CN105555806B - 医用或兽医用装置的表面修饰 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含共价固定化且交联的琼脂糖涂层的医用或兽医用装置、其生产方法和交联的琼脂糖涂层。

Description

医用或兽医用装置的表面修饰
技术领域
本发明涉及包含共价固定化且交联的琼脂糖涂层的医用或兽医用装置、其生产方法和交联的琼脂糖涂层。
背景技术
腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是用于患有严重肾病之患者的有效的居家(home-based)透析处理形式，并且其已在许多国家中用作血液透析的显著更低成本的替代方案。然而，与导管相关的并发症可危害PD的成功，所述导管通常由硅酮制成。生物污着(biofouling)(以蛋白质吸附和细胞黏附的形式)和微生物(细菌和真菌)附着到高度疏水的硅酮表面上可导致网膜包裹(omental wrapping)和感染，这分别是PD流出失败的首要原因和PD患者死亡的第二常见原因。此外，当与血液接触时，血小板黏附和活化诱导的血栓形成可导致PD导管的腔内阻塞。可以认为PD导管是PD患者的“生命线”，并且导管相关的并发症是广泛PD使用的首要障碍。自从在20世纪60年代中期引入了坦克霍夫导管(Tenckhoffcatheter)，对新PD导管设计的开发尚未在降低感染和提高PD患者的生存率方面显示出令人信服的改进。1因此，近些年来，对导管表面进行修饰以改进其防污着(antifouling)、抗菌和血液相容性(hemocompatible)特性已经吸引了越来越多的关注。2
另一种类型的导管，中央静脉导管(通常由聚氨酯或硅酮制成)在临床上广泛用于施用药物、抽取血液样品和血液透析处理。在这些留置导管的内部或外部上可容易地发生微生物定殖，并且由使用此类血管接入装置导致的导管相关的血流感染(catheter-associated bloodstream infection，CABSI)仍然是主要的临床问题，对患者发病率、死亡率和医疗保健成本有不利影响。在使用留置导尿管(通常由尿硅酮制成)时出现类似的情况，导尿管是医院和疗养院设施中的标准医用装置。导管相关的尿路感染(catheter-associated urinary tract infection，CAUTI)是世界范围内最常见的医院获得性感染(hospital-acquired infection)。因此，抑制微生物定殖的导管表面修饰将高度地有利于抗击CABSI和CAUTI。
通过共价键合拴系功能性聚合物涂层为修饰导管表面性质提供了有效途径。合成的亲水聚合物聚(乙二醇)(PEG)及其衍生物是最广泛使用的防污着和抗菌材料。然而，PEG受困于一些限制：PEG涂覆的表面由于其与蛋白质相互作用而不能将蛋白质吸附降低到非常低的水平，并且它们在氧气和过渡金属离子的存在下易于氧化降解，这在体内限制了其长期防污着和抗菌性能。已经广泛研究了另一些合成聚合物(例如聚(丙烯酰胺)、聚(磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯)、3，4聚(羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯)和聚(拟肽))用作防污着涂层。天然聚合物(与其来自石油化学制品的合成对应物相比)提供了有吸引力的替代。壳聚糖及其衍生物是用于抗菌涂层的最广泛使用的天然聚合物，但是其防污着性能由于其与蛋白质的强相互作用而受限。5已经报道常用的抗凝剂肝素(Heparin，HEP)提供在体内和体外均可降低感染的抗菌涂层。6然而，HEP的抗菌作用仍是有争议的。一些研究报道HEP不显著降低金黄色葡萄球菌(S.aureus)的生物膜形成并且甚至可刺激该过程。7，8此外，已发现蛋白质降解酶(例如链霉蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶)的固定化降低表面上的蛋白质吸附。9，10
琼脂糖(agarose，AG)是中性的多糖，其来自琼脂。作为食品及药物管理局(Foodand Drug Administration，FDA)批准的成分，AG广泛地用于生物医学应用的多个领域，例如神经再生、药物和基因递送以及牙印模(dental impression)，原因是其生物相容性、稳定性和惰性。在较早的报道中，膜或水凝胶形式的AG显示出对奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)细菌黏附11和海洋污着(marine fouling)12的抵抗。
目前，为了长期改善生物材料(例如硅酮、聚氨酯和钛)所缺乏的防污着、抗菌/抗真菌和血液相容性特性，用共价固定化的天然聚合物涂层对其进行表面修饰。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了医用或兽医用装置，所述装置在其表面的至少一部分上包含共价固定化且交联的琼脂糖涂层。
在本发明的一个优选实施方案中，所述涂层在生物材料表面(例如硅酮、聚氨酯或钛表面)上提供，所述生物材料表面理想地为医用级生物材料表面。
除了在金属表面，在生物材料表面修饰中频繁遇到的问题是疏水性恢复(hydrophobic recovery)，这是由于生物材料聚合物的高柔性和低玻璃化转变温度所造成的疏水性生物材料链段和涂层聚合物的重定向和迁移引起的。
因此，本文中提及的固定化且交联的涂层是防止聚合物材料的疏水性恢复和/或相对于现有涂层来说稳定或具有改进的稳定性的涂层。因此，在本工作中，琼脂糖涂层被交联以防止疏水性恢复并改善其稳定性。
更优选地，所述涂层在所述装置与患者接触的至少一部分上提供。
在本发明的另一个优选的实施方案中，通过引入以下对琼脂糖进行修饰以促进琼脂糖涂层的共价固定化和交联：丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺、硅烷、硫醇、叠氮化物、炔、乙烯基吡啶或乙烯基咪唑基团或者这些基团的衍生物，例如但不限于：丙烯酸酐、甲基丙烯酰氯、N-羟乙基(甲基)丙烯酰胺、1-2-羧乙基-4-乙烯基吡啶溴化物和1-羟乙基-3-乙烯基咪唑溴化物以及本领域技术人员已知的其他衍生物。在一个实施方案中，如此修饰的琼脂糖(例如丙烯酸化的琼脂糖)用于所述涂层。
作为替代或补充，所述涂层还包含肝素和理想地经修饰的肝素。最优选地，肝素用以下进行修饰以使其被共价并入到交联的AG涂层中：甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺、硅烷、硫醇、叠氮化物、炔、乙烯基吡啶或乙烯基咪唑基团或者这些基团的衍生物，例如但不限于丙烯酸酐、甲基丙烯酰氯、N-羟乙基(甲基)丙烯酰胺、1-2-羧乙基-4-乙烯基吡啶溴化物和1-羟乙基-3-乙烯基咪唑溴化物以及本领域技术人员已知的其他衍生物。
因此，理想地，用丙烯酸酯基团(例如甲基丙烯酸酯基团)修饰的HEP共价并入到交联的AG层以进一步改进装置的血液相容性。
更优选地，所述涂层为1至10μm厚并且最优选为2、3、4或5μm厚，如本文中所证明的，2μm的涂层有效地实现期望的生物学特性，所以涂层理想地为2μm或约2μm。
更优选地，交联的琼脂糖涂层中肝素的量为1至15μg/cm2，最理想地为1、2、3、4或5μg/cm2，更理想地为1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8或2.9μg/cm2，并且更优选2.6μg/cm2。我们发现，如果固定化的肝素为2.6μg/cm2或约2.6μg/cm2，则涂层(特别是琼脂糖组分)的蛋白质排斥特性得以保留。此外，如果固定化肝素的表面浓度限制到为2.6μg/cm2或约2.6μg/cm2或更少，则琼脂糖和肝素的抗菌效力将与单独琼脂糖没有显著差异。
