BRPI0609392B1 - Substituto cartilaginiforme e osteocondral compreendendo uma estrutura de múltiplas camadas e seu uso - Google Patents

Abstract

substituto cartilaginiforme e osteocondral compreendendo uma estrutura de múltiplas camadas e seu uso. trata-se de uma estrutura de camadas múltiplas (1) que inclui uma primeira camada superior (2), que consiste em uma matriz orgânica incluindo colágeno e pelo menos uma camada inferior (3, 4, ..., 10), que consiste em uma matriz composta incluindo hidroxiapatita e colágeno. além disso, a presente invenção se refere a um substituto cartilaginoso incluindo a referida estrutura de múltiplas camadas (1) assim como um substituto osteocondral incluindo a referida estrutura de camadas múltiplas (1). finalmente, a presente invenção se refere ao uso da referida estrutura de múltiplas camadas (1) para o preparo do referido substituto cartilaginoso e do referido substituto osteocondral para o tratamento de defeitos cartilaginosos e de defeitos osteocondrais ou para a neoformação de um tecido cartilaginoso e/ou de um tecido ósseo subcondral.

Description

(54) Título: SUBSTITUTO CARTILAGINIFORME E OSTEOCONDRAL COMPREENDENDO UMA ESTRUTURA DE MÚLTIPLAS CAMADAS E SEU USO (51) Int.CI.: A61L 27/48; A61L 27/24; A61L 27/42 (30) Prioridade Unionista: 04/03/2005 IT MI2005A000343 (73) Titular(es): FIN-CERAMICA FAENZA SPA (72) Inventor(es): ΑΝΝΑ TAMPIERI; DANIELE PRESSATO; CLÁUDIO DE LUCA; SÉRGIO Dl FEDE; ELENA LANDI

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “SUBSTITUTO CARTILAGINIFORME E OSTEOCONDRAL COMPREENDENDO UMA ESTRUTURA DE MÚLTIPLAS CAMADAS E SEU USO”.

A presente invenção refere-se a uma estrutura dotada de múltiplas camadas que incluem uma primeira camada superior que consiste em uma matriz orgânica, que compreende colágeno e pelo menos uma camada inferior que consiste em uma matriz de composto que inclui hidroxiapatita e colágeno. Além disso, a presente invenção se refere a um substituto cartilaginoso incluindo a referida estrutura de múltiplas camadas, assim como a um substituto osteocondral que inclui a referida estrutura de múltiplas camadas. Finalmente, a presente invenção se refere ao uso da referida estrutura de múltiplas camadas para o preparo do referido substituto cartilaginoso e o referido substituto osteocondral para o tratamento de defeitos cartilaginosos articulares e defeitos osteocondrais ou para a neoformação de um tecido cartilaginoso e/ou um tecido ósseo subcondral.

Sabe-se que a cartilagem articular (tecido cartilaginoso) é um tecido conjuntivo viscoelástico formado por um complexo, altamente organizado, estrutura não-vascular e livre de terminações nervosas.

A cartilagem articular é colocada fora da placa óssea subcondral próxima às juntas.

OÃ

O tecido cartilaginoso, juntamente com o tecido ósseo, pertence aos tecidos esqueléticos de suporte ou aos tecidos « conjuntivos os quais têm grandes propriedades mecânicas.

O tecido cartilaginoso tem grandes propriedades 5 mecânico-elásticas específicas, as quais permitem reduzir constantemente a fricção induzida pelas cargas na superfície articular durante as atividades de movimento normais do corpo humano. Além disso, o tecido cartilaginoso é capaz de dissipar os picos de estresse mecânico no osso subcondral.

O tecido conjuntivo ao redor do componente cartilaginoso celular, a saber, os condrócitos (2% do volume total da cartilagem) estão mergulhados numa matriz extracelular/rótula * que consiste em colágeno, proteoglicanas e glicoproteínas. Por exemplo, 2-40% do tecido conjuntivo incluem cerca de: 50-60% de colágeno, 25-35% de proteoglicanas e 10—15% de glicoproteínas.

As moléculas de colágeno são uniformemente distribuídas através do tecido e são responsáveis por sua força e pela força mecânica.

As proteoglicanas e as glicoproteínas se ligam ao colágeno pelo aprisionamento da água na matriz.

Traumas, doenças inflamatórias e degenerativas podem induzir danos significativos na cartilagem articular a qual, numa porcentagem não-negligível, pode evoluir na doença artrose crônica. O tecido cartilaginoso submetido a um dano, particularmente a um dano profundo, tem uma fraca capacidade

auto-reparatório considerando a região anatômica fracamente vascularizada e a capacidade de replicação limitada das células » condrocíticas. O resultado do processo auto-reparatório da cartilagem é geralmente uma formação de tecido fibroso, o qual certamente não pode ser comparado, em termos de desempenho . mecânico e características fisiológicas, com uma cartilagem hialina normal. Concordantemente, a alteração do balanço viscoelástico e mecânico pode levar a consequências patológicas consideráveis com um conseqüente comprometimento da função articular e com ocorrência de dor, embora o processo de degeneração cartilaginosa, na maioria dos casos, é um fenômeno assintomático.

< A situação evolui numa forma mais complexa no caso de lesões envolvendo a estrutura óssea subcondral, quando a demolição completa da camada cartilaginosa expõe diretamente o osso ao estresse mecânico da junta.

Em conclusão, entre as condições patológicas as quais podem incluir quase sempre processos degenerativos irreversíveis podem ser listadas, a mero título de exemplo: os maus alinhamentos (condições arqueadas e voltadas para fora), necrose avascular, osteoartrite e artrite reumatóide.

As técnicas cirúrgicas conhecidas atualmente utilizadas para o reparo do tecido cartilaginoso são, é claro, aplicadas como uma função das dimensões e da profundidade do defeito.

Algumas técnicas conhecidas são estabelecidas abaixo na forma de um resumo.

« A técnica chamada de cirurgia mosaico-plástica, a qual consiste do transplante de múltiplos cilindros osteocondrais retirados de uma zona cartilaginosa saudável da junta não . submetida a uma carga é geralmente executada pela artroscopia.

A cirurgia mosaico-plástica pode ser somente adequada para defeitos osteocondrais de pequenos tamanhos, uma vez que tal prática pode produzir alguns efeitos colaterais adversos no sítio doador.

A técnica relacionada com transplantes do tecido osteocondral de um doador. Essa técnica mostra problemas * ligados à possível transmissão viral, à rejeição e à disponibilidade limitada de tecido de um banco.

A técnica relacionada com o transplante de condrócitos autólogos retirados de zonas cartilaginosas saudáveis não submetidas a uma carga, cultivadas in vitro e reinjetadas sob um enxerto periósteo ou uma membrana impermeável de origem polimérica.

As técnicas de engenharia tecidual, em que os condrócitos cultivados são transportados através de esqueletos tridimensionais baseados em polímeros naturais ou sintéticos.

Até aqui, essas duas últimas técnicas permitiram alcançar resultados morfofuncionais suficientemente satisfatórios da estrutura cartilaginosa presente no compartimento articular do joelho.

O reparo do defeito osteocondral, o qual geralmente representa uma condição patológica de uma difícil solução para o cirurgião, particularmente quando o indivíduo é um paciente jovem, resulta mais complexo. Nessas condições, além da restauração da camada cartilaginosa, é importante a reconstrução da estrutura óssea subcondral.

Para o tratamento de grandes defeitos osteocondrais, o uso de esqueletos tridimensionais, os quais tendem a mimetizar o compartimento osteocondral inteiro, foi proposto. Os referidos esqueletos têm uma estrutura complexa, com composição, porosidade, arquitetura e propriedades mecânicas bem definidas. A superfície externa geralmente consiste em uma camada polimérica com uma porosidade de uma dimensão macroscópica, enquanto que a camada mais interna consiste em um material composto com uma matriz polimérica a qual incorpora o componente mineral (Sherwood J et al. Biomaterials 2002; 23 (24): 4739).

Conseqüentemente, persiste a necessidade de ter um dispositivo médico para ser usado como um substituto de cartilagem e um substituto osteocondral, o qual não apresente as desvantagens dos dispositivos existentes na técnica conhecida.

