CN111902150B - 具有防污、抗血栓形成和抗菌性质的表面和涂层组合物及制备方法 - Google Patents

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Abstract

提供了涂层组合物、包含该涂层组合物的被涂覆的物品以及制备该涂层组合物和该被涂覆的物品的方法。在一些方面中，涂层组合物被应用到具有释放一氧化氮的性质的基底上。涂层组合物可以包括具有交联剂的共聚物，该交联剂可以用温和的UV光(约345nm至365nm)活化，以避免在与基底产生强共价键时损坏基底。共聚物可以包含亲水性重复单元，并且特别是两性离子重复单元例如含有磷酰胆碱基团的重复单元。在一些方面中，涂层组合物被应用到聚合物基底的表面，其中聚合物基底具有释放一氧化氮的性质。涂层组合物和被涂覆的物品可以具有防污性质、抗血栓形成性质和/或抗菌性质。

Description

具有防污、抗血栓形成和抗菌性质的表面和涂层组合物及制 备方法
相关申请的交叉引用
本申请要求以下申请的优先权和权益：2018年1月15日提交的、具有序列号62/617,418的、标题为“SURFACES HAVING ANTIFOGGING AND ANTIFOULING CHARACTERISTICS,COATING COMPOSITIONS HAVING ANTIFOGGING AND ANTIFOULING CHARACTERISTICS,ANDMETHODS OF MAKING ANTIFOGGING AND ANTIFOULING SURFACES”的共同未决的美国临时申请；2017年10月20日提交的、具有序列号62/575,104的、标题为“SURFACES AND COATINGCOMPOSITIONS HAVING ANTIFOULING CHARACTERISTICS,AND METHODS OF MAKING”的共同未决的美国临时申请；以及2018年6月15日提交的、具有序列号62/685,621的、标题为“SURFACES AND COATING COMPOSITIONS HAVING ANTIFOULING,ANTITHROMBOTIC,ANDANTIBACTERIAL PROPERTIES AND METHODS OF MAKING”的共同未决的美国临时申请，这些申请的内容通过引用以其整体并入。
关于联邦赞助研究或开发的声明
本发明是在美国政府支持下，根据由美国国立卫生研究院(National Institutesof Health)资助的合同K25HL111213、R01HL134899和R01HL111213以及由美国疾病控制和预防中心(Centers for Disease Control and Prevention)资助的合同200-2016-91933完成的。政府对本发明具有某些权利。
技术领域
本公开内容总体上涉及涂层(coating)、涂层组合物(coating composition)、被涂覆的物品(coated article)及其使用和制备方法。
背景
蛋白质的非特异性吸附一直被认为是许多生物医学应用中的巨大挑战，生物医学应用例如植入物、隐形眼镜、导管和生物传感器。除了医疗装置失效(medical devicefailure)外，蛋白质吸附的后果还包括血栓形成、先天免疫反应和细菌感染。防止直接微生物污染也是医疗装置、植入物和医院设备的高度期望的特征。尽管在理解和减少吸附和污染方面已经取得了重大进展，但美国疾病控制和预防中心(CDC)仍报告称，在2011年，在美国急性护理医院中估计有722,000例医疗护理相关感染(health care-associatedinfection)(HAI)。此外，约75,000名患有HAI的患者在其住院期间死亡。在任何给定的一天，在美国约每25名患者中就有1名在其医院护理期间感染至少一种传染病。因此，显示防污和抗微生物效果的材料是非常期望的。
仍然存在对克服上述缺陷的改进的涂覆技术、涂层组合物、涂层和被涂覆的物品的需求。
概述
在本文描述的多个方面中，提供了涂层组合物、被涂覆的物品及其制备和使用方法。在多个方面中，被涂覆的物品提供了用于主动(active)和被动(passive)两者的防污性质、抗微生物性质和/或抗血栓形成性质的机制。
在一些方面中，被涂覆的物品包括具有至少一个表面的释放一氧化氮的基底；和两性离子聚合物，所述两性离子聚合物共价地附接到所述至少一个表面以形成被涂覆的物品。NO释放可以提供延长的主动的防污性质、抗微生物性质和/或抗血栓形成性质。通过在表面上呈现两性离子基团，被涂覆的物品还能够提供被动的防污性质、抗微生物性质和/或抗血栓形成性质，这些性质即使在从基底的NO释放已经停止之后仍然继续存在。
在一些方面中，两性离子聚合物是包含两性离子重复单元和系链重复单元(tethering repeat unit)的共聚物，并且系链重复单元包括与基底的至少一个表面的共价键。例如，两性离子聚合物可以是具有根据下式的结构的无规共聚物：
其中Z的每次出现都是两性离子部分；其中，在每种情况下，(i)A1不存在并且A2是＝O，或者(ii)A1是与所述基底的所述至少一个表面的共价键并且A2是-OH；其中R1的每次出现独立地是共价键或具有从1个至12个碳原子的直链或支链的、被取代的或未被取代的烷基二价基团(diradical)；其中R2、R3和R4的每次出现独立地是具有从1个至12个碳原子的直链或支链的、被取代的或未被取代的烷基；并且其中a、b和c是实数，使得0<a<1，0≤b<1，0<c<1，并且a+b+c＝1。
合适的释放一氧化氮的基底可以包括聚合物和分散在聚合物中的一氧化氮供体；其中一氧化氮供体以基于释放一氧化氮的基底的总重量的从约6wt％至约11wt％的量存在。在一些方面中，基底具有能够与系链重复单元形成共价键的表面氢。分散在聚合物中的一氧化氮供体可以是任何合适的NO供体材料，例如有机硝酸盐(nitrate)、金属-NO络合物、N-亚硝胺、S-亚硝基硫醇、或其组合。
在一些方面中，被涂覆的物品包括具有释放一氧化氮的基团的基底，所述释放一氧化氮的基团通过支链烷基胺间隔基被共价地附接至表面。烷基胺间隔基可以被共价地附接至基底的表面，使得偶联至聚合物基底的表面的支链烷基胺间隔基提供被动的防污性质、抗血栓形成性质和抗微生物性质，同时NO供体部分释放NO并且提供主动的抗微生物性质。
在多个方面中，提供了包含聚合物的涂层组合物以及使用该涂层组合物制备被涂覆的物品的方法。特别地，聚合物可以包括交联剂，该交联剂可以用温和的UV光(约345nm至365nm)活化，以避免在与基底产生强共价键的同时损坏基底。该方法可以包括使用旋涂、喷涂、浸涂、垫涂(pad application)或具有粘性背衬的膜将聚合物应用至表面。该方法可以包括应用UV光以使聚合物交联到基底的表面。
被涂覆的物品可以包括其中防污性质、抗血栓形成性质和抗微生物性质是有益的任何物品。在一些方面中，该物品可以包括导管(包括但不限于血管导管和导尿管)、冠状动脉支架(coronary stent)、伤口敷料、体外回路(extracorporeal circuit)、膜式氧合器(membrane oxygenator)、气管内导管、血管移植物(vascular graft)及类似物品。
在研究以下附图和详述后，对于本领域技术人员来说，涂层组合物、被涂覆的物品及其制备方法的其他系统、方法、特征和优点将是明显的或将变成明显的。意图是所有这样的另外的系统、方法、特征和优点被包括在本描述内、在本公开内容的范围内并且由所附权利要求保护。
附图简述
在结合附图阅读下文描述的本公开内容的多种实施方案的详述后，将容易地理解本公开内容的另外的方面。
图1示出了一氧化氮化学发光分析仪的流程图。
图2示出了在254nm(6.5mW cm-2强度)处作为光化学辐照时间的函数的滴铸(drop-cast)到石英基底上的BPMPC的UV-可见吸收光谱。
图3示出了在UV暴露之前(下曲线)和之后(上曲线)的BPMPC涂层的ATR-FTIR光谱。
图4示出了关于CarboSil的作为时间的函数的接触角测量值，所述CarboSil涂覆有BPMPC并且在37℃在温和搅拌下在PBS中孵育(incubate)。
图5A-图5B示出了在2周内使用UV-可见光测量的SNAP浸出以及在2周内使用化学发光测量的一氧化氮释放(n＝3)。
图6A-图6B示出了在(图6A)纤维蛋白原溶液中和在(图6B)溶菌酶溶液中孵育后的厚度增加。
图7A-图7B示出了在(图7A)在2mg/ml FITC-BSA溶液中孵育90分钟后、(图7B)在2mg/ml FITC-BSA溶液中孵育前在BSAPBS溶液中1天后，以及(图7C)在2mg/ml FITC-BSA溶液中孵育前在BSAPBS溶液中7天后的未被涂覆的膜的荧光显微照片(放大率10x)。(图7D-图7F)是在相同实验条件下测量的被涂覆的膜。
图8示出了相对于对照，释放NO的BPMPC涂覆的样品的抗微生物功效(n＝3)。
图9示出了SNAP-BPAM CarboSil膜的制造及其杀生物作用。抗菌聚合物复合材料通过将NO供体，S-亚硝基-N-乙酰基-青霉胺(SNAP)并入CarboSil聚合物中来制造，并且经由光交联顶部涂覆有表面固定的基于二苯甲酮的季铵(BPAM)抗微生物小分子。
图10A-图10B示出了BPAM在SNAP膜上的UV介导的光交联研究：(图10A)：在UV辐照(254nm，90s)之前和之后的SNAP-BPAM膜的UV-可见光谱。在UV辐照持续90秒后，在255nm处的吸光度下降，这表明交联反应的完成。(图10B)：UV辐照后的总SNAP含量被报告为是初始SNAP含量的约95.44±2.5％。数据以对于n＝3个样品的平均值±标准偏差报告，并且陈述了p值<0.05的显著性用于比较。
图11示出了在生理温度使用Sievers一氧化氮分析仪(NOA)分析的SNAP掺杂的CarboSil(黑色)和BPAM涂覆的SNAP CarboSil膜(红色)的实时NO通量速率(flux rate)。
图12示出了SNAP和SNAP-BPAM膜的一氧化氮(NO)通量分析(在0h和24h时间段)。SNAP-BPAM膜在初始和24h时间点释放较高的NO通量。即使在24h后，SNAP-BPAM的NO通量仍保持在生理范围内。数据以对于n＝3个样品的平均值±标准偏差报告，并且陈述了p值<0.05的显著性用于比较。
图13示出了对比图，以显示与对照CarboSil相比，SNAP膜、BPAM膜和SNAP-BPAM膜的抑制单位表面积上的革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(S.aureus)和革兰氏阴性铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的活菌落形成单位(viable colony forming unit)(CFU/cm2)的差异。结果表明，SNAP和BPAM两者均具有对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的不同程度的毒性。虽然与SNAP相比，BPAM本身对革兰氏阴性铜绿假单胞菌具有更好的抗菌潜力，但SNAP关于其对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的杀菌作用优于BPAM。SNAP-BPAM的组合作用对这两种细菌同样有效。数据以对于n＝3个样品的平均值±标准偏差报告，并且陈述了p值<0.05的显著性用于比较。
图14示出了固定的BPAM顶涂层对SNAP-BPAM膜的NO释放动力学的影响，如通过在细菌暴露研究之前(0h和24h)和之后(24h)的化学发光所测量的。即使在细菌暴露24h后，仍观察到残留的NO通量在生理范围内，这表明抗菌效果可以延长超过24h。数据以对于n＝3个样品的平均值±标准偏差报告，并且陈述了p值<0.05的显著性用于比较。
图15A-图15B示出了可以在红色虚线圆圈内看到的抑制区(ZOI)：(图15A)金黄色葡萄球菌；(图15B)铜绿假单胞菌；(i)对照，(ii)SNAP，(iii)BPAM，以及(iv)SNAP-BPAM。在SNAP-BPAM组合的情况下较大的ZOI是由于在BPAM顶涂层的情况下NO通量的增加。
图16示出了表面固定的S-亚硝基-N-乙酰基-d-青霉胺(SIM-S1，SIM-S2，SIM-S4)的制备，A)通过将PDMS表面浸入到H2O中的50:50的比的13N HCl:30wt.％H2O2中，用羟基基团来官能化PDMS表面，B)用APTMES处理用于胺官能化，C)NAP-硫代内酯与游离胺基团的开环反应以产生游离硫醇基团(分别对步骤G和K进行重复用于SIM-N2和SIM-N4)，D)用亚硝酸叔丁酯对硫醇基团的亚硝化(分别对步骤H和L进行重复用于SIM-S2和SIM-S4)，E)经由与丙烯酸甲酯反应的伯胺的支化(对步骤I进行重复)，F)使用乙二胺对支化位点的胺官能化(对步骤J进行重复)。
图17示出了对于不同样品的FTIR光谱。胺-1、胺-2和胺-4对应于具有未支化的表面和支化的表面的胺官能化的表面。3500-2500代表在对SIM-N4和胺-2胺官能化后存在的未反应的-COOH基团。2950代表大量存在于SR和SR的胺化表面中的烷基基团。1650、1550的双峰代表在胺-1、胺-2和胺-4中的伯胺基团。1650代表SIM-N1、SIM-N2、SIM-N4、SIM-S1、SIM-S2和SIM-S4中的饱和酰胺基团。SIM-S2中的1550代表所附接的NO供体的亚硝基基团。
图18示出了本公开内容的未支化的(SIM-S1)和支化的(SIM-S2和SIM-S4)表面固定的NO供体表面的实施方案的图示。
图19A-图19B示出了(图19A)对于600h/25d的每日NO释放测量值以及(图19B)在600h/25d期间的累积NO释放。
图20示出了在2h时间段内纤维蛋白原至改性的SR表面的吸附。值被表示为平均值±标准误差。使用每组n＝8进行测量。*-与未改性的SR相比显著不同。#-与SIMS-2构型相比显著不同。
图21示出了当与对照样品相比时，SIM-S2能够将细菌粘附减少～2.5个对数(～2.5log)。
图22示出了在90min时间段内每表面积吸附的血小板。
详述
在多个方面中，提供了克服前述问题中的一个或更多个的涂层组合物、被涂覆的物品及其制备方法。根据本公开内容的目的，如在本文体现和广泛描述的，本公开内容的实施方案涉及具有防污特性和抗微生物特性的涂层、基底和/或物品，制备该涂层、基底和/或物品的方法，以及减少在基底或物品的表面上形成的生物化学组分和/或微生物的量的方法，以及诸如此类。
在更详细地描述本公开内容之前，应当理解，本公开内容不限于所描述的特定实施方案，并且本身当然可以变化。还应理解，本文使用的术语仅为了描述具体实施方案的目的，并且不意图是限制性的。本领域技术人员将认识到本文所描述的实施方案的许多变化和修改。这些变化和修改意图被包括在本公开内容的教导中，并且被本文的权利要求所涵盖。
在本说明书中引用的所有出版物和专利被引用以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。所有这样的出版物和专利通过引用被并入本文，如同每个单独的出版物或专利被具体地和单独地指示通过引用被并入。这样的通过引用的并入明确地限于在所引用的出版物和专利中描述的方法和/或材料，并且并不扩展到来自所引用的出版物和专利的任何词典定义。在本说明书中没有明确重复的在所引用的出版物和专利中的任何词典定义不应被如此对待，并且不应被理解为定义所附权利要求中出现的任何术语。对任何出版物的引用是针对其在提交日之前的公开内容，并且不应被理解为承认本公开内容由于先前公开内容而无权先于这样的出版物。此外，提供的出版物的日期可能不同于实际出版日期，实际出版日期可能需要独立地确认。
虽然与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以用于本公开内容的实践或测试中，但现在描述优选的方法和材料。为了简洁和/或清晰起见，可能没有详细描述本领域中熟知的功能或结构。除非另外指示，否则本公开内容的实施方案将采用纳米技术、有机化学技术、材料科学与工程技术及类似技术，这些技术在本领域的技能内。这样的技术在文献中被充分地解释。
应注意，比率(ratio)、浓度、量和其他数值数据可以以范围格式在本文中表示。应理解，为了方便和简洁起见而使用这样的范围格式，并且因此应以灵活的方式解释为不仅包括作为范围的限值明确叙述的数值，而且还包括该范围内涵盖的所有单独的数值或子范围，如同每个数值和子范围被明确地叙述。举例说明，“约0.1％至约5％”的数值范围应被解释为不仅包括约0.1％至约5％的明确叙述的值，而且还包括在所指示的范围内的单独的值(例如，1％、2％、3％和4％)和子范围(例如，0.5％、1.1％、2.2％、3.3％和4.4％)。在陈述的范围包括限值中的一个或两个的情况下，排除那些所包括的限值中的任一个或两个的范围也包括在本公开内容中，例如短语“x至y”包括从“x”至“y”的范围以及大于“x”且小于“y”的范围。该范围还可以以上限来表示，例如“约x、y、z或更小”，并且应被解释为包括“约x”、“约y”和“约z”的特定范围以及“小于x”、“小于y”和“小于z”的范围。同样，短语“约x、y、z或更大”应被解释为包括“约x”、“约y”和“约z”的特定范围以及“大于x”、“大于y”和“大于z”的范围。在一些实施方案中，术语“约”可以包括根据数值的有效数字的传统四舍五入。此外，在‘x’和‘y’是数值的情况下，短语“约‘x’至‘y’”包括“约‘x’至约‘y’”。
定义
缩写：BPMPC，2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱-共-甲基丙烯酸丁酯-共-二苯甲酮；N-(4-苯甲酰基苄基)-N,N-二甲基丁-1-铵碘化物(BPAM)；NO，一氧化氮；SNAP，S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺；BP，4-乙烯基二苯甲酮；MPC，2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱；BSA，牛血清白蛋白；FITC-BSA，异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白；NAP，N-乙酰基-D-青霉胺；NaNO2，亚硝酸钠；浓H2SO4，浓硫酸；THF，四氢呋喃；NaH2PO4，磷酸二氢钠；LB，Luria肉汤；Na2HPO4，磷酸氢二钠；EDTA，乙二胺四乙酸；NaOH，氢氧化钠；KH2PO4，磷酸二氢钾；20 80A热塑性有机硅-聚碳酸酯-聚氨酯(silicone-polycarbonate-urethane)(下文将被称为CarboSil)；DMAc，二甲基乙酰胺；NBS，N-溴代琥珀酰亚胺；AIBN，2,2’-偶氮-双(2-甲基丙腈)；PBS，磷酸盐缓冲盐水；ATCC，美国典型培养物保藏中心(American TypeTissue Collection)。
如本文使用的术语“防污(anti-fouling)”或“防污(anti-foul)”适用于具有防止或最小化生物材料(例如，蛋白质)、微生物或其他碎片(debris)的粘附的特性的组合物、表面或物品。
术语“抗微生物”和“抗微生物特性”指的是杀死和/或抑制微生物的生长的能力。具有抗微生物特性的物质可能对微生物(例如，细菌、真菌、原生动物、藻类及类似物)是有害的。具有抗微生物特性的物质可以杀死微生物和/或防止或基本上防止微生物的生长或繁殖。
