BR112021008888A2 - fragmentos de peptídeos para o tratamento de diabetes - Google Patents
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Abstract
fragmentos de peptídeos para o tratamento de diabetes. a presente invenção diz respeito a agentes e ao uso dos mesmos no tratamento de doenças endócrinas, nutricionais e/ou metabólicas em um mamífero. a invenção também diz respeito a novos fragmentos de peptídeos.
Description
“FRAGMENTOS DE PEPTÍDEOS PARA O TRATAMENTO DE DIABETES” Campo Técnico
[0001] A presente revelação se refere a peptídeos úteis para o tratamento do diabetes e distúrbios associados. Antecedentes da Invenção
[0002] O hormônio peptídico insulina, que é produzido pelas células β nas ilhotas de Langerhans no pâncreas, é liberado em resposta ao aumento dos níveis de glicose no sangue. Dessa forma, a glicose é removida do sangue por estimulação dependente de insulina dos transportadores de glicose localizados nas membranas celulares do tecido-alvo, como por exemplo, o tecido adiposo, músculo esquelético e fígado. A insulina exerce seus efeitos biológicos ligando e ativando o receptor de insulina ligado à membrana (IR), iniciando assim uma cascata de eventos de sinalização intracelular, que regulam múltiplos processos biológicos, como o metabolismo da glicose e dos lipídios.
[0003] Atualmente, o tratamento do diabetes, tanto do diabetes tipo 1 quanto do tipo 2, depende principalmente do tratamento de insulina. Um complemento ao tratamento de insulina são os agonistas do receptor do peptídeo semelhante a glucagon 1 (GLP-1) de ação prolongada, ou seja, derivados que atuam no mesmo receptor que o GLP-1. O GLP-1 é um hormônio metabólico que estimula a secreção de insulina. Além de aumentar a secreção de insulina do pâncreas de forma dependente da glicose, o GLP-1 é conhecido por aumentar a sensibilidade à insulina nas células α e β; por aumentar a massa de células β e da expressão de insulina, a modificação após a tradição, e a secreção; e diminuir a secreção de glucagon do pâncreas. Outros medicamentos utilizados complementares ao tratamento de insulina com o objetivo de reduzir os níveis de glicose plasmática incluem inibidores da DPP-IV, metformina, inibidores do SGLT-2 e sulfonilureia.
[0004] Certas desvantagens estão associadas ao uso prolongado da insulina, como ganho de peso e aumento dos riscos de câncer e hipoglicemia. Assim, há uma demanda crescente na área por novos compostos não insulínicos capazes não apenas de tratar o diabetes, abordando a resistência à insulina e a hiperglicemia, mas também reduzir complicações associadas e derivadas.
[0005] Portanto, a identificação de novos compostos que podem restaurar o metabolismo da glicose e tratar o diabetes e distúrbios relacionados é altamente relevante. Múltiplas abordagens podem ser contempladas, embora nenhuma delas seja óbvia para a pessoa versada na técnica. Sumário
[0006] Os presentes inventores descobriram que os peptídeos que estimulam a proliferação de células β têm a capacidade de resgatar células β da apoptose induzida por condições glicotóxicas e estimulam a secreção de insulina das células β de ratos INS-1, assim como das ilhotas pancreáticas isoladas de camundongo. Além disso, os presentes inventores descobriram que, em um teste de tolerância à glicose, os peptídeos reduziram os níveis plasmáticos de glicose in vivo e retardaram o surgimento do diabetes em ratos BB lyp/lyp, um modelo para o diabetes tipo
1. Portanto, os peptídeos da presente revelação são adequados para uso no tratamento de doenças e distúrbios endócrinos, nutricionais e metabólicos.
[0007] Em um aspecto, a presente revelação se refere a um agente que compreende ou consiste em um peptídeo ou análogo de peptídeo, em que o peptídeo ou o análogo de peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos da fórmula geral: X1LX2YGIK (SEQ ID NO: 177) em que: X1 é E ou G; X2 é S ou T; com a condição de que se X2 é T, então o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende no máximo 25 aminoácidos; e com a condição de que se X1 é E X2 é S, o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende no máximo 85 resíduos de aminoácidos.
[0008] Em um aspecto, a presente revelação se refere a um agente compreendendo um peptídeo ou análogo de peptídeo que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos DTYDGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 4), TYDGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 8), YDGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 13) e DGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 19). GDISVVYGLR (SEQ ID NO: 26), DISVVYGLR (SEQ ID NO: 34);
[0009] Em um aspecto, a presente revelação se refere a uma composição que compreende o agente descrito na presente invenção.
[0010] Em um aspecto, a presente revelação se refere a um polinucleotídeo que codifica, na expressão, um peptídeo ou análogo de peptídeo, conforme é descrito na presente invenção.
[0011] Em um aspecto, a presente revelação se refere a um vetor que compreende um polinucleotídeo, conforme é descrito na presente invenção.
[0012] Em um aspecto, a presente revelação se refere a uma célula que compreende um polinucleotídeo ou um vetor, conforme é descrito na presente invenção.
[0013] Em um aspecto, a presente revelação se refere a um agente, um polinucleotídeo, um vetor, uma célula ou uma composição, conforme é descrito na presente invenção, para uso como um medicamento.
[0014] Em um aspecto, a presente revelação se refere a um agente que compreende: a) um peptídeo ou um análogo de peptídeo selecionado do grupo consistindo em: (i) um peptídeo que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos da fórmula geral: X1LX2YGIK (SEQ ID NO: 177) em que: X10 é E ou G; X12 é S ou T; com a condição de que se X12 é T, o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende no máximo 25 resíduos de aminoácidos; (ii) um peptídeo que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos da fórmula geral:
Z1Z2SZ3Z4YGLR (SEQ ID NO: 178) em que: Z1 é D ou G; Z2 é I ou G; Z3 é V ou L; Z4 é V ou A; e (iii) um peptídeo que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste na VDTYDGDISVVYGL (SEQ ID NO: 3) VDTYDGDISVVYG (SEQ ID NO: 6), VDTYDGDISVVY (SEQ ID NO: 10), VDTYDGDISVV (SEQ ID NO: 15), VDTYDGDISV (SEQ ID NO: 21) e VDTYDGDIS (SEQ ID NO: 28); b) um polinucleotídeo que codifica, na expressão, o peptídeo de a); c) um vetor que compreende o polinucleotídeo de b); ou d) uma célula que compreende o polinucleotídeo de b), ou o vetor de c). para uso no tratamento de uma doença endócrina, uma doença nutricional e/ou uma doença metabólica em um mamífero.
[0015] Em um aspecto, a presente revelação diz respeito a um método de tratamento de uma doença endócrina, uma doença nutricional e/ou uma doença metabólica, o método compreendendo a administração de uma quantidade terapêutica eficaz de um agente, uma composição, um polinucleotídeo, um vetor ou uma célula, como aqui descrito, a um indivíduo em necessidade do mesmo.
[0016] Em um aspecto, a presente revelação diz respeito ao uso de um agente, uma composição, um polinucleotídeo, um vetor ou uma célula, conforme é descrito na presente invenção, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença endócrina, uma doença nutricional e/ou uma doença metabólica.
[0017] Em um aspecto, a presente revelação diz respeito a um método para retardar o surgimento do diabetes, o método compreendendo a administração de uma quantidade terapêutica eficaz de um agente, uma composição, um polinucleotídeo, um vetor ou uma célula, como aqui descrito, a um indivíduo em necessidade do mesmo.
[0018] Em um aspecto, a presente revelação diz respeito a um método para diminuir os níveis de glicemia, o método compreendendo a administração de uma quantidade terapêutica eficaz de um agente, uma composição, um polinucleotídeo, um vetor ou uma célula, como aqui descrito, a um indivíduo em necessidade do mesmo.
[0019] Em um aspecto, a presente revelação diz respeito a um método, por exemplo, a um método in vitro, para melhorar a morfologia das células beta, o método compreendendo a administração de uma quantidade terapêutica eficaz de um agente, uma composição, um polinucleotídeo, um vetor ou uma célula, como aqui descrito, a um indivíduo em necessidade do mesmo.
[0020] Em um aspecto, a presente revelação diz respeito a um método para melhorar a viabilidade das células beta, o método compreendendo a administração de uma quantidade terapêutica eficaz de um agente, uma composição, um polinucleotídeo, um vetor ou uma célula, como aqui descrito, a um indivíduo em necessidade do mesmo.
[0021] Em um aspecto, a presente revelação diz respeito ao uso de agente aqui descrito para a preparação de uma composição diagnóstica para o diagnóstico de uma doença, distúrbio ou dano ao pâncreas em um indivíduo. Descrição dos desenhos
[0022] Figura 1. FOL-005 e FOL-014 induziu a proliferação de células β. A adição de concentrações crescentes de FOL-005 na solução induziu a crescente proliferação de células INS-1 após 48 horas (figura 1A). Os poços revestidos com FOL-005 e bloqueados com albumina sérica bovina (BSA) induziram mais a proliferação de células β em comparação com os poços apenas com controle revestido com BSA (ctrl) (figura 1B). Os poços pré-revestidos com FOL-014 e bloqueados com BSA induziram mais a proliferação em comparação com apenas poços revestidos com BSA (figura 1C). Os dados são apresentados como contagens por minuto (CPM) em relação às células de controle não estimuladas (ctrl). As médias ± SD são apresentadas para 10 a 12 observações diferentes em cada grupo.
[0023] Figura 2. FOL-005 protegeu as células β contra a glicotoxicidade. As células INS-1 incubadas durante 48 h em glicose 20 mM apresentaram mais células apoptóticas (positivas para anexina V) em comparação com as células incubadas em glicose 5 mM. A adição de FOL-005 às células incubadas com glicose 20 mM reduziu o nível de células apoptóticas em comparação com apenas glicose 20 mM (figura 2A). A apoptose medida pela atividade da caspase-3 foi aumentada nas células INS-1 em glicose 20 mM em comparação com a glicose 5 mM. FOL-005 diminuiu a taxa de atividade da caspase-3 induzida pela glicotoxicidade (figura 2B). As médias ± SD são apresentadas para 4 a 8 observações diferentes em cada grupo.
[0024] Figura 3. A secreção de insulina foi aumentada a partir das ilhotas e células β após a estimulação com FOL-005. O FOL-005 estimulou as células β e a secreção de insulina a partir das ilhotas. A liberação de insulina das células INS-1 aumentou após a estimulação com FOL-005 (6 μM) em meio não contendo glicose em comparação com o controle não estimulado (ctrl) e com um peptídeo de controle scrambled (FOL-015) (figura 3A). Liberação de insulina estimulada por FOL-005 a partir de INS-1 tanto em concentração de glicose baixa (5 mM) quanto alta (20 mM) (figura 3B). Ilhotas pancreáticas isoladas de camundongo estimuladas com FOL-005 (6 μM) ou GLP-1 (100 nM) secretaram mais insulina em comparação com as ilhotas de controle não estimuladas (figura 3C). As médias ± SD são apresentadas para 5 a 6 observações diferentes em cada grupo.
[0025] Figura 4. A secreção de insulina foi aumentada a partir das ilhotas e células β após a estimulação com FOL-014. FOL-014 estimulou a secreção de insulina a partir das células β e ilhotas pancreáticas. As células INS- 1 estimuladas com FOL-014 (6 μM) secretaram mais insulina em comparação com as células controle não estimuladas (figura 4A). As ilhotas pancreáticas isoladas de camundongo estimuladas com FOL-014 (6 μM) secretaram mais insulina em comparação com as ilhotas de controle (figura 4B). A adição de GLP-1 (100 nM) ou FOL-014 (0,6 μM) não teve efeito na secreção da insulina. As médias ± SD são apresentadas para 5 a 6 observações diferentes em cada grupo.
[0026] Figura 5. O efeito de FOL-014 sobre a secreção de insulina foi dependente da dose. A estimulação das células INS-1 aumentando as doses de FOL-014 resultou em um aumento significativo na secreção de insulina para todas as concentrações testadas. A secreção de insulina aumentou de forma linear na presença de FOL-014 variando de 0,6 nM a 60 nM. Concentrações mais elevadas pareceram resultar em um efeito menos acentuado na secreção de insulina. Além disso, a secreção de insulina induzida por FOL-014 foi comparável ao efeito de GLP-1 100 nM. As barras representam os valores médios e o erro padrão da média (EPM).
[0027] Figura 6. O efeito de FOL-014 sobre a secreção de insulina foi dependente da concentração de glicose. A secreção de insulina a partir de células INS-1 não tratadas ou expostas a FOL-014 foi medida na presença de concentrações crescentes de glicose. Nos níveis de glicose de 5,5 mM ou maiores, a secreção de insulina foi significativamente maior nas células tratadas com FOL-014, em comparação com as células de controle não tratadas. As barras representam os valores médios e o erro padrão da média (EPM).
[0028] Figura 7. A dosagem combinada de FOL-005 e FOL-014 juntamente com GLP-1 nativo provocou um efeito aditivo sobre a secreção de insulina. A liberação de insulina a partir das células INS-1 foi medida após o tratamento combinado de GLP-1 juntamente com FOL-005 e FOL-014 (todos os três peptídeos em uma concentração de 100 nM), respectivamente, e comparada com o efeito de cada peptídeo, isoladamente. A combinação de GLP-1 e FOL-014 aumentou significativamente a secreção de insulina em comparação com cada peptídeo isoladamente. Observou-se também um aumento para a combinação de FOL-005 e GLP-1. As barras representam os valores médios e o erro padrão da média (EPM).
[0029] Figura 8. FOL-014 afetou a secreção de insulina e de glucagon nas ilhotas pancreáticas. Duas concentrações diferentes de FOL-014 foram testadas e comparadas com o efeito de GLP-1 100 nM nas ilhotas isoladas de camundongos em baixas (2,8 mM) (A, C) e altas (16,7mM) (B, D) concentrações de glicose. Nas amostras de baixa concentração de glicose, a presença de FOL-014 não aumentou a secreção de insulina, mas reduziu a secreção de glucagon em comparação com o controle e GLP-1. Nas amostras de alta concentração de glicose, GLP-1 e FOL-014 600 nM, mas não FOL-014 6 μM, aumentou significativamente a secreção de insulina (B) e GLP-1, assim como ambas as concentrações de FOL-014 reduziram eficientemente a secreção de glucagon (D). As barras representam os valores médios e o erro padrão da média (EPM).
[0030] Figura 9. FOL-014 reduziu os níveis de glicose plasmática in vivo após uma injeção de glicose. Um teste de tolerância à glicose intraperitoneal (IPGTT) foi realizado em camundongos tipo selvagem C57bl/6. O FOL-014 dosado a 200 nmol/kg reduziu significativamente os níveis plasmáticos de glicose em comparação com o controle em 15 minutos, 30 minutos e 45 minutos (P = 0,0027). Na dose de 30 nmol/kg, o FOL-014 reduziu os níveis de glicose com um efeito significativo em 45 minutos após a injeção de glicose. A linha pontilhada corresponde aos níveis médios de glicemia não em jejum. Os dados representam os valores médios e o erro padrão da média (EPM). A análise estatística foi realizada usando o teste t de Student.
[0031] Figura 10. FOL-014 atrasou o surgimento do diabetes tipo 1 em ratos BB lyp/lyp. Ratos BB lyp/lyp tratados com FOL-014 apresentaram um atraso significativo no surgimento do diabetes definido como níveis de glicose plasmática < 11,1 mmol/l. A idade do início do diabetes para cada rato foi representada em (A) com uma diferença significativa entre os grupos não tratado e tratado. A porcentagem de animais que desenvolveram diabetes tipo 1 a cada dia foi representada em (B) com uma diferença significativa entre os grupos. As barras de erro em (A) representam o erro padrão da média (EPM).
[0032] Figura 11. O efeito sobre a secreção de insulina dos análogos de peptídeos derivados de FOL-005 ou FOL-014. Novos análogos de peptídeos foram testados em duas linhagens celulares de INS-1 separadas (A e B) quanto à sua capacidade de induzir a secreção de insulina sob condições de alta concentração de glicose (16,7 mM). O efeito foi comparado com o do GLP-1 nativo, FOL-005 e FOL-014, bem como o efeito apenas da alta concentração de glicose. Análogos induzindo a liberação de insulina abaixo da média do controle de alta concentração de glicose foram considerados não funcionais (não mostrados). O nível de secreção de insulina está mostrado em barras pretas, preenchidas para os novos análogos, e em padrões contrastivos para os comparadores. As barras representam os valores médios e o erro padrão da média (EPM).
[0033] Figura 12. FOL-005 e FOL-014 apresentaram padrões de distribuição específicos após a injeção em camundongo. Após a administração subcutânea de 3H-FOL-005, os maiores níveis globais de radioatividade estavam presentes no pâncreas e no local da injeção, 1 hora (A) e 2 horas (B) após a injeção. O acúmulo do 3H-FOL-005 também é visível no fígado, rim e nas glândulas salivares. Utilizando o sistema de captura de imagem Small Animal Imaging System da Pearl Trilogy, a biodistribuição in vivo e a localização no tecido de FOL-005 (C) e FOL-014 (D) marcado com Cy7.5 em camundongos nude NMRI através de injeção subcutânea foram investigadas. Após a captura de imagem do controle inicial, uma dose de 10 nmol por camundongo foi administrada, e a captura de imagens de células vivas foi realizada em 5 min, 20 min, 50 min, 60 min, 2 h, 4 h, 6 h, 24 h e 48 h. O acúmulo elevado de ambos os peptídeos ficou evidente na região pancreática, bem como no local de injeção.
