CN101137287A

CN101137287A - 包含共价键结合到基底特别是通过s-s桥经由间隔分子共价键结合到基底的半胱氨酸化合物的抗微生物剂

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Publication number: CN101137287A
Application number: CNA2006800075637A
Authority: CN
Inventors: 安德斯·维尔森; 比吉塔·阿格贝特; 格门迪尔·格门德松; 雅各布·奥德贝格; 托尔比约恩·林德伯格
Original assignee: Cytacoat AB
Current assignee: Cytacoat AB
Priority date: 2005-03-21
Filing date: 2006-03-21
Publication date: 2008-03-05
Anticipated expiration: 2026-03-21
Also published as: US20140018423A1; JP2008533197A; CA2601459A1; EP1860937B1; ES2588305T3; EP1860937A1; RU2007135048A; AU2006225382B2; CN101137287B; PL1860937T3; KR20070118097A; CA2601459C; DK1860937T3; WO2006101438A1; EP1860937A4; US9155301B2; BRPI0609476A2; HK1111858A1; JP5222129B2; KR101365712B1

Abstract

本发明涉及抗微生物剂，其中半胱氨酸化合物共价键结合到基底，特别是通过S－S桥经由间隔分子结合到基底。所述间隔基包含碳链，任选地插入一个或多个杂原子，例如O、S、N、P和Si；所述碳链任选地被一个或多个烷基基团取代，优选被具有1～5个碳原子的低级烷基基团、羟基基团或烷氧基基团取代。本发明还涉及涂敷有本发明抗微生物剂的基底。所述试剂具有优良的抗微生物特性，且能用于涂敷各种装置的表面和基底，以防止或抑制微生物的累积和/或生长和/或增殖和/或生存力和/或生物膜的形成，所述装置例如为医疗装置或用于食物处理的装置。

Description

包含共价键结合到基底特别是通过S-S桥经由间隔分子共价键结合到基底的半胱氨酸化合物的抗微生物剂

技术领域

本发明涉及抗微生物剂或与微生物接触的装置和/或希望保持没有微生物累积和/或附着的装置。基底或装置表面呈现出本发明的抗微生物剂。

背景技术

在各种情况和应用中，例如在医疗护理、食品处理和食品贮存中，保持所使用的装置和产品没有微生物的生长或增殖是非常重要的。这不仅仅是在医院中与患者接触的医疗装置时是极其重要的，在医疗装置中是极其重要的是因为被污染的装置可通过可严重影响很多患者健康的方式参与疾病和微生物的传播。

例如，如果与可能有害的微生物接触的装置和产品具有抑制或杀灭细菌和/或其它微生物(例如病毒和真菌)的能力以防止疾病的传播，那么这将是非常有利的。

目标在于防止随后可发展成生物膜的初始定殖(colonization)。可通过抑制或杀灭微生物来抑制定殖的初始阶段。

为得到这样的保护，已知在装置中提供具有金属离子的表面，例如元素Ag和Ni的离子。通常Ag作为合金应用以达到以合适的速率向环境释放Ag⁺离子的目的，由此防止微生物的累积。

然而，采用这种解决办法的一个问题是金属或合金粘着到所述表面。而且，不易控制抗微生物效应，另外金属离子涂敷的表面可能具有细胞毒性的作用。

US-A-6475434公开了渗透生物膜的组合物，其用于除去由感染性微生物形成和构成的生物膜和用于涂敷医用装置以防止这样生物膜的形成。该组合物包含半胱氨酸和其类似物或其衍生物以便选择作为组分之一。半胱氨酸或半胱氨酸相关组分的作用并不清楚，尤其是对于涂敷应用它们以与已知抗微生物剂例如利福霉素、四环素和青霉素的组合使用。特别地，如在US-A-6475434中的实施例2和3中所示，仅测试的半胱氨酸部分(其为N-乙酰基半胱氨酸)没有效用，除非与测试的抗生素结合。此外，对生物膜保护而言，通过浸渍所述装置或在生产期间与所述装置材料混合来应用所有的组分。这些组分然后通过附着和渗透于所述装置材料而变为物理性结合，这意味着在其向环境释放时在很大程度上发挥其功能。尤其在医学应用中，这样的原理需要严格控制在抗微生物、细胞毒性和免疫效应之间的平衡。因为扩散基于时间和温度，所以涂敷装置的贮存和耐久性也成为特别关注的问题。

Olofsson等(Applied and Environmental Microbiology，August 2003；69(8)，4814-4822)已描述过N-乙酰基半胱氨酸能在溶液中影响细菌生长。N-乙酰基半胱氨酸的其它效应是减少多种类的细菌附着到不锈钢表面或利于从不锈钢表面脱离生物膜。

发明内容

本发明的主要目的是提供抗微生物剂，其具有以稳定的和长期的方式防止或至少基本上降低个体微生物在装置表面上累积和/或附着的能力。

该目的由发明人在本发明的第一个方面实现，即关于包含共价键结合半胱氨酸化合物的基底的抗微生物剂。

具体地，本发明提供抗微生物剂，其中所述半胱氨酸化合物通过S-S桥经由间隔分子结合到所述基底。所述间隔基包含碳链，任选地插入一个或多个杂原子，例如O、S、N、P或Si，且该链任选地被一个或多个烷基基团取代，优选被具有1-6个碳原子的低级烷基基团、羟基基团或烷氧基基团取代。在以下给出的实施例中该半胱氨酸化合物经由S-S桥结合在该间隔基的末端位置，这是本发明的一个优选实施方案。然而，间隔链上的其它位置也是可能的，只要该半胱氨酸官能团暴露于环境中。

根据本发明一个优选实施方案，与基底结合的含半胱氨酸的配体具有通式：

(1)R₁-X-L-S-S-(半胱氨酸部分)，

其中

-R₁为可溶的或不溶的基底；例如固体表面或可溶的有机分子或聚合物。

-X为来自基底和L之间的偶联反应的连接基团。

-L为间隔分子，选自包括(CH₂)_m、(CH₂CH₂O)_n(CH₂)_P或(CH(CH₃)CH₂O)_n(CH₂)_p的组，其中m为1-20，优选1-12、1-8或1-6；其中n为1-1000，优选1-100或3-50；且p为1-20，优选1-12、1-10或1-6。所述(CH₂)_p部分与二硫桥结合，但也可任选地出现在嵌段共聚物中的(CH₂CH₂O)_n和/或(CH(CH₃)CH₂O)_n链段之间；

-本文中半胱氨酸化合物是指半胱氨酸化合物的残基，包括半胱氨酸、半胱氨酸类似物或半胱氨酸衍生物的残基，所述半胱氨酸类似物或半胱氨酸衍生物具有与半胱氨酸赋予的抗微生物活性基本上相同或处于相当水平的抗微生物活性。已注意到由于其优良的抗微生物活性，至少在某些应用中，本发明如下的一个实施方案特别重要：其中半胱氨酸化合物经由S-S桥结合，所述S-S桥包含一个来自半胱氨酸化合物的硫醇基的S和一个来自所述间隔分子的S。

因此，提供了共价键结合到所述装置表面的抗微生物剂，其由于共价键结合半胱氨酸的令人惊奇的有利作用而对个体微生物具有强的和长期的效果，参见以下关于的实施例，从而防止或基本上抑制了个体微生物的附着和累积。因此，本发明提供了用于需要表面或基底会表现出抗微生物/抗菌性质的所有应用的巨大潜力。本发明另外的和重要的优点在于已由发明人表明本发明的试剂表现出无细胞毒性作用，这使得其可用于多种不同的应用中。

