BR122021001279B1

BR122021001279B1 - Molécula de dna compreendendo elementos reguladores de plantas

Info

Publication number: BR122021001279B1
Application number: BR122021001279-2A
Authority: BR
Inventors: Stanislaw Flasinski; Charles Dietrich; Wei Wu; Zhaolong Li; Bo-Xing Qiu; Liang Guo; Jaishree M. Chittoor
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2010-01-14
Filing date: 2011-01-14
Publication date: 2022-02-08
Also published as: EP3473721B1; EP3760726A1; BR122021001271B1; BR122021001265B1; BR112012019582A2; CA3017321C; CA2786697A1; AU2018267596B2; AU2020223681A1; CA3017321A1; BR112012019582B1; AU2020223686A1; AU2020223686B2; US10301625B2; US20210230620A1; AU2020223680A1; ZA201205194B; CA3121068A1; AR079909A1; AU2011205793A1

Abstract

a presente invenção refere-se a moléculas de dna e construções, e suas sequências de nucleotídeos, úteis para a modulação da expressão do gene em plantas, e para especificar localização intracelular ou extracelular de um produto de gene de interesse. a invenção refere-se também a plantas transgênicas, células de plantas, partes de plantas e sementes compreendendo as moléculas de dna operacionalmente ligadas a polinucleotídeos transcritíveis heterólogos.

Description

REFERÊNCIA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício dos pedidos provisórios US 61/295.160 depositado em 14 de janeiro de 2010; 61/295.162 depositado em 14 de janeiro de 2010; 61/339.057 depositado em 26 de fevereiro de 2010, 61/308.919 depositado em 27 de fevereiro de 2010; 61/308.921 depositado em 27 de fevereiro de 2010; e 61/331.924 depositado em 6 de maio de 2010, todos aqui incorporados por referência na sua totalidade.

INCORPORAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] A listagem de sequência que está contida no arquivo chamado "MONS279WO_ST25.txt", que tem 1.194 KB (como medido no Microsoft Windows®) e foi criada em 11 de janeiro de 2011, está depositada com este documento por submissão eletrônica e é incorporada aqui por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A invenção refere-se ao campo da biologia molecular de plantas e engenharia genética de plantas e às moléculas de DNA úteis para modular a expressão de gene em plantas, e à especificação intracelular ou localização extracelular de um produto de gene.

ANTECEDENTES

[004] Os elementos reguladores são elementos genéticos que regulam a atividade de genes pela modulação da transcrição de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita ligada operacionalmente. Tais elementos incluem promotores, líderes, íntrons, e regiões não traduzidas 3' e são úteis no campo da biologia molecular de plantas e engenharia genética de plantas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] A presente invenção fornece novos elementos reguladores de gene e as sequências de codificação de peptídeos de trânsito para o uso em plantas. A presente invenção também fornece construções de DNA que compreendem os elementos reguladores e sequências de codificação de peptídeos de trânsito. A presente invenção também fornece células de plantas transgênicas, plantas e sementes, incluindo os elementos reguladores e/ou as sequências de codificação de peptídeos de trânsito, operacionalmente ligados a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita. A presente invenção também fornece métodos para fazer e usar os elementos reguladores, as construções de DNA compreendendo os elementos reguladores, e as células de plantas transgênicas, plantas e sementes compreendendo os elementos reguladores operacionalmente ligados a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita.

[006] Assim, em um aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de DNA compreendendo uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste em a) uma sequência com pelo menos 85 porcento de identidade de sequência para qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-323 ou SEQ ID NOs: 352-924; b) uma sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-323 ou SEQ ID NOs: 352-924; e c) um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-323 ou SEQ ID NOs: 352-924; em que o fragmento tem uma atividade reguladora de gene ou em que o peptídeo codificado funciona para localizar um polipeptídeo operacionalmente ligado dentro de uma célula; e em que referida sequência está operacionalmente ligada a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita heteróloga. Em uma modalidade, a sequência tem pelo menos 90 porcento de identidade de sequência a uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 1-323 e SEQ ID NOs: 352-924. Em uma outra modalidade, a sequência tem pelo menos 95 porcento de identidade de sequência a uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 1-323 e SEQ ID NOs: 352-924. Em certas modalidades da molécula de DNA, a sequência de DNA compreende um elemento regulador. Em algumas modalidades o elemento regulador compreende um promotor. Em modalidades particulares, a molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita heteróloga compreende um gene de interesse agronômico, um gene capaz de fornecer resistência aos herbicidas em plantas, ou um gene capaz de fornecer controle de pestes em plantas.

[007] A invenção também fornece uma célula de planta compreendendo uma construção de DNA compreendendo uma sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-323 ou SEQ ID NOs: 352-924, ou um fragmento ou variante das mesmas, em que a referida sequência está operacionalmente ligada a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita heteróloga. Em certas modalidades, a célula de planta transgênica é uma célula de planta monocotiledônea. Em outras modalidades, a célula de planta transgênica é uma célula de planta dicotiledônea.

[008] Também está incluída uma planta transgênica, ou parte da mesma, que compreende uma molécula de DNA compreendendo uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste em: a) a uma sequência com pelo menos 85 porcento de identidade de sequência para qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 -323 ou SEQ ID NOs: 352-924; b) uma sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-323 ou SEQ ID NOs: 352-924 e c) um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 - 323 ou SEQ ID: 352-924; em que o fragmento tem uma atividade reguladora de gene ou em que o peptídeo codificado funciona para localizar um polipeptídeo operacionalmente ligado dentro de uma célula, e em que a referida sequência está operacionalmente ligada a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita heteróloga. Em algumas modalidades uma planta de progênie de qualquer geração de uma tal planta transgênica, ou uma parte da mesma é fornecida. Além disso, uma semente transgênica, em que a semente compreende uma molécula de DNA é também fornecida.

[009] Em um outro aspecto, a invenção fornece uma molécula de DNA compreendendo uma sequência de DNA que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto, em que a sequência da proteína do peptídeo de trânsito codificado é selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma sequência de proteína de peptídeo de trânsito de qualquer uma das SEQ ID NOs: 324-350, e b) uma sequência de proteína de peptídeo de trânsito com pelo menos 95 porcento de identidade de sequência para qualquer uma das SEQ ID NOs: 324-350; em que a molécula de DNA de codificação de peptídeo de trânsito de cloroplasto é operacionalmente ligada a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita heteróloga. Em algumas modalidades, tal molécula de DNA compreende uma sequência de DNA que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto, em que a sequência de DNA é selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 277-284 e 289-293, 296, 301-304 e 307-316. A presente invenção fornece, assim, uma construção de DNA que codifica um tal peptídeo de trânsito de cloroplasto.

[0010] É também fornecida pela invenção uma célula de planta transgênica que compreende uma sequência de DNA que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto, em que a sequência do peptídeo de trânsito de cloroplasto é selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 324-350. Em algumas modalidades, a célula de planta transgênica é uma célula de planta monocotiledônea. Em outras modalidades, a célula de planta transgênica é uma célula de planta dicotiledônea. Uma planta transgênica, ou parte da mesma, que compreende a molécula de DNA é também contemplada pela invenção, bem como uma planta transgênica de progênie de qualquer geração, ou parte da mesma, da planta transgênica; e uma semente transgênica, cada uma compreendendo a molécula de DNA.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0011] As figuras 1a- 1c descrevem o alinhamento das variantes de tamanho correspondente para SEQ ID NOs:24-25 para o promotor de Foxtail Millet Actina 8.

[0012] As figuras 2a- 2c descrevem o alinhamento das variantes de tamanho correspondente para SEQ ID NOs:28-29 para o promotor de Foxtail Millet Alc1.

[0013] As figuras 3a- 3f descrevem o alinhamento das variantes de tamanho correspondente para SEQ ID NOs:45-46 para o promotor de Foxtail Millet Cys.

[0014] As figuras 4a- 4f descrevem o alinhamento das variantes de tamanho correspondente para SEQ ID NOs:47-48 para o promotor de Foxtail Millet Dzs.

[0015] As figuras 5a- 5c descrevem o alinhamento das variantes de tamanho correspondente para SEQ ID NOs:58-59 para o promotor de Foxtail Millet Gst.

[0016] As figuras 6a- 6C descrevem o alinhamento das variantes de tamanho correspondente para SEQ ID NOs:60-61 para o promotor de Foxtail Millet Ifr.

[0017] As figuras 7a- 7d descrevem o alinhamento das variantes de tamanho correspondente para SEQ ID NOs:64-65 para o promotor de Foxtail Millet Nrt2.

[0018] As figuras 8a- 8e descrevem o alinhamento das variantes de tamanho correspondente para SEQ ID NOs:74-75 para o promotor de Foxtail Millet Ppc.

[0019] As figuras 9a- 9f descrevem o alinhamento das variantes de tamanho correspondente para SEQ ID NOs:82-83 para o promotor de Foxtail Millet Prx3.

[0020] As figuras 10a- 10f descrevem o alinhamento das variantes de tamanho correspondente para SEQ ID NOs:88-91 para o promotor de Foxtail millet Rcc3.

[0021] As figuras 11a- 11b descrevem o alinhamento das variantes de tamanho correspondente para SEQ ID NOs:93-94 para o promotor de Foxtail Millet Ssp1.

[0022] As figuras 12a- 12d descrevem o alinhamento das variantes de tamanho correspondente para SEQ ID NOs:96-97 para o promotor de Foxtail Millet Tip.

[0023] As figuras 13a- 13d descrevem o alinhamento das variantes de tamanho correspondente para SEQ ID NOs:98-99 para o promotor de Foxtail Millet TubA2-1.

[0024] As figuras 14a- 14c descrevem o alinhamento das variantes de tamanho correspondente para SEQ ID NOs:102-103 para o promotor de Foxtail Millet Ubq1.

[0025] A figura 15 representa configurações de cassetes de transgenes da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0026] A invenção divulgada aqui fornece moléculas de polinucleotídeos tendo atividade reguladora de gene benéfica ou outras atividades a partir de foxtail millet, Setaria italica. O projeto, construção e uso destas moléculas de polinucleotídeos são um objeto da presente invenção. As sequências de nucleotídeos destas moléculas de polinucleotídeos são fornecidas entre a SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 323 e SEQ ID NO: 352 através de SEQ ID NO: 1060. Estas moléculas de polinucleotídeos são, por exemplo, capazes de afetar a expressão de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita operacionalmente ligada em tecidos de plantas, ou de efetuar a localização de um produto de gene codificado e, portanto, pode regular seletivamente a expressão do gene, ou a atividade de um produto de gene codificado, em plantas transgênicas. A presente invenção também fornece métodos para modificação, produção, e uso do mesmo. A invenção também inclui composições, células hospedeiras transformadas, plantas transgênicas, e sementes que contêm os promotores e/ou outras sequências de nucleotídeos de S. Italica divulgadas, e métodos para a preparação e uso das mesmas.

[0027] As seguintes definições e métodos são fornecidos para definir melhor a presente invenção e para guiar os versados na técnica na prática da presente invenção. Salvo indicação em contrário, os termos devem ser entendidos de acordo com o uso convencional por aqueles com conhecimentos comuns na técnica relevante.

Moléculas de DNA

[0028] Como usado aqui, o termo “DNA” ou “molécula de DNA” refere-se a uma molécula de DNA de fita dupla de origem genômica ou sintética, ou seja, um polímero de bases de desoxirribonucleotídeo ou uma molécula de polinucleotídeo,lida a partir da extremidade 5' (a montante) para a extremidade 3' (a jusante). Tal como usado aqui, o termo "sequência de DNA" refere-se à sequência de nucleotídeos de uma molécula de DNA. A nomenclatura usada aqui é aquela exigida pelo Título 37 do Código dos Estados Unidos de Regulamentos Federais § 1.822 e as estabelecidas nas tabelas no padrão WIPO ST.25 (1998), apêndice 2, Tabelas 1 e 3.

[0029] Tal como usado aqui, o termo "molécula de DNA isolada" refere-se a uma molécula de DNA pelo menos parcialmente separada de outras moléculas, normalmente associadas no seu estado nativo ou natural. Em uma modalidade, o termo "isolado" refere-se a uma molécula de DNA que está pelo menos parcialmente separada dos ácidos nucleicos que normalmente flanqueiam a molécula de DNA no seu estado nativo ou natural. Assim, as moléculas de DNA fundidas a sequências reguladoras ou de codificação com as quais não estão normalmente associadas, por exemplo, como resultado de técnicas recombinantes, são consideradas isoladas aqui. Tais moléculas são consideradas isoladas mesmo quando integradas no cromossoma de uma célula hospedeira ou presentes em uma solução de ácido nucleico com outras moléculas de DNA.

[0030] Qualquer número de métodos bem conhecidos dos versados na técnica pode ser usado para isolar e manipular uma molécula de DNA, ou fragmento da mesma, divulgada na presente invenção. Por exemplo, a tecnologia de PCR (reação em cadeia da polimerase) pode ser usada para amplificar uma molécula de DNA de partida particular e/ou para produzir variantes da molécula original. As moléculas de DNA, ou fragmentos das mesmas, podem também ser obtidas por outras técnicas, tais como por síntese de forma direta do fragmento por meios químicos, como é comumente praticado pelo uso de um sintetizador de oligonucleotídeos automático.

[0031] Tal como usado aqui, o termo "identidade de sequência" refere-se à extensão a qual duas sequências de polinucleotídeos alinhadas otimamente ou duas sequências de polinucleotídeos alinhadas otimamente são idênticas. Um alinhamento da sequência ótimo é criado pelo alinhamento manual de duas sequências, por exemplo, uma sequência de referência e uma outra sequência, para maximizar o número de fósforos de nucleotídeos coincide no alinhamento de sequências com inserções, deleções, ou ausências (gaps) de nucleotídeos internos adequados. Tal como usado aqui, o termo "sequência de referência" refere-se a uma sequência fornecida como as sequências de polinucleotídeos das SEQ ID NOs: 1 a 323 e 352 até 924 ou das sequências de polinucleotídeos de SEQ ID NOs: 324 até 350.

[0032] Como usado aqui, o termo "percentual de identidade de sequência" ou "percentual de identidade" ou "% de identidade" é a fração de identidade vezes 100. A "fração de identidade" para uma sequência otimamente alinhada com uma sequência de referência é o número de coincidências de nucleotídeos no alinhamento ótimo, dividido pelo número total de nucleotídeos na sequência de referência, por exemplo, o número total de nucleotídeos no comprimento completo da sequência de referência inteira. Assim, uma modalidade da invenção é a uma molécula de DNA compreendendo uma sequência que, quando otimamente alinhada com uma sequência de referência, fornecida aqui como SEQ ID NOs: 1 a 323 e 352 até 924, tem cerca de 85 porcento de identidade ou superior, cerca de 90 porcento de identidade ou superior, cerca de 95 porcento de identidade ou superior, ou, pelo menos, 96 porcento de identidade, 97 porcento de identidade, 98 porcento de identidade, ou 99 porcento de identidade com a sequência de referência e tem uma atividade reguladora de gene.

Elementos reguladores

[0033] Um elemento regulador é uma molécula de DNA tendo atividade reguladora de gene, isto é, uma que tem a capacidade de afetar a transcrição e/ou tradução de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita operacionalmente ligada. O termo "atividade reguladora de gene" refere-se, assim, à capacidade de afetar o padrão de expressão de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita operacionalmente ligada afetando a transcrição e/ou tradução da molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita operacionalmente ligada. A atividade reguladora de gene pode ser positiva e/ou negativa e o efeito pode ser caracterizado pelas suas qualidades temporais, espaciais, de tecido, de desenvolvimento, do meio ambiente, fisiológicas, patológicas, de ciclo celular, e/ou responsivas quimicamente, bem como por indicações quantitativas ou qualitativas.

[0034] Elementos reguladores, tais como promotores, líderes, íntrons e regiões de terminação de transcrição são moléculas de DNA que têm atividade reguladora de gene e desempenham um papel fundamental na expressão global de genes em células vivas. O termo "elemento regulador" refere-se a uma molécula de DNA tendo atividade reguladora de gene, isto é, uma que tem a capacidade de afetar a transcrição e/ou tradução de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita operacionalmente ligada. Elementos reguladores isolados, tais como promotores e líderes, que funcionam nas plantas são, portanto, úteis para modificar fenótipos de plantas através dos métodos de engenharia genética.

[0035] Elementos reguladores podem ser caracterizados pelo seu padrão de expressão, ou seja, como constitutiva e/ou pelo seu padrão de expressão temporal, espacial, de desenvolvimento, de tecido, do meio ambiente, fisiológico, de ciclo celular, patológico e/ou responsivo quimicamente, e qualquer combinação dos mesmos, bem como por indicações quantitativas ou qualitativas. Um promotor é útil como um elemento regulador para a modulação da expressão de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita operacionalmente ligada.

[0036] Como usado aqui, um "padrão de expressão de gene" é qualquer padrão de transcrição de uma molécula de DNA operacionalmente ligada a uma molécula de RNA transcrito. A expressão pode ser caracterizada pelas suas qualidades temporais, espaciais, de tecido, de desenvolvimento, do meio ambiente, fisiológicas, patológicas, de ciclo celular, e/ou responsivas quimicamente, bem como por indicações quantitativas ou qualitativas. A molécula de RNA transcrito pode ser traduzida para produzir uma molécula de proteína ou pode fornecer uma molécula de RNA antissenso ou outra molécula de RNA reguladora, tal como um dsRNA, uma tRNA, um rRNA, um miRNA, e semelhantes.

[0037] Como usado aqui, o termo “expressão da proteína” é qualquer padrão de tradução de uma molécula de RNA transcrito em uma molécula de proteína. A expressão de proteína pode ser caracterizada pelas suas qualidades temporais, espaciais, de desenvolvimento, ou morfológicas, bem como por indicações quantitativas ou qualitativas.

[0038] Tal como usado aqui, o "promotor" refere-se geralmente a uma molécula de DNA que está envolvida no reconhecimento e ligação da RNA polimerase II e outras proteínas (fatores de transcrição trans- atuantes) para iniciar a transcrição. Um promotor pode ser inicialmente isolado a partir da região 5' não traduzida (5' UTR) de uma cópia genômica do gene. Como alternativa, os promotores podem ser moléculas de DNA manipuladas ou produzidas sinteticamente. Os promotores podem também ser quiméricos, ou seja, um promotor produzido através da fusão de duas ou mais moléculas de DNA heterólogo. Os promotores úteis na prática da presente invenção incluem SEQ ID NOs: 23 até 105 e SEQ ID NOs: 353 até 536 ou fragmentos ou variantes destes.

[0039] Em uma modalidade, os fragmentos são fornecidos de uma sequência de promotor divulgada aqui. Os fragmentos de promotor podem exibir atividade de promotor, e podem ser úteis por si sós ou em combinação com outros promotores e fragmentos de promotor, tal como na construção de promotores quiméricos. Em modalidades específicas, os fragmentos de um promotor são fornecidos compreendendo pelo menos cerca de 50, 95, 150, 250, 500, ou cerca de 750 nucleotídeos contíguos de uma molécula de polinucleotídeo possuindo atividade de promotor aqui revelado.

[0040] Um fragmento de promotor ou promotor pode também ser analisado para a presença de elementos de promotor conhecidos, isto é, as características da sequência de DNA, tais como um TATA-box e outros fatores de transcrição conhecidos que se ligam a motivos do sítio. A identificação de tais elementos de promotor conhecidos pode ser usada por uma pessoa versada na técnica para projetar variantes de promotor tendo um padrão de expressão semelhante ao promotor original.

[0041] Tal como usado aqui, o termo "potenciador" ou "elemento potenciador" refere-se a um elemento regulador transcricional cis- atuante, também conhecido como elemento-cis, que confere um aspecto do padrão de expressão geral, mas é geralmente insuficiente individualmente para dirigir a transcrição, de uma sequência de polinucleotídeos operacionalmente ligada. Ao contrário dos promotores, os elementos potenciadores não costumam incluir um sítio de início de transcrição (TSS) ou TATA-box. Um promotor pode, naturalmente, compreender um ou mais elementos potenciadores que afetam a transcrição de uma sequência de polinucleotídeos ligada operacionalmente. Um elemento potenciador isolado também pode ser fundido com um promotor para produzir um elemento-cis.promotor quimérico, que confere um aspecto da modulação global da expressão do gene. Um fragmento de promotor ou promotor pode compreender um ou mais elementos potenciadores que afetam a transcrição de genes operacionalmente ligados. Acredita-se que muitos elementos potenciadores de promotor se ligam às proteínas de ligação a DNA e/ou afetam a topologia do DNA, produzindo conformações locais que seletivamente permitem ou restringem o acesso da RNA polimerase para o molde de DNA ou que facilitam a abertura seletiva da dupla hélice no local de iniciação da transcrição. Um elemento potenciador pode funcionar para ligar fatores de transcrição que regulam a transcrição. Alguns elementos potenciadores ligam mais do que um fator de transcrição, e os fatores de transcrição podem interagir com afinidades diferentes com mais do que um domínio potenciador. Os elementos potenciadores podem ser identificados por um número de técnicas, incluindo análise de deleção, ou seja, deleção de um ou mais nucleotídeos a partir da extremidade 5' ou interna a um promotor; análise da proteína de ligação a DNA usando footprinting com DNase I, interferência de metilação, ensaios de troca de mobilidade por eletroforese, footprinting genômico in vivo por PCR mediada por ligação, e outros ensaios convencionais; ou por análise de similaridade de sequência de DNA usando motivos de elemento-cis conhecidos ou elementos potenciadores como uma sequência alvo ou motivo alvo com métodos de comparação de sequências de DNA convencionais, como BLAST. A estrutura fina de um domínio potenciador pode ser ainda estudada por mutagênese (ou substituição) de um ou mais nucleotídeos ou por outros métodos convencionais. Elementos potenciadores podem ser obtidos por síntese química ou por isolamento a partir de elementos reguladores que incluem tais elementos, e eles podem ser sintetizados com nucleotídeos de flanqueamento adicionais que contêm sítios de enzimas de restrição úteis para facilitar a manipulação de subsequência. Assim, o projeto, construção e uso de elementos potenciadores de acordo com os métodos divulgados aqui para a modulação da expressão de moléculas de polinucleotídeos transcritíveis operacionalmente ligadas são englobados pela presente invenção.

[0042] Tal como usado aqui, o termo "líder" refere-se a uma molécula de DNA isolada a partir da região 5' não traduzida (5' UTR) de uma cópia genômica de um gene e definida em geral como um segmento de nucleotídeo entre o sítio de início da transcrição (TSS) e o sítio de início da sequência de codificação de proteína. Alternativamente, os líderes podem ser elementos de DNA produzidos ou manipulados sinteticamente. Um líder pode ser usado como um elemento regulador 5' para modulação da expressão de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita operacionalmente ligada. As moléculas líderes podem ser usadas com um promotor heterólogo ou com o seu promotor nativo. As moléculas de promotor da presente invenção podem assim ser operacionalmente ligadas ao seu líder nativo ou podem ser operacionalmente ligadas a um líder heterólogo. Os líderes úteis na prática da presente invenção incluem SEQ ID NOs: 106 até 171 e SEQ ID NOs: 537 até 588 ou fragmentos ou variantes das mesmas.

[0043] Tal como usado aqui, o termo "quimérico" refere-se a uma única molécula de DNA produzida por fusão de uma primeira molécula de DNA a uma segunda molécula de DNA, onde nem a primeira nem a segunda molécula de DNA seria normalmente encontrada naquela configuração, ou seja, fundida com a outra. A molécula de DNA quimérica é, assim, uma nova molécula de DNA de outra forma não normalmente encontrada na natureza. Tal como usado aqui, o termo "promotor quimérico" refere-se a um promotor produzido através da tal manipulação de moléculas de DNA. Um promotor quimérico pode combinar dois ou mais fragmentos de DNA; um exemplo seria a fusão de um promotor de um elemento potenciador. Assim, o projeto, construção e uso de promotores quiméricos de acordo com os métodos aqui divulgados para a modulação da expressão das moléculas de polinucleotídeos transcritíveis operacionalmente ligadas são englobados pela presente invenção.

[0044] Tal como usado aqui, o termo "variante" refere-se a uma segunda molécula de DNA que está em composição semelhante, mas não idêntica a, uma primeira molécula de DNA e, também a segunda molécula de DNA ainda mantém a funcionalidade geral, ou seja, mesmo padrão de expressão, ou similar, da primeira molécula de DNA. Uma variante pode ser uma versão mais curta ou truncada da primeira molécula de DNA e/ou uma versão alterada da sequência da primeira molécula de DNA, tal como um sítio de enzimas de restrição diferente e/ou deleções, substituições e/ou inserções internas. Uma "variante" pode também englobar um elemento regulador com uma sequência de nucleotídeos que compreende uma substituição, deleção e/ou inserção de um ou mais nucleotídeos de uma sequência de referência, em que o elemento regulador derivado tem mais ou menos ou equivalente atividade de transcrição ou tradução do que a molécula reguladora original correspondente. As "variantes" de elementos reguladores irão também englobar variantes decorrentes de mutações que ocorrem naturalmente na transformação de células bacterianas e de plantas. Na presente invenção, uma sequência de polinucleotídeos fornecida como SEQ ID NOs: 1 até 325 e 352 até 924 pode ser usada para criar variantes que são de composição semelhante, mas não idênticas a, a sequência de polinucleotídeos do elemento regulador original, enquanto ainda mantendo a funcionalidade geral, isto é, mesmo padrão de expressão, ou semelhante, do elemento regulador original. A produção de tais variantes da presente invenção está bem dentro do conhecimento do versado na técnica à luz da divulgação e está englobada no escopo da presente invenção. As "variantes" de elementos reguladores quiméricos compreendem os mesmos elementos constitutivos que uma sequência de referência, mas os elementos constitutivos que compreendem o elemento regulador quimérico podem ser operacionalmente ligados por vários métodos conhecidos na técnica, tais como, a digestão e ligação de enzimas de restrição, a clonagem independente de ligação, a montagem modular de produtos de PCR durante a amplificação, ou síntese química direta do elemento regulador, bem como outros métodos conhecidos na técnica. A "variante" do elemento regulador quimérico resultante pode ser constituída pelos mesmos, ou variantes dos mesmos, elementos constitutivos da sequência de referência, mas diferem na sequência ou sequências que compreendem a sequência ou sequências de ligação que permitem que os elementos constitutivos sejam operacionalmente ligados. Na presente invenção, uma sequência de polinucleotídeos fornecida como SEQ ID NOs: 1 a 323 e 352 a 924 fornece uma sequência de referência, em que os elementos constitutivos que compreendem a sequência de referência podem ser unidos por meio de métodos conhecidos na técnica e podem compreender substituições, deleções e/ou inserções de um ou mais nucleotídeos ou mutações que ocorrem naturalmente na transformação de células de plantas e bacterianas.

Construções

[0045] Tal como usado aqui, o termo "construção" significa qualquer molécula de polinucleotídeo recombinante tal como um plasmídeo, vírus, cosmídeo, molécula de polinucleotídeo de replicação autônoma, fago, ou molécula de polinucleotídeo de DNA ou RNA de fita simples ou de fita dupla linear ou circular, derivada a partir de qualquer fonte, capaz de integração genômica ou replicação autônoma, compreendendo uma molécula de polinucleotídeo onde uma ou mais moléculas de polinucleotídeos foram ligadas de um modo funcionalmente operativo, isto é operacionalmente ligadas. Tal como usado aqui, o termo "vetor" significa qualquer construção de polinucleotídeo recombinante que pode ser usado para o propósito de transformação, ou seja, a introdução de DNA heterólogo em uma célula hospedeira.

[0046] Tal como usado aqui, o termo "operacionalmente ligada" refere-se a uma primeira molécula unida a uma segunda molécula, em que as moléculas estão dispostas de modo que a primeira molécula afeta a função da segunda molécula. As duas moléculas podem ou não ser parte de uma única molécula contígua e podem ou não estar adjacentes. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita se o promotor modula a transcrição da molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita de interesse em uma célula.

[0047] As construções da presente invenção são geralmente construções de DNA de fronteira de plasmídeo Ti duplo que têm as regiões de fronteira direita (RB ou AGRtu.RB) e de fronteira esquerda (LB ou AGRtu.LB) do plasmídeo Ti isolado de Agrobacterium tumefaciens compreendendo um T-DNA que, juntamente com as moléculas de transferência fornecidas pelas células de A. tumefaciens, permitem a integração do T-DNA no genoma de uma célula de planta (ver, por exemplo, Patente US 6.603.061). As construções também podem conter os segmentos de DNA do esqueleto de plasmídeo que fornecem a função de replicação e seleção de antibiótico em células bacterianas, por exemplo, uma origem de replicação de Escherichia coli, tais como ori322, uma origem de replicação de faixa de hospedeiro ampla, tais como oriV ou oriRi, e uma região de codificação para um marcador selecionável tal como Spec/Strp que codifica Tn7 aminoglicosídeo adeniltransferase (aadA) que confere resistência à espectinomicina ou estreptomicina, ou um gene marcador selecionável de gentamicina (Gm, Gent). Para a transformação de plantas, a cepa bacteriana hospedeira é muitas vezes A. tumefaciens ABI, C58, ou LBA4404; no entanto, outras cepas conhecidas dos versados na técnica de transformação de plantas podem funcionar na presente invenção.

[0048] Os métodos são conhecidos na técnica para a montagem e introdução das construções em uma célula de tal maneira que a molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita é transcrita em uma molécula de mRNA funcional que é traduzido e expresso como um produto de proteína. Para a prática da presente invenção, as composições e métodos convencionais para a preparação e uso de construções e as células hospedeiras são bem conhecidos por uma pessoa versada na técnica, ver, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3° edição Volumes 1, 2, e 3 (2000) J.F. Sambrook, D.W. Russell, e N. Irwin, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Métodos para preparação de vetores recombinantes particularmente adequados para transformação de plantas incluem, sem limitação, aqueles descritos nas Patentes US Nos 4.971.908; 4.940.835; 4.769.061; e 4.757.011 nas suas totalidades. Estes tipos de vetores também têm sido revistos na literatura científica (ver, por exemplo, Rodriguez, et al., Vetors: A Survey of Molecular Cloning Vetors and Their Uses, Butterworths, Boston, (1988) and Glick, et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton, FL. (1993)). Os vetores típicos úteis para a expressão de ácidos nucleicos em plantas superiores são bem conhecidos na técnica e incluem vetores derivados do plasmídeo indutor de tumores (Ti) de Agrobacterium tumefaciens (Rogers, et al., Methods in Enzymology 153: 253-277 (1987)). Outros vetores recombinantes úteis para transformação de plantas, incluindo o vetor de controle de transferência pCaMVCN, também foi descrito na literatura científica (ver, por exemplo, Fromm, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828 (1985)).

[0049] Vários elementos reguladores podem ser incluídos em uma construção. Quaisquer tais elementos reguladores podem ser fornecidos em combinação com outros elementos reguladores. Essas combinações podem ser projetadas ou modificadas para produzir características desejáveis de regulamentação. As construções da presente invenção tipicamente compreendem pelo menos um elemento regulador operacionalmente ligado a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita operacionalmente ligado a uma molécula de terminação de transcrição 3'.