术语“细菌(bacteria)”或“细菌(bacterium)”包括但不限于革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。细菌可以包括但不限于：营养缺陷菌属(Abiotrophia)、无色杆菌属(Achromobacter)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、噬酸菌属(Acidovorax)、不动杆菌属(Acinetobacter)、放线杆菌属(Actinobacillus)、放线棒菌属(Actinobaculum)、马都拉放线菌属(Actinomadura)、放线菌属(Actinomyces)、气球菌属(Aerococcus)、气单胞菌属(Aeromonas)、阿菲波菌属(Afipia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、差异球菌属(Alloiococcus)、交替单胞菌属(Alteromonas)、无枝酸菌属(Amycolata)、拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)、厌氧螺菌属(Anaerobospirillum)、近亲鱼腥藻(Anabaena affinis)和其他蓝藻细菌(cyanobacteria)(包括鱼腥藻属(Anabaena)、项圈藻属(Anabaenopsis)、束丝藻属(Aphanizomenon)、Camesiphon、拟柱胞藻(Cylindrospermopsis)、粘杆菌属(Gloeobacter)、软管藻属(Hapalosiphon)、鞘丝藻属(Lyngbya)、微囊藻属(Microcystis)、节球藻属(Nodularia)、念珠藻属(Nostoc)、席藻属(Phormidium)、浮丝藻属(Planktothrix)、假鱼腥藻属(Pseudoanabaena)、裂须藻属(Schizothrix)、螺旋藻属(Spirulina)、束毛藻属(Trichodesmium)和Umezakia属)、棍状厌氧菌属(Anaerorhabdus)、蛛网菌属(Arachnia)、隐秘杆菌属(Arcanobacterium)、弓形菌属(Arcobacter)、节杆菌属(Arthrobacter)、陌生菌属(Atopobium)、金杆菌属(Aureobacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)、巴氏发菌属(Balneatrix)、巴尔通体属(Bartonella)、伯杰氏菌属(Bergeyella)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、嗜胆菌属(Bilophila)、布兰汉氏球菌属(Branhamella)、疏螺旋体属(Borrelia)、鲍特氏菌属(Bordetella)、短螺菌属(Brachyspira)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、布鲁氏菌属(Brucella)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、布丘氏菌属(Buttiauxella)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、鞘杆菌属(Calymmatobacterium)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、二氧化碳嗜纤维菌属(Capnocytophaga)、心杆菌属(Cardiobacterium)、卡托氏菌属(Catonella)、西地西菌属(Cedecea)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、百足菌属(Centipeda)、衣原体属(Chlamydia)、嗜衣原体属(Chlamydophila)、色杆菌属(Chromobacterium)、金黄杆菌属(Chyseobacterium)、金色单胞菌属(Chryseomonas)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、梭菌属(Clostridium)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、棒杆菌属(Corynebacterium)、考克斯氏体属(Coxiella)、隐小杆菌属(Cryptobacterium)、戴尔福特菌属(Delftia)、皮杆菌属(Dermabacter)、嗜皮菌属(Dermatophilus)、脱硫单胞菌属(Desulfomonas)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、小杆菌属(Dialister)、偶蹄形菌属(Dichelobacter)、狡诈球菌属(Dolosicoccus)、狡诈菌属(Dolosigranulum)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、埃格特菌属(Eggerthella)、埃利希氏体属(Ehrlichia)、艾肯菌属(Eikenella)、稳杆菌属(Empedobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、欧文氏菌属(Erwinia)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、埃希氏菌属(Escherichia)、真杆菌属(Eubacterium)、爱文菌属(Ewingella)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、费克蓝姆菌属(Facklamia)、产线菌属(Filifactor)、黄色单胞菌属(Flavimonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、弗朗西斯菌属(Francisella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、加德纳菌属(Gardnerella)、孪生球菌属(Gemella)、格鲁比卡氏菌属(Globicatella)、戈登氏菌属(Gordona)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、哈夫尼菌属(Hafnia)、螺杆菌属(Helicobacter)、盐球菌属(Helococcus)、霍尔德曼氏菌属(Holdemania)、不活动粒菌属(Ignavigranum)、约翰森氏菌属(Johnsonella)、金氏菌属(Kingella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、考克氏菌属(Kocuria)、科泽氏菌属(Koserella)、库特氏菌属(Kurthia)、盖球菌属(Kytococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、劳特罗普氏菌属(Lautropia)、勒克菌属(Leclercia)、军团杆菌属(Legionella)、勒米诺菌属(Leminorella)、钩端螺旋体属(Leptospira)、纤毛菌属(Leptotrichia)、明串珠菌属(Leuconostoc)、李斯特氏菌属(Listeria)、利斯顿氏菌属(Listonella)、巨球形菌属(Megasphaera)、甲基杆菌(Methylobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、微球菌属(Micrococcus)、光冈菌属(Mitsuokella)、动弯杆菌(Mobiluncus)、米勒氏菌属(Moellerella)、莫拉氏菌属(Moraxella)、摩根氏菌属(Morganella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、支原体属(Mycoplasma)、香味菌属(Myroides)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、诺卡氏菌属(Nocardia)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、厄氏菌属(Oeskovia)、寡源杆菌属(Oligella)、东方体属(Orientia)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、泛菌属(Pantoea)、副衣原体属(Parachlamydia)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、片球菌属(Pediococcus)、消化球菌属(Peptococcus)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、发光杆菌属(Photobacterium)、光杆状菌属(Photorhabdus)、植原体属(Phytoplasma)、邻单胞菌属(Plesiomonas)、卟啉单胞菌属(Porphyrimonas)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、变形杆菌属(Proteus)、普罗威登斯菌属(Providencia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、假支杆菌属(Pseudoramibacter)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、拉恩氏菌属(Rahnella)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、红球菌属(Rhodococcus)、立克次氏体属(Rickettsia)、罗卡利马氏体菌属(Rochalimaea)、玫瑰单胞菌属(Roseomonas)、罗氏菌属(Rothia)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、沙门氏菌(Salmonella)、月形单胞菌属(Selenomonas)、蛇形螺旋体属(Serpulina)、沙雷氏菌属(Serratia)、希瓦氏菌属(Shewenella)、志贺氏菌属(Shigella)、芯卡体属(Simkania)、史雷克氏菌属(Slackia)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、螺旋菌属(Spirillum)、螺原体属(Spiroplasma)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、口腔球菌属(Stomatococcus)、链杆菌属(Streptobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)、萨特氏菌属(Sutterella)、萨顿氏菌属(Suttonella)、塔特姆菌属(Tatumella)、泰氏菌属(Tissierella)、特拉布斯氏菌属(Trabulsiella)、密螺旋体属(Treponema)、养障体属(Tropheryma)、束村氏菌属(Tsakamurella)、苏黎士菌属(Turicella)、脲原体属(Ureaplasma)、漫游球菌属(Vagococcus)、韦容球菌属(Veillonella)、弧菌属(Vibrio)、威克斯氏菌属(Weeksella)、沃林氏菌属(Wolinella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、致病杆菌属(Xenorhabdus)、耶尔森氏菌属(Yersinia)和约克氏菌属(Yokenella)。细菌的其他实例包括：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝杆菌(M.bovis)、鼠伤寒分枝杆菌(M.typhimurium)、牛分枝杆菌菌株BCG、BCG亚株、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、海分枝杆菌(M.marinum)、溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)、鸟分枝杆菌副结核亚种(M.avium subspecies paratuberculosis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、马葡萄球菌(Staphylococcus equi)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、单核增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、伊氏李斯特氏菌(Listeria ivanovii)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)和其他诺卡氏菌属、草绿色链球菌群(Streptococcus viridans group)、消化球菌属(Peptococcus species)、消化链球菌属(Peptostreptococcus species)、衣氏放线菌(Actinomyces israelii)和其它放线菌属(Actinomyces species)、以及疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、其它梭菌属(Clostridiumspecies)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、其它假单胞菌属(Pseudomonasspecies)、弯曲杆菌属(Campylobacter species)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、埃里希氏体属(Ehrlichia species)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、溶血性巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)和其它巴斯德氏菌属(Pasteurella species)、嗜肺军团杆菌(Legionella pneumophila)、其它军团杆菌属(Legionella species)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、其它沙门氏菌属(Salmonella species)、志贺氏菌属(Shigella species)、流产布鲁氏菌(Brucellaabortus)、其它布鲁氏菌属(Brucella species)、沙眼衣原体(Chlamydi trachomatis)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetii)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhea)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、杜克雷氏嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、其它嗜血杆菌属(Haemophilus species)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、其它耶尔森氏菌属(Yersinia species)、大肠埃希氏菌、希拉埃希氏菌(E.hirae)和其它埃希氏菌属(Escherichia species)、以及其它肠道菌属(Enterobacteria)、流产布鲁氏菌和其它布鲁氏菌属、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、普雷沃氏菌属(Provetella species)和反刍类考德里氏体(Cowdria ruminantium)，或其任何菌株或变体。革兰氏阳性细菌可以包括但不限于革兰氏阳性球菌(例如，链球菌、葡萄球菌和肠球菌)。革兰氏阴性细菌可以包括但不限于革兰氏阴性杆菌(例如，类杆菌科(Bacteroidaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、弧菌科(Vibrionaceae)、巴斯德氏菌科(Pasteurellae)和假单胞菌科(Pseudomonadaceae))。在实施方案中，细菌可以包括肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)。
如本文使用的术语“原生动物”包括但不限于鞭毛虫类(例如，兰伯贾第鞭毛虫(Giardia lamblia))、拟变形虫类(amoeboids)(例如，溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica))和孢子虫(例如，诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi))以及纤毛虫(例如，结肠小袋纤毛虫(B.coli))。原生动物可以包括但不限于：结肠内阿米巴(Entamoeba coli)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、布氏嗜碘内阿米巴(Iodamoeba buetschlii)、迈氏唇鞭毛虫(Chilomastix mesnili)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、人五毛滴虫(Pentatrichomonas homini)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、巴西利什曼原虫(Leishmania braziliensis)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)和粘孢子虫(Myxosporidia)。
如本文使用的术语“藻类”包括但不限于：微藻类和丝状藻类诸如巢状组囊藻(Anacystis nidulans)、栅藻属(Scenedesmus sp.)、衣藻属(Chlamydomonas sp.)、小球藻属(Chlorella sp.)、杜氏藻属(Dunaliella sp.)、裸藻属(Euglena sp.)、定鞭金藻属(Prymnesium sp.)、紫球藻属(Porphyridiumsp.)、聚球藻属(Synechococcus sp.)、布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)、寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)、细柱藻属(Cylindrotheca sp.)、微囊藻属(Microcystis sp.)、等鞭金藻属(Isochrysis sp.)、单肠藻(Monallanthus salina)、微小单肠藻(M.minutum)、微球藻属(Nannochloris sp.)、微拟球藻属(Nannochloropsis sp.)、富油新绿藻(Neochloris oleoabundans)、菱形藻属(Nitzschia sp.)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、裂壶藻属(Schizochytriumsp.)、斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)和干扁藻(Tetraselmis sueica)以及属于水绵属(Spirogyra)、刚毛藻属(Cladophora)、无隔藻属(Vaucheria)、黑孢藻属(Pithophora)和浒苔属(Enteromorpha)中的任一种的藻类。
如本文使用的术语“真菌”包括但不限于多种生物体，例如霉菌(molds)、霉菌(mildews)和锈菌(rusts)并且包括以下中的物种：青霉菌属(Penicillium)、曲霉菌属(Aspergillus)、支顶孢属(Acremonium)、分支孢子菌属(Cladosporium)、镰孢菌属(Fusarium)、毛霉菌属(Mucor)、脉孢菌属(Neurospora)、根霉菌属(Rhizopus)、毛发癣菌属(Trichophyton)、葡萄孢盘菌属(Botryotinia)、疫霉属(Phytophthora)、长喙壳属(Ophiostoma)、稻瘟菌属(Magnaporthe)、葡萄穗霉属(Stachybotrys)和锈菌属(Uredinales)。
如本文使用的术语“广谱杀生物剂”、“杀生物剂”和“杀生物的”包括但不限于杀虫剂(pesticide)(例如杀真菌剂、除草剂、杀昆虫剂、杀藻剂、杀软体动物剂、杀螨剂和灭鼠剂)和抗微生物剂，并且还可以包括杀菌剂、抗生素、抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗原虫剂和抗寄生虫剂。
如本文使用的术语“抗微生物有效量”指的是被施用/释放的化合物的量(例如从约5％至约100％)，所述量将在一定程度上杀死微生物或抑制其生长和/或繁殖。关于本公开内容的组合物或物品，抗微生物有效量指的是具有以下的效果及其组合的量：减少现有微生物的存在、稳定(例如，不增加)存在的微生物的数目、防止出现另外的微生物、延迟或减缓微生物的繁殖。类似地，术语“抗菌有效量”指的是被施用/释放的化合物的量(例如从约5％至约100％)，所述量将在一定程度上杀死细菌生物或抑制其生长和/或繁殖。关于本公开内容的组合物或物品，抗菌有效量指的是具有以下的效果及其组合的量：减少现有细菌的存在、稳定(例如，不增加)存在的细菌的数目、防止出现另外的细菌、延迟或减缓细菌的繁殖。
如本文使用的术语“生物相容的”指的是在不对活的生物物质或生物系统施加过度的应激、毒性或不利影响的情况下，与活的生物物质和/或生物系统(例如，细胞、细胞成分、活组织、器官等)共存的能力。