在本发明的一个方面，使用根据本发明的抗微生物剂完全或部分涂敷所需保持没有微生物累积和/或附着的各种装置。

在另一方面，本发明涉及本发明的抗微生物剂用于防止微生物在基底和/或装置表面上生长和/或增殖的用途。

与US-A-6475434相比，本发明提供了使半胱氨酸或半胱氨酸相关组分共价键结合到基底的方法。本发明的主要用途是为固体装置提供抗微生物涂层。根据此原理所述抗微生物剂永久地结合到所述表面，与表面接触时发生所述抗微生物效应而非来自释放试剂的反应，这将大大降低在生物环境中不良影响的风险。与作为如此释放试剂提供半胱氨酸的现有技术方法相比，这是主要的区别。就表面浓度和化学结构而言，也可以通过共价连接更特定地制备所述表面。因此不仅表面结合的半胱氨酸或半胱氨酸相关组分本身，而且至少在某些应用中借以将半胱氨酸或半胱氨酸相关组分连接到所述表面的二硫键也是关于抗微生物效果的本发明原理的发明性特征之一。此外，此共价连接提供了表面，与主要涉及活性剂的扩散和渗漏的表面相比，该表面在一致性和耐久性方面是原位和贮存优越的。

“抗微生物剂”包含基底，所述基底已被修饰以呈现出共价键结合的半胱氨酸部分，并具有防止或至少基本上防止至少一种特定微生物的累积、生长和/或增殖的作用。此作用可例如通过现有技术中已知的方法观察到，如通过本公开实施例部分中使用的方法。

“半胱氨酸部分”包括具有抗微生物作用的半胱氨酸、半胱氨酸类似物或半胱氨酸衍生物的残基，例如高半胱氨酸或N-取代的半胱氨酸比如N-乙酰基-L-半胱氨酸和N-烷基化的半胱氨酸。

“基底”(R₁)包括任何可溶的或不溶的制品、装置、分子或聚合物，其可通过结合半胱氨酸部分而被官能化以获得抗微生物性质。特别感兴趣的是固体制品，比如待在人或动物身体尤其是敏感组织和体液的内部或与之接触使用的医用装置。此可能应用的列表是广泛的，进一步参见下面，并包括待用于例如以下应用中的植入物、管道引流导管(tubings drainagecatheters)等，所述应用例如为体外应用、引流(例如耳或脑积水)、透析、隐形眼镜、眼内透镜、人造皮肤、透析装置、心肺机、缝合材料、伤口护理装置、牙科产品、胃肠外施用、药物递送、支架、泵(例如用于胰岛素)、助听装置、注射器、缝合材料、起搏器等。

“防止”或“抑制”包括在存在本发明试剂的位置停止或基本上降低微生物的生长和/或增殖和/或累积和/或基本上降低微生物生存力的能力。

本发明的主要潜力是为固体装置提供抗微生物表面的可能性，所述固体装置可能与微生物接触，且需要保持没有微生物的累积和/或增殖和/或作为有生存力的微生物的贮库。待用于微生物的存在可或多或少是危险的医疗和食品处理应用中的大量装置，说明了本发明的潜力。为使这成为可能，发明人已成功地使用了半胱氨酸物质，发明人已展示了当如本文中描述和要求保护的那样共价键结合后其具有出乎意料强的抗微生物作用。对于半胱氨酸类似物和其衍生物如N-乙酰基半胱氨酸和高半胱氨酸，已显示了具有抗微生物作用。

环氧乙烷和环氧丙烷的聚合物或低聚物，即聚(环氧乙烷)或聚(乙二醇)是可易溶于水的，另外聚(环氧乙烷)具有蛋白质排斥性质，其可增加本发明的抗微生物功能特别是当用于与表面接触时。根据半胱氨酸部分，以下结构是待使用的合适配体的实例：

在式(2)中，在R₂和R₃的任意组合中，取代基R₂、R₃可为氢或具有1～20个碳原子，优选1～12个碳原子，更优选1～6个碳原子的烷基；q可具有与如前所述的L部分的亚甲基组分的m和p相同的变化，即1～20，优选1～12，更优选1～6。当q＝1且R₂＝R₃＝H时，该半胱氨酸部分变为半胱氨酸残基，其如同半胱氨酸类似物和衍生物一样经由其硫醇基团偶联，该硫醇基团为该二硫键贡献一个硫。除了半胱氨酸氨基基团的直接烷基化以外，R₂和R₃烷基还可通过包含该半胱氨酸部分氮原子的酰胺键结合，例如当R₂为氢且R₃为甲基时，该半胱氨酸部分变为乙酰基半胱氨酸。

在式(3)中R₂、R₃、R₄为烷基取代基，其给出带正电的季铵基团。在此情况下，所述R₂、R₃、R₄取代基的烷基链中碳原子数目可在1～25间变化，优选在1～18间变化，以任意组合。此外，q可具有与如前所述的L部分的亚甲基组分的m和p相同的变化，即1～20，优选1～12，更优选1～6。

根据pH，也可出现带电的离子基团，如(2)中质子化的氨基基团和(2)与(3)中的羧酸盐基团。

取代基R₁和所述配体之间的偶联-X-通过R₁上的官能团和相应配体间的化学反应而得到。如果R₁具有化学官能团Y且配体具有官能团Z，其通过反应得到X，忽略副产物，则主要的偶联反应可写成：

(4)R₁-Y+Z-L-S-S-(半胱氨酸部分)---------------->

----------------->R₁-X-L-S-S-(半胱氨酸部分)

根据Y和Z的选择以及反应条件，得到的X基团可为酰胺、仲胺、酯、醚、肼、尿烷、脲、碳酸酯等。有大量特定有效的已在有机化学中充分确定的反应可供使用。因此，本文中给出的Y、Z和X基团以及反应是示例性的而非对本发明的限制。

(a) 当Y＝COOH 且Z＝NH₂ 则X＝CONH

(b) ″Y＝COCl ″Z＝NH₂ ″X＝CONH

(c) ″Y＝COOH ″Z＝OH ″X＝COO

(d) ″Y＝COCl ″Z＝OH ″X＝COO

(e) ″Y＝NH₂ ″Z＝CHO ″X＝NH

(f) ″Y＝NHNH₂ ″Z＝CHO ″X＝NHNH

(g) ″Y＝NH₂ ″Z＝NCO ″X＝NHCONH

(h) ″Y＝NH₂

″X＝NHCOO

(i) ″Y＝NH₂ ″Z＝琥珀酰亚胺基- ″X＝NHCO

(j) ″Y＝NH₂ ″Z＝环氧- ″X＝NHCH₂CH(OH)

(k) ″Y＝OH ″Z＝NCO ″X＝OCONH

(l) ″Y＝OH ″Z＝环氧 ″X＝OCH₂CH(OH)

(m) ″ Y＝OSO₂CH₂CF₃ ″Z＝NH₂ ″X＝CH₂NH

(n) ″ Y＝OS0₂CH₂CF₃ ″Z＝SH ″X＝CH₂S

(o) ″Y＝SS ″Z＝SH ″X＝SS

(p) ″Y＝(烷基)₃COK ″Z＝(烷基)Br ″X＝O

(q) ″R₁＝Au，Ag ″Z＝SH ″X＝S

(r) ″R₁＝Au，Ag ″Z＝SS ″X＝S

(s) ″R₁＝R₁· ″Z＝CH₂＝C- ″X＝CH-C-

实例(a)到(p)中的Y和Z基团可在R₁和所述配体之间互换以给出同样的X连接，尽管其在R₁和该配体之间是颠倒的。例如当(a)中的所述官能团被换成Y＝NH₂和Z＝COOH时，X连接变为HNOC。在实例(e)和(F)中，初始得到的通常被称为Schiff碱的亚胺被用NaCNBH₃还原成仲胺连接。常使用中间步骤以提高选择性和产率。所熟知的实例是在与氨基基团(Z)形成酰胺之前，用碳二亚胺和/或N-羟基琥珀酰亚胺活化(a)中羧基基团(Y)。可用二琥珀酰亚胺基碳酸酯活化胺基团以与另一个胺基团形成脲连接。

除了羧基和氨基基团外，也可在大量的偶联反应中使用羟基：

-在衍生化为碳酸酯后得到(h)中的Z基团(其中表示苯环)、或衍生化为如在(m)和(n)中的三氟乙磺酰化的(tresylated)基团

-在通过衍生化为甲苯磺酰基或琥珀酰亚胺基碳酸酯基团来活化羟基后，用Br₂或CNBr处理以用于与亲核物质如胺和/或硫醇进行偶联反应。

-可使用光气将两个羟基连接在一起以形成碳酸酯连接。

关于本文中提及反应和其它偶联反应的偶联化学的全面综述见于文献(参考Herman S.等的J.Bioact.Compat.Pol.1995，10，145-187)。

