BR112021006607A2 - métodos para tratar inflamação - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA TRATAR INFLAMAÇÃO. A presente invenção é direcionada a sítios de ligação ao antígeno de depleção que se ligam a CXCR3 e um método de usar esses sítios de ligação ao antígeno para tratar condições inflamatórias e autoimunes, em particular, doença hepática gordurosa, o acúmulo de depósitos de lipídios no fígado, esteatohepatite, rejeição a enxerto e condições associadas a células T efetoras e/ou de memória.

Description

MÉTODOS PARA TRATAR INFLAMAÇÃO Campo da invenção

[001] A invenção se refere a métodos e composições para tratar ou prevenir condições associadas à expressão de CXCR3, em particular esteatohepatite não alcoólica (NASH). Aplicação associada

[002] Este pedido reivindica prioridade ao pedido provisório australiano AU 2018903814, cujo conteúdo e invenção é incorporado na presente invenção por referência em sua totalidade. Antecedentes da invenção

[003] Quimiocinas ou citocinas quimioatraentes compreendem uma família de moléculas secretadas induzíveis de pequeno peso molecular (~8-10 KDa) que tipicamente funcionam como ativadores e quimioatraentes para leucócitos e podem modular a angiogênese, cicatrização de feridas e tumorigênese. A maior parte do conhecimento das funções das quimiocinas é derivada da pesquisa sobre o sistema imunológico devido às suas implicações na regulação da coordenação imunológica e inflamação. Os papéis que envolvem muitos outros sistemas biológicos estão sendo lentamente elucidados.

[004] As quimiocinas são tipicamente classificadas em quatro subfamílias de acordo com o número de resíduos de cisteína conservados em seu amino terminal. A maioria das quimiocinas se enquadra em duas subfamílias principais com quatro resíduos de cisteína. Estas subfamílias são tipicamente classificadas de acordo com a presença ou ausência de um aminoácido entre os dois resíduos de cisteína do amino terminal e são, portanto, denominadas quimiocinas CC e CXC. As quimiocinas CXC, que são tipicamente restritas a vertebrados superiores, são geralmente adicionalmente classificadas de acordo com a presença ou ausência de um motivo glutamato-lisina-arginina (ELR) em seu amino terminal adjacente ao primeiro resíduo de cisteína.

[005] Receptores de quimiocina, como CXCR3, são receptores acoplados à proteína G (GPCRs) tipicamente ligados a proteínas Gi sensíveis à toxina pertussis (PTX). Pensa-se que o domínio do N-terminal do CXCR é importante para determinar a especificidade de ligação ao ligante.

[006] CXCR3 também é conhecido como um receptor 9 acoplado à proteína G (GPR9), CD182, CD183, CKR-L2, CMKAR3, GPR9, IP10-R, Mig-R, MigR e receptor de quimiocina 3 do motivo C-X-C e é uma proteína transmembrana sete de 38 kDa. CXCR3 é expresso primariamente em linfócitos T ativados e células NK, e algumas células epiteliais. CXCR3 é expresso preferencialmente em células Th1 (enquanto as células Th2 favorecem a expressão de CCR3 e CCR4). Os ligantes de CXCR3 que atraem células Th1 podem bloquear concomitantemente a migração de células Th2 em resposta aos ligantes de CCR3, aumentando assim a polarização do recrutamento de células T efetoras. CXCR3 é capaz de regular o tráfego de leucócitos. A ligação de quimiocinas a CXCR3 induz várias respostas celulares, mais notavelmente a ativação da integrina, alterações do citoesqueleto e migração quimiotática. A interação dCXCR3-ligante atrai células Th1 e promove a maturação de células Th1.

[007] CXCR3 é expresso em células T efetoras/de memória em cultura in vitro, e em células T presentes em muitos tipos de tecidos inflamados. Além disso, CXCL9, CXCL10 e CXCL11 são comumente produzidos por células locais em lesões inflamatórias, sugerindo que CXCR3 e suas quimiocinas participam do recrutamento de células inflamatórias. CXCR3 tem sido implicado em câncer, cicatrização de feridas, respostas a doenças infecciosas e transplante de tecidos e doenças autoimunes, incluindo: aterosclerose, esclerose múltipla, fibrose pulmonar, diabetes tipo 1, myasthenia gravis autoimune, nefrite nefrotóxica, rejeição aguda de aloenxerto cardíaco e Doença Celíaca.

[008] Existe uma necessidade de métodos novos e/ou aprimorados para tratar doenças associadas à ativação de CXCR3.

[009] A referência a qualquer anterioridade no relatório descritivo não é um reconhecimento ou sugestão que esta anterioridade forme parte do conhecimento geral comum em qualquer jurisdição ou que se possa razoavelmente esperar que esta anterioridade seja entendida, considerada relevante e/ou combinada com outras partes de anterioridades por um técnico no assunto. Sumário da invenção

[010] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para tratar uma condição associada com células T efetoras e/ou de memória em um indivíduo, o método compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em administrar ao indivíduo um sítio de ligação ao antígeno de depleção que se liga a CXCR3, tratando assim uma condição associada a células T efetoras e/ou de memória no indivíduo.

[011] Em outro aspecto, a presente invenção também fornece um método para tratar a doença hepática gordurosa em um indivíduo, o método compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em administrar ao indivíduo um sítio de ligação ao antígeno de depleção que se liga a CXCR3, tratando assim a doença hepática gordurosa no indivíduo.

[012] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método para prevenir ou retardar o início da doença hepática gordurosa em um indivíduo, o método compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em administrar ao indivíduo um sítio de ligação ao antígeno de depleção que se liga a CXCR3, prevenindo ou retardando, assim, o início da doença hepática gordurosa no indivíduo.

[013] A doença hepática gordurosa pode ser associada, causada ou resultado do alcoolismo. Alternativamente, a doença hepática gordurosa pode ser associada, causada por ou resultado de uma causa dietética não alcoólica (doença hepática gordurosa não alcoólica, NAFLD). A NAFLD pode ser esteatose simples ou pode ser esteatose simples incluindo um ou mais sinais de inflamação e fibrose.

[014] A doença hepática gordurosa pode ser caracterizada por esteatose hepática, triglicerídeos circulantes ou hepáticos elevados e/ou níveis elevados de colesterol circulante ou hepático.

[015] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método para tratar esteatohepatite não alcoólica (NASH) em um indivíduo, o método compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em um sítio de ligação ao antígeno de depleção que se liga a CXCR3, tratando, assim, NASH no indivíduo.

[016] Em outro aspecto, a presente invenção também fornece um método para prevenir ou retardar o início da esteatohepatite não alcoólica (NASH) em um indivíduo, o método compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em um sítio de ligação ao antígeno de depleção que se liga a CXCR3, desse modo prevenindo ou atrasando o início de NASH.

