BR112021015872A2

BR112021015872A2 - Método não terapêutico para a modulação dirigida da expressão genética, e, naringina, naringenina ou suas misturas

Info

Publication number: BR112021015872A2
Application number: BR112021015872-3A
Authority: BR
Inventors: Francisco Javier Crespo Montero; Montserrat Paniagua Jiménez; Anna Arís Giralt; Maria Devant Guille
Original assignee: HealthTech Bio Actives, S.L.U.
Priority date: 2019-02-21
Filing date: 2020-02-20
Publication date: 2021-10-05
Also published as: CA3129925A1; EP3927177B1; WO2020169733A8; TW202045156A; MX2021009994A; ES2975437T3; AU2020225027A1; EP3927177A1; AR118150A1; CN113453560A; US20220133764A1; KR20210129053A; JP2022522117A; WO2020169733A1; EP3698642A1

Abstract

método não terapêutico para a modulação dirigida daexpressão genética, e, naringina, naringenina ou suas misturas. a presente invenção se refere à utilização de naringina, sua forma aglicona naringenina ou suas misturas na modulação da expressão de alguns receptores de genes específicos em ruminantes e/ou porcos que têm impacto positivo no comportamento de alimentação, padrões de ingestão e comportamento animal.

Description

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MÉTODO NÃO TERAPÊUTICO PARA A MODULAÇÃO DIRIGIDA DA EXPRESSÃO GENÉTICA, E, NARINGINA, NARINGENINA OU SUAS

MISTURAS Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Europeia 19382127.9 depositado em 21 de fevereiro, 2019.

DOMÍNIO TÉCNICO

[001] A presente invenção se refere à utilização de naringina, sua forma aglicona naringenina ou suas misturas na modulação da expressão de alguns receptores de genes específicos em ruminantes e/ou porcos que têm impacto positivo no comportamento de alimentação, padrões de ingestão e comportamento animal.

TÉCNICA ANTERIOR

[002] Fitoquímicos são substâncias químicas presentes em legumes e frutos comestíveis. Desempenham funções importantes em plantas, atuando como moléculas protetoras contra agentes nocivos (insetos, bactérias…) ou situações estressantes (UV, temperatura, falta de água…). Por outro lado, os fitoquímicos mostraram ter atividades biológicas e efeitos saudáveis em humanos e animais.

[003] Flavonoides são polifenóis que foram profundamente estudados, e frutos Citrus são considerados a fonte principal de flavonoides, contendo uma gama larga destes fitoquímicos. Alguns destes compostos têm propriedades anti-inflamatórias, antioxidantes e antimicrobianas. Devido às suas capacidades interessantes, flavonoides de diferentes fontes estão sendo estudados para diferentes aplicações na produção animal. Bioflavex® CA (Interquim, S.A., Espanha) é um extrato de laranja amarga (Citrus aurantium) cujo principal flavonoide é a naringina. Naringina é uma flavanona glicosilada classificada no tipo neo-hesperidosídeo, com uma neo-hesperidose (ramnosil-α-1,2-glicose) ligada à sua estrutura básica como uma flavanona. Foi mostrado que outros extratos contendo naringina têm efeitos benéficos na

2 / 52 regulação do pH do rúmen em gado bovino para engorda, bem como na redução da produção de metano in vitro por bezerros alimentados com dietas altamente concentradas. As propriedades da naringina podem afetar a microflora do rúmen, aumentando a concentração de bactérias que consomem ácido láctico, tais como Megasphaera elsdenii, originando um pH ruminal mais elevado e uma diminuição de comunidades de Archaea metanogênicas (pedido PCT número WO2013156574). A composição de ácidos graxos voláteis (VFA) no rúmen também foi modificada, aumentando a proporção molar de ácido propiônico. Uma vez que o ácido propiônico é um regulador importante da ingestão de alimento em ruminantes alimentados com dietas ricas em amido, afetando a saciedade e a fome, a suplementação de flavonoides pode afetar o padrão de alimentação de touros alimentados com dietas altamente concentradas. Além disso, esta suplementação pode reduzir a produção de metano e, juntamente com as flutuações reduzidas do pH ruminal, pode aumentar a eficiência da utilização de nutrientes em bezerros.

[004] No entanto, os mecanismos pelos quais flavonoides de citrinos podem modular o comportamento de alimentação e animal são desconhecidos. Naringina é o flavonoide responsável pelo sabor amargo típico de alguns citrinos, de modo que outro mecanismo possível pode estar relacionado com o sabor amargo, um dos cinco sabores básicos (doce, salgado, amargo, ácido e umami) apercebidos por humanos e animais. Estudos recentes demonstraram que receptores de sabor, incluindo receptores de sabor amargo (TAS2R), são expressos no trato gastrointestinal, incluindo de ruminantes e suínos. Assim, receptores de sabor amargo podem modular o padrão de alimentação de animais, reduzindo tamanhos grandes de refeições, melhorando parâmetros de saúde do epitélio digestivo e, como resultado, intensificando o bem-estar animal. A nutrição do trato gastrointestinal pode ter impacto no comportamento animal, modulando comportamentos sexuais e agressivos bem como comportamentos orais não nutritivos, uma vez que há

3 / 52 uma ligação entre o trato digestivo e o sistema nervoso central, também conhecida como eixo intestino-cérebro, no qual a microbiota digestiva é um ator-chave.

[005] Até à data foram propostas no estado da técnica várias soluções para melhorar o comportamento e, consequentemente, bem-estar em animais. No entanto, ainda é difícil obter substâncias naturais que possuam efeitos de longa duração nos animais uma vez que os animais aparentam ficar habituados a elas e, consequentemente, os seus efeitos positivos desaparecem ao longo do tempo.

[006] Portanto, são necessários na técnica novos métodos que consigam proporcionar modulação dirigida da expressão genética de alguns receptores de genes específicos envolvidos no eixo intestino-cérebro, nomeadamente receptores de sabor amargo e receptores de imunidade, que têm um impacto positivo no comportamento de alimentação, microflora intestinal, resposta inflamatória e comportamento animal.

[007] Além disso, um objetivo da invenção é proporcionar composições de rações para animais alternativas compreendendo compostos de origem natural e cuja utilização seja segura na criação de gado e eficaz para melhorar o comportamento de alimentação e o seu impacto em perturbações digestivas, no comportamento animal e, consequentemente, no bem-estar de animais.

[008] As questões acima foram abordadas na presente invenção e suas modalidades específicas.

DESCRIÇÃO BREVE DAS FIGURAS

[009] A Figura 1 representa interações não agonistas de touros alimentados com dietas altamente concentradas com ou sem suplementação com Bioflavex® CA.

[0010] A Figura 2 representa interações agonistas de touros alimentados com dietas altamente concentradas com ou sem suplementação

4 / 52 com Bioflavex® CA.

[0011] A Figura 3 representa interações sexuais de touros alimentados com dietas altamente concentradas com ou sem suplementação com Bioflavex® CA.

[0012] A Figura 4 representa a razão da expressão relativa de genes em rúmen de touros Holstein alimentados com dietas altamente concentradas suplementadas ou não com Bioflavex CA após 168 dias de tratamento.

[0013] A Figura 5 representa a razão da expressão genética relativa de TAS2R no jejuno de leitões após 7 dias alimentados com duas dietas que correspondem a T1: dieta basal e T2: T1 + extrato de laranja amarga (300 g/Tm).

[0014] A Figura 6 representa a razão da expressão relativa de genes no duodeno de touros Holstein alimentados com dietas altamente concentradas suplementadas ou não com Bioflavex CA após 168 dias de tratamento.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0015] Em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a um método não terapêutico para a modulação dirigida da expressão genética de pelo menos um receptor de sabor amargo e/ou pelo menos um receptor do eixo intestino-cérebro, em ruminantes e/ou porcos, compreendendo administrar naringina, naringenina ou suas misturas.

[0016] Em um segundo aspecto, a presente invenção se refere a naringina, naringenina ou suas misturas para utilização na modulação da expressão genética de pelo menos um gene relacionado com o sistema imune em ruminantes e/ou porcos.

DECRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0017] A presente invenção se refere à utilização de naringina, sua forma aglicona naringenina ou suas misturas na modulação da expressão de alguns receptores de genes específicos em ruminantes e/ou porcos que têm

5 / 52 impacto positivo no comportamento de alimentação, padrões de ingestão e comportamento animal.

[0018] Em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a um método não terapêutico para a modulação dirigida da expressão genética de pelo menos um receptor de sabor amargo e/ou pelo menos um receptor do eixo intestino-cérebro, em ruminantes e/ou porcos, compreendendo administrar naringina, naringenina ou suas misturas.

[0019] O termo “modulação dirigida da expressão genética”, como usado aqui, pretende incluir uma redução da expressão genética bem como uma amplificação da referida expressão genética.

[0020] Os autores da presente invenção descobriram agora que naringina, naringenina ou suas misturas administradas a ruminantes e/ou porcos modificam significativamente a expressão de alguns genes do epitélio do rúmen, no caso de ruminantes, ou intestino, no caso de porcos, envolvidos na percepção de sabor, inflamação e mecanismos de linhas cruzadas intestino- cérebro. Este efeito explica as diferenças observadas no padrão de alimentação e comportamento animal em ruminantes e/ou porcos.

[0021] Além disso, também foi surpreendentemente descoberto que ruminantes suplementados com naringina, naringenina ou suas misturas modificaram o seu padrão de alimentação, reduzindo tamanhos grandes de refeições e gastando mais tempo a comer palha, e os parâmetros de saúde da parede do rúmen foram melhorados. Além disso, também foi observado que ruminantes suplementados com naringina, naringenina ou suas misturas reduziram o comportamento agonista e interações sexuais. Receptor de sabor amargo

[0022] Em uma modalidade da presente invenção, o receptor de sabor amargo é selecionado do grupo consistindo em TAS2R7, TAS2R16, TAS2R38 e TAS2R39.

[0023] Os receptores de sabor foram inicialmente descobertos em

6 / 52 papilas gustativas localizadas na língua e diferentes partes da cavidade oral. Recentemente, muitos estudos descrevem a presença de receptores de sabor para os sabores básicos (doce, amargo, umami, ácido e salgado) em todo o corpo, incluindo sistema respiratório e trato gastrointestinal. Este sistema gustativo periférico tem a função de saborear o conteúdo luminal do trato digestivo e regular a expressão de transportadores de nutrientes, captação de nutrientes e também a liberação de hormônios gastrointestinais e neurotransmissores envolvidos na regulação da função gastrointestinal, alimentação e saciedade.

[0024] Moléculas amargas desencadeiam a liberação de hormônios e peptídeos anorexigênicos, como colecistocinina (CCK), neuropeptídeo Y (NPY) e peptídeo YY (PYY). Tal resposta será lógica, uma vez que o sabor amargo tem sido muitas vezes relacionado com a presença de toxinas e é considerado como tendo um valor negativo. Assim, a ativação de uma resposta anorexigênica no trato digestivo será uma resposta adaptativa a este sabor. O comportamento de alimentação e animal (social e sexual) podem estar relacionados. Foi descrito que algumas estratégias nutricionais centradas no aumento do tempo dedicado a comer reduziram o comportamento agressivo e anormal em animais.

[0025] Os autores da presente invenção descobriram que touros suplementados com naringina, naringenina ou suas misturas dedicaram mais tempo a comer concentrado ou ruminar durante o procedimento de observação visual. Ver, por exemplo, comportamento animal revelado no Exemplo 1 (Tabelas 7 e 8). Assim, animais que dedicam mais tempo a eventos de alimentação tiveram menos tempo para exibir outros comportamentos, como comportamento agressivo e interações sexuais. Aqui, receptores de sabor amargo no trato digestivo desempenham um papel importante na modulação do comportamento de alimentação e, em consequência, do comportamento animal. Além disso, surpreendentemente, a

7 / 52 suplementação com flavonoides modificou a expressão genética de todos os receptores de sabor amargo analisados na parede do rúmen (TAS2R7, TAS2R16, TAS2R38 e TAS2R39), como pode ser observado no Exemplo 1 (Tabela 11), bem como no epitélio do duodeno, como pode ser observado no Exemplo 3 (Figura 6). Apesar de a naringina ter um sabor amargo característico, é rapidamente desglicosilada por enzimas em naringenina, e a microflora do rúmen também é capaz de degradar naringina em naringenina.

Contrariamente à naringina, a naringenina atua como uma molécula importante de mascaramento do sabor amargo e esta propriedade é bem conhecida na indústria alimentar, maioritariamente pelo seu uso em bebidas (US 8,685,436). Foi descrito como algumas flavanonas atuam como antagonistas reais do receptor de sabor amargo humano TAS2R39, reduzindo a resposta do receptor possivelmente por um mecanismo ortostérico atuando em uma única bolsa de ligação do receptor de sabor amargo.

