BRPI0112407B1

BRPI0112407B1 - Uso de cepas de parapoxvírus ovis para produzir medicamentos antivirais e medicamentos contra câncer

Info

Publication number: BRPI0112407B1
Application number: BRPI0112407-2A
Authority: BR
Inventors: Olaf Weber; Tobias Schlapp; Angela Siegling; Andreas Knorr; Claudia Hirth-Dietrich; Gudrun Theiss; Hans-Dieter Volk
Original assignee: Aicuris Gmbh & Co. Kg
Priority date: 2000-07-11
Filing date: 2001-07-11
Publication date: 2019-02-12
Also published as: KR100805996B1; TWI304341B; ZA200300274B; SV2002000528A; DE10122451A1; PE20020187A1; HN2001000154A; GT200100136A; JP2012121902A; DOP2001000211A; KR20030016387A; ECSP034419A; BR0112407A; BRPI0112407B8

Abstract

"uso de cepas de parapoxvírus ovis para produzir medicamentos antivirais e medicamentos contra câncer". a invenção refere-se ao uso de cepas do vírus parapox ovis como terapia imune para fraquezas imunes infecciosas ou não-infecciosas, assim como o uso de cepas do referido vírus para tratar doenças tumorais e infecções virais. a invenção também refere-se ao uso de cepas do vírus parapox ovis, para produzir medicamentos, tanto para seres humanos, como para animais.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para USO DE VÍRUS OS QUAIS PERTENCEM TAXONOMICAMENTE À CEPA DE PARAPOXVÍRUS OVIS NZ2.

A presente invenção refere-se ao uso de classes de Parapoxvírus ovis como agentes imunoterapêuticos para imunodeficiências de uma natureza infecciosa ou não-infecciosa, e ao uso de cepas de Parapoxvírus ovis para tratar doenças de tumores e infecções e doenças virais as quais acompanham tais infecções, e o uso de cepas de Parapoxvírus ovis para produzir medicamentos para uso em humanos e animais.

A presente invenção além do mais refere-se ao uso de cepas de Parapoxvírus ovis, e de formas medicinais preparadas do mesmo, como agentes imunoterapêuticos ou agentes imunoprofiláticos em metafilaxia de tensão para prevenir ou evitar doenças infecciosas seguindo tensão (por exemplo operações); a seu uso em profilaxia de infecção, para prevenir ou evitar doenças infecciosas por meios de administração antes de operações ou intervenções (por exemplo antes de implantação de próteses ou antes de intervenções dentais), a seu uso em metafilaxia de infecção ou na terapia de infecções virais agudas ou crônicas, por exemplo do trato respiratório, de infecções por papilomavírus, de infecção com vírus do herpes, de infecção por HIV, e de infecção viral de órgãos internos tais como infecção com vírus da hepatite, a seu uso em cicatrização de ferimento a fim de acelerar processos de cicatrização de ferimentos, e a seu uso para dar suporte a cicatrização de ferimentos os quais somente curam parciamente ou não curam totalmente (por exemplo úlcera da perna), a seu uso para doenças tais como esclerose múltipla, asma, verrugas e outras neoformações da pele, a seu uso para doenças do espectro de doenças alérgicas, a seu uso para prevenir o início de alergias sistemáticas, e para seu uso a alergias tópicas e a seu uso para melhorar bem-estar, por exemplo em pacientes idosos, com as cepas de Parapoxvírus ovis as quais são usadas dentro do contexto da invenção sendo as classes NZ2, NZ-7, NZ-10 e orf-11.

É também possível usar descendentes destas cepas as quais foram obtidas por passagem e/ou adaptação a células particulares, por exemPetição 870180142637, de 19/10/2018, pág. 7/11 pio WI-38, MRC-5 ou células Vero, ou partes ou fragmentos de vírus destas cepas ou destes descendentes. Partes são para serem compreendidas ···

como significando fragmentos genômicos ou subgenômicos os quais são expressos com o auxílio de vetores adequados, por exemplo varíola bovina, 5 em sistema adequados, por exemplo culturas de células de fibroblastos.

Fragmentos são compreendidos como sendo as frações, as quais são obtidas por purificação bioquímica, por exemplo por meios de cromatografia, de partículas as quais foram fisicamente partidas, por exemplo por meios de ultra-sonicação.

A presente invenção além disso refere-se ao uso de ditas cepas de Parapoxvírus ovis para produzir medicamentos e preparações farmacêuticas. Além disso, a invenção refere-se ao uso de ditas cepas de Parapoxvírus ovis, em combinação com outros remédios, para produzir medicamentos e preparações farmacêuticas para terapia antiviral ou terapia de câncer.

É conhecido que infecções virais latentes e persistentes podem ser ativadas ou reativadas por uma imunossupressão, ou, inversamente, que o sistema imunológico suprime a doença aguda a qual pode ser induzida por um vírus o qual é latente (por exemplo uma infecção de vírus do herpes latente reaparece em associação com imunossupressão: bolhas labiais em 20 associação com tensão ou administração de cortisona). É além disso conhecido que infecções virais cronicamente persistentes ou latentes são difíceis ou ainda impossíveis para tratar usando substâncias antivirais convencionais com uma base de peso molecular baixo.

Uma razão para isto pode ser a ausência de atividade enzimáti25 ca viral em conjunção com tais infecções (por exemplo a ausência de qualquer atividade de polimerase viral a qual primeiramente tem que incorporar um inibidor nucleosídico no ácido nuclêico viral de modo que este inibidor possa, por exemplo dar origem à terminação da cadeia no DNA viral; por exemplo a ausência de qualquer atividade de timidina quinase viral, a qual primeiramente tem, por exemplo, que fosforilar um composto antiviral de modo que este composto possa tornar-se ativo), ou então a falta de qualquer reconhecimento, pelo sistema imunológico do hospedeiro, de células infec3 tadas ou degeneradas, por exemplo células de câncer, ou de antígenos virais.