[0050] As construções da presente invenção podem incluir qualquer promotor ou líder conhecido na técnica. Por exemplo, um promotor da presente invenção pode ser operacionalmente ligado a um líder 5' não traduzido heterólogo, tal como um derivado de um gene da proteína de choque térmico (ver, por exemplo, Patentes US Nos 5.659.122 e 5.362.865). Alternativamente, um líder da presente invenção pode ser operacionalmente ligado a um promotor heterólogo, tal como o promotor de transcrito do vírus do mosaico da couve-flor 35S (ver, Patente US No 5.352.605).

[0051] Tal como usado aqui, o termo "íntron" refere-se a uma molécula de DNA que pode ser isolada ou identificada a partir da cópia genômica de um gene e pode ser definida em geral como uma região de “splice out” durante o processamento de mRNA antes da tradução. Alternativamente, um íntron pode ser um elemento de DNA produzido sinteticamente ou manipulado. Um íntron pode conter elementos potenciadores que efetuam a transcrição de genes operacionalmente ligados. Um íntron pode ser usado como um elemento regulador para modulação da expressão de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita operacionalmente ligada. Uma construção de DNA pode compreender um íntron, e o íntron pode ou não ser heterólogo em relação à sequência de molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita. Exemplos de íntrons na técnica incluem o íntron de actina de arroz (Patente US No 5.641.876) e o íntron de milho HSP70 (Patente US No 5.859.347). Íntrons úteis na prática da presente invenção incluem SEQ ID NOs: 172 até 267, SEQ ID NOs: 317 até 323 e SEQ ID NOs: 589 até 778.

[0052] Tal como usado aqui, o termo "molécula de terminação da transcrição 3'" ou "3' UTR" refere-se a uma molécula de DNA que é usada durante a transcrição para produzir a região não traduzida 3' (3' UTR) de uma molécula de mRNA. A região não traduzida 3' de uma molécula de mRNA pode ser gerada por clivagem específica e poliadenilação de 3', também conhecida como cauda poliA. A 3' UTR pode ser operacionalmente ligada a, e localizada a jusante de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita e pode incluir polinucleotídeos que fornecem um sinal de poliadenilação e outros sinais reguladores capazes de afetar a da transcrição, processamento de mRNA, ou expressão de gene. Acredita-se que as caudas PoliA funcionam na estabilidade do mRNA e na iniciação da tradução. Exemplos de moléculas de terminação de transcrição 3' na técnica são a região 3' de nopalina sintase (ver, Fraley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 4803-4807 (1983)); região 3' de trigo hsp17; região 3' de subunidade de ervilha rubisco pequena; região 3' de algodão E6 (Patente US No 6.096.950); regiões 3' divulgadas em WO0011200A2; e a 3' UTR coixin (Patente US No 6.635.806). Sequências das regiões 3' UTR úteis na prática da presente invenção são fornecidas como SEQ ID NOs: 268 até 276 e SEQ ID NOs: 779 até 924.

[0053] As 3' UTRs são um pré-requisito básico para a expressão recombinante de genes específicos. Em sistemas de animais, um maquinário de UTRs 3' foi bem definido (por exemplo, Zhao et al., Microbiol Mol Biol Rev 63:405-445 (1999); Proudfoot, Nature 322:562565 (1986); Kim et al., Biotechnology Progress 19:1620-1622 (2003); Yonaha and Proudfoot, EMBO J. 19:3770-3777 (2000); Cramer et al., FEBS Letters 498:179-182 (2001); Kuerstem and Goodwin, Nature Reviews Genetics 4:626-637 (2003)). A terminação efetiva da transcrição de RNA é necessária para impedir a transcrição indesejada de sequências não relacionadas com o traço (a jusante), que podem interferir com o desempenho do traço (veja abaixo para mais detalhes). O arranjo de múltiplos cassetes de expressão de genes em proximidade local a um outro (por exemplo, dentro de um T-DNA) pode causar supressão da expressão do gene de um ou mais genes na referida construção em comparação com as inserções independentes (Padidam and Cao, BioTechniques 31:328-334 (2001)). Isto pode interferir com a obtenção de níveis adequados de expressão, por exemplo, nos casos em que a expressão forte do gene a partir de todos os cassetes é desejada.

[0054] Em plantas, as sequências de sinal de poliadenilação claramente definidas não são conhecidas. Hasegawa et al., Plant J. 33:1063-1072, (2003)) não foram capazes de identificar as sequências de sinal de poliadenilação conservadas tanto em sistemas in vitro quanto in vivo em Nicotiana sylvestris e para determinar o comprimento real do transcrito primário (não-poliadenilado). Uma fraca 3' UTR tem o potencial para gerar leitura através, o que pode afetar a expressão dos genes localizados nos cassetes de expressão vizinhos (Padidam and Cao, BioTechniques 31:328-334 (2001)). O controle apropriado da terminação da transcrição pode impedir leitura através em sequências (por exemplo, outros cassetes de expressão) localizadas a jusante e pode ainda permitir a reciclagem eficiente de RNA polimerase, para melhorar a expressão do gene. A terminação da transcrição eficiente (liberação de RNA polimerase II a partir do DNA) é pré-requisito para a reiniciação da transcrição e, assim, diretamente afeta o nível do transcrito geral. Subsequente a sequência de terminação da transcrição, o mRNA maduro é liberado a partir do sítio de síntese e do molde para o citoplasma. Os mRNAs eucarióticos são acumulados como formas poli (A) in vivo, de modo que é difícil de detectar sítios de terminação de transcrição por métodos convencionais. No entanto, a previsão de 3' UTRs funcionais e eficientes por métodos bioinformáticos é difícil pelo fato de que não existem sequências conservadas que permitiriam a fácil predição de uma 3' UTR eficaz.

[0055] Do ponto de vista prático, é preferível que uma 3' UTR usada em um cassete de transgene possua as seguintes características. A 3' UTR deve ser capaz de terminar a transcrição do transgene de forma eficiente e eficaz e impedir leitura através do transcrito em qualquer sequência de DNA vizinha, que pode ser composta por outro cassete de transgene como no caso de múltiplos cassetes residentes em um T- DNA , ou do DNA cromossômico vizinho em que o T-DNA foi inserido. A 3' UTR não deve causar uma redução na atividade transcricional conferida pelo promotor, líder, e íntrons que são usados para dirigir a expressão do transgene. Na biotecnologia planta, a 3' UTR é frequentemente usada para a iniciação das reações de amplificação do RNA transcrito reverso extraído a partir da planta transformada e usado para (1) avaliar a atividade ou expressão de transcrição do cassete de transgene uma vez integrado no cromossoma da planta, (2 ) avaliar o número de cópias de inserções dentro do DNA das plantas; e (3) avaliar a zigosidade da semente resultante após a reprodução. A 3' UTR também é usada em reações de amplificação de DNA extraído da planta transformada para caracterizar a integridade do cassete inserido.

[0056] As 3' UTRs úteis no fornecimento de expressão de um transgene em plantas são identificadas com base na expressão de tags de sequências expressas (ESTs) em bibliotecas de cDNA feitas a partir de RNA mensageiro isolado a partir de sementes, flores, e outros tecidos derivados de Foxtail millet (Setaria italica (L. ) Beauv). Bibliotecas de cDNA são feitas a partir de tecidos isolados a partir de S. italica usando métodos conhecidos dos versados na técnica a partir de tecido de flores, sementes, folha, e raiz. Os cDNAs resultantes são sequenciados usando vários métodos de sequenciação conhecidos na técnica. Os ESTs resultantes são montados em clusters (agrupamentos) usando software bioinformático tais como clc_ref_assemble_complete versão 2.01.37139 (CLC bio EUA, Cambridge, Massachusetts 02142). A abundância do transcrito de cada agrupamento é determinada por contagem do número de cDNA lido para cada agrupamento. As 3' UTRs identificadas podem ser constituídas de sequências derivadas a partir de sequências de cDNA, assim como sequências derivadas a partir de DNA genômico. A sequência de cDNA é usada para iniciadores de projeto, que são então usados com bibliotecas de GenomeWalkerTM (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA) construídas seguindo o protocolo do fabricante para clonar a região 3' da sequência de DNA genômico correspondente para fornecer uma sequência de terminação mais longa. A análise de abundância de transcrito relativa,quer por contagens diretas ou contagens normalizadas da sequência observada lida para cada biblioteca de tecido pode ser usada para inferir propriedades sobre os padrões de expressão. Por exemplo, alguns 3' UTRs podem ser encontradas nos transcritos vistos em maior abundância no tecido da raiz, em oposição ao da folha. Isto é sugestivo de que o transcrito é altamente expresso na raiz e que as propriedades de expressão da raiz podem ser atribuíveis à regulação transcricional do promotor, do líder, íntrons ou a 3' UTR. O teste empírico de 3' UTRs identificadas pelas propriedades de expressão dentro de tipos de órgãos, tecidos ou células específicas pode resultar na identificação de 3' UTRs que potencializam a expressão naqueles tipos de órgãos, tecidos ou células específicas.

[0057] As construções e vetores podem também incluir uma sequência de codificação do peptídeo de trânsito que expressa um peptídeo ligado que é útil para o direcionamento de um produto de proteína, particularmente, para um cloroplasto, leucoplasto, ou outra organela plastidial; mitocôndrias; peroxissomas; vacúolo, ou uma localização extracelular. Para descrições de uso de peptídeos de trânsito de cloroplastos, ver Patente US No 5.188.642 e Patente US No 5.728.925. Muitas proteínas localizadoras de cloroplasto são expressas a partir de genes nucleares como precursores e são alvos para o cloroplasto por um peptídeo de trânsito de cloroplasto (CTP). Exemplos de tais proteínas de cloroplastos isolados incluem, mas não estão limitados a, aqueles associados com a subunidade pequena (SSU) da ribulose-1,5,-bifosfato carboxilase, ferredoxina, ferredoxina oxidorredutase, proteína I e proteína II do complexo de coleta de luz, tiorredoxina F, enolpiruvil chiquimato fosfato sintase (EPSPS), e os peptídeos de trânsito descritos na Patente US No 7.193.133. Foi demonstrado in vivo e in vitro que proteínas de não cloroplastos podem ser direcionadas para o cloroplasto através do uso de fusões de proteína com um CTP heterólogo e que o CTP é suficiente para ter como alvo uma proteína para o cloroplasto. A incorporação de um peptídeo de trânsito de cloroplasto adequado, tais como o Arabidopsis thaliana EPSPS CTP (CTP2) (Ver, Klee et al., Mol. Gen. Genet. 210:437-442 (1987)) ou o Petunia hybrida EPSPS CTP (CTP4) (Ver, della-Cioppa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 83:6873-6877 (1986)), demonstraram ter como alvo as alvejar as sequências de proteína de EPSPS heteróloga para cloroplastos em plantas transgênicas (ver, Patentes US Nos 5.627.061; 5.633.435 e 5.312.910 e EP 0218571, EP 189707; EP 508909 e EP 924299). As sequências que codificam peptídeos de trânsito úteis para a presente invenção são fornecidas como SEQ ID NOs: 277 até 316. As sequências de proteínas de peptídeos de trânsito úteis para a presente invenção são fornecidas como SEQ ID NOs: 324 até 350.

Moléculas de polunucleotídeo transcritíveis

[0058] Tal como usado aqui, o termo "molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita" refere-se a qualquer molécula de DNA capaz de ser transcrita em uma molécula de RNA, incluindo, mas não limitado a, aquelas tendo sequências de codificação de proteína e as tendo sequências úteis para a supressão de gene. Um "transgene" refere-se a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita heteróloga para uma célula hospedeira e/ou uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita artificialmente incorporada no genoma de uma célula hospedeira.

[0059] Um promotor da presente invenção pode ser operacionalmente ligado a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita que é heteróloga em relação à molécula de promotor. Tal como usado aqui, o termo "heteróloga" refere-se à combinação de duas ou mais moléculas de polinucleotídeos quando uma tal combinação não seria normalmente encontrada na natureza. Por exemplo, as duas moléculas podem ser derivadas de diferentes espécies e/ou as duas moléculas podem ser derivadas de genes diferentes, por exemplo, genes diferentes das mesmas espécies ou os mesmos genes de espécies diferentes. Um promotor é, assim, heterólogo em relação a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita operacionalmente ligada se uma tal combinação não é normalmente encontrada na natureza, isto é, a molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita não ocorre naturalmente operacionalmente ligada em combinação com essa molécula de promotor.

[0060] A molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita pode geralmente ser qualquer molécula de DNA para a qual a expressão de um transcrito de RNA é desejada. Tal expressão de um transcrito de RNA pode resultar na tradução da molécula de mRNA resultante e, assim, na expressão da proteína. Alternativamente, uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita pode ser projetada para, em última análise, causar a expressão diminuída de um gene ou proteína específica. Isto pode ser realizado usando uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita que é orientada na direção antissenso. Uma pessoa versada na técnica está familiarizada com o uso da tecnologia antissenso. Resumidamente, a molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita antissenso é transcrita, o produto de RNA se hibridiza com, e sequestra uma molécula de RNA complementar no interior da célula. Esta molécula de RNA dúplex não pode ser traduzida em uma proteína pelo maquinário de translação de célula e é degradado na célula. Qualquer gene pode ser regulado negativamente desta maneira.

[0061] Assim, uma modalidade da invenção é um elemento regulador da presente invenção, tais como os fornecidos como SEQ ID NOs: 1 até 276, SEQ ID NOs: 317 até 323 e 352 até 924, operacionalmente ligadas a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita para modular a transcrição da molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita a um nível desejado ou em um padrão desejado, após a introdução da referida construção em uma célula de planta. Em uma modalidade, a molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita compreende uma região de proteína codificante de um gene, e o promotor afeta a transcrição de uma molécula de RNA que é traduzida e expressa como um produto de proteína. Em uma outra modalidade, a molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita compreende uma região antissenso de um gene, e o promotor afeta a transcrição de uma molécula de RNA antissenso ou outra molécula de RNA inibidora semelhante, a fim de inibir a expressão de uma molécula de RNA específica de interesse em uma célula hospedeira alvo.

Genes de Interesse Agronômico

[0062] As moléculas de polinucleotídeos transcritíveis podem ser genes de interesse agronômico. Tal como usado aqui, o "gene de interesse agronômico" refere-se a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita que, quando expressa em um tecido de planta particular, célula, ou tipo de célula fornece uma característica desejável associada com a morfologia, fisiologia, crescimento, desenvolvimento, rendimento, produto, perfil nutricional, doença ou resistência a pestes, e/ou tolerância química ou ambiental da planta. Genes de interesse agronômico incluem, mas não estão limitados a, aqueles que codificam uma proteína de rendimento, uma proteína de resistência ao estresse, uma proteína de controle do desenvolvimento, uma proteína de diferenciação de tecidos, uma proteína de meristema, uma proteína ambientalmente sensível, uma proteína de senescência, uma proteína responsiva ao hormônio, uma proteína de abscisão, uma proteína de fonte, uma proteína sink, uma proteína de controle de flor, uma proteína da semente, uma proteína de resistência a herbicidas, uma proteína de resistência a doença, uma enzima biossintética de ácidos graxos, uma enzima de biossíntese de tocoferol, uma enzima de biossíntese de aminoácidos, uma proteína pesticida, ou qualquer outro agente tal como uma molécula de RNAi ou antissenso alvo de um gene em particular para a supressão. O produto de um gene de interesse agronômico pode atuar dentro da planta, a fim de causar um efeito sobre a fisiologia ou metabolismo da planta ou pode atuar como um agente de pesticida na dieta de uma peste que se alimenta da planta.

[0063] Em uma modalidade da invenção, um promotor da presente invenção está incorporado uma construção tal que o promotor esteja operacionalmente ligado a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita que é um gene de interesse agronômico. A expressão do gene de interesse agronômico é desejável a fim de conferir uma característica agronomicamente benéfica. Um traço agronômico benéfico pode ser, por exemplo, mas não limitado a, tolerância a herbicida, controle de insetos, rendimento modificado, resistência a doenças fúngicas, resistência a vírus, resistência a nematoides, resistência a doenças bacterianas, crescimento e desenvolvimento da planta, produção de amido, produção de óleos modificados, alta produção de óleo, teor de ácido graxo modificado, alta produção de proteína, amadurecimento dos frutos, nutrição humana e animal potencializada, biopolímeros, resistência ao estresse ambiental, peptídeos farmacêuticos e peptídeos secretáveis, traços de processamento melhorados, melhor digestibilidade, produção de enzimas, sabor, fixação de nitrogênio, produção de sementes híbridas, produção de fibras, e produção de biocombustíveis. Exemplos de genes de interesse agronômico conhecidos na técnica incluem aqueles para resistência aos herbicidas (Patentes US Nos 6.803.501; 6.448.476; 6.248.876; 6.225.114; 6.107.549; 5.866.775; 5.804.425; 5.633.435; e 5.463.175), o rendimento aumentado (Patentes US Nos USRE38.446; 6.716.474; 6.663.906; 6.476.295; 6.441.277; 6.423.828; 6.399.330; 6.372.211; 6.235.971; 6.222.098 e 5.716.837), controle de insetos (Patentes US Nos 6.809.078; 6.713.063; 6.686.452; 6.657.046; 6.645.497; 6.642.030; 6.639.054; 6.620.988; 6.593.293; 6.555.655; 6.538.109; 6.537.756; 6.521.442; 6.501.009; 6.468.523; 6.326.351; 6.313.378; 6.284.949; 6.281.016; 6.248.536; 6.242.241; 6.221.649; 6.177.615; 6.156.573; 6.153.814; 6.110.464; 6.093.695; 6.063.756; 6.063.597; 6.023.013; 5.959.091; 5.942.664; 5.942.658, 5.880.275, 5.763.245; e 5.763.241), resistência a doenças fúngicas (Patentes US Nos 6.653.280; 6.573.361; 6.506.962; 6.316.407; 6.215.048; 5.516.671; 5.773.696; 6.121.436; 6.316.407; e 6.506.962), a resistência ao vírus (Patentes US Nos 6.617.496; 6.608.241; 6.015.940; 6.013.864; 5.850.023; e 5.304.730), a resistência de nemátodos (Patente US No 6.228.992), resistência a doenças bacterianas (Patente US No 5.516.671), o crescimento e desenvolvimento das plantas (Patentes US Nos 6.723.897 e 6.518.488), a produção de amido (Patentes US Nos 6.538.181; 6.538.179 ; 6.538.178; 5.750.876; 6.476.295), produção de óleos modificados (Patentes US Nos 6.444.876; 6.426.447 e 6.380.462), produção de óleos superiores (Patentes US Nos 6.495.739; 5.608.149; 6.483.008 e 6.476.295), teor de ácidos graxos modificados (Patentes US Nos 6.828.475; 6.822.141; 6.770.465; 6.706.950; 6.660.849; 6.596.538; 6.589.767; 6.537.750; 6.489.461; e 6.459.018), alta produção de proteína (Patente US No 6.380.466), amadurecimento do fruto (Patente US No 5.512.466), nutrição humana e animal potencializada (Patentes US Nos 6.723.837; 6.653.530; 6.5412.59; 5.985.605; e 6.171.640), biopolímeros (Patentes US Nos USRE37,543; 6.228.623; e 5.958.745, e 6.946.588), resistência ao estresse ambiental (Patente US No 6.072.103), peptídeos farmacêuticos e peptídeos secretáveis (Patentes US Nos 6.812.379; 6.774.283; 6.140.075; e 6.080.560), traços de processamento melhorados (Patente US No 6.476.295), digestibilidade melhorada (Patente US No 6.531.648) rafinose baixa (Patente US No 6.166.292) e a produção de enzima industrial (Patente US No 5.543.576), sabor melhorado (Patente US No 6.011.199), fixação de nitrogênio (Patente US No 5.229.114), a produção de sementes híbridas (Patente US No 5.689.041), a produção de fibras (Patentes US Nos 6.576.818; 6.271.443; 5.981.834; e 5.869.720) e produção de biocombustível (Patente US No 5.998.700).

[0064] Alternativamente, um gene de interesse agronômico pode afetar a característica da planta acima mencionada ou fenótipo por codificação de uma molécula de RNA que causa a modulação da expressão do gene alvo de um gene endógeno, por exemplo, através de antissenso (ver por exemplo Patente US No 5.107.065); RNA inibidor ("RNAi ", incluindo a modulação da expressão do gene através de mecanismos mediados por miRNA-, siRNA-, trans-atuante siRNA-, e sRNA de fase, por exemplo, como descrito no pedidos publicados US 2006/0200878 e US 2008/0066206, e no pedido de patente US 11/974.469); ou mecanismos mediados por cossupressão. O RNA poderia também ser uma molécula de RNA catalítico (por exemplo, uma ribozima ou um riboswitch; ver, por exemplo, US 2006/0200878) construída para clivar um produto de mRNA endógeno desejado. Assim, qualquer molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita que codifica uma molécula de RNA transcrito que afeta uma mudança de interesse de morfologia ou fenótipo agronomicamente importante pode ser útil para a prática da presente invenção. Os métodos são conhecidos na técnica para a construção e introdução de construções em uma célula de tal maneira que a molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita seja transcrita em uma molécula que é capaz de causar supressão do gene. Por exemplo, a supressão do gene pós- transcricional usando uma construção com uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita orientada antissenso para regular a expressão do gene em células de plantas é divulgada nas Patentes US Nos 5.107.065 e 5.759.829, e a supressão do gene pós- transcricional usando uma construção com uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita orientada em senso para regular a expressão de genes em plantas é divulgada nas Patentes US Nos 5.283.184 e 5.231.020. A expressão de um polinucleotídeo que pode ser transcrita em uma célula de planta pode também ser usada para suprimir pestes de plantas que se alimentam na célula de planta, por exemplo, composições de isoladas de pestes de coleópteranos (publicação de Patente US US20070124836) e composições isoladas de pestes de nematoides (publicação de Patente US US20070250947). As pestes de plantas incluem, mas não estão limitadas a, pestes de artrópodes, pestes de nematoides, e pestes causadas por fungos ou microbianas. Exemplos de moléculas de polinucleotídeos transcritíveis para a incorporação em construções da presente invenção incluem, por exemplo, moléculas ou genes de DNA a partir de uma espécie diferente da espécie alvo ou genes que se originam com ou estão presentes na mesma espécie, mas são incorporados em células receptoras por métodos de engenharia genética em vez de reprodução clássica ou técnicas de reprodução. O tipo de molécula de polinucleotídeo pode incluir, mas não está limitada a, uma molécula de polinucleotídeo que já está presente na célula da planta, uma molécula de polinucleotídeo de outra planta, uma molécula de polinucleotídeo a partir de um organismo diferente, ou uma molécula de polinucleotídeo gerada externamente, tal como uma molécula de polinucleotídeo contendo uma mensagem antissenso de um gene, ou uma molécula de polinucleotídeo que codifica uma versão artificial, sintética, ou de outra forma modificada de um transgene.

Marcadores selecionáveis

[0065] Como usado aqui o termo "marcador" se refere a qualquer molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita cuja expressão, ou a falta dela, pode ser rastreada para ou pontuada de alguma forma. Os genes marcadores para uso na prática da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, moléculas de polinucleotídeos transcritíveis que codificam β-glucuronidase (GUS descritas na Patente US No 5.599.670), proteína fluorescente verde e suas variantes (GFP descrita nas Patentes US Nos 5.491.084 e 6.146.826), proteínas que conferem resistência a antibióticos, ou proteínas que conferem tolerância a herbicida. Marcadores de resistência a antibióticos úteis, incluindo os que codificam proteínas que conferem resistência à canamicina (nptII), higromicina B (aph IV), estreptomicina ou espectinomicina (aad, spec/strep) e gentamicina (aac3 e aacC4) são conhecidos na técnica. Herbicidas para o qual a tolerância da planta transgênica foi demonstrada e o método da presente invenção pode ser aplicado, incluem, mas não estão limitados a: ácido amino-metil-fosfônico, glifosato, glufosinato, sulfonilureias, imidazolinonas, bromoxinil, delapona, dicamba, ciclohezanediona, inibidores de protoporfirinogênio oxidase e herbicidas de isoxasflutol. As moléculas de polinucleotídeos transcritíveis que codificam para proteínas envolvidas na tolerância a herbicida são conhecidas na técnica, e incluem, mas não estão limitadas a, uma molécula polinucleotídeo que pode ser transcrita que codifica 5- enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS para a tolerância ao glifosato descrito nas Patentes US Nos 5.627.061; 5.633.435; 6.040.497; e 5.094.945); uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita que codifica uma glifosato oxidoredutase e um glifosato-N-acetil- transferase (GOX descrito nas Patentes US Nos 5.463.175; GAT descrito na publicação de Patente US 20030083480, e dicamba monoxigenase na publicação da Patente US 20030135879); uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita que codifica bromoxinil nitrilase (Bxn para tolerância de Bromoxinil descrito na Patente US No 4.810.648); uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita que codifica fitoeno dessaturase (crtI) descrito em Misawa, et al., Plant Journal 4:833-840 (1993) e Misawa, et al., Plant Journal 6:481-489 (1994) para a tolerância a norflurazona;. uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita que codifica acetohidroxiácido sintase (AHAS, também conhecido como ALS) descrito em Sathasiivan, et al., Nucl. Acids Res. 18:2188-2193 (1990) para a tolerância a herbicidas de sulfonilureia; e o gene bar descrito no DeBlock, et al., EMBO Journal 6:2513-2519 (1987) para tolerância a glufosinato e bialafos. As moléculas de promotor da presente invenção podem expressar moléculas de polinucleotídeos transcritíveis ligadas que codificam a fosfinotricina acetiltransferase, glifosato resistente a EPSPS, aminoglicosídeo fosfotransferase, hidroxifenil piruvato desidrogenase, higromicina fosfotransferase, neomicina fosfotransferase, dalapona dehalogenase, bromoxinil resistente nitrilase, antranilato sintase, ariloxialcanoato dioxigenases, acetil CoA carboxilase, glifosato oxidoredutase e glifosato-N-acetil-transferase.

[0066] Incluído dentro do termo "marcadores selecionáveis" estão também os genes que codificam um marcador secretável cuja secreção pode ser detectada como um meio de identificação ou para selecionar células transformadas. Exemplos incluem marcadores que codificam um antígeno secretável que pode ser identificado pela interação de anticorpo, ou até mesmo enzimas secretáveis que podem ser detectadas cataliticamente. As proteínas marcadoras secretadas selecionáveis caem em um número de classes, incluindo proteínas difusíveis pequenas, que são detectáveis, (por exemplo, por ELISA), pequenas enzimas ativas que são detectáveis em solução extracelular (por exemplo, alfa-amilase, beta-lactamase, fosfinotricina transferase), ou proteínas que são inseridas ou presas na parede da célula (tais como proteínas que incluem uma sequência líder tal como a encontrada na unidade de expressão de extensão ou proteínas relacionadas a patogênese do tabaco também conhecida como tabaco PR-S). Outros genes marcadores selecionáveis possíveis serão evidentes para aqueles versados na técnica e são englobados pela presente invenção.

Transformação celular

[0067] A invenção também é dirigida a um método de produção de células transformadas e plantas que compreendem um promotor operacionalmente ligado a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita.

[0068] O termo "transformação" refere-se à introdução de ácido nucleico em um hospedeiro receptor. Tal como usado aqui, o termo "hospedeiro" refere-se a bactérias, fungos, ou plantas incluindo quaisquer células de tecidos, órgãos ou progênie de bactérias, fungos, ou plantas. Tecidos de plantas e células de interesse particular incluem protoplastos, calos, raízes, tubérculos, sementes, caules, folhas, mudas, embriões, e pólen.

[0069] Tal como usado aqui, o termo "transformado" refere-se a uma célula, tecido, órgão, ou organismo em que uma molécula de polinucleotídeo estranha, tal como uma construção foi introduzida. A molécula de polinucleotídeo introduzida pode ser integrada no DNA genômico da célula, tecido, órgão, ou organismo receptor tal que a molécula de polinucleotídeo introduzida é herdada pela progênie subsequente. Uma célula ou organismo "transgênico" ou "transformado" também inclui progênie da célula ou organismo e progênie produzida a partir de um programa de reprodução que emprega tal organismo transgênico como um original em uma cruz e exibindo um fenótipo alterado resultante da presença de uma molécula polinucleotídeo estranha. O termo "transgênico" refere-se a uma bactéria, fungos ou plantas que contenham uma ou mais moléculas de ácidos polinucleicos heterólogas.

[0070] Existem muitos métodos para a introdução de moléculas de ácidos polinucleicos em células de plantas. O método geralmente compreendem as etapas de selecionar uma célula hospedeira adequada, transformar a célula hospedeira com um vetor recombinante, e obter a célula hospedeira transformada. Os métodos adequados incluem a infecção bacteriana (por exemplo, Agrobacterium), vetores de cromossomas artificiais binários bacterianos, dirigir a distribuição de DNA (por exemplo, através de transformação mediada por PEG, absorção de DNA mediada por dessecação/inibição, eletroporação, agitação com fibras de carbeto de silício, e aceleração de partículas revestidas de DNA, etc. (revisto em Potrykus, et al., Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 205 (1991)).

[0071] A tecnologia para introdução de uma molécula de DNA em células é bem conhecida por aqueles que são versados na técnica. Os métodos e materiais para a transformação de células de plantas através da introdução de uma construção de DNA de planta no genoma de uma planta na prática da presente invenção podem incluir qualquer um dos métodos bem conhecidos e demonstrados, incluindo, mas não se limitados a:

[0072] métodos químicos (Graham and Van der Eb, Virology 54:536-539 (1973) and Zatloukal, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 136153 (1992));

[0073] métodos físicos, tais como microinjeção (Capecchi, Cell 22:479-488 (1980)), eletroporação (Wong and Neumann, Biochim. Biophys. Res. Commun., 107:584-587 (1982); Fromm, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824-5828 (1985); Patente US No 5.384.253) aceleração de partículas (Johnston e Tang, Methods Cell Biol. 43(A):353-365 (1994); Fynan, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11478-11482 (1993)): e bombardeamento microinjetável (como ilustrado nas Patentes US Nos 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880; 6.160.208; 6.399.861; e 6.403.865);

[0074] vetores virais (Clapp, Clin. Perinatol. 20:155-168 (1993); Lu, et al., J. Exp. Med. 178:2089-2096 (1993); Eglitis e Anderson, Biotechniques 6:608-614 (1988));

[0075] mecanismos mediados por receptor (Curiel et al., Hum. Gen. Ther. 3:147-154 (1992) e Wagner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6099-6103 (1992); (5) mecanismos mediados por bactérias, tais como transformação mediada por Agrobacterium (como ilustrado nas Patentes US Nos 5.824.877; 5.591.616; 5.981.840; e 6.384.301); introdução direta em pólen, injetando órgãos reprodutivos de uma planta (Zhou, et al., Methods in Enzymology 101:433, (1983); Hess, Intern Rev. Cytol. 107:367 (1987); Luo, et al., Plant Mol Biol. Reporter 6:165 (1988); Pena, et al., Nature 325:274 (1987));

[0076] (7) transformação de protoplastos (como ilustrado na Patente US No 5.508.184); e

[0077] (8) injeção em embriões imaturos (Neuhaus, et al., Theor. Appl. Genet. 75:30 (1987)).