O Exemplo 1 e Exemplo 3 mostraram uma redução da expressão genética dos quatro receptores de sabor amargo analisados em touros suplementados com flavonoides de citrinos (TAS2R7, TAS2R16, TAS2R38 e TAS2R39). Estes resultados estão de acordo com a função da naringenina como molécula de mascaramento do sabor amargo, atuando como antagonista de diferentes receptores de sabor amargo ao mesmo tempo.

Esta redução da expressão genética de receptores de sabor amargo analisados pode estar relacionada com o tempo maior dedicado a comer observado em touros alimentados com Bioflavex®. Assim, a suplementação com flavonoides de citrinos em touros modula o padrão de alimentação, atuando como regulador de receptores de sabor amargo expressos na parede do rúmen e duodeno e, consequentemente, modificando a liberação de hormônios e peptídeos bioativos envolvidos em fome e saciedade.

Em consequência, flavonoides de citrinos podem atuar como moléculas de mascaramento do sabor amargo no rúmen, e touros suplementados com estes flavonoides dedicaram mais tempo a comer,

8 / 52 exibindo menos interações agonistas e sexuais.

[0026] No caso de suínos, quando flavonoides de citrinos foram adicionados à ração de leitões desmamados, a expressão genética de todos os receptores de sabor amargo analisados (TAS2R7, TAS2R16, TAS2R38 e TAS2R39) foi maior no jejuno em comparação com animais não suplementados, como pode ser observado no Exemplo 2, Figura 5.

[0027] O termo “flavonoides”, como usado aqui, se refere a uma classe de pigmentos vegetais solúveis em água que produzem pigmentação amarela ou vermelha/azul em pétalas. O termo “flavanonas” se refere a um tipo de flavonoides. As flavanonas são geralmente glicosiladas por um dissacarídeo na posição sete, originando “de flavanonas-glicosídeos”. Receptor do eixo intestino-cérebro

[0028] Em outra modalidade da presente invenção, o receptor do eixo intestino-cérebro é selecionado do grupo consistindo em FFAR2, FFAR3, PPYR1 e CCKBR.

[0029] O eixo intestino-cérebro foi proposto como uma rede de comunicação entre o sistema digestivo e o cérebro e pode afetar o comportamento em humanos e outros animais. Foi sugerido que o rúmen pode estar envolvido na linha cruzada entre o sistema digestivo e o cérebro em gado bovino para engorda, e a modificação do comportamento agressivo e sexual animal pode estar implicada nesta modulação do comportamento. Observaram que a dieta modificou a expressão de diferentes genes (FFAR3, PPYR1, ADRA2C, occluding e TNFα) em rúmen de gado bovino alimentado com dietas altamente concentradas que podem estar envolvidos no eixo intestino-cérebro. Estes autores sugeriram que o rúmen pode desempenhar um papel importante na linha cruzada entre sistema digestivo e cérebro e modificar o comportamento agressivo e sexual animal. Surpreendentemente, os resultados da presente invenção mostraram uma diminuição clara da expressão genética de receptores relacionados com neurotransmissores, como

9 / 52 CCKBR (atua como receptor de CCK e gastrina) e PPYR (atua como receptor de NPY e PYY ) em touros suplementados com flavonoides, como pode ser observado no Exemplo 1 (Tabela 11) e Exemplo 3 (Figura 6). Estes resultados estão de acordo com a redução da expressão dos receptores de sabor amargo analisados na parede do rúmen e duodeno destes animais, uma vez que estes receptores estão envolvidos na liberação destas moléculas anorexigênicas.

[0030] Em outra modalidade da presente invenção, a expressão genética de pelo menos um desses receptores é reduzida. Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a expressão genética de pelo menos um desses receptores é reduzida pelo menos 20%, preferencialmente é reduzida pelo menos 30%, mais preferencialmente é reduzida pelo menos 40%.

[0031] Como mostrado nos exemplos abaixo, os inventores descobriram surpreendentemente que a expressão de receptores de sabor amargo e receptores do eixo intestino-cérebro é surpreendentemente reduzida por administração a ruminantes de uma composição de ração de acordo com a presente invenção relativamente aos não alimentados com tal composição.

[0032] O termo “ruminante”, como usado aqui, se refere a qualquer mamífero artiodáctilo da subordem Ruminantia. Os referidos mamíferos fazem a segunda mastigação e têm um estômago com quatro compartimentos, um dos quais é o rúmen. O grupo inclui, entre outros, gado bovino, búfalos, ovelhas, veados, camelos, cabras e antílopes. Deve ser entendido que o termo ‘gado bovino' inclui vacas, vitelos e touros. Em outra modalidade da presente invenção, os ruminantes do primeiro aspecto são gado bovino, búfalos, ovelhas, veados, camelos, cabras ou antílopes. Em uma modalidade preferencial da presente invenção, os referidos ruminantes são gado bovino.

[0033] O termo “porco”, como usado aqui, se refere a qualquer mamífero da família Suidae. Os referidos suídeos são animais corpulentos com olhos pequenos e pelagem grossa, por vezes escassa. Todos têm focinhos que terminam em um disco de cartilagem arredondado usado para procurar

10 / 52 alimentos. Algumas espécies têm presas. Os suídeos são omnívoros e habitualmente gregários. O grupo inclui, entre outros, porcos, suínos selvagens ou domésticos, cerdos e javalis. Em outra modalidade da presente invenção, os porcos do primeiro aspecto são suínos selvagens ou domésticos, cerdos ou javalis.

[0034] Em outra modalidade da presente invenção, a quantidade de naringina, naringenina ou suas misturas é administrada como uma mistura com ração, em que a referida composição de ração compreende pelo menos 0,005% p/p de naringina ou a quantidade equimolar de naringenina ou de uma mistura de naringina e naringenina se ambas estiverem presentes.

[0035] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a referida composição de ração compreende pelo menos 0,01% p/p de naringina ou a quantidade equimolar de naringenina ou de uma mistura de naringina e naringenina se ambas estiverem presentes quando é administrada a ruminantes.

[0036] Em outra modalidade preferencial da presente invenção, a referida composição de ração compreende pelo menos 0,0075% p/p de naringina ou a quantidade equimolar de naringenina ou de uma mistura de naringina e naringenina se ambas estiverem presentes quando é administrada a porcos.

[0037] Naringina é um flavanona-7-O-glicosídeo entre a flavanona naringenina e o dissacarídeo neo-hesperidose. O flavonoide naringina ocorre naturalmente em citrinos, especialmente em toranja, na qual naringina é responsável pelo sabor amargo do fruto. Na produção comercial de suco de toranja, a enzima naringinase pode ser usada para remover o sabor amargo criado pela naringina. Em humanos, a naringina é metabolizada na aglicona naringenina (não amarga) por naringinase presente no intestino. Naringenase é um complexo multienzimático que possui centros ativos de α-L- ramnosidase e β-d-glucosidase. Tal acontece em dois passos, primeiramente a

11 / 52 naringina é hidrolisada, por atividade de α-L-ramnosidase, de naringinase em ramnose e prunina.

A prunina formada é então hidrolisada, por atividade de β- d-glucosidase, de naringinase em naringenina e glicose (ver Esquema 1). A naringenase é uma enzima que ocorre amplamente na natureza e é produzida por muitos microrganismos, maioritariamente fungos, leveduras e bactérias.

Enquanto glucosídeos podem ser clivados por lactase-florizina hidrolase intestinal ou β-glucosidase de células epiteliais do intestino delgado, não existe nenhuma α-L-ramnosidase ou rutinosidase humana, e a biodisponibilidade de flavonoides contendo ramnose depende totalmente da sua clivagem pela microbiota intestinal.

Em porcos, estas enzimas também podem ser encontradas no intestino.

No entanto, em ruminantes, se encontram no rúmen.

12 / 52 Esquema 1. Hidrólise de naringina por naringinase para originar naringenina.

[0038] A naringenina tem a estrutura de esqueleto de uma flavanona com três grupos hidróxi nos carbonos 4', 5, e 7. Pode estar presente na forma aglicol, naringenina, ou em sua forma glicosídica, naringina, que tem a adição do dissacarídeo neo-hesperidose ligado, via uma ligação glicosídica, ao carbono 7.

[0039] Esta quantidade equimolar de naringenina ou de uma mistura de naringina e naringenina é, por exemplo, a quantidade de naringenina equivalente em % p/p a naringina considerando o peso molecular. Por exemplo, 0,01% p/p de naringina serão equivalentes a 0,0053% p/p de

13 / 52 naringenina.

[0040] Em outra modalidade preferencial da presente invenção, a referida composição de ração é administrada na forma de farelada ou pélete.

[0041] O modo de alimentação não está restringido a nenhum em particular, e a composição de ração da presente invenção pode ser administrada como uma camada sobre a ração com composto, ou disponibilizada depois de a presente composição de ração ser misturada com a ração com composto.

[0042] A forma da composição de ração de acordo com a presente invenção não está restringida a nenhuma em particular e pode estar em qualquer forma de uma composição de ração convencional, como um pó ou farelada e um pélete. Além disso, a referida composição de ração pode ser produzida de acordo com o método geralmente empregue para produzir uma ração com composto e um suplemento de ração. A composição de acordo com a presente invenção pode conter outros ingredientes de rações tais como vitaminas, enzimas, sais minerais, cereais triturados, componentes contendo proteínas, componentes contendo carboidratos, sêmea e/ou farelo de trigo.

[0043] A composição de ração da presente invenção pode ser qualquer tipo de ração para animais, cujas possíveis composições são bem conhecidas do perito na técnica, planejadas de acordo com os requisitos de nutrição dos animais específicos e do período de idades específico. Por exemplo, uma ração para leitões contém tipicamente cereais, tais como milho, trigo, soja, cevada ou aveia; diferentes fontes de proteína, tais como farinha de peixe, farinha de soja ou plasma animal, por exemplo; aminoácidos, tais como metionina, treonina, valina, triptofano, arginina, histidina ou leucina; bem como vitaminas e minerais para cumprir os requisitos do crescimento de leitões (U.S. National Research Council, NRC, 2012).

[0044] Em outra modalidade da presente invenção, naringina,

14 / 52 naringenina ou suas misturas são administradas em uma dose diária de 0,001 até 0,01 g de naringina por kg de peso do corpo do animal ou a quantidade equimolar de naringenina ou de uma mistura de naringina e naringenina se ambas estiverem presentes. Em uma modalidade preferencial da presente invenção, naringina, naringenina ou suas misturas são administradas em uma dose diária de 0,002 até 0,003 g de naringina por kg de peso do corpo do animal ou a quantidade equimolar de naringenina ou de uma mistura de naringina e naringenina se ambas estiverem presentes.

[0045] Em outra modalidade da presente invenção, naringina, naringenina ou suas misturas estão na forma de um extrato vegetal natural.

[0046] Em outra modalidade preferencial da presente invenção, o referido extrato vegetal natural é extrato de laranja amarga. Em outra modalidade preferencial da presente invenção, o referido extrato de laranja amarga compreende adicionalmente pelo menos uma flavanona-glicosídeo selecionada do grupo consistindo em neo-hesperidina, isonaringina, poncirina, hesperidina e suas misturas.

[0047] Em outra modalidade preferencial da presente invenção, o referido extrato de laranja amarga é uma mistura compreendendo 20 até 35% p/p de naringina, 10% até 20% p/p de neo-hesperidina e 0,5% até 5% p/p de poncirina; preferencialmente, o referido extrato de laranja amarga compreende 21 até 30% p/p de naringina, 11 até 18% p/p de neo-hesperidina e 1 até 5% p/p de poncirina; mais preferencialmente, o referido extrato de laranja amarga compreende 25 até 27% p/p de naringina, 11 até 15% p/p de neo-hesperidina e 1 até 3% p/p de poncirina. Em um caso particular, o referido extrato vegetal natural está comercialmente disponível (Bioflavex®). Em consequência, de acordo com a presente invenção, a naringina, naringenina ou suas misturas da presente invenção podem ser obtidas de uma planta, mais particularmente, de uma planta de citrino. Todos os produtos de acordo com a presente invenção são produtos de origem natural e facilmente

15 / 52 obteníveis.

[0048] O termo “citrino”, como usado aqui, se refere a uma planta do gênero Citrus. Exemplos das referidas plantas de citrinos incluem Citrus maxima (Pomelo), Citrus medica (Cidra) Citrus reticulata (Mandarina), Citrus aurantium (Laranja amarga), Citrus latifolia (Lima-da-Pérsia), Citrus limon (Limão) Citrus paradisi (Toranja), Citrus sinensis (Laranja doce), Citrus trifoliata (Laranja Trifoliada), etc.