我们发现，当共价地固定化在医用级生物材料表面(例如，例如但不限于导管表面(例如导尿管、腹膜透析导管或中央静脉导管)上提供的硅酮表面)上时，琼脂糖(以及还理想地肝素)具有改善的抗菌、抗真菌、防污着和血液相容性特性。出人意料地，我们发现，与原始(pristine)硅酮上的那些相比，在根据本发明的经琼脂糖修饰的表面上的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌二者的黏附和生物膜形成分别降低了98％和＞99％。无论下表面是否由硅酮、聚氨酯或钛制成，均获得这些结果。经琼脂糖修饰的表面还抑制真菌生物膜的发生。优选1、2、3、4或5μm厚的交联琼脂糖涂层，更理想地优选约2μm厚的涂层，因为其在溶菌酶溶液中老化30天之后并且还在高压灭菌之后是稳定的并且保持其抗微生物效力。此外，我们发现，交联的琼脂糖涂层可有效地抵抗非特异性蛋白质吸附以及成纤维细胞和血小板黏附。有利地，在涂层中共固定化(co-immobilization)约2.6μg/cm2的肝素通过抑制血小板活化、延长血浆复钙时间(plasma recalcification time，PRT)和降低溶血的程度进一步改善了血液相容性，同时保持了涂层的防污着效力。
根据本发明的第二方面，提供了用于制造医用或兽医用装置的方法，所述装置在其表面的至少一部分上具有共价固定化且交联的琼脂糖涂层，所述方法包括：
i.使所述装置的表面氧化；
ii.将所述经氧化的表面暴露于经修饰的琼脂糖；以及
iii.使所述表面固化(curing)。
在本发明的一个优选方法中，通过添加以下对所述琼脂糖进行修饰：丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺、硅烷、硫醇、叠氮化物、炔、乙烯基吡啶或乙烯基咪唑基团、或者本领域人员公知的这些基团的衍生物。
在本发明的另一个优选方法中，氧化所述表面包括将所述表面暴露于氧等离子体(oxygen plasma)或臭氧。作为替代或补充，使用利用气体(例如氩、氢、氮或氨)进行的等离子体处理、然后暴露于空气来氧化所述表面。再次，所述表面可以使用电晕放电处理(corona discharge treatment)或γ照射来氧化所述表面。
在本发明的另一个优选方法中，将所述经氧化的表面暴露于经修饰的琼脂糖包括：使用水溶液(例如丙烯酸化琼脂糖的水溶液，通常但不排他地为5wt.％)并且理想地还将该溶液涂覆在所述生物材料的表面上，理想地使用旋涂法(spin-coating procedure)或通过将生物材料浸入溶液中。
在本发明的另一个优选方法中，所述固化使用紫外(ultra violet，UV)光或加热进行。理想地，固化在脱气环境中进行。在使用UV来固化表面的情况下，UV的量决定了固化的量，并且我们发现，随UV照射时间延长(例如从15分钟至120分钟)，经固定化的琼脂糖的接枝密度提高。
在本发明的另一个优选方法中，还将所述经氧化的表面暴露于经修饰的肝素。理想地，使用丙烯酸化琼脂糖和甲基丙烯酸化肝素溶液的混合物。优选地，丙烯酸化AG和/或甲基丙烯酸化HEP在溶液中的浓度为1至5wt％，理想地5wt.％。
优选地，涂层中甲基丙烯酸化肝素的量为约2.6μg/cm2。根据本发明的另一方面，提供了导管，所述导管在其表面的至少一部分上具有共价固定化且交联的琼脂糖涂层。
根据本发明的另一方面，提供了导管，所述导管在其表面的至少一部分上具有共价固定化且交联的琼脂糖和肝素涂层。
在本发明的该方面中，所述肝素的浓度为约2.6μg/cm2。
在前述方面的任一项中，所述导管是腹膜透析导管或中央静脉导管或导尿管。
根据本发明的另一方面，提供了适于防止细菌或真菌感染的医用或兽医用装置，其包括如本文中所述的在其表面的至少一部分上具有共价固定化且交联的琼脂糖涂层的医用装置。
根据本发明的又一个方面，提供了适于防止网膜包裹的医用或兽医用装置，其包括如本文中所述的在其表面的至少一部分上具有共价固定化且交联的琼脂糖涂层的医用装置。
根据本发明的另一方面，提供了如本文中所述的交联的琼脂糖涂层，其用于以共价固定化的方式施加至医用或兽医用装置表面的至少一部分，来防止生物污着、细菌或真菌感染。
在本发明的所附权利要求书中和前述说明书中，除非上下文中因为语言表达或必须暗示而另有说明，否则词语“包含”或变化形式例如“包括”或“含有”以包容性含义使用，即列出所陈述特征的存在，但在本发明的各实施方案中不排除存在或添加另外的特征。
在本说明书中引用的所有参考文献(包括任何专利或专利申请)通过引用并入本文。不承认任何参考文献构成现有技术。此外，不承认任何现有技术构成本领域公知常识的一部分。
本发明的各方面的优选特征可以结合任何其他方面进行描述。
通过以下实施例，本发明的另一些特征将变得明显。一般而言，本发明延伸至本说明书(包括所附权利要求书和附图)中所公开的特征中任意的新颖的一个特征或任意的新颖的特征组合。因此，结合本发明的一个具体方面、实施方案或实施例描述的特征、整数、特性、化合物或化学部分应理解为可应用于本文中所述的任何其他方面、实施方案或实施例，除非与其不相容。
此外，除非另有说明，本文中所公开的任何特征可被用于相同或相似目的的替代特征所替换。
本申请的整个说明书和权利要求书中，除非上下文中另有说明，否则没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。特别地，说明书中没有数量词修饰的名词应理解为表示一个/种或更多个/种，除非上下文中另有说明。
本申请的整个说明书和权利要求书中，琼脂糖表示为AG，并且肝素表示为HEP。
现在通过举例且仅具体参考以下来描述本发明的一个实施方案，其中：
主附图
图1示意性地举例说明了硅酮表面的修饰，通过氧等离子体或臭氧处理在硅酮表面上产生过氧化物和羟基过氧化物，以充当用于随后AG聚合物链之固定化的锚定位点(步骤(1))，以及UV或加热诱导的丙烯酸化AG和甲基丙烯酸化HEP的固定化和交联(步骤(2))。
图2，(a，a’)硅酮-g-AG4、(b，b’)硅酮-g-HEP和(c，c’)硅酮-g-AG-HEP1膜的XPS宽扫描(widescan)和S 2p芯能级谱(core-level spectra)。插图示出对应膜的N 1s芯能级谱。在交联AG接枝的硅酮膜、硅酮-g-AG4的宽扫描谱中Si 2p和Si 2s信号的强度(图2(a))与原始硅酮膜的信号强度(图S1(a))相比显著降低，表明AG成功地接枝到硅酮膜上。
图3，(a)硅酮-g-AG4和(b)硅酮-g-AG-HEP1膜截面的FESEM图像。标尺条为1μm。
图4，在暴露于金黄色葡萄球菌的PBS混悬液(108个细胞/mL)4个小时后，(a)原始硅酮、(b)硅酮-g-AG4、(c)硅酮-g-AG-HEP1和(d)硅酮-g-HEP膜表面的SEM图像。标尺条为10μm。
图5，在含有107个细菌细胞/mL的生长培养基中孵育48小时后，(a-c)金黄色葡萄球菌和(d-f)大肠杆菌(E.coli)生物膜在(a，d)原始的、(b，e)硅酮-g-AG4和(c，f)硅酮-g-AG-HEP1膜上的SEM图像。标尺条为10μm。
图6，在含有107个细菌细胞/mL的生长培养基中孵育48小时后，通过涂布平板法(spread plate method)确定在原始的和经修饰的膜表面上每cm2黏附的(a)金黄色葡萄球菌和(b)大肠杆菌细胞的定量计数。＊与原始硅酮相比的显著性差异(P＜0.05)。#与各个所制备的膜相比的显著性差异(P＜0.05)。
图7，在含有107个细菌细胞/mL的生长培养基中孵育48小时后，(a)原始钛箔、(b)AG修饰的钛箔、(c)AG-HEP修饰的钛箔、(d)原始聚氨酯膜、(e)AG修饰的聚氨酯膜和(f)AG-HEP修饰的聚氨酯膜上大肠杆菌生物膜的SEM图像。标尺条为10μm。
图8，用1.0mg/mL的纯蛋白质溶液处理膜4小时后，在原始硅酮、硅酮-g-AG4、硅酮-g-AG-HEP1和硅酮-g-HEP膜上的BSA和FBG吸附。＊与原始硅酮相比的显著性差异(P＜0.05)。
