BRPI0404635B1

BRPI0404635B1 - processo para a obtenção de esteróides seco derivados do ergostano

Info

Publication number: BRPI0404635B1
Application number: BRPI0404635A
Authority: BR
Inventors: Therezinha Coelho Barbosa Tomassini; Ivone Maria Ribeiro; Ana Cláudia Fernandes Amaral; Milena Botelho Pereira Soares; Ricardo Ribeiro Dos Santos
Original assignee: Fundação Oswaldo Cruz
Priority date: 2004-10-25
Filing date: 2004-10-25
Publication date: 2019-01-15
Also published as: BRPI0404635B8; WO2006045171A2; WO2006045171A3; BRPI0404635A

Abstract

"processo para a obtenção de esteróides seco derivados do ergostano". a presente invenção refere-se a um processo de obtenção de esteróides seco derivados do ergostano, como as fisalinas, compreendendo as etapas de: (a) moagem de partes secas de planta(s) da família solanaceae; (b) tratamento das ditas partes de planta(s) da etapa (a) com solução salina de cloreto de sódio (tampão fisiológico) por um período de tempo apropriado; (c) filtração do soluto proveniente da etapa (b) e, então, particioná-lo em diclorometano ou solvente imiscível em água, como clorofórmio ou acetato de etila; (d) lavagem da fase orgânica resultante da etapa (c) com água destilada e posterior filtração em sulfato de magnésio anidro ou qualquer outro secante insolúvel em água; (e) evaporação da solução resultante da etapa (d) , fornecendo uma fração enriquecida em esteróides seco derivados do ergostano; (f) separação dos esteróides seco derivados do ergostano por cromatografia líquida de média pressão (mplc) e subseqüente caracterização espectroscópia.

Description

PROCESSO PARA A OBTENÇÃO DE ESTERÓIDES SECODERIVADOS DO ERGOSTANO

A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de esteróides seco-derivados do ergostano, como as 5 fisalinas, no qual há a extração de tais esteróides a partir de planta(s) seca(s) e molda(s) da família

Solanaceae, a exemplo de espécies do gênero Physalis, e a separação dos esteróides mencionados anteriormente através

do emprego da técnica de Cromatografia líquida de Média

Pressão (MPLC).

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Os vitaesteróides são esteróides derivados do ergostano e foram isolados, principalmente, de plantas da família Solanaceae, e mais especificamente, dos gêneros

Physalis, Withania,

Duralia,

Datura, Jaborosa,

Deprea e

Nicandria. O uso popular dessas plantas é difundido mundialmente. Seus extratos, por exemplo, são usados no tratamento da asma, disfunções hepáticas, diferentes

processos inflamatórios, câncer até mesmo como droga hipnótica.

Vitajardin A,

B, C e e seus derivados são vitanolídeos isolados do caule das folhas de Deprea orinocensis e apresentam atividade como imuno-moduladores do sistema imune (Patente

As fisalinas do guimiotipo III são seco-ergostanos derivados abertos em possuindo a posição funcionalizada por uma hidroxila ou em ponte oxiranica em

C28. Elas são constituintes do tipo esteróidal presentes nas espécies de

Physalis compreendendo, dentre as mais estudadas: P. angulata, P.

alkekengi var francheti minima, P. peruviana, P.

P. ixocarpa,

P.

phyladelphia, P. pubescens and P.

viscosa.

Como resultado de suas estruturas polioxifuncionais, como o grupo mais termos do nível de as fisalinas podem avançado, dentre os oxidação biogenética.

ser classificadas vitaesteróides, em

As fisalinas estão normalmente presentes na raiz e nas partes aéreas de Physalis angulata L. em uma proporção que varia de 30 a 500 ppm. Essa planta, a qual pertence à família Solanaceae, é cosmopolita tropical e ocorre no Brasil desde o Pará até o Rio de Janeiro (Braga,R., Plantas do Nordeste, especialmente do Ceará, Mossoró, Brasil·, ESAM,

540, 1976). Neste país, é popularmente conhecida como BateTesta, Bucho de Rã, Mata-Fome, Juá ou Juá de Capote e, mais freqüentemente, Camapú (Pio Corrêa, Dicionário das Plantas úteis do Brasil e das exóticas cultivadas, Rio de Janeiro, Min. da Agricultura, Vol. I, pp. 10,1962).