[017] Em outro aspecto, a invenção também fornece um método para reduzir ou tratar inflamação em um indivíduo em risco de, ou tendo uma doença autoimune, o método compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em um sítio de ligação ao antígeno de depleção que se liga a CXCR3, desse modo reduzindo ou tratando a inflamação no indivíduo.

[018] Reduzir ou tratar inflamação pode incluir reduzir a proporção de uma ou mais citocinas pró-inflamatórias no paciente. Além disso, reduzir ou tratar inflamação pode incluir aumentar a proporção de uma ou mais citocinas anti- inflamatórias no indivíduo.

[019] Em um aspecto, a invenção fornece um método para inibir o recrutamento ou migração de células de CXCR3+ a um sítio de inflamação em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um sítio de ligação ao antígeno de depleção que se liga a CXCR3, dessa forma inibindo o recrutamento ou migração de células CXCR3+ a um sítio de inflamação no indivíduo.

[020] Em qualquer aspecto da presente invenção, o sítio de ligação ao antígeno que se liga a CXCR3 é um anticorpo de depleção. O anticorpo de depleção tem a capacidade de causar ou mediar uma redução na atividade ou viabilidade de uma célula que expressa CXCR3. Tipicamente, o anticorpo de depleção tem a capacidade de induzir citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC).

[021] O sítio de ligação ao antígeno pode ter sido modificado para fornecer a capacidade de depletar uma célula ou pode ter sido modificado para aumentar a capacidade existente do sítio de ligação ao antígeno para depletar uma célula.

[022] Em algumas modalidades, as células são células T CXCR3+/CD4+, células T CXCR3+/CD8+ e/ou células B CXCR3+/CD19+. Em modalidades adicionais, o indivíduo recebeu, está recebendo ou vai receber um enxerto ou transplante.

[023] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir o acúmulo de depósitos de lipídios no fígado de um indivíduo, o método compreendendo administrar um sítio de ligação ao antígeno de depleção que se liga a CXCR3 ao indivíduo, desse modo tratando ou prevenindo o acúmulo de depósitos de lipídios no fígado de um indivíduo.

[024] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para tratar ou prevenir doença hepática gordurosa em um indivíduo, o método compreendendo administrar um sítio de ligação do antígeno de depleção que se liga a CXCR3 ao indivíduo, desse modo tratando ou prevenindo a doença hepática gordurosa no indivíduo. A doença hepática gordurosa pode ser doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFDL) ou causada por ou é o resultado de alcoolismo.

[025] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para tratar ou prevenir esteatohepatite em um indivíduo, o método compreendendo administrar um sítio de ligação ao antígeno de depleção que se liga a CXCR3 ao indivíduo, desse modo tratando ou prevenindo a esteatohepatite. A esteatohepatite pode ser esteatohepatite alcoólica (ASH) ou esteatohepatite não alcoólica (NASH). Preferencialmente, a esteatohepatite é NASH.

[026] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para inibir a rejeição de enxerto ou transplante em um indivíduo que recebeu, está recebendo ou deverá receber um enxerto ou transplante, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um sítio de ligação ao antígeno de depleção que se liga a CXCR3, inibindo assim a rejeição do enxerto ou transplante no indivíduo.

[027] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, o enxerto é um aloenxerto ou xenoenxerto, ou o transplante é um alotransplante ou xenotransplante. Em exemplos particulares, o enxerto ou transplante é selecionado dentre coração, rim, pulmão, fígado, pâncreas, ilhotas pancreáticas, tecido cerebral, estômago, intestino grosso, intestino delgado, córnea, pele, traqueia, osso, medula óssea, músculo e enxerto ou transplante de bexiga. Em alguns casos, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é administrado ao indivíduo antes, ao mesmo tempo e/ou após o indivíduo ter recebido o enxerto ou transplante.

[028] Em uma modalidade dos métodos da invenção, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é administrado ao indivíduo duas ou mais vezes. Em alguns exemplos, os métodos compreendem adicionalmente administrar ao indivíduo um ou mais outros agentes terapêuticos, como uma citocina (por exemplo, interleucina 2), quimiocina ou anticorpo. Em modalidades particulares, o agente terapêutico é um agente imunossupressor, por exemplo, um glicocorticóide, ciclosporina, rapamicina, voclosporina, sirolimo, everolimo. tacrolimo, micofenolato, mofetila, ácido micofenólico, mizoribina, um agonista S1P-R, uma malononitrilamida, um anticorpo anti-CD3, um anticorpo anti-CD25, um anticorpo anti-CD52, um anticorpo anti-CD20 ou um anticorpo anti-fator de necrose tumoral.

[029] Também são fornecidos os usos de um sítio de ligação ao antígeno de depleção que se liga a CXCR3 para a preparação de um medicamento para depletar células CXC3+; inibir o recrutamento ou migração de células CXCR3+ para um sítio de inflamação; e/ou a preparação de um medicamento para inibir a rejeição de enxerto em um indivíduo que recebeu, está recebendo ou deverá receber um enxerto.

[030] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para tratar fibrose em um indivíduo, o método compreendendo administrar um sítio de ligação ao antígeno conforme descrito na presente invenção ao indivíduo, desse modo tratando a fibrose.

[031] Em qualquer aspecto da presente invenção, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao ou se liga especificamente a CXCR3 e inibe a atividade de CXCR3.

[032] Preferencialmente, o sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo, o domínio de ligação ao antígeno se liga a ou se liga especificamente a CXCR3 e inibe a atividade de CXCR3.

[033] A atividade de CXCR3 que pode ser inibida por qualquer sítio de ligação ao antígeno da invenção inclui: ligação do ligante a CXCR3; mudança conformacional induzida por ligante de CXCR3; ativação de CXCR3; ativação de proteína G; sinalização celular mediada por CXCR3; um crescimento tumoral imflamatório, migratório, mediado por células CXCR3, resposta angiogênica ou metastática in vitro ou in vivo; crescimento de células tumorais mediado por CXCR3; e/ou recrutamento mediado por CXCR3 de células inflamatórias, migração de leucócitos (por exemplo, neutrófilos, eosinófilos, mastócitos ou células T), ativação de integrina, migração quimiotática e maturação de células Th1.

[034] Preferencialmente, o sítio de ligação ao antígeno, conforme descrito na presente invenção, liga-se ou liga-se especificamente a CXCR3 humano. Preferencialmente, o sítio de ligação ao antígeno se liga a ou se liga especificamente a uma molécula CXCR3 humana compreendendo, consistindo essencialmente de ou consistindo em uma sequência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 7

[035] Preferencialmente, o sítio de ligação ao antígeno inibe ou reduz a atividade CXCR3 induzida por um ou mais ligantes selecionados a partir do grupo que consiste em CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP10) e CXCL11 (I-TAC). Por exemplo, o sítio de ligação ao antígeno pode inibir a migração de uma célula, preferencialmente uma célula imune, estimulada por um ligante CXCR3. A redução ou inibição da atividade de CXCR3 pode ser determinada por qualquer método descrito na presente invenção, particularmente o Exemplo 4.