图9，用3T3成纤维细胞(2×105个细胞/mL)孵育24小时后，(a)原始硅酮、(b)硅酮-g-AG4、(c)硅酮-g-AG-HEP1和(d)硅酮-g-HEP膜表面的光学显微术图像。标尺条为100μm。(e)使用MTT测定定量分析每cm2膜表面黏附的3T3成纤维细胞。＊与原始硅酮相比的显著性差异(P＜0.05)。
图10，用富血小板血浆(platelet-rich plasma)孵育1小时后，(a)原始硅酮、(b)硅酮-g-AG4、(c)硅酮-g-AG-HEP1和(d)硅酮-g-HEP膜表面的SEM图像。(a-d)及其插图中的标尺条分别为10μm和5μm。(e)相对于原始硅酮表面，经修饰的硅酮表面上的血小板黏附。＊与原始硅酮相比的显著性差异(P＜0.05)。
图11，在原始硅酮、硅酮-g-AG4、硅酮-g-AG-HEP1和硅酮-g-HEP膜表面上的(a)PRT和(b)溶血程度。＊与原始硅酮相比的显著性差异(P＜0.05)。
补充附图
图S1，原始硅酮膜的XPS(a)宽扫描和(a’)S 2p芯能级谱。(a’)的插图示出原始硅酮的N 1s芯能级谱。
图S2，UV诱导的接枝时间对硅酮-g-AG膜上黏附的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌细胞之数目的影响。在暴露于各细菌的PBS混悬液(108个细胞/mL)4小时后，使用涂布平板法定量膜表面上黏附的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌细胞的数目。
图S3，固定化肝素的浓度对硅酮-g-AG-HEP膜上黏附的金黄色葡萄球菌之数目的影响。在暴露于金黄色葡萄球菌的PBS混悬液(108个细胞/mL)4小时后，使用涂布平板法定量膜表面上黏附的金黄色葡萄球菌细胞的数目。
图S4，在含有107个细菌细胞/mL的生长培养基中孵育48小时后，通过涂布平板法确定在每cm2原始硅酮表面和经琼脂糖修饰的(有或没有肝素)膜表面上黏附之铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)细胞的定量计数。＊与原始硅酮相比的显著性差异(P＜0.05)。
图S5，在含有107个真菌细胞/mL的生长培养基中孵育24小时后，(a)原始硅酮和(b)硅酮-g-AG4膜上光滑念珠菌(C.glabrata)生物膜的SEM图像。标尺条为10μm。
图S6，以(a)8小时和(b)18小时的加热时间制备的AG接枝的PD导管段之截面的SEM图像。(a)和(b)中的标尺条分别为2μm和5μm。(c)在含有107个细菌细胞/mL的生长培养基中孵育48小时后，通过涂布平板法确定在每cm2原始PD导管段表面和经修饰的PD导管段表面上黏附之大肠杆菌细胞的定量计数。＊与原始PD导管相比的显著性差异(P＜0.05)。
图S7，在含有107个细菌细胞/mL的生长培养基中孵育48小时后，通过涂布平板法确定在每cm2原始导尿管段表面和经修饰的导尿管段表面上黏附之大肠杆菌细胞的定量计数。＊与原始导尿管相比的显著性差异(P＜0.05)。
图S8，在含有107个细菌细胞/mL的生长培养基中孵育48小时后，通过涂布平板法确定在每cm2原始PD导管段表面和经修饰的PD导管段表面上黏附之大肠杆菌细胞的定量计数。＊与原始PD导管相比的显著性差异(P＜0.05)。
图S9，用1.0mg/mL的FBG蛋白溶液预处理4小时后，(a，c)原始的和(b，d)硅酮-g-AG4膜上的(a，b)金黄色葡萄球菌黏附和(c，d)金黄色葡萄球菌生物膜的SEM图像。标尺条为10μm。
图S10，原始硅酮、硅酮-g-AG4、硅酮-g-AG-HEP1和硅酮-g-HEP膜对3T3成纤维细胞之生存力的影响。生存力表示为相对于由对照(没有任何膜存在下孵育的3T3成纤维细胞)所获得之结果的百分比。
图S11，当(通常但不排他地)由硅酮制成的医用或兽医用装置通过与固定化且交联的琼脂糖涂层相同的涂层(特别地但不排他地，通过添加肝素进一步修饰的涂层)修饰时实现的有利作用的图解展示。
表1通过XPS确定的表面组成和经聚合物修饰之硅酮膜的水接触角。
2.实验部分
2.1材料
医用级硅酮膜购自Bioplexus Inc.(Ventura，CA，USA)。所有硅酮QuintonTM腹膜透析(PD)导管均购自Tyco International Ltd.(Princeton，NJ，USA)。钛(Ti)箔购自Goodfellow Inc.(Huntingdon，UK)。聚氨酯膜购自Central Polymer Engineering Supply(Singapore)。所有的硅酮Foley导尿管均购自C.R.Bard Inc.(Murray Hill，NJ，USA)。琼脂糖(AG)购自Bio-Rad Laboratories(Hercules，CA，USA)。肝素钠(HEP)和3-[4，5-二甲基-噻唑-2-基]-2，5-二苯基溴化四氮唑溴化物(MTT)购自Alfa Aesar Co.(Ward Hill，MA，USA)。丙烯酰氯(97％)、甲基丙烯酸酐(94％)、牛血清白蛋白(BSA)、牛血浆纤维蛋白原(FBG)和所使用的所有溶剂(分析级)购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。大肠杆菌(Escherichia coli，ATCC DH5α)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC 25923)、光滑念珠菌(Candida glabrata，ATCC CBS138)、和3T3小鼠成纤维细胞购自American Type Culture Collection(Manassas，VA，USA)。铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PAO1)购自National Collection of Industrial Food and MarineBacteria(NCIMB，Bucksburn，Aberdeen，Scotland)。使用文献中所描述的程序类似制备丙烯酸化的AG。13简而言之，在100℃下将1.0g AG溶解在25mL的N，N-二甲基乙酰胺(DMAC)中。在AG完全溶解后，将溶液在冰水浴中冷却至0℃。然后，将2.5mL DMAC中的0.125mL丙烯酰氯在搅拌下逐滴添加到AG溶液中。允许反应在0℃进行1小时，在25℃另外进行4小时。丙烯酸化的AG产物在过量体积的丙酮中沉淀并用丙酮彻底清洗，随后在减压下干燥。使用与文献中所述类似的方法制备甲基丙烯酸化的HEP。14将200mg HEP溶解在10mL双蒸水中。然后，将10μL甲基丙烯酸酐添加到溶液中，使用4M NaOH溶液将该溶液的pH调整至8.5。将溶液在搅拌下在0℃反应过夜。在过量体积的冷乙醇中沉淀甲基丙烯酸化的HEP产物，随后使用透析管(分子量截断值为1000，Spectrum Laboratories Inc.，Rancho Dominguez，CA，USA)相对于水进行透析，持续72小时。透析后，将甲基丙烯酸化HEP溶液冷冻干燥。
2.2制备琼脂糖(AG)、肝素(HEP)和AG-HEP接枝的膜和导管