É também conhecido que, em associação com infecções virais cronicamente persistentes, uma superinfecção com outro vírus pode dar ori5 gem a efeitos antivirais os quais são direcionados contra o vírus cronicamente persistente¹⁾. Os autores ¹⁾ foram capazes de demonstrar a dependência deste efeito em interferonas, tais como IFN-δ e TNF-α, os quais são

secretados por células T, células assassinas naturais e macrófagos.

Os resultados obtidos por estes autores confirmaram outro, βει 0 tudo precoce o qual demonstrou que células T citotóxicas restritas à Classe I foram capazes de inibir expressão de gene HBV hepatocelular em camundongos transgênicos a HBV, onde este processo acontece sem qualquer destruição das células do fígado, e onde o processo foi extraído por TNF-α e IFN-γ²).

Um produto para induzir imunidade paraespecífica, isto é que é denominado um indutor de paraimunidade, foi usado terapeuticamente, metafilaticamente e profilaticamente em prática veterinária por um tempo relativamente longo. Indutores de paraimunidade consistem, por exemplo, em Parapoxvírus ovis, cepa D 1701 (DE 3 504 940). BAYPAMUN® é um pro20 duto o qual é preparado na base deste vírus (Parapoxvírus ovis, cepa D 1701).

Em animais, o parapoxvírus inativado induz proteção nãoespecífica contra infecções causadas por uma variedade muito ampla de agentes patogênicos. É assumido que esta proteção é mediada por via de 25 uma variedade de mecanismos formando parte do sistema de defesa endógeno.

Estes mecanismos incluem a indução de interferona, a ativação de células assassinas naturais, a indução de atividade estimuladora de colônia (CSA), e a estimulação de proliferação de linfócito. Investigações pre30 coces no mecanismo de ação demonstraram o efeito estimulador de interleucina 2 e interferona-α ³⁾.

Contra este histórico, o objeto portanto surge de além disso me-

lhorar a utilidade terapêutica de efeito excelente de Parapoxvírus ovis a fim de qualitativamente aumentar indução generalizada descrita acima de uma imunorresposta paraespecífica por Parapoxvírus ovis, cepa D 1701 e melho5 rar isso tal que melhores efeitos antivirais ou anti-tumores possam ser alcançados usando doses inferiores. O efeito terapêutico seria então também esperado a ter menos efeitos colaterais.

O objeto da invenção foi portanto melhorar o efeito imunológico de Parapoxvírus. O objeto é alcançado usando as cepas acima menciona10 das de Parapoxvírus ovis ao invés da classe 1701 a qual é convencionalmente empregada.

A presente invenção refere-se ao uso de vírus os quais pertencem taxonomicamente a uma das cepas do Parapoxvírus ovis NZ2, NZ-7, NZ-10 ou orf-11 para produzir medicamentos direcionados contra infecções 15 virais e câncer em humanos e animais.

A invenção além disso refere-se ao uso de descendentes das cepas de acordo com a invenção, os quais descendentes são obtidos por passagem ou adaptação a sistemas de células adequados, por exemplo células humanas, tais como células WI-38, MRC-5, e de macacos, por exemplo 20 células Vero, células bovinas tais como BK-KI3A47/Reg ou MDBK, e células ovinas, tais como MDOK, para produzir medicamentos contra infecções virais e câncer em humanos e animais, e também refere-se ao uso de partes ou fragmentos das ditas cepas, e suas variantes de passagem ou de adaptação, onde partes são para serem compreendidas como sendo fragmentos 25 genômicos e subgenômicos os quais são expressos com o auxílio de vetores adequados, tais como vírus de varíola bovina, em sistemas adequados, tais como culturas de célula de fibroblasto e fragmentos são para serem compreendidos como sendo as frações, as quais são obtidas por purificação bioquímica, tal como cromatografia, das partículas virais expressas ou fisica30 mente partidas, para produzir medicamentos os quais são direcionados contra infecções virais e câncer em humanos e animais, e também refere-se ao uso de uma das cepas de Parapoxvírus ovis, e de derivados os quais são • · ··

derivados como descritos acima, para produzir medicamentos e preparações farmacêuticas como agentes imunoterapêuticos ou agentes imunoprofiláticos para doenças autoimunes e para infecções virais agudas e crônicas do trato respiratório e dos órgãos internos, e também refere-se ao uso de uma das 5 cepas, e de derivativos derivados, para produzir medicamentos e preparações farmacêuticas para metafilaxia de tensão e para prevenir ou evitar doenças infecciosas seguindo tensão e também em conjunção com profilaxia da infecção dentro do contexto de operações e intervenções dentais, e também refere-se ao uso de uma das cepas, e de derivativos disso, para produ10 zir medicamentos e preparações farmacêuticas para uso em metafilaxia de infecção ou a terapia de infecções virais agudas e crônicas, por exemplo do trato respiratório, de infecções por papilomavírus, de infecção com vírus do grupo de herpes de infecção por HIV, ou de infecção viral de órgãos internos, tais como infecção com vírus da hepatite, e também uso em conjunção 15 com doenças tais como esclerose múltipla, asma, verrugas e outras neoformações da pele, e também refere-se ao uso de uma das cepas, e de derivativos derivados, para produzir medicamentos e preparações farmacêuticas para uso em ferimentos, para acelerar processos de cicatrização de ferimento, e uso para suportar a cicatrização de ferimentos os quais somente 20 cicatrizam insuficientemente ou os quais não cicatrizam totalmente e úlcera da perna, e também refere-se ao uso de uma das cepas, e de derivativos derivados, para produzir medicamentos e preparações farmacêuticas para uso em doenças do espectro de doenças alérgicas, psoríase, neurodermatite e outras doenças autoimunes, tais como lupus eritematódio, e também para 25 melhorar bem estar, por exemplo em pacientes idosos, e também refere-se ao uso de uma das cepas, e de derivativos derivados, para produzir medicamentos e preparações farmacêuticas para uso contra doenças inflamatórias, degenerativas e proliferativas dos órgãos internos, por exemplo doença de Crohn, da pele, do sangue, do sistema nervoso central e suas estruturas 30 anexas, e incluindo o olho, incluindo câncer, e também refere-se ao uso de uma das classes, e de derivativos derivados, em combinação com outros remédios para produzir medicamentos e preparações farmacêuticas para ··«·

terapia antiviral ou terapia de câncer em seres humanos e animais.