[0034] Figura 13. FOL-056 induz a secreção de insulina das células INS-1E. O peptídeo FOL-056 suplementado às células INS-1E em um tampão experimental com alto teor de glicose (16,7 mM) aumentou significativamente a secreção da insulina em comparação com as células tratadas com um tampão com alto teor de glicose não suplementado. A presença do peptídeo comparador, FOL-014, também resultou em um aumento significativo na secreção de insulina. Os peptídeos foram adicionados ao tampão experimental em uma concentração de 100 nM.
[0035] Figura 14. FOL-056 preserva a capacidade de secretar insulina das células INS-1E durante as condições glicotóxicas de longo prazo. As células INS-1 foram submetidas a níveis tóxicos de glicose (20 mM) durante 72 horas na presença ou ausência de FOL-014 ou FOL-056. Por referência, as células submetidas a baixos níveis de glicose (5 mM) foram incluídas. (A) A exposição de longo prazo a níveis tóxicos de glicose reduz significativamente a capacidade das células de segregar a insulina. (B) A presença de FOL-014 no meio com alto teor de glicose aumentou significativamente a capacidade de secreção de insulina das células em comparação apenas com os meios com alto teor de glicose. A presença de FOL-056 nos meios com alto teor de glicose aboliu os efeitos glicotóxicos e manteve a liberação de insulina no mesmo nível das células no grupo de tratamento de baixo teor de glicose (5 mM).
[0036] Figura 15. A dosagem combinada de FOL-005 juntamente com GLP-1 nativo provocou um efeito aditivo sobre a secreção de insulina. A liberação de insulina a partir das células INS-1 foi medida após o tratamento combinado de GLP- 1 juntamente com FOL-056 (ambos os peptídeos em uma concentração de 100 nM), e foi comparada com o efeito de cada peptídeo, isoladamente. A combinação de GLP-1 e FOL-056 aumentou significativamente a secreção de insulina em comparação com cada peptídeo isoladamente. (P = 0,0037 em comparação com GLP-1 e P = 0,0003 em comparação com FOL- 056). Os dados representam os valores médios; as barras de erro são apresentadas como EPM.
[0037] Figura 16. Novos análogos de peptídeo induzem a secreção de insulina a partir de células INS-1E. Os peptídeos FOL-057, FOL-058 e FOL-059 suplementados às células INS-1E em um tampão experimental com alto teor de glicose (16,7 mM) aumentou a secreção da insulina em comparação com as células tratadas com um tampão com alto teor de glicose não suplementado. A liraglutida foi incluída para fins de comparação. Os peptídeos foram adicionados ao tampão experimental em uma concentração de 100 nM. Os dados representam os valores médios; as barras de erro são apresentadas como EPM.
[0038] Figura 17. Novos análogos de peptídeo preservam a capacidade de secretar insulina das células INS- 1E durante as condições glicotóxicas de longo prazo. As células INS-1 foram submetidas a níveis tóxicos de glicose (20 mM) durante 72 horas na presença ou ausência de vários novos análogos de peptídeo. Por referência, as células submetidas a baixos níveis de glicose (5 mM) foram incluídas (não mostrado). A presença de análogos de peptídeo no meio com alto teor de glicose aumentou a capacidade de secreção de insulina das células em comparação apenas com os meios com alto teor de glicose. Análogos induzindo a liberação de insulina abaixo da média do controle de alta concentração de glicose foram considerados não funcionais (não mostrados). Os dados representam os valores médios; as barras de erro são apresentadas como EPM.
[0039] Figura 18. FOL-056 e FOL-014 induziram a secreção de insulina a partir de células 1.2B4 humanas. Os peptídeos FOL-056 e FOL-014 suplementados às células 1.2B4 em um tampão experimental com alto teor de glicose (16,7 mM) aumentaram significativamente a secreção da insulina em comparação com as células tratadas com um tampão com alto teor de glicose não suplementado. A liraglutida foi incluída para fins de comparação. Os peptídeos foram adicionados ao tampão experimental em uma concentração de 100 nM. Os dados representam os valores médios; as barras de erro são apresentadas como EPM.
[0040] Figura 19. Secreção de insulina induzida por FOL-056 das ilhotas humanas. O peptídeo FOL-056 suplementado às células das ilhotas humanas recém-isoladas de dois doadores separados em um tampão experimental com alto teor de glicose (16,7 mM) aumentou significativamente a secreção da insulina em comparação com as células tratadas com um tampão com alto teor de glicose não suplementado. O efeito da liraglutida foi testado para fins de comparação. FOL-056 e liraglutida foram adicionados ao tampão experimental a uma concentração de 1 e 100 nM, respectivamente. Os dados representam os valores médios; as barras de erro são apresentadas como EPM.
[0041] Figura 20. FOL-056 manteve a capacidade de secreção de insulina em resposta aos níveis elevados de glicose em um modelo de camundongo obeso induzido por dieta. Após 12 semanas de dosagem nos camundongos c57Bl6 em dieta rica em gordura, a resposta aguda à insulina (AIR, sigla para o termo em inglês “acute insulin response”), medida como o aumento da insulina plasmática após uma injeção de glicose, foi significativamente maior em camundongos tratados com FOL-056 em comparação com o grupo de controle não tratado (P = 0,01). Os dados representam os valores médios; as barras de erro são apresentadas como EPM.
[0042] Figura 21. Dosagem com FOL-014 ou FOL-056 reduziu a concentração de HbA1c em um modelo de camundongo diabético. A análise de amostras de sangue integral coletadas de camundongos db/db após 4 semanas de dosagem mostrou um nível de HbA1c significativamente menor em animais tratados com FOL-014 (P = 0,0015) ou FOL-056 (P = 0,0028) em comparação com os animais de controle não tratados. Os dados representam os valores médios; as barras de erro são apresentadas como EPM. Descrição detalhada
[0043] A revelação é tal como é definida nas reivindicações.
[0044] Em um aspecto, a presente revelação diz respeito a um agente que compreende ou consiste em: a) um peptídeo ou análogo de peptídeo, em que o peptídeo ou o análogo de peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos da fórmula geral: X1LX2YGIK (SEQ ID NO: 177) em que: X1 é E ou G; X2 é S ou T; com a condição de que se X2 é T, o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende no máximo 25 aminoácidos; e com a condição de que se X1 é E e X2 é S, o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende no máximo 85 resíduos de aminoácidos; b) um polinucleotídeo que codifica, na expressão, o peptídeo de a); c) um vetor que compreende o polinucleotídeo de b); ou d) uma célula que compreende o polinucleotídeo de b), ou o vetor de c).
[0045] Em uma concretização, a presente revelação se refere a um peptídeo ou a um análogo de peptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos da fórmula geral: X1LX2YGIK (SEQ ID NO: 177) em que: X1 é E ou G; X2 é S ou T; com a condição de que se X2 é T, o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende no máximo 25 aminoácidos; e com a condição de que se X1 é E e X2 é S, o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende no máximo 85 resíduos de aminoácidos.
[0046] Em uma concretização, a presente revelação se refere a um polinucleotídeo que codifica, na expressão, um peptídeo ou análogo de peptídeo, conforme é descrito na presente invenção.
[0047] Em uma concretização, a presente revelação se refere a um vetor que compreende um polinucleotídeo, conforme é descrito na presente invenção.
[0048] Em uma concretização, a presente revelação se refere a uma célula que compreende um polinucleotídeo, conforme é descrito na presente invenção. Em uma concretização, a presente revelação se refere a uma célula que compreende um vetor, conforme é descrito na presente invenção.
[0049] Em uma concretização, a presente revelação se refere a um agente que compreende:
a) um peptídeo, em que o peptídeo é selecionado do grupo consistindo em: i) um peptídeo que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183 e 184; ii) uma variante da sequência biologicamente ativa de qualquer um dos peptídeos de i), em que qualquer aminoácido foi alterado para outro aminoácido proteinogênico ou não proteinogênico, com a condição de que não mais do que cinco aminoácidos estão alterados dessa forma; iii) um fragmento biologicamente ativo do peptídeo de qualquer um de i) ou ii), em que o fragmento compreende pelo menos 10 aminoácidos consecutivos de qualquer um de i) ou ii); b) um polinucleotídeo que codifica, na expressão, o peptídeo de a); c) um vetor que compreende o polinucleotídeo de b); ou d) uma célula que compreende o polinucleotídeo de b), ou o vetor de c).
[0050] Em uma concretização, a presente revelação diz respeito a um agente que compreende um peptídeo, em que o peptídeo é selecionado do grupo consistindo em um peptídeo que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183 e 184.
[0051] Em uma concretização, a presente revelação diz respeito a uma variante da sequência biologicamente ativa de qualquer um dos peptídeos aqui descritos, em que qualquer aminoácido foi alterado para outro aminoácido proteinogênico ou não proteinogênico, com a condição de que não mais do que cinco aminoácidos estão alterados dessa forma.
[0052] Em uma concretização, a presente revelação se refere a um agente que compreende: a) um peptídeo, em que o peptídeo compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em DTYDGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 4), TYDGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 8), YDGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 13) e DGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 19). GDISVVYGLR (SEQ ID NO: 26), DISVVYGLR (SEQ ID NO: 34); b) um polinucleotídeo que codifica, na expressão, o peptídeo de a); c) um vetor que compreende o polinucleotídeo de b); e d) uma célula que compreende o polinucleotídeo de b), ou o vetor de c).
[0053] Em uma concretização, a presente revelação diz respeito a um agente que compreende um peptídeo, em que o peptídeo compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste na DTYDGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 4), TYDGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 8), YDGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 13), DGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 19), GDISVVYGLR (SEQ ID NO: 26) e DISVVYGLR (SEQ ID NO: 34).
[0054] Em uma concretização, a presente revelação se refere a um peptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos da fórmula geral: Z1Z2SZ3Z4YGLR (SEQ ID NO: 178) em que: Z1 é D ou G; Z2 é I ou G;
Z3 é V ou L; Z4 é V ou A.
[0055] O termo “ausente”, conforme utilizado na presente invenção, por exemplo, “X6 é C, I ou ausente” deve ser entendido como que os resíduos de aminoácidos diretamente adjacentes ao aminoácido ausente estão diretamente ligados um ao outro por uma ligação amida convencional.
[0056] O termo “análogo de peptídeo”, descrito na presente invenção, se refere a uma sequência de aminoácidos que não ocorre na natureza, ou a uma sequência de aminoácidos que ocorre na natureza que foi modificada.
[0057] O termo “aminoácido”, conforme utilizado na presente invenção, inclui os vinte aminoácidos padrão geneticamente codificados e seus estereoisômeros correspondentes na forma “D” (em comparação com a forma “L” natural), aminoácidos ômega e outros aminoácidos que ocorrem na natureza, aminoácidos não convencionais (por exemplo, aminoácidos α,α-dissubstituídos, aminoácidos N-alquila, etc.) e aminoácidos quimicamente derivados (consulte abaixo).
[0058] Quando um aminoácido está sendo especificamente indicado, como “alanina” ou “Ala” ou “A”, o termo se refere tanto à L-alanina como à D-alanina, a menos que seja explicitamente declarado de outra forma. Outros aminoácidos não convencionais também podem ser componentes adequados para peptídeos da presente revelação, desde que a propriedade funcional desejada seja conservada pelo peptídeo. Para os peptídeos mostrados, cada resíduo de aminoácido codificado, quando apropriado, é representado por uma única letra, correspondente ao nome trivial do aminoácido convencional.
[0059] Os derivados químicos de um ou mais aminoácidos podem ser obtidos pela reação com um grupo lateral funcional. Tais derivados incluem, por exemplo, aquelas moléculas nas quais grupos aminos livres foram derivados para formar cloridratos de amina, grupos de p- toluenossulfonila, grupos carboxibenzóxi, grupos t- butiloxicarbonila, grupos cloroacetila ou grupos formila. Os grupos carboxila livres podem ser derivados para formar sais, ésteres de metila e etila ou outros tipos de ésteres e hidrazidas. Grupos hidroxilas livres podem ser derivados para formar os derivados O-acila ou O-alquila. Também estão incluídos como derivados químicos os peptídeos que contêm derivados de aminoácidos que ocorrem na natureza, dos vinte aminoácidos padrão. Por exemplo: 4-hidroxiprolina pode ser substituída por prolina; 5-hidroxilisina pode ser substituída por lisina; 3-metil-histidina pode ser substituída por histidina; e homosserina pode ser substituída por serina, e ornitina por lisina. Os derivados também incluem peptídeos contendo uma ou mais adições ou deleções, contanto que a atividade necessária seja preservada. Outras modificações incluídas são a amidação, acilação do terminal amino (por exemplo, acetilação ou amidação do ácido tioglicólico), carboxiamidação terminal (por exemplo, com amônia ou metilamina), e modificações nos terminais semelhantes.
[0060] Alguns dos peptídeos da revelação compartilham similaridades em relação à sequência de aminoácidos com uma sub-região de proteínas de osteopontina que ocorrem na natureza. Em algumas concretizações, o dito peptídeo pode ser considerado como um fragmento ativo de uma proteína osteopontina de ocorrência natural ou uma variante da mesma, como um fragmento.
[0061] Alguns dos peptídeos da revelação compartilham similaridades em relação à sequência de aminoácidos com uma sub-região de proteínas tenascina que ocorrem na natureza. Em algumas concretizações, o dito peptídeo pode ser considerado como um fragmento ativo de uma proteína tenascina que ocorre na natureza, ou uma variante da mesma, como um fragmento.
[0062] Por “fragmento”, estão incluídos pelo menos 5 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácidos, por exemplo, pelo menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácidos. Assim, o fragmento pode ter 15 ou menos aminoácidos de comprimento, como por exemplo 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ou 5 aminoácidos de comprimento
[0063] Em uma concretização, o dito peptídeo não é maior do que 85, assim como não maior do que 80, assim como não maior do que 75, assim como não maior do que 70, assim como não maior do que 65, assim como não maior do que 60, assim como não maior do que 55, assim como não maior do que 50, assim como não maior do que 55, assim como não maior do que 40 aminoácidos, assim como não maior do que 35, assim como não maior do que 30, assim como não maior do que 28, assim como não maior do que 26, assim como não maior do que 24, assim como não maior do que 22, assim como não maior do que 20, assim como não maior do que 19, assim como não maior do que 18, assim como não maior do que 17, assim como não maior do que 16, assim como não maior do que 15, assim como não maior do que 14, assim como não maior do que 13, assim como não maior do que 12, assim como não maior do que 11, assim como não maior do que 10 aminoácidos de comprimento.
[0064] Em outra concretização, o dito peptídeo possui entre 5 e 30 aminoácidos de comprimento, assim como entre 5 e 20, assim como entre 8 e 20, assim como entre 8 e 16 ou assim como entre 10 e 15 aminoácidos de comprimento.
[0065] Em ainda outra concretização, o dito fragmento compreende 15 ou menos aminoácidos de comprimento, assim como menos de 14 aminoácidos, assim como menos de 13 aminoácidos, assim como menos de 12 aminoácidos, assim como menos de 11 aminoácidos, assim como menos de 10 aminoácidos, assim como menos de 9 aminoácidos, assim como menos de 8 aminoácidos, assim como menos de 7 aminoácidos, assim como menos de 6 aminoácidos ou assim como menos de 5 aminoácidos de comprimento.
[0066] O termo “variante” se refere a um peptídeo que não compartilha 100% de identidade de sequência de aminoácidos com o peptídeo original, ou seja, um ou mais aminoácidos devem ser modificados por mutação. “Modificado por mutação” se refere à alteração de um aminoácido em uma posição especificada no peptídeo original. Por exemplo, um aminoácido em uma posição especificada pode ser excluído, alterado, substituído ou pode ser o local de uma inserção/adição de um ou mais aminoácidos. Será notado pelos técnicos versados no assunto que as substituições podem ser conservadoras ou não conservadoras.
[0067] Em uma concretização, a dita variante do peptídeo compreende ou consiste em uma sequência em que não mais do que cinco aminoácidos são alterados por outro aminoácido proteinogênico ou não proteinogênico, assim como não mais do que 4 aminoácidos, não mais do que 3 aminoácidos, não mais do que 2 aminoácidos ou não mais do que 1 aminoácido é(são) alterado(s). Em uma concretização, um ou mais aminoácidos é(são) conservadoramente substituídos. “Conservadoramente substituído” se refere à substituição de um aminoácido por outro com propriedades semelhantes (tamanho, hidrofobicidade etc.), de tal forma que a função do peptídeo não seja significativamente alterada. Assim, por “substituições conservadoras” se entende combinações assim como Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; e Phe, Tyr.
[0068] Em outra concretização, o peptídeo compreende ou consiste em um ou mais aminoácidos adicionais, inseridos no N e/ou C-terminal, e/ou internamente dentro da sequência. Em uma concretização, pelo menos 2 aminoácidos adicionais, como pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15 ou pelo menos 20 aminoácidos adicionais são inseridos. Os aminoácidos adicionais podem ser os aminoácidos das posições correspondentes da osteopontina humana tipo selvagem (SEQ ID NO: 66) ou das posições correspondentes da osteopontina de murino tipo selvagem (SEQ ID NO: 134). O termo “posições correspondentes” da osteopontina tipo selvagem significa que os aminoácidos adicionais são os mesmos presentes na posição equivalente na osteopontina tipo selvagem acima (se imaginarmos que a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 substitui a sequência sublinhada em itálico na SEQ ID NO:
66.