Particularmente, existe a necessidade de ter um dispositivo médico o qual possa ser colocado no compartimento cartilaginoso e subcondral submetido à lesão e/ou degeneração.

Um primeiro objetivo da presente invenção é fornecer novos substitutos condrais e osteocondrais com uma alta

biocompatibilidade, uma vez que eles não gerem qualquer resposta inflamatória e excluam a capacidade de induzir uma resposta imune do corpo humano.

Outro objetivo da presente invenção é fornecer 5 novos substitutos nos quais exista uma matriz composta incluindo fibras de colágeno ou outros tipos de polímeros naturais e/ou sintéticos, nos quais cristais nanodimensionais (5-30 nm) de hidroxiapatita sejam nucleados.

Outro objetivo da presente invenção é fornecer 10 uma estrutura de múltiplas camadas, capaz de mimetizar tanto o componente cartilaginoso quanto o componente ósseo subcondral.

' Outro objetivo da presente invenção é fornecer « estruturas biomiméticas.

Outro objetivo da presente invenção é fornecer 15 estruturas osteocondutoras.

Outro objetivo da presente invenção é fornecer estruturas degradáveis e bio-reabsorvíveis (com referência acima a toda a parte colágena) e osteointegráveis (com referência acima a toda a parte inorgânica de hidroxiapatita).

Outro objetivo da presente invenção é fornecer um dispositivo médico capaz de agir como um suporte (esqueleto) para a ligação in situ e para a diferenciação de células ’ mesenquimais não-diferenciadas vindas do compartimento subcondral, de acordo com o conceito da regeneração controlada dos tecidos (Baran ET et al. J Master Sei Mater Med. febbraio 2004; 15(2): 161-5).

Outro objetivo da presente invenção consiste em fornecer um dispositivo médico capaz de ser carregado ex-vivo com um concentrado do sangue medular, com um concentrado plaquetário (PRP), fatores e crescimento capazes de promover o trofismo e a diferenciação celular, tais como TGF, EGF, BMP e outros fatores.

Outro objetivo da presente invenção é fornecer um dispositivo médico capaz de ser carregado ex vivo com células mesenquimais não-diferenciadas ou mantidas numa cultura por um período de tempo necessário para a multiplicação e/ou diferenciação em células de origem dos osteoblastos e condrócitos.

Outro objetivo da presente invenção é fornecer novos enxertos/substitutos osteocondrais e cartilaginosos, os quais podem ser: dimensionados e adaptados como função das dimensões do dano cartilaginoso ou osteocondral; carregados com substâncias farmacologicamente ativas, tais como, por exemplo, corticosteróides antiinflamatórios, FANS, imunossupressores, antibióticos, antiblásticos, antiproliferativos, antivirais; aplicados com técnicas artroscópica; fixados com a ajuda de suturas absorvíveis e não-absorvíveis, colas cirúrgicas de origem biológica e sintética.

Esses e outros objetos, os quais irão resultar aparentes a partir da seguinte descrição detalhada são realizados pelo requerente, o qual efetuou uma estrutura de múltiplas camadas, assim como um substituto cartilaginoso e osteocondral β

incluindo a referida estrutura de múltiplas camadas, com as características estabelecidas na reivindicação independente em anexo. Um objeto da presente invenção é uma estrutura de múltiplas camadas incluindo uma primeira camada superior que consiste em uma matriz orgânica, incluindo colágeno e pelo menos uma camada inferior que consiste em uma matriz composta incluindo hidroxiapatita e colágeno.

Outro objeto da presente invenção é um substituto cartilaginoso incluindo a referida estrutura de múltiplas camadas.

Um outro objeto da presente invenção é um substituto osteocondral incluindo a referida estrutura de múltiplas camadas.

Outro objeto da presente invenção é o uso da 15 referida estrutura de múltiplas camadas para o preparo do referido substituto cartilaginoso e do referido substituto osteocondral para o tratamento de defeitos cartilaginosos articulares e de defeitos osteocondrais.

Finalmente, outro objeto da presente invenção é 20 o uso da referida estrutura de múltiplas camadas estrutura de múltiplas camadas para a neoformação de um tecido cartilaginoso e/ou a formação de um tecido ósseo subcondral.

Outras características e vantagens da presente invenção irão melhor resultar a partir da descrição indicativa, e conseqüentemente não limitativa de uma modalidade preferida, porém não exclusiva de um substituto cartilaginoso e

osteocondral, conforme ele é mostrado nos desenhos em anexo, nos quais:

-A Figura 1 mostra uma vista de perspectiva diagramática de uma estrutura de múltiplas camadas de acordo com uma primeira modalidade;

-A Figura 2 mostra uma vista de perspectiva diagramática de uma estrutura de múltiplas camadas de acordo com uma segunda modalidade;

-A Figura 3 mostra uma vista de perspectiva 10 diagramática de uma estrutura de múltiplas camadas de acordo com uma terceira modalidade.

-A estrutura de múltiplas camadas 1, assunto da presente invenção, inclui uma primeira camada superior 2 apresentando uma superfície superior 2a e uma superfície inferior 2b.

Conforme é mostrado na Figura 1, a referida estrutura de múltiplas camadas 1 inclui ainda pelo menos uma camada inferior 3 associada com a referida camada superior 2.

Particularmente, a camada inferior 3 inclui uma 20 superfície superior 3a associada com a referida superfície inferior 2b da referida camada superior 2, e uma superfície inferior 3b oposta à referida superfície superior 3a.

Numa modalidade preferida da presente invenção, mostrada na Figura 2, duas camadas inferiores, 3, 4 podem ser previstas. Nessa situação, a camada inferior 3 próxima à camada superior 2 apresenta uma respectiva superfície superior

3a associada com a referida camada inferior 2b da camada superior 2 e uma superfície inferior 3b associada com uma superfície superior 5a da camada inferior 4.

Vantajosamente, nessa situação, a camada 5 inferior 3 forma uma camada intermediária disposta entre a referida camada superior 2 e a referida camada inferior 4.

No âmbito da presente invenção, as estruturas de múltiplas camadas 1, incluindo uma pluralidade de camadas inferiores, por exemplo, numa quantidade maior do que duas e menor ou igual a dez, são incluídas.

Por exemplo, conforme é mostrado na Figura 3, a estrutura de múltiplas camadas 1 pode mostrar quatro camadas inferiores, 3, 4, 5 e 6, cada uma das quais apresentando uma superfície superior respectiva associada com a superfície inferior da camada adjacente.

A camada superior 2 consiste em uma matriz orgânica incluindo colágeno.

As camadas inferiores 3, 4, 5 e 6 consistem de uma matriz composta incluindo colágeno e hidroxiapatita.

No contexto da presente invenção, as quantidades de colágeno e de hidroxiapatita são expressas em porcentagem em peso.

Preferivelmente, o colágeno está presente numa camada inferior numa quantidade entre 99 e 1%.

Altemativamente, a hidroxiapatita está presente numa camada inferior numa quantidade entre 1 e 99%.

Na modalidade mostrada na Figura 1, a camada inferior 3 consiste em uma matriz composta incluindo colágeno numa quantidade entre 95 e 75% e hidroxiapatita numa quantidade entre 5 e 25%.

Na modalidade mostrada na Figura 2, a camada inferior 3 consiste em uma matriz composta incluindo colágeno numa quantidade entre 95 e 75% e hidroxiapatita numa quantidade entre 5 e 25%, enquanto que a camada inferior 4 consiste em um material composto incluindo colágeno numa quantidade entre 75 e 45% e hidroxiapatita numa quantidade entre 25 e 55%.

Na modalidade mostrada na Figura 3, a camada inferior 4 consiste em uma matriz composta incluindo colágeno numa quantidade entre 95 e 75% de hidroxiapatita numa quantidade entre 5 e 25%, pelo menos uma camada inferior 5 que consiste em uma matriz composta incluindo colágeno numa quantidade entre 75 e 45% e hidroxiapatita numa quantidade entre 25 e 55% e pelo menos uma camada inferior 6 que consiste em uma matriz composta incluindo colágeno numa quantidade entre 45 e 25% e hidroxiapatita numa quantidade entre 55 e 75%.