在表1的实例(s)中，R₁·表示具有自由基的固体基底，所述自由基可与不饱和基团反应，所述不饱和基团例如但不限于：乙烯、丙烯酸或甲基丙烯酸的双键。通过使用具有与反应性的碳-碳键连接的配体-L-S-S-(半胱氨酸部分)的单体，可得到共价连接到所述基底且其具有配体作为侧基的低聚物链或聚合物链。可通过与合适单体的共聚合控制低聚物链和聚合物链中这些侧基的浓度，所述合适的单体例如但不限于：丙烯酸或甲基丙烯酸或酯或丙烯酰胺。其它路线将使用单体如马来酸、马来酸酐、惕各酸或烯丙基胺，其易于与提供表面的自由基结合但具有大幅降低的链增长。由这些单体提供的官能团，即酸酐、羧基或胺将因此被限制在基底上非常薄的表面层上。通过此路线，配体的各个偶联将基本上通过直接与所述表面上的官能团的末端连接而发生，因此与当所述配体参与接枝聚合时得到的结构相比提供了不同的结构。

如果Y基团选择性地与所述配体的Z基团反应且不与所述半胱氨酸部分中的氨基或羧基基团反应，则可根据(4)与R₁-Y进行偶联反应。

在Y基团可能不排它性地与下式配体的Z基团反应而且还可与该半胱氨酸部分的氨基和/或羧基基团反应的情况下：

(5)Z-L-S-S-(半胱氨酸部分)

如果需要，可分别通过取代和酯化保护这些基团。可通过取代基保护氨基基团，例如通过叔丁氧羰基(t-BuO)。当然这只有当所述氨基未被烷基化成如式(2)和(3)中所定义的叔胺或季铵时才是必需的。可通过甲基化保护该半胱氨酸部分的羧基基团。在如式(4)所示的R₁-Y与Z-配体之间的偶联反应以获得X连接的配体之后，t-BuO和酯甲基基团可分别通过酸和碱水解脱除，并因此恢复所述Z-配体的原始结构。通过如式(2)-(4)和式(5)中定义的Z-配体以及另外可得到的各种Z官能团的这些选择，是本发明待用作官能化表面的单步修饰的试剂盒(kit)组件的单独的项目。本发明的这一方面还覆盖了以前所述的其中基底的官能团Y是自由基和配体的官能团Z是不饱和的反应性碳-碳键的实例。

当所述官能团Y结合到固体基底时，可在所述基底表面原位合成配体。此具有优点：在中间步骤除去未反应的Y基团和副产物。

通过此方法，第一步骤将是使R₁-Y表面与具有如下一般组成的化合物反应：

(6)Z-L-S-S-R₅

其中L具有与如前相同的定义，且当取代基R₅与硫醇反应时其易于被取代以与硫醇化合物得到新的二硫键。

第一偶联步骤可表示为：

(7)R₁-Y+Z-L-S-S-R₅------------------>

------------------>R₁-X-L-S-S-R₅

以及随后的步骤：

(8)R₁-X-L-S-S-R₅+HS-半胱氨酸部分------------->

--------------->R₁-X-L-S-S-半胱氨酸部分(+R₅HS)

R₅的一个常见实例是吡啶基，但也使用丹酰基。作为替代，(6)中的二硫键可属于硫代硫酸酯基团，通过与硫醇反应所述硫代硫酸酯基团也会得到二硫键。

此外还有可替代的方式用于获得如前所述的基本相同的化学结构，这也在本发明的范围之内。在此情况下，硫醇部分或基团-L-SH经由偶联基团X与R₁结合，其中L和X如前所定义的且-SH为末端硫醇基团。这可在氧化剂存在下排它性地与所述半胱氨酸部分的硫醇基团反应，以形成与该半胱氨酸部分的二硫化物连接：

(9)R₁-X-L-SH+HS-(半胱氨酸部分)--------------->

-------->R₁-X-L-S-S-(半胱氨酸部分)

+(H₂或含氢副产物)

当最后根据式(9)偶联所述半胱氨酸部分时，得到了抗微生物配体，其与R₁共价键结合，如式(9)中所示的。

聚合物材料例如塑料、橡胶、纤维素塑料等的表面官能化可通过接枝或吸附具有官能团的化合物而实现，所述官能团例如羧基或胺。给出与所述基底共价连接的接枝需要表面的官能化。在用UV、电子束或γ辐照或气体等离子活化的期间或之后，接枝能与自由基反应的化合物。通过这些方法，可在聚合物基底中产生自由基，这可引发这样基底上的接枝聚合。这些用于固体聚合物基底的表面修饰方法由表1中的实例(q)所代表。在此方法中，接枝通常包括称为接枝聚合的从所述基底表面的链增长。

常用于自由基接枝聚合的单体为丙烯酸化合物如丙烯酸、甲基丙烯酸和其酯或丙烯酰胺以及乙烯基吡咯烷酮。通过含有如羧基、氨基、卤素等官能团的这些单体的接枝聚合，可以提供具有共价键结合官能团的固体表面，所述共价键结合官能团用于共价键结合抗微生物配体。以前描述的接枝聚合的特定应用也包含在本发明中，其中当Z为包含反应性不饱和碳-碳键的自由基反应性基团时，如式(6)所示的抗微生物配体能接枝聚合。这将给出在接枝聚合链中作为侧基的抗微生物配体，其浓度和位置可通过与适合乙烯或丙烯酸单体的接枝共聚进行控制。然而，也如以前所述的，该抗微生物配体可在末端与基底直接结合。在此情况下在第一步骤中通过与具有可忽略链增长的不饱和化合物的单分子接枝而实现所述基底的官能化，所述不饱和化合物例如为马来酸酐、马来酸和三氟甲磺酸或自终止单体如烯丙基胺。通过此过程可在所述表面上产生官能团，以便通过化学偶联直接末端结合所述抗微生物配体。同样在当式(6)中的乙烯或丙烯酸配体不聚合的情况下，例如由于空间位阻原因，其将通过与所述基底上自由基的末端反应直接结合。

在所述基底为可水解的塑料材料如聚酯(PET)、聚酰胺(Nylon^TM，Nomex^TM，Kevlar^TM)或聚丙烯酸酯(PMMA)的情况下，可通过在碱性或酸性溶液中水解得到表面官能化。聚酯将给出羧基和羟基，聚酰胺将给出羧基和胺基，其可通过偶联或吸附用于随后的修饰中。

可通过辐照和等离子体处理使用羧基基团表面官能化金属基底如不锈钢。医疗制品如支架通过暴露于硅烷和丙烯酸的气体等离子体而羧基化。金和银表面可通过利用其与硫醇和二硫化物化合物的反应性而接枝，所述硫醇和二硫化物化合物也会具有其它基团如羧基和胺。同样对于金属基底而言，可通过在暴露于一旦与自由基反应能形成共价连接的单体期间该导电基底的阴极极化，而实现表面的自由基接枝。该表面接枝在引发、增长和单体方面类似于固体聚合物基底，同样也由表1中的实例所代表。

当通过吸附进行聚合物基底的表面修饰时，所述基底的底漆往往通过化学氧化、电晕处理或氧化性气体等离子体实现，以在表面层中获得亲水基团和离子基团。一个实例是将聚亚乙烯亚胺吸附到已被高锰酸盐或过硫酸盐氧化过的聚合物基底上。所得氨基表面可用于化学偶联反应和在合适的pH下吸附带负电聚合物如聚丙烯酸、右旋糖酐硫酸酯或肝素。往往在其离子带电状态下以交替的层吸附这些聚电解质，感兴趣的性质在最外层。特别是往往通过聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸的吸附而实现金属表面的羧基化。如上所述，然后可通过化学偶联或通过离子吸附例如聚乙烯亚胺或聚烯丙基胺，来胺化它们。