[0069] Em outra concretização, o peptídeo é selecionado do grupo consistindo na SEQ ID NO: 1, 136, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 67, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 135, 137, 138, 139, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 167, 168, 169, 171,171,172,173,174,175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183 e 184; i. Peptídeos de 15 aminoácidos: VDTYDGDISVVYGLR SEQ ID NO: 1 VDTYDGDISVVYGLS SEQ ID NO: 2 ii. Peptídeos de 14 aminoácidos: VDTYDGDISVVYGL SEQ ID NO: 3 DTYDGDISVVYGLR SEQ ID NO: 4 TYDGDISVVYGLRS SEQ ID NO: 5 iii.
Peptídeos de 13 aminoácidos: VDTYDGDISVVYG SEQ ID NO: 6 DTYDGDISVVYGL SEQ ID NO: 7 TYDGDISVVYGLR SEQ ID NO: 8 YDGDISVVYGLRS SEQ ID NO: 9 iv.
Peptídeos de 12 aminoácidos: VDTYDGDISVVY SEQ ID NO: 10 DTYDGDISVVYG SEQ ID NO: 11 TYDGDISVVYGL SEQ ID NO: 12 YDGDISVVYGLR SEQ ID NO: 13 DGDISVVYGLRS SEQ ID NO: 14 v.
Peptídeos de 11 aminoácidos: VDTYDGDISVV SEQ ID NO: 15 DTYDGDISVVY SEQ ID NO: 16 TYDGDISVVYG SEQ ID NO: 17 YDGDISVVYGL SEQ ID NO: 18 DGDISVVYGLR SEQ ID NO: 19 GDISVVYGLRS SEQ ID NO: 20 vi.
Peptídeos de 10 aminoácidos: VDTYDGDISV SEQ ID NO: 21 DTYDGDISVV SEQ ID NO: 22 TYDGDISVVY SEQ ID NO: 23 YDGDISVVYG SEQ ID NO: 24 DGDISVVYGL SEQ ID NO: 25 GDISVVYGLR SEQ ID NO: 26 DISVVYGLRS SEQ ID NO : 27 vii.
Peptídeos de 9 aminoácidos: VDTYDGDIS SEQ ID NO: 28 DTYDGDISV SEQ ID NO: 29
TYDGDISVV SEQ ID NO: 30 YDGDISVVY SEQ ID NO: 31 DGDISVVYG SEQ ID NO: 32 GDISVVYGL SEQ ID NO: 33 DISVVYGLR SEQ ID NO: 34 ISVVYGLRS SEQ ID NO: 35 viii.
Peptídeos de 8 aminoácidos: VDTYDGDI SEQ ID NO: 36 DTYDGDIS SEQ ID NO : 37 TYDGDISV SEQ ID NO: 38 YDGDISVV SEQ ID NO: 39 DGDISVVY SEQ ID NO: 40 GDISVVYG SEQ ID NO: 41 DISVVYGL SEQ ID NO: 42 ISVVYGLR SEQ ID NO: 43 ix.
Peptídeos de 7 aminoácidos: VDTYDGD SEQ ID NO: 44 DTYDGDI SEQ ID NO: 45 TYDGDIS SEQ ID NO: 46 YDGDISV SEQ ID NO: 47 DGDISVV SEQ ID NO: 48 GDISVVY SEQ ID NO: 49 DISVVYG SEQ ID NO: 50 ISVVYGL SEQ ID NO: 51 x.
Peptídeos de 6 aminoácidos: DTYDGD SEQ ID NO: 52 TYDGDI SEQ ID NO: 53 YDGDIS SEQ ID NO: 54 DGDISV SEQ ID NO: 55
GDISVV SEQ ID NO: 56 DISVVY SEQ ID NO: 57 ISVVYG SEQ ID NO: 58 xi.
Peptídeos de 5 aminoácidos: TYDGD SEQ ID NO: 59 YDGDI SEQ ID NO: 60 DGDIS SEQ ID NO: 61 GDISV SEQ ID NO: 62 DISVV SEQ ID NO: 63 ISVVY SEQ ID NO: 64 SVVYG SEQ ID NO: 65 xii.
Peptídeo de 16 aminoácidos: VDTYDGRGDSVVYGLR SEQ ID NO: 67 xiii.
Peptídeos de 15 aminoácidos: VDVPNGDISLAYGLR SEQ ID NO: 69 DVPNGDISLAYGLRS SEQ ID NO: 70 xiv.
Peptídeos de 14 aminoácidos: VDVPNGDISLAYGL SEQ ID NO: 71 DVPNGDISLAYGLR SEQ ID NO: 72 VPNGDISLAYGLRS SEQ ID NO: 73 xv.
Peptídeos de 13 aminoácidos: VDVPNGDISLAYG SEQ ID NO: 74 DVPNGDISLAYGL SEQ ID NO: 75 VPNGDISLAYGLR SEQ ID NO: 76 PNGDISLAYGLRS SEQ ID NO: 77 xvi.
Peptídeos de 12 aminoácidos: VDVPNGDISLAY SEQ ID NO: 78 DVPNGDISLAYG SEQ ID NO: 79 VPNGDISLAYGL SEQ ID NO: 80
PNGDISLAYGLR SEQ ID NO: 81 NGDISLAYGLRS SEQ ID NO: 82 xvii.
Peptídeos de 11 aminoácidos: VDVPNGDISLA SEQ ID NO: 83 DVPNGDISLAY SEQ ID NO: 84 VPNGDISLAYG SEQ ID NO: 85 PNGDISLAYGL SEQ ID NO: 86 NGDISLAYGLR SEQ ID NO: 87 GDISLAYGLRS SEQ ID NO: 88 xviii.
Peptídeos de 10 aminoácidos: VDVPNGDISL SEQ ID NO: 89 DVPNGDISLA SEQ ID NO: 90 VPNGDISLAY SEQ ID NO: 91 PNGDISLAYG SEQ ID NO: 92 NGDISLAYGL SEQ ID NO: 93 GDISLAYGLR SEQ ID NO: 94 DISLAYGLRS SEQ ID NO: 95 xix.
Peptídeos de 9 aminoácidos: VDVPNGDIS SEQ ID NO: 96 DVPNGDISL SEQ ID NO: 97 VPNGDISLA SEQ ID NO: 98 PNGDISLAY SEQ ID NO: 99 NGDISLAYG SEQ ID NO: 100 GDISLAYGL SEQ ID NO: 101 DISLAYGLR SEQ ID NO: 102 ISLAYGLRS SEQ ID NO: 103 xx.
Peptídeos de 8 aminoácidos: VDVPNGDI SEQ ID NO: 104 DVPNGDIS SEQ ID NO: 105
VPNGDISL SEQ ID NO: 106 PNGDISLA SEQ ID NO: 107 NGDISLAY SEQ ID NO: 108 GDISLAYG SEQ ID NO: 109 DISLAYGL SEQ ID NO: 110 ISLAYGLR SEQ ID NO: 111 xxi.
Peptídeos de 7 aminoácidos: VDVPNGD SEQ ID NO: 112 DVPNGDI SEQ ID NO: 113 VPNGDIS SEQ ID NO: 114 PNGDISL SEQ ID NO: 115 NGDISLA SEQ ID NO: 116 GDISLAY SEQ ID NO: 117 DISLAYG SEQ ID NO: 118 ISLAYGL SEQ ID NO: 119 xxii.
Peptídeos de 6 aminoácidos: DVPNGD SEQ ID NO: 120 VPNGDI SEQ ID NO: 121 PNGDIS SEQ ID NO: 122 NGDISL SEQ ID NO: 123 GDISLA SEQ ID NO: 124 DISLAY SEQ ID NO: 125 ISLAYG SEQ ID NO: 126 xxiii.
Peptídeos de 5 aminoácidos: VPNGD SEQ ID NO: 127 PNGDI SEQ ID NO: 128 NGDIS SEQ ID NO: 129 GDISL SEQ ID NO: 130 DISLA SEQ ID NO: 131
ISLAY SEQ ID NO: 132 SLAYG SEQ ID NO: 133 xxiv.
Peptídeos de 16 aminoácidos: KPLAEIDSIELSYGIK SEQ ID NO: 136 GDPNDGRGDSVVYGLR SEQ ID NO: 137 xxv.
Peptídeos de 15 aminoácidos: VDTYDGGISVVYGLR SEQ ID NO: 138 DTYDGDGSVVYGLR SEQ ID NO: 139 xxvi.
Peptídeos de 16 aminoácidos: KCLAECDSIELSYGIK SEQ ID NO: 141 xxvii.
Peptídeos de 8 aminoácidos: CLAEIDSC SEQ ID NO: 142 xxviii.
Peptídeos de 18 aminoácidos: CFKPLAEIDSIECSYGIK SEQ ID NO: 143 xxix.
Peptídeos de 16 aminoácidos: KPLAEDISIELSYGIK SEQ ID NO: 144 KPLAEISDIELSYGIK SEQ ID NO: 145 KPLAEIGDIELSYGIK SEQ ID NO: 146 xxx.
Peptídeos de 15 aminoácidos: KPLAEGDIELSYGIK SEQ ID NO: 147 xxxi.
Peptídeos de 13 aminoácidos: KPLAEIELSYGIK SEQ ID NO: 148 xxxii.
Peptídeos de 16 aminoácidos: KPLAEIDSIELTYGIK SEQ ID NO: 149 KPLAEIDGIELSYGIK SEQ ID NO: 150 KPLAEIDGIELTYGIK SEQ ID NO: 151 KPLAEIGSIELSYGIK SEQ ID NO: 152 KGLAEIDSIELSYGIK SEQ ID NO: 153 KPLAGIDSIGLSYGIK SEQ ID NO: 154
KCLAEIDSCELSYGIK SEQ ID NO: 155 xxxiii.
Peptídeos de 13 aminoácidos: CFKPLAEIDSIEC SEQ ID NO: 156 xxxiv.
Peptídeos de 15 aminoácidos: VDVPEGDISLAYGLR SEQ ID NO: 157 LDGLVRAYDNISPVG SEQ ID NO: 158 xxxv.
Peptídeos de 14 aminoácidos: GDPNGDISVVYGLR SEQ ID NO: 159 xxxvi.
Peptídeos de 15 aminoácidos VDVPNGDISLAYRLR SEQ ID NO: 160 VDVPEGDISLAYRLR SEQ ID NO: 161 V(beta-D)TYDGDISVVYGLR SEQ ID NO: 167 VDTY (beta-D) GDISVVYGLR SEQ ID NO: 168 VDTYDG(beta-D)ISVVYGLR SEQ ID NO: 169 xxxvii.
Peptídeos de 14 aminoácidos: LAEIDSIELSYGIK SEQ ID NO: 170 xxxviii.
Peptídeos de 13 aminoácidos: AEIDSIELSYGIK SEQ ID NO: 171 xxxix.
Peptídeos de 12 aminoácidos: EIDSIELSYGIK SEQ ID NO: 172 xl.
Peptídeos de 11 aminoácidos: IDSIELSYGIK SEQ ID NO: 173 xli.
Peptídeos de 10 aminoácidos: DSIELSYGIK SEQ ID NO: 174 xlii.
Peptídeos de 9 aminoácidos: SIELSYGIK SEQ ID NO: 175 xliii.
Peptídeos de 8 aminoácidos: IELSYGIK SEQ ID NO: 176 xliv. Peptídeos de 15 aminoácidos: KPLAEIDSIELSYGI SEQ ID NO: 179 xlv. Peptídeos de 14 aminoácidos: KPLAEIDSIELSYG SEQ ID NO: 180 xlvi. Peptídeos de 13 aminoácidos: KPLAEIDSIELSY SEQ ID NO: 181 xlvii. Peptídeos de 12 aminoácidos: KPLAEIDSIELS SEQ ID NO: 182 xlviii. Peptídeos de 10 aminoácidos: KPLAEIDSIEL SEQ ID NO: 183 xlix. Peptídeos de 9 aminoácidos: KPLAEIDSIE SEQ ID NO: 184
[0070] Em uma concretização, o dito peptídeo é derivado da osteopontina, como uma variante de osteopontina de mamífera e/ou um fragmento.
[0071] Em uma concretização, o dito peptídeo não ocorre na natureza, como um peptídeo que compreende resíduos de aminoácidos não proteinogênicos.
[0072] Em algumas concretizações, o dito peptídeo é adicionalmente conjugado com uma porção, que pode ser selecionada do grupo consistindo em PEG, monossacarídeos, fluoróforos, cromóforos, compostos radioativos e peptídeos de penetração celular. Em uma concretização, o fluoróforo é selecionado do grupo consistindo em amarelo lúcifer, biotina, 5,6-carboxiltetrametilrodamina (TAMRA), indodicarbocianina (C5) Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 647, ATTO 488, ATTO 532, 6-carboxifluoresceína (6-FAM), Alexa Fluor® 350, DY-415, ATTO 425, ATTO 465, Bodipy® FL, isotiocianato de fluoresceína, Oregon Green®
488, Oregon Green® 514, Rhodamine Green™, 5'- tetraclorofluoresceína, ATTO 520, 6-carboxi-4',5'-dicloro- 2',7'-dimetoxifluoresceína, corantes Yakima Yellow™, Bodipy® 530/550, hexaclorofluoresceína, Alexa Fluor® 555, DY-549, Bodipy® TMR-X, cianino fosforoamiditas (cianina 3, cianina 3,5, cianina 5, cianina 5,5, cianina 7.5), ATTO 550, Rhodamine Red™, ATTO 565, carboxi-X-rodamina, vermelho texas (cloreto ácido de sulforrodamina 101), LightCycler® Red 610, ATTO 594, DY-480-XL, DY-610, ATTO 610, LightCycler® Red 640, boro-dipirrometeno 630/650, ATTO 633, boro-dipirrometeno 650/665, ATTO 647N, DY-649, LightCycler® Red 670, ATTO 680, LightCycler® Red 705, DY-682, ATTO 700, ATTO 740, DY-782, IRD 700, IRD 800, CAL Fluor® Gold 540 nm, CAL Fluor® Gold 522 nm, CAL Fluor® Gold 544 nm , CAL Fluor® Orange 560 nm, CAL Fluor® Orange 538 nm, CAL Fluor® Orange 559 nm, CAL Fluor® Red 590 nm, CAL Fluor® Red 569 nm, CAL Fluor® Red 591 nm, CAL Fluor® Red 610 nm, CAL Fluor® Red 590 nm, CAL Fluor® Red 610 nm, CAL Fluor® Red 635 nm, Quasar® 570 nm, Quasar® 548 nm, Quasar® 566 nm (Cy 3), Quasar® 670 nm, Quasar® 647 nm, Quasar® 670 nm, Quasar® 705 nm, Quasar® 690 nm, Quasar® 705 nm (Cy 5.5), corantes Pulsar® 650, corantes SuperRox®)..
[0073] Em outra concretização, o peptídeo é adicionalmente modificado, como sendo glicosilado ou por PEGuilação, amidação, esterificação, acilação, acetilação e/ou alquilação.
[0074] Em uma concretização, o dito peptídeo é composto ou consiste em repetições em tandem, que podem compor ou consistir na sequência de aminoácidos de qualquer uma ou mais das sequências descritas na presente invenção.
[0075] Em uma concretização, o dito peptídeo é cíclico. A estrutura cíclica pode ser obtida por qualquer método adequado de síntese. Assim, as ligações heterodéticas podem incluir, mas sem se limitar, à formação através de pontes de dissulfeto, cisteína, alquileno ou sulfeto.
[0076] Em uma concretização adicional, o peptídeo compreende ou consiste em uma fusão. Por exemplo, o peptídeo pode compreender uma fusão da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou 136.
[0077] O termo “fusão” de um peptídeo se refere a uma sequência de aminoácidos correspondente, por exemplo, à SEQ ID NO: 1 ou 136 (ou a um fragmento ou variante da mesma) fundido a qualquer outro peptídeo. Por exemplo, o dito peptídeo pode ser fundido a um polipeptídeo, como glutationa-S-transferase (GST) ou proteína A, a fim de facilitar a purificação do dito peptídeo. Exemplos dessas fusões são bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. Da mesma forma, o dito peptídeo pode ser fundido a um marcador de oligo-histidina, como His6, ou a um epítopo reconhecido por um anticorpo, como o epítopo do marcador Myc bem conhecido. Fusões para qualquer variante ou derivado do referido peptídeo também estão incluídas no escopo da revelação.
[0078] Alternativamente, a porção fundida pode ser uma molécula lipofílica ou domínio peptídico capaz de promover a captação celular do polipeptídeo, tal como é conhecido pelas pessoas versadas na técnica.
Peptídeos novos
[0079] Em uma concretização, a presente revelação se refere a um peptídeo que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em LAEIDSIELSYGIK (SEQ ID NO: 170), AEIDSIELSYGIK (SEQ ID NO: 171), EIDSIELSYGIK (SEQ ID NO: 172), IDSIELSYGIK (SEQ ID NO: 173), DSIELSYGIK (SEQ ID NO: 174), SIELSYGIK (SEQ ID NO: 175), IELSYGIK (SEQ ID NO: 148), KPLAEIDSIELTYGIK (SEQ ID NO: 176), ou uma variante ou fragmento da mesma.