A estrutura de múltiplas camadas 1 é caracterizada pela presença de um gradiente de colágeno se estendendo da camada superior 2, na qual há 100% de colágeno na camada inferior 3, na qual há uma quantidade de colágeno de 90 a 70%, até a última camada inferior ser alcançada, por exemplo, a camada inferior 10, na qual a quantidade de colágeno

é menor do que 10%. Claramente, a quantidade de hidroxiapatita é complementar à quantidade de colágeno.

Por exemplo, a camada superior 2 tem uma espessura entre 1 e 10 mm; preferivelmente, de 2 a 8; ainda mais preferivelmente, de 3 a 5 mm.

As camadas inferiores 3-10 podem ter espessuras iguais ou diferentes entre elas sem qualquer restrição. A espessura da camada inferior é entre 1 e 10 nm; preferivelmente, de 2 a 8; ainda mais preferivelmente, de 3 a 5 mm.

No contexto da presente invenção, pelo termo colágeno se entende uma proteína fibrosa do tipo mucopolissacarídeo, a qual representa o principal componente da matriz extracelular. O colágeno é reconhecido como a unidade estrutural mais importante dos tecidos conjuntivos do corpo humano. Pelo termo colágeno, é compreendido verdadeiramente uma classe ampla e heterogênea de moléculas as quais, além das funções estruturais, podem ter outras importantes funções/papéis fisiológicos diretos ou indiretos, tais como adesão e diferenciação celular durante o desenvolvimento de órgãos e tecidos. Dentre os organismos vertebrados, pelo menos 15 tipos de colágenos com diferentes funções estão naturalmente presentes. A estrutura de tripla hélice molecular junta todos os tipos de colágenos. Ela consiste em três cadeias individuais, chamadas de cadeias a, cada uma das quais contém uma seqüência característica de

4$ aminoácidos. Essas três cadeias individuais são enroscadas umas nas outras, gerando uma típica estrutura de tripla hélice.

Essa conformação é estabilizada pela presença de pontes de hidrogênio, além disso, a tripla hélice do colágeno é tomada compacta e estável por uma seqüência de aminoácidos particular. Um aminoácido a cada três é glicina e muitos dos aminoácidos resultantes são prolina ou hidroxiprolina. O colágeno do tipo I representa o tipo mais abundante de colágeno existente na natureza e está presente em vários tecidos conjuntivos de adultos, tais como na derme, no osso, no tendão e na córnea. O colágeno usado na presente invenção pode ser do tipo I ou do tipo II ou do tipo IV ou suas misturas e pode ser derivado de diferentes fontes, por exemplo, pela extração de derivação bovina, suína e eqüina.

Altemativamente, o colágeno usado pode ser de uma origem sintética, por exemplo, pode ser recombinante.

No contexto da presente invenção, pelo termo hidroxiapatita é geralmente entendido tanto a hidroxiapatita Caio(P04)ô(OH)2 com um alto e baixo grau de cristalinidade quanto à hidroxiapatita com substituições químicas, uma vez que o componente inorgânico/mineral do osso é formado por íons sódio, magnésio, carbonato e citrato.

A hidroxiapatita sintética representa o substituto ósseo de uso mais amplo na cirurgia. Entretanto, os resultados clínicos expressos como a qualidade do osso neoformado nem sempre proporcionam resultados satisfatórios. A desvantagem é

está na sua maior parte ligada ao fato de que a hidroxiapatita sintética não tem as mesmas características da hidroxiapatita humana, as quais de um ponto de vista bioquímico são formadas com um processo de mineralização nas fibrilas de colágeno. Para esse propósito, uma tentativa biomimética para sintetizar componentes inorgânicos minerais associada com os componentes orgânicos, ambas baseadas em colágeno ou outros polímeros naturais ou sintéticos, com uma diferente composição química e estrutura macromolecular, tem sido amplamente utilizada. AS matrizes macromoleculares, na sua maioria, agem como moldes e induzem o depósito orientado do componente inorgânico pelo impedimento do crescimento do cristalino, o qual permanece com dimensões de 10-20 nm ao longo do eixo principal (uma medida completamente semelhante àquela de uma apatita humana natural). A interação da HA com o colágeno induz uma carbonação espontânea na posição B, a qual aumenta ainda mais a capacidade biomimética e o grau de biodisponibilidade da apatita. As propriedades flsico-químicas dos componentes macromoleculares orgânicos e das hidroxiapatitas são influenciadas pelas interações químicas e pela organização estrutural entre os dois componentes os quais, além de conferir geometria e morfologia, estabelecem as propriedades biomecânicas do dispositivo da invenção.

Numa modalidade preferida da presente invenção, agentes de ligação cruzada, tais como glutaraldeído, formaldeído, éteres, bis-epóxidos e ácido hialurônico tem sido

usados para conferir maiores propriedades mecânicas e viscoelásticas, particularmente na parte formada pela camada de colágeno, por exemplo, na camada superior 2 na Figura 1,2 ou 3.

A estrutura de múltiplas camadas 2, apresentada 5 a título de exemplo nas Figuras anexadas 1,2 e 3, é obtida através da associação com uma camada superior 2 formada por uma matriz orgânica incluindo colágeno e uma ou mais camadas inferiores formadas por uma matriz composta, incluindo hidroxiapatita e colágeno. A camada superior 2 e uma camada inferior 3, por exemplo, na forma de um gel, entram em contato e, subseqüentemente, a estrutura de múltiplas camadas 1 é submetida a um passo de liofilização ou de secagem.

Numa modalidade preferida, a estrutura de múltiplas camadas 1 pode ser associada com:

1. Alguns componentes presentes na estrutura cartilaginosa e/ou na estrutura óssea, por exemplo, através do embebimento ou do revestimento externo com biopolímeros hidrofílicos, tais como ácido hialurônico e derivados (ligados de forma cruzada, ésteres, sulfatados), queratan-sulfato, condroitina20 sulfato.

2. Biopolímeros, por exemplo, proteoglicanas e glicosaminoglicanas geralmente contidas na matriz extracelular do tecido conjuntivo cartilaginoso e no conjuntivo ósseo respectivamente numa extensão de 15% e de 5%. Tal adição permite melhorar as propriedades de biocompatibilidade e de viscoelasticidade e, ao mesmo tempo, permite reduzir a ação compressiva das cargas.

3. Polímeros naturais e sintéticos, tais como alginato de sódio, gelana, quitosana, gelatina, ácido polilático (PLLG), ácido poliglicólico (PGA), policaprolactona (PCL), polietilenoglicol (PEG).

Vantajosamente, numa modalidade da presente invenção, a estrutura de múltiplas camadas pode ser usada ou associada com técnicas de engenharia tecidual, as quais envolvem o uso de condrócitos autólogos cultivados in vitro, o uso de células mesenquimais da medula óssea pré-cultivada e expandida in vitro ou pré-diferenciadas ou completamente diferenciadas num sentido de osteoblasto ou de condroblasto, células da medula óssea retiradas do paciente no passo intraoperativo a ser usado como tal ou concentradas.

Vantajosamente, em outra modalidade da presente invenção, os substitutos cartilaginosos e os substitutos osteocondrais podem ser usados para aplicações cirúrgicas nas quais a reconstrução de superfícies cartilaginosas e ósseas é necessária, por exemplo, na lâmina epifiseal do corpo vertebral da espinha, onde a parte cartilaginosa consiste em cartilagem hialina envolta por um anel ósseo.

Vantajosamente, em outra modalidade da presente invenção, os substitutos cartilaginosos e os substitutos osteocondrais podem ser usados na região articular femural, na região articular do tornozelo, na região maxilofacial (no caso da

reconstrução da ramificação condiliana-mandibular), nos defeitos osteocondrais, na cirurgia de ombro e em todos os tipos de cirurgia ortopédica, as quais necessitam da formação de um novo tecido ósseo e tecido cartilaginoso para regenerar/substituir tais tecidos originalmente existentes, porém subseqüentemente danificados ou cirurgicamente removidos.

Vantajosamente, em outra modalidade da presente invenção, as novas estruturas compostas tridimensionais, de múltiplas camadas, bioativas e biomiméticas podem ser usadas como substitutos cartilaginosos e como substitutos osteocondrais. Tais estruturas, matrizes ou “esqueletos” tridimensionais, cirurgicamente dispostos no compartimento cartilaginoso e subcondral submetidos a uma lesão/degeneração serão capazes de promover o processo regenerativo (condrogênese e osteogênese) os quais levam à restauração da anatomia, morfologia e das propriedades mecânicas de um tecido osteocartilaginoso normal das superfícies articulares.