[0078] Qualquer um dos métodos acima descritos pode ser usado para transformar uma célula hospedeira com um ou mais promotores e/ou construções da presente invenção. As células hospedeiras podem ser qualquer célula ou organismo tal como uma célula de planta, célula de algas, algas, célula fúngica, fungos, células bacterianas, ou célula de inseto. Hospedeiros preferidos e células transformadas incluem células de: plantas, Aspergillus, leveduras, insetos, bactérias e algas.

[0079] Métodos para a transformação de plantas dicotiledôneas, principalmente pelo uso de Agrobacterium tumefaciens e obtenção de plantas transgêncica foram publicados para algodão (Patentes US Nos 5.004.863; 5.159.135; e 5.518.908); soja (Patentes US No 5.569.834 e 5.416.011; ver também, McCabe, et al., Biotechnolgy 6:923 (1988) e Christou et al., Plant Physiol. 87:671-674 (1988)); Brassica (Patente US No 5.463.174); amendoim (Cheng et al., Plant Cell Rep. 15:653-657 (1996) and McKently et al., Plant Cell Rep. 14:699-703 (1995)); papaia; e ervilha (Grant et al., Plant Cell Rep. 15:254-258 (1995)).

[0080] Transformações de plantas monocotiledôneas usando eletroporação, bombardeamento de partículas, e Agrobacterium foram também relatados. A transformação e a regeneração de plantas foram atingidas em espargos (Bytebier, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84:5354 (1987); cevada (Wan and Lemaux, Plant Physiol. 104:37 (1994)); milho (Rhodes, et al., Science 240:204 (1988), Gordon-Kamm, et al., Plant Cell 2:603-618 (1990), Fromm, et al., Bio/Technology, 8:833 (1990), Koziel et al., Bio/Technology 11:194 (1993), e Armstrong, et al., Crop Science 35:550-557 (1995)); aveia (Somers, et al., Bio/Technology 10:1589 (1992)); grama pomar (Horn, et al., Plant Cell Rep. 7:469 (1988)); centeio (De la Pena, et al., Nature, 325:274 (1987)); cana-de- açúcar (Bower e Birch, Plant Journal 2:409 (1992)); festuca (Wang, et al., Bio/Technology 10:691 (1992)); e trigo (Vasil, et al., Bio/Technology 10:667 (1992) e Patente US No 5.631.152).

[0081] A regeneração, desenvolvimento, e cultivo de plantas de protoplastos de plantas transformados ou explantes são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Weissbach e Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.), Academic Press, Inc., San Diego, CA (1988) e Horsch et al., Science 227:1229-1231 (1985)). As células transformadas são geralmente cultivadas na presença de um meio seletivo, que seleciona as células transformadas com sucesso e induz a regeneração de brotos e raízes de plantas em plantas intactas (Fraley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 80: 4803 (1983)). Plantas transformadas são tipicamente obtidas dentro de dois a quatro meses.

[0082] As plantas transgênicas regeneradas são autopolinizadas para fornecer plantas transgênicas homozigotas. Alternativamente, o pólen obtido a partir das plantas transgênicas regeneradas pode ser cruzado com plantas não transgênicas, preferencialmente, de linhagens puras de espécies agronomicamente importantes. As descrições dos métodos de reprodução que são comumente usados para diferentes traços e culturas podem ser encontradas em um dos inúmeros livros de referência, ver, por exemplo, Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, U. de CA, Davis, CA, 50-98 (1960); Simmonds, Principles of crop improvement, Longman, Inc., NY, 369-399 (1979); Sneep e Hendriksen, Plant breeding perspectives, Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation (1979); Fehr, Soybeans: Improvement, Production and Uses, 2° Edição, Monograph, 16:249 (1987); Fehr, Principles of variety development, Theory and Technique, (Vol. 1) and Crop Species Soybean (Vol 2), Iowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376 (1987). Inversamente, o pólen de plantas não transgênicas pode ser usado para polinizar as plantas transgênicas regeneradas.

[0083] As plantas transformadas podem ser analisadas para a presença dos genes de interesse e o nível e/ou perfil de expressão conferido pelos elementos reguladores da presente invenção. Aqueles versados na técnica têm conhecimento dos numerosos métodos disponíveis para a análise de plantas transformadas. Por exemplo, os métodos para análise de plantas incluem, mas não estão limitados a, Southern blots ou Northern blots, abordagens baseadas em PCR, análises bioquímicas, métodos de rastreio fenotípico, avaliações de campo, e ensaios de imunodiagnóstico. A expressão de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita pode ser medida usando reagentes de TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA) e métodos conforme descritos pelo fabricante e os tempos de ciclo de PCR determinados usando a Matriz de Teste de TaqMan®. Alternativamente, os reagentes e métodos de Invader® (Third Wave Technologies, Madison, WI) como descritos pelo fabricante podem ser usados para a expressão do transgene.

[0084] As sementes das plantas da presente invenção podem ser colhidas a partir de plantas transgênicas férteis e ser usadas para o crescimento de gerações progênies de plantas transformadas da presente invenção, incluindo as linhagens de plantas híbridas que compreendem a construção da presente invenção e expressão de um gene de interesse agronômico.

[0085] A presente invenção também fornece para partes das plantas da presente invenção. Partes de planta, sem limitação, incluem folhas, caules, raízes, tubérculos, sementes, endosperma, óvulo e pólen. A invenção também inclui e fornece células de plantas transformadas que compreendem uma molécula de ácido nucleico da presente invenção.

[0086] A planta transgênica pode passar ao longo da molécula de polinucleotídeo transgênico para a sua progênie. Progênie inclui qualquer parte da planta ou semente regenerável compreendendo o transgene derivado de uma planta progenitora. A planta transgênica é preferencialmente homozigótica para a molécula de polinucleotídeo transformada e transmite essa sequência para toda a progênie como um resultado da reprodução sexual. A Progênie pode ser crescida a partir de sementes produzidas pela planta transgênica. Estas plantas adicionais podem então ser autopolinizadas para gerar uma linhagem de reprodução verdadeira de plantas. A progênie de tais plantas é avaliada, entre outras coisas, para a expressão do gene. A expressão do gene pode ser detectada por vários métodos comuns, tais como western blotting, Northern blotting, imunoprecipitação, e ELISA.

[0087] Tendo agora descrito genericamente a invenção, a mesma será mais facilmente compreendida através da referência aos exemplos seguintes que são fornecidos a título de ilustração e não se destinam a ser limitantes da presente invenção, a menos que especificado. Deve ser apreciado por aqueles versados na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos seguintes representam técnicas identificadas pelos inventores para funcionar bem na prática da invenção. No entanto, aqueles que são versados na técnica devem, à luz da presente revelação, apreciar que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são divulgadas e ainda obter um resultado similar ou semelhante, sem se afastar do espírito e do escopo da invenção, por conseguinte, todo o assunto exposto ou mostrado nos desenhos anexos deve ser interpretado como ilustrativo e não em um sentido limitativo.

EXEMPLOS

[0088] Os elementos reguladores úteis para dirigir a expressão de um polinucleotídeo que pode ser transcrita ligado operacionalmente em plantas transgênicas foram isolados, e o padrão de expressão destes elementos reguladores operacionalmente ligados a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita foi analisado em plantas de soja transgênicas.

Exemplo 1: Identificação e Clonagem de Novos Elementos Reguladores: Promotores, Líderes e Íntrons.

[0089] Elementos reguladores foram identificados e isolados a partir de DNA genômico das espécies monocotiledôneas, Foxtail millet (Setaria italica (L.) Beauv). Genômicos e EST de propriedade e sequência de EST e genômico público foram usados para projetar iniciadores, que foram então usados com bibliotecas GenomeWalkerTM (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA) construídas seguindo o protocolo do fabricante para clonar a região 5' da sequência de DNA genômico correspondente. No caso de íntrons e líderes de promotores, esta região clonada composta do regulador transctiptional 5', 5' UTR e se presente, a sequência de íntron a montante da região de codificação de proteína para cada gene a partir de S. italica. Usando esta sequência, os elementos reguladores foram identificados bioinformaticamente dentro da região 5' para cada gene. A análise bioinformática foi usada para identificar o sítio de início de transcrição (TSS) e qualquer bidirecionalidade, íntrons, ou sequência de codificação a montante presentes na sequência. Usando os resultados desta análise, os elementos reguladores foram definidos dentro da sequência a 5' a montante da sequência de codificação do gene. Os iniciadores foram então projetados para amplificar os elementos reguladores. A molécula de DNA correspondente de cada elemento regulador foi amplificada usando as condições de reação em cadeia de polimerase padrões com iniciadores contendo sítios de enzimas de restrição únicos e DNA genômico isolado a partir de S. italica. Os fragmentos de DNA resultantes foram ligados num vetor de expressão de planta base usando a digestão com enzima de restrição padrão de sítios de restrição compatíveis e métodos de ligação de DNA.

[0090] As sequências de elementos reguladores, elementos de codificação de peptídeo de trânsito e sequências de proteínas de peptídeo de trânsito identificadas a partir de S. italica estão listados na Tabela 1 abaixo. As sequências dos elementos reguladores identificados a partir de S. italica são fornecidas aqui como SEQ ID NOs: 1 até 276, SEQ ID NOs: 317 até 323 e 352 até 924. Os grupos de elementos reguladores transcricionais (EXP) constituídos por um promotor, líder, e íntron operacionalmente ligado ou um promotor, líder, íntron e líder operacionalmente ligado são fornecidos aqui como SEQ ID NOs: 1 até 22. As sequências de promotor são fornecidas aqui como SEQ ID NOs: 23 até 105 e SEQ ID NOs: 353 até 536. As sequências líder são fornecidas aqui como SEQ ID NOs: 106 até 171 e SEQ ID NOs: 537 até 588. Sequências de íntron são fornecidas como SEQ ID NOs: 172 até 267, SEQ ID NOs: 317 até 323 e SEQ ID NOs: 589 até 778. As sequências que compreendem 3' UTRs são fornecidas aqui como SEQ ID NOs: 268 até 276 e SEQ ID NOs: 779 até 924. As sequências que codificam peptídeos de trânsito são aqui fornecidas como SEQ ID NOs: 277 até 316. O DNA genômico que codifica alguns dos peptídeos de trânsito também são compostos por íntrons apresentados como SEQ ID NOs: 317 até 323. As sequências de proteínas de peptídeo de trânsito são fornecidas aqui como SEQ ID NOs: 324 até 350. Um elemento potencializador é fornecido como SEQ ID NO: 352. Tabela 1. Elementos reguladores e Promotores, líderes e introns correspondentes, e sequências de trânsito (localização).

[0091] Duas variantes de Promotor de Foxtail millet Act8 (Actina 8) estão apresentadas na Tabela 1. O alinhamento das variantes de tamanho para o promotor de Actina 8 é fornecido nas figuras 1a até 1c. O promotor, P-SETit.Act8-1:1:5 (SEQ ID NO: 24) tem 1419 nucleotídeos de comprimento. O promotor, P-SETit.Act8-1:1:6 (SEQ ID NO: 25) é composto de uma deleção 5' de P-SETit.Act8-1:1:5 (SEQ ID NO: 24) e tem 902 nucleotídeos de comprimento.

[0092] Duas variantes de promotor de Foxtail millet Alc1 estão apresentadas na Tabela 1. O alinhamento das variantes de tamanho para o promotor Alc1 é fornecido nas figuras 2a até 2c. O promotor, P- SETit.Alc1-1:1:1 (SEQ ID NO: 28) tem 1577 nucleotídeos de comprimento. O promotor, P-SETit.Alc1-1:1:2 (SEQ ID NO: 29) é composto de uma deleção 5' de P-SETit.Alc1-1:1:1 (SEQ ID NO: 28) e tem 412 nucleotídeos de comprimento.

[0093] Duas variantes de promotor de Foxtail millet Cys estão apresentadas na Tabela 1. O alinhamento das variantes de tamanho para o Cys promotor é fornecido nas figuras 3a até 3f. O promotor, P- SETit.Cys-1:1:2 (SEQ ID NO: 45) tem 3277 nucleotídeos de comprimento. O promotor, P-SETit.Cys-1:1:3(SEQ ID NO: 46) é composto de uma deleção 5' de P-SETit.Cys-1:1:2 (SEQ ID NO: 45) e tem 2020 nucleotídeos de comprimento.

[0094] Duas variantes de promotor de Foxtail millet Dzs estão apresentadas na Tabela 1. O alinhamento das variantes de tamanho para o promotor de Dzs é fornecido nas figuras 4a até 4f. O promotor, P-SETit.Dzs-1:1:4 (SEQ ID NO: 47) tem 3508 nucleotídeos de comprimento. O promotor, P-SETit.Dzs-1:1:5 (SEQ ID NO: 48) é composto de uma deleção 5' de P-SETit.Dzs-1:1:4 (SEQ ID NO: 47) e tem 1008 nucleotídeos de comprimento.

[0095] Duas variantes de promotor de Foxtail millet Gst estão apresentadas na Tabela 1. O alinhamento das variantes de tamanho para o promotor de Gst é fornecido nas figuras 5a até 5c. O promotor, P-SETit.Gst-1:1:1 (SEQ ID NO: 58) tem 1681 nucleotídeos de comprimento. O promotor, P-SETit.Gst-1:1:2 (SEQ ID NO: 59) é composto de uma deleção 5' de P-SETit.Gst-1:1:1 (SEQ ID NO: 58) e tem 428 nucleotídeos de comprimento.

[0096] Duas variantes de promotor de Foxtail millet Ifr estão apresentadas na Tabela 1. O alinhamento das variantes de tamanho para o promotor de Ifr é fornecido nas figuras 6a até 6c. O promotor, P- SETit.Ifr-1:1:2 (SEQ ID NO: 60) tem 1280 nucleotídeos de comprimento. O promotor, P-SETit.Ifr-1:1:3 (SEQ ID NO: 61) é composto de uma deleção 5' de P-SETit.Ifr-1:1:2 (SEQ ID NO: 60) e tem 275 nucleotídeos de comprimento.

[0097] Duas variantes de promotor de Foxtail millet Nrt2 estão apresentadas na Tabela 1. O alinhamento das variantes de tamanho para o promotor de Nrt2 é fornecido nas figuras 7a até 7d. O promotor, P-SETit.Nrt2-1:1:2 (SEQ ID NO: 64) tem 1866 nucleotídeos de comprimento. O promotor, P-SETit.Nrt2-1:1:3 (SEQ ID NO: 65) é composto de uma deleção 5' de P-SETit.Nrt2-1:1:2 (SEQ ID NO: 64) e tem 382 nucleotídeos de comprimento.

[0098] Duas variantes de promotor de Foxtail millet Ppc estão apresentadas na Tabela 1. O alinhamento das variantes de tamanho para o promotor de Ppc é fornecido nas figuras 8a até 8e. O promotor, P-SETit.Ppc-1:1:3 (SEQ ID NO: 74) tem 2722 nucleotídeos de comprimento. O promotor, P-SETit.Ppc-1:1:4 (SEQ ID NO: 75) é composto de uma deleção 5' de P-SETit.Ppc-1:1:3 (SEQ ID NO: 74) e tem 1882 nucleotídeos de comprimento.

[0099] Duas variantes de promotor de Foxtail millet Prx3 estão apresentadas na Tabela 1. O alinhamento das variantes de tamanho para o Prx3 promotor é fornecido nas figuras 9a até 9f. O promotor, P- SETit.Prx3-1:1:4 (SEQ ID NO: 83) tem 3354 nucleotídeos de comprimento. O promotor, P-SETit.Prx3-1:1:3 (SEQ ID NO: 82) é composto de uma deleção 5' de P-SETit.Prx3-1:1:4 (SEQ ID NO: 83) e tem 1908 nucleotídeos de comprimento.

[00100] Três variantes de promotor de Foxtail millet Rcc3 estão apresentadas na Tabela 1. O alinhamento das variantes de tamanho para o promotor de Rcc3 é fornecido nas figuras 10a até 10f. O promotor, P-SETit.Rcc3-1:1:1 (SEQ ID NO: 88) tem 2062 nucleotídeos de comprimento. O promotor, P-SETit.Rcc3-1:1:16 (SEQ ID NO: 91) é composto de uma deleção 5' de P-SETit.Rcc3-1:1:1 (SEQ ID NO: 88) e tem 2024 nucleotídeos de comprimento. O promotor, P-SETit.Rcc3- 1:1:10 (SEQ ID NO: 89) é composto de uma deleção 5' de P-SETit.Rcc3- 1:1:1 (SEQ ID NO: 88) e tem 1563 nucleotídeos de comprimento. O promotor, P-SETit.Rcc3-1:1:11 (SEQ ID NO: 90) é composto de uma deleção 5' de P-SETit.Rcc3-1:1:1 (SEQ ID NO: 88) e tem 915 nucleotídeos de comprimento.

[00101] Duas variantes de promotor de Foxtail millet Ssp1 estão apresentadas na Tabela 1. O alinhamento das variantes de tamanho para o Ssp1 promotor é fornecido nas figuras 11a até 11b. O promotor, P-SETit.Ssp1-1:1:1 (SEQ ID NO: 93) tem 1128 nucleotídeos de comprimento. O promotor, P-SETit.Ssp1-1:1:2 (SEQ ID NO: 94) é composto de uma deleção 5' de P-SETit.Ssp1-1:1:1 (SEQ ID NO: 93) e tem 479 nucleotídeos de comprimento.

[00102] Duas variantes de promotor de Foxtail millet Tip estão apresentadas na Tabela 1. O alinhamento das variantes de tamanho para o promotor Tip é fornecido nas figuras 12a até 12d. O promotor, P- SETit.Tip-1:1:4 (SEQ ID NO: 97) tem 2108 nucleotídeos de comprimento. O promotor, P-SETit.Tip-1:1:1 (SEQ ID NO: 96) é composto de uma deleção 5' de P-SETit.Tip-1:1:4 (SEQ ID NO: 97) e tem 917 nucleotídeos de comprimento.

[00103] Duas variantes de promotor Foxtail millet TubA2-1 estão apresentadas na Tabela 1. O alinhamento das variantes de tamanho para o TubA2-1 promotor é fornecido nas figuras 13a até 13d. O promotor, P-SETit.TubA2-1-1:1:2 (SEQ ID NO: 98) tem 1593 nucleotídeos de comprimento. O promotor, P-SETit.TubA2-1-1:1:3 (SEQ ID NO: 99) é composto de uma deleção 5' de P-SETit.TubA2-1- 1:1:2 (SEQ ID NO: 98) e tem 856 nucleotídeos de comprimento.

[00104] Duas variantes de promotor de Foxtail millet Ubq1 estão apresentadas na Tabela 1. O alinhamento das variantes de tamanho para o promotor de Ubq1 é fornecido nas figuras 14a até 14c. O promotor, P-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 102) tem 1492 nucleotídeos de comprimento. O promotor, P-SETit.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 103) é composto de uma deleção 5' de P-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 102) e tem 680 nucleotídeos de comprimento.

[00105] Composições derivadas de qualquer um dos promotores apresentados como SEQ ID NOs: 23 até 105 e SEQ ID NOs: 353 até 536 compostas de deleções 5' ou internas podem ser construídas usando métodos conhecidos na técnica para melhoras a expressão, pela remoção de elementos que têm efeitos positivos ou negativos na expressão; ou duplicação de elementos que têm efeitos positivos ou negativos na expressão; ou duplicação ou remoção de elementos que têm efeitos específicos na célula ou tecido na expressão. Composições derivadas de qualquer um dos promotores apresentados como SEQ ID NOs: 23 até 105 e SEQ ID NOs: 353 até 536 compostas de deleções 3' em que o elemento TATA box ou sequência equivalente do mesmo e a sequência a jusante que é removida pode ser usada para tornar os elementos potenciadores. As deleções adicionais podem ser feitas para remover quaisquer elementos que têm efeitos positivos ou negativos, ou tecido específicos; ou células específicas; ou temporizações específicas (tais como, mas não se limitadas a, ritmos circadium) sobre a expressão. Qualquer um dos promotores apresentados como SEQ ID NOs: 23 até 105 e SEQ ID NOs: 353 até 536 e os fragmentos ou potenciadores derivados das mesmas podem ser usados para fazer composições de elementos reguladores transcricionais quiméricos compostos de qualquer um dos promotores apresentados como SEQ ID NOs: 23 até 105 e SEQ ID NOs: 353 até 536 e os fragmentos ou potenciadores derivados das mesmas operacionalmente ligados a outros potenciadores e promotores. A eficácia das modificações, duplicações ou deleções descritas acima, sobre os aspectos de expressão desejados de um transgene particular são testados empiricamente em ensaios de plantas estáveis e transientes, uma vez que o efeito de tais alterações à composição promotora nativa não são facilmente previsíveis e requerem testes empíricos para validar tais efeitos.

[00106] As sequências líderes (5' UTR) apresentadas como SEQ ID NOs: 106 até 171 e SEQ ID NOs: 537 até 588 podem ser compostas de elementos reguladores ou podem adotar estruturas secundárias que podem ter efeitos na transcrição ou tradução de um transgene. As sequências líderes apresentadas como SEQ ID NOs: 106 até 171 e SEQ ID NOs: 537 até 588 podem ser usadas para fazer elementos reguladores quiméricos que afetam a transcrição ou tradução de um transgene. Além disso, as sequências líderes apresentadas como SEQ ID NOs: 106 até 171 e SEQ ID NOs: 537 até 588 podem ser usadas para fazer sequências líderes químericas que afetam a transcrição ou tradução de um transgene.

[00107] As composições derivadas de qualquer um dos íntrons apresentados como SEQ ID NOS: 172 até 267, SEQ ID NOS: 317 até 323 e SEQ ID NOS: 589 até 778 podem ser compostas de deleções internas ou duplicações de elementos reguladores cis; ou alterações das sequências 5' e 3' que compreendem as junções de splicing de íntron/éxon, podem ser usadas para melhorar a expressão ou a especificidade de expressão quando ligadas operacionalmente a um promotor + líder ou promotor quimérico + líder e sequência de codificação. As alterações das regiões 5' e 3' que compreendem a junção de splicing de íntron/éxon podem também ser feitas para reduzir o potencial para a introdução de partida falsa e os códons de parada começam a ser produzidos no transcrito resultante após processamento e splicing de RNA mensageiro. Os íntrons são testados empiricamente como descritos abaixo para determinar o efeito do íntron na expressão de um transgene.

Exemplo 2: Análise de Elementos reguladores que conduzem GUS no Milho Transgênico

[00108] As plantas de milho foram transformadas com vetores de expressão de plantas contendo os elementos reguladores de teste que conduzem a expressão do transgene β-glucuronidase (GUS), e as plantas resultantes foram analisadas quanto à expressão da proteína de GUS.

[00109] As plantas de milho foram transformadas com as construções de expressão de plantas GUS, listados na Tabela 2, abaixo. Os elementos reguladores e elementos reguladores quiméricos apresentados no exemplo 1 foram clonados em um vetor de expressão base de planta, usando métodos padrões conhecidos na técnica. Os vetores de expressão resultantes de plantas continham uma região de fronteira direita de Agrobacterium tumefaciens, um primeiro cassete de transgene para testar o elemento regulador quimérico ou regulador composto de, um elemento regulador quimérico ou regulador, operacionalmente ligado a um íntron derivado da proteína de choque térmico HSP70 de Zea mays (I-Zm.DnaK-1: 1:1, SEQ ID NO: 1102), ligada operacionalmente a uma sequência de codificação para β- glucuronidase (GUS) que possuía um íntrons processável (GUS-2, SEQ ID NO: 1091 ) ou nenhum íntron (GUS-1, SEQ ID NO: 1090), operacionalmente ligado à região de terminação 3' de nopalina sintase de A. tumefaciens (T-AGRtu.nos-1: 1:13, SEQ ID NO: 1088) ou a região de terminação 3' do gene da proteína de transferência de lipídeo de arroz (T-Os.LTP-1: 1:1, SEQ ID NO: 1089); um segundo cassete de selecção transgene usado para a seleção de células de plantas transformadas que conferem resistência ao herbicida glifosato (conduzido pelo grupo de elemento regulador transcricional de actina 1 do arroz, SEQ ID NO: 1098), ou alternativamente, o antibiótico canamicina (conduzido pelo grupo de elemento regulador transcricional de Actina 1 de arroz, SEQ ID NO: 1098) e uma região da fronteira esquerda a partir A. tumefaciens. Os plasmídeos resultantes, pMON109728, pMON112215, pMON116789, pMON116816, pMON116818, pMON116820, pMON116829, pMON120698, pMON120699, pMON120700, pMON120701, pMON120702, pMON120703, pMON120704, pMON120705, pMON120706, pMON120709, pMON120710, pMON120711, pMON120712, pMON120713, pMON127440, pMON127441, pMON127442, pMON127443, pMON127444, pMON127445, pMON127446, pMON127447, pMON127448, pMON127449 e pMON132037 foram usados para transformar plantas de milho. Tabela 2. Construções Binárias de Transformação de Planta, Reguladores ou Elementos Reguladores Quiméricos, GUS e 3' UTRs.

[00110] O vetor de transformação da planta, pMON109728 é composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP- FMV.35S-SETit.Tip (SEQ ID NO: 8),que é ainda composto do elemento potenciador, E-FMV.35S-1:1:2 (SEQ ID NO: 351),operacionalmente ligado em 5' ao elemento promotor, P-SETit.Tip-1:1:1 (SEQ ID NO: 96),operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Tip-1:1:1 (SEQ ID NO: 165). O vetor de transformação da planta, pMON112215 é composto do elemento promotor, P-SETit.Rcc3-1:1:1 (SEQ ID NO: 88), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Rcc3- 1:1:1 (SEQ ID NO: 161). O vetor de transformação da planta, pMON116789 é composto do elemento promotor, P-SETit.Rcc3-1:1:11 (SEQ ID NO: 90), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L- SETit.Rcc3-1:1:2 (SEQ ID NO: 162). O vetor de transformação da planta, pMON116816 é composto do elemento promotor, P-SETit.Rcc3- 1:1:11 (SEQ ID NO: 90), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Rcc3-1:1:2 (SEQ ID NO: 162). O vetor de transformação da planta, pMON116818 é composto do elemento promotor, P- SETit.Pox-1:1:1 (SEQ ID NO: 73), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Pox-1:1:1 (SEQ ID NO: 147). O vetor de transformação da planta, pMON116820 é composto do elemento promotor, P-SETit.Gst-1:1:1 (SEQ ID NO: 58), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Gst-1:1:1 (SEQ ID NO: 135). O vetor de transformação da planta, pMON116829 é composto do elemento promotor, P-SETit.Rcc3-1:1:10 (SEQ ID NO: 89), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Rcc3-1:1:2 (SEQ ID NO: 162). O vetor de transformação da planta, pMON120698 é composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP-FMV.35S-SETit.Rcc3:a (SEQ ID NO: 6), que é ainda composto do elemento potenciador, E- FMV.35S-1:1:2 (SEQ ID NO: 351), operacionalmente ligado em 5' ao elemento promotor, P-SETit.Rcc3-1:1:10 (SEQ ID NO: 89), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Rcc3-1:1:2 (SEQ ID NO: 162). O vetor de transformação da planta, pMON120699 é composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP- FMV.35S-SETit.Gst:a (SEQ ID NO: 2),que é ainda composto do elemento potenciador, E-FMV.35S-1:1:2 (SEQ ID NO: 351), operacionalmente ligado em 5' ao elemento promotor, P-SETit.Gst-1:1:1 (SEQ ID NO: 58), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L- SETit.Gst-1:1:1 (SEQ ID NO: 135). O vetor de transformação da planta, pMON120700 é composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP-FMV.35S-SETit.Rcc3:b (SEQ ID NO: 7),que é ainda composto do elemento potenciador, E-FMV.35S-1:1:2 (SEQ ID NO: 351), operacionalmente ligado em 5' ao elemento promotor, P- SETit.Rcc3-1:1:11 (SEQ ID NO: 90), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Rcc3-1:1:2 (SEQ ID NO: 162). O vetor de transformação da planta, pMON120701 é composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP-FMV.35S-SETit.Pox (SEQ ID NO: 5),que é ainda composto do elemento potenciador, E-FMV.35S- 1:1:2 (SEQ ID NO: 351), operacionalmente ligado em 5' ao elemento promotor, P-SETit.Pox-1:1:1 (SEQ ID NO: 73), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Pox-1:1:1 (SEQ ID NO: 147). O vetor de transformação da planta, pMON120702 é composto do elemento promotor, P-SETit.Ccoamt-1:1:2 (SEQ ID NO: 35), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Ccoamt-1:1:2 (SEQ ID NO: 116). O vetor de transformação da planta, pMON120703 é composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP-FMV.35S-SETit.Ccoamt (SEQ ID NO: 1),que é ainda composto do elemento potenciador, E- FMV.35S-1:1:2 (SEQ ID NO: 351), operacionalmente ligado em 5' ao elemento promotor, P-SETit.Ccoamt-1:1:2 (SEQ ID NO: 35), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Ccoamt-1:1:2 (SEQ ID NO: 116). O vetor de transformação da planta, pMON120704 é composto do elemento promotor, P-SETit.Gst-1:1:2 (SEQ ID NO: 59), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Gst-1:1:1 (SEQ ID NO: 135). O vetor de transformação da planta, pMON120705 é composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP- FMV.35S-SETit.Gst:b (SEQ ID NO: 3),que é ainda composto do elemento potenciador, E-FMV.35S-1:1:2 (SEQ ID NO: 351), operacionalmente ligado em 5' ao elemento promotor, P-SETit.Gst-1:1:2 (SEQ ID NO: 59), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L- SETit.Gst-1:1:1 (SEQ ID NO: 135). O vetor de transformação da planta, pMON120706 é composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP-FMV.35S-SETit.Ifr (SEQ ID NO: 4),que é ainda composto do elemento potenciador, E-FMV.35S-1:1:2 (SEQ ID NO: 351), operacionalmente ligado em 5' ao elemento promotor, P-SETit.Ifr- 1:1:3 (SEQ ID NO: 61), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Ifr-1:1:1 (SEQ ID NO: 136). O vetor de transformação da planta, pMON120709 é composto do elemento promotor, P-SETit.Nrt2- 1:1:3 (SEQ ID NO: 65), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Nrt2-1:1:2 (SEQ ID NO: 139). O vetor de transformação da planta, pMON120710 é composto do elemento promotor, P- SETit.Nrt2-1:1:2 (SEQ ID NO: 64), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Nrt2-1:1:2 (SEQ ID NO: 139). O vetor de transformação da planta, pMON120711 é composto do elemento promotor, P-SETit.Pip2-1:1:3 (SEQ ID NO: 71), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Pip2-1:1:1 (SEQ ID NO: 145). O vetor de transformação da planta, pMON120712 é composto do elemento promotor, P-SETit.Ifr-1:1:2 (SEQ ID NO: 60), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Ifr-1:1:1 (SEQ ID NO: 136). O vetor de transformação da planta, pMON120713 é composto do elemento promotor, P-SETit.Ifr-1:1:3 (SEQ ID NO: 61), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Ifr-1:1:1 (SEQ ID NO: 136). O vetor de transformação da planta, pMON127440 é composto do elemento promotor, P-SETit.Ppc-1:1:3 (SEQ ID NO: 74), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Ppc-1:1:1 (SEQ ID NO: 148). O vetor de transformação da planta, pMON127441 é composto do elemento promotor, P-SETit.Ppc-1:1:4 (SEQ ID NO: 75), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Ppc-1:1:1 (SEQ ID NO: 148)O vetor de transformação da planta, pMON127442 é composto do elemento promotor, P-SETit.Gapdh2-1:1:3 (SEQ ID NO: 55), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Gapdh2-1:1:1 (SEQ ID NO: 133). O vetor de transformação da planta, pMON127443 é composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP-SETit.Ppdk:1:1 (SEQ ID NO: 14),promotor element, P-SETit.Ppdk-1:1:1 (SEQ ID NO: 76), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Ppdk-1:1:4 (SEQ ID NO: 150), operacionalmente ligado em 5' ao elemento de íntron, I-SETit.Ppdk-1:1:1 (SEQ ID NO: 175), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Ppdk-1:1:2 (SEQ ID NO: 149). O vetor de transformação da planta, pMON127444 é composto do elemento promotor, P-SETit.CP29-1:1:4 (SEQ ID NO: 42), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.CP29-1:1:1 (SEQ ID NO: 124). O vetor de transformação da planta, pMON127445promotor element, P- SETit.Cab3-1:1:3 (SEQ ID NO: 33), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Cab3-1:1:1 (SEQ ID NO: 114). O vetor de transformação da planta, pMON127446 é composto do elemento promotor, P-SETit.PSI-4a-1:1:1 (SEQ ID NO: 86), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.PSI-4a-1:1:1 (SEQ ID NO: 159). O vetor de transformação da planta, pMON127447 é composto do elemento promotor, P-SETit.Rbcs-1:1:1 (SEQ ID NO: 87), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Rbcs-1:1:1 (SEQ ID NO: 160). O vetor de transformação da planta, pMON127448 é composto do elemento promotor, P-SETit.Cab1-1:1:1 (SEQ ID NO: 32), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Cab1- 1:1:1 (SEQ ID NO: 113). O vetor de transformação da planta, pMON127449 é composto do elemento promotor, P-SETit.Fba-1:1:1 (SEQ ID NO: 51), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L- SETit.Fba-1:1:1 (SEQ ID NO: 131). O vetor de transformação da planta, pMON132037 é composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP-SETit.Ubq1:1:1 (SEQ ID NO: 20),which is further comprised of o promotor element, P-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 102), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Ubq1- 1:1:1 (SEQ ID NO: 169), operacionalmente ligado em 5' ao elemento de íntron, I-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 177).

