TWI683903B

TWI683903B - 高效率運送蛋白質至色質體的方法

Info

Publication number: TWI683903B
Application number: TW105122284A
Authority: TW
Inventors: 李秀敏; 朱瓊枝
Original assignee: 中央研究院
Priority date: 2015-07-14
Filing date: 2016-07-14
Publication date: 2020-02-01
Also published as: TW201704473A; US10577620B2; US20190055573A1; US20170016011A1; US10184128B2; US20190055572A1; US10577621B2

Abstract

本發明係提供一種編碼一融合蛋白的重組DNA分子，包含：一編碼有一高效率訊息胜肽的第一DNA序列，以及一與該第一DNA序列操作性連接編碼有一運載蛋白的第二DNA序列，其中該高效率訊息胜肽係選自於由葉綠體內膜運輸機組40kD、伴隨蛋白10-2、小纖維蛋白1B、ATP硫酸化酶1、ATP硫酸化酶3、5’-焦磷酸化還原酶3、基質的抗壞血酸鹽過氧化物酶、葉綠體內膜運輸機組40kD突變體以及伴隨蛋白10-1突變體之前驅物訊息胜肽、任何該訊息胜肽的功能性片段以及等效之片段所組成之群組。本發明亦提供一種使用該高效率運送胜肽高效率運送蛋白質至色質體的方法。

Description

高效率運送蛋白質至色質體的方法

本發明係關於一種植物生物科技，特別係關於一種高效率運送蛋白質至色質體的方法，其中該色質體特別係為白色體。

色質體(plastid)是植物中的必要胞器，主要負責光合作用，氮、硫之同化作用，以及合成脂肪、澱粉、類胡蘿蔔素和大部分的胺基酸。色質體在不同組織中會分化為不同功能類型，例如在綠色組織中分化成負責進行光合作用的葉綠體(chloroplast)、在花瓣及果實中分化成類胡蘿蔔色素堆積的有色體(chromoplast)、以及在非綠色組織中分化成負責澱粉、蛋白質以及油脂等營養物合成及儲存的白色體(leucoplast)。為進行這些特定的功能，不同類型的色質體需要有不同的蛋白質，因而會運送不同的蛋白質至色質體。

雖然色質體有自己的基因組，但是大部分的色質體的蛋白質是經由在細胞核基因編碼，在細胞質中合成具有N-端延伸稱之為訊息胜肽的前驅物(precursor)。訊息胜肽(transit peptide)是使前驅蛋白進入色質體充分且必要元素，例如從原始的前驅物選取訊息胜肽，再與運載蛋白(passenger protein)融合，便能使運載蛋白被運送至色質體。目前已有一些可高效率運送運載蛋白至葉綠體的訊息胜肽，例如RuBP羧化酶小亞單位前驅物(RuBP carboxylase small subunit precursor，prRBCS)的訊息胜肽，是目前最被廣泛使用於運送運載蛋白質至色質體的訊息胜肽。

大多數穀實類及根類糧食作物，例如是稻米、玉米以及木薯，係使用白色體合成及儲存作為世界上大部分人口的主要食物澱粉之來源。然而，儘管白色體在經濟上極具重要性，但是目前的研究中僅知道蛋白質如何運送至葉綠體，對於如何運送蛋白質至白色體幾無所知。不幸的是，白色體顯然具有不同的受體特性，喜歡輸入不同之蛋白質，而使得例如prRBCS訊息胜肽運送蛋白質至白色體的效率極差。例如目前已知在轉殖基因小麥胚乳中，prRBCS訊息胜肽無法運送運載蛋白綠色螢光蛋白質(green fluorescent protein，GFP)至白色體(Primavesi et al.,2008)；已知prRBCS訊息胜肽運送蛋白質至從碗豆中分離的葉綠體效率明顯優於從蓖麻種子(castor seed)中分離的白色體(Wan et al.,1996)；以及已知prRBCS訊息胜肽無法運送蛋白質至碗豆根的白色體(Yan et al.,2006)。然而，在這些研究中，沒有進行任何定量比較，所以訊息胜肽的運送效率無法直接進行比較。因此，無法確知prRBCS訊息胜肽運送蛋白至白色體的效率，以及尚未找到具有高效率運送蛋白至白色體的訊息胜肽。

在生物技術的應用中，prRBCS訊息胜肽已被廣泛的應用於運送基因工程蛋白質至色質體，例如黃金米、Roundup Ready®玉米以及抗汰克草(Dicamba)除草劑之黃豆。如上所述，很多研究提出prRBCS訊息胜肽運送蛋白質至白色體的功效極差，因此其非為在白色體中表現蛋白質應用中的最佳訊息胜肽。然而，目前尚未有進行訊息胜肽之間的定量比較之報導，如果進行定量比較則可找出比prRBCS訊息胜肽運送蛋白質至白色體之效率高的訊息胜肽，而這些新穎的訊息胜肽將可作為運送基因工程蛋白質至白色體的重要工具。

本發明係關於一種編碼一融合蛋白的重組DNA分子，包含：一編碼有一高效率訊息胜肽的第一DNA序列，以及一與該第一DNA序列操作性連接編碼有一運載蛋白(passenger protein)的第二DNA序列；一種DNA構築質體，包含該重組DNA分子與一啟動子操作性地連接；一種轉殖基因植物細胞包含該DNA構築質體或該重組DNA分子；以及一種高效率運送一運載蛋白質至色質體(特別是白色體)的方法，其係使用該重組DNA分子或該DNA構築質體。