NO，一氧化氮；SNAP，S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺；GSNO，S-亚硝基-谷胱甘肽；PVA，聚乙烯醇；SIM，表面固定的。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。应当进一步理解，术语，诸如在常用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与它们在本说明书和相关领域的上下文中的含义一致的含义，并且不应该以理想的或过于正式的含义来理解，除非本文中明确地定义。
如本文使用的冠词“一(a)”和“一(an)”当应用于说明书和权利要求书中描述的本发明的实施方案中的任何特征时意指一个或更多个。“一(a)”和“一(an)”的使用并不将含义限制成单个特征，除非明确地说明了这样的限制。在单数或复数名词或名词短语之前的冠词“该(the)”表示一个或更多个特别指定的特征，并且取决于其使用的上下文可以具有单数或复数含义。
涂层组合物
本公开内容包括涂层，该涂层包含NO供体基底和聚合物。在一个方面中，聚合物包括亲水性部分和光可交联部分，其中涂层具有防污特性和抗微生物特性之一或两者。在一个方面中，亲水性部分在暴露于光能(例如，紫外线能量)后通过光可交联部分被共价地附接至NO供体基底的表面，这可以在表面上形成涂层(例如，约10nm至500nm厚)。有利地，NO供体基底具有抗微生物性质，并且光可交联部分具有防污特性。将光可交联部分附接至NO供体基底是简单且可调整规模(scalable)的一步工艺。
在实施方案中，光可交联部分可以包括芳基酮(约340nm至400nm)、芳基叠氮基基团(aryl azide group)(约250nm至450nm或者约350nm至375nm)、二吖丙因(diazirine)基团(约340nm至375nm)，并且聚合物可以包含这些基团的组合。在实施方案中，光可交联部分可以包括带有至少一个稠环体系取代基例如萘基和蒽基的烷基-芳基酮和二芳基酮。在实施方案中，芳基酮基团可以包括二苯甲酮(约340nm至380nm)、苯乙酮(约340nm至400nm)、萘基甲基酮(约320nm至380nm)、二萘基酮(约310nm至380nm)、二萘基酮衍生物(约320nm至420nm)或这些中的每一种的衍生物。在实施方案中，光可交联部分是二苯甲酮基团。在实施方案中，芳基叠氮基基团可以包括苯基叠氮基(phenyl azide)、烷基取代的苯基叠氮基、卤素取代的苯基叠氮基或这些中的每一种的衍生物。在实施方案中，二吖丙因基团可以包括3,3二烷基二吖丙因(例如，3,3二甲基二吖丙因、3,3二乙基二吖丙因)、3,3二芳基二吖丙因(例如，3,3二苯基二吖丙因)、3-烷基3-芳基二吖丙因(例如，3-甲基-3-苯基二吖丙因)，或这些中的每一种的衍生物。
本公开内容的实施方案包括如上所述的涂层，其中光可交联部分可以是二苯甲酮。亲水性聚合物可以被用作用于制备超亲水性表面的涂层材料。芳基酮部分例如二苯甲酮(BP)充当交联剂以及从合适的氢供体中提取氢的能力已经被很好地研究并且被用于多种化学体系中持续许多年。5-7BP可以用于交联有机薄膜，并且其可以使用温和的UV光(345nm-365nm)来活化，这避免了在暴露于较高能量的UV后可能发生的聚合物和表面的氧化损伤。二苯甲酮部分是比其他有机交联剂更化学稳健的(chemically robust)，并且在宽范围的不同的化学环境中优先与C-H键反应。通过UV光的触发，二苯甲酮经历n-π*跃迁(n-pi*transition)，这导致二价自由基三重激发态(biradical triplet excited state)的形成，该二价自由基三重激发态可以从相邻的脂族C-H基团中提取氢原子以形成新的C-C键。这种三重态对于位于供电子杂原子(氮和氧)的α位的H也具有特别高的反应性。这种光反应最近已经被用于将薄聚合物层附接至金属和氧化物表面，8-11以及应用于微流体、12有机半导体、13和生物传感器。14(本段的参考文献对应于实施例1)
在实施方案中，亲水性部分起为涂层提供至少一种亲水特性的作用。本公开内容的实施方案包括如上所述的表面，其中亲水性部分可以是甲基丙烯酸C1-C4-烷基酯例如甲基丙烯酸异丁酯或是丙烯酸烷基酯。
在实施方案中，亲水性部分可以是两性离子聚合物(或乙二醇聚合物，或羟基官能的丙烯酸酯聚合物)。在多种实施方案中，两性离子聚合物可以是2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱-共-甲基丙烯酸丁酯-共-二苯甲酮(BPMPC)(或任何磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯、羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯-共-甲基丙烯酸丁酯-共-二苯甲酮共聚物)。BPMPC可以是从约20％至约99％的2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(MPC)(例如，30％ MPC、50％ MPC、70％ MPC或90％ MPC)。有利地，BPMPC涂层具有优良的亲水性，这有助于当将涂层应用于物品时抑制蛋白质从溶液的吸附。在多个实施方案中，BPMPC涂层是从约20nm至约1μm。
在实施方案中，聚合物可以由以下聚合物中的一种或更多种表示：
其中组分的比率可以不同于上文描述的那些，其中每个下标可以从0.05至0.9变化。
基底
在一个方面中，NO供体基底释放NO。本公开内容的实施方案包括如上所述的涂层，其中NO供体基底包括有机硝酸盐、金属-NO络合物、N-亚硝胺、S-亚硝基硫醇，或其组合。在多种实施方案中，NO供体基底可以是掺杂有S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺(SNAP)的聚合物膜。本公开内容的实施方案包括如上所述的涂层，其中NO供体基底具有约6％-11％wt的S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺(SNAP)。在多种实施方案中，聚合物膜可以是有机硅-聚碳酸酯-聚氨酯热塑性塑料(CarboSil)。
有利地，当用BPMPC涂覆时，NO供体基底以比单独使用时更高、更持久的速率释放NO。该涂层的另一个优点是比单独的CarboSil减少了SNAP的浸出。
本公开内容的实施方案包括如上所述的涂层，其中NO供体基底在暴露于光能后被共价地连接至光可交联部分。在实施方案中，涂层的光可交联部分和NO供体基底经由UV光(例如，约340nm至370nm)的相互作用共价地结合，所述UV光的相互作用导致在NO供体基底和光可交联部分之间形成C-C键。
本公开内容的实施方案包括如上所述的涂层，其中掺杂的聚合物膜被涂覆在聚合物膜的另外的层中。在多种实施方案中，掺杂的聚合物膜可以涂覆有一层或更多层的膜。涂层的厚度可以是从约20nm至约1μm。
本公开内容还包括具有表面的基底，其包括包含NO供体基底和光可交联部分的涂层。NO供体基底被共价地附接至光可交联部分，以形成应用至表面的膜。有利地，涂层给予表面防污特性和抗微生物特性之一或两者。
尽管NO供体基底提供了抗微生物作用的主动机制(active mechanism)，但是一旦基底/涂层/材料的NO释放性质已经被耗尽，它可能不再提供防污/抗微生物活性。因此，本公开内容提供了具有主动和被动两者的防污性质、抗微生物性质和抗血栓形成性质的聚合物基底表面、涂层和物品。本公开内容提供了聚合物材料和/或涂层，所述聚合物材料和/或涂层提供了支化的聚合物表面化学，以提供疏水性和对蛋白质、细菌和其他微生物的粘附的空间位阻，且同时提供了来自表面固定的NO供体的主动防污活性和抗微生物活性。
在实施方案中，本公开内容提供了具有表面固定的(SIM)NO供体官能化的表面的聚合物材料和/或基底。SIM NO供体官能化的表面包括支链烷基胺间隔基，该支链烷基胺间隔基被偶联至聚合物基底的表面以提供被动的防污性质、抗血栓形成性质和抗微生物性质。SIM NO供体官能化的表面还包括NO供体部分，该NO供体部分被偶联至支链烷基间隔基，使得NO供体部分释放NO并提供主动抗微生物性质。在实施方案中，在所有的NO已经被释放后，具有SIM NO供体官能化的表面的聚合物材料保持防污性质、抗血栓形成性质和抗微生物性质。
在实施方案中，聚合物基底/聚合物材料可以包括例如但不限于以下的聚合物：聚氨酯、有机硅、聚氯乙烯、酮聚合物(包括但不限于聚醚醚酮)、聚乙烯(包括但不限于乙烯乙酸乙烯酯)、可生物再吸收的聚合物(bioresorbable polymer)(包括但不限于聚乳酸、聚乙醇酸和聚己内酯)、含氟聚合物(包括但不限于聚四氟乙烯、全氟乙醚(perfluoroether)和氟化乙烯丙烯)，及其组合。在实施方案中，聚合物基底包括通常用于制造医疗装置的聚合物材料。在实施方案中，聚合物基底是医疗装置的一部分或者形成医疗装置的一部分。
在实施方案中，支链烷基胺间隔基具有多个支链。下文所述的支化步骤可以向间隔基添加1-4个支链。因此，多个支链是可能的，并且本公开内容的实施方案意图涵盖多种支化密度。
在实施方案中，NO供体是生物相容的。在实施方案中，NO供体包括生物相容的NO供体，例如但不限于，N-亚硝胺、S-亚硝基硫醇、二醇二氮烯鎓盐，或其组合。在实施方案中，可以使用NO供体的组合。例如，在实施方案中，亚硝基硫醇和二醇二氮烯鎓盐可以通过在主链中具有仲胺而结合使用，其中将亚硝基硫醇附接至末端官能团。在实施方案中，NO供体是S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺(SNAP)、S-亚硝基-谷胱甘肽、S-亚硝基-N-乙酰半胱氨酸，及其他。在一些实施方案中，聚合物基底还包括浸渍到聚合物基底中的硅油。在实施方案中，在形成SIM NO供体官能化的表面后将硅油浸渍到聚合物基底中。
本公开内容的实施方案还包括医疗装置，该医疗装置包括本公开内容的聚合物基底。这样的医疗装置包括可植入装置或其他医疗设备(medical equipment)。在一些实施方案中，该可植入医疗装置可以包括但不限于导管(包括但不限于血管导管和导尿管)、冠状动脉支架、伤口敷料、体外回路、膜式氧合器、气管内导管、血管移植物及类似医疗装置。
本公开内容还包括具有带有涂层组合物的表面的物品，其中涂层组合物包括偶联至聚合物基底的表面的支链烷基胺间隔基和偶联至烷基间隔基以形成SIM支链NO供体涂层的SIM NO供体部分。采用这样的涂层，NO供体部分释放NO，为表面提供防污性质、抗血栓形成性质和抗微生物性质，以及由上文描述的支链聚合物间隔基提供的性质。在实施方案中，该物品是医疗植入物、医疗装置或医疗设备。在实施方案中，该物品还浸渍有硅油，这增加了表面的疏水性，进一步增加了防污性质、抗血栓形成性质和抗微生物性质。在实施方案中，NO供体可以包括但不限于N-亚硝胺、S-亚硝基硫醇、二醇二氮烯鎓盐，或其组合。在实施方案中，NO供体是S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺(SNAP)。
本公开内容还提供了制备本公开内容的涂层/表面的方法。在实施方案中，聚合物材料/基底/表面可以是但不限于聚氨酯、有机硅、聚氯乙烯，及其组合。在聚合物基底表面上制造SIM NO供体官能化的涂层的方法的实施方案包括以下一般步骤。首先，将聚合物表面胺官能化。在实施方案中，在胺官能化之前，用羟基基团官能化聚合物表面，以提供羟基官能化的聚合物表面，以有助于胺官能化。
在实施方案中，聚合物材料包括有机硅，或者聚合物具有有机硅涂层，或者聚合物基底是有机硅膜/涂层。在实施方案中，有机硅聚合物表面可以通过用HCl和过氧化氢在水中的混合物接触或浸没有机硅表面而被羟基官能化。在实施方案中，羟基官能化的聚合物表面随后用胺基团来官能化，以提供胺官能化的聚合物表面。在实施方案中，胺官能化包括使羟基官能化的表面与APTMES接触以提供胺官能化的表面。用于在表面上赋予羟基基团的可选方案包括但不限于用空气或氧等离子体处理。硅烷的应用可以在如上文提及的溶液中完成，或者通过气相沉积(孵育样品，其中硅烷被蒸发而不是液体形式)来完成。
在提供胺官能化的聚合物表面之后，在实施方案中，使在胺官能化的表面上的伯胺与丙烯酸烷基酯反应以形成支链烷基间隔基，以提供支化的表面。在实施方案中，这可以包括在甲醇:丙烯酸甲酯中孵育胺官能化的表面，以形成固定至聚合物表面的支链烷基间隔基。在支化后，支链烷基间隔基可以用胺或烷基胺官能化，以提供胺官能化的支链聚合物表面。在实施方案中，这可以包括在甲醇:乙二胺中孵育支化的表面，以形成固定至聚合物表面的胺官能化的支链烷基间隔基。在实施方案中，重复支链间隔基的支化和胺官能化，以增加间隔基的支化。这可以根据需要被重复，以获得期望的支化密度。在实施方案中，丙烯酸烷基酯的选择和胺/烷基胺的选择可以控制支化的程度。例如，使用戊烷-1,3,5三胺而不是乙二胺可以被用于在甲基丙烯酸酯步骤之后提供另外的游离伯胺。然后，这将使支化顺序从1-2-4变为1-4-8。因此，根据需要，每个支化步骤可以添加多个支链并且可以重复(例如，甲基丙烯酸酯或乙二胺)以添加更多支链。在实施方案中，每个支化步骤可以添加1-4个支链(1个支链是双官能分子)。
然后，将NO供体偶联至固定的、支化的、胺官能化的烷基间隔基。在实施方案中，在提供固定的、支化的、胺官能化的烷基间隔基之后，使胺官能化的支链烷基间隔基与NO供体前体反应，以将NO供体前体固定至聚合物表面，随后使NO供体前体亚硝化。在实施方案中，可以将胺官能化的支链聚合物表面与NAP-硫代内酯(NO供体前体)接触，其中硫代内酯的开环允许结合游离胺，以将NAP固定至支链聚合物表面。使NO供体前体亚硝化将前体转化为活性NO供体，并且因此在聚合物表面上提供表面固定的NO供体官能化的涂层。在实施方案中，NO供体前体是NAP，并且固定的NAP的亚硝化包括在纯的硝酸叔丁酯中孵育表面。亚硝化步骤在聚合物表面上产生表面固定的SNAP官能化的支链聚合物涂层。
被涂覆的物品及其制备方法
本公开内容包括具有表面的物品，该表面具有防污特性和抗微生物特性之一或两者。防污特性和抗微生物特性是在物品的表面上应用涂层的结果。如本文所使用的，涂层的防污特性和抗微生物特性之一或两者，相对于没有这些防污特性和抗微生物特性的表面，防止或显著地减少(例如，约80％-99％、约85％至99％、约90％至99％、约95％至99.9％)在表面上的生化物质(例如，蛋白质)积聚和细菌积聚。有利地，涂层可以被应用到可以是亲水性或疏水性的表面。
在实施方案中，基底或物品(或设置在物品的表面上的涂层)可以具有抗微生物特性(例如，与没有设置在表面上的涂层的类似表面相比，杀死表面上的至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的微生物(例如，细菌)，和/或将在表面上形成或生长的微生物的量减少至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％)。在实施方案中，基底或物品(或设置在物品的表面上的涂层)可以具有防污特性(例如，与没有设置在表面上的涂层的类似表面相比，将在表面上形成或生长的生化物质(例如，蛋白质)、微生物或碎片的量减少至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％)。
在多种实施方案中，物品可以具有表面，该表面包括可能暴露于微生物和/或微生物可能通常在其上生长的那些，例如但不限于医疗器械、医疗植入物、假体装置(prosthetic device)、隐形眼镜、塑料装置(plastic device)、电路、织物、烹饪柜台、食品加工设施、厨房用具、食品包装、包装材料(例如，食品、肉、家禽及类似食品包装材料)、塑料结构(例如，由聚合物或聚合物共混物制成)、在结构的表面上具有官能化的层(例如，包括C-H基团)的玻璃或玻璃样结构、在结构的表面上具有官能化的层(例如，包括C-H基团)的金属、金属合金或金属氧化物结构、在结构的表面上具有官能化的层(例如，包括C-H基团)的结构(例如，瓦、石头、陶瓷、大理石、花岗岩或类似物)及其组合、纺织品、过滤器、船舶、游泳池、金属、药瓶、纱线、纤维、手套、家具、玩具、尿布、皮革、瓷砖、以及铺地材料(flooringmaterial)。
本公开内容的实施方案包括如上所述的物品或基底，其中使用例如旋涂、喷涂、浸涂、垫涂、具有粘性背衬的膜及类似方法将涂层应用到表面。
本公开内容还包括通过以下来制造基底的方法：将NO供体基底暴露于包含亲水性部分和光可交联部分的聚合物，并且将该聚合物暴露于光能，从而使光可交联部分共价地附接至NO供体基底并在NO供体基底上形成涂层。
本公开内容还包括制备涂层的方法，该方法包括用S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺掺杂聚合物膜以形成NO供体基底，将NO供体基底与聚合物结合以形成涂层，以及将涂层暴露于光能，从而使光可交联部分共价地附接至NO供体基底。
本公开内容的实施方案包括如上所述的方法，其中掺杂的聚合物膜可以被涂覆在聚合物膜的另外的层中。在多种实施方案中，掺杂的聚合物膜可以涂覆有一层或更多层的膜。涂层的厚度可以是从约20nm至约1μm。
一氧化氮(NO)是内源性的气态自由基，其由巨噬细胞和衬在血管壁上的内皮细胞天然地产生，并且参与多种生物过程，例如防止血小板活化和粘附，同时还是有效的广谱杀菌剂。为了利用这些性质，已经开发出了NO供体(例如，s-亚硝基硫醇或二醇二氮烯鎓盐)，以允许NO的储存和局部递送，并且所述NO供体对于通常用于医疗装置的聚合物材料是特别有利的，所述聚合物材料例如聚氨酯、有机硅或聚氯乙烯。添加不同水平的这些供体还提供了用于控制从材料中递送的NO的水平的简单方法。[15]在体外循环(extracorporeal-circuit)和血管导管模型两者中，释放NO的材料已经显示出显著减少血栓形成，并且已经显示出在长期导管插入期间提供细菌的显著减少。[2,16]
实施例
现在已经大体上描述了本公开内容的实施方案，以下实施例描述本公开内容的一些另外的实施方案。尽管本公开内容的实施方案结合以下实施例以及对应的文字和附图进行描述，但不意图将本公开内容的实施方案限制于本说明书。相反，意图覆盖包括在本公开内容的实施方案的精神和范围内的所有可选方案、修改和等效物。
实施例1
为了探索两性离子聚合物到范围从亲水性到疏水性的多种基底的共价接枝，将二苯甲酮(BP)发色团(光活性系链试剂)并入到聚合物主链中。19-24在低强度UV辐照下(350nm-365nm)，BP基团可以产生二价基团，该二价基团从相邻的C-H键中提取脂族氢以形成新的C-C键，而不会对聚合物或基底造成强烈的UV氧化损伤。20通过这一过程，网状聚合物膜可以带着优良的耐久性被接枝到广泛选择的含C-H的材料和表面，并且已经被用于许多应用，例如微流体、25-26有机半导体、27氧化还原聚合物、28-29防冰聚合物、30和生物传感器。31-32
在本公开内容的实施例中，合成了两性离子三元共聚物(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱-共-甲基丙烯酸丁酯-共-二苯甲酮，BPMPC)，其可以在UV辐照后被共价地接枝到抗微生物的释放NO的CarboSil(有机硅-聚碳酸酯-聚氨酯热塑性塑料)。聚合物涂覆的表面被详细地表征，并且两性离子稳定性在生理条件下被评估。评估了这些涂层的蛋白质排斥性质。同时，在涂覆或UV辐照期间没有观察到SNAP降解，并且对于两性离子顶涂层，释放曲线保持在生理水平之上持续2周。此外，采用细菌测试证实了增强的抗微生物活性。
实验部分
材料
4-乙烯基二苯甲酮(BP)根据先前报告的方法来合成。30 2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(MPC)、来自牛血清的白蛋白(BSA)、异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白(FTIC-BSA)、N-乙酰基-D-青霉胺(NAP)、亚硝酸钠(NaNO2)、浓硫酸(浓H2SO4)、四氢呋喃(THF)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、氯化钾、氯化钠和乙二胺四乙酸(EDTA)购自SigmaAldrich(St.Louis,MO)。2,2’-偶氮双(2-甲基丙腈)(AIBN)和甲基丙烯酸正丁酯(BMA)购自Alfa-Aesar(Haverhill,MA)。异丁基三氯硅烷购自Tokyo Chemical Industry(Portland,OR)。浓盐酸(浓HCl)、氢氧化钠(NaOH)和甲醇购自Fisher-Scientific(Hampton,NH)。磷酸二氢钾(KH2PO4)和来自蛋清的溶菌酶购自BDH Chemicals-VWR International(WestChester,PA)。CarboSilTM 20 80AUR STPU(以下被称为CarboSil)从DSM Biomedical Inc.(Berkeley,CA)获得。Milli-Q过滤器被用于获得用于所有水溶液制剂的去离子水(DI)。氮气瓶和氧气瓶购自Airgas(Kennesaw,GA)。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC 6538，金黄色葡萄球菌(S.aureus))用于细菌实验。LB琼脂(LA)，Miller和Luria肉汤(LB)Lennox购自Fischer BioReagents(Fair Lawn,NJ)。所有化学品在没有另外的纯化下使用。