[036] Um sítio de ligação ao antígeno, conforme descrito na presente invenção, pode se ligar a CXCR3 e não se ligar a ou se ligar significativamente a CXCR1, CXCR2 e/ou C5aR de maneira detectável. A ligação de um sítio de ligação ao antígeno a CXCR1, CXCR2 e/ou C5aR pode ser determinada por qualquer método descrito na presente invenção, particularmente citometria de fluxo,

conforme descrito no Exemplo 2.

[037] Um sítio de ligação ao antígeno, conforme descrito na presente invenção, pode se ligar a CXCR3 e exibir um EC50 de menos de 2 nM, menos de 1 nM ou menos de 0,5 nM. Preferencialmente o EC50 do sítio de ligação ao antígeno é aproximadamente 0,2 nM ou menos. Preferencialmente, o EC50 é determinado usando uma citometria de fluxo ou ensaio ELISA conforme descrito na presente invenção, particularmente o Exemplo 2.

[038] Um sítio de ligação ao antígeno, conforme descrito na presente invenção, pode exibir um IC50 em um ensaio de ligação de competição com MIG, ITAC e/ou IP10 inferior a cerca de 20, 15, 12, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 nM.

[039] Um sítio de ligação ao antígeno, conforme descrito na presente invenção, pode inibir a migração de uma célula imune que expressa CXCR3 em concentrações de 10 µg/mL, 1 µg/mL ou menos. Preferencialmente, o ensaio de migração é realizado por qualquer método conforme descrito na presente invenção, particularmente o Exemplo 4.

[040] Um sítio de ligação ao antígeno, conforme descrito na presente invenção, pode se ligar ao primeiro e/ou segundo loop de N-terminal em CXCR3. Por exemplo, o sítio de ligação ao antígeno pode ligar-se a CXCR3 dentro dos resíduos 1 a 23 da proteína CXCR3 (numeração de acordo com CXCR3 humano). Preferencialmente, o sítio de ligação ao antígeno da invenção se liga a um peptídeo compreendendo a sequência: MVLEVSDHQVLNDAEVAALLENF (SEQ ID NO: 8), ou um fragmento do mesmo. Preferencialmente, o sítio de ligação ao antígeno da invenção não se liga a uma sequência de CXCR3 que é C-terminal para resíduo 23. Alternativamente, o sítio de ligação ao antígeno pode se ligar a CXCR3 dentro dos resíduos 23 a 44 da proteína CXCR3 (numeração de acordo com CXCR3 humano). Preferencialmente, o sítio de ligação ao antígeno da invenção se liga a um peptídeo compreendendo a sequência:

FSSSYDYGENESDSCCTSPPCP (SEQ ID NO: 10), ou um fragmento do mesmo.

[041] A presente invenção também fornece um sítio de ligação ao antígeno que se liga a uma região N-terminal de CXCR3 e inibe a ligação de CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP10) e/ou CXCL11 (I-TAC) a, ou de CXCL9 (MIG), Atividade mediada por CXCL10 (IP10) e/ou CXCL11 (I-TAC) de, CXCR3. Preferencialmente, a região N- terminal compreende, consiste essencialmente de ou consiste dos resíduos 1 a 23 (numeração de acordo com CXCR3 humano). Preferencialmente, a atividade mediada por CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP10) e/ou CXCL11 (I-TAC) é a quimiotaxia mediada por CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP10) e/ou CXCL11 (I-TAC) de uma célula imune (por exemplo, neutrófilos).

[042] Como descrito na presente invenção, o sítio de ligação ao antígeno pode estar na forma de: (i) um fragmento Fv de cadeia simples (scFv); (ii) um scFv dimérico (di-scFv); (iii) um dentre (i) ou (ii) ligado a uma região constante de um anticorpo, Fc ou um domínio constante de cadeia pesada (CH) 2 e/ou CH3; ou (iv) um dentre (i) ou (ii) ligado a uma proteína que se liga a uma célula efetora imune.

[043] Adicionalmente, conforme descrito na presente invenção, o sítio de ligação ao antígeno pode estar na forma de: (i) um diacorpo; (ii) um triacorpo; (iii) um tetracorpo; (iv) um Fab; (v) um F(ab')2; (vi) um Fv; (vii) um dentre (i) a (vi) ligado a uma região constante de um anticorpo, Fc ou um domínio constante de cadeia pesada (CH)2 e/ou CH3; ou (viii) um dentre (i) a (vi) ligado a uma proteína que se liga a uma célula efetora imune.

[044] Os sítios de ligação ao antígeno anteriores também podem ser referidos como domínios de ligação ao antígeno de anticorpos.

[045] Preferencialmente, um sítio de ligação ao antígeno, conforme descrito na presente invenção, é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Tipicamente, o sítio de ligação ao antígeno é um anticorpo, por exemplo, um anticorpo monoclonal.

[046] Conforme usado na presente invenção, o sítio de ligação ao antígeno pode ser um domínio variável.

[047] Em qualquer aspecto ou modalidade, o anticorpo é um anticorpo nu. Especificamente, o anticorpo está em uma forma não conjugada e não está adaptado para formar um conjugado.

[048] A referência na presente invenção a uma proteína ou anticorpo que “se liga a” CXCR3 fornece suporte literal para uma proteína ou anticorpo que “se liga especificamente a” ou “se liga especificamente a” CXCR3.

[049] A presente invenção também fornece domínios de ligação ao antígeno ou fragmentos de ligação ao antígeno dos anticorpos anteriores.

[050] A invenção também fornece uma proteína de fusão compreendendo um sítio de ligação ao antígeno, domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, dab (anticorpo de domínio único), di-scFv, scFv, Fab, Fab’, F(ab’)2, fragmento de Fv, diacorpo, triacorpo, tetracorpo, anticorpo linear, molécula de anticorpo de cadeia simples ou anticorpo multiespecífico conforme descrito na presente invenção.

[051] A invenção também fornece um conjugado na forma de um sítio de ligação ao antígeno, domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, dab, di-scFv,

scFv, Fab, Fab’, F(ab’)2, fragmento de Fv, diacorpo, triacorpo, tetracorpo, anticorpo linear, molécula de anticorpo de cadeia simples ou anticorpo multiespecífico ou proteína de fusão, conforme descrito na presente invenção, conjugado a um marcador ou agente citotóxico.

[052] A invenção também fornece um anticorpo para ligação a um sítio de ligação ao antígeno, domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, dab, di-scFv, scFv, Fab, Fab’, F(ab’)2, fragmento de Fv, diacorpo, triacorpo, tetracorpo, anticorpo linear, molécula de anticorpo de cadeia simples ou anticorpo multiespecífico, proteína de fusão ou conjugado conforme descrito na presente invenção.

