horas) (materiais de controle) nãoexibiu inibição, comparada a cultura de pós-incubação semcateter.

Os Cis-cateteres mostraram 130 vezes bactériasviáveis, comparados aos cateteres Vygon irradiadoquando testados para aderência de bactérias.

Para resumir, o armazenamento do produto paraprolongados não afeta criticamente as propriantibacteriais da modificação superficial.

Exemplo 16

Inibição de crescimento bacterial em uma cultura deStaphylococcus aureus (B5381, um isolado clinico) foitestada com superficie de cateter de poliuretano, em 8 00 jalde cultura bacterial de meio LB. Discos foram pré-lavadospor 1,5 horas em PSB. Estes cateteres foram cortados empeças de 5 x 4 mm, e pré-irradiados de acordo com o exemplo1, a uma dose de 1 Mrad. O enxerto foi realizado de acordocom o exemplo 2.

As superficies funcionais nos discos foram:a) Amostras enxertadas de PDEA acoplado a ácidoacrílico foram produzidas essencialmente seguindo oprocedimento descrito nos Exemplos 1 e 2 com as seguintesmodificações: 5 minutos de tempo de enxerto, e 15 minutosde lavagem de banho ultra-sônico subseqüente ao enxerto.b) As amostras de PDEA obtidas em (a) foram usadaspara acoplamento de L-cisteina seguindo o procedimentodescrito no Exemplo 2.

O efeito antibacterial foi comparado para as amostrasde (a) e (b) para investigar uma possivel influênciasignificante no componente de PDEA antes do acoplamento decisteina.

0 titulo inicial da cultura foi 800 000 cfu/ml, e otitulo de pós-incubação de cultura (sem disco) foi 19 000000 cfu/ml. Nenhuma diferença no titulo de pós-incubaçãofoi observada entre os tipos de amostra (a) e (b) . Asamostras de Cis-ácido acrílico (b) mostraramaproximadamente 35 vezes bactérias aderentes menos viáveis,comparadas às amostras de PDEA acoplada de ácido acrílico(a) quando testada para aderência de bactérias viáveis.Este experimento verifica que o cis-componente é essencialpara o efeito antibacterial.

Exemplo 17

Inibição de crescimento bacterial em uma cultura deStaphylococcus aureus (B5381) foi testada com discos depoliuretano (PUR) em 500 pl de cultura bacterial de meioLB. Estas amostras foram cortadas em discos quadrados de 5x 5 cm.

As superfícies funcionais nos discos foram:(a) Amostras de PUR foram radiadas com EB a 1 Mrad eenxertadas por 3 minutos a 35 °C com ácido acrílico, eextensivamente lavadas em água aquecida e água MilliQ,incluindo um banho de lavagem ultra-sônico por 15 minutos,seguido por acoplamento com PDEA, e finalmente L-cisteina,de acordo com os procedimentos descritos nos exemplos 1 e2. Estas amostras foram denotadas "PDEA-Cis".

(b) Uma superficie foi produzida conforme se segue:PDEA com quantidade equimolar de trietilamina foi reagidocom uma quantidade equimolar de acriloilcloreto em umsolvente seco. O produto 2- (2-piridinilditio)-etilacrilamida, aqui denotado "PDEAm", foi purificado porprecipitação em dietiléter, que foi repetido até que umfiltrado claro incolor fosse obtido. 0 produto levementeamarelo foi secado sob vácuo. Uma solução contendo 2,2 mmol(0,5 g) de PDEA e 16,1 mmol (1 g) de ácido acrílico em águaMilliQ foi desaerada por purga com Argônio por 10 minutos eaquecida a 35 °C. As amostras de PUR irradiadas de EB (a)foram tomadas a partir do armazenamento de nitrogênioliquido, e imersas na solução onde a corrente de Argôniotambém agiu como um dispositivo de agitação. A reação deenxerto foi interrompida após 8 minutos, e as amostrasforam lavadas em água de torneira quente e água MilliQ,incluindo um banho de lavagem ultra-sônico por 15 minutos.L-cisteina foi acoplada de acordo com os procedimentosdescritos nos exemplos 1 e 2. As amostras foram secadas sobvácuo. Estas amostras são denotadas "PDEAm-Cis".

Uma comparação foi feita entre PDEA-Cis (a) e PDEAm-Cis (b) . O titulo inicial da cultura foi 500 000 cfu/ml, eo titulo de pós-incubação de cultura (sem disco) foi 20 000000 cfu/ml.O PDEA-Cis (a) mostrou 45 vezes inibição de titilopós-incubação, comparada a cultura sem disco.