白色體是一種用於合成及儲存澱粉、脂肪以及蛋白質的必要色質體。大多數穀類及根類糧食作物係利用白色體合成及儲存營養物質。如欲將白色體中的生物合成過程加以改良以更適合人類需求，是需要將基因工程蛋白質以高效率運送至白色體。很多研究已知因為葉綠體及白色體具有不同的蛋白質輸入特性，所以許多蛋白質運送至葉綠體良好但運送至白色體卻很差。然而，大部分目前可獲得的色質體訊息胜肽皆來自於具有高效率葉綠體運送功能的前驅蛋白，尚未獲得具有高效率白色體運送功能的訊息胜肽。為確認具有高效率白色體運送功能的訊息胜肽，本發明先於活體外(in vitro)經由大量的色質體前驅蛋白質進行快速、定量及精確性的比較，以篩選出最適合的白色體運送系統；再經由該白色體運送系統，本發明鑑定出九個具有高效率運送至色質體及葉綠體的前驅蛋白；該前驅蛋白訊息胜肽運送蛋白質至葉綠體的效率與目前被廣泛使用的prRBCS訊息胜肽一致或更佳；但該前驅蛋白訊息胜肽運送蛋白質至白色體的效率明顯優於prRBCS訊息胜肽二至八倍。因此，本發明之訊息胜肽可被廣泛地使用作為運送至包含白色體之各式色質體的訊息胜肽。

有鑑於此，本發明之一目的在於提供一種編碼一融合蛋白的重組DNA分子，其中該重組DNA分子包含：一編碼有一高效率訊息胜肽的第一DNA序列，以及一編碼有一運載蛋白(passenger protein)的第二DNA序列，其與該第一DNA序列操作性連接，其中該高效率訊息胜肽係選自於由葉綠體內膜運輸機組(translocon at the inner envelope membrane of chloroplasts)40kD前驅物(prTic40)、伴隨蛋白(chaperonin)10-2前驅物(prCpn10-2)、小纖維蛋白(Fibrillin)1B前驅物(prFibrillin)、ATP硫酸化酶(sulfurylase)1前驅物(prAPS1)、ATP硫酸化酶(sulfurylase)3前驅物(prAPS3)、5’-焦磷酸化還原酶(adenylylsulfate reductase)3前驅物(prAPR3)、基質的抗壞血酸鹽過氧化物酶(stromal ascorbate peroxidase)前驅物(prsAPX)、葉綠體內膜運輸機組40kD前驅物突變體(prTic40-E2A，a prTic40 variant)以及伴隨蛋白10-1前驅物突變體(prCpn10-1-△C7C37S，a chaperonin 10-1 variant)之訊息胜肽、任何該訊息胜肽的功能性片段以及等效之片段所組成之群組。

本發明之另一目的在於提供一種DNA構築質體包含如該重組DNA分子，其中該重組DNA分子與一啟動子操作性的連接。

本發明之又一目的在於提供一種轉殖基因植物細胞包含該 DNA構築質體。

本發明之再一目的在於提供一種高效率運送一運載蛋白質至色質體的方法，包含：(a)提供一編碼有一融合蛋白的重組DNA分子；(b)將該重組DNA分子操作性連接一啟動子以形成一DNA構築質體；以及(c)轉形該構築質體至一植物材料中以表現該融合蛋白；其中該高效率訊息胜肽係選自於由葉綠體內膜運輸機組(translocon at the inner envelope membrane of chloroplasts)40kD前驅物(prTic40)、伴隨蛋白(chaperonin)10-2前驅物(prCpn10-2)、小纖維蛋白(Fibrillin)1B前驅物(prFibrillin)、ATP硫酸化酶(sulfurylase)1前驅物(prAPS1)、ATP硫酸化酶(sulfurylase)3前驅物(prAPS3)、5’-焦磷酸化還原酶(adenylylsulfate reductase)3前驅物(prAPR3)、基質的抗壞血酸鹽過氧化物酶(stromal ascorbate peroxidase)前驅物(prsAPX)、葉綠體內膜運輸機組40kD前驅物突變體(prTic40-E2A，a prTic40 variant)以及伴隨蛋白10-1前驅物突變體(prCpn10-1-△C7C37S，a chaperonin 10-1 variant)之訊息胜肽、任何該訊息胜肽的功能性片段以及等效之片段所組成之群組。

在本發明之一實施例中，其中該第一DNA序列係選自於由SEQ ID NO：10至SEQ ID NO：18所組成之群組及其相同片段組成之群組。

在本發明之一實施例中，其中該高效率訊息胜肽能運送運載蛋白至葉綠體的量等同於或高於prRBCS訊息胜肽，以及能運送運載蛋白至白色體的量高於prRBCS訊息胜肽。

在本發明之一實施例中，其中該運載蛋白係為一具生物活性之蛋白質；在本發明之另一實施例中，其中該運載蛋白係為一被運送至色質體的蛋白質。

在本發明之一實施例中，其中該啟動子係在植物細胞中具有功能性。

在本發明之一實施例中，其中該植物材料係選自於由植物細胞、植物組織、植物組織培養、癒傷組織培養以及基因轉殖植物所組成之群組。

在本發明之一實施例中，其中該轉殖基因植物細胞係來自於一單子葉植物或一雙子葉植物。

因此，本發明之九個訊息胜肽，包含：葉綠體內膜運輸機組40kD前驅物(prTic40)(SEQ ID NO：10)、伴隨蛋白10-2前驅物(prCpn10-2)(SEQ ID NO：11)、小纖維蛋白1B前驅物(prFibrillin)(SEQ ID NO：12)、ATP硫酸化酶1前驅物(prAPS1)(SEQ ID NO：13)、ATP硫酸化酶3前驅物(prAPS3)(SEQ ID NO：14)、5’-焦磷酸化還原酶3前驅物(prAPR3)(SEQ ID NO：15)、基質的抗壞血酸鹽過氧化物酶前驅物(prsAPX)(SEQ ID NO：16)、葉綠體內膜運輸機組40kD前驅物突變體(prTic40-E2A，a prTic40 variant)(SEQ ID NO：17)以及伴隨蛋白10-1前驅物突變體(prCpn10-1-△C7C37S，a chaperonin 10-1 variant)(SEQ ID NO：18)之訊息胜肽，該九個訊息胜肽提供一個適合所有植物的高效率運送基因工程蛋白質至色質體之方法。