[0049] Métodos para o isolamento de flavanoides a partir de plantas são bem conhecidos no estado da técnica. Em um caso particular, o extrato de laranja amarga pode ser obtido de citrinos triturados (especialmente Citrus aurantium) por métodos habituais bem conhecidos do perito na técnica, tais como extração, filtração, concentração, precipitação, clarificação e secagem final. Processos de extração podem ser realizados em sistemas binários alcanol/água, em que o alcanol é selecionado de metanol, etanol, propanol e similares. Metanol é preferencialmente usado. Como exemplo ilustrativo não limitador, 50 g de laranja amarga seca são extraídos com 300 mL de metanol. A suspensão é centrifugada para separar o resíduo e o líquido-mãe é concentrado sob vácuo para um volume final de 50 mL. O líquido resultante é deixado repousar à temperatura ambiente durante cinco dias, é filtrado para separar o material insolúvel, concentrado, filtrado novamente através de um leito de terra diatomácea e seco por pulverização.

[0050] Em uma modalidade particular, a referida flavanona pode ser obtida do fruto de uma planta de citrino. Por exemplo, naringina é uma flavanona glicosilada obtida da casca de alguns citrinos, como toranja (Citrus paradise) e laranja amarga (Citrus aurantium). Também está presente na polpa do fruto e nas folhas, flores e sementes da planta. Métodos ilustrativos e não limitadores para o isolamento dos flavonoides de acordo com a presente invenção são, por exemplo, os descritos nos documentos US2421063A e US2421062A, onde é descrito um método para a recuperação de naringina de

16 / 52 material vegetal. A hesperidina também pode ser obtida de acordo com os métodos descritos nos documentos US2442110A, US2348215A e US2400693A. De igual modo, a neo-hesperidina pode ser obtida de acordo com o método descrito no documento US3375242A. US3375242A descreve um método para produzir neo-hesperidina no qual naringina reage com isovanilina para produzir neo-hesperidina-chalcona. Esta chalcona é então ciclizada para originar neo-hesperidina.

[0051] Adicionalmente, as flavononas da composição da presente invenção podem ser facilmente obtidas uma vez que estão comercialmente disponíveis. Por exemplo, como mostrado nos exemplos que acompanham a presente invenção, isonaringina, neoeritrocina e poncirina são adquiridas à INDOFINE Chemical Company, Inc (EUA). Além disso, como descrito acima, o referido extrato vegetal natural de acordo com a presente invenção está comercialmente disponível (Bioflavex®).

[0052] Em outra modalidade da presente invenção, o referido extrato de laranja amarga é administrado em uma dose diária de 0,005 g por kg de peso do corpo do animal até 0,02 g por kg de peso do corpo do animal; preferencialmente, o referido extrato de laranja amarga é administrado em uma dose diária de 0,01 g por kg de peso do corpo do animal.

[0053] Uma modalidade adicional da presente invenção compreende administrar naringina, naringenina ou suas misturas a um ruminante e/ou porcos durante pelo menos 5 dias. Uma modalidade preferencial da presente invenção compreende administrar naringina, naringenina ou suas misturas a porcos durante pelo menos 10 dias. Outra modalidade preferencial compreende administrar naringina, naringenina ou suas misturas a ruminantes durante pelo menos 15 dias. Genes relacionados com o sistema imune

[0054] Em um segundo aspecto, a presente invenção se refere a naringina, naringenina ou suas misturas para utilização na modulação da

17 / 52 expressão genética de pelo menos um gene relacionado com o sistema imune em ruminantes e/ou porcos.

[0055] O termo “modulação da expressão genética”, como usado aqui, pretende incluir uma redução da expressão genética bem como uma amplificação da referida expressão genética. Também pode ser entendido que tal modulação da expressão genética também pode originar uma modulação da produção de pelo menos um gene relacionado com o sistema imune em ruminantes e/ou porcos. Assim, uma redução da expressão genética de qualquer gene relacionado com o sistema imune irá originar uma redução da produção do referido gene e adicionalmente uma modulação de inflamação.

[0056] Além disso, os autores da presente invenção descobriram que a suplementação com flavonoides de citrinos reduziu claramente a expressão genética dos receptores relacionados com a inflamação na parede do rúmen dos touros. Foi sugerido que inflamação desempenha um papel importante no bem-estar e comportamento animais, possivelmente pela linha cruzada eixo intestino-cérebro. Inflamação pode estar envolvida em um decréscimo dos níveis de serotonina no soro devido ao aumento do uso do aminoácido triptofano para produzir quinurina. A serotonina é um neurotransmissor que desempenha um papel importante no eixo intestino-cérebro e foi associada a modulação do humor e uma redução de comportamentos agressivos. Adicionalmente, inibidores seletivos da recaptação de serotonina (que aumentam a serotonina extracelular) foram relacionados com redução da líbido e problemas sexuais em humanos. IL-25 é produzida por uma variedade de células, incluindo células imunes e não imunes (epiteliais e endoteliais) e pode potenciar inflamação alérgica. Defensina-β é um peptídeo antimicrobiano e tem efeitos moduladores em processos imunes inatos e adaptativos em mamíferos. Assim, o Exemplo 1 (ver a Tabela 11) e Exemplo 3 mostram que a suplementação com flavonoides de citrinos reduziu a expressão genética destas moléculas pró-inflamatórias, e tal pode conduzir a

18 / 52 uma redução da resposta inflamatória e inflamação na parede do rúmen e duodeno. Adicionalmente, a naringenina atua como antioxidante potente e o seu efeito anti-inflamatório está de acordo com a técnica anterior. Além disso, os resultados obtidos, listados na Tabela 7 e 8, mostram que interações agressivas e sexuais em touros suplementados com flavonoides de citrinos foram reduzidas, e dados da expressão genética no rúmen suportam a hipótese de a redução da inflamação do rúmen poder ser um ator-chave nesta resposta.

[0057] Em resumo, a regulação da ingestão de concentrado (tempo dedicado a comer) em conjunto com a inflamação e outros mecanismos de linha cruzada intestino-cérebro na parede do rúmen estão envolvidos na melhoria do comportamento animal e bem-estar de animais suplementados com flavonoides de citrinos.

[0058] O termo “bem-estar animal”, como usado aqui, inclui três elementos: O funcionamento biológico normal do animal (que, entre outras coisas, significa assegurar que o animal é saudável e está bem nutrido), o seu estado emocional (incluindo a ausência de emoções negativas, tais como dor e medo crônico) e a sua capacidade de exprimir certo comportamento normal. Não obstante, nem todos os comportamentos são igualmente importantes em termos de bem-estar animal. Do ponto de vista prático, a indicação mais clara de que um determinado comportamento é importante é se o animal exibe uma resposta de estresse ou exibe comportamento anormal quando impedido de o ter. O comportamento de preparação de ninhada pré-parto de uma porca ou o comportamento de procura de alimentos de porcos são exemplos de tal comportamento importante. Estes três princípios não se contradizem necessariamente; de fato, muitas vezes são complementares.

[0059] Em uma modalidade do segundo aspecto, o gene relacionado com o sistema imune é selecionado do grupo consistindo em IL-6, IL-8, IL- 10, IL-25 e β-defensina.

[0060] Em outra modalidade do segundo aspecto, a expressão

19 / 52 genética de pelo menos um desses receptores é reduzida. Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a expressão genética de pelo menos um desses receptores é reduzida pelo menos 20%, preferencialmente é reduzida pelo menos 30%, mais preferencialmente é reduzida pelo menos 40%.

[0061] Como mostrado nos exemplos abaixo, os inventores descobriram surpreendentemente que a expressão de genes relacionados com o sistema imune é significativamente reduzida por administração a ruminantes de uma composição de ração de acordo com a presente invenção relativamente aos não alimentados com tal composição.

[0062] Em outra modalidade do segundo aspecto, os referidos ruminantes são gado bovino, búfalos, ovelhas, veados, camelos, cabras ou antílopes. Em uma modalidade preferencial da presente invenção, os referidos ruminantes são gado bovino.

[0063] Em outra modalidade do segundo aspecto, os referidos porcos são suínos selvagens ou domésticos, cerdos ou javalis.

[0064] Em outra modalidade do segundo aspecto, o referido produto é administrado como uma mistura com ração, em que a referida composição de ração compreende pelo menos 0,005% p/p de naringina ou a quantidade equimolar de naringenina ou de uma mistura de naringina e naringenina se ambas estiverem presentes. O produto deve incluir naringina, naringenina ou suas misturas.

[0065] Em uma modalidade preferencial do segundo aspecto, a referida composição de ração compreende pelo menos 0,01% p/p de naringina ou a quantidade equimolar de naringenina ou de uma mistura de naringina e naringenina se ambas estiverem presentes quando é administrada a ruminantes.

[0066] Em outra modalidade preferencial do segundo aspecto, a referida composição de ração compreende pelo menos 0,0075% p/p de naringina ou a quantidade equimolar de naringenina ou de uma mistura de

20 / 52 naringina e naringenina se ambas estiverem presentes quando é administrada a porcos.

[0067] Em outra modalidade preferencial do segundo aspecto, a referida composição de ração é administrada na forma de farelada ou pélete.

[0068] Em outra modalidade do segundo aspecto, o produto é administrado em uma dose diária de 0,001 até 0,01 g de naringina por kg de peso do corpo do animal ou a quantidade equimolar de naringenina ou de uma mistura de naringina e naringenina se ambas estiverem presentes. Em uma modalidade preferencial do segundo aspecto, o produto é administrado em uma dose diária de 0,002 até 0,003 g de naringina por kg de peso do corpo do animal ou a quantidade equimolar de naringenina ou de uma mistura de naringina e naringenina se ambas estiverem presentes.

[0069] Em outra modalidade do segundo aspecto, o referido produto está na forma de um extrato vegetal natural. Em outra modalidade preferencial do segundo aspecto, o referido extrato vegetal natural é extrato de laranja amarga. Em outra modalidade preferencial, o referido extrato de laranja amarga compreende adicionalmente pelo menos uma flavanona- glicosídeo selecionada do grupo consistindo em neo-hesperidina, isonaringina, poncirina, hesperidina e suas misturas.

[0070] Em outra modalidade preferencial do segundo aspecto, o referido extrato de laranja amarga é uma mistura compreendendo 20 até 35% p/p de naringina, 10% até 20% p/p de neo-hesperidina e 0,5% até 5% p/p de poncirina; preferencialmente, o referido extrato de laranja amarga compreende 21 até 30% p/p de naringina, 11 até 18% p/p de neo-hesperidina e 1 até 5% p/p de poncirina; mais preferencialmente, o referido extrato de laranja amarga compreende 25 até 27% p/p de naringina, 11 até 15% p/p de neo-hesperidina e 1 até 3% p/p de poncirina.

[0071] Em outra modalidade do segundo aspecto, o referido extrato de laranja amarga é administrado em uma dose diária de 0,005 g por kg de

21 / 52 peso do corpo do animal até 0,02 g por kg de peso do corpo do animal; preferencialmente, o referido extrato de laranja amarga é administrado em uma dose diária de 0,01 g por kg de peso do corpo do animal.

[0072] Uma modalidade adicional do segundo aspecto compreende administrar o referido produto a um ruminante e/ou porcos durante pelo menos 5 dias. Uma modalidade preferencial do segundo aspecto compreende administrar o referido produto a porcos durante pelo menos 10 dias. Outra modalidade preferencial compreende administrar o referido produto a ruminantes durante pelo menos 15 dias.

[0073] Uma modalidade adicional do segundo aspecto se refere a naringina, naringenina ou suas misturas para utilização no tratamento ou prevenção de doenças que têm uma resposta inflamatória em ruminantes e/ou porcos.

[0074] As principais doenças neurológicas inflamatórias causadas por bactérias em ruminantes são: listeriose, leptomeningite e meningoencefalite supurativas, abcessos cerebrais e da medula espinhal, empiema basilar e neurotuberculose.

[0075] Outros aspectos e modalidades da presente invenção são descritos nas seguintes cláusulas abaixo: Cláusula 1.- Um método não terapêutico para a modulação dirigida da expressão genética de pelo menos um receptor de sabor amargo e/ou pelo menos um receptor do eixo intestino-cérebro, em ruminantes e/ou porcos, compreendendo administrar naringina, naringenina ou suas misturas.

[0076] Cláusula 2.- O método de acordo com a cláusula 1, em que o receptor de sabor amargo é selecionado do grupo consistindo em TAS2R7, TAS2R16, TAS2R38 e TAS2R39.

[0077] Cláusula 3.- O método de acordo com a cláusula 1, em que o receptor do eixo intestino-cérebro é selecionado do grupo consistindo em FFAR2, FFAR3, PPYR1 e CCKBR.

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[0078] Cláusula 4.- O método de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes, em que a expressão genética de pelo menos um de tais receptores é reduzida.

[0079] Cláusula 5.- O método de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes, em que a expressão genética de pelo menos um de tais receptores é reduzida pelo menos 20%.

[0080] Cláusula 6.- O método de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes, em que a expressão genética de pelo menos um de tais receptores é reduzida pelo menos 30%.

[0081] Cláusula 7.- O método de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes, em que a expressão genética de pelo menos um de tais receptores é reduzida pelo menos 40%.

[0082] Cláusula 8.- O método de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes, em que os referidos ruminantes são gado bovino, búfalos, ovelhas, veados, camelos, cabras ou antílopes.

