BR9913652B1 - Vetor compreendendo sequência de Ehrlichia canis, bem como microoganismo transgênico - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VETOR

COMPREENDENDO SEQUÊNCIA DE EHRLICHIA CANIS, BEM COMO MICROORGANISMO TRANSGÊNICO".

Fundamentos da Invenção Campo da Invenção A presente invenção refere-se em geral aos campos de biologia molecular de bactérias parasitárias, particularmente a agentes de doenças de tipo rickettsia e bactéria ehrlichial. Mais especificamente, a presente in- venção refere-se à clonagem molecular e caracterização de gene de proteí- na imunorreativa de 120 kDa de Ehrlichia canis.

Descrição da Técnica Relacionada Ehrlichia spp. são bactérias gram negativas obrigatoriamente intracelular que residem em um endossoma de células hematopoiéticas e infectam vários hospedeiros de animais incluindo seres humanos, canídio selvagem e doméstico, veado, cavalos, carneiro, gado bovino e roedores selvagens. Cada membro da tribo Ehrlichieae tem seu próprio tropismo celu- lar alvo particular. A maioria das espécies de Ehrlichia são ou monocitotrópi- cas (E. canis, E. chaffeensis, E. sennetsu, E. risticii e E. muris) ou granuloci- totrópicas (ehrlichia granulocítica humana, E. equi, E. phagocytophila e E. ewingii) com as exceções de Cowdria ruminantium que se desenvolve nas células endoteliais do hospedeiro e Anaplasma marginale, um parasita celu- lar de sangue vermelho.

Embora ehrlichiase tenham sido descritas na parte inicial deste século, elas receberam muito pouca atenção uma vez que elas foram consi- deradas patógenos de apenas importância veterinária nos Estados Unidos até esta década. O interesse renovado em ehrlichiae é devido à emergência de erliquioses afetar seres humanos. Na última década, dois novos patóge- nos de Ehrlichia humana (E. chaffeensis e um organismo humano de tipo E. phagocytophilia) foram descobertos nos Estados Unidos (Bakken Js 1994, Chen SM 1994. JCM, Fishbein DB, 1987, Maeda, K., 1987). Ehrlichia canis, a espécie protótipo do gênero, é o agente etiológico de erliquiose canina, realmente apenas uma das cinco espécies de ehrlichia que naturalmente infectam cachorros. Erliquiose canina é uma doença mundialmente transmi- tida pelo carrapato de cachorro marrom, Rhipicephalus sanguineus (Groves MG, 1975. Lewis GE Jr, 1977). Ehrlichia canis causa uma doença febril agu- da transitória leve e pode progredir para doença severa e para uma síndro- me fatal (pancitopenia canina tropical) (Buhles WC, 1974, Greene CE e J. W.

Harvey. 1984, Walker, JS 1970). Cada ano custa milhões de dólares tratar cachorros de companhia e de trabalho infectados com E. canis pelo mundo inteiro. Além do mais, E. canis também apresenta uma ameaça de saúde pública. Ehrlichia canis, ou um organismo antigenicamente indistinguível, foi isolado de um ser humano recentemente (Perez M. 1996).

Compreensão da composição genética e antigênica de E. canis é essencial para o estudo da patogênese de erliquiose canina e desenvolvi- mento de uma vacina eficaz. Ehrlichia canis está proximamente relacionada com E. chaffeensis geneticamente e antigeneticamente (Anderson BE, 1991, 1992, Chen SM, 1994, Am J Trop Med Hyg). Portanto, erliquiose canina pode ser um modelo apropriado para o estudo da patogênese de Ehrlichia spp. monocitotrópica incluindo E. chaffeensis. A técnica anterior é deficiente na falta de clonagem e caracteri- zação de gene imunorreativo de Ehrlichia canis. Além disso, a técnica ante- rior é deficiente na falta de proteína recombinante de tal gene imunorreativo de Ehrlichia canis. A presente invenção satisfaz este desejo e necessidade estabelecidos a muito tempo na técnica.

Sumário da Invenção Em uma concretização da presente invenção, é provido um gene que codifica uma proteína imunorreativa de 120 kDa de Ehrlichia canis. De preferência, a proteína tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e o gene tem uma sequência de ácidos nucléicos de SEQ ID NO: 7.

Em uma concretização preferida da presente invenção, é provido um vetor de expressão que compreende um gene que codifica um proteína imunorreativa de 120 kDa de Ehrlichia canis e em que o vetor seja capaz de expressar o gene quando o vetor é introduzido para dentro de uma célula.

Em uma outra concretização da presente invenção, é provida uma proteína recombinante que compreende uma seqüência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 8. De preferência, a seqüência de aminoácidos é codifi- cada por uma seqüência de ácidos nucléicos de SEQ ID NO: 7. De preferên- cia, a proteína recombinante compreende 14 unidades de repetição tandem com 36 aminoácidos cada. Mais de preferência, as unidades de repetição são hidrofílicas. Ainda mais de preferência, a proteína recombinante é um antígeno.

Em uma concretização preferida da presente invenção, é provido um método de produção da proteína recombinante, compreendendo as eta- pas de obtenção de um vetor que compreende uma região de expressão que compreende uma seqüência de codificação da seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 8 operativamente ligada a um promotor; transfecção do vetor para dentro de uma célula; e cultivo da célula sob condições eficazes para a expressão da região de expressão. A invenção pode ser descrita em certas concretizações como um método de inibição de infecção de Ehrlichia canis em um indivíduo compre- endendo as etapas de: identificação de um indivíduo suspeito de ter sido exposto a ou infectado com Ehrlichia canis; e administração de uma compo- sição compreendendo um antígeno de 120 kDa de Ehrlichia canis em uma quantidade eficaz para inibir uma infecção de Ehrlichia canis. A inibição pode ocorrer através de qualquer meio tal como, por exemplo, a estimulação das respostas imunes celulares ou humorais do indivíduo ou por outros meios tal como inibição da função normal do antígeno para a interação com algum agente no corpo do indivíduo.

Outros ulteriores aspectos, características e vantagens da pre- sente invenção estarão evidentes a partir da seguinte descrição das concre- tizações presentemente preferidas da invenção dada para a finalidade de revelação.

Breve Descrição dos Desenhos De modo que o assunto em que os objetivos, vantagens e ca- racterísticas relatados acima da invenção, bem como outros que se tornarão claros, são alcançados e podem ser entendidos em detalhes, nas descrições mais particulares da invenção brevemente sumarizada acima podem ser ti- das por referência a certas concretizações da mesma que são ilustradas nos desenhos anexos. Estes desenhos fazem parte do relatório. Deve ser obser- vado, no entanto, que os desenhos anexos ilustram as concretizações prefe- ridas da invenção e portanto não devem ser considerados limitantes em seu escopo. A fig. 1 mostra posições e seqüências de DNA de iniciadores de oligonucleotídeos derivados do gene de proteína de 120 kDA de E. chaffe- ensis (caixa aberta) e as seqüências de DNA que flanqueia o gene (linha).

As posições de iniciadores são indicadas como menos ou mais para as se- qüências de DNA a montante e a jusante da proteína de gene de 120 kDa, respectivamente. Nove pares de iniciadores foram formados por combinação de cada iniciador forward (SEQ ID NOs: 1-3) com cada iniciador reverso (SEQ ID NOs: 4-6) e foram usados para ampliar o gene de proteína de 120 kDa de E. canis por PCR. A fig. 2A mostra eletroforese de gel de agarose das unidades de repetição do gene de proteína de 120 kDa de E. canis. pCA120 foi primeira- mente digerido com EcoRI para liberar o inserto e então é digerido com Spe I em vários pontos de tempo. A fig. 2B mostra uma determinação de Sou- thern blot do número de repetições. O DNA digerido por 35 minutos com Spe I oriundo do gene no painel A foi transferido para uma membrana de náilon e foi hibridizado com sonda de oligonucleotídeo marcado por digoxigenina que se anela às seqüências de DNA a montante da região de repetição do gene de proteína de 120 kDa de E. canis. ND = DNA não digerido A fig. 3 mostra a seqüência de DNA do gene de 120 kDa de E. canis (SEQ ID NO: 7) e os aminoácidos deduzidos (SEQ ID NO: 8). Os áci- dos nucléicos de repetições 1,3, 5,7, 9,11 e 13 estão sublinhados. A fig. 4 mostra a árvore filogenética das unidades de repetição do gene de 120 kDa de E. canis. A escala representa % de diferença em seqüência de DNA. A fig. 5 mostra o alinhamento das seqüências de aminoácidos das proteínas de 120 kDa de E. canis (SEQ ID NO: 10) e de E. chaffeensis (SEQ ID NO: 9). Barras representam aminoácidos idênticos. Dois pontos indicam substituições observadas. A fig. 6 mostra a hidrofobicidade e probablidade superficial das proteínas de 120 kDa de E. canis e de E. chaffeensis. A região entre as se- tas representa o domínio de repetição. Todas as repetições em ambas as proteínas são hidrofílicas ou de superfície exposta. A segunda unidade de repetição da proteína de 120 kDa de E. canis e um pico da primeira unidade de repetição de proteína de 120 kDa de E. chaffeensis estão presentes entre as duas setas são ampliados na figura 7. A fig. 7 mostra uma comparação dos aminoácidos de superfície exposta em uma unidade de repetição das proteínas de 120 kDa de E. canis e da E. chaffeensis. A fig. 7A mostra a probabilidade de superfície de amino- ácidos. As regiões correspondentes foram identificadas por duas setas na figura 6. Letras em negrito indicavam os aminoácidos conservados entre E. canis e E. chaffeenis. A fig. 7B mostra um alinhamento da seqüência de aminoácidos mostrada no painel A (SEQ ID NOs: 11-12). Barras represen- tam aminoácidos idênticos. Pontos representam substituições conservadas. A fig. 8 mostra eietroforese de gel de agarose do gene de 120 kDa de E. canis oriundo de todas as cepas de E. canis parcialmente digerido com Spe I. Os plasmídios de pCR2.1 recombinantes foram primeiramente digeridos com EcoR I para liberar o inserto a partir do vetor e então foi dige- rido com Spe I parcialmente. Não digerido: DNA de gene de 120 kDa de cepa Oklahoma foi digerido com EcoR I, mas não com Spe I para mostrar o tamanho do inserto. A fig. 9A mostra SDS-PAGE de proteína de 120 kDa de E. canis expressa por E. coli. 1, Proteína de fusão de GST; 2, proteína de 120 kDa recombinante de E. canis clivada da proteína de fusão de GST portrombina.

A fig. 9B mostra eietroforese de gel de agarose de um plasmídio de pGEX que expressa a proteína de 120 kDa de E. canis. O inserto é indicado por uma seta. A fig. 10 mostra um Western immunoblot de soros de proteína recombinante de 120 kDa de anti-E. canis de camundongo reagidos com antígeno de E. canis (raia 1) e proteína recombinante de 120 kDa raia 2 seta). A fig. 11 mostra Western blotting de soro convalescente de cani- no que reage com proteína de 120 kDa recombinante de E. canis.