A matriz composta da estrutura de múltiplas camadas 1 apresenta um “gradiente” de hidroxiapatita/colágeno entre as diferentes camadas inferiores 3-10, cada uma contendo uma diferente quantidade de colágeno e de hidroxiapatita nucleada independentemente da espessura de cada camada.

Para esse propósito, uma pessoa pode simultaneamente proceder com a síntese dos compostos com um conteúdo diferente de fase de apatita, como uma função do tipo de gradiente desejado (porcentagem). Um procedimento de

nucleação direto da hidroxiapatita nas fibras de colágeno, as quais foram anteriormente fixadas, foi executado. Essas reações de nucleação ocorrem em água ou SBF (fluido fisiológico sintético) e em tais condições de pH para permitir que as fibras do colágeno incorporem o nanonúclco da apatita.

Uma vez obtidos os compostos, eles são repetidamente lavados para purificá-los de possíveis resíduos de reação ácida ou básica, filtrados com a ajuda de uma peneira de malha fina e espalhados numa superfície a partir da qual é possível facilmente removê-los dali. As camadas individuais são, a seguir, estratificadas dentro de um molde e compacatadas umas com as outras. As múltiplas camadas obtidas dessa forma são secas por liofilização de forma a obter um material esponjoso, porém resistente e compacto de uma espessura e gradiente desejados.

Como para a camada inferior, que é o componente o qual, durante a operação, está intimamente em contato com a superfície óssea subcondral, é preferível obter uma estrutura o mais similar quanto forem possíveis em relação ao osso humano. O colágeno e a hidroxiapatita e as misturas relacionadas são conhecidas. Não é conhecido, ao contrário, um método para a preparação de uma matriz tridimensional de cerâmica orgânica composta com propriedades semelhantes ao tecido ósseo humano.

Uma vantagem da presente invenção é fornecer um substituto tridimensional com uma camada inferior

(hidroxiapatita nucleada ou colágeno) com as mesmas características morfológicas do osso humano.

Tal vantagem é conseguida através de um processo de nucleação direto de uma fase de apatita em fibrilas de colágeno, em que uma solução de sais de cálcio, o qual promove a formação de hidroxiapatita, reage com polímeros naturais similares ao colágeno numa suspensão ácida. Na mistura de sais de cálcio em solução aquosa, uma solução aquosa de componente fosfórico, anteriormente adicionada com a suspensão ácida de polímeros semelhantes a colágeno, é pingada. O produto obtido dessa forma é subseqüentemente submetido à lioíilização e/ou filtração e secagem. A estrutura do polímero natural semelhante a colágeno transfere para o nível molecular aquelas informações as quais permitem substituir quimicamente a hidroxiapatita, tal como ocorre no corpo humano, a saber, substituintes, tais como frações de carbonato e frações iônicas, tais como fosfato, existentes na mistura reacional, entram. O produto obtido através de tal processo tem características idênticas com aquelas do tecido ósseo humano graças à presença de tais substituintes na estrutura do composto obtida. A nucleação direta age como um mecanismo de tendência biológica pela formação de nanocristais de hidroxiapatita crescidos orientados em paralelo com o eixo ao longo das fibrilas de colágeno, tal como ocorre no corpo humano, e origina um componente inorgânico com um baixo grau de cristalinidade, quase amorfo e, concordantemente muito solúvel. Os cristais formados dessa forma não crescem, mas permanecem de dimensões da ordem de nanômetros. A nucleação da hidroxiapatita no colágeno envolve uma carbonação da fase inorgânica, que é a incorporação de grupos CO₃ ²' na treliça de hidroxiapatita durante a nucleação do mesmo sítio B numa proporção similar àquela do tecido ósseo calcificado natural. Além disso, a carbonação pode ser atribuída na sua maior parte à posição Β. A interação da hidroxiapatita com o colágeno previne a carbonação na posição A provavelmente pelo bloqueio do acesso aos grupos -OH. Esse desvio da estequiometria aumenta surpreendentemente a similaridade com o tecido ósseo natural e, conseqüentemente, não somente a microestrutura, mas também a composição do tecido artificial obtido é exatamente a mesma que aquela do tecido ósseo natural. A carbonação na posição B é vantajosa em relação à carbonação na posição A porque, como conseqüência, a bioatividade e a biodegradabilidade do tecido ósseo artificial obtido aumentam notoriamente, o que são características essenciais para a calcificação, uma vez que elas permitem uma troca dinâmica contínua entre o fluido fisiológico e a célula, a qual usa os íons para a formação óssea.

FÓRMULA

Ca₅ (PO₄)₃ (OH)

4Posição B Entrada de CO³‘

Posição A Entrada de CO³

A presente invenção usa uma tentativa de tendência biológica para sintetizar nanocristais de hidroxiapatita

em fibrilas de colágeno auto-montáveis semelhantes aos nanocristais de ossos naturais, pela exploração da capacidade dos grupos carboxila de colágeno negativamente carregados de se ligar aos íons cálcio da hidroxiapatita; seguindo essa abordagem, foi provado de fonna bem sucedida que os sistemas biológicos estocam e processam informação em nível molecular. Por essa razão, as moléculas de colágeno do tipo I sem telopeptídeos e livres de regiões glicosiladas, capazes de se auto-agregar em fibrilas sem agentes de ligação cruzada, foram usadas como materiais de partida.

Preparação do colágeno

O colágeno do tipo I foi descoberto no mercado como um produto padrão. Depois do processo de purificação, o colágeno do tipo I é dissolvido num volume estimado de ácido acético até ser obtida uma suspensão homogênea (1% de colágeno).

Numa modalidade preferida, sais de cálcio em solução aquosa ou SBF (fluido corporal sintético) são usados, os quais promovem a formação de hidroxiapatita, preferivelmente selecionados do grupo incluindo hidróxido de cálcio, nitrato de cálcio, acetato de cálcio, sulfato de cálcio, carbonato de cálcio. Mais preferivelmente, é usado hidróxido de cálcio. Além disso, uma suspensão ácida de polímero natural semelhante a colágeno é usada, obtida por tratamento de colágeno animal extraído do tensão de cavalo, do rabo de camundongo, do rabo de canguru ou polímero sintético semelhante a colágeno ou gelatinas

quimicamente ligadas de forma cruzada. Além disso, o componente fosfato usado foi selecionado dentre ácido fosfórico em solução aquosa ou SBF ou um sal de cálcio, amônio, sódio, potássio e magnésio em solução aquosa com um ânion fosfato PO₄ ⁽’³⁾, monoidrogenofosfato HPO/'²⁾ ou diidrogenofosfato H2PO4^W. Mais preferivelmente, ácido fosfórico H3PO₄ é usado. Os sais de cálcio usados pela presente invenção estão na faixa entre 1 e 4 gm/L, o componente fosfato está na faixa entre 2 gm/L e 4 gm/L. Mais preferivelmente, os sais de cálcio usados na presente invenção estão na faixa entre 2 e 3 gm/L, o componente fosfato está na faixa entre 3 e 4 gm/L.

O passo de nucleação direta ocorre com um pH preferivelmente entre 9 e 12, mais preferivelmente entre 9-11 (no final da reação o pH deve estar entre 7 e 8,5 ou, mais preferivelmente, entre 7 e 7,5) e numa temperatura preferivelmente entre 25 a 45 °C, mais preferivelmente entre 35 e 40 °C.

Numa modalidade preferida, numa solução aquosa ou de SBF de Ca(OH)₂ (146 gm de Ca(OH)₂ em 300 cc de H₂O) uma solução de ácido fosfórico (1,17 gm de H₃PO₄ em 200 cc de H₂O) e 50 gm de colágeno em ácido acético foram gotejados. O pH durante o processo foi entre 7-10, a temperatura foi mantida por volta de 25 °C, o tempo de gotejamento da solução de ácido fosfórico na mistura de sais de cálcio em solução aquosa e suspensão ácida de colágeno foi mantido entre 15 e 60 minutos e, consequentemente, a taxa de gotejamento foi preferivelmente entre 0,0133 L/minuto e 0,0033 L/minuto, mais preferivelmente entre 0,0100 e 0,0060 L/min.