É relatado na literatura o uso de extratos brutos de

Physalis spp. por tribos indígenas. Segundo Sanchez et al (Sanchez,E.G., Silva, M.T.G., Ribeiro,I.M.,

Tomassini,T.C.B. , Evolutions of the antibacterial activity of Physalis angulata L., in Abstracts of the l^st Congress of Pharmaceuticals Sciences, Ribeirão Preto, S. Paulo, Brasil, - Index. Bolletino Chimico Farmacêutico, Vol. 136, pp. 154, 1997), extratos e constituintes isolados de Physalis apresentam atividade biológica, incluindo a ação anti-bacteriana de extratos de raiz, caule e folha de P. angulata L.

Chiang et al (Chiang, H.C., Jaw, S.M., Chen, C.F. e

Kan, W.S.

Anticancer Research 12, 837

1992.)

que as fisalinas D e F extraídas de Physalis spp. têm apresentado atividade em testes laboratoriais, in vitro e in vivo, contra diversos tipos de tumores humanos, a 5 saber: hepatoma, cérvix uterino, pulmão e células do cólon.

documento de patente BRPI9904363-7 apresenta composições medicamentosas com atividade imuno-moduladora, sendo os princípios ativos representados por extratos de Physalis spp ou por fisalinas obtidas a partir desses

documento de patente BRPI 9904635 também descreve um outro tipo de atividade para as fisalinas, ou seja, a atividade anti-protozoa. Paralelamente, apresenta um processo de isolamento de fisalinas a partir de plantas da 15 família Solanaceae (a exemplo do gênero Physalis), caracterizado por conter as seguintes etapas: (a) moagem das raízes, folhas ou caules de Physalis spp.; (b) extração das ditas raízes, folhas ou caules da etapa (a) com um

solvente alcoólico selecionado do grupo consistindo de metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol, iso-butanol, secbutanol, entre outros, a frio ou a quente, por período de tempo apropriado; (c)evaporação do extrato orgânico da etapa (b) e lavagem do material xaroposo com um solvente orgânico não polar selecionado do grupo consistindo de 25 clorofórmio, diclorometano, dicloroetano, éter dietila, tolueno ou similar; (d) purificação do extrato submetido à lavagem da etapa (c) por filtração rápida em um adsorvente de sílica gel H, seguido de um gradiente de polaridade com solventes orgânicos; e separação dos seco-esteróides pelo

uso de cromatografia.

Contudo, o processo descrito no documento de patente mencionado anteriormente (BRPI9904635) apresenta a desvantagem da extração não ser realizada em uma única etapa e, portanto, a mistura de fisalinas apenas é obtida após extração com um solvente alcoólico, evaporação e lavagem com um solvente orgânico não polar e, após etapas de purificação e filtração, submissão a um gradiente de polaridade com solventes orgânicos.

φ 10

Também é importante mencionar as desvantagens da conhecida Técnica Mabry (Mabry et al.

The structure of

Psilocostachyin, a new sesquieterpene dilactone from

Ambrosia Psilostachya.

Tetrahedron, 22, 1139-1146, 1966), a qual usa taninos, referido acetato de clorofilas e sal orgânico chumbo para possível retirada moléculas aromáticas em geral.

de é tóxico e insolúvel em água temperatura ambiente. Além disso, é de difícil remoção do meio, exigindo, assim, elevação da temperatura, o que pode ocasionar modificações estruturais. Adicionalmente, a presente técnica usa carvão ativado para filtração.

Este carvão ativado também é adsorvente. Tal técnica

Mabry original também emprega celite, o que onera e baixa, desta forma, o rendimento; uma vez que há números de etapas maiores que os processos usuais e, com isto, eleva o custo operacional.

As outras técnicas usuais são caracterizadas pelo preparo de extratos alcoólicos (etanol ou metanol), seguido de sucessivas cromatografias em colunas abertas, o que apresenta as seguintes desvantagens: (a) emprego de grandes

volumes de solventes; (b) tempo de eluição alto e número elevado de frações.

Um exemplo clássico foi demonstrado por Matsuura T. et al (Matsuura T.; et al; The Struture of Physalins F. and J 5 from Physalis angulata and P.lancefolia, Phytochemistry, vol.17, 1647-1650, 1978), onde, na extração da fisalina F, são colhidas 86 frações de 500ml cada (correspondendo a 430 litros de solvente), seguido de evaporação; o que, por consequência, vai diminuindo o rendimento pelo elevado 10 número de frações a evaporar e repurificar.

Também é relevante citar o trabalho do pesquisador

Kawai M. et al (Kawai M. et al; Physalin L isolated from P minimia, Phytochemistry, vol 43, n°3, 661-663, 1996), o qual aponta a possibilidade de surgirem artefatos 15 (substância que não é a mesma elaborada inicialmente pela planta), através da longa exposição do material botânico com adsorventes e solventes polares.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

O objetivo da presente invenção é a obtenção de esteróides seco-derivados do ergostano, como as fisalinas, através de um processo que possua elevado rendimento, que não empregue substâncias tóxicas, que seja rápido e que tenha um baixo custo operacional.