Descrição Detalhada da Invenção De acordo com a presente invenção podem ser empregadas técnicas de DNA recombinantes, de biologia molecular e de microbiologia convencionais dentro da habilidade na técnica. Tais técnicas são explicadas totalmente na literatura. Ver, por exemplo, Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); "DNA Cloning: A Praticai Approach", volumes I e II (D. N. Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthe- sis" (M. J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B. D. Hames & S. J.

Higgins eds. (1985)]; "Transcription and Translation" [B. D. Hames & S. J.

Higgins eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R. I. Freshney, etd (1986)]; "lm- mobilized Cells and Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A praticai Gui- de To Molecular Cloning" (1984).

Portanto, se surgir aqui, os seguintes termos terão as definições indicadas abaixo. O aminoácido descrito aqui é preferido ser na forma isomérica "L". No entanto, resíduos na forma isomérica "D" podem estar substituídos por qualquer resíduo de L-aminoácido, contanto que a propriedade funcional desejada de ligação de imunoglobulina é retida pelo polipeptídeo. NH2 se refere ao grupo amino livre presente no terminal amino de um polipeptídeo. COOH se refere ao grupo carbóxi presente no terminal carbóxi de um poli- peptídeo. De acordo com nomeclatura de polipeptídeo padrão, J. Biol.

Chem., 243: 3552-59 (1969), abreviações para resíduos de aminoácido são mostrados na seguinte tabela de correspondência: Tabela de Correspondência Seria observado que todas as seqüências de resíduos são re- presentadas aqui por fórmulas cuja orientação à esquerda e à direita está na direção convencional de terminal amino para terminal carbóxi. Além do mais seria observado que um hífen no início e no fim de uma seqüência de resí- duos de aminoácídos indica uma ligação de peptídeo a uma outra seqüência de um ou mais resíduos de aminoácidos. A tabela acima é apresentada para correlacionar as notações de três letras e de uma letra que podem aparecer alternativamente aqui.

Um "réplicon" é qualquer elemento genético (por exemplo, pias- mídio, cromossoma, vírus) que funciona como uma unidade autônoma de réplicon de DNA in vivo; isto é, capaz de replicação sob seu próprio controle.

Um "vetor" é um réplicon, tal como plasmídio, fago ou cosmídio, ao qual um outro segmento de DNA pode estar ligado de modo a realizar replicação do segmento ligado.

Um "molécula de DNA" se refere à forma polimérica de desoxir- ribonucleotídeos (adenina, guanina, timina ou citosina) ou em sua forma de fio único ou uma hélice de fio duplo. Este termo se refere apenas à estrutura secundária e primária da molécula, e não a limita para quaisquer formas ter- ciárias particulares. Assim, este termo inclui DNA de fio duplo encontrado, inter alia, em moléculas de DNA lineares (por exemplo, fragmentos de restri- ção), vírus, plasmídios e cromossomas. Discutindo a estrutura aqui de acor- do com a convenção normal de se dar apenas a sequência na direção 5’ para 3’ ao longo do fio não transcrito de DNA (isto é, o fio tendo uma se- qüência homóloga ao mRNA).

Uma "origem de replicação" se refere àquelas seqüências de DNA que participam na síntese de DNA. Uma "seqüência que codifica" DNA é uma seqüência de DNA de fio duplo que é transcrita e traduzida em um polipeptídeo in vivo quando colocada sob o controle de seqüências regulado- ras apropriadas. Os limites da seqüência de codificação são determinados por um códon inicial no terminal 5’ (amino) e um códon de parada de tradu- ção no terminal 3’ (carboxila). Uma seqüência de codificação pode incluir, mas não é limitada a, seqüências procarióticas, cDNA oriundo de mRNA eu- cariótico, seqüências de DNA genômicas oriundas de DNA eucarióticos (por exemplo, mamífero), e ainda seqüências de DNA sintéticas. Uma seqüência de sinal de poliadenilação e terminação de transcrição usualmente estará localizada 3' em relação a seqüência de codificação.

Seqüências de controle traducionais e transcripcionais são se- qüências reguladoras de DNA, tais como promotores, aumentadores, sinais de poliadenilação, terminadores e semelhantes que provêem a expressão de uma seqüência de codificação em uma célula de hospedeiro.

Uma "seqüência de promotor" é uma região reguladora de DNA capaz de ligar polimerase de RNA em uma célula e iniciar transcrição de uma seqüência de codificação a jusante (direção 3’). Para as finalidades de definição da presente invenção, a seqüência de promotor está ligada em seu terminal 3’ pela sítio de iniciação de transcrição e se prolonga a jusante (di- reção 5’) para incluir o número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar transcrição em níveis detectáveis acima da base. Dentro da se- qüência de promotor será encontrado um sítio de iniciação de tanscrição, bem como domínios de ligação de proteína (seqüências de consenso) res- ponsáveis pela ligação de polimerase de RNA. Promotores eucarióticos fre- quentemente, mas não sempre, contêm caixas de "TATA" e caixas de "CAT". Promotores procarióticos contêm seqüências Shine-Dalgarno além das seqüências de consenso -10 e -35.

Uma "seqüência de controle de expressão" é uma seqüência de DNA que controla e regula a transcrição e tradução de uma outra seqüência de DNA. Uma seqüência de codificação está "sob o controle" de seqüências de controle traducionais e transcripcionais em uma célula quando polimerase de RNA transcreve a seqüência de codificação em mRNA, que é então tra- duzido na proteína codificada pela seqüência de codificação.

Uma "seqüência de sinal" pode ser incluída perto da seqüência de codificação. Esta seqüência codifica um peptídeo de sinal, N-terminal para o polipeptídeo, que se comunica com a célula de hospedeiro para dire- cionar o polipeptídeo para a superfície de célula ou secretar o polipeptídeo para dentro dos meios, e este peptídeo de sinal é removido pela célula de hospedeiro antes que a proteína deixe a célula. Seqüências de sinais podem ser encontradas associadas a uma variedade de proteínas nativas para pro- cariotes e eucariotes. O termo "oligonucleotídeo", como usado aqui em referência à sonda da presente invenção, é definido como uma molécula constituída de dois ou mais deoxirribonucleotídeos, de preferência mais do que três. Seu tamanho exato dependerá de muitos fatores que, por sua vez, dependerão da função e do uso final do oligonucleotídeo. O termo "iniciador" como usado aqui se refere a um oligonucleo- tídeo, seja de ocorrência natural como em um digesto de restrição punficado ou produzido sinteticamente, que é capaz de agir como um ponto de inicia- ção de síntese quando colocado sob condições em que a síntese de um produto de extensão de iniciador, que é complementar a um fio de ácido nu- cléico, é induzida, isto é, na presença de nucleotídeos e um agente de indu- ção tal como uma polimerase de DNA e em uma temperatura e pH adequa- dos. O iniciador pode ser ou de fio único e deve ser suficientemente longo para inicializar a síntese do produto de extensão desejado na presença do agente de indução. O comprimento exato do iniciador dependerá de muitos fatores, incluindo da temperatura, da fonte de iniciador e do uso do método.

Por exemplo, para aplicações de diagnósticos, dependendo da complexida- de da seqüência alvo, o iniciador de oligonucleotídeo tipicamente contém 15- 25 ou mais nucleotídeos, embora possa conter menos nucleotídeos.

Os iniciadores aqui são selecionados serem "substancialmente" complementares a fios diferentes de uma seqüência de DNA alvo particular.

Isto significa que os iniciadores devem ser suficientemente complementares para hibridizar com seus fios respectivos. Portanto, a seqüência de iniciador não necessita refletir a seqüência exata do modelo. Por exemplo, um frag- mento de nucleotídeo não complementar pode estar ligado à extremidade 5’ do iniciador, com o restante da seqüência de iniciador sendo complementar ao fio. Alternativamente, bases não complementares ou seqüências mais longas podem ser interspersadas no iniciador, com a condição de que a se- qüência de iniciador tenha complementaridade suficiente com a seqüência ou hibridizam com as mesmas e desse modo formam um modelo para a síntese de produto de extensão.

Como usado aqui, os termos "endonuclease de restrição" e "en- zimas de restrição" se referem a enzimas, cada uma das quais cortam DNA de fio duplo em ou perto de uma seqüência de nucleotídeo específica.

Uma célula foi "transformada" por DNA heterólogo ou exógeno quando tal DNA foi introduzido dentro da célula. O DNA transformante pode ou pode não ser integrado (covalentemente ligado) no genoma da célula. Em células de mamífero, procariotes e levedura, por exemplo, o DNA transfor- mante pode ser mantido sobre um elemento epissomal tal como um plasmi- dio. Com relação a células eucarióticas, uma célula estavelmente transfor- mada é aquela em que o DNA transformante tomou-se integrado em um cromossoma de modo que ele é herdado por células-filhas através da repli- cação de cromossoma. Isto estavelmente é demonstrado pela capacidade da célula eucariótica estabelecer clones ou linhas de células constituídas de uma população de células-filhas contendo o DNA transformante. Um "clone" é uma população de células derivadas de um antepassado ou célula única por mitose. Uma "linha de célula" é um clone de uma célula primária que é capaz de crescimento estável in vitro para muitas gerações.

Duas seqüências de DNA são "substancialmente homólogas" quando pelo menos cerca de 75% (de preferência pelo menos cerca de 80%, e mais de preferência pelo menos cerca de 90% ou 95%) dos nucleotí- deos emparelham sobre o comprimento definido das seqüências de DNA.

Seqüências que são substancialmente homólogas podem ser identificadas por comparação das seqüências usando programa padrão disponível em bancos de dados de seqüência, ou em uma experiência de hibridização Southern sob, por exemplo, condições rigorosas como definidas para aquele sistema particular. A definição de condições de hibridização apropriadas está dentro da técnica. Ver, por exemplo, Maniatis e outros, supra; DNA Cloning, vols. I & II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

Uma região "heteróloga" do construto de DNA é um segmento identificável de DNA dentro de uma molécula de DNA maior, isto é, não en- contrado em associação com a molécula maior na natureza. Assim, quando a região heteróloga codifica um gene de mamífero, o gene usualmente será flanqueado por DNA que não flanqueia o DNA genômico de mamífero no genoma do organismo de fonte. Em um outro exemplo, seqüência de codifi- cação é um construto onde a própria seqüência de codificação não é encon- trada na natureza (por exemplo, um cDNA onde a seqüência de codificação genômica contém íntrons ou seqüências sintéticas tendo códons diferentes do que o gene nativo). Variações alélicas ou eventos mutacionais de ocor- rência natural não dão origem a uma região heteróloga de DNA como defini- do aqui.

Os rótulos mais comumente empregados para aqueles estudos são elementos radioativos, enzimas, produtos químicos que fluorescem quando expostos à luz ultravioleta e outros. Numerosos materiais fluores- centes são conhecidos e podem ser utilizados como rótulos. Estes incluem, por exemplo, fluoresceína, rodamina, auramina, Vermelho Texas, azul AMCA e Amarelo Lucifer. Um material de detecção particular é anticorpo de anticoelho preparado em cabra e é conjugado com fluoresceína através de um isotiocianato.