以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

第一圖A及B係表示無論是以等量蛋白質或等量色質體為基礎，prRBCS運送至白色體的效率皆遠小於其運送至葉綠體的效率，而prTic40運送至白色體的效率皆高於prRBCS。第一圖A表示，分別從在4至5天黑暗生長碗豆苗的根部取得白色體，從光照12小時生長7天的碗豆苗葉子取得葉綠體。分離的白色體(500μg或113.67μg蛋白質)及葉綠體(500μg蛋白質)在含有18μL活體外-轉譯的[³⁵S]Met-prTic40或[³⁵S]Met-prRBCS及3mM ATP，總體積為200μL的運送狀況下，反應25分鐘。兩種不同濃度的白色體(500μg及113.67μg蛋白質)分別為以相同蛋白質為基礎以及相同色質體數目為基礎與葉綠體進行比較。運送之後，分別經由10%或40% Percoll墊層(cushion)再分離出完整的白色體及葉綠體。運送樣本利用SDS-PAGE電泳圖分析、考馬斯亮藍(Coomassie blue)染色、乾燥後進行螢光顯影(fluorography)。每個運送反應中取4%的色質體(20μg或4.55μg的蛋白質) 以電泳分析。Tr係表示使用在每個運送反應中1%的活體外-轉譯的前驅蛋白。第一圖B，為計算在第一圖A實驗中運送成熟蛋白質的定量及運送效率之結果。數據以三個獨立的實驗mean±SD計算。Cpt係表示葉綠體；Leu係表示白色體；pr係表示前驅蛋白；m係表示運送進入色質體後的成熟蛋白質。

第二圖A及B係表示不同的前驅蛋白偏好不同的色質體。鐵氧還原蛋白前驅物(prFd)-蛋白質A作為極度偏好葉綠體的範例；丙酮酸脫氫酶E1α小亞單位前驅物(prPDH E1α)作為作為中度偏好葉綠體的範例；以及伴隨蛋白10-2前驅物(prCpn10-2)作為對白色體及葉綠體的運送效率皆良好的範例。在第二圖A中，分離的白色體(113.67μg蛋白質)及葉綠體(500μg蛋白質)在運送條件下，與活體外-轉譯的prFd-蛋白質A、prPDH E1α或prCpn10-2一起反應25分鐘。運送之後，分別經由10%或40% Percoll墊層再分離出完整的白色體及葉綠體。在每個運送反應中取4%的色質體，利用SDS-PAGE電泳圖分析、考馬斯亮藍(Coomassie blue)染色、乾燥後進行螢光顯影(fluorography)。Tr係表示使用在每個運送反應中1%(prFd-蛋白質A以及prPDH E1α)或1.2%(prCpn10-2)的活體外-轉譯的前驅蛋白。第二圖B，係為計算在第二圖A實驗中運送成熟蛋白質的定量及運送效率之結果。數據以三個獨立的實驗mean±SD計算。Cpt係表示葉綠體；Leu係表示白色體；pr係表示前驅蛋白；m係表示運送進入色質體後的成熟蛋白質。

第三圖A至C係表示九個高效率運送至白色體及葉綠體的前驅蛋白，且該九個前驅蛋白被運送至白色體的效率比prRBCS更高。在第三圖A中，分離的白色體(113.67μg蛋白質)及葉綠體(500μg蛋白質)在運送條件下，與活體外-轉譯的[³⁵S]前驅蛋白一起反應25分鐘。運送之後，分別經由10%或40% Percoll墊層再分離出完整的白色體及葉綠體。在每個運送反應中取4%的色質體，利用SDS-PAGE電泳圖分析、考馬斯亮藍(Coomassie blue)染色、乾燥後進行螢光顯影(fluorography)。Tr係表示使用在每個運送反應中1.2%的活體外-轉譯的前驅蛋白；pr係表示前驅蛋白；m係表示運送進入色質體後的成熟蛋白質。第三圖B及C，係為計算在第三圖A實驗中在葉綠體(第三圖B)及白色體(第三圖C)中運送進入色質體後其成熟蛋白質的定量及運送效率之結果。prRBCS的運送效率設定為1。數據以三個獨立的實驗mean±SD計算。Cpt係表示葉綠體；Leu係表示白色體。

第四圖A及B係表示本發明之九個高效率訊息胜肽比prRBCS訊息胜肽具有較高的運送運載蛋白質至白色體的能力。在第四圖A中，從菸草BY-2細胞分離的原生體(protoplast)進行綠色螢光蛋白質(green fluorescent protein，GFP)或訊息胜肽-GFP融合質體以及質體pBI221共同轉形(co-transformed)；質體pBI221會在細胞質中表現β-葡萄糖醛酸苷酶(β-Glucuronidase，GUS)，用以作為轉形以及蛋白質表現效率的內在控制組。轉形之後，該原生體在25℃黑暗下培養16小時後，利用SDS-PAGE電泳圖分析，利用抗體(標示於左側)進行免疫檢測。每個膠行注入30μg的蛋白質；每個膠行其樣品所含之質體DNA標記在上方。膠行1係表示在轉形作用時加入不具有質體DNA的控制組原生體；膠行2係表示原生體與pBI221以及未融合任何訊息胜肽的GFP載體(vector)進行轉形；膠行3至12係表示原生體與pBI221以及編碼GFP融合至prRBCS訊息胜肽(膠行3)、GFP融合至本發明之九個訊息胜肽中的一個(膠行4至12)。tp下標係表示訊息胜肽；實心圓係標記每個融合蛋白的前驅物以及括號係標記被運送至BY2細胞白色體中的GFP。第四圖B，係為計算在第四圖A實驗中表現的GUS以及被運送至白色體的GFP量之定量結果。在相同樣本中經由GUS產量標準化GFP產量計算出每個訊息胜肽的效率。RBCS_tp-GFP的GFP/GUS比率設定為1。數據以兩個獨立的實驗mean±SD計算。