为了制备交联AG接枝的硅酮膜(硅酮-g-AG)，将医用级硅酮膜切成2×2cm2的块并在异丙醇、乙醇和双蒸水中超声清洁，每个步骤持续10分钟。使洁净的硅酮膜在AnatechSP100等离子体系统中经受氧等离子体5分钟。然后将经氧等离子体处理的膜暴露于大气另外10分钟以促进在经等离子体处理的表面上形成过氧化物基团。这些过氧化物基团充当活性位点以起始随后的UV诱导的固定化和交联反应，从而将丙烯酸化AG接枝到经氧化的表面上。将200μL丙烯酸化AG水溶液(5wt.％)滴到经等离子体处理的硅酮膜表面上，所述膜放置在SCS P6206旋涂仪上。以1000rpm的速度进行旋涂，持续60秒。然后对膜的另一面重复该过程。将具有经旋涂之丙烯酸化AG的硅酮膜放置在Pyrex玻璃管中并用氩气脱气30分钟。将玻璃管密封并用UV光在Riko旋转光化学反应器(Model RH400-10W)中照射15、30、60和120分钟以分别获得Silicone-g-AG1、硅酮-g-AG2、硅酮-g-AG3和硅酮-g-AG4膜(表1)。照射后，将硅酮-g-AG膜用60℃的双蒸水彻底清洗24小时以除去物理吸附的丙烯酸化AG。类似地，分别使用甲基丙烯酸化的HEP溶液和具有如表1中所示之不同比例的丙烯酸化AG和甲基丙烯酸化HEP溶液的混合物制备经HEP修饰的硅酮膜(硅酮-g-HEP)和经AG-HEP修饰的硅酮膜(硅酮-g-AG-HEP)。类似地，使用未经修饰的AG溶液制备未交联AG涂覆的硅酮膜(硅酮-c-AG)。溶液中丙烯酸化AG、甲基丙烯酸化HEP和未修饰AG的浓度固定在5wt.％。
用于经交联AG接枝的Ti箔和AG-HEP接枝的Ti箔以及聚氨酯膜的制备方法与用于AG接枝之硅酮膜的那些类似。将Ti箔切割成1×1cm2的块，然后依次在Kroll试剂(4.0％HF、7.2％HNO3、88.8％水)、二氯甲烷、丙酮和水中超声清洁，每一步持续10分钟，然后用AG或AG-HEP接枝，而将聚氨酯膜切成2×2cm2的块并在乙醇和水中超声清洁，每一步持续10分钟。之后，采用如上所述的旋涂和UV照射。
为了制备AG和AG-HEP接枝的硅酮导管，将PD导管切成6cm的段并如上所述用异丙醇、乙醇和水进行清洗。为了活化导管段的腔外表面和腔内表面二者，使用臭氧替代氧等离子体。在用氧-臭氧气体混合物(由Azcozon臭氧发生器(Model VMUS-4PSE)产生，氧流入速率为60L/小时，臭氧产生速率为约3.6g/小时)预处理20分钟之后，将经臭氧处理的导管段引入含有如上所述各试剂(5wt.％的AG或AG-HEP)的Pyrex玻璃管中并用氩气脱气30分钟。将玻璃管密封，在油浴中加热至70℃，然后在70℃维持8小时。反应后，将AG或AG-HEP修饰的导管段用双蒸水在60℃清洗24小时。类似地，通过臭氧预处理、暴露于各试剂和UV照射，用AG和AG-HEP接枝导尿管段(1cm长)。
通过向含有10mL丙烯酸化AG水溶液(5wt.％)的Pyrex管添加5mg 4，4’-偶氮双(4-氰基戊酸)来制备交联AG水凝胶(没有硅酮膜)。用氩气吹扫30分钟后，将烧瓶密封并在Riko旋转光化学反应器中用UV光照射120分钟。照射后，用乙醇和双蒸水在60℃清洗交联AG水凝胶24小时，随后冷冻干燥。类似地，使用丙烯酸化AG和甲基丙烯酸化HEP溶液的混合物(丙烯酸化AG∶甲基丙烯酸化HEP＝9∶1(w/w))制备交联AG-HEP水凝胶。通过以下制备未交联的AG凝胶，将未经修饰的AG溶液加热至120℃并冷却至25℃，随后冷冻干燥。
2.3微生物黏附和生物膜形成测定
在生长培养基中过夜培养细菌(胰蛋白酶大豆肉汤用于金黄色葡萄球菌，营养肉汤用于大肠杆菌，并且溶原性肉汤用于铜绿假单胞菌)。然后将含有细菌的生长肉汤以2,700rpm离心10分钟以除去上清。用PBS(pH7.4)清洗细菌细胞并以108个细胞/mL的浓度重悬在PBS中，如从540nm的光密度(OD)所估计的(540nm处的OD为0.1等同于基于平板涂布计数的约108个细胞/mL)。在37℃，将1×1cm2大小的原始硅酮膜和经修饰的硅酮膜放置在24孔板中并用1mL细菌混悬液覆盖4小时。在细菌黏附过程之后，将膜用PBS清洗三次以除去未黏附的细菌。为了定量黏附的细菌，如文献所述进行涂布平板法。15简而言之，将具有黏附细菌的膜放到2mL PBS中并超声处理7分钟，随后涡旋30秒以将细菌细胞释放到PBS中。将细菌混悬液连续稀释并铺到琼脂平板上。培养过夜后，通过对琼脂平板上的菌落数目进行计数来定量活细菌细胞的数目。为了扫描电子显微术(scanning electron microscopy，SEM)观察，将膜上黏附的细菌用PBS中3vol.％戊二醛在4℃固定过夜。在用25％、50％、75％和100％乙醇连续脱水(每次10分钟)后，将膜在减压下干燥，涂覆铂，并在SEM下观察。为了评估原始硅酮和经修饰硅酮上黏附细菌的生存力，用组合染料(LIVE/DEAD BacLight细菌生存力试剂盒)对膜进行染色并在配备100W Hg灯的Leica DMLM显微镜下观察。
为了评估金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌的生物膜形成，将过夜细菌培养肉汤用其相应的生长培养基稀释到107个细胞/mL的浓度。在37℃，将原始的和经修饰的基材(1×1cm2膜或1cm导管段)放置在24孔板中并用1mL细菌混悬液覆盖48小时以允许生物膜生长。生物膜生长阶段之后，用PBS将基材清洗三次。在SEM下观察膜，使用如上所述的涂布平板法定量膜和导管段(腔内表面和腔外表面二者)上生物膜细菌细胞的数目。
为了评估光滑念珠菌的生物膜形成，将过夜真菌培养肉汤稀释到107个细胞/mL的浓度。在37℃，将原始的和经修饰的基材(1×1cm2膜)放置在24孔板中并用1mL真菌混悬液覆盖。1.5小时之后，将真菌混悬液除去并用PBS清洗基材两次。然后在基材上添加1mL的新鲜培养基，在37℃保持24小时以允许真菌生物膜生长。在生物膜生长阶段之后，将基材用PBS中的3vol.％戊二醛固定并经历用25％、50％、75％和100％乙醇连续脱水并在SEM下观察。
2.4稳定性测试
通过使膜在37℃在溶菌酶水溶液(10μg/mL)中老化30天来评估硅酮膜上AG和AG-HEP接枝层的稳定性。选择溶菌酶浓度来模拟人血清中的浓度。在老化阶段之后，如上所述进行膜上细菌生物膜形成的评估以测试涂层的稳定性。处于比较的目的，还进行了溶菌酶溶液中所制备的AG和AG-HEP水凝胶(没有硅酮膜)的降解。100mg的干AG和AG-HEP水凝胶在37℃在10mL溶菌酶溶液(10μg/mL)中老化30天。老化阶段之后，使用透析管(分子量截断值为3500，Spectrum Laboratories Inc.，Rancho Dominguez，CA，USA)相对于水对水凝胶进行透析，持续72小时，随后冷冻干燥。重量损失(weight loss)的程度如下计算：
WL＝(WB-WA)/WB×100％ (1)
其中WB和WA分别是老化之前和之后的水凝胶重量。
通过在两块生肉(猪肉)之间牵拉导管段研究摩擦力下经修饰的PD导管的稳定性。将肉固定在长度为5cm的两个PMMA平板之间。将6cm长的经修饰导管段从一侧插入到两块肉之间并从另一侧拉出。将这一过程重复5次。在摩擦测试之后，将导管段切成1cm长并如上所述在导管段上进行细菌生物膜形成的测定以测试接枝层的稳定性。还对6cm经修饰导管段进行弯曲测试，其中该段向上和向下弯曲成圆15次。在弯曲测试之后，将导管的中间3cm(经受最高的弯曲应力)切成1cm长的三段，然后在这些段上进行细菌生物膜形成的测定。
2.5蛋白质吸附
首先将2×2cm2大小的原始硅酮膜和经修饰硅酮膜在CPBS(柠檬酸盐-磷酸盐缓冲盐水、PBS和0.01M柠檬酸钠，pH 7.4)中平衡1小时，然后在37℃浸入纯BSA或FBG蛋白质溶液(CPBS中的1.0mg/mL)中4小时。在该蛋白质吸附阶段之后，分别用CPBS和双蒸水清洗膜两次。使用与文献中所述类似的方法，采用修改的染料相互作用法使用Bio-Rad蛋白质染色试剂(Catalog No.500-0006)确定吸附在膜上之蛋白质的量。16简而言之，将不同已知浓度的蛋白质溶液(0.4mL)添加到10mL的5倍稀释的贮藏染料溶液。10分钟后，以5000rpm离心15分钟，然后使用在465nm的蛋白质-染料溶液之上清液的吸光度来获得标准校准曲线。为了定量吸附到膜上的蛋白质，将膜放到10mL的染料溶液中。浸入3小时后，移出膜。将剩余的溶液离心并在465nm测量上清液的吸光度。由标准校准曲线计算吸附到膜上之蛋白质的量。
2.6细胞毒性测定