[00111] As plantas de milho foram transformadas com construções de expressão de plantas GUS, pMON109728, pMON112215, pMON116789, pMON116816, pMON116818, pMON116820, pMON116829, pMON120698, pMON120699, pMON120700, pMON120701, pMON120702, pMON120703, pMON120704, pMON120705, pMON120706, pMON120709, pMON120710, pMON120711, pMON120712, pMON120713, pMON127440, pMON127441, pMON127442, pMON127443, pMON127444, pMON127445, pMON127446, pMON127447, pMON127448, pMON127449 and pMON132037.

[00112] As plantas foram transformadas usando transformações mediadas por Agrobacterium conhecidas dos versados na técnica. Resumidamente, os embriões de sementes de milho LH244 são extraídos a partir de grãos de milho em desenvolvimento, com superfície esterilizada, de aproximadamente 9 a 13 dias após a polinização. Os embriões são cocultivados com Agrobacterium tumefaciens, transformados com as construções de expressão de GUS durante 18 a 28 horas no escuro. Os embriões são então transferidos para meios seletivos e cultivados no escuro durante cerca de 3 semanas para induzir a formação de calo. Após a indução de calo, o tecido do calo derivado de embrião é transferido para novo meio cultivado sob luz durante 5 a 10 dias. O tecido do calo é então transferido para novo meio para induzir a formação de brotos. Após 2 a 3 semanas, os brotos transformados são transferidos para meio de enraizamento e cultivados para permitir a formação de raízes. Uma vez que a formação de raízes suficiente ocorreu, as plantas transformadas são transferidas para o solo e transferidas para a estufa. Eventos que contêm uma ou duas cópias do cassete de transgene são selecionados para um estudo usando métodos de PCR em tempo real conhecidos dos versados na técnica.

[00113] Análise histoquímica de GUS foi usada para análise de expressão qualitativa de plantas transformadas. As seções de tecido inteiras foram incubadas com solução de coloração de GUS X-Gluc (5- bromo-4-cloro-3-indolil-b-glucuronido) (1 miligrama/mililitro) por um período de tempo apropriado, lavadas, e inspecionadas visualmente para a coloração azul. A atividade de GUS foi qualitativamente determinada por inspeção visual direta ou inspeção sob um microscópio usando órgãos e tecidos das plantas selecionadas. As plantas R0 foram inspecionadas para a expressão nas raízes e folhas.

[00114] Para a análise quantitativa, a proteína total foi extraída a partir de tecidos selecionados de plantas de milho transformadas. Um micrograma de proteína total foi usado com o substrato fluorogênico 4- metileumbeliferil-β-D-glucuronido (MUG) em um volume total de reação de 50 microlitros. O produto da reação, 4-metilumbeliferona (4-MU), é maximamente fluorescente a pH elevado, em que o grupo hidroxil é ionizado. A adição de uma solução básica de carbonato de sódio, simultaneamente, interrompe o ensaio e ajusta o pH para a quantificação do produto fluorescente. A fluorescência foi medida com excitação a 365 nm, emissão a 445 nm usando um Fluoromax-3 com leitor Micromax, com largura de fenda fixada em 2 nm de excitação e 3nm de emissão.

[00115] A expressão média R0 GUS observada para cada transformação é apresentada nas Tabelas 3 e 4 abaixo. Tabela 3. Expressão média de folha e de raiz de R0 GUS em plantas de milho transgênicas, transformadas com as construções listadas.

[00116] O nível médio de expressão de GUS entre as construções variou. As construções que demonstraram o mais elevado nível de expressão de Raiz, particularmente no estádio VT foram: pMON116789 ((P-SETit.Rcc3-1:1:11 (SEQ ID NO: 90) + L-SETit.Rcc3-1:1:2 (SEQ ID NO: 162)); pMON120699 ((EXP-FMV.35S-SETit.Gst:a (SEQ ID NO: 2), composto de E-FMV.35S-1:1:2 (SEQ ID NO: 179) + P-SETit.Gst-1:1:1 (SEQ ID NO: 58) + L-SETit.Gst-1:1:1 (SEQ ID NO: 135)); pMON120703 ((EXP-FMV.35S-SETit.Ccoamt (SEQ ID NO: 1), composto de E- FMV.35S-1:1:2 (SEQ ID NO: 179) + P-SETit.Ccoamt-1:1:2 (SEQ ID NO: 35) + L-SETit.Ccoamt-1:1:2 (SEQ ID NO: 116)); pMON120706 ((EXP- FMV.35S-SETit.Ifr (SEQ ID NO: 4) composto de E-FMV.35S-1:1:2 (SEQ ID NO: 179) + P-SETit.Ifr-1:1:3 (SEQ ID NO: 61) + L-SETit.Ifr-1:1:1 (SEQ ID NO: 136)) e pMON132037 ((EXP-SETit.Ubq1:1:1 (SEQ ID NO: 20) composto de P-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 102) + L-SETit.Ubq1- 1:1:1 (SEQ ID NO: 169) + I-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 177)).

[00117] As construções que demonstraram o mais elevado nível de expressão da Folha foram: pMON127447 ((P-SETit.Rbcs-1:1:1 (SEQ ID NO: 87) + L-SETit.Rbcs-1:1:1 (SEQ ID NO: 160)); pMON127444 ((P- SETit.CP29-1:1:4 (SEQ ID NO: 42) + L-SETit.CP29-1:1:1 (SEQ ID NO: 124)); pMON127445 ((P-SETit.Cab3-1:1:3 (SEQ ID NO: 33) + L- SETit.Cab3-1:1:1 (SEQ ID NO: 114)); pMON127441 ((P-SETit.Ppc- 1:1:4 (SEQ ID NO: 75) + L-SETit.Ppc-1:1:1 (SEQ ID NO: 148)); pMON120699 ((EXP-FMV.35S-SETit.Gst:a (SEQ ID NO: 2) composto de E-FMV.35S-1:1:2 (SEQ ID NO: 179) + P-SETit.Gst-1:1:1 (SEQ ID NO: 58) + L-SETit.Gst-1:1:1 (SEQ ID NO: 135)); pMON127446 ((P- SETit.PSI-4a-1:1:1 (SEQ ID NO: 86) + L-SETit.PSI-4a-1:1:1 (SEQ ID NO: 159)); pMON120706 ((EXP-FMV.35S-SETit.Ifr (SEQ ID NO: 4) composto de E-FMV.35S-1:1:2 (SEQ ID NO: 179) + P-SETit.Ifr-1:1:3 (SEQ ID NO: 61) + L-SETit.Ifr-1:1:1 (SEQ ID NO: 136)); pMON120705 ((EXP-FMV.35S-SETit.Gst:b (SEQ ID NO: 3) composto de E-FMV.35S- 1:1:2 (SEQ ID NO: 179) + P-SETit.Gst-1:1:2 (SEQ ID NO: 59) + L- SETit.Gst-1:1:1 (SEQ ID NO: 135)) e pMON127449 ((P-SETit.Fba-1:1:1 (SEQ ID NO: 51) + L-SETit.Fba-1:1:1 (SEQ ID NO: 131)). Tabela 4. Expressão de média de R0 GUS de Antera, Seda, endosperma, e embriões em plantas de milho transgênico, transformadas com as construções listadas.

[00118] O nível médio de expressão de GUS na semente e tecidos reprodutivos variou entre as construções. Os níveis de expressão mais altos em Antera no estágio de VT foram observados para pMON116789 ((P-SETit.Rcc3-1:1:11 (SEQ ID NO: 90) + L-SETit.Rcc3-1:1:2 (SEQ ID NO: 162)); pMON127441 ((P-SETit.Ppc-1:1:4 (SEQ ID NO: 75) + L- SETit.Ppc-1:1:1 (SEQ ID NO: 148)); pMON120705 ((EXP-FMV.35S- SETit.Gst:b (SEQ ID NO: 3) composto de E-FMV.35S-1:1:2 (SEQ ID NO: 179) + P-SETit.Gst-1:1:2 (SEQ ID NO: 59) + L-SETit.Gst-1:1:1 (SEQ ID NO: 135)); pMON132037 ((EXP-SETit.Ubq1:1:1 (SEQ ID NO: 20) composto de P-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 102) + L-SETit.Ubq1- 1:1:1 (SEQ ID NO: 169) + I-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 177)); pMON127447 ((P-SETit.Rbcs-1:1:1 (SEQ ID NO: 87) + L-SETit.Rbcs- 1:1:1 (SEQ ID NO: 160)); pMON127444 ((P-SETit.CP29-1:1:4 (SEQ ID NO: 42) + L-SETit.CP29-1:1:1 (SEQ ID NO: 124)) e pMON120706 ((EXP-FMV.35S-SETit.Ifr (SEQ ID NO: 4) composto de E-FMV.35S- 1:1:2 (SEQ ID NO: 179) + P-SETit.Ifr-1:1:3 (SEQ ID NO: 61) + L- SETit.Ifr-1:1:1 (SEQ ID NO: 136)).

[00119] Os níveis médios de expressão de GUS mais altos na seda foram observados em plantas transformadas com pMON120706 ((EXP- FMV.35S-SETit.Ifr (SEQ ID NO: 4) composto de E-FMV.35S-1:1:2 (SEQ ID NO: 179) + P-SETit.Ifr-1:1:3 (SEQ ID NO: 61) + L-SETit.Ifr-1:1:1 (SEQ ID NO: 136)); pMON127446 ((P-SETit.PSI-4a-1:1:1 (SEQ ID NO: 86) + L-SETit.PSI-4a-1:1:1 (SEQ ID NO: 159)); pMON120709 ((P-SETit.Nrt2- 1:1:3 (SEQ ID NO: 65) + L-SETit.Nrt2-1:1:2 (SEQ ID NO: 139)); pMON127447 ((P-SETit.Rbcs-1:1:1 (SEQ ID NO: 87) + L-SETit.Rbcs- 1:1:1 (SEQ ID NO: 160)) e pMON132037 ((EXP-SETit.Ubq1:1:1 (SEQ ID NO: 20) composto de P-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 102) + L- SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 169) + I-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 177)). A expressão média de GUS no embrião 21 DAP em desenvolvimento foi observada em plantas transformadas com pMON127442 ((P-SETit.Gapdh2-1:1:3 (SEQ ID NO: 55) + L- SETit.Gapdh2-1:1:1 (SEQ ID NO: 133)); pMON120709 ((P-SETit.Nrt2- 1:1:3 (SEQ ID NO: 65) + L-SETit.Nrt2-1:1:2 (SEQ ID NO: 139)); pMON132037 ((EXP-SETit.Ubq1:1:1 (SEQ ID NO: 20) composto de P- SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 102) + L-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 169) + I-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 177)); pMON120705 ((EXP- FMV.35S-SETit.Gst:b (SEQ ID NO: 3) composto de E-FMV.35S-1:1:2 (SEQ ID NO: 179) + P-SETit.Gst-1:1:2 (SEQ ID NO: 59) + L-SETit.Gst- 1:1:1 (SEQ ID NO: 135)) e pMON120699 ((EXP-FMV.35S-SETit.Gst:a (SEQ ID NO: 2) composto de E-FMV.35S-1:1:2 (SEQ ID NO: 179) + P- SETit.Gst-1:1:1 (SEQ ID NO: 58) + L-SETit.Gst-1:1:1 (SEQ ID NO: 135)). A expressão média de GUS foi também mais alta em plantas transformadas com pMON127442 ((P-SETit.Gapdh2-1:1:3 (SEQ ID NO: 55) + L-SETit.Gapdh2-1:1:1 (SEQ ID NO: 133)) e pMON120709 ((P- SETit.Nrt2-1:1:3 (SEQ ID NO: 65) + L-SETit.Nrt2-1:1:2 (SEQ ID NO: 139))

[00120] As plantas transformadas com os vetores de expressão de GUS, pMON112215 ((P-SETit.Rcc3-1:1:1 (SEQ ID NO: 88) + L- SETit.Rcc3-1:1:1 (SEQ ID NO: 161)) foram cruzadas com plantas LH244 não transformadas para produzir uma população de F1 de transformantes. Os níveis de expressão de GUS foram medidos em tecidos selecionados ao longo de desenvolvimento. Os tecidos F1 usados para este estudo foram: embrião da semente embebida, endospermas de sementes embebidos, raiz (3 dias após a germinação), coleóptilos (3 dias após a germinação), raiz V3, folha V3, raiz V7, folhas maduras V7, raiz seminal VT (no pendoamento, antes da reprodução), internó VT, sabugo VT, antera VT, pólen VT, seda VT, núcleo 7 dias após a polinização, o embrião de 21 dias após a polinização, endosperma 21 dias após a polinização, embrião de 35 dias após a polinização, endosperma 35 dias após a polinização.

[00121] O estresse por secura foi induzido em plantas R0 V3 e em plantas F1 V3 por retenção de regagem por 4 dias permitindo que o teor de água seja reduzida em pelo menos 50% do teor de água original da planta completamente regada. O protocolo de secura era constituído essencialmente das seguintes etapas. Plantas de estágio V3 foram privadas de água. Na medida em que uma planta de milho experimenta a secura, a forma da folha irá mudar a partir da aparência desdobrada e saudável usual para uma folha demonstrando dobragem no feixe vascular da costela central e aparecendo em forma de V quando vista a partir da ponta da folha para o caule. Esta mudança na morfologia geralmente começava a ocorrer por cerca de 2 dias após a cessação da regagem e foi demonstrada em experiências anteriores como estando associada com a perda de água em torno de 50% tal como medido pelo peso de vasos antes da cessação da regagem e o peso dos vasos quando a morfologia de ondulação da folha foi observada em plantas não regadas. As plantas foram consideradas como estando sob condições de secura, quando as folhas mostraram murchamento como evidenciado por uma ondulação interna (em forma de V) da folha. Este nível de estresse é considerado como sendo uma forma de estresse subletal. Amostras de folhas de controle foram tomadas de cada planta para testar GUS antes da indução de secura. A secura (indicada como "Des" na Tabela 5 abaixo) foi então induzida e uma vez que cada planta demonstrou a indução de secura como acima definido, a planta foi destruída para adquirir tanto amostras da raiz quanto de folhas. Os níveis de expressão de GUS nas folhas foram comparados com as amostras de tecidos de controle das mesmas plantas anteriores à secura. Para as plantas de geração de R0, quatorze plantas para cada vetor foram usadas. Para a análise de F1, oito plantas para cada vetor foram usadas e as medidas de GUS foram tomadas como descrito acima. Quatro das plantas F1 foram destruídas para amostragem do tecido para ensaio de GUS (Des) após a indução de secura. As outras duas plantas F1 foram deixadas se recuperar e, em seguida, destrutivamente amostradas para determinar se o padrão de expressão de GUS sob recuperação foi o mesmo que antes da secura ter sido imposta.

[00122] Além da secura, mudas de germinação de F1 e plantas de estágio F1 V3 transformadas com os vetores apresentados na Tabela 2 também foram expostas a condições de frio para determinar se os elementos reguladores e elementos reguladores quiméricos demonstraram expressão de GUS induzida pelo frio. Sessenta sementes, compostas de 6 sementes a partir de cada um dos 10 eventos de transformação para cada elemento regulador ou elemento regulador quimérico foram testados para a indução da expressão do gene sob condições de frio. As sementes foram germinadas em placas de Petri sobre papel filtro saturado de água. Três dias após a germinação, as mudas foram expostas ao estresse causado pelo frio, pela colocação das placas de Petri contendo as mudas germinadas na câmara escura de crescimento ajustada para 10 graus Celsius por 24 horas. No final do período de 24 horas, os tecidos da raiz e de coleóptilos foram amostrados para a expressão de GUS quantitativa como descrito acima. As plantas inteiras foram testadas para a indução da expressão de GUS sob o estresse causado pelo frio no estágio V3. Vinte plantas de milho no estágio V3, compostas de 2 plantas a partir de cada um dos 10 eventos de transformação para cada elemento regulador ou elemento regulador quimérico, foram expostas a uma temperatura de 12 graus Celsius em uma câmara de crescimento durante 24 horas. As plantas na câmara de crescimento foram crescidas em uma fluência de luz branca de 800 micromoles por metro quadrado por segundo com um ciclo de luz de dez horas de luz branca e catorze horas de escuridão. Após a exposição ao frio, os tecidos das folhas e de raízes foram amostrados para exposição de GUS quantitativa como descrito acima. A Tabela 5 abaixo mostra o nível de expressão de GUS em tecidos selecionados em plantas F1 transformadas com pMON112215. Tabela 5. Expressão de GUS F1 em plantas de milho transgênicas, transformadas com pMON112215.

[00123] As Plantas de milho F1, transformadas com pMON112215 ((P-SETit.Rcc3-1: 1:1 (SEQ ID NO: 88) + L-SETit.Rcc3-1:1:1 (SEQ ID NO: 161)) demonstraram altos níveis de expressão em tecido de anteras VT. A expressão em pólen também foi observada como sendo maior em tecidos diferentes de antera. A expressão foi observada em torno de níveis de base em embrião em desenvolvimento e endosperma, seda VT, raiz seminal VT e internós VT. Usando mais métodos de ensaio sensíveis, tais como ELISA de expressão de TIC809, o líder e promotor SETit.Rcc3 demonstraram anteriormente dirigir a expressão de um transgene em tecidos da raiz do milho estavelmente transformadas (WO 2009/126470).

Exemplo 3: Análise de Elementos reguladores que conduzem GUS no milho transgênico

[00124] O tecido de folha e a raiz do milho de mudas de 12 a 13 dias de idade são bombardeados com a expressão de Plantas GUS e vetores de controle para determinar a capacidade de elementos reguladores transcricionais derivados de Setaria italica para dirigir a expressão de um transgene, GUS.

[00125] Os tecidos de plantas de milho foram transformados com as construções de expressão Plantas GUS listados na Tabela 6 abaixo. Elementos reguladores apresentados no exemplo 1 foram clonados em um vetor de expressão de base de planta, usando métodos padrões conhecidos na técnica. Os vetores de expressão de plantas resultantes continham uma região da fronteira direita de Agrobacterium tumefaciens, um primeiro cassete de transgene para testar o elemento regulador quimérico ou regulador composto de um elemento regulador quimérico ou regulador, operacionalmente ligado a um íntron derivado da proteína de choque térmico HSP70 de Zea mays (I-Zm.DnaK-1: 1:1, SEQ ID NO: 1102), operacionalmente ligada a uma sequência de codificação para β-glucuronidase (GUS) que possuía um íntron processável (GUS-2, SEQ ID NO: 1091), operacionalmente ligado à região de terminação 3' do gene da proteína de transferência de lipídeo de arroz (T-Os.LTP-1: 1:1, SEQ ID NO: 1089); um segundo cassete de seleção de transgene usado para a seleção de células de plantas transformadas que conferiram resistência ao herbicida glifosato (conduzido pelo grupo de elemento transcricional regulador de Actina 1 de arroz, SEQ ID NO: 1098), e uma região da fronteira esquerda a partir de A. tumefaciens. Os plasmídeos resultantes, pMON129227, pMON129228, pMON129229, pMON129230, pMON129231, pMON129232, pMON129233, pMON129234, pMON129235, pMON129236, pMON129237, pMON129238, pMON129239, pMON129240, pMON129241, pMON129242, pMON129243, pMON129244, pMON129245, pMON129246, pMON129247, pMON129248, pMON129249, pMON129250, pMON129251, pMON129252, pMON129253, pMON129254, pMON129255, pMON129256, pMON129257, pMON129258 e pMON129259 foram usados para transformar o tecido de plantas de milho usando bombardeamento de partículas. Tabela 6. Vetores Binários de Transformação de Planta, elementos reguladores quiméricos ou reguladores, Gus e 3' UTRs.

[00126] O vetor de transformação da planta, pMON129227 é composto do elemento promotor, P-SETit.Cyp-1-1:1:1 (SEQ ID NO: 43), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Cyp-1-1:1:1 (SEQ ID NO: 125). O vetor de transformação da planta, pMON129228 é composto do elemento promotor, P-SETit.Cyp78a-1:1:2 (SEQ ID NO: 44), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Cyp78a- 1:1:1 (SEQ ID NO: 126). O vetor de transformação da planta, pMON129229 é composto do elemento promotor, P-SETit.OMT2.1- 1:1:2 (SEQ ID NO: 66), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.OMT2.1-1:1:1 (SEQ ID NO: 140). O vetor de transformação da planta, pMON129230 é composto do elemento promotor, P-SETit.OMT2.2-1:1:2 (SEQ ID NO: 67), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.OMT2.2-1:1:2 (SEQ ID NO: 142). O vetor de transformação da planta, pMON129231 é composto do elemento promotor, P-SETit.OMT2.3-1:1:1 (SEQ ID NO: 68), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.OMT2.2-1:1:1 (SEQ ID NO: 141). O vetor de transformação da planta, pMON129232 é composto do elemento promotor, P-SETit.Grcw2-1:1:1 (SEQ ID NO: 56), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Grcw2- 1:1:1 (SEQ ID NO: 134). O vetor de transformação da planta, pMON129233 é composto do elemento promotor, P-SETit.Prx2-1:1:3 (SEQ ID NO: 81), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L- SETit.Prx2-1:1:2 (SEQ ID NO: 155). O vetor de transformação da planta, pMON129234 é composto do elemento promotor, P-SETit.Srp-1:1:2 (SEQ ID NO: 92), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L- SETit.Srp-1:1:1 (SEQ ID NO: 163). O vetor de transformação da planta, pMON129235 é composto do elemento promotor, P-SETit.LaDo-1:1:2 (SEQ ID NO: 62), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L- SETit.LaDo-1:1:1 (SEQ ID NO: 137). O vetor de transformação da planta, pMON129236 é composto do elemento promotor, P-SETit.Aip- 1:1:1 (SEQ ID NO: 27), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Aip-1:1:1 (SEQ ID NO: 109). O vetor de transformação da planta, pMON129237 é composto do elemento promotor, P-SETit.Prx- 1:1:1 (SEQ ID NO: 79), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Prx-1:1:1 (SEQ ID NO: 153). O vetor de transformação da planta, pMON129238 é composto do elemento promotor, P-SETit.Cbl7- 1:1:1 (SEQ ID NO: 34), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Cbl7-1:1:1 (SEQ ID NO: 115). O vetor de transformação da planta, pMON129239 é composto do elemento promotor, P- SETit.Fst-1:1:1 (SEQ ID NO: 54), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Fst-1:1:1 (SEQ ID NO: 132). O vetor de transformação da planta, pMON129240 é composto do elemento promotor, P-SETit.Cda-1:1:1 (SEQ ID NO: 36), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Cda-1:1:1 (SEQ ID NO: 117). O vetor de transformação da planta, pMON129241 é composto do elemento promotor, P-SETit.Prx3-1:1:4 (SEQ ID NO: 83), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Prx3-1:1:1 (SEQ ID NO: 156). O vetor de transformação da planta, pMON129242 é composto do elemento promotor, P-SETit.Prx3-1:1:3 (SEQ ID NO: 82), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Prx3-1:1:1 (SEQ ID NO: 156). O vetor de transformação da planta, pMON129243 é composto do elemento promotor, P-SETit.Prx47-1:1:2 (SEQ ID NO: 84), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Prx47- 1:1:1 (SEQ ID NO: 157). O vetor de transformação da planta, pMON129244 é composto do elemento promotor, P-SETit.Eie-1:1:1 (SEQ ID NO: 49), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L- SETit.Eie-1:1:1 (SEQ ID NO: 129). O vetor de transformação da planta, pMON129245 é composto do elemento promotor, P-SETit.Omt3-1:1:3 (SEQ ID NO: 69), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L- SETit.Omt3-1:1:1 (SEQ ID NO: 143). O vetor de transformação da planta, pMON129246 é composto do elemento promotor, P-SETit.Cys- 1:1:2 (SEQ ID NO: 45), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Cys-1:1:1 (SEQ ID NO: 127). O vetor de transformação da planta, pMON129247 é composto do elemento promotor, P-SETit.Cys- 1:1:3 (SEQ ID NO: 46), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Cys-1:1:1 (SEQ ID NO: 127). O vetor de transformação da planta, pMON129248 é composto do elemento promotor, P-SETit.Ucc1- 1:1:2 (SEQ ID NO: 105), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Ucc1-1:1:1 (SEQ ID NO: 170). O vetor de transformação da planta, pMON129249 é composto do elemento promotor, P- SETit.Tip-1:1:4 (SEQ ID NO: 97), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Tip-1:1:1 (SEQ ID NO: 165). O vetor de transformação da planta, pMON129250 é composto do elemento promotor, P-SETit.Prx72-1:1:2 (SEQ ID NO: 85), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Prx72-1:1:1 (SEQ ID NO: 158). O vetor de transformação da planta, pMON129251 é composto do elemento promotor, P-SETit.Prx17-1:1:2 (SEQ ID NO: 80), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Prx17-1:1:1 (SEQ ID NO: 154). O vetor de transformação da planta, pMON129252 é composto do elemento promotor, P-SETit.Mt1-1:1:2 (SEQ ID NO: 63), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Mt1-1:1:1 (SEQ ID NO: 138). O vetor de transformação da planta, pMON129253 é composto do elemento promotor, P-SETit.Ali1-1:1:3 (SEQ ID NO: 31), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Ali1-1:1:1 (SEQ ID NO: 112). O vetor de transformação da planta, pMON129254 é composto do elemento promotor, P-SETit.Rcc3-1:1:16 (SEQ ID NO: 91), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Rcc3- 1:1:2 (SEQ ID NO: 162). O vetor de transformação da planta, pMON129255 é composto do elemento promotor, P-SETit.Pip2-3-1:1:1 (SEQ ID NO: 72), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L- SETit.Pip2-3-1:1:1 (SEQ ID NO: 146). O vetor de transformação da planta, pMON129256 é composto do elemento promotor, P-SETit.Tga6- 1:1:2 (SEQ ID NO: 95). O vetor de transformação da planta, pMON129257 é composto do elemento promotor, P-SETit.25509-1:1:3 (SEQ ID NO: 23). O vetor de transformação da planta, pMON129258 é composto do elemento promotor, P-SETit.Grf-1:1:2 (SEQ ID NO: 57). O vetor de transformação da planta, pMON129259 é composto do elemento promotor, P-SETit.Omt4_2-1:1:2 (SEQ ID NO: 70), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Omt4_2-1:1:1 (SEQ ID NO: 144).

[00127] Tecidos de plantas de milho foram transformados com construções de expressão de plantas GUS, pMON129227, pMON129228, pMON129229, pMON129230, pMON129231, pMON129232, pMON129233, pMON129234, pMON129235, pMON129236, pMON129237, pMON129238, pMON129239, pMON129240, pMON129241, pMON129242, pMON129243, pMON129244, pMON129245, pMON129246, pMON129247, pMON129248, pMON129249, pMON129250, pMON129251, pMON129252, pMON129253, pMON129254, pMON129255, pMON129256, pMON129257, pMON129258 e pMON129259, usando bombardeamento de partículas.

[00128] O tecido da planta do milho foi transformado usando métodos de bombardeamento de partículas conhecidos dos versados na técnica com os vetores descritos acima. Resumidamente, as sementes de milho LH244 são esterilizadas superficialmente e deixadas germinar em bandejas com fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de escuridão. Após 12 a 13 dias, o tecido é colhido em condições estéreis a partir de mudas e é usado para bombardeamento. Aproximadamente 10 folhas e 15 explantes de raiz são usados para bombardeamento de cada construção experimental. As amostras de tecido são colocadas aleatoriamente em uma placa de petri contendo o meio de cultura de planta. Dez microgramas de DNA de plasmídeo são usados para revestir as partículas de ouro de 0,6 mícron (catálogo # 165-2262 BioRad, Hercules, CA) para o bombardeamento. Macrocarreadores foram carregados com as partículas de ouro revestidas com DNA (catálogo # 165-2335 Bio-Rad, Hercules CA). Uma pistola biobalística PDS 1000/He foi usada para a transformação (Catálogo # 165-2257 Bio-Rad, Hercules CA). Os tecidos de folha e raiz bombardeados foram deixados incubar no escuro durante 24 horas a 26 graus Celsius. Após esta incubação durante a noite, os tecidos são corados em solução para expressão de GUS durante a noite a 37 graus Celsius. Após a coloração durante a noite, os tecidos são embebidos em etanol a 70% durante a noite para remover clorofila e revelar a coloração de GUS. Os tecidos foram então fotografados e uma classificação de "0" a "4" refletindo o nível de expressão de GUS que é atribuído a cada construção.