Os produtos obtidos, codificados como HACol nuc. Col. Foram subseqüentemente submetidos a um passo de

Iiofílização ou de secagem.

Conseqüentemente, os compostos foram caracterizados por análise de cristal com um difractômetro de raio-X (Rigaku Miniflex); para analisar a orientação, alguns gráficos de difração foram fotograficamente registrados com uma distância amostra-filme de 70 mm pelo uso de uma câmara plana (sempre com radiação Cu-Ka).

A análise termogravimétrica foi executada (Polymer STA 1660) pelo uso de um cadinho de alumina em ar e usando uma taxa de aquecimento de 10 °C/min.

Análise dos Compostos

Os compostos preparados de acordo com o método da presente invenção por nucleação direta da hidroxiapatita nas fibrilas de colágeno tinham uma composição nominal de hidroxiapatita/colágeno de 80/20 até 10/90 como massa. Entretanto, por análise termogravimétrica, foi descoberto que a verdadeira composição foi respectivamente 70/30 e 10/90. Essa discrepância é devido ao rendimento reacional o qual não alcança 100%. O conteúdo de água no composto é muito semelhante àquele do colágeno puro (10%). Essa análise foi usada com sucesso para obter informação acerca das modificações das relações estruturais entre as fibrilas de colágeno e a fase

inorgânica como função do conteúdo mineral. Anteriormente, tal análise foi executada no tensão flexor da pata de peru, o qual é usada como padrão no processo de calcifícação.

De fato, os gráficos TG-DTG parecem modificados em relação com aqueles dos compostos de hidroxiapatita/colágeno, os quais mostram uma interação da fase inorgânica com as fibras de colágeno. Esse tipo de interação pode ser comparado com o processo de calcifícação, o qual naturalmente ocorre. A comparação é executada com um gráfico TG-DTG relacionado com o tendão calcificado de peru, usado como um padrão teórico de osso. A íntima similaridade é aparente porque em ambos os casos o pico DTG a 450-500 °C tende a desaparecer pela formação de um “ombro alargado”.

Pode-se supor que, quando uma nucleação direta de hidroxiapatita em colágeno é executada, o composto se comporta como um tecido naturalmente calcificado.

O cristalograma XRD mostra um gráfico típico de hidroxiapatita com uma cristalinidade muito baixa, os tamanhos dos cristais estimados ao longo do eixo é de cerca de 12-15 nm. A nucleação ocorre de acordo com o processo típico do osso natural, no qual a nanodimensão dos cristais é responsável pela extensão da reflexão no gráfico. Além disso, uma vez que a reação tenha sido executada em cerca de 25 °C, uma pessoa está amplamente dento dos limites para formar nanocristais de hidroxiapatita monocristalina. Tais nanocristais crescem nas fibras de colágeno com seus eixos c preferivelmente

orientados em paralelo com a direção de orientação das fibras. De fato, o gráfico de difiação do ângulo de raio-X amplo é obtido a partir de uma amostra que consiste em algumas fibrilas calcificadas.

A micrografia TEM mostra nanonúcleos formados nas fibrilas de colágeno as quais crescem em paralelo com as fibrilas. Tais técnicas analíticas apontaram fortes interações entre os dois colágenos e os componentes de hidroxiapatita e uma completa analogia do composto com o tecido natural calcificado.

Além disso, a análise sob microscópio ótico mostra a morfologia cristalina diferente do composto de hidroxiapatita/colágeno obtido por nucleação direta e, subseqüentemente, por liofilização a partir do ar seco. Os compostos liofilizados apresentam uma rede tridimensional caracterizada por uma distribuição de poros muito grande similar àquela do algodão na lã. Quando a amostra é seca num filtro de ar, ao contrário, uma rede bidimensional é formada e a estrutura se parece com um enchimento de gaze.

O tecido ósseo artificial de acordo com a presente invenção pode ser obtido com diferentes quantidades de hidroxiapatita/colágeno e várias formulações e é adequado para várias aplicações clínicas. Tal tecido ósseo artificial pode ser usado como um constituinte da(s) camada(s) de HA-colágeno inferior(es) do substituto cartilaginoso/osteocartilaginoso da presente invenção e também como um material prostético, para // substituir ou encher o osso, como uma membrana reconstrutiva ou tecido hemostático em ortopedia, odontoterapia, cirurgia maxilofacial.

Vantajosamente, os substitutos acima 5 mencionados podem ser usados como um substituto osteocondral para defeitos cartilaginosos de grau 3 e 4 de Outerbridge ou para defeitos cartilaginoso de grau 4 de Outerbridge profundo.

Parte experimental

A parte experimental será agora descrita com 10 referência às Figuras e imagens anexadas, as quais mostram alguns exemplos de modalidade não limitativos, em que:

- Figura 4 mostra a estrutura de colágeno do protótipo A’ sem a adição de qualquer ligante de forma cruzada no passo de preparação. O protótipo A’ é exatamente uma amostra sem a adição de qualquer ligante de forma cruzada no passo de preparação. Na Figura 4 é ele está mostrado: por (1) um particular da estrutura porosa da camada de colágeno, por (2) um grande alargamento da estrutura porosa da camada de colágeno, por (3) uma camada de colágeno na interface de gradiente de

HA/colágeno;

- A Figura 5 mostra a porosidade de uma camada de colágeno B’ com a adição de ácido hialurônico no passo de preparação. O protótipo B’ é uma amostra com a adição de ácido hialurônico no passo de preparação. Na Figura 5 ele está mostrado: por (1) um /2 particular da estrutura porosa da camada de colágeno, por (2) um grande alargamento da estrutura porosa da camada de colágeno, por (3) uma interface de colágeno no gradiente da superfície HA/colágeno;

- A Figura 6 mostra a estrutura porosa de uma amostra C’ submetida à ligação cruzada através da adição de éter 1,4-butanodioldiglicidílico (BDDGE). Na Figura 6, ele está mostrado: por (1) um particular da estrutura porosa com orientação numa direção vertical, por (2) um particular com um grande alargamento da estrutura porosa com uma orientação na direção vertical das paredes dos poros, por (3) um detalhe da interface HA gradiente/colágeno;

- A Figura 7 mostra a estrutura colágena porosa do protótipo D’ submetido à ligação cruzada através do tratamento com vapores de glutaraldeído. Na Figura 7 ela está mostrada: por (1) um particular com um grande alargamento da estrutura porosa da camada de colágeno, por (2) uma interface de camada-HA de colágeno gradiente/colágeno;

- A Figura 8 mostra uma ilustração diagramática do côndilo direito de um cavalo. Na Figura 8 é mostrado: por (A) uma lesão lateral condral + microabrasões com um dispositivo posicionando com 2 gradientes (substituto cartilaginoso, configuração I), por (B) uma lesão média osteocondral + epistaxe com um esqueleto

A se posicionando com 3 gradientes (substituto osteocartilaginoso, configuração II);

- A Figura 9 mostra uma ilustração diagramática do côndilo de um cavalo. Na Figura 9 ele está mostrado: por (C) uma lesão mediai osteocondral + epistaxe com um esqueleto posicionando com 3 gradientes (substituto osteocartilaginoso); por (D) uma lesão lateral condral + microabrasões com um dispositivo se posicionando com 2 gradientes (substituto cartilaginoso);

- A Figura 10 mostra uma abertura e uma região anatômica incisada;

- A Figura 11 mostra a exposição das superfícies do côndilo;

- A Figura 12 mostra uma lesão na superfície cartilaginosa com exposição do osso subcondral;

- A Figura 13 mostra um exemplo do posicionamento do dispositivo;

- A Figura 14 mostra uma análise histológica depois de 8 semanas (manchamento com hematoxilina/eosina). Figura 14 mostra a presença de tecido fibroso em correspondência com o gradiente 1 de colágeno sozinho. Na zona mais profunda, em correspondência com o gradiente 3 com um componente de hidroxiapatita prevalente, a presença de uma neoformação óssea é notada;

- A Figura 15 mostra uma “2° aspecto” artroscópico;

- A Figura 16 mostra um “2° aspecto” do animal No. 1.