另一个不需要基底的任何初步官能化的获得吸附的方法是使用既有疏水性又有亲水性的嵌段或部分的嵌段共聚物，其将选择性地吸附到所述基底表面或使所述基底表面官能化。典型地，这样的嵌段共聚物为聚乙二醇-聚丙烯(Pluronics)和聚丙烯酸酯-聚苯乙烯、聚丙烯酸酯-聚乙烯、聚丁二烯-聚苯乙烯等，其也可包含氨基或羧基官能团。

本发明定义的抗菌配体-L-S-S-(半胱氨酸部分)总是与基底R₁共价键结合。

然而，由于R₁的定义包含有机和聚合物化合物，R₁也将覆盖随后能通过共价键结合或吸附而结合到固体基底的聚合物。

本发明的抗菌剂对固体基底的共价键结合的选择通过R₁的定义而被强调，其包括通过吸附将所述抗微生物剂连接到固体基底。在此情况下，R₁为可溶性的基底，例如可电离的聚合物如聚乙烯亚胺或聚丙烯酸或具有疏水性/亲水性嵌段的嵌段聚合物，如聚乙二醇-聚丙二醇或在与聚苯乙烯、聚乙烯等的嵌段共聚物中的聚丙烯酸酯。半胱氨酸部分共价键结合到可溶性基底上，所述可溶性基底在另外的步骤中固定于固体基底上，如本文所述。

因此，可通过许多不同途径实现用于连接抗菌剂的表面修饰和随后的化学偶联或吸附。此外所述基底可为有机或无机材料，其包括合成的或天然的聚合物以及金属和矿物。因此，在此处和下面实施例中提出的方法、化学反应和基底仅仅是说明性的，并非限制本发明覆盖的所得抗菌剂和表面。本发明试剂的表面浓度，例如L-半胱氨酸为10^-11～10^-4摩尔/cm²，优选10^-9～10^-5摩尔/cm²。

为获得临床上或技术上重要的微生物抑制，对于附着的活细菌，优选根据本发明达到100倍的抑制，所述附着的活细菌能用以起始于大幅暴露(在起始培养中滴度为400000cfu/ml)的方法进行释放。这可部分取决于特定生物体和暴露的程度/滴度。所述测试条件大大超过在实际临床条件下可预期的条件。

可用本发明防止其生长和/或增殖的微生物的实例为厌氧菌和需氧菌，其包含选自但不限于以下的不同革兰氏阳性菌：不同种的葡萄球菌(Staphylococci)例如金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermides)以及其它的凝固酶阴性葡萄球菌，腐生葡萄球菌(S.saphrophyticus)，肠球菌种(Enterococcus spp)，奈瑟氏菌属(Nesseria)(脑膜炎球菌(Meningococci)、淋球菌(Gonococci))，链球菌属(Streptococci)(绿色链球菌(Viridans)、溶血性和非溶血性链球菌(hemolytic andnon-hemolytic)、B组和D组链球菌(group B and D)、肺炎链球菌(S.pneumoniae))，Chlostridia(产气荚膜梭菌(perfringens)、肉毒梭菌(botulinum))，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，以及选自但不限于以下的不同革兰氏阴性菌：不同的肠杆菌种(Enterobacter spp)，大肠杆菌(Escherichia coli)，克雷伯氏菌种(Klebsiella spp)，变形杆菌属(Proteus)，弯曲杆菌属(Campylobacter)，耶尔森氏菌属(Yersinia)，志贺氏菌属(Shigella)，沙门氏菌属(Salmonella)，嗜血杆菌属(hemophilus)(流感嗜血杆菌(influenza))，拟杆菌属(Bacteroides)(脆弱拟杆菌(fragilis)、双道拟杆菌(bivius))，假单胞菌属(Pseudomonas)(铜绿假单胞菌(aeruginosa)、洋葱假单胞菌(cepacia))，军团菌属(Legionella)(嗜肺军团菌(pneumophilia))。还包括不同的支原体种(mycoplasma)和假丝酵母种(Candida)以及不同的真菌。优选细菌的实例是革兰氏阳性金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性大肠杆菌、或革兰氏阳性巨大芽孢杆菌。

本发明可用于在不同应用表面上防止或抑制由于定殖或感染而可引起问题的微生物生长。已表明对抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌(革兰氏阴性大肠杆菌、或革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和巨大芽孢杆菌)是有效的。已描述了几种与卫生保健部门和医院环境中的导管定殖和感染有关的不同的微生物。这些微生物包括但不限于以下列出的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。还有不同的真菌也是常见的问题，特别是对于免疫抑制患者(经历移植或其它的免疫抑制治疗等)。在人工装置(导管、trachiostomi管等)的感染、定殖或生物膜形成能在卫生保健中导致问题的情况下，可使用本发明。已知的或描述过的由导管具有的微生物和能用本发明对抗的微生物的实例为(但不限于)：葡萄球菌(例如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和其它的凝固酶阴性葡萄球菌如腐生葡萄球菌)；链球菌(例如绿色链球菌、溶血性和非溶血性链球菌、B组和D组链球菌、肺炎链球菌)；肠球菌(Enterococcus spp)，粪链球菌(S.facealis)；Chlostridia(产气荚膜梭菌、肉毒杆菌)；不同的肠杆菌，如大肠杆菌、克雷伯氏菌(肺炎)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloace)、产气菌、变形杆菌属、(奇异变形杆菌(mirabilis))、弯曲杆菌属、耶尔森氏菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属、嗜血杆菌属(流感嗜血杆菌)、奈瑟氏菌属(脑膜炎球菌、淋球菌)、拟杆菌属(拟杆菌和梭杆菌(fusobacterium))、假单胞菌属(绿脓杆菌、洋葱假单胞菌)、军团菌属(嗜肺军团菌)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcenens)、不动杆菌(Acinetobacter spp)、摩氏摩根氏菌(Morganellamorganii)、窄食单胞菌属(Stenotrophomonas)、柠檬酸杆菌(Citrobacterspp)、棒状杆菌(Corynebacterium spp)、Burkholder Cepafia、不动杆菌(Acinetobacter spp)；不同的支原体(鸡毒支原体(M.avian)等)；还有真菌例如假丝酵母、热带假丝酵母(C.tropicalis)、近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、Tricosporun、芽裂霉属(Blastoschizomyces)、嗜麦芽窄食假单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、马拉色菌属(Malassezia)、Bukholderia cepafia、曲霉属(Aspergillus)。

在本发明的很多应用中，所述基底为选自以下的装置、设备和/或表面的一部分：(a)医疗装置，所述医疗装置例如为可用于人或动物体的外部的体外医疗装置、或可用于人或动物体内部的体内医疗装置，(b)食品装置，和(c)其它装置。以下列出的应用实例仅意在表明本发明的潜力而不是以任何方式的限制。

医疗装置(a)包括选自以下的应用：

-人工皮肤或烧伤伤口覆盖物(covering for burning wounds)

-透析(往来透析装置的管道)

-耳引流(从空腔、伤口或脓肿或在耳内部的引流)

-耳植入物(在耳内部的植入物)

-助听装置(内部放置的听觉装置)

-心肺机管道(往来心肺机装置的管道)

-脑水肿引流(从脑区域/脑室的引流)

-注射器(一次性注射器)

-造口术(stomis)(造口装置((stomi devices))

-缝合材料(缝合装置)

-伤口护理(伤口护理装置，如硬膏)

-导管(一次性和永久导管装置，例如中心静脉导管(CVC)、外周静脉导管(PVC)、经外周插入中心的导管(peripherally insertedcentral catheters)、导尿管、和腹膜导管)

-牙科产品(植入口腔区域的产品)

-体内植入物(骨、proparadontit(植入口腔区域的产品))

-胰岛素泵(进出胰岛素泵的管道)

-神经导向(神经的导向装置)

-起搏器(起搏器及其周围装置)

-术后引流(手术后的引流装置)

-从人体内的区域和/或器官和空腔引流(脓肿、肾造口(nephrostomi)或类似的)

-体内/腔内支架(用于保持不同腔开放的支架，例如在血管系统和脉管内、在器官和组织内、在肠系统、胆道等内部)

-用于液体、溶液、输注、药物递送的胃肠外给药的管道或设备。

食品装置(b)包括选自以下的应用：

-新鲜食品的接触表面或用于食品处理的基底或装置(可能与细菌源接触的表面)