[00129] Quatro plasmídeos de controle foram também usados para bombardeamento designados, pMON19469, pMON59327, pMON30098 e pMON103758. Os vetores de plasmídeo, pMON19469, pMON59327, e pMON103758 continham elementos reguladores transcritionais conhecidos conduzindo a expressão de GUS e foram usados como comparações para a expressão. O vetor de plasmídeo, pMON30098 era composto por um cassete de transgene usado para a expressão da proteína fluorescente verde e serviu como um controle negativo no ensaio de bombardeamento. O vetor de plasmídeo, pMON19469 é composto por um cassete de transgene composto de promotor P-CaMV.35S-enh-1:1:9 (SEQ ID NO: 1096), derivado do promotor do vírus do mosaico da couve-flor 35S, operacionalmente ligado em 5' a um íntron derivado da proteína de choque térmico HSP70 de Zea mays (I-Zm.DnaK-1:1:1, SEQ ID NO: 1102), ligada operacionalmente a uma sequência de codificação para β- glucuronidase (GUS-3, SEQ ID NO: 1092), operacionalmente ligada em 5' a região de terminação 3' de nopalina sintase de A. tumefaciens (T- AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 1088). O vetor de plasmídeo, pMON59327 é composto por um cassete de transgene usado para a expressão de GUS que é composto pelo promotor de arroz Rcc3 (P- Os.Rcc3-1:1:24, SEQ ID NO: 1093) e líder (L-Os . Rcc3-1: 1:1, SEQ ID NO: 1094), operacionalmente ligados em 5' de um íntron derivado da proteína de choque térmico HSP70 de Zea mays (I-Zm.DnaK-1:1:1, SEQ ID NO: 1102), ligada operacionalmente em 5' a uma sequência de codificação para β-glucuronidase (GUS-3, SEQ ID NO: 1092), ligada operacionalmente em 5' para a região de terminação 3' de nopalina sintase de A. tumefaciens (T-AGRtu.nos- 1:1:13, SEQ ID NO: 1088). O vetor plasmídico, pMON103758 é composto por um cassete de transgene usado para a expressão de GUS que é composto pelo promotor de arroz Rcc3 (P-Os.Rcc3-1:1:24, SEQ ID NO: 1093) e líder (L-Os . Rcc3-1: 1:1, SEQ ID NO: 1094), operacionalmente ligado em 5' a um íntron derivado da proteína de choque térmico HSP70 de Zea mays (I-Zm.DnaK-1: 1:1, SEQ ID NO: 1102), ligado operacionalmente em 5' a uma sequência de codificação para β-glucuronidase (GUS-3, SEQ ID NO: 1092), ligada operacionalmente em 5' para a região de terminação 3' de nopalina sintase de A. tumefaciens (T-AGRtu.nos- 1:1:13, SEQ ID NO: 1088). O vetor de plasmídeo, pMON30098 era composto por um cassete de transgene de proteína fluorescente verde e serviu como um controle negativo no ensaio de bombardeamento e era composto de um cassete de transgene composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP-CaMV.35S-enh (SEQ ID NO: 1095) que era ainda composto do promotor, P-CaMV.35S-enh-1:1:9 (SEQ ID NO: 1096), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-CaMV.35S-1:1:2 (SEQ ID NO: 1097), operacionalmente ligado em 5' a um íntron derivado da proteína de choque térmico HSP70 de Zea mays (I-Zm.DnaK-1: 1:1, SEQ ID NO: 1102), operacionalmente ligado em 5' a uma sequência que codifica GFP (CR-Av.GFP.nno, SEQ ID NO: 1103), operacionalmente ligada em 5' a região de terminação 3' de nopalina sintase de A. tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 1088).

[00130] As classificações de expressão média de GUS a partir do ensaio bombardeado de partículas são mostradas na Tabela 7 abaixo. Tabela 7. Classificações de expressão média de GUS para tecido de folha e de raiz de milho bombardeados transformados com as construções de expressão de Planta GUS listados.

[00131] O nível médio mais alto de expressão média de GUS para os tecidos de raiz transformados por bombardeamento partícula foi observado usando as construções, pMON129231 ((P-SETit.OMT2.3- 1:1:1 (SEQ ID NO: 68) + L-SETit.OMT2.2-1:1:1 (SEQ ID NO: 141)); pMON129234 ((P-SETit.Srp-1:1:2 (SEQ ID NO: 92) + L-SETit.Srp-1:1:1 (SEQ ID NO: 163)); pMON129237 ((P-SETit.Prx-1:1:1 (SEQ ID NO: 79) + L-SETit.Prx-1:1:1 (SEQ ID NO: 153)); pMON129241 ((P-SETit.Prx3- 1:1:4 (SEQ ID NO: 83) + L-SETit.Prx3-1:1:1 (SEQ ID NO: 156)); pMON129242 ((P-SETit.Prx3-1:1:3 (SEQ ID NO: 82) + L-SETit.Prx3- 1:1:1 (SEQ ID NO: 156)); pMON129243 ((P-SETit.Prx47-1:1:2 (SEQ ID NO: 84) + L-SETit.Prx47-1:1:1 (SEQ ID NO: 157)); pMON129247 ((P- SETit.Cys-1:1:3 (SEQ ID NO: 46) + L-SETit.Cys-1:1:1 (SEQ ID NO: 127)); pMON129248 ((P-SETit.Ucc1-1:1:2 (SEQ ID NO: 105) + L- SETit.Ucc1-1:1:1 (SEQ ID NO: 170)); pMON129249 ((P-SETit.Tip-1:1:4 (SEQ ID NO: 97) + L-SETit.Tip-1:1:1 (SEQ ID NO: 165)); pMON129250 ((P-SETit.Prx72-1:1:2 (SEQ ID NO: 85) + L-SETit.Prx72-1:1:1 (SEQ ID NO: 158)); pMON129254 ((P-SETit.Rcc3-1:1:16 (SEQ ID NO: 91) + L- SETit.Rcc3-1:1:2 (SEQ ID NO: 162)) e pMON129255 ((P-SETit.Pip2-3- 1:1:1 (SEQ ID NO: 72) + L-SETit.Pip2-3-1:1:1 (SEQ ID NO: 146)). A expressão de folha foi vista mais alta em tecidos bombardeados com as construções pMON129241 ((P-SETit.Prx3-1:1:4 (SEQ ID NO: 83) + L- SETit.Prx3-1:1:1 (SEQ ID NO: 156)) e pMON129250 ((P-SETit.Prx72- 1:1:2 (SEQ ID NO: 85) + L-SETit.Prx72-1:1:1 (SEQ ID NO: 158)).

Exemplo 4: Análise de Elementos reguladores que conduzem GUS no milho transgênico

[00132] As plantas de milho foram transformadas com vetores de expressão de planta contendo os elementos reguladores de teste que conduzem a expressão do transgene β-glucuronidase (GUS), e as plantas resultantes foram analisadas para à expressão da proteína de GUS.

[00133] As plantas de milho foram transformadas com as construções de expressão de plantas GUS, listados na Tabela 8, abaixo. Elementos reguladores apresentados no Exemplo 1 para a expressão de monocotiledôneas foram clonados em um vetor de expressão de planta de base, usando métodos padrões conhecidos na técnica. Os vetores de expressão resultantes de plantas continham uma região da fronteira direita de Agrobacterium tumefaciens, um primeiro cassete de transgene para testar o elemento regulador quimérico ou regulador composto de, um elemento regulador quimérico ou regulador, operacionalmente ligado a um íntron derivado da proteína de choque térmico HSP70 de Zea mays (I-Zm.DnaK-1:1:1, SEQ ID NO: 1102), ligado operacionalmente a uma sequência de codificação para β- glucuronidase (GUS), que possuía um íntron processável (GUS-2, SEQ ID NO: 1091), operacionalmente ligado à região de terminação 3' do gene da proteína de transferência de lipídeo arroz (T-Os.LTP-1:1:1, SEQ ID NO: 1089); um segundo cassete de seleção de transgene usado para a seleção de células de plantas transformadas que conferiram resistência ao herbicida glifosato (conduzido pelo promotor de Actina 1 de arroz, SEQ ID NO: 1098), e uma região da fronteira esquerda a partir de A. tumefaciens. Os plasmídeos resultantes, pMON129227, pMON129228, pMON129229, pMON129230, pMON129231, pMON129232, pMON129233, pMON129234, pMON129235, pMON129236, pMON129237, pMON129238, pMON129239, pMON129240, pMON129241, pMON129242, pMON129243, pMON129244, pMON129245, pMON129246, pMON129247, pMON129249, pMON129250, pMON129251, pMON129252, pMON129253, pMON129254, pMON129255, pMON129256, pMON129257, pMON129258 e pMON129259 foram usados para transformar as plantas de milho. Tabela 8. Vetores Binários de Transformação de Plantas, Elementos Reguladores Quiméricos ou Reguladores, GUS e 3' UTRs.

[00134] O vetor de transformação da planta, pMON129227 é composto do elemento promotor, P-SETit.Cyp-1-1:1:1 (SEQ ID NO: 43), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Cyp-1-1:1:1 (SEQ ID NO: 125). O vetor de transformação da planta, pMON129228 é composto do elemento promotor, P-SETit.Cyp78a-1:1:2 (SEQ ID NO: 44), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Cyp78a- 1:1:1 (SEQ ID NO: 126). O vetor de transformação da planta, pMON129229 é composto do elemento promotor, P-SETit.OMT2.1- 1:1:2 (SEQ ID NO: 66), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.OMT2.1-1:1:1 (SEQ ID NO: 140). O vetor de transformação da planta, pMON129230 é composto do elemento promotor, P-SETit.OMT2.2-1:1:2 (SEQ ID NO: 67), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.OMT2.2-1:1:2 (SEQ ID NO: 142). O vetor de transformação da planta, pMON129231 é composto do elemento promotor, P-SETit.OMT2.3-1:1:1 (SEQ ID NO: 68), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.OMT2.2-1:1:1 (SEQ ID NO: 141). O vetor de transformação da planta, pMON129232 é composto do elemento promotor, P-SETit.Grcw2-1:1:1 (SEQ ID NO: 56), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Grcw2- 1:1:1 (SEQ ID NO: 134). O vetor de transformação da planta, pMON129233 é composto do elemento promotor, P-SETit.Prx2-1:1:3 (SEQ ID NO: 81), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L- SETit.Prx2-1:1:2 (SEQ ID NO: 155). O vetor de transformação da planta, pMON129234 é composto do elemento promotor, P-SETit.Srp-1:1:2 (SEQ ID NO: 92), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L- SETit.Srp-1:1:1 (SEQ ID NO: 163). O vetor de transformação da planta, pMON129235 é composto do elemento promotor, P-SETit.LaDo-1:1:2 (SEQ ID NO: 62), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L- SETit.LaDo-1:1:1 (SEQ ID NO: 137). O vetor de transformação da planta, pMON129236 é composto do elemento promotor, P-SETit.Aip- 1:1:1 (SEQ ID NO: 27), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Aip-1:1:1 (SEQ ID NO: 109). O vetor de transformação da planta, pMON129237 é composto do elemento promotor, P-SETit.Prx- 1:1:1 (SEQ ID NO: 79), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Prx-1:1:1 (SEQ ID NO: 153). O vetor de transformação da planta, pMON129238 é composto do elemento promotor, P-SETit.Cbl7- 1:1:1 (SEQ ID NO: 34), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Cbl7-1:1:1 (SEQ ID NO: 115). O vetor de transformação da planta, pMON129239 é composto do elemento promotor, P- SETit.Fst-1:1:1 (SEQ ID NO: 54), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Fst-1:1:1 (SEQ ID NO: 132). O vetor de transformação da planta, pMON129240 é composto do elemento promotor, P-SETit.Cda-1:1:1 (SEQ ID NO: 36), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Cda-1:1:1 (SEQ ID NO: 117). O vetor de transformação da planta, pMON129241 é composto do elemento promotor, P-SETit.Prx3-1:1:4 (SEQ ID NO: 83), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Prx3-1:1:1 (SEQ ID NO: 156). O vetor de transformação da planta, pMON129242 é composto do elemento promotor, P-SETit.Prx3-1:1:3 (SEQ ID NO: 82), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Prx3-1:1:1 (SEQ ID NO: 156). O vetor de transformação da planta, pMON129243 é composto do elemento promotor, P-SETit.Prx47-1:1:2 (SEQ ID NO: 84), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Prx47- 1:1:1 (SEQ ID NO: 157). O vetor de transformação da planta, pMON129244 é composto do elemento promotor, P-SETit.Eie-1:1:1 (SEQ ID NO: 49), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L- SETit.Eie-1:1:1 (SEQ ID NO: 129). O vetor de transformação da planta, pMON129245 é composto do elemento promotor, P-SETit.Omt3-1:1:3 (SEQ ID NO: 69), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L- SETit.Omt3-1:1:1 (SEQ ID NO: 143). O vetor de transformação da planta, pMON129246 é composto do elemento promotor, P-SETit.Cys- 1:1:2 (SEQ ID NO: 45), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Cys-1:1:1 (SEQ ID NO: 127). O vetor de transformação da planta, pMON129247 é composto do elemento promotor, P-SETit.Cys- 1:1:3 (SEQ ID NO: 46), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Cys-1:1:1 (SEQ ID NO: 127). O vetor de transformação da planta, pMON129249 é composto do elemento promotor, P-SETit.Tip- 1:1:4 (SEQ ID NO: 97), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Tip-1:1:1 (SEQ ID NO: 165). O vetor de transformação da planta, pMON129250 é composto do elemento promotor, P- SETit.Prx72-1:1:2 (SEQ ID NO: 85), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Prx72-1:1:1 (SEQ ID NO: 158). O vetor de transformação da planta, pMON129251 é composto do elemento promotor, P-SETit.Prx17-1:1:2 (SEQ ID NO: 80), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Prx17-1:1:1 (SEQ ID NO: 154). O vetor de transformação da planta, pMON129252 é composto do elemento promotor, P-SETit.Mt1-1:1:2 (SEQ ID NO: 63), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Mt1-1:1:1 (SEQ ID NO: 138). O vetor de transformação da planta, pMON129253 é composto do elemento promotor, P-SETit.Ali1-1:1:3 (SEQ ID NO: 31), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Ali1-1:1:1 (SEQ ID NO: 112). O vetor de transformação da planta, pMON129254 é composto do elemento promotor, P-SETit.Rcc3-1:1:16 (SEQ ID NO: 91), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Rcc3- 1:1:2 (SEQ ID NO: 162). O vetor de transformação da planta, pMON129255 é composto do elemento promotor, P-SETit.Pip2-3-1:1:1 (SEQ ID NO: 72), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L- SETit.Pip2-3-1:1:1 (SEQ ID NO: 146). O vetor de transformação da planta, pMON129256 é composto do elemento promotor, P-SETit.Tga6- 1:1:2 (SEQ ID NO: 95). O vetor de transformação da planta, pMON129257 é composto do elemento promotor, P-SETit.25509-1:1:3 (SEQ ID NO: 23). O vetor de transformação da planta, pMON129258 é composto do elemento promotor, P-SETit.Grf-1:1:2 (SEQ ID NO: 57). O vetor de transformação da planta, pMON129259 é composto do elemento promotor, P-SETit.Omt4_2-1:1:2 (SEQ ID NO: 70), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Omt4_2-1:1:1 (SEQ ID NO: 144).

[00135] As plantas foram transformadas com construções de expressão de plantas GUS, pMON129227, pMON129228, pMON129229, pMON129230, pMON129231, pMON129232, pMON129233, pMON129234, pMON129235, pMON129236, pMON129237, pMON129238, pMON129239, pMON129240, pMON129241, pMON129242, pMON129243, pMON129244, pMON129245, pMON129246, pMON129247, pMON129249, pMON129250, pMON129251, pMON129252, pMON129253, pMON129254, pMON129255, pMON129256, pMON129257, pMON129258 e pMON129259.

[00136] As plantas foram transformadas usando transformações mediadas Agrobacterium e embriões de sementes de milho LH244 como descrito no Exemplo 2. O tecido da folha e da raiz foi colhido a partir de 1 a 5 transformantes e ensaiado quanto à expressão de GUS. A análise histoquímica de GUS foi usada para análise de expressão qualitativa de plantas transformadas. As seções de tecido inteiras foram incubadas com solução de coloração GUS X-Gluc (5-bromo-4-cloro-3- indolil-b-glucuronido) (1 miligrama/mililitro) para um período de tempo apropriado, lavadas, e inspecionadas visualmente para a coloração azul. A atividade de GUS foi qualitativamente determinada por inspeção visual direta ou inspecção sob um microscópio usando órgãos e tecidos das plantas selecionados. As plantas R0 foram inspecionadas para a expressão nas raízes e folhas.

[00137] Para análise quantitativa, a proteína total foi extraída a partir de tecidos selecionados de plantas de milho transformado. Um micrograma de proteína total foi usado com o substrato fluorogênico 4- metileumbeliferil-β-D-glucuronido (MUG) num volume total de reação de 50 microlitros. O produto da reação, 4-metilumbeliferona (4-MU), é maximamente fluorescente em pH elevado, em que o grupo hidroxil é ionizado. A adição de uma solução básica de carbonato de sódio, simultaneamente, interrompe o ensaio e ajusta o pH para a quantificação do produto fluorescente. A fluorescência foi medida com excitação a 365 nm, emissão a 445 nm usando um Fluoromax-3 com leitor Micromax, com largura de fenda fixa em 2 nm de excitação e 3 nm de emissão.

[00138] A expressão média de R0 GUS para as plantas transgênicas transformadas com as construções descritas na Tabela 8 é apresentada na Tabela 9 abaixo. Tabela 9. Expressão Média de Folha e Raiz R0 GUS V3 em plantas de milho transgênico, transformadas com as construções listadas.

[00139] Os níveis médios mais altos de expressão de GUS nas raizes de plantas de estágio V3 foram observados em plantas transformadas com as construções pMON129255 ((P-SETit.Pip2-3-1:1:1 (SEQ ID NO: 72) + L-SETit.Pip2-3-1:1:1 (SEQ ID NO: 146)) e pMON129249 ((P- SETit.Tip-1:1:4 (SEQ ID NO: 97) + L-SETit.Tip-1:1:1 (SEQ ID NO: 165)).

Exemplo 5: Análise de Elementos Reguladores de Actina e Tubulina que Conduzem GUS em Protoplastos de Milho

[00140] Protoplastos de folha de milho são transformados com vetores de expressão de planta contendo um elemento regulador transcricional de teste ou grupo de elementos de expressão reguladora transcricional, conduzindo a expressão do transgene β-glucuronidase (GUS), e comparados com os protoplastos de folha em que a expressão de GUS é conduzida por promotores constitutivos conhecidos.

[00141] As células de protoplastos de milho, derivadas de tecido de folha são transformadas usando métodos conhecidos na técnica com vetores de expressão de plantas para comparar a expressão de um transgene conduzida pelos grupos de elementos de expressão reguladora transcricionais, EXP-SETit.TubA3:1:3 (SEQ ID NO: 19), EXP-SETit.TubA2:1:3 (SEQ ID NO: 16), EXP-SETit.TubA2-2:1:1 (SEQ ID NO: 18), EXP-SETit.Act8:1:1 (SEQ ID NO: 9), EXP-SETit.Act8:1:2 (SEQ ID NO: 10), EXP-SETit.Act8:c (SEQ ID NO: 11), EXP- SETit.TubA2-1:1:2 (SEQ ID NO: 17) e EXP-SETit.TubA2:1:1 (SEQ ID NO: 15) com a de promotores constitutivos conhecidos. Cada grupo de elemento de expressão reguladora transcricional é clonado usando métodos conhecidos na técnica para um vetor de expressão de plantas mostrados na Tabela 10 abaixo. Os vetores de expressão de plantas resultantes são constituídos por um cassete de transgene composto por um grupo de elemento de expressão reguladora transcricional, operacionalmente ligado em 5' a uma sequência de codificação para β- glucuronidase (GUS) (GUS-1 ou GUS-3, representado por SEQ ID NOS: 1090 e 1092, respectivamente), que está ligada operacionalmente em 5' a uma região de terminação 3' derivada do gene de nopalina sintase A. tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 1088) ou o gene de trigo Hsp17 (T-Ta.Hsp17-1:1:1, SEQ ID NO: 1108).

[00142] Os plasmídeos de controle usados para comparação são construídos como descrito acima e são constituídos de grupos de elementos de expressão reguladora transcricional constitutivos, conhecidos. O vetor de plasmídeo de controle, pMON19469 é composto do grupo de elementos reguladores transcricionais, EXP-CaMV.35S- enh/I-Zm.DnaK-1:1:1 (SEQ ID NO: 1104). O vetor de plasmídeo de controle, pMON65328 é composto do grupo de elementos reguladores transcricionais, EXP-CaMV.35S-enh-Lhcb1/I-Os.Act1-1:1:9 (SEQ ID NO: 1105). O vetor de plasmídeo de controle, pMON25455 é composto do grupo de elementos reguladores transcricionais, EXP-Os.Act1: 1:1 (SEQ ID NO: 1098). O vetor de plasmídeo de controle, pMON122605 é composto do grupo de elementos reguladores transcricionais, EXP- Os.TubA-3: 1:1 (SEQ ID NO: 1107). Cada grupo de elemento regulador transcricional do vetor de controle está operacionalmente ligado em 5' a uma sequência de codificação para β-glucuronidase (GUS) (GUS-1 ou GUS-3, representada por SEQ ID NOS: 1090 e 1092, respectivamente), que está ligado operacionalmente em 5' a para uma região de terminação 3' derivada do gene de nopalina sintase A. tumefaciens (T- AGRtu.nos-1: 1:13, SEQ ID NO: 1088) ou do gene de trigo Hsp17 (T- Ta.Hsp17-1:1:1, SEQ ID NO: 1108). Além disso, três controles são fornecidos como controles para o GUS de base e expressão de luciferase, um controle de DNA, um vetor vazio que não é projetado para a expressão do transgene e um vetor de expressão usado para expressar a proteína fluorescente verde (GFP). Tabela 10. Vetores de expressão de plantas GUS e Grupos de Elementos de Expressão Reguladora Transcricional Correspondentes e Promotores Constitutivos, Líderes e Íntrons, e 3' UTR usados para Transformação de Protoplastos de Folhas de Milho.

[00143] O vetor de transformação da planta, pMON136270 é composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP- SETit.TubA3:1:3 (SEQ ID NO: 19), que é ainda composto do elemento promotor, P-SETit.TubA3-1:1:3 (SEQ ID NO: 101), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.TubA3-1:1:1 (SEQ ID NO: 168). O vetor de transformação da planta, pMON136272 é composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP-SETit.TubA2:1:3 (SEQ ID NO: 16), que é ainda composto do elemento promotor, P-SETit.TubA2- 1-1:1:3 (SEQ ID NO: 99), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.TubA2-1-1:1:1 (SEQ ID NO: 166), operacionalmente ligado em 5' ao elemento de íntron, I-SETit.TubA2_1-1:1:2 (SEQ ID NO: 176). O vetor de transformação da planta, pMON136275 é composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP-SETit.TubA2-2:1:1 (SEQ ID NO: 18), que é ainda composto do elemento promotor, P- SETit.TubA2-2-1:1:3 (SEQ ID NO: 100), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.TubA2-2-1:1:1 (SEQ ID NO: 167). O vetor de transformação da planta, pMON136276 é composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP-SETit.Act8:1:1 (SEQ ID NO: 9), que é ainda composto do elemento promotor, P-SETit.Act8-1:1:5 (SEQ ID NO: 24), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L- SETit.Act8-1:1:2 (SEQ ID NO: 106), operacionalmente ligado em 5' ao elemento de íntron, I-SETit.Act8-1:1:2 (SEQ ID NO: 172), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Act8-1:1:3 (SEQ ID NO: 107). O vetor de transformação da planta, pMON136277 é composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP- SETit.Act8:1:2 (SEQ ID NO: 10), que é ainda composto do elemento promotor, P-SETit.Act8-1:1:6 (SEQ ID NO: 25), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Act8-1:1:2 (SEQ ID NO: 106), operacionalmente ligado em 5' ao elemento de íntron, I-SETit.Act8-1:1:2 (SEQ ID NO: 172), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L- SETit.Act8-1:1:3 (SEQ ID NO: 107). O vetor de transformação da planta, pMON136278 é composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP-SETit.Act8:c (SEQ ID NO: 11), que é ainda composto do elemento promotor, P-SETit.Act8-1-1:1:2 (SEQ ID NO: 26), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Act8- 1:1:4 (SEQ ID NO: 108), operacionalmente ligado em 5' ao elemento de íntron, I-SETit.Act8-1:1:2 (SEQ ID NO: 172), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Act8-1:1:3 (SEQ ID NO: 107). O vetor de transformação da planta, pMON136279 é composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP-SETit.TubA2-1:1:2 (SEQ ID NO: 17), que é ainda composto do elemento promotor, P-SETit.TubA2-1- 1:1:2 (SEQ ID NO: 98), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.TubA2-1-1:1:1 (SEQ ID NO: 166). O vetor de transformação da planta, pMON136280 é composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP-SETit.TubA2:1:1 (SEQ ID NO: 15), que é ainda composto do elemento promotor, P-SETit.TubA2-1- 1:1:2 (SEQ ID NO: 98), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.TubA2-1-1:1:1 (SEQ ID NO: 166), operacionalmente ligado em 5' ao elemento de íntron, I-SETit.TubA2_1-1:1:2 (SEQ ID NO: 176).

[00144] Dois plasmídios, para uso em cotransformação e normalização de dados, são também construídos usando métodos conhecidos na técnica. Cada plasmídeo contém uma sequência de codificação de luciferase específica que é conduzida por um grupo de elemento de expressão reguladora transcricional constitutivo. O vetor de planta, pMON19437 é composto de um cassete de transgene composto de um promotor constitutivo (EXP-CaMV.35S-enh, SEQ ID NO: 1095), operacionalmente ligado em 5' a um íntron, (I-Zm.DnaK- 1:1:1, SEQ ID NO: 1102), operacionalmente ligado em 5' a uma sequência de codificação de luciferase de vaga-lume (Photinus pyralis) (LUCIFERASE:1:3, SEQ ID NO: 1109), operacionalmente ligada em 5' a uma região de terminação 3' do gene napolina sintase de Agrobacterium tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 1088). O vetor de planta, pMON63934 é composto de um cassete de transgene composto do grupo de elemento de expressão reguladora transcricional constitutivo, (EXP-CaMV.35S-enh-Lhcb1, SEQ ID NO: 1106), operacionalmente ligado em 5' a uma sequência de codificação de luciferase de rim-do-mar (Renilla reniformis) (CR-Ren.hRenilla Lucife- 0:0:1, SEQ ID NO: 1110), operacionalmente ligada em 5' a uma região de terminação 3' do gene napolina sintase de Agrobacterium tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 1088).

[00145] Os protoplastos de folha de milho são transformados usando um método de transformação baseado em PEG, semelhante aos conhecidos na técnica. As células de protoplastos são transformadas com um DNA prep composto de quantidades equimoleculares de dois plasmídeos de expressão de luciferase, pMON19437 e pMON63934 e um dos plasmídeos de teste e incubadas durante a noite em escuridão total. Após a incubação, as células são lavadas, ressuspensas e lisadas. As medições tanto de GUS quanto de luciferase são conduzidas usando alíquotas de cada preparação de lise. Essencialmente, as células de protoplástos transformadas, coletadas são lisadas em tampão de lise passivo 5X (Promega). Depois de deixar ocorrer a lise, as alíquotas da preparação lisada são colocadas em duas bandejas de poços pequenos diferentes. Uma bandeja é usada para medições de GUS. Para análise quantitativa da expressão de GUS, proteína total é extraída da preparação de lise. Um micrograma do total de proteína é usado com o substrato fluorogênico 4-metileumbeliferil-β-D-glucuronida (MUG) em um volume de reação total de 50 microlitres. O produto da reação, 4- metilumbeliferona (4-MU), é maximamente fluorescente em pH alto, onde o grupo hidroxil é ionizado. A adição de solução básica de carbonato de sódio simultaneamente interrompe o ensaio e ajusta o pH para quantificação do produto fluorescente. A fluorescência é medida com excitação a 365 nm, emissão a445 nm usando um Fluoromax-3 com leitor Micromax , com largura de fenda ajustada a 2nm de excitação e 3nm de emissão. Os valores de GUS são expressos como pmol de proteína 4-MU por minuto por miligrama de proteína (pmol 4-MU min-1 mg-1 proteína).

[00146] A segunda bandeja é usada para realizar um ensaio de luciferase dupla usando o sistema de ensaio de repórter de luciferase dupla (Promega, Madison, WI). Todos os reagentes de detecção de luciferase são preparados como descrito pelo fabricante e os ensaios são conduzidos seguindo o protocolo do fabricante (Ver, por exemplo, Promega Notes Magazine, No: 57, 1996, p.02). O reagente de luciferase de vaga-lume (LARII) é adicionado a cada amostra e o ensaio da atividade de luciferase de vaga-lume é registrado. Após a conclusão do ensaio de luciferase de vaga-lume, a luminescência do vaga-lume é resfriada bruscamente e a luminescência da luciferase Renilla reniformis simultaneamente ativada pela adição de reagente Stop & Glottm à amostra. A medição da atividade de luciferase Renilla reniformis é registrada após a ativação da luciferase Renilla. Uma ou duas transformações para cada grupo de elemento regulador de expressão transcricional são realizadas e os valores médios de expressão para cada grupo de elemento regulador de expressão transcricional são determinados a partir de várias amostras de cada experimento de transformação. As medições de amostra são feitas usando quatro replicatas de cada transformação de construção de grupo de elemento de expressão reguladora transcricional de teste, ou, alternativamente, três replicatas de cada construção de grupo de elemento de expressão reguladora transcricional de teste por um de dois experimentos de transformação. Os níveis médios de expressão de luciferase e GUS são fornecidos nas Tabelas 11 e 12. Os valores de luciferase de vaga-lume são fornecidos na coluna identificada como "Fluc" e os valores de luciferase de Renilla são fornecidos como na coluna identificada como "Rluc".

[00147] Para comparar a atividade relativa de cada grupo de elemento de expressão reguladora transcricional, Os valores de GUS são expressos como uma razão da expressão média de GUS para a atividade média de luciferase e normalizados com respeito aos níveis de expressão observados para os grupos de elementos de expressão reguladora transcricional EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 1098) e EXP- Os.TubA-3:1:1 (SEQ ID NO: 1107). A tabela 11 abaixo mostra as razões media de GUS/Rluc normalizadas com respeito a expressão de EXP- Os.Act1:1: e EXP-Os.TubA-3:1:1 em protoplastos de milho. Tabela 11. Expressão Média de Dobra de GUS/Rluc com Relação à Expressão de EXP-Os.TubA-3:1:1 em Células de Protoplastos de Folha de Milho.

Tabela 12. Expressão Média de Dobra de GUS/Fluc com Relação à Expressão de EXP-Os.TubA-3:1:1 em Células de Protoplastos de Folha de Milho.

[00148] As razões de GUS/Rluc e GUS/Fluc normalizadas fornecidas nas Tabelas 11 e 12 fornecem evidências de que a maioria dos elementos de expressão é capaz de conduzir a expressão de GUS nos protoplastos de folha de milho. As construções, pMON136275 (EXP- SETit.TubA2-2:1:1 (SEQ ID NO: 18)) e pMON136279 (EXP- SETit.TubA2-1:1:2 (SEQ ID NO: 17)) demonstraram a menor quantidade de expressão. A construção, pMON136270 (EXP- SETit.TubA3:1:3 (SEQ ID NO: 19)) forneceu o nível mais alto de expressão entre os elementos de teste em relação aos controles constitutivos.