简言之，使用溶剂蒸发和/或旋涂方法制备具有10wt％SNAP的CarboSil聚合物(测试样品)和无SNAP含量的CarboSil聚合物(对照样品)。然后用两性离子共聚物(被称为BPMPC)涂覆这些样品，所述两性离子共聚物通过UV交联被共价地结合到CarboSil基础聚合物。对UV辐射前和UV辐射后的膜进行表面分析，以了解聚两性离子体系(polyzwitterionicsystem)的交联行为。分析了具有BPMPC涂层的测试样品和对照样品的NO释放行为。然后在生理条件下(37℃，在PBS中)测试样品的蛋白质粘附性持续14天，以评估顶涂层的防污性质。最后，使用ASTM E2180方案的修改版本对样品进行抗微生物测定。
NO供体SNAP的合成
采用先前报告的方法的修正方法来合成S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺。38将1M H2SO4和1M HCl与等摩尔量的NAP、甲醇和NaNO2水溶液混合。将该反应混合物搅拌持续20分钟，并且然后在混合物上方用恒定的空气流来冷却持续7小时。在将反应混合物的未反应部分蒸发之后，将沉淀的SNAP的绿色晶体过滤、收集并且在带盖的真空干燥器中干燥。干燥的SNAP的晶体用于所有实验。
掺杂有SNAP的CarboSil膜的合成
使用溶剂蒸发法来制备含10wt％SNAP的CarboSil膜。将700mg的CarboSil溶解在10mL的THF中，以制成聚合物溶液。向该溶液中加入77mg的SNAP，最终浓度为10wt％的SNAP。在黑暗条件下搅拌该聚合物-SNAP共混物，直到SNAP晶体完全溶解。然后将该共混物转移到特氟隆(Teflon)模具中，并且允许使溶剂在通风橱中蒸发过夜。然后将过夜干燥的膜切割成各自具有0.8cm的直径的圆形形状。将每个样品浸入到不含SNAP的CarboSil溶液(在THF中40mg mL-1的聚合物浓度)中以对其进行涂覆(这对每个样品重复三次)。将样品干燥过夜，并且然后在真空下干燥持续另外的24小时。包括此增加的干燥时间以消除可能影响任何后续研究的任何剩余的THF。对于所有SNAP浸出行为测试，在顶涂层应用之前记录每个膜的重量。在实验之间将配制的样品储存在处于黑暗中的冷冻器(-18℃)中，以防止SNAP的逸出或随之发生的NO的损失。这些并入SNAP的膜被用于NO释放、SNAP浸出和细菌细胞生存力分析。所有用于测试的样品都小于一周龄，以确保研究的完整性。
两性离子共聚物(BPMPC)的合成
该聚合物通过自由基聚合来合成。将MPC(0.546g，1.85mmol)、n-BMA(0.105mL，0.66mmol)和BP(0.027g，0.132mmol)溶解在具有引发剂AIBN(0.01mmol mL-1)的5.3mL乙醇(单体总浓度1.0mmol mL-1)中，并且将溶液倒入聚合管中。在用氩气脱气持续30分钟后，聚合反应在氮气流下在60℃进行持续16h。通过将溶液暴露于空气来停止反应，冷却至室温，并且倒入乙醚中以沉淀聚合物。通过真空过滤来收集白色固体并且在真空下干燥持续12h。收率：0.552g，83％。采用1H NMR(D2O)来确认聚合物组成。
BPMPC与基底的交联
将硅基底切割成2.4cm×2.4cm的片，并且在去离子水、异丙醇和丙酮中各自声处理持续5min，然后在氮气下干燥，随后用等离子体(Harrick Plasma PDC-32G)清洗并且用在甲苯中的iBTS处理过夜，然后用聚合物改性。CarboSil基底在没有预处理的情况下用聚合物涂覆。
当将BPMPC应用于基底上时，采用了两种涂覆方法：旋涂和喷涂。对于旋涂，聚合物改性的膜通过使用0.5mL BPMPC/乙醇溶液(10mg mL-1)以1000rpm在官能化的硅基底上展开(develop)持续30秒。喷涂应用于具有和不具有SNAP的CarboSil膜。使用喷枪从10cm的距离将BPMPC/乙醇溶液(2mg mL-1)喷到竖直放置的基底上，以在干燥后获得均匀的涂层。基于在不同形式的基底上提供最平滑的、无针孔的涂层的方法，在蛋白质吸附实验中使用旋涂，并且在SNAP/NO释放和细菌实验中使用喷涂。然后，用UV光(UVP，254nm，6.5mW cm-2)辐照BPMPC基底持续1min，以将BPMPC共价地结合到表面。用大量乙醇冲洗基底以除去未附接的BPMPC，然后在氮气下干燥。
聚合物涂层的表征
通过测量静态水接触角来表征表面润湿性，所述静态水接触角是从具有计算机控制的液体分配系统的DSA100液滴形状分析系统(drop shape analysis system)获得的。将1μL DI水滴沉积到基底表面上，并且通过分析摄影图像在10秒内测量水接触角。通过采用254nm UV光的UV-可见光谱(Varian)研究了BPMPC涂层的交联动力学。在硅基底和CarboSil基底上的旋涂的聚合物层的厚度通过具有在三个入射角(65°、70°和75°)处的白光源的M-2000V光谱型椭偏仪(J.A.Woollam co.,INC.)来测量。使用Cauchy层模型测量和计算改性层的厚度。聚合物涂覆的膜的红外光谱研究使用配备有可变角度掠射角衰减全反射(GATR-ATR)配件(Harrick Scientific)的Thermo-Nicolet 6700型光谱仪进行。
SNAP浸出研究和NO释放曲线
通过记录PBS溶液(用于浸泡样品)在340nm(SNAP的S-NO基团的特征吸光度最大值)处的吸光度，来量化从样品中排出的SNAP的百分比。在用非SNAP聚合物溶液涂覆之前对每个样品称重，以确定每个膜中SNAP的初始量。然后，将膜浸入含有PBS(pH 7.4，具有100μMEDTA以防止由金属离子引起的对NO释放的催化作用)的小瓶中，并在37℃储存。UV-可见分光光度计(Thermoscientific Genesys 10S UV-vis)被用于在所要求的时间间隔内定量缓冲溶液的吸光度。利用每个样品中存在的SNAP的初始量，将读数转换为缓冲液中SNAP的wt％。PBS溶液(样品被浸泡在其中)的1mL等分试样被用于每个样品的吸光度测量，以避免任何不一致的读数，并且对于每次定量使用三个重复。具有已知量的在PBS(具有EDTA)中的SNAP的校准图被用于内推(interpolate)从研究中记录的吸光度定量，并且将其转换为定量的样品中的SNAP的浓度。
被并入到聚合物中的SNAP在生理条件下释放NO，并且对于该研究，使用Sieverschemiluminescence NO (Sievers/> )(NOA280i，GEAnalytical,Boulder,CO,USA)对该释放进行实时测量和记录。样品储器(sample holder)为样品保持黑暗条件，以防止由任何光源引起的对产生NO的催化作用。其填充有5mL的PBS(pH 7.4，具有100μM的EDTA)以浸泡样品。EDTA充当螯合剂以防止由PBS中的金属离子引起的对产生NO的催化作用。该缓冲溶液通过放置在样品储器周围的温度调节的水夹套被保持在37℃。一旦在没有样品时的NO通量的基线(根据实施例2：一氧化氮释放动力学准备)被建立，随后将样品放置在样品储器中。通过经由吹扫和气泡流(sweep and bubble flow)连续供应被维持在200mL min-1的恒定流量的氮气，由样品储器中的样品释放的一氧化氮被朝向分析仪推动和吹扫。由样品释放的NO被朝向化学发光检测室推动，在化学发光检测室中发生图1上示出的反应。
产生的电压信号被转换成NO的浓度，并且显示在分析仪的屏幕上。使用ppb形式的原始数据和NOA常数(mol ppb-1s-1)，以ppb计的数据关于样品的表面积进行归一化，并且被转换为NO通量单位(x 10-10mol cm-2min-1)。在所提及的时间间隔内收集数据，并且在测量之间将样品储存在黑暗条件中的37℃的PBS(具有EDTA)溶液中。每天更换PBS，以避免在储存时间期间浸出的SNAP或释放的NO的任何积聚。仪器操作参数为7.4托的室压(cellpressure)、6.1psig的供应压力和-12℃的温度。对于每次测量使用三个重复。
蛋白质粘附测定
蛋白质吸附测试是用于评估血液粘附性的很重要的方法。因此，监测在蛋白质溶液中孵育之前和之后的基底的厚度变化，作为蛋白质吸附的指示。被涂覆的基底在PBS(pH7.4，0.01M)溶液中的纤维蛋白原(1mg mL-1)和溶菌酶(1mg mL-1)中孵育多达14天，随后每天进行厚度测量。
在第二方法中，使用在PBS溶液中的异硫氰酸荧光素-牛血清白蛋白(FITC-BSA，2mg mL-1)来评估在由BPMPC改性的CarboSil基底的表面上的蛋白质吸附行为。42-43在37℃将基底在FITC-BSA溶液中浸泡持续一个半小时，然后用蒸馏水冲洗并且用氮气干燥。然后通过Nikon Eclipse NI-U荧光显微镜(Nikon Instruments,Inc.)分析具有蛋白质的基底，所述显微镜使用5x物镜，具有滤光片组(Ex/Em 470/525nm)。为了证实对蛋白质吸附的长期抗性，在放入到FITC-BSA溶液中之前，将基底在BSA(1mg mL-1)PBS溶液中在37℃孵育持续多达7天。
细菌测定
在孵育24小时的时间段后，使用连续稀释，在细菌细胞生存力方面计算每个样品的细菌粘附性。用于执行该测定的方法是基于美国材料与试验协会(American Societyfor Testing and Materials)E2180方案的修改版本。金黄色葡萄球菌被用于样品的抗微生物评估。细菌在37℃的LB肉汤(Lennox)中培养，并且生长至每mL～106个菌落形成单位(CFU)，如通过光密度所测量的。所得的过夜培养物通过离心(2500g，7min)收集，并且重悬于PBS中。这种重悬的细菌悬浮液被用于孵育聚合物样品持续24小时。
在用细菌溶液孵育后，样品用PBS轻轻洗涤，以除去任何未结合的细菌。然后将样品放入1mL的PBS中，并且各自均质化持续1分钟，以将任何粘附的细菌转移到该新的PBS溶液中。在均质化后，将匀浆样品连续地稀释并且铺板在LB琼脂营养板上(37℃)。通过对每个板上的菌落手动地计数来测定细菌生存力。通过对每个样品每cm2的菌落数计数来完成细菌粘附力的计算。
统计分析
对于所有试验，所有数据均被量化为n≥3的平均值±标准偏差。对照膜和测试膜之间的结果通过使用学生t检验的方法的比较来分析。对于所分析的数据获得p的值，并且p<0.05被认为是显著的。
结果与讨论
两性离子聚合物(BPMPC)通过在乙醇中的自由基聚合来合成(方案1A)。该共聚物组成通过1H NMR光谱法来证实，并且由74:18:8(MPC:nBMA:BP)组成，其大致匹配单体进料比。该比提供了最佳的防污效果(下文讨论)连同在疏水性基底和亲水性基底两者上的最均匀的涂层。聚合物合成是简单且容易的，除沉淀外不需要另外的纯化，这使得大规模生产成为可行。BPMPC由于高浓度的MPC，是亲水性聚合物，并且在水溶液和醇溶液中具有高溶解度。三元共聚物中的甲基丙烯酸丁酯组分有助于均匀性和基底润湿(疏水性和亲水性两者)，以及提供另外的光化学交联位点。如上文所描述的，BPMPC的二苯甲酮组分通过C-H活化充当亲水性聚合物和任何有机基底之间的交联剂。
方案1A示出了BPMPC共聚物的合成。方案1B示出了SNAP的化学结构和NO分解，以及无害的N-乙酰基青霉胺副产物。
通过UV-可见光谱法对异丁基三氯硅烷(iBTS)官能化的石英基底研究了BPMPC的交联动力学。将聚合物溶液(10μL，10mg mL-1)滴铸在烷基化的石英上，并且允许溶剂蒸发。通过UV-vis监测UV交联反应，其中随着辐照时间的增加，发生了在255nm处的BP基团的吸光度降低。图2示出了UV-可见光谱，其中从0s至120s，255nm处的吸光度最大值急剧地下降，并且在240s后，没有观察到进一步的吸光度变化，甚至是在延长的辐照后。该结果表明，BPMPC交联以快速的动力学发生，并且只需要几秒钟就将BPMPC共价地结合到多种不同的基底。
为了进一步证实BPMPC聚合物的沉积和交联，对涂覆的基底进行FTIR。在IR光谱(图3)中，观察到羰基(1720cm-1)和PC基团(1240cm-1、1080cm-1和970cm-1)的吸收峰，并将它们归属于MPC单元。在(1650cm-1)处的峰代表BP酮的C＝O拉伸。辐照后该峰的显著减少进一步支持了形成具有在BP和基底之间的共价连接的网状聚合物。
为了测试涂层的稳定性和耐久性，监测BPMPC涂覆的硅样品的水接触角持续多达14天。将涂覆的基底浸入到PBS溶液中，并在37℃的培养箱中搅拌，随后用H2O冲洗并用氮气干燥，然后测量水接触角(图4)。对于裸CarboSil基底(bare CarboSil substrate)的初始静态接触角是约110°。在用BPMPC涂覆后，观察到接触角从110°至50°的显著下降，并且该接触角的值在浸入搅拌的PBS溶液中14天的时间段内被保持，这表明BPMPC涂层共价地结合到基底并且在生理条件下不会剥离。
用于测试NO释放行为的对照样品仅涂覆有CarboSil(用于并入SNAP的相同聚合物)，而测试样品涂覆有CarboSil和BPMPC。样品在轻度搅拌的条件下测试，以模拟生理条件。测试样品持续两周的时间段，以证明NO从疏水性聚合物和亲水性聚合物的组合中的可持续释放。
首先进行SNAP浸出研究，以测量在研究过程中在对照聚合物膜和测试聚合物膜中的SNAP的保留。每隔一天记录在PBS中浸泡的测量值持续2周(图5A)。聚合物中的大量SNAP保留确保了NO从聚合物基体中的持续释放，并且最小化了与SNAP浸出相关的风险(如果有的话)。44如图5A中所看到的，对于浸出的初始测量值(图5A的图中第0天)，在PBS中在37℃储存1小时后，对于对照基底和BPMPC涂覆的基底分别记录了0.39±0.06％和0.47±0.26％的损失。BPMPC涂覆的基底的这种最初的较高浸出可能是由于表面的亲水性。然而，如由来自在37℃储存1天和3天的关于BPMPC涂覆的测试膜的数据(对于第1天和第3天分别为0.96±0.26％和1.44±0.26％)和关于对照膜的数据(对于第1天和第3天分别为0.96±0.05％和1.55±0.07％)所支持的，SNAP浸出在对照样品和测试样品之间几乎是相同的。
SNAP分子从测试膜中较低浸出的趋势在14天的时间段内观察到。还应注意的是，在14天的时间段期间的任何点没有保持在低于37℃的温度或干燥条件下的样品。这样做是为了近似地模拟生理条件持续连续的持续时间。在实验持续时间内，对照样品和测试样品两者的浸出都保持非常低(<3.5％)，但是这里值得注意的是，尽管预期亲水性涂层可以通过将水分子吸引到聚合物表面而导致SNAP分子从含NO供体的聚合物中更高的浸出，但事实并非如此。这可能是由于涂层的超薄性质，其影响水性界面(aqueous interface)，但不影响聚合物膜的主体(bulk)。
对照样品和测试样品的NO释放测量也进行了持续14天的时间段(图5B)。采用Sievers化学发光NO分析仪的测量是对于释放NO的聚合物所接受的标准表征方法。45-47它通过测量NO与臭氧反应时由光子产生的电压来实时地测量NO释放。在37℃的恒温以及在PBS中储存样品以模拟生理条件。
结果表明，与对照样品(仅涂覆有CarboSil的含SNAP材料)相比，从测试样品(涂覆有CarboSil和BPMPC的含SNAP材料)的较高的NO释放的总体趋势。第0天的测量结果表明，测试样品具有7.75±3.26(x 10-10)mol cm-2min-1的通量，而对照样品具有3.76±1.50(x 10-10)mol cm-2min-1的通量(表1)。从测试样品的这种NO释放的爆发(burst)是由顶涂层的亲水性导致的，所述顶涂层将水分子吸引到样品表面。表面上的水分子可以调节NO的释放，因为SNAP在含水条件下更可溶(并且易于S-N＝O键断裂)。在储存一天后，对照样品示出NO通量的急剧下降(0.34±0.03×10-10mol cm-2min-1)。这被看到是因为第0天的SNAP分子的初始损失以及无法在第1天保持水合状态。相比之下，BPMPC涂覆的基底以1.02±0.02×10- 10mol cm-2min-1示出三倍的NO通量。NO通量的这种差异可能是由于测试样品的亲水性顶涂层，该顶涂层保持了水合的表面层，这促进了更多NO的释放。当与对照样品相比时，来自测试样品的这种较高NO通量的趋势可以通过表1中的14天研究和图5B中的图看出。
表1.对照样品和被涂覆的样品之间的一氧化氮释放动力学的比较
在14天的研究结束时，与对照样品(0.13±0.03(x10-10)mol cm-2min-1)相比，测试样品(0.38±0.13(x10-10)mol cm-2min-1)仍然释放三倍的NO通量。这种从顶部涂覆有BPMPC的CarboSil中较高的NO释放的倾向连同SNAP浸出的减少是非常有益的，并且将CarboSil的材料性能(低SNAP浸出)与归因于亲水的BPMPC顶涂层的较高的、持续的NO释放相结合。
如前所述，BPMPC涂层具有优良的亲水性，这有助于抑制蛋白质从溶液中的吸附。使用纤维蛋白原和溶菌酶作为模型蛋白质，以评估BPMPC涂层的防污性质。纤维蛋白原是大的(340kD，pI＝6.0)蛋白质，并且是凝血级联(coagulation cascade)中的关键生物大分子，其迅速地吸附到异物表面(foreign surface)并且结合到血小板并活化血小板。溶菌酶是小的蛋白质(14kD，pI＝12)，其在生理pH下带正电荷。图6A示出了纤维蛋白原分别在CarboSil、具有10％的SNAP的CarboSil、BPMPC涂覆的CarboSil和BPMPC涂覆的具有10％的SNAP的CarboSil的基底上的吸附厚度增加。在用作对照的裸CarboSil膜上，在孵育持续24小时后厚度增加约3nm，并且在2周后增加至超过30nm。对于具有10％ SNAP的CarboSil膜，观察到了类似的现象，这表明在表面上大量的蛋白质吸附，并且蛋白质随着时间的推移积聚。在另一方面，对于涂覆有BPMPC的CarboSil膜，吸附量明显较低，在孵育持续2周后仅观察到2nm的增加。吸附厚度的大的差异证实了BPMPC涂层具有优良的抗蛋白质性质，甚至在UV活化后。如所预期的，BPMPC涂覆的具有10％ SNAP的CarboSil膜也示出对纤维蛋白原的低吸附。此外，当膜经历溶菌酶溶液时，观察到类似的行为(图6B)。对照组中厚度增加超过14nm，而涂覆的组小于3nm。蛋白质吸附结果表明，亲水性BPMPC表面层提供了优秀的抗蛋白质性质。
为了进一步证实耐久的BPMPC涂层的防污效果，使用FITC标记的BSA蛋白质，使用荧光显微术来评估在未涂覆的CarboSil膜和涂覆的CarboSil膜上的蛋白质吸附。使用相同的激发光强度和暴露时间，比较未涂覆的CarboSil膜和BPMPC涂覆的CarboSil膜之间的结垢水平。图7A显示了在对照样品上的蛋白质吸附，并且在用BSAPBS溶液预处理的样品中观察到增强的荧光信号(图7B-图7C)。这些结果表明，在蛋白质溶液中孵育后，大量的BSA附着至CarboSil样品，这促进了FITC-BSA的聚集。相反，即使在BSA溶液中孵育持续7天后，也没有观察到蛋白质粘附到BPMPC改性的样品的表面(图7D-图7F)。综合所有这些结果，对照膜显示出大量的蛋白质吸附，而BPMPC涂覆的膜显示出优良的防污性质。
经常导致生物膜形成的细菌粘附是在潮湿和湿润的环境(包括植入的装置)中普遍存在的问题。对细菌生长重要的基本营养物可以从装置材料、植入后附着的身体蛋白质(bodily protein)或粘附至装置的表面的其他身体大分子污染物中获得。将设计的测试样品的抗微生物功效与对照样品进行比较，以确认其优越的杀菌性质和细菌排斥性质。
将样品浸泡在含～106CFU/mL金黄色葡萄球菌的细菌溶液中。金黄色葡萄球菌是常见的医院感染细菌(nosocomial infection bacteria)。在过去的二十年里，它与医疗保健相关的感染联系越来越紧密。48它们最常见地与心脏装置、血管内导管和导尿管以及其他假体装置相关。金黄色葡萄球菌的这种高流行性连同其已知的对污染医疗装置的蛋白质的亲和力49-50已经使其成为用于评估医疗装置材料的抗微生物功效的非常重要的病原体。由于这些原因，所开发的释放防污-杀生物剂的聚合物的细菌粘附研究是用金黄色葡萄球菌进行的。
如介绍中所提到的，由SNAP的分解所释放出的NO分子主动地杀死细菌，而两性离子顶涂层排斥蛋白质吸附，导致增强的抗微生物功效。在孵育24小时后，清楚地观察到测试样品的抗微生物效果。与其中观察到～106CFU/cm2的生长的对照样品相比，具有BPMPC的顶涂层的释放NO的聚合物示出99.91±0.06％的杀菌效率(～3对数减少(log reduction)，图8)。与仅具有BPMPC顶涂层的膜(70.15±14.13％)以及还有仅具有释放NO的部分的膜(98.88±0.54％)相比，这种减少更大。从结果中还可以得出结论，单独的BPMPC仅减少细菌粘附。然而，由于NO不是接触活性抗微生物剂，而是扩散性杀生物剂(diffusing biocide)，负载SNAP的样品也显著地减少细菌粘附。