O PDEAm-Cis (b) mostrou 50 vezes inibição de titilopós-incubação, comparada a cultura sem disco.

O PDEA-Cis (a) e o PDEAm-Cis (b) mostraram inibiçãoigual de unidades de formação de colônia de bactériasviáveis quando testados para aderência de bactérias viáveisusando-se o método descrito acima. Nenhum crescimentobacterial envolvendo as bordas do disco, conforme analisadoem placas LB agar após procedimentos de lavagem, foidetectado para qualquer das amostras.

Exemplo 18

Inibição de crescimento bacterial em uma cultura dabactéria Gram positiva Bacillus megaterium (cepa Bm 11) foianalisada com um disco de PCL em 500 pl de culturabacterial em meio LB. As superfícies funcionais foram:

a) L-cisteina acoplada a PCL enxertado de ácidoacrílico como nos Exemplos 1 e 2 (designada "Cis-cisteina");

b) PCL enxertado de ácido acrílico como no Exemplo 1.

O titulo inicial da cultura foi 2 92 000 cfu/ml, e otitulo de pós-incubação de cultura (sem disco) foi 9 850000 cfu/ml.

Para tubos com Cis-discos houveram 13,5 vezes inibiçãode crescimento bacterial na cultura incubada com o discodurante incubação, comparada à cultura de pós-incubação dereferência (sem disco presente). Os discos com somenteácido acrilico não revelaram inibição de crescimentobactéria1 na cultura comparados ao controle com nenhumdisco presente.

O teste de aderência de bactérias viáveis mostrou 10 a13 vezes bactérias menos viáveis nos Cis-discos comparadosaos discos de ácido acrilico.

O crescimento bacterial envolvendo as bordas de discofoi somente encontrado para discos acoplados com ácidoacrilico quando os discos foram ajustados nas placas de LBapós os procedimentos de lavagem, e incubados durante anoite.

Exemplo 19

A citotoxidade foi testada por incubação dos discosfuncionais diferentes em células mononucleares de sanguePeriféricas (PBMC) a partir de doadores de sanguesaudáveis.

As amostras testadas foram:

a) Cis-discos (Exemplo 2);

b) Discos de ácido acrilico (Exemplo 3);

c) Discos irradiados por Feixe de Elétrons (parte doExemplo 1) (denotados "EB discos");

d) Células de controle (incubadas sem qualquer discopresente).

As determinações foram feitas após 24, 48 e 69 horas,respectivamente.A quantidade de células mortas foram 4% a 7% após 18horas de incubação em PBMC para todos os tipos de disco econtrole, indicando nenhuma diferença significante entreCis-discos, discos de ácido acrílico, EB discos ou célulasde controle incubadas sem qualquer disco presente. Isto foivisto indiferente se os discos foram pré-lavados em PSB ou não.

As partes de células mortas eram 10% a 15% nos Cis-discos e discos de ácido acrílico após 4 8 horas deincubação. Não houve diferença notável no número de célulasmortas entre Cis-discos lavados, discos de ácido acrílico,EB discos, comparado às células de controle sem qualquerdisco presente (5-6%).

A proliferação de células T foi estudada porestimulação com mitogen phytohemaglutin (PHA) . As PBMC s apartir de doadores de sangue saudáveis foram isoladas, e ascélulas foram estimuladas com PHA (Sigma, St Louise, MO,USA) em triplicatas. As culturas foram pulsadas com 1 \iCi.metil-3H-timedina (Amersham, LIFE SCIENCE) em 2 dias pos-es timulação . As células foram recebidas em filtros,utilizando-se um coletador de placa (Harveter 996, Tomtec,Connecticut, USA) no dia subseqüente, de acordo com asinstruções do fabricante, e contadas em um contadorautomático (1450 MicroBeta Trilux, WALLAC, Suécia AB) . Osresultados foram expressos como contagens por minuto (cpm).Nenhuma diferença na proliferação de célula T foi vistaentre qualquer tipo de disco e controles.O teste seguinte foi realizado de modo a investigar sea capacidade de monócitos derivados das PMBC sediferenciarem em macrofagos foi negativamente afetada pelaexposição aos tipos diferentes de discos.