[053] A invenção também fornece um ácido nucleico que codifica um sítio de ligação ao antígeno, domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, dab, di- scFv, scFv, Fab, Fab’, F(ab’)2, fragmento de Fv, diacorpo, triacorpo, tetracorpo, anticorpo linear, molécula de anticorpo de cadeia simples ou anticorpo multiespecífico, proteína de fusão ou conjugado conforme descrito na presente invenção.

[054] Em um exemplo, tal ácido nucleico é incluído em um construto de expressão em que o ácido nucleico está operacionalmente ligado a um promotor. Tal construto de expressão pode estar em um vetor, por exemplo, um plasmídeo.

[055] Em exemplos da invenção direcionados a sítios de ligação de antígeno de cadeia polipeptídica simples, o construto de expressão pode compreender um promotor ligado a um ácido nucleico que codifica essa cadeia polipeptídica.

[056] Em exemplos direcionados a múltiplas cadeias polipeptídicas que formam um sítio de ligação ao antígeno, um construto de expressão compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo, por exemplo, um VH operacionalmente ligado a um promotor e um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo, por exemplo, um VL operacionalmente ligado a um promotor.

[057] Em outro exemplo, o construto de expressão é um construto de expressão bicistrônica, por exemplo, compreendendo os seguintes componentes operacionalmente ligados na ordem de 5’ para 3’: (i) um promotor (ii) um ácido nucleico que codifica um primeiro polipeptídeo; (iii) um sítio interno de entrada do ribossomo; e (iv) um ácido nucleico que codifica um segundo polipeptídeo, em que o primeiro polipeptídeo compreende um VH e o segundo polipeptídeo compreende um VL, ou vice-versa.

[058] A presente invenção também contempla construtos de expressão separados, um dos quais codifica um primeiro polipeptídeo compreendendo um VH e outro dos quais codifica um segundo polipeptídeo compreendendo um VL. Por exemplo, a presente invenção também fornece uma composição compreendendo: (i) um primeiro construto de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um VH operacionalmente ligado a um promotor; e (ii) um segundo construto de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um VL operacionalmente ligado a um promotor.

[059] A invenção fornece uma célula compreendendo um vetor ou ácido nucleico descrito na presente invenção. Preferencialmente, a célula é isolada, substancialmente purificada ou recombinante. Em um exemplo, a célula compreende o construto de expressão da invenção ou: (i) um primeiro construto de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um VH operacionalmente ligado a um promotor; e (ii) um segundo construto de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um VL operacionalmente ligado a um promotor, em que o primeiro e o segundo polipeptídeos se associam para formar um sítio de ligação ao antígeno, conforme descrito na presente invenção.

[060] Exemplos de células da presente invenção incluem células bacterianas, células de levedura, células de inseto ou células de mamífero.

[061] A invenção também fornece uma composição farmacêutica compreendendo um sítio de ligação ao antígeno, ou compreendendo uma sequência de CDR e/ou FR conforme descrita na presente invenção, ou um domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, dab (anticorpo de domínio único), di-scFv, scFv, Fab, Fab’, F(ab’)2, fragmento de Fv, diacorpo, triacorpo, tetracorpo, anticorpo linear, molécula de anticorpo de cadeia simples ou anticorpo multiespecífico, proteína de fusão ou conjugado conforme descrito na presente invenção e um carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[062] A invenção também fornece uma composição de diagnóstico compreendendo um sítio de ligação ao antígeno, ou compreendendo uma sequência CDR e/ou FR conforme descrita na presente invenção, ou sítio de ligação ao antígeno, domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, dab, di-scFv, scFv, Fab, Fab’, F(ab’)2, fragmento de Fv, diacorpo, triacorpo, tetracorpo, anticorpo linear, molécula de anticorpo de cadeia simples ou anticorpo multiespecífico, proteína de fusão ou conjugado conforme descrito na presente invenção, um diluente e opcionalmente um marcador.

[063] A invenção também fornece um kit ou artigo de fabricação compreendendo um sítio de ligação ao antígeno, ou compreendendo uma sequência de CDR e/ou FR conforme descrita na presente invenção ou um domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, dab, di-scFv, scFv, Fab, Fab’, F(ab’)2, fragmento de Fv, diacorpo, triacorpo, tetracorpo, anticorpo linear, molécula de anticorpo de cadeia simples ou anticorpo multiespecífico, proteína de fusão ou conjugado conforme descrito na presente invenção.

[064] Um sítio de ligação ao antígeno, uma proteína ou anticorpo conforme descrito na presente invenção pode compreender uma região constante humana, por exemplo, uma região constante de IgG, tal como uma IgG1, IgG2 ou IgG3 ou suas misturas. No caso de um anticorpo ou proteína compreendendo um VH e um VL, o VH pode ser ligado a uma região constante da cadeia pesada e o VL pode ser ligado a uma região constante da cadeia leve.

[065] Em qualquer aspecto da presente invenção, o sítio de ligação ao antígeno compreende uma região Fc que é modificada para ter capacidade aumentada para induzir citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC). Preferencialmente, a capacidade aumentada para induzir ADCC é conferida por mutação, deleção ou modificação de aminoácidos na região Fc que interagem com um receptor de Fc. Preferencialmente, os aminoácidos que são mutados, deletados ou modificados estão na posição 239, 330 e/ou 332 de acordo com a SEQ ID NO: 1 (onde a alanina está na posição 118) ou em uma posição equivalente a 239, 330 e/ou 332. Preferencialmente, os aminoácidos são mutados para S239D, A330L e I332E. Tipicamente, o Fc compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3

[066] Em qualquer aspecto da presente invenção, o sítio de ligação ao antígeno compreende uma região Fc que não é modificada para ter uma capacidade reduzida de induzir citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC). Preferencialmente, existem os aminoácidos na posição 234, 235 e/ou 331 de acordo com a SEQ ID NO: 1 (onde alanina é a posição 118) ou em uma posição equivalente a 234, 235 e/ou 331 não são F, E e/ou S, respectivamente. Em outras palavras, o aminoácido na posição 234 não é F, na posição 235 não é E e/ou na 331 não é S.

[067] Em qualquer aspecto da presente invenção, o sítio de ligação ao antígeno não compreende uma região Fc compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma sequência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO: 2.

[068] As características funcionais de um sítio de ligação ao antígeno, conforme descrito na presente invenção, serão consideradas como aplicáveis mutatis mutandis a um anticorpo da invenção.

[069] Um sítio de ligação ao antígeno, conforme descrito na presente invenção, pode ser purificado, substancialmente purificado, isolado e/ou recombinante.