这些结果与构成BPMPC的表面化学和NO的杀菌性质的基础的理论预期相一致。概况地说，来自CarboSil的表面的可改变的NO释放动力学和归因于BPMPC的表面化学的防止蛋白质和/或细菌粘附的协同效应将显著地降低植入的医疗装置的不期望的临床后果。
结论
总之，本公开内容的实例已经证明了NO释放和BPMPC的组合可以产生具有抗微生物能力和优良的防污性质的材料。在温和的UV条件下共价聚合物网络的形成是快速的(少于1min)，并且可以应用于从亲水性到疏水性的多种基底。更重要地，即使BPMPC涂层是约50nm，但其在保持其防污性质的情况下抵抗中度磨损持续超过一周。此外，NO释放曲线表明，当与对照相比时，从BPMPC涂覆的样品的较高的NO释放，其中SNAP的浸出较低。涂层也受到蛋白质吸附测试的挑战，持续延长的时间(多达2周)，其中防污性质保持。值得注意的是，通过BPMPC涂层增强了SNAP对金黄色葡萄球菌的高杀死效率。防污涂层与释放NO的抗微生物聚氨酯的这种一步光化学附接工艺是简单且可调整规模的工艺，其在医疗装置和其中需要防污性质和抗微生物性质的其他工业应用两者中具有应用。
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实施例2
本实施例示出了释放NO的供体(SNAP)和非浸出季铵(BPAM)的组合作用，该组合作用除了杀死超出直接接触点范围的细菌之外，还防止细菌细胞粘附在聚合物表面上。简言之，通过将SNAP并入到2080A(医疗级有机硅-聚碳酸酯-聚氨酯共聚物)中来制备聚合物膜。通过基于UV的光交联，BPAM作为顶涂层被表面固定到SNAP-CarboSil膜上。杀死聚合物表面上的细菌的基于SNAP-BPAM的策略被物理地和化学地表征，并且验证其抗菌效率。
材料和方法
材料
20 80A热塑性有机硅-聚碳酸酯-聚氨酯(下文将被称为CarboSil)从DSM Biomedical(Berkeley,CA)获得。N-乙酰基-D-青霉胺(NAP)、甲醇、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、二甲基乙酰胺(DMAc)、四氢呋喃(THF)、乙二胺四乙酸(EDTA)和硫酸从Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)获得。N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、2,2’-偶氮-双(2-甲基丙腈)(AIBN)和N,N-二甲基十二烷基胺购自Alfa-Aesar。LB肉汤Lennox和LB琼脂，miller培养基(miller media)购自Fischer Bioreagents(Fair Lawn,NJ)。4-甲基二苯甲酮(Oxchem)、环己烷(Honeywell)、叔戊醇(JT Baker)、异丙醇(IPA)(JT Baker)、氯化钠(EMD Chemical)和蛋白胨(HiMedia)在没有另外的纯化下使用。磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH 7.4，含有138mMNaCl、2.7mM KCl、10mM磷酸钠，被用于所有体外实验，包括细菌测试。包含/>9绿色荧光核酸染色剂和碘化丙啶红色荧光核酸染色剂的双色荧光活/死BacLight细菌生存力试剂盒L7012(two-color fluorescent live/dead BacLight bacterial viability kitL7012)(分子探针，Life Technologies)被用于评估细菌生存力。革兰氏阴性铜绿假单胞菌(ATCC 27853)和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)最初从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。
仪器方法
UV-可见光谱在Cary Bio分光光度计(Varian)上进行。在本研究中使用了254nm和365nm两种辐照波长。对于小的基底(1cm×1cm)和较大的基底(2.5cm×2.5cm)，UV光源分别为具有254nm波长的灯泡的紧凑型UV灯(UVP)和FB-UBXL-1000UV交联仪(FisherScientific)。在辐照期间，将基底保持在距离光源0.5cm处，以获得6.5mW/cm2的功率。另一个UV光源是OmniCure系列1000，其具有365nm带通滤波器，配备有液体填充的光纤波导(liquid-filled fiber optic waveguide)。将聚合物复合膜保持在距离该源2cm处，功率为25mW/cm2。使用M-2000光谱型椭偏仪(J.A.Woollam Co.,Inc)测量表面接枝的BPAM膜的厚度。水接触角通过具有计算机控制的液体分配系统的DSA 100液滴形状分析系统来测量。具有1μL的体积的水滴用于测量静态接触角。配备有100×物镜的荧光显微镜(EVOS FL,Thermo-Scientific)用于活/死细菌生存力显微照片。GFP FITC滤光块(filter cube)(激发：490nm，发射：503nm)被用于/>9并且德克萨斯红(Texas Red)滤光块(激发：577nm，发射：620nm)被用于碘化丙啶。使用一氧化氮分析仪(NOA)280i进行NO释放研究。
杀菌剂的合成及聚合物膜的制备
S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺(SNAP)的合成-将由Chipinda等人报告的方法改进用于从NAP合成SNAP[61]。简言之，亚硝酸钠和NAP以等摩尔比添加到含有2M H2SO4和2M HCl的甲醇和水的1:1混合物中。使用磁力搅拌器在黑暗中搅拌该混合物(以防止通过光刺激的NO释放)持续40分钟。此后，将反应容器置于冰浴中以沉淀SNAP晶体。将得到的晶体从溶液中过滤出来，并且允许其在黑暗中风干，随后抽真空以除去微量的任何溶剂。SNAP晶体在使用前储存在冷冻器中。
基于二苯甲酮的抗微生物分子(BPAM)的合成
基于二苯甲酮的抗微生物分子(BPAM)使用先前报告的Gao等人的程序来制备[20]。简言之，在氮气气氛下，将4-甲基二苯甲酮(6.0g，30.6mM)、NBS(6.0g，33.6mM)、AIBN(1.0g，6.1mM)和环己烷(100mL)添加到圆底烧瓶中。将悬浮液在回流下搅拌过夜。在搅拌后，将混合物冷却并过滤以除去任何固体残留物，并且将滤液在减压下浓缩。将固体混合物溶解在乙醚中，并且用水、盐水洗涤，并且经硫酸镁干燥。将混合物过滤并且在减压下浓缩。将重新获得的固体从无水乙醇中重结晶，以给出细小的白色晶体。收率：7.1g，89％。1HNMR:δ,7.80(t,2H,J＝3.0Hz)；7.78(t,2H,J＝1.4Hz)；7.60(t,1H,J＝7.0Hz)；7.50(d,2H,8.2Hz)；7.49(t,2H,7.6Hz)；4.53(s,2H)。13C NMR(CDCl3):δ,195.93,142.09,137.39,132.54,130.52,129.99,128.92 128.33,128.16,32.25。
N-(4-苯甲酰基苄基)-N,N-二甲基丁-1-铵碘化物(BPAM)
将(4-溴甲基)二苯甲酮(1.7g，6.2mM)、N,N-二甲基十二烷基胺(1.7mL，6.2mM)和叔戊醇(5mL)添加到可密封的耐压烧瓶(pressure flask)中。在95℃在该密封容器中将混合物搅拌并加热持续24h。将烧瓶冷却至室温，并且在减压下除去溶剂。将所得的棕色蜡状固体在己烷/乙酸乙酯(7:4)中重结晶，以给出蜡状白色固体。收率：1.7g，67％。1H NMR(CDCl3):δ,7.84(dd,4H,J＝8.2,23.9Hz)；7.75(d,2H,J＝7.0Hz)；7.59(t,1H,J＝7.6Hz)；7.47(t,2H,7.7Hz)；3.57(m,2H)；3.35(s,6H)；1.80(bs,2H)；1.31(bs,4H)；1.21(bs,16H)；0.84(t,3H,J＝6.6Hz)。13C NMR(CDCl3):δ,210.33,139.75,136.70,133.53,133.24,131.53,130.54,130.24,120.66,66.63,64.12,49.85,32.06,29.69,29.58,29.46,29.37,26.42,22.82,14.29。
抗微生物SNAP-CarboSil聚合物膜的制备
为了开始制备聚合物SNAP膜，将70mg/mL的CarboSil溶解在作为溶剂的四氢呋喃(THF)中，并且使用磁力搅拌器在室温搅拌持续1h。在完全溶解后，在Carbosil-THF溶液中快速加入10％(w/w)的SNAP并且溶解持续2min。使用3ml的所得SNAP-CarboSil-THF溶液将SNAP膜(10wt％)浇铸在特氟隆模具(直径＝2.5cm)中，并且在黑暗中干燥过夜，以防止不期望的NO从膜中的损失。该膜用50mg/ml的CarboSil溶液(在THF中)涂覆两次。这种外部涂层确保了SNAP不从膜中浸出，并且还产生光滑的表面。对照CarboSil膜在不添加SNAP的情况下以类似的方式制备和涂覆。
BPAM在SNAP-CarboSil膜上的表面固定
使用喷涂将BPAM膜固定在SNAP-CarboSil膜表面上。使用airbrush喷枪从20cm的距离将BPAM/异丙醇溶液(5mg/mL)喷到竖直放置的基底上，以获得均匀的涂层。在溶剂蒸发后，BPAM的薄膜保留在表面上。然后，将BPAM涂覆的膜随后用UV光(254nm，6.5mW/cm2)辐照持续2min，以将BPAM共价地固定至表面。在异丙醇的情况下将该膜声处理持续1min以冲洗掉任何残留物，物理吸附BPAM并且在氮气流下干燥。图9示出了制备SNAP-BPAM CarboSil膜(下文将被称为SNAP-BPAM膜)的制造程序。
一氧化氮释放动力学
使用Sievers化学发光一氧化氮分析仪(NOA)280i(Boulder,CO)测量从SNAP膜和SNAP-BPAM膜的一氧化氮释放。Sievers化学发光NOA被认为是用于检测从基底的体外一氧化氮释放的黄金标准。由于限制干扰物质例如硝酸盐和亚硝酸盐(nitrite)的能力，它被广泛地用于测量从材料释放的一氧化氮，因为干扰物质不从样品容器转移到反应池。在NO释放测量之前，将膜(n＝3)孵育持续1h(含100mM EDTA的PBS，室温)，以避免与NO释放材料相关的爆发释放[42，58]。然后将膜放置在浸没在含100mM EDTA的PBS(pH 7.4)中的样品容器中。使用氮气吹扫气体和鼓泡器将一氧化氮从缓冲液中连续地吹除并从顶部空间吹扫到化学发光检测室中。将膜浸入具有EDTA的PBS中，并且在NO释放测量之间储存在玻璃小瓶中并保持在37℃。对于每次NO释放测量都使用新鲜的PBS溶液，并且在每次测量后都将膜保存在新鲜的PBS溶液中用于储存。
UV-可见分光光度法
在室温，使用UV-可见分光光度计Cary Bio分光光度计(Varian)在200nm-700nm的波长范围内记录所有UV-可见光谱。通过以1000rpm用200μL的CarboSil/THF溶液(50mg/mL)旋涂持续30s，在石英玻璃基底上展开CarboSil膜和SNAP CarboSil膜。通过用BPAM/IPA溶液(10mg/mL)喷涂，在CarboSil/石英基底上顶部涂覆BPAM。测量CarboSil的UV可见光谱作为背景。SNAP的S-NO基团的存在提供了在340nm和590nm处的特征吸光度最大值[42，62]。将CarboSil膜溶解在DMAc中，并且在340nm处测量吸光度值。然后使用从已知的SNAP在DMAC中的摩尔浓度获得的校准曲线来确定SNAP的量，并且与未经处理的对照CarboSil膜进行比较。
在聚合物表面上的粘附和活菌落形成单位(adhered and viable colonyforming units)的定量
在该实施例中，使用革兰氏阴性铜绿假单胞菌和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(它们是医院获得性感染(hospital acquired infection)(HAI)的最常见原因之一)来测试具有SNAP-BPAM组合的CarboSil聚合物杀死聚合物表面上的粘附的细菌的能力。使用标准细菌粘附测试的改进的方案来定量膜的每表面积的细菌的活菌落形成单位(CFU/cm2)[63-65]。从先前孵育的LB-琼脂板中分离出单个细菌菌落，并在LB培养基中以150rpm的旋转速度在37℃孵育持续14h。使用UV-可见分光光度计(Thermo scientific Genesys10S UV-vis)以600nm的波长测量培养物的光密度(O.D600)，以确保细菌处于其生长的对数期。然后，将细菌培养物以3500rpm离心持续7min，弃去上清液。并且将pH 7.4的无菌的磷酸盐缓冲盐水(PBS)添加到细菌颗粒(bacterial pellet)中。将该程序重复两次，以除去所有微量的LB培养基并将细菌悬浮在PBS溶液中。平行地，制备细菌的系列稀释液，并将其铺板在LB琼脂陪替氏培养皿中，以便验证实验之间活细胞的浓度的一致性。测量在PBS中的细胞悬浮液的OD600，并基于标准校准曲线将其调节为107-109范围内的CFU/ml。在将CarboSil对照、SNAP膜、BPAM涂覆的CarboSil膜和SNAP-BPAM膜(n＝3；表面积＝0.94cm2)在PBS中浸泡持续1h之后，将它们在37℃在振荡孵育箱(shaker incubator)(150rpm)中暴露于细菌细胞(CFU：109-107)持续24h，以说明爆发效应。24h孵育允许细菌粘附至膜的表面，并且粘附的细菌受到BPAM和NO的作用。在24h后，从溶液中移除膜，并且任何松散结合的细菌通过使用移液管用连续流动的PBS(5ml)将其轻轻冲洗来洗涤。使用Omni-Tip均质器将膜声处理持续45秒，随后涡旋持续30秒，以在2ml PBS溶液中收集结合的细菌。将含细菌的PBS溶液连续地稀释(10-1-10-5)，铺板在固体LB琼脂培养基中，并且在37℃孵育持续20h。在20h后，对在聚合物表面上的粘附的活细菌的CFU计数，同时考虑稀释因子。
细菌暴露之后残留NO通量的分析
为了确保制造的膜在暴露于铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌菌株持续24h后释放足够水平的一氧化氮(实施例2：在聚合物表面上的粘附和活菌落形成单位的定量)，按照如在实施例2：一氧化氮释放动力学中所解释的相同程序，使用Sievers一氧化氮分析仪(NOA)来确定残留NO释放。分析一式三份的每种膜类型(n＝3)，用于测量残留的NO通量。
抑制区(ZOI)分析
遵循标准琼脂扩散方案以进行抑制区(ZOI)研究，以证明从SNAP和SNAP-BPAM膜释放的NO分子在周围琼脂中的扩散性质。设计这项研究以证明从聚合物复合材料的NO释放可以杀死与聚合物膜不直接接触的细菌，这是单独的BPAM无法实现的。作为概念的证明，革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性铜绿假单胞菌菌株被用于本研究。将每种细菌的单个菌落分别悬浮在LB中，并且在37℃以150rpm的旋转速度孵育持续14h。使用UV-可见分光光度计(Genesis 10S-Thermo Scientific)，在600nm处测量每种细菌培养物的光密度(OD)(OD600)。基于基于金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的已知浓度的校准曲线，将观察到的OD600调节为1×107菌落形成单位每mL(CFU/mL)。将无菌的棉拭子放置在每个菌株培养物中，并且然后抵着预先制备的LB-琼脂陪替氏培养皿(14cm)轻轻按压并旋转，以无菌地且均匀地扩散细菌。将对照膜、SNAP膜、BPAM膜和SNAP-BPAM膜的圆盘(直径：22mm)置于细菌培养物的顶部并轻轻地按压。将陪替氏培养皿在37℃以倒置的位置孵育过夜。比较ZOI直径以评估释放NO的SNAP膜和SNAP-BPAM膜的抗微生物功效。
活/死染色测定(Live/dead staining assay)
尽管细菌粘附测试允许对在聚合物的表面上的活CFU进行计数，但它不能提供关于有多少细胞最初被附着并且由于SNAP-BPAM杀生物活性而死亡的任何定量或定性信息。使用活/死染色，我们观察到结合到聚合物的表面的活细菌细胞和死细菌细胞。该定性研究然后与Cell Profiler软件相结合，以对聚合物表面上的活细菌和死细菌进行定量。9染料，产生绿色荧光，并且标记具有完整的膜的群体中的所有细菌。相比之下，产生红色荧光的碘化丙啶仅穿透具有受损的膜的细菌，并且替代/>9染色剂，这导致绿色荧光的减少和红色荧光的出现。因此，具有受损的细胞膜的细菌可以与活细菌区分开。对于每种细菌菌株，10mL的细菌培养物在肉汤中生长至对数期后期(在37℃以100rpm振荡持续10h)。将培养物以4000rpm离心持续10min。除去上清液，并且将颗粒悬浮于无菌的蒸馏水中。在染色前，将具有约108CFU/mL的浓度的10μL细菌悬浮液置于CarboSil膜、BPAM涂覆的CarboSil膜、SNAP共混的CarboSil膜和SNAP-BPAM CarboSil膜上，并且在37℃干燥持续5min，以实现快速且紧密的接触。将等体积的/>9和碘化丙啶(1.5μL)合并，加入到1mL的蒸馏水中，并充分混合。将稀释的染料混合物(10μL)夹在带有粘附的细菌的载玻片和18mm方形盖玻片之间。将样品在室温在黑暗中孵育持续15min，并且用EVOS荧光显微镜定性地成像。然后，通过在膜上随机选择不同的点(n＝3)，用Cell Profiler软件对来自荧光图像的活细菌和死细菌两者进行定量。
统计显著性-除非另有说明，否则对于所有定量测量都考虑了n＝3个数据点。标准的不等方差双尾t检验(two-tailed t-test with unequal variance)被用于进行所有的统计比较。数据以平均值±标准偏差报告，并且陈述了p值<0.05的显著性用于比较。
结果
BPAM在SNAP-CarboSil上的光交联和总SNAP的定量
BPAM的二苯甲酮部分与CarboSil聚合物的C-H基团发生光化学反应，以在界面处形成新的C-C键。在吸收UV光后，一个电子从羰基基团的非键n轨道升到反键π*轨道产生了类双自由基三重态(biradicaloid triplet state)，其中缺电子的氧n轨道与周围的弱C-Hδ键相互作用，导致H的提取以完成半充满的n轨道。两个生成的碳自由基然后组合以形成新的C-C键。该过程使用UV-可见光谱法通过BP的n-π*跃迁的吸光度的降低来监测(图10A)。在暴露于UV光之前，观察到在255nm处的λ最大吸光度，这是BPAM的特征性n-π*跃迁[20]。在从310nm-350nm的范围内的光谱肩峰被指定为SNAP的UV吸光度(λ最大)[61]。SNAP吸光度的低强度是由于CarboSil聚合物基体中SNAP的低浓度。在UV辐照持续90秒后，在255nm处的吸光度下降，这表明交联反应的完成。在250nm～300nm的宽肩峰可能是由于聚碳酸酯基质(polycarbonate base)的轻微光氧化[66]。UV处理后剩余的SNAP含量在图10B中示出并且被证实保持初始SNAP含量的95.44±2.5％。这可能主要是由于在应用BPAM之前，在SNAP膜中存在CarboSil的顶涂层。在过去，当与无顶部涂覆的膜相比时，应用约100微米的CarboSil的顶涂层已经显示出显著减少了浸出[42]。这些结果证实了表面固定的BPAM不会不利地导致SNAP从聚合物复合材料中的显著损失。
从SNAP膜和SNAP-BPAM CarboSil膜的一氧化氮释放
将SNAP并入到CarboSil中已经显示出向感兴趣的特定位点提供连续的和局部的NO递送[67，68]。在医疗级聚合物中并入SNAP已经显示出是血液相容的(hemocompatible)，并且在室温和生理条件在长期储存期间具有稳定性[60,69,70]。