[0083] Cláusula 9.- O método de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes, em que os referidos ruminantes são gado bovino.

[0084] Cláusula 10.- O método de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 até 7, em que os referidos porcos são suínos selvagens ou domésticos, cerdos ou javalis.

[0085] Cláusula 11.- O método de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes, em que a quantidade de naringina, naringenina ou suas misturas é administrada como uma mistura com ração, em que a referida composição de ração compreende pelo menos 0,005% p/p de naringina ou a quantidade equimolar de naringenina ou de uma mistura de naringina e naringenina se ambas estiverem presentes.

[0086] Cláusula 12.- O método de acordo com a cláusula precedente, em que a referida composição de ração compreende pelo menos 0,01% p/p de naringina ou a quantidade equimolar de naringenina ou de uma mistura de

23 / 52 naringina e naringenina se ambas estiverem presentes quando é administrada a ruminantes.

[0087] Cláusula 13.- O método de acordo com a cláusula 11, em que a referida composição de ração compreende pelo menos 0,0075% p/p de naringina ou a quantidade equimolar de naringenina ou de uma mistura de naringina e naringenina se ambas estiverem presentes quando é administrada a porcos.

[0088] Cláusula 14.- O método de acordo com qualquer uma das cláusulas 11 até 13, em que a referida composição de ração é administrada na forma de farelada ou pélete.

[0089] Cláusula 15.- O método de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes, em que naringina ou naringenina ou suas misturas são administradas em uma dose diária de 0,001 até 0,01 g de naringina por kg de peso do corpo do animal ou a quantidade equimolar de naringenina ou de uma mistura de naringina e naringenina se ambas estiverem presentes.

[0090] Cláusula 16.- O método de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes, em que naringina ou naringenina ou suas misturas são administradas em uma dose diária de 0,002 até 0,003 g de naringina por kg de peso do corpo do animal ou a quantidade equimolar de naringenina ou de uma mistura de naringina e naringenina se ambas estiverem presentes.

[0091] Cláusula 17.- O método de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes, em que naringina, naringenina ou suas misturas estão na forma de um extrato vegetal natural.

[0092] Cláusula 18.- O método de acordo com a cláusula precedente, em que o referido extrato vegetal natural é extrato de laranja amarga.

[0093] Cláusula 19.- O método de acordo com a cláusula precedente, em que o referido extrato de laranja amarga compreende adicionalmente pelo menos uma flavanona-glicosídeo selecionada do grupo consistindo em neo- hesperidina, isonaringina, poncirina, hesperidina e suas misturas.

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[0094] Cláusula 20.- O método de acordo com qualquer uma das cláusulas 18 até 19, em que o referido extrato de laranja amarga é uma mistura compreendendo 20 até 35% p/p de naringina, 10% até 20% p/p de neo-hesperidina e 0,5% até 5% p/p de poncirina.

[0095] Cláusula 21.- O método de acordo com qualquer uma das cláusulas 18 até 20, em que o referido extrato de laranja amarga compreende 21 até 30% p/p de naringina, 11 até 18% p/p de neo-hesperidina e 1 até 5% p/p de poncirina.

[0096] Cláusula 22.- O método de acordo com qualquer uma das cláusulas 18 até 21, em que o referido extrato de laranja amarga compreende 25 até 27% p/p de naringina, 11 até 15% p/p de neo-hesperidina e 1 até 3% p/p de poncirina.

[0097] Cláusula 23.- O método de acordo com qualquer uma das cláusulas 18 até 22, em que o referido extrato de laranja amarga é administrado em uma dose diária de 0,005 g por kg de peso do corpo do animal até 0,02 g por kg de peso do corpo do animal.

[0098] Cláusula 24.- O método de acordo com qualquer uma das cláusulas 18 até 23, em que o referido extrato de laranja amarga é administrado em uma dose diária de 0,01 g por kg de peso do corpo do animal.

[0099] Cláusula 25.- O método de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes, compreendendo administrar naringina, naringenina ou suas misturas a um ruminante e/ou porcos durante pelo menos 5 dias.

[00100] Cláusula 26.- O método de acordo com a cláusula precedente, compreendendo administrar naringina, naringenina ou suas misturas a porcos durante pelo menos 10 dias.

[00101] Cláusula 27.- O método de acordo com a cláusula 25, compreendendo administrar naringina, naringenina ou suas misturas a ruminantes durante pelo menos 15 dias.

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[00102] Cláusula 28.- Naringina, naringenina ou suas misturas para utilização na modulação da expressão genética de pelo menos um gene relacionado com o sistema imune em ruminantes e/ou porcos.

[00103] Cláusula 29.- O produto para utilização de acordo com a cláusula precedente, em que o gene relacionado com o sistema imune é selecionado do grupo consistindo em IL-6, IL-8, IL-10, IL-25 e β-defensina.

[00104] Cláusula 30.- O produto para utilização de acordo com qualquer uma das cláusulas 28 até 29, em que a expressão genética de pelo menos um de tais receptores é reduzida.

[00105] Cláusula 31.- O produto para utilização de acordo com qualquer uma das cláusulas 28 até 30, em que a expressão genética de pelo menos um de tais receptores é reduzida pelo menos 20%.

[00106] Cláusula 32.- O produto para utilização de acordo com qualquer uma das cláusulas 28 até 31, em que a expressão genética de pelo menos um de tais receptores é reduzida pelo menos 30%.

[00107] Cláusula 33.- O produto para utilização de acordo com qualquer uma das cláusulas 28 até 32, em que a expressão genética de pelo menos um de tais receptores é reduzida pelo menos 40%.

[00108] Cláusula 34.- O produto para utilização de acordo com qualquer uma das cláusulas 28 até 33, em que os referidos ruminantes são gado bovino, búfalos, ovelhas, veados, camelos, cabras ou antílopes.

[00109] Cláusula 35.- O produto para utilização de acordo com qualquer uma das cláusulas 28 até 34, em que os referidos ruminantes são gado bovino.

[00110] Cláusula 36.- O produto para utilização de acordo com qualquer uma das cláusulas 28 até 35, em que os referidos porcos são suínos selvagens ou domésticos, cerdos ou javalis.

[00111] Cláusula 37.- O produto para utilização de acordo com qualquer uma das cláusulas 28 até 36, em que o referido produto é

26 / 52 administrado como uma mistura com ração, em que a referida composição de ração compreende pelo menos 0,005% p/p de naringina ou a quantidade equimolar de naringenina ou de uma mistura de naringina e naringenina se ambas estiverem presentes.

[00112] Cláusula 38.- O produto para utilização de acordo com a cláusula precedente, em que a referida composição de ração compreende pelo menos 0,01% p/p de naringina ou a quantidade equimolar de naringenina ou de uma mistura de naringina e naringenina se ambas estiverem presentes quando é administrada a ruminantes.

[00113] Cláusula 39.- O produto para utilização de acordo com a cláusula 37, em que a referida composição de ração compreende pelo menos 0,0075% p/p de naringina ou a quantidade equimolar de naringenina ou de uma mistura de naringina e naringenina se ambas estiverem presentes quando é administrada a porcos.

[00114] Cláusula 40.- O produto para utilização de acordo com qualquer uma das cláusulas 37 até 39, em que a referida composição de ração é administrada na forma de farelada ou pélete.

[00115] Cláusula 41.- O produto para utilização de acordo com qualquer uma das cláusulas 28 até 40, em que o produto é administrado em uma dose diária de 0,001 até 0,01 g de naringina por kg de peso do corpo do animal ou a quantidade equimolar de naringenina ou de uma mistura de naringina e naringenina se ambas estiverem presentes.

[00116] Cláusula 42.- O produto para utilização de acordo com qualquer uma das cláusulas 28 até 41, em que o produto é administrado em uma dose diária de 0,002 até 0,003 g de naringina por kg de peso do corpo do animal ou a quantidade equimolar de naringenina ou de uma mistura de naringina e naringenina se ambas estiverem presentes.

[00117] Cláusula 43.- O produto para utilização de acordo com qualquer uma das cláusulas 28 até 42, em que o referido produto está na

27 / 52 forma de um extrato vegetal natural.

[00118] Cláusula 44.- O produto para utilização de acordo com a cláusula precedente, em que o referido extrato vegetal natural é extrato de laranja amarga.

[00119] Cláusula 45.- O produto para utilização de acordo com a cláusula precedente, em que o referido extrato de laranja amarga compreende adicionalmente pelo menos uma flavanona-glicosídeo selecionada do grupo consistindo em neo-hesperidina, isonaringina, poncirina, hesperidina e suas misturas.

[00120] Cláusula 46.- O produto para utilização de acordo com qualquer uma das cláusulas 44 até 45, em que o referido extrato de laranja amarga é uma mistura compreendendo 20 até 35% p/p de naringina, 10% até 20% p/p de neo-hesperidina e 0,5% até 5% p/p de poncirina.

[00121] Cláusula 47.- O produto para utilização de acordo com qualquer uma das cláusulas 44 até 46, em que o referido extrato de laranja amarga compreende 21 até 30% p/p de naringina, 11 até 18% p/p de neo- hesperidina e 1 até 5% p/p de poncirina.

[00122] Cláusula 48.- O produto para utilização de acordo com qualquer uma das cláusulas 44 até 47, em que o referido extrato de laranja amarga compreende 25 até 27% p/p de naringina, 11 até 15% p/p de neo- hesperidina e 1 até 3% p/p de poncirina.

[00123] Cláusula 49.- O produto para utilização de acordo com qualquer uma das cláusulas 44 até 48, em que o referido extrato de laranja amarga é administrado em uma dose diária de 0,005 g por kg de peso do corpo do animal até 0,02 g por kg de peso do corpo do animal.

[00124] Cláusula 50.- O produto para utilização de acordo com qualquer uma das cláusulas 44 até 49, em que o referido extrato de laranja amarga é administrado em uma dose diária de 0,01 g por kg de peso do corpo do animal.

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[00125] Cláusula 51.- O produto para utilização de acordo com qualquer uma das cláusulas 28 até 50, compreendendo administrar o referido produto a ruminantes e/ou porcos durante pelo menos 5 dias.

[00126] Cláusula 52.- O produto para utilização de acordo com a cláusula precedente, compreendendo administrar o referido produto a porcos durante pelo menos 10 dias.

[00127] Cláusula 53.- O produto ou a composição para utilização de acordo com a cláusula 51, compreendendo administrar o referido produto a ruminantes durante pelo menos 15 dias.

EXEMPLOS

[00128] A presente invenção será agora descrita em mais detalhe com referência aos seguintes Exemplos, que não devem, de modo nenhum, ser considerados limitadores do escopo da presente invenção. Exemplo 1: Efeito de flavonoides no desempenho, comportamento animal e expressão genética no rúmen em touros alimentados com dietas altamente concentradas Materiais e Métodos Animais, Alimentação, Alojamento e Planejamento Experimental

[00129] Este estudo foi conduzido de acordo com as diretrizes espanholas para a proteção de animais experimentais (Decreto Real 53/2013 de 1 de fevereiro sobre a proteção de animais usados para experimentação ou outros propósitos científicos; Boletín Oficial del Estado, 2013). Cento e quarenta e quatro touros Holstein (164,8 ± 5,91 kg de peso do corpo (PC) e 135 ± 7,2 dias de idade) foram engordados sob condições comerciais em uma herdade (Granja l'Alzina, L'Alzina, Lleida). Os animais foram aleatoriamente atribuídos a um de oito currais totalmente cobertos (12 por 6 m) que foram dotados de uma camada profunda de palha e equipados com um comedouro de três espaços (1,50 m de comprimento, 0,40 m de largura, 1,50 m de altura e 0,35 m de profundidade). O comedouro de cada curral pesou o concentrado

29 / 52 continuamente como descrito por Verdú et al. (2017), e estes dados foram registrados para calcular o consumo de concentrado por curral.