-药品包装(以保持开口无菌)(敏感药品的包装)

-挤奶装置(在挤奶操作中遭受细菌源的装置)

-喷洒器装置(可定殖微生物的喷洒器装置及其它水传送装置，例如食品店中的嘴(mouthpiece))

-渔业中的轧辊钢(用于渔业中以增强鱼产品生产的轧辊)。

包含选自以下应用的各种装置：

-隐形眼镜(普通隐形眼镜)

-眼内透镜

-化妆品包装品(不同化妆品产品的包装)

-水箱(容纳自来水或再循环水的水箱)

-水管(运输自来水或再循环水的管道)

-空调、空气和水冷却装置，

-其它用于储藏产品或材料的装置，其中储藏材料表面上的细菌生长是不希望的。

在所有这些应用中，如上所讨论的，本发明的抗微生物剂偶联到所述装置表面上，以赋予抗微生物作用。

在一个优选的实施方案中，所述抗微生物剂偶联到导管表面，由此提供能防止微生物生长和/或增殖的导管。通常所述导管的内表面和外表面涂敷有本发明的试剂。可进一步在导管的挤出期间或其后、或者在组装该特定的导管之前或之后作为单独的步骤引入所述涂层处理的导管表面。对于处理过的导管样品而言，在环境条件下存放数年之后仍保留该微生物效应。导管通道的供应商提供可用于本发明的导管，例如Rehau、Habia、Vygon、Teknofluor、Optinova、Baxter等。

在另一方面，本发明涉及用于使用抗微生物剂处理表面的部分的试剂盒，其包括：(a)权利要求1的抗微生物剂的前体，该前体具有下式：

Z-L-S-S-(半胱氨酸部分)

其中L、m和半胱氨酸部分如上定义，Z为如上定义的配体官能团并其能与如上定义的化学化合物Y 反应给出化学化合物X，如上定义的；(b)用于将所述前体共价键结合到表面的必需试剂，其中所述试剂盒还包括使用该试剂盒的说明。必需试剂可包含进行Y和Z的偶联反应以得到X所必需的任何试剂(如上所概述)，并将取决于Y和Z的特定种类。本领域技术人员会知道在每种情况下何种试剂会是必需的。

因此，提供了试剂盒，其能与本发明的抗微生物剂一起用于处理任何所需表面，以给予所述表面抗微生物性质。

具体实施方式

现将通过实施例的方式对本发明做进一步阐述。这些实施例仅是说明性目的，不应以任何方式看作是对本发明范围的限制。

实施例部分

方法

对修饰表面上微生物生长的抑制分析

菌株

采用三种不同的菌株进行以下的分析(但应用不限于这些)：革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(临床分离物B5381)、革兰氏阳性巨大芽孢杆菌(菌株Bm11)、革兰氏阴性大肠杆菌(菌株D21)的临床分离物(来自患有脓毒症的患者)。选择的细菌既含有革兰氏阳性菌又含有革兰氏阴性菌，其包含了那些引起明显临床问题的细菌。

制备细菌培养物以测定滴度

以下描述目的在于(但不限于)测定不同细菌培养物的约400000-800000cfu/ml的滴度，所述细菌培养物用作暴露源以评价对功能性表面上细菌生长的抑制。将特定的菌株接种到LB培养基(Luria Bertani肉汤)上，但不限于此培养基。一天前将选择的菌株接种到选择的培养基的琼脂板上并允许在37℃生长过夜。从所述板上刮取几个菌落并用于接种该培养基，随后允许其生长到0.4的光密度。用同样的LB培养基将该培养物稀释到约400000-800000cfu/ml的初始滴度。通过平板连续稀释和在合适的稀释中计数菌落测定细菌数。(作为一般参考，在平板上计数的合适细菌数为30-300)

片的预处理

在选择的情况下通过在以下材料中培养片来预处理片：

a)磷酸盐缓冲盐水(PBS)

b)胎牛血清(FCS)

c)无菌LB培养基

在不同的时间段进行所述培养：1h、1.5h、2.5h、过夜、2天或7天，如在以下实施例中所述的。通过在37℃于无菌eppendorf管中旋转(200rpm)进行培养。

功能性表面暴露于不同菌株

将处于片状的表面修饰的基底放置在无菌eppendorf管中。将每个片(直径5或9mm)放入特定体积(分别为500或1000μl)的起始培养物中。将这些管以“管1”表示。通过旋转(200rpm)在37℃培养在起始培养物中的片2.5小时。

平行地培养同样体积的起始培养物作为参比样品(以“培养后的培养物”表示)。使用此方法以确定当不暴露于所述片时，该起始培养物的滴度(将培养片的培养物)将生长至何种水平。用无菌LB培养基培养对照样品(用于比较抑制水平的同样的片)，随后以同样方式处理，作为排除污染的阴性对照。

在功能性表面上活细菌附着分析的测定

培养(在现在描述的情形下：2.5小时)之后，使用无菌镊子将片从每个管中取出。将在其中培养片的培养物平行地转移入分离的无菌eppendorf管，如所述的测定其滴度。将镊子和片浸入约4ml无菌PBS溶液的管中，然后将该片投入第二个具有PBS的管中，以“管2”表示。其后用无菌镊子将此片从管2中取出。进行此操作以便排除源自在其中培养该片的细菌培养物的多余的细菌悬液滴，并因此除去任何不直接附着于所述片表面的细菌。

将清洗的片置于具有1mlPBS的eppendorf管中(以“管3”表示)，在涡旋振荡器上强烈振摇10分钟。附着的活细菌(其未在以前的步骤中除去)现将其从所述表面脱离进入该PBS溶液中。

将该溶液以“洗1”表示，并测定其滴度。

然后用无菌镊子通过浸入具有约4ml无菌PBS的管中将该片取出，然后以如上所述的同样方式将其投入另一个具有约2ml无菌PBS的管中。用无菌镊子将该片迅速取出并转移至一个新的eppendorf管，向其中加入1ml无菌PBS，并重复已描述过的涡旋步骤。

将此PBS溶液转移到无菌eppendorf管(以“洗2”表示)并测定其滴度。

将此片暂时置于无菌Kleenex擦上以除去多余的洗2的滴，随后将其置于LB培养基的无菌琼脂板上，在37℃培养过夜。监测细菌菌落的外观、围绕所述片边缘的细菌生长。

测定不同培养物和清洗溶液中的细菌滴度

在LB培养基和选择的稀释剂中进行稀释(参见下文)，其中分析菌落并计数。

铺展以下悬浮液的100μl体积的系列稀释物：

1.在稀释到培养培养物(OD约0.4)之前的初始培养物：

2.初始培养培养物(估计400000-800000cfu/ml)；1∶100，1∶1000和1∶10000。

3.培养后的培养物(参比的和培养片的)1∶1000，1∶10000，1∶100000。

4.阴性对照(无初始细菌培养物的培养基)

5.洗1∶1∶10和1∶100。

6.洗2∶1∶1。

实施例1

将直径为5mm的1mm厚的平坦试样形状的聚己内酯(PCL；UC787)用脉冲发生器(6.5MeV/75Hz/4微秒/60mA)以1Mrad的剂量预辐照。然后如下所述可将此样品按直接接枝或在接枝前保存于液氮中。

在辐照之后，可替代地在中间存储于液氮中之后，将所述PCL样品引入恒温在30℃的丙烯酸(20重量％)和0.1重量％Mohr’s盐的水溶液中。将所述溶液通过惰性气体吹扫以除去氧，所述吹洗也起到搅拌作用。在丙烯酸溶液中2分钟以后，用大量约30℃的自来水清洗所述样品，并在随后的表面修饰前保存于去离子水中。在室温下，用特定量的0.01M的NaOH将大量具有总面积5cm²的样品和未接枝的参比样品沉积6小时。电位滴定后测得(1.8±0.2)×10^-5摩尔COOH/cm²的表面浓度。

实施例2

在0℃混合各自的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(etylkarbodiimid)(EDC)和N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)(Sigma)在去离子水中的溶液，形成浓度分别为0.3MEDC和0.075MNHS的溶液。