A Figura 16 mostra um recrescimento do tecido conjuntivo nas lesões condrais laterais A e D e nas lesões osteocondrais mediais B e C;

- Figura 17 (A-H) mostra uma análise histológica com um manchamento de azul de toluidina em diferentes alargamentos do implante condral (animal 1).

O substituto condral ou osteocondral (esqueleto) da presente invenção foi quimicamente modificado de forma a tomar toda a estrutura geral mais elástica e mais hidrofilica, conseqüentemente menos sujeita a deslaminação na interface entre a superfície inferior 2b da camada superior 2 e a superfície superior 3a da camada inferior 3 durante o manuseio executado pelo operador.

O fenômeno da deslaminação das camadas é uma desvantagem a qual ocorre quando o substituto, uma vez preparado, é hidratado. A deslaminação representa um problema o qual tem que ser necessariamente contornado.

Uma estrutura de múltiplas camadas 1 apresenta uma camada superior 2 que consiste em colágeno do tipo I e uma camada inferior 3 que consiste em hidroxiapatita/colágeno do tio I (40%-60%).

Outra estrutura de múltiplas camadas 1 apresenta uma camada superior 2 que consiste em um colágeno do tipo I e de uma camada inferior 3 que consiste em

hidroxiapatita/colágeno do tipo I (40%-60%) e uma camada inferior 4 que consiste em hidroxiapatita/colágeno (70%-30%).

Para cada uma das duas configurações de camadas múltiplas, foram preparados 4 protótipos, cujas características químicas e geométricas depois da liofilização estão reportadas nas Figuras 1 e 2.

Cada protótipo foi liofilizado (quando levado à temperatura de -40 °C, uma vez completamente congelado, ele é submetido a um vácuo de cerca de 7.10'² Pirani (1 Pirani = 1.10‘³ mBar), a seguir aquecido até 30 °C pela manutenção do grau de vácuo) numa placa de Petri e subdividido em 4 porções de 12 cm² cada com o uso de uma faca afiada. Todos os protótipos foram embalados em embalagens individuais e esterilizados por radiação γ a 25 KGy.

Uma porção estéril foi submetida aos seguintes testes:

- Manuseio a seco;

- Capacidade de umidificação;

- Microscopia ótica;

- Análise estrutural SEM.

Uma porção estéril foi submetida a testes in vitro e in vivo e a testes de manuseio in vivo em ovelhas e na cartilagem de machinho de um cadáver de cavalo. Finalmente, uma alíquota para executar testes adicionais e análises químicas foi mantida.

As amostras B e C resultam, para o seu uso tencionado, nas mais adequadas tanto quanto as suas boas propriedades de elasticidade quanto ao seu alto grau de hidrofilicidade:

- O fluxo elástico ao manuseio é uma propriedade a qual promove o seu uso

- A hidrofilicidade é um parâmetro muito importante porque facilita a migração, no esqueleto, das células tronco mesenquimais vindas da medula óssea; isso, concordantemente, permite, no esqueleto, a diferenciação celular e a regeneração dos tecidos a serem reparados.

Num estado seco a boa compactação dos protótipos é observada, uma maior elasticidade e fluxo de compressão para os protótipos B e C para ambas as versões I e II é aparente. Para o protótipo D, o qual apresenta um manchamento tendendo para o amarelo provavelmente devido ao tratamento com vapor de glutaraldeído, é notada uma rigidez.

Os testes de capacidade de umidificação foram executados em água, pela imersão, manuseio e reidratação de cada porção de esqueleto individual e eles foram observados por até uma semana. Para todas as versões, uma estabilidade de até dois dias foi observada. Os protótipos B e C mostraram uma primeira capacidade de hidrataçâo e uma maior intumescência do que os protótipos A e D. A versão D apresentou uma maior rigidez.

No terceiro dia de exame, a estabilidade diminuiu sensivelmente para o protótipo A com uma perda de fibra e uma deslaminação parcial nos limites do gradiente, enquanto que uma leve perda de fibra foi visível nos protótipos B e C. A versão D manteve intacta a geometria inicial quando submetida ao manuseio.

No sétimo dia, foi notada quase que a deslaminação total das camadas no protótipo A, enquanto que B e C apresentou uma perda das fibras de colágeno com uma deslaminação parcial. O protótipo D manteve a geometria inicial.

Microscopia ótica e ESEM

As observações de microscopia ótica em 12x foram executadas em seções sagitais de 2 mm de cada configuração. As imagens ESEM foram adquiridas em 25 e lOOx.

Figura 4 mostra uma série de imagens de uma microscopia de varredura de elétrons sozinha, se referindo a todos os protótipos da configuração I do esqueleto.

Na Figura 4, a estrutura do colágeno do protótipo A’ mostrou uma porosidade mais propriamente regular (1), mas com um maior alargamento as paredes dos poros pareceram mais denteadas (2). A interface colágenohidroxiapatita gradiente/colágeno 40/60 é aparente (3).

Figura 5 mostra a porosidade da camada de colágeno do protótipo B’, a qual é regular e algum tanto compacta em relação ao protótipo A’. Essa compactação é provavelmente para ser entendida como um artefato devido, numa maior

extensão, à ação de lâmina durante o corte da cartilagem ao invés de ser devida a uma ação do ácido hialurônico na estrutura (1). Com um maior alargamento, a conservação da regularidade do poro é notada, com uma conservação similar da regularidade da superfície das paredes internas (2). Orientações particulares dos poros não são visíveis. Ao contrário, uma maior uniformidade e compactação das estruturas individuais na interface colágeno-HA gradiente/colágeno (3) aparenta ser visível.

Na Figura 6 a observação do protótipo C’ é 10 reportada. O elemento interessante aparecendo das observações do protótipo C’ é a estrutura porosa do colágeno orientado numa direção vertical (1). Estruturas lamelares amplas as quais poderíam promover e orientar a migração e diferenciação numa direção condrocítica das células de origem ou os condrócitos possivelmente carregados no esqueleto (2) são aparentes. Também nesse caso, as interfaces colágeno-gradiente HA/colágeno aparentam estarem bem conectadas (3).

Na Figura 7, a observação da estrutura porosa do colágeno do protótipo D’ é reportada com uma grande ampliação. Da Figura 7, é observada uma maior compactação em relação a todos os outros protótipos (1). A porosidade é de dimensões definitivamente menores do que as estruturas anteriormente analisadas. Também nesse caso a interface entre as duas camadas é muito mais compacta pelo conferência de uma altura reduzida ao esqueleto (2).

A adição de plastificantes ou agentes de ligação cruzada durante o passo preparativo do esqueleto é capaz de conferir uma maior estabilidade à sua estrutura.

O requerimento de estabilidade para um esqueleto baseado em colágeno, o qual pode ser projetado ou não, representa o elemento determinante.

Nesse passo de desenvolvimento, ácido hialurônico com um peso molecular médio, um agente de ligação cruzada pertencendo à família dos bis-epóxidos (éter diglicidílico) e vapores de glutarato ou seus derivados foram usados como agentes capazes de aumentar as propriedades hidrofílicas e plásticas do constructo.

Os resultados preliminares alcançados através de testes de “manuseio” e observações ESEM mostram que a melhor forma para a estabilização do colágeno é obtida pela ligação cruzada com éter 1,4-butanodioldiglicidílico (BDDGE). A seguir, é reportada uma parte experimental relacionada com testes in vivo e in vitro, executados para verificar o comportamento do esqueleto osteocondral da presente invenção.

O objetivo dos experimentos foi checar o comportamento in vivo de uma configuração de esqueleto condral e osteocondral com uma configuração com dois (substituto cartilaginoso) e três gradientes (substituto osteocartilaginoso), respectivamente, submetidos a uma ligação cruzada com BDDGE (éter 1,4-butanodioldiglicidílico) no passo de preparação.

Os modelos de animais selecionados foram:

1) implante num camundongo nu da configuração do esqueleto de três gradientes (esqueleto osteocondral), carregado com células de origem estromal de ovelha (BMSC) derivadas da medula óssea.

2) Implante das duas configurações do esqueleto após lesões cartilaginosas e osteocartilaginosas no côndilo femural de cavalo.