A invenção preferivelmente refere-se ao uso de uma das classes de Parapoxvírus ovis em combinação com outros remédios para produzir medicamentos e preparações farmacêuticas para administração oral, e/ou 5 em uma formulação resistente ao suco gástrico para administração oral.

O Parapoxvírus ovis NZ-2 mencionado aqui por via de exemplo foi depositado em 10 de julho de 2001 na European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Reino Unido. O número de depósito é

O seguinte foi descoberto por via de exemplo:

1. Demonstração de atividade terapêutica em camundonqos transgênicos com vírus de Hepatite B

Camundongos transgênicos com vírus de hepatite B (cepa HBV

1,3 X tg) foram usados para o experimento de comprovação de conceito. 7 animais machos, de 8 a 10 semanas de idade, foram usados por grupo. As várias doses foram administradas intraperitonealmente em um volume de 0,15 ml em dia 1 (início do experimento) e no dia 4.

Para a administração, as diluições seguintes de cada classe de vírus foram preparadas para os grupos de dose individual;

1^a dose 1,5x10⁶ TCID₅₀

2^a dose 5x10⁵ TCID₅₀

3^a dose 1,5x10⁵ TCID₅₀

4^a dose 5x10⁴ TCID₅₀

PBS sem pirogênio estéril foi usado como o controle de placebo.

Os vírus foram concentrados no modo seguinte: 500 ml de sobrenadante obtido de Parapoxvírus ovis classe NZ2 (título, aproximadamente 2x10⁵ TCID₅₀/ml) e Parapoxvírus ovis classe D 1701 (título 1x10⁷

TCID₅₀/ml) foram ajustados ao mesmo título de vírus. Uma ultracentrífuga de

Beckman (SW28 rotor a 28000 RPM e 4°C por 3 h) foi usada para este pro30 pósito. Após a centrifugação, as bolinhas foram ajustadas a um título de

1x10⁷ TCID₅₀/ml usando volumes apropriados de meio de diluição.

·«··

Alíquotas de dosagens correspondentes foram usadas para uma titulação de retroverificação, a qual confirmou os títulos destas dosagens. Após as alíquotas de verificação terem sido removidas, as doses correspondentes foram inativadas a 56°C por 1 hora.

Meio de diluição: 10 ml de EMEM 10x

2,7 ml de 2g/l de bicarbonato ml de glutamina 1%

86,3 ml de água bi-destilada

No dia 5, os animais foram sacrificados sem dor e o fígado e sangue foram removidos. Aproximadamente 20 mg de fígado de cada animal foram elaboradas usando um kit de tecidos de QIAamp (Qiagen, Hilden) e a concentração do DNA foi determinada fotometricamente enquanto sua integridade foi verificada eletroforeticamente em um gel de agarose 1%. O DNA foi hibridizado com uma sonda específica a HBV em um método de hibridi15 zação de pequena mancha. O DNA foi previamente tratado com RNAse (Qiagen, Hilden) a fim de excluir sinais provocados por RNA. 200 pl de DNA (10 pg) foram carregados em uma membrana de náilon (Boehringer Mannheim) e tratados 4 vezes, para cada caso 3 minutos, com Soak I (NaOH 0,5N; NaCI 1M) e duas vezes com Soak II (NaCI 3M; tris-HCI 0,5M, pH 7,4); o DNA foi então cozido a 120°C por meia hora e subseqüentemente pré-hibridizado, a 60°C por 30 minutos, com um tampão de hibridização padrão (5xSSC, Nlauroilsarcosina, 0,1% p/v; SDS, 0,02%; reagente de bloqueio, 1 x e 100 pg de DNA de esperma de peixe/ml) o qual não conteve qualquer sonda. Seguindo esta etapa, o DNA foi hibridizado com uma sonda iniciada por oligo25 nucleotídeo aleatória contendo o genoma de HBV inteiro (20-40 ng/ml de tampão de hibridização). Após isto, o filtro foi lavado, a 64°C por 10 minutos, em 4xSSC/SDS 0,1%, 2xSSC/SDS 0,1% e 1xSSC/SDS 0,1%.

Detecção imunológica foi efetuada usando o sistema CDP-Star® (Boehringer Mannheim) de acordo com as instruções do fabricante. Um Lu30 milmager® (Boehringer Mannheim) foi usado para a avaliação. DNA específico HBV no sangue foi quantificado por meios de PCR quantitativo. O plasma foi antes de tudo isolado centrifugando o sangue de EDTA. O DNA foi ·

• · * · • · • · ·· · «· • * * · · • · · · · • ··<* · · • t · · ···· w ·· purificado usando um Kit de Ácido Nuclêico Viral de Sistema de Alta Pureza 16 (Boehringer Mannheim)e, por meio de PCR quantitativo, examinado com o Sistema de Detecção de Seqüência ABI PRIMS™ 7700 (PE Applied Biosystems) para sinais específicos a HBV. Os iniciadores e sonda seguintes foram empregados:

ayw-570f (sentido) 5’-CTGTACCAAACCTTCGGACGG-3’ ayw-670r (antisentido) 5’-AGGAGAAACGGGCTGAGGC-3’ Sonda:

ayw-613t 5’-CCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAATT-3’

O DNA foi ampliado em um volume de reação de 50 pl (a reação conteve 1,4 mM de cada dNTP, 4,75 mM de MgCI₂, 15 pmol de cada iniciador e da sonda, 5 μΙ de tampão de PCR 10 vezes [todos os reagentes PCR foram derivados do kit de reagente de núcleo TaqMan; Perkin Elmer/Roche Molecular Systems Inc.] e 1,5 U de Taq DNA polimerase e 0,25 U de Amp Erase. Após uma etapa de desnaturação inicial (10 min a 95°C), as amostras foram sujeitas a 40 ciclos de desnaturação (95°C, 30 s) e anelação/extensão (56°C, 1 min). Os produtos foram analisados usando o software padrão de Sistema de Detecção de Seqüência ABI PRISM® 7700.

