BR112021011654A2 - 3¿-(benziloxi)-17¿-metil-pregn-5-en-20-ona para uso no tratamento de distúrbios cognitivos - Google Patents

Abstract

3?-(benziloxi)-17?-metil-pregn-5-en-20-ona para uso no tratamento de distúrbios cognitivos. a presente invenção se refere em geral a um derivado específico da pregnenolona para seu uso para o tratamento de distúrbios cognitivos. mais particularmente, a invenção se refere a um composto de fórmula (i), para seu uso no tratamento de distúrbios cognitivos. na verdade, o composto da invenção é muito potente in vivo na correção das deficiências cognitivas observadas em distúrbios cognitivos. fórmula (i).

Description

“3Β-(BENZILOXI)-17Α-METIL-PREGN-5-EN-20-ONA PARA USO NO TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS COGNITIVOS”

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção se refere ao campo de distúrbios mentais e, em particular, ao campo de distúrbios cognitivos. Ela se refere a um derivado de pregnenolona particular, “3β-(benziloxi)-17α-metil-pregn-5-en-20- ona” (3Bn17MeP), que não pode ser metabolizado em metabólitos de pregnenolona ativos e seu uso para o tratamento de distúrbios cognitivos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Os distúrbios cognitivos são definidos como distúrbios que resultam em deficiências da função cognitiva de um indivíduo que torna a vida independente em sociedade difícil ou impossível sem tratamento.

[0003] Os distúrbios cognitivos referem-se a deficiências em qualquer domínio do funcionamento cognitivo, incluindo aprendizagem e memória (por exemplo, memórias de curto e longo prazo, aquisição, consolidação, evocação e reconhecimento de memória), funções executivas (por exemplo, memória de trabalho, flexibilidade cognitiva, tomada de decisão), atenção complexa, linguagem, habilidades perceptivo-motoras ou cognição social. As funções cognitivas são necessárias para o funcionamento global dos indivíduos. Portanto, distúrbios cognitivos afetam realizações sociais pessoais, acadêmicas ou profissionais, com como consequência final uma perda de autonomia.

[0004] Os distúrbios cognitivos podem ser causados por doenças muito heterogêneas e podem se manifestar em qualquer fase da vida. Por exemplo, distúrbios cognitivos podem ser a consequência de um defeito de nascença genético, uma lesão cerebral física, uma doença neurodegenerativa ou de declínio cognitivo associado ao envelhecimento.

[0005] De acordo com a Quinta Edição do Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais (DSM-5™), os distúrbios cognitivos são compostos por duas categorias de doenças que se distinguem por considerações de desenvolvimento e tempo de vida: distúrbios do neurodesenvolvimento e distúrbios neurocognitivos.

[0006] Os transtornos do neurodesenvolvimento são um grupo de transtornos mentais que se manifestam durante o período inicial de desenvolvimento (ou seja, antes do ingresso no ensino fundamental). Normalmente, distúrbios do neurodesenvolvimento podem ser causados por defeitos congênitos genéticos (por exemplo, síndrome de Down, síndrome do X frágil), anomalias de desenvolvimento (por exemplo, malformação cerebral), doenças maternas (por exemplo, doença placentária) ou fatores ambientais perinatais (por exemplo, exposição fetal ao álcool).

[0007] Os transtornos do neurodesenvolvimento são caracterizados por dificuldades intelectuais, adaptativas e deficiências de comunicação. As consequências para os indivíduos com distúrbios do neurodesenvolvimento variam de acordo com a gravidade das deficiências cognitivas, mas sempre impedem atividades pessoais, sociais e acadêmicas. Por exemplo, na síndrome de Down, que é a causa genética mais comum de deficiência intelectual, os prejuízos cognitivos se manifestam principalmente pela redução da memória e das funções executivas (Grieco et al., 2015). A aquisição da linguagem e da escrita são atrasadas e a idade mental em adultos não ultrapassa os 8 anos com Quociente Intelectual <70. Consequentemente, os indivíduos com síndrome de Down são altamente dependentes, necessitando, por exemplo, de apoio educacional específico e individualizado e estando expostos à alta. taxa de desemprego (por exemplo, 50% nos Estados Unidos). Mais da metade dos indivíduos com síndrome de Down vivenciam comportamentos não adaptados e/ou dificuldades no convívio social (Grieco et al., 2015; Kumin e Schoenbrodt, 2016).

[0008] Os distúrbios do neurodesenvolvimento são altamente prevalentes. A deficiência intelectual por si só atinge 1% da população em geral com síndrome de Down representando 1% dos casos (DSM-5™). No entanto, não existe atualmente nenhum medicamento aprovado para o tratamento de deficiências cognitivas induzidas pelos distúrbios do neurodesenvolvimento.

[0009] • Os distúrbios neurocognitivos são um grupo de transtornos mentais caracterizados por déficits cognitivos essenciais que representam um declínio em relação a um nível cognitivo previamente atingido. As etiologias de distúrbios neurocognitivos incluem distúrbios neurodegenerativos (por exemplo, doença de Alzheimer, degeneração lobar frontotemporal, doença de Parkinson), doenças vasculares, lesões cerebrais traumáticas, abuso de substâncias/medicamentos, infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou doença de príon.

[0010] Os distúrbios neurocognitivos podem ser considerados leves (também chamados de deficiências cognitivas leves) ou maiores (também chamados de demência) de acordo com a gravidade do impacto na autonomia de indivíduos com distúrbios neurocognitivos.

[0011] Os principais distúrbios neurocognitivos levam a incapacidades de gerenciar as atividades diárias, como pagar contas ou manter a conformidade com medicamentos sem assistência. Indivíduos com deficiências neurocognitivas leves permanecem independentes ao custo de um maior esforço e adoção de estratégias compensatórias (DSM-5™).

[0012] Os distúrbios neurocognitivos são causados por muitas doenças, pelo que a sua prevalência na população global é difícil de estimar. No entanto, na população idosa, os principais distúrbios neurocognitivos afetam até 2% da população de 65 anos e 30% aos 85 anos. A prevalência de distúrbios neurocognitivos leves atinge 10% aos 65 e 25% aos 70 anos (DSM- 5TM). A frequência dos distúrbios neurocognitivos está aumentando com o envelhecimento da população global. Tratamentos capazes de melhorar o funcionamento cognitivo são, portanto, altamente aguardados.

[0013] Intervenções farmacológicas estão atualmente aprovadas para limitar ou retardar o declínio cognitivo associado ao Alzheimer e à doença de Parkinson. São inibidores da acetilcolinesterase (por exemplo, donepezil, rivastigmina, galantamina) e um inibidor dos receptores glutamatérgicos N-

metil-D-aspartato (NMDA) (memantina). Exames recentes de sua eficácia e tolerância em pacientes foram realizados em diferentes países (Haute Autorité de Santé, 2016; Instituto Nacional de Excelência em Saúde e Cuidados, 2011; Breton et al., 2015). Esses estudos concluíram que esses medicamentos não têm nenhum interesse terapêutico fraco devido a:

[0014] - A ausência de eficácia a longo prazo em limitar ou retardar a perda cognitiva.

[0015] - Não à eficácia modesta de curto prazo em limitar ou retardar a perda cognitiva.

[0016] - Ineficácia na melhoria das capacidades cognitivas.

[0017] - Um risco não desprezível de efeitos adversos; complicações digestivas, cardiovasculares e neuropsiquiátricas foram relatadas. A frequência desses eventos adversos é alta, levando a até 30% de interrupção do tratamento (Haute Autorité de Santé, 2016).

[0018] Além disso, compostos de ambas as classes farmacológicas foram testados em pacientes com distúrbios de neurodesenvolvimento, mas não mostraram efeitos terapêuticos positivos, por exemplo na síndrome de Down e na síndrome do X frágil (Hanney et al., 2012; Kishnani et al., 2010; NCT01120626; NCT00584948, https://clinicaltrials.gov/).

[0019] Opções farmacológicas eficazes e seguras são, portanto, necessárias para o tratamento de distúrbios cognitivos.

[0020] O uso de compostos (antagonistas ortostéricos) bloqueando a atividade do receptor CB1 por meio da inibição de seu local de ligação ortostérico, o local no qual os endocanabinoides se ligam para ativar o receptor, demonstrou melhorar os déficits cognitivos na síndrome do X frágil (Busquets-Garcia et al., 2013). Um desses compostos, o rimonabanto, foi lançado no mercado com a marca Acomplia®. Infelizmente, os antagonistas ortostéricos disponíveis, como o rimonabanto, inibem toda a atividade do receptor e também podem atuar como agonistas inversos do receptor CB1, ou seja, não apenas inibem a ativação do CB1, mas também induzem respostas de sinalização opostas do receptor. Por causa dessa ação agonista inversa e da inibição total da atividade do receptor, os métodos disponíveis baseados na administração de antagonistas CB1 ortostéricos também apresentam uma série de efeitos adversos graves. Devido a esses efeitos adversos, a comercialização do Acomplia® foi suspensa e o desenvolvimento de outros métodos para inibir o local ortostérico do CB1 interrompido.

[0021] Antagonistas CB1 ortostéricos e em particular Acomplia® têm os seguintes efeitos adversos conhecidos que os tornam ferramentas pouco práticas para o tratamento de distúrbios cognitivos:

[0022] 1. Eles reduzem a ingestão de alimentos, o que indica uma interrupção geral do sistema de recompensa;

[0023] 2. Eles induzem comportamentos relacionados à ansiedade em animais e ansiedade em humanos;

[0024] 3. Eles induzem comportamentos relacionados à depressão em animais e depressão em humanos;

[0025] 4. Eles induzem convulsões e um comprometimento geral comportamental e clínico em estudos de farmacologia e toxicologia de segurança;

[0026] 5. Eles têm efeitos hepatotóxicos;

[0027] 6. Eles têm efeitos inespecíficos, inibindo, por exemplo, analgesia induzida por morfina por meio de uma interação direta com receptores opioides (Seely et al., 2012).

[0028] Esses efeitos são claramente incompatíveis com o uso de antagonistas CB1 como terapia de distúrbios cognitivos, especialmente porque os distúrbios cognitivos afetam populações jovens e idosas que são uma população mais frágil e/ou enfraquecida.

[0029] Foi revelado recentemente que, quando o receptor CB1 é superativado, a concentração do hormônio esteroide pregnenolona aumenta (3000%) no cérebro. A pregnenolona então se liga a um local específico no receptor CB1, distinto daquele ligado pelos agonistas CB1, e atua como um inibidor específico da sinalização endógena do receptor CB1 (eCB1-SSi). Assim, a pregnenolona inibe seletivamente a ativação induzida por CB1 da via MAPK (proteína quinase ativada por mitógeno), mas não a inibição induzida por CB1 da adenilato ciclase. Apesar dessa ação molecular restrita, a pregnenolona inibe a maioria dos efeitos comportamentais induzidos pela superativação do receptor CB1 em roedores (Vallée et al., 2014).

[0030] Infelizmente, a pregnenolona não pode ser usada como tratamento farmacológico porque está pouco disponível, tem meia-vida muito curta e é convertida em esteroides ativos a jusante.

[0031] O documento WO2012/160006 divulga 3β-(benziloxi)-17α- metil-pregn-5-en-20-ona como derivado de pregnenolona que não é metabolizado em esteroides a jusante e seu uso para inibir o receptor CB1.

[0032] O desenvolvimento de um tratamento para distúrbios cognitivos baseado em uma inibição específica da sinalização do receptor CB1 que possa ser usado em humanos apresenta vários desafios. Assim, tal composto deve apresentar concomitantemente todas as seguintes características:

[0033] 1. Deve melhorar o desempenho em diferentes domínios do funcionamento cognitivo, considerando a variabilidade dos sintomas cognitivos em pacientes com distúrbios cognitivos.

[0034] 2. Deve mostrar eficácia em modelos que aproximam os processos cognitivos humanos para alcançar uma tradução melhor.

[0035] 3. Deve melhorar o desempenho cognitivo em várias doenças/condições considerando a heterogeneidade das etiologias dos distúrbios cognitivos.

[0036] 4. Deve ser desprovido dos efeitos adversos conhecidos dos inibidores CB1. Em particular, não deve induzir: a. uma diminuição na ingestão de alimentos; b. um aumento nos comportamentos relacionados à ansiedade e à depressão; c. convulsão e comprometimento dos sinais clínicos relacionados ao sistema nervoso central.

[0037] 5. Não deve modificar a ligação de outros receptores a fim de evitar efeitos fora do alvo ou modificação da atividade de outras drogas terapêuticas como no caso do rimonabanto.

[0038] 6. Não deve ter efeitos comportamentais inespecíficos, incluindo, mas não se limitando a, sedação, excitabilidade, comportamento espontâneo alterado que pode interferir com seus efeitos terapêuticos.

[0039] 7. Deve ter uma margem de segurança aceitável. É geralmente reconhecido que a dose mais alta que não induz nenhum efeito adverso deve ser pelo menos 10 vezes maior do que a dose terapêutica.

[0040] Para nenhum dos inibidores específicos de sinalização e outros antagonistas dos receptores CB1 descritos no conhecimento previamente disponível, todas as características mencionadas acima foram descritas. Tanto quanto sabemos, nenhum composto utilizado no tratamento de distúrbios cognitivos ou, de um modo mais geral, distúrbios comportamentais tem todas estas características. Assim, as três principais classes de psicofármacos, ansiolíticos, antidepressivos e neurolépticos, bem como os medicamentos aprovados para déficits cognitivos associados à doença de Alzheimer, induzem a efeitos adversos comportamentais na faixa das doses terapêuticas. Por exemplo: a. fármacos ansiolíticos induzem sonolência, diminuem o estado de alerta e prejudicam a memória; b. os antidepressivos induzem excitabilidade, insônia e diminuição da libido; c. os neurolépticos induzem perturbações hormonais, sedação, discinesia e movimentos involuntários. d. os inibidores da acetilcolinesterase e a memantina induzem efeitos adversos digestivos, cardiovasculares e neuropsiquiátricos.

[0041] Consequentemente, um composto que apresente todas as características descritas nos pontos 1 a 7 seria uma grande inovação para um medicamento concebido para o tratamento de distúrbios cognitivos mas também uma grande inovação para todo o campo da psiquiatria.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0042] A presente invenção geralmente se refere a um derivado específico da pregnenolona para seu uso no tratamento de um distúrbio cognitivo.

[0043] Mais particularmente, a invenção se refere a um composto de Fórmula (I) Fórmula (I)

[0044] para seu uso no tratamento de distúrbios cognitivos.

[0045] De acordo com a invenção, o tratamento de distúrbios cognitivos pelo composto de Fórmula (I) compreende:

[0046] - A reversão completa ou parcial do comprometimento causado pelo distúrbio cognitivo, incluindo a melhora da função cognitiva.

[0047] - A prevenção de declínio cognitivo adicional.

[0048] - O adiamento ou desaceleração do declínio cognitivo ou maior perda de habilidades cognitivas.

[0049] A presente invenção é dotada das seguintes propriedades:

[0050] 1. Além disso, melhora o desempenho cognitivo em diferentes domínios cognitivos (por exemplo, memória declarativa/relacional, reconhecimento, funções executivas). Portanto, seria capaz de atender aos critérios de eficácia em praticamente todos os perfis de déficits cognitivos.

[0051] 2. Ele melhora o desempenho em testes cognitivos que foram empregados com sucesso para detectar deficiências cognitivas em humanos (em um labirinto radial virtual) e em camundongos (em um labirinto radial) usando procedimentos muito semelhantes.

[0052] 3. Melhora o desempenho cognitivo em diferentes modelos de doenças/patologias (por exemplo, síndrome de Down, síndrome do X frágil,

défices cognitivos associados ao envelhecimento). Portanto, seria capaz de atender a critérios de eficácia em déficits cognitivos, qualquer que seja sua etiologia.

[0053] 4. É desprovido dos efeitos adversos conhecidos dos inibidores CB1. Não induz: a. uma diminuição na ingestão de alimentos e no peso corporal; b. um aumento nos comportamentos relacionados à ansiedade e à depressão, tanto em condições saudáveis quanto em condições patológicas; c. neurotoxicidade, convulsão e comprometimento dos sinais clínicos relacionados ao sistema nervoso central. d. hepatotoxicidade e genotoxicidade.

[0054] 5. Não modifica a ligação de um grande painel de receptores (85), incluindo os receptores opioides.

[0055] 6. Não tem efeitos comportamentais inespecíficos, incluindo, mas não se limitando a, sedação, excitabilidade, comportamento espontâneo alterado que pode interferir com seus efeitos terapêuticos.

[0056] 7. Possui uma margem de segurança muito grande (>3.500).

[0057] Essa divulgação também se refere a um método para tratar um distúrbio cognitivo, conforme descrito neste documento, por meio da administração a um indivíduo em necessidade de uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula I. Em alguns exemplos, o indivíduo em necessidade de terapia possui X Frágil, síndrome de Down ou declínio cognitivo relacionado à idade.

[0058] Esta divulgação também se refere à composição farmacêutica para o tratamento de um distúrbio cognitivo, conforme descrito neste documento, compreendendo, como ingrediente ativo, um composto de Fórmula I. Em alguns exemplos, a composição farmacêutica é para o tratamento de um indivíduo com X Frágil, síndrome de Down ou declínio cognitivo relacionado à idade.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0059] Figura 1: Fluxograma de composto de síntese de fórmula (I)

(3Bn17MeP) seguindo a Via A.

[0060] Figura 2: Fluxograma de composto de síntese de fórmula (I) (3Bn17MeP) seguindo a Via B.

[0061] Figura 3: Fluxograma de composto de síntese de fórmula (I) (3Bn17MeP) seguindo a Via C.

[0062] Figura 4: Fluxograma de composto de síntese de fórmula (I) (3Bn17MeP) seguindo a Via D.

[0063] Figura 5: Efeitos in vitro de 3Bn17MeP na inibição da respiração celular, no aumento da fosforilação de quinases ativadas por mitógeno (p-MAPK) e na diminuição do monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) induzido pela estimulação de receptores CB1 com ∆ 9- tetrahidrocanabinol (THC).