在这项研究中，在生理条件下(pH 7.4，37℃)测量了NO的释放速率，以证明BPAM涂层的存在不会不利地影响NO释放曲线。NO从这些化合物的释放来源于S-NO键的断裂，这种断裂可以使用热、光、水分(moisture)或金属离子来催化[42,57,62]。如图11中所示，经由NOA记录了来自SNAP膜和SNAP-BPAM膜的代表性实时NO释放曲线。SNAP膜表现出1.35±0.11×10-10mol min-1cm-2的初始释放速率以及在24h后的0.28±0.02×10-10mol min-1cm-2的释放速率。带有BPAM顶涂层的SNAP膜在初始(2.58±0.25×10-10mol min-1cm-2)和在24小时时间点(0.59±0.04×10-10mol min-1cm-2)两者处均示出NO通量的增加(图12)。这可以归因于在存在如上文所描述的BPAM顶涂层的情况下膜的亲水性的增加。增加的通量还完全在生理范围内(0.5-4.0×10-10mol min-1cm-2)，这使得它对于生物医疗装置应用是相关的且有效的[39]。由膜所呈现的NO通量足以杀死细菌超过24h。这已经在使用具有10wt.％SNAP的类似疏水性聚合物的7天绵羊导管模型(sheep catheter model)中在体内被示出[71]。这些材料在28天时间段内表现出相似的NO释放特性，并且证明在生理极限的下限的NO释放速率仍然有效地提供抗菌活性。另一份报告还已经示出，具有SNAP的疏水性聚合物已经在生理水平延长了NO释放(多达20天)[67]。此外，在医疗级聚合物中并入SNAP不仅是血液相容的和生物相容的，而且在室温和生理条件在长期储存(6个月)期间也是稳定的[60,69,70]。
涂层厚度和接触角分析
厚度和静态接触角测量是对于聚合物涂层最相关的物理表征之一。在表3.1中说明了用单独的抗菌剂和组合的抗菌剂官能化的CarboSil膜的这种表征的结果。在UV辐照后，在CarboSil膜和SNAP CarboSil膜上的交联的BPAM涂层的厚度分别为45.7±0.3nm和47.9±0.5nm，这表明BPAM涂层的成功的接枝。在表1中还列出了对照CarboSil表面、SNAPCarboSil表面、BPAM CarboSil表面和SNAP-BPAM CarboSil表面的水接触角。我们之前已经示出，将SNAP共混到CarboSil聚合物基体中不影响聚合物的疏水性[68]。研究表明，由于CarboSil的较低的水吸收，从SNAP掺杂的CarboSil中已经观察到了SNAP的有限浸出。与未涂覆的膜相比，使用顶涂层进一步减少了浸出(在前24h中<10％的总SNAP负载量)。Carbosil的顶涂层的变化比光交联的BPAM涂层厚得多(100μm相对于BPAM的50nm)，并且因此预期SNAP的浸出动力学的很小变化或没有变化。
表2.抗菌SNAP-BPAM膜的物理性质
数据以对于n＝3个样品的平均值±标准偏差报告，并且陈述了p值<0.05的显著性用于比较。
将SNAP共混到CarboSil聚合物基体中不影响聚合物的疏水性。发现CarboSil对照表面是疏水性的，其中接触角(CA)为119.3±0.4°。BPAM的表面接枝层显著地降低了基于CarboSil的聚合物膜的疏水性，将CA减少到63.5°±0.5°，这是由带正电荷的铵官能团引起的。表面亲水性的增加预期增加SNAP-BPAM聚合物膜的抗菌功效，因为研究已经表明，当与疏水性表面相比时，从亲水性表面的NO释放显著增加[42]。这与从NO释放动力学研究中获得的结果一致。此外，增加的亲水性有助于排斥非特异性蛋白质吸附，并且最终是细菌粘附[72,73]，如通过细菌粘附测试和活/死染色所证实的。
粘附的活细菌的定量(CFU/cm2)
生物膜形成是与医院获得性感染(HAI)相关的发病率和死亡率的主要原因。金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性细菌)和铜绿假单胞菌(革兰氏阴性细菌)是医院血流感染的最常见原因之一，它们可以在留置的生物医疗装置上形成嵌入的生物膜基体[74-76]。如图13中所示，粘附在SNAP-BPAM膜表面上的活的铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的量显著低于对照膜的量。虽然BPAM和SNAP是优秀的抗微生物剂，但该组合提供了单独的抗微生物剂不具备的若干优势。与SNAP相比，BPAM本身对革兰氏阴性铜绿假单胞菌具有更好的抗菌潜力，并且SNAP关于其对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的杀菌作用更好。该组合对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌两者都非常有效。总的来说，与对照膜相比，SNAP-BPAM膜最大程度地减少了粘附的活细菌(革兰氏阳性和阴性两者)。与CarboSil对照相比，SNAP-BPAM膜示出对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌4个对数的减少，以及对革兰氏阴性的3个对数的减少。图13和表3代表对于聚合物复合材料的每表面积的两种细菌的粘附的CFU的降低的图和原始数据。这两种细菌之间的结果的差异可以归因于革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的细胞壁和细胞膜组成的差异[77]。
表3.在细菌暴露之前和之后，比较的聚合物复合材料的活细菌粘附数据和NO通量分析
*NO通量(x 10-10mol min-1cm-2)。数据以对于n＝3个样品的平均值±标准偏差报告，并且陈述了p值<0.05的显著性用于比较。S.A后意指金黄色葡萄球菌暴露24h后的NO通量，并且P.A后意指铜绿假单胞菌暴露24h后的NO通量。
非浸出的BPAM只能作用于密切接触的细菌，而NO由于扩散可以超出直接接触点范围起作用。随着时间的推移，聚合物复合材料上的细菌细胞层(活的或死的)也会降低BPAM的活性，因为它们倾向于中和季铵上的电荷。该问题可以通过应用NO来解决。NO的小分子尺寸允许其扩散穿过细菌生物膜并且杀死细菌细胞，否则该细菌细胞对杀菌剂有抗性。换句话说，逐渐释放的NO通过降低表面附近的周围细菌的浓度延长了BPAM的寿命。SNAP-BPAM膜具有比单独的SNAP膜相对较高的亲水性(由于BPAM涂层)，这增加了从SNAP-BPAM膜的NO通量释放。
将膜暴露于细菌悬浮液之后的残留NO分析(图14)示出了多达0.92±0.05×10- 10mol min-1cm-2通量的NO的丰度，这表明这些膜可以在超出24h后继续表现出抗菌性质。这些杀菌剂通过多种细菌杀死机制的组合作用保证了对于革兰氏阳性菌株和革兰氏阴性菌株两者的活细菌负载的显著降低。
通过NO扩散杀死细菌
虽然BPAM是优秀的抗微生物剂，但由于其非扩散的性质，它不能杀死在生物膜基体中受保护的细菌。此外，表面结合的BPAM的电荷密度可能被从死细菌排出的细胞质中的阴离子细胞组分所中和，或者被覆盖材料的表面的带负电荷的死细菌细胞层所遮蔽[26，27]。因此，NO的扩散性质在超出材料的接近的附近的范围的生物膜清除中可以是有益的。标准琼脂扩散测试允许我们显示在存在BPAM和不存在BPAM的情况下释放NO的膜的杀菌效果。
当暴露于带有细菌培养物的LB琼脂板时，具有并入的抗微生物剂(SNAP-BPAM)及其组合的CarboSil膜产生不同直径的抑制区(ZOI)。如所预期的，结果表明BPAM没有ZOI，而SNAP膜和SNAP-BPAM膜显示出清晰的ZOI，这是由于当放置在37℃的孵育箱中持续20h时从SNAP释放NO气体(图15A-图15B)。对此的解释是NO的扩散性质，NO可以渗透到LB琼脂中，并且从而阻止在膜周围的区域中的细菌生长。SNAP中S-NO键的断裂导致NO的释放。在另一方面，BPAM在本质上是非扩散的，并且因此只能作用于直接接触的细菌。从应用的角度来看，这将有益于生物膜的消除，因为NO由于其小尺寸而将容易地穿透细菌生物膜的基体。尽管BPAM没有显示任何ZOI，但它确实阻止了在膜下直接接触的细菌的生长。观察到铜绿假单胞菌的ZOI对于SNAP膜为24mm，并且对于SNAP-BPAM膜为26mm。类似地，观察到金黄色葡萄球菌的ZOI对于SNAP膜为24mm，并且对于SNAP-BPAM膜为25mm。在所有复合材料中，全部SNAP-BPAM复合材料示出对于金黄色葡萄球菌以及铜绿假单胞菌菌株两者的最大ZOI。SNAP-BPAM组合的较大ZOI是由于BPAM顶涂层的NO通量的增加(在SNAP膜中的1.35±0.11×10-10相对于在SNAP-BPAM膜的2.58±0.25×10-10mol min-1cm-2)，如由化学发光NOA观察到的。图15A-图15B示出了对于两种细菌菌株的膜之间的比较的ZOI直径。对这两种细菌菌株示出的抗菌功效的差异可以归因于革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的膜性质[77]。
在CarboSil膜上的活/死染色测试的分析和定量
如上文所提及的，细菌粘附测试示出粘附的活细胞的减少，并且抑制区琼脂扩散测试分别证实了通过扩散杀死细菌。然而，膜上的活细菌和死细菌的相对数目都没有通过这些测试中的任一种被评估。因此，还使用活/死荧光染色测定来评估SNAP-BPAM杂合CarboSil膜的抗菌活性，所述活/死荧光染色测定将活细胞染色为绿色，并且将死细胞染色为红色。在对照CarboSil膜、BPAM膜、SNAP膜和SNAP-BPAM膜上暴露的金黄色葡萄球菌细胞的荧光图像。通过使用Cell Profiler软件，在三个随机选择的点上定量地估计对于活/死测定的细菌细胞计数，如由已发表的报告所建议的[78,79]。在对照膜上，97.35±0.72％的细菌细胞显示绿色荧光，其在整个表面均匀地分布，并且保持完整的球形形状，这表明测试的细菌细胞是活的。在BPAM涂覆的CarboSil膜上，全部细菌细胞的94.41±0.61％被染色为红色，这指示通过与表面结合的季铵接触所导致的细胞膜破裂。在SNAP膜上，全部细菌的97.58±0.44％显示红色荧光，这指示死亡的细胞。在SNAP-BPAM CarboSil膜的情况下，获得了99.62±0.59％的杀死功效，这表明该混合方法有效地增强了官能化的生物相容性聚合物材料的抗菌活性。与SNAP和BPAM膜相比，SNAP-BPAM的杀菌活性的这种增强与活细菌粘附测试以及抑制区测试相一致。值得注意地，观察到细菌细胞在膜的表面上的聚集模式不同，并且依赖于抗菌剂。在对照CarboSil膜和BPAM膜上的细菌细胞具有规则的细菌细胞分布模式。在另一方面，细胞在SNAP CarboSil膜上聚集在一起，这可能是由于CarboSil表面的疏水性，该疏水性导致对带负电荷的细菌细胞的排斥。在SNAP-BPAM膜上，死细胞在整个表面分散，这可能是由于与SNAP膜(C.A＝115°±0.2°)相比，SNAP-BPAM膜的表面的相对较低的疏水性(C.A＝63.5°±0.5°)，这是由带正电荷的铵官能团产生的。总的来说，活/死染色实验结合Cell Profiler软件进一步验证了组合的NO和表面结合的季铵可以提供双重抗菌活性，并且因此与单独的剂相比，显著地增强了杀生物活性。作者建议对细菌聚集模式进行进一步的体外测试和高分辨率图像分析，以验证这一似乎合理的理论解释。
讨论
在本实施例中，组合使用了NO供体分子(SNAP)和表面固定的基于二苯甲酮的抗微生物分子(BPAM)，并且评估了它们降低医疗级聚合物表面上的微生物粘附和生存力的组合效果。由于BPAM和SNAP的λ最大明显是分开的，这以两种方式有益于杂合材料：(1)即使在SNAP存在的情况下，BPAM也可以有效地吸收光子用于光反应；(2)SNAP的光降解在交联过程中被限制，因为对于BPAM的最大能量吸收效率，辐照波长是254nm。
通过以下来测试SNAP-BPAM膜的抗菌潜力：(i)细菌粘附测试，(ii)琼脂扩散测试，(iii)活/死染色。结合这三种测试允许定量地评估细菌粘附(活的和非活的两者)以及它们随后被NO和BPAM作用杀死。NO的抗微生物性质是由于酶的变性、DNA的脱氨基作用和细菌基体中的脂质氧化[52]。在另一方面，BPAM通过破坏细菌细胞膜的完整性来杀死直接接触的细菌，该破坏细菌细胞膜的完整性是由于静电相互作用[21,22]。
从平移的角度(translational perspective)来看，基于SNAP的释放NO的聚合物具有许多期望的性质，例如长期储存稳定性(6个月)、易于灭菌和延长的NO释放(>2周)而不负面地影响聚合物的物理特性、生物相容性和血液相容性[42,59,60]。类似地，已经报告了由于沉积的BPAM薄膜的高表面电荷密度，表面接枝的BPAM在瞬间接触时表现出对抗革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的优秀的抗微生物活性[20]。然而，这是将SNAP和BPAM组合在一起以证明它们的抗菌潜力的第一个实例。
本实施例表明，SNAP-BPAM组合比单独的SNAP或BPAM具有更好的抗菌性质。BPAM被高度认为是杀菌剂，但是，它只能作用于直接接触的细菌。NO分子通过其扩散性质而允许作用于超出直接接触范围的细菌。这种性质可用于作用于生物膜基体，否则该生物膜基体阻止抗菌剂的渗透并且保持细菌免疫。然而，如从接触角的降低明显的，BPAM赋予SNAP-CarboSil相对亲水的表面。研究已经表明，当与疏水性表面相比时，从亲水性表面释放更多的NO，这又导致更多的细菌杀死[42]。这与NO通量分析相一致，因为与SNAP膜相比，SNAP-BPAM膜示出更高的NO通量。此外，亲水性表面有助于排斥非特异性蛋白质吸附，并且最终是细菌粘附[72,73]，如通过细菌粘附测试和活/死染色所证实的。从平移的角度来看，用非浸出的亲水性表面制造的生物医疗植入物在与体液接触后将能够形成溶剂化的含水层，并且从而减少细菌粘附[80]。此外，在血液接触装置应用中，NO还具有暂时抑制接近聚合物表面的血小板的活化的局部效应的优点[56]。
在本实施例中，含SNAP-BPAM的CarboSil聚合物的体外表征表明，与单独的SNAP或BPAM相比，这样的聚合物复合材料可以产生更好的抗菌效果(图14、图15A-图15B)。它们的独特但非常有效的杀菌作用的模式确保了与聚合物复合材料接触的细菌通过多种杀菌机制受到攻击。采用SNAP-BPAM组合的NO释放显示出高于采用单独的SNAP，这使得它们的协同作用在NO向生物膜中的扩散方面更有效(图11和图12)。这些SNAP-BPAM-CarboSil复合材料在细菌暴露持续24h后，在生理范围内继续释放NO通量(图14)。通过降低聚合物表面附近的周围活细菌的浓度，可扩散的NO的持续释放还延长了BPAM的局部作用的持续时间，这允许BPAM杀死任何局部接触的细菌。
总的来说，这些杀菌剂通过不同机制的组合作用保证了对于革兰氏阳性菌株和革兰氏阴性菌株两者的活细菌负载的显著减少。此外，NO的快速作用(半衰期<5秒)和表面结合的BPAM通过物理膜破坏的非特异性致死作用限制了抗性细菌菌株的发育[47,51,53-55]。
结论
在本实施例中，通过在CarboSil聚合物中共混SNAP来制造聚合物复合材料，并且通过UV光交联来表面接枝BPAM，并且定性和定量地测试其抑制表面上的细菌的能力。与单独的SNAP膜或BPAM膜相比，SNAP-BPAM组合在最大化聚合物复合材料的表面上的细菌负载方面更有效。细菌粘附测试证明，组合在最小化革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌两者的粘附的活的CFU方面同样有效，而当单独测试时，SNAP对金黄色葡萄球菌更有效，并且单独的BPAM对铜绿假单胞菌更有效。如由琼脂扩散测试所证明的，NO的扩散性质允许杀死超出直接接触点范围的细菌，而这是BPAM不能单独实现的。这对于在生物膜消除中的潜在应用是重要的。与对照相比，活/死染色允许观察到SNAP-BPAM组合具有较高数目的附接的死细菌(相比于活的)。与SNAP膜相比，BPAM涂层还增加了亲水性和较高的NO通量。此外，基于NO的材料可以被用于血液接触装置的应用，因为它暂时抑制了在聚合物的表面上的血小板的活化，这是BPAM所不能的[56]。总的来说，所有这些特性对于控制生物医疗装置相关的感染都是理想的，特别是在防止细菌由于由SNAP和BPAM所展示的不同杀死机制而发展出抗生素抗性方面。这样的高效抗微生物属性提供了制造用于各种医疗装置应用的抗微生物表面的新的范例。
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实施例3
为了探索两性离子聚合物到范围从亲水性到疏水性的多种基底的共价接枝，我们将二苯甲酮(BP)发色团(光活性系链试剂)并入到聚合物主链中。19-24在低强度UV辐照下(350nm-365nm)，BP基团可以产生二价自由基，该二价自由基从相邻的C-H键中提取脂族氢以形成新的C-C键，而不会对聚合物或基底造成强烈的UV氧化损伤。20通过这一过程，网状聚合物膜可以带着优良的耐久性被接枝到广泛选择的含C-H的材料和表面，并且已经被用于许多应用，例如微流体、25-26有机半导体、27氧化还原聚合物、28-29防冰聚合物、30和生物传感器。31-32
一氧化氮(NO)由于其天然的广谱抗微生物性质而被认为是有效且非特异性的杀菌剂，具有低的促进细菌抗药性的风险。33-35NO利用了若干抗微生物机制，包括胺和硫醇的亚硝化、脂质过氧化、酪氨酸硝化和DNA切割。36目前NO供体的主要类型包括有机硝酸盐、金属-NO络合物、N-亚硝胺和S-亚硝基硫醇，37S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺(SNAP)(经常被研究的NO供体)表现出显著的抗微生物作用和抗血栓形成作用。38-39在我们先前的研究中，SNAP已经被成功地掺杂到CarboSil聚合物膜中，并且这些SNAP掺杂的基于聚氨酯的材料可以在很低的浸出水平下释放NO持续延长的时间段(20天)。38,40-41
在这项工作中，我们合成了两性离子三元共聚物(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱-共-甲基丙烯酸丁酯-共-二苯甲酮，BPMPC)，其可以在UV辐照后共价地接枝到抗微生物的释放NO的CarboSil(有机硅-聚碳酸酯-聚氨酯热塑性塑料)。聚合物涂覆的表面被详细地表征，并且两性离子稳定性在生理条件下被评估。评估了这些涂层的蛋白质排斥性质。同时，在涂覆或UV辐照期间没有观察到SNAP降解，并且在两性离子顶涂层的情况下释放曲线保持在生理水平之上持续2周。此外，采用细菌测试证实了增强的抗微生物活性。
实验部分
材料
4-乙烯基二苯甲酮(BP)根据先前报告的方法合成。30 2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(MPC)、来自牛血清的白蛋白(BSA)、异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白(FTIC-BSA)、N-乙酰基-D-青霉胺(NAP)、亚硝酸钠(NaNO2)、浓硫酸(浓H2SO4)、四氢呋喃(THF)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、氯化钾、氯化钠和乙二胺四乙酸(EDTA)购自SigmaAldrich(St.Louis,MO)。2,2’-偶氮双(2-甲基丙腈)(AIBN)和甲基丙烯酸正丁酯(BMA)购自Alfa-Aesar(Haverhill,MA)。异丁基三氯硅烷购自Tokyo Chemical Industry(Portland,OR)。浓盐酸(浓HCl)、氢氧化钠(NaOH)和甲醇购自Fisher-Scientific(Hampton,NH)。磷酸二氢钾(KH2PO4)和来自蛋清的溶菌酶购自BDH Chemicals-VWR International(WestChester,PA)。CarboSilTM 2080AUR STPU(以下被称为CarboSil)从DSM Biomedical Inc.(Berkeley,CA)获得。Milli-Q过滤器被用于获得用于所有水溶液制剂的去离子水(DI)。氮气瓶和氧气瓶购自Airgas(Kennesaw,GA)。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC 6538，金黄色葡萄球菌(S.aureus))用于细菌实验。LB琼脂(LA)，Miller和Luria肉汤(LB)Lennox购自Fischer BioReagents(Fair Lawn,NJ)。所有化学品在没有另外的纯化下使用。
简言之，使用溶剂蒸发和/或旋涂方法制备具有10wt％SNAP的CarboSil聚合物(测试样品)和无SNAP含量的CarboSil聚合物(对照样品)。然后用两性离子共聚物(被称为BPMPC)涂覆这些样品，所述两性离子共聚物通过UV交联被共价地结合到CarboSil基础聚合物。对UV辐射前和UV辐射后的膜进行表面分析，以了解聚两性离子体系的交联行为。分析了具有BPMPC涂层的测试样品和对照样品的NO释放行为。然后在生理条件下(37℃，在PBS中)测试样品的蛋白质粘附性持续14天，以评估顶涂层的防污性质。最后，使用ASTM E2180方案的修改版本对样品进行抗微生物测定。
NO供体SNAP的合成
S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺使用先前报告的方法的改进方法来合成。38将1M H2SO4和1M HCl与等摩尔量的NAP、甲醇和NaNO2水溶液混合。将该反应混合物搅拌持续20分钟，并且然后在混合物上方用恒定的空气流来冷却持续7小时。在将反应混合物的未反应部分蒸发之后，将沉淀的SNAP的绿色晶体过滤、收集并且在带盖的真空干燥器中干燥。干燥的SNAP的晶体用于所有实验。