Uma análise histoquímica foi realizada usando anticorpos direcionados contra o antígeno de núcleo de vírus de hepatite B ( Dako). Para isto, partes de um lóbulo do fígado foram fixadas durante a noite em formaldeído 4%, embebidas em parafina e secionadas (5 pm). Após remoção da parafina e rehidratação, a atividade de peroxidase endógena foi resfriada por um período de 20 minutos usando H2O2 3%. Aglutinação não específica foi bloqueada com soro de carneiro normal. As secções foram então incubadas à temperatura ambiente por 30 minutos com o anticorpo, o qual foi diluído 1:500. Todas as etapas subseqüentes foram realizadas usando o kit Vectastain ABC (Vector Laboratories) como descrito pelo fabricante.

A reação imunológica foi visualizada usando tetracloreto de 3,3’diaminobenzidina e peróxido de hidrogênio. As seções foram contramanchadas com hematoxilina/eosina.

Os resultados foram analisados estatisticamente por meios de análises de variação e comparação pós hoc.

Em conclusão, foi encontrado, surpreendentemente, que uma ampliação do efeito antiviral, conforme comparado com aquele obtido com o 5 Parapox ovis cepa D 1701, é alcançado quando a cepa NZ2 é usada. Isto torna possível, pela primeira vez, usar Parapoxvírus ovis para induzir a capacidade do complexo do sistema imunológico com uma intensidade a qual difere significantemente da intensidade do efeito alcançado com os indutores de paraimunidade previamente conhecidos.

Os resultados seguintes foram surpreendentemente obtidos:

Fígado: Uma redução significantemente maior de DNA específico a HBV foi observado em animais tratados com NZ2 como comparado com animais tratados com D 1701. A atividade antiviral de NZ2 é mais potente do que aquela de D 1701: no grupo de dose mais elevada, administra15 ção de NZ2 reduz o DNA específico a HBV mais do que 45 vezes mais eficientemente do que o que faz administração da mesma quantidade de D 1701, enquanto, no grupo de menor dose, reduz 57 vezes mais efetivamente. Em plasma, administração de NZ2 reduz o DNA específico a HBV, no grupo de menor dose, mais do que 10 vezes mais eficazmente do que o faz 20 que administração da mesma quantidade de D1701. Isto demonstra que a eficácia terapêutica de Parapoxvírus ovis cepa NZ2 é significantemente superior àquela de classe D 1701.

Nas figuras, a redução de sinais específicos a HBV é mostrado em comparação com o grupo placebo (isto foi equiparado com 100%).

Figura 1 mostra resultados de tratar camundongos transgênicos a HBV com classe D 1701 ou NZ2. Enquanto DNA específico a HBV é significantemente reduzido no fígado, conforme comparado com o grupos placebo, com ambas cepas e em todos os grupos de doses, a redução é maior do que quando cepa NZ2 é usada. Em ambas as menores doses de NZ2, a re30 dução em DNA específico a HBV é significantemente maior do que no caso dos grupos de dose de D 1701 equivalentes.

JLí

Figura 2 mostra o resultado, obtido no plasma, de tratar camundongos transgênicos a HBV com cepa D1701 ou NZ2. Enquanto DNA específico a HBV é significantemente reduzido no plasma, conforme comparado com o grupo placebo, com ambas cepas e em todos os grupos de dose, a redução é maior do que quando NZ2 é usado. Em contraste a menor dose de NZ2, a menor dose de cepa D 1701 não mais tem um efeito antiviral significante.

2. Indução de citocinas:

Camundongos Balb/c fêmeas de 7 a 8 semanas de vida foram mantidos sob condições estéreis e usados para o experimento. Os animais foram escolhidos aleatoriamente e divididos em grupos os quais cada um continha 6 animais. O esquema de tratamento seguinte foi aplicado: Grupo 1: Placebo

Grupo 2: Parapoxvírus ovis cepa D 1701; 5x10⁴ TCID₅o/dose

Grupo 3: Parapoxvírus ovis cepa ΝΖ2; 5x10⁴ TCID₅₀/dose

Grupo 4: Placebo

Grupo 5: Parapoxvírus ovis cepa D 1701; 5x10⁴ TCID50/dose Grupo 6: Parapoxvírus ovis cepa ΝΖ2; 5x10⁴ TCID50/dose

O volume administrado foi 10 ml/kg, com a administração acontecendo intraperitonealmente.

Os animais em grupos 1 a 3 foram sacrificados 6 horas após a administração, enquanto os animais em grupos 4 a 6 foram sacrificados 12 horas após a administração; células peritoniais foram obtidas por meios de uma lavagem usando PBS gelado, e os nódulos de via portal e de linfa mesentéricos foram isolados.

As células peritoniais foram concentradas por meios de uma etapa de centrifugação (5 min a 300 rpm e temperatura ambiente em uma centrífuga de bancada Eppendorf) e seqüentemente apanhadas em 0,2 ml de tampão de quebra (solução de quebra: citrato de sódio 25 mM, isotiocianato de guanidínio 4M, N-lauroilsarcosina 0,5%), congeladas por choque e armazenadas a -75°C até a hora de preparar o RNA.