使用标准MTT测定研究经修饰硅酮膜的细胞毒性。使用补充有10％胎牛血清、1mML-谷氨酰胺、100IU/mL青霉素的DMEM培养3T3成纤维细胞。将含有密度为104个细胞/mL之DMEM 3T3成纤维细胞的1mL培养基放置到24孔板的各个孔中。然后将板在95％空气和5％CO2的潮湿气氛中于37℃孵育24小时。用新鲜培养基替换培养基之后，将1×1cm2大小的膜轻轻的放在孔中的细胞层上。使用不含膜的完全生长培养基进行对照试验(无毒对照)。在37℃另外孵育24小时后，除去每个孔中的培养基和膜。然后向每个孔添加900μL的培养基和100μL的MTT溶液(PBS中5mg/mL)。孵育4小时后，除去MTT溶液和培养基并添加1mL二甲基亚砜(DMSO)以溶解甲结晶(formazan crystal)。然后在BIO-TEK微孔板读取仪(ModelPowerwave XS)上测量570nm处的吸光度。结果表示为相对于在对照试验中所获得之吸光度的百分比。
2.7细胞黏附
将1×1cm2大小的原始硅酮膜和经修饰的硅酮膜放置在24孔板中。添加含有密度为2×105个细胞/mL之3T3成纤维细胞的1mL培养基并孵育24小时。在孵育阶段之后，用培养基润洗膜三次以除去未黏附细胞。使用Leica DMLM显微镜查看具有黏附细胞的膜表面。为了对黏附的3T3成纤维细胞进行定量，将具有黏附细胞的膜放置在24孔板中并进行MTT测定。通过以下来建立标准校准曲线：在24孔板中接种已知数目的3T3成纤维细胞并于37℃孵育4小时，随后进行MTT测定。由标准校准曲线计算黏附到膜上的3T3成纤维细胞之数目。
2.8血小板黏附
将从健康兔收集的新鲜血液立即与3.8wt％柠檬酸钠溶液以9∶1(v/v)的比例混合。通过将血液在8℃以700rpm离心10分钟获得富血小板血浆(Platelet-rich plasma，PRP)。用PBS以1∶1(v/v)的比例稀释PRP，并将0.1mL经稀释PRP引入到1×1cm2的硅酮膜表面上。在37℃孵育1小时后，将膜用PBS清洗三次。然后将黏附血小板用PBS溶液中的3vol％戊二醛在4℃固定过夜。在用10％、25％、50％、75％、90％和100％乙醇连续脱水(每次10分钟)后，将膜在减压下干燥，涂覆铂，并在SEM下观察。通过在相同放大倍数(×2,000)通过代表性SEM图像计数的黏附血小板总数定量膜上血小板的数目。17从经修饰的膜获得的结果相对于从原始硅酮获得的结果进行归一化。
2.9血浆复钙时间(PRT)
如上所述制备与3.8wt％柠檬酸钠溶液混合的来自健康兔的新鲜血液。通过将血液在8℃以3,000rpm离心20分钟获得贫血小板血浆(platelet poor plasma，PPP)，并将0.1mL的PPP引入到2×2cm2硅酮膜的表面上。所述膜在37℃孵育10分钟后，向硅酮膜上的PPP添加0.1mL 37℃的0.025M CaCl2水溶液。监测PPP溶液的凝结，通过将用硅酮涂覆的不锈钢丝钩手动浸入到溶液中以检测纤维蛋白丝(fibrin thread)。在第一次出现丝样纤维蛋白时记录PRT。
2.10溶血测试
将1×1cm2大小的硅酮膜和10mL的PBS引入到离心管中。管在37℃孵育1小时后，添加0.2mL的经稀释兔血液(8mL血液与10mL的PBS混合)并将管在37℃再孵育1小时。使用PBS和双蒸水分别作为阴性对照和阳性对照。然后将管以1,500rpm离心10分钟并用HITACHI分光光度计(Model U-2800)在545nm处测量上清液的吸光度。如下计算溶血率(hemolysis rate，HR)：
HR＝(AS-AN)/(AP-AN) (2)
其中AS、AN和AP分别是含有膜、阴性对照和阳性对照之溶液的上清液的吸光度。
2.11表征
由于导管的弯曲表面(curved surface)，无法在其表面上容易地对黏附的细菌细胞实施表征方法，例如X射线光电子能谱法(X-ray photoelectron spectroscopy，XPS)和接触角测量以及SEM观察。因此，选择平的医用级硅酮片作为模型表面，在修饰后，进行涂层表征的研究。在具有单色Al KαX射线源(1486.71eV光子)的AXIS UltraDLD光谱仪(KratosAnalytical Ltd.，UK)上通过XPS分析硅酮膜的表面化学组成。通过SEM(JEOL，Model5600LV)观察硅酮膜表面，并分别通过场发射扫描电子显微镜术(FESEM，JEOL，Model JSM-6700)和SEM观察膜和导管的截面。使用双面碳胶带(double-sided carbon tape)将样品固定在SEM金属桩(metal stub)上并溅射涂覆薄的铂层以增强图像的对比度和质量，然后用SEM和FESEM进行观察。使用如先前所述的甲苯胺蓝方法对经修饰膜上固定化肝素浓度进行定量。18在室温，在Rame-Hart伸缩式测角仪(Rame-Hart telescopic goniometer，Model100-00-(230))中使用3μL水滴通过液滴法(sessile drop method)测量不同表面的静态接触角。对于每个样品，在表面的不同区域进行三次测量，并且每次用一式三份的样品进行至少三次独立的测试。
2.12统计学分析
结果报告为平均值±标准差(SD)并使用单因素方差分析(ANOVA)和Tukey事后检验在统计学上进行评估。接受P＜0.05为统计学显著。
3.结果和讨论
3.1表面表征
在图1中图示举例说明了在硅酮表面上共价接枝和交联AG和AG-HEP聚合物的过程。通过氧等离子体或臭氧处理在硅酮表面上产生的过氧化物或羟基过氧化物充当锚定位点，用于后续聚合物链的固定化。19在图2中示出了AG、HEP和AG-HEP接枝的硅酮膜的XPS宽扫描、S 2p芯能级谱和N 1s芯能级谱。在硅酮-g-AG4膜的宽扫描谱中Si 2p和Si 2s信号的强度(图2(a))与原始硅酮膜(图S1(a))的信号强度相比显著降低，表明成功地将AG接枝到硅酮膜上。如所预期的，在硅酮-g-AG4的S 2p芯能级谱和N 1s芯能级谱中没有可辨别的硫和氮信号(分别为图2(a’)及其插图)，因为这些元素不存在于硅酮或丙烯酸化AG聚合物中。如表1所示，通过XPS确定原始的硅酮和聚合物修饰之硅酮的表面元素组成。硅酮-g-AG4膜的[Si]/[C]比例为约0.08∶1并且远低于原始硅酮的比例(0.52∶1)。可以从[Si]/[C]比例定量地评估AG接枝的程度，因为Si仅存在于硅酮中并且不存在于丙烯酸化AG中。如表1所示，随着UV照射时间从15分钟延长至120分钟，硅酮-g-AG1、硅酮-g-AG2、硅酮-g-AG3和硅酮-g-AG4膜的[Si]/[C]比例降低，表明固定化AG之接枝密度提高。
对于硅酮-g-HEP膜，120分钟的UV诱导甲基丙烯酸化HEP接枝后，在S 2p芯能级谱和N 1s芯能级谱(分别为图2(b’)及其插图)中存在硫和氮信号。此外，硅酮-g-HEP膜的[Si]/[C]比例降低至0.14∶1，这也确认了硅酮膜上HEP的成功接枝。如通过甲苯胺蓝法确定的，固定化HEP的表面浓度为12.1μg/cm2硅酮-g-HEP膜。
对于硅酮-g-AG-HEP1膜，在S 2p芯能级谱和N 1s芯能级谱中可辨别硫和氮信号(分别为图2(c’)及其插图)。硅酮-g-AG-HEP1膜的[Si]/[C]比例降低至0.10∶1。图3示出了经AG和AG-HEP修饰膜之截面的FESEM图像。可以清楚地观察到硅酮-g-AG4上接枝的AG层(图3(a)中的上层)的厚度和硅酮-g-AG-HEP1上AG-HEP层(图3(b)的上层)的厚度为约2μm，确认AG和AG-HEP成功地接枝到硅酮表面上。接枝的AG层的厚度可通过改变UV照射时间而不同。当UV照射时间降低至60分钟和15分钟，接枝AG层的厚度分别降低至0.8μm和0.3μm。随着反应溶液中甲基丙烯酸化HEP的进料比(feed ratio)的提高，固定化HEP的表面浓度提高(与表1中硅酮-g-AG-HEP1和硅酮-g-AG-HEP2的固定化HEP浓度相比)，这也被表1中这些膜的[S]/[C]和[N]/[C]比例提高所确认。