本發明為鑑定具有高效率運送至白色體之訊息胜肽，首先優化於活體外(in vitro)白色體蛋白運送之系統，並建立一套系統可快速分析、可定量且精確的比較各種訊息胜肽在葉綠體及白色體中之運送效率。本發明鑑定出九個具有高效率運送至色質體的訊息胜肽，該訊息胜肽運送蛋白質至葉綠體的效率與目前被廣泛使用的RuBP羧化酶小亞單位前驅物(RuBP carboxylase small subunit precursor，prRBCS)訊息胜肽近乎一致；但其運送蛋白質至白色體的效率明顯優於prRBCS。因此，本發明進一步在活體內(in vivo)證實相較於prRBCS訊息胜肽融合運載蛋白(passenger protein)，本發明之高效率運送訊息胜肽可運送更多的運載蛋白至白色體。

定義

除非另外定義，本文中所使用的技術上或科學上的用語，皆為該領域具有通常知識者所理解在本發明所涉及的一般定義；在有衝突的情形下，將以目前文件(包括定義)為準。

在本文中適用於本發明之「啟動子(promoter)」包含所有可在植物體中驅動RNA表現的啟動子，包含為持續表現(constitutive)、誘導表現(inducible)或在特定組織表現(tissue-specific)的啟動子。其中舉例包含但不限於：玉米RS81啟動子、水稻泛素(ubiquitin)啟動子、水稻穀蛋白(glutelin，Gt1)啟動子、玉米RS324啟動子、玉米PR-1啟動子、玉米A3啟動子、玉米L3油體膜蛋白(oleosin)啟動子、水稻肌動蛋白(actin)啟動子、prRBCS啟動子、八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase，crt 1)啟動子、甘藷儲蛋白(sporamin)啟動子、薏苡醇溶蛋白(gamma-coixin)啟動子、玉米葉綠體醛縮酶(maize chloroplast aldolase)啟動子、胭脂氨酸合酶(nopaline synthase，NOS)啟動子、章魚堿合成酶(octopine synthase，OCS)啟動子、椰菜嵌紋病毒(Cauliflower mosaic virus，CaMV)19S以及35S啟動子、玄參花葉病毒(Figwort mosaic virus)35S啟動子、阿拉伯芥棉花蔗糖合成酶(Arabidopsis sucrose synthase)啟動子、R基因複合體啟動子、葉綠素a/b結合蛋白基因啟動子、具有強化子(enhancer)e35S序列CaMV35S啟動子、FMV35S啟動子、花生褪綠條紋病毒(Peanut chlorotic streak virus)FLt36啟動子、At.Act 7啟動子、At.ANT1啟動子、FMV.35S-EF1a啟動子、eIF4A10啟動子、AGRtu.nos啟動子以及水稻三碳糖磷酸異構酶(Triose phosphate isomerase)啟動子。

在本文中適用於本發明之「運載蛋白(passenger protein)」為任何本發明技術領域中通常技術者所欲在色質體中表現的蛋白質。舉例包含但不限於綠色螢光蛋白質(green fluorescent protein，GFP)、β-葡萄糖醛酸苷酶(β-Glucuronidase，GUS)、汰克草單氧化酶(dicamba monooxygenase，DMO)、烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(enolpyruvylshikimate-3-phosphate(EPSP)synthase)、嘉磷塞氧化酶(glyphosate oxidase，GOX)、八氫番茄紅素合成酶(phytoene synthase，psy)、具有R90H突變的阿拉伯芥橙蛋白(the R90H mutant of Arabidopsis ORANGE protein，AtOR(R90H))、β-胡蘿蔔素酮酶(β-carotene ketolase)以及八氫番茄紅素去氫酶(phytoene desaturase，PDS)。

本文中所述「單子葉植物」係表示任何一類具有在種子中具有單子葉的被子植物，其包含但不限於水稻、黑麥、小麥、大麥、高粱、玉米、燕麥、蘭花、百合、香蕉、芋頭及甘蔗。

本文中所述「雙子葉植物」係指非為單子葉植物的被子植物，其具有兩個子葉的種子，並且包含但不限於阿拉伯芥(Arabidopsis)、菸草、馬鈴薯、紅薯、油菜、黃豆、豆莢、棉花、向日葵、白花菜、菊花、木薯和玫瑰。

本文所述「高效率」訊息胜肽係指一種訊息胜肽能運送運載蛋白至葉綠體的量等同於或高於prRBCS訊息胜肽能運送運載蛋白至葉綠體的量；以及一種訊息胜肽能運送運載蛋白至白色體的量高於prRBCS訊息胜肽能運送運載蛋白至白色體的量。用於比較運載蛋白運送至葉綠體及白色體之量的方法，係如本文所述最優化的方法，或任何能夠區分在至少兩種類型的細胞實驗中特定蛋白質累積在葉綠體及白色體中較高或較低的量之方法。