Proteínas podem também ser marcadas com um elemento radi- oativo ou com uma enzima. O rótulo radioativo pode ser detectado por qual- quer um dos procedimentos de contagem disponíveis correntemente. O isó- topo preferido pode ser selecionado de 3H, 14C, 32P, 35S, 36CI, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125l, 131l e 186Re. Rótulos de enzima são do mesmo modo úteis, e podem ser de- tectados por qualquer uma das técnicas presentemente utilizadas colorimé- tricas, espectrofotométricas, fluoroespectrofotométricas, amperométricas ou gasométricas. A enzima é conjugada à partícula selecionada por reação com moléculas de ligação por pontes tais como carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldeído e semelhantes. Muitas enzimas que podem ser usadas nestes procedimentos são conhecidas e podem ser utilizadas. As preferidas são, peroxidase, beta-glucoronidase, beta-D-glucosidase, beta-D-galactosidase, urease, glicose oxidase mais peroxidase e fosfatase alcalina. As patentes U.S. n® 3.654.090, 3.850.752 e 4.016.043 são mencionadas a título de exemplo para sua revelação de métodos e material de marcação substitutos.

Um sistema de ensaio particular desenvolvido e utilizado na téc- nica é conhecido como um ensaio de receptor. Em um ensaio de receptor, o material a ser analisado é apropriadamente marcado e então certas colônias de teste celulares são inoculadas com uma quantidade de ambos os rótulos depois dos quais estudos de ligação são conduzidos para se determinar a extensão à qual o material marcado se liga aos receptores celulares. Deste modo, diferenças em afinidade entre materiais podem ser determinadas.

Um ensaio útil na técnica é conhecido como um ensaio "cis/trans". Resumi- damente, este ensaio emprega dois construtos genéticos, um dos quais é tipicamente um plasmídio que continuamente expressa um receptor particu- lar de interesse quando transfectado para dentro de uma linha de célula a- propriada, e segundo dos quais é um plasmídio que expressa um repórter tal como luciferase, sob o controle de um complexo de receptor/ligante. Assim, por exemplo, se é desejado avaliar um composto como um ligante para um receptor particular, um dos plasmídios seria um construto que resulta em expressão do receptor na linha de célula escolhida, enquanto o segundo plasmídio possuiría um promotor ligado ao gene de luciferase em que o ele- mento de resposta ao receptor particular é inserido. Se o composto sob teste é um agonista para o receptor, o ligante complexará com o receptor, e o complexo resultante ligará o elemento de resposta e iniciará transcrição do gene de luciferase. A quimioluminescência resultante é então medida foto- metricamente, e curvas de resposta de dose são obtidas e são comparadas com aqueles ligantes conhecidos. O protocolo exposto acima é descrito em detalhes na patente U.S. n° 4.981.784.

Como usado aqui, o termo "hospedeiro" destina-se a incluir não apenas procariotes mas também eucariotes tais como células de animais, planta e levedura. Um gene ou uma molécula de DNA recombinante que codifica uma proteína imunorreativa de 120 kDa de Ehrlichia canis da pre- sente invenção pode ser usado para transformar um hospedeiro usando-se qualquer uma das técnicas comumente conhecidas por aqueles versados na técnica. Especialmente preferido é o uso de um vetor contendo seqüências de codificação para um gene que codifica uma proteína imunorreativa de 120 kDa de Ehrlichia canis da presente invenção para as finalidades de transformação procariote.

Hospedeiros procarióticos podem incluir E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens, Mycobacterium vaccae e Bacillus subtitlis. Hospedei- ros eucarióticos incluem leveduras tal como Pichia pastoris, células de ma- mífero e células de inseto.

Em geral, vetores de expressão contendo seqüências de pro- motor que facilitam a transcrição eficiente do fragmento de DNA inserido são usados em conexão com o hospedeiro. O vetor de expressão tipicamente contém uma origem de replicação, promotor(es), terminador(es) bem como genes específicos que são capazes de prover seleção fenotípica em células transformadas. Os hospedeiros transformados podem ser fermentados e cultivados de acordo com o meio conhecido na técnica para se conseguir ótimo crescimento celular. A invenção inclui um DNA substancialmente puro que codifica uma proteína imunorreativa de 120 kDa de Ehrlichia canis, um fio do qual DNA se hibridizará em alta severidade para dar uma sonda contendo uma seqüência de pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos de (SEQ ID NO: 6). A proteína codificada pelo DNA desta invenção pode partilhar pelo menos 80% de identidade de seqüência (de preferência 85%, mais de preferência 90% e mais de preferência 95%) com os ácidos nucléicos listados na figura 3 (SEQ ID NO: 7). Mais de preferência, o DNA inclui a seqüência de codifi- cação dos nucleotídeos de SEQ ID NO: 8 ou um variante degenerado de uma tal seqüência. A sonda da qual o DNA da invenção hibridiza de preferência consiste de uma seqüência de pelo menos 20 nucleotídeos consecutivos, mais de preferência 40 nucleotídeos, ainda mais de preferência 50 nucleotí- deos e mais de preferência 100 nucleotídeos ou mais (até 100%) da se- qüência de codificação dos nucleotídeos listados em SEQ ID NO: 8 ou o seu complemento. Uma tal sonda é útil para a detecção de expressão de gene de proteína imunorreativo de 120 kDa de Ehrlichia canis em uma célula hu- mana por um método incluindo as etapas de (a) contatação de mRNA obtido a partir da célula com a sonda de hibridização marcada; e (b) detecção de hibridização da sonda com o mRNA.

Esta invenção também inclui um DNA substancialmente puro contendo uma seqüência de pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos (de preferência 20, mais de preferência 30, ainda mais de preferência 50, e mais de preferência todos) da região oriunda dos nucleotídeos listados em (SEQ ID NO: 8).

Por "alta severidade" quer se dizer hibridização de DNA e condi- ções de lavagem caracterizadas por alta temperatura e baixa concentração de sal, por exemplo, condições de lavagem de 65°C em uma concentração de sal de cerca de 0,1 x SSC ou o seu equivalente funcional. Por exemplo, condições de alta severidade podem incluir hibridização a cerca de 42°C na presença de cerca de 50% de formamida; uma primeira lavagem a cerca de 65°C com cerca de 2 x SSC contendo SDS a 1%; seguido por segunda lava- gem a cerca de 65°C com cerca de 0,1 x SSC.

Por "DNA substancialmente puro" quer se dizer DNA que não é parte de um meio em que o DNA naturalmente ocorre, em virtude da sepa- ração (purificação parcial ou total) de alguma ou todas as moléculas daquele meio, ou em virtude de alteração de seqüências que flanqueiam o DNA rei- vindicado. O termo, portanto, inclui, por exemplo, um DNA recombinante que é incorporado em um vetor, em um vírus ou plasmídio de replicação autô- noma, ou no DNA genômico de um procariote ou eucariote; ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, um cDNA ou um fragmento de cDNA ou genômico produzido por reação de cadeia de polimerase (PCR) ou digestão de endonuclease de restrição) independente de outras seqüências.

Ele também inclui DNA recombinante que é parte de um gene híbrido que codifica seqüência de polipeptídeo adicional, por exemplo, uma proteína de fusão. Também incluído é um DNA recombinante que inclui uma porção dos nuleotídeos listados em SEQ ID NO: 8) que codifica uma variante de união alternativa de um gene que codifica uma proteína imunorreativa de 120 kDa de Ehrlichia canis. O DNA pode ter pelo menos cerca de 70% de identidade de se- qüência com a seqüência de codificação dos nucleotídeos listados em SEQ ID NO: 8, de preferência pelo menos 75% (por exemplo, pelo menos 80%); e mais de preferência pelo menos 90%. A identidade entre duas seqüências é uma função direta do número de emparelhamento ou posições idênticas.

Quando uma posição de subunidade em ambas as duas seqüências é ocu- pada pela mesma subunidade monomérica, por exemplo, se uma dada posi- ção é ocupada por uma adenina em cada uma das duas moléculas de DNA, então elas são idênticas naquela posição. Por exemplo, se 7 posições em uma seqüência de comprimento de 10 nucleotídeos são idênticas às posi- ções correspondentes em uma segunda seqüência de 10 nucleotídeos, en- tão as duas seqüências têm 70% de identidade de seqüência. O compri- mento de seqüências de comparação em geral será pelo menos 50 nucleotí- deos de preferência pelo menos 60 nucleotídeos, mais de preferência pelo menos 75 nucleotídeos e mais de preferência 100 nucleotídeos. Identidade de seqüência é tipicamente medida usando-se programa de análise de se- qüência (por exemplo, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 Uni- versity Avenue, Madison, Wl 53705). A presente invenção compreende um vetor que compreende uma seqüência de DNA que codifica um gene que codifica uma proteína imunorreativa de 120 kDa Ehrlichia canis e o dito vetor é capaz de replicação em um hospedeiro que compreende, em ligação operável: a) uma origem de replicação; b) um promotor; e c) uma seqüência de DNA que codifica a dita proteína. De preferência, o vetor da presente invenção contém uma porção da seqüência de DNA mostrada em SEQ ID NO: 8. Um "vetor" pode ser de- finido como um construto de ácido nucléico replicável, por exemplo, um plasmídio ou um ácido nucléico viral. Vetores podem ser usados para ampli- ar e/ou expressar ácido nucléico que codifica uma proteína imunorreativa de 120 kDa de Ehrlichia canis. Um vetor de expressão é um construto replicável em que uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica um polipeptídeo é operavelmente ligada às seqüências de controle adequadas capaz de afetar expressão do polipeptídeo em uma célula. A necessidade de tais seqüências de controle variará dependendo da célula selecionada e do método de transformação escolhido. Em geral, seqüências de controle incluem um au- mentador/promotor transcripcional, sítios de ligação ribossomais de mRNA adequados, e seqüências que controlam a terminação de transcrição e tra- dução. Métodos que são conhecidos por aqueles versados na técnica po- dem ser usados para construir vetores de expressão contendo sinais de controle traducionais e transcripcionais apropriados. Ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook e outros, 1989. Molecular Clonmg A Labo- ratory Manual (2a ed), Cold Spring Harbor Press, NY. Um gene e suas se- qüências de controle de transcrição são definidos como sendo "operavel- mente ligados" se as seqüências de controle de transcrição eficazmente controlam a transcrição do gene. Vetores da invenção incluem mas não são limitados a, vetores de plasmídio e vetores virais. Vetores virais preferidos da invenção são aqueles derivados de retrovírus, adenovírus, vírus adeno- associados, vírus SV40 ou vírus de herpes.