Uma concretização da presente invenção se relaciona a um processo de obtenção de seco-esteróides derivados do ergostano, a exemplo das fisalinas, compreendendo as etapas de:

(a) moagem de partes secas de planta(s) da família

Solanaceae;

(a) com solução salina de cloreto de sódio (tampão (b) (c) (d) (e) fisiológico) por um período de tempo apropriado;

filtração do soluto proveniente da etapa (b) e, então, particioná-lo em diclorometano ou solvente imiscivel em água, como clorofórmio ou acetato de etila;

lavagem da fase orgânica resultante da com água destilada e posterior filtração de magnésio anidro ou qualquer insolúvel em água;

evaporação da solução resultante fornecendo uma fração enriquecida seco-derivados do ergostano;

separação dos esteróides ergostano por cromatografia pressão (MPLC) em sulfato outro secante da etapa (d), em esteróides seco-derivados do líquida de média e subseqüente caracterização espectroscópia.

BREVE

Figura

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

1: Apresenta um gráfico comparativo entre os rendimentos de fisalinas obtidas a partir de Physalis angulata patente presente

Figura 2:

L. através da Técnica Mabry modificada (pedido

BRPI 9904363-7) e do processo apresentado invenção.

Corresponde ao espectro de Infravermelho de na da fisalina B.

Figura 3: Apresenta o espectro de Infravermelho da fisalina

D.

Figura 4: Corresponde ao espectro de Infravermelho da fisalina F.

Figura 5: Apresenta o espectro de Infravermelho da

,.γΥ Yá,..

', íhjò:. P « Y fisalina

G.

Figura 6: Corresponde ao espectro de Ultra Violeta da fisalina B.

Figura 7: Apresenta o espectro de Ultra Violeta da fisalina

D.

	Figura	10:	Corresponde	ao espectro	de massas	da fisalina	B.
	Figura	11:	Apresenta o	espectro de	massas da	fisalina D.
	Figura	12:	Corresponde	ao espectro	de massas	da fisalina	F.
15	Figura	13:	Apresenta o	espectro de	massas da	fisalina G.
	Figura	14:	Corresponde	ao espectro	RMN	de ¹³C	da fisalina	B.
	Figura	15:	Apresenta o	espectro RMN	1 de	¹³C da	fisalina D.
	Figura	16:	Corresponde	ao espectro	RMN	de ¹³C	da fisalina	F.
	Figura	17:	Apresenta o	espectro RMN	i de	¹³C da	fisalina G.
2 0	Figura	18:	Corresponde	ao espectro	RMN	de te	da fisalina	B.
-	Figura	19:	Apresenta o	espectro RMN	de	te da	fisalina D.
	Figura	20:	Corresponde	ao espectro	RMN	de te	da fisalina	F.
	Figura	21:	Apresenta o	espectro RMN	de	te da	fisalina G.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

As fisalinas são esteróides do grupo seco-ergostanos derivados, abertos em C13-C14 e ciclizados em C16-C24 possuindo as seguintes características: a) 2 lactonas, γ e δ, nas posições C13-C20 e C22-C24; b) uma cetona α, β insaturada na anel A; c) um anel etéreo entre os carbonos e 17;

hidroxil o 'ia

-A ’

d) uma cetona na posição C15; e) um grupamento <

/* em C13 e f) opcionalmente, uma entre os carbonos C14-C27. A principal característica desses seco-esteróides é a presença do esqueleto vitaesteroide tendo a posição C13-C14 aberta e a C16-C24 ciclizada (Glotter, E.,Withanolides and related ergostane type steroids, Nat. Prod. Rep., 8, 415, 1994).

quais são divididas em quimiotipos: a) quimiotipo

D 10 representado pelas fisalinas A e C, b) quimiotipo II pelas fisalinas L,

O, c) quimiotipo III composto pelas fisalinas B,

D, E, F, H,

I, J e N, d) quimiotipo IV

VI

S, fisalina P, quimiotipo V

g) quimiotipo fisalinas K e Q,

VII representado

f) quimiotipo pela fisalina e h) quimiotipo VIII pela fisalina R. As fisalinas A,

Q correspondem às matrizes dos esqueletos que levam biosintese fisalina B fisalinas.

de outras substâncias relacionadas, sendo a precursora biogenética da maioria das demais