原始的硅酮和聚合物修饰硅酮之水接触角的改变也提供了硅酮膜表面已经被成功修饰的支持证据。如表1所示，原始硅酮膜是疏水的，水接触角为107°。用AG、HEP和AG-HEP接枝后，经修饰之硅酮膜变成亲水的，具有低得多的水接触角。此外，可以观察到，经AG修饰之硅酮膜的接触角随UV反应时间的延长而提高，表明固定化AG的接枝密度提高，这与这些膜的表面[Si]/[C]比例所揭示的结果一致(表1)。
3.2微生物黏附和生物膜形成测定
形成对细菌黏附的表面抗性是防止细菌感染的关键步骤。在黏附到表面上后，细菌将在生长培养基的存在下增殖并形成生物膜。生物膜继而保护细菌不受宿主天然防御系统以及抗生素的影响。对于植入的装置(例如PD导管)，插入后的前几个小时被认为是重要的时期，其中所引入的病原体仍然处于静止阶段，并且宿主免疫系统可主动地中和入侵的病原体。使用模型细菌(革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌)评价经聚合物修饰之硅酮膜降低细菌黏附的效力，因为它们是引起PD相关感染的最常见物种。图4示出原始硅酮膜和经修饰之硅酮膜上黏附的金黄色葡萄球菌细胞的SEM图像。在PBS中孵育4小时后，在原始硅酮上观察到大量的金黄色葡萄球菌(图4(a))。在用AG、AG-HEP和HEP对硅酮膜的表面进行修饰之后，黏附的金黄色葡萄球菌的数目显著降低(图4(b-d))。公知的是，微生物因为疏水相互作用偏好附着至疏水性表面。20因此，经AG、AG-HEP和HEP修饰之硅酮抑制金黄色葡萄球菌黏附的能力可归因于表面亲水性的改进，这是由亲水性聚合物的接枝导致的。因此，AG和HEP聚合物是抗黏附的，但并非杀菌的。经AG修饰之硅酮的抗黏附特性强烈依赖于固化定AG层的接枝密度，这与UV诱导的接枝时间相关(图S2)。抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌黏附的效力随着UV照射时间的延长而提高。120分钟的UV诱导接枝后，所得的硅酮-g-AG4分别将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌黏附降低约98％和约99％。
HEP在降低金黄色葡萄球菌黏附方面不如AG有效(比较图4(d)与图4(b))。因此，在经AG-HEP修饰之硅酮上接枝大量的HEP将导致黏附的细菌数目提高。如果固定化HEP之表面浓度被限制到2.6μg/cm2或更低，则硅酮-g-AG-HEP的抗菌效力将没有与硅酮-g-AG4的抗菌效力显著不同(比较图S3中具有不同表面浓度之HEP的硅酮-g-AG-HEP膜上黏附的细菌数目)。
细菌和真菌生物膜是PD透析中腹膜炎和其他PD导管相关感染的主要原因。类似地，在中央静脉导管和导尿管上的生物膜形成分别提高了CABSI和CAUTI的风险。在本工作中，在含有107个细菌细胞/mL的生长培养基中孵育48小时后评估经聚合物修饰的硅酮膜在抑制细菌生物膜形成中的效力。图5示出在原始硅酮表面和经修饰硅酮表面上细菌生物膜的SEM图像。从图5(a)和5(d)可以看出，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌二者在原始硅酮膜上都容易形成厚的生物膜。在硅酮表面上接枝AG之后，观察到细菌生物膜显著降低。在硅酮-g-AG4膜和硅酮-g-AG-HEP1膜(分别为图5(b)和5(c))上没有明显的金黄色葡萄球菌生物膜，但存在一些细菌集群(cluster)。硅酮-g-AG4膜和硅酮-g-AG-HEP1膜在防止大肠杆菌生物膜形成方面甚至更有效，仅可观察到几个单独的细菌细胞(分别为图5(e)和5(f))。这些结果表明，与大肠杆菌生物膜相比，更难以防止在硅酮表面上形成金黄色葡萄球菌生物膜，这与先前的报道21一致。然而，原始硅酮膜和经修饰之硅酮膜上黏附的细菌数目的定量显示，与原始膜相比，经修饰的硅酮(硅酮-g-AG4和硅酮-g-AG-HEP1)将黏附的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌数目分别降低了约2.4和约3.3个数量级(图6(a)和6(b))。除了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，还评估经AG和AG-HEP修饰之硅酮膜上的革兰氏阴性铜绿假单胞菌生物膜形成，因为铜绿假单胞菌是PD透析中感染的另一个主要原因。与原始的硅酮相比，经AG和AG-HEP修饰之硅酮膜上黏附的铜绿假单胞菌细胞数目降低超过2个数量级(图S4)。因此，细菌黏附和生物膜形成测定指示AG和AG-HEP接枝层有效地对抗革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌物种二者。
真菌感染在死亡率和发病率方面是比细菌感染更严重的PD相关感染，在受感染的PD患者中的死亡率多至44％。22评估AG修饰之硅酮膜在抑制真菌生物膜形成中的效力并且在图S5中示出SEM图像结果。如图S5(a)所示，光滑念珠菌容易在原始硅酮膜上黏附并形成多个集群。在硅酮表面上表面接枝AG后，观察到真菌细胞和集群的数目显著降低(图S5(b))，指示AG涂层有效地抑制真菌生物膜形成。
在图7中示出了用经AG和AG-HEP修饰之Ti箔和聚氨酯膜暴露于生长培养基中的大肠杆菌所获得的相应结果。将该图中的结果与图5(d)至5(f)相比，可以得出以下结论：在抑制生物膜形成方面，AG和AG-HEP接枝层在Ti和聚氨酯上与在硅酮上同等有效。
除了平硅酮膜表面，通过以下将AG和AG-HEP聚合物接枝到管状PD导管表面上：臭氧处理，随后加热诱导聚合物层的固定化和交联。通过改变加热时间，AG接枝层的厚度可不同。在图S6(a)和S6(b)中举例说明这一点，其示出分别使用8小时和18小时加热时间制备的经AG修饰之PD导管的截面。这些加热时间分别导致约2μm和约5μm厚的AG接枝层。图S6(c)示出在培养基中孵育48小时后原始导管表面和经修饰导管表面上黏附的大肠杆菌的数目。与用硅酮-g-AG4膜所获得的结果类似，经AG和AG-HEP修饰的PD导管使黏附的细菌细胞数目降低超过3个数量级。此外，发现在具有2μm和5μm聚合物接枝层的经修饰导管上的黏附细菌细胞数目没有显著差异，指示超过2μm厚度的AG和AG-HEP涂层的抗菌效力没有显著的改进。还测试了通过以下将AG和AG-HEP聚合物接枝到管状导尿管表面：臭氧处理，随后UV诱导固定化。图S7示出经修饰之导尿管段也非常显著地降低了细菌定殖。
3.3稳定性
如果将涂层施加到导管上，其稳定性是一项重要的需求，因为导管可能长时间放置在身体中。通过以下评估经AG和AG-HEP修饰之硅酮膜的稳定性：将膜在溶菌酶溶液中于37℃老化30天后在其上进行细菌生物膜测定。如图6(a)中所示，在生物膜测定之后黏附的金黄色葡萄球菌数目稍微提高，但对于老化的AG和AG-HEP修饰的膜不显著(P＞0.05)。对于大肠杆菌获得了类似的结果(图6(b))。此外，生物膜形成测定还示出，在121℃高压灭菌20分钟后，硅酮-g-AG4和硅酮-g-AG-HEP1保持其抗菌特性(图6(a)和6(b))。这些结果表明，硅酮上的交联AG和AG-HEP层是稳定的。老化30天后接枝层的稳定性还指示交联的AG和AG-HEP层能够防止硅酮的疏水性恢复并维持其抗菌效力。
用交联的AG和AG-HEP水凝胶和未交联的AG水凝胶在溶菌酶溶液中进行30天的类似老化试验。对于交联的AG和AG-HEP水凝胶，分别观察到13.5％和11.8％的重量损失。未交联的AG水凝胶示出22.7％的更高重量损失。用老化的硅酮-c-AG膜(未交联的AG涂覆的硅酮膜)进行生物膜测定(图6)也确认未交联的AG涂层不如交联的涂层稳定。此外，在121℃高压灭菌20分钟后，硅酮-c-AG膜不具有抗菌特性，因为未交联的AG层仅物理吸附到膜上并且其在高压灭菌过程中熔化。