在HEPES缓冲液(pH7.4)中清洗根据实施例1的丙烯酸接枝的PCL样品，并浸入20ml EDC/NHS溶液中。通过振摇搅拌10分钟后，在去离子水中漂洗样品，并加入0.04M的2-(2-吡啶基二硫)-乙胺盐酸盐(hydroklorid)(PDEA)在0.1M硼酸盐(borat)缓冲液(pH8.5)中的溶液。搅拌15分钟后将样品在去离子水中漂洗并加入0.5ML一半胱氨酸(sigma)在0.1M甲酸盐(format)缓冲液(pH4.3)与1MNaCI中的溶液。在用1MNaCI和去离子水清洗后，将样品置于空气中干燥并保存在干燥器中。用ESCA(XPS)进行的表面分析测定得到6.8原子％氮的值。

实施例3

根据实施例1，以2.5Mrad的剂量预辐照低密度聚乙烯(LDPE)的样品。在50℃用丙烯酸接枝4分钟之后，所有其他条件与实施例1的相同，检测到(2.7±0.2)×10^-5摩尔COOH/cm²的羧酸化值。以如实施例2中对PCL相同的方式，进行PDEA和L-半胱氨酸对丙烯酸接枝的LDPE的偶联反应，并根据ESCA的表面分析，得到6.0原子％的氮的值。

实施例4

将外径为2mm的聚氨酯导管(Vygon

)切成20mm的长度，并根据实施例1以1Mrad的剂量预辐照。根据实施例2进行接枝。

实施例5

对胺功能性表面的偶联将与实施例2的步骤相似。不同点在于PDEA中的胺基团被糍团代替，以得到2-(2-吡啶基二硫)-乙基羧酸(PDEC)。当使此化合物与表面上的胺基团反应时，在与所述胺表面反应之前分别用EDC/NHS活化所述羧基。然后将如实施例2进行随后的与L-半胱氨酸的偶联。

实施例6

根据实施例1和2制备参比表面，区别在于用EDC/NHS活化后，L-半胱氨酸经由半胱氨酸内的胺基基团直接与姒的PCL表面偶联，即排除了与PDEA的偶联步骤，从而消除了当与PDEA偶联时得到的二硫键，如在实施例2中所述的。

实施例7

根据实施例1至3制备参比表面，不同点在于根据实施例2中描述的步骤，偶联乙酰基半胱氨酸而不是L-半胱氨酸。

实施例8

根据实施例1至3制备参比表面，不同点在于根据实施例2中描述的过程，偶联高半胱氨酸而不是L-半胱氨酸。

实施例9

对于偶联有：

a)如实施例1和2中所述，与丙烯酸接枝的PCL偶联的L-半胱氨酸(以“Cys-片”表示)

b)如实施例1中所述的，丙烯酸接枝的PCL的PCL片，在500μl LB培养基中用片检测对革兰氏阴性细菌大肠杆菌(菌株D21)培养物的细菌生长的抑制。

所述培养物的初始滴度为513000cfu/ml，培养物(参比，无片)的培养后滴度为28000000cfu/ml。

与培养后的培养物(无片存在)相比，在培养期间培养Cys-片的培养物在培养基中显示出125倍的生长抑制。与培养后的培养物(无片存在)相比，在培养丙烯酸片的培养物中未观察到抑制。

对于附着细菌的测试，通过分析活细菌对片的附着性，与仅有丙烯酸的片相比，Cys-片显示出对活细菌数目的100倍的抑制。

对于仅有丙烯酸的片，观察到置于LB琼脂上的环绕片边缘的细菌生长；对于Cys-片则未观察到。

实施例10

在1000μl细菌培养物中用PE片测试了对在金黄色葡萄球菌(B5381，临床分离物)培养物中细菌生长的抑制。

片的功能性表面为：

a)根据实施例3，偶联到丙烯酸接枝的片上的L-半胱氨酸(在PBS中预清洗/预培养1.5小时)

b)根据实施例3，偶联到丙烯酸接枝的片上的L-半胱氨酸(在PBS中预清洗/预培养2天)

c)根据实施例3，偶联到丙烯酸接枝的片上的L-半胱氨酸(在PBS中预清洗/预培养7天)

d)根据实施例3，丙烯酸接枝的片。

培养培养物的初始滴度为400000cfu/ml，培养后的滴度为10000000cfu/ml。

用预清洗1.5小时的Cys-片培养的培养物表现出25倍的细菌生长抑制；用预清洗7天的Cys-片培养的培养物表现出17倍的细菌生长抑制。

当测试细菌附着性时，预清洗2天和7天的Cys-片表现出为丙烯酸片约1/50的活细菌。

总之，认为由于cys-偶联的抑制在至少7天时间是持续存在的。

实施例11

在1000μl LB培养基中用聚乙烯(PE)片测试对在革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(B5381，临床分离物)培养物中细菌生长的抑制。功能性表面为：

a)根据实施例3，偶联到丙烯酸接枝的片上的L-半胱氨酸(以″Cys-片″表示)

b)根据实施例3，丙烯酸接枝的片(以丙烯酸片表示)

c)根据实施例3，仅电子束辐照的片(以“EB片”表示)

分析了两个平行的对照实验，其中在培养基中溶解的L-半胱氨酸为50μg/ml和5μg/ml。

将起始培养物设定为所述测定方法中的10倍(超过4百万cfu/ml)，其允许以暴露给细菌的极值评价活细菌的附着效应。

与培养后的培养物相比，Cys-片培养物表现出1/8的生长。与培养后的培养物相比，EB片未表现出明显的降低。

对于溶解的L-半胱氨酸的培养物，未发现抑制。

在细菌附着的分析中，与丙烯酸片相比，Cys-片显示了1/25到1/40的附着活细菌，与EB片相比显示了1/21到1/27的附着活细菌。

环绕所述片边缘的细菌生长只在丙烯酸和EB片上见到。

Cys-偶联对活金黄色葡萄球菌对所述片的附着的作用仍是明显和显著的，尽管系统被淬灭。

实施例12

在1000μl细菌LB培养基中用PE片检测了对在大肠杆菌(菌株D21)培养物中细菌生长的抑制。测试的表面为：

a)根据实施例3，偶联到丙烯酸接枝的片上的L-半胱氨酸(以“Cys-片”表示)

b)根据实施例3和7，偶联到丙烯酸接枝的片的N-乙酰基-半胱氨酸(以“乙酰基-Cys-片”表示)

c)根据实施例3，丙烯酸接枝的片(以“丙烯酸”片表示)

所有的片在PBS中预培养过夜。

培养物的起始滴度为1000000cfu/ml，培养物的培养后滴度(无片)为50000000cfu/ml。

在培养期间，与培养后的培养物(无片存在)相比，Cys-片在培养基中显示出45倍的生长抑制。乙酰基-Cys-片在培养基中显示出10倍的抑制。在存在丙烯酸片的培养物中，未检测到抑制。

当研究细菌附着性时，Cys-片显示出丙烯酸片1/70的活细菌而乙酰基半胱氨酸片显示出丙烯酸片1/7的活细菌。

在所有丙烯酸片周围均检测到环绕所述片边缘的细菌生长，在乙酰基-Cys-片周围部分地检测到环绕所述片边缘的细菌生长，而在Cys-片周围则未观察到细菌。

实施例13

对于偶联有：

b)根据实施例3和6，经由氨基基团偶联到丙烯酸接枝的PE片上的L-半胱氨酸(以“氨基偶联的Cys-片”表示)

c)根据实施例3，丙烯酸接枝的片(以“丙烯酸片”表示)的片，在1000μl细菌培养物中用PE片测试对在大肠杆菌(菌株D21)培养物中细菌生长的抑制。

所有的片在无菌LB培养基中预培养过夜。

培养物的起始滴度为680000cfu/ml，培养物的培养后滴度(无片)为32000000cfu/ml。

在培养期间，与培养后的培养物(无片存在)相比，Cys-片在培养基中显示出26倍的细菌生长抑制。氨基偶联的Cys-片和丙烯酸片在培养基中均未显示出抑制。

当测试细菌附着性时，Cys-片显示出丙烯酸片的1/100到1/140的附着活细菌，而氨基偶联的Cys-片与丙烯酸片相比，未显示出附着活细菌数目的减少。

对于所有氨基偶联的片和丙烯酸片，在清洗程序后在LB琼脂板上的分析，均检测到环绕所述片边缘的明显的细菌生长，而对于Cys-片则未检测到。

实施例14

通过极端细菌浓度，在1000μl LB培养基细菌培养物中用PE片测试对在金黄色葡萄球菌(B5381，临床分离物)培养物中细菌生长的抑制。

片上的功能性表面为：

b)根据实施例3，偶联到丙烯酸接枝的片上的高半胱氨酸(以“高半胱氨酸片”表示)

c)根据实施例3，丙烯酸接枝的片(以“丙烯酸片”表示)