[070] Um sítio de ligação ao antígeno, conforme descrito na presente invenção, pode ser parte de um sobrenadante retirado do meio no qual um hibridoma que expressa um sítio de ligação ao antígeno, conforme descrito na presente invenção, foi cultivado.

[071] Em outro aspecto, a presente invenção também fornece um método para depleção de células CXCR3+ em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um sítio de ligação ao antígeno, conforme descrito na presente invenção.

[072] A invenção também fornece uma célula compreendendo um vetor ou molécula de ácido nucleico descrito na presente invenção.

[073] A invenção também fornece um animal ou tecido derivado do mesmo compreendendo uma célula descrita na presente invenção.

[074] Conforme usado na presente invenção, exceto onde o contexto exigir de outra forma, o termo “compreende” e variações do termo, tais como “compreendendo”, “compreende” e “compreendido”, não se destinam a excluir outros aditivos, componentes, números inteiros ou etapas.

[075] Aspectos adicionais da presente invenção e modalidades adicionais dos aspectos descritos nos parágrafos anteriores se tornarão aparentes a partir da seguinte descrição, dada a título de exemplo e com referência aos desenhos anexos. Breve descrição dos desenhos

[076] Figura 1 Efeito de longa duração da depleção de CXCR3 após uma única injeção IV. Um anticorpo anti-CXCR3 de depleção foi injetado em camundongos. As células CD4, CD8 e B foram quantificadas aos 24 e 36 dias, pós- injeção. Os resultados indicam que a depleção de células usando um anticorpo anti-CXCR3 de depleção é de longa duração.

[077] Figura 2 A depleção de Anti-CXCR3 não afeta muito os números de Treg (CD4+; FoxP3+). Um mAb mIgG1 anti-CXCR3 de depleção (5 mg/kg) ou controle de isotipo m IgG1 (5 mg/kg) foram injetados IV em camundongos repórter FoxP3-GFP. Após 4 dias, as populações de linfócitos esplênicos CD4+ foram analisadas com anti-mCXCR3 da Biolegend. Esses dados confirmam que apenas o subconjunto CXCRr3+ Treg foi depletado, mas a razão CD4+ FoxP3 - /CD4+ FoxP3+ é inalterada.

[078] Figura 3 Modelo de enxerto de pele. Experimento de transplante de pele com depleção do anticorpo anti-CXCR3 Balb/c para C57BL/6. Camundongos que receberam o anticorpo anti-CXCR3 de depleção mostram evidências de pele aloenxertada aceita, 200 dias após o transplante.

[079] Figura 4 Alvejar células CXCR3+ em NASH melhora a esteatohepatite e a fibrose. Foi demonstrado que um mAb anti-CXCR3 de depleção protege contra o desenvolvimento de NASH em camundongos e diminui a deposição de colágeno (fibrose).

[080] Figura 5 A depleção das células CXCR3+ protege contra o desenvolvimento de NASH. Os camundongos foram colocados em uma dieta MCD para induzir NASH. Os camundongos também receberam um controle de isotipo; um mAb anti-CXCR3 de depleção ou um mAb anti-CXCR3 de não depleção. Apenas os camundongos que receberam o anticorpo de depleção foram protegidos contra o desenvolvimento de NASH.

[081] Figura 6 mAbs anti-CXCR3 depletam as células NKT e células T CD8 intra-hepáticas ativadas. A dieta MCD aumenta a frequência das células T CD8+ CXCR3+; A dieta MCD aumenta a frequência das células NKT; as células NKT são CXCR3+ e são depletadas após o tratamento com mAb anti-CXCR3 modificado por Fc.

[082] Figura 7 Tratamento com anti-CXCR3 diminui a liberação de ALT no soro e a infiltração de monócitos no Fígado. Descrição detalhada das modalidades

[083] Será entendido que a invenção revelada e definida neste relatório descritivo se estende a todas as combinações alternativas de duas ou mais das características individuais mencionadas ou evidentes a partir do texto ou desenhos. Todas essas combinações diferentes constituem vários aspectos alternativos da invenção.

[084] Aspectos adicionais da presente invenção e modalidades adicionais dos aspectos descritos nos parágrafos anteriores se tornarão aparentes a partir da seguinte descrição, dada a título de exemplo e com referência aos desenhos anexos.

[085] Agora será feita referência em detalhes a certas modalidades da invenção. Embora a invenção seja descrita em conjunto com as modalidades,

será entendido que a intenção não é limitar a invenção a essas modalidades. Pelo contrário, a invenção se destina a cobrir todas as alternativas, modificações e equivalentes, que podem ser incluídas no escopo da presente invenção conforme definido pelas reivindicações.

[086] Os presentes inventores demonstraram que várias condições podem ser tratadas usando um sítio de ligação ao antígeno que se liga a CXCR3 e causa ou medeia o a depleção de uma célula que expressa CXCR3. Como resultado, os métodos descritos na presente invenção encontram aplicação particular na prevenção ou tratamento de várias condições associadas à expressão de CXCR3, incluindo, mas não se limitando a, NASH. Em geral

[087] Ao longo deste relatório descritivo, a menos que especificamente indicado de outra forma ou o contexto exija o contrário, a referência a uma única etapa, composição de matéria, grupo de etapas ou grupo de composições de matéria deve ser considerada para abranger uma e uma pluralidade (isto é, uma ou mais) dessas etapas, composições de matéria, grupos de etapas ou grupos de composições de matéria. Assim, Conforme usado na presente invenção, as formas singulares “um”, “uma” e “o”, “a” incluem aspectos plurais e vice-versa, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Por exemplo, a referência a “um” inclui um, bem como dois ou mais; a referência a “uma” inclui uma, bem como duas ou mais; a referência a “o”, “a” inclui um único, bem como dois ou mais e assim por diante.

[088] Os técnicos no assunto apreciarão que a presente invenção é suscetível a variações e modificações diferentes das especificamente descritas. Deve-se entender que a invenção inclui todas essas variações e modificações. A invenção também inclui todas as etapas, características, composições e compostos referidos ou indicados neste relatório descritivo, individualmente ou coletivamente, e qualquer e todas as combinações ou quaisquer duas ou mais das referidas etapas ou características.

[089] Um técnico no assunto reconhecerá muitos métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos na presente invenção, que podem ser usados na prática da presente invenção. A presente invenção não está de forma alguma limitada aos métodos e materiais descritos.

[090] Todas as patentes e publicações referidas na presente invenção são incorporadas por referência em sua totalidade.

[091] A presente invenção não deve ser limitada em escopo pelos exemplos específicos descritos na presente invenção, que se destinam apenas ao propósito de exemplificação. Produtos, composições e métodos funcionalmente equivalentes estão claramente dentro do escopo da presente invenção.

[092] Qualquer exemplo ou modalidade da presente invenção aqui deve ser considerado como aplicável mutatis mutandis a qualquer outro exemplo ou modalidade da invenção, a menos que especificamente indicado de outra forma.