[00130] Os currais também foram equipados com um bebedouro (0,30 m de comprimento, 0,30 m de largura, 0,18 m de profundidade) e um medidor de água registrando diariamente o consumo de água no curral. Palha foi proporcionada ad libitum em um comedouro de palha separado (3,60 m de comprimento, 1,10 m de largo e 0,32 m de profundidade), e sempre que foi substituído foi registrado para estimar o consumo total de palha. Uma vez que palha também foi usada para o acamamento, estes dados são somente uma estimativa. Consumo de Ração e Desempenho

[00131] Os animais foram alimentados com um concentrado comercial em forma de farinha, formulado para cumprir os requisitos nutricionais dos animais (NRC, 2001). Nos primeiros 112 dias do estudo, os animais foram alimentados com uma fórmula de concentrado de crescimento, e entre os 112 dias e o fim do estudo, os animais foram alimentados com um concentrado final. Os ingredientes e composição nutricional dos concentrados são mostrados na Tabela 1. Ao longo do estudo, os animais tiveram acesso ad libitum a palha de trigo (3,5% de CP, 1,6% de extrato etéreo, 70,9% de NDF e 6,1% de cinzas; base DM) e água fresca. Tabela 1. Ingredientes e composição de nutrientes dos concentrados de ração Item Crescimento Final Ingredientes, % Farinha de grãos de milho 39,97 45,09 Farinha de grãos de cevada 17,98 15,55 DDGs 17,98 15,02 Trigo 10,97 11,03 Polpa de beterraba 7,39 8,02 Óleo de palma 2,00 2,50 Carbonato de cálcio 1,55 1,28 Ureia 0,80 0,40 Bicarbonato de sódio 0,50 0,40 Fosfato dicálcico 0,36 0,31 Pré-mistura de vitaminas 0,30 0,20 Sal 0,20 0,20 Nutrientes, base de matéria seca (DM) UFc/kg 1,18 1,06 Proteína bruta (CP), % 15,73 12,26

30 / 52 Extrato etéreo (EE), % 5,82 5,41 Cinzas, % 5,60 4,38 NDF, % 17,80 15,11 TDN, % 88,19 79,02 PDIE, g/kg 101,6 88,1 PDIN, g/kg 100,7 79,9 NFC, % 55,05 51,23

[00132] DM:Matéria Seca; UFc: Unidade de energia líquida de cultura forrageira para a produção de carne; CP:Proteína Bruta; NDF: Fibra em Detergente Neutro; TDN: Nutrientes Digestivos Totais; PDIE: Proteína Digerida Intestino (proteína digerida no intestino delgado quando energia fermentável no rúmen é limitante) – Energia; PDIN: Proteína Digerida Intestino (proteína digerida no intestino delgado quando nitrogênio fermentável no rúmen é limitante) – Nitrogênio; NFC: Carboidratos Não Fibrosos.

[00133] Os animais foram aleatoriamente atribuídos a um de 8 currais, e atribuídos a um dos dois tratamentos (4 currais por tratamento), de controle (C) ou suplementado (BF) com 0,04% de extrato de laranja amarga (Citrus aurantium) do fruto completo rico em em naringina, >20% (Bioflavex® CA, Interquim, S.A., Barcelona, Espanha).

[00134] Os animais foram pesados individualmente a cada 14 dias ao longo do estudo em 12 períodos experimentais de 14 dias; durante os 8 primeiros períodos (desde 1 até 112 dias), os animais consumiram o concentrado de crescimento, e durante os últimos 4 períodos (desde 113 até 168 dias) e durante os dias antes do abate, os animais consumiram o concentrado final (ver a Tabela 1). Após 168 dias de estudo, os touros foram transportados para o matadouro (Escorxador del Grup Alimentari Guissona, Guissona, Espanha), localizado a 15 km da herdade. Os animais foram abatidos em duas semanas, 4 currais por semana, dois currais de touros C e dois de BF. O tempo de espera antes do abate foi menor do que 6 h. Os animais foram pesados antes da carga. Foram abatidos seguindo práticas comerciais e seguindo a Regulamentação EU 1099/2009 sobre a proteção de animais no momento da morte ou abate. O peso da carcaça quente (PCQ) de

31 / 52 cada animal foi registrado. Comportamento Animal

[00135] Foi efetuado um procedimento de observação visual aos dias 15, 30, 43, 57, 71, 85, 94, 112, 127, 141, 155 e 170 do estudo para estudar a atividade geral (erguido, deitado, comendo, bebendo e ruminando) e comportamento social (não agonista, agonista e interações sexuais) dos animais em cada curral. As atividades de comportamento social registradas são descritas na Tabela 2. A observação visual foi efetuada para 2 currais ao mesmo tempo. desde as 8:00 até às 10:30 h da manhã, como descrito por Mach et al. (2008), Rotger et al. (2006), Robles et al. (2007), e Martí et al. (2010). As atividades gerais foram pontuadas usando amostragens de 3 observações de 10 s em intervalos de 5 min, e o comportamento social foi pontuado durante três períodos de amostragem contínua de 5 min. Este procedimento de observação de 15 min foi repetido duas vezes consecutivamente em cada curral, começando aleatoriamente em um curral diferente em cada dia de observação. Este método descreve um comportamento exibido por um animal em um intervalo de tempo fixo. Tabela 2. Descrição das categorias de comportamento social registradas.

Interações Item Definição Lamber não estereotipado do seu próprio corpo, coçar Autolimpeza com um membro posterior ou contra as instalações. Interações não Lamber, esfregar com o focinho ou investir com os Comportamento social agonistas chifres um touro vizinho. Comportamento não Lamber ou morder instalações com finalidade não nutritivo oral nutritiva. Quando touros investiram vigorosamente cabeça contra Lutar cabeça. Quando um touro empurra vigorosamente a sua cabeça Marrar contra qualquer parte do corpo de outro touro. Quando um touro força o seu posicionamento entre 2 Interações Deslocamento outros touros ou entre um touro e qualquer agonistas equipamento. Quando um touro segue rapidamente ou corre atrás de Perseguir outro touro. Coagir a se erguer Quando um touro empurra um animal em repouso e faz (“Chasing-up”) com que se erga. Flehmen Lábio superior invertido. Interações sexuais Cobrições tentadas Cabeça no dorso de outro animal. Cobrições completadas Membros anteriores no dorso de outro animal.

32 / 52 Enrolar a língua, lamber ou morder de modo Estereotipias Estereotipias orais estereotipado qualquer equipamento Qualidade da Carcaça

[00136] Após o abate, o peso da carcaça quente (PCQ) foi registrado para cada animal. O rendimento percentual foi calculado dividindo o PCQ pelo peso do corpo (PC) registrado antes do abate. E, seguindo as categorias (S)EUROP descritas pela Regulamentação EU No. 1208/81 e 1026/91, a conformação das carcaças foi classificada, em que “E” correspondeu a uma conformação excelente, “U” a conformação muito boa, “R” a conformação boa, “O” a conformação razoável, e “P” a conformação má. A camada de gordura foi classificada de acordo com a Regulamentação EU No. 1208/81, que utiliza um sistema de classificação por números, 1.2.3.4.5, em que 5 indica um grau muito elevado de gordura de cobertura e depósitos graxos pesados na cavidade torácica e 1 é classificado como grau baixo, sem camada de gordura. Avaliação Macroscópica do Rúmen e Fígado e recolha de amostras

[00137] O rúmen e o fígado de cada animal foram avaliados macroscopicamente no matadouro. Os rúmens foram classificados dependendo da cor por uma avaliação visual, desde 1 até 5, em que “5” é um rúmen negro e “1” é um rúmen claro (González et al., 2001). Também foram divididos em áreas, de acordo com Lesmeister et al. (2004), para examinar a presença de úlceras, regiões calvas, e de papilas agrupadas (Nocek et al., 1984). Abcessos do fígado foram classificados de acordo com Brown et al. (1975).

[00138] Adicionalmente, seções de 1 cm2 de cada sítio do rúmen foram submetidas a amostragem e foram enxaguadas 2 vezes com PBS refrigerado após a amostragem e imediatamente incubadas em RNAlater (Invitrogen, Madrid, Espanha) para preservar a integridade do RNA. Após 24 horas de incubação com RNAlater a 4 ºC, o líquido foi removido e o tecido foi congelado a -80 ºC até extração adicional de RNA e subsequente análise da

33 / 52 expressão genética. Análises Biológicas e Químicas

[00139] Seções de 1 cm2 de cada sítio do rúmen foram submetidas a amostragem e foram enxaguadas 2 vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) refrigerada após a amostragem e imediatamente incubadas em RNAlater (Invitrogen, Madrid, Espanha) para preservar a integridade do RNA. Após 24 horas de incubação com RNAlater a 4 ºC, o líquido foi removido e o tecido foi congelado a -80 ºC até extração adicional de RNA e subsequente análise da expressão genética.

[00140] Durante o estudo, amostras de concentrado foram recolhidas nos dias 0, 42, 84, 126 e 168 e analisadas quanto à matéria seca (DM) (24 h a 103 ºC), cinzas (4 h a 550 ºC), proteína bruta (CP) pelo método de Kjeldahl (método 981.10; AOAC, 1995), fibra em detergente ácido (ADF) e fibra em detergente neutro (NDF) de acordo com Van Soest et al. (1991), usando sulfito de sódio e alfa-amilase, e extrato etéreo (EE) por Soxhlet com uma hidrólise ácida prévia (método 920.39; AOAC, 1995).

[00141] Naringina foi determinada para cada amostra como um marcador Bioflavex® CA para o grupo BF, e foi usada como análise de controle de qualidade para garantir a adição correta do produto à ração pelo método interno do Laboratory of Interquim S.A. para quantificação da naringina usando HLPC desenvolvido por Interquim S.A. (Paniagua et al., 2018).

[00142] Para análises da expressão genética, RNA total foi extraído de tecidos da parede do rúmen usando Trizol (Invitrogen). mRNA isolado foi transcrito de modo reverso em cDNA usando um Kit de Reagentes PrimeScript RT (Takara, Frankfurt, Alemanha) seguindo as instruções do fabricante. A pureza do RNA foi avaliada com um instrumento NanoDrop (ThermoFisher, Madrid, Espanha) a 260, 280 e 230 nm. A quantificação de expressão de genes codificando 1) a produção, expressão, e renovação de

34 / 52 neurotransmissores: receptor de ácidos graxos livres 2 (FFAR2) e receptor de ácidos graxos livres 3 (FFAR3), receptor de polipeptídeo pancreático 1 (PPYR1); receptor da colecistocinina B (CCKBR); 2) citocinas pró- inflamatórias ou citocina IL-25 (IL25) e peptídeos antimicrobianos liberados por células intestinais, β-defensinas, e 3) receptores de sabor amargo tipo 2 membro 7, 16, 38 e 39 (TAS2R7, TAS2R16, TAS2R38 e TAS2R39), foi efetuada por PCR quantitativa (qPCR) usando gene codificando a Proteína Ribossômica Subunidade 9 (RPS9) como gene doméstico, que foi verificado quanto à estabilidade seguindo Vandesompele et al. (2002), em comparação com genes codificando β-actina (ACTB), Proteína Transcrita Ubiquamente Expressa (UXT) e Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH). As condições de qPCR para cada conjunto de iniciadores foram individualmente otimizadas. A especificidade da amplificação foi avaliada por identificação de bandas únicas ao peso molecular esperado em géis de DNA agarose 0,8% e um único pico na curva de fusão. A eficiência foi calculada amplificando diluições em série 1:10 de cada amplicon genético. Uma curva padrão do ponto característico (Cq) versus o logaritmo da concentração foi representada graficamente para obter a eficiência, que foi calculada usando a fórmula 101/inclinação, com um intervalo aceitável de 1,8 até 2,2. Foi usado um volume reacional total de 20 μL, contendo 50 ng de cDNA, 10 μL de SYBR Premix EXTaq (TliRNAseH) (Takara, Frankfurt, Alemanha) e a concentração de iniciador otimizada para cada gene. As reações de qPCR foram submetidas a ciclos do modo seguinte: um passo de desnaturação inicial de 10 min a 95 °C seguido de 40 ciclos de 10 s a 95 °C, 15 s à temperatura de emparelhamento otimizada para cada gene, 30 s a 72 °C, e uma extensão final de 10 min a 72 °C. Os valores de Cq resultantes foram usados para calcular a expressão relativa de genes selecionados por quantificação relativa usando um gene de referência (gene doméstico) e um calibrador do grupo de controle.