As PBMCs a partir dos doadores de sangue saudáveiscolocadas nas placas de Petri (Primaria, Falcon, BectonDicknson) a uma concentração de célula de 10-18xl06células/ml em meio Modificado Iscove com 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 yig/ml deestreptomicina (Gibco BRL, Grand Island, NY) , 10% de soroAB, e incubadas a 37 °C durante a noite. As células nãoaderentes foram removidas no dia seguinte. As culturasforam lavadas extensivamente, e as células enriguecidas demonócitos foram estimuladas pela adição de um allo-sobrenadante por 24 horas. O allo-sobrenadante foipreparado conforme segue: PBMCs de doadores de sanguediferentes foram misturados e incubados por 24 horas emmeio completo de Iscove. Em seguida, o sobrenadante foicoletado, clareado por centrifugação, e usado paraestimular culturas de monócito simples. Em 2 ou 3 dias depós-estimulação, as culturas foram lavadas com meio Iscovee, em seguida, culturadas em 60% de meio AIM-V, 30% de meiomodificado de Iscove e 10% de soro AB, com a adição de L-glutamina, penicilina e estreptomicina (meio 60/30completo) . O meio foi mudado para meio 60/30 completofresco todo 3-4 dias.

Nenhuma diferença significante foi vista entre ascélulas de controle ou células expostas aos tiposdiferentes de discos, isto é, culturas de macrofagos boas esaudáveis foram vistas em todas as placas de Petri.

Exemplo 20

A citotoxidade foi também analisada pela medição doefeito hematolitico dos tipos de disco diferentes pelacolocação do disco em agar de sangue, ou imediatamente notopo, ou inserindo-se os discos no agar do sangue.

As amostras testadas foram:

Cis-discos não lavados. (Exemplo 3);

Cis-discos pré-tratados com meio de LB. (Exemplo 3);

Cis-discos pré-tratados com soro de bezerro fetal (FCS). (Exemplo 3);

Cis-cateteres Vygo. (Exemplo 4).

0 diâmetro das zonas usadas foi medido após incubaçãoa 37°C durante a noite. Um controle positivo foi localizadono centro de cada placa de agar de sangue. Na inspeção, osdiscos foram removidos, e a área abaixo e ao redor dalocalização dos discos, foi analisada.

Nenhum lises pode ser detectado para nenhum dos tiposde disco analisados.

Uma cor amarela foi detectada de cerca de 4 a 5 mm apartir da borda dos discos para Cis-discos não-lavados.Para os discos pré-tratados, com ou meio de LB ou soro debezerro fetal (FCS), uma mudança muito fraca de cor naborda mais próxima do disco foi notada.

Em conclusão, os Cis-discos não tem efeito detoxicidade significante nas células sangüíneas humanas.

Claims (16)

1. - Agente antimicrobial, caracterizado pelo fato decompreender um substrato com um composto de cisteinacovalentemente ligado.

2. - Agente antimicrobial, de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o compostode cisteina é ligado através de uma ponte S-S, via umamolécula espaçadora, ao substrato; o espaçador compreendeuma cadeia de carbono, opcionalmente interrompida por um oumais heteroátomos, por exemplo, O, S, N, P e Si; a cadeia éopcionalmente substituída com um ou mais grupos alquil,preferivelmente grupos alquil inferior com 1-6 átomos decarbono, grupos hidroxil ou grupos alcóxi.

3. - Agente antimicrobial, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 ou 2, tendo a fórmula substrato-X-L-S-S-(componente de cisteina), caracterizado pelo fato de que- L é uma molécula espaçadora selecionada a partir dogrupo consistindo de (CH2) nu onde m é 1-20, pref erivelmente1-12, 1-8 ou 1-6; (CH2CH20) n (CH2) P, ou (CH (CH3) CH20) n (CH2) p,onde n é 1-1000, preferivelmente 1-100 ou 3-50, e p é 1-20,pref erivelmente 1-12, 1-10 ou 1-6; o segmento (CH2)P sendoligado à ponte de disulfito, e pode opcionalmente estarposicionado entre os segmentos (CH2CH20)n ou (CH (CH3) CH20) n;- X é um grupo de ligação a partir da reação deacoplamento entre o substrato e L;- o componente de cisteina é aqui referido como oresíduo de um composto de cisteina compreendendo cisteina,um análogo de cisteina, ou derivado de cisteina.

4. - Agente antimicrobial, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que osubstrato é insolúvel ou solúvel.

5. - Agente antimicrobial, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1-4, tendo a fórmula(1) R1-X-L-S-S-(componente de cisteina), caracterizado pelo fato de queR1 é o substrato, por exemplo, um composto orgânico,ou polímero, ou um substrato sólido;X é um grupo quimico obtido por uma reação deacoplamento quimico; L é (CH2)m ou (CH2CH20)n(CH2)p;m é 1-8, n é 1-100, e p é 1-10;onde o segmento (CH2) p quando ocorre junto com o(CH2CH20) n está posicionado entre o segmento (CH2) CH20) n e aligação de disulfito.