培养物的起始滴度为4000000cfu/ml，培养物的培养后滴度(无片)为80000000cfu/ml。

与无片存在的培养后的培养物相比，Cys-片在培养基中显示出13倍的生长抑制。高半胱氨酸片在培养基中显示出20倍的抑制。

当在极端暴露条件下测试活细菌的附着性时，与丙烯酸片相比Cys-片显示出约1/4到1/10的附着活细菌，而高半胱氨酸片与丙烯酸片相比显示出1/2到1/4的活细菌。对于半胱氨酸和高半胱氨酸片而言均获得了可检测的效果，尽管在淬灭条件下。

实施例15

通过使用存放3年的表面修饰的导管，测试抗菌作用的长期持久性和稳定性。

用在1000μl LB培养基细菌培养物中的聚氨酯导管Vygon(实施例4)测试了对在大肠杆菌D21培养物中细菌生长的抑制。这些半胱氨酸修饰的导管样品与参比表面(根据实施例4，EB辐照的和丙烯酸接枝的)在环境条件下已存放3年。在进行该实验之前，将这些导管(20mm长)切成两半，得到10mm长的两段。片上的功能性表面为：

d)根据实施例4，偶联到丙烯酸接枝的Vygon导管上的L-半胱氨酸，以Cys-导管表示(在PBS中预清洗/预培养2小时)

e)EB辐照的Vygon导管(部分实施例1和实施例4)(在PBS中预清洗/预培养2小时)

当无导管样品存在时，培养培养物的起始滴度为264000cfu/ml，培养后的滴度为52000000cfu/ml。

与无片的后-培养物相比，培养Cys-导管的培养物(预清洗2小时)显示出34倍的细菌生长抑制。

与无导管的培养后的培养物相比，培养EB辐照的Vygon导管的培养物(预清洗2小时)(对照材料)不显示出抑制。

当测试细菌附着性时，与EB辐照的Vygon导管相比，Cys-导管显示出1/130的活细菌。

总之，延长产品的存放时间不决定性地影响表面修饰的抗菌性质。

实施例16

在800μl LB培养基细菌培养物中，用聚氨酯导管表面测试了对在金黄色葡萄球菌(B5381，临床分离物)培养物中的细菌生长的抑制。将片在PBS中预清洗1-5小时。将这些导管切成5×4mm的段，并根据实施例1以1Mrad的剂量进行预辐照。根据实施例2进行接枝。

片上的功能性表面为：

a)基本上按照在实施例1和2中描述的步骤制备PDEA-偶联的丙烯酸接枝的样品，并作以下改变：5分钟的接枝时间和接枝后超声浴清洗15分钟。

b)按照在实施例2中描述的步骤，将在(a)中得到的PDEA样品用于偶联L-半胱氨酸。

对样品(a)和(b)的抗菌作用进行比较以考察在偶联所述半胱氨酸之前PDEA组分的可能的显著影响。培养物的起始滴度为800000cfu/ml，培养物的培养后滴度(无片)为19000000cfu/ml。在样品类型(a)和(b)之间没有观察到培养后滴度的不同。当测试活细菌附着性时，与PDEA-偶联的丙烯酸样品(a)相比，Cys-丙烯酸样品(b)显示出约1/35的附着活细菌。本实验证明Cys-组分对于抗菌作用是必需的。

实施例17

在500μl LB培养基细菌培养物中用聚氨酯(PUR)片测试了对在金黄色葡萄球菌(B5381)培养物中细菌生长的抑制。将这些样品切成5×5mm的方片。

片上的功能性表面为：

(a)以1Mrad EB辐照PUR样品，并在35℃用丙烯酸接枝3分钟，以温的自来水和MilliQ水大量地清洗，其中包括超声洗浴15分钟，随后根据在实施例1和2中描述的步骤，与PDEA偶联最后与L-半胱氨酸偶联。这些样品以“PDEA-Cys”表示。

(b)按以下制备表面：使PDEA和等摩尔量的三乙胺与等摩尔量的丙烯酰氯(acryloylcloride)在干燥溶剂中反应。通过在乙醚(diethyleter)中沉淀而纯化产品2-(2-吡啶基二硫)-乙基丙烯酰胺，此处以“PDEAm”表示，重复此步骤直到获得无色澄清的滤液。真空下干燥此浅黄色产物。通过以氩气吹扫10分钟，将含有2.2mmol(0.5g)PDEAm和16.1mmol(1g)丙烯酸的5ml MilliQ水中的溶液脱气，并恒温于35℃。将EB辐照的PUR样品(a)从液氮储器中取出并浸入该溶液中，其中所述氩气流也用作搅拌装置。在8分钟后中断所述接枝反应，以温的自来水和MilliQ水充分地清洗样品，所述清洗包括超声洗浴15分钟。根据在实施例1和2中描述的步骤偶联L-半胱氨酸。在真空下干燥样品。这些样品以“PDEAm-Cys”表示。

在PDEA-Cys(a)和PDEAm-Cys(b)之间做比较。培养物的起始滴度为500000cfu/ml，培养后的培养物滴度(无片)为20000000cfu/ml。

与无片存在的培养物相比，PDEA-Cys(a)显示出45倍的培养后滴度抑制。

与无片存在的培养物相比，PDEAm-Cys(b)显示出50倍的培养后滴度抑制。

当使用上述方法测试活细菌附着性时，PDEA-Cys(a)和PDEAm-Cys(b)显示出对活细菌菌落形成单位相等的抑制。在所述清洗程序结束后如在LB琼脂板上分析的，对于任何所述样品，都未检测到环绕所述片边缘的细菌生长。

实施例18

在LB培养基中的500μl细菌培养物中用PCL片测试了对在革兰氏阳性巨大芽孢杆菌(菌株Bm11)培养物中细菌生长的抑制。功能性表面为：

a)如在实施例1和2中，偶联到丙烯酸接枝的PCL的L-半胱氨酸(以“Cys-片”表示)

b)如在实施例1中，丙烯酸接枝的PCL

培养物的起始滴度为292000cfu/ml，培养物的培养后滴度(无片)为9850000cfu/ml。

在培养期间，与对比的培养后的培养物(无片存在)相比，对于有Cys-片的管，在培养片的培养物中具有13.5倍的细菌生长抑制。与无片存在的对照相比，仅有丙烯酸的片在培养物中不显示对细菌生长的抑制。

与丙烯酸片相比，Cys-片对活细菌附着性的测试显示出1/10到1/13的活细菌。

在所述清洗程序结束并培养过夜后，当把所述片置于LB板上时，仅对于偶联有丙烯酸的片发现环绕所述片边缘的细菌生长。

实施例19

通过在来自健康血液提供者的外周血单核细胞(PBMC)中培养不同的功能性片测定了细胞毒性。

测试的样品为：

a)Cys-片(实施例2)

b)丙烯酸片(实施例1)

c)电子束辐照的片(部分实施例1)

(以“EB片”表示)

d)对照细胞(在无任何片存在下培养)

分别在24、48和69小时后进行测定。

对所有的片类型和对照，在PBMC中培养18小时后，死亡细胞的数量为4％～7％，表明在Cys-片、丙烯酸片、EB片或在无任何片存在下培养的对照细胞之间没有显著的差别。不论片是否已在PBS中预洗过，都可看到此结果。

培养48小时以后，在未清洗的Cys-片和丙烯酸片中的死细胞部分为10％～15％。与无任何片存在的对照细胞相比，在清洗过的Cys-片、丙烯酸片、EB片之间，在死细胞数量上没有明显差别(5-6％)。