当导管插入到体内时，其将遇到摩擦力和弯曲力。在经历这样的力之后，使用细菌生物膜形成测定评价PD导管上交联的AG和AG-HEP层的稳定性，结果在图S8中示出。经AG和AG-HEP修饰之导管示出良好的稳定性，因为在摩擦和弯曲测试之后，经修饰的导管上黏附的细菌数目没有显著改变。
3.4蛋白质吸附和细胞黏附
网膜包裹是PD治疗中PD流出失败的首要原因。网膜(omentum)是主要的腹膜防御器官，并且响应于炎症或异物，其将黏附并隔离开受影响的区域。PD导管表面上的蛋白质吸附对于网膜包裹是关键因素，因为认为网膜黏附的机制涉及在攻击部位纤维蛋白渗出物的形成，这吸引成纤维细胞和白细胞主动迁移并最终导致受影响区域被包裹。在这个工作中，研究在经修饰硅酮膜上两种蛋白质FBG和BSA的吸附。如图8所示，在原始硅酮膜上吸附的FBG和BSA的量分别为约2.9μg/cm2和约1.9μg/cm2。在用AG接枝后，蛋白质吸附非常显著地降低。硅酮-g-AG4降低约98％的BSA和FBG吸附，并且硅酮-g-AG-HEP1膜示出类似的蛋白质吸附降低。已知亲水性AG聚合物上蛋白质的非特异性吸附是非常低的，并且AG及其衍生物经常用作蛋白质分离的支持材料以使非特异性吸附最小化。因此，在硅酮-g-AG4膜和硅酮-g-AG-HEP1膜上观察到的蛋白质吸附降低可归因于AG层。另一方面，硅酮-g-HEP膜在降低蛋白质吸附方面不太有效(吸附的BSA和FBG分别降低约51％和约80％)。这是由于HEP能够与某些种类的蛋白质(包括BSA和FBG)相互作用。然而，如果(例如硅酮-g-AG-HEP1膜上)固定化HEP较低(2.6μg/cm2)，则保留了AG的蛋白质排斥特性(与硅酮-g-AG4相比，图8)。
使用FBG和金黄色葡萄球菌研究原始硅酮膜和硅酮-g-AG4膜上蛋白质吸附对后续细菌黏附和生物膜形成的影响。图S9(a)和S9(b)示出用FBG预处理后在这些膜上黏附的金黄色葡萄球菌的SEM图像。与图4(a)相比，可以在图S9(a)中观察到细菌细胞的集群提高，这与更早报道的结果一致，所述结果示出在聚吡咯表面上预吸附的FBG增强金黄色葡萄球菌黏附到表面上和凝集。这归因于由金黄色葡萄球菌细胞表达的FBG结合蛋白(凝集因子)。用FBG预处理后硅酮-g-AG4膜上黏附的细菌细胞数目轻微地升高(将图S9(b)与4(b)比较)，但这些细胞保持为单独单元而非成簇。图S9(c)和S9(d)示出用FBG预处理的原始硅酮膜和硅酮-g-AG4膜上金黄色葡萄球菌生物膜的SEM图像。无论FBG存在与否，在原始硅酮膜上形成厚的生物膜。然而，在FBG预处理后，硅酮-g-AG4膜仍能够抵抗生物膜形成，因为FBG吸附的程度低(图8)。
在细胞黏附测定中，选择3T3小鼠成纤维细胞作为模式哺乳动物细胞来研究其与经修饰硅酮膜的相互作用。图9(a-c)示出在原始硅酮表面和经修饰硅酮表面上黏附的3T3成纤维细胞的光学显微术图像。大量的3T3成纤维细胞容易地黏附在原始硅酮表面上(图9(a))，而成纤维细胞在AG和AG-HEP修饰的表面上的黏附几乎被完全抑制(图9(b)和9(c))。从图9(d)还可以看出，在防止3T3成纤维细胞黏附方面，HEP不如AG和AG-HEP那样有效。与原始硅酮相比，经AG和AG-HEP修饰的硅酮分别降低了约92％和约93％的3T3成纤维细胞黏附，然而经HEP修饰的硅酮上的降低为约83％(图9(e))。在AG、AG-HEP和HEP修饰的硅酮膜上成纤维细胞黏附程度的差异可与其蛋白质排斥性质相关，因为已报道非特异性蛋白质吸附对于抑制细胞与材料表面的相互作用是关键的。
虽然已知AG和HEP是无毒的，但是需要测试经修饰硅酮膜的细胞毒性，因为所制备的AG和AG-HEP涂层旨在用于可植入装置。使用MTT测定用3T3成纤维细胞评价原始硅酮膜和经修饰硅酮膜的细胞毒性。在所有情况下，放置成与原始膜和经修饰膜接触24小时的3T3成纤维细胞的存活力大于95％(图S10)。与对照试验(不存在任何膜)相比，在细胞生存力中没有发现显著差异，指示这些膜没有细胞毒性或具有很低的细胞毒性。这些细胞生存力结果还确认了经修饰硅酮表面上细胞黏附的降低(图9)是由于聚合物涂层的抗黏附特性而非由于其细胞毒性。
3.5血液相容性测定
血液相容性是在人体中与血液接触的生物医学装置(例如中央静脉导管)的重要特性。表面上的血小板黏附和活化可诱导血液凝集和血栓形成。在PD中，这样的事件可导致腔内阻塞以及最终导致导管的流出失败。通过血小板黏附和活化、溶血和血浆复钙时间(PRT)测试评价经AG和AG-HEP修饰的硅酮膜的血液相容性。在图10(a-d)中示出了原始硅酮膜和经修饰硅酮膜上血小板黏附的SEM图像。血小板很容易黏附到原始硅酮表面上(图10(a))并且黏附的血小板是高度活化的，具有伪足和伸展(spreading)的特征。在将AG和AG-HEP接枝到硅酮上后，黏附的血小板的数目显著降低(图10(b)和10(c))。多种膜上黏附的血小板数目的定量比较(图10(e))示出与原始表面相比，经修饰硅酮表面上的血小板黏附降低了超过一个数量级。AG和AG-HEP修饰之硅酮膜上对血小板黏附的抗性再次归因于如上所讨论的其蛋白质排斥特性，因为血浆蛋白吸附(特别是血小板黏附促进蛋白(FBG)的吸附)在血小板黏附到生物材料表面上中发挥重要作用。然而，应当注意到，硅酮-g-AG4膜上的血小板仍然是活化的(图10(b)的插图)，表明AG涂层不能有效地抑制血小板活化。另一方面，AG-HEP涂层有效地防止了血小板的活化(图10(c)的插图)，并且这可以归因于AG-HEP层中HEP的存在。HEP通常用作抗凝剂并且已经被报道能够抑制血小板黏附和活化，这通过硅酮-g-HEP膜上低程度的血小板黏附和活化得到确认(图10(d))。
图11(a)示出了从原始硅酮膜和经修饰硅酮膜上的血液凝集测试所得到的PRT结果。将AG接枝到硅酮上导致PRT显著降低约13至约16分钟(P＜0.05)，而在AG接枝层中存在HEP的情况下，PRT进一步降低至约19分钟。已知HEP以高亲和力结合抗凝血酶III(antithrombin III，ATIII)，导致ATIII构象改变。随着这一构象改变，ATIII的活性位点更暴露，这极大地促进了ATIII抑制凝血蛋白酶的活性，继而延迟了纤维蛋白原向纤维蛋白的转变并抑制凝血。溶血是与血液接触的生物材料之血液相容性相关的另一个问题。图11(b)示出用原始硅酮膜和经修饰硅酮膜获得的溶血程度。原始硅酮的溶血程度为约1％。在AG、AG-HEP和HEP接枝后，经修饰硅酮膜示出显著更低的溶血程度(P＜0.05)，硅酮-g-AG4的0.77％到硅酮-g-HEP膜的0.56％。尽管根据美国材料与试验协会(American Society forTesting and Materials，ASTM)F 756-00标准，对于生物材料，2％的溶血程度被认为是非溶血性的并且原始硅酮满足这一要求，但经修饰的膜进一步降低了溶血的程度，继而改善硅酮的血液相容性。
4.结论
将AG和HEP聚合物共价固定化在医用级生物材料和导管表面上(腔内和腔外)以改善其抗微生物、抗真菌、防污着和血液相容特性特性。与原始硅酮相比，在经AG修饰的表面上，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的黏附和生物膜形成分别降低98％和＞99％。光滑念珠菌在AG修饰之表面上的生物膜形成也被抑制。通过类似方法在Ti箔、聚氨酯膜和硅酮导尿管表面上接枝的AG和HEP聚合物同样成功地抑制生物膜形成。约2μm厚的经交联AG涂层是稳定的并且在溶菌酶溶液中老化30天后以及还在高压灭菌后保持其抗菌效力。此外，AG涂层可有效地抵抗非特异性蛋白质吸附、成纤维细胞和血小板黏附。这分别在图8、9和10中举例说明。在AG涂层中共固定化2.6μg/cm2的HEP通过抑制血小板活化、延长PRT和降低溶血程度进一步改善血液相容性。伴随地，保留AG的抗菌和防污着效力。基于AG之涂层的有利的抗微生物、防污着和改善的血液相容性特性以及无细胞毒性为以下提供了有前景的机会：对抗感染和PD导管的网膜包裹以及当使用其他类型之导管时降低CABSI和CAUTI，等。