[0080] Em uma concretização, o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em KPLAEIDSIELSYGI (SEQ ID NO: 179), KPLAEIDSIELSYG (SEQ ID NO: 180), KPLAEIDSIELSY (SEQ ID NO: 181), KPLAEIDSIELS (SEQ ID NO: 182), KPLAEIDSIEL (SEQ ID NO: 183), KPLAEIDSIE (SEQ ID NO: 184), ou uma variante ou fragmento da mesma.
[0081] Em uma concretização, a presente revelação se refere ao agente que compreende um peptídeo, em que o peptídeo compreende ou consiste na sequência de aminoácidos LAEIDSIELSYGIK (SEQ ID NO: 170), ou uma variante ou fragmento da mesma.
[0082] Em uma concretização, a presente revelação se refere ao agente que compreende um peptídeo, em que o peptídeo compreende ou consiste na sequência de aminoácidos AEIDSIELSYGIK (SEQ ID NO: 171), ou uma variante ou fragmento da mesma.
[0083] Em uma concretização, a presente revelação se refere ao agente que compreende um peptídeo, em que o peptídeo compreende ou consiste na sequência de aminoácidos
EIDSIELSYGIK (SEQ ID NO: 172), ou uma variante ou fragmento da mesma.
[0084] Em uma concretização, a presente revelação se refere ao agente que compreende um peptídeo, em que o peptídeo compreende ou consiste na sequência de aminoácidos IDSIELSYGIK (SEQ ID NO: 173), ou uma variante ou fragmento da mesma.
[0085] Em uma concretização, a presente revelação se refere ao agente que compreende um peptídeo, em que o peptídeo compreende ou consiste na sequência de aminoácidos DSIELSYGIK (SEQ ID NO: 174), ou uma variante ou fragmento da mesma.
[0086] Em uma concretização, a presente revelação se refere ao agente que compreende um peptídeo, em que o peptídeo compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SIELSYGIK (SEQ ID NO: 175), ou uma variante ou fragmento da mesma.
[0087] Em uma concretização, a presente revelação se refere ao agente que compreende um peptídeo, em que o peptídeo compreende ou consiste na sequência de aminoácidos IELSYGIK (SEQ ID NO: 176), ou uma variante ou fragmento da mesma.
[0088] Em uma concretização, a presente revelação se refere ao agente que compreende um peptídeo, em que o peptídeo compreende ou consiste na sequência de aminoácidos KPLAEIDSIELSYGI (SEQ ID NO: 179), ou uma variante ou fragmento da mesma.
[0089] Em uma concretização, a presente revelação se refere ao agente que compreende um peptídeo, em que o peptídeo compreende ou consiste na sequência de aminoácidos KPLAEIDSIELSYG (SEQ ID NO: 180), ou uma variante ou fragmento da mesma.
[0090] Em uma concretização, a presente revelação se refere ao agente que compreende um peptídeo, em que o peptídeo compreende ou consiste na sequência de aminoácidos KPLAEIDSIELSY (SEQ ID NO: 181), ou uma variante ou fragmento da mesma.
[0091] Em uma concretização, a presente revelação se refere ao agente que compreende um peptídeo, em que o peptídeo compreende ou consiste na sequência de aminoácidos KPLAEIDSIELS (SEQ ID NO: 182), ou uma variante ou fragmento da mesma.
[0092] Em uma concretização, a presente revelação se refere ao agente que compreende um peptídeo, em que o peptídeo compreende ou consiste na sequência de aminoácidos KPLAEIDSIEL (SEQ ID NO: 183), ou uma variante ou fragmento da mesma.
[0093] Em uma concretização, a presente revelação se refere ao agente que compreende um peptídeo, em que o peptídeo compreende ou consiste na sequência de aminoácidos KPLAEIDSIE (SEQ ID NO: 184), ou uma variante ou fragmento da mesma.
[0094] Em uma concretização, a presente revelação se refere a um agente que compreende: a) um peptídeo ou análogo de peptídeo que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos DTYDGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 4), TYDGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 8), YDGDISVVYGLR (SEQ
ID NO: 13) e DGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 19), GDISVVYGLR (SEQ ID NO: 26), DISVVYGLR (SEQ ID NO: 34); b) um polinucleotídeo que codifica, na expressão, o peptídeo de a); c) um vetor que compreende o polinucleotídeo de b); ou d) uma célula que compreende o polinucleotídeo de b), ou o vetor de c).
[0095] Em uma concretização, a presente revelação se refere a um agente compreendendo um peptídeo ou análogo de peptídeo que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos DTYDGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 4), TYDGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 8), YDGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 13) e DGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 19), GDISVVYGLR (SEQ ID NO: 26), DISVVYGLR (SEQ ID NO: 34).
[0096] Em algumas concretizações, a dita variante compreende ou consiste em uma sequência em que qualquer um dos aminoácidos foi alterado por outro aminoácido proteinogênico ou não proteinogênico, com a condição de que não mais do que cinco aminoácidos são alterados dessa forma, como não mais do que 4 aminoácidos, não mais do que 3 aminoácidos, não mais do que 2 aminoácidos ou não mais do que 1 aminoácido é(são) alterado(s). Em algumas concretizações, um ou mais aminoácidos são conservadoramente substituídos.
[0097] Em algumas concretizações, o peptídeo compreende ou consiste em um ou mais aminoácidos adicionais, inseridos no N e/ou C-terminal, e/ou internamente dentro da sequência. Em uma concretização, pelo menos 2 aminoácidos adicionais, como pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5,
pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15 ou pelo menos 20 aminoácidos adicionais são inseridos.
[0098] Em uma concretização, o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende um resíduo de aminoácido P no terminal N.
[0099] Em algumas concretizações, o dito peptídeo não é maior do que 85, assim como não é maior do que 80, assim como não é maior do que 75, assim como não é maior do que 70, assim como não é maior do que 65, assim como não é maior do que 60, assim como não é maior do que 55, assim como não é maior do que 50, assim como não é maior do que 55, assim como não é maior do que 40 aminoácidos, assim como não é maior do que 35, assim como não é maior do que 30, assim como não é maior do que 28, assim como não é maior do que 26, assim como não é maior do que 24, assim como não é maior do que 22, assim como não é maior do que 20, assim como não é maior do que 19, assim como não é maior do que 18, assim como não é maior do que 17, assim como não é maior do que 16, assim como não é maior do que 15, assim como não é maior do que 14, assim como não é maior do que 13, assim como não é maior do que 12, assim como não é maior do que 11, assim como não é maior do que 10 aminoácidos de comprimento.
[0100] Em algumas concretizações, o dito peptídeo é adicionalmente conjugado com uma porção, que pode ser selecionada do grupo consistindo em PEG, monossacarídeos, fluoróforos, cromóforos, compostos radioativos e peptídeos de penetração celular.
[0101] Em uma concretização, o peptídeo é adicionalmente modificado, como sendo glicosilado ou por PEGuilação, amidação, esterificação, acilação, acetilação e/ou alquilação.
[0102] Em algumas concretizações, o dito peptídeo compreende ou consiste em repetições em tandem, que podem compor ou consistir na sequência de aminoácidos de qualquer uma ou mais das sequências descritas na presente invenção.
[0103] Em uma concretização, o dito peptídeo é cíclico. A estrutura cíclica pode ser obtida por qualquer método adequado de síntese. Assim, as ligações heterodéticas podem incluir, mas sem se limitar, à formação através de pontes de cisteína, dissulfeto, alquileno ou sulfeto. Indicações
[0104] Os agentes, os peptídeos ou análogos de peptídeos, as composições, os polinucleotídeos, os vetores ou as células da presente revelação são adequados para uso no tratamento de doenças e distúrbios endócrinos, nutricionais e metabólicos.
[0105] Em uma concretização, o mamífero que necessita de tratamento de uma doença endócrina, uma doença nutricional e/ou uma doença metabólica em um ser humano.
[0106] Em algumas concretizações, a doença endócrina, a doença nutricional e/ou a doença metabólica é selecionada do grupo consistindo em diabetes mellitus, diabetes mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2, diabetes mellitus relacionado à desnutrição, distúrbios da regulação da glicose e secreção interna pancreática, síndrome da resistência à insulina, tolerância à glicose prejudicada,
hiperglicemia, hiperinsulinemia e quaisquer combinações das mesmas.
[0107] Em algumas concretizações, a doença endócrina, a doença nutricional e/ou a doença metabólica é selecionada do grupo que consiste em diabetes mellitus, distúrbios da glândula tireoide, distúrbios da regulação da glicose e secreção interna pancreática, distúrbios das glândulas endócrinas, desnutrição, deficiências nutricionais, obesidade, hiperalimentação e distúrbios metabólicos.
[0108] Em uma concretização, o diabetes mellitus é selecionado do grupo que consiste em diabetes mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2, diabetes mellitus relacionado à desnutrição, diabetes mellitus especificado e diabetes mellitus não especificado.
[0109] Em uma concretização, os distúrbios da regulação da glicose e da secreção interna pancreática são selecionados do grupo consistindo em coma hipoglicêmico não diabético e distúrbios da secreção interna pancreática.
[0110] Em uma concretização, os distúrbios de obesidade e hiperalimentação são selecionados do grupo que consiste em adiposidade localizada, hiperalimentação e sequelas da hiperalimentação.
[0111] Em uma concretização, os distúrbios das deficiências nutricionais são selecionados do grupo que consiste nos distúrbios do metabolismo de aminoácidos aromáticos, distúrbios do metabolismo de aminoácidos de cadeia ramificada e metabolismo de ácidos graxos, desordens do metabolismo de aminoácidos, intolerância à lactose,
distúrbios do metabolismo de carboidratos, distúrbios do metabolismo de esfingolipídios, distúrbios do armazenamento lipídico, distúrbios do metabolismo de glicosaminoglicanos, distúrbios do metabolismo de glicoproteínas, distúrbios do metabolismo de lipoproteínas, lipidemias, distúrbios do metabolismo da purina e pirimidina, distúrbios do metabolismo da porfirina e bilirrubina, distúrbios do metabolismo de minerais, fibrose cística, amiloidose, depleção de volume, distúrbios do equilíbrio de fluidos, eletrólitos e ácido-base, e distúrbios endócrinos e metabólicos pós-procedimento. Composições
[0112] Em um aspecto, a presente revelação se refere a uma composição que compreende o agente descrito na presente invenção. A composição pode ser uma composição farmacêutica.
[0113] Em um aspecto, a presente revelação diz respeito a um agente que compreende ou consiste em: a) um peptídeo ou um análogo de peptídeo selecionado do grupo consistindo em: (i) um peptídeo que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos da fórmula geral: X1LX2YGIK (SEQ ID NO: 177) em que: X1 é E ou G; X2 é S ou T; com a condição de que se X2 é T, o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende no máximo 25 resíduos de aminoácidos;
(ii) um peptídeo que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos da fórmula geral: Z1Z2SZ3Z4YGLR (SEQ ID NO: 178) em que: Z1 é D ou G; Z2 é I ou G; Z3 é V ou L; Z4 é V ou A; e (iii) um peptídeo que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste na VDTYDGDISVVYGL (SEQ ID NO: 3) VDTYDGDISVVYG (SEQ ID NO: 6), VDTYDGDISVVY (SEQ ID NO: 10), VDTYDGDISVV (SEQ ID NO: 15), VDTYDGDISV (SEQ ID NO: 21) e VDTYDGDIS (SEQ ID NO: 28); b) um polinucleotídeo que codifica, na expressão, o peptídeo de a); c) um vetor que compreende o polinucleotídeo de b); ou d) uma célula que compreende o polinucleotídeo de b), ou o vetor de c); para uso no tratamento de uma doença endócrina, uma doença nutricional e/ou uma doença metabólica em um mamífero.
[0114] Em um aspecto, a presente revelação se refere a um agente que compreende ou consiste em um peptídeo ou análogo de peptídeo, em que o peptídeo ou o análogo de peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos da fórmula geral: X1LX2YGIK (SEQ ID NO: 177) em que: X1 é E ou G; X2 é S ou T;
com a condição de que se X2 é T, o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende no máximo 25 resíduos de aminoácidos; para uso no tratamento de uma doença endócrina, uma doença nutricional e/ou uma doença metabólica em um mamífero.
[0115] Em um aspecto, a presente revelação se refere a um agente que compreende ou consiste em um peptídeo ou análogo de peptídeo, em que o peptídeo ou o análogo de peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos da fórmula geral: Z1Z2SZ3Z4YGLR (SEQ ID NO: 178) em que: Z1 é D ou G; Z2 é I ou G; Z3 é V ou L; Z4 é V ou A; para uso no tratamento de uma doença endócrina, uma doença nutricional e/ou uma doença metabólica em um mamífero.
[0116] Em um aspecto, a presente revelação se refere a um peptídeo que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo na VDTYDGDISVVYGL (SEQ ID NO: 3) VDTYDGDISVVYG (SEQ ID NO: 6), VDTYDGDISVVY (SEQ ID NO: 10), VDTYDGDISVV (SEQ ID NO: 15), VDTYDGDISV (SEQ ID NO: 21) e VDTYDGDIS (SEQ ID NO: 28) para uso no tratamento de uma doença endócrina, uma doença nutricional e/ou uma doença metabólica em um mamífero.
[0117] Em uma concretização, a presente revelação se refere a um polinucleotídeo que codifica na expressão, o peptídeo como aqui descrito para uso no tratamento de uma doença endócrina, uma doença nutricional e/ou uma doença metabólica em um mamífero.
[0118] Em uma concretização, a presente revelação se refere a um vetor que compreende um polinucleotídeo conforme descrito na presente invenção para uso no tratamento de uma doença endócrina, uma doença nutricional e/ou uma doença metabólica em um mamífero.
[0119] Em uma concretização, a presente revelação se refere a uma célula que compreende um polinucleotídeo conforme descrito na presente invenção para uso no tratamento de uma doença endócrina, uma doença nutricional e/ou uma doença metabólica em um mamífero.
[0120] Em uma concretização, a presente revelação se refere a uma célula que compreende um vetor conforme descrito na presente invenção para uso no tratamento de uma doença endócrina, uma doença nutricional e/ou uma doença metabólica em um mamífero.
[0121] Em um aspecto, a presente revelação se refere a uma composição para uso no tratamento de uma doença endócrina, uma doença nutricional e/ou uma doença metabólica, compreendendo um agente descrito na presente invenção. Em uma concretização, a dita composição é uma composição farmacêutica.
[0122] Em uma concretização, o agente compreende adicionalmente um segundo ingrediente ativo. O dito segundo ingrediente ativo pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em insulina, peptídeo tipo glucagon 1 (GLP-1), biguanidas, compostos de forscolina, sulfonilureia, um inibidor da dipeptidil peptidase-4 (DPP4), um inibidor da alfa-glicosidase, um inibidor da tiazolidina, uma meglitidina e um inibidor do cotransportador de sódio- glicose 2 (SGLT2). Outros métodos
[0123] Em um aspecto, a presente revelação diz respeito a um método de tratamento de uma doença endócrina, uma doença nutricional e/ou uma doença metabólica, o método compreendendo a administração de um agente, uma composição, um polinucleotídeo, um vetor ou uma célula, como aqui descrito, a um indivíduo em necessidade do mesmo.
[0124] Em um aspecto, a presente revelação diz respeito ao uso de um agente, uma composição, um polinucleotídeo, um vetor ou uma célula, conforme é descrito na presente invenção, para a fabricação de um medicamento para uso no tratamento de uma doença endócrina, uma doença nutricional e/ou uma doença metabólica em um mamífero.
[0125] Em um aspecto, a presente revelação se refere a um polinucleotídeo que codifica, na expressão, um peptídeo conforme descrito na presente invenção. Em um aspecto, a presente revelação se refere a um vetor que compreende o dito polinucleotídeo que codifica, na expressão, o peptídeo conforme descrito na presente invenção. Em um aspecto, a presente revelação se refere a uma célula que compreende o dito polinucleotídeo ou o dito veto que codifica, na expressão, do peptídeo conforme descrito na presente invenção.
[0126] Em um aspecto, a presente revelação se refere a um método para aumentar a secreção da insulina, o método compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo ou análogo de peptídeo descrito na presente invenção, a um indivíduo em necessidade do mesmo. Em uma concretização, o dito método é um método in vitro. Em um aspecto, a presente revelação se refere a um método para aumentar a secreção de insulina, o método compreendendo administrar uma quantidade terapêutica eficaz de um agente, uma composição, um polinucleotídeo, um vetor ou uma célula, como aqui descrito, a um indivíduo em necessidade do mesmo. Em uma concretização, o dito método é um método in vitro.
[0127] Em um aspecto, a presente revelação diz respeito a um método para diminuir os níveis de glicemia, o método compreendendo a administração de uma quantidade terapêutica eficaz de um peptídeo ou análogo de peptídeo, um agente, uma composição, um polinucleotídeo, um vetor ou uma célula, como aqui descrito, a um indivíduo em necessidade do mesmo. Em uma concretização, o dito método é um método in vitro. Em uma concretização, a secreção de insulina é aumentada. Em outra concretização, a absorção celular da glicose é aumentada. Em ainda outra concretização, a produção de insulina é aumentada. Em outra concretização, a produção de glucagon é diminuída.