[0064] Figura 5A: Efeito de 3Bn17MeP (1; 2,5; 5; 50 e 100 nM) na inibição induzida por THC (1 µM) da respiração celular em HEK293 transfectada com o receptor CB1 humano de tipo selvagem. Os dados são expressos como porcentagem do efeito de THC (a linha pontilhada em 0% representa o efeito do veículo de THC; a linha pontilhada em 100% representa o efeito de THC na ausência de 3Bn17MeP). 3Bn17MeP bloqueia de forma dependente da dose a inibição da respiração celular induzida por THC com efeitos significativos de 2,5 nM. p <0,001, THC em comparação com o veículo de THC na ausência de 3Bn17MeP, teste de Tukey. p <0,001, 3Bn17MeP (2,5; 5; 50 e 100 nM) em comparação com seu veículo na presença de THC, teste de Tukey.

[0065] Figura 5B: Efeito de 3Bn17MeP (100 nM) na inibição induzida por THC (1 µM) da respiração celular em HEK293 transfectada com o receptor CB1 humano de tipo selvagem (HEK293-hCB1-WT) ou com o receptor CB1 humano mutante (HEK293-hCB1-Mut) em que o local de ligação da pregnenolona foi invalidado (hCB1p.E1.49G; Vallée et al., 2014). 3Bn17MeP inibe a diminuição induzida por THC (1 µM) na respiração celular em HEK293 transfectada com o hCB1-WT (barra preenchida em branco), enquanto

3Bn17MeP não inibe este efeito de THC em HEK293 transfectada com o hCB1-Mut. p <0,01, hCB1-WT em comparação com hCB1-Mut na presença de 3Bn17MeP e THC, teste t não pareado).

[0066] Figura 5C: Efeito de 3Bn17MeP (0,1; 0,3; 1; 3 e 9 µM) no aumento induzido por THC (10 µM) na fosforilação de MAPK (p-Erk1/2MAPK). 3Bn17MeP inibe o aumento induzido por THC na fosforilação de MAPK.

[0067] Figura 5D: Efeito de 3Bn17MeP na diminuição induzida por THC dos níveis de cAMP em células CHO estavelmente transfectadas com hCB1. 3Bn17MeP não modificou a diminuição de cAMP induzida por THC. NT, não tratado com THC.

[0068] Figura 6: Efeito do 3Bn17MeP no comprometimento do reconhecimento de objetos em um modelo pré-clínico da síndrome de Down.

[0069] Figura 6A: 3Bn17MeP restaura o reconhecimento de objeto sequencial de curto prazo de camundongos Ts65Dn após administração oral crônica (0,6 µg/ml) em água potável. **p <0,01; ***p <0,001, 1ª apresentação versus 2ª apresentação do mesmo objeto após um atraso de 5 min e ##p <0,01; ### p <0,001, após um atraso de 35 min (teste de Fisher).

[0070] Figura 6B: 3Bn17MeP restaura o reconhecimento de objeto de longo prazo de camundongos Ts65Dn após repetidas administrações via oral em óleo de milho (15 µg/kg; b.i.d). ***p <0,001, WT versus Ts65Dn ### administrado com o veículo de 3Bn17MeP (0 µg/kg) e p <0,001, veículo de 3Bn17MeP (0 µg /kg) versus 3Bn17MeP (15 µg/kg) em Ts65Dn (Teste de Tukey). Nenhuma diferença significativa entre WT e Ts65Dn administrado com 3Bn17MeP (15 µg/kg, teste de Tukey).

[0071] Figura 7: Efeito do 3Bn17MeP no comprometimento da memória declarativa/relacional em um modelo pré-clínico da síndrome de Down. A administração oral crônica de 3Bn17MeP em água potável (0,6 µg/ml) em camundongos Ts65Dn restaura o desempenho da memória (conforme medido pela porcentagem de resposta correta) ao nível de camundongos WT. A linha pontilhada descreve o nível de chance. *p <0,05, WT versus Ts65Dn administrado com o veículo de 3Bn17MeP (0 µg/ml; teste t não pareado). #p <0,05, veículo de 3Bn17MeP (0 µg/ml) versus 3Bn17MeP (0,6 µg/ml) em Ts65Dn (teste t não pareado). Nenhum efeito significativo entre WT e Ts65Dn administrado com 3Bn17MeP (0,6 µg/ml; teste t não pareado).

[0072] Figura 8: Efeito do 3Bn17MeP no comprometimento da memória de trabalho em um modelo pré-clínico da síndrome de Down. A administração oral crônica de 3Bn17MeP em água potável (0,06 µg/ml) em camundongos Ts65Dn restaura o desempenho da memória (conforme medido pela porcentagem de resposta correta) no nível de camundongos WT. ***p <0,001, WT versus Ts65Dn administrado com o veículo de 3Bn17MeP (VEH; ## teste de Tukey). p <0,01, VEH versus 3Bn17MeP (0,06 µg/ml) em Ts65Dn (teste de Tukey). Nenhum efeito significativo entre WT e Ts65Dn administrado com 3Bn17MeP (0,06 µg/ml; teste de Tukey).

[0073] Figura 9: Efeito de 3Bn17MeP na deficiência no reconhecimento de objetos em um modelo pré-clínico da síndrome do X Frágil. As administrações repetidas por via oral de 3Bn17MeP em óleo de milho (15 µg/kg; b.i.d) corrigem o índice de discriminação diminuído de camundongos fmr1-KO de WT. **p <0,01, WT versus fmr1-KO administrado com o veículo de 3Bn17MeP (0 µg/kg; teste de Tukey). #p <0,05, veículo de 3Bn17MeP (0 µg/kg) versus 3Bn17MeP (15 µg/kg) em fmr1-KO (teste de Tukey). Nenhum efeito significativo entre WT e fmr1-KO administrado com 3Bn17MeP (15 µg/kg; teste de Tukey).

[0074] Figura 10: Efeito de 3Bn17MeP no comprometimento da memória declarativa/relacional em um modelo pré-clínico de comprometimentos cognitivos relacionados à idade. A administração oral crônica de 3Bn17MeP na água potável (0,6 µg/ml) melhora o desempenho da memória de camundongos idosos (conforme medido pela porcentagem de resposta correta). A linha pontilhada descreve o nível de chance. *p <0,05, veículo de 3Bn17MeP (0 µg/ml) versus 3Bn17MeP (0,6 µg/ml; teste t não pareado).

[0075] Figura 11: Efeitos de administrações repetidas de 3Bn17MeP e de rimonabanto na ingestão de alimentos e peso corporal em camundongos do tipo selvagem.

[0076] Figura 11A: Efeitos da administração aguda de 3Bn17MeP (0; 0,05; 5; 15 e 30 mg/kg; por via oral em óleo de milho) na ingestão alimentar cumulativa de ração padrão medida 3 e 13 horas após a luz apagada. 3Bn17MeP não tem efeito na ingestão de alimentos.

[0077] Figura 11B: Efeitos da administração aguda de rimonabanto (0; 10 mg/kg; ip) na ingestão alimentar cumulativa de ração padrão medida 3 e 13 horas após o apagamento. Rimonabant diminui a ingestão de alimentos. **, p <0,01; rimonabanto vs veículo (0 mg/kg; ANOVA de dois fatores, efeito principal do tratamento).

[0078] Figura 11C: Efeitos de administrações repetidas (39 dias, uma vez ao dia) de 3Bn17MeP (0, 0,05; 5; 15 e 30 mg/kg, per os em óleo de milho) no peso corporal de camundongos alimentados com ração padrão. 3Bn17MeP não tem efeito no peso corporal.

[0079] Figura 11D: Efeitos de administrações repetidas (39 dias, uma vez ao dia) de rimonabanto (0 e 10 mg/kg, ip) no peso corporal de camundongos alimentados com ração padrão. Rimonabanto diminui o peso corporal.

[0080] Figura 12: Efeitos de 3Bn17MeP e de rimonabanto em comportamentos relacionados à ansiedade e depressão em camundongos do tipo selvagem.

[0081] Figura 12A: Efeitos da administração per os aguda de 3Bn17MeP em óleo de milho (30 mg/kg) ou veículo (0 mg/kg) em comportamentos semelhantes à ansiedade, medidos pela porcentagem de tempo gasto e de visitas nos braços abertos do labirinto em cruz elevado. 3Bn17MeP não tem efeito nos comportamentos relacionados à ansiedade.

[0082] Figura 12B: Efeitos da administração intraperitoneal aguda de rimonabanto (10 mg/kg) ou veículo (0 mg/kg) em comportamentos de ansiedade, medidos pela porcentagem de tempo gasto e de visitas nos braços abertos do labirinto em cruz elevado. Rimonabanto diminui o tempo gasto e o número de visitas de braços abertos. ***, p <0,001; **, p <0,01; rimonabanto versus veículo (0 mg/kg) (teste t não pareado).

[0083] Figura 12C: Efeitos de administrações repetidas (28 dias, uma vez por dia) de 3Bn17MeP (0, 0,05; 5; 15 e 30 mg/kg, por via oral em óleo de milho) em comportamentos relacionados à depressão, conforme medido no teste de preferência de sacarose. 3Bn17MeP não tem efeito sobre a ingestão de sacarose.

[0084] Figura 12D: Efeitos de administrações repetidas (28 dias, uma vez ao dia) de rimonabanto (0 e 10 mg/kg; ip) em comportamentos relacionados à depressão, conforme medido no teste de preferência de sacarose. Rimonabanto diminui a ingestão de sacarose. *p <0,05, rimonabanto versus veículo (0 mg/kg; teste t não pareado).

[0085] Figura 13: Avaliação da neurotoxicidade e genotoxicidade do 3Bn17MeP e do rimonabanto in vitro.

[0086] Figura 13A: Efeito de 3Bn17MeP, rimonabanto (0; 10; 30 e 100 µM) e da estaurosporina de controle positivo de referência (100 nM) na toxicidade de culturas primárias de camundongos de neurônios corticais. O 3Bn17MeP não tem efeito tóxico nessas condições, ao passo que o rimonabanto mostra efeito tóxico dependente da dose nessas condições. ***, p <0,001; *, p <0,05, rimonabanto versus veículo (0 µM) (teste de Holm-Sidak).

[0087] Figura 13B: Efeito de 3Bn17MeP (0; 0,1; 0,3; 1; 3; 10; 30 e 100 µM), rimonabanto (0; 0,1; 0,3; 1 e 100 µM) e do etoposídeo de controle positivo de referência (3 µM) na fosforilação de Histona H2AX em células HeLa. 3Bn17MeP não tem efeito em células H2AX fosforiladas, enquanto rimonabanto aumentou o número de células H2AX fosforiladas a 100 µM. ***, p <0,001, rimonabanto versus veículo (0 µM) (teste de Holm-Sidak).

[0088] Figura 14: Avaliação da hepatotoxicidade do 3Bn17MeP e do rimonabanto in vitro.

[0089] Figura 14A: Efeito de 3Bn17MeP, rimonabanto (0; 0,1; 0,3; 1; 3; 10; 30 e 100 µM) e do paracetamol de controle positivo de referência (APAP, 50 mM) na sobrevivência de culturas primárias de hepatócitos de camundongo. 3Bn17MeP não teve efeito hepatotóxico, enquanto o rimonabanto aumentou a morte de células hepatocitárias de 3 µM. ***, p<0,001, rimonabanto versus veículo (0 µM) (teste de Holm-Sidak).

[0090] Figura 14B: Efeito de 3Bn17MeP, rimonabanto (0; 0,1; 0,3; 1; 3; 10; 30 e 100 µM) e do controle positivo de referência ciclosporina A (10 µM) na inibição de canalículos biliares em culturas primárias de hepatócitos de camundongo. 3Bn17MeP não teve efeito nos canalículos biliares, enquanto o rimonabanto diminuiu o número de canalículos de 1 µM. ***, p<0,001; **, p<0,01, rimonabanto versus veículo (0 µM) (ANOVA de 1 via seguida de teste post hoc de Bonferroni).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0091] A presente invenção se refere em geral a um composto de Fórmula (I): Fórmula (I)

[0092] para uso no tratamento de um distúrbio cognitivo.

[0093] O composto de Fórmula (I) corrige as alterações cognitivas observadas em distúrbios cognitivos. Em todas as funções cognitivas e modelos de doença avaliados, a administração de 3β-(benziloxi)-17α-metil- pregn-5-en-20-ona (3Bn17MeP) restaura totalmente o desempenho cognitivo nos níveis de controles saudáveis.

[0094] 3Bn17MeP mostra eficácia em vários domínios cognitivos,

incluindo memória de longo prazo, reconhecimento e funções executivas. A presente invenção se beneficia de um amplo espectro de ações na função cognitiva. Portanto, 3Bn17MeP é provavelmente um potencializador cognitivo global.

[0095] O composto da presente invenção, 3Bn17MeP, não bloqueia toda a atividade do receptor-alvo, mas apenas parte de sua atividade. O receptor-alvo específico do composto da presente invenção é o receptor CB1.

[0096] O composto de Fórmula (I) é pensado para reproduzir os efeitos de um mecanismo cerebral recentemente revelado que fornece um feedback negativo endógeno, regulando uma sobre ativação do receptor CB1 (Vallée et al., 2014). É importante observar que esse mecanismo regulatório é acionado apenas quando CB1 está superativado, o que é provável que seja o caso no distúrbio cognitivo, mas não quando a ativação do receptor está dentro de uma faixa mais fisiológica.

[0097] Isso pode explicar porque o composto da presente invenção é extremamente potente na correção de déficits cognitivos e, portanto, eficaz no tratamento de distúrbios cognitivos. Além disso, devido ao seu mecanismo de ação específico de sinalização, o composto da presente invenção não tem efeito sobre o comportamento per se em indivíduos saudáveis nos quais a sinalização CB1 se encontra na faixa fisiológica.

[0098] O mecanismo de ação do composto da presente invenção é, neste aspecto, muito diferente daquele dos antagonistas ortostéricos CB1 que, ao bloquearem a ligação dos agonistas endógenos e exógenos do receptor CB1, induzem uma inibição completa de toda a atividade CB1 e interrompem o comportamento por si só. Além disso, o mecanismo de ação dos antagonistas não existe fisiologicamente, ou seja, até onde sabemos, não existem compostos endógenos que, como os antagonistas, bloqueiem a ligação de um agonista CB1 ao receptor. Devido à natureza artificial desse mecanismo de ação, esses antagonistas, além de corrigirem uma superativação de um receptor-alvo, geralmente reduzem sua atividade abaixo dos níveis basais, prejudicando a fisiologia e gerando efeitos colaterais.

[0099] O diferente mecanismo de ação entre o composto do presente invenção e antagonistas ortostéricos, como o rimonabanto, explica por que ambos os fármacos podem corrigir distúrbios cognitivos, mas não compartilham outros efeitos comportamentais.

[0100] Portanto, o composto da presente invenção não é um antagonista ortostérico CB1 e, como tal, não bloqueia todos os efeitos celulares induzidos pela ativação do receptor CB1, como faz o antagonista CB1 ortostérico rimonabanto.

[0101] Ainda vantajosamente e mais geralmente nenhum efeito colateral foi observado com o composto da presente invenção.

[0102] A ausência de efeito adverso e, em muitos casos, a ausência de efeito do composto da presente invenção em controles saudáveis se deve provavelmente à estrutura e mecanismo de ação específicos do composto da presente invenção.

[0103] Os inventores demonstram que o composto da invenção possui características concomitantes que o tornam um instrumento ideal e único para o tratamento de distúrbios cognitivos. Essas características incluem, mas não estão limitadas a:

[0104] 1. O composto da presente invenção tem um mecanismo de ação único criado como um mecanismo cerebral endógeno para superar uma sobreativação do receptor CB1, mas parece não ter efeito sobre a atividade basal do receptor. A interrupção da atividade basal do sistema alvo é frequentemente responsável por alguns dos efeitos adversos dos antagonistas. Além disso, o composto da presente invenção é muito seletivo e não interage com nenhum dos 85 receptores testados. Os efeitos fora do alvo costumam ser responsáveis por alguns dos efeitos colaterais de novas entidades químicas. A atividade celular do receptor CB1 é então inibida de maneira seletiva e específica para sinalização.

[0105] 2. O composto da presente invenção apresenta in vivo uma potência muito elevada na correção de um amplo espectro de deficiências cognitivas, incluindo a memória de longo prazo, o reconhecimento e as funções executivas.

[0106] 3. O composto da presente invenção mostra eficácia in vivo em modelos de diferentes distúrbios cognitivos incluindo síndrome de Down, síndrome do X Frágil e declínio cognitivo relacionado à idade.

[0107] 4. O composto da presente invenção não tem nenhum dos efeitos colaterais dos antagonistas CB1 ortostéricos, incluindo, mas não se limitando a: a. a diminuição na ingestão de alimentos; b. o aumento dos comportamentos relacionados à ansiedade e à depressão; c. neurotoxicidade, indução de convulsão clônica e sinal clínico relacionado ao comprometimento do sistema nervoso central. d. hepatotoxicidade e genotoxicidade.

[0108] 5. O composto da presente invenção não causa efeitos comportamentais inespecíficos mesmo em doses milhares de vezes superiores à dose efetiva para a melhoria das funções cognitivas. Esses efeitos incluem, mas não estão limitados a mudanças em comportamentos espontâneos, sedação, excitabilidade.

[0109] 6. O composto da presente invenção não tem efeitos adversos ou tóxicos, in vitro e in vivo, em doses milhares de vezes superiores à dose efetiva para a melhora das funções cognitivas. Consequentemente, o composto da presente invenção apresenta um alto índice de segurança (>3.500).

[0110] De acordo com a presente invenção, “distúrbios cognitivos” podem ser entendidos como distúrbios intelectuais, deficiências cognitivas ou intelectuais, dificuldades cognitivas ou intelectuais, retardo mental ou declínio cognitivo e incluem todas as doenças/condições que podem estar associadas a distúrbios cognitivos.