O RNA total foi preparado por meios de extração de fenol áci do/clorofórmio. Para isto, as amostra as quais foram congeladas em tampão de quebra foram descongeladas à temperatura ambiente e tratadas, para a extração, com as soluções seguintes: 1/10 do volume de tampão de quebra de acetato de sódio 2M (pH 4,0), 1 volume de tampão de quebra de fenol saturado em água e 1/5 do volume de tampão de quebra de clorofórmio/isoamil álcool (24:1). Estes ingredientes foram misturados em um turbilhão por 10 segundos e então levados à temperatura constante sendo mantidos por 10 minutos em gelo. As fases foram separadas centrifugando a 15365g e 4°C por 30 minutos. Após isto, a fase aquosa foi transferida em um 10 novo recipiente e 8 ml de RNA-MATRIX, proveniente de kit Rnaid® plus (DlANOVA), foram adicionados, a fim de isolar o RNA presente nesta fase, e tudo foi incubado à temperatura ambiente por 15 minutos, o complexo de RNA/RNA-MATRIX resultante foi peletizado centrifugando a 7000g e o sobrenadante foi descartado. O pélete foi subseqüentemente lavado 2 x em 15 cada caso com 250 ml de RNA-WASH (DIANOVA) e, após a última lavagem, seca por centrifugação a vácuo. O RNA foi extraído adicionando 20-30 ml de água destilada sem RNA se e aquecendo tudo a temperatura de 55°C por 15 minutos. Após centrifugar a 7000g e a temperatura ambiente por 1 minuto, a matriz foi separada transferindo a solução de RNA a um novo recipiente.

A qualidade do RNA foi verificada por meio de eletroforese de gel. O RNA foi armazenado a -70°C.

O cDNA foi sintetizado por transcrição reversa do mRNA usando iniciadores de oligo(dt) como moléculas iniciais para a polimerização. Os componentes seguintes estiveram presentes na mistura de síntese: 200 ng-2 25 pg de RNA total, 2μΙ de transcriptase reversa de M-MLV (200 U/μΙ) (GIBCO/BRL), 8 μΙ do tampão 5xRT pertinente (GIBCO/BRL), 1 μΙ de DTT (0,1 M) (GIBCO/BRL), 1 μΙ de DTT (0,1 M) (GIBCO/BRL), 4 μΙ de dNTP (2,5 mM) (SIGMA), 2μΙ de iniciador de oligo(dT)₁₂-is (100 μg/ml) (PROMEGA), 1 μΙ de inibidor de RNAse de placenta humana (10000 U/ml) (GIBCO/BRL) e 30 água a 40 μΙ de volume total. A mistura foi mantida à temperatura ambiente por 10 minutos e então incubada a 37°C por 45 minutos; ela foi então aquecida a 95°C por 3 minutos e imediatamente resfriada em gelo. O cDNA, o j .··. ···;

• · · · · • · · · · · · • · · · • · · · qual foi sintetizado neste modo, foi armazenado a -20°C.

As quantidade dos cDNAs foram padronizadas usando um gene de organização de casa (β-actina). O PCR quantitativo foi realizado usando Sistema de Detecção de Seqüência ABI PRISM® 7700 (PE Applied Biosystems). Os iniciadores seguintes foram empregados:

β-Actina sentido: 5’-TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C-3’ anti-sentido : 5’-TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G-3’ IFN-γ sentido: 5’-AGCGGC TGA CTG AAC TCA GAT TGT AG-3’ anti-sentido: 5’-GTC ACA GTT TTC AGC TGT ATA GGG-3’ TNF-α sentido: 5’-GGC AGG TCT ACT TTG GAG TCA TTG C-3’ anti-sentido: 5’-ACA TTC GAG GCT CCA GTG AAT TCG G-3’

IL-15 sentido: 5’-GCC AAC TGG ATA GAT GTA AGA TAT GAC CT-3’ anti-sentido: 5’-CGT GTT GAT GAA CAT TTG GAC AAT GCG TAT-3’

O DNA foi ampliado em um volume de reação de 25 pl (a reação conteve 1,4 mM de cada dNTP, MgCI₂ 4 mM, 0,3 pmol de cada iniciador e da sonda, 2,5 pl de 10 vezes tampão de PCR contendo SYBR Green [todos os reagentes PCR foram derivados do kit de reagente de núcleo de PCR de SYBR Green; Perkin Elmer/Roche Molecular Systems Inc.] e 1,25 U de Taq DNA polimerase e 0,25 U de Amp Erase. Após uma etapa de desnaturação inicial (95°C por 10 min), as amostras foram sujeitas a 40 ciclos de desnaturação (95°C 30 s) e anelação/extensão (60°C, 1,30 min). OS produtos foram analisados usando o Software Padrão de Sistema de Detecção de Seqüência ABI PRISM® 7700. Os resultados foram analisados estatisticamente por análise de variação e comparação pós- hoc.

Os resultados seguintes foram surpreendentemente obtidos:

1. Após tratar com classe D 1701 ou cepa NZ2, a expressão de γ interferona é induzida em ambas 6 e 12 horas após a administração (Figura 3). No caso da cepa NZ2, esta indução é significantemente maior ambos em relação ao placebo e em relação à cepa D 1701. A magnitude de expressão de γ interferona a qual é observada seguindo a administração de D1701 não é significantemente diferente daquela do controle de placebo. A figura descreve os valores os quais foram medidos em células obtidas por lavagem peritonial.

2. Seguindo tratamento com classe D1701, a expressão de TNFa é induzida em 12 horas após a administração, enquanto esta é induzida a 6 e 12 horas após administração seguindo tratamento com cepa NZ2 (com isso já sendo possível observar um decréscimo, como comparado com o valor 6 horas, após 12 horas; Figura 4). No caso de cepa NZ2, esta indução a 6 horas após administração é significantemente maior do que aquela observada no caso de cepa D 1701. A figura descreve os valores os quais foram medidos em células as quais foram obtidas por lavagem peritonial.