A seguir, apresenta-se as estruturas das fisalinas mencionadas anteriormente:

fisalina A

fisalina C fisalina B

fisalina D

fisalina E

fisalina G

fisalina J

fisalina K

fisalina Μ fisalina N

físalina Ο fisalina P

fisalina Ο

físalina R

fisalina S

fisalina T

Na presente invenção é descrito um novo processo obtenção de seco-esteróides derivados do ergostano (exemplo:fisalinas) , no qual há a extração de tais

esteróides a partir de plantas

Solanaceae, a exemplo de separação dos esteróides emprego da técnica de

Pressão (MPLC).

secas e moidas da família espécies do gênero Physalis, e a obtidos anteriormente através do

Cromatografia liquida de Média processo de obtenção de esteróides seco-derivados do ergostano, o qual é apresentado na presente invenção, quando comparado com aqueles tradicionalmente empregados para a obtenção dos seco-derivados esteroidais mencionados, apresenta diversas vantagens, a saber:

migração dos constituintes da planta efetuada em solução salina, cujo soluto contém a fração enriquecida em fisalinas. A fração enriquecida em fisalinas no soluto acima é tratada com solvente orgânico: diclorometano (podendo, também, ser utilizado o clorofórmio

ou o acetato de etila), ou solventes insolúveis em água.

- a extração procede numa única etapa com cloreto de sódio a 0,9%. A etapa seguinte é partição, pois as fisalinas já estão extraídas no soluto obtido com o tampão fisiológico.

- Elevado rendimento (as fisalinas isoladas estão em valores de 2 a 3 vezes superiores àqueles observados com outros processos utilizados para tal fim: (Row,L.R.,

Reddy,K.S., Sarma, N.S., Matsuura,T., Nakashima, R., New Physalins from Physalis angulata and Physalis lanei folia, strueture and reactions of Physalins D, I,

G and K.

Phytochemistry, vol 19, 1175-1181, 1980; Vasina,O.E

Withaesteroids of Physalis VII Vamonolide , Khim.

Soed., n° 6, 856-858,1987; Kawai, M. Yamamoto, T., Makino,

B. Yamamura, H. Araki, S., Butsugan, Y., Saito, K., The 5 structure of Physalin T from Physalis alkekengi Var francheti, JNPR, vol 3,199-205, 2001).

- Não emprega substâncias tóxicas;

- Rapidez na execução (6 a 8 horas de trabalho) da extração. Para efeito de comparação, é possível mencionar o

trabalho de Chiang et al (Chiang, H.C, Jaw, S.M., Chen,

C.F, Kan, W.S., Antitumor agent ,Physalin F from Physalis angulata L., Anticancer Research , vol 12, 837-844, 1992), no qual, visando isolar a fisalina F, a extração leva uma semana para cada solvente; totalizando, no final, o período 15 de três semanas para o processo extrativo e, assim, contrastando claramente com a o tempo da presente invenção (6 á 8 horas). Outro trabalho que pode ser observado para comparação é o de Row et al (Row, L. R. , Sarma, N.S.,

Matsura, T. Nakashima,R., Physalins E and H, NEW Physalins from Physalis angulata and P. lancifolia, Phytochemistry, vol 17, 1641-1645, 1978);

- Tem um baixo custo operacional (por exemplo, pelo uso da substância química cloreto de sódio, cujo preço unitário é menor do que as substâncias empregadas em 25 outros processos utilizados com esta mesma finalidade).

Esta afirmativa pode ser comprovada através da observação dos seguintes trabalhos: (Kawai, M., Ogura, T. Marino, B. MATSUMOTO,^a, Yamamura, H. Butsugan, Y., Hayashi,

M., Physalins N and from Physalis alkekengi Phytochemistry

-vjfr'’14 vol 31

- Z3 > _; g n° 12, 4299-4302, 1992; Mulchandani, N.B., Benjamin^A Y

B.D. ,

Isolation of Physalins D, a 13,14 seco -16,24, cyclo steroid f rom tissue cultures of Physalis minima,

Medica,

Short

Planta trabalhos utilizam,

Comminications, para extração, como: clorofórmio, etanol, metano,

88-89, 1978). Tais solventes orgânicos etanol, acetato de etila, que são bem mais caros que a solução tampão de cloreto de sódio.

Para a concretização da presente invenção, partes de planta(s) da família Solanaceae podem ser coletadas com o objetivo de obter esteróides seco-derivados do ergostano, a exemplo de raízes e/ou caules e/ou folhas e/ou cápsula do fruto de espécies do gênero Physalis no intuito de obter as fisalinas.