1) Implante do esqueleto carregado com BMSC. O objetivo do presente estudo foi verificar a neoformação óssea e cartilaginosa do esqueleto de três fases ou com uma configuração II (gradiente 1 do colágeno tipo I, proporção de gradiente 2 do colágeno tipo I/hidroxiapatita 70%/30%, proporção de gradiente 3 de colágeno tipo I/hidroxiapatita de 30%/70%) carregada com células de origem estromal de ovelha (BMSC) vindas de uma retirada do sangue medular. O esqueleto foi implantado num local intramuscular (sítio extra-esquelético ou heterotrópico) num camundongo nu imunodeprimido para o propósito de verificar a diferenciação tecidual nos gradientes do esqueleto osteocondral.

1) Diferenciação celular num sentido ósseo no gradiente 3;

2) Diferenciação celular num sentido cartilaginoso no gradiente 1 consistindo somente de colágeno.

3) Implante do esqueleto após uma lesão cartilaginosa e osteocartilaginosa num cavalo.

O objetivo do presente estudo in vivo foi verificar nos animais de No. 2, após uma lesão cartilaginosa e osteocartilaginosa na epífise distal do terceiro metacarpo (machinho) de um cavalo, o comportamento das configurações com 2 e 3 gradientes do esqueleto preparado com um processo de nucleação de nanopartículas de hidroxiapatita nas fibras de colágeno submetidas a um processo de ligação cruzada por BDDGE (éter 1,4-butanodioldiglicidílico). As duas formas do esqueleto foram representadas por: configuração I ou esqueleto de duas fases (2 gradientes) cujo uso tencionado é um esqueleto substituto cartilaginoso para o tratamento de lesões condrais e configuração II do esqueleto de três fases (3 gradientes) cujo uso tencionado é um esqueleto de substituto cartilaginoso para o tratamento de um grau severo ou de lesões osteocondrais profundas.

As seguintes avaliações foram executadas:

1) estabilidade do esqueleto (fixação, permanência na base do implante) através do controle artroscópico depois de três meses;

2) restabelecimento da manta cartilaginosa anteriormente removida, análise radiológica e histológica das biópsias tomadas num intervalo de pelo menos seis meses do implante.

Procedimento Cirúrgico.

Depois de um período de 7 dias de aclimatização e de um tratamento farmacológico pré-operatório,

os 2 animais foram submetidos a um controle radiográfico das juntas para excluir a presença de quaisquer alterações patológicas. Esses cavalos são mantidos sem comida nas doze horas antes da operação.

No momento da cirurgia, os animais foram anestesiados com uma solução composta de 5% de glicose guaiacolglicérica contendo 3 gm de tiopental de sódio. A manutenção da anestesia foi garantida pelo halotano numa mistura de oxigênio.

Depois do posicionamento dos animais em decúbito lateral em ambos os membros anteriores, a circulação foi bloqueada com um esvaziamento vascular do caipo. Em condições estéreis, foi efetuada uma miniartrotomia na face dorsal do machinho em correspondência com a extremidade distal do metacarpal III^o (figura 10), lateralmente e numa posição superior em relação ao tendão do músculo extensor dorsal do dedo. No machinho decúbito, foi efetuada a miniartrotomia mediai ao tendão mencionado.

Pela colocação do machinho dobrado, a parte distal do côndilo lateral (machinho superior) e o côndilo mediai (machinho decúbito) foi exposta (figura 11). Através de um cortador de moagem impulsionado por força própria, um defeito circular da cartilagem articular foi executado, com dimensões de

Λ

1,0 cm até a exposição completa do osso subcondral por uma profundidade de cerca de 5 mm no caso da lesão condral e de 810 mm no caso de lesão osteocondral. Em ambos os casos, foram efetuadas microabrasões (Figura 12). As dimensões de tais lesões asseguram o alojamento dos esqueletos nas suas configurações. Os esqueletos foram colocados nos buracos e mantidos no local por alguns segundos através de pressão digital até ocorrer um inchaço, o qual assegurou sua fixação às paredes das lesões (figura 13).

No final da operação, as suturas das incisões locais foram executadas em níveis da seguinte forma: sutura de local separado da cápsula articular com ácido poliglicólico

No. 0, sutura contínua da fáscia digital com ácido poliglicólico No. 00 e sutura de local separado da derme com náilon No. 0.

O procedimento foi, a seguir, repetido de uma forma idêntica nas porções metacarpais remanescentes depois de ter invertido o decúbito do cavalo. Ao total, para cada animal, 4 miniartrotomias e o implante de 4 esqueletos (dois esqueletos condrais, configuração I, e dois esqueletos osteocondrais, configuração II) foram executados. No final da operação, bandagens semi-rígidas do casco do carpo foram aplicadas. O padrão cirúrgico e de tratamento para ambos os animais estão abaixo reportados.

Na Figura 8 um côndilo esquerdo é reportado:

A. Lesão lateral condral + microabrasões com o posicionamento de dispositivo de 2 gradientes (substituto cartilaginoso, configuração I).

B. Lesão mediai osteocondral + sangramento com o posicionamento de esqueletos de 3 gradientes (substituto osteocartilaginoso, configuração II).

Na Figura 9, um côndilo direito é reportado:

C. Lesão mediai osteocondral + sangramento com o posicionamento de esqueleto de 3 gradientes (substituto osteocartilaginoso).

D. Lesão lateral condral + microabrasões com o posicionamento de um dispositivo de 2 gradientes (substituto cartilaginoso).

No final da operação cirúrgica, os animais foram submetidos a um tratamento farmacológico com antibiótico e com antiinflamatório. Ao despertar, foi permitida a desambulação normal com carga imediata.

Resultados

1) Implante do esqueleto carregado com BMSC

Análise histológica depois de 8 semanas

Os animais foram sacrificados depois de 8 semanas e o local de implante foi precisamente removido e processado para o manchamento com hematoxilina/eosina. As observações ao microscópio apontaram uma neoformação óssea no gradiente com um componente de hidroxiapatita prevalente (gradiente 3), enquanto não foi observada nenhum osso excessivo na porção de colágeno (gradiente 1) tencionado para uma neoformação cartilaginosa (figura 14).

Os dados mostram como a hidroxiapatita pode desempenhar uma função “iniciadora”, a saber, ela é capaz de ativar o processo de diferenciação celular, num sentido ósseo, na camada mais profunda, enquanto nas camadas mais superficiais, a composição de colágeno do esqueleto direciona a diferenciação celular num sentido cartilaginoso.

2) Implante do esqueleto após uma lesão cartilaginosa e osteocartilaginosa num cavalo.

2° aspecto artroscópico

A verificação artroscópica foi executada depois de 3 meses a partir da primeira data de operação. As imagens destacadas, no local de lesão condral e osteocondral de ambos os membros anteriores, uma neoformação do tecido conectivo a qual resultou de uma boa consistência visual, entretanto ela não foi distinguível de um tecido fibroso. Em algumas zonas da superfície de operação, traços de esqueleto foram aparentes. A partir das observações artroscópicas executadas no animal no. 2 em correspondência com a lesão lateral, nenhuma reação de um tipo inflamatório, nem um deslocamento do dispositivo foram aparentes (figura 15).

Avaliações macroscópicas na eutanásia

Os animais foram mortos num intervalo de média de 214 ± 11 dias. Os animais foram sacrificados através de injeção intravenosa de uma solução Tanax, pela administração prévia de anestesia geral.

Para cada animal, ambos os membros foram removidos 20 cm numa porção proximal em relação à junta (machinho) onde as operações cirúrgicas foram executadas.

Ambos os côndilos das juntas foram cuidadosamente expostos pela preservação da superfície de operação nas zonas mediai e lateral. O tecido neoformado nas zonas de implante dos esqueletos foi avaliado macroscopicamente. Nas áreas de implante nas zonas mediais (esqueleto osteocartilaginoso), uma boa neoformação do tecido conjuntivo brilhoso, com cura do tecido até o nível de saúde da cartilagem, foi aparente. Na superfície de cartilagem articular, correspondendo ao implante cartilaginoso (côndilos laterais), a mesma situação do côndilo mediai com uma formação de tecido conjuntivo até o completo rearranjo do buraco foi observada (figura 16).