6.- Agente antimicrobial, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1-5, caracterizado pelo fato de que -L-S-S-(componente de cisteina) tem uma das seguintesestruturas: <formula>formula see original document page 56</formula>no qual R2/ R3 é hidrogênio ou alquil com 1 a 25,preferivelmente 1-18 ou 1-6 átomos de carbono,preferivelmente metil, em qualquer combinação; q é de 1-20,preferivelmente 1-12, ou 1-6;<formula>formula see original document page 57</formula>no qual R2, R3/ R4 são substituintes alquil com 1-25,preferivelmente 1-18 ou 1-6 átomos de carbono, e, emparticular, metil, em qualquer combinação; q tem um valorno intervalo 1-20, preferivelmente 1-12, 1-10 ou 1-6.

7.- Agente antimicrobial, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1-6, caracterizado pelo fato de que umde R2 ou R3 conforme descrito na fórmula (2) nareivindicação 6, pode ser fixado via uma ligação de amidacompreendendo o nitrogênio do componente de cisteina.

8. - Agente antimicrobial, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1-7, caracterizado pelo fato de que osubstrato é uma superfície sólida.

9.- Agente antimicrobial, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1-8, caracterizado pelo fato de ser paraimpedir ou inibir crescimento e/ou proliferação de bactériaGram-positiva e/ou Gram-negativa.

10. - Agente antimicrobial, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1-9, caracterizado pelo fato de ser paraimpedir ou inibir crescimento e/ou proliferação da bactériaGram-positiva Staphylococcus aureus, da bactéria Gram-negativa Escherichia coli, ou da bactéria Gram positivaBacillus megaterium.

11. - Substrato que vem em contato com microorganismos,e/ou que é de se j ável para manter livre de acúmulo e/ouadesão de microorganismos, caracterizado pelo fato de que asuperfície é revestida com um agente antimicrobial conformedefinido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10.

12. - Substrato, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-11, caracterizado pelo fato de que osubstrato é uma parte de um dispositivo, um aparelho e/ouuma superfície escolhidos a partir de (a) dispositivosmédicos, tais como dispositivos médicos extracorporeos, quesão aplicáveis no exterior do corpo humano ou animal, oudispositivos intracorpóreos, que são aplicáveis no interiordo corpo humano ou animal, (b) dispositivos de mercearia, e(c) outros dispositivos, tais como lente de contato,produtos de acondicionamento de cosmético, tanques de águafresca e tubos de água, dispositivos para armazenamento deprodutos ou materiais onde crescimento bacterial nassuperfícies do material de armazenamento é indesej ado.

13. - Substrato, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que o dispositivo é escolhido apartir de pele artificial para ferimentos por queimadura,um dispositivo de diálise, um dispositivo de drenagem deorelha, implantes de orelha, um dispositivo de auxilio deaudição, tubos de máquina de coração e pulmão, drenagemhidrocéfala, uma seringa, estomias, dispositivos de cuidadode ferimento, materiais de sutura, cateteres, produtosdentais, tubo ou equipamento usados para administraçãoparenteral de liquidos, soluções, infusões, distribuição dedroga, implantes no corpo (ossos, pró-paradontite), bombade insulina, diretrizes de nervo, marca-passos, drenagem apartir do interior do corpo (abscesso, pós-operatório),stents intraluminais (vascular e luminal em órgãos outecido).

14. - Uso de um agente antimicrobial conforme definidode acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10,caracterizado pelo fato de ser para impedir ou inibircrescimento e/ou proliferação de microorganismos em umsubstrato e/ou uma superfície.

15. - Kit de partes para uso no tratamento de umasuperfície de um dispositivo com um agente antimicrobial,caracterizado pelo fato de compreender, em compartimentosseparados, (a) um precursor para o agente antimicrobial deacordo com a reivindicação 1, o precursor tendo a fórmula:Z-L-S-S-(componente de cisteina)no qual L, m e o componente de cisteina são definidosacima, e Z é uma funcionalidade de ligante que pode reagircom um composto químico ou radical livre para dar o residuode acoplamento químico X, e (b) reagentes necessários demodo a ligar covalentemente o precursor a uma superfície,no qual o kit compreende adicionalmente instruções para usodo kit.

16. - Método para manufaturamento de um dispositivoantimicrobial, caracterizado pelo fato de compreender asetapas dei) provisão de um dispositivo;ii) ligação covalentemente de um ligante -L-S-S-(composto de cisteina) a grupos funcionais na superfície dodispositivo; oua um substrato solúvel que é subseqüentementeimobilizado na superfície do dispositivo.