Na presente da família

Solanaceae, a exemplo de raízes e/ou caules e/ou folhas, são secas, cortadas em pequenos pedaços e moídas.

Posteriormente, é realizada a migração das fisalinas para solução salina de cloreto de sódio (tampão fisiológico) por um período de tempo apropriado.

Também na presente invenção, a concentração da solução salina de cloreto de sódio (ou soro fisiológico) é 0,9% (p/v).

O tampão fisiológico está na faixa de pH de 7,2 a

7,4. A migração dos constituintes na solução salina pode ser feita com tampão à quente, com a temperatura variando entre 36°C e 38°C, durante 6 a 8 horas sob agitação.

A próxima etapa consiste em filtrar o soluto proveniente da etapa anterior, isto é da extração, e particioná-lo em diclorometano, ou clorofórmio, ou acetato , Λ .·. V·. _ * A efetuada com a solução tampão. A fase orgânica lavada com água destilada e seca em sulfato de magnésio anidro (ou outro qualquer secante insolúvel solução resultante é evaporada, fornecendo uma mistura de esteróides seco-derivados do ergostano, a qual cromatografada por

MPLC.

Na presente invenção, a partição mencionada anteriormente pode ser realizada com diclorometano, como também com clorofórmio ou acetato de etila. Atenção não se trata de faixa percentual do solvente mais sim ser somente ele o particionante, isto é, 100% de diclorometano, por exemplo.

Na presente invenção, a etapa de separação dos esteróides seco-derivados do ergostano pela cromatografia liquida de média pressão (MPLC) pode ser feita em aparelhos destinados para tal finalidade.

Em uma concretização preferida da presente invenção, raizes e/ou caules e/ou folhas e/ou cápsula do fruto de Physalis angulata L., os quais estão secos, moidos, são tratados com solução salina de cloreto de sódio a 0,9% (tampão fisiológico com pH na faixa 7,2 -7,4). O produto resultante desta extração já é a fração enriquecida em fisalinas, que é então, na etapa seguinte, particionada com diclorometano, ou clorofórmio, ou éter ou acetato de etila. Esta fração enriquecida em fisalinas é, então cromatografada por MPLC, sendo seus eluatos identificados por espectroscopia.

Ainda nesta concretização preferida da presente invenção, a etapa de MPLC é realizada em um aparelhoAç/S ' ’ destinado para tal finalidade, o qual emprega, como adsorvente, sílica. Tal adsorvente é previamente tratado, mediante lavagem com metanol, para sua ativação (reativado em estufa).

Suspende-se então o adsorvente (sílica) na mistura de colocado na solventes hexano/acetato de etila, que é coluna acondicionada sob pressão e tempo necessários para a realização da separação da mistura das fisalinas.

Também nesta concretizacão preferida da presente invenção, o processo de eluição da coluna é feito com um sistema gradiente de hexano / acetato de etila.

Os esteróides seco-derivados do ergostano obtidos de acordo com o processo descrito na presente invenção, por exemplo as fisalinas, podem ser caracterizadas por dados fisico-quimicos usando não mais que experimentação de rotina, tal como a espectroscopia.

Os seguintes exemplos são ilustrativos da invenção e representam, concretizações preferidas. É necessário frisar que a invenção não está limitada a esses exemplos, mas que também inclui variações e modificações dentro dos limites nos quais ela funciona.

EXEMPLO 1: Etapa de extração das fisalinas a partir de Physalis angulata L.

A planta seca e moida foi submetida à extração com solução de soro fisiológico (0,9%) à quente com temperatura de, aproximadamente, 36°C - 38°C por 6-8 horas, sob agitação. Após aquele tempo, o soluto foi filtrado e particionado em 100% de dicloromentano e a fase orgânica,

í depois de ter sido lavada com água destilada, foi seca^p sulfato de magnésio anidro. A solução de dicloromentano foi evaporada fornecendo a fração enriquecida em fisalinas.

EXEMPLO 2: Etapa de separação das fisalinas obtidas a partir de Physalis angulata L. - Preparação do adsorvente e da amostra:

Cerca de 1

Kg de silica

Lichroprep

Si 60 foi previamente lavada com metanol e ativada por horas, em estufa, a

100°C.

Esse material foi suspenso em solução (70:30v/v') de hexano/acetato de etila e utilizado para preenchimento da coluna cromatográfica, a qual foi acondicionada, sobre pressão de 20 bar (Condições operacionais da bar), durante

O preparo bomba: Fluxo:

minutos.

da pastilha

18ml/minuto, Pressão limite:

com a fração enriquecida (mistura de fisalinas obtidas conforme o exemplo anterior) empregando-se gel de silica na proporção de 5% referente ao peso da amostra ser adsorvida (p/p').