Por uma "proteína substancialmente pura" quer se dizer uma proteína que foi separada de pelo menos alguns daqueles componentes que naturalmente a acompanham. Tipicamente, a proteína é substancial mente pura quando ela é pelo menos 60% em peso, livre das proteínas e outras moléculas de ocorrência natural com a qual ela é naturalmente associada in vivo. De preferência, a pureza da preparação é pelo menos 75%, mais de preferência pelo menos 90% e mais de preferência pelo menos 90% em peso. Uma proteína imunorreativa de 120 kDa substancialmente pura de Ehrlichia canis pode ser obtida, por exemplo, por extração de uma fonte na- tural; por expressão de uma ácido nucléico que codifica uma proteína imunorreativa de 120 kDa de Ehrlichia canis; ou por sintetização química da proteína. Pureza pode ser medida por qualquer método apropriado, por exemplo, cromatografia de coluna tal como cromatografia de imunoafinidade usando-se um anticorpo específico para uma proteína imunorreativa de 120 kDa de Ehrlichia canis, análise de HPLC ou eletroforese de gel de poliacri- lamida. Uma proteína é substancialmente livre de componentes natural- mente associados quando ela é separada de pelo menos alguns daqueles contaminantes que a acompanham em seu estado natural. Assim, uma pro- teína que é quimicamente sintetizada ou produzida em um sistema celular diferente da célula da qual ela se origina naturalmente, será por definição, substancialmente livre de seus componentes naturalmente associados. Cor- respondentemente, proteínas substancialmente puras incluem proteínas eu- carióticas sintetizadas em E. coli, outras procariotas ou qualquer outro orga- nismo em que elas não ocorrem naturalmente.

Além das proteínas de comprimento substancialmente total, a invenção também inclui fragmentos (por exemplo, fragmentos antigênicos) da proteína imunorreativa de 120 kDa de Ehrlichia canis (SEQ ID NO: 7).

Como usado aqui, "fragmento" como aplicado a um polipeptídeo, normal- mente terá pelo menos 10 resíduos, mais tipicamente pelo menos 20 resídu- os e de preferência pelo menos 30 (por exemplo, 50) resíduos de compi- mento, menos do que a seqüência intacta total. Fragmentos da proteína imunorreativa de 120 kDa de Ehrlichia canis podem ser gerados por méto- dos conhecidos por aqueles versados na técnica, por exemplo, por digestão enzimática de ocorrência natural ou proteína imunorreativa de 120 kDa re- combinante de Ehrlichia canis, por técnicas de DNA recombinantes usando- se um vetor de expressão que codifica um fragmento definido de proteína imunorreativa de 120 kDa de Ehrlichia canis, ou por síntese química. A ca- pacidade de um fragmento de candidato para exibir uma característica de proteína imunorreativa de 120 kDa de Ehrlichia canis (por exemplo, ligação a um anticorpo específico para proteína imunorreativa de 120 kDa de Ehrlichia canis) pode ser analisada por métodos descritos aqui. Proteína imunorreati- va de 120 kDa purificada de Ehrlichia canis ou fragmentos antigênicos de proteína imunorreativa de 120 kDa de Ehrlichia canis podem ser usados para gerar novas anticorpos ou para testar anticorpos existentes (por exem- plo, como controles positivos em um ensaio de diagnóstico) por emprego de protocolos padrão conhecidos por aqueles versados na técnica. Incluídos nesta invenção são anti-soros policlonais gerados por uso de proteína imunorreativa de 120 kDa de Ehrlichia canis ou um fragmento de proteína imunorreativa de 120 kDa de Ehrlichia canis como o imunógeno em, por exemplo, coelhos. Protocolos padrão para produção de anticorpo monoclo- nal ou policlonal conhecidos por aqueles versados na técnica são emprega- dos. Os anticorpos monoclonais gerados por este procedimento podem ser triados quanto a capacidade de identificar clone de cDNA de Ehrlichia canis recombinantes e de distingui-los de clones de cDNA conhecidos.

Incluídos ulteriormente nesta invenção são fragmentos da pro- teína imunorreativa de 120 kDa de Ehrlichia canis que são codificados pelo menos em parte por porções de SEQ ID NO: 7, por exemplo, produtos de eventos de processamento de proteína alternativos ou união de mRNA alter- nativos, ou em que uma seção da seqüência foi deletada. O fragmento ou a proteína imunorreativa de 120 kDa de Ehrlichia canis intacta, pode ser co- valentemente ligado a um outro polipeptídeo, por exemplo, que age como um rótulo, um ligante ou um meio de aumentar antigenicidade. A frase "farmaceuticamente aceitável" refere-se às composições e entidades moleculares que não produzem uma reação adversa similar ou alérgica quando administradas a um ser humano. A preparação de uma composição aquosa que contém uma proteína como um ingrediente ativo é bem conhecida na técnica. Tipicamente, tais composições são preparadas como injetáveis, ou como soluções líquidas ou suspensões; formas sólidas adequadas para solução em ou suspensão em líquido antes que a injeção possa ser preparada. A preparação pode também ser emulsificada.

Uma proteína pode ser formulada para a formação de uma com- posição em uma forma de sal ou neutra. Sais farmaceuticamente aceitáveis, incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres da proteína) e que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exem- plo, ácidos clorídricos ou fosfóricos, ou tais ácidos orgânicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico e semelhantes. Sais formados com os grupos carboxila livres podem também ser derivados de bases inorgânicas, tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, de potássio, amônio, cálcio ou férri- co, e tais bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, pro- caína e semelhantes. Após a formulação, soluções serão administradas em um modo compatível com a formulação de dosagem e em tal quantidade como é terapeuticamente eficaz. As formulações são administradas em uma variedade de formas de dosagem como soluções injetáveis.

Para a administração parenteral em uma solução aquosa, por exemplo, a solução seria adequadamente tamponada se necessária e o di- luente líquido primeiramente tornado isotônico com glicose ou solução salina suficiente. Estas soluções aquosoas particulares são especialmente ade- quadas para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intra- peritoneal. A esse respeito, meios aquosos estéreis que podem ser empre- gados serão conhecidos por aqueles versados na técnica à luz da presente revelação. Por exemplo, uma dosagem poderia ser dissolvida em 1 ml de solução de NaCI isotônica e ou adicionada a 1000 ml de fluido de hipoder- móclise ou injetada no sítio proposto de infusão (ver, por exemplo, "Remin- gton’s Pharmaceutical Sciences" 15a ed., págs. 1035 -1038 e 1570- 1580).

Alguma variação em dosagem necessariamente ocorrerá dependendo da condição do indivíduo a ser tratado. A pessoa responsável pela administra- ção, em qualquer evento, determinará a dose apropriada para o indivíduo individual.

Como é bem conhecido na técnica, um dado polipeptídeo pode variar em sua imunogenicidade. É frequentemente necessário, portanto, acoplar o imunógeno (por exemplo, polipeptídeo da presente invenção) com um veículo. Veículos preferidos e exemplares são hemocianina de lapa "keyhole" (KLH) e albumina de soro humano. Outros veículos podem incluir uma variedade de linfocinas e auxiliares tais como IL2, IL4, IL8 e outros.

Meios para a conjugação de um polipeptídeo a uma proteína de veículo são bem conhecidos na técnica e incluem glutaraldeído, éster de m- maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida, carbo-diimida e benzidina bis- biazotizada. É também conhecido que o peptídeo pode ser conjugado a uma proteína por técnicas de engenheiramento genético que são bem conhecidas na técnica.

Como é também conhecido na técnica, imunogenicidade a um imunógeno particular pode ser aumentada pelo uso de estimuladores não específicos da resposta imune conhecida como auxiliares. Auxiliares preferi- dos e exemplares incluem BCG,Detox completo, (RIBI, Immunochem Rese- arch Inc.) ISCOMS e auxiliar de hidroxido de alumínio (Superphos, Biosec- tor). A preparação de vacinas que contêm seqüências de peptídeos como ingredientes ativos é geral bem entendidos na técnica, como exempli- ficada pelas patentes U.S. nos. 4.608.251; 4.601.903; 4.599.231; 4.599.230; 4.596.792; e 4.578.770, todas incorporadas aqui por referência. Tipicamente, tais vacinas são preparadas como injetáveis ou como soluções líquidas ou suspensões: formas sólidas adequadas para a solução em ou suspensão em líquido antes da injeção, podem também ser preparadas. A preparação pode também ser emulsificada. O ingrediente imunogênico ativo é frequentemente misturado com excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e compa- tíveis com o ingrediente ativo. Excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol ou semelhantes e suas com- binações. Além disso, se desejada, a vacina pode conter quantidades meno- res de substâncias auxiliares tais como agentes de umectação ou de emulsi- ficação, agentes de tamponamento de pH, ou auxiliares que aumentam a eficácia das vacinas. A proteína de 120 kDa é uma adesina potencial de Ehrlichia spp. e é diferentemente expressa sobre a superfície de células de núcleo denso de E. chaffeensis. O gene de E. canis foi ampliado por PCR usando-se inici- adores derivados das seqüências de DNA que flanqueiam o gene de E. cha- ffeensis. O gene de E. canis foi clonado, seqüenciado e foi ultra-expresso em Escherichia coli. A proteína de 120 kDa de E. canis contém 14 unidades de repetição tandem com 36 aminoácidos cada. As seqüências de DNA das repetições são 94% homólogas umas as outras. As unidades de repetição são hidrofílicas e por análise de probabilidade são preditas ser de superfície exposta. A sequência de aminoácidos totais da proteína de 120 kDa de E. canis é 30% homologa à proteína de 120 kDa de E. chaffeenis. As regiões de repetição das proteínas de 120 kDa das duas espécies partilham seqüên- cias de aminoácidos comuns que são preditas ser de superfície exposta. A proteína de 120 KDa de E. canis recombinante reagiu com soros oriundos de cachorros convalescentes de erliquiose canina. A presente invenção é destinada a um gene que codifica uma proteína imunorreativa de 120 kDa de Ehrlichia canis e uma proteína recom- binante codificada por seu tal gene. Em uma concretização da presente in- venção, é provido um gene que codifica uma proteína imunorreativa de 120 kDa de Ehrlichia canis. De preferência, a proteína tem uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e o gene tem uma seqüência de ácidos nu- cléicos de SEQ ID NO: 7. Em uma concretização preferida da presente in venção, é provido um vetor de expressão que compreende um gene que codifica uma proteína imunorreativa de 120 kDa de Ehrlichia canis e capaz de expressar o gene quando o vetor é introduzido para dentro de uma célula.

Em uma outra concretização da presente invenção, é provida uma proteína recombinante compreendendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. De preferência, a seqüência de aminoácidos é codificada por uma seqüência de ácidos nucléicos de SEQ ID NO: 7. De preferência, a proteína recombinante compreende 14 unidades de repetição tandem com 36 aminoácidos cada. Mais de preferência, as unidades de repetição são hídrofílicas. Ainda mais de preferência, a proteína recombinante é um antí- geno.

Em uma concretização preferida da presente invenção, é provido um método de produção da proteína recombinante, compreendendo as eta- pas de obtenção de um vetor que compreende uma região de expressão que compreende uma seqüência que codifica a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 operativamente ligada a um promotor; transfecção do vetor para dentro de uma célula; e cultivo da célula sob condições eficazes para expressão da região de expressão.

Como usado aqui o termo "complemento" é usado para definir o fio de ácido nucléico que se hibridizará para dar a primeira seqüência de ácidos nucléicos para formar molécula de fio duplo sob condições rigorosas.