Exemplo 6: Análise de Elementos Reguladores de Actina e Tubulina que Conduzem GUS em Protoplastos de Trigo

[00149] Protoplastos de folha de trigo foram transformados com vetores de expressão de planta contendo um grupo de elemento de expressão reguladora transcricional, conduzindo a expressão do transgene β-glucuronidase (GUS), e comparados com protoplastos de folha em que a expressão de GUS é conduzida por promotores constitutivos conhecidos.

[00150] As células de protoplastos de trigo, derivadas de tecido de folha foram transformadas usando métodos de transformação baseados em PEG conhecidos na técnica com vetores de expressão de plantas com a comparar a expressão de um transgene conduzida pelos grupos de elementos de expressão reguladora transcricional, EXP- SETit.TubA3:1:3 (SEQ ID NO: 19), EXP-SETit.TubA2:1:3 (SEQ ID NO: 16), EXP-SETit.TubA2-2:1:1 (SEQ ID NO: 18), EXP-SETit.Act8:1:1 (SEQ ID NO: 9), EXP-SETit.Act8:1:2 (SEQ ID NO: 10), EXP- SETit.Act8:c (SEQ ID NO: 11), EXP-SETit.TubA2-1:1:2 (SEQ ID NO: 17) e EXP-SETit.TubA2:1:1 (SEQ ID NO: 15) com a de promotores constitutivos conhecidos. Cada grupo de elemento de expressão reguladora transcricional é clonado usando métodos conhecidos na técnica para um vetor de expressão de plantas mostrado na Tabela 10 no exemplo 5 acima. Os vetores de expressão de plantas resultantes são compostos de um cassete de transgene composto por um grupo de elemento de expressão reguladora transcricional, operacionalmente ligado em 5' a uma sequência de codificação para β-glucuronidase (GUS) (GUS-1 ou GUS-3, representada por SEQ ID NOS: 1090 e 1092, respectivamente), que está ligada operacionalmente em 5' a uma região de terminação 3' derivada do gene da nopalina sintase de A. tumefaciens (T-AGRtu.nos-1: 1:13, SEQ ID NO: 56) ou do gene do trigo Hsp17 (T-Ta.Hsp17-1: 1:1, SEQ ID NO: 57).

[00151] As construções de vetor de plasmídeo de controle e construções de plasmídeo de controle de transformação de luciferase foram os mesmos que os descritos no exemplo 5. As medições da atividade tanto de GUS quanto de luciferase foram conduzidas como descrito no exemplo 5.

[00152] Para comparar a atividade relativa de cada grupo de elemento de expressão reguladora transcricional, os valores de GUS foram expressos como uma razão atividade de GUS para luciferase e normalizados com respeito aos níveis de expressão observados para o grupo de elemento de expressão reguladora transcricional EXP- Os.TubA-3: 1:1 (SEQ ID NO: 1107). A Tabela 13 abaixo mostra as razões de GUS/Rluc normalizadas com respeito à expressão de EXP- Os.TubA-3: 1:1 em protoplastos de milho.

[00153] As atividades de GUS e de luciferase são medidas como descrito no Exemplo 2 com os ensaios em duplicata para determinar o nível médio de expressão de GUS e luciferase em células de protoplastos de trigo. Os valores médios de GUS são comparados com os valores médios de luciferase e normalizados em relação à expressão vista em células de protoplastos de trigo transformadas com um vetor de expressão de GUS em que GUS é conduzido pelo grupo de elemento de expressão reguladora transcricional, EXP-Os.TubA-3: 1: 1 (SEQ ID NO: 65) para determinar a atividade de dobragem relativa da expressão de GUS conduzida pelos grupos de elementos de expressão reguladora transcricional, EXP-SETit.TubA3:1:3 (SEQ ID NO: 19), EXP- SETit.TubA2:1:3 (SEQ ID NO: 16), EXP-SETit.TubA2-2:1:1 (SEQ ID NO: 18), EXP-SETit.Act8:1:1 (SEQ ID NO: 9), EXP-SETit.Act8:1:2 (SEQ ID NO: 10), EXP-SETit.Act8:c (SEQ ID NO: 11), EXP-SETit.TubA2-1:1:2 (SEQ ID NO: 17) e EXP-SETit.TubA2:1:1 (SEQ ID NO: 15).

[00154] Os níveis médios de expressão de GUS e de luciferase são fornecidos na Tabela 13. Os valores de luciferase de Renilla são fornecidos na coluna identificada como "Rluc". Tabela 13. Expressão Média de Dobra de Gus/Rluc com Relação à Expressão de EXP-Os.TubA-3:1:1 em Células de Protoplastos de Folha de Milho.

[00155] O nível mais alto de expressão de GUS em protoplastos de trigo foi observado em células transformadas com as construções pMON136270 (EXP-SETit.TubA3:1:3 (SEQ ID NO: 19)); pMON136276 (EXP-SETit.Act8:1:1 (SEQ ID NO: 9)); pMON136277 (EXP- SETit.Act8:1:2 (SEQ ID NO: 10)) e pMON136280 (EXP- SETit.TubA2:1:1 (SEQ ID NO: 15)).

Exemplo 7: Identificação de Elementos Reguladores Transcricionais usados para a Expressão de Sementes.

[00156] Os elementos reguladores transcricionais que compreendem os promotores, líderes, íntrons e 3' UTRs úteis no fornecimento de expressão de um transgene em sementes de plantas e tecidos reprodutivos são identificados com base na expressão de tags de sequências expressos (ESTs) em bibliotecas de cDNA feitas a partir de RNA mensageiro isolado de sementes, flores e outros tecidos derivados de Foxtail millet (Setaria italica (L.) Beauv). As bibliotecas de cDNA são feitas a partir de tecidos isolados de S. italica usando métodos conhecidos dos versados na técnica a partir de tecido de flor em 0, 4, 7, 14, 21 e 31 dias após a polinização (DAP), bem como de folhas e raízes. Os cDNAs resultantes são sequenciados usando vários métodos de sequenciação conhecidos na técnica. Os ESTs resultantes são montados em clusters usando software bioinformático tais como clc_ref_assemble_complete versão 2.01.37139 (CLC bio EUA, Cambridge, Massachusetts 02142). A abundância do transcrito de cada agrupamento é determinada por contagem do número de cDNA lido para cada agrupamento. A Tabela 14 abaixo mostra conjuntos de clusters que foram produzidos usando cDNAs a partir de bibliotecas feitas de tecido de S. italica isolado da folha, raiz, e flor em 0, 4, 7, 14, 21 e 31 dias após a polinização (DAP) que demonstram expressão em janelas específicas de desenvolvimento da semente em desenvolvimento e não foram observados ou foram minimamente observados na folha e na raiz. Cada agrupamento é anotado usando métodos de análise de bioinformática como BLAST de nucleotídeo e proteína contra dados públicos e de propriedade de genes expressos em monocotiledôneas e dicotiledôneas. Em muitos casos, um homólogo ao agrupamento não foi identificado e é indicado na Tabela 14 como "sem homólogo". Tabela 14. Anotações e Clusters de ESTs de Foxtail millet.

[00157] Uma análise de expressão de cDNAs para cada agrupamento apresentado na Tabela 14 é fornecida na Tabela 15 abaixo. Para tecido de flor, os seguintes números de EST lidos foram realizados; flor 0 DAP, 251341; flor 4 DAP, 39277; flor 7 DAP, 34330; flor 14 DAP, 34920; flor 21 DAP, 42321; flor 31 DAP, 257327. Para tecido de folha e raiz, os seguintes números de EST lidos foram realizados; folha, 478570 e raiz, 434180. Tabela 15. Contagem de cDNAs expressos correspondentes a clusters de EST.

[00158] Como pode ser visto na Tabela 15 acima, muitos dos clusters identificados demonstram a expressão em janelas específicas do desenvolvimento da semente; em 0 DAP em que a expressão é inferida como sendo tanto no óvulo quanto no pólen, ou durante a janela de desenvolvimento da semente de 4 a 31 DAP. Os clusters identificados de cDNA foram usados para projetar iniciciadores, que foram então usados com bibliotecas de GenomeWalkerTM (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA) construídas seguindo o protocolo do fabricante para clonar a região 5' da sequência de DNA genômico correspondente. No caso de líderes e íntrons promotores, esta região clonada continha o o regulador transctiptional 5', 5' UTR, e se presente, a sequência de íntron a montante da região de codificação da proteína para cada gene a partir de S. italica. Usando esta sequência, os elementos reguladores foram identificados bioinformaticamente dentro da região 5' para cada gene. A análise Bioinformática foi usada para identificar o sítio de início transcricional (TSS) e qualquer bidirecionalidade, íntrons, ou sequência de codificação a montante presentes na sequência. Usando os resultados desta análise, os elementos de regulação foram definidos dentro da sequência 5' a montante da sequência de codificação do gene. Os iniciadores foram então projetados para amplificar os elementos reguladores. A molécula de DNA correspondente de cada elemento regulador foi amplificada usando as condições padrões de reação em cadeia de polimerase com iniciadores contendo sítios de restrição de enzimas únicos e de DNA genômico isolado de S. italica. Os fragmentos de DNA resultantes foram ligados em um vetor de expressão de planta base, utsando digestão com enzima de restrição padrão de sítios de restrição compatíveis e métodos de ligação de DNA. Em alguns casos, a identidade de alta sequência entre alguns líderes proporcionaram a identificação de elementos reguladores de genes homólogos. Os grupos de elementos reguladores transcricionais, promotores, líderes e íntrons resultantes identificados através desta análise são apresentados na Tabela 16 abaixo: Tabela 16. Grupos de Elementos Reguladores Transcricionais (EXP), Promotores (P), Líderes (L) e Íntrons (I) identificados usando Análise de Expressão.

[00159] Em alguns casos, o sítio de início transcricional não pode ser identificado. Os elementos reguladores transcriptionais, P-SETit.FM54- 1:1:2 (SEQ ID NO: 52), P-SETit.FM63-1:1:2 (SEQ ID NO: 53) e P- SETit.CLUS1165324-1:1:1 (SEQ ID NO: 38) podem ser compostos ainda de um elemento promotor operacionalmente ligado a um elemento líder ou fragmento de um elemento líder.

Exemplo 8: Análise de Elementos Reguladores de Semente que conduzem GUS em Tecidos de Milho Bombardeados.

[00160] Tecido de semente, raiz e folha isolado de plantas de milho é bombardeado com expressão de planta GUS e vetores de controle para determinar a capacidade de elementos reguladores transacricionais derivados de Setaria italica para conduzir a expressão de um transgene, GUS.

[00161] Tecidos de plantas de milho foram transformados com construções de expressão de planta GUS usando bombardeamento de partículas, listados na Tabela 17, abaixo. Os elementos reguladores apresentados no exemplo 7 foram clonados em um vetor de expressão de planta de base, usando métodos padrões conhecidos na técnica. Os vetores de expressão de plantas resultantes continham uma região da fronteira direita de Agrobacterium tumefaciens, um primeiro cassete de transgene para testar o elemento regulador quimérico ou regulador composto de, um elemento regulador quimérico ou regulador, operacionalmente ligado a um íntron derivado da proteína de choque térmico HSP70 de Zea mays (I-Zm.DnaK-1: 1:1, SEQ ID NO: 1102), ligada operacionalmente a uma sequência de codificação para β- glucuronidase (GUS), que possuía um íntron processável (GUS-2, SEQ ID NO: 1091), operacionalmente ligado à região de terminação 3' do gene da proteína de transferência de lipídeo de arroz (T-Os.LTP-1: 1:1, SEQ ID NO: 1089); um segundo cassete de seleção de transgene usado para a seleção de células de plantas transformadas que conferiram resistência ao herbicida glifosato (conduzida pelo grupo de elemento regulador transcricional de Actina 1 de arroz, SEQ ID NO: 1098), e uma região da fronteira esquerda a partir de A. tumefaciens. Os plasmídeos resultantes, pMON117992, pMON117993, pMON117994, pMON117995, pMON117996, pMON117997, pMON117998, pMON117999, pMON130551, pMON140500, pMON140501, pMON140502, pMON140503, pMON140504, pMON140505, pMON140506, pMON140507 e pMON140508 são usados para transformar o tecido de plantas de milho usando bombardeamento de partículas. Tabela 17. Construções Binárias de Transformação de Planta e Elementos Reguladores.

[00162] O vetor de transformação da planta, pMON117992 é composto do elemento promotor, P-SETit.EST CLUS675389-2-1:1:2 (SEQ ID NO: 50), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L- SETit.EST CLUS675389-2-1:1:1 (SEQ ID NO:130). O vetor de transformação da planta, pMON117993 é composto do elemento promotor, P-SETit.Pro1-1:1:2 (SEQ ID NO: 77), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Pro1-1:1:1 (SEQ ID NO: 151). O vetor de transformação da planta, pMON117994 é composto do elemento promotor, P-SETit.Pro2-1:1:3 (SEQ ID NO: 78), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Pro2-1:1:2 (SEQ ID NO: 152). O vetor de transformação da planta, pMON117995 é composto do elemento promotor, P-SETit.CLUS882664-1-1:1:2 (SEQ ID NO: 41), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L- SETit.CLUS882664-1-1:1:1 (SEQ ID NO: 123). O vetor de transformação da planta, pMON117996 é composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP-SETit.CLUS19108 (SEQ ID NO: 13),que é ainda composto do elemento promotor, P-SETit.CLUS19108- 1:1:2 (SEQ ID NO: 40), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.CLUS19108-1:1:2 (SEQ ID NO: 122), operacionalmente ligado em 5' ao elemento de íntron, I-SETit.CLUS19108-1:1:1 (SEQ ID NO: 174), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L- SETit.CLUS19108-1:1:1 (SEQ ID NO: 121). O vetor de transformação da planta, pMON117997 é composto do elemento promotor, P- SETit.Alc1-1:1:1 (SEQ ID NO: 28), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Alc1-1:1:1 (SEQ ID NO: 110). O vetor de transformação da planta, pMON117998 é composto do elemento promotor, P-SETit.Alc2-1:1:2 (SEQ ID NO: 30), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Alc2-1:1:1 (SEQ ID NO: 111). O vetor de transformação da planta, pMON117999 é composto do elemento promotor, P-SETit.Dzs-1:1:4 (SEQ ID NO: 47), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Dzs-1:1:1 (SEQ ID NO: 128). O vetor de transformação da planta, pMON130551 é composto do elemento promotor, P-SETit.Alc1-1:1:2 (SEQ ID NO: 29), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Alc1-1:1:1 (SEQ ID NO: 110). O vetor de transformação da planta, pMON140500 é composto do elemento promotor, P-SETit.Dzs-1:1:5 (SEQ ID NO: 48), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Dzs-1:1:1 (SEQ ID NO: 128). O vetor de transformação da planta, pMON140501 é composto do elemento promotor, P-SETit.Ssp1-1:1:1 (SEQ ID NO: 93), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Ssp1-1:1:1 (SEQ ID NO: 164). O vetor de transformação da planta, pMON140502 é composto do elemento promotor, P-SETit.Ssp1-1:1:2 (SEQ ID NO: 94), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Ssp1-1:1:1 (SEQ ID NO: 164). O vetor de transformação da planta, pMON140503 é composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP- SETit.CLUS120796-1 (SEQ ID NO: 12),que é ainda composto do elemento promotor, P-SETit.CLUS120796-1-1:1:1 (SEQ ID NO: 39), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.CLUS120796- 1-1:1:2 (SEQ ID NO: 120), operacionalmente ligado em 5' ao elemento de íntron, I-SETit.CLUS120796-1-1:1:1 (SEQ ID NO: 173), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.CLUS120796- 1-1:1:1 (SEQ ID NO: 119). O vetor de transformação da planta, pMON140504 é composto do elemento promotor, P- SETit.CLUS1164825-1-1:1:1 (SEQ ID NO: 37), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.CLUS1164825-1-1:1:1 (SEQ ID NO: 118). O vetor de transformação da planta, pMON140505 é composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP-SETit.Ubq5 (SEQ ID NO: 22),que é ainda composto do elemento promotor, P-SETit.Ubq5- 1:1:2 (SEQ ID NO: 104), operacionalmente ligado em 5' ao elemento líder, L-SETit.Ubq5-1:1:1 (SEQ ID NO: 170), operacionalmente ligado em 5' ao elemento de íntron, I-SETit.Ubq5-1:1:2 (SEQ ID NO: 178). O vetor de transformação da planta, pMON140506 é composto do elemento promotor, P-SETit.FM54-1:1:2 (SEQ ID NO: 52).O vetor de transformação da planta, pMON140507 é composto do elemento promotor, P-SETit.FM63-1:1:2 (SEQ ID NO: 53).O vetor de transformação da planta, pMON140508 é composto do elemento promotor, P-SETit.CLUS1165324-1:1:1 (SEQ ID NO: 38).

[00163] Tecidos de plantas de milho são transformados usando métodos de bombardeamento de partículas e sementes de milho LH244 como descrito no Exemplo 3 acima. Os tecidos de raiz e da folha bombardeados são deixados incubar no escuro durante 24 horas a 26°C. Após esta incubação durante a noite, os tecidos são coloridos em solução para expressão de GUS durante a noite a 37 graus Celsius. Após a coloração durante a noite, os tecidos são embebidos em etanol a 70% durante a noite para remover clorofila e revelar a coloração de GUS. Os tecidos são então fotografados e uma escala de "0" a "4" refletindo o nível de expressão de GUS é atribuída a cada construção.

[00164] A expressão do transgene GUS demonstrada em cada tecido é usada para inferir com o nível potencial relativo e especificidade de cada capacidade de elemento para conduzir a expressão do transgene em plantas de milho estavelmente transformadas. As classificações médias de expressão de GUS são fornecidas na Tabela 18 abaixo. Tabela 18. Classificações de Expressão de GUS para Ensaio de Bombardeamento de Partículas de Promotores de Semente Potenciais.

[00165] Em todos os casos, alguma expressão do transgene foi observada em tecido bombardeado com a construção mostrada acima na Tabela 18. Níveis mais altos de expressão na semente foram observados para os tecidos bombardeados com as construções, pMON117996 ((EXP-SETit.CLUS19108 (SEQ ID NO: 13) composto de P-SETit.CLUS19108-1:1:2 (SEQ ID NO: 40) + L-SETit.CLUS19108- 1:1:2 (SEQ ID NO: 122) + I-SETit.CLUS19108-1:1:1 (SEQ ID NO: 174) + L-SETit.CLUS19108-1:1:1 (SEQ ID NO: 121)) e pMON140505 ((EXP- SETit.Ubq5 (SEQ ID NO: 22) composto de P-SETit.Ubq5-1:1:2 (SEQ ID NO: 104) + L-SETit.Ubq5-1:1:1 (SEQ ID NO: 170) + I-SETit.Ubq5-1:1:2 (SEQ ID NO: 178)). Surpreendentemente, a construção pMON140505 ((EXP-SETit.Ubq5 (SEQ ID NO: 22) composto de P-SETit.Ubq5-1:1:2 (SEQ ID NO: 104) + L-SETit.Ubq5-1:1:1 (SEQ ID NO: 170) + I- SETit.Ubq5-1:1:2 (SEQ ID NO: 178)) demonstraram níveis altos de expressão constitutiva que não tinham sido inicialmente previstos pelas contagens de EST fornecidas na Tabela 15 do Exemplo 7. Algumas construções tais como, pMON117998 (P-SETit.Alc2-1:1:2 (SEQ ID NO: 30) + L-SETit.Alc2-1:1:1 (SEQ ID NO: 111)); pMON140500 (P- SETit.Dzs-1:1:5 (SEQ ID NO: 48) + L-SETit.Dzs-1:1:1 (SEQ ID NO: 128)); pMON140501 (P-SETit.Ssp1-1:1:1 (SEQ ID NO: 93) + L- SETit.Ssp1-1:1:1 (SEQ ID NO: 164) e pMON140502 (P-SETit.Ssp1- 1:1:2 (SEQ ID NO: 94) + L-SETit.Ssp1-1:1:1 (SEQ ID NO: 164)), demonstraram expressão no endosperma e não no embrião. Além disso, embora a construção, pMON140500 (P-SETit.Dzs-1:1:5 (SEQ ID NO: 48) + L-SETit.Dzs-1:1:1 (SEQ ID NO: 128)) tenha demonstrado expressão apenas no endosperma, a construção, pMON117999 (P- SETit.Dzs-1:1:4 (SEQ ID NO: 47) + L-SETit.Dzs-1:1:1 (SEQ ID NO: 128)), que é composto de uma versão mais longa do promotor Dzs, (P- SETit.Dzs-1:1:5 (SEQ ID NO: 48)), demonstrou expressão tanto no endosperma quanto no embrião, sugerindo o potencial para um potenciador de embrião compreendendo o fragmento deletado de P- SETit.Dzs-1:1:4 (SEQ ID NO: 47) para produzir P-SETit.Dzs-1:1:5 (SEQ ID NO: 48).

Exemplo 9: Elementos Reguladores que Conduzem a Expressão de Transgene de GUS no Trigo ou Milho Transgênico

[00166] As plantas de milho ou de trigo são transformadas com construções compreendendo elementos reguladores, tais como os grupos de elementos reguladores transcricionais, fornecidos como SEQ ID NOs: 1 até 22; ou os promotores fornecidos como SEQ ID NOs: 23 até 105 e SEQ ID NOs: 353 até 536, operacionalmente ligadas a qualquer um dos líderes fornecidos como SEQ ID NOs: 106 até 171 e 537 até 588. Os grupos de elementos reguladores transcricionais ou promotores podem ser operacionalmente ligados a um transgene marcador tal como GUS semelhantes aos descritos no exemplo 2 acima. Além disso, os elementos de íntrons tais como os fornecidos como SEQ ID NOs: 172 até 267 e SEQ ID NOs: 317 até 323 e SEQ ID NOs: 589 até 778 podem ser operacionalmente ligados entre os elementos de expressão e os transgenes de interesse para melhorar a expressão ou modular a expressão do transgene no interior da planta transformada. As plantas são transformadas usando agrobacterium ou métodos de bombardeamento de partículas conhecidos na técnica. Os transformantes contendo uma ou duas cópia de cassete de transgene são selecionados usando métodos conhecidos na técnica. Os transformantes são então ensaiados para determinar o nível de expressão do transgene marcador em vários tecidos da planta semelhante ao descrito no exemplo 2. As progênies de F1 são produzidas seja pelo cruzamento do evento transformado com um evento não transformado, ou por meio de autofertilização. As progênies de F1 são crescidas e a expressão do transgene marcador é determinada usando a progênie possuindo uma ou duas cópias de cassete de transgene. Os elementos reguladores quiméricos compostos de qualquer um dentre promotores, líder e íntrons apresentados acima são selecionados com base no nível de expressão e especificidade de tecido da expressão para conduzir transgenes de importância agronômica ou comercial.

Exemplo 10: Potenciadores Derivados de Elementos Reguladores

[00167] Os potenciadores são derivados dos elementos promotores apresentados como SEQ ID NOS: 23 até 105 e SEQ ID NOS: 353 até 536. O elemento potenciador pode ser composto por um ou mais elementos reguladores cis que, quando ligados operacionalmente em 5' ou 3' a um elemento promotor, ou ligados operacionalmente em 5' ou 3' a elementos potenciadores adicionais que estão operacionalmente ligados a um promotor, podem potencializar ou modular a expressão de um transgene, ou fornecer a expressão de um transgene em um órgão da planta ou tipo de célula específico ou em um ponto de tempo particular em desenvolvimento ou ritmo circadiano. Os potenciadores são feitos pela remoção de TATA box ou elementos funcionalmente semelhantes e qualquer sequência a jusante a partir dos promotores que permitem que a transcrição seja iniciada a partir dos promotores apresentados como SEQ ID NOS: 23 até 105 e SEQ ID NOS: 353 até 536 ou fragmentos dos mesmos, em que o TATA box ou elementos funcionalmente semelhantes e a sequência a jusante de TATA box são removidos.

[00168] Elementos potenciadores são derivados dos elementos promotores apresentados como SEQ ID NOS: 23 até 105 e SEQ ID NOS: 353 até 536 e clonados usando métodos conhecidos na técnica para serem operacionalmente ligados em 5' ou 3' a um elemento promotor, ou operacionalmente ligado em 5' ou 3' a elementos potenciadores adicionais que estão operacionalmente ligados a um promotor. Alternativamente, os elementos potenciadores são clonados usando métodos conhecidos na técnica para serem operacionalmente ligados a uma ou mais cópias do elemento potenciador que são operacionalmente ligadas a 5' ou 3' a um elemento promotor, ou ligadas operacionalmente em 5' ou 3' a elementos potenciadores adicionais que são operacionalmente ligados a um promotor. Os elementos potenciadores também podem ser clonados usando métodos conhecidos na técnica para serem ligados operacionalmente em 5' ou 3' a um elemento promotor derivado de um organismo de gênero diferente, ou ligado operacionalmente em 5' ou 3' a elementos potenciadores adicionais derivados de outros organismos do gênero ou de organismo do mesmo gênero que são operacionalmente ligadoa a um promotor derivado de um organismo de gênero diferente ou do mesmo gênero, resultando em um elemento regulador quimérico. Um vector de transformação de plantas com expressão de GUS é construído usando métodos conhecidos na técnica semelhante às construções descritas nos exemplos anteriores, em que os vetores de expressão de plantas resultantes contém uma região da fronteira direita a partir de A. tumefaciens, um primeiro cassete de transgene para testar o elemento regulador quimérico ou regulador composto de, um elemento quimérico regulador ou regulado, operacionalmente ligado a um íntron derivado da proteína de choque térmico HSP70 de Zea mays ou qualquer um dos íntrons apresentados como SEQ ID NOs: 172 até 267 e SEQ ID NOs: 317 até 323 e SEQ ID NOs: 589 até 778 ou qualquer outro íntron, operacionalmente ligado a uma sequência de codificação para β-glucuronidase (GUS) que ou possui um íntron processável (GUS-2, SEQ ID NO: 1091) ou nenhum íntron (GUS-1, SEQ ID NO: 1090), operacionalmente ligado à região de terminação 3' de Nopalina sintase de A. tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 1088) ou a região de terminação 3' do gene de proteína de transferência de lípideo de arroz (T-Os.LTP-1:1:1, SEQ ID NO: 1089); um segundo cassete de seleção de transgene usado para seleção de células de plantas transformadas que confere resistência ao herbicida glifosato (conduzido pelo promotor de Actina 1 de arroz), ou alternativamente, o antibiótico kanamicina (conduzido pelo promotor de Actina 1 de arroz) e uma região da fronteira da esquerda de A. tumefaciens. Os plasmídeos resultantes são usados para transformar plantas de milho ou plantas de outros gêneros pelos métodos descritos acima ou por outros métodos mediados por Agrobacterium ou de bombardeamento de partículas conhecidos na técnica. Alternativamente, células de protoplastos derivadas de plantas de milho ou plantas de outros gêneros são transformadas usando métodos conhecidos na técnica para realizar ensaios transientes.

[00169] A expressão de GUS conduzida pelo elemento regulador de teste compreendendo um ou mais potenciadores é avaliada em ensaios de plantas estáveis ou transientes para determinar os efeitos do elemento potenciador sobre a expressão de um transgene. As modificações de um ou mais elementos potenciadoras ou duplicação de um ou mais elementos potenciadores é realizada com base em experimentação empírica e a regulação da expressão de gene resultante é observada usando cada composição de elemento regulador. Alterando as posições relativas de um ou mais potenciadores no elemento regulador quimérico ou regulador resultante pode afetar a atividade transcricional ou especificidade do elemento regulador quimérico ou regulador e são determinadas empiricamente para identificar os melhores potenciadores para o perfil de expressão de transgene desejado dentro da planta de milho ou plantas de outro gênero.

Exemplo 11: Análise de Potencialização mediada por íntron da Atividade de GUS Usando Protoplastos Derivados de Plantas

[00170] A introdução de um gene estranho em um novo hospedeiro de planta nem sempre resulta em uma alta expressão do gene de entrada. Além disso, ao lidar com traços complexos, por vezes é necessário modular vários genes com diferentes padrões de expressão espacialmente ou temporariamente. Os íntrons podem fornecer, principalmente, essa modulação. Contudo, o múltiplo uso do mesmo íntron em uma planta tem apresentado desvantagens. Nesses casos, é necessário ter uma coleção de elementos de controle de base para a construção de elementos de DNA recombinantes adequados. No entanto, a coleção disponível de íntrons com propriedades de potencialização de expressão é limitada e as alternativas são necessárias.

[00171] Nas plantas, a inclusão de alguns íntrons em construções de genes leva a um aumento do mRNA e acumulação relativa de proteínas para as construções sem o íntron. Este efeito tem sido chamado de "potencialização mediada por intron" (IME) da expressão do gene (Mascarenhas et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15:913-920). Os íntrons conhecidos por estimular a expressão em plantas foram identificados em genes de milho (por exemplo, tubA1, Adh1, Sh1, Ubi1 (Jeon et al. (2000) Plant Physiol. 123:1005-1014; Callis et al. (1987) Genes Dev. 1:1183-1200; Vasil et al. (1989) Plant Physiol. 91:1575-1579; Christiansen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689) and in rice genes (por exemplo, salt, tpi: McElroy et al., Plant Cell 2:163-171 (1990); Xu et al., Plant Physiol. 106:459-467 (1994)). Do mesmo modo, os íntrons de genes de plantas dicotiledôneas como os da petúnia (por exemplo, rbcS), batata (por exemplo, st-ls1) e de Arabidopsis thaliana (por exemplo, ubq3 e pat1) foram verificados como elevando as taxas de expressão de genes (Dean et al. (1989) Plant Cell 1:201-208; Leon et al. (1991) Plant Physiol. 95:968-972; Norris et al. (1993) Plant Mol Biol 21:895-906; Rose and Last (1997) Plant J.11:455-464). Foi demonstrado que deleções ou mutações dentro dos sítios de splicing de um íntrons reduzem a expressão do gene, indicando que o splicing pode ser necessário para IME (Mascarenhas et al. (1990) Plant Mol Biol. 15:913-920; Clancy and Hannah (2002) Plant Physiol. 130:918-929). No entanto, o splicing em si não que é necessário para um determinado IME em plantas dicotiledôneas tem sido demonstrado por mutações pontuais dentro dos sítios de splicing do gene de pat1 de A. thaliana (Rose and Beliakoff (2000) Plant Physiol. 122:535-542).

[00172] A potencialização da expressão de genes por íntrons não é um fenômeno geral, porque algumas inserções de íntron em cassetes de expressão recombinantes falham na potencialização da expressão (por exemplo, íntrons de genes de dicotiledôneas (gene rbcS de ervilha, gene de faseolina de feijão e o gene stls-1 a partir de Solanum tuberosum) e íntrons de genes de milho (gene adh1 do nono íntron, gene hsp81 do primeiro íntron)) (Chee et al. (1986) Gene 41:47-57; Kuhlemeier et al. (1988) Mol Gen Genet 212:405-411; Mascarenhas et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:913-920; Sinibaldi e Mettler (1992) In WE Cohn, K Moldave, eds, Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, Vol 42. Academic Press, New York, pp 229-257; Vancanneyt et al. 1990 Mol. Gen. Genet. 220:245-250). Portanto, não cada íntron pode ser empregado a fim de manipular o nível de expressão do gene de genes não endógenos ou genes endógenos em plantas transgênicas. Quais características ou aspectos de sequência específica devem estar presentes em uma sequência de íntron, a fim de potencializar a taxa de expressão de um determinado gene não são conhecidos na técnica anterior e, portanto, a partir do estado da técnica, não é possível prever se um dado íntron de planta, quando usado de forma heteróloga, causará IME.