3. Seguindo tratamento com cepa D1701 ou cepa NZ2, a expressão de IL-15 é induzida em ambos 6 e 12 horas após a administração (Figura 5). No caso de cepa NZ2, esta indução é significantemente maior, a 6 horas após administração, do gue no caso de classe D 1701 ou no placebo. A magnitude de expressão de IL-15 a qual é observada seguindo admi15 nistração de D 1701 não é significantemente maior do que aquela observada no controle de placebo. A figura descreve os valores os quais foram medidos em células obtidas por lavagem peritonial.

3. Demonstração de eficácia terapêutica em camundongos sem-pêlo sofrendo de tumor

Células MDA-MB231 (ATCCn²HTB26) foram cultivadas, a 37°C e na presença de CO₂ 5%, em meio completo (88 5 DMEM, FBS 10%, penicilina/estreptomicina 1%, L-glutamina 1% (em cada caso Gibco Life Technologies)) em um incubador. No dia da transplantação, as células foram aprox. 70% confluentes. As células foram tripsinizadas, lavadas com HBSS, contadas e ajustadas a 2,5x10⁷ células/ml usando PBS pré-esfriado. Camundongos sem-pêlo NCr fêmeas (tacônicos) foram usados. Os camundongos estavam entre 8 e 10 semanas de vida e pesavam aprox. 22g. Todas as manipulações nos animais foram realizadas sob condições estéreis. 5 χ 10⁶células foram injetadas subcutaneamente na região de flanco em um volume total de 0,2 ml. Após isto, os camundongos foram mantidos por um adicional de sete dias até os tumores alcançarem uma massa média de aprox. 80 mg. Os tumores foram medidos e os camundongos foram divididos aleatória mente nos três grupos de cada caso 10 animais. Os seguintes foram administrados aos grupos individuais:

Grupo 1: Placebo (PBS)

Grupo 2: Parapoxvírus ovis, cepa D1701

Grupo 3: Parapoxvírus ovis, cepa NZ2

D1701 foi administrado em uma dose de 2,5x10⁵ TCID₅₀, enquanto NZ2 foi administrado em uma dose de 1x10⁵ TCID50; estas doses foram em cada caso administradas quatro vezes em todos os intervalos de em cada caso três dias. Os tumores foram medidos duas vezes semanal10 mente. Significâncias foram determinadas usando teste de Student.

A Figura 6 mostra o tamanho médio dos tumores (em miligramas) em animais pertencendo a Grupos de 1 a 3 sobre o período experimental (em dias). (Símbolos: Grupo 1, círculos, Grupo 2, triângulos, Grupo 3, quadrados)

Surpreendentemente, uma atividade direta contra tumores, qual atividade foi significante (p<0,05) conforme comparado com o grupo de controle, foi encontrado no sistema experimental. A classe NZ2 foi encontrada ser notadamente mais potente neste respeito do que a cepa D1701. Somente aproximadamente metade da quantidade de NZ2, conforme compa20 rado com D1701, foi exigida a fim de alcançar o mesmo efeito.

Esta descoberta fornece substantificação clara da eficácia terapêutica de preparações de vírus de acordo com a invenção em camundongos sem-pêlo sofrendo de tumor.

Camundongos sem-pêlo são imunodeficientes e não possuem qualquer célula T funcional. No sistema experimental, a atividade a qual é direcionada contra tumores é presumivelmente devido às células assassinas naturais (NK), a outras células e ao efeito direto de citocinas/quimiocinas. A eficácia superior de NZ2 seria esperada ser ainda mais claramente evidente no caso de um sistema imunológico o qual estava completo e intacto.

4. Outras diferenças biológicas entre NZ2 e D1701

Foi encontrado que, em contraste a cepa D1701, Parapox vírus NZ2 pode ser continuamente passado em linhas de células humanas. Isto ·· • ···· demonstra diferenças fundamentais entre NZ2 e D1701 em comportamento de reprodução e/ou nos receptores virais.

Adaptação a linhas de células humanas é um pré-requisito importante para a produção de cepas virais em linhas de células humanas.

4.a) Capacidade para ser passado continuamente em células MRC-5 humanas.

Figura 7 descreve uma tentativa para adaptar cepas NZ2 e D1701 a linha de célula diplóide humana MRC-5. MRC-5 é adequado para produzir compostos ativos biológicos e vacinas. O mesmo título inicial foi empregado para ambas as cepas e os sobrenadantes de cultura de célula correspondentes foram continuados acima de 5 passagens em células MRC-

5. A figura descreve o título em TCID₅₀, de amostras de sobrenadantes das células MRC-5 as quais foram em cada caso infectadas, plotado contra o número de passagem. Somente cepa NZ2, e não D1701, era retrotitulável em culturas de célula de rim bovina (BL clone 3a). Isto aponta à presença de diferenças biológicas fundamentais entre as duas cepas em seu comportamento de infecção e reprodução. Ao mesmo tempo, este resultado mostra que NZ2 pode ser reproduzido em um espectro mais amplo de células do que D1701, desse modo dando origem à possibilidade de um processo de produção o qual é baseado em células humanas.

4.b) Capacidade de NZ2 e D1701 para ser passado em células WI-38 e células BK clone 3a

Diferenças biológicas fundamentais entre as cepas NZ2 e D1701 são também claramente demonstradas pelos experimentos descritos na Figura 8 e Figura 9. A Figura 8 mostra o título de vírus obtido em tentativas para passar D1701 em células de BK clone 3a bovina e em células WI-38 humanas, plotadas contra o número de passagens. Pode ser visto que D1701 pode ser continuamente passado em células BL clone 3a mas não em células WI-38 humanas.

A situação é diferente com a classe NZ2. Esta classe pode ser passada continuamente durante diversos dias em células BK clone 3a e em células WI-38 (Figura 9).

Estes resultados também apontam diferenças distintas no comportamento de infecção e reprodução de NZ2 e D1701.