[0111] Cognição ou função cognitiva pode ser definida como todas as atividades mentais dedicadas ao processamento de informações. Eles incluem funções elementares, como percepção e habilidades motoras, bem como processos de alta ordem, como atenção, aprendizagem e memória, raciocínio ou funções executivas. Déficits na cognição estão relacionados ao comprometimento em qualquer domínio cognitivo, incluindo:

[0112] - Atenção complexa: atenção sustentada, atenção dividida, atenção seletiva e velocidade de processamento. Por exemplo, déficits de atenção complexos podem levar a dificuldades em manter as informações na mente no ambiente com distratores ou cometer erros em tarefas rotineiras.

[0113] - Funções executivas: planejamento, tomada de decisão, memória de trabalho, resposta a feedback/correção de erros, hábitos/inibição de superação e flexibilidade mental. Por exemplo, déficits de funções executivas podem levar a dificuldades na conclusão de projetos em vários estágios, no planejamento de atividades da vida diária ou no acompanhamento de conversas.

[0114] - Aprendizagem e memória: memórias imediatas e recentes, incluindo rememoração e reconhecimento livres ou ordenados, memórias de longo a muito longo prazo e aprendizagem implícita. Por exemplo, as consequências no aprendizado e no comprometimento da memória podem ser a perda de controle do pagamento de contas ou a repetição de uma conversa.

[0115] - Linguagem: linguagem expressiva e compreensão. Por exemplo, o déficit de linguagem pode estar associado ao uso de termos gerais em vez de termos específicos, causando erros gramaticais. Formas graves de déficits de linguagem levam à ecolalia ou mutismo.

[0116] - Habilidades perceptivo-motoras: desenho, práxis (aprendizagem de sequências motoras) e gnose (por exemplo, reconhecimento de rostos e cores): déficits perceptivo-motores podem levar a dificuldades em realizar atividades previamente familiares, como usar ferramentas ou dirigir.

[0117] - Reconhecimento social: capacidade de reconhecer emoções expressas por outras pessoas e de considerar pensamentos e intenções expressas por outras pessoas em situações peculiares. A deficiência de reconhecimento social pode levar, por exemplo, a diminuir a empatia, a expressar comportamentos ou discursos que estão fora dos limites sociais aceitos (por exemplo, roupas inadequadas) ou a manter conversas.

[0118] No presente caso, um distúrbio cognitivo pode se referir a uma condição patológica em que os distúrbios cognitivos são maiores do que o nível cognitivo padrão para indivíduos da mesma idade. Além disso, distúrbios cognitivos podem ser entendidos como declínios cognitivos associados ao envelhecimento saudável (denominado declínio cognitivo relacionado à idade).

[0119] Para exemplificar os principais distúrbios cognitivos, os inventores utilizam aqui os critérios do DSM-5™ que se referem a distúrbios do neurodesenvolvimento e distúrbios neurocognitivos. No entanto, essa não é uma descrição exclusiva de distúrbios cognitivos, mas engloba distúrbios semelhantes descritos em outros manuais de diagnóstico incluindo, não se limitando à Classificação CID-10 de Transtornos Mentais e Comportamentais e, mais geralmente, todos os transtornos principalmente associados a um comprometimento das habilidades cognitivas.

[0120] A esse respeito, distúrbios cognitivos abrangem distúrbios de neurodesenvolvimento e distúrbios neurocognitivos.

[0121] Os distúrbios do neurodesenvolvimento referem-se a distúrbios que se manifestam no início do desenvolvimento, geralmente antes de a criança entrar na escola primária. Eles são caracterizados por anormalidades de desenvolvimento que produzem prejuízos no funcionamento conceitual, prático e social. Consequentemente, o indivíduo não consegue atender aos padrões de desenvolvimento intelectual, desempenho acadêmico, independência pessoal e/ou participação social correspondentes à idade. A gama de déficits de desenvolvimento varia de limitações muito específicas de aprendizagem ou de funções executivas a deficiências globais de habilidades sociais ou inteligência.

[0122] Os distúrbios do neurodesenvolvimento podem estar associados a uma causa específica (por exemplo, uma condição genética conhecida ou fator ambiental) ou podem não ser especificados quando a etiologia é desconhecida. Exemplos de especificadores incluem doenças genéticas como, mas não se limitando a, síndrome de Down, síndrome do X frágil, esclerose tuberosa, síndrome de Rett, síndrome de William, espinha bífida. As condições médicas incluem patologias como epilepsia, doenças metabólicas; anomalias de desenvolvimento (por exemplo, malformações cerebrais), doenças maternas (por exemplo, doença placentária) ou fatores ambientais perinatais (por exemplo, exposição fetal a álcool, toxinas e teratógenos).

[0123] Os distúrbios do neurodesenvolvimento incluem sete categorias de distúrbios que são especificados a seguir:

[0124] 1. Deficiências intelectuais são caracterizadas por déficits nas habilidades mentais gerais, como raciocínio, resolução de problemas, planejamento, pensamento abstrato, julgamento, aprendizagem acadêmica e aprendizagem com a experiência. O atraso de desenvolvimento global é diagnosticado para indivíduos que são incapazes de se submeter a avaliações sistemáticas de funcionamento intelectual, incluindo crianças que são muito jovens para participar de testes padronizados.

[0125] 2. Distúrbios de comunicação incluem déficits de linguagem (ou seja, uso de um sistema convencional de símbolos para comunicação), fala (ou seja, expressão de pensamentos por sons articulados), bem como comunicação verbal e não verbal. Esta categoria inclui transtorno de linguagem, transtorno de sons da fala, transtorno de fluência de início na infância (gagueira), transtorno de comunicação social (pragmático) e transtorno de comunicação não especificado.

[0126] 3. Transtorno do espectro do autismo é caracterizado por déficits persistentes na comunicação e interação social, interesses restritos e comportamentos repetitivos. O transtorno do espectro do autismo também se refere como transtorno autista, transtorno de Asperger ou transtorno invasivo do desenvolvimento.

[0127] 4. Transtorno de déficit de atenção/hiperatividade (ADHD) está associado a acentuada desatenção e/ou hiperatividade e impulsividade inconsistente com o nível de desenvolvimento esperado e que impacta diretamente nas atividades sociais e acadêmicas/ocupacionais. Os sintomas não são apenas uma manifestação de comportamento de oposição, desafio, hostilidade ou falha em compreender tarefas ou instruções.

[0128] 5. Transtorno de aprendizagem específico é caracterizado por déficits específicos na capacidade de perceber ou processar informações com eficiência e precisão. Relaciona-se com dificuldades persistentes na aprendizagem e no uso de habilidades acadêmicas em um ou mais domínios entre leitura (por exemplo, dislexia), expressão escrita (por exemplo, disgrafia) e matemática (por exemplo, discalculia).

[0129] 6. Distúrbios motores do neurodesenvolvimento são caracterizados por movimentos anormais involuntários ou incontroláveis do corpo. Esses distúrbios podem causar falta de movimentos pretendidos ou excesso de movimentos involuntários. Mais especificamente, os distúrbios motores podem ser distúrbios do desenvolvimento da coordenação (déficits na aquisição e execução de habilidades motoras coordenadas), distúrbio do movimento estereotípico (comportamentos motores repetitivos, aparentemente direcionados e aparentemente sem propósito) e distúrbios de tiques (movimentos motores estereotipados ou vocalizações repentinas, rápido, recorrente e não rítmico). A duração, a etiologia presumida e a apresentação clínica definem o tique nervoso específico que é diagnosticado (por exemplo, o distúrbio de Tourette).

[0130] 7. Outros distúrbios do neurodesenvolvimento se aplicam quando os sintomas são característicos de um distúrbio do neurodesenvolvimento, mas não atendem a todos os critérios para qualquer um dos distúrbios da classe diagnóstica distúrbio do neurodesenvolvimento.

[0131] Digno de nota, os distúrbios do neurodesenvolvimento frequentemente coexistem; por exemplo, indivíduos com transtorno do espectro do autismo costumam ter deficiência intelectual, e muitas crianças com TDAH também têm um transtorno de aprendizagem específico.

[0132] Os distúrbios do neurodesenvolvimento devem ser diagnosticados por um clínico com base nos critérios de diagnóstico do DSM- 5™ ou em qualquer outra ferramenta de diagnóstico de saúde mental. Os testes usados para avaliar a natureza e o grau das deficiências podem ser selecionados entre os que avaliam o funcionamento intelectual e/ou comportamentos adaptativos. Os testes relevantes devem ser selecionados de acordo com a idade do paciente e a natureza e gravidade das deficiências suspeitas. Exemplos não exaustivos de escalas que avaliam funções globais ou específicas e que são validados incluindo para populações pediátricas são especificados abaixo.

[0133] • Escalas que avaliam a saúde cognitiva global (Hessl et al., 2016; Esbensen et al., 2017):

[0134] - As baterias de testes CANTAB

[0135] - Bateria Cognitiva do NIH Toolbox para Deficiências Intelectuais

[0136] • Escalas que avaliam o funcionamento independente e comportamentos adaptativos (Berry-Kravis et al., 2013; Esbensen et al., 2017):

[0137] - Sistema de Avaliação Comportamental Adaptativa– Terceira edição (ABAS-III) ou mais recente

[0138] - Lista de verificação de comportamento aberrante (ABC)

[0139] - Escalas de comportamento adaptativo de Vineland (VABS)

[0140] - Escalas de classificação de Connors

[0141] • Escalas que avaliam a qualidade de vida do paciente

(Varni et al., 2001; Burckhardt e Anderson, 2003):

[0142] - Inventário de Qualidade de Vida Pediátrico (PedsQL)

[0143] - A Qualidade da Escala de Vida (QOLS)

[0144] • Escalas que avaliam funções específicas

[0145] - Funções executivas: Inventário de classificação de comportamento de inventários de funções executivas (BRIEF), Wisconsin Card Sorting Test (WCST), Labirinto radial virtual (procedimento de memória de trabalho) (Marighetto et al., 2012)

[0146] - Aprendizagem e memória: labirinto radial virtual (procedimento de memória declarativa/relacional) (Sellami et al., 2017)

[0147] - Cognição social: Escala de Resposta Social

[0148] - Linguagem: Teste de Nomeação Boston (BNT), Teste Token

[0149] - Qualidade do sono: Índice de qualidade do sono de Pittsburgh (PSQI)

[0150] Os distúrbios neurocognitivos se referem a perturbações mentais caracterizadas por défices clínicos primários na função cognitiva. Esses déficits devem ser adquiridos em vez de desenvolvimentais, representando um declínio de um nível cognitivo previamente alcançado. Os déficits cognitivos associados a distúrbios neurocognitivos devem impactar nas atividades da vida cotidiana do indivíduo e podem levar à perda de autonomia. Os distúrbios neurocognitivos podem afetar um ou mais domínios cognitivos entre atenção complexa, funções executivas, aprendizagem e memória, linguagem, funções perceptivas motoras/viso-espaciais e cognição social.

[0151] Os distúrbios neurocognitivos podem ser causados por diferentes patologias, incluindo, mas não se limitando a doenças neurodegenerativas (por exemplo, doença de Alzheimer, degeneração lobar frontotemporal, demência por corpos de Lewy, doença de Parkinson ou doença de Huntington), doença vascular, lesão cerebral traumática, uso de substância/medicamento, infecção pelo vírus da imunodeficiência humana

(HIV), doença de príon.

[0152] Os distúrbios neurocognitivos são categorizados como a seguir:

[0153] 1. Delírio: se refere a distúrbios na cognição que se desenvolvem em um curto período de tempo (horas). Delírio é uma consequência direta de outra condição médica ou de intoxicação ou abstinência de substância (por exemplo, uma droga de abuso, um medicamento, uma toxina). O delírio pode durar de algumas horas a vários meses.

[0154] 2. Distúrbios neurocognitivos maiores e leves: se referem a um declínio cognitivo (em um ou mais domínios cognitivos) que interfere na independência nas atividades da vida cotidiana. Os principais distúrbios neurocognitivos (também designados por demência) são caracterizados por uma perda significativa de autonomia. Normalmente, os indivíduos requerem assistência, no mínimo, para realizar tarefas complexas, como gerenciamento de medicamentos ou pagamento de contas. Os distúrbios neurocognitivos leves (também chamados de comprometimento cognitivo leve) são caracterizados por um declínio cognitivo mais fraco do que os distúrbios neurocognitivos maiores. Os distúrbios neurocognitivos leves não impedem a autonomia do indivíduo, mas realizar tarefas complexas da vida diária requer maior esforço ou estratégias de compensação.

[0155] Além disso, o distúrbio neurocognitivo maior leve ou não especificado pode ser diagnosticado quando o paciente manifesta sintomas de déficits cognitivos que não podem ser associados a uma etiologia precisa.

[0156] O diagnóstico de distúrbios neurocognitivos deve ser realizado pelo médico por meio de avaliações subjetivas e/ou objetivas da função cognitiva. A avaliação cognitiva subjetiva consiste em obter informações do paciente e/ou cuidadores sobre as alterações no funcionamento cognitivo que se manifestam nas atividades cotidianas (por exemplo, administração de finanças e medicamentos).

[0157] A avaliação objetiva deve ser realizada por meio de um ou mais testes padronizados com o objetivo de avaliar as funções cognitivas. Várias escalas estão disponíveis (Sheehan, 2012). Alguns são dedicados ao inventário de atividades de vida diária, como o Questionário de Atividades Funcionais, ou de qualidade de vida, como a Escala de Qualidade de Vida (QOLS). Outros avaliam funções cognitivas específicas ou o funcionamento cognitivo global. Exemplos não exaustivos de testes cognitivos globais são o Miniexame do Estado Mental, o Teste Curto de Status Mental, a Avaliação Cognitiva de Montreal, os testes Mini-Cog, a série de testes CANTAB, Bateria Repetível para Avaliação do Status Neuropsicológico (RBANS) e as baterias de cognição do NIH Toolbox.

[0158] Além disso, os procedimentos do labirinto radial virtual desenvolvidos por A. Marighetto e colegas são capazes de detectar déficits de memória de trabalho sutis e de memória declarativa/relacional associados ao envelhecimento normal e patológico (Etchamendy et al., 2012; Marighetto et al., 2012; Sellami et al., 2017). Estes procedimentos de labirinto radial possuem equivalentes correspondentes em roedores, permitindo melhorar a tradução de candidatos terapêuticos para o tratamento de distúrbios cognitivos de animais para pacientes humanos.

[0159] Assim, a presente invenção se refere a um composto de Fórmula (I): Fórmula (I)

[0160] para uso na prevenção ou tratamento de um distúrbio cognitivo selecionado entre distúrbios do neurodesenvolvimento, distúrbios neurocognitivos e declínio cognitivo relacionado à idade. A administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de composto de Fórmula (I) reduz, anula, estabiliza (isto é, evita ou limita o agravamento de) o distúrbio cognitivo ou deficiência. Assim, um indivíduo tratado com um regime de tratamento eficaz exibe uma melhora após exame clínico subjetivo ou em um ou vários parâmetros dos testes neuropsicológicos ou das escalas de qualidade de vida relevantes para a patologia, idade, idioma e cultura do indivíduo. Em alternativa, o tratamento de um indivíduo com um regime eficaz de composto de Fórmula (I) preserva a função cognitiva de modo a prevenir ou abrandar o declínio na primeira apresentação ou diagnóstico, em comparação com o declínio esperado na ausência de tratamento.

[0161] Os termos “3β-benziloxi, 17metil-pregn-5-en-20-ona” ou “C29H40O2” ou “3Bn17MeP” ou “1-((3S, 8R, 9S, 10R, 13S, 14S, 17S)-3- (benziloxi)-10,13,17-trimetil-2,3,4,7,8,9,10, 11,12,13,14,15,16,17-tetradecaidro- 1H-ciclopenta[a]fenantreno-17-il)etano-1-ona” designa o derivado de pregnenolona de acordo com a presente invenção que tem a seguinte fórmula (I): Fórmula (I) Processo para a fabricação

[0162] A presente invenção também se refere ao processo de fabricação do composto da invenção. O composto de Fórmula (I) pode ser obtido por diferentes vias sintéticas como podemos ver a seguir.

[0163] Primeiro, o composto 3β-benziloxi-17-metil-pregn-5-en- 20-ona pode ser obtido em 2 etapas químicas a partir da pregnenolona (Via A).

Pregnenolona

[0164] - A introdução do grupo metila na posição C17 é realizada pela reação entre um intermediário de acetato de enol, permitido pela reação de pregnenolona e anidrido acético, e um reagente de Grignard para obtenção do composto de fórmula (II) Fórmula (II)

[0165] Então, o grupo hidroxila em C3 é benzilado com reagente triflato de 2-benziloxi-1-metilpiridínio para se obter 3β-benziloxi-17metil- pregn-5-en-20-ona de fórmula (I).

Fórmula (I)

[0166] Como podemos ver nas Figuras 1 a 4 e conforme descrito abaixo, outras vias podem ser usadas para fornecer 3β-benziloxi-17metil- pregn-5-en-20-ona.

[0167] Por exemplo, a alquilação de último estágio do grupo hidroxila na posição C3 pode ser realizada em condições básicas (NaH, t- BuOK ou outras bases) na presença de cloreto de benzila ou brometo de benzila (via B). A alquilação em meio ácido usando tricloroacetimidato na presença de quantidade catalítica de um ácido orgânico também pode ser realizada.

[0168] Outra forma (via C) pode começar com a proteção da função cetona da pregnenolona por meio de um acetal para dar composto da fórmula (III).

Fórmula (III)

[0169] O álcool livre é então alquilado por um grupo benzila (em condições ácidas ou básicas ou via triflato de 2-benziloxi-1-metilpiridínio como descrito acima) para dar o composto de Fórmula (IV).

Fórmula (IV)

[0170] O acetal é hidrolisado em condições ácidas para dar composto de fórmula (V).