[0128] Em um aspecto, a presente revelação diz respeito a um método, por exemplo, um método in vitro, para melhorar a morfologia das células β, o método compreendendo a administração de uma quantidade terapêutica eficaz de um peptídeo ou análogo de peptídeo, um agente, uma composição, um polinucleotídeo, um vetor ou uma célula, como aqui descrito, a um indivíduo em necessidade do mesmo.
[0129] Em um aspecto, a presente revelação se refere a um método para aumentar a viabilidade das células β, o método compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo ou análogo de peptídeo, um agente, uma composição, um polinucleotídeo, um vetor ou uma célula, como aqui descrito, a um indivíduo em necessidade do mesmo.
[0130] Em um aspecto, a presente revelação se refere a um método para retardar o surgimento do diabetes e de distúrbios e doenças associados com o diabetes, o método compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo ou análogo de peptídeo, um agente, uma composição, um polinucleotídeo, um vetor ou uma célula, como aqui descrito, a um indivíduo em necessidade do mesmo.
[0131] Em uma concretização da presente revelação, o agente pode compreender adicionalmente uma porção detectável. Por exemplo, uma porção detectável pode compreender ou consistir em um radioisótopo, como em um radioisótopo selecionado do grupo consistindo em 99mTc, 111In, 67Ga, 68Ga, 72As,89Zr, 123I e 201Tl. Dessa forma, as porções de ligação podem ser acopladas a nanopartículas que tenham a capacidade de formar imagens por vários métodos (por exemplo, SPECT, PET, MRI, ótico ou por ultrassom). Alternativamente, a porção detectável pode compreender ou consistir em um isótopo paramagnético, sendo tal isótopo paramagnético selecionado do grupo consistindo em 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr e 56Fe.
[0132] No caso do agente compreender uma porção detectável, então a porção detectável pode ser detectável por uma técnica de imageamento como por SPECT, PET, ressonância magnética, óptica ou ultrassom.
[0133] Em um aspecto, a presente revelação se refere ao uso de um agente, uma composição, um polinucleotídeo, um vetor ou uma célula, conforme descrito na presente invenção, para a preparação de uma composição diagnóstica para o diagnóstico de uma doença, distúrbio ou dano do pâncreas em um indivíduo. Itens
1. Um agente que compreende um peptídeo ou análogo de peptídeo, em que o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos da fórmula geral: X1LX2YGIK (SEQ ID NO: 177) em que: X1 é E ou G; X2 é S ou T; com a condição de que se X2 é T, o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende no máximo 25 resíduos de aminoácidos; e com a condição de que se X1 é E X2 é S, o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende no máximo 85 resíduos de aminoácidos.
2. Um agente que compreende um peptídeo, em que o peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos da fórmula geral: Z1Z2SZ3Z4YGLR (SEQ ID NO: 178) em que: Z1 é D ou G; Z2 é I ou G;
Z3 é V ou L; Z4 é V ou A.
3. O agente de acordo com o item Erro! Fonte de referência não encontrada., em que o agente compreende um peptídeo, em que o peptídeo compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo composto na DTYDGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 4), TYDGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 8), YDGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 13) e DGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 19). GDISVVYGLR (SEQ ID NO: 26), DISVVYGLR (SEQ ID NO: 34).
4. Um agente que compreende um peptídeo ou análogo de peptídeo compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos DTYDGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 4), TYDGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 8), YDGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 13) e DGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 19). GDISVVYGLR (SEQ ID NO: 26), DISVVYGLR (SEQ ID NO: 34);
5. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o agente compreende resíduos que não ocorrem na natureza, como por exemplo, aminoácidos não proteinogênicos.
6. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o agente é conjugado com uma porção.
7. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a porção é selecionada do grupo consistindo em polietilenoglicol (PEG), monossacarídeos, fluoróforos, cromóforos, compostos radioativos e peptídeos de penetração celular.
8. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o agente é adicionalmente modificado,
como por glicosilação, PEGuilação, amidação, esterificação, acilação, acetilação e/ou alquilação.
9. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o agente compreende ou consiste em repetições em tandem.
10. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que as repetições em tandem compreendem ou consistem na sequência de aminoácidos de qualquer uma ou mais das sequências como descritas nos itens anteriores.
11. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o agente é fundido com outro polipeptídeo.
12. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o dito polipeptídeo é selecionado do grupo consistindo em glutationa-S-transferase (GST) e proteína A.
13. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o agente é fundido com um marcador.
14. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o dito marcador é um marcador de oligo- histidina.
15. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o agente é cíclico, como quando o peptídeo é cíclico.
16. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o peptídeo ou análogo de peptídeo é capaz de formar pelo menos uma ponte de cisteína intramolecular, por exemplo, para formar um peptídeo cíclico ou parcialmente cíclico.
17. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em LAEIDSIELSYGIK (SEQ ID NO: 170), AEIDSIELSYGIK (SEQ ID NO: 171), EIDSIELSYGIK (SEQ ID NO: 172), IDSIELSYGIK (SEQ ID NO: 173), DSIELSYGIK (SEQ ID NO: 174), SIELSYGIK (SEQ ID NO: 175), IELSYGIK (SEQ ID NO: 148), KPLAEIDSIELTYGIK (SEQ ID NO: 176), ou uma variante ou fragmento da mesma.
18. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em KPLAEIDSIELSYGI (SEQ ID NO: 179), KPLAEIDSIELSYG (SEQ ID NO: 180), KPLAEIDSIELSY (SEQ ID NO: 181), KPLAEIDSIELS (SEQ ID NO: 182), KPLAEIDSIEL (SEQ ID NO: 183), KPLAEIDSIE (SEQ ID NO: 184), ou uma variante ou fragmento da mesma.
19. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende ou consiste na sequência de aminoácidos LAEIDSIELSYGIK (SEQ ID NO: 170), ou uma variante ou fragmento da mesma.
20. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende ou consiste na sequência de aminoácidos AEIDSIELSYGIK (SEQ ID NO: 171), ou uma variante ou fragmento da mesma.
21. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende ou consiste na sequência de aminoácidos
EIDSIELSYGIK (SEQ ID NO: 172), ou uma variante ou fragmento da mesma.
22. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende ou consiste na sequência de aminoácidos IDSIELSYGIK (SEQ ID NO: 173), ou uma variante ou fragmento da mesma.
23. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende ou consiste na sequência de aminoácidos DSIELSYGIK (SEQ ID NO: 174), ou uma variante ou fragmento da mesma.
24. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SIELSYGIK (SEQ ID NO: 175), ou uma variante ou fragmento da mesma.
25. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende ou consiste na sequência de aminoácidos IELSYGIK (SEQ ID NO: 176), ou uma variante ou fragmento da mesma.
26. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a variante compreende ou consiste em uma sequência em que qualquer um dos aminoácidos tenha sido alterado por outro aminoácido proteinogênico ou não proteinogênico, com a condição de que no máximo cinco aminoácidos são alterados dessa forma.
27. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a variante compreende ou consiste em uma sequência em que não mais do que cinco aminoácidos são alterados por outro aminoácido proteinogênico ou não proteinogênico, assim como não mais do que 4 aminoácidos, não mais do que 3 aminoácidos, não mais do que 2 aminoácidos ou não mais do que 1 aminoácido é(são) alterado(s).
28. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que um ou mais aminoácidos é(são) conservadoramente substituídos.
29. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende ou consiste em um ou mais aminoácidos adicionais, inseridos no terminal N e/ou C e/ou internamente dentro da sequência.
30. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende 1 aminoácido adicional conjugado ao terminal N ou C.
31. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende ou consiste em uma prolina inserida no terminal N.
32. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o agente não compreende mais do que 85, assim como não mais do que 80, assim como não mais do que 75, assim como não mais do que 70, assim como não mais do que 65, assim como não mais do que 60, assim como não mais do que 55, assim como não mais do que 50, assim como não mais do que 55, assim como não mais do que 40 aminoácidos, assim como não mais do que 35, assim como não mais do que 30, assim como não mais do que 28, assim como não mais do que 26, assim como não mais do que 24, assim como não mais do que 22, assim como não mais do que 20, assim como não mais do que 19, assim como não mais do que 18, assim como não mais do que 17, assim como não mais do que 16, assim como não mais do que 15, assim como não mais do que 14, assim como não mais do que 13, assim como não mais do que 12, assim como não mais do que 11, assim como não mais do que 10 aminoácidos.
33. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o agente compreende pelo menos 2 aminoácidos adicionais, assim como pelo menos 3, assim como pelo menos 4, assim como pelo menos 5, assim como pelo menos 6, assim como pelo menos 7, assim como pelo menos 8, assim como pelo menos 9, assim como pelo menos 10, assim como pelo menos 15 ou assim como pelo menos 20 aminoácidos conjugados ao terminal N ou C do peptídeo ou do análogo de peptídeo.
34. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o agente compreende adicionalmente uma porção detectável.
35. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a porção detectável compreende ou consiste em um radioisótopo.
36. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o radioisótopo é selecionado do grupo consistindo em 99mTc, 111In, 67Ga, 68Ga, 72As,89Zr, 123I e 201Tl.
37. O agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a porção detectável é detectável por uma técnica de imageamento, como imageamento por SPECT, PET, ressonância magnética, óptica ou ultrassom.
38. Uso do agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores, para a preparação de uma composição diagnóstica para o diagnóstico de uma doença, distúrbio ou dano ao pâncreas em um indivíduo.
39. Um polinucleotídeo que codifica, na expressão, um peptídeo ou análogo de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.
40. Um vetor que compreende um polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 39.
41. Uma célula que compreende um polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 39, ou um vetor de acordo com a reivindicação 40.
42. Uma composição que compreende o agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores.
43. A composição de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a composição é uma composição farmacêutica.
44. O agente de acordo com as reivindicações 1 a 37, o polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 39, o vetor de acordo com a reivindicação 40, a célula de acordo com a reivindicação 41 ou a composição de acordo com as reivindicações 42 e 43, para uso como um medicamento.
45. Um agente selecionado do grupo que consiste em: a) um peptídeo selecionado do grupo que consiste em (i) um peptídeo que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos da fórmula geral: X1LX2YGIK (SEQ ID NO: 177) em que: X1 é E ou G;
X2 é S ou T; com a condição de que se X2 é T, o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende no máximo 25 resíduos de aminoácidos; (ii) um peptídeo que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos da fórmula geral: Z1Z2SZ3Z4YGLR (SEQ ID NO: 178) em que: Z1 é D ou G; Z2 é I ou G; Z3 é V ou L; Z4 é V ou A; ou (iii) um peptídeo que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste na VDTYDGDISVVYGL (SEQ ID NO: 3) VDTYDGDISVVYG (SEQ ID NO: 6), VDTYDGDISVVY (SEQ ID NO: 10), VDTYDGDISVV (SEQ ID NO: 15), VDTYDGDISV (SEQ ID NO: 21) e VDTYDGDIS (SEQ ID NO: 28); b) um polinucleotídeo que codifica, na expressão, o peptídeo de a); c) um vetor que compreende o polinucleotídeo de b); ou d) uma célula que compreende o polinucleotídeo de b), ou o vetor de c); para uso no tratamento de uma doença endócrina, uma doença nutricional e/ou uma doença metabólica em um mamífero.
46. O agente ou a composição para uso de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o peptídeo é selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO: 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155 e 156.
47. O agente ou a composição para uso de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o peptídeo é selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 1, 136, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 67, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 135, 137, 138, 139, 157, 158, 159, 160, 161, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183 e 184.
48. O agente ou a composição para uso de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o dito agente compreende um segundo ou outro ingrediente ativo.
49. O agente ou a composição para uso de acordo com o item 48, em que o segundo ou outro ingrediente ativo é selecionado do grupo consistindo em insulina, peptídeo tipo glucagon 1 (GLP-1), sulfonilureia, um inibidor da dipeptidil peptidase-4 (DPP4), um inibidor da alfa-glicosidase, uma tiazolidinodiona, uma meglitidina e um inibidor do cotransportador de sódio-glicose 2 (SGLT2).
50. O agente ou a composição de acordo com qualquer um dos itens anteriores para uso no tratamento de uma doença endócrina, uma doença nutricional e/ou uma doença metabólica em um mamífero.
51. O agente ou a composição para uso de acordo com o item 50, em que o mamífero é um ser humano.
52. O agente ou a composição para uso de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a doença endócrina, a doença nutricional e/ou a doença metabólica é selecionada do grupo consistindo em diabetes mellitus, diabetes mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2, diabetes mellitus relacionado à desnutrição, distúrbios da regulação da glicose e secreção interna pancreática, síndrome da resistência à insulina, tolerância à glicose prejudicada, hiperglicemia, hiperinsulinemia e quaisquer combinações das mesmas.
53. O agente ou a composição para uso de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a doença endócrina, a doença nutricional e/ou a doença metabólica é selecionada do grupo que consiste em diabetes mellitus, distúrbios da glândula tireoide, distúrbios da regulação da glicose e secreção interna pancreática, distúrbios das glândulas endócrinas, desnutrição, deficiências nutricionais, obesidade, hiperalimentação e distúrbios metabólicos.
54. O agente ou a composição para uso de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o diabetes mellitus é selecionado do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2, diabetes mellitus relacionado à desnutrição, diabetes mellitus especificado e diabetes mellitus não especificado.
55. O agente ou a composição para uso de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o distúrbio da regulação da glicose e da secreção interna pancreática é selecionado do grupo consistindo em coma hipoglicêmico não diabético e distúrbios da secreção interna pancreática.
56. O agente ou a composição para uso de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o distúrbio da obesidade e hiperalimentação é selecionado do grupo consistindo em adiposidade localizada, hiperalimentação e sequelas causadas pela hiperalimentação.
57. O agente ou a composição para uso de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o distúrbio das deficiências nutricionais é selecionado do grupo consistindo em distúrbios do metabolismo de aminoácidos aromáticos, distúrbios do metabolismo de aminoácidos de cadeia ramificada e metabolismo de ácidos graxos, desordens do metabolismo de aminoácidos, intolerância à lactose, distúrbios do metabolismo de carboidratos, distúrbios do metabolismo de esfingolipídios, distúrbios do armazenamento lipídico, distúrbios do metabolismo de glicosaminoglicanos, distúrbios do metabolismo de glicoproteínas, distúrbios do metabolismo de lipoproteínas, lipidemias, distúrbios do metabolismo da purina e pirimidina, distúrbios do metabolismo da porfirina e bilirrubina, distúrbios do metabolismo de minerais, fibrose cística, amiloidose, depleção de volume, distúrbios do equilíbrio de fluidos, eletrólitos e ácido-base, e distúrbios endócrinos e metabólicos pós-procedimento.
58. Um método de tratamento de uma doença endócrina, uma doença nutricional e/ou uma doença metabólica, o método compreendendo administrar um agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores a um indivíduo em necessidade do mesmo.
59. Uso de um agente de acordo com qualquer um dos itens anteriores para a fabricação de um medicamento para uso no tratamento de uma doença endócrina, uma doença nutricional e/ou uma doença metabólica em um mamífero.
60. Um método para retardar o surgimento do diabetes e de distúrbios e doenças associados com o diabetes, o método compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente, conforme definido em qualquer um dos itens anteriores, a um indivíduo em necessidade do mesmo.
61. Um método para diminuir os níveis de glicemia, o método compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de qualquer um dos itens anteriores, a um indivíduo em necessidade do mesmo.
62. O método de acordo com o item 61, em que a secreção de insulina é aumentada.
63. O método de acordo com o item 61, em que a absorção celular da glicose é aumentada.
64. O método de acordo com o item 61, em que a secreção de insulina é aumentada.
65. O método de acordo com o item 61, em que a produção de glucagon é diminuída.
66. Um método para melhorar a viabilidade das células beta, o método compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de qualquer um dos itens anteriores, a um indivíduo em necessidade do mesmo.
67. Um método para melhorar a morfologia das células beta, o método compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de qualquer um dos itens anteriores, a um indivíduo em necessidade do mesmo.
68. Um método para estabilizar ou melhorar a viabilidade e/ou a morfologia das ilhotas pancreáticas, o método compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de qualquer um dos itens anteriores, a um indivíduo em necessidade do mesmo. Exemplos
[0134] A revelação é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos, que, no entanto, não devem ser interpretados como limitantes para a revelação. Esses exemplos demonstram que os peptídeos exemplares da presente divulgação estimulam a proliferação de células β e têm a capacidade de proteger e resgatar as células β da apoptose induzida por condições glicotóxicas. Também é demonstrado que os peptídeos exemplares têm a capacidade de estimular a secreção de insulina a partir de células β de ratos, assim como das ilhotas pancreáticas isoladas de camundongo, onde também é demonstrado que os peptídeos reduzem os níveis de glucagon. Além disso, os exemplos demonstram que os peptídeos reduzem os níveis de glicose plasmática in vivo em um teste de tolerância à glicose e que os peptídeos retardam o surgimento de diabetes tipo 1 em ratos BB lyp/lyp. Exemplo 1: Design do peptídeo
[0135] Os novos peptídeos foram projetados após investigações lógicas da atividade da estrutura. Para FOL- 005 (SEQ ID NO: 1), os peptídeos foram projetados ao redor do sítio RGD, mas sofreram mutação para gerar diferentes estruturas que poderiam potencialmente interagir com diferentes integrinas. Uma sequência semelhante à FOL-005 foi identificada no terceiro domínio de repetição de fibronectina tipo III (TNfn3) na tenascina C, e verificou- se que ele era razoavelmente semelhante ao sítio RGD que sofreu mutação do FOL-005. Um peptídeo foi projetado a partir desta sequência, chamado de FOL-014. A estrutura de cristal de raios-X do domínio da tenascina 3 TNfn3 (código PDB 1TEN, Leahy et al. (1992) Science 258(5084):987-91) foi analisada. A sequência FOL-014 (SEQ ID NO: 136) abrange a volta beta e toda a 3ª folha beta. As variantes de FOL-014 foram projetadas para permitir a modificação estrutural e estabilização da estrutura molecular tridimensional. Especificamente, as variantes de peptídeos abrangeram a região da volta beta com cadeias laterais expostas e algumas variantes ciclizadas para manter a geometria.