Condições rigorosas são aquelas que permitem hibridização entre as duas seqüências de ácidos nucléicos com um alto grau de homologia, mas evita hibridização de seqüências aleatórias. Por exemplo, hibridização em baixa temperatura e/ou alta concentração iônica é denominada baixa severidade e hibridização em alta temperatura e/ou baixa concentração iônica é denomi- nada alta severidade. A concretização iônica e temperatura de severidades desejadas são entendidas serem aplicáveis a comprimentos de sonda parti- culares, ao comprimento e conteúdo de base das seqüências e à presença de formamida na mistura de hibridização.

Como usado aqui, o termo célula "engenheirada" ou "recombi- nante" tem a finalidade de se referir a uma célula para dentro da qual um gene recombinante, tal como um gene que codifica um antígeno de Ehrlichia chaffeensis foi introduzido. Portanto, células engenheiradas são distinguíveis de células de ocorrência natural que não contêm um gene recombinante- mente introduzido. Células engenheiradas são assim células tendo um gene ou genes introduzido(s) através da mão do homem. Genes recombinante- mentes introduzidos ou estarão na forma de um gene de cDNA, uma cópia de um gene genômico, ou incluirão genes posicionados adjacentes a um promotor não naturalmente associados ao gene introduzido particular. Além disso, o gene recombinante pode ser integrado no genoma de hospedeiro ou pode estar contido em um vetor, ou em genoma bacteriano transfectado para dentro da célula de hospedeiro.

Os seguintes exemplos são dados para a finalidade de ilustração de várias concretizações da invenção e não se destinam a limitar a presente invenção em qualquer forma.

Exemplo 1 Ehrlichia Cepa Oklahoma de Ehrlichia canis foi provida por Dr. Jacqueline Dawson (Centers for Disease Control, Atlanta, GA). Cepa Florida de E. canis e três isolados Carolina do Norte (Demon, DJ, e Jake) foram providos por Dr.

Edward B. Breitschwerdt (College of Veterinary Medicine, North Caroline State University, Raleigh, NC). A cepa Louisiana de E. canis foi provida por Dr. R. E. Corstvet (Louisiane State University, Baton Rouge, Louisiana). Ehr- lichiae foram cultivadas em célula DH82, uma linha de célula de tipo macró- fago canino (Dawson JE, 1991). Células DH82 foram cultivadas com um raspador de célula quando 100% das células foram infectadas com Ehrlichi- ae. As células foram centrifugadas a 17.400 x g por 20 mins. Os péletes fo- ram rompidos com um sonicador Braun-Sonic a 40 W por 30 segundos duas vezes sobre gelo. O lisado de célula foi carregado sobre gradientes descon- tínuos de 42%-36%-30% de renografina, e então foi centrifugado a 80.000 x g por 60 minutos. Ehrlichiae nas tiras leves e pesadas foram coletadas (Weiss E, 1975) e foram lavadas por centrifugação com tampão de sacaro- se-fofato-glutamato (SPG, sacarose a 218 mM, KH2P04 a 3,8 mM, KH2P04 a 7,2 mM, glutamato a 4,9 mM, pH 7,0).

Exemplo 2 Preparação de DNA DNA genômico de Ehrlichia canis foi preparado a partir de gradi- ente de densidade de renografina purificado por uso de um kit de extração de ácido nucléico IsoQuick (ORCA Research Inc., Bothell, WA) de acordo com as instruções do fabricante. DNA de plasmídio foi purificado por uso de um kit de isolamento de plasmídio de alta pureza (Boehringer Mannheim Corp. Indianapolis, IN). O produto de PCR foi purificado por uso de um kit de purificação de PCR QIAquick (QIAGEN Inc., Santa Clarita, CA).

Exemplo 3 Ampliação por PCR do Gene de Proteína de 120 kDa de E. canis Iniciadores foram projetados com base na seqüência de DNA o gene de proteína de 120 kDa de E. Chaffeenis (SEQ ID NOs: 1-6, figura 1) (Yu, X-J 1996). O gene de proteína de 120 kDa de E. canis foi ampliado por PCR com 30 ciclos de 94°C 30 segundos, 52°C minutos, e 72°C 2 mins. Pro- dutos ampliados por PCR foram clonados para dar vetor de clonagem de pCR2.1 TA (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Exemplo 4 Seqüenciação de DNA DNA foi seqüenciado com um seqüenciador de DNA ABI Prism 377 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA).

Exemplo 5 Deleção Unidirecional do Gene de Proteína de 120 kDa de E. canis A região de repetição foi deletada da extremidade 5’ do gene de proteína de 120 kDa de E. canis por uso de digestão parcial de endonuclea- se de restrição Spe I. O plasmídio pCR120 foi primeiramente totalmente di- gerido com Xba I, que tinha um sítio de divagem único sobre a seqüências de plasmídios perto da extremidade 5’ do gene de proteína de 120 kDa de E. canis. Então o plasmídio foi parcialmente digerido com Spe I. Spe I tinha um único sítio de divagem em cada repetição do gene de proteína de 120 kDa de E. canis, mas não tinha nenhum sítio de corte do lado de fora da região de repetição incluindo a sequência de vetor de plasmídio. Para se assegurar uma digestão parcial apropriadamente representativa, uma alíquota foi re- movida da mistura de digestão a cada 5 minutos. A digestão foi parada por adição de EDTA para dar uma concentração final de 50 mm e aquecimento a 70°C por 10 minutos. Depois da digestão completa com Xba I e digestão parcial com Spe I, vários números de unidades de repetição foram removi- dos (deletados) entre Xba I e cada sito de divagem Spe I para gerar DNAs de plasmídio deletados com extremidades compatíveis (Xba I na extremida- de 3’ e Spe I na extremidade 5’). A mistura digerida de enzima de restrição foi tratada com fragmento de Klenow para preencher as extremidades. A mistura de restrição foi então separada por eletroforese sobre um gel de agarose para remover os plasmídios das repetições internas uma vez que seus tamanhos moleculares eram significativamente diferentes. A mistura dos plasmídios deletados foi extraída do gel por uso de um kit de extração de gel QIAquick (QIAGEN Inc., Santa Clarita) e foi auto-ligada por uso de ligase T4. Os plasmídios deletados foram transformados em cepa de E. coli DH5 alfa e foram selecionados quanto a seqüenciação de acordo com seus tamanhos. Alternativamente, a região de repetição do gene de proteína de 120 kDa de E. canis foi unidirecionalmente deletada da extremidade 3’ por uso de Exonuclease III com um sistema de Erase-a-Base (Promega, Madi- son, Wl) de acordo com as instruções do fabricante.

Exemplo 6 Determinação do Número de Repetições no Gene de Proteína de 120 kDa de E. canis O gene de proteína de 120 kDa ampliado por PCR oriundo de todas E. canis foi clonado para dar vetor de clonagem pCR2.1 TA (Invitro- gen). O plasmídio recombinante foi primeiramente digerido totalmente com EcoR I e então foi digerido parcialmente com Spe I como descrito acima. A misturas de digestão foram separadas em um gel de agarose a 1% e vácuo foram transferidas sobre um membrana de náilon. As tiras de DNA na mem- brana de náilon foram hibridizadas com uma sonda de oligonucleotídeo que foi derivada da seqüência a montante da região de repetição do gene de proteína de 120 kDa de Ehrlichia canis. As sondas de DNA foram marcadas usando-se digoxigenin-11-dUTP com um Kit de Adição de Cauda ("Tailing") de Oligonucleotídeo de DIG (Boehringer, Mannheim Co., Indianapolis, In) de acordo com o protocolo do fabricante.

Exemplo 7 Análise de Gene Seqüência de DNA e seqüências de aminoácidos deduzidas fo- ram analisadas usando-se o pacote de programa Wisconsin GCG (Genetic Computer Group, Inc., Madison, Wl) e o programa DNASTAR (DNASTAR, Inc., Madison, Wl). A seqüência de sinal da proteína deduzida foi analisada por uso do programa PSORT (site World Wide Web em URL: http://osort.nibb.ac.ipV, que prediz a presença de seqüências de sinais pelos métodos de McGeoch (D. J. Mcgeoch, Vírus Research, 3, 271, 1985) e von Heijne (von Heijne G., 1986. Nucl. Acids Res., 14, 4683) e detecta domínios de transmembrana potenciais pelo método de Klein e outros (P. Klein, M.

Kanehisa, e C. DeLisi, Biochem. Biophys. Acta 815,468,1985).

Exemplo 8 Expressão de Gene de Proteína de 120 kDa de E. canis em E. coli Clonagem direta do gene de proteína de 120 kDa de Ehrlichia canis para dar o vetor de expressão pGEX (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) foi evitada pela ausência de sítios de divagem de endonu- clease de restrição emparelhados sobre tanto seqüências de DNA de gene de proteína de 120 kDa quanto o sítio de múltiplas clonagem do vetor de pGEX. A região de codificação do gene de proteína de 120 kDa de E. canis oriundo nucleotídeo 175 a nucleotídeo 1793 foi ampliada por uso de PCR

com um iniciador avante (SEQ ID NO: 13) e um iniciador reverso (SEQ ID NO: 14). Os produtos de PCR foram clonados para dar vetor de clonagem pCR2.1 TA (Invitrogen) para se obter o sítio de divagem de EcoR I sobre ambas as extremidades do inserto. O inserto em um plasmídio pCR2.1 re- combinante foi cortado por EcoR I e foi separado do DNA de plasmídio em um gel de agarose. O inserto foi extraído de gel de agaorse por uso de um kit de extração de gel QIAquick (QIAGEN Inc., Santa Clanta) e foi clonado para dar vetor de pGEX digerido por EcoR I. A proteína de E. canis foi ex- pressa em cepa de BL21 de E. coli como uma proteína de fusão de GST. A proteína de fusão de GST foi purificada por afinidade por uso de contas de Sefarose 4B de Glutationa (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). A proteína recombinante de 120 kDa de E. canis foi clivada da proteína de fusão de GST com trombina.

Exemplo 9 Imunização de Camundonqos Camundongos foram imunizados com proteína de 120 kDa de E. canis para produzir anti-soros. A proteína p120 recombinante foi misturada com um volume igual de auxiliar completo de Freund para a primeira injeção e com auxiliar incompleto de Freund para as injeções subseqüentes. Ca- mundongos foram imunizados intraperitonealmente ou subcutaneamente com 50 pg da fusão recombinante da proteína de 120 kDa e GST em cada uma de 4 ocasiões.

Exemplo 10 Detecção do Gene de Proteína de 120 kDa de E. canis Southern blotting foi usado para tentar detectar o gene de pro- teína de 120 kDa de E. canis. Um fragmento de DNA de 1,2 kb ampliado a partir do gene de proteína de 120 kDa de E. chaffeensis com par de iniciador de PCR pxcf3b (SEQ ID NO: 3) e pxar4 (SEQID NO: 5, figura 1) foi marcado com digoxigenin-d-UTP e foi usado como uma sonda para detectar o gene homólogo em E. canis por Southern blot. Southern blot revelou que a sonda de gene de proteína de 120 kDa de E. chaffeensis não conseguiu se hibridi- zar com DNA genômico de E. canis digerido por EcoR I sob condições em que a sonda forneceu forte hibridização com DNA genômico de E. chaffeen- sis. Este resultado indicou que gene de proteína de 120 kDa de E. canis se diferenciou substancialmente do gene de proteína de 120 kDa de E. chaffe- ensis homólogo.