[093] A menos que especificamente definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção devem ser considerados como tendo o mesmo significado como comumente entendido por um técnico no assunto (por exemplo, em cultura de células, genética molecular, imunologia, imuno-histoquímica, química de proteínas e bioquímica).

[094] A menos que indicado de outra forma, a proteína recombinante, cultura de células e técnicas imunológicas utilizadas na presente invenção são procedimentos padrão, bem conhecidos pelos técnicos no assunto. Tais técnicas são descritas e explicadas ao longo da literatura em fontes como J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach,

Volumes 1 e 2, IRL Press (1991), DM Glover e BD Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 e 1996) e FM Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates e Wiley-Interscience (1988, incluindo todas as atualizações até o presente), Ed Harlow e David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988), e J.E. Coligan et al. (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluindo todas as atualizações até o presente).

[095] A descrição e definições de regiões variáveis e suas partes, imunoglobulinas, anticorpos e fragmentos dos mesmos na presente invenção podem ser adicionalmente esclarecidos pela discussão em Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 e 1991, Bork et al., J Mol. Biol. 242, 309-320, 1994, Chothia e Lesk J. Mol Biol. 196: 901 -917, 1987, Chothia et al. Nature 342, 877-883, 1989 e/ou Al- Lazikani et al., J Mol Biol 273, 927-948, 1997.

[096] O termo “e/ou”, por exemplo, “X e/ou Y” deve ser entendido como significando “X e Y” ou “X ou Y” e deve ser considerado para fornecer suporte explícito para ambos os significados ou para qualquer um dos significados.

[097] Conforme usado na presente invenção, o termo “derivado a partir de” deve ser tomado para indicar que um número inteiro especificado pode ser obtido de uma fonte particular, embora não necessariamente diretamente dessa fonte.

[098] A referência aqui a uma gama de, por exemplo, resíduos, será entendida como inclusiva. Por exemplo, a referência a “uma região compreendendo os aminoácidos 56 a 65” será entendida de uma maneira inclusiva, isto é, a região compreende uma sequência de aminoácidos com os números 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 e 65 em uma sequência especificada. Definições Selecionadas

[099] As células T são divididas em várias subclasses principais, incluindo células T citotóxicas, que matam células infectadas por vírus, bem como duas classes de células reguladoras, chamadas células T auxiliares (células Th) e células T supressoras, que atuam para modular a atividade de outras células imunológicas. Durante infecções crônicas, as células Th se desenvolvem em pelo menos três populações efetoras fenotipicamente e funcionalmente distintas, células T Th1, Th2 e Th17. As células Th1 produzem IFN-gama e IL-2, que são comumente associados a respostas imunes mediadas por células contra vários patógenos intracelulares, enquanto as células Th2 produzem citocinas, como IL- 4, IL-5 e IL-13, que são cruciais para controlar infecções helmínticas extracelulares. As células Th17 produzem isoformas de IL-17, e as células Th17 fazem um papel importante na manutenção das barreiras mucosas e contribuem para a eliminação do patógeno nas superfícies mucosas.

[100] As células Th1 foram associadas a doenças autoimunes específicas de órgãos, hipersensibilidade do tipo retardado e rejeição de transplantes. Adicionalmente, citocinas como IL-12 e IL-4 têm papéis dominantes na determinação do resultado da diferenciação de Th em subconjuntos Th1 e Th2, respectivamente. Por exemplo, em células Th1, após a ligação de IL-12 ao seu receptor cognato, STAT4 é ativado, desse modo levando à produção de IFN-γ. Consequentemente, os camundongos com deficiência de STAT4 são defeituosos na diferenciação de Th1 e não respondem a patógenos intracelulares, como Listeria monocytogenes.

[101] As células Th1 expressam vários receptores de quimiocinas, comCXCR3, CCR1 e CCR5. Geralmente, CXCR3 é considerado um dos melhores marcadores de células Th1, embora CXCR3 seja expresso também por células NKT e algumas células B, particularmente aquelas associadas à inflamação (Qin et al J. Clin. Invest. 1997).

[102] CXCR3 também é conhecido como receptor 9 acoplado à proteína G (GPR9), CD182, CD183, CKR-L2, CMKAR3, GPR9, IP10-R, Mig-R, MigR,). CXCR3 é um receptor inflamatório da quimiolina cuja expressão está associada ao auxiliar CDr+ Tipo-1 (Th1) e aos linfócitos citotóxicos CD8+ (CTLs). Além da expressão de CXCR3 em células T CD4+ e CD8+ efetoras, CXCR3 também é altamente expresso em linfócitos inatos, tais como células assassinas naturais (NK) e células NT, e em DCs plasmocitoides e subconjuntos de células B.

[103] CXCR3 liga três quimiocinas: CXCL9 (também conhecido como monocina induzida por nterferon-gama, ou MIG), CXCL10 (proteína induzida por interferon de 10 kDa, ou IP-10) e CXCL11 I (quimioatraente de células T induzível por interferon, ou I-TAC). A ligação dCXCR3 a esses ligantes, que por sua vez são induzidos por citocinas inflamatórias, medeia a migração celular, desse modo coordenando a inflamação na periferia.

[104] Por causa da expressão de CXCR3 em células efetoras e seu papel na migração e inflamação celular, há uma necessidade de tratamentos aprimorados para inibir a migração e/ou inflamação celular. Por exemplo, a migração de células T ativadas para o enxerto após o transplante resulta em dano ao órgão do doador e é uma marca registrada da rejeição aguda e crônica. Uma grande variedade de agentes imunossupressores está disponível e é rotineiramente usada em clínicas para reduzir os episódios de rejeição e melhorar a sobrevida do enxerto a ambos curto e longo prazo. Entretanto, seu modo de ação geralmente resulta em um desligamento completo do sistema imune e seu uso depende de absorção indefinida. Como tal, eles estão tipicamente associados a efeitos colaterais, como infecções oportunistas, distúrbios linfoproliferativos ou doenças cardiovasculares. Consequentemente, o desenvolvimento de fármacos mais específicos capazes de induzir a tolerância ao transplante e, assim, eliminar a restrição de altas doses de agentes imunossupressores contínuos é um objetivo principal no campo dos transplantes.