[00143] A concentração de ácidos graxos voláteis (VFA) produzidos

35 / 52 no rúmen foi analisada com uma coluna semicapilar (15 m por 0,53 mm d.i., espessura do filme 0,5 μm, TRB-FFAP; Teknokroma, Barcelona, Espanha) composta por polietilenoglicol 100% esterificado com ácido nitrotereftálico, fase ligada e reticulada (método número 5560) usando um CP-3800-GC (Varian, Inc., Walnut Creek, CA). Resultados Saúde animal

[00144] Dois animais do grupo de Controle (grupo C) não terminaram o estudo devido a problemas de coxeadura e foram removidos antes do dia

168. Um animal do grupo tratado com BF® CA (grupo BF ou touros BF) que terminou o estudo também foi removido da base de dados devido a problemas crônicos de saúde. Todos os dados destes animais foram removidos da base de dados. Ingestão e Consumo de Água, Desempenho e Qualidade das Carcaças

[00145] Não foram encontradas diferenças estatísticas ao longo do estudo para a ingestão de concentrado entre tratamentos (Tabela 3), nem durante a fase de crescimento (Tabela 4) nem durante a fase final (Tabela 5). Do mesmo modo, a estimativa do consumo de palha não exibiu diferenças estatísticas durante todo o estudo (Tabela 3), nem durante a fase de crescimento (Tabela 4) nem durante a fase final (Tabela 5). O consumo de água também não foi afetado por tratamentos ao longo do estudo (Tabela 3), nem durante a fase de crescimento (Tabela 4) nem durante a fase final (Tabela 5). Tabela 3. Desempenho, ingestão de concentrado e comportamento de alimentação desde 0 d até 168 dias de idade para touros Holstein alimentados com dietas altamente concentradas suplementadas com BIOFLAVEX® CA Tratamento1 Valor P2 4 Item Controle BF® CA EPM T Tempo T x Tempo Idade inicial, d 134,25 135,22 0,215 0,002 Idade final, d 302,02 303,22 0,677 0,25 PC inicial, kg 165,03 164,64 5,906 0,96 PC final (168 d de estudo), 436,34 439,48 1,849 0,28 kg

36 / 52 CV, % 8,10 8,91 0,764 0,46 <0,0001 0,34 ADG, kg/d 1,62 1,64 0,011 0,19 <0,0001 0,57 CV, % 27,60 26,85 1,564 0,74 <0,0001 0,61 Ingestão de concentrado

DM Média, kg/d 7,21 7,04 0,126 0,37 <0,0001 0,51 CV, % 10,93 11,32 0,623 0,66 0,0002 0,97 FCR, kg/kg 5,36 5,11 0,108 0,10 <0,0001 0,03 1 Controle = não suplementado, BF® CA = concentrado suplementado com BIOFLAVEX® CA a 0,04%. 2 T = efeito do tratamento; Tempo = efeito temporal (período de 14 dias); T x Tempo = efeito da interação tratamento por tempo. 3 ADG = Ganho médio diário 4 EPM = erro padrão da média dos dados com transformação logarítmica Tabela 4. Desempenho, ingestão de concentrado e comportamento de alimentação desde 4 até 9 meses de idade para touros Holstein alimentados com dietas altamente concentradas suplementadas com BIOFLAVEX® CA Tratamento1 Valor P2 Item Controle BF® CA EPM T Tempo T x Tempo Idade inicial, d 134,25 135,22 0,215 0,002 Idade final, d 246,16 247,22 0,689 0,32 PC inicial, kg 165,03 164,64 5,906 0,96 PC final (168 d de estudo), 360,34 360,27 1,282 0,97 kg CV, % 8,65 9,37 0,773 0,54 <0,0001 0,34 ADG, kg/d 1,75 1,75 0,011 0,97 <0,0001 0,58 CV, % 19,98 22,15 0,934 0,11 0,0011 0,29 Ingestão de concentrado

DM Média, kg/d 6,83 6,60 0,143 0,26 <0,0001 0,46 CV, % 10,53 11,29 0,700 0,45 0,0002 0,95 FCR, kg/kg 4,50 4,34 0,087 0,19 <0,0001 0,22 1 Controle = não suplementado, BF® CA = concentrado suplementado com BIOFLAVEX® CA a 0,04%. 2 T = efeito do tratamento; Tempo = efeito temporal (período de 14 dias); T x Tempo = efeito da interação tratamento por tempo.

Tabela 5. Desempenho, ingestão de concentrado e comportamento de alimentação desde 9 até 11 meses de idade para touros Holstein alimentados com dietas altamente concentradas suplementadas com BIOFLAVEX® CA Tratamento1 Valor P2 Item Controle BF® CA EPM T Tempo T x Tempo Idade inicial, d 246,16 247,22 0,689 0,32 Idade final, d 302,02 303,22 0,677 0,25 PC inicial, kg 360,34 360,27 1,212 0,97 PC final (168 d de estudo), 436,34 439,48 1,849 0,28 kg CV, % 7,04 8,24 0,308 0,01 0,82 0,76 ADG, kg/d 1,36 1,41 0,019 0,048 <0,0001 0,35 CV, % 42,83 36,28 1,831 0,02 0,018 0,95 Ingestão de concentrado

DM Média, kg/d 7,96 7,91 0,193 0,86 0,022 0,39 CV, % 11,68 11,43 0,767 0,82 0,63 0,70 FCR, kg/kg 7,08 6,66 0,297 0,34 <0,0001 0,049 1 Controle = não suplementado, BF® CA = concentrado suplementado com BIOFLAVEX® CA a 0,04%. 2 T = efeito do tratamento; Tempo = efeito temporal (período de 14 dias); T x Tempo = efeito da interação tratamento por tempo.

37 / 52

[00146] O ganho médio diário (ADG) da fase de crescimento é mostrado na Tabela 4. Foram encontradas diferenças não estatísticas para os parâmetros de produção analisados durante esta fase. No entanto, o ADG durante a fase final foi maior (P < 0,05) para touros BF (1,41 ± 0,019 kg/d) do que para o grupo C (1,36 ± 0,019 kg/d), e CV para este parâmetro foi menor (P < 0,05) para o grupo BF (36,28 ± 1,831%) em comparação com touros C (42,83 ± 1,831%) (Tabela 5). Quanto ao restante, CV para PC final foi maior (P = 0,01) para touros BF (8,24 ± 0,308%) do que para touros C (7,04 ± 0,308%). A taxa de conversão alimentar (FCR) tendeu (P = 0,10) a ser menor para touros BF (5,11 ± 0,108 kg/kg) do que para touros C (5,36 ± 0,108 kg/kg) no fim do estudo, apesar de o PC (437,9 ± 1,85 kg) e ingestão de concentrado (7,13 ± 0,126 kg/d) não terem sido afetados pelo tratamento (Tabela 3). Foi encontrada uma interação entre tratamento e tempo para FCR (P = 0,05) durante a fase final (Tabela 5).

[00147] Em resumo, o ADG de touros BF desempenhou melhor durante esta fase final sem um aumento da ingestão de concentrado. Consequentemente, touros BF foram mais eficientes durante esta fase, apesar de a melhoria da FCR ter sido apenas numérica. Então, presumindo que touros suplementados com flavonoides podem ter reduzido os tamanhos grandes de refeições, tal poderá explicar a melhoria da eficiência do concentrado durante a fase final e o maior desempenho de ADG destes animais BF.

[00148] Os dados da qualidade das carcaças estão apresentados na Tabela 6. O PC final (451,51 ± 3,154 kg), rendimento percentual (52,94% ± 0,326), conformação das carcaças e pontuação de gordura não foram afetados pelo tratamento. Tabela 6. Qualidade das carcaças de touros Holstein alimentados com dietas altamente concentradas suplementadas com BIOFLAVEX® CA. Tratamento1 Valor P2 Item Controle BF® CA EPM T Idade antes do abate, d 313,38 314,75 0,916 0,29

38 / 52 Dias em estudo, d 179,37 179,53 0,431 0,80 PC antes do abate, kg 450,39 452,62 3,154 0,62 Peso da carcaça quente, kg 237,60 239,92 2,019 0,42 Rendimento percentual, % 52,80 53,07 0,326 0,56 Gordura, % - 1 2 3 100 100 Conformação3, % 0,37 P 91,43 84,93 O 8,57 13,70 R 0 1,37

U 1 Controle = não suplementado, BF® CA = concentrado suplementado com BIOFLAVEX® CA a 0,04%. 2 T = efeito do tratamento; Tempo = efeito temporal (período de 14 dias); T x Tempo = efeito da interação tratamento por tempo. 3 Conformação de carcaças: Categorias (S)EUROP descritas pela Regulamentação EU No. 1208/81 e 1026/91, em que “E” corresponde a uma conformação excelente, “U” a conformação muito boa, “R” a conformação boa, “O” a conformação razoável, e “P” a conformação má.

Comportamento Animal

[00149] Todos os dados do comportamento animal, atividades gerais e também comportamento ativo são mostrados na Tabela 7 e Tabela 8 para a fase de crescimento e final, respectivamente.

[00150] Atividades Gerais. Não foram encontradas diferenças estatísticas na percentagem de animais por curral erguidos, deitados, comendo palha e ruminando ao longo do período de observação visual (2:30 h) para a fase de crescimento (desde 0 até 112 dias do estudo). A percentagem de animais comendo concentrado foi maior (P < 0,01) para touros BF em comparação com animais do grupo C, e a proporção de animais bebendo água também tendeu (P < 0,10) a ser maior para touros BF do que para touros C durante esta fase.

[00151] Para a fase final, não foram encontradas diferenças na proporção de animais por curral erguidos, deitados, comendo palha e bebendo água durante o período de observação visual. Nesta fase, a proporção de animais por curral comendo concentrado tendeu (P < 0,10) a ser maior em touros BF em comparação com touros C, e a proporção de animais ruminando no grupo BF foi maior (P < 0,01) do que para touros C.

[00152] Comportamento Ativo. Na fase de crescimento, durante o período de observação visual, o único parâmetro não afetado pelo tratamento

39 / 52 foi o comportamento social. O comportamento de autolimpeza foi maior para touros BF em comparação com o grupo C, e este grupo C exibiu mais (P = 0,01) comportamento oral não nutritivo do que os touros do grupo BF. Estes resultados estão mostrados graficamente na Figura 1. Todo o comportamento relacionado com interações agonistas foi estatisticamente diferente durante esta fase (Figura 2) e mais frequentemente exibido por touros do grupo C. O comportamento de luta foi maior (P < 0,01) em touros C do que em touros BF, e o comportamento de marrar também foi maior (P < 0,01) para o grupo C em comparação com o grupo BF. As interações de deslocamento exibidas foram maiores (P < 0,01) no grupo C em comparação com o grupo BF. Interações de perseguir e coagir a se erguer foram ocasionalmente exibidas, mas foram maiores (P < 0,05) no grupo C do que no grupo BF. O comportamento Flehmen exibido foi maior (P = 0,05) em touros C em comparação com o grupo BF. Adicionalmente, tentativas de cobrição e cobrições completadas tenderam (P < 0,10) a ser maiores para touros C do que para touros do grupo BF (Figura 3).

[00153] Durante a fase final (desde 113 até 168 dias), não foram observadas diferenças entre tratamentos para o comportamento social e oral. Touros do grupo C tenderam (P < 0,10) a exibir mais comportamento de autolimpeza do que touros BF (Figura 1). Quanto ao restante, o comportamento agonista, como interações de luta e marradas, foi maior (P < 0,001 e P < 0,001, respectivamente) no grupo C do que no grupo BF. Além disso, apesar de o deslocamento e perseguição raramente terem ocorrido, touros do grupo C exibiram maiores (P < 0,0001 em ambos os casos) interações do que touros BF. No que se refere a interações sexuais, tentativas de cobrição e cobrições completadas exibidas foram maiores (P < 0,001) para o grupo C do que para touros BF, sendo que Flehmen também tendeu (P < 0,10) a ser maior para touros C em comparação com touros BF. Os resultados de interações agonistas e sexuais estão mostrados graficamente nas Figuras 2

40 / 52 e 3. Tabela 7. Comportamento, 1 - 112 dias em ensaio (do estudo) Item Tratamento1 Valores P2 3 Controle BF EPM T Tempo Tx Tempo Atividade Geral, % Erguidos 55,64 58,80 4,123 0,60 <.0001 0,99 Deitados 44,36 41,15 4,104 0,58 0,008 0,99 Comendo concentrado 8,95 11,07 0,495 <0,0001 <0,0001 0,82 Comendo palha 4,87 7,45 0,617 0,35 0,188 0,44 Bebendo 1,40 2,59 0,192 0,09 0,059 0,89 Ruminando 12,24 14,74 2,035 0,70 0,003 0,86 Comportamento social, /15 min Autolimpeza 15,22 18,23 0,717 0,01 <.0001 0,096 Social 4,61 5,97 0,851 0,14 <.0001 0,99 Oral não nutritivo 1,41 0,88 0,283 0,01 0,177 0,78 Lutar 7,42 3,20 0,908 0,0003 0,0004 0,91 Marrar 4,19 1,61 0,480 <0,0001 <0,0001 0,73 Deslocamento 1,69 1,09 0,109 0,0004 0,0008 0,85 Perseguir 0,84 0,30 0,203 0,04 0,140 0,70 Coagir a se erguer 0,16 0,02 0,068 0,03 0,103 0,22 Flehmen 3,03 2,00 0,574 0,05 0,045 0,63 Tentativas de cobrição 1,76 0,75 0,524 0,09 <0,0001 0,31 Cobrições completadas 1,33 0,91 0,284 0,09 <0,0001 0,31 1 C = controle, BF = concentrado suplementado com BIOFLAVEX® CA a 0,04% 2 T = efeito do tratamento; Tempo = efeito temporal (medições a cada 14 dias); T x Tempo = interação tratamento por tempo. 3 EPM = erro padrão da média dos dados com transformação logarítmica (atividade geral) ou dados com transformação quadrática (comportamento social).