4.c) Efeito dependente de dose de NZ2 no teste de contestação de vírus do herpes seguindo passando em WI-38

Testes de contestação de vírus do herpes foram realizados em camundongos a fim de investigar as propriedades imunoestimuladoras de cepas NZ2 as quais foram passadas em células WI-38. Três grupos em cada caso 10 animais experimentais foram tratados com 1x1O⁴TCID5o, 5x10⁴TCID50 e 1x10⁵TCID₅₀₎ respectivamente, enquanto um grupo de con10 trole foi dado um placebo. A Figura 10 descreve a taxa de sobrevivência dos quatro grupos experimentais ao longo do tempo seguindo a infecção com vírus do herpes. Foi encontrado, surpreendentemente, que NZ2 não perdeu suas propriedades imunoestimuladoras como um resultado da passagem em células WI-38.

Todos os resultados experimentais neste exemplo apontam para diferenças biológicas fundamentais no comportamento de infecção e reprodução de ΝΖ2 e D1701. Foi encontrado, surpreendentemente, que, em contraste à situação com D1701, a preparação de NZ2 para uso como um imunomodulador não é ligada ao uso de células renais bovinas como a linha 20 de célula de produção.

Baseado nas circunstâncias conhecidas da influência de uma resposta imunológica Th1 em infecções por vírus latente e cronicamente persistente ^4,5) e também doenças proliferativas, por exemplo câncer^8,9), e o fato de que as propriedades imunomoduladoras de Parapoxvírus ovis classe 25 NZ2 são superiores àquelas de Parapoxvírus ovis cepa D1701, o uso de imunomoduladores baseados em Parapoxvírus ovis cepa NZ2, ou uma das cepas acima mencionadas, como uma monoterapia ou em combinação com compostos de baixo peso molecular, biologicamente ativos, por exemplo antivirais, em seres humanos e animais é possível e de utilidade terapêutica 30 para a terapia antiviral de infecções com vírus da hepatite B ou vírus da hepatite C ou qualquer outro agente patogênico do grupo de vírus originadores de hepatite, e também outras infecções virais dos órgãos internos, e também ·· ·· i

··· • · · •···· •· ·*··· infecções, acompanhadas por outras doenças bem como, com os vários tipos de vírus simples de herpes (HSV), os vários tipos de vírus de papilomavírus humano (HPV), vírus de imunodeficiência humana (HIV), vírus de zoster de varicela, citomegalovírus humano (HCMV) e as doenças de vírus correspondentes em animais.

Além do mais, na base do mecanismo de ação o qual foi demonstrado, as classes acima mencionadas de Parapoxvírus ovis podem ser usadas, com alguma perspectiva de sucesso, para realizar os tratamentos profiláticos ou terapêuticos seguintes, em particular:

Prevenção de reaparecimentos em conjunção com infecções de vírus do herpes, metafilaxia, isto é prevenção do estabelecimento de infecções virais (por exemplo HIV), quando tratamento com o remédio é efetuado imediatamente após exposição⁷⁾. Com base no mecanismo de ação, é igualmente possível tratar câncer^8,9).

Dependendo da natureza do problema clínico, o agente terapêutico a base de parapoxvírus é administrado ou sistemicamente, isto é, por exemplo, intramuscularmente, subcutaneamente, intraperitonealmente, intravenosamente ou oralmente, ou então localmente. Nesta conjunção, o parapoxvírus está ou presente no estado purificado e liofilizado e/ou está suspenso em um solvente adequado imediatamente antes da administração, ou então está presente em outra formulação adequada ou está presente em uma forma de administração resistente ao suco gástrico ou outra forma de administração oral.

Preparações adequadas podem também ser produzidas de descendentes de NZ2 os quais são obtidos por passagem e/ou adaptação a células particulares, por exemplo WI-38, MRC-5 ou células Vero, e outras cepas acima mencionadas ou partes ou fragmentos de NZ2, e cepas classes acima mencionadas ou seus descendentes. Partes são para serem compreendidas como sendo fragmentos genômicos ou subgenômicos os quais são expressos com o auxílio de vetores adequados, por exemplo, varíola bovina, em sistemas adequados, por exemplo culturas de células de fibroblasto. Fragmentos são compreendidos como sendo as frações, as quais são obti-

das por purificação bioquímica, por exemplo cromatografia, de partículas as quais são partidas fisicamente, por exemplo por meio de ultrasonicação.

Nesta conjunção, diversas administrações, ou tratamento a longo prazo de acordo com esquemas cronológicos os quais alcançam as exi5 gências do problema clínico, podem ser necessários.

Assim, o uso de acordo com o esquema seguinte foi provado a ser particularmente promissor no caso de terapia de câncer, por exemplo (mas sem qualquer restrição):

Administração intramuscular a cada caso a partir de 10⁶ a 10⁷10 TCID50 (dosagem infecciosa de cultura de tecido) a cada 3 dias por 4 semanas, seguido por uma pausa de 2 semanas; administração intramuscular renovada a cada caso a partir de 10⁶ a 10⁷ TCID50 a cada 3 dias por 4 semanas, seguido por uma pausa de 2 semanas; administração intramuscular renovada a cada caso a partir de 10⁶ a 10⁷ TCID₅₀ a cada 3 dias por 4 se15 manas, seguido por uma pausa de 2 semanas; dependendo da seriedade e do sucesso da terapia, estes ciclos podem ser suplementados com ciclos adicionais; alternativamente, um esquema pode ser indicado sob o qual a formulação é administrada a cada 4^o ou 5^o dia durante pelo menos 3 meses.

Por exemplo, no caso de infecção viral crônica, a partir de 10⁶ a 20 10⁷ TCID50 da formulação são administrados subcutaneamente na região abdominal, ou intramuscularmente na região do deltóide ou do quadríceps, a cada 3 dias por um total de 5 vezes ao todo. É possível desviar-se deste esquema dependendo das necessidades surgindo a partir da doença. Para a profilaxia de resfriados, a formulação tem que ser usada para gargarejo e 25 isto tem que ser repetido diariamente tanto quanto existir um risco de contágio.