[105] Embora IP-10 e MIG pertençam à subfamília CXC, em contraste com IL-8 e outras quimiocinas CXC que são quimioatraentes potentes para neutrófilos, os alvos primários de IP-10 e MIG são linfócitos, particularmente células efetoras, tais como linfócitos T ativados ou estimulados e células natural killer (NK). Consistentemente, IP-10 e MIG não têm o motivo ELR, um epítopo de ligação essencial naquelas quimiocinas CXC que induzem eficientemente a quimiotaxia de neutrófilos. Além disso, tanto a MIG humana recombinante quanto a IP-10 humana recombinante foram relatadas por induzir o fluxo de cálcio em linfócitos infiltrantes de tumor (TIL). Embora IP-10 seja relatado por induzir quimiotaxia de monócitos in vitro, o receptor responsável não foi identificado, a MIG humana parece altamente seletiva e não apresenta tal efeito. A expressão de IP-10 é induzida em uma variedade de tecidos em condições inflamatórias, como psoríase, erupções DRUG fixas, respostas de hipersensibilidade cutânea tardia, hanseníase tuberculóide e em glomerulonefrite experimental e encefalomielite alérgica experimental. O IP-10 também tem um potente efeito antitumoral in vivo que é dependente de células T, é relatado como sendo um inibidor da angiogênese in vivo, e pode induzir quimiotaxia e desgranulação de células NK in vitro, sugerindo um papel como mediador do recrutamento e desgranulação das células NK (na destruição das células tumorais, por exemplo). Os padrões de expressão de IP-10 e MIG também são distintos em que a expressão de cada um é induzida por interferon- gama (IFNγ), enquanto a expressão de IL-8 é infrarregulada por IFNγ.

[106] As quimiocinas foram recentemente reconhecidas como os mediadores há muito procurados para o recrutamento de linfócitos. Descobriu- se que várias quimiocinas CXC induzem a quimiotaxia de linfócitos, mas também são ativas em granulócitos e monócitos. A situação é diferente para IP-10 e MIG,

que são seletivos em sua ação sobre os linfócitos, incluindo linfócitos T ativados e células NK, e que se ligam a CXCR3, um receptor que não reconhece várias outras quimiocinas e que exibe um padrão seletivo de expressão.

[107] Conforme usado na presente invenção, a referência a CXCR3 é a uma molécula que tem pelo menos uma atividade bioquímica ou biofísica de CXCR3 conforme descrito na presente invenção. O termo “CXCR3”, conforme fornecido na presente invenção, inclui qualquer uma das formas naturais do receptor 3 de quimiocina do motivo C-X-C (CXCR3), homólogos ou variantes que mantêm a atividade de CXCR3 (por exemplo, dentro de pelo menos 50%, 80%, 90%, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de atividade em comparação com a proteína nativa). Em algumas modalidades, variantes ou homólogos têm pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos em toda a sequência ou uma porção da sequência (por exemplo, uma porção contínua de 50, 100, 150 ou 200 aminoácidos) em comparação com uma forma de ocorrência natural.

[108] Para efeitos de nomenclatura apenas e não de limitação, uma sequência de aminoácidos exemplar de CXCR3 humano é SEQ ID NO: 7 e suas variantes tendo pelo menos ou cerca de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, incluindo as variantes naturais apresentadas em SEQ ID NOs: 108 e 109, compreendendo as mutações R292Q e A363T, respectivamente. Polipeptídeos CXCR3 não humanos exemplares incluem, mas não estão limitados a, CXCR3 de camundongo (por exemplo, SEQ ID NO: 5), rato (por exemplo, SEQ ID NO: 8), porco (por exemplo, SEQ ID NO: 9). vaca (por exemplo, SEQ ID NO: 10), macaco rhesus (por exemplo, SEQ ID NO: 11), e cachorro (por exemplo, SEQ ID NO: 12), e suas variantes tendo pelo menos ou cerca de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com o mesmo.

[109] A frase “inibe a atividade de CXCR3” é entendida como significando que o sítio de ligação ao antígeno da presente invenção inibe ou reduz qualquer uma ou mais atividades dCXCR3, incluindo, mas não se limitando à ligação do ligante a CXCR3; mudança conformacional de CXCR3 induzida por ligante; ativação de CXCR3; ativação de proteína G; sinalização celular mediada por CXCR3; um crescimento tumoral imflamatório, migratório, mediado por células CXCR3, resposta angiogênica ou metastática in vitro ou in vivo; crescimento de células tumorais mediado por CXCR3; e/ou recrutamento de linfócitos mediado por CXCR3.

[110] “Inibe a atividade de CXCR3 mediada por MIG, IP-10 ou I-TAC” é entendido como significando que o sítio de ligação ao antígeno da presente invenção inibe ou reduz uma ou mais atividades descritas acima que são mediadas ou induzidas por MIG, IP-10 e/ou I-TAC. Adicionalmente, a atividade é medida usando um ensaio adequado in vitro, celular ou in vivo e a atividade é bloqueada ou reduzida em pelo menos 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% ou mais, em comparação com a atividade de CXCR3 no mesmo ensaio sob as mesmas condições, mas sem o sítio de ligação ao antígeno. Preferencialmente, a atividade de CXCR3 é mediada ou induzida por qualquer um ou mais ligantes, por exemplo, MIG, IP-10 e I-TAC.

[111] Conforme usado na presente invenção, “depleção” em relação às células CXCR3+ (isto é, células que expressam CXCR3, preferencialmente exibindCXCR3 de superfície celular) refere-se à redução na atividade ou remoção dessas células a partir de uma população de células. Preferencialmente, a depleção em relação às células CXCR3+ refere-se à remoção ou redução da viabilidade dessas células a partir de uma população de células. A referência à depleção inclui a depleção total ou parcial. Adicionalmente, a depleção pode ser permanente ou temporária e pode ser em graus variáveis de magnitude e/ou espacialidade. A depleção pode ser o resultado de morte celular, tal como por apoptose ou necrose. Preferencialmente, a morte celular é mediada por ADCC. Alternativamente, um sítio de ligação ao antígeno per se conforme descrito na presente invenção pode ter pouca ou nenhuma capacidade para reduzir a atividade ou viabilidade de uma célula CXCR3+, mas pode ser conjugado ou associado a um composto que tem a capacidade de reduzir a atividade ou viabilidade de uma célula. Tipicamente, um sítio de ligação ao antígeno que tem pouca ou nenhuma capacidade para reduzir a atividade ou viabilidade de uma célula CXCR3+ é conjugado ou associado a um composto citotóxico.

[112] A depleção pode ser avaliada medindo o número de células CXCR3+ em uma população usando qualquer método conhecido na técnica (por exemplo, citometria de fluxo, imunohistoquímica, etc.), antes e após a exposição a um sítio de ligação ao antígeno, ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção, ou na ausência e presença de um sítio de ligação ao antígeno ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção. Após a exposição a um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção, células CXCR3+ podem estar depletadas em pelo menos ou cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%. 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais. Um sítio de ligação ao antígeno que tem a capacidade de depleção em relação às células CXCR3+ pode ser referido como um sítio de ligação ao antígeno de depleção.