Fórmula (V)

[0171] A metilação direta usando iodeto de metila na presença de hidreto de sódio dá 3β-benziloxi, 17metil-pregn-5-en-20-ona de fórmula (I).

Fórmula (I)

[0172] Outra alternativa é realizar a via C sem proteção do grupo das cetonas da pregnenolona (via D).

[0173] A presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo um composto de Fórmula (I): Fórmula (I)

[0174] e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0175] A forma da composição farmacêutica, a via de administração, a dosagem e o regime dependem naturalmente da condição a ser tratada, da gravidade da doença, da idade, do peso e do sexo do paciente, etc.

[0176] Embora seja possível que o composto da presente invenção seja administrado sozinho, é preferível formulá-lo numa composição farmacêutica de acordo com a prática farmacêutica padrão. Assim, a invenção também fornece uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) em mistura com pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0177] É ainda proporcionado pela presente invenção um processo de preparação de uma composição farmacêutica, processo esse que compreende a mistura de um composto de Fórmula (I), juntamente com pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0178] A composição farmacêutica compreenderá tipicamente pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. Excipientes aceitáveis para uso terapêutico são bem conhecidos na técnica farmacêutica e são descritos, por exemplo, em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 21ª edição 2011. A escolha do excipiente farmacêutico pode ser selecionada em relação à via de administração pretendida e à prática farmacêutica padrão. O excipiente deve ser aceitável no sentido de não ser prejudicial para o receptor. O pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser, por exemplo, um aglutinante, um diluente, um carreador, um lubrificante, um desintegrador, um agente umectante, um agente dispersante, um agente de suspensão e semelhantes.

[0179] As vias para administração (entrega) do composto definido acima incluem, mas não estão limitadas a: oral (por exemplo, como um comprimido, cápsula ou como uma solução ingerível), tópica, mucosa (por exemplo, como um aerossol nasal ou aerossol para inalação), nasal, gastrointestinal, intraespinhal, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, intrauterina, intraocular, intradérmica, intracraniana, intratraqueal, intravaginal, intracere broventricular, intracerebral, subcutâneo, oftálmico (incluindo intravítrea ou intracameral), transdérmica, retal, bucal, epidural, sublingual.

[0180] As vias de administração preferenciais incluem oral, mucosa, parenteral e sublingual.

[0181] Por exemplo, o composto pode ser administrado por via oral na forma de comprimidos, comprimidos revestidos, pílulas, cápsulas, cápsulas de gelatina mole, pós orais, grânulos, óvulos, elixires, soluções ou suspensões, que podem conter agentes aromatizantes ou corantes, aplicações para liberação imediata, retardada, modificada, sustentada, pulsada ou controlada.

[0182] Os comprimidos podem conter excipientes, tais como celulose microcristalina, lactose, citrato de sódio, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio dibásico e glicina, um desintegrante, tal como amido (de preferência amido de milho, batata ou tapioca), glicolato de amido sódico, croscarmelose sódica e certos silicatos complexos, um aglutinante como polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), hidroxipropilcelulose (HPC), sacarose, gelatina e acácia, um lubrificante como estearato de magnésio, ácido esteárico, beenato de glicerila. As composições sólidas de um tipo semelhante também podem ser utilizadas como enchimentos em cápsulas de gelatina dura. Excipientes preferenciais a esse respeito incluem lactose, sacarose, sorbitol, manitol, amido de batata, amido de milho, amilopectina, derivados de celulose ou gelatina. As cápsulas de gelatina dura podem conter grânulos do composto da invenção.

[0183] As cápsulas de gelatina mole podem ser preparadas com cápsulas contendo o composto da invenção, óleo vegetal, ceras, gordura ou outro veículo adequado para cápsulas de gelatina mole. Como exemplo, o veículo aceitável pode ser um veículo oleaginoso, como um óleo vegetal de triglicerídeo de cadeia longa (por exemplo, óleo de milho).

[0184] Pós dispersíveis e grânulos adequados para a preparação de uma suspensão aquosa pela adição de água podem conter o ingrediente ativo em uma mistura com agentes dispersantes, agentes umectantes e agentes de suspensão e um ou mais excipientes adicionais conservantes, por exemplo agentes adoçantes, aromatizantes e corantes, também podem estar presentes. Estas composições podem ser preservadas pela adição de um antioxidante como o ácido ascórbico.

[0185] As formas de dosagem líquidas para administração oral podem incluir soluções, emulsões, suspensões, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis contendo diluentes inertes comumente usados na técnica, tais como água ou um veículo oleaginoso. A forma de dosagem líquida pode ser apresentada como um produto seco para constituição com água ou outro veículo adequado antes do uso. Tais composições também podem compreender adjuvantes, tais como agentes umectantes, agentes emulsionantes e de suspensão, agentes complexantes, tais como 2- hidroxipropil-beta-ciclodextrina, sulfobutiléter-beta-cilodextrina e adoçantes, aromatizantes, agentes perfumantes, matérias corantes ou corantes com diluentes tais como água, etanol, propilenoglicol e glicerina, e suas combinações. Estas composições podem ser preservadas pela adição de um antioxidante, como hidroxianisol butilado ou alfa-tocoferol.

[0186] O pó finamente dividido dos compostos da invenção pode ser preparado, por exemplo, por micronização ou por processos conhecidos na técnica. Os compostos da invenção podem ser moídos usando procedimentos de moagem conhecidos, tais como moagem a úmido para obter um tamanho de partícula apropriado para a formação de comprimidos e para outros tipos de formulação.

[0187] Se o composto da presente invenção for administrado por via parenteral, então exemplos de tal administração incluem um ou mais de: administração intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraesternal, intracraniana, intramuscular ou subcutânea do agente; e/ou usando técnicas de infusão.

[0188] O composto da invenção pode ser administrado por via parentérica com uma formulação prontamente disponível ou do tipo depósito.

[0189] As composições farmacêuticas para a administração parenteral de uma formulação prontamente disponível podem estar na forma de uma solução aquosa ou oleaginosa injetável estéril ou suspensão em um diluente ou solvente não tóxico parenteralmente aceitável e podem conter agentes de formulação, tais como suspensão, dispersão estabilizadora, agentes molhantes e/ou complexantes, tais como ciclodextrina, por exemplo, 2- hidroxipropil-beta-ciclodextrina, sulfobutiléter-beta-cilodextrina.

[0190] A formulação do tipo depósito para a administração parenteral pode ser preparada por técnicas convencionais com excipiente farmaceuticamente aceitável incluindo, sem estar limitado a, polímeros biocompatíveis e biodegradáveis (por exemplo, poli(β-caprolactona), poli(óxido de etileno), poli(ácido glicólico), poli[(ácido lático)-co-(ácido glicólico)...)], poli (ácido láctico)...), polímeros não biodegradáveis (por exemplo, copolímero de etileno vinilacetato, poliuretano, poliéster (amida), cloreto de polivinila ...) veículos aquosos e não aquosos (por exemplo, água, óleo de gergelim, óleo de semente de algodão, óleo de soja, óleo de rícino, óleo de amêndoa, ésteres oleosos, álcool etílico ou óleos vegetais fracionados, propilenoglicol, DMSO, THF, 2-pirrolidona, N-metilpirrolidinona, N-vinilpirrolidinona...).

[0191] Alternativamente, o ingrediente ativo pode estar na forma seca, tal como um pó, sólido cristalino ou liofilizado para constituição com um veículo adequado. A preparação de formulações parentéricas adequadas em condições estéreis é facilmente realizada por técnicas farmacêuticas padrão bem conhecidas dos especialistas na técnica.

[0192] Conforme indicado, o composto da presente invenção pode ser administrado por via intranasal ou por inalação e é convenientemente distribuído na forma de um inalador de pó seco ou uma apresentação de spray de aerossol a partir de um recipiente pressurizado, bomba, spray ou nebulizador com o uso de um propulsor adequado, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, (por exemplo da Ineos Fluor), dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada fornecendo uma válvula para distribuir uma quantidade medida. O recipiente pressurizado, bomba, spray ou nebulizador pode conter uma solução ou suspensão do composto ativo. Cápsulas e cartuchos (feitos, por exemplo, de gelatina) para uso em um inalador ou insuflador podem ser formulados para conter uma mistura de pó do composto e uma base de pó adequada, como lactose ou amido. Para composições adequadas e/ou adaptadas para administração por inalação, é preferido que o composto ou sal de fórmula (I) esteja em uma forma de tamanho de partícula reduzido, e mais preferencialmente a forma de tamanho reduzido seja obtida ou obtenível por micronização. O tamanho de partícula preferível do composto ou sal ou solvato de tamanho reduzido (por exemplo, micronizado) é definido por um valor D50 de cerca de 0,5 a cerca de 50 mícrons (por exemplo, medido usando difração de laser).

[0193] Alternativamente, o composto da presente invenção pode ser administrado na forma de um supositório ou pessário, ou pode ser aplicado topicamente na forma de um gel, hidrogel, loção, solução, creme, unguento ou pó para polvilhar. O composto da presente invenção também pode ser administrado dermicamente ou transdermicamente, por exemplo, pelo uso de um adesivo para a pele. Eles também podem ser administrados pelas vias pulmonar ou retal. Eles também podem ser administrados por via ocular. Para uso oftálmico, os compostos podem ser formulados como suspensões micronizadas em isotônico, pH ajustado, solução salina estéril ou, de preferência, como soluções isotônico, pH ajustado, solução salina estéril, opcionalmente em combinação com um conservante, tal como cloreto de benzilalcônio. Alternativamente, eles podem ser formulados em uma pomada, como vaselina.

[0194] Para aplicação tópica na pele, o agente da presente invenção pode ser formulado como uma pomada adequada contendo o composto ativo suspenso ou dissolvido em, por exemplo, uma mistura com um ou mais dos seguintes: óleo mineral, vaselina líquida, vaselina branca, propilenoglicol, polioxietileno polioxipropileno composto, cera emulsificante e água. Alternativamente, pode ser formulado como uma loção ou creme adequado, suspenso ou dissolvido em, por exemplo, uma mistura de um ou mais dos seguintes: óleo mineral, monoestearato de sorbitano, um polietilenoglicol, parafina líquida, polissorbato 60, cera de ésteres cetílicos, álcool cetearílico, 2-octildodecanol, álcool benzílico e água.

[0195] Normalmente, um médico determinará a dosagem real que será mais adequada para um indivíduo individual. O nível de dose específica e a frequência de dosagem para qualquer indivíduo em particular podem ser variados e dependerão de uma variedade de fatores, incluindo a atividade do composto específico empregado e a duração da ação desse composto, a idade, peso corporal, saúde geral, sexo, dieta, modo e tempo de administração, taxa de excreção, combinação de fármacos, a gravidade da condição particular e o indivíduo em terapia.

[0196] O composto definido acima pode ser administrado a um indivíduo para seu uso no tratamento de distúrbios cognitivos em qualquer dose adequada para a obtenção de um efeito terapêutico.

[0197] Para administração oral e parentérica a humanos, o nível de dosagem diária do agente pode ser em doses únicas ou divididas.

[0198] Uma faixa proposta de dose do composto de acordo com o presente invenção para administração a um ser humano (de aproximadamente 70 kg de peso corporal) é, incluindo, mas não se limitando a 1 µg a 1.000 mg, mais tipicamente 1 µg a 500 mg, mais tipicamente 1 µg a 100 mg, mais tipicamente 1 µg a 50 mg, mais tipicamente 1 µg a 10 mg, mais tipicamente 1 µg a 5 mg, mais tipicamente 1 µg a 1 mg, mais tipicamente 1 µg a 600 µg, mais tipicamente 1 µg a 200 µg, mais tipicamente 1 µg a 100 µg, mais tipicamente 1 µg a 60 µg, mais tipicamente 10 µg a 1.000 mg, mais tipicamente 10 µg a 500 mg, mais tipicamente 10 µg a 100 mg, mais tipicamente 10 µg a 50 mg, mais tipicamente 10 µg a 10 mg, mais tipicamente 10 µg a 5 mg, mais tipicamente 10 µg a 1 mg, mais tipicamente 10 µg a 600 µg, mais tipicamente 10 µg a 200 µg, mais tipicamente 10 µg a 100 µg, mais tipicamente 20 µg a 1.000 mg, mais tipicamente 20 µg a 600 mg, mais tipicamente 20 µg a 200 mg, mais tipicamente 20 µg a 60 mg, mais tipicamente 20 µg a 20 mg, mais tipicamente 20 µg a 6 mg, mais tipicamente 20 µg a 2 mg, mais tipicamente 20 µg a 600 µg, mais tipicamente 20 µg a 200 µg do ingrediente ativo por dose unitária, expresso como o peso de ácido livre. A dose unitária pode ser administrada, por exemplo, 1 a 4 vezes por dia. A dose dependerá da via de administração. Será apreciado que pode ser necessário fazer variações de rotina para a dosagem dependendo da idade e peso do paciente, bem como da gravidade da condição. A dosagem também dependerá da via de administração. A dose precisa e a via de administração ficarão, em última instância, a critério do médico assistente ou veterinário.

[0199] Uma “dose adequada”, uma “quantidade eficaz” do composto da invenção refere-se à quantidade eficaz suficiente para prevenir, reduzir, eliminar, controlar, tratar ou inibir um distúrbio cognitivo. O termo “controlar” se destina a referir-se a todos os processos em que pode haver uma desaceleração, interrupção, parada ou parada da progressão das doenças e condições descritas neste documento, mas não indica necessariamente uma eliminação total de todos os sintomas de doenças e condições. As doses utilizadas para a administração podem ser adaptadas em função de vários parâmetros, em particular em função do modo de administração utilizado, da patologia relevante ou, alternativamente, da duração de tratamento desejada. Naturalmente, a forma da composição farmacêutica, a via de administração, a dosagem e o regime dependem naturalmente da condição a ser tratada, da gravidade da doença, da idade, do peso e do sexo do indivíduo, etc., as doses eficazes fornecidas abaixo não se destinam a limitar a invenção e representam intervalos de dose preferenciais. No entanto, a dose preferencial pode ser adaptada ao indivíduo individual, como é entendido e determinável por um versado na técnica, sem experimentação indevida.

[0200] A invenção também se refere a um método de tratamento de distúrbios cognitivos em um indivíduo com necessidade, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do composto de Fórmula (I):

Fórmula (I)

[0201] ao dito paciente.

[0202] Todas as modalidades divulgadas acima são englobadas nesse aspecto.

[0203] Em outro aspecto, a presente invenção se refere ao uso do composto de Fórmula (I): Fórmula (I)

[0204] para o tratamento de distúrbios cognitivos.

[0205] Todas as modalidades divulgadas acima são englobadas nesse aspecto.

[0206] Em uma modalidade adicional, a presente invenção se refere ao uso do composto de Fórmula (I): Fórmula (I)

[0207] para a fabricação de uma preparação farmacêutica para o tratamento de distúrbios cognitivos.

[0208] Todas as modalidades divulgadas acima são englobadas nesse aspecto.

EXEMPLOS Exemplo 1: Síntese de 3Bn17MeP

[0209] 3β-benziloxi, 17metil-pregn-5-en-20-ona (3Bn17MeP) é uma entidade química contendo 7 centros quirais 3S, 8S, 9S, 10R, 13S, 14S, 17S como descrito na Fórmula (I): Fórmula (I)

[0210] A configuração estereoquímica nesses centros é idêntica à do material de partida pregnenolona.

[0211] Esse exemplo é o modo de preparação de 3β-benziloxi, 17metil-pregn-5-en-20-ona (3Bn17MeP) seguindo a rota A da Figura 1. Síntese do intermediário de acetato de enol

[0212] Monoidrato de ácido p-toluenossulfônico (1,12 g; 5,9 mmoles; 0,93 eq.) foi adicionado a uma solução de Pregnenolona (2 g; 6,3 mmoles; 1 eq.) em anidrido acético (230 ml). O meio de reação foi agitado por 5 h em refluxo e anidrido acético foi lentamente destilado. Após deixar resfriar a 20 °C, o meio de reação foi vertido em gelo moído e então a mistura foi extraída com éter dietílico. A camada orgânica foi lavada com Na2CO3 aquoso saturado, seca em Na2SO4, depois evaporada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em gel de sílica (eluente: ciclo- hexano/AcOEt de 100/0 a 90/10) para proporcionar o acetato de enol Pregnenolona (2,2 g; 85%) como um sólido branco. Síntese do 17α-metil-pregnenolona

[0213] Como mostrado abaixo, MeMgBr2 (3M em Et2O; 25 ml; 75 mmoles; 10 eq.) foi adicionado a uma solução de acetato de enol pregnenolona (3 g; 7,5 mmoles; 1 eq.) em tetraidrofurano anidro (65 ml). O meio de reação foi agitado por 1 h em refluxo, então deixado resfriar a 20 °C. CH3I (4,6 ml; 75 mmoles; 10 eq.) foi adicionado e meio de reação foi agitado em refluxo. A adição de CH3I foi repetida a cada 45 minutos até 40 equivalentes. Após resfriamento a 20 °C, uma solução aquosa de NH4Cl foi adicionada e a mistura foi extraída com acetato de etila. A camada orgânica foi lavada com salmoura, seca em Na2SO4 depois evaporada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em gel de sílica (eluente: ciclo-hexano/AcOEt 75/25) pra proporcionar a 17α-metil-pregnenolona (¬600 mg; 25%) como um sólido branco. Síntese da 3β-(benziloxi)-17α-metil-pregn-5-en-20-ona

[0214] MgO (100 mg; 2,42 mmoles; 2 eq.) e triflato de 2-benziloxi- 1-metilpiridínio (850 mg; 2,42 mmoles; 2,0 eq.) foram adicionados a uma solução de 17α-metil-pregnenolona (400 mg; 1,21 mmol; 1 eq.) em trifluorotolueno (10 ml). O meio de reação foi agitado por uma noite a 85 °C, depois filtrado em celite e evaporado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em gel de sílica (eluente: ciclo-hexano/AcOEt 95/5), depois por cristalização em acetona para proporcionar a 3β-(benziloxi)-

17α-metil-pregn-5-en-20-ona (0,28 g; 36%) como um sólido branco. Exemplo 2: Inibição específica da atividade do receptor CB1 por 3Bn17MeP

[0215] A compreensão dos efeitos do composto da presente invenção, 3Bn17MeP, nas atividades celulares tem sido conduzida estudando sua capacidade de inibir diversos efeitos induzidos pela estimulação de CB1. Em particular, a capacidade de 3Bn17MeP (i) para suprimir a inibição da respiração celular, (ii) para inibir o aumento na fosforilação de Erk1/2MAPK (p- Erk1/2MAPK, quinases reguladas por sinal extracelular da família de proteínas quinases ativadas por mitogênio) e (iii) para prevenir a inibição da estimulação do receptor CB1 induzida por monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) com ∆ 9- tetrahidrocanabinol (THC). Respiração celular, p-Erk1/2MAPK e cAMP foram estudados porque essas respostas celulares determinam a inibição específica da sinalização da atividade do receptor CB1 pela pregnenolona (Vallée et al., 2014). Ou seja, pregnenolona bloqueia a inibição da respiração celular induzida por THC, inibe o aumento induzido por THC em p-Erk1/2MAPK, mas não tem efeito na inibição induzida por THC de cAMP. Por outro lado, os antagonistas de CB1 ortostéricos, como o rimonabanto, inibem ambas as respostas.