[0136] Todos os peptídeos foram sintetizados pela síntese de peptídeos em fase sólida usando vários fabricantes de peptídeos. Principalmente, as variantes de peptídeos foram fornecidas pela Biopeptide Inc., Califórnia. Exemplo 2: FOL-005 e FOL-014 induziram a proliferação de células INS-1
[0137] Para investigar se FOL-005 e FOL-014 poderiam induzir a proliferação de células β, usamos células INS-1. As células INS-1 de ratos foram semeadas em placas de 96 poços em meio RPMI com suplemento e, após 2 horas, o meio foi alterado para RPMI sem suplemento. Durante o experimento de proliferação, as células foram incubadas em diferentes condições de teste (FOL-005, FOL-014, revestidas ou em solução, incubação por 48 h) e, durante as últimas 20 horas do período de cultura, as células foram pulsadas com 1 μ de Ci/poço de [metil-3H]-timidina. As células foram, em seguida, coletadas sobre filtros de fibra de vidro usando uma colheitadeira FilterMate. Os filtros foram secos com ar, e a radioatividade ligada foi medida usando um contador de cintilação líquida. Para estudar se o FOL-005 influenciou a proliferação de células β, as células INS-1 foram tratadas com quantidades crescentes de FOL-005 solúvel (0,06 a 6 μM) durante 48 horas, e a proliferação foi medida com incorporação de timidina radiomarcada em DNA recém- sintetizado. O FOL-005 estimulou a proliferação de células INS-1 (figura 1A). Os poços foram revestidos com FOL-005 ou FOL-014 e, posteriormente, bloqueados com albumina sérica bovina (BSA) antes da adição de células INS-1, também estimularam a proliferação em comparação com os poços revestidos de controle (ctrl) (figuras 1B e C).
[0138] Isso demonstrou que FOL-005 e FOL-014 interagiram com células β e induziram a proliferação. Exemplo 3: FOL-005 protegeu as células β contra a glicotoxicidade
[0139] Como a glicotoxicidade nas células β pancreáticas é um processo bem estabelecido no diabetes tipo 2, investigamos em seguida os efeitos protetores do FOL-005 nas células durante as condições glicotóxicas. Primeiro, confirmamos que 20 mM de glicose induziu a apoptose celular nas células INS após 48 h de exposição. O meio RPMI contendo alto teor de glicose (20 mM) induziu mais células anexina V positivas e mais atividade da caspase-3 em células INS em comparação com as células incubadas com meio contendo glicose
5 mM (figuras 2A e B). A exposição das células INS-1 a glicose 20 mM ao mesmo tempo que FOL-005 diminuiu a apoptose celular detectada tanto pela marcação com anexina V como pela atividade da caspase-3 (figuras 2A e B). A taxa de apoptose nas células INS-1 foi medida com o kit de ensaio da caspase-3 ou por marcação com o kit de detecção de apoptose à base de anexina V com 7-AAD. A atividade da caspase-3 foi medida com fluorescência em um comprimento de onda de excitação de 380 nm e um comprimento de onda de emissão de 440 nm. A atividade da caspase-3 foi, em seguida, normalizada para a concentração de proteína em cada poço. As medições das células marcadas com anexina V foram feitas utilizando um citômetro de fluxo CyAn ADP e analisadas com o software Summit V4.3.
[0140] Em conclusão, sabe-se que a glicotoxicidade induz a apoptose de células β; no entanto, na presença de FOL-005, a apoptose induzida pela glicotoxicidade foi diminuída. Exemplo 4: FOL-005 induziu a secreção de insulina das células INS-1
[0141] Para investigar o efeito estimulante do FOL-005 sobre a secreção de insulina, as células β INS-1 foram utilizadas nos experimentos a seguir. As células foram semeadas de um dia para o outro em cRPMI e, em seguida, elas foram lavadas com PBS antes da pré-incubação por 60 min a 37 °C em tampão de bicarbonato de Krebs-Ringer (KRB), em pH 7,4, suplementado com HEPES 10 mM e 0,1% de albumina sérica bovina. Após a pré-incubação, o tampão foi trocado e as células INS-1 foram incubadas em diferentes condições de teste (0 mM, 5 mM ou 20 mM de glicose) e estimuladas com peptídeo FOL-005 ou FOL-015 (SEQ ID NO: 158), ou elas não foram tratadas durante 60 min a 37° C. Imediatamente após a incubação, uma alíquota do tampão foi removida e congelada para ser usada em um ensaio posterior de insulina com um kit de radioimunoensaio de insulina.
[0142] Os resultados demonstraram que as β células estimuladas com peptídeo FOL-005 secretaram mais insulina em comparação com células de controle não estimuladas ou com as células estimuladas com o peptídeo de controle FOL-015 (figura 3A) sob condições sem glicose. As células β INS-1 submetidas à glicose (5 mM ou 20 mM) responderam com secreção de insulina após a estimulação com o peptídeo FOL-005 (6 μM) (figura 3B). As células INS-1 estimuladas com peptídeo FOL-005 6 μM na presença de glicose 20 mM responderam com mais secreção de insulina em comparação com as células estimuladas com FOL-005 incubadas com glicose 5 mM (figura 3B). Exemplo 5: FOL-005 induziu a secreção de insulina a partir das ilhotas pancreáticas de camundongos
[0143] As ilhotas pancreáticas dos camundongos foram isoladas dos camundongos machos C57BL/6J de 8 semanas de idade (Taconic). Os camundongos foram sacrificados por uma overdose de isoflurano e deslocamento cervical. 3 ml de colagenase P 0,9 U/ml foram injetados no duto pancreático para inflar o pâncreas. O pâncreas foi, em seguida, removido, e o colágeno foi digerido por 19 min a 37 °C. As amostras foram vigorosamente agitadas para romper o tecido. O material digerido foi transferido para a solução salina balanceada de
Hank (HBSS) resfriada com Ca2+ e Mg2+. A suspensão foi deixada em repouso por 10 minutos para permitir que as ilhotas imergissem, e foram lavadas com HBSS fresco quatro vezes. As ilhotas foram, então, colhidas manualmente e selecionadas de acordo com o tamanho. As ilhotas (n = 3 por poço em uma placa de 96 poços) foram pré-incubadas em tampão KRB durante 10 min a 37 º C, em pH 7,4, e suplementadas com HEPES 10 mM com 0,1 % de albumina sérica bovina. Após a pré-incubação, o tampão foi trocado e as ilhotas foram incubadas em diferentes condições de teste no novo tampão KRB com albumina sérica bovina 0,1 % (ctrl não tratado, peptídeo FOL-005 ou GLP-1) durante 60 min a 37 °C. Imediatamente após a incubação, uma alíquota do tampão foi removida e congelada para ser usada em um ensaio posterior de insulina.
[0144] Os resultados demonstraram que as ilhotas pancreáticas isoladas de camundongo estimuladas com GLP-1 (100 nM) ou FOL-005 (6 µM) secretaram mais insulina em comparação com as ilhotas de controle não estimuladas (figura 3C). Exemplo 6: FOL-014 induziu a secreção de insulina das células INS-1
[0145] As células β INS-1 foram usadas para investigar o efeito estimulante do FOL-014 sobre a secreção de insulina. As células foram semeadas de um dia para o outro e, em seguida, elas foram lavadas com PBS antes da pré- incubação por 60 min a 37 °C em tampão de bicarbonato de Krebs-Ringer (KRB), em pH 7,4, suplementado com HEPES 10 mM e 0,1% de albumina sérica bovina. Após a pré-incubação, o tampão foi trocado e as células INS-1 foram incubadas em novo tampão KRB suplementado com HEPES 10 mM com 0,1 % de albumina sérica bovina, e foram estimuladas com peptídeo FOL-014 ou deixadas sem tratamento durante 60 min a 37 °C. Imediatamente após a incubação, uma alíquota do tampão foi removida e congelada para ser usada em um ensaio posterior de insulina.
[0146] Os resultados demonstraram que as células β estimuladas com peptídeo FOL-014 secretaram mais insulina em comparação com as células de controle não estimuladas (figura 4A). Exemplo 7: FOL-014 induziu a secreção de insulina a partir das ilhotas pancreáticas de camundongos
[0147] As ilhotas pancreáticas dos camundongos foram isoladas de camundongos machos C57BL/6J de 8 semanas de idade, como descrito de acordo com o exemplo 5. As ilhotas foram, então, colhidas manualmente e selecionadas de acordo com o tamanho. As ilhotas (n = 5 por poço em uma placa de 96 poços) foram pré-incubadas em 200 µl de tampão KRB durante 10 min a 37 ºC, em pH 7,4, e suplementadas com HEPES 10 mM com albumina sérica bovina a 0,1%. Após a pré-incubação, o tampão foi trocado e as ilhotas foram incubadas em diferentes condições de teste no novo tampão KRB com albumina sérica bovina 0,1 % (ctrl não tratado, peptídeo FOL-014 e GLP-1) durante 60 min a 37 °C. Imediatamente após a incubação, uma alíquota do tampão foi removida e congelada para ser usada em um ensaio posterior de insulina.
[0148] O resultado mostra que as ilhotas pancreáticas de camundongo estimuladas com FOL-014 (6 μM) secretaram mais insulina em comparação com as ilhotas de controle não estimuladas (figura 4B). O GLP-1 (100 nM) ou FOL-014 (0,6 μM) não afetaram a secreção de insulina (figura 4B). Exemplos 8 a 11; 20 e 21: Estimulação da secreção de insulina das linhagens celulares INS-1 por FOL-014, FOL-005 e peptídeos relacionados
[0149] Materiais e métodos: As células β INS-1 de rato (passagens 60 a 70) foram cultivadas a 37 °C e a 5% de CO2 em meio cRPMI (RPMI 1640 suplementado com soro bovino fetal a 10%, penicilina 50 UI/ml, estreptomicina 50 mg/l, HEPES 10 mM, L-glutamina 2 mM, piruvato de sódio 1 mM e beta- mercaptoetanol 50 μM), a menos que seja indicado de outra forma. As células INS-1 foram semeadas em placas de 96 poços (2 × 103 células/poço) em meio cRPMI e, após a incubação de um dia para o outro, as células foram lavadas com PBS antes da pré-incubação por 120 min a 37 °C em tampão de bicarbonato de Krebs-Ringer em pH 7.4, suplementado com HEPES 10 mM, albumina sérica bovina 0,1% e glicose 2,8 mM. Após a pré- incubação, o tampão foi trocado com tampão de Krebs-Ringer fresco, conforme descrito acima, e suplementado com concentrações de glicose e peptídeos específicos para os experimentos individuais descritos abaixo. Imediatamente após 60 minutos de incubação a 37 ºC, uma alíquota do tampão foi removida e congelada para ser usada em um ensaio posterior de insulina de ELISA. Exemplo 8. A secreção de insulina induzida por FOL-014 é dependente da dose de forma não linear
[0150] A liberação de insulina das células INS-1 foi medida após a exposição a concentrações crescentes de
FOL-014 e comparada com o efeito estimulador do GLP-1 e do controle não tratado durante a alta concentração de glicose (16,7 mM). Todas as concentrações de FOL-014 testadas provocaram uma liberação significativamente maior de insulina em comparação com o controle não tratado. A 6 nM ou mais, o FOL-014 desencadeou a liberação de insulina dentro da mesma faixa que GLP-1 100 nM. Em concentrações variando de 0,6 a 60 nM, a secreção de insulina aumentou de forma linear em relação ao aumento das concentrações de FOL-014. A exposição às concentrações de FOL-014 ≥ 600 nM não aumentou a secreção de insulina (figura 5).
[0151] Os resultados demonstraram que o FOL-014 aumentou significativamente a secreção de insulina das células INS-1 in vitro de forma dependente da dose e não linear. Exemplo 9. A capacidade do FOL-014 para induzir a secreção de insulina é dependente de glicose
[0152] A liberação de insulina das células INS-1 foi medida após a exposição a FOL-014 60 nM em concentrações crescentes de glicose. Nas amostras de controle não tratadas, as concentrações elevadas de glicose aumentaram a secreção de insulina até 11,1 mM de glicose ou acima disso. Na presença de FOL-014, a secreção de insulina aumentou significativamente de forma dependente de glicose já a partir de glicose 5,5 mM. (Figura 6).
[0153] Os resultados demonstraram que a presença de FOL-014 aumentou significativamente a secreção de insulina de células INS-1 in vitro de forma dependente da concentração de glicose e que o FOL-014 também foi eficaz em níveis de glicose marginalmente elevados. Exemplo 10. FOL-014 ou FOL-005, em combinação com GLP- 1, aumentaram a secreção de insulina em comparação com qualquer um dos peptídeos, isoladamente.
[0154] A secreção de insulina das células INS-1 foi medida após a exposição ao FOL-005, FOL-014, GLP-1 ou combinações desses, e foi expressa como a porcentagem de controle não tratado. O efeito combinado de GLP-1 e FOL-014 resultou em uma liberação significativamente maior de insulina do que GLP-1 ou FOL-014 isoladamente. O efeito aditivo da combinação de FOL-005 e GLP-1 foi menos acentuado, mas aumentou a secreção de insulina em comparação com GLP-1 isoladamente. Os experimentos foram realizados na presença de glicose 16,7 mM (Figura 7).
[0155] Os resultados demonstraram que a combinação de GLP-1 e FOL-014 poderia potencializar ainda mais a secreção de insulina a partir das células INS-1 in vitro em comparação com cada peptídeo, isoladamente. Além disso, a combinação de FOL-005 e GLP-1 aumentou tangencialmente a secreção de insulina. Exemplo 11. A capacidade dos novos análogos de peptídeo de induzir a secreção de insulina nas linhagens de células pancreáticas foi investigada
[0156] Novos análogos de peptídeos, derivados de FOL-005 ou FOL-014, foram testados quanto à sua capacidade de induzir a secreção de insulina em duas linhagens celulares de INS-1 separadas na presença de glicose 16,7 mM. FOL-005, FOL-014 e GLP-1, bem como um controle com alto teor de glicose (16,7 mM) e outro com baixo teor de glicose (2,8 mM) (não mostrado) foram incluídos em cada experimento, e a concentração de peptídeos foi igual a 100 nM. Para corrigir a variância entre os experimentos, todos os valores foram normalizados e expressos como a porcentagem do valor médio do controle com alto teor de glicose nos experimentos individuais. Os análogos foram posteriormente classificados de acordo com o desempenho (figuras 11A e 11B). Os análogos de peptídeo que provocaram uma resposta à insulina abaixo do valor médio de controle da alta concentração de glicose foram considerados não funcionais e, por isso, foram excluídos (não mostrados).
[0157] Os resultados demonstraram a capacidade de vários novos análogos de peptídeo para melhorar a secreção de insulina a partir de células β INS-1 in vitro. Exemplo 12. FOL-014 aumentou a secreção de insulina das ilhotas pancreáticas derivadas de camundongos
[0158] Os camundongos C57/bl6 machos de doze semanas de idade foram eutanasiados com isoflurano e deslocamento cervical. Após o aperto dos dutos hepáticos, 3 ml de colagenase P 0,9 U/ml foram injetados no duto biliar para inflar o pâncreas. O pâncreas foi, em seguida, removido, e digerido por 19 min a 37 °C. As amostras foram vigorosamente agitadas para romper o tecido. O material digerido foi rapidamente transferido para a solução de sais balanceados de Hank com Ca 2+ e Mg2+. A suspensão foi deixada em repouso por 8 minutos para permitir que as ilhotas imergissem, e foram lavadas da mesma maneira por quatro vezes. As ilhotas foram, então, colhidas manualmente e selecionadas de acordo com o tamanho.
[0159] As ilhotas recém-isoladas foram semeadas em grupos de 5 em uma placa de 96 poços e pré-incubadas por 1 h a 37 °C em um tampão de bicarbonato de Krebs-Ringer (pH 7,4). As ilhotas foram incubadas por 1 h a 37 °C em solução tamponada de Krebs-Ringer suplementada com FOL-014 0,6 ou 6 μM ou GLP-1 100 nM, ou não foram suplementadas, para fins de controle. Imediatamente após a incubação, o meio foi removido para os ensaios de insulina e glucagon usando os kits de ELISA da Mercodia. O efeito do FOL-014 na secreção de insulina (figuras 8A e B) e de glucagon (figuras 8C e D) das ilhotas de camundongo isoladas foi medido na presença de concentrações de glicose baixa (2,8 mM; figuras 8A e C) ou alta (16,7 mM; figuras 8B e D. Observou-se efeito significativo do FOL-014 na presença da alta concentração de glicose para insulina e na presença das concentrações alta e baixa de glicose para o glucagon. O efeito do FOL-014 difere do GLP-1, que também aumentou a secreção de insulina em amostras de baixo teor de glicose, mas não inibiu a secreção de glucagon em baixas condições de glicose.