EXEMPLO 3: Etapa de separação das fisalinas obtidas partir de Physalis angulata L. - Processo Cromatográfico:

O processo por MPLC foi efetuado num total de quatro análises reprodutivas, empregando-se amostras que entre 2,9g e 15,Og das frações enriquecidas, variaram as quais continham as fisalinas provenientes do caule de

Physalis angulata L.

O aparelho fluxo programável de MPLC utilizado era da marca BÜCHI, com na faixa de 16 até 160 ml/minuto de acordo tipo e dimensões da coluna cromatográfica escolhida. Este aparelho é constituído de uma Bomba de fluxo binário

A' ,-.V <*' (linhêfc/V^g -bA e B) modelo 688, um Coletor de frações modelo 684, um Sistema gerador de gradiente modelo 687, uma Coluna de borosilicato 3.3 (4 6cm x 10 cm) modelo 685 e Tubos de recolhimento com capacidade de 50ml.

O processo de eluição da coluna foi iniciado com (70:30 v/v') de hexano/acetato de etila, em sistema binário, aumentado progressivamente o solvente mais polar em 5% com intervalos maiores, na faixa critica de 40% a 60% 10 da programação.

Foram coletadas frações de 50 ml que forneceram l,2g de quatro substâncias puras química e espectroscopicamente identificadas como fisalinas B, D, F e G (a partir de 2,9g da fração enriquecida) por exemplo. Quando se trabalhou com

15,Og da fração enriquecida, o total obtido em fisalinas foi de 7,7g. Estes resultados são apresentados na Tabela 1. Tabela 1: Isolamento de Fisalinas através do processo da presente invenção.

Fisalinas Isoladas	2,9g fração enriquecida	15,Og fração enriquecida
Massa (g)	O, O	Massa (g)	o o
B	0,218	7,5	1,030	7,0
D	0, 416	14,3	2,756	18,3
F	0, 378	13,0	1,794	11,9
G	0,182	6,3	2,112	18,8

É importante comentar que a identificação foi

realizada inicialmente por CCD (Cromatografia

Delgada), usando o material de referência B, D, F e G puras, e confirmados por resultados da literatura correspondentes ao ponto de fusão, infravermelho, ultravioleta, Massas e

Ressonância Magnética Nuclear de e ¹³C. As figuras 2 à 21 correspondem aos respectivos espectros.

Os dados de Infravermelho são:

Aparelho: Nexus 670/ FT- IR - Thermo Nicolet

Fisalinas: v KBR cm^-1φ 10 B - 3430 OH's

-1780 γ lactona; 1763 cetona saturada

-1721 δ lactona; 1656 cetona α β insaturada

D -3470 OH's

-1763superposição δ lactona e cetona saturada;

15		-1733 γ lactona; 1666	cetona	α β	insaturada
	F	-3502 3460 OH's
		-1780 γ lactona; 1762	cetona	saturada
		-1739 δ lactona; 1670	cetona	α β	insaturada
	G	-3554,3419 OH's
20		-1780 γ lactona; 1769	cetona	saturada
•		-1739 δ lactona; 1655	cetona	α β	insaturada

- 1620 insaturaçâo C=C

Os dados de Ultravioleta são:

Aparelho: Hitachi U.2000

Concentração: 0,01mg/ ml

Fisalinas	λ maxi	Absorbância
B	226,5nm	1,717
D	224,5nm	1,044
F	226,Onm	0, 907
G	312,Onm	0,592

Os dados de

Espectrometria de Massas são:

Aparelho:

LC mass/mass - Waters

Fisalina

B:

20mg/ml em metanol (conc).

Injeção : 10μ1 m/z 510 (M+)

Fisalina

D: 40mg/ml em metanol

Inj eção:

25μ1 m/z 544 (M+)

Fisalina

F: 20mg/ml em metanol • 10

Inj eção:

10μ1

M/z 526 (M+)

Fisalina

G: 20mg/ml em metanol (conc)

Injeção:

10μ1

M/z 526 (M+)

Os dados espectrais ¹³C

RMN são:

Dados espectrais ¹³C RMN com deslocamento químico (δ/ppm) das fisalinas B, D, F e G em DMSO-dg. As absorções intensas na região 39ppm são do solvente Aparelho. Bruker 100MHz

Fisalinas	B	D	F	G
# carbono	δ/ppm	δ/ppm	δ/ppm	δ/ppm

C	1	202,3	204,3	204,2	204,70
C	2	126, 8	127,1	127,1	157,85
C	3	146, 0	142,8	142,7	139,80
C	4	32,1	35,1	35,7	125,60
C	5	135, 4	76, 3	61, 0	116,40
C	6	123, 2	72,4	73, 0	71, 50
C	7	24,2	26, 5	24,3	24,30
C	8	40,0	38,2	40,0	40,30
C	9	33, 0	29, 8	35, 1	34,10
C	10	51, 8	53, 4	53, 9	53, 60
C	11	24,0	24,6	24,6	24,30
C	12	25, 5	25,7	26, 0	25, 00
C	13	78,0	78,5	76, 9	78,00
C	14	106,2	106, 8	106, 7	106,20

(Cont.)