[00173] Um íntron é selecionado com base em experimentação e comparação com um controle de vetor de expressão de intronless para selecionar empiricamente um íntron e configuração dentro do arranjo de elemento T-DNA de vetor para a expressão ótima de um transgene. Por exemplo, na expressão de um gene de resistência aos herbicidas, tais como CP4 que confere resistência ao herbicida glifosato, é desejável ter a expressão do transgene nos tecidos reprodutivos, bem como nos tecidos vegetativos, para evitar a perda de rendimento quando se aplica o herbicida. Um íntron, neste caso, seria selecionado mediante sua capacidade, quando ligado operacionalmente a um promotor constitutivo, para potencializar a expressão do transgene que confere resistência a herbicidas, particularmente, no interior das células e tecidos reprodutivos da planta transgênica e fornecendo, assim, a tolerância vegetativa e reprodutiva à planta transgênica, quando pulverizada com o herbicida (ver, por exemplo, Pedido de Patente Internacional, WO2007/098042A2).

[00174] Os íntrons apresentados como SEQ ID NOS: 16 até 306 são identificados usando contigs de DNA genômico em comparação com clusters de tag de sequências expressos ou contigs de cDNA para identificar sequências de éxon e íntron dentro do DNA genômico. Além disso, as sequências líderes ou 5' UTR também são usadas para definir a junção de splicing do íntron/éxon de um ou mais íntrons sob condições em que a sequência do gene codifica uma sequência líder que é interrompida por um ou mais íntrons. Os íntrons apresentados como SEQ ID NOs: 172 até 267 e SEQ ID NOs: 317 até 323 e SEQ ID NOs: 589 até 778 são clonados usando métodos conhecidos na técnica em um vetor de transformação de planta a ser operacionalmente ligado em 3' a um elemento regulador transcricional e fragmento de líder e operacionalmente ligado em 5' para um segundo fragmento de líder ou para sequências líderes como representados nos cassetes de transgene apresentados na figura 15. Um primeiro cassete de transgene possível (Configuração 1 de cassete de transgene na figura 15) e composto de um elemento promotor quimérico ou promotor [A], operacionalmente ligado em 5' a um elemento líder [B], operacionalmente ligado em 5' a um elemento de íntron de teste [C], operacionalmente ligado a uma região de codificação [D], que é operacionalmente ligado a um elemento de 3' UTR [E]. Alternativamente, um segundo cassete de transgene possível (Configuração 2 de cassete de transgene na figura 15) é composto de um elemento promotor quimérico ou promotor [F], operacionalmente ligado em 5' a um primeiro elemento líder a um primeiro fragmento de elemento líder [G], operacionalmente ligado em 5' a um elemento de íntron de teste [H], operacionalmente ligado em 5' a um segundo elemento líder a um primeiro elemento líder do segundo fragmento [I], operacionalmente ligado a uma região de codificação [J], que é operacionalmente ligada a um elemento de 3' UTR [K].

[00175] Os primeiros 6 nucleotídeos na extremidade 5' e os últimos 6 nucleotídeos na extremidade 3' dos íntrons apresentados como SEQ ID NOs: 172 até 267 e SEQ ID NOs: 317 até 323 e SEQ ID NOs: 589 até 778 representam nucleotídeos antes e depois da junção de splicing íntron/éxon, respectivamente. Estas 6 sequências de nucleotídeos curtas podem ser alteradas ou modificadas por terem sequência adicional anexa (isto é, nativa ou artificial) para facilitar a clonagem do íntron em um vetor de transformação de plantas, desde que os os sétimo e oitavo nucleotídeos da extremidade 5' (GT) e os sétimo e oitavo nucleotídeos da extremidade 3' (AG) de SEQ ID NOS: 172 até 267 e SEQ ID NOS: 317 até 323 e SEQ ID NOS: 589 até 778 são preservados, preservando assim a junção de splicing de íntron/éxon do íntron. É preferível evitar o uso da sequência de nucleotídeo TG ou G imediatamente antes dos sétimo e oitavo nucleotídeos da extremidade 5' (GT) e a sequência de nucleotídeos, A ou AT a partir dos sétimo e oitavo nucleotídeos da extremidade 3' (AG) para eliminar o potencial de códons de parada e de partida indesejados os serem formados durante o processamento do RNA mensageiro no transcrito final.

[00176] Os íntrons são ensaiados para a capacidade de potencializar a expressão em ensaio de planta transiente ou ensaio de planta estável. Para o ensaio transiente da potencialização mediada por íntron, um vetor de planta de base é construído usando métodos conhecidos na técnica. O íntron é clonado em um vetor de planta de base que compreende um cassete de expressão composto de um promotor constitutivo, tais como o promotor do vírus do mosaico da couve-flor, P- CaMV.35S-enh-1:1:9 (SEQ ID NO: 1096), operacionalmente ligado em 5' a um elemento líder, L-CaMV.35S-1:1:15 (SEQ ID NO: 1111), operacionalmente ligado em 5' a um elemento de íntron de teste (SEQ ID NOs: 172 até 267 e SEQ ID NOs: 317 até 323 e SEQ ID NOs: 589 até 778), operacionalmente ligado a uma sequência de codificação para β-glucuronidase (GUS) que ou possui um íntron processável (GUS-2, SEQ ID NO: 1091) ou nenhum íntron (GUS-1, SEQ ID NO: 1090), operacionalmente ligado à região de terminação 3' de Nopalina sintase de A. tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 1088). As células de protoplastos derivadas de tecido de planta de milho ou de outro gênero de planta são transformadas com o vetor de planta de base e ensaiadas quanto à atividade. Uma comparação de atividade é feita usando um plasmídeo de controle composto do mesmo cassete de transgene que o plasmídeo de teste, mas sem o íntron de teste para ver se o íntron fornece um efeito de potencialização mediado pelo íntron.

[00177] Dois plasmídeos, para uso na cotransformação e normalização de dados, são também construídos usando métodos conhecidos na técnica. Cada plasmídeo contém uma sequência de codificação de luciferase específica que é conduzida por um grupo de elemento de expressão reguladora transcricional constitutivo. O vetor de planta, pMON19437 é composto de um cassete de transgene composto de um promotor constitutivo (EXP-CaMV.35S-enh, SEQ ID NO: 1095), operacionalmente ligado em 5' a um íntron, (I-Zm.DnaK- 1:1:1, SEQ ID NO: 1102), operacionalmente ligado em 5' a uma sequência de codificação de luciferase de vaga-lume (Photinus pyralis) (LUCIFERASE:1:3, SEQ ID NO: 1109), operacionalmente ligado em 5' a uma região de terminação 3' de A. tumefaciens nopaline sintase gene (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 1088). O vetor de planta, pMON63934 é composto de um cassete de transgene composto de um grupo de elemento de expressão reguladora transcricional constitutivo, (EXP-CaMV.35S-enh-Lhcb1, SEQ ID NO: 1106), operacionalmente ligado em 5' a uma sequência de codificação de luciferase de rim-do- mar (Renilla reniformis) (CR-Ren.hRenilla Lucife-0:0:1, SEQ ID NO: 1110), operacionalmente ligado em 5' a uma região de terminação 3' de A. tumefaciens nopaline sintase gene (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 1088).

[00178] Os protoplastos de folha de milho ou protoplastos de plantas de outros gêneros são transformados usando um método de transformação baseado em PEG, semelhante aos conhecidos na técnica. As células de protoplastos são transformadas com um DNA prep composto de quantidades equimoleculares de dois plasmídeos de expressão de luciferase, pMON19437 e pMON63934 e um dos plasmídeos de teste e incubadas durante a noite em escuridão total. Após a incubação, as células são lavadas, ressuspensas e lisadas. As medições tanto de GUS quanto de luciferase são conduzidas usando alíquotas de cada preparação de lise. Essencialmente, as células de protoplástos transformadas, coletadas são lisadas em tampão de lise passivo 5X (Promega). Depois de deixar ocorrer a lise, as alíquotas da preparação lisada são colocadas em duas bandejas de poços pequenos diferentes. Uma bandeja é usada para medições de GUS. Para análise quantitativa da expressão de GUS, proteína total é extraída da preparação de lise. Um micrograma do total de proteína é usado com o substrato fluorogênico 4-metileumbeliferil-β-D-glucuronida (MUG) em um volume de reação total de 50 microlitres. O produto da reação, 4- metilumbeliferona (4-MU), é maximamente fluorescente em pH alto, onde o grupo hidroxil é ionizado. A adição de solução básica de carbonato de sódio simultaneamente interrompe o ensaio e ajusta o pH para quantificação do produto fluorescente. A fluorescência é medida com excitação a 365 nm, emissão a445 nm usando um Fluoromax-3 com leitor Micromax, com largura de fenda ajustada a 2nm de excitação e 3nm de emissão. Os valores de GUS são expressos como pmol de proteína 4-MU por minuto por miligrama de proteína (pmol 4-MU min-1 mg-1 proteína).

[00179] A segunda bandeja é usada para realizar um ensaio de luciferase dupla como descrito no Exemplo 5 acima. Para comparar a capacidade relativa do íntron para potencializar a expressão, os valores de GUS são expressos como uma razão de atividade de GUS para luciferase e comparados com os níveis conferidos por meio do promotor constitutivo e um íntron padrão conhecido tal como o íntron derivado da proteína de choque térmico HSP70 Zea mays, I-Zm.DnaK-1:1:1 (SEQ ID NO: 1102).

[00180] Para o ensaio de planta estável dos íntrons apresentadas como SEQ ID NOS: 172 até 267 e SEQ ID NOS: 317 até 323 e SEQ ID NOS: 589 até 778, um vetor de transformação de plantas de expressão de GUS é construído usando métodos conhecidos na técnica semelhantes às construções descritas nos exemplos anteriores, em que os vetores de expressão de plantas resultantes contêm uma região da fronteira direita a partir de A. tumefaciens, um primeiro cassete de transgene para testar o íntron composto de um promotor constitutivo, tal como o promotor do vírus do mosaico da couve-flor, P-CaMV.35S-enh- 1:1:9 (SEQ ID NO: 1096), operacionalmente ligado em 5' a um elemento líder, L-CaMV.35S-1:1:15 (SEQ ID NO: 1111), operacionalmente ligado em 5' a um elemento de íntron de teste (SEQ ID NOs: 16 até 306), operacionalmente ligado a uma sequência de codificação para β- glucuronidase (GUS) que ou possui um íntron processável (GUS-2, SEQ ID NO: 1091) ou nenhum íntron (GUS-1, SEQ ID NO: 1090), operacionalmente ligado à região de terminação 3' de Nopalina sintase de A. tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 1088) ; um segundo cassete de seleção de transgene usado para seleção de células de plantas transformadas que confere resistência ao herbicida glifosato (conduzido pelo promotor de Actina 1 de arroz), ou alternativamente, o antibiótico kanamicina (conduzido pelo promotor de Actina 1 de arroz) e uma região da fronteira da esquerda de A. tumefaciens. Os plasmídeos resultantes são usados para transformar plantas de milho ou plantas de outros gêneros pelos métodos descritos acima ou por métodos mediados por Agrobacterium conhecidos na técnica. Os transformantes de baixo número de cópias ou de cópia única são selecionados para comparação com plantas transformadas com baixo número de cópias ou com uma única cópia, transformadas com um vetor de transformação de plantas idêntico ao vetor de teste, mas sem o íntron de teste para determinar se o íntron de teste fornece um efeito de potencialização mediado por íntron.

[00181] Qualquer um dos íntrons apresentados como SEQ ID NOS: 172 até 267 e SEQ ID NOS: 317 até 323 e SEQ ID NOS: 589 até 778 pode ser modificado de um número de maneiras, tal como deleção de fragmentos dentro da sequência do íntron que pode reduzir a expressão ou duplicação de fragmentos com o íntron que pode potencializar a expressão. Além disso, as sequências dentro do íntron que podem afetar a especificidade de expressão para os tipos de células particulares ou tecidos e órgãos podem ser duplicadas ou alteradas ou deletadas para afetar a expressão e os padrões de expressão do transgene. Além disso, os íntrons apresentados como SEQ ID NOS: 172 até 267 e SEQ ID NOS: 317 até 323 e SEQ ID NOS: 589 até 778 podem ser modificados para remover quaisquer códons de partida potenciais (ATG) que podem fazer com que transcritos não intencionais sejam expressos a partir de íntrons de splicing como proteínas diferentes, mais longas ou truncadas. Uma vez que o íntron foi empiricamente testado, ou que foi alterado com base em experimentação, o íntron é usado para potencializar a expressão de um transgene em plantas transformadas estavelmente que podem ser de plantas monocotiledóneas ou dicotiledôneas de qualquer gênero, contanto que o íntron forneça potencialização ao transgene. O íntron pode também ser usado para potencializar a expressão em outros organismos, tais como células de algas, fungos ou animais, contanto que o íntron forneça potencialização ou atenuação ou especificidade da expressão do transgene ao qual ele está ligado operacionalmente.

Exemplo 12: Construções de Plasmídeos Compostas de Cassete de Transgene para Análise de Potencialização mediada por Íntron de Atividade de Transgene de GUS

[00182] Os elementos de íntrons isolados de Setaria italica são clonados usando métodos conhecidos na técnica em construções de plasmídeos compreendendo um promotor constitutivo para testar o efeito do íntron sobre a expressão de um transgene de GUS conduzido por um promotor constitutivo.

[00183] Os elementos de íntron apresentados como SEQ ID NOs: 179 até 267 foram clonados em construções de plasmídeos compreendendo um promotor constitutivo, P-CaMV.35S-enh-1:1:13 (SEQ ID NO: 1112), operacionalmente ligado em 5' a um elemento líder, L-CaMV.35S-1:1:15 (SEQ ID NO: 1111), operacionalmente ligado a um elemento de íntron de teste (SEQ ID NOs: 179 até 267), operacionalmente ligado em 5' a uma sequência de codificação de GUS, (GUS-1, SEQ ID NO: 1090), operacionalmente ligado em 5' a uma região de terminação 3' de Nopalina sintase de A. tumefaciens (T- AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 1088). O identificador de construção de plasmídeo, juntamente com cada anotação de íntron é apresentado na Tabela 19 abaixo. Tabela 19. Construções de Plasmídeos compreendendo cassetes de transgene para avaliar a potencialização mediada por íntron de expressão de transgene de GUS.

[00184] Cada plasmídeo foi usado como molde para amplificação por PCR do cassete de transgene para uso no ensaio de protoplastos, como descrito abaixo.

Exemplo 13: Análise de Potencialização Mediada por Íntron de Atividade de GUS Usando Protoplastos de Milho

[00185] As células de protoplastos, derivadas de tecido de folha de milho, são transformadas com cassetes de transgene na forma de amplicons de PCR para determinar o efeito de cada íntron na expressão do trangene, GUS, conduzidas por um promotor constitutivo e comparadas com íntrons conhecidos para ter um efeito de potencialização na expressão do transgene.

[00186] As construções descritas no exemplo 12 acima e apresentados na Tabela 19 do exemplo 12 foram usados como molde para gerar amplicons de PCR usando métodos conhecidos na técnica compreendendo um promotor constitutivo, P-CaMV.35S-enh-1:1:13 (SEQ ID NO: 1112), operacionalmente ligado em 5' a um elemento líder, L-CaMV.35S-1:1:15 (SEQ ID NO: 1111), operacionalmente ligado a um elemento de íntron de teste (SEQ ID NOs: 179 até 267), operacionalmente ligado em 5' a uma sequência de codificação de GUS, (GUS-1, SEQ ID NO: 1090), operacionalmente ligado em 5' a uma região de terminação 3' de Nopalina sintase de A. tumefaciens (T- AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 1088). Além disso, os amplicons, derivados de plasmídeos de controle também foram gerados usando os mesmos métodos de amplificação a partir das construções de plasmídio de controle, pMON19469, pMON65328, pMON25455, pMON8677 e pMON33449. O cassete de transgene de pMON19469 é composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP-CaMV.35S-enh/I- Zm.DnaK-1:1:1 (SEQ ID NO: 1104) e fornece uma comparação do promotor constitutivo potencializado usando o íntron I-Zm.DnaK-1:1:1. O cassete de transgene de pMON65328 é composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP-CaMV.35S-enh-Lhcb1/I- Os.Act1-1:1:9 (SEQ ID NO: 1105) e fornece uma comparação de potencialização do promotor constitutivo usando o íntron, I-Os.Act1- 1:1:9. O cassete de transgene de pMON25455 é composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 1098) e fornece uma comparação da expressão usando o promotor nativo, líder e íntron do gene de Actina 1 de arroz. O cassete de transgene de pMON8677 é composto do promotor, P-CaMV.35S-enh-1:1:9 (SEQ ID NO: 1096) operacionalmente ligado à sequência de codificação de GUS e fornece uma comparação da expressão com um promotor constitutivo sem um íntron para potencialização. O cassete de transgene de pMON33449 é composto de uma variante do promotor CaMV 35S (P- E35S:1:52, SEQ ID NO: 1117) e fornece uma comparação adicional sem um íntron.

[00187] As células de protoplastos, derivadas de tecido de folha de milho são transformadas usando métodos de transformação baseados em PEG conhecidos na técnica. Resumidamente, cada construção de teste e de controle é usado para fornecer molde para amplificação do cassete de transgene compreendendo cada construção. O amplicon resultante é fracionado por tamanho sobre um gel de agarose e o amplicon DNA é excisado do gel. O amplicon DNA é extraído do fragmento de gel usando métodos conhecidos na técnica e qualificado por espectrofotometria. As células de protoplastos são transformadas usando métodos de PEG conhecidos na técnica e usando 0,3 ou 0,1 pico-moles de amplicon DNA por PCR. De duas a quatro replicatas são realizadas para cada transformação e a expressão média conferida por cada construção é determinada. A expressão média de GUS observada para cada construção derivado de amplicon é normalizada com respeito à expressão observada para o amplicon derivado de pMON19469 composto do elemento de íntron, I-Zm.DnaK-1:1:1 (SEQ ID NO: 1102). As Tabelas 20 e 21 abaixo mostram a expressão média de GUS normalizada conferida por amplicons derivados de construções apresentadas na Tabela 19 do exemplo 12 com relação à expressão média de GUS conferida a amplicons derivados de plasmídeos de controle descritos acima usando 0,3 e 0,1 pmol de amplicon, respectivamente. Tabela 20. Potencialização mediada por íntron da expressão de GUS em protoplastos de milho com relação a I-Zm.DnaK-1:1:1 (SEQ ID NO: 1102) usando 0,3 pmol de amplicon de DNA.

[00188] Usando 0,3 pmol de amplicon, a maioria dos elementos de íntron de teste, derivados de S. italica, potencializou a expressão de GUS com relação a nenhum controle de íntron usando um promotor semelhante (pMON8677 e pMON33449). A potencialização melhorada da expressão de GUS, com relação ao elemento de íntron, I-Zm.DnaK- 1:1:1 (SEQ ID NO: 1102) foi observada para os elementos de íntron, I- SETit.eIF5A1-1-1:1:1 (SEQ ID NO: 222), I-SETit.60S_L10A1-5-1:1:2 (SEQ ID NO: 215), I-SETit.GRP-1-1:1:1 (SEQ ID NO: 242), I- SETit.LSm8-1-1:1:2 (SEQ ID NO: 243), I-SETit.60S_L10A1-2-1:1:2 (SEQ ID NO: 212), I-SETit.TubA2_3-1:1:1 (SEQ ID NO: 264), I-SETit.14- 3-3A-3-1:1:2 (SEQ ID NO: 180), I-SETit.eIF5A1-3-1:1:2 (SEQ ID NO: 224), I-SETit.14-3-3E-4-1:1:2 (SEQ ID NO: 199), I-SETit.PIP1-4_3-1:1:2 (SEQ ID NO: 252), I-SETit.PGK3_1-1:1:2 (SEQ ID NO: 247), I- SETit.40S-7S-3_1-1:1:2 (SEQ ID NO: 208), I-SETit.PIP1-1_3-1:1:2 (SEQ ID NO: 251), I-SETit.LSm8-4-1:1:2 (SEQ ID NO: 246), I- SETit.eIF5A2-2-1:1:3 (SEQ ID NO: 228), I-SETit.14-3-3E-3-1:1:2 (SEQ ID NO: 198), I-SETit.LSm8-2-1:1:1 (SEQ ID NO: 244), I-SETit.14-3-3A- 2-1:1:1 (SEQ ID NO: 179), I-SETit.eIF5A3-3-1:1:2 (SEQ ID NO: 234), I- SETit.14-3-3B-2-1:1:1 (SEQ ID NO: 183), I-SETit.14-3-3D-4-1:1:3 (SEQ ID NO: 195), I-SETit.14-3-3C-1-1:1:1 (SEQ ID NO: 187), I-SETit.14-3- 3C-3-1:1:2 (SEQ ID NO: 189), I-SETit.DnaJ_1-1:1:2 (SEQ ID NO: 218), I-SETit.eIF5A3-2-1:1:2 (SEQ ID NO: 233), I-SETit.40S-7S-1_2-1:1:2 (SEQ ID NO: 202), I-SETit.eIF5A3-4-1:1:2 (SEQ ID NO: 235) and I- SETit.ASA2-3-1:1:2 (SEQ ID NO: 216). Dados mostrados na Tabela 21 abaixo. Tabela 21. Potencialização mediada por íntron da expressão de GUS em protoplastos de milho com relação a I-Zm.DnaK-1:1:1 (SEQ ID NO: 1102) usando 0,1 pmol de amplicon de DNA.

[00189] A tendência básica na potencialização foi semelhante usando 0,1 pmol de amplicon. A maioria dos elementos de íntron de teste, derivados de S. italica, potencializou a expressão de GUS com relação a nenhum controle de íntron usando um promotor semelhante (pMON8677 e pMON33449). A potencialização melhorada da expressão de GUS, com relação ao elemento de íntron, I-Zm.DnaK- 1:1:1 (SEQ ID NO: 1102) foi observada usando os elementos de íntron, I-SETit.LSm8-1-1:1:2 (SEQ ID NO: 243), I-SETit.60S_L10A1-5-1:1:2 (SEQ ID NO: 215), I-SETit.eIF5A1-3-1:1:2 (SEQ ID NO: 224), I- SETit.GRP-1-1:1:1 (SEQ ID NO: 242), I-SETit.14-3-3D-2-1:1:1 (SEQ ID NO: 193), I-SETit.14-3-3D-3-1:1:2 (SEQ ID NO: 194), I-SETit.eIF5A3-3- 1:1:2 (SEQ ID NO: 234), I-SETit.LSm8-4-1:1:2 (SEQ ID NO: 246), I- SETit.LSm8-2-1:1:1 (SEQ ID NO: 244), I-SETit.eIF5A3-2-1:1:2 (SEQ ID NO: 233), I-SETit.eIF5A1-4-1:1:2 (SEQ ID NO: 225), I-SETit.ASA2-3- 1:1:2 (SEQ ID NO: 216), I-SETit.60S_L10A1-2-1:1:2 (SEQ ID NO: 212), I-SETit.eIF5A2-5-1:1:2 (SEQ ID NO: 231), I-SETit.14-3-3B-3-1:1:2 (SEQ ID NO: 184), I-SETit.14-3-3B-2-1:1:1 (SEQ ID NO: 183), I-SETit.DnaJ3- 2-1:1:2 (SEQ ID NO: 219), I-SETit.14-3-3A-3-1:1:2 (SEQ ID NO: 180), I- SETit.eIF5A3-4-1:1:2 (SEQ ID NO: 235), I-SETit.14-3-3C-5-1:1:2 (SEQ ID NO: 191), I-SETit.TubA3_2-1:1:1 (SEQ ID NO: 266), I-SETit.40S-7S- 1_3-1:1:2 (SEQ ID NO: 203), I-SETit.TubA2_3-1:1:1 (SEQ ID NO: 264), I-SETit.14-3-3C-3-1:1:2 (SEQ ID NO: 189), I-SETit.Prx3-1-1:1:2 (SEQ ID NO: 258) and I-SETit.DnaJ_1-1:1:2 (SEQ ID NO: 218).

Exemplo 14: Análise de Potencialização Mediada por Íntron de Atividade de GUS Usando Protoplastos de Trigo

[00190] As células de protoplastos, derivadas de tecido de folha de trigo, são transformadas com cassetes de transgene na forma de amplicons de PCR para determinar o efeito de cada íntron na expressão do trangene, GUS, conduzidas por um promotor constitutivo e comparadas com íntrons conhecidos para ter um efeito de potencialização na expressão do transgene.

[00191] As construções descritas no exemplo 12 acima e apresentadas na Tabela 19 do exemplo 12 foram usados como molde para gerar amplicons de PCR usando métodos conhecidos na técnica compreendendo um promotor constitutivo, P-CaMV.35S-enh-1:1:13 (SEQ ID NO: 1112), operacionalmente ligado em 5' a um elemento líder, L-CaMV.35S-1:1:15 (SEQ ID NO: 1111), operacionalmente ligado a um elemento de íntron de teste (SEQ ID NOs: 179 até 267), operacionalmente ligado em 5' a uma sequência de codificação de GUS, (GUS-1, SEQ ID NO: 1090), operacionalmente ligado em 5' a uma região de terminação 3' de Nopalina sintase de A. tumefaciens (T- AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 1088). Além disso, os amplicons, derivados de plasmídeos de controle também foram gerados usando os mesmos métodos de amplificação a partir das construções de plasmídio de controle, pMON19469, pMON65328, pMON25455, pMON8677 e pMON33449. O cassete de transgene de pMON19469 é composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP-CaMV.35S-enh/I- Zm.DnaK-1:1:1 (SEQ ID NO: 1104) e fornece uma comparação do promotor constitutivo potencializado usando o íntron I-Zm.DnaK-1:1:1. O cassete de transgene de pMON65328 é composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP-CaMV.35S-enh-Lhcb1/I- Os.Act1-1:1:9 (SEQ ID NO: 1105) e fornece uma comparação de potencialização do promotor constitutivo usando o íntron, I-Os.Act1- 1:1:9. O cassete de transgene de pMON25455 é composto do grupo de elemento regulador transcricional, EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 1098) e fornece uma comparação da expressão usando o promotor nativo, líder e íntron do gene de Actina 1 de arroz. O cassete de transgene de pMON8677 é composto do promotor, P-CaMV.35S-enh-1:1:9 (SEQ ID NO: 1096) operacionalmente ligado à sequência de codificação de GUS e fornece uma comparação da expressão com um promotor constitutivo sem um íntron para potencialização. O cassete de transgene de pMON33449 é composto de uma variante do promotor CaMV 35S (P- E35S:1:52, SEQ ID NO: 1117) e fornece uma comparação adicional sem um íntron.

[00192] As células de protoplastos, derivadas de tecido de folha de trigo são transformadas usando métodos de transformação baseados em PEG conhecidos na técnica. Resumidamente, cada construção de teste e de controle é usado para fornecer molde para amplificação do cassete de transgene compreendendo cada construção. O amplicon resultante é fracionado por tamanho sobre um gel de agarose e o amplicon de DNA é excisado do gel. O amplicon de DNA é extraído do fragmento de gel usando métodos conhecidos na técnica e qualificado por espectrofotometria. As células de protoplastos são transformadas usando métodos de PEG conhecidos na técnica e usando 0,1 picomoles de amplicon de DNA por PCR. De duas a quatro replicatas são realizadas para cada transformação e a expressão média conferida por cada construção é determinada. A expressão média de GUS observada para cada construção derivada de amplicon é normalizada com respeito à expressão observada para o amplicon derivado de pMON19469 composto do elemento de íntron, I-Zm.DnaK-1:1:1 (SEQ ID NO: 1102). As Tabelas 22 abaixo mostram a expressão média de GUS normalizada conferida por amplicons derivados das construções apresentadas na Tabela 19 do exemplo 12 com relação à expressão média de GUS conferida aos amplicons derivados de plasmídeos de controle descritos acima usando 0,1 pmol de amplicon. Tabela 22. Potencialização Mediada por Íntron de Expressão de GUS em Protoplastos de Trigo com Relação a I-Zm.DnaK-1:1:1 (SEQ ID NO: 1102).

[00193] Como foi observado em células de protoplastos de milho, muitos dos elementos de íntron de teste forneceram potencialização da expressão do transgene em relação aos controles de intronless. A potencialização melhorada da expressão de GUS, com relação ao elemento de íntron, I-Zm.DnaK-1:1:1 (SEQ ID NO: 1102) foi observada usando os elementos de íntron, I-SETit.LSm8-1-1:1:2 (SEQ ID NO: 243), I-SETit.60S_L10A1-5-1:1:2 (SEQ ID NO: 215), I-SETit.eIF5A1-3- 1:1:2 (SEQ ID NO: 224), I-SETit.GRP-1-1:1:1 (SEQ ID NO: 242), I- SETit.14-3-3D-2-1:1:1 (SEQ ID NO: 193), I-SETit.14-3-3D-3-1:1:2 (SEQ ID NO: 194), I-SETit.eIF5A3-3-1:1:2 (SEQ ID NO: 234), I-SETit.LSm8- 4-1:1:2 (SEQ ID NO: 246), I-SETit.LSm8-2-1:1:1 (SEQ ID NO: 244), I- SETit.eIF5A3-2-1:1:2 (SEQ ID NO: 233), I-SETit.eIF5A1-4-1:1:2 (SEQ ID NO: 225), I-SETit.ASA2-3-1:1:2 (SEQ ID NO: 216), I- SETit.60S_L10A1-2-1:1:2 (SEQ ID NO: 212), I-SETit.eIF5A2-5-1:1:2 (SEQ ID NO: 231), I-SETit.14-3-3B-3-1:1:2 (SEQ ID NO: 184), I- SETit.14-3-3B-2-1:1:1 (SEQ ID NO: 183), I-SETit.DnaJ3-2-1:1:2 (SEQ ID NO: 219), I-SETit.14-3-3A-3-1:1:2 (SEQ ID NO: 180), I-SETit.eIF5A3- 4-1:1:2 (SEQ ID NO: 235), I-SETit.14-3-3C-5-1:1:2 (SEQ ID NO: 191), I- SETit.TubA3_2-1:1:1 (SEQ ID NO: 266), I-SETit.40S-7S-1_3-1:1:2 (SEQ ID NO: 203), I-SETit.TubA2_3-1:1:1 (SEQ ID NO: 264), I-SETit.14- 3-3C-3-1:1:2 (SEQ ID NO: 189), I-SETit.Prx3-1-1:1:2 (SEQ ID NO: 258) e I-SETit.DnaJ_1-1:1:2 (SEQ ID NO: 218).