A fim de prevenir infecções seguindo intervenções cirúrgicas na região oral (por exemplo operações dentais), gargarejo tem que ser executado com a formulação por 1-2min, à noite antes da intervenção.

Referências

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' 5 Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 93:4589-4594.

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L. , Schreiber R.D., and Chisari, F.V. (1994): Cytotoxic T lymphocytes inhibit hepatitis B vírus gene expression by a noncytolytic mechanism in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 91:3764-3768.

3,Steinmassl,G., G.Wolf (1990): Bildung von Interleukin 2 und

Interferon-durch mononukleãre Leukozyten des Schweines nach in vitroStimulation mit verschiedenen Vírusprãparaten (Formation of interleukin 2 and interferon by pig mononuclear leukocytes following in-vitro stimulation with various vírus preparations). J. Vet.Med.B37,5,321-331.

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Koszinowski (1994): Late-Phase inhibition of murine cytomegalovírus replication by synergistic action of interferon gamma and tumor necrosis factor alpha. J. Gen. Virol 75: 101-110; P.M.

5. Smith, R.M. Wolcott, R. Chervenak. S.R. Jennings (1994):

Control of acute cutaneous herpes-simplex vírus-lnfection - T -cell mediated viral clearance is dependent upon interferon gamma. Virology 202 (1):76-88].

6. Y. Kawanashi, N. Hayashi, K. Katayama, K. ueda, T. Takehara, E. Miyoshi, E. Mita, A. Kasahara, H. Fusamoto, T. Kamada (1995): Tumor necrosis factor alpha and interferon gamma inhibit synergistically viral repli- cation in hepatitis B vírus replicating cells. J. Medicai Virology 47 (3):272-277

7. Dhawan, S., L.M. Wahl, A. Heredia, Y.H. Zhang, J.S. Epstein.

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• · • · · ·

9. M.KIouche, H.Kirchner, F.Holzel (1994): Antiproliferative effects of interferon gamma in combination with alpha-difluoromethylomithine on human carcinoma cell cultures. J .Câncer Research and Clinicai Oncology 120(12):706].

'5 O Paparoxvírus NZ-02 foi depositado em 10.07.2001 no Centro de Cultura de Células Européia (ECACC) sob o número de depósito 01071006 (comunicado na fase internacional como mostrado no Doc 1 apenso).

• · · ·

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA <110> Bayer AG <120> Uso de classes de Parapoxvírus ovis para produzir medicamentos antivirais <130> Parapoxvírus ovis classe NZ2 <140>

<141 >

<160> 11 <170> Patentln Versão 2.1 >210> 1 <211 >25 <212>DNA <213> Mus sp.

<220>

<223> Iniciador de beta-actina, antisentido <400> 1 taaaacgcag ctcagtaaca gtccg 25 <210> 2 <211 >25 <212>DNA <213> Mus sp.

<220>

<223> Iniciador de beta-actina, sentido <400> 2 tggaatcctg tggcatccat gaaac 25 <210> 3 <211 >26 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <220>

<223> Sonda de HBV, ayw-613t <400> 3

ccatcatcct gggctttcgg aaaatt <210>4 <211>19	26
•		<212> DNA
	* 5	<213> Vírus de hepatite B
A	10	<220> <223> Iniciador HBV, ayw-670r (antisentido) <400> 4 aggagaaacg ggctgaggc <210>5	19
V	15	<211> 21 <212> DNA <213> Vírus de hepatite B <220> <223> Iniciador de HBV, ayw-570f (sentido)
-		<400> 5
		ctgtaccaaa ccttcggacg g	21
	20	<210>6 <211 >24 <212> DNA
•	25	<213>Mussp. <220> <223> Iniciador IFN-gama (antisentido) <400> 6 gtcacagttt tcagctgtat aggg	24
	30	<210>7 <211 >26 <212> DNA <213> Mus sp. <220>
		<223> Iniciador IFN-gama (sentido) <400> 7

agcggctgac tgaactcaga ttgtag 26 <210>8 <211> 30 <212> DNA *5 <213>Mussp.

<220>

<223> Iniciador IL-15 (antisentido) <400> 8 cgtgttgatg aacatttgga caatgcgtat

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. USO DE VÍRUS OS QUAIS PERTENCEM TAXONOMICAMENTE À CEPA DE PARAPOXVÍRUS OVIS NZ2, depositada no European Collection of Cell Cultures sob o número de depósito 01071006, caracterizado por ser na preparação de medicamentos para tratar infecções virais e câncer em seres humanos e animais.
2. USO DA CEPA DE PARAPOXVÍRUS OVIS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser na preparação de medicamentos e preparações farmacêuticas como agentes imunoterapêuticos ou agentes imunoprofiláticos para tratar infecções virais agudas e crônicas do trato respiratório e dos órgãos internos.
3. USO DA CEPA DE PARAPOXVÍRUS OVIS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser na preparação de medicamentos e preparações farmacêuticas para prevenir ou evitar doenças infecciosas após tensão e também em conjunção com profilaxia de infecção dentro do contexto de operações e intervenções dentais.
4. USO DA CEPA DE PARAPOXVÍRUS OVIS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser na preparação de medicamentos e preparações farmacêuticas para a metafilaxia de infecção ou terapia de infecções virais agudas, tais como do trato respiratório, de infecções por papilomavírus, de infecção com vírus do herpes, de infecção por HIV, ou de infecção viral de órgãos internos, tais como infecção com vírus da hepatite.
5. USO DA CEPA DE PARAPOXVÍRUS OVIS, acordo a reivindicação 1, em combinação com outros remédios, caracterizado por ser na preparação de medicamentos e preparações farmacêuticas para terapia antiviral e de câncer em seres humanos e animais.
6. USO DA CEPA DE PARAPOXVÍRUS OVIS, acordo com a reivindicação 1, em combinação com outros remédios, caracterizado por ser na preparação de medicamentos e preparações farmacêuticas para administração oral e/ou em uma formulação resistente ao suco gástrico para administração oral.