Fisalinas	B	D	F	G
# carbono	δ/ppm	δ/ppm	δ/ppm	δ/ppm

C 15	209,2	209, 8	209,7	209,40
C 16	54,0	53,9	54,4	53, 60
C 17	80,6	80,6	81,1	80, 60
C 18	171, 6	171, 7	171,1	171,50
C 19	16,7	13,2	13, 1	18,10
C 20	80,2	80,6	80,1	80,30
C 21	21, 6	21,5	21, 5	21,50
C 22	76,2	76,3	76, 3	76, 10
C 23	31,2	31,2	31,2	31,16
C 24	30,4	30,4	30,4	30,80
C 25	40,2	49,3	49,3	49, 10
C 26	167,1	167,2	167,2	167,10
C 27	60,5	60,4	60,4	60,60
C 28	24,0	24,6	24,0	24,30

Espectro de ¹³C é inédito- submetido à publicação pelo grupo Farmanguinhos- PN₂ e Central Analítica.

Dados espectrais ‘H RMN com deslocamento químico (δ/ppm) , 5 tipos de sinais das fisalinas B, D, F e G em DMSO-d₆. As absorções intensas na região 39ppm são do solvente. Aparelho Bruker 400MHz.

Fisalinas	B	D	F	G
# Prótons	ô/ppm/sinal	δ/ppm/sinal	ô/ppm/sinal	δ/ppm/sinal

H	2	5,82/dd	5,71/dd	5,70/dd	5,93/dd
H	3	6,91/ddd	6,62/ddd	6,62/ddd	7,02/ddd
H	4	2,95/m		1,80/d 3,13/dd	6,16/dd
H	5	-	4,25(OH)/S	-	-
H	6	5,56/m	3,59/d 4,60(OH)/d	3,11/d	6,40(OH)/s
H	7	1,90/m		1,74/d 2,18/dt	5,11/d
H	8	1,80/m	2,20/dt	1,95/td	2,88/dd
H	9	2,96/m	-	2,90/d	2,51/m

(Cont.)

Fisalinas	B	D	F	G
# Prótons	δ/ppm/sinal	ô/ppm/sinal	δ/ppm/sinal	δ/ppm/sinal

H 11	2,20/m 1,12/m	1,22/m	1,95/m 0,92/m
H 12	2,17/m 1,54/m	1,80/dd 2,13/m	2,10/m 1,45/m
H 13	6,34(OH)/ S	5,77/S	5,7 6(OH)/s	2,54(OH)/s
H 16	2,82/S	2,79/S	-	-
H 19	1, 08(Me)/ S	1,15(Me)/S	1,23(Me)/s	1,16(Me)/s
H 21	l,80(Me)/ S	1,98(Me)/S	1,84(Me)/s	1,21(Me)/s
H 22	4,36/dd	4,56/m	4,25/m	4,25/dd
H 23	2,15/m 1,81/Sd	1,98/dd 2,10/dd	1,99/m
H 25	2,8 6/dbr	2,90/d	2,88/s	-
H 26	—	4,01/m 3,55/ds	*“	3,58/d 4,48/dd
H 27	3,55/dd 4,25/dd	3,59/d 4,23/dd	3,59/brd	—
H 28	1,20(Me)/S	1,20(Me)/S	1,19(Me)/s	1,71(Me)/s

Referências Bibliográficas

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MakinoB., Kawai M. , Kito K. , Yamamura H., Butsugan Y., New

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Physalis alkekengi var. francheti

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Fisalina D

Kawai M., Yamamoto T., Makino B., Yamamura H., Araki S.,

Butsugan Y., Saito K. , The Structure of Physalin T from

Physalis alkekengi var. francheti, JANPR, 3, 199-205, 2001.

Fisalina F

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Χ^άι!Ρ·

T

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Fisalina G

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Lanei folia. Structure and Reactions af Physalins and K., Phytochemistry, 19, 1175-81, 1980.