本文所述「構築質體(construct)」以及「載體(vector)」可以交互使用。

目前已知訊息胜肽具有跨物種的功能，例如：從碗豆中取得的prRBCS訊息胜肽可使用在黃金米(Golden Rice)；從碗豆取得的prRBCS訊息胜肽亦可使用在抗汰克草(Dicamba)除草劑之黃豆以及阿拉伯芥及菸草的研究中；從阿拉伯芥取得的prRBCS訊息胜肽可使用在抗草劑(Roundup Ready®)玉米(USDA，1996)；以及從玉米取得的蠟質(waxy)蛋白質可在馬鈴薯中具有良好的功能表現。在本發明中已從碗豆及阿拉伯芥鑑定出具高效率的訊息胜肽，且在碗豆、菸草及水稻中皆已完成初步測試，未來亦將在阿拉伯芥進行測試。可預期本發明之高效率運送至色質體的訊息胜肽可提供高效率運送蛋白質至所有單子葉及雙子葉植物的色質體中，特別是白色體，例如：在塊莖(tuber)、水稻的胚乳及根、大麥、小麥、玉米、木薯、馬鈴薯及黃豆的白色體中；以及所有花的白色花瓣之白色體中。此外，因為含有該訊息胜肽的前驅物亦有高效率運送至葉綠體的功能，該運送胜肽亦可預期具有高效率運送蛋白質至葉綠體的能力。

實施例1 分離色質體、蛋白質濃度分析以及色質體計數

本發明取得生長在20℃蛭石上的碗豆苗(品種Pisum sativum)，依據先前文獻(Chu and Li,2015)所述之方法從4至5天黑暗生長碗豆苗的根部取得白色體；依據(Perry et al.,1991)所述之方法從在光週期為12小時，光強度約150μmol m^-2 s^-1狀況下，生長7天的碗豆苗葉子取得葉綠體，並另外將2mM抗壞血酸(ascorbic acid)、0.1mM二硫蘇糖醇(dithiothreitol)及1.2mM穀胱甘肽(glutathione)加入研磨緩衝液中進行均質化之步驟。已分離的葉綠體調整為每毫升具有1mg葉綠素之濃度。

實施例2 優化分離具有運送能力白色體的步驟

為建立可定量化的白色體運送系統，本發明先優化分離白色體條件之步驟。本發明在均質緩衝液中加入乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)及牛血清白蛋白(BSA)的濃度並加入還原劑至該緩衝液中。經過該修飾後，可增加前驅蛋白運送至分離之白色體的效率(Chu and Li,2015)。

實施例3構築質體以及用於活體外運送至分離的色質體的前驅物之轉譯

先前技術(Teng et al.,2012)已描述編碼prRBCS、葉綠體內膜運輸機組(Translocon at the inner envelope membrane of chloroplasts)40kD前驅物(prTic40)、鐵氧還原蛋白(ferredoxin)前驅物(prFd)-蛋白質A、丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase)E1α小亞單位前驅物(prPDH E1α)以及伴隨蛋白(chaperonin)10-2前驅物(prCpn10-2)的質體。從RIKEN生物資源中心(http：//en.brc.riken.jp)獲得ATP硫酸化酶(sulfurylase)1前驅物(prAPS1，編碼AT3G22890)cDNA選殖編號pda02149以及5’-焦磷酸化還原酶(adenylylsulfate reductase)3前驅物(prAPR3，編碼AT4G21990)cDNA選殖編號pda04912。利用阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana Columbia ecotype)的cDNA作為模板，以表一所述之正向及反向引子對，分別擴增小纖維蛋白 (Fibrillin)1B前驅物(prFibrillin，編碼AT4G22240)、ATP硫酸化酶(sulfurylase)3前驅物(prAPS3，編碼AT4G14680)以及基質的抗壞血酸鹽過氧化物酶(stromal ascorbate peroxidase)前驅物(prsAPX)。將prFibrillin的PCR產物以HindIII以及PstI限制酶酵素切割並接入至pSP72的HindIII/PstI位置。prAPS3以及prsAPX的PCR產物分別以XhoI以及SalI限制酶酵素切割並接入至pSP72的XhoI/SalI位置。以定序確認prFibrillin、prAPS3以及prsAPX之質體序列，並將該質體分別命名為pSP72-prFibrillin、pSP72-prAPS3以及pSP72-prsAPX。因prFibrillin僅在訊息胜肽區域中有兩個甲硫胺酸(Methionine，Met)，故利用QuikChange II定位突變試劑套組(Site-Directed Mutagenesis Kit)(安捷倫科技公司，美國)以及prFibrillin-2M-F正向引子以及prFibrillin-2M-R反向引子(表一)將該序列編碼額外加入兩個Met至cDNA的3’端終止密碼前；以定序確認該質體序列，並命名為pSP72-prFibrillin-2M，利用該質體進行後續分析。在pBS質體中prTic40的編碼區域以XhoI以及PstI限制酶酵素切割並接入至pSP72的XhoI/PstI位置以產生pSP72-Tic40質體。利用QuikChange II定位突變試劑套組以及pSP72-Tic40-E2A-F正向引子以及pSP72-Tic40-E2A-R反向引子(表一)，將E2A突變引入pSP72-Tic40質體；以定序確認該質體序列，並命名為pSP72-Tic40-E2A，利用該質體進行後續分析。利用先前技術中(Teng et al.,2012)用到的prCpn10-1質體，利用QuikChange II定位突變試劑套組以及Cpn10-1-△C7-F正向引子以及Cpn10-1-△C7-R反向引子(表一)先產生pSP72-Cpn10-1-△C7質體；接著再利用Cpn10-1-C37S-F正向引子以及Cpn10-1-C37S-R反向引子將pSP72-Cpn10-1-△C7質體進行定位突變，產生prCpn10-1-△C7C37S質體，以定序確認該質體序列後，命名為pSP72-Cpn10-1-△C7C37S。同時，本發明利用T7啟動子的控制組活體外(in vitro)表現prAPS1以及prAPR3；利用SP6啟動子的控制組活體外(in vitro)表現prFibrillin、prAPS3、prsAPX、pSP72-Tic40-E2A以及prCpn10-1-△C7C37S。