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表1经聚合物修饰之硅酮膜的水接触角和通过XPS确定的表面组成
a通过敏感度因数校正的XPS C 1s、Si 2p、S 2p和N 1s芯能级谱面积比计算的[C]∶[Si]∶[S]∶[N]摩尔比。
b通过丙烯酸化AG的UV诱导的固定化和交联制备的AG接枝的硅酮。
c通过丙烯酸化AG和甲基丙烯酸化HEP的UV诱导的固定化和交联制备的AG-HEP接枝的硅酮。
d通过甲基丙烯酸化HEP的UV诱导的固定化和交联制备的HEP接枝的硅酮。

Claims (44)

1.医用或兽医用装置，所述装置在其表面的至少一部分上包含共价固定化且交联的琼脂糖涂层。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述涂层在选自包含以下的组的表面上提供：生物材料、硅酮、聚氨酯和钛。
3.根据权利要求2所述的装置，其中所述表面是医用级表面。
4.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述涂层在所述装置与患者或动物接触的至少一部分上提供。
5.根据前述权利要求1-3中任一项所述的装置，其中所述琼脂糖通过引入以下进行修饰：丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺、硅烷、硫醇、叠氮化物、炔、乙烯基吡啶或乙烯基咪唑基团或者这些基团的衍生物。
6.根据权利要求5所述的装置，其中所述衍生物选自包含以下的组：丙烯酸酐、甲基丙烯酰氯、N-羟乙基(甲基)丙烯酰胺、1-2-羧乙基-4-乙烯基吡啶溴化物和1-羟乙基-3-乙烯基咪唑溴化物。
7.根据前述权利要求1-3中任一项所述的装置，其中所述涂层还包含肝素。
8.根据权利要求7所述的装置，其中所述肝素通过引入以下进行修饰：甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺、硅烷、硫醇、叠氮化物、炔、乙烯基吡啶或乙烯基咪唑基团或者这些基团的衍生物。
9.根据权利要求8所述的装置，其中所述衍生物选自包含以下的组：丙烯酸酐、甲基丙烯酰氯、N-羟乙基(甲基)丙烯酰胺、1-2-羧乙基-4-乙烯基吡啶溴化物和1-羟乙基-3-乙烯基咪唑溴化物。
10.根据前述权利要求1-3中任一项所述的装置，其中所述涂层为1至10μm厚。
11.根据权利要求10所述的装置，其中所述涂层的厚度选自包含以下的组：1、2、3、4或5μm。
12.根据权利要求11所述的装置，其中所述涂层为2μm。
13.根据权利要求7所述的装置，其中所述涂层中肝素的量为1至15μg/cm2。
14.根据权利要求13所述的装置，其中所述涂层中肝素的量选自包含以下的组：2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8或2.9μg/cm2。
15.根据权利要求14所述的装置，其中所述涂层中肝素的量为2.6μg/cm2。
16.根据前述权利要求1-3中任一项所述的装置，其中所述装置是导管。
17.根据权利要求16所述的装置，其中所述装置选自包含以下的组：腹膜透析导管、中央静脉导管和导尿管。
18.用于制造医用或兽医用装置的方法，所述装置在其表面的至少一部分上具有共价固定化且交联的琼脂糖涂层，所述方法包括：
i.使所述装置的表面氧化；
ii.将所述经氧化的表面暴露于经修饰的琼脂糖；以及
iii.使所述表面固化。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述琼脂糖通过添加以下进行修饰：丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺、硅烷、硫醇、叠氮化物、炔、乙烯基吡啶或乙烯基咪唑基团、或者这些基团的衍生物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述衍生物选自包含以下的组：丙烯酸酐、甲基丙烯酰氯、N-羟乙基(甲基)丙烯酰胺、1-2-羧乙基-4-乙烯基吡啶溴化物和1-羟乙基-3-乙烯基咪唑溴化物。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中使所述表面氧化包括使所述表面暴露于利用气体进行的等离子体处理，随后暴露于空气。
22.根据权利要求21所述的方法，其中使所述气体为氩、氢、氮或氨。
23.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中使所述表面氧化包括电晕放电处理或γ照射处理。
24.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述琼脂糖处于水溶液中。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述溶液包含5wt.％的所述琼脂糖。
26.根据权利要求24所述的方法，其中将所述溶液滴到或喷洒到所述装置的表面上。
27.根据权利要求26所述的方法，其中使用旋涂法使所述溶液沉积。
28.根据权利要求24所述的方法，其中将所述装置的表面浸入所述溶液中。
29.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述固化在脱气环境中进行。
30.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述固化使用紫外(UV)光或加热进行。
31.根据权利要求30所述的方法，在其中使用UV来固化所述表面的情况下，将所述表面暴露于UV持续15至120分钟的时间。
32.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中还使所述经氧化的表面暴露于经修饰的肝素。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述肝素通过引入以下进行修饰：甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺、硅烷、硫醇、叠氮化物、炔、乙烯基吡啶或乙烯基咪唑基团或者这些基团的衍生物。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述衍生物选自包含以下的组：丙烯酸酐、甲基丙烯酰氯、N-羟乙基(甲基)丙烯酰胺、1-2-羧乙基-4-乙烯基吡啶溴化物和1-羟乙基-3-乙烯基咪唑溴化物。
35.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述肝素是甲基丙烯酸化的。
36.根据权利要求32所述的方法，其中所述涂层中肝素的量为1至15μg/cm2。
37.根据权利要求36所述的方法，其中甲基丙烯酸化的肝素的量为2.6μg/cm2。
38.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述涂层沉积为1至10μm的厚度。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述涂层为2μm。
40.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述装置是导管。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述装置选自包含以下的组：腹膜透析导管、中央静脉导管和导尿管。
42.导管，所述导管在其表面的至少一部分上具有共价固定化且交联的琼脂糖涂层。
43.导管，所述导管在其表面的至少一部分上具有共价固定化且交联的琼脂糖和肝素涂层。
44.根据权利要求43所述的导管，其中肝素的量为2.6μg/cm2。
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