Embora a similaridade total dos genes de proteína de 120 kDa de E. canis e E. chaffeensis seja baixa, era concebível que eles poderíam conter alguns domínios conservados que poderíam ser usados para projetai inicíadores de PCR que ampliariam ambos os genes de proteína de 120 kDa. Portanto, o gene de homólogo da proteína de 120 kDa em E. canis (cepa de Oklahoma) foi ulteriormente ampliado por PCR. Inicíadores deriva- dos do gene de proteína de 120 kDa de E. chaffeensis e seqüências que flanqueiam o gene tinham sido usados anterioremnte para a seqüenciação do gene de proteína de 120 kDa de E. chaffeensis (figura 1). Os três inicia- dores avantes (SEQ ID NOs: 1-3) foram emparelhados com 3 inicíadores reversos (SEQ ID NOs: 4-6) para formar nove pares de inicíadores. Resulta- dos de PCR demonstraram que DNA de E. canis não foi ampliado com inici- adores dentro da região de codificação do gene de proteína de 120 kDa de E. chaffeensis. Um fragmento de DNA de 2,5 kb foi ampliado a partir de DNA genômico do E. canis por uma par de inicíadores pxcf. 2 e pxar 3, derivado das seqüências de DNA de não codificação que flanqueiam o gene de pro- teína de 120 kDa de E. chaffeensis (figura 1).

Exemplo 11 Determinação do Número de Unidades de Repetição no Gene de Proteína de 120 kDade E. canis Southern blot foi usado para demonstrar quantas unidades de repetição o gene de proteína de 120 kDa de E. canis tinha. Análise de enzi- ma de restrição da seqüência de DNA do gene de proteína de 120 kDa da cepa Oklahoma demonstrou que todas as repetições tinham um único sítio de divagem de endonuclease Spe I. O inserto no plasmídio pCR120 foi par- cialmente digerido com Spe I. A digestão parcial de Spe I do DNA de gene de proteína de 120 kDa de E. canis produziu três espécies de fragmentos de DNA: repetições com a seqüência não repetida de extremidade 5’, as repeti- ções internas, e as repetições com seqüências não repetidas de extremida- de 3’. Depois da digestão parcial de Spe I, todos os fragmentos DNA com a seqüência de não repetição de extremidade 5’ do gene partiram do mesmo ponto (extremidade 5’ do gene), mas terminaram dentro das várias repeti- ções. Estes fragmentos de DNA foram separados sobre gel de agarose de acordo com seu comprimento que correspondia a seus números de repeti- ção. DNAs foram transferidos para uma membrana de náilon e foram usados para se hibridizar com oligonucleotídeo marcado por DIG. O oligonucleotídeo (SEQ ID NO: 15) foi derivado das sequências de DNA oriundas de nucleotí- deo 38 a 59 que estão a montante da região de repetição. Portanto, o oligo- nucleotídeo hibridizou só com os fragmentos de DNA que tinham extremida- de 5’ do gene, mas não com as repetições internas ou as repetições com extremidade 3’ do gene. Assim, numerosas tiras detectadas pela sonda de oligonucleotídeo representam numerosas repetições. Southern blot revelou uma escada de 14 tiras com incrementos de 108 pb em E. canis (figura 2).

Estes resultados indicaram que E. canis tinha 14 repetições com 108 pb cada.

Exemplo 12 Análise de Seqüência de DNA do Gene de Proteína de 120 kDa de E. canis O fragmento de DNA de E. canis ampliado por PCR foi clonado para dar vetor pCR2.1. O plasmídio recombinante resultante foi projetado como pCA120.0 DNA de plasmídio de pCA120 foi usado como modelo para a seqüenciação do inserto de DNA de E. canis. Seqüência de DNA foi obtida inicialmente por utilização de iniciadores reversos T7 e M13 que são com- plementares à seqüência de DNA de vetor que flanqueia o inserto. Seqüen- ciação subseqüente de DNA foi conseguida por condução iniciadora ("primer walking") do inserto e da deleção unidirecional de exonuclease III ou endo- nuclease de restrição do inserto no plasmídio pCA120. Análise de seqüência de DNA demonstrou que o inserto de DNA continha um quadro de leitura aberta (ORF) de 2064 nucleotídeos (SEQ ID NO: 7) que codificou 688 ami- noácidos (SEQ ID NO: 8). Este quadro de leitura aberto foi designado como o gene de proteína de 120 kDa de E. canis. Seqüências de DNA de não consenso de promotor de E. coli perto da extremidade 5’ do gene não foram encontradas. O terminal N dos aminoácidos deduzidos não partilham se- qüência de consenso com peptídeos de sinal de E. coli. Há quatorze repeti- ções tandem no gene de proteína de 120 kDa de E. canis. Cada repetição consistia em 108 nucleotídeos que codificaram 36 aminoácidos cada (figura 3). A homologia de aminoácido de todas as repetições era maior do que 94% (figura 4). Precedendo a primeira repetição há uma repetição incompleta que tem uma deleção de 7 aminoácidos (figura 3) e é 70% homóloga às outras unidades de repetição. A busca de programa FastA da base de dados de Genbank re- velou que o gene de proteína de 120 kDa de E. canis não tinha nenhuma homologia significativa com qualquer seqüência conhecida na base de da- dos. A homologia de aminoácido de proteínas de 120 kDa de E. canis (SEQ ID NO: 10) e E. chaffeensis (SEQ ID NO: 9) é 30% (figura 5). As proteínas de 120 kDa são mais conservadas sobre seu terminal N e na região de re- petição. A homologia de aminoácido é de 50% para os primeiros 32 aminoá- cidos sobre o terminal N das proteínas de 120 kDa de E. canis e E. chaffe- ensis. A homologia de seqüência de DNA é de 58% para os genes de pro- teína de 120 kDa das duas espécies. O DNA de seqüência de não codifica- ção de 340 bp a montante do gene de proteína de 120 kDa de E. canis foi seqüenciada e verificou-se que as regiões de não codificação adjacentes aos genes de proteína de 120 kDa das duas espécies de Ehrlichia tinham 84% de homologia.

Exemplo 13 Localização Prevista e Antigenicidade da Proteína de 120 kDa de E. canis A seqüência de aminoácidos deduzida do gene de proteína de 120 kDa de E. canis foi analisada quanto a hidrofobicidade, probabilidade de susperfície, e antigenicidade com o programa de Proteína do Software La- sergene (DNASTRA Inc., Madison, Wl). Todas as unidades de repetição são previstas ser hidrofílicas e de superfície exposta (figuras 6). Comparação das proteínas de 120 kDa de E. canis e E. chaffeensis demonstrou que to- das as unidades de repetição em ambas as proteínas são preditas para se- rem de superfície exposta. As regiões de superfície exposta das repetições têm aminoácidos comuns nas duas espécies ehrlichial (SEQ ID NOs: 11-12, figura 7). Estes resultados sugerem que a proteína de 120 kDa de E. canis é uma proteína de membrana externa. Os aminoácidos hidrofílicos nas repeti- ções podem ter as porções de superfície exposta da proteína.

Análise de proteínas com o método de Jameson-Wolf que prediz determinantes antigênicos potenciais indicou que tanto proteína de 120 kDa de E. canis quanto de E. chaffeensis eram muito prováveis de serem alta- mente antigênicas (figura 6). Análise das proteínas com o método de Ro- thbard-Taylor, que localiza determinantes antigênicos de T-linfócito potenci- ais, demonstrou que a proteína de 120 kDa de E. canis tinha alguns epítopos de célula T e todos eles localizados sobre as seqüências externas do domí- nio de repetição. Em contraste com isso, cada repetição da proteína de 120 kDa de E. chaffeensis tinha dois epítopos de célula T.

Exemplo 14 Genes Homólogos em Outras Cepas de E. canis PCR foi usado para ampliar gene de proteína de 120 kDa oriun- do de outras cepas de E. canis. O fragmento de DNA de 2,5 kb foi ampliado a partir de todas as cepas de E. canis incluindo Cepas Florida, Louisiana e três isolados caninos Carolina do Norte: Demon, DJ e Jake com iniciadores PXCÍ2-2 e PXAr3. Os segmentos de gene de proteína de 120 kDa de todas as cepas de E. canis foram seqüenciados tanto sobre as extemidades 5’ quanto 3’. Análise de seqüência de DNA demonstrou que as seqüências de DNA a montante e a jusante da região de repetição eram idênticas entre to- das as cepas de E. canis. A região de repetição completa para todas as ce- pas de E. canis não foi seqüenciada uma vez que o gene tinha de ser dele- tado para a seqüenciação. Apenas a última repetição de todas as cepas e a primeira repetição de cepa DJ foi seqüenciada. A seqüência da primeira re- petição de cepas DJ e Oklahoma era idêntica. A seqüência da última repeti- ção era idêntica entre todas as cepas. A homologia do gene de proteína de 120 kDa oriundo de todas as cepas E. canis foi ulteriormente demonstrada por seus mapas físicos de restrição de Spe I idênticos (figura 8).

Exemplo 15 SDS-PAGE e Western Blot O gene de proteína de 120 kDa de E. canis foi ultra-expresso em E. coli (figura 9). A proteína recombinante codificada por um fragmento de DNA de 1620 bp incluindo a região de repetição total do gene de proteína de 120 kDa foi expressa como uma proteína de fusão de GST. O tamanho mo- lecular estimado da proteína de fusão sobre gel de SDS foi cerca de 140 kDa, que é muito maior do que a massa molecular prevista da proteína de 120 kDa de E. canis total, que é de apenas 73,6 kDa com base nos aminoá- cidos deduzidos da sequência de DNA (figura 9). Anticorpos de camundongo para a proteína de 120 kDa recombinante reagida com uma proteína de 120 kDa de E. canis (figura 10). Soros de anti-E. canis canino também reagiram com a proteína de 120 kDa de E. canis recombinante (figura 11).

Exemplo 16 Discussão Embora Ehrlichia spp. sejam bactérias obrigatoriamente intrace- lulares, nem o gene de adesina nem o gene de invasina de ehrlichial foi identificado. O gene de proteína de 120 kDa de E. chaffeensis foi anterior- mente clonado e foi seqüenciado (Yu 1997). A proteína de 120 kDa de E. chaffeensis foi recentemente demonstrada ser uma proteína de membrana externa que é preferencialmente expressa sobre a forma ultra-estrutural de núcleo denso de E. chaffeensis, mas não sobre a célula reticular. Uma cepa não aderente, não invasiva de E. coli que expressa a proteína de 120 kDa adquiriu a capacidade de aderência e de entar para dentro das células de mamífero cultivadas. Estes resultados sugerem que a proteína de 120 kDa podería ser uma adesina ou invasina, e, portanto, seria um candidato de va- cina.