[³⁵S]Met標記prPDH E1α係經由活體外(in vitro)轉錄產生RNA，接者利用兔網織紅細胞裂解物系統(Rabbit Reticulocyte Lysate system)(PROMEGA公司，美國)轉譯產生的蛋白質。其他前驅物則利用TNT 偶聯麥胚提取系統(TNT Coupled Wheat Germ Extract system)或TNT偶聯網織紅細胞裂解物系統(TNT Coupled Reticulocyte Lysate system)(PROMEGA公司，美國)合成。

實施例4 蛋白質運送至分離的色質體以及運送後分析

本發明在建立白色體分離條件之後，接著進行各種前驅蛋白運送至白色體或葉綠體效率之比較。當比較不同色質體運送效率時，以等量的蛋白質(Yan et al.,2006)或相同數目的色質體(Wan et al.,1996)為基礎。為確認色質體的數目，利用Multisizer 3庫爾特計數儀(貝克曼庫爾特公司，美國)計算葉綠體及白色體的數目。本發明使用從7天幼苗分離的葉綠體進行分析以減少白色體及葉綠體之間年齡之差距。白色體及葉綠體的平均大小分別估計分別為1.81±0.21μm和3.24±0.23μm。估算色質體數量之樣品同時進行蛋白質濃度分析，進而估算每個白色體及葉綠體的平均蛋白質含量分別為1.85±0.63以及8.13±1.42pg/色質體。本發明在後續實驗中以蛋白質含量作為色質體數目的估計值，例如，500μg的色質體蛋白質應分別代表2.71×10⁸個白色體及6.15×10⁷個葉綠體。為在相同蛋白質基礎上，進行葉綠體與白色體之間運送效率之比較，在含有3mM ATP的條件下，將18μL [³⁵S]Met標記的前驅物與等同於500μg的色質體蛋白質之分離的色質體(相當於2.71×10⁸個白色體或6.15×10⁷個葉綠體)一起反應，最後體積為200μL。為在相同色質體數目為基礎上，進行運送效率比較，則使用113.67μg的白色體蛋白質(相當於6.15×10⁷個白色體)取代500μg的白色體蛋白質進行分析。運送反應在室溫下進行25分鐘，再轉移至含有1mL預冷的運送緩衝液的新試管中終止反應。於4℃，以3,000g轉速離心3分鐘以沉澱色質體，並以200μL的運送緩衝液懸浮色質體。將1mL 10% Percoll^TM(v/v)分離液加至白色體懸浮液之底層，葉綠體懸浮液則加至1mL 40% Percoll^TM(v/v)墊層之上層，在4℃下，利用吊桶式轉頭(swinging bucket rotors)以2,900g轉速離心6分鐘，以分離出完整的色質體。利用運送緩衝液清洗色質體一次，再以少量體積的運送緩衝液懸浮色質體。利用BCA蛋白質分析套組(賽爾飛世爾有限公司，美國)測量色質體樣本的蛋白質濃度；利用 SDS-PAGE電泳圖分析樣本；利用FLA5000磷光顯影儀(phosphorimager)(富士全錄股份有限公司，日本)進行膠體亮帶(gel band)定量分析。

實施例5 prRBCS運送至白色體的運送效率較差而prTic40運送至白色體及葉綠體皆具有較高的運送效率

為提供prRBCS運送至葉綠體或色質體的比較，本發明以等量的蛋白質或相同數目的色質體為基礎進行運送比較。該結果顯示無論是以等量的蛋白質或相同數目的色質體為基礎進行比較，prRBCS運送至白色體的效率遠低於其運送至葉綠體的效率(第一圖A及B)。再者，本發明在先前收集的前驅物中進行篩選，其中prTic40顯示出最佳運送至分離的白色體之能力，因此將其與prRBCS進行比較。prTic40運送至葉綠體之效率與prRBCS近乎一致，但prTic40運送至白色體之效率遠優於prRBCS。

實施例6 具有高效率運送至白色體之訊息胜肽的確認

本發明進一步測試另三種前驅物，包含鐵氧還原蛋白(ferredoxin)前驅物(prFd)、丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase)E1α小亞單位前驅物(prPDH E1α)以及伴隨蛋白(chaperonin)10-2前驅物(prCpn10-2)，以確認不同的前驅物偏好不同的色質體特性。關於prFd，利用先前技術所述(Smith et al.,2004)的prFd-蛋白質A之構築質體，其包含鐵氧還原蛋白訊息胜肽融合葡萄球菌(Staphylococcal)蛋白質A。如第二圖A及B所示，prFd-蛋白質A可高效率地運送至葉綠體，但幾乎不會運送至白色體，與prRBCS的結果一致。雖然prPDH E1α亦可有效率的運送至葉綠體，但其運送至白色體的效率僅為葉綠體的一半；而prCpn10-2則皆可有效率的運送至葉綠體及白色體。

由於prTic40以及prCpn10-2在白色體具有高運送效率，本發明之發明人特別對於prTic40以及prCpn10-2前驅物之訊息胜肽感到興趣。因此，在本發明建立的白色體運送系統中，進一步進行超過60個來自於阿拉伯芥的色質體前驅蛋白質的選殖及測試。本發明發現另外5個在葉綠體及白色體兩者皆表現良好運送效率的前驅物(如第三圖A至C以及表二)。其中包含小纖維蛋白(Fibrillin)1B前驅物(prFibrillin)、ATP硫酸化酶 (sulfurylase)1前驅物(prAPS1)、ATP硫酸化酶(sulfurylase)3前驅物(prAPS3)、5’-焦磷酸化還原酶(adenylylsulfate reductase)3前驅物(prAPR3)以及基質的抗壞血酸鹽過氧化物酶(stromal ascorbate peroxidase)前驅物(prsAPX)。另外兩個為前驅物的突變體，葉綠體內膜運輸機組40kD前驅物突變體(prTic40-E2A)以及伴隨蛋白10-1前驅物突變體(prCpn10-1-△C7C37S)亦在葉綠體及白色體兩者皆表現良好運送效率(第三圖B及C，以及表2)。該九個前驅物運送至葉綠體的效率與prRBCS差不多(第三圖B)，但比prRBCS具有高於2至8倍的運送至白色體效率(第三圖C)。