Na Figura 14, a análise histológica depois de 8 semanas (manchamento com hematoxilina/eosina) é reportada. A presença de tecido fibroso foi encontrada em correspondência com o gradiente 1 do colágeno sozinho. Na parte mais profunda, em correspondência com o gradiente 3 com um componente de hidroxiapatita prevalente, a presença de uma neoformação óssea é notada.

A Figura 15 refere-se a um “2° aspecto” artroscópico.

A Figura 16 se refere ao “2° aspecto” do animal no. 1. O recrescimento do tecido conjuntivo nas lesões laterais condrais A e D e nas lesões mediais osteocondrais B e C.

A Figura 17 se refere à análise histológica com 5 um manchamento de azul de toluidina com diferentes alargamentos do implante condral (animal 1).

As imagens histológicas reportadas (figuras 17 A a H) se referem ao animal No. 1, lesão lateral correspondente ao implante condral.

As zonas de operação foram cuidadosamente removidas, também pela coleta de uma porção de cartilagem saudável ao redor da lesão.

Cada coleta foi dividida em duas partes e o corte no micrótomo foi efetuado a partir do centro para a periferia e foi manchada com azul de toluidina para as observações microscópicas.

As observações microscópicas apontaram uma elevada formação óssea na parte inferior e mais profunda do esqueleto condral. A camada de colágeno da superfície foi colonizada por um tecido fíbrocartilaginoso distinguível do tecido cartilaginoso saudável e a presença de tecido ósseo excedente nele não foi encontrada.

A amostra analisada, de cerca de 1 cm, foi coletada no nível do implante e inclui a área ao redor da cartilagem articular. A amostra foi descalcificada e incluída em

parafina. As seções foram cortadas numa espessura de cerca de 10 pm e manchadas com azul de toluidína.

As fotografias concernem as duas extremidades do implante, a saber, as zonas de interesse na interface cartilagem-implante articular saudáveis.

Ali podem ser notadas as zonas residuais das margens de cartilagem articular num tecido novo formado a partir da aparência aparente das fibrocartilagens.

O implante por si só aparenta ser 10 superficialmente formado com fibrocartilagem e tecido conjuntivo fibroso sem qualquer traço de tecido morfologicamente referível com uma cartilagem articular e profunda de tecido ósseo.

O tecido ósseo neoformado (visível em A e B) 15 aparenta estar bem integrado com o osso ao redor, o tecido cartilaginoso apresenta uma linha de demarcação aparente (seta) a qual marca a passagem da cartilagem articular pré-existente com a fibrocartilagem neoformada.

1/4

Claims (14)

REIVINDICAÇÕES

1/14

FIG 2

FIG 1

1. Estrutura de múltiplas camadas incluindo:

- uma primeira camada superior (2) que consiste em uma matriz orgânica consistindo em colágeno; e

- uma ou mais camadas inferiores (3, 4, ..., 10) que consistem em uma matriz composta incluindo hidroxiapatita e colágeno, caracterizada pelo fato de que a referida camada superior (2) está em contato direto com a primeira camada inferior (3) e em que a referida primeira camada inferior (3) consiste em uma matriz composta incluindo colágeno numa quantidade de peso entre 95 e 75% e hidroxiapatita numa quantidade em peso entre 5 e 25%, e em que a estrutura de multicamada é ligada de forma cruzada com um agente de ligação cruzada.

2/14

2/4 superior (2), composta por 100% do colágeno, para a primeira camada inferior (3), na qual existe uma quantidade de colágeno de 90 a 70% até a última camada inferior (10) ser alcançada, na qual a quantidade de colágeno é menor do que 10%.

2. Estrutura de camadas múltiplas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma segunda camada inferior (4) consistindo em uma matriz composta incluindo colágeno numa quantidade em peso entre 75 e 45% e de hidroxiapatita numa quantidade em peso entre 25 e 55%.

3/14

E.-l·

3/4

3. Estrutura de camadas múltiplas, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma terceira camada inferior (5) que consiste em uma matriz composta incluindo colágeno numa quantidade em peso entre 45 e 25% e hidroxiapatita numa quantidade entre 55 e 75%.

4/14

Ε

4/4 etapa de nucleação ocorre com um pH entre 9 e 12 a uma temperatura entre 25 a 45°C e então é sujeitado a uma etapa de secagem a frio ou liofilização.

18. Substituto, de acordo com uma ou mais das reivindicações 9-14, caracterizado pelo fato de que a estrutura de camadas múltiplas é ligada de forma cruzada com BDDGE ou um derivado seu.

19. Substituto, de acordo com uma ou mais das reivindicações 12-17, caracterizado pelo fato de que a estrutura de camadas múltiplas é ligada de forma cruzada com glutaraldeído ou um derivado seu ou com um ligante cruzado selecionado dentre bis-epóxidos (éter diglicidílico).

20. Substituto, de acordo com uma ou mais das reivindicações 12-20, caracterizado pelo fato de estar na forma liofilizada ou seca. 21. Substituto, de acordo com uma ou mais das

reivindicações 12-20, caracterizado pelo fato de estar na forma esterilizada

Petição 870180017769, de 05/03/2018, pág. 9/13 (,-lf

4. Estrutura de camadas múltiplas, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a última camada inferior (10) consiste em uma matriz composta incluindo colágeno em uma quantidade em peso menor do que 5% e de hidroxiapatita numa quantidade em peso para fornecer 100%.

5/14

5/

FIG

5. Estrutura de camadas múltiplas, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes 1 a 4, caracterizada pelo fato de que um gradiente de colágeno está presente se estendendo a partir da camada

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6/14

6. Estrutura de camadas múltiplas, de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a referida hidroxiapatita na referida matriz composta é diretamente nucleada nas fibras de colágeno.

7/14

7. Estrutura de camadas múltiplas, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o colágeno é selecionado de: colágeno do tipo I, do tipo II, do tipo IV ou misturas suas.

8/14

8. Estrutura de camadas múltiplas, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a estrutura de camadas múltiplas é ligada de forma cruzada com ácido hialurônico ou um sal seu ou um derivado seu.

9/14

FIG 12 FIG 13

9. Estrutura de camadas múltiplas, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a estrutura de camadas múltiplas é ligada de forma cruzada com BDDGE ou um derivado seu.

10/14

10. Estrutura de camadas múltiplas, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a estrutura de camadas múltiplas é ligada de forma cruzada com glutaraldeído ou um derivado seu ou com um ligante cruzado selecionado dentre bis-epóxidos (éter diglicidílico).

11/14

FIG 15

11. Substituto cartilaginoso, caracterizado pelo fato de incluir uma estrutura de múltiplas camadas definida de acordo com uma ou mais das reivindicações 1-10.

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12. Substituto osteocondral, caracterizado pelo fato de incluir uma estrutura de múltiplas camadas definida de acordo com uma ou mais das reivindicações 1-10.

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FIG 17c FIG 17d

13. Substituto, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que a estrutura de camadas múltiplas representa um esqueleto para a ligação in situ e para a diferenciação das células mesenquimais.

14. Substituto, de acordo com a reivindicação 1 ou 11, caracterizado pelo fato de que a estrutura de camadas múltiplas é carregada ex vivo com um concentrado do sangue medular ou com um concentrado plaquetário (PRP) ou com fatores de crescimento ou fatores capazes de promover o trofismo e a diferenciação celular, tais como TGF, EGF, BMP e outros fatores.

15. Substituto, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que a estrutura de camadas múltiplas é carregada ex vivo com células mesenquimais as quais não são diferenciadas ou mantidas em cultura por um período de tempo requerido para a multiplicação e/ou a diferenciação em células de origem dos osteoblastos e condrócitos.

16. Substituto, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que a estrutura de camadas múltiplas é carregada com substâncias farmacologicamente ativas selecionadas de: corticosteróides antiinflamatórios, FANS, imunossupressores, antibióticos, antiblásticos, antiproliferativos e antivirais.

17. Processo para a preparação de uma estrutura de camadas múltiplas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizado pelo fato de incluir pelo menos um passo no qual uma primeira camada superior (2) que consiste em uma matriz orgânica incluindo colágeno está associada com pelo menos uma camada inferior (3, 4, ..., 10) que consiste em uma matriz composta incluindo hidroxiapatita e colágeno, em que uma

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