Exemplo 4: Etapa de separação das fisalinas obtidas

D, I, G a partir de Physalis angulata L. - Reaproveitamento do adsorvente:

Com intuito de viabilizar economicamente o processo cromatográfico, o adsorvente (Sílica Lichroprep Si 60, partícula 40- 63pm, Marca Merck, código 113905) foi recondicionado e testado quanto à eficiência.

O procedimento operacional adotado consistiu na lavagem da coluna com metanol, por duas horas, sob pressão da bomba idêntica àquela descrita nas condições iniciais, após aquele período de tempo, o adsorvente foi seco e ativado em estufa, por 100 °C, durante oito horas. 0 material resultante foi acondicionado em frasco âmbar.

EXEMPLO 5: Comparação entre os rendimentos das fisalinas obtidas de acordo com a Técnica Mabry modificada (pedido de patente BRPI 9904363-7) e de acordo com o processo descrito pela presente invenção.

A fim de observar os rendimentos das fisalinas obtidas de acordo com a Técnica Mabry modificada e de acordo com o ' ''O';Tf.

? '’Χ

I processo descrito pela presente invenção, o qual empreg^»^ experimentos soro fisiológico, foram realizados

comparativos.

As fisalinas obtidas de acordo com o processo descrito pela presente invenção foram decorrentes da metodologia empregada nos exemplos anteriores.

As fisalinas obtidas de acordo com a Técnica Mabry modificada.

A técnica

Mabry modificada emprega acetato de chumbo para retirada de clorofilas, taninos, aromáticos, • 10 substâncias estas que se presentes retardam e encarecem as etapas de purificação.

Após duas horas de agitação intensa é colocado carvão ativo, o material resultante é filtrado é carreado para fase orgânica com clorofórmio. A etapa seguinte consiste na lavagem com água é evaporação da fase orgânica (vide referência pedido de patente BRPI9904363-7).

Os resultados percentuais encontram-se na Figura 1 e na Tabela 2. Observando esta figura e esta tabela, é possível verificar que, para cada fisalina obtida, o

rendimento é maior quando se emprega o processo da presente invenção.

Tabela 2: Percentuais de rendimentos das fisalinas isoladas de P. angulata L

Fisalinas	Técnica Mabry	Técnica solução tampão pH
Isoladas	modificada	7,2-7,4
B	7,5%	15, 6%
D	14,3%	27,1%
F	13, 0%	22,9%
G	6, 3%	19, 0%

Embora a presente invenção tenha sido descrita em relação às suas modalidades preferidas, é especialista na arte que são possíveis várias

alterações e modificações sem se afastar do escopo da presente invenção que está determinado pelas reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo de obtenção de esteróides seco-derivados do ergostano caracterizado por compreender as seguintes etapas:

(a) moagem de partes secas de planta(s) da família Solanaceae;

(b) tratamento das ditas partes de planta(s) da etapa (a) com solução salina de cloreto de sódio a uma concentração de 0,9% (tampão fisiológico com pH na faixa de 7,2 a 7,4), onde a extração é realizada sob temperatura controlada de 36-38°C por 6 a 8 horas e sob agitação;

(c) filtração do soluto proveniente da etapa (b) e, então, particioná-lo em diclorometano ou clorofórmio ou acetato de etila;

(d) lavagem da fase orgânica resultante da etapa (c) com água destilada e posterior filtração em sulfato de magnésio anidro ou qualquer outro secante insolúvel em água;

(e) evaporação da solução resultante da etapa (d) , fornecendo uma fração de esteróides secoderivados do ergostano;

(f) separação dos esteróides seco-derivados do ergostano por cromatografia líquida de média pressão (MPLC), com um sistema gradiente de hexano / acetato de etila, e subsequente caracterização espectroscópica.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato das partes secas de planta(s) da

Petição 870180132524, de 20/09/2018, pág. 7/8 família Solanaceae empregadas na etapa (a) serem raízes e/ou caules e/ou folhas e/ou cápsulas dos frutos.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2 caracterizado pelo fato de raízes e/ou caules e/ou folhas 5 e/ou cápsulas dos frutos de plantas do gênero Physalis serem empregadas na etapa (a). 4. Processo de acordo com a reivindicação 3 caracterizado pelo fato de ser empregado o caule de Physalis angulata L. . na etapa (a) . 10 5. Processo de acordo com a reivindicação 1

caracterizado pelo fato da partição referente à etapa (c) ser realizada com diclorometano.
6. Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato da MPLC referente à etapa (f) ser 15 realizada através da utilização da silica como adsorvente, que é reutilizada, ao menos por três vezes, após sua lavagem com metanol.