通过以促细胞分裂剂植物血球凝集素(PHA)刺激，研究了T细胞的增殖。将来自健康血液提供者的PBMC分离，以PHA(Sigma，St Louise，MO，美国)刺激细胞，分三份进行。在刺激后2天将1μCi甲基-3H-thymedine(Amersham，LIFE SCIENCE)以脉冲方式加入(pulsedwith)培养物。根据生产商的说明书，在第二天利用平板收割机(Harvester996，Tomtec，Hamden，Connecticut，USA)在过滤器上收获细胞，并在自动计数器(1450MicroBeta Trilux,WALLAC，Sweden AB)上计数。结果以每分钟计数表示(cpm)。在任何片类型和对照之间，在T细胞增殖上均未发现差别。

为考察源于PBMC的单细胞分化为巨噬细胞的能力是否受到暴露于不同类型片的负面影响，进行了以下测试。

将来自健康血液提供者的PBMC：s以在含有2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素(Gibco BRL,Grand Island，NY)、10％AB血清的Iscove′s修饰的培养基中10-18×10⁶细胞/ml的浓度涂布于petri皿(Primaria，Falcon，Becton Dickinson)上，并在37℃培养过夜。在第二天除去未附着的细胞。大量地清洗培养物，通过加入24小时的分上清液(allo-supernatant)刺激富集单核细胞的细胞。如下制备分上清液(allosupernatant)：混合来自不同血液提供者的PBMC：s并在Iscove＇s完全培养基中培养24小时。其后，收集上清液，通过离心澄清并用于刺激单独的单核细胞培养物。在刺激后2～3天，用Iscove＇s培养基清洗该培养物，随后在60％AIM-V培养基、30％Iscove＇s修饰的培养基和10％AB血清中培养，并加入L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素(完全60/30培养基)。每3-4天将培养基更换为新鲜的完全60/30培养基。

在对照细胞或暴露于不同类型片的细胞之间，未发现显著的差别，即在所有的Petri皿中均可见完好的或健康的巨噬细胞培养物。

实施例20

另外也通过将片放置于血琼脂上或者恰在其顶部或者通过将所述片推入所述血琼脂中测量不同片类型的溶血效应，而分析了细胞毒性。

测试的样品为：

a)未清洗的Cys-片(实施例3)

b)以LB培养基预处理的Cys-片(实施例3)

c)以胎牛血清(FCS)预处理的Cys-片(实施例3)

d)Cys-导管Vygon(实施例4)

在37℃培养过夜后测量细胞溶解区的直径。阳性对照位于每个血琼脂板的中心。在检查时，移开片并分析所述片位置的下面区域和周围区域。

对于分析的片类型，根本不可检测到没有细胞溶解。

对于未清洗的Cys-片，从所述片边缘的约4～5mm处可见黄色。对于预处理的片(或者用LB培养基或者用胎牛血清(FCS))，在所述片最接近边缘处可注意到非常弱的颜色变化。

结论是Cys-片对于人血细胞没有明显的细胞毒性作用。

Claims

1.包含具有共价键结合的半胱氨酸化合物的基底的抗微生物剂。

2.根据权利要求1的抗微生物剂，其中所述半胱氨酸化合物通过S-S桥经由间隔分子结合到所述基底；所述间隔基包含碳链，所述碳链任选地插入一个或多个杂原子，例如O、S、N、P和Si；所述链任选地被一个或多个烷基基团取代，优选被具有1～6个碳原子的低级烷基基团、羟基基团或烷氧基基团取代。

3.根据权利要求1或2任一项的抗微生物剂，其具有式基底-X-L-S-S-(半胱氨酸部分)，其中

-L为选自包括(CH₂)_m、(CH₂CH₂O)_n(CH₂)_p或(CH(CH₃)CH₂O)_n(CH₂)_P的组的间隔分子，其中m为1-20，优选1-12、1-8或1-6；其中n为1-1000，优选1-100或3-50，且p为1-20，优选1-12、1-10或1-6；所述(CH₂)_p部分与所述二硫桥结合并可任选地位于(CH₂CH₂O)_n或(CH(CH₃)CH₂O)部分之间；

-X为来自所述弎底和L之间的偶联反应的连接基团

-此处，半胱氨酸部分指包含半胱氨酸、半胱氨酸类似物或半胱氨酸衍生物的半胱氨酸化合物的残基。

4.根据权利要求1-3中任一项的抗微生物剂，其中所述基底为不可溶的或可溶的。

5.根据权利要求1-4的抗微生物剂，其具有式

(1)R₁-X-L-S-S-(半胱氨酸部分)

其中

R₁为所述基底，例如有机化合物或聚合物或固体基底

X为通过化学偶联反应得到的化学基团

L为(CH₂)_m或(CH₂CH₂O)_n(CH₂)_p，

m为1-8，n为1-100且p为1-10，

其中当与所述(CH₂CH₂O)_n同时出现时，所述(CH₂)_P部分位于所述(CH₂CH₂O)_n部分和所述二硫键之间。

6.根据权利要求1-5的抗微生物剂，其中-L-S-S-(半胱氨酸部分)具有一种以下的结构：

其中R₂、R₃为氢或者具有1～25个、优选1-18个或1-6个碳原子的烷基，优选甲基，以任意组合；q为1-20，优选1-12或1-6

其中R₂、R₃、R₄为具有1～25个、优选1-18个或1-6个碳原子的烷基取代基，特别是甲基，以任意组合；q具有1-20范围内的值，优选1-12、1-10或1-6。

7.根据权利要求1-6的抗微生物剂，其中如权利要求6中式(2)所述的R₂或R₃之一可经由包含所述半胱氨酸部分的氮的酰胺键连接。

8.根据权利要求1-7的抗微生物剂，其中所述基底为固体表面。

9.根据权利要求1-8中任一项的抗微生物剂，用于防止或抑制革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌的生长和/或增殖。

10.根据权利要求1-9中任一项的抗微生物剂，用于防止或抑制革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、革兰氏阴性大肠杆菌(Escherichia coli)、或革兰氏阳性巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的生长和/或增殖。

11.一种与微生物接触和/或需要保持没有微生物累积和/或附着的基底，其特征在于所述表面涂敷有如权利要求1-10中限定的抗微生物剂。

12.根据权利要求1-11的基底，其中所述基底为选自以下的装置、设备和/或表面的一部分：(a)医疗装置，例如可应用于人或动物体外部的体外医疗装置、或可应用于人或动物体内部的体内医疗装置，(b)食品装置，和(c)其他装置，例如隐形眼镜、化妆品包装产品、淡水水箱和水管、用于存储其中在存储材料表面上的细菌生长是不希望的产品或材料的装置。

13.根据权利要求12的基底，其中所述装置选自用于烧伤伤口的人造皮肤，透析装置，耳引流装置，耳植入物，助听装置，心肺机管道，脑水肿引流，注射器，造口，伤口护理装置，缝合材料，导管，牙科产品，用于液体、溶液、输注、药物递送的胃肠外施用的管道或设备，体内植入物(骨、pro paradontit)，胰岛素泵，神经导向，起搏器，从体内引流(脓肿、腔、器官、术后)，腔内支架(在器官和组织内的血管和腔内)。

14.如权利要求1-10中定义的抗微生物剂用于防止或抑制基底和/或表面上微生物的生长和/或增殖的用途。

15.用于用抗微生物剂处理装置表面的部分的试剂盒，其在分离的隔室中包含：(a)权利要求1的抗微生物剂的前体，所述前体具有式：

Z-L-S-S-(半胱氨酸部分)

其中L、m和半胱氨酸部分如上定义，且Z为能与化合物或自由基反应以得到化学偶联残基X的配体官能团，和(b)用于将所述前体共价键结合到表面的必需试剂，其中所述试剂盒还包括使用该试剂盒的说明。

16.生产抗微生物装置的方法，其包括以下步骤：

i)提供装置

ii)使配体-L-S-S-(半胱氨酸化合物)共价键结合到所述装置表面的官能团，或

共价键结合到可溶的基底，所述可溶的基底随后固定于所述装置的表面上。