[0160] Os resultados demonstraram que o FOL-014 aumentou a secreção da insulina e inibiu a secreção de glucagon nas ilhotas pancreáticas. Exemplo 13 FOL-014 reduziu os níveis de glicose plasmática em um teste de tolerância à glicose intraperitoneal (IPGTT) em camundongos
[0161] O sangue total foi coletado para efetuar medições de glicose e insulina de camundongos C57bl/6 machos tipo selvagem com 10 semanas de idade. Após um jejum de 4 horas, os camundongos foram divididos em três grupos e receberam uma injeção intraperitoneal (ip) de soro fisiológico, peptídeo 30 nmol/kg (figura 9A) ou peptídeo 200 nmol/kg (figura 9B). 15 min após as injeções de FOL-014 ou soro fisiológico (controle), os camundongos receberam 2 g de glicose/kg ip. A glicemia foi medida em 5, 15, 30, 45 e 60 minutos após a injeção de glicose. Os cálculos estatísticos foram realizados usando o teste t de Student. O FOL-014 dosado a 200 nmol/kg reduziu significativamente os níveis plasmáticos de glicose em comparação com o controle, quando medido como a área sob a curva. Além disso, a diferença foi significativa em 15, 30 e 45 minutos. Na dose de 30 nmol/kg, o FOL-014 reduziu os níveis plasmáticos de glicose com um efeito significativo 45 minutos após a injeção de glicose.
[0162] Os resultados demonstraram que o FOL-014 poderia reduzir os níveis plasmáticos de glicose em um teste de tolerância à glicose realizado em camundongos selvagens saudáveis. Exemplo 14. FOL-014 atrasou o surgimento do diabetes tipo 1 em ratos BB lyp/lyp.
[0163] Os ratos BB lyp/lyp foram randomizados nos grupos de placebo (cloreto de sódio, 9 mg/ml) ou de tratamento com FOL-014 3 vezes/semana, do dia 40 até o surgimento do diabetes tipo 1, definido como níveis de glicose plasmática ≥ 11,1 mM. A dose de 100 nmol/kg de peptídeo FOL-014 em soro fisiológico ou placebo (solução salina) foi administrada subcutaneamente, e os animais foram imediatamente cessados após exceder os níveis plasmáticos críticos de glicose. A diferença entre animais tratados com FOL-014 e animais que recebem tratamento com placebo foi significativa tanto quando expressa como idade média para o surgimento do diabetes tipo 1 (figura 10A) quanto quando descrita como a porcentagem de animais que desenvolveram diabetes tipo 1 por dia (figura 10B).
[0164] Os resultados demonstraram que o tratamento com FOL-014 retardou significativamente o surgimento do diabetes tipo 1 em ratos BB lyp/lyp. Exemplo 15 FOL-005 e FOL-014 apresentaram padrões de distribuição específicos de órgão em camundongos.
[0165] Os camundongos C57Bl/6 receberam, por injeção subcutânea, FOL-005 marcado com H3, e foram eutanasiados em 1 h (figura 12A) ou 2 h (figura 12B) após a injeção. Após o corte do corpo, a distribuição do peptídeo marcado foi visualizada. A ligação forte ficou evidente no pâncreas e no local da injeção. Utilizando o sistema de captura de imagem Small Animal Imaging System da Pearl Trilogy, a biodistribuição in vivo e a localização no tecido de dois peptídeos marcados com Cy7.5, FOL-005 (figura 12C) e FOL-014 (figura 12D) em camundongos nude NMRI via injeção subcutânea foi investigada. O acúmulo elevado de peptídeo ficou evidente na área do tecido pancreático. O mesmo padrão de distribuição foi encontrado após as administrações i.v.(não mostradas). A dose de cada peptídeo foi de 10 nmol por camundongo. Os camundongos foram imageados antes da injeção, em 5 min, 20 min, 50 min, 60 min, 2 h, 4 h, 6 h, 24 h e 48 h após a administração de peptídeo marcado.
Exemplo 16. Captura de imagem específica do tecido para uso diagnóstico
[0166] Os agentes preparados conforme definido aqui são marcados por conjugação a uma sonda ou porção para captura de imagem adequada, utilizando métodos conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. Os agentes conjugados de peptídeo-sonda são posteriormente administrados a um indivíduo e a biodistribução é posteriormente monitorada, por exemplo, por até 48 h após a administração. O agente conjugado é, dessa forma, utilizado como uma ferramenta diagnóstica ou prognóstica para investigação do estado pancreático. Sendo assim, os agentes conjugados são adequados para detectar, diagnosticar ou monitorar doenças, processos da doença e progressão, suscetibilidade e também para determinar a eficácia de um tratamento. Os agentes são particularmente adequados para monitorar o estado diabético de um indivíduo. Os agentes conjugados também são utilizados para monitorar e/ou prever o risco de desenvolver uma doença, especificamente do diabetes. O teste é usado sozinho ou juntamente com outros testes conhecidos pelas pessoas versadas na técnica, como exames de sangue, testes genéticos, exames de urina e biópsias. Exemplo 17: Visão geral da sequência SEQ ID NO Sequência Observações: 1 VDTYDGDISVVYGLR FOL-005 2 VDTYDGDISVVYGLS 3 VDTYDGDISVVYGL FOL-025 4 DTYDGDISVVYGLR FOL-061 5 TYDGDISVVYGLRS 6 VDTYDGDISVVYG FOL-024 7 DTYDGDISVVYGL 8 TYDGDISVVYGLR 9 YDGDISVVYGLRS
10 VDTYDGDISVVY 11 DTYDGDISVVYG 12 TYDGDISVVYGL 13 YDGDISVVYGLR 14 DGDISVVYGLRS 15 VDTYDGDISVV 16 DTYDGDISVVY 17 TYDGDISVVYG 18 YDGDISVVYGL 19 DGDISVVYGLR FOL-062 20 GDISVVYGLRS 21 VDTYDGDISV 22 DTYDGDISVV 23 TYDGDISVVY 24 YDGDISVVYG 25 DGDISVVYGL 26 GDISVVYGLR FOL-009h 27 DISVVYGLRS 28 VDTYDGDIS FOL-019h 29 DTYDGDISV 30 TYDGDISVV 31 YDGDISVVY 32 DGDISVVYG 33 GDISVVYGL 34 DISVVYGLR 35 ISVVYGLRS 36 VDTYDGDI 37 DTYDGDIS 38 TYDGDISV 39 YDGDISVV 40 DGDISVVY 41 GDISVVYG 42 DISVVYGL 43 ISVVYGLR 44 VDTYDGD 45 DTYDGDI 46 TYDGDIS 47 YDGDISV 48 DGDISVV 49 GDISVVY 50 DISVVYG 51 ISVVYGL 52 DTYDGD 53 TYDGDI 54 YDGDIS
55 DGDISV 56 GDISVV 57 DISVVY 58 ISVVYG 59 TYDGD 60 YDGDI 61 DGDIS 62 GDISV 63 DISVV 64 ISVVY 65 SVVYG 66 MRIAVICFCLLGITCAIPVKQADSGSSEEK Osteopontina QLYNKYPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQT humana tipo LPSKSNESHDHMDDMDDEDDDDHVDSQDS selvagem, ou IDSNDSDDVDDTDDSHQSDESHHSDESDE seja, GenBank: LVTDFPTDLPATEVFTPVVPTVDTYDGRG AAA59974.1
LDSASSEVN 67 VDTYDGRGDSVVYGLR FOL-002 68 VDZ3Z4Z5GZ7Z8SZ10Z11YGLR Z3 é T ou V; Z4 é Y ou P; Z5 é D ou N; Z7 é D ou G; Z8 é I ou G; Z10 é V ou L; Z11 é V ou A 69 VDVPNGDISLAYGLR FOL-004 70 DVPNGDISLAYGLRS 71 VDVPNGDISLAYGL FOL-016 72 DVPNGDISLAYGLR FOL-007 73 VPNGDISLAYGLRS 74 VDVPNGDISLAYG FOL-017 75 DVPNGDISLAYGL 76 VPNGDISLAYGLR 77 PNGDISLAYGLRS 78 VDVPNGDISLAY 79 DVPNGDISLAYG 80 VPNGDISLAYGL 81 PNGDISLAYGLR FOL-008 82 NGDISLAYGLRS 83 VDVPNGDISLA FOL-018 84 DVPNGDISLAY
85 VPNGDISLAYG 86 PNGDISLAYGL 87 NGDISLAYGLR 88 GDISLAYGLRS 89 VDVPNGDISL 90 DVPNGDISLA 91 VPNGDISLAY 92 PNGDISLAYG 93 NGDISLAYGL 94 GDISLAYGLR FOL-009 95 DISLAYGLRS 96 VDVPNGDIS FOL-019 97 DVPNGDISL 98 VPNGDISLA 99 PNGDISLAY 100 NGDISLAYG 101 GDISLAYGL 102 DISLAYGLR 103 ISLAYGLRS 104 VDVPNGDI 105 DVPNGDIS 106 VPNGDISL 107 PNGDISLA 108 NGDISLAY 109 GDISLAYG 110 DISLAYGL 111 ISLAYGLR 112 VDVPNGD 113 DVPNGDI 114 VPNGDIS 115 PNGDISL 116 NGDISLA 117 GDISLAY 118 DISLAYG 119 ISLAYGL 120 DVPNGD 121 VPNGDI 122 PNGDIS 123 NGDISL 124 GDISLA 125 DISLAY 126 ISLAYG 127 VPNGD 128 PNGDI 129 NGDIS
130 GDISL 131 DISLA 132 ISLAY 133 SLAYG 134 MRLAVICFCLFGIASSLPVKVTDSGSSEEK Osteopontina LYSLHPDPIATWLVPDPSQKQNLLAPQNA murina tipo VSSEEKDDFKQETLPSNSNESHDHMDDDD selvagem, ou DDDDDDGDHAESEDSVDSDESDESHHSDE seja, SDETVTASTQADTFTPIVPTVDVPNGRGD Sequência de SLAYGLRSKSRSFQVSDEQYPDATDEDLT referência SHMKSGESKESLDVIPVAQLLSMPSDQDN NCBI: NGKGSHESSQLDEPSLETHRLEHSKESQE NP_001191162.1
EVN 135 VDVPNGRGDSLAYGLR FOL-001 136 KPLAEIDSIELSYGIK FOL-014 137 GDPNDGRGDSVVYGLR FOL-003 138 VDTYDGGISVVYGLR FOL-026 139 VDTYDGDGSVVYGLR FOL-027 140 KX2LAX5X6X7X8IX10LX12YGIK X2 é C, P ou G; X5 é E ou G; X6 é C, D ou I; X7 é D, I, S ou G; X8 é S, D ou G; X10 é E ou G; X12 é S ou T; 141 KCLAECDSIELSYGIK (cíclico) FOL-032 142 CLAEIDSC (cíclico) FOL-033 143 CFKPLAEIDSIECSYGIK (cíclico) FOL-036 144 KPLAEDISIELSYGIK FOL-037 145 KPLAEISDIELSYGIK FOL-038 146 KPLAEIGDIELSYGIK FOL-039 147 KPLAEGDIELSYGIK FOL-040 148 KPLAEIELSYGIK FOL-041 149 KPLAEIDSIELTYGIK FOL-042 150 KPLAEIDGIELSYGIK FOL-043 151 KPLAEIDGIELTYGIK FOL-044 152 KPLAEIGSIELSYGIK FOL-045 153 KGLAEIDSIELSYGIK FOL-046 154 KPLAGIDSIGLSYGIK FOL-047 155 KCLAEIDSCELSYGIK cíclico FOL-034 156 CFKPLAEIDSIEC cíclico FOL-035 157 VDVPEGDISLAYGLR FOL-010
158 LDGLVRAYDNISPVG FOL-015
159 GDPNGDISVVYGLR FOL-006 160 VDVPNGDISLAYRLR FOL-011
161 VDVPEGDISLAYRLR FOL-012
162 KX2LAX5X6X7X8IX10LSYGIK X2 é C, P ou G; X5 é E ou G; X6 é C, I ou está ausente; X7 é D, G ou está ausente; X8 é S, G ou está ausente; X10 é E ou G; 163 KX2LAX5IX10LSYGIK X2 é C, P ou G; X5 é E ou G; X10 é E ou G. 164 VDVPZ5GDISLAYZ13LR Z5 é E ou N; Z13 é R ou G. 165 VDTYDGZ7Z8SVVYGLR Z7 é D ou G; Z8 é I ou G. 166 GDPNZ5Z6Z7Z8Z9SVVYGLR Z5 é D ou G; Z6 é D ou G Z7 é I ou R; Z8 é G ou está ausente; Z9 é D ou está ausente. 167 VZ2TYDGDISVVYGLR Z2 é beta D FOL-005 (2betaAsp) 168 VDTY Z5GDISVVYGLR Z5 é beta D FOL-005 (5betaAsp) 169 VDTYDG Z7ISVVYGLR FOL-005 (7betaAsp) Z7 é beta D 170 LAEIDSIELSYGIK 171 AEIDSIELSYGIK FOL-056 172 EIDSIELSYGIK FOL-057 173 IDSIELSYGIK FOL-058 174 DSIELSYGIK FOL-059 175 SIELSYGIK FOL-060 176 IELSYGIK
177 X1LX2YGIK X1 é E ou G; X2 é S ou T; 178 Z1Z2SZ3Z4YGLR Z1 é D ou G; Z2 é I ou G; Z3 é V ou L; Z4 é V ou A. 179 KPLAEIDSIELSYGI 180 KPLAEIDSIELSYG 181 KPLAEIDSIELSY 182 KPLAEIDSIELS 183 KPLAEIDSIEL 184 KPLAEIDSIE
[0167] A invenção é adicionalmente ilustrada pelos dois exemplos a seguir que, no entanto, não devem ser interpretados como limitantes para a revelação. Esses exemplos demonstram o peptídeo exemplar da presente invenção e têm a capacidade de estimular a secreção de insulina a partir de células β de ratos e proteger as células β dos efeitos das condições glicotóxicas, mantendo sua capacidade de secretar insulina. Exemplo 18: FOL-056 induzir a secreção de insulina das células INS-1E
[0168] Para investigar o efeito estimulante do FOL-056 sobre a secreção de insulina, usamos células INS-1E. As células foram semeadas de um dia para o outro e foram lavadas com PBS antes da pré-incubação por 60 min a 37 °C em tampão de bicarbonato de Krebs-Ringer (KRB), em pH 7,4, suplementado com HEPES 10 mM e 0,1% de albumina sérica bovina. Após a pré-incubação, o tampão foi descartado e as células INS-1E foram incubadas em tampão KRB fresco suplementado com HEPES 10 mM, albumina sérica bovina 0,1% com ou sem o peptídeo FOL-056. Para fins comparativos, foram incluídas células tratadas com FOL-014. Após 60 min de incubação a 37 °C, o tampão foi removido e congelado para um ensaio subsequente de insulina. Os resultados demonstram que as células β estimuladas com o peptídeo FOL-056 secretam significativamente mais insulina em comparação com as células de controle não estimuladas (figura 13). Exemplo 19: FOL-056 preserva a capacidade de secretar insulina das células INS-1E durante as condições glicotóxicas de longo prazo
[0169] Para investigar o efeito protetor sobre as células β do FOL-056, submetemos as INS-1E a níveis citotóxicos de glicose por 72 horas. As células INS-1E de ratos foram semeadas em placas de 96 poços (2×103 células/poço) em meio cRPMI. Após 72 horas de incubação, os meios foram trocados para RPMI contendo 20 mM de glicose com ou sem FOL-056 ou FOL-014, e foram cultivados a 37 °C durante mais 72 horas para induzir a glicotoxicidade. RPMI contendo glicose 5 mM foi incluído como um controle de baixo teor de glicose. Após 72 horas, o meio foi removido e as células INS-1E foram equilibradas em tampão de bicarbonato de Krebs- Ringer (KREB), em pH 7,4 (suplementado com HEPES 10 mM, albumina sérica bovina 0,1% e glicose 2,8 mM) por 2 horas. Após o equilíbrio, o tampão foi alterado e as células INS- 1E foram incubadas em KREBs contendo glicose 16,7 mM suplementada durante 1 h. Imediatamente após a incubação, uma alíquota do tampão foi removida e congelada para ser usada posteriormente em um ensaio de teor de insulina.
[0170] Os resultados demonstram que a presença de FOL-056 durante as condições glicotóxicas preserva a função das células β, tal como é mostrado pela secreção de insulina induzida pela glicose retida. Exemplo 20. FOL-056 em combinação com GLP-1 aumenta a secreção de insulina em comparação com qualquer peptídeo isoladamente
[0171] A secreção de insulina das células INS-1 foi medida após a exposição ao FOL-056, GLP-1 ou uma combinação desses, expressa como a porcentagem de controle não tratado. O efeito combinado de GLP-1 e FOL-056 resultou em uma liberação significativamente maior de insulina do que GLP-1 ou FOL-056 isoladamente. Os experimentos foram realizados na presença de glicose 16,7 mM (Figura 15).