掺杂有SNAP的CarboSil膜的合成
使用溶剂蒸发法来制备含10wt％SNAP的CarboSil膜。将700mg的CarboSil溶解在10mL的THF中，以制成聚合物溶液。向该溶液中加入77mg的SNAP，最终浓度为10wt％的SNAP。在黑暗条件下搅拌该聚合物-SNAP共混物，直到SNAP晶体完全溶解。然后将该共混物转移到特氟隆模具中，并且允许使溶剂在通风橱中蒸发过夜。然后将过夜干燥的膜切割成各自具有0.8cm的直径的圆形形状。将每个样品浸入到不含SNAP的CarboSil溶液(在THF中40mgmL-1的聚合物浓度)中以对其进行涂覆(这对每个样品重复三次)。将样品干燥过夜，并且然后在真空下干燥持续另外的24小时。包括此增加的干燥时间以消除可能影响任何后续研究的任何剩余的THF。对于所有SNAP浸出行为测试，在顶涂层应用之前记录每个膜的重量。在实验之间将配制的样品储存在处于黑暗中的冷冻器(-18℃)中，以防止SNAP的逸出或随之发生的NO的损失。这些并入SNAP的膜被用于NO释放、SNAP浸出和细菌细胞生存力分析。所有用于测试的样品都小于一周龄，以确保研究的完整性。
两性离子共聚物(BPMPC)的合成
该聚合物通过自由基聚合来合成。将MPC(0.546g，1.85mmol)、n-BMA(0.105mL，0.66mmol)和BP(0.027g，0.132mmol)溶解在具有引发剂AIBN(0.01mmol mL-1)的5.3mL乙醇(单体总浓度为1.0mmol mL-1)中，并且将溶液倒入聚合管中。在用氩气脱气持续30分钟后，聚合反应在氮气流下在60℃进行持续16h。通过将溶液暴露于空气来停止反应，冷却至室温，并且倒入乙醚中以沉淀聚合物。通过真空过滤来收集白色固体并且在真空下干燥持续12h。收率：0.552g，83％。采用1H NMR(D2O)以确认聚合物组成。
BPMPC与基底的交联
将硅基底切割成2.4cm×2.4cm的片，并且在去离子水、异丙醇和丙酮中各自声处理持续5min，然后在氮气下干燥，随后用等离子体(Harrick Plasma PDC-32G)清洗并且用在甲苯中的iBTS处理过夜，然后用聚合物改性。CarboSil基底在没有预处理的情况下用聚合物涂覆。
当将BPMPC应用于基底上时，采用了两种涂覆方法：旋涂和喷涂。对于旋涂，聚合物改性的膜通过使用0.5mLBPMPC/乙醇溶液(10mg mL-1)以1000rpm在官能化的硅基底上展开持续30秒。喷涂应用于具有SNAP和没有SNAP的CarboSil膜。使用喷枪从10cm的距离将BPMPC/乙醇溶液(2mg mL-1)喷到竖直放置的基底上，以在干燥后获得均匀的涂层。基于在不同形式的基底上提供最平滑的、无针孔的涂层的方法，我们在蛋白质吸附实验中使用旋涂，并且在SNAP/NO释放和细菌实验中使用喷涂。然后，用UV光(UVP，254nm，6.5mW cm-2)辐照BPMPC基底持续1min，以将BPMPC共价地结合到表面。用大量乙醇冲洗基底以除去未附接的BPMPC，然后在氮气下干燥。
聚合物涂层的表征
通过测量静态水接触角来表征表面润湿性，所述静态水接触角是从具有计算机控制的液体分配系统的DSA 100液滴形状分析系统获得的。将1μL的DI水滴沉积到基底表面上，并且通过分析摄影图像在10秒内测量水接触角。通过采用254nm UV光的UV-可见光谱(Varian)研究了BPMPC涂层的交联动力学。在硅基底和CarboSil基底上的旋涂聚合物层的厚度通过具有在三个入射角(65°、70°和75°)处的白光源的M-2000V光谱型椭偏仪(J.A.Woollam co.,INC.)来测量。使用Cauchy层模型测量和计算改性层的厚度。聚合物涂覆的膜的红外光谱研究使用配备有可变角度掠射角衰减全反射(GATR-ATR)配件(HarrickScientific)的Thermo-Nicolet6700型光谱仪进行。
SNAP浸出研究和NO释放曲线
通过记录PBS溶液(用于浸泡样品)在340nm(SNAP的S-NO基团的特征吸光度最大值)处的吸光度，来量化从样品中排出的SNAP的百分比。在用非SNAP聚合物溶液涂覆之前对每个样品称重，以确定每个膜中SNAP的初始量。然后，将膜浸入含有PBS(pH 7.4，具有100μMEDTA以防止由金属离子引起的对NO释放的催化作用)的小瓶中，并在37℃储存。UV-可见分光光度计(Thermoscientific Genesys 10S UV-vis)被用于在所要求的时间间隔内定量缓冲溶液的吸光度。利用每个样品中存在的SNAP的初始量，将读数转换为缓冲液中SNAP的wt％。PBS溶液(样品被浸泡在其中)的1mL等分试样被用于每个样品的吸光度测量，以避免任何不一致的读数，并且对于每次定量使用三个重复。具有已知量的在PBS(具有EDTA)中的SNAP的校准图被用于内推从研究中记录的吸光度定量，并且将其转换为定量的样品中的SNAP的浓度。
被并入到聚合物中的SNAP在生理条件下释放NO，并且对于该研究，使用Sieverschemiluminescence NO(NOA280i，GE Analytical,Boulder,CO,USA)对该释放进行实时测量和记录。样品储器为样品保持黑暗条件，以防止由任何光源引起的对产生NO的催化作用。其填充有5mL的PBS(pH 7.4，具有100μM的EDTA)以浸泡样品。EDTA充当螯合剂以防止由PBS中的金属离子引起的对产生NO的催化作用。该缓冲溶液通过放置在样品储器周围的温度调节的水夹套被保持在37℃。一旦在没有样品时的NO通量的基线(根据实施例2：一氧化氮释放动力学准备)被建立，随后将样品放置在样品储器中。通过经由吹扫和气泡流连续供应被维持在200mL min-1的恒定流量的氮气，由样品储器中的样品释放的一氧化氮被朝向分析仪推动和吹扫。由样品释放的NO被朝向化学发光检测室推动。
产生的电压信号被转换成NO的浓度，并且显示在分析仪的屏幕上。使用ppb形式的原始数据和NOA常数(mol ppb-1s-1)，以ppb计的数据关于样品的表面积进行归一化，并且被转换为NO通量单位(x 10-10mol cm-2min-1)。在所提及的时间间隔内收集数据，并且在测量之间将样品储存在黑暗条件中的37℃的PBS(具有EDTA)溶液中。每天更换PBS，以避免在储存时间期间浸出的SNAP或释放的NO的任何积聚。仪器操作参数为7.4托的室压、6.1psig的供应压力和-12℃的温度。对于每次测量使用三个重复。
蛋白质粘附测定
蛋白质吸附测试是用于评估血液粘附性的很重要的方法。因此，监测在蛋白质溶液中孵育之前和之后的基底的厚度变化，作为蛋白质吸附的指示。被涂覆的基底在PBS(pH7.4，0.01M)溶液中的纤维蛋白原(1mg mL-1)和溶菌酶(1mg mL-1)中孵育多达14天，随后每天进行厚度测量。
在第二种方法中，使用在PBS溶液中的异硫氰酸荧光素-牛血清白蛋白(FITC-BSA，2mg mL-1)来评估在由BPMPC改性的CarboSil基底的表面上的蛋白质吸附行为。42-43在37℃将基底在FITC-BSA溶液中浸泡持续一个半小时，然后用蒸馏水冲洗并且用氮气干燥。然后通过Nikon Eclipse NI-U荧光显微镜(Nikon Instruments,Inc.)分析具有蛋白质的基底，所述显微镜使用5x物镜，具有滤光片组(Ex/Em 470/525nm)。为了证实对蛋白质吸附的长期抗性，在放入到FITC-BSA溶液中之前，将基底在BSA(1mg mL-1)PBS溶液中在37℃孵育持续多达7天。
细菌测定
在孵育24小时的时间段后，使用连续稀释，在细菌细胞生存力方面计算每个样品的细菌粘附性。用于执行该测定的方法是基于美国材料与试验协会E2180方案的修改版本。金黄色葡萄球菌被用于样品的抗微生物评估。细菌在37℃的LB肉汤(Lennox)中培养，并且生长至每mL～106个菌落形成单位(CFU)，如通过光密度所测量的。所得的过夜培养物通过离心(2500g，7min)收集，并且重悬于PBS中。这种重悬的细菌悬浮液被用于孵育聚合物样品持续24小时。
在用细菌溶液孵育后，样品用PBS轻轻洗涤，以除去任何未结合的细菌。然后将样品放入1mL的PBS中，并且各自均质化持续1分钟，以将任何粘附的细菌转移到该新的PBS溶液中。在均质化后，将匀浆样品连续地稀释并且铺板在LB琼脂营养板上(37℃)。通过对每个板上的菌落手动地计数来确定细菌生存力。通过对每个样品每cm2的菌落数计数来完成细菌粘附的计算。
统计分析。对于所有试验，所有数据均被量化为n≥3的平均值±标准偏差。对照膜和测试膜之间的结果通过使用学生t检验的方法的比较来分析。对于所分析的数据获得p的值，并且p<0.05被认为是显著的。
结果与讨论
两性离子聚合物(BPMPC)通过在乙醇中的自由基聚合来合成。该共聚物组成通过1H NMR光谱法来证实，并且由74:18:8(MPC:nBMA:BP)组成，其大致匹配单体进料比。该比提供了最佳的防污效果(下文讨论)连同在疏水性基底和亲水性基底两者上的最均匀的涂层。聚合物合成是简单且容易的，除沉淀外不需要另外的纯化，这使得大规模生产成为可行。BPMPC由于高浓度的MPC，是亲水性聚合物，并且在水溶液和醇溶液中具有高溶解度。三元共聚物中的甲基丙烯酸丁酯组分有助于均匀性和基底润湿(疏水性和亲水性两者)，以及提供另外的光化学交联位点。如上文所描述的，BPMPC的二苯甲酮组分通过C-H活化充当亲水性聚合物和任何有机基底之间的交联剂。
通过UV-可见光谱法对异丁基三氯硅烷(iBTS)官能化的石英基底研究了BPMPC的交联动力学。将聚合物溶液(10μL，10mg mL-1)滴铸在烷基化的石英上，并且允许溶剂蒸发。通过UV-vis监测UV交联反应，其中随着辐照时间的增加，发生了在255nm处的BP基团的吸光度降低。图2示出了UV-可见光谱，其中从0s至120s，255nm处的吸光度最大值急剧下降，并且在240s后，没有观察到进一步的吸光度变化，甚至是在延长的辐照后。该结果表明，BPMPC交联以快速的动力学发生，并且只需要几秒钟就将BPMPC共价地结合到多种不同的基底。
为了进一步证实BPMPC聚合物的沉积和交联，对涂覆的基底进行FTIR。在IR光谱中，观察到羰基(1720cm-1)和PC基团(1240cm-1、1080cm-1和970cm-1)的吸收峰，并将它们归属于MPC单元。在(1650cm-1)处的峰代表BP酮的C＝O拉伸。辐照后该峰的显著减少进一步支持了形成具有在BP和基底之间的共价连接的网状聚合物。
为了测试涂层的稳定性和耐久性，我们监测了BPMPC涂覆的硅样品的水接触角多达14天。将涂覆的基底浸入到PBS溶液中，并在37℃的培养箱中搅拌，随后用H2O冲洗并用氮气干燥，然后测量水接触角(图4)。对于裸CarboSil基底的初始静态接触角是约110°。在用BPMPC涂覆后，观察到接触角从110°至50°的显著下降，并且该接触角的值在浸入搅拌的PBS溶液中14天的时间段内被保持，这表明BPMPC涂层共价地结合到基底并且在生理条件下不会剥离。
用于测试NO释放行为的对照样品仅涂覆有CarboSil(用于并入SNAP的相同聚合物)，而测试样品涂覆有CarboSil和BPMPC。样品在轻度搅拌的条件下测试，以模拟生理条件。测试样品持续两周的时间段，以证明NO从疏水性聚合物和亲水性聚合物的组合中的可持续释放。
首先进行SNAP浸出研究，以测量在研究过程中在对照聚合物膜和测试聚合物膜中的SNAP的保留。每隔一天记录在PBS中浸泡的测量值持续2周(图5A)。聚合物中的大量SNAP保留确保了NO从聚合物基体中的持续释放，并且最小化了与SNAP浸出相关的风险(如果有的话)。44如图5A中所看到的，对于浸出的初始测量值(图5A的图中第0天)，在PBS中在37℃储存1小时后，对于对照基底和BPMPC涂覆的基底分别记录了0.39±0.06％和0.47±0.26％的损失。BPMPC涂覆的基底的这种最初的较高浸出可能是由于表面的亲水性。然而，如由来自在37℃储存1天和3天的关于BPMPC涂覆的测试膜的数据(对于第1天和第3天分别为0.96±0.26％和1.44±0.26％)和关于对照膜的数据(对于第1天和第3天分别为0.96±0.05％和1.55±0.07％)所支持的，SNAP浸出在对照样品和测试样品之间几乎是相同的。
SNAP分子从测试膜中较低浸出的趋势在14天的时间段内观察到。还应注意的是，在14天的时间段期间的任何点，没有保持在低于37℃的温度或干燥条件下的样品。这样做是为了近似地模拟生理条件持续连续的持续时间。在实验持续时间内，对照样品和测试样品两者的浸出都保持非常低(<3.5％)，但是这里值得注意的是，尽管预期亲水性涂层可以通过将水分子吸引到聚合物表面而导致SNAP分子从含NO供体的聚合物中更高的浸出，但事实并非如此。这可能是由于涂层的超薄性质，其影响含水界面，但不影响聚合物膜的主体。
对照样品和测试样品的NO释放测量也进行了持续14天的时间段(图5B)。采用Sievers化学发光NO分析仪的测量是对于释放NO的聚合物所接受的标准表征方法。45-47它通过测量NO与臭氧反应时由光子产生的电压来实时地测量NO释放。在这项研究中，在37℃的恒温以及在PBS中储存样品以模拟生理条件。
结果表明，与对照样品(仅涂覆有CarboSil的含SNAP材料)相比，从测试样品(涂覆有CarboSil和BPMPC的含SNAP材料)的较高的NO释放的总体趋势。第0天的测量结果表明，测试样品具有7.75±3.26(x 10-10)mol cm-2min-1的通量，而对照样品具有3.76±1.50(x 10-10)mol cm-2min-1的通量(表4)。从测试样品的这种NO释放的爆发是由顶涂层的亲水性导致的，所述顶涂层将水分子吸引到样品表面。表面上的水分子可以调节NO的释放，因为SNAP在含水条件下更可溶(并且易于S-N＝O键断裂)。在储存一天后，对照样品示出NO通量的急剧下降(0.34±0.03×10-10mol cm-2min-1)。这被看到是因为第0天的SNAP分子的初始损失以及无法在第1天保持水合状态。相比之下，BPMPC涂覆的基底以1.02±0.02×10-10mol cm- 2min-1示出三倍的NO通量。NO通量的这种差异可能是由于测试样品的亲水性顶涂层，该顶涂层保持了水合的表面层，这促进了更多NO的释放。当与对照样品相比时，来自测试样品的这种较高NO通量的趋势可以通过表4中的14天研究和图5B中的图看出。
表4.对照样品和被涂覆的样品之间的一氧化氮释放动力学的比较
在14天的研究结束时，与对照样品(0.13±0.03(x10-10)mol cm-2min-1)相比，测试样品(0.38±0.13(x10-10)mol cm-2min-1)仍然释放三倍的NO通量。这种从顶部涂覆有BPMPC的CarboSil中较高的NO释放的倾向连同SNAP浸出的减少是非常有益的，并且将CarboSil的材料特性(低SNAP浸出)与归因于亲水性BPMPC顶涂层的较高的、持续的NO释放相结合。
如前所述，BPMPC涂层具有优良的亲水性，这有助于抑制蛋白质从溶液中的吸附。使用纤维蛋白原和溶菌酶作为模型蛋白，以评估BPMPC涂层的防污性质。纤维蛋白原是大的(340kD，pI＝6.0)蛋白质，并且是凝血级联中的关键生物大分子，其迅速地吸附到异物表面并且结合到血小板并活化血小板。溶菌酶是小的蛋白质(14kD，pI＝12)，其在生理pH下带正电荷。图6A示出了纤维蛋白原分别在CarboSil、具有10％的SNAP的CarboSil、BPMPC涂覆的CarboSil和BPMPC涂覆的具有10％的SNAP的CarboSil的基底上的吸附厚度增加。在用作对照的裸CarboSil膜上，在孵育持续24小时后厚度增加约3nm，并且2周后增加至超过30nm。对于具有10％ SNAP的CarboSil膜，观察到了类似的现象，这表明在表面上的大量的蛋白质吸附，以及蛋白质随着时间的推移积累。在另一方面，对于涂覆有BPMPC的CarboSil膜，吸附量明显较低，在孵育持续2周后仅观察到2nm的增加。吸附厚度的大的差异证实了BPMPC涂层具有优良的抗蛋白质性质，甚至在UV活化后。如所预期的，BPMPC涂覆的具有10％SNAP的CarboSil膜也示出对纤维蛋白原的低吸附。此外，当膜经历溶菌酶溶液时，观察到类似的行为(图6B)。对照组中厚度增加超过14nm，而涂覆的组小于3nm。蛋白质吸附结果表明，亲水性BPMPC表面层提供了优秀的抗蛋白质性质。
为了进一步证实耐久的BPMPC涂层的防污效果，使用FITC标记的BSA蛋白质，使用荧光显微法来评估在未涂覆的CarboSil膜和涂覆的CarboSil膜上的蛋白质吸附。使用相同的激发光强度和暴露时间，比较未涂覆的CarboSil膜和BPMPC涂覆的CarboSil膜之间的结垢水平。结果指示在对照样品上的蛋白质吸附，并且在用BSA PBS溶液预处理的样品中观察到增强的荧光信号。这些结果表明，在蛋白质溶液中孵育后，大量的BSA附着在CarboSil样品上，这促进了FITC-BSA的聚集。相反，即使在BSA溶液中孵育持续7天后，也没有观察到蛋白质粘附到BPMPC改性的样品的表面。综合所有这些结果，对照膜显示出大量的蛋白质吸附，而BPMPC涂覆的膜显示出优良的防污性质。
经常导致生物膜形成的细菌粘附是在潮湿和湿润的环境(包括植入的装置)中普遍存在的问题。对细菌生长重要的基本营养物可以从装置材料、植入后附着的身体蛋白质或粘附至装置的表面的其他身体大分子污染物中获得。将设计的测试样品的抗微生物功效与对照样品进行比较，以确认其优越的杀菌性质和细菌排斥性质。
将样品浸泡在含～106CFU/mL金黄色葡萄球菌的细菌溶液中。金黄色葡萄球菌是常见的医院感染细菌。在过去的二十年里，它与医疗保健相关的感染联系越来越紧密。48它们最常见地与心脏装置、血管内导管和导尿管以及其他假体装置相关。金黄色葡萄球菌的这种高流行性连同其已知的对污染医疗装置的蛋白质的亲和力49-50已经使其成为用于评估医疗装置材料的抗微生物功效的非常重要的病原体。由于这些原因，所开发的释放防污-杀生物剂的聚合物的细菌粘附研究是用金黄色葡萄球菌进行的。
如介绍中所提到的，由SNAP的分解所释放出的NO分子主动地杀死细菌，而两性离子顶涂层排斥蛋白质吸附，导致增强的抗微生物功效。在孵育24小时后，清楚地观察到测试样品的抗微生物效果。与其中观察到～106CFU/cm2的生长的对照样品相比，具有BPMPC的顶涂层的释放NO的聚合物示出99.91±0.06％的杀菌效率(～3对数减少，图8)。与仅具有BPMPC顶涂层的膜(70.15±14.13％)以及还有仅具有释放NO的部分的膜(98.88±0.54％)相比，这种减少更大。从结果中还可以得出结论，单独的BPMPC仅减少细菌粘附。然而，由于NO不是接触活性抗微生物剂，而是扩散性杀生物剂，负载SNAP的样品也显著地减少细菌粘附。
这些结果与构成BPMPC的表面化学和NO的杀菌性质的基础的理论预期相一致。概括地说，来自CarboSil的表面的可改变的NO释放动力学和归因于BPMPC的表面化学的防止蛋白质和/或细菌粘附的协同效应将显著地降低植入的医疗装置的不期望的临床后果。
结论
总之，我们已经证明了NO释放和BPMPC的组合可以产生具有抗微生物能力和优良的防污性质的材料。在温和的UV条件下共价聚合物网络的形成是快速的(少于1min)，并且可以应用于从亲水性到疏水性的多种基底。更重要的是，即使BPMPC涂层为约50nm，在保持其防污性能的情况下，它仍能耐受中度磨损持续一周以上。此外，NO释放曲线表明，当与对照相比时，从BPMPC涂覆的样品的较高的NO释放，其中SNAP的浸出较低。涂层也受到蛋白质吸附测试的挑战，持续延长的时间(多达2周)，其中防污性质保持。值得注意的是，通过BPMPC涂层增强了SNAP对金黄色葡萄球菌的高杀死效率。防污涂层与释放NO的抗微生物聚氨酯的这种一步光化学附接工艺是简单且可调整规模的工艺，其在医疗装置和其中需要防污性质和抗微生物性质的其他工业应用两者中具有应用。
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实施例4
材料和方法
SIM材料的合成
有机硅膜首先通过将Sylgard 184基质与固化剂(比为10：1)混合来制造。将溶液浇铸到特氟隆模具中，并且置于真空下用于脱气。然后将浇铸的溶液放入烘箱中(80℃，90min)用于固化。表面改性以图16中图示的步骤进行，如下文所述。为了产生羟基基团官能化的表面(步骤A)，将有机硅膜在温和搅拌下浸没在H2O中的13N HCI：30wt.％H2O2(50：50)的混合物中(15min)。然后用DI H2O冲洗表面，并且在真空下干燥。然后通过将羟基官能化的表面浸没到在超干丙酮中的5wt.％APTMES中持续2h来实现胺官能化(步骤B)。然后用超干丙酮冲洗膜以从表面除去任何非共价附接的硅烷，并且真空干燥持续24h。通过在2：1(v/v)甲醇：丙烯酸甲酯(24h)(步骤E和I)随后是2：1(v/v)甲醇：乙二胺(24h)(步骤F和J)中孵育胺官能化的表面来实现固定的部分的支化，如图16中所示。在孵育溶液之间，样品用甲醇(20mL)冲洗两次。然后将胺官能化的表面浸没在甲苯中的10mg mL-1的NAP-硫代内酯中持续24h(步骤C、G和K)，这允许硫代内酯的开环反应以结合到游离胺。24,25然后将样品空气干燥持续5h，以完全除去任何残留溶剂。固定的NAP的亚硝化(步骤D、H和L)通过在纯的亚硝酸叔丁酯中孵育持续2h来实现。所得的SIMS样品被储存在-20℃用于另外的实验。