[0216] A seletividade dos efeitos do 3Bn17MeP no receptor CB1 foi estudada através da análise da ligação deste composto em 85 receptores. Materiais e Métodos Efeito de 3Bn17MeP na inibição de respiração celular induzida por THC:

[0217] O objetivo desses estudos foi avaliar o efeito de 3Bn17MeP na inibição da respiração celular induzida por THC (1 µM) em células HEK-293 transitoriamente transfectadas com os receptores CB1 humanos (hCB1). As células HEK-293 foram escolhidas porque não expressam receptores CB1 endógenos, podem ser facilmente transfectadas e foram utilizadas anteriormente em experimentos que estudam a atividade in vitro do receptor CB1 (Shore et al., 2014) e em experimentos que mostram que pregnenolona é capaz de inibir a diminuição induzida pelo THC na respiração celular (Vallée et al., 2014).

[0218] Em um primeiro estudo (Figura 5A), células HEK-293 foram transitoriamente transfectadas com o plasmídeo que expressa hCB1 de tipo selvagem (HEK-293-hCB1-WT). As células foram primeiro tratadas com 3Bn17MeP (0; 1; 2,5; 5; 50 e 100 nM dissolvidos em acetonitrila 0,01%). Após 15 min de incubação, THC (0; 1 µM, dissolvido em EtOH, 0,0034%) foi adicionado nas placas de cultura por 30 minutos.

[0219] Em um segundo estudo (Figura 5B), as células HEK-293 foram transitoriamente transfectadas com o plasmídeo que expressa hCB1 de tipo selvagem (HEK-293-hCB1-WT) ou com o plasmídeo que expressa hCB1p.E1.49G mutante (HEK- 293-hCB1-Mut). Neste mutante, o aminoácido glutamato na posição 1.49 foi substituído por uma glicina. Essa mutação mostrou preservar o efeito do THC, mas suprimir o efeito da pregnenolona nas atividades celulares induzidas pela estimulação do receptor CB1 (Vallée et al., 2014). Na verdade, o glutamato na posição 1,49 é essencial para a ligação da pregnenolona ao receptor CB1. As células foram primeiro tratadas com 3Bn17MeP (100 nM dissolvidos em acetonitrila 0,01%). Após 15 min de incubação, THC (0; 1 µM, dissolvido em EtOH, 0,0034%) foi adicionado nas placas de cultura por 30 minutos.

[0220] A respiração celular foi medida em um oxígrafo calibrado equipado com um eletrodo Clark. A taxa de consumo de oxigênio (CO) foi usada para medir a respiração celular. Os efeitos do THC na taxa de OC, na ausência e na presença de 3Bn17MeP, foram expressos como porcentagens do OC da linha de base da célula tratada com o veículo de 3Bn17MeP e o veículo de THC do mesmo experimento. Efeito de 3Bn17MeP no aumento em p-Erk1/2MAPK induzida por THC

[0221] O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos de 3Bn17MeP no aumento da fosforilação de p-Erk1/2MAPK induzida pela administração de THC na linha celular STHdhQ7/Q7 (linha celular derivada de estriatal de um camundongo transgênico knock-in contendo loci homozigotos de Huntingtin com um éxon 1 humanizado com 7 repetições de poliglutamina). As células STHdhQ7/Q7 foram escolhidas porque expressam de forma estável níveis elevados de receptores CB1 endógenos. Essas células foram utilizadas anteriormente em experimentos que estudam a atividade in vitro de receptores CB1 após estimulação por endocanabinoides (Laprairie et al., 2014) e em nossas condições são as que permitem a análise mais confiável do aumento induzido por CB1 na fosforilação de MAPK.

[0222] O efeito de 3Bn17MeP em 5 doses (0,1; 0,3; 1; 3 e 9 µM; dissolvidos em DMSO 0,9%) foi testado nos efeitos do THC a 10 µM (dissolvido em DMSO 0,05%) na fosforilação de MAPK. As células foram pré-tratadas com 3Bn17MeP ou veículo 30 minutos antes de serem tratadas com THC ou veículo por 30 min).

[0223] A fosforilação de MAPK (proteínas p-Erk1/2MAPK) foi medida por kits AlphaLISA SureFire Ultra usando as proteínas Erk1/2MAPK não fosforiladas como controles de carregamento. As contagens de p-Erk1/2MAPK foram normalizadas calculando a porcentagem de aumento das contagens de p- Erk1/2MAPK induzidas por THC ou veículo na ausência e na presença de 3Bn17MeP. Efeito de 3Bn17MeP na inibição de cAMP induzida por THC

[0224] O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos de 3Bn17MeP na diminuição do cAMP induzida pela administração de THC em células de ovário de hamster chinês (CHO) que expressam de forma estável o receptor CB1 humano CHO-hCB1.

[0225] As células CHO-hCB1 foram escolhidas nesses experimentos porque não expressam endogenamente o receptor CB1 e foram anteriormente utilizadas em experimentos que estudam os efeitos dos agonistas CB1 (Rinaldi-Carmona et al., 1996), incluindo THC, no cAMP e P- MAPK e em experimentos mostrando que pregnenolona é capaz de inibir os efeitos induzidos por THC em P-MAPK, mas não em cAMP (Vallée et al.,

2014).

[0226] O efeito de 3Bn17MeP (1 nM, 10 nM, 100 nM e 1 μM, dissolvidos em DMF (N,N-Dimetilformamida), 0,01%, Figura 5C) foi testado contra uma função de resposta à dose de THC (0,3, 1, 3, 10, 30, 100 e 300 nM, dissolvidos em etanol, 0,0063%).

[0227] As células CHO-CB1-C2 foram tratadas adicionando concomitantemente THC e o teste composto durante 45 minutos. Forskolin (2,5 µM) também foi adicionado simultaneamente em todas as condições testadas para sustentar o nível basal de cAMP.

[0228] No final do tratamento, as células foram lisadas para prosseguir com a quantificação de cAMP. Todas as medidas foram realizadas em triplicatas em um experimento. A determinação quantitativa de cAMP foi realizada por meio de um imunoensaio de fluorescência competitivo. Os dados foram expressos como % de Fluorescência Delta (Delta F) que foi calculada da seguinte forma: Delta F% = (Fluorescência de Amostra - Fluorescência de Controle Negativo)/Fluorescência de Controle Negativo. Seletividade de ligação de 3Bn17MeP in vitro:

[0229] A especificidade dos efeitos do 3Bn17MeP no receptor CB1 foi estudada através da análise dos efeitos desse composto na ligação de outros 85 receptores. Essa série de ensaios teve como objetivo avaliar a especificidade de ligação do 3Bn17MeP comparando-a com o perfil da pregnenolona.

[0230] A capacidade potencial de 3Bn17MeP e pregnenolona, em uma concentração de 10 μM, para deslocar a ligação de ligantes de 85 receptores (perfil de alto rendimento CEREP + 4 receptores de esteroides + receptor de canabinoide tipo 2) foi testada. O perfil de alto rendimento do CEREP consiste em uma ampla coleção de 80 receptores transmembranares e solúveis, canais iônicos e receptores acoplados à proteína G. Ele foi projetado especificamente para fornecer informações para priorizar os compostos mais promissores no processo de seleção identificação do agente ativo (hit-to-lead). Os receptores de andrógeno, estrógeno, progesterona e PXR e, em seguida, o receptor de canabinoide tipo 2 foram adicionados a esse ensaio para melhor adequar o ensaio a 3Bn17MeP, completando o espectro do receptor de esteroide já contido no perfil de alto rendimento CEREP. Resultados

[0231] 3Bn17MeP inibe a diminuição da respiração celular induzida por THC em HEK-293-hCB1-WT (Figura 5A). No ID100 de 3Bn17MeP (50 nM), o efeito do THC é totalmente abolido. Em contraste, em HEK-293- hCB1-Mut a diminuição induzida por THC na respiração celular é insensível a 3Bn17MeP (100 nM, Figura 5B), indicando que 3Bn17MeP inibe o efeito do THC ao interagir com os receptores CB1.

[0232] Em células STHdhQ7/Q7 que expressam de forma estável os receptores CB1 endógenos, a dose de 3Bn17MeP diminui de forma dependente a fosforilação de MAPK induzida por THC (Figura 5C), com um ED50 de aproximadamente 1 µM.

[0233] Em contraste, 3Bn17MeP não modifica a inibição de cAMP induzida por THC em qualquer uma das doses testadas em células CHO que expressam de forma estável os receptores CB1 humanos (Figura 5D).

[0234] 3Bn17MeP (10 µM) não modifica a ligação de qualquer um dos 85 receptores que foram testados in vitro usando o perfil de alto rendimento CEREP, incluindo os principais receptores de esteroides, os receptores PXR e os receptores CB1 e CB2 (Tabela 1). A esse respeito, o 3Bn17MeP é mais seletivo do que a pregnenolona (10 µM), que deslocou (>80%) a ligação dos receptores de glicocorticoide, androgênio e progesterona e, em menor grau (>40%), a ligação dos receptores de benzodiazepina centrais e periféricos. Tabela 1: Comparação entre 3Bn17MeP e pregnenolona se ligando a 85 receptores FAMÍLIA ENSA % de inibição FAMÍ- ENSA % de inibição FAMÍLIA ENSAIO % de inibição FAMÍ- ENSAI % de inibição FAMÍ- ENSA % de inibição IO PRE 3B LIA IO PRE 3B PRE 3B LIA O PRE 3B LIA IO PRE 3B G n G n G n G n G n 17 17 17 17 17 Me Me Me Me Me

P P P P P GPCRs Outros receptores

Adenosi- A1 -25 -27 Dopa- D1 -8 -10 Neuroci- NK1 17 8 Seroto- 5- 12 25 Benzo- BZD 42 1 na mina nina nina HT1A diaze- (perif) pina A2A -1 -6 D2S 5 6 NK2 -1 -12 5- -28 -15 TNF- 4 4 HT1B alfa A3 11 1 D3 11 -2 NK3 11 7 5- -1 -8 GABA 10 10 HT2A Adrenér- alfa1 1 5 D4.4 20 -10 Neuropeptí Y1 -11 -32 5- -38 16 BZD -43 -16 gico deo Y HT2B (cen- tral) alfa2 -2 -1 D5 -4 -6 Y2 -9 -6 5- -9 -10 Canal 29 1 HT2C Cl beta2 -5 -4 Endo- ETA -3 1 Neuro- NTS1 -19 -13 5-HT5a 11 2 PCP 5 5 telina tensina (NT1) beta1 4 7 ETB 4 -13 Opioide e delta2 9 -3 5-HT6 5 -1 PDGF -15 -13 seme- (DOP) Angioten AT1 -28 -13 Gala- GAL1 -16 -26 lhante a kappa 38 -17 5-HT7 11 8 P2X 13 8 -sina-II nina opioide (KOP) AT2 -18 -5 GAL2 1 -11 mu -5 -4 Canais de íon 5-HT3 6 4 (MOP) Bombesi BB Histami- H1 0 3 NOP 2 2 Canais Ca2+- -19 12 sigma 26 9 -na na (ORL 1) Ca2+ L Bradicini B2 H2 9 12 Prosta- EP2 24 19 Canais KV -23 -15 Receptores nucleares -na noide K+ Relacion CGR Melano- MC4 -15 -10 EP4 21 25 SKCa -8 -3 Recep- GR 88 -2 ada ao P cortina tores gene nuclea- calcitoni res na esteroi Canabi- CB1 Mela- MT1 26 -8 IP (PGI2) -12 0 Canais Na+- 23 -12 des AR 95 16 noide tonina (ML1 Na+ local 2 A) CB2 Muscaric M1 -14 -25 Purinérgi- P2Y -3 -2 Transportadores ER 26 -5 ina ca Quimioci CXCR M2 -4 -17 Somato- sst -8 -6 Dopam Dopam -12 -23 PR 87 20 -nas 2 (IL- estatina ina ina 8B) CCR1 M3 2 16 Peptídeo VPAC1 -10 -17 Nore- Nore- -12 -1 Recep- PPAR 4 -12 vasoativo (VIP1) pine- pine- tores gama intestinal frina frina nuclea Colecis- CCK1 M4 -4 2 PAC1 – -25 - Seroto- Trans. 1 1 res não PXR 15 -8 tocinina (CCK PACAP 21, nina 5-HT este- A) 2 roides CCK2 M5 8 0 Vasopressi Vasopres 10 0 (CCK na sina B)

[0235] Os efeitos in vitro de 3Bn17MeP são resumidos na tabela abaixo: Tabela 2: Avaliação in vitro do mecanismo de ação de 3Bn17MeP % Sistema de Efeitos de 3Bn17MeP sobre: ID50 ID100 de teste inibição Diminuição induzida por THC na HEK-293-hCB1 2,5 nM 50 nM 100 respiração celular Aumento induzido por THC em

MAPK STHdhQ7/Q7 1 µM 9 µM ~100 p-Erk1/2 Diminuição de cAMP induzida CHO-hCB1 -- -- -- por THC

Perfil de ligação de alto Ligação de >10 rendimento CEREP (85 -- NA receptor µM receptores) NA = Não Analisado porque nenhum efeito foi encontrado Conclusão

[0236] Portanto, 3Bn17MeP in vitro atua como um inibidor específico de sinalização do CB1 (CB1-SSi). Assim, 3Bn17MeP inibe a diminuição da respiração celular induzida por THC em HEK-293 transfectada com os receptores CB1 humanos. 3Bn17MeP exerce o seu efeito inibitório na estimulação do receptor CB1 através de um local de ligação que é diferente do local de ligação do THC. 3Bn17MeP inibe o aumento na fosforilação de MAPK induzido por THC em células STHdhQ7/Q7 que expressam receptores CB1 endogenamente, mas não tem efeito na diminuição dos níveis de cAMP induzidos por THC em células CHO transfectadas com os receptores CB1 humanos.

[0237] Além disso, 3Bn17MeP in vitro é mais seletivo do que sua contraparte endógena pregnenolona. De fato, pregnenolona (10 µM) desloca a ligação (>80%) dos receptores de progesterona, glicocorticoides e androgênios, bem como a ligação dos receptores de benzodiazepina (>40%). 3Bn17MeP (10 µM) não modifica a ligação desses receptores ou de qualquer um dos outros receptores (85 no total) que foram estudados usando o perfil de alto rendimento CEREP. Exemplo 3: Eficácia de 3Bn17MeP em modelos pré-clínicos de distúrbios cognitivos

[0238] A avaliação pré-clínica da eficácia de 3Bn17MeP em distúrbios cognitivos pode ser realizada em modelos pré-clínicos associados a distúrbios cognitivos, incluindo em modelos animais disponíveis de distúrbios do neurodesenvolvimento (por exemplo, síndrome de Down e síndrome do X frágil), distúrbios neurocognitivos (por exemplo, doença de Alzheimer, doença de Parkinson) e de declínio cognitivo relacionado à idade.

[0239] Modelos de camundongos com síndrome de Down, síndrome do X frágil e declínio cognitivo relacionado à idade foram selecionados porque:

[0240] - A síndrome de Down é o defeito de nascença genético mais comum em humanos e é caracterizada por dificuldades intelectuais marcantes. (Grieco et al., 2015).

[0241] - A síndrome do X frágil é a principal causa monogênica de deficiência intelectual e autismo (Hunter et al., 2014).

[0242] - As linhas de camundongos Ts65Dn e fmr1-KO, os modelos de camundongos da síndrome de Down e da síndrome do X frágil, respectivamente, são os modelos pré-clínicos de distúrbios do neurodesenvolvimento mais usados (Chang et al., 2013).

[0243] - O envelhecimento é o fator de risco mais alto associado a distúrbios neurocognitivos e, em particular, a doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer (DSM-5tm). Portanto, deficiências cognitivas relacionadas à idade são muitas vezes as premissas do declínio cognitivo patológico.

[0244] O efeito de aumento da administração de 3Bn17MeP foi estudado em três funções cognitivas, memória de reconhecimento, memória declarativa/relacional e memória de trabalho.

[0245] - O reconhecimento refere-se ao tipo de recuperação de memória que ocorre quando um evento experimentado anteriormente corresponde à memória armazenada desse evento.

[0246] - Memória declarativa/relacional: no ser humano, a memória declarativa é um tipo de memória de longo prazo que se refere à lembrança intencional de informações, experiências anteriores e conceitos. Uma propriedade da memória declarativa é a capacidade de estabelecer relações entre elementos da experiência espacialmente e/ou temporalmente distintos (Sellami et al., 2017). Na verdade, a memória declarativa/relacional é flexível, permitindo relembrar e manipular duas informações adquiridas separadamente para fazer inferências ou para guiar uma decisão.