Exemplo 15. Ensaio de molécula de terminação de transcrição 3' ou 3' UTRs em protoplastos

[00194] As moléculas de terminação de transcrição 3' ou 3' UTRs são isoladas de Foxtail millet (Setaria italica (L.) Beauv) e clonadas em vetores de base de plantas usando métodos conhecidos na técnica para testar a eficácia de 3' UTR na terminação de transcrição bem como a potencialização da expressão de um transgene.

[00195] As 3' UTRs úteis para fornecer a expressão de um transgene em plantas são identificadas com base na expressão de tags de sequências expressos (ESTs) em bibliotecas de cDNA feitos a partir de RNA mensageiro isolado a partir de semente, flor e de outros tecidos derivados de Foxtail millet (Setaria italica (L.) Beauv). As bibliotecas de cDNA são feitas a partir de tecidos isolados de S. italica usando métodos conhecidos dos versados na técnica a partir de tecido de flor, semente, folha e raiz. Os cDNAs resultantes são sequenciados usando vários métodos de sequenciamento conhecidos na técnica. Os ESTs resultantes são montados em clusters usando software de bioinformática, tais como clc_ref_assemble_complete versão 2.01.37139 (CLC bio USA, Cambridge, Massachusetts 02142). A abundância do transcrito de cada agrupamento é determinada por contagem do número de cDNA lido para cada grupo.

[00196] As 3' UTRs identificadas podem ser compostas de sequência derivadas da sequência de cDNA, assim como de sequências derivados de DNA genômico. A sequência de cDNA é usada para projetar iniciadores, que são então utilizados com bibliotecas de GenomeWalkerTM (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA) construídas seguindo o protocolo do fabricante para clonar a região 3' da sequência de DNA genômico correspondente para fornecer uma sequência de terminação mais longa. A análise de abundância de transcrito relativa, quer por contagens diretas ou contagens normalizadas de sequência observada lidas para cada biblioteca de tecido pode ser usada para inferir propriedades sobre padrões de expressão. Para Exemplo, algumas 3' UTRs podem ser encontradas em transcritos vistas em maior abundância no tecido de raiz em oposição ao da folha. Isto é sugestivo de que o transcrito é altamente expresso em raiz e que as propriedades de expressão de raiz podem ser atribuíveis à regulação transcricional do promotor, líder, íntrons ou a 3' UTR. O teste empírico de 3' UTRs identificado pelas propriedades de expressão no interior de órgãos, tecidos ou tipos de células específicos pode resultar na identificação de 3' UTRs que potencializam a expressão naqueles órgãos, tecidos ou tipos de células específicos.

[00197] As sequências de 3' UTR isoladas de S. italica são apresentadas em como SEQ ID NOs: 268 até 276 e SEQ ID NOS: 779 até 924. A Tabela 23 abaixo apresenta 3' UTRs identificadas como sendo úteis para o controle de expressão e potencialização da expressão da raiz ou expressão constitutiva. Tabela 23. Elementos de Terminação de Transcrição ou 3' UTR derivados de S. italica.

[00198] As 3' UTRs da presente invenção, apresentadas como SEQ ID NOs: 268 até 276 e SEQ ID NOs: 779 até 924 são testadas em ensaios de protoplastos transientes. Um promotor constitutivo ou de outro tipo é usado para dirigir a expressão de um transgene, tais como GUS. Os vetores de plantas são construídos usando métodos conhecidos na técnica em que um cassete de transgene é usado para testar as propriedades de 3 'UTR, bem como fornecer transcrito que pode ser analisado para compreender a eficácia de 3' UTR na expressão de controle do transgene e processamento do transcrito resultante.

[00199] Para o ensaio transiente da eficácia de 3' UTR de teste, um vetor de planta de base é construído usando métodos conhecidos na técnica. A 3' UTR é clonada em um vetor de planta de base que compreende um primeiro cassete de transgene para testar a 3' UTR composto de um promotor constitutivo, tal como o promotor do vírus do mosaico da couve-flor, P-CaMV.35S-enh-1:1:9 (SEQ ID NO: 1096), operacionalmente ligado em 5' a um elemento líder, L-Ta.Lhcb1-1:1:1 (SEQ ID NO: 1114), operacionalmente ligado a um íntron derivados da proteína de choque térmico HSP70 de Zea mays (I-Zm.DnaK-1:1:1, SEQ ID NO: 1102), operacionalmente ligado a uma sequência de codificação para β-glucuronidase (GUS) que possuía um intron processável (GUS-2, SEQ ID NO: 1091) ou nenhum íntron (GUS-1, SEQ ID NO: 1090), operacionalmente ligado à região de terminação 3' de Nopalina sintase de A. tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 1088) ou a região de terminação 3' do gene de proteína de transferência de lípideo de arroz (T-Os.LTP-1:1:1, SEQ ID NO: 1089); um segundo cassete de seleção de transgene usado para seleção de células de plantas transformadas que confere resistência ao herbicida glifosato (conduzido pelo grupo de elemento regulador transcricional de Actina 1 de arroz, SEQ ID NO: 1098), ou alternativamente, o antibiótico kanamicina (conduzido pelo grupo de elemento regulador transcricional de Actina 1 de arroz, SEQ ID NO: 1098) e uma região da fronteira da esquerda de A. tumefaciens.

[00200] Várias observações experimentais são feitas para caracterizar a 3' UTR no ensaio de protoplastos. Por exemplo, o nível de expressão é determinado usando coloração de GUS tal como descrito nos exemplos anteriores para avaliar a quantidade de proteína expressa e é normalizado usando métodos conhecidos na técnica para estabelecer uma comparação dos níveis de expressão de proteína de 3' UTR de teste com relação a controle T-AGRtu.nos. O RNA total é extraído e sondado em Northern blots com sondas específicas para a sequência de codificação de GUS para avaliar o tamanho ou os tamanhos de transcritos produzidos nas células de protoplastos para determinar a eficácia da 3' UTR na transcrição de terminação. Alternativamente, a sequência de 3' de 3' UTR pode ser usada para reações de amplificação de iniciadores a partir do RNA transcrito reverso para detectar transcritos em que a leitura ocorreu para além de 3' UTR. O RNA total sondado em Northern blots também pode revelar a abundância relativa do transcrito quando comparado com o controle T- AGRtu.nos.

Exemplo 16. Ensaio de Sequências de Terminação Transcricional ou 3' UTRs em Plantas Estáveis.

[00201] As 3' UTRs, apresentadas como SEQ ID NOs: 268 até 276 e SEQ ID NOs: 779 até 924 são testadas em plantas de milho estavelmente transformadas. Para ensaio de planta estável de 3' UTR, um vetor de transformação de planta de expressão de GUS é construído usando métodos conhecidos na técnica semelhantes às construções descritas no exemplos anteriores. A 3' UTR é clonada em um vetor de planta de base que compreende um primeiro cassete de transgene para testar a 3' UTR composto de um promotor constitutivo, tal como o promotor do vírus do mosaico da couve-flor, P-CaMV.35S-enh-1:1:9 (SEQ ID NO: 1096), operacionalmente ligado em 5' a um elemento líder, L-Ta.Lhcb1-1:1:1 (SEQ ID NO: 1114), ou alternativamente, a raiz promotor tal como proteína de transferência de lipídeo promotor, P- Os.Rcc3-1:1:24 (SEQ ID NO: 1093), operacionalmente ligado em 5' ao líder, L-Os.Rcc3-1:1:2 (SEQ ID NO: 1094), operacionalmente ligado a um íntron derivado de proteína de choque térmico HSP70 de Zea mays (I-Zm.DnaK-1:1:1, SEQ ID NO: 1102), operacionalmente ligado a uma sequência de codificação para β-glucuronidase (GUS) que possuía um íntron processável (GUS-2, SEQ ID NO: 1091) ou nenhum íntron (GUS- 1, SEQ ID NO: 1090), operacionalmente ligado a uma região de terminação 3' de teste; um segundo cassete de seleção de transgene usado para seleção de células de plantas transformadas que confere resistência ao herbicida glifosato (conduzido pelo grupo de elemento regulador transcricional de Actina 1 de arroz, SEQ ID NO: 1098), ou alternativamente, o antibiótico kanamicina (conduzido pelo grupo de elemento regulador transcricional de Actina 1 de arroz, SEQ ID NO: 1098) e uma região da fronteira da esquerda de A. tumefaciens.

[00202] Os plasmídeos resultantes são usados para transformar plantas de milho. Transformantes de baixo número de cópias ou de cópia única são selecionados para comparação com plantas transformadas de baixo número de cópia ou de uma única cópia, transformados com um vetor de transformação de plantas idêntico ao vetor de teste mas compreendendo uma 3' UTR bem caracterizada, tal como a região de terminação 3' de Nopalina sintase de A. tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 1088) operacionalmente ligada a transgene de GUS.

[00203] As plantas de milho são transformadas como descrito acima ou por métodos de transformação mediados por Agrobacterium conhecidos na técnica. O tecido é colhido em pontos de tempo diferentes de desenvolvimento e de diferentes órgãos e ensaiado quanto à atividade de GUS para avaliar a quantidade de proteína expressa em cada tecido em janelas de tempos diferentes de desenvolvimento e é comparado com a expressão de GUS em plantas transformadas de controle. O RNA total é extraído a partir de diferentes tecidos de interesse e sondado em Northern blots com sondas específicas para a sequência de codificação de GUS para avaliar o tamanho ou os tamanhos de transcritos produzidos no interior de cada um dos tecidos selecionados para determinar a eficácia da 3' UTR na transcrição de terminação e na abundância relativa de mensagem em cada tecido selecionado. Alternativamente, a sequência de 3' de 3' UTR pode ser usada para iniciar reações de amplificação a partir de RNA transcrito reverso para detectar transcritos em que a leitura ocorreu para além da 3' UTR ou avaliar a quantidade de transcrição expressa em cada tecido. As 3 'UTRs mais úteis e eficazes são selecionadas para uso em cassetes de transgenes em que os genes de importância agronômica são expressos.

Exemplo 17: Análise de Potencialização Mediada por 3' UTR da Atividade de GUS em Plantas de Milho Transgênico.

[00204] Os vetores binários de plantas são construídos usando métodos conhecidos na técnica semelhantes aos descritos no exemplo anterior e usados para transformar plantas de milho para testar a eficácia de 3' UTRs selecionadas.

[00205] Os vetores de transformação de plantas são usados para transformar plantas de milho para testar a eficácia no controle da expressão do transgene de GUS, quando conduzida por um promotor constitutivo, (P-FMV.35S-enh-1:1:1 (SEQ ID NO: 1115) + L-Ta.Lhcb1- 1:1:1 (SEQ ID NO: 1114)) ou um promotor de raiz potencializado, ((E- CaMV.35S-enh-1:1:1 (SEQ ID NO: 1116) + P-Os.Rcc3-1:1:24 (SEQ ID NO: 1093) + L-Os.Rcc3-1:1:2 (SEQ ID NO: 1094)). Os vetores expressão de planta resultantes contêm uma região da fronteira direita de Agrobacterium tumefaciens, um primeiro cassete de transgene para testar a 3' UTR composto de um promotor constitutivo, (P-FMV.35S- enh-1:1:1 (SEQ ID NO: 1115) + L-Ta.Lhcb1-1:1:1 (SEQ ID NO: 1114)) ou um promotor de raiz potencializado, ((E-CaMV.35S-enh-1:1:1 (SEQ ID NO: 1116) + P-Os.Rcc3-1:1:24 (SEQ ID NO: 1093) + L-Os.Rcc3-1:1:2 (SEQ ID NO: 1094)), operacionalmente ligado em 5' a uma sequência de codificação para β-glucuronidase (GUS) que possui um íntron processável (GUS-2, SEQ ID NO: 1091) operacionalmente ligado a 3' UTR de teste; um segundo cassete de seleção de transgene usado para seleção de células de plantas transformadas que confere resistência ao herbicida glifosato (conduzido pelo promotor de Actina 1 de arroz), e uma região da fronteira da esquerda de A. tumefaciens. A Tabela 24 abaixo mostra as construções de teste e o promotor e 3' UTR correspondentes. Tabela 24. Construções de Teste de Terminação transcricional ou 3' UTR em que GUS é conduzido por um promotor constitutivo ou um promotor de raiz potencializado.

[00206] Plantas de milho são transformadas usando métodos mediados por Agrobacterium conhecidos na técnica e como descrito nos Exemplos anteriores. Plantas de milho transformadas são ensaiadas para a atividade de GUS como descrito nos Exemplos anteriores. As Tabelas 25 e 26 mostram o nível médio de expressão de GUS observada em vários tecidos isolados a partir das plantas transformadas em oo promotor constitutivo, ((P-FMV.35S-enh-1:1:1 (SEQ ID NO: 1115) + L-Ta.Lhcb1-1:1:1 (SEQ ID NO: 1114)), conduziu a expressão do transgene de GUS. As Tabelas 27 e 28 mostram o nível médio de expressão de GUS observada em tecidos isolados a partir das plantas transformadas em que o promotor de raiz potencializado, ((E- CaMV.35S-enh-1:1:1 (SEQ ID NO: 1116) + P-Os.Rcc3-1:1:24 (SEQ ID NO: 1093) + L-Os.Rcc3-1:1:2 (SEQ ID NO: 1094)), conduziu a expressão de transgene de GUS. A potencialização da expressão conferida pela 3' UTR é inferida pela comparação relativa entre as construções transformadas compreendendo cada UTR e promotor específico. Tabela 25. Expressão Média de R0 GUS de um promotor constitutivo que conduz GUS com 3' UTRs diferentes.

[00207] A expressão média do gene de GUS foi efetuada por 3' UTRs diferentes. A expressão de GUS conduzida pelo promotor constitutivo pareceu ser afetada pelo uso de 3' UTRs diferentes, particularmente, com respeito a expressão de folha. Uma potencialização da expressão da folha no estágio V3 e V7 pode ser vista quando a 3' UTR, T- SETit.Ctpt-1:1:2 (SEQ ID NO: 271) foi usada em combinação com o promotor constitutivo. A potencialização foi fornecida para todos os 3 estágios da folha ao combinar o promotor constitutivo com 3' UTRs, T- SETit.Mes2-1:1:1 (SEQ ID NO: 274), T-SETit.Act1-1:1:1 (SEQ ID NO: 268) e T-SETit.Ams1-1:1:1 (SEQ ID NO: 270). A potencialização de expressão na raiz usando o promotor constitutivo foi observada em todos os 3 estágios usando a 3 'UTR, T-SETit.Ams1-1:1:1 (SEQ ID NO: 270) e no estágio VT usando as 3' UTRs, T-SETit.Mes2-1:1:1 (SEQ ID NO: 274), T-SETit.Act8-1:1:1 (SEQ ID NO: 269) e T-SETit.Act1-1:1:1 (SEQ ID NO: 268). Tabela 26. Expressão Média de R0 GUS de um promotor constitutivo que conduz GUS com 3' UTRs diferentes.

[00208] A potencialização da expressão de GUS na antera e pólen ao usar um promotor constitutivo pode ser observada para as 3' UTRs, T-SETit.Fnr-1:1:1 (SEQ ID NO: 273), T-SETit.Mes2-1:1:1 (SEQ ID NO: 274), T-SETit.Act8-1:1:1 (SEQ ID NO: 269), T-SETit.Act1-1:1:1 (SEQ ID NO: 268) e T-SETit.Ams1-1:1:1 (SEQ ID NO: 270). A potencialização da expressão de GUS no endosperma ao usar um promotor constitutivo pode ser observada para a 3' UTR, T-SETit.Sus2-1:1:1 (SEQ ID NO: 276). A potencialização da expressão de GUS no embrião ao usar um promotor constitutivo pode ser observada na maioria das 3' UTRs com relação ao de mais baixa expressão, T-SETit.Ntr-1:1:1 (SEQ ID NO: 275). A maior quantidade de potencialização no embrião foi observada usando as 3' UTRs, T-SETit.Mes2-1:1:1 (SEQ ID NO: 274) e T- SETit.Act1-1:1:1 (SEQ ID NO: 268).

[00209] A leitura foi avaliada usando métodos de PCR conhecidos na técnica. As 3' UTRs que demonstraram alguma leitura no ensaio foram T-SETit.Ntr-1:1:1 (SEQ ID NO: 275), T-SETit.Sus2-1:1:1 (SEQ ID NO: 276), T-SETit.Ctpt-1:1:2 (SEQ ID NO: 271), T-SETit.Mes2-1:1:1 (SEQ ID NO: 274) e T-SETit.Act1-1:1:1 (SEQ ID NO: 268). As 3' UTRs em que a leitura não foi observada foram T-SETit.Fnr-1:1:1 (SEQ ID NO: 273), T-SETit.Fba-1:1:1 (SEQ ID NO: 272), T-SETit.Act8-1:1:1 (SEQ ID NO: 269) e T-SETit.Ams1-1:1:1 (SEQ ID NO: 270). Tabela 27. Expressão Média de R0 GUS de um Promotor Raiz Potencializado que Conduz GUS com Diferentes 3' UTRs.

[00210] Usando um promotor de raiz potencializado, a potencialização na raiz no Estágio V3 e V7 foi observada usando a 3' UTR, T-SETit.Sus2-1:1:1 (SEQ ID NO: 276). A ligeira potencialização de expressão de raiz também pôde ser observada ao usar as 3' UTRs, T-SETit.Ctpt-1:1:2 (SEQ ID NO: 271) (Estágio V3 e V7), T-SETit.Fnr- 1:1:1 (SEQ ID NO: 273) (V3 stage) e T-SETit.Fba-1:1:1 (SEQ ID NO: 272) (estágio V3). Uam potencialização da expressão de folha foi observada ao usar o promotor de raiz potencializado em combinação com T-SETit.Fnr-1:1:1 (SEQ ID NO: 273). Tabela 28. Expressão média de R0 GUS de um promotor de raiz potencializado que conduz GUS com diferentes 3' UTRs.

[00211] A potencialização da expressão no embrião foi observada para a 3' UTR, T-SETit.Sus2-1:1:1 (SEQ ID NO: 276), quando combinada com o promotor de raiz potencializado. Os elementos da 3' UTR apresentados acima, cada um, tinham um efeito sobre a expressão de GUS quando combinados em ligação operativa com um promotor constitutivo ou um promotor de raiz potencializado.

Exemplo 18. Identificação e Ensaio de Peptídeos de Trânsito de Cloroplastos (CTPs).

[00212] É bem conhecido que as células de organismos eucariotas, e mais particularmente células de plantas, contêm distintos compartimentos subcelulares, ou organelas, delimitadas por sistemas de membrana característicos e realizam funções especializadas dentro da célula. Em células fotossintéticas as organelas mais evidentes de plantas superiores são os cloroplastos, que existem em uma forma semiautônoma dentro da célula, que contêm seu próprio sistema genético e maquinário de síntese de proteínas, mas contando com uma estreita cooperação com o sistema nucleo-citoplasmático no seu desenvolvimento e atividades biossintéticas.

[00213] A maioria das proteínas de cloroplastos é codificada para no DNA nuclear e são os produtos da síntese de proteína em ribossomas citoplasmáticos, muitos como precursores de pesos moleculares elevados solúveis. Estes precursores são então translocados, quer através de uma ou de ambas as membranas de envelope plastidiais, processados e montados no seu compartimento organelar final ou complexo holoenzima. Os experimentos de reconstituição in vitro usando cloroplastos isolados demonstraram que a absorção e o processamento de mais de cem precursores sintetizados citoplasmaticamente, codificados nucleares por cloroplastos ocorrem por um mecanismo pós-translacional dependente de energia.

[00214] A mais extensivamente caracterizada proteína de cloroplasto nuclear codificada é a subunidade pequena da ribulose-1,5-bifosfato (RuBP) carboxilase. Este polipeptídeo é sintetizado em ribossomas citoplasmáticos livres como um precursor de 20.000 daltons contendo uma extensão amino terminal ou o peptídeo de trânsito de cerca de 5-6.000 daltons. Durante ou imediatamente depois da importação do precursor para o interior do cloroplasto, o peptídeo de trânsito é proteoliticamente removido em duas etapas por uma protease solúvel, obtendo-se um polipeptídeo de subunidade pequeno maduro de 15.000 daltons. Este polipeptídeo é então montado com uma subunidade endógena grande na holoenzima funcional RuBP carboxilase.

[00215] Estas propriedades diferentes dos peptídeos de trânsito estão na base dos DNAs recombinantes, mais particularmente vetores recombinantes incluindo uma sequência de ADN que codifica uma determinada proteína ou polipeptídeo, particularmente, uma proteína estranha, a ser introduzida e processada em cloroplastos, bem como os processos para a introdução de tal polipeptídeo ou proteína estranha para os cloroplastos, por exemplo, nas membranas tilacoides ou, preferencialmente, no estroma das mesmas.

[00216] Os peptídeos de trânsito de cloroplasto (CTPS) são isolados a partir de S. italica com base na análise de sequências de agrupamento de EST e homologia com moléculas alvos de plastídeos conhecidas. Clusters de sequências de EST são usados para deduzir a sequência de codificação de moléculas de proteínas alvos de cloroplastos. Um fragmento derivado da extremidade 5' da sequência de codificação da molécula alvo de cloroplasto deduzida é clonado usando métodos conhecidos na técnica para produzir uma molécula quimérica, em que uma sequência de codificação que codifica uma molécula alvo de não cloroplasto é fundida na estrutura na extremidade 5' com um fragmento de DNA que codifica a sequência de peptídeo de trânsito putativo e clonada em um vetor de expressão de plantas para determinar a capacidade e eficiência do CTP putativo para causar a importação da molécula quimérica no cloroplasto e subsequente processamento da sequência do peptídeo de trânsito na proteína processada, madura.

[00217] Os clusters da sequência de EST de S. Italica traduzidos são comparados com as sequências de DNA que codificam moléculas alvos de plastídeos conhecidas a partir de monocotiledôneas, tais como milho, sorgo e arroz para determinar a integridade da sequência de codificação de agrupamento e deduzir a sequência de aminoácidos N- terminal potencial que será útil como uma sequência de codificação de peptídeo de trânsito. Em alguns casos, a maior parte da porção 5' do agrupamento de EST S. italica está ausente. Nestas condições, um oligo degenerativo é projetado com base no alinhamento das sequências de codificação de sorgo e arroz, que codifica os homólogos à sequência de codificação da proteína S. italica para facilitar a amplificação da sequência de 5' desconhecida.

[00218] As sequências que codificam as proteínas alvos de plastídeos úteis no isolamento e clonagem de S. Italica CTPs são apresentadas como SEQ ID NOS: 1034 até 1060. As sequências de proteínas representando peptídeos alvos plastidiais úteis na identificação de S. Italica CTPs são apresentados como 1061 até 1087. As sequências de nucleotídeos que codificam peptídeos de trânsito mostradas na Tabela 29 abaixo estão apresentadas como SEQ ID NOS: 277 até 284, 289 até 293, 296, 301 até 304 e 307 até 316. As sequências de proteínas dos peptídeos de trânsito codificados são apresentadas como SEQ ID NOS: 324 até 350.

[00219] As construções para uso na clonagem dos peptídeos de trânsito e sequências que codificam os peptídeos de trânsito, bem como as IDs (identificações) sequências de peptídeos de trânsito são apresentados na Tabela 29 abaixo. Tabela 29. Construções de Plasmídeos para uso na clonagem de Peptídeos de Trânsito de Cloroplastos e sequências de codificação de nucleotídeos e proteínas associadas.

[00220] As sequências de codil ficação de peptídeo de trânsito apresentadas como SEQ ID NOs: 325, 326, 332, 334, 335 e 340 são derivadas e clonadas das sequências de DNA compreendendo um íntron processável. A construção de plasmídeo pMON136303 é composto da sequência de codificação de peptídeo de trânsito, GOI-TS- APX, apresentada como SEQ ID NO: 277, que é ainda composta do elemento, TS-SETit.APX.ex1-1:1:1 (SEQ ID NO: 286), operacionalmente ligado em 5' ao elemento de íntron, I-SETit.APX-1:1:1 (SEQ ID NO: 318), operacionalmente ligado em 5' to the element, TS- SETit.APX.ex2-1:1:2 (SEQ ID NO: 287). A construção de plasmídeo pMON139282 é composto da sequência de codificação de peptídeo de trânsito, GOI-TS-APX:1:2, apresentada como SEQ ID NO: 278, que é ainda composta do elemento, TS-SETit.APX.ex1-1:1:1 (SEQ ID NO: 286), operacionalmente ligado em 5' ao elemento de íntron, I- SETit.APX-1:1:2 (SEQ ID NO: 319), operacionalmente ligado em 5' ao elemento, TS-SETit.APX.ex2-1:1:2 (SEQ ID NO: 287). A construção de plasmídeo pMON139283 é composta da sequência de codificação de peptídeo de trânsito, GOI-TS-APX2:1:1, apresentada como SEQ ID NO: 279, que é ainda composta do elemento, TS-SETit.APX.2,ex1-1:1:1 (SEQ ID NO: 285), operacionalmente ligado em 5' ao elemento de íntron, I-SETit.APX.2-1:1:1 (SEQ ID NO: 317), operacionalmente ligado em 5' ao elemento, TS-SETit.APX2,ex2-1:1:1 (SEQ ID NO: 288). A construção de plasmídeo pMON139281 é composto da sequência de codificação de peptídeo de trânsito, GOI-TS-CNT:1:2, apresentadas como SEQ ID NO: 280, que é ainda composta do elemento, TS- SETit.CNT.ex1-1:1:1 (SEQ ID NO: 294), operacionalmente ligado em 5' ao elemento de íntron, I-SETit.CNT.1-1:1:1 (SEQ ID NO: 320), operacionalmente ligado em 5' ao elemento, TS-SETit.CNT.ex2-1:1:2 (SEQ ID NO: 295). A construção de plasmídeo pMON139291 é composta da sequência de codificação de peptídeo de trânsito, GOI-TS- DHDPS:1:2, apresentada como SEQ ID NO: 281, que é ainda composta do elemento, TS-SETit.DHDPS.Ex1-1:1:1 (SEQ ID NO: 297), operacionalmente ligado em 5' ao elemento de íntron, I- SETit.DHDPS_1-1:1:1 (SEQ ID NO: 321), operacionalmente ligado em 5' ao elemento, TS-SETit.DHDPS.Ex2-1:1:1 (SEQ ID NO: 298). A construção de plasmídeo pMON139288 é composta da sequência de codificação de peptídeo de trânsito, GOI-TS-Fe-SD:1:1, apresentada como SEQ ID NO: 282, que é ainda composta do elemento, TS- SETit.Fe-SD.ex1-1:1:1 (SEQ ID NO: 299), operacionalmente ligado em 5' ao elemento de íntron, I-SETit.Fe-SD-1:1:1 (SEQ ID NO: 322), operacionalmente ligado em 5' ao elemento, TS-SETit.Fe-SD.ex2-1:1:1 (SEQ ID NO: 300). A construção de plasmídeo pMON139287 é composta da sequência de codificação de peptídeo de trânsito, GOI-TS- PPR:1:1, apresentadas como SEQ ID NO: 283, que é ainda composta do elemento, TS-SETit.PPR.ex1-1:1:1 (SEQ ID NO: 305), operacionalmente ligado em 5' ao elemento de íntron, I-SETit.PPR-1:1:2 (SEQ ID NO: 323), operacionalmente ligado em 5' ao elemento, TS- SETit.PPR.ex2-1:1:2 (SEQ ID NO: 306).

[00221] As sequências de codificação isoladas que codificam CTPs S. Italica são testadas usando vetores de plantas projetados para uso em ensaios de plantas de transformação estáveis ou protoplastos transientes. Os fragmentos de DNA que codificam a CTP são clonados na estrutura com uma sequência de codificação de GUS usando métodos conhecidos na técnica. Um vetor de transformação de plantas é construído usando métodos conhecidos na técnica e é composto de uma maneira semelhante como os vetores de plantas descritos nos exemplos anteriores. O cassete de expressão usado para testar CTP é composto por um promotor constitutivo, tal como o promotor do vírus do mosaico da couve-flor, P-CaMV.35S-enh-1:1:9 (SEQ ID NO: 1096), operacionalmente ligado em 5' a um elemento líder, L-Ta.Lhcb1-1:1:1 (SEQ ID NO: 1097), operacionalmente ligado em 5' a uma sequência de codificação para GFP em que o CTP de teste está fundido na estrutura na extremidade 5' da sequência de codificação de GFP para possibilitar a translação de uma molécula CTP-GFP quimérica, operacionalmente ligada à região de terminação 3' de Nopalina sintase de A. tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 1088). Para a transformação de planta estável, um segundo cassete de seleção de transgene usado para seleção de células de plantas transformadas que confere resistência ao herbicida glifosato (conduzido pelo promotor de Actina 1 de arroz) é clonado adjacente ao cassete de transgene de teste de CTP. Os dois cassetes de transgene são flanqueados na região da fronteira da direita e fronteira da esquerda de Agrobacterium tumefaciens para permitir a integração estável de ambos os cassetes de transgene no genoma de célula da planta.

[00222] Para os testes de ensaio transiente de CTP, as células de protoplastos são transformadas com a construção de plasmídeo de planta compreendendo o cassete transgene de teste de CTP. As células de protoplastos transformadas são observadas por microscopia e fluorescência para determinar a quantidade relativa de proteína GFP presente no cloroplasto e no citosol. Uma CTP eficaz irá causar mais fluorescência de GFP para aparecer no estroma do cloroplasto ou tilacóide, dependendo do tipo de CTP escolhido. A proteína é isolada e sujeita à eletroforese em géis de poliacrilamida e colorida usando métodos padrões e comparada com um padrão de proteína GFP alvo não plastidial para determinar se o processamento correto do peptídeo de trânsito ocorreu.

[00223] Para a transformação de planta estável, as plantas de milho são transformadas como descrito acima usando métodos de transformação mediados por Agrobacterium conhecidos na técnica. Os tecidos são colhidos a partir dos transformantes em desenvolvimento e visualizados ao microscópio com fluorescência para determinar as quantidades relativas de proteína GFP no cloroplasto e citosol. A proteína é isolada e sujeita à eletroforese em géis de poliacrilamida e colorida usando métodos padrões e comparada com um padrão de proteína GFP alvo não plastidial para determinar se o processamento correto do peptídeo de trânsito ocorreu.

[00224] Tendo ilustrado e descrito os princípios da presente invenção, deve ser aparente para as pessoas versadas na técnica que a invenção pode ser modificada em arranjos e detalhes sem se afastar de tais princípios. São reivindicadas todas as modificações que estão dentro do espírito e escopo das reivindicações. Todas as publicações e documentos de patentes publicados aqui citados são aqui incorporados por referência na mesma medida como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

Claims

1. Molécula de DNA recombinante, caracterizada pelo fato de que consiste em uma sequência de DNA compreendendo SEQ ID NO: 187, em que a referida sequência é operacionalmente ligada a uma molécula de polinucleotídeo heteróloga que pode ser transcrita.

2. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de polinucleotídeo heteróloga que pode ser transcrita compreende um gene de interesse agronômico.

3. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de polinucleotídeo heteróloga que pode ser transcrita compreende um gene capaz de fornecer resistência aos herbicidas em plantas.

4. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de polinucleotídeo heteróloga que pode ser transcrita compreende um gene capaz de fornecer controle de pestes de plantas nas plantas.