接触角和FTIR分析
使用接触角测量和FTIR分析了一氧化氮供体附接到有机硅表面的表面性质和证据。静态接触角使用具有计算机控制的液体分配系统(Krüss)的DSA 100液滴形状分析系统(KRU SS)来测量。将3μL水滴放置在多种有机硅膜上，并且通过Krüss软件测量左接触角和右接触角的平均值。样品的红外光谱学研究使用Thermo-Nicolet 6700型光谱仪进行。
游离胺定量
使用ATTO-TAG(3-2-(呋喃甲酰基喹啉-2-甲醛))(FQ)胺衍生化试剂盒(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)对附接于PDMS的表面的APTMES进行定量。每种伯胺与FQ试剂形成缀合物，于是其可以被荧光检测。荧光计数使用Biotek Synergy微孔板读数器(microplate reader)(Winooski，VT)来测量。在被置于含有15μL的10mM氰化钾(KCN)、25μL的0.01M PBS(pH＝7.4)和10μL的10mM FQ溶液(在甲醇中)的溶液中之前，首先仔细地测量APTMES官能化的PDMS的测试样品。然后将样品避光并且允许其反应持续1h。然后轻轻地搅动含有样品的溶液，以确保所有荧光产物都从表面除去。然后丢弃样品片(samplepiece)，并且将具有荧光产物的溶液置于96孔板中，以分别在480nm和590nm的激发波长和发射波长进行测量。使用制备的甘氨酸完成校准曲线，以将荧光计数与伯胺浓度直接关联。
一氧化氮释放特性
使用Sievers化学发光一氧化氮分析仪(NOA)280i(Boulder,CO)测量从含有SNAP的膜的一氧化氮释放。Sievers化学发光一氧化氮分析仪被认为是用于检测一氧化氮的黄金标准，并且由于其限制干扰物质(例如硝酸盐和亚硝酸盐)的能力而被广泛使用，因为干扰物质不从样品容器转移到反应池。然后将膜放入浸没在含100mM EDTA的PBS(pH 7.4)中的样品容器中。使用氮气吹扫气体和鼓泡器将一氧化氮从缓冲液中连续地吹除并从顶部空间吹扫到化学发光检测室中。
蛋白质排斥定量：
使用先前报告的方法的改进版本对多种材料的蛋白质粘附的水平进行量化。7FITC-人纤维蛋白原(13mg/mL，Molecular Innovations)被稀释以获得在PBS(pH 7.4)中的2mg mL-1。有机硅盘状物(silicone disk)在96孔板中在37℃孵育持续30min，随后添加储备蛋白溶液以获得2mg mL-1的浓度。7在孵育2h后，进行孔内容物的无限稀释，以从材料中洗掉块体和任何松散结合的蛋白质。然后使用96孔板读数器(Biotek)测量每个孔的荧光(n＝8)，并且通过校准曲线确定吸附的蛋白质的量。
细菌粘附测定：
按照基于美国材料与试验协会E2180方案的指南，使用常见的医院内病原体(nosocomial pathogen)(革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(ATCC 6538))，来测试样品抑制聚合物表面上的粘附的细菌的生长和促进杀死聚合物表面上的粘附的细菌的能力。从先前培养的LB-琼脂板中分离出单个细菌菌落，并在LB肉汤中孵育(37℃，150rpm，14h-16h)。使用UV-可见分光光度计(Thermoscientific Genesys 10S UV-vis)在600nm的波长处测量培养物的光密度，以确保存在～106-108CFU mL-1。然后将过夜培养物以2500rpm离心持续7min，以获得细菌颗粒。将获得的细菌颗粒重悬于无菌的PBS中。然后将聚合物样品(SR对照、SIM-N1、SIM-S1、SIM-N2和SIM-S2)在细菌悬浮液中孵育(37℃，24h，200rpm)。在孵育后，将样品从细菌悬浮液中移除，并且用无菌的PBS冲洗以除去任何未结合的细菌。然后每个样品使用Omni Tip均质器声处理持续1min，以收集无菌的PBS中的粘附的细菌。为了确保所收集的细菌的适当均质化，样品各自被涡旋持续45s。将溶液连续地稀释，铺板在LB琼脂培养基上，并且在37℃孵育。在24h后，对连续稀释和铺板的细菌溶液的总CFU进行计数。
血小板粘附测定：
新鲜抽取的猪血购自Lampire Biologicals。使用Eppendorf离心机5702离心抗凝的血液(1100rpm，12min)。用移液管小心地收集富血小板的血浆(PRP)部分，以便不干扰血沉棕黄层(buffy coat)。然后将剩余的样品离心(4000rpm，20min)以回收贫血小板的血浆(PPP)。使用血细胞计数器(Fisher)确定PRP部分和PPP部分两者中的总血小板计数。PRP和PPP以一定比率合并，以给出约2×108血小板mL-1的最终的血小板浓度。将氯化钙(CaCl2)添加到最终的血小板溶液中，以达到2.5mM的最终浓度。7将每个相应的表面的盘状物放置在5mL的血液管中。将约4mL的钙化的PRP添加到每个管中，并在轻微摇动(25rpm)的情况下孵育(37℃，90min)。在孵育后，所述管用生理盐水无限稀释。使用Roche细胞毒性检测试剂盒(LDH)，使用当用Triton-PBS缓冲液溶解(lyse)粘附的血小板时释放的乳酸脱氢酶(LDH)来确定血小板粘附的程度。然后将有机硅盘状物在1mL的Triton-PBS缓冲液中孵育。在25min后，将100μL转移至96孔板，并且根据供应商说明书与100μL的LDH试剂缓冲液合并。然后使用96孔板读数器(Biotek)测量每个孔的吸光度(n＝6的重复)，并且使用校准曲线来确定粘附的血小板的数目。
结果与讨论
为了利用一氧化氮(NO)的抗微生物性质和防止血小板活化的性质，已经开发了NO供体(例如，s-亚硝基硫醇或二醇二氮烯鎓盐)以提供NO的储存和局部递送。这样的NO供体适用于并入到通常用于医疗装置的聚合物材料中，例如聚氨酯、有机硅或聚氯乙烯。26,27以不同水平添加这些供体还提供了控制从材料中递送的NO水平的能力。28释放NO的材料已经被用于减少在导管插入术期间的血栓形成和细菌生长。然而，一旦全部或大部分的NO已经被释放，材料的抗菌性质就显著地降低。因此，本实施例提供了涂层和涂覆的表面的实施例，其提供了抑制血栓形成、细菌生长和表面污染的被动机制和主动机制两者。
本实施例证明了材料以下的能力：所述材料不仅通过被动机制提供防止细菌和蛋白质粘附的空间位阻能力(steric ability)的增加，而且还利用NO的主动杀生物机制。除了组合这些机制之外，在所有NO已经从表面被释放后，该材料的防污能力被保持，这使其对于长期应用具有吸引力。具体地，这通过使用烷基胺间隔基将NO供体前体N-乙酰基-D-青霉胺(NAP)固定至有机硅表面来实现(图16)。如图16中所示，增加游离胺的接枝密度通过初始间隔基的支化来完成(图16的步骤E、F、I、J)。在固定NO供体前体(图16的步骤C、G、K)之后，接枝的供体被亚硝化成其富含NO的形式S-亚硝基-N-乙酰基-D-青霉胺(SNAP)(图16的步骤D、H、L)。
SIM-N1和SIM-S1分别对应于未亚硝化的(图16上C的产物)和亚硝化的(图16上D的产物)无支链聚合物。SIM-N2和SIM-S2分别对应于未亚硝化的(图16上G的产物)和亚硝化的(图16上H的产物)支链聚合物。最后，SIM-N4和SIM-S4分别对应于未亚硝化的(图16上K的产物)和亚硝化的(图16上L的产物)支链聚合物。图18提供了支化的(SIM-S2和SIM-S4)和未支化的(SIM-S1)官能化表面的示意图。在本实施例中，除了将被视为对照的裸有机硅表面之外，这些材料对于所有实验都将如上文缩写的被提及。为了确保表面改性的共价结合，进行了FTIR测量(图17)。由于氮原子在FTIR峰方面重叠，当反应步骤完成时，看到酰胺和伯胺的出现和消失。这之后测量水接触角，以检查官能化的表面的亲水性的任何显著差异。这里令人感兴趣地注意到，表面的亲水性随着NO释放的增加而增加(在下文更详细地讨论)。这可能归因于当反应更完全时胺官能化的表面的较低的可用性。
表8示出了多种表面改性的SR基底在2h内减少非特异性蛋白质吸附的能力
如从设计策略中看到的，通过初始烷基间隔基的支化以增加游离胺的数目，来改变材料的NO负载和释放能力。通过使用化学发光一氧化氮分析仪(NOA)来测量NO负载和释放能力的这种变化。NOA是用于测量来自材料的NO通量的黄金标准，并且是非常高效和灵敏的仪器，其可以分析低至十分之一ppb的NO释放。29为了确保NO释放仅来自表面官能化而不是由于在反应周期期间二胺基团的可能的溶胀(swell)来自主体材料，在不固定氨基硅烷的情况下使用相同的反应方案对样品进行对照测量。
本研究的理论预期之一是看到随着支化的增加，NO负荷和释放测量值的增加。然而，如图19A-图19B中所示的，在25天时间段内，当与SIM-S4(累积释放：23319.98×10-10molcm-2)(图19B，表7)相比时，SIM-S2的NO释放测量值明显更高(累积释放：43442.53×10-10molcm-2)。对此可以存在两种可能的解释：在较高的支化的情况下的空间位阻，并且因此NAP硫代内酯不能完全地与胺基团结合，和/或在游离的胺基团可以与NAP硫代内酯反应之前，更多的支化增加了聚合物内的链相互作用的可能性。因此，可以得出结论，逐渐增加的支化不一定使NO负载或释放增加。这项研究还展示了表面的设计，其可以在内源性通量水平释放NO多达25天。这种增加支化的方法是增加NO释放特性的技术，其很像当添加到NO释放聚合物中时金属离子的功能。然而，除了增加的NO释放性质，这种材料被证明还提供了另外的优点，因为它还赋予材料防污特性，如由下文描述的数据所证明的。
表5在所有NAP-硫代内酯和亚硝基基团官能化的表面之间比较的接触角测量值。
表6：对于SIM-S1、SIM-S2和SIM-S4多达600h的NO通量释放测量值。
表7：对于SIM-S1、SIM-S2和SIM-S4多达600h的累积NO释放测量值。
用于体外评估材料的污染的一种常用方法是检查材料抵抗非特异性蛋白质粘附的能力。更具体地，如果意图用于血液接触应用，则可以评估纤维蛋白原(Fg)粘附。Fg到材料表面的吸附大大增加了活化的血小板或细菌与表面结合的能力，这导致血栓形成或感染的较高的风险。6虽然已经显示Fg吸附的方向决定了血小板粘附的程度，但不管方向如何，限制蛋白质粘附通常被认为是材料的血液相容性的改进。7开发可以减少蛋白质吸附的释放NO的材料可以在这些材料的总体血液相容性和抗菌性质方面提供巨大的改进。30
为了检查表面固定的NO供体(亚硝化的和未亚硝化的两者)是否可以提供在释放NO的材料上观察到的蛋白质粘附的减少，在37℃进行对FITC标记的纤维蛋白原(2mg mL-1)的2h暴露(表8和图20)。虽然观察到接触角的最小变化，但是增加在SIM-N1和SIM-N2之间的表面接枝的NAP基团的支化性质降低了Fg吸附的程度，并且被认为是空间位阻的增加的结果。29然而，改变与胺官能化的表面的连接的化学性质进一步增加了这些材料的不污结(non-fouling)能力。总的来说，与未改性的SR相比，观察到对于SIM-S2，蛋白质吸附的减少达到65.8±8.9％。还令人感兴趣地注意到，NO从表面的释放对吸附的Fg的量没有显著影响。
最终导致生物膜形成的细菌粘附是植入装置中的主要问题，其由潮湿和微生物群系维持环境(microbiome sustaining milieu)辅助。与污染性蛋白质结合，植入物可以变成若干病原体的宿主，这些病原体最终导致医疗装置失效、感染(包括血流感染)以及有时死亡。8将所设计的不污结的抗微生物涂层材料的抗微生物功效与SR对照样品进行比较(表9和图21)，以证实它们优越的细菌排斥性质。将样品在含有～107-108CFU mL-1的金黄色葡萄球菌的细菌溶液中孵育，金黄色葡萄球菌是最常见的医院感染细菌之一。30,31这些感染最常见地与导管、支架和假体装置以及其他植入物相关。如上文所提及的，据信NO分子将主动杀死细菌，而固定的结构即使在所有的NO负载被耗尽之后也将被动地排斥蛋白质并且增强材料的生物相容性。在24h的孵育后，即细菌感染开始的关键时间，可以清楚地观察到所设计的测试样品的抗微生物功效。粘附到每种材料的金黄色葡萄球菌的CFU cm-2在表9中示出。尽管未亚硝化的表面(SIM-N1和SIM-N2)显示相对于对照的细菌活性的某些降低，但SIM-S2示出最高的杀菌效率，当与观察到～108CFU cm-2的生长的SR样品相比时，具有99.91±0.06％的降低(图21)。与仅具有NAP硫代内酯官能化的样品(SIM-N1＝82.14±22.20％以及SIM-N2＝96.86±0.49％)和SIM-S1(85.71±24.74％)相比，这种降低更高。从结果中还可以得出结论，NAP硫代内酯官能化的表面(SIM-N1和SIM-N2)单独地只能减少细菌粘附，因为它们不能杀死细菌，因为其不具有任何杀菌性质。官能化有释放NO的性质的表面通过被动机制以及具有主动抗菌活性来减少粘附，从而产生增强抗微生物功效的协同效应。概括地说，来自SR表面的可改变的NO释放动力学以及归因于表面固定的结构的防止蛋白质和细菌粘附的协同效应可以有助于显著地降低医疗植入的不期望的临床后果。
表9示出了多种表面在24h内减少细菌粘附的能力。
当确定材料的血液相容性时，血小板活化和粘附是重要的考虑因素。在活化后，血小板释放若干凝结激动剂(coagulation agonist)，例如磷脂酶A2(其随后被转化为血栓素A2)，这促进血小板活化和凝结级联(coagulation cascade)并增加凝血酶生成。32血小板活化的一个关键前驱(predecessor)是纤维蛋白原到材料表面的吸附，其中蛋白质确认的变化允许与血小板Gp IIb/IIIa受体结合。因此，单独减少蛋白质粘附可以充当减少血小板活化的机制。因此，证明的是，尽管NO释放材料已经示出显著地减少血小板粘附，但是在所有负载的NO已经被释放之后，改性的表面的功能性没有丧失。事实上，通过结合到与动脉血栓中的粘附的血小板交联的血管性血友病因子(von Willebrand factor)，具有游离硫醇基团的小分子(类似于NAP)已经显示在全身施用时提供强有力的溶栓作用。33亚硝化的表面和未亚硝化的表面两者都在富含猪血小板的血浆中孵育持续90min，然后其中使用乳酸脱氢酶(LDH)测定来确定血小板粘附。所有材料的血小板粘附的程度在图22中示出。当与未改性的SR对照相比时，表面改性的每种变化都能够提供血小板粘附的显著减少(表10)。SIM-N1和SIM-S2改性提供了最高的减少，但当相互比较时没有统计显著性(p值>0.5)。然而，随着支化从SIM-N1构型到SIM-N2构型的增加，防止粘附的能力似乎降低(p＝0.001)。据信这可能源于甲基丙烯酸酯和二胺连接的化学结构。改变这些的组成以提供更亲水性的表面(例如使用胺封端的聚乙二醇硅烷，或者羟基或羧酸侧链的存在/加入)可能允许随着表面处聚合度的增加而进一步减少蛋白质粘附。这些侧链的加入还可以为支化提供可选择的化学过程。其他非限制性的选项可以包括用二亚乙基三胺代替乙二胺的纯烷烃主链。尽管当与SIM-N1或SIM-S1相比时，SIM-S2构型不提供血小板粘附的显著减少，但NO释放的显著增加可以提供增加的杀菌活性持续延长的时间段。
表10：示出了在90min的时间段内多种表面减少每表面积吸附的血小板的能力。
概括地说，本实施例描述了本公开内容的实施方案，以将多种量的释放一氧化氮的供体SNAP附接到任何聚合物材料上，以提供杀菌活性/抗血小板活性，而同时为材料表面提供不污结性质。该方法将高度地适用于倾向于与感染和血栓形成相关的失效的生物医疗装置材料，并且可以容易地与其它现有的释放NO的聚合物偶联。
应强调，本公开内容的上文描述的实施方案仅仅是实施方式的可能的实例，并且仅仅为了清楚理解本公开内容的原理而阐述。可以对本公开内容的上文描述的实施方案作出多种变化和修改，而不实质上偏离本公开内容的精神和原理。所有这样的修改和变化意图在本文中被包括在本公开内容的范围内。
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应注意，比率、浓度、量和其它数值数据可以以范围格式在本文中表达。应理解，这样的范围格式是为了方便和简洁起见而使用的，并且因此应以灵活的方式被解释为不仅包括作为范围的限值明确叙述的数值，而且还包括该范围内涵盖的所有个别数值或子范围，如同每个数值和子范围被明确地叙述。举例说明，“约0.1％至约5％”的浓度范围应被解释为不仅包括约0.1wt％至约5wt％的明确叙述的浓度，而且还包括在所指示的范围内的个别浓度(例如，1％、2％、3％和4％)和子范围(例如，0.5％、1.1％、2.2％、3.3％和4.4％)。在实施方案中，“约0”可以指的是0、0.001、0.01或0.1。在实施方案中，术语“约”可以根据数值的有效数字包括传统的四舍五入。此外，短语“约‘x’至‘y’”包括“约‘x’至约‘y’”。
应强调，本公开内容的上文描述的实施方案仅仅是实施方式的可能的实例，并且仅仅为了清楚理解本公开内容的原理被阐述。可以对本公开内容的上文描述的实施方案作出多种变化和修改，而不实质上偏离本公开内容的精神和原理。所有这样的修改和变化意图在本文中被包括在本公开内容的范围内。

Claims (16)

1.一种涂层组合物，所述涂层组合物包括(a)NO供体基底，所述NO供体基底包括有机硝酸盐、金属-NO络合物、N-亚硝胺、S-亚硝基硫醇、或其组合，及(b)光可交联部分，其中所述涂层组合物具有防污特性和抗微生物特性中的一种或两种，其中所述光可交联部分是2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱-共-甲基丙烯酸丁酯-共-二苯甲酮。
2.根据权利要求1所述的涂层组合物，其中所述NO供体基底包括掺杂有S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺的聚合物膜。
3.根据权利要求1所述的涂层组合物，其中所述NO供体基底在暴露于光能后被共价地连接至所述光可交联部分。
4.根据权利要求2所述的涂层组合物，其中掺杂的聚合物膜是6％wt至11％wt的S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺。
5.根据权利要求4所述的涂层组合物，其中所述掺杂的聚合物膜被涂覆在聚合物膜的另外的层中。
6.一种物品，所述物品具有表面，所述物品包括：
涂层组合物，所述涂层组合物包括(a)NO供体基底，所述NO供体基底包括有机硝酸盐、金属-NO络合物、N-亚硝胺、S-亚硝基硫醇、或其组合，及(b)光可交联部分，其中所述NO供体基底被共价地附接至所述光可交联部分以形成被应用到所述表面的膜，其中所述涂层组合物给予所述表面防污特性和抗微生物特性中的至少一种，其中所述光可交联部分是2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱-共-甲基丙烯酸丁酯-共-二苯甲酮。
7.根据权利要求6所述的物品，其中NO供体基底包括掺杂有S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺的聚合物膜。
8.根据权利要求6所述的物品，其中所述NO供体基底在暴露于光能后被共价地连接至所述光可交联部分。
9.根据权利要求6所述的物品，其中所述涂层组合物使用旋涂、喷涂、浸涂、垫涂或具有粘性背衬的膜被应用至所述表面。
10.根据权利要求6所述的物品，其中所述物品是医疗植入物。
11.根据权利要求6所述的物品，其中所述物品是医疗装置。
12.根据权利要求6所述的物品，其中所述物品是医疗设备。
13.根据权利要求7所述的物品，其中掺杂的聚合物膜被涂覆在聚合物膜的另外的层中。
14.一种用于制备涂层组合物的方法，包括：
用S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺掺杂聚合物膜以形成NO供体基底，
将所述NO供体基底与光可交联部分结合以形成所述涂层组合物，以及
将所述涂层组合物暴露于光能，从而使所述光可交联部分共价地附接至所述NO供体基底，
其中所述光可交联部分是2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱-共-甲基丙烯酸丁酯-共-二苯甲酮。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述光能是紫外光。
16.一种涂层组合物，所述涂层组合物包括(a)NO供体基底，所述NO供体基底包括(i)有机硅-聚碳酸酯-聚氨酯热塑性塑料及(ii)有机硝酸盐、金属-NO络合物、N-亚硝胺、S-亚硝基硫醇、或其组合，及(b)光可交联部分，其中所述涂层组合物具有防污特性和抗微生物特性中的一种或两种，其中所述光可交联部分是2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱-共-甲基丙烯酸丁酯-共-二苯甲酮。
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