實施例7 構築質體在活體內(in vivo)菸草BY-2懸浮細胞及水稻癒傷細胞

在活體內(in vivo)暫時性表現的質體之製備方法如下。利用加入XbaI切位的正向引子以及加入BamHI切位的反向引子，將prRBCS、prTic40、prCpn10-2、prFibrillin、prAPS1、prAPS3、prAPR3、prsAPX,prTic40-E2A以及prCpn10-1-△C7C37S的訊息胜肽的編碼區域及成熟蛋白編碼區域中的前一至三個胺基酸區域(對應於表二)，進行聚合酶鏈鎖反應(PCR)以擴增該片段。每一個PCR片段進行XbaI及BamHI限制酶切割並接入p326GFP的XbaI/BamHI位置(Lee et al.,2002)，將訊息胜肽編碼融合至綠色螢光蛋白質(green fluorescent protein，GFP)編碼的N端，產生可轉譯出訊息胜肽融合綠色螢光之蛋白質的質體。該序列經由定序確認，並分別命名為prRBCS_tp-GFP、prTic40_tp-GFP、prCpn10-2_tp-GFP、prFibrillin_tp-GFP、prAPS1_tp-GFP、prAPS3_tp-GFP、prAPR3_tp-GFP、prsAPX_tp-GFP、prTic40-E2A_tp-GFP以及prCpn10-1-△C7C37S_tp-GFP。將該訊息胜肽-GFP融合構築質體置於椰菜嵌紋病毒(Cauliflower mosaic virus，CaMV)35S啟動子及胭脂氨酸合酶(nopaline synthase，NOS)終結子的控制下。訊息胜肽-GFP融合構築質體與質體pBI221共同轉形(co-transformed)，質體pBI221包含CaMV35S啟動子驅動β-葡萄糖醛酸苷酶(β-Glucuronidase，GUS)基因以作為轉形及蛋白質表現效率的內部控制組。從菸草BY-2懸浮細胞分離的原生體(protoplast)經由以聚乙二醇為媒介之轉形系統進行轉形實驗，並經由免疫墨點法(immunoblotting)確認產生的GFP及GUS蛋白質的量。經由每個轉形樣品的GUS產量標準化GFP之產量，以計算出每個訊息胜肽的運送效率。由水稻胚所誘導產生的癒傷細胞，經由粒子轟擊進行轉形(particle bombardment)或以農桿菌作為媒介進行轉形(Agrobacterium-mediated transformation)。每個構築質體進行多次轉形實驗並計算每個訊息胜肽的平均運送效率，與prRBCS的平均運送效率進行比較。經由共焦顯微鏡確認表現蛋白質位於細胞中的位置。

實施例8 經由在活體內(in vivo)融合蛋白的表現顯示出訊息胜肽的運送效率

本發明進一步將上述來自於九個高效率運送前驅物的訊息胜肽融合至GFP，並在活體內(in vivo)測試該九個融合蛋白運送至白色體的效率。本發明利用菸草BY-2懸浮細胞及水稻癒傷組織，進行活體內細胞中的暫時性表現之試驗，這兩種細胞分別被廣泛地使用作為雙子葉植物以及單子葉植物含有白色體組織的代表模組系統。兩種系統易於轉形且可作為評估活體內(in vivo)融合蛋白運送至白色體之效率的快速、可靠的工具。該結果顯示於第四圖A及B，當GFP融合至本發明之九個訊息胜肽中的其中八個時，GFP運送至白色體的量遠高於prRBCS的訊息胜肽融合之GFP。而另一個訊息胜肽的運送效率與prRBCS的訊息胜肽近乎一致。