Tabela 8. Comportamento, 112 - 168 dias em ensaio (do estudo) Item Tratamento1 Valores P2 3 Controle BF EPM T Tempo Tx Tempo Atividade Geral, % Erguidos 63,46 64,11 2,700 0,51 0,739 0,70 Deitados 35,44 35,68 2,673 0,75 0,881 0,86 Comendo concentrado 6,00 7,91 0,815 0,09 0,395 0,65 Comendo palha 4,27 6,25 0,869 0,24 0,072 0,69 Bebendo 1,87 1,93 0,382 0,87 0,203 0,85 Ruminando 7,33 12,68 1,813 <0,0001 0,194 0,99 Comportamento social, /15 min Autolimpeza 8,62 7,00 0,809 0,08 0,480 0,80 Social 4,69 3,53 1,067 0,24 0,451 0,92 Oral não nutritivo 0,94 0,38 0,318 0,20 0,271 0,54 Lutar 10,34 3,53 1,712 <0,0001 0,0004 0,49 Marrar 4,63 2,00 0,869 0,0004 0,046 0,50 Deslocamento 0,78 0,28 0,242 0,0009 0,143 0,91 Perseguir 1,62 0,19 0,194 <0,0001 <0,0001 0,025 Coagir a se erguer 0,13 0,03 0,042 0,12 0,450 0,17 Flehmen 4,91 3,78 0,807 0,07 0,010 0,86 Tentativas de cobrição 8,01 2,32 1,717 0,0008 <0,0001 0,020 Cobrições completadas 6,16 2,52 1,610 0,0008 <0,0001 0,20 1 C = controle, BF = concentrado suplementado com BIOFLAVEX® CA a 0,04% 2 T = efeito do tratamento; Tempo = efeito temporal (medições a cada 14 dias); T x Tempo = interação tratamento por tempo. 3 EPM = erro padrão da média dos dados com transformação logarítmica (atividade geral) ou dados com transformação quadrática (comportamento social).

41 / 52

[00154] Ao analisar o comportamento de alimentação, os períodos de observação visual (manhã) indicaram que touros suplementados com flavonoides ocupavam mais o comedouro de concentrado em comparação com touros C; este efeito foi mais acentuado durante a fase de crescimento do que durante a fase final. Então , durante o período de observação visual, estes animais BF dedicaram mais tempo a comer. Na fase de crescimento, apesar desta maior ocupação do comedouro, a ingestão de concentrado foi numericamente menor para touros BF, indicando que provavelmente a taxa de alimentação foi menor. Apesar de terem sido encontradas diferenças não estatísticas para a ocupação do comedouro de palha (dados da amostragem da observação visual matinal) ao longo do estudo, touros BF exibiram maior comportamento ruminante durante a fase final. É difícil explicar este resultado, e pode se dever ao procedimento de observação visual, que não descreve a ocupação do comedouro e atividades ruminantes diárias totais. A ocupação do bebedouro tendeu a ser maior para touros suplementados com flavonoides durante a fase de crescimento. Habitualmente, a ingestão de matéria seca e ingestão de água estão diretamente relacionadas. Fermentação no rúmen

[00155] VFA da fermentação no rúmen são apresentados na Tabela 10. A concentração de VFA total no rúmen não foi afetada pelo tratamento. A proporção molar de acetato foi maior (P < 0,0001) em touros BF em comparação com touros C, ao passo que a proporção molar de propionato foi maior (P < 0,0001) para touros dos touros C do que para touros BF. Em conformidade, a razão acetato:propionato foi maior (P < 0,0001) para os touros BF do que para touros C. Os restantes VFA analisados (butirato, valerato, isobutirato e isovalerato) não foram afetados pelo tratamento. Tabela 10. Parâmetros VFA de fermentação no rúmen de touros Holstein alimentados com dietas altamente concentradas suplementadas ou não com Bioflavex CA Controle1 BF CA2 EPM Valor P

42 / 52 Rúmen VFA Total, mM 75,6 67,2 4,76 0,22 VFA Individual, mol/100 mol Acetato 58,8 66,4 1,12 <0,0001 Propionato 28,9 20,7 1,21 <0,0001 Isobutirato 7,4 7,5 0,34 0,90 n-butirato 1,2 1,5 1,13 0,11 IsoValerato 1,5 1,3 0,13 0,26 Valerato 2,1 2,5 0,24 0,22 Acetato:propionato, mol/mol 2,15 3,35 0,171 <0,0001 1 Controle = não suplementado 2 BF CA = concentrado suplementado com BIOFLAVEX® CA a 0,04%.

Expressão de genes no rúmen

[00156] A razão da expressão relativa de genes estudados no epitélio do rúmen é apresentada na Tabela 11 e Figura 4. A suplementação com flavonoides afetou a razão da expressão relativa de todos os receptores de sabor amargo (TAS2R) analisados, sendo menos expressos por touros BF em comparação com touros C. A razão da expressão relativa de TAS2R7, TAS2R16, TAS2R38 e TAS2R38 foi maior (P = 0,002, P = 0,003, P = 0,002 e P = 0,002, respectivamente) para touros do grupo C em comparação com touros BF.

[00157] A razão da expressão relativa de receptores relacionados com a sinalização de neurotransmissores diferiu com o tipo de receptor. Enquanto o FFAR3 tendeu (P = 0,10) a ser maior para touros C do que para touros BF, o FFAR2 foi mais (P = 0,002) expresso nestes touros C em comparação com touros BF. Além disso, a razão da expressão relativa para PPYR1 e CCKBR também foi maior (P = 0,003 e P = 0,007, respectivamente) para touros C do que para touros BF.

[00158] Adicionalmente, a razão da expressão relativa dos receptores relacionados com inflamação, como IL-25 e β-defensina, foi maior (P = 0,005, P = 0,03, e P = 0,0002, respectivamente) para touros C do que para touros BF. Tabela 11. Razão da expressão de genes de touros Holstein alimentados com dietas altamente concentradas suplementadas ou não com Bioflavex CA após 168 dias de tratamento Controle1 BF CA2 EPM3 Valor P

43 / 52 TAS2R74 0,94 0,13 0,139 0,002 TAS2R165 0,94 0,46 0,097 0,003 TAS2R386 1,06 0,38 0,125 0,002 TAS2R397 0,88 0,37 0,100 0,002 FFAR38 0,98 0,64 0,141 0,10 FFAR29 0,96 0,38 0,111 0,002 PPYR110 1,02 0,55 0,103 0,003 CCKBR11 1,04 0,62 0,098 0,007 IL-25 0,98 0,50 0,107 0,005 β-Defensina- ß 1,00 0,48 0,085 0,0002 1 Controle = não suplementado. 2 BF CA = concentrado suplementado com BIOFLAVEX® CA a 0,04%. 3 EPM são derivados de análises estatísticas de dados transformados por logaritmo de base 10, e médias são valores retrotransformados. 4 Receptor de sabor amargo 7 5 Receptor de sabor amargo 16 6 Receptor de sabor amargo 38 7 Receptor de sabor amargo 39 8 receptor de ácidos graxos livres 3 (gpr41) 9 receptor de ácidos graxos livres 2 (gpr43) 10 receptor de polipeptídeo pancreático 1 11 receptor de colecistocinina 4 Exemplo 2: Efeito da suplementação com flavonoides de dietas de desmame na expressão genética de receptores de sabor amargo (T2Rs) em leitões durante o período de viveiro Materiais e Métodos Animais, Alimentação, Alojamento e Planejamento Experimental

[00159] Um total de 168 leitões de cruzamento comerciais ([Large White x Landrace] x Pietrain) foi usado no ensaio. Os animais foram obtidos da mesma herdade comercial no dia do desmame e passados para a unidade de viveiro (sem transporte). Foram usados leitões machos e fêmeas com 21 d de idade com 4-7 kg de PC. Foi usada identificação com marca de orelha de plástico com o número do animal. Para o ensaio de desempenho, os animais foram distribuídos em 2 blocos por peso do corpo inicial. Dentro de cada bloco, os porcos foram distribuídos em currais para uma distribuição equilibrada do peso do corpo. Cada bloco consistiu portanto em 6 currais de 14 animais aos quais as dietas experimentais foram aleatoriamente atribuídas. Os porcos foram então atribuídos a 12 currais (14 leitões/curral/lote desmamado de fresco). Cada curral tinha um funil sem tampa comercial e um bebedouro de tetina para assegurar alimentação ad libitum e acesso livre a

44 / 52 água. Aos currais foram atribuídos dois tratamentos experimentais (6 repetições para cada tratamento). Programa de alimentação

[00160] No desmame, aos animais selecionados foram oferecidas as mesmas dietas pré-iniciais basais seguindo a mesma especificação mas com ou sem suplementação com o produto experimental em estudo. A dieta pré- inicial foi proporcionada ad libitum durante quatorze dias consecutivos (Tabela 1, ingredientes, e Tabela 2, composição de nutrientes)

[00161] A dieta experimental foi produzida em farelada e ensacada e etiquetada, pronta para expedição para a herdade. As dietas foram misturadas em lotes de 1500 kg. Tabela 12. Composição da dieta pré-inicial (%)1 INGREDIENTES % Milho 18,86 Trigo 16,25 Soro de leite ácido 13,00 Farinha de soja HTM96 9,38 Cevada 8,81 Trigo Extrudado 7,83 Milho Extrudado 5,22 Farinha de soja integral (47% de proteína) 4,05 Concentrado de farinha de soja 4,00 Farinha de peixe 70% CP 4,00 Plasma animal 80CP 3,00 Banha 2,90 fosfato dicálcico 0,96 Sulfato de lisina 0,53 Pré-mistura Vit-Min 0,40 DL-Metionina 0,22 Sal 0,20 L-Treonina 0,18 L-Valina 0,11 L-Triptofano 0,07 1 Fornecidos os seguintes por kg de dieta: 7 000 IU de vitamina A (acetato); 500 IU de vitamina D3 (colecalciferol); 250 IU de vitamina D (25-hidroxicolecalciferol); 45 mg de vitamina E; 1 mg de vitamina K3; 1,5 mg de vitamina B1; 3,5 mg de vitamina B2; 1,75 mg de vitamina B6; 0,03 mg de vitamina B12; 8,5 mg de ácido D-pantotênico; 22,5 mg de niacina; 0,1 mg de biotina; 0,75 mg de folacina; 20 mg de Fe (quelato de aminoácidos); 2,5 mg de Cu (sulfato); 7,5 mg de Cu (quelato de glicina); 0,05 mg de Co (sulfato); 40 mg de Zn (óxido); 12,5 mg de Zn (quelato de aminoácidos); 12,5 mg de Mn (óxido); 7,5 de Mn (quelato de glicina); 0,35 mg de I, 0,5 de Se (orgânico); 0,1 mg de Se (sódio).

Tabela 13. Composição de nutrientes da dieta pré-inicial experimental (%, como base de ração) NUTRIENTES % Matéria seca 90,104 Cinzas 5,291 Energia líquida (Kcal/kg) 2460

45 / 52 Extrato Etéreo 6,738 Ácido linoleico 1,836 Fibra bruta 2,75 Fibra em detergente neutro 3,914 Amido 32,465 Açúcares 10,965 Proteína bruta 20,7 Lys 1,472 Lys dig 1,368 Met 0,538 Met dig 0,51 Cys 0,372 Cys dig 0,324 Met+Cys 0,91 Met+Cys dig 0,834 Thr 0,994 Thr dig 0,899 Trp 0,328 Trp dig 0,295 Val 1,004 Val dig 0,999 Ile 0,565 Ile dig 0,517 Leu 1,07 Leu dig 0,985 Phe 0,453 Phe dig 0,408 Tyr 0,274 Tyr dig 0,243 Phe+Tyr 0,727 Phe+Tyr dig 0,651 His 0,26 His dig 0,231 Ca 63 P Total 0,65 P dig 0,36 Na 0,29 Cl 0,43 Tratamentos e planejamento experimental

[00162] Foram preparados dois tratamentos experimentais, controle (T1) ou suplementado (T2) com 0,03% de extrato de laranja amarga (Citrus aurantium) do fruto completo rico em naringina, >20% (Bioflavex® CA, Interquim, S.A., Barcelona, Espanha). Em consequência, os diferentes tratamentos experimentais foram os seguintes: T1: Dieta basal T2: T1 + extrato de laranja amarga (300 g/Tm) Amostragem de tecido intestinal

[00163] Um leitão por curral foi eutanasiado no dia 7 pós-desmame (sugerido como sendo o período mais crítico após o desmame) e amostras de

46 / 52 tecido da seção do jejuno foram recolhidas em RNAlater e formaldeído, respectivamente, e mantidas armazenadas para análise adicional. Análise biológica