[0247] - A memória de trabalho é um tipo de função executiva que permite armazenar e processar temporariamente as informações. É necessário realizar atividades da vida cotidiana, como manter uma conversa, raciocinar, compreender a leitura.

[0248] Esses processos são fundamentais para o funcionamento cognitivo normal e suas deficiências são provavelmente os sintomas cognitivos mais incapacitantes. Por exemplo, a aquisição da linguagem requer reconhecer e lembrar palavras e processar com seu significado para compreender e fazer- se compreender. Além disso, deficiências desses processos são comumente detectadas em doenças que causam distúrbios cognitivos e são reproduzidas em modelos pré-clínicos dessas doenças, incluindo camundongos Ts65Dn, camundongos fmr1-KO e camundongos idosos.

[0249] Assim, os seguintes estudos foram realizados para avaliar a eficácia de 3Bn17MeP em distúrbios cognitivos; a. Comprometimento no reconhecimento de objetos associado à síndrome de Down; b. Comprometimento da memória declarativa/relacional associada à síndrome de Down; c. Comprometimento da memória operacional associada à síndrome de Down; d. Comprometimento no reconhecimento de objetos associados à síndrome do X frágil; e. Comprometimento da memória relacional/declarativa de longo prazo associado ao envelhecimento

[0250] Nos estudos pré-clínicos a seguir, 3Bn17MeP foi administrado por rota oral em duas formulações diferentes que podem ser usadas com segurança em humanos.

[0251] 3Bn17MeP pode ser solubilizado em óleo de milho, um óleo vegetal de triglicerídeo de cadeia longa. Essa formulação lipídica foi administrada por via oral por gavagem como um líquido.

[0252] 3Bn17MeP pode ser dissolvido em água da torneira contendo 0,3% de 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (HP-β-CD). Essa solução foi administrada por via oral a camundongos como bebida ad libitum diária em uma garrafa de vidro. Água da torneira contendo 0,3% de HP-β-CD foi usada como veículo de controle. Durante a administração de 3Bn17MeP, os frascos foram pesados 3 vezes por semana para monitorar a ingestão de 3Bn17MeP. O volume de solução consumido diariamente por camundongo foi de aproximadamente 4 ml. Por exemplo, uma concentração de 3Bn17MeP a 0,6 µg/ml na água potável, corresponde a aproximadamente 80 µg/kg em um camundongo pesando 30 g.

[0253] Os modelos pré-clínicos usados para avaliar a eficácia de 3Bn17MeP são descritos a seguir:

[0254] - Modelo pré-clínico da síndrome de Down: Os camundongos Ts65Dn são caracterizados pela triplicação do cromossomo 16, que contém a maioria dos genes ortólogos do cromossomo 21 humano (Gardiner, 2015). Os camundongos Ts65Dn recapitulam bem os prejuízos cognitivos observados na síndrome de Down e é o modelo pré-clínico da síndrome de Down mais estudado (Gardiner, 2015). Camundongos experimentais derivam da criação de fêmeas TS65Dn (B6EiC3Sn.BLiA-Ts (1716) 65Dn/DnJ; Jackson Laboratory; nº de estoque: 5252) com machos B6EiC3Sn.BLiAF1 (Jackson Laboratory; nº de estoque: 3647). Camundongos transgênicos (Ts65Dn) e seus companheiros de ninhada de tipo selvagem (WT) são de um fundo misto de DBA/2J x C57Bl/6J x C3H/HeJ.

[0255] - Modelo pré-clínico da síndrome do X frágil: camundongos fmr1- KO são caracterizados pela deleção direcionada do éxon 5 da sequência do gene fmr1 (Kazdoba et al., 2014). Essa deleção resulta no silenciamento do gene fmr1 e, portanto, na supressão da proteína codificada, a proteína de retardo mental do X frágil (FMRP). O principal papel da FMRP é regular a síntese de proteínas locais nos neurônios, limitando a tradução do mRNA. A perda de FMRP leva ao comprometimento da maturação neuronal que está associada a defeitos sensório-motores, comportamentais e cognitivos (Kazdoba et al., 2014). Em particular, os camundongos fmr1-KO expressam comprometimento de memória de longo prazo, incluindo comprometimento de reconhecimento de objeto (Busquets-Garcia et al., 2013). Os camundongos experimentais derivam da criação de camundongos fmr1-KO (FVB.129P2- Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/linha J; The Jackson Laboratory, nº de estoque: 4624) com camundongos do tipo selvagem (WT; FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc- ch/AntJ; The Jackson Laboratory, nº de estoque: 4828). Camundongos transgênicos e seus companheiros de ninhada do tipo selvagem são de um fundo FVB.

[0256] Modelo pré-clínico de declínio cognitivo relacionado à idade: camundongos C57Bl/6J de 19 a 22 meses de idade são conhecidos por expressar déficits cognitivos em comparação com camundongos C57Bl/6J adultos jovens de 3 a 4 meses criados nas mesmas condições (Sellami et al., 2017). Exemplo 3a: Eficácia de 3Bn17MeP em comprometimento de reconhecimento de objetos associado à síndrome de Down.

[0257] Em camundongos, o teste de reconhecimento de objetos, do qual existem várias variantes, é baseado na preferência pela novidade espontânea. Assim, os camundongos exploram objetos novos mais longos (Ennaceur, 2010) e mostram “reconhecimento” de um objeto que já encontraram explorando-o menos. A memória de um objeto específico pode ser avaliada após um pequeno atraso (por exemplo, alguns minutos a uma hora) ou um longo atraso (por exemplo, 24 horas).

[0258] O objetivo desses estudos é avaliar o efeito da administração de 3Bn17MeP no comprometimento do reconhecimento de objetos em camundongos Ts65Dn, um modelo pré-clínico de síndrome de Down.

[0259] Em um primeiro estudo (Figura 6A), o reconhecimento de objetos de curto prazo foi testado usando um procedimento sequencial no qual os objetos eram apresentados um de cada vez. Reconhecimento de um objeto encontrado anteriormente, assim, manifestado por uma redução da exploração desse objeto. Esse procedimento foi escolhido por ser o mais próximo das tarefas de reconhecimento de objetos utilizadas em humanos (por exemplo, Memória de Reconhecimento de Padrões Cantab) e em que os sujeitos com síndrome de Down se mostraram prejudicados. Nessa tarefa, objetos/padrões foram apresentados sucessivamente, e o reconhecimento foi avaliado após um atraso de alguns minutos (Edgin et al., 2012).

[0260] Em um segundo estudo (Figura 6B), o reconhecimento de objetos de longo prazo foi testado. Embora a memória de longo prazo não seja um dos principais comprometimentos observados em indivíduos com síndrome de Down, esse teste é o que tem sido usado para demonstrar o efeito dos antagonistas ortostéricos CB1 no desempenho cognitivo. Por esse motivo, era importante analisar os efeitos de 3Bn17MeP nessa tarefa específica. Materiais e Métodos Efeito de 3Bn17MeP em reconhecimento sequencial de objetos em um modelo pré-clínico de síndrome de Down

[0261] Os camundongos puderam explorar 3 objetos diferentes (A, B, C) apresentados um após o outro e seguindo uma das duas sequências possíveis: A-C-C-B-A e A-B-C-C-A. Em um campo aberto, os camundongos foram expostos ao objeto A por 5 min e então colocados de volta em sua gaiola. Após um atraso de 5 minutos, os camundongos foram expostos ao objeto B ou C por 5 minutos e então colocados de volta em sua gaiola e assim por diante. Consequentemente, o retardo de retenção entre duas apresentações do objeto C foi de 5 minutos, enquanto o retardo de retenção entre duas apresentações do objeto A foi de 35 minutos. O tempo gasto explorando o objeto A ou C na primeira apresentação foi comparado com o tempo gasto explorando o mesmo objeto na segunda apresentação. Esse parâmetro é usado para avaliar o desempenho do reconhecimento de objetos.

[0262] 3Bn17MeP (0,6 µg/ml em 0,3% de HP-β-CD) ou veículo (0,3% de

HP-β-CD) foram administrados por via oral ad libitum como bebida diária. Camundongos Ts65Dn e WT machos e fêmeas (3 a 4 meses de idade; n = 7 a 11 por grupo) tiveram acesso livre ao veículo ou solução 3Bn17MeP. Antes do procedimento de reconhecimento de objetos, os camundongos foram testados no labirinto radial. O reconhecimento do objeto foi realizado após 2 meses de 3Bn17MeP ou administração de veículo. Efeito de 3Bn17MeP sobre o reconhecimento de objetos a longo prazo em um modelo pré-clínico da síndrome de Down

[0263] Em camundongos, a memória de longo prazo pode ser avaliada usando o teste de reconhecimento de objetos, no qual a memória de um objeto específico é avaliada 24 horas depois. Os camundongos foram autorizados a explorar 2 objetos idênticos em um labirinto em forma de “L”. No dia seguinte, o reconhecimento de objetos foi testado pela substituição de um objeto por um novo. De acordo com a preferência pela novidade espontânea, os camundongos exploram objetos novos mais longos (Ennaceur, 2010). A relação entre o tempo gasto explorando objetos novos e familiares é usada como um índice de discriminação entre familiaridade e novidade. Portanto, esse parâmetro é usado para avaliar o desempenho do reconhecimento de objetos.

[0264] O efeito de administrações repetidas via oral de 3Bn17MeP a 15 µg/kg em óleo de milho ou veículo (óleo de milho; 2 ml/kg) foi estudado em camundongos machos Ts65Dn e WT de 2 a 4 meses de idade (n = 7 a 8 por grupo). O 3Bn17MeP foi administrado duas vezes ao dia (às 9h00 e às 17h00) durante 7 dias consecutivos. O teste de reconhecimento de objetos foi realizado no 7º dia, 3 horas após a 13ª administração de 3Bn17MeP ou de veículo. Resultados

[0265] No protocolo de reconhecimento de objeto sequencial de curto prazo (Figura 6A), os camundongos do tipo selvagem foram capazes de reconhecer os objetos já encontrados, conforme mostrado por um tempo de exploração reduzido entre a primeira e a segunda apresentação do mesmo objeto, e isso após atrasos de 5 e 35 minutos entre as apresentações. Em contraste, os camundongos Ts65Dn que receberam veículo não mostraram uma diminuição significativa no tempo de exploração entre apresentações consecutivas, independentemente do atraso, indicando que Ts65Dn estava prejudicado no reconhecimento de objetos de curto prazo. O Ts65Dn administrado com 3Bn17MeP (0,6 µg/ml) explorou significativamente menos o objeto familiar após 5 e 35 minutos, adquirindo um desempenho semelhante ao dos animais selvagens.

[0266] No protocolo de reconhecimento de objeto de longo prazo (Figura 6B), Ts65Dn administrado com veículo de óleo de milho exibe um comprometimento profundo de reconhecimento de objeto em comparação com WT (Figura 6B). A administração de 3Bn17MeP (15 µg/kg) aumentou o índice de discriminação de camundongos Ts65Dn no nível de WT.

[0267] Assim, o 3Bn17MeP restaurou as habilidades completas de reconhecimento de objetos neste modelo pré-clínico de síndrome de Down. Exemplo 3b: Eficácia do 3Bn17MeP no comprometimento da memória declarativa/relacional associada à síndrome de Down.

[0268] O objetivo desse estudo é avaliar o efeito da administração de 3Bn17MeP no comprometimento da memória declarativa/relacional em camundongos Ts65Dn, um modelo de síndrome de Down. O seguinte teste de memória declarativa/relacional foi realizado em um procedimento de labirinto radial que foi empregado com sucesso para detectar deficiências em pacientes com síndrome de Down (em um labirinto radial virtual) e em camundongos Ts65Dn (em um labirinto radial) usando um protocolo semelhante. Materiais e Métodos

[0269] A tarefa de memória relacional foi realizada usando labirintos radiais de 8 braços. O diâmetro da plataforma central era de 30 cm e os braços de 55 cm de comprimento; 10 cm de largura e 100 cm de altura do chão. Cada braço era equipado com uma porta retrátil em sua entrada e com um sistema de entrega de péletes em sua extremidade. Cada labirinto foi colocado em uma sala contendo pistas visuais nas paredes para permitir a discriminação espacial. Não houve sugestão intralabirinto. Cada labirinto foi totalmente automatizado por rastreamento de vídeo (IMETRONIC Pessac-France). Isso permitiu controlar automaticamente as portas dos braços (abertura/fechamento) e entrega de alimentos de acordo com a localização do camundongo.

[0270] Camundongos com restrição alimentar (85% de seu peso corporal original durante todo o estudo) foram primeiro submetidos a 3 sessões de habituação aos labirintos. Durante cada sessão de habituação, o camundongo explorou livremente o labirinto até visitar cada um dos 8 braços, ou 30 minutos decorridos. No início de cada sessão de habituação, o camundongo era posicionado na plataforma central com todos os braços fechados. Após um minuto, todos os braços foram iscados com recompensa alimentar (pérola de massa seca, Panzani “Pâtes Perles”, 100% trigo duro, aproximadamente 10 mg cada) e abertos simultaneamente. Um braço foi considerado visitado assim que o rato alcançou a bandeja de comida em sua extremidade. A porta do braço visitado fechou depois que o camundongo voltou ao centro.

[0271] Os camundongos foram submetidos a uma sessão diária de habituação. No final da segunda sessão, se um camundongo deixasse de visitar todos os braços dentro do tempo alocado ou de coletar as recompensas alimentares dos quatro últimos braços visitados, eles eram submetidos a uma sessão adicional no mesmo dia e a outra no dia seguinte se esse critério não tivesse sido alcançado. Se após o terceiro dia de habituação, um camundongo ainda não conseguisse explorar todos os braços ou coletar as recompensas dos quatro últimos braços visitados, ele era excluído dos experimentos.

[0272] A aquisição começou 24 horas após a última sessão de habituação. A fase de aquisição consistiu em aprender as posições dos péletes de alimento dentro do labirinto. A posição da recompensa não mudou ao longo de todo o procedimento. Seis braços de oito foram usados (3 pares (A, B ou C) de braços adjacentes). Um braço de cada par continha recompensa em sua extremidade, o outro braço de cada par não tinha isca.

[0273] No início de cada sessão diária, o camundongo foi colocado no centro do labirinto sem acesso aos braços. As portas do primeiro par de braços então se abriram dando acesso aos dois braços do par. Assim que o camundongo visitou um braço e voltou para a plataforma central, a porta se fechou e o animal foi confinado na plataforma central. Duas portas se abrem novamente dando acesso a um par de braços imediatamente após (intervalo entre tentativas de 0 segundos). Assim que o animal visitou um dos braços e voltou para a plataforma central, as portas se fecharam novamente antes do próximo ensaio. Em cada sessão, o camundongo foi submetido a 20 apresentações repetidas e sucessivas dos 3 pares de braços, um de cada vez.

[0274] O número de respostas corretas foi medido em cada sessão. Um camundongo foi considerado como tendo adquirido o teste quando atingiu um critério de aprendizagem. Esse critério consistia em pelo menos (i) 75% de respostas corretas (para os três pares) em duas sessões consecutivas e (ii) 62% de respostas corretas para cada um dos 3 pares em duas sessões consecutivas.

[0275] O teste de flexibilidade começou um dia após o critério de aprendizagem ter sido atingido. Na verdade, os camundongos podem realizar o teste de flexibilidade em dias diferentes.

[0276] Nessa tarefa de flexibilidade, um novo par foi formado pela recombinação de 2 braços de dois pares diferentes adquiridos durante o estágio de aquisição. A posição da comida no labirinto não mudou, mas a forma de apresentar os braços mudou. De fato, em vez dos pares A e B, um par denominado AB foi apresentado ao camundongo. O par AB consistia na combinação dos dois braços adjacentes dos pares A e B (ou seja, um braço com isca e o outro sem isca). Esse par representou a tentativa de teste do teste de flexibilidade. A variável dependente que mede o desempenho da flexibilidade (ou seja, memória declarativa/relacional) é a porcentagem de respostas corretas na apresentação do par AB.

[0277] 3Bn17MeP (0,6 µg/ml em 0,3% HP-β-CD) ou veículo (0,3% HP-β- CD) foi administrado por via oral ad libitum como bebida diária. Camundongos Ts65Dn e WT machos e fêmeas (3 a 4 meses de idade; n = 7 por grupo) tiveram acesso livre ao veículo ou solução de 3Bn17MeP (0,6 µg/ml) 7 dias antes do início do procedimento do labirinto radial e até o fim do estudo.

[0278] No final do estudo comportamental, os camundongos foram sacrificados, amostras de sangue e cérebro foram coletadas. 3Bn17MeP foi quantificado por cromatografia LC/MS-MS em plasma e cérebro. Resultados

[0279] No teste de flexibilidade, camundongos Ts65Dn administrados com veículo foram prejudicados em comparação com WT. A precisão da escolha de camundongos Ts65Dn tratados com veículo não foi acima do nível de chance (Figura 7). A administração de 3Bn17MeP (0,6 µg/ml) aumentou a precisão da escolha de camundongos Ts65Dn que atingiram o nível de WT. Assim, nesse modelo pré-clínico da síndrome de Down 3Bn17MeP restaura totalmente a flexibilidade de aprendizagem, essa função está subjacente às habilidades corretas de memória declarativa/relacional.

[0280] O 3Bn17MeP acessa o cérebro e o plasma dos camundongos Ts65Dn. As concentrações médias no plasma e no cérebro de 3Bn17MeP foram, respectivamente, de 1,33 ng/ml e 5,91 ng/g, o que dá uma razão cérebro/plasma de 4,4. Exemplo 3c: Eficácia do 3Bn17MeP no comprometimento da memória de trabalho associada à síndrome de Down.

[0281] O objetivo desse estudo é avaliar o efeito da administração de 3Bn17MeP no comprometimento da memória de trabalho em camundongos Ts65Dn, um modelo de síndrome de Down. O seguinte teste de memória de trabalho foi realizado em um procedimento de labirinto radial que foi empregado com sucesso para detectar deficiências tanto em pacientes com síndrome de Down (em um labirinto radial virtual) e em camundongos Ts65Dn (em um labirinto radial) usando um protocolo muito semelhante.