實施例9 構築質體以及在阿拉伯芥轉殖植物中的蛋白質表現

本發明將來自於p326GFP(Lee et al.,2002)的GFP編碼之DNA片段利用加入BamHI切位的正向引子以及加入XbaI切位的反向引子進行聚合酶鏈鎖反應(PCR)以擴增該片段。將該片段進行BamHI以及XbaI限制酶酵素切割並接入pSP72的BamHI/XbaI位置。該序列經由定序確認，並命名為pSP72-GFP。利用加入SacI切位的正向引子以及加入BamHI切位的反向引子對，將prRBCS、prTic40、prCpn10-2、prFibrillin、prAPS3、prAPR3、prsAPX,prTic40-E2A以及prCpn10-1-△C7C37S的訊息胜肽的編碼區域及成熟蛋白編碼區域中的前一至三個胺基酸區域(表二)，進行聚合酶鏈鎖反應(PCR)以擴增該片段。每個片段進行SacI以及BamHI限制酶酵素切割並接入pSP72-GFP的SacI/BamHI位置以產生訊息胜肽-GFP融合構築質體。利用加入KpnI切位的正向引子以及加入BamHI切位的反向引子對，將prAPS1的訊息胜肽的編碼區域及成熟蛋白編碼區域中的前三個胺基酸區域(表二)，進行聚合酶鏈鎖反應(PCR)以擴增該片段。該片段進行KpnI以及BamHI限制酶酵素切割並接入pSP72-GFP的KpnI/BamHI位置。所有序列經由定序確認。編碼有訊息胜肽-GFP的DNA片段分別以SacI以及BamHI限制酶酵素切割(用於為prRBCS_tp-GFP、prTic40_tp-GFP、prCpn10-2_tp-GFP、prFibrillin_tp-GFP、prAPS3_tp-GFP、prAPR3_tp-GFP、prsAPX_tp-GFP、prTic40-E2A_tp-GFP以及prCpn10-1-△C7C37S_tp-GFP)，並分別接入至雙元載體(binary vector)pCHF1的SacI/PstI位置(Hajdukiewicz et al.,1994)；或者以KpnI以及PstI限制酶酵素切割prAPS1_tp-GFP DNA片段，並接入至雙元載體(binary vector)pCHF1的KpnI/PstI位置(Hajdukiewicz et al.,1994)。該訊息胜肽-GFP融合構築質體置於CaMV35S啟動子及RBCS終結子的控制下。將產生的質體轉形至根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101。阿拉伯芥(Columbia ecotype)經由噴霧法(floral spray)進行轉形實驗(Chung et al.,2000)。具有轉入的訊息胜肽-GFP融合轉殖基因的轉殖植物可在含有100μg/mL G418的MS培養基確認。選取多株獨立的含有訊息胜肽-GFP融合基因的轉殖植物，經由RT-PCR以及免疫墨點法(immunoblotting)檢測GFP的RNA以及蛋白質的表現並加以定量。經由共焦顯微鏡確認GFP存在於根部細胞的白色體中。GFP的大小亦應經由免疫墨點法確認成熟-GFP大小，確認GFP運送至色質體且已去除訊息胜肽。將GFP之RNA表現量標準化後，可計算在每個轉殖植物中每個訊息胜肽運送GFP至根部白色體的效率。每個訊息胜肽的平均效率將與prRBCS訊息胜肽進行比較。每個訊息胜肽運送GFP至葉子葉綠體的效率亦與prRBCS訊息胜肽進行比較。本發明預測每個高效率運送訊息胜肽將GFP運送至葉綠體之效率，將與prRBCS訊息胜肽的效率相同或更高；本發明更進一步預測每個高效率運送訊息胜肽，將GFP運送至白色體的效率將比prRBCS訊息胜肽更高。

本發明提供九個具有非常高效率運送至葉綠體及白色體的訊息胜肽群組，其包含：葉綠體內膜運輸機組40kD前驅物(prTic40)、伴隨蛋白10-2前驅物(prCpn10-2)、小纖維蛋白1B前驅物(prFibrillin)、ATP硫酸化酶1前驅物(prAPS1)、ATP硫酸化酶3前驅物(prAPS3)、5’-焦磷酸化還原酶3前驅物(prAPR3)、基質的抗壞血酸鹽過氧化物酶前驅物(prsAPX)、葉綠體內膜運輸機組40kD前驅物突變體(prTic40突變體)以及伴隨蛋白10-1前驅物突變體(chaperonin 10-1 variant)之訊息胜肽。本發明之九個訊息胜肽相較於prRBCS訊息胜肽皆具有相近的運送至葉綠體效率，以及較高的運送至白色體效率。本發明測試超過60個前驅物，而本發明之九個前驅物之訊息胜肽先前尚未在白色體運送實驗中被測試。而prRBCS之訊息胜肽目前被廣泛地使用於運送基因工程蛋白質至色質體，舉例包含著名的黃金米、Roundup Ready®玉米以及抗汰克草(Dicamba)除草劑之黃豆。在黃金米的範例中，舉例而言，使用prRBCS之訊息胜肽來運送細菌的胡蘿蔔素脫氫酶至水稻的白色體。本發明已藉由定量分析證實運送蛋白質至白色體，使用本發明之九個運送訊息胜肽比prRBCS訊息胜肽具有較高的效率。本發明技術領域中熟悉技藝人士可使用本發明之訊息胜肽中的一個，在水稻中生產更高的維生素A原(provitamin A)；下一步可測試在轉殖植物中，本發明之九個訊息胜肽哪一個可提供最高的運送至色質體的效率。

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Claims

一種編碼一融合蛋白的重組DNA分子，其中該重組DNA分子包含：一編碼有一高效率訊息胜肽的第一DNA序列，以及一編碼有一運載蛋白(passenger protein)的第二DNA序列，其與該第一DNA序列操作性連接，其中該高效率訊息胜肽具有SEQ ID NO：18的前40個胺基酸的胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項所述之重組DNA分子，其中該運載蛋白係一被運送至色質體的蛋白質。
一種DNA構築質體，包含如申請專利範圍第1項所述之重組DNA分子，其中該重組DNA分子與一啟動子操作性的連接。
如申請專利範圍第3項所述之DNA構築質體，其中該啟動子係在一植物細胞中具有功能性。
一種轉殖基因植物細胞，包含如申請專利範圍第3項所述之DNA構築質體。
如申請專利範圍第5項所述之轉殖基因植物細胞，其中該轉殖基因植物細胞係來自於一單子葉植物或一雙子葉植物。
一種高效率運送一運載蛋白至色質體的方法，包含：(a)提供一編碼有一融合蛋白的重組DNA分子；(b)將該重組DNA分子操作性連接一啟動子以形成一DNA構築質體；以及(c)轉形該構築質體至一植物材料中以表現該融合蛋白；其中該重組DNA分子包含一編碼有一高效率訊息胜肽的第一DNA序列，以及一與該第一DNA序列操作性連接編碼有一運載蛋白(passenger protein)的第二DNA序列，其中該高效率訊息胜肽具有SEQ ID NO：18的前40個胺基酸的胺基酸序列。
如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該運載蛋白係一被運送至色質體的蛋白質。
如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該啟動子係在一植物細胞中具有功能性。
如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該植物材料係選自於由植物細胞、植物組織、植物組織培養、癒傷組織培養以及基因轉殖植物所組成之群組。
如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該植物材料係來自於一單子葉植物或一雙子葉植物。