[00164] Para análises da expressão genética, RNA total foi extraído de tecidos do jejuno usando Trizol (Invitrogen). mRNA isolado foi transcrito de modo reverso em cDNA usando um Kit de Reagentes PrimeScript RT (Takara, Frankfurt, Alemanha) seguindo as instruções do fabricante. A pureza do RNA foi avaliada com um instrumento NanoDrop (ThermoFisher, Madrid, Espanha) a 260, 280 e 230 nm. A quantificação da expressão de genes que codificam receptores de sabor amargo tipo 2 membro 7, 17, 38 e 39 (TAS2R7, TAS2R16, TAS2R38 e TAS2R39) foi efetuada por PCR quantitativa (qPCR) usando gene codificando Proteína Ribossômica Subunidade 9 (RPS9) como gene doméstico, que foi verificado quanto à estabilidade seguindo Vandesompele et al. (2002), em comparação com genes codificando β-actina (ACTB), Proteína Transcrita Ubiquamente Expressa (UXT) e Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH). As condições de qPCR para cada conjunto de iniciadores foram individualmente otimizadas. A especificidade da amplificação foi avaliada por identificação de bandas únicas ao peso molecular esperado em géis de DNA agarose 0,8% e um único pico na curva de fusão. A eficiência foi calculada amplificando diluições em série 1:10 de cada amplicon genético. Uma curva padrão do ponto característico (Cq) versus o logaritmo da concentração foi representada graficamente para obter a eficiência, que foi calculada usando a fórmula 101/inclinação, com um intervalo aceitável de 1,8 até 2,2. Foi usado um volume reacional total de 20 μL, contendo 50 ng de cDNA, 10 μL de SYBR Premix EXTaq (TliRNAseH) (Takara, Frankfurt, Alemanha) e a concentração de iniciador otimizada para cada gene. As reações qPCR foram submetidas a ciclos do modo seguinte: um passo de desnaturação inicial de 10 min a 95 °C seguido de 40 ciclos de 10 s a 95 °C, 15 s à temperatura de emparelhamento otimizada para cada gene, 30 s

47 / 52 a 72 °C, e uma extensão final de 10 min a 72 °C. Os valores de Cq resultantes foram usados para calcular a expressão relativa de genes selecionados por quantificação relativa usando um gene de referência (gene doméstico) e um calibrador do grupo de controle (Pfaffl, 2004, Eq. [3.5]). Resultados

[00165] A razão da expressão relativa de genes estudados no epitélio do jejuno dos leitões é apresentada na Figura 5. A suplementação com flavonoides afetou a razão da expressão relativa de todos os receptores de sabor amargo (TAS2R) analisados, sendo mais expressos por leitões de T2 em comparação com os animais de T1. Exemplo 3: Efeito de flavonoides na expressão genética no epitélio do duodeno em touros alimentados com dietas finais ricas em gordura Materiais e Métodos Os mesmos do Exemplo 1 Consumo de Ração e Desempenho

[00166] Os animais foram alimentados com um concentrado comercial em forma de farinha, formulado para cumprir os requisitos nutricionais dos animais (FEDNA, 2008). Nos primeiros 112 dias do estudo, os animais foram alimentados com uma fórmula de concentrado de crescimento, e entre os 112 dias e o fim do estudo, os animais foram alimentados com um concentrado final rico em gordura. Os ingredientes e composição nutricional dos concentrados são mostrados na Tabela 14. Ao longo do estudo, os animais tiveram acesso ad libitum a palha de trigo (3,5% de CP, 1,6% de extrato etéreo, 70,9% de NDF e 6,1% de cinzas; base DM) e água fresca. Tabela 14. Ingredientes e composição de nutrientes dos concentrados de ração Item Crescimento1 Final2 Ingrediente, g/ kg Farinha de grãos de milho 399,7 436,9 Farinha de grãos de cevada 179,8 150,2 DDGs 179,8 150,2 Trigo 109,7 109,8 Polpa de beterraba 73,9 80,0

48 / 52 Óleo de palma 20,0 45,0 Carbonato de cálcio 15,5 12,8 Ureia 8,0 4,0 Bicarbonato de sódio 5,0 4,0 Fosfato dicálcico 3,6 3,1 Pré-mistura de vitaminas 3,0 2,0 Sal 2,0 2,0 Nutriente UFc/kg DM 1,18 1,25 CP, g/ kg DM 157 136 Extrato etéreo, g/ kg DM 58 84 Cinzas, g/ kg DM 56 46 NFD, g/ kg DM 178 169 NFC, g/ kg DM 551 565 1 desde 0 até 112 dias do estudo. 2 desde 113 dias até ao fim do estudo. DM:Matéria Seca; ME energia metabólica; CP:Proteína Bruta; NDF: Fibra em Detergente Neutro; NFC: Carboidratos Não Fibrosos.

[00167] Os animais foram aleatoriamente atribuídos a um de 8 currais, e atribuídos a um dos dois tratamentos (4 currais por tratamento), de controle (C) ou suplementado (BF) com 0,04% de extrato de laranja amarga (Citrus aurantium) do fruto completo rico em em naringina, >20% (Bioflavex® CA, Interquim, S.A., Barcelona, Espanha).

[00168] Os animais foram pesados individualmente a cada 14 dias ao longo do estudo em 12 períodos experimentais de 14 dias; durante os primeiros 8 períodos (desde 1 até 112 dias), os animais consumiram o concentrado de crescimento, e durante os últimos 4 períodos (desde 113 até 168 dias) e durante os dias antes da do abate, os animais consumiram o concentrado final (ver a Tabela 14). Após 168 dias de estudo, os touros foram transportados para o matadouro (Escorxador del Grup Alimentari Guissona, Guissona, Espanha), localizado a 15 km da herdade. Os animais foram abatidos em duas semanas, 4 currais por semana, dois currais de touros C e dois de BF. O tempo de espera antes do abate foi menor do que 6 h. Os animais foram pesados antes da carga. Foram abatidos seguindo práticas comerciais e seguindo a Regulamentação EU 1099/2009 sobre a proteção de animais no momento da morte ou abate. O peso da carcaça quente (PCQ) de cada animal foi registrado. Análises Biológicas e Químicas

[00169] Seções de 1 cm2 de cada sítio do duodeno foram submetidas a

49 / 52 amostragem e foram enxaguadas 2 vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) refrigerada após a amostragem e imediatamente incubadas em RNAlater (Invitrogen, Madrid, Espanha) para preservar a integridade do RNA. Após 24 horas de incubação com RNAlater a 4 ºC, o líquido foi removido e o tecido foi congelado a -80 ºC até extração adicional de RNA e subsequente análise da expressão genética.

[00170] Para análises da expressão genética, RNA total foi extraído de tecidos da parede do rúmen usando Trizol (Invitrogen). mRNA isolado foi transcrito de modo reverso em cDNA usando um Kit de Reagentes PrimeScript RT (Takara, Frankfurt, Alemanha) seguindo as instruções do fabricante. A pureza do RNA foi avaliada com um instrumento NanoDrop (ThermoFisher, Madrid, Espanha) a 260, 280 e 230 nm. A quantificação de expressão de genes codificando 1) a produção, expressão, e renovação de neurotransmissores: receptor de ácidos graxos livres 2 (FFAR2) e receptor de ácidos graxos livres 3 (FFAR3), receptor de polipeptídeo pancreático 1 (PPYR1); receptor da colecistocinina B (CCKBR); 2) citocinas pró- inflamatórias ou citocina IL-25 (IL25) e peptídeos antimicrobianos liberados por células intestinais, β-defensinas, e 3) receptores de sabor amargo tipo 2 membro 7, 16, 38 e 39 (TAS2R7, TAS2R16, TAS2R38 e TAS2R39), foi efetuada por PCR quantitativa (qPCR) usando gene codificando a Proteína Ribossômica Subunidade 9 (RPS9) como gene doméstico, que foi verificado quanto à estabilidade seguindo Vandesompele et al. (2002), em comparação com genes codificando β-actina (ACTB), Proteína Transcrita Ubiquamente Expressa (UXT) e Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH). As condições de qPCR para cada conjunto de iniciadores foram individualmente otimizadas. A especificidade da amplificação foi avaliada por identificação de bandas únicas ao peso molecular esperado em géis de DNA agarose 0,8% e um único pico na curva de fusão. A eficiência foi calculada amplificando diluições em série 1:10 de cada amplicon genético. Uma curva padrão do

50 / 52 ponto característico (Cq) versus o logaritmo da concentração foi representada graficamente para obter a eficiência, que foi calculada usando a fórmula 101/inclinação, com um intervalo aceitável de 1,8 até 2,2. Foi usado um volume reacional total de 20 μL, contendo 50 ng de cDNA, 10 μL de SYBR Premix EXTaq (TliRNAseH) (Takara, Frankfurt, Alemanha) e a concentração de iniciador otimizada para cada gene. As reações de qPCR foram submetidas a ciclos do modo seguinte: um passo de desnaturação inicial de 10 min a 95 °C seguido de 40 ciclos de 10 s a 95 °C, 15 s à temperatura de emparelhamento otimizada para cada gene, 30 s a 72 °C, e uma extensão final de 10 min a 72 °C. Os valores de Cq resultantes foram usados para calcular a expressão relativa de genes selecionados por quantificação relativa usando um gene de referência (gene doméstico) e um calibrador do grupo de controle. Resultados

[00171] No que se refere à expressão relativa ao nível do mRNA de genes estudados no epitélio do duodeno, os dados são apresentados na Figura

6. A suplementação com flavonoides afetou a expressão de todos os receptores de sabor amargo (TAS2R) analisados exceto TAS2R38. No duodeno, a expressão relativa de TAS2R7, TAS2R16 e TAS2R39 foi maior (P < 0,001) em touros C em comparação com touros BF. A expressão relativa de alguns receptores relacionados com a sinalização de neurotransmissores também diferiu entre tratamentos. O FFAR2 (P < 0,01) teve maior expressão nestes touros C em comparação com touros BF. Além disso, a expressão relativa de PPYR1 e CCKBR também foi maior (P < 0,01) para touros C do que para touros BF. Adicionalmente, a expressão relativa dos receptores relacionados com inflamação, IL-25 e β-defensina, foi mais uma vez maior (P < 0,05) para touros C do que para touros BF.

[00172] A expressão genética destas moléculas pró-inflamatórias no epitélio do duodeno de touros BF foi reduzida, como observado no epitélio do rúmen no estudo anterior (Exemplo 1). Estes resultados também estiveram de

51 / 52 acordo com a redução dos receptores sensores de nutrientes estudados no epitélio do duodeno de touros BF, tais como TAS2R, FFAR2, PPYR1 e CCKBR.

[00173] Em resumo, a suplementação com flavonoides modificou diferentemente a expressão genética de genes no epitélio do duodeno, o que pode estar relacionado com o padrão de alimentação e regulação do comportamento animal.

REFERÊNCIAS

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1.- Método não terapêutico para a modulação dirigida da expressão genética de pelo menos um receptor de sabor amargo e/ou pelo menos um receptor do eixo intestino-cérebro, em ruminantes e/ou porcos, caracterizado pelo fato de que compreende administrar naringina, naringenina ou suas misturas.

2.- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o receptor de sabor amargo ser selecionado do grupo consistindo em TAS2R7, TAS2R16, TAS2R38 e TAS2R39.

3.- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o receptor do eixo intestino-cérebro ser selecionado do grupo consistindo em FFAR2, FFAR3, PPYR1 e CCKBR.

4.- Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a expressão genética de pelo menos um de tais receptores ser reduzida.

5.- Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a quantidade de naringina, naringenina ou suas misturas ser administrada como uma mistura com ração, em que a referida composição de ração compreende pelo menos 0,005% p/p de naringina ou a quantidade equimolar de naringenina ou de uma mistura de naringina e naringenina se ambas estiverem presentes.

6.- Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que naringina ou naringenina ou suas misturas serem administradas em uma dose diária de 0,001 até 0,01 g de naringina por kg de peso do corpo do animal ou a quantidade equimolar de naringenina ou de uma mistura de naringina e naringenina se ambas estiverem presentes.

7.- Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que naringina, naringenina ou suas misturas estarem na forma de um extrato vegetal natural, preferencialmente o referido extrato vegetal natural é extrato de laranja amarga.

8.- Método de acordo com a reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que o referido extrato vegetal natural ser extrato de laranja amarga que é administrado em uma dose diária de 0,005 g por kg de peso do corpo do animal até 0,02 g por kg de peso do corpo do animal.

9.- Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende administrar naringina, naringenina ou suas misturas a um ruminante e/ou porcos durante pelo menos 5 dias.

10.- Naringina, naringenina ou suas misturas, caracterizadas pelo fato de que se destinarem à utilização na modulação da expressão genética de pelo menos um gene relacionado com o sistema imune em ruminantes e/ou porcos.

11.- Produto para utilização de acordo com a reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que o gene relacionado com o sistema imune ser selecionado do grupo consistindo em IL-6, IL-8, IL-10, IL-25 e β- defensina.

12.- Produto para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 11, caracterizado pelo fato de que a expressão genética de pelo menos um de tais receptores ser reduzida.

13.- Produto para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que o referido produto ser administrado como uma mistura com ração, em que a referida composição de ração compreende pelo menos 0,005% p/p de naringina ou a quantidade equimolar de naringenina ou de uma mistura de naringina e naringenina se ambas estiverem presentes.

14.- Produto para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo fato de que o produto ser administrado em uma dose diária de 0,001 até 0,01 g de naringina por kg de peso do corpo do animal ou a quantidade equimolar de naringenina ou de uma mistura de naringina e naringenina se ambas estiverem presentes.

15.- Produto para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende administrar o referido produto a ruminantes e/ou porcos durante pelo menos 5 dias.