[0172] Os resultados demonstram que a combinação de GLP-1 e fragmentos dos peptídeos FOL potencializam ainda mais a secreção de insulina a partir das células INS-1 in vitro, em comparação com cada peptídeo, isoladamente. Exemplo 21. Novos análogos de peptídeos induzem a secreção de insulina nas linhagens de células pancreáticas
[0173] Novos análogos de peptídeos foram testados para investigar sua capacidade de induzir a secreção de insulina em uma linhagem de células INS-1 na presença de glicose 20 mM. A liraglutida, assim como um controle de alta (20 mM) e baixa (5 mM) concentração de glicose, foram incluídos em cada experimento (a concentração de peptídeos foi de 100 nM). Para corrigir a variância entre os experimentos, todos os valores foram normalizados e expressos como a porcentagem do valor médio do controle com alto teor de glicose nos experimentos individuais. Os análogos foram posteriormente classificados de acordo com o desempenho (figura 16).
[0174] Os resultados demonstram a capacidade dos novos análogos de peptídeo de melhorar a secreção de insulina a partir de células β INS-1 in vitro. Exemplo 22: Novos peptídeos derivados de FOL-005 e FOL- 014 preservam a capacidade de segregação da insulina das células INS-1 durante as condições glicotóxicas de longo prazo
[0175] Para investigar o efeito protetor das células β de vários fragmentos de peptídeos novos derivados de FOL-005 e FOL-014, as células INS-1 foram submetidas a níveis citotóxicos de glicose por 72 horas. As células INS- 1 de ratos foram semeadas em placas de 96 poços (2×103 células/poço) em meio cRPMI. Após 72 horas de incubação, os meios foram trocados para RPMI contendo glicose 20 mM com ou sem peptídeos, e as células foram cultivadas a 37 °C durante mais 72 horas para induzir a glicotoxicidade. As RPMI contendo glicose 5 mM foram incluídas como um controle baixo teor de glicose (não mostrado) e a liraglutida foi incluída para fins de comparação. Após 72 horas, o meio foi removido e as células INS-1 foram equilibradas em tampão de bicarbonato de Krebs-Ringer (KREB), em pH 7,4 (suplementado com HEPES 10 mM, albumina sérica bovina 0,1% e glicose 2,8 mM) por 2 horas. Após o equilíbrio, o tampão foi alterado e as células INS-1E foram incubadas em KREBs contendo glicose 16,7 mM suplementada durante 1 h. Imediatamente após a incubação, uma alíquota do tampão foi removida e congelada para ser usada posteriormente em um ensaio de teor de insulina. Para corrigir a variância entre os experimentos, todos os valores foram normalizados e expressos como a porcentagem do valor médio do controle com alto teor de glicose nos experimentos individuais. Os análogos foram posteriormente classificados de acordo com o desempenho (figura 17).
[0176] Os resultados demonstram que a presença de vários novos peptídeos durante as condições glicotóxicas preserva a função das células β, tal como é mostrado pela secreção de insulina induzida pela glicose retida. Exemplo 23: Estimulação da secreção de insulina a partir de células β pancreáticas humanas por peptídeos FOL-056
[0177] Para testar o efeito do FOL-014 e FOL-056 nas células humanas, a linhagem de células β pancreáticas humanas 1.2B4 foi cultivada a 37 °C e a 5% de CO2 em RPMI 1640 suplementado com soro bovino fetal 10%, penicilina 50 UI/ml, estreptomicina 50 mg/l e L-glutamina 1 mM. As células
1.2B4 foram semeadas em placas de 24 poços em meio RPMI e, após a incubação de um dia para o outro, os meios foram removidos antes da pré-incubação durante 40 min a 37 ºC em tampão de bicarbonato de Krebs-Ringer em pH 7.4, suplementado com HEPES 10 mM, albumina sérica bovina 0,1% e glicose 1,0 mM. Após a pré-incubação, o tampão foi trocado com tampão de Krebs-Ringer fresco, como descrito acima, e suplementado com concentrações específicas de glicose, de 1 mM ou 16,7 mM. FOL-014, FOL-056 ou liraglutida foi adicionado a uma concentração de 100 nM na presença de glicose 16,7 mM. Imediatamente após 60 minutos de incubação a 37 ºC, uma alíquota do tampão foi removida e congelada para ser usada em um ensaio posterior de insulina de ELISA. (Figura 18)
[0178] Os resultados demonstram que os peptídeos FOL-014 e FOL-056 aumentam a capacidade de secreção de insulina nas células humanas 1.2B4 na presença de glicose 16,7 mM. Exemplo 24: Estimulação da secreção de insulina a partir das ilhotas pancreáticas humanas pelos peptídeos FOL-056
[0179] Para investigar a funcionalidade do FOL- 056 no tecido primário humano, as ilhotas pancreáticas de dois doadores humanos não diabéticos foram usadas. As ilhotas foram coletadas, aliquotadas em grupos de 12 e incubadas a 37° C em 1 ml de tampão de bicarbonato de Krebs-Ringer, em pH 7,4, suplementado com HEPES 10 mM, albumina sérica bovina 0,1% e glicose 1,0 mM. Após a pré-incubação, o tampão foi trocado com tampão de Krebs-Ringer fresco, como descrito acima, e suplementado com concentrações específicas de glicose (1 mM ou 16,7 mM), peptídeos FOL-056 (1 nM) ou liraglutida (100 nM). Imediatamente após 60 minutos de incubação a 37 ºC, uma alíquota do tampão foi removida e congelada para ser usada em um ensaio posterior de insulina de ELISA. (Figura 19)
[0180] Os resultados demonstram que o FOL-056 potencializa a capacidade das ilhotas pancreáticas humanas primárias para secretar insulina como resposta aos altos níveis de glicose.
Exemplo 25 e 26: Dosagem de dieta de longo prazo induz os camundongos c57Bl6 obesos
[0181] Materiais e métodos: Para investigar os efeitos do FOL-056 in vivo em um modelo de dieta rica em gordura, os camundongos c57Bl6 selvagens foram dosados por via subcutânea 5 dias por semana com 300 nmol/kg de FOL-056, sendo alimentados com dieta rica em gordura por 12 semanas. Os animais de controle foram dosados com PBS. Exemplo 25: Dosagem de longo prazo com FOL-056 aumenta a resposta aguda à insulina in vivo
[0182] Em camundongos c57Bl6 obesos por indução de dieta, não tratados ou dosados com FOL-056, os níveis de insulina plasmática em jejum foram medidos antes, bem como 1 minuto após uma injeção de glicose intravenosa de 1 g/kg. O valor da insulina medido antes da injeção de glicose foi subtraído do valor medido após a injeção para cada camundongo individual, a fim de obter a resposta aguda à insulina (AIR). (Figura 20)
[0183] Os resultados demonstram que a resposta aguda à insulina (AIR) foi significativamente melhorada em camundongos tratados com FOL-056 em comparação com camundongos de controle não tratados. Exemplo 26: Redução de HbA1c em camundongos diabéticos após 4 semanas de dosagem
[0184] Para investigar o efeito de longo prazo do FOL-014 e FOL-056 em camundongos diabéticos, os camundongos db/db foram dosados com 100 nmol/kg de peptídeo por via subcutânea, 5 dias por semana, durante 4 semanas. Os camundongos de controle foram injetados com PBS. Após 4 semanas de tratamento, os camundongos foram cessados e 25 μl de sangue total foram imediatamente congelados para análise subsequente de HbA1c. (Figura 21).
[0185] Os resultados demonstram que 4 semanas de tratamento com FOL-014 e FOL-056 reduzem a HbA1c em camundongos db/db em comparação com o grupo de controle não tratado.
Claims (57)
1. Agente caracterizado pelo fato de que compreende um peptídeo ou análogo de peptídeo, em que o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos da fórmula geral: X1LX2YGIK (SEQ ID NO: 177) em que: X1 é E ou G; X2 é S ou T; com a condição de que se X2 é T, o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende no máximo 25 resíduos de aminoácidos; e com a condição de que se X1 é E X2 é S, o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende no máximo 85 resíduos de aminoácidos.
2. Agente, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente não compreende mais do que 85, assim como não mais do que 80, assim como não mais do que 75, assim como não mais do que 70, assim como não mais do que 65, assim como não mais do que 60, assim como não mais do que 55, assim como não mais do que 50, assim como não mais do que 55, assim como não mais do que 40 aminoácidos, assim como não mais do que 35, assim como não mais do que 30, assim como não mais do que 28, assim como não mais do que 26, assim como não mais do que 24, assim como não mais do que 22, assim como não mais do que 20, assim como não mais do que 19, assim como não mais do que 18, assim como não mais do que 17, assim como não mais do que 16, assim como não mais do que 15, assim como não mais do que 14, assim como não mais do que 13, assim como não mais do que 12, assim como não mais do que 11, assim como não mais do que 10 aminoácidos.
3. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que o agente compreende pelo menos 2 aminoácidos adicionais, assim como pelo menos 3, assim como pelo menos 4, assim como pelo menos 5, assim como pelo menos 6, assim como pelo menos 7, assim como pelo menos 8, assim como pelo menos 9, assim como pelo menos 10, assim como pelo menos 15 ou assim como pelo menos 20 aminoácidos conjugados ao terminal N ou C do peptídeo ou análogo de peptídeo.
4. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o agente é conjugado com uma porção.
5. Agente, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a porção é selecionada do grupo consistindo em polietilenoglicol (PEG), monossacarídeos, fluoróforos, cromóforos, compostos radioativos e peptídeos de penetração celular.
6. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o agente é adicionalmente modificado, assim como por glicosilação, PEGuilação, amidação, esterificação, acilação, acetilação e/ou alquilação.
7. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o agente compreende ou consiste em repetições em tandem.
8. Agente, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as repetições em tandem compreendem ou consistem na sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma ou mais das sequências, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
9. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o agente é fundido com outro polipeptídeo.
10. Agente, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo é selecionado do grupo consistindo em glutationa-S-transferase (GST) e proteína A.
11. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o agente é fundido a um marcador.
12. Agente, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o dito marcador é um marcador de oligo-histidina.
13. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o agente é cíclico.
14. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o peptídeo ou análogo de peptídeo é capaz de formar pelo menos uma ponte de cisteína intramolecular.
15. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o agente compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em LAEIDSIELSYGIK (SEQ ID
NO: 170), AEIDSIELSYGIK (SEQ ID NO: 171), EIDSIELSYGIK (SEQ ID NO: 172), IDSIELSYGIK (SEQ ID NO: 173), DSIELSYGIK (SEQ ID NO: 174), SIELSYGIK (SEQ ID NO: 175), IELSYGIK (SEQ ID NO: 148) e KPLAEIDSIELTYGIK (SEQ ID NO: 176).
16. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o agente compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em KPLAEIDSIELSYGI (SEQ ID NO: 179), KPLAEIDSIELSYG (SEQ ID NO: 180), KPLAEIDSIELSY (SEQ ID NO: 181), KPLAEIDSIELS (SEQ ID NO: 182), KPLAEIDSIEL (SEQ ID NO: 183) e KPLAEIDSIE (SEQ ID NO: 184).
17. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o agente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos LAEIDSIELSYGIK (SEQ ID NO: 170).
18. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o agente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos AEIDSIELSYGIK (SEQ ID NO: 171).
19. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o agente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos EIDSIELSYGIK (SEQ ID NO: 172).
20. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o agente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos IDSIELSYGIK (SEQ ID NO: 173).
21. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o agente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos DSIELSYGIK (SEQ ID NO: 174).
22. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o agente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SIELSYGIK (SEQ ID NO: 175).
23. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que o agente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos IELSYGIK (SEQ ID NO: 176).
24. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que o um ou mais aminoácidos são conservadoramente substituídos.
25. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende ou consiste em um ou mais aminoácidos adicionais, inseridos no terminal N e/ou C e/ou internamente dentro da sequência.
26. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o peptídeo ou análogo de peptídeo compreende um resíduo de aminoácido P no terminal N.
27. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que o peptídeo ou análogo de peptídeo tem 1 aminoácido adicional.
28. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que o agente compreende adicionalmente uma porção detectável.
29. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que a porção detectável compreende ou consiste em um radioisótopo.
30. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que o radioisótopo é selecionado do grupo consistindo em 99mTc, 111In, 67Ga, 68Ga, 72As,89Zr, 123I e 201Tl.
31. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que a porção detectável é detectável por uma técnica de imagem, como imagem por SPECT, PET, ressonância magnética, óptica ou ultrassom.
32. Uso do agente conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma composição diagnóstica para o diagnóstico de uma doença, distúrbio ou dano do pâncreas em um indivíduo.
33. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato que codifica, na expressão, um peptídeo ou análogo de peptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 32.
34. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 33.
35. Célula caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo conforme definido n reivindicação 33 ou um vetor, conforme definido na reivindicação 34.
36. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um agente conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 32, um polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 33, um vetor conforme definido na reivindicação 34 ou uma célula conforme definida na reivindicação 35.
37. Composição, de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que a composição é uma composição farmacêutica.
38. Agente caracterizado pelo fato de que compreende um peptídeo ou análogo de peptídeo compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos DTYDGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 4), TYDGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 8), YDGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 13), DGDISVVYGLR (SEQ ID NO: 19), GDISVVYGLR (SEQ ID NO: 26) e DISVVYGLR (SEQ ID NO: 34).
39. Agente, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 32 ou 38, polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 33, vetor conforme definido na reivindicação 34, célula conforme definida na reivindicação 35 ou composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 36 a 37, caracterizado pelo fato de ser para uso como um medicamento.
40. Agente caracterizado pelo fato de que compreende: a) um peptídeo ou um análogo de peptídeo selecionado do grupo consistindo em: (i) um peptídeo que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos da fórmula geral: X1LX2YGIK (SEQ ID NO: 177) em que: X1 é E ou G; X2 é S ou T; com a condição de que se X2 é T, o peptídeo compreende no máximo 25 resíduos de aminoácidos;
(ii) um peptídeo que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos da fórmula geral: Z1Z2SZ3Z4YGLR (SEQ ID NO: 178) em que: Z1 é D ou G; Z2 é I ou G; Z3 é V ou L; Z4 é V ou A; e (iii) um peptídeo que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste na VDTYDGDISVVYGL (SEQ ID NO: 3) VDTYDGDISVVYG (SEQ ID NO: 6), VDTYDGDISVVY (SEQ ID NO: 10), VDTYDGDISVV (SEQ ID NO: 15), VDTYDGDISV (SEQ ID NO: 21) e VDTYDGDIS (SEQ ID NO: 28); b) um polinucleotídeo que codifica, na expressão, o peptídeo de a); c) um vetor que compreende o polinucleotídeo de b); ou d) uma célula que compreende o polinucleotídeo de b), ou o vetor de c); para uso no tratamento de uma doença endócrina, uma doença nutricional e/ou uma doença metabólica em um mamífero.
41. Agente ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizado pelo fato de que o dito agente compreende um segundo ou outro ingrediente ativo.
42. Agente ou composição para uso, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o segundo ou o outro ingrediente ativo é selecionado do grupo consistindo em insulina, peptídeo semelhante a glucagon 1
(GLP-1), sulfonilureia, um inibidor da dipeptidil peptidase- 4 (DPP4), um inibidor da alfa-glicosidase, uma tiazolidinodiona, uma meglitidina e um inibidor do cotransportador de sódio-glicose 2 (SGLT2).
43. Agente ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 42, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de uma doença endócrina, uma doença nutricional e/ou uma doença metabólica em um mamífero.
44. Agente ou composição para uso, de acordo com a reivindicação Error! Reference source not found., caracterizado pelo fato de que o mamífero é um ser humano.
45. Agente ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 45, caracterizado pelo fato de que a doença endócrina, a doença nutricional e/ou a doença metabólica é selecionada do grupo consistindo em diabetes mellitus, diabetes mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2, diabetes mellitus relacionado à desnutrição, distúrbios da regulação da glicose e secreção interna pancreática, síndrome da resistência à insulina, tolerância à glicose prejudicada, hiperglicemia, hiperinsulinemia e quaisquer combinações das mesmas.
46. Agente ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 45, caracterizado pelo fato de que o diabetes mellitus é selecionado do grupo consistindo em diabetes mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2, diabetes mellitus relacionado à desnutrição, diabetes mellitus especificado e diabetes mellitus não especificado.
47. Método de tratamento de uma doença endócrina, uma doença nutricional e/ou uma doença metabólica caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar um agente conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 46 a um indivíduo em necessidade do mesmo.
48. Uso de um agente, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 47, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para uso no tratamento de uma doença endócrina, uma doença nutricional e/ou uma doença metabólica em um mamífero.
49. Método para retardar o surgimento do diabetes e/ou de distúrbios e doenças associados com o diabetes caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 48, a um indivíduo em necessidade do mesmo.
50. Método para diminuir os níveis de glicemia caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 49, a um indivíduo em necessidade do mesmo.
51. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a secreção de insulina é aumentada.
52. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a absorção celular da glicose é aumentada.
53. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a produção de insulina é aumentada.
54. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a produção de glucagon é diminuída.
55. Método para melhorar a viabilidade das células beta, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 54, a um indivíduo em necessidade do mesmo.
56. Método para melhorar a morfologia das células beta, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 55 a um indivíduo em necessidade do mesmo.
57. Método para estabilizar ou melhorar a viabilidade e/ou a morfologia das ilhotas pancreáticas, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 56, a um indivíduo em necessidade do mesmo.
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