Materiais e Métodos

[0282] A tarefa de memória de trabalho foi realizada usando labirintos radiais de 8 braços descritos no Exemplo 3a. O procedimento de restrição alimentar e habituação foi realizado conforme descrito no Exemplo 3a. O procedimento de memória operacional teve início 24 horas após a última sessão de habituação. Cada camundongo foi submetido a 15 sessões de aprendizagem diárias (5 blocos de 3 dias) compostas por 23 tentativas cada. Seis braços de oito foram usados durante o teste de memória operacional (3 pares (A, B ou C) de braços adjacentes). No início de cada sessão diária, o camundongo foi colocado no centro do labirinto sem acesso aos braços. As portas do primeiro par de braços então se abriram dando acesso aos dois braços do par. Assim que o camundongo visitou um dos braços e voltou para a plataforma central, a porta se fechou e o animal foi confinado na plataforma central por 10 segundos (intervalo entre os ensaios, ITI) antes que duas portas se abrissem novamente dando acesso a um par de braços. Assim que o animal visita um dos braços e retorna à plataforma central, as portas se fecham novamente por 10 segundos antes da próxima tentativa. Em cada sessão, o camundongo foi submetido a apresentações repetidas e sucessivas dos 3 pares de braços, um de cada vez. Na primeira apresentação de cada par de braços, a recompensa alimentar estava presente em ambos os braços. Nas apresentações subsequentes de pares de braços, a recompensa alimentar estava presente apenas no braço oposto ao que foi visitado anteriormente, independentemente da correção da resposta anterior. A variável dependente que mede o desempenho da memória de trabalho é a porcentagem de respostas corretas em cada bloco de três sessões.

[0283] 3Bn17MeP (0,06 µg/ml em 0,3% HP-β-CD) ou veículo (0,3% HP- β-CD) foi administrado por via oral ad libitum como bebida diária. Camundongos Ts65Dn e WT machos e fêmeas (3 a 4 meses de idade; n = 24 a 26 por grupo) receberam acesso gratuito ao veículo ou solução de 3Bn17MeP (0,06 µg/ml) 7 dias antes do início do procedimento do labirinto radial e até o final do estudo. Resultados

[0284] A porcentagem de respostas corretas foi fortemente diminuída em camundongos Ts65Dn administrados com veículo em comparação com WT (Figura 8). A administração de 3Bn17MeP (0,06 µg/ml) aumentou as respostas corretas em Ts65Dn em comparação com camundongos de veículo que atingiram o nível de WT no final do procedimento de memória de trabalho. Assim, o 3Bn17MeP corrige o comprometimento da memória de trabalho nesse modelo pré-clínico da síndrome de Down. Exemplo 3d: Eficácia de 3Bn17MeP na deficiência de reconhecimento de objeto associada à síndrome do X frágil.

[0285] O objetivo desse estudo é avaliar o efeito da administração de 3Bn17MeP no comprometimento do reconhecimento de objetos em camundongos fmr1-KO, um modelo pré-clínico da síndrome do X frágil. Materiais e métodos

[0286] O procedimento de reconhecimento de objeto foi executado conforme descrito no Exemplo 3a.

[0287] O efeito de administrações repetidas por via oral de 3Bn17MeP a 15 µg/kg em óleo de milho ou veículo (óleo de milho; 2 ml/kg) foi estudado em camundongos machos fmr1-KO e WT de 2 a 4 meses de idade (n = 7 a 8 por grupo). O 3Bn17MeP foi administrado duas vezes ao dia (às 9h00 e às 17h00) durante 7 dias consecutivos. O teste de reconhecimento de objetos foi realizado no 7º dia, 3 horas após a 13ª administração de 3Bn17MeP ou veículo. Resultados

[0288] Fmr1-KO administrado com veículo de óleo de milho exibe prejuízo no reconhecimento de objeto em comparação com WT (Figura 9). A administração de 3Bn17MeP (15 µg/kg) aumentou o índice de discriminação de camundongos fmr1-KO no nível de WT. Assim, o 3Bn17MeP restaurou a capacidade total de reconhecimento de objetos nesse modelo pré-clínico de X frágil.

Exemplo 3e: Eficácia de 3Bn17MeP no comprometimento da memória relacional/declarativa de longo prazo associado ao envelhecimento.

[0289] O seguinte teste cognitivo foi empregado com sucesso para detectar deficiências de memória declarativa/relacional tanto em sujeitos humanos idosos (em um labirinto radial virtual) e em camundongos idosos (em um labirinto radial) usando um procedimento muito semelhante (Sellami et al., 2017). Na verdade, tanto os sujeitos humanos quanto os camundongos idosos são prejudicados quando o teste de flexibilidade exige a lembrança e a manipulação de duas informações adquiridas dentro de duas sequências temporais distintas. Materiais e Métodos

[0290] A tarefa de memória relacional foi realizada usando labirintos radiais de 8 braços descritos no Exemplo 3b. Os procedimentos de restrição alimentar e habituação foram realizados conforme descrito no Exemplo 3b. A aquisição começou 24 horas após a última sessão de habituação. A fase de aquisição consistiu em aprender as posições dos péletes de alimento dentro do labirinto. A posição da recompensa não mudou ao longo de todo o procedimento. Um braço de cada par continha recompensa em sua extremidade, o outro braço de cada par não tinha isca

[0291] A aquisição é baseada em um procedimento de continuidade/não continuidade. Os braços são apresentados um a um. Espera-se que os indivíduos visitem os braços recompensados mais rápido do que os não recompensados. No início de cada sessão diária, o camundongo foi colocado no centro do labirinto sem acesso aos braços. As portas do primeiro braço então se abriram. Assim que o camundongo visitou o braço e voltou para a plataforma central (ou após um atraso de 90 s se não visitou o braço), a porta se fechou e o animal foi confinado na plataforma central. A porta de um braço é aberta imediatamente após (intervalo entre tentativas de 0 segundo). Assim que o animal visitou o braço e retornou à plataforma central (ou após 90 segundos de atraso se não visitou o braço), a porta se fechou novamente antes da próxima tentativa. Cada sessão diária continha 40 apresentações sucessivas do braço (ou seja, tentativas) organizadas em duas sequências temporais distintas. Na primeira sequência (20 tentativas), quatro braços do labirinto foram apresentados alternadamente (dois com isca e dois sem isca). Consecutivamente, iniciou-se a segunda sequência (20 tentativas); os outros quatro braços do labirinto foram apresentados alternadamente (dois com isca e dois sem isca). Os braços são apresentados em suas respectivas sequências durante toda a fase de aquisição.

[0292] Em cada tentativa, a latência para visitar o braço é medida. Um camundongo foi considerado como tendo adquirido o teste quando atingiu um critério de aprendizagem. Esse critério consistiu em (i) pelo menos 50% menos tempo para visitar os braços premiados em comparação com os braços não premiados, em média em duas sessões consecutivas e (ii) pelo menos 30% menos tempo para visitar os braços premiados em média na última sessão.

[0293] O teste de flexibilidade começou um dia após o critério de aprendizagem ter sido atingido. Na verdade, os camundongos podem realizar o teste de flexibilidade em dias diferentes.

[0294] A flexibilidade de aprendizagem foi avaliada nas seguintes condições. Os oito braços do labirinto foram virtualmente divididos em pares, cada um formado por dois braços adjacentes, um recompensado e outro não recompensado. Os pares consistiam em um braço adquirido na primeira sequência e o outro na segunda sequência. A posição da comida no labirinto não mudou, mas a forma de apresentar os braços mudou. No início da sessão de flexibilidade, o camundongo foi colocado no centro do labirinto sem acesso aos braços. As portas do primeiro par de braços então se abriram dando acesso aos dois braços do par. Assim que o camundongo visitou um braço e voltou para a plataforma central, a porta se fechou e o animal foi confinado na plataforma central. Duas portas se abrem novamente dando acesso a um par de braços imediatamente após (intervalo entre tentativas de 0 segundos).

Assim que o animal visitou um dos braços e voltou para a plataforma central, as portas se fecharam novamente antes do próximo ensaio. O camundongo foi submetido a 20 apresentações repetidas e sucessivas dos pares, um de cada vez.

[0295] A porcentagem de respostas corretas para cada par foi medida. A precisão da escolha para os pares feitos de braços que foram apresentados em diferentes sequências refletiu o desempenho da memória relacional.

[0296] 3Bn17MeP (0,6 µg/ml em 0,3% HP-β-CD) ou veículo (0,3% HP-β- CD) foi administrado por via oral ad libitum como bebida diária. Camundongos C57Bl/6J machos de 19 a 22 meses de idade (n = 9 a 12 por grupo) receberam acesso livre ao veículo ou solução de 3Bn17MeP (0,6 µg/ml) 7 dias antes do início do procedimento do labirinto radial e até o final do estudo.

[0297] No final do estudo comportamental, os camundongos foram sacrificados, amostras de sangue e cérebro foram coletadas. 3Bn17MeP foi quantificado por cromatografia LC/MS-MS em plasma e cérebro. Resultados

[0298] No teste de flexibilidade, a precisão da escolha de camundongos idosos tratados com veículo não foi acima do nível de chance (50%, Figura 10). A administração de 3Bn17MeP (0,6 µg/ml) aumentou fortemente a precisão da escolha de camundongos idosos que alcançaram mais de 70% das respostas corretas. Assim, 3Bn17MeP restaura a capacidade de memória relacional em camundongos idosos.

[0299] O 3Bn17MeP acessa o cérebro e o plasma de camundongos idosos. As concentrações médias no plasma e no cérebro de 3Bn17MeP foram, respectivamente, 1,28 ng/ml e 6,75 ng/g, o que dá uma razão cérebro/plasma de 5,3. Conclusão

[0300] O composto da presente invenção mostra in vivo uma potência muito alta na correção de um amplo espectro de deficiências cognitivas, incluindo a memória declarativa/relacional de longo prazo, reconhecimento e deficiências nas funções executivas. 3Bn17MeP mostra eficácia em vários modelos de distúrbios cognitivos incluindo síndrome de Down, síndrome do X frágil e declínio cognitivo relacionado à idade. Portanto, 3Bn17MeP se beneficia de um amplo espectro de ações na função cognitiva e, portanto, é provavelmente um potencializador cognitivo global. Exemplo 4: 3Bn17MeP não tem nenhum dos efeitos colaterais comportamentais dos antagonistas CB1 ortostéricos

[0301] O perfil farmacológico e os efeitos de 3Bn17MeP em fenótipos relacionados a efeitos adversos do antagonista CB1 ortostérico rimonabanto foram avaliados. Antagonistas ortostéricos CB1, como Acomplia®, foram retirados do mercado devido aos efeitos adversos. Consequentemente, para uma ferramenta terapêutica que inibe o CB1 para ser de uso prático em humanos, não deve ter os efeitos adversos conhecidos dos antagonistas CB1 ortostéricos.

[0302] Os efeitos adversos conhecidos dos antagonistas ortostéricos dos receptores CB1 e em particular do rimonabanto são: 1. Redução da ingestão de alimentos e do peso corporal que é um sinal de um efeito não específico nas vias de recompensa; 2. Uma indução de comportamento relacionado à ansiedade e à depressão.

[0303] Portanto, os efeitos do 3Bn17MeP na ingestão de alimentos, no peso corporal e nos comportamentos relacionados à ansiedade e à depressão em camundongos foram comparados aos do antagonista CB1 ortostérico rimonabanto.

[0304] O rimonabanto é conhecido por induzir alterações nos comportamentos espontâneos em roedores, como coçar, hiperatividade seguida de sedação e convulsões em doses que são 6 vezes a dose terapêutica para o tratamento da obesidade (Zavatti et al., 2011; discussão EPAR, EMEA 2006). De fato, o efeito de 3Bn17MeP em comportamentos espontâneos foi estudado em camundongos. Exemplo 4a: Ausência de efeitos indesejáveis induzidos por

3Bn17MeP na ingestão de alimentos e peso corporal em comparação com rimonabanto em camundongos do tipo selvagem

[0305] Esses experimentos objetivaram avaliar a capacidade de um tratamento agudo com 3Bn17MeP para diminuir a ingestão de alimentos em camundongos magros alimentados ad libitum com ração de laboratório padrão e comparar esses efeitos potenciais com aqueles do antagonista CB1 ortostérico rimonabanto. A ingestão alimentar e o peso corporal foram estudados porque a diminuição na ingestão alimentar e no peso corporal é uma consequência prototípica dos antagonistas ortostéricos CB1 tanto em camundongos quanto em humanos (Carai et al., 2006). Materiais e Métodos Efeitos de uma administração aguda de 3Bn17MeP na ingestão de alimentos em camundongos magros ad libitum alimentados com ração padrão

[0306] A ingestão espontânea de ração padrão em camundongos foi avaliada durante a fase escura do ciclo claro-escuro. A quantidade de comida ingerida foi medida no momento do apagamento, 3 horas e 13 horas após o apagamento.

[0307] O efeito de uma administração aguda de 3Bn17MeP (0,05, 5, 15 e 30 mg/kg, via oral em óleo de milho, 5 ml/kg) ou veículo (óleo de milho) na ingestão de alimentos foi comparado ao de rimonabanto (10 mg/kg, via intraperitoneal em 0,9% NaCl contendo 2% DMSO e 2% Tween80, 10 ml/kg) ou veículo (2% DMSO e 2% Tween80 em 0,9% NaCl) em camundongos machos C57BL/6J (n = 7 a 8 por grupo). 3Bn17MeP e rimonabanto foram administrados 3 horas e 30 minutos antes do início da fase escura, respectivamente. Efeitos de administrações repetidas de 3Bn17MeP no peso corporal de camundongos magros alimentados ad libitum com ração padrão

[0308] O efeito de administrações repetidas de 3Bn17MeP (0,05, 5, 15 e 30 mg/kg, via oral em óleo de milho, 5 ml/kg) ou veículo (óleo de milho) no peso corporal foi comparado ao de rimonabanto (10 mg/kg, via intraperitoneal em 0,9% NaCl contendo 2% DMSO e 2% Tween80, 10 ml/kg) ou veículo (2% DMSO e 2% Tween80 em 0,9% NaCl) em camundongos machos C57BL/6J (n = 7 a 8 por grupo). 3Bn17MeP e rimonabanto foram administrados uma vez ao dia durante 40 dias. Os camundongos foram pesados antes da administração do medicamento todos os dias na primeira semana de tratamento e, em seguida, quatro dias por semana. Resultados

[0309] 3Bn17MeP (0,05, 5; 15 e 30 mg/kg) não modificou a ingestão de alimentos em comparação com o veículo (Figura 11A), enquanto o rimonabanto (10 mg/kg) diminuiu significativamente a ingestão de alimentos durante as primeiras 3 horas após o apagamento (Figura 11B). Nas mesmas doses, o 3Bn17MeP não modificou a evolução do peso corporal durante os 40 dias de administração repetida em comparação com o veículo (Figura 11C). Por outro lado, o rimonabanto (10 mg/kg) diminuiu o peso corporal dos camundongos durante esse período (Figura 11D). Exemplo 4b: Ausência de efeitos indesejáveis induzidos por 3Bn17MeP em comportamentos semelhantes aos de ansiedade e depressão em comparação com rimonabanto em camundongos do tipo selvagem

[0310] Os comportamentos relacionados à ansiedade e à depressão foram estudados porque o aumento da ansiedade e da depressão são consequências do tratamento repetido com antagonistas ortostéricos CB1 tanto em roedores quanto em humanos (Bellocchio et al., 2013; Moreira et al., 2009). Comportamentos semelhantes à ansiedade foram estudados no labirinto em cruz elevado (LCE) porque este modelo é amplamente utilizado em roedores para avaliar os efeitos ansiogênicos ou ansiolíticos putativos de compostos farmacológicos (Walf e Frye, 2007). Os comportamentos relacionados à depressão foram estudados por meio do teste de preferência pela sacarose, amplamente utilizado como modelo de anedonia, um dos principais sintomas da depressão (Overstreet, 2012).

[0311] O objetivo desses experimentos foi avaliar os efeitos de um tratamento repetido com 3Bn17MeP na depressão e nos comportamentos relacionados à ansiedade em camundongos. Esses efeitos foram comparados aos do antagonista do receptor CB1 ortostérico, rimonabanto, conhecido por induzir comportamentos semelhantes aos da depressão e da ansiedade, tanto em camundongos quanto em humanos. Materiais e Métodos Comportamentos de ansiedade no labirinto em cruz elevado

[0312] O aparelho EPM era feito de cloreto de polivinila cinza e consistia em quatro braços elevados. Os braços (altura, 60 cm; comprimento, 37 cm; largura, 6 cm; cada) estavam dispostos em forma de cruz, com dois braços opostos cercados por paredes e os outros dois abertos. Uma câmera de vídeo colocada no topo do labirinto e conectada a um sistema de rastreamento permitiu a pontuação automática da locomoção dos camundongos no labirinto. A intensidade da luz do labirinto foi fixada em 45 lux nos braços abertos. Um camundongo foi colocado no centro do EPM e então ficou livre para explorar todo o labirinto por 5 minutos. O tempo gasto e o número de entradas nos braços abertos e fechados foram medidos. Uma diminuição nas porcentagens de visitas e/ou do tempo gasto de braços abertos reflete um aumento nos níveis de ansiedade.

[0313] O efeito da administração via oral aguda de 3Bn17MeP dissolvido em óleo de milho a 30 mg/kg ou de veículo (óleo de milho; 5 ml/kg) foi estudado no teste de EPM em camundongos C57Bl/6J machos de 2 meses de idade (n = 10 por grupo). O teste de EPM foi realizado 3 horas após a administração de 3Bn17MeP. Rimonabanto foi dissolvido em um veículo contendo DMSO, (2%), Tween80 (2%) em NaCl injetável 0,9%. No mesmo estudo, o efeito da injeção intraperitoneal de rimonabanto a 10 mg/kg ou de veículo sozinho (10 ml/kg) foi estudado no EPM em camundongos C57Bl/6J machos de 2 meses de idade (n = 10 por grupo). O teste de EPM foi realizado 30 minutos após a injeção de rimonabanto.