Ehrlichia canis e E. chaffeensis são geneticamente e antigeni- camente espécies proximamente correlatas. As homologias entre as E. canis e E. chaffeensis são de 98% para o gene de rRNA 16 S e de 89% para o gene nadA (Yu 1997). Uma vez que a proteína de 120 kDa parece ser im- portante na ligação e entrada de E. chaffeensis e as duas espécies de Ehrli- chia são proximamente relacionadas, levanta-se a hipótese de que um aná- logo do gene de proteína de 120 kDa de E. chaffeensis pode existir em E. canis e possui funções biológicas similares. A hipótese foi confirmada por ampliação de PCR do gene de proteína de 120 kDa de E. canis com inicia- dores derivados do gene de E. chaffeensis. No entanto, a homologia de DNA do gene de proteína de 120 kDa de E. canis difenciou-se substancialmente do gene homólogo de E. chaffeensis. A homologia dosgenes de proteína de 120 kDa de E. canis e de E. chaffeenis é de apenas 30%. A baixa homologia dos genes destas duas espécies de Ehrlichia pode explicar a falta de hibridi- zação por Southern blotting de DNA de E. canis com uma sonda de gene de proteína de 120 kDa de E. chaffeensis e a falta de ampliação de PCR do gene de E. canis com iniciadores derivados da região de codificação do ge- ne de proteína de 120 kDa de E. chaffeensis. É surpreendente que as se- quências de não codificação qué flanqueiam os genes de proteína de 120 kDa são mais conservadas do que as seqüências de codificação dos genes de proteína de 120 kDa de E. canis e E. chaffeensis. A partir de um ponto de vista evolutivo, a seqüência de codificação que está sob pressão de seleção seria esperada ser mais conservada do que a seqüência de não codificação em que a mutação não seria esperada afetar a sobrevivência do organismo.

Embora a homologia dos genes de proteína de 120 kDa de E. canis e E. chaffeensis não seja, significativa, acredita-se que o gene de E. canis seja o homólogo da proteína de 120 kDa de E. chaffeensis conside- rando que ele esteja localizado em posições similares no genoma respecti- vo; eles são 30% homólogos; e especialmente eles partilham pedaços co- muns na região de repetição. No entanto, tanto a seqüência de aminoácidos quanto o número de repetições nos genes de proteína de 120 kDa de E. chaffeensis e E. canis são diferentes. A proteína de 120 kDa de E. chaffeen- sis contém 4 repetições com 80 aminoácidos cada, e a proteína de 120 kDa de E. canis contém 14 repetições com 36 aminoácidos cada. No entanto, as repetições em ambas as proteínas são hidrofílicas e são preditas ser de su- perfície exposta. Mesmo o número total de regiões de superfície exposta das duas proteínas é muito próximo apesar da diferença no número de repetição.

As unidades de repetição de ambas as proteínas partilham um pedaço co- mum que consiste em aminoácidos idênticos que são hidrofílicos e formam o núcleo das regiões de superfície exposta destas proteínas. As unidades de repetição de ambas as proteínas são ricas em serina e ácido glutâmico. Se- rina e ácido glutâmico cada um compreendem 19% dos aminoácidos da uni- dade de repetição de E. canis. Ácido glutâmico e serina compreendem de 22% e 15% dos aminoácidos das unidades de repetição de E. chaffeensis respectivamente. Embora uma sequência de sinal não tenha sido encontra- da no terminal N dos aminoácidos deduzidos da proteína de 120 kDa de E. canis pelo programa de prognóstico de localização de proteína PSORT, no entanto, acredita-se que a proteína de 120 kDa de E. canis seja uma proteí- na de superfície similar à proteína de 120 kDa de E. chaffeensis em que a seqüência de sinal está também ausente (Yu 1997).

Como o gene de proteína de 120 kDa de E. chaffeensis, a mas- sa molecular predita da proteína de 120 kDa de E. canis é muito maior do que o tamanho molecular estimado pela mobilidade eletroforética da proteí- na por SDS-PAGE. O mesmo fenômeno foi relatado para outras proteínas contendo domínios de repetição, incluindo Anaplasma marginale (Allred DR e outros 1990), Plasmodium (Kemp DJ 1987), Staphylococcus aureus (Ho- llingshead 1986, Signas 1989), e as proteínas de 100 kDa e de 130 kDA de ehrlichia granulocítica humana (HGE) (Storey JR 1998). As unidades de re- petição das proteínas de 100 e 130 kDa de HGE têm seqüências em co- muns com aquelas da proteína de 120 kDa de E. chaffeensis (Storey, 1998). A migração anômala das proteínas de 120 kDa de E. canis e de E. chaffee- nis não é causada pelas altas percentagens de certos aminoácidos uma vez que o peso molecular da proteína é maior do que o peso molecular total dos aminoácidos preditos. A migração anômala da proteína de 120 kDa está possivelmente relacionada com a modificação pós-traducional da proteína tal como glicosilação. A modificação pós-traducional da proteína de 120 kDa de E. coli e de E. chaffeensis está atualmente sob investigação. Uma vez que a proteína de 120 kDa de E. chaffeensis foi diferentemente expressa em for- mas ultra-estruturais diferentes de E. chaffeensis, esta proteína pode de- sempenhar um papel na patogênese de infecção de E. chaffeensis. Se ou não a proteína de 120 kDa de E. canis, é preferencialmente expressa na célula de núcleo denso de E. canis está sob investigação. Embora o gene de proteína de 120 kDa da maioria das cepas de E. canis não tenha sido se- qüenciado totalmente, é razoável admitir que a seqüência de gene de pro- teína de 120 kDa seja idêntica entre todas as cepas de E. canis com base no fato de que a seqüência conhecida incluindo as regiões de não repetição bem como a primeira e a última repetição é idêntica entre as cepas de E. canis e o fato de que todas as cepas de E. canis têm o mesmo número de repetições. A homologia alta de seqüência de DNA e número idêntico de repetições do gene de proteína de 120 kDa entre as cpeas de E. canis indi- cou que cepas de E. canis são em geral menos diversificadas do que E. chaffeensis em que o número de repetições do gene de proteína de 120 kDa é diferenciado entre as cepas.

As seguintes referências são citadas aqui. 1. Allred, D.R., e outros, 1990. Proc. Natl. Aca. Sei. USA. 87:3220-4. 2. Anderson, B.E., e outros, 1991. J Clin Microbiol 29:2838-2842. 3. Anderson, B.E., e outros, 1992. Int J Syst Bacteriol 42:299-302. 4. Bakken, J. S., e outros, 1994. JAMA. 272:212-8. 5. Buhles, W.C. Jr., e outros, 1974. J Infect. Dis 130:357-367. 6. Chen, S. M., e outros, 1994. J Clin Microbiol 32:589-95. 7. Chen, S.M., e outros, 1994. Am J Trop Med Hyg 50:52-58. 8. Dawson J. E., e outros, 1991. J Infect Dis 163:564-567. 9. Fishbein, D.B., e outros, 1987. JAMA. 257:3100-4, 10. Greene C.E., e outros, 1984. Canine ehrlichiosis. p545-561. In C.E. Greene (ed), Clinicai microbiology and infectious diseases of the dog and cat. The W.B. Saunders Co., Philadelphia. 11. Groves, M.G., e outros, 1975. Am J Veterinary Research. 36:937-40. 12. Hollingshead, S. K., e outros, 1986. J Biol Chem 261:1677-86. 13. Kemp, D.J., e outros, 1987. Annu. Rev. Microbiol. 41:181-208. 14. Jameson, B. A., e outros, 1988. CABIO, 4:181-186. 15. Klein, P., e outros, 1985. Biochem. Biophys. Acta, 815: 468-76. 16. Lewis, G.E. Jr., e outros, 1977. American Journal of Veterinary Research. 38:1953-5. 17. Maeda, K., N. e outros, 1987. N. Engl. J. Med. 316:853-856. 18. McGeoch D. J., 1985. Virus Research 3,271-86. 19. Perez, M., e outros, 1996. J Clin Microbiol 34:2133-9. 20. Rothbard, J. B., e outros, 1988. The EMBO J 7 93-100 21. Signas, C., e outros, 1989. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:699- 703. 22. Storey, J. R., e outros, 1998. Infect, Immun, 66:1356-63. 23. von Heijne G. 1986. Nucl. Acids Res. 14: 4683-90. 24. Walker, J. S., e outros, 1970. J Am Vet Med Assoe. 157:43-55. 25. Yu, X-J., e outros, 1996. Gene. 184:149-54. 26. Yu X-J., e outros, 1997. FEMS Microbiol Letters. 154:53-8.

Quaisquer patentes ou publicações mencionadas neste relatório são indicativas dos níveis daqueles versados na técnica aos quais a inven- ção pertence. Estas patentes e publicações são incorporadas aqui por refe- rência à mesma extensão como se cada publicação individual tenha sido especificamente e individualmente indicada ser incorporada por referência.

Aquele versado na técnica prontamente apreciará que a pre- sente invenção é bem adaptada para realizar os objetivos e obter as finali- dades e vantagens mencionadas, bem como aquelas inerentes aqui. Os presentes exemplos, juntamente com os métodos, os procedimentos, os tratamentos, as moléculas e compostos específicos descritos aqui são pre- sentemente representativos das concretizações preferidas, são exemplares, e não são pretendidos como limitações o escopo da invenção. Mudanças aqui e outros usos ocorrerão por aqueles versados na técnica que estão in- cluídos dentro do espírito da invenção como definido pelo escopo das reivin- dicações.

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA <110> Walker, David H.

Yu, Xue-Jie <120> Gene de Proteína Antigênica Imunodominante de 120 Kda de Ehrlichia canis <130> D6143PCT <140> <141> 199-08-27 <150> US 09/141,047 <151 > 1998-08-27 <160> 15 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> seqüência artificial <220> <221 > ligação de iniciador <222> -341..-321 <223> Iniciador avante pxcf2-2 usado para ampliar o gene que codifica a proteína imunorreativa de 120 kDa <400> 1 gaaacaatct accgggcata c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> seqüência artificial <220> <221 > ligação de iniciador <222> -110..-56 <223> Iniciador avante pxcf3 usado para ampliar o gene de E. canis que codifica a proteína imunorreativa de 120 kDa <400> 2 gagaattgat tgtggagttg g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> sequência artificial <220> <221 > ligação de iniciador <222> 38..59 <223> iniciador avante pxcf3b usado para ampliar o gene de E. canis que codifica a proteína imunorreativa de 120 kDa <400> 3 cagcaagagc aagaagatga c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> seqüência artificial <220> <221 > ligação de iniciador <222> 1258-1237 <223> Iniciador reversa pxar5 usado para ampliar o gene de E. canis que codifica a proteína imunorreativa de 120 kDa <400> 4 atctttctct acaacaaccg g 21 <210> 5 <221> 21 <212> DNA <213> seqüência artificial <220> <221 > ligação de iniciador <222> 1454..1433 <223> iniciador reversa pxar4 usado para ampliar o gene de E. canis que codifica a proteína imunorreativa de 120 kDa <400> 5 acataacatt ccactttcaa a <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> seqüência artificial <220> <221 > ligação de iniciador <222> 49.70 <223> iniciador reversa pxar3 usado para ampliar o gene de E. canis que codifica a proteína imunorreativa de 120 kDa <400> 6 aaacaaaaaa atagcaagca a 21 <210> 7 <211> 2489 <212> DNA <213> Ehrlichia canis <220> <222> -340..2149 <223> seqüência de nucleotídeos de gene que codifica proteína imunorreativa de 120 kDa <400> 7 aaacaatcta ccgggcatac ttcaacacaa tcagtatatt tgcatcttat 50 gcacttatcg gtaacgaagt gtgtcattac agagttatta ataataaagt 100 aaccattttt attgtaatgt tttttcttgc caagttcaat taatttattg 150 tttacataag gtataaatgc ggattatggt taaattatgc atgtcgtaag 200 tataaaataa gttgataagt gttttgttat atcctaatag atataggagg 250 cattggttct atataaatgt tattttatga taaataatta atttttaaca 300 ggatgaattt gtgcaatgta tttaaattaa gaggattttt atggatattg 350 ataacaataa tgtgactaca tcaagtacgc aagataaaag tgggaattta 400 atggaagtga ttatgcgtat attaaatttt ggtaataatt cagatgagaa 450 agtaagcaat gaagacacta aagttcttgt agagagttta caacctgctg 500 tgaatgacaa tgtaggaaat ccatcaagtg aagttggtaa agaagaaaat 550 gctcctgaag ttaaagcgga agatttgeaa cctgctgtag atggtagtgt 600 agaacattca tcaagtgaag ttgggaaaaa agtatctgaa actagtaaag 650 aggaaagtac tcotgaagtt aaagcagaag atttgcaacc tgctgtagat 700 ggtagtatag aacattcatc aagtgaagtt ggagaaaaag tatctaaaac 750 tagtaaagag gaaagtactc ctgaagttaa agcagaagat ttgcaacctg 800 ctgtagatga tagtgtggaa cattcatcaa gtgaagttgg agaaaaagta 850 tctgaaacta gtaaagagga aaatactcct gaagttaaag cagaagattt 900 gcaacctgct gtagatggta gtatagaaca ttcatcaagt gaagttggag 950 aaaaagtatc taaaactagt aaagaagaaa gtactcctga agttaaagca 1000 gaagatttgc aacctgctgt agatgatagt gtggaacatt catcaagtga 1050 agttggagaa aaagtatctg aaactagtaa agaagaaaat actcctgaag 1100 ttaaagcgga agatttgcaa cctgctgtag atggtagtgt agaacattca 1150 tcaagtgaag ttgggaaaaa agtatctgaa actagtaaag aggaaagtac 1200 tcctgaagtt aaagcagaag atttgcaacc tgctgtagat gatagtgtgg 1250 aacattcatc aagtgaagtt ggagaaaaag tatctgaaac tagtaaagag 1300 gaaaatactc ctgaagttag agcagaagat ttgcaacctg ctgtagatgg 1350 tagtgtagaa cattcatcaa gtgaagttgg agaaaaagta tctgaaacta 1400 gtaaagagga aagtactcct gaagttaaag cagaagattt gcaacctgct 1450 gtagatagta gtatagaaca ttcatcaagt gaagttggga aaaaagtatc 1500 tgaaactagt aaagaggaaa gtactcctga agttaaagca gaagatttgc 1550 aacctgctgt agatggtagt gtagaacatt catcaagtga agttggagaa 1600 aaagtatctg aaactagtaa agaggaaaat actcctgaag ttaaagcaga 1650 agatttgcaa cctgctgtag atggtagtgt agaacattca tcaagtgaag 1700 ttggagaaaa agtatctgaa actagtaaag aggaaaatac tcctgaagtt 1750 aaagcggaag atttgcaacc tgctgtagat ggtagtgtag aacattcatc 1800 aagtgaagtt ggagaaaaag tatctgaaac tagtaaggaa gaaagtactc 1850 ctgaagttaa agcggaagat ttgcaacctg ctgtagatgg tagtgtggaa 1900 cattcatcaa gtgaagttgg agaaaaagta tctgagacta gtaaagaaga 1950 aagtactcct gaagttaaag cggaagattt gcaacctgct gtagatggta 2000 gtgtggaaca ttcatcaagt gaagttggag aaaaagtatc tgagactagt 2050 aaagaggaaa gtactcctga agttaaagcg gaagtacagc ctgttgcaga 2100 tggtaatcct gttcctttaa atcctatgcc ttcaattgat aatattgata 2150 ctaatataat attccattac cataaagact gtaaaaaagg ttcagctgta 2200 ggaacagatg aaatgtgttg tcctgtatca gaattaatgg ctggggaaca 2250 tgttcatatg tatggaattt atgtctatag agttcaatca gtaaaggatt 2300 taagtggtgt atttaatata gatcattcta catgtgattg taatttagat 2350 gtttattttg taggatacaa ttcttttact aacaaagaaa cagttgattt 2400 aatataatat tgtagtacgt aagctttata aaattgtata ttgaatagca 2450 agtaatgcta atgcagtatt gcttgctatt tttttgttt 2489 <210> 8 <211> 688 <212> PRT <213> Ehrlichia canis <220> <223> Sequência de aminoácidos de proteína imunorreativa de 120 kDa <400> 8 Met Asp Ile Asp Asn Asn Asn Vai Thr Thr Ser Ser Thr Gin Asp 5 10 15 Lys Ser Gly Asn Leu Met Glu Vai Ile Met Arg Ile Leu Asn Phe 20 25 30 Gly Asn Asn ser Asp Glu Lys Vai Ser Asn Glu Asp Thr Lys Vai 35 40 45 Leu Vai Glu Ser Leu Gin Pro Ala Vai Asn Asp Asn Vai Gly Asn 50 55 60 Pro Ser Ser Glu Vai Gly Lys Glu Glu Asn Ala Pro Glu Vai Lys 65 70 75 Ala Glu Asp Leu Gin Pro Ala Vai Asp Gly Sér Vai Glu His Ser 80 85 90 Ser Ser Glu Vai Gly Lys Lys Vai Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu 95 100 105 Ser Thr Pro Glu Vai Lys Ala Glu Asp Leu Gin Pro Ala Vai Asp 110 115 120 Gly Ser Ile Glu His Ser Ser Ser Glu Vai Gly Glu Lys Vai Ser 125 130 135 Lys Thr Ser Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Vai Lys Ala Glu Asp 140 145 150 Leu Gin Pro Ala Vai Asp Asp Ser Vai Glu His Ser Ser Ser Glu 155 160 165 Vai Gly Glu Lys Vai Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Asn Thr Pro 170 175 180 Glu Vai Lys Ala Glu Asp Leu Gin Pro Ala Vai Asp Gly Ser Ile 185 190 195 Glu His Ser Ser Ser Glu Vai Gly Glu Lys Vai Ser Lys Thr Ser 200 205 210 Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Vai Lys Ala Glu Asp Leu Gin Pro 215 220 225 Ala Vai Asp Asp Ser Vai Glu His Ser Ser Ser Glu Vai Gly Glu 230 235 240 Lys Vai Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Asn Thr Pro Glu Vai Lys 245 250 255 Ala Glu Asp Leu Gin Pro Ala Vai Asp Gly Ser Vai Glu His Ser 260 265 270 Ser Ser Glu Vai Gly Lys Lys Vai Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu 275 280 285 Ser Thr Pro Glu Vai Lys Ala Glu Asp Leu Gin Pro Ala Vai Asp 290 295 300 Asp Ser Vai Glu His Ser Ser Ser Glu Vai Gly Glu Lys Vai Ser 305 310 315 Glu Thr Ser Lys Glu Glu Asn Thr Pro Glu Vai Arg Ala Glu Asp 320 325 330 Leu Gin Pro Ala Vai Asp Gly Ser Vai Glu His Ser Ser Ser Glu 335 340 345 Vai Gly Glu Lys Vai Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Ser Thr Pro 350 355 360 Glu Vai Lys Ala Glu Asp Leu Gin Pro Ala Vai Asp Ser Ser Ile 365 370 375 Glu His Ser Ser Ser Glu Vai Gly Lys Lys Vai Ser Glu Thr Ser 390 385 390 Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Vai Lys Ala Glu Asp Leu Gin Pro 395 400 405 Ala Vai Asp Gly Ser Vai Glu His Ser Ser Ser Glu Vai Gly Glu 410 415 420 Lys Vai Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Asn Thr Pro Glu Vai Lys 425 430 435 Ala Glu Asp Leu Gin Pro Ala Vai Asp Gly Ser Vai Glu His Ser 440 445 450 Ser Ser Glu Vai Gly Glu Lys Vai Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu 455 460 465 Asn Thr Pro Glu Vai Lys Ala Glu Asp Leu Gin Pro Ala Vai Asp 470 475 480 Gly Ser Vai Glu His Ser Ser Ser Glu Vai Gly Glu Lys Vai Ser 485 490 495 Glu Thr Ser Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Vai Lys Ala Glu Asp 500 505 5io Leu Gin Pro Ala Vai Asp Gly Ser Vai Glu His Ser Ser Ser Glu 515 520 525 Vai Gly Glu Lys Vai Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Ser Thr Pro 530 535 540 Glu Vai Lys Ala Glu Asp Leu Gin Pro Ala Vai Asp Gly Ser Vai 545 550 555 Glu His Ser Ser Ser Glu Vai Gly Glu Lys Vai Ser Glu Thr Ser 560 565 570 Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Vai Lys Ala Glu Vai Gin Pro Vai 575 580 585 Ala Asp Gly Asn Pro Vai Pro Leu Asn Pro Met Pro Ser Ile Asp 590 595 600 Asn Ile Asp Thr Asn Ile Ile Phe His Tyr His Lys Asp Cys Lys 605 610 615 Lys Gly Ser Ala Vai Gly Thr Asp Glu Met Cys Cys Pro Vai Ser 620 625 630 Glu Leu Met Ala Gly Glu His Vai His Met Tyr Gly Ile Tyr Vai 635 640 645 Tyr Arg Vai Gin Ser Vai Lys Asp Leu Ser Gly Vai Phe Asn Ile 650 655 660 Asp His Ser Thr Cys Asp Cys Asn Leu Asp Vai Tyr Phe Vai Gly 665 670 675 Tyr Asn Ser Phe Thr Asn Lys Glu Thr Vai Asp Leu Ile 680 685 <210> 9 <211> 406 <212> PRT <213> Ehrlichia chaffeensis <220> <223> sequência de aminoácidos de proteína de 120 kDa para deter- minar homologia com proteína de 120 kDa de E. canis <300> <301 > Walker, David H.

Claims (2)

1. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a sequên- cia de SEQ ID NO: 7 operativamente ligada a uma origem de replicação e a um promotor heterólogo, em que a origem de replicação e o promotor são de um organismo diferente de Erlichia canis.

2. Microorganismo transgênico, caracterizado pelo fato de que contém o vetor, como definido na reivindicação 1.