Comportamentos de tipo depressivo no teste de preferência de sacarose

[0314] A preferência pela sacarose foi testada nas gaiolas dos camundongos. Uma solução de sacarose contendo 2% de sacarose (D(+) sacarose) em água da torneira foi vertida em frascos graduados de plástico (volume em cada frasco, 45 ml). Garrafas idênticas foram enchidas com água da torneira. Todos os camundongos foram primeiro habituados aos frascos e à solução de sacarose. Uma garrafa contendo água e uma garrafa contendo sacarose foram colocadas na tremonha de cada gaiola. Para garantir que os animais não apresentavam preferência pelo lado da bebida, metade dos frascos contendo cada solução foram colocados no lado esquerdo da tremonha e a outra metade no lado direito. Os camundongos tiveram acesso às soluções desde o início da fase escura, no pico diário do consumo de ração e água (das 19h às 8h30). O teste de preferência de sacarose foi realizado sete dias depois. As soluções de água e sacarose foram apresentadas conforme descrito para habituação, exceto que os camundongos tiveram acesso às soluções das 12h às 22h. Em cada momento, as garrafas foram pesadas, 1 g correspondendo a 1 ml. O volume de ingestão foi calculado subtraindo o peso inicial da garrafa ao peso final da garrafa.

[0315] O efeito de administrações repetidas via oral de 3Bn17MeP dissolvido em óleo de milho a 0,05; 5; 15 ou 30 mg/kg ou de veículo (óleo de milho; 5 ml/kg) foi estudado no teste de preferência de sacarose em camundongos C57Bl/6J machos de 2 meses de idade (n = 7 a 8 por grupo). Rimonabanto foi dissolvido em um veículo contendo dimetilsulfóxido (DMSO, 2%), Tween80 (2%) em NaCl injetável 0,9%. No mesmo estudo, o efeito de injeções intraperitoneais repetidas de rimonabanto a 10 mg/kg ou de veículo sozinho (10 ml/kg) foi estudado no teste de preferência de sacarose em camundongos C57Bl/6J machos de 2 meses de idade (n = 8 por grupo). 3Bn17MeP e rimonabanto foram administrados uma vez ao dia durante 28 dias. O teste de preferência de sacarose foi realizado no 28º dia, as soluções de sacarose e água foram entregues 3 horas após a administração de 3Bn17MeP e 30 min após a administração de rimonabanto. Resultados

[0316] 3Bn17MeP, administrado a 30 mg/kg de forma aguda, não teve efeito na porcentagem de tempo gasto e na porcentagem de visitas nos braços abertos do labirinto em cruz elevado (Figura 12A). Por outro lado, o rimonabanto a 10 mg/kg reduziu significativamente o tempo gasto e o número de visitas nos braços abertos (Figura 12B).

[0317] As administrações crônicas de 3Bn17MeP até 30 mg/kg não tiveram efeito sobre a ingestão de sacarose em nenhuma das doses testadas (0,05; 5; 15; 30 mg/kg), enquanto o rimonabanto (10 mg/kg) reduziu pela metade o consumo de sacarose nas mesmas condições (Figuras 12C e D).

[0318] Esses resultados mostram que as administrações repetidas de 3Bn17MeP não induzem comportamentos do tipo depressão ou ansiedade em camundongos. Em contraste, o antagonista ortostérico do receptor CB1 rimonabanto (10 mg/kg) induz anedonia no teste de preferência de sacarose e aumenta comportamentos semelhantes aos de ansiedade no labirinto em cruz elevado. Esses resultados estão de acordo com estudos anteriores que relataram efeitos semelhantes do rimonabanto em roedores em doses tão baixas quanto 1 mg/kg (Beyer et al., 2010; Patel e Hillard, 2006). Exemplo 4c: 3Bn17MeP não tem efeito sobre comportamentos espontâneos em camundongos.

[0319] 3Bn17MeP não teve efeitos detectáveis nos comportamentos por si só em roedores, como mostrado pela análise de vídeo de comportamentos espontâneos na gaiola doméstica durante 24 horas após a administração via oral de 3Bn17MeP em camundongos a 30 mg/kg. Conclusão

[0320] Os efeitos adversos do rimonabanto são comparados com os efeitos do 3Bn17MeP na TABELA 3. Tabela 3: 3Bn17MeP não tem nenhum dos efeitos adversos do rimonabanto

3Bn17MeP Rimonabanto Dose SISTEMA DE mais N N

IN VIVO TESTE Efeito alta dobras Efeito ID100 dobras testada ID100* ID100** (mg/kg) Inibição da ingestão de alimentos e peso Camundongos Não 30 2.000 Sim 10 1 corporal machos (administração repetida) Aumento de comportamentos Camundongos de ansiedade Não 30 2.000 Sim 10 1 machos (administração aguda) Aumento de comportamentos relacionados à Camundongos Não 30 2.000 Sim 10 1 depressão machos (administração repetida) *= Dose capaz de restaurar a capacidade total de reconhecimento de objetos tomar como referência; isto é, 15 µg/kg, administração via oral em óleo de milho **= Referência ID100 para efeitos de rimonabanto = 10 mg/kg.

[0321] Os efeitos do 3Bn17MeP são muito diferentes daqueles do antagonista ortostérico CB1 rimonabanto.

[0322] 3Bn17MeP não tem nenhum dos efeitos adversos típicos de rimonabanto e outros antagonistas ortostéricos CB1, como diminuição na ingestão de alimentos, aumento nos comportamentos relacionados à ansiedade e depressão. Essa falta de efeitos de 3Bn17MeP foi observada para todas as doses mais altas usadas em cada teste. Além disso, 3Bn17MeP não induz a modificação de comportamentos espontâneos em camundongos. Essas doses de 3Bn17MeP foram várias vezes maiores do que as alterações cognitivas reversíveis de dose em todos os modelos de distúrbio cognitivo testados. Exemplo 5: 3Bn17MeP não é tóxico in vitro e mostra um perfil de segurança vantajoso in vivo Exemplo 5a: Toxicidade in vitro de 3Bn17MeP

[0323] Para estudar o potencial de toxicidade in vitro de 3Bn17MeP, quatro modelos foram usados: 1. Neurotoxicidade em cultura primária de neurônios corticais de camundongos. 2. Hepatotoxicidade e função biliar em cultura primária de hepatócitos de camundongo em configuração sanduíche. 3. Medição da genotoxicidade da fosforilação de Histona H2AX (γH2AX) em células HeLa. Nesses ensaios, o efeito do 3Bn17MeP foi comparado com o do rimonabanto. 4. Cardiotoxicidade, medindo a inibição da corrente hERG em células hERG-CHO. 3Bn17MeP foi testado até 100 µM. Material e Métodos Neurotoxicidade

[0324] O objetivo desse estudo foi analisar os efeitos citotóxicos do 3Bn17MeP e do rimonabanto em cultura primária de neurônios corticais. Neurônios corticais primários cultivados de embriões de camundongo E19 foram tratados com 3Bn17MeP, rimonabanto (ambos a 0, 10, 30 ou 100 µM em NMP 0,1%) ou estaurosporina (100 nM, usado como um composto de referência) e um marcador de citólise fluorescente solúvel. As células foram seguidas por imagens de lapso de tempo durante 72 horas. As células foram então permeabilizadas. Este procedimento permitiu expressar a citólise ao longo do tempo como uma porcentagem do número total de células por poço. Genotoxicidade

[0325] Esse estudo teve como objetivo medir a fosforilação da Histona H2AX (γH2AX), que é a resposta celular ao dano ao DNA resultando em quebras de DNA de fita dupla. Esse experimento foi realizado em células HeLa tratadas com 3Bn17MeP (0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 e 100 µM em NMP, 0,1%) ou com rimonabanto (0,1, 0,3, 1 ou 100 µM em NMP, 0,1%) para 24 horas. Etoposídeo a 3 µM foi adicionado como controle positivo dos efeitos genotóxicos. Uma imunofluorescência foi realizada em células tratadas com um anticorpo específico contra a histona fosforilada gH2AX. Os núcleos foram corados com um agente intercalante de DNA fluorescente. As células coradas foram fotografadas e analisadas no imageador BD Pathway 855 imager®. Hepatotoxicidade e função biliar

[0326] O objetivo deste estudo foi analisar os efeitos citotóxicos do 3Bn17MeP em cultura primária de hepatócitos de camundongos. A porcentagem de hepatócitos citolisados ao longo do tempo foi determinada por imagem de lapso de tempo com um marcador de citólise fluorescente. O número de canalículos biliares após 48 horas de tratamento foi determinado usando um análogo de sal biliar fluorescente.

[0327] Os hepatócitos primários de camundongos Wistar com 10-12 semanas de idade foram isolados usando um método de perfusão de colagenase em duas etapas. Após 24 horas, as células foram cobertas com uma camada de Matrigel para realizar uma cultura de configuração em sanduíche. Após 24 horas, as células foram tratadas com 3Bn17MeP ou rimonabanto (0, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 e 100 µM em NMP, 0,1%) e um marcador de citólise fluorescente e, em seguida, monitorado por fluorescente e intervalo de tempo de contraste de fase imagem por 48 horas. As células foram então coradas usando um análogo de sal biliar fluorescente para medir o estado da rede de canalículos biliares e a atividade da bomba Bsep. Paracetamol (30 mM) e Ciclosporina A (1 µM) foram adicionados como controles positivos de hepatotoxicidade e perda de canalículos biliares, respectivamente. Cardiotoxicidade

[0328] Esse estudo teve como objetivo medir o efeito do 3Bn17MeP na corrente do canal hERG, que é fundamental para a repolarização dos potenciais de ação dos cardiomiócitos. Essa experiência foi realizada em células hERG-CHO-K1 tratadas com 3Bn17MeP (0,1, 1 e 10 µM em DMSO, 1%) durante 5 min. E-4031 a 0,3 µM foi adicionado como controle positivo dos efeitos cardiotóxicos. A corrente hERG foi registrada pela técnica patch clamp de célula inteira automatizada. O grau de inibição (%) foi obtido medindo-se a diferença entre as amplitudes da corrente de cauda induzidas pelo protocolo de estimulação (+20 mV, 2 s e -40 mV, 1 s) aplicado antes e após a incubação do fármaco. Resultados

[0329] Em nenhuma das doses testadas e em nenhum dos testes realizados, neurotoxicidade (Figura 13A), genotoxicidade (Figura 13B), hepatotoxicidade (Figura 14A), funções biliares (Figura 14B) e cardiotoxicidade, 3Bn17MeP apresentaram efeito tóxico.

[0330] Em contraste, o rimonabanto mostrou neurotoxicidade significativa a partir de 10 µM e induziu 80% da morte de células neurais a partir de 30 µM (Figura 13A). O rimonabanto mostrou genotoxicidade, pois induziu danos ao DNA a 100 µM (Figura 13B). Rimonabanto apresentou efeito hepatotóxico, pois a partir de 10 µM induziu 100% da morte de hepatócitos e suprimiu canalículos biliares (Figura 14A-B). Para 3Bn17MeP, a dose máxima testada (100 µM) é

2.000 vezes maior do que o ID100 de 3Bn17MeP para inibir a diminuição induzida por THC na respiração celular (50 nM) em HEK-293 transfectada com os receptores CB1 humanos (Figura 5A). Exemplo 5b: Segurança in vivo de 3Bn17MeP

[0331] Esse estudo (CERB, França) teve como objetivo avaliar o efeito in vivo do 3Bn17MeP em camundongos Sprague-Dawley após a administração de 3Bn17MeP administrado por rota oral uma vez por dia durante 7 dias.

Material e métodos:

[0332] Os camundongos (5 machos, 5 fêmeas) receberam uma dose fixa de 3Bn17MeP (20 mg/kg em 10 ml/kg de óleo de milho) uma vez por dia por via oral durante 7 dias.

[0333] As verificações de morbidade/mortalidade foram realizadas duas vezes ao dia. As observações clínicas foram realizadas antes da primeira dosagem e, em seguida, diariamente. Os testes funcionais e neurocomportamentais foram realizados antes da primeira dosagem e no último dia de tratamento. O peso corporal foi registrado no Dia 1, Dia 3, Dia 5 e Dia 7. O consumo de alimentos foi medido semanalmente.

[0334] Amostras de sangue para parâmetros hematológicos e análises de química clínica foram coletadas no dia da necropsia (Dia 8).

[0335] Amostras de sangue para análise do fármaco no plasma foram coletadas após o último tratamento, 5 e 24 horas após a dose. A quantificação foi feita por cromatografia LC/MS-MS.

[0336] Os animais foram sacrificados no Dia 8. Os órgãos selecionados foram pesados, fixados, preservados na necropsia e examinados histopatologicamente. Resultados:

[0337] As únicas mudanças menores foram observadas na hematologia e na química do sangue. Em hematologia, houve uma tendência para contagens de glóbulos brancos mais baixas em homens e mulheres e uma ligeira tendência para contagens de glóbulos vermelhos mais baixas em homens. Na química do sangue, houve uma tendência para diminuir o nível de proteína total e um nível mais alto de triglicerídeos. Nas mulheres, houve tendência a um nível mais baixo de triglicerídeos. Mas essas alterações não foram associadas a quaisquer alterações histopatológicas.

[0338] No Dia 7, 5 horas após o último tratamento, a concentração plasmática média de 3Bn17MeP era de 4652,4 ng/ml. 24 horas após o tratamento, a concentração plasmática média diminuiu para 973,8 ng/ml. Esses resultados mostraram que o 3Bn17MeP foi absorvido e que 24 horas após a última administração, não foi totalmente eliminado.

[0339] Como comparação, a concentração plasmática média medida em camundongos após um mês de administração de 3Bn17MeP em água potável em uma concentração que revertia deficiências de memória de longo prazo associadas ao envelhecimento (exemplo 7) e à síndrome de Down (exemplo 4) foi de 1,3 ng/ml. A razão entre essa concentração e a concentração plasmática de 3Bn17MeP medida 5 horas após a última administração nesse estudo de toxicidade (4652,4 ng/ml) revelou uma janela de alta segurança >3.500. Conclusão:

[0340] Nas condições experimentais adotadas, o 3Bn17MeP administrado por via oral durante 7 dias consecutivos não induziu nenhum sinal de toxicidade na dose de 20 mg/kg/dia nos camundongos Sprague-Dawley. Consequentemente, após tratamento repetido em dose única, a dose máxima tolerada (MTD) é considerada superior a 20 mg/kg/dia.

[0341] A razão entre a concentração plasmática medida durante o teste de segurança e o experimento de eficácia mostra uma janela de alta segurança >3.500.

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Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. Composto de acordo com a Fórmula (I): Fórmula (I) caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de distúrbios cognitivos.

2. Composto para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o distúrbio cognitivo é um distúrbio neurocognitivo escolhido entre os seguintes distúrbios: delírio, distúrbio neurocognitivo maior ou distúrbio neurocognitivo leve.

3. Composto para uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o distúrbio neurocognitivo está relacionado a pacientes diagnosticados com uma patologia escolhida dentre: doenças neurodegenerativas, em particular doença de Alzheimer, degeneração lobar frontotemporal, demência por corpos de Lewy, doença de Parkinson ou doença de Huntington, doença vascular, lesão cerebral traumática, uso de substância/medicamento, infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), doença de príon.

4. Composto para uso, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o distúrbio neurocognitivo está relacionado a pacientes diagnosticados com uma doença neurodegenerativa como doença de Alzheimer, degeneração lobar frontotemporal, demência por corpos de Lewy doença de Parkinson ou doença de Huntington.

5. Composto para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou 4, caracterizado pelo fato de que o distúrbio neurocognitivo está relacionado a pacientes diagnosticados com doença de Alzheimer.

6. Composto para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que o distúrbio neurocognitivo está relacionado a pacientes diagnosticados com doença de Parkinson.

7. Composto para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o distúrbio cognitivo está relacionado ao declínio cognitivo relacionado à idade.

8. Composto para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o distúrbio cognitivo é um distúrbio do neurodesenvolvimento.

9. Composto para uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o distúrbio do neurodesenvolvimento está relacionado a pacientes diagnosticados com uma patologia escolhida dentre: doença genética, como síndrome de Down, síndrome do X frágil, esclerose tuberosa, síndrome de Rett, síndrome de William, espinha bífida ou condições médicas, como epilepsia, doenças metabólicas; anomalias de desenvolvimento, em particular malformações cerebrais, doenças maternas, em particular doença placentária ou fatores ambientais perinatais, em particular exposição fetal a álcool, toxinas e teratógenos.

10. Composto para uso, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o distúrbio do neurodesenvolvimento está relacionado a pacientes diagnosticados com dificuldades intelectuais, dificuldades de desenvolvimento intelectual, distúrbios de comunicação, espectro do autismo, transtorno de déficit de atenção/hiperatividade (ADHD), transtorno de aprendizagem específico ou distúrbios motores do desenvolvimento.

11. Composto para uso, de acordo com a reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que o distúrbio do neurodesenvolvimento está relacionado a pacientes diagnosticados com uma doença genética, como síndrome de Down, síndrome do X frágil, esclerose tuberosa, síndrome de Rett,

síndrome de William, espinha bífida.

12. Composto para uso, de acordo com as reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que o distúrbio do neurodesenvolvimento está relacionado a pacientes diagnosticados com uma doença genética, como síndrome de Down

13. Composto para uso, de acordo com as reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que o distúrbio do neurodesenvolvimento está relacionado a pacientes diagnosticados com uma doença genética, como síndrome do X frágil.

14. Composto para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o dito composto é administrado a um indivíduo por uma rota escolhida dentre: rota oral, rota parenteral, rota intravenosa, rota subcutânea, rota intranasal ou rota intramuscular.

15. Composto para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o dito composto é administrado a um indivíduo em uma dose compreendida entre 1 µg a 1.000 mg.