[113] O termo “proteína isolada” ou “polipeptídeo isolado” é uma proteína ou polipeptídeo que, em virtude de sua origem ou fonte de derivação, não está associado a componentes naturalmente associados que o acompanham em seu estado nativo; está substancialmente livre de outras proteínas da mesma fonte. Uma proteína pode ser tornada substancialmente livre de componentes naturalmente associados ou substancialmente purificada por isolamento,

usando técnicas de purificação de proteínas conhecidas na técnica. Por “substancialmente purificada” entende-se que a proteína é substancialmente livre de agentes contaminantes, por exemplo, pelo menos cerca de 70% ou 75% ou 80% ou 85% ou 90% ou 95% ou 96% ou 97% ou 98% ou 99% livre de agentes contaminantes.

[114] O termo “recombinante” deve ser entendido como o produto de recombinação genética artificial. Consequentemente, no contexto de uma proteína recombinante compreendendo um domínio de ligação ao antígeno do anticorpo, este termo não abrange um anticorpo de ocorrência natural dentro do corpo de um indivíduo que é o produto da recombinação natural que ocorre durante a maturação das células B. Entretanto, se tal anticorpo for isolado, deve ser considerado uma proteína isolada compreendendo um domínio de ligação ao antígeno do anticorpo. De maneira similar, se o ácido nucleico que codifica a proteína é isolado e expresso usando meios recombinantes, a proteína resultante é uma proteína recombinante compreendendo um domínio de ligação ao antígeno do anticorpo. Uma proteína recombinante também abrange uma proteína expressa por meios recombinantes artificiais quando está dentro de uma célula, tecido ou indivíduo, por exemplo, no qual é expressa.

[115] O termo “proteína” deve ser entendido como incluindo uma única cadeia polipeptídica, isto é, uma série de aminoácidos contíguos ligados por ligações peptídicas ou uma série de cadeias polipeptídicas covalentemente ou não covalentemente ligadas entre si (isto é, um complexo polipeptídico). Por exemplo, a série de cadeias polipeptídicas pode ser ligada covalentemente usando um produto químico adequado ou uma ligação dissulfeto. Exemplos de ligações não covalentes incluem ligações de hidrogênio, ligações iônicas, forças de Van der Waals e interações hidrofóbicas.

[116] O termo “polipeptídeo” ou “cadeia polipeptídica” será entendido a partir do parágrafo anterior como significando uma série de aminoácidos contíguos ligados por ligações peptídicas.

[117] Conforme usado na presente invenção, o termo “sítio de ligação ao antígeno” é usado indistintamente com “domínio de ligação ao antígeno” e deve ser entendido como uma região de um anticorpo que é capaz de se ligar especificamente a um antígeno, isto é, um VH ou um VL ou um Fv compreendendo ambos um VH e um VL. O domínio de ligação ao antígeno não precisa estar no contexto de um anticorpo inteiro, por exemplo, pode estar isolado (por exemplo, um anticorpo de domínio) ou em outra forma, por exemplo, conforme descrito na presente invenção, como um scFv.

[118] Para os fins da presente invenção, o termo “anticorpo” inclui uma proteína capaz de se ligar especificamente a um ou alguns antígenos intimamente relacionados (por exemplo, CXCR3) em virtude de um domínio de ligação ao antígeno contido em um Fv. Este termo inclui anticorpos de quatro cadeias (por exemplo, duas cadeias leves e duas cadeias pesadas), anticorpos recombinantes ou modificados (por exemplo, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, anticorpos enxertados com CDR, anticorpos primatizados, anticorpos desimunizados, anticorpos sinumanizados, semianticorpos, anticorpos biespecíficos). Um anticorpo geralmente compreende domínios constantes, que podem ser arranjados em uma região constante ou fragmento constante ou fragmento cristalizável (Fc). Formas exemplares de anticorpos compreendem uma estrutura de quatro cadeias como sua unidade básica. Os anticorpos de comprimento total compreendem duas cadeias pesadas (~50 a 70 kD) ligadas covalentemente e duas cadeias leves (~23 kDa cada). Uma cadeia leve geralmente compreende uma região variável (se presente) e um domínio constante e em mamíferos é uma cadeia leve κ ou uma cadeia leve λ. Uma cadeia pesada geralmente compreende uma região variável e um ou dois domínios constantes ligados por uma região de dobradiça a domínios constantes adicionais. Cadeias pesadas de mamíferos são de um dos seguintes tipos α, δ, ε, γ ou μ. Cada cadeia leve também está covalentemente ligada a uma das cadeias pesadas. Por exemplo, as duas cadeias pesadas e as cadeias pesada e leve são mantidas juntas por ligações dissulfeto entre cadeias e por interações não covalentes. O número de ligações dissulfeto entre cadeias pode variar entre diferentes tipos de anticorpos. Cada cadeia tem uma região variável N-terminal (VH ou VL em que cada uma tem ~110 aminoácidos de comprimento) e um ou mais domínios constantes no C-terminal. O domínio constante da cadeia leve (CL que tem ~110 aminoácidos de comprimento) é alinhado e ligado por dissulfeto ao primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1 que tem 330 a 440 aminoácidos de comprimento). A região variável da cadeia leve é alinhada com a região variável da cadeia pesada. A cadeia pesada do anticorpo pode compreender 2 ou mais domínios CH adicionais (tais como, CH2, CH3 e semelhantes) e pode compreender uma região de dobradiça entre os domínios constantes CH1 e CH2. Os anticorpos podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse. Em um exemplo, o anticorpo é um anticorpo murino (camundongo ou rato) ou um anticorpo primata (tal como, humano). Em um exemplo, a cadeia pesada do anticorpo está sem um resíduo de lisina C- terminal. Em um exemplo, o anticorpo é humanizado, sinumanizado, quimérico, enxertado com CDR ou desimunizado.

[119] Os termos “anticorpo de comprimento total”, “anticorpo intacto” ou “anticorpo inteiro” são usados indistintamente para se referir a um anticorpo em sua forma substancialmente intacta, em oposição a um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo. Especificamente, anticorpos inteiros incluem aqueles com cadeias pesadas e leves, incluindo uma região de Fc. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência de tipo selvagem (por exemplo, domínios constantes de sequência de tipo selvagem humano) ou variantes de sequência de aminoácidos dos mesmos.

[120] Conforme usado na presente invenção, “região variável” refere-se às porções das cadeias leves e/ou pesadas de um anticorpo, conforme definido na presente invenção, que é capaz de se ligar especificamente a um antígeno e inclui sequências de aminoácidos de regiões determinantes de complementaridade (CDRs); isto é, CDR1, CDR2 e CDR3 e regiões de estrutura (FRs). Por exemplo, a região variável compreende três ou quatro FRs (por exemplo, FR1, FR2, FR3 e opcionalmente FR4) junto com três CDRs. O VH refere- se à região variável da cadeia pesada. O VL refere-se à região variável da cadeia leve.

[121] Conforme usado na presente invenção, o termo “regiões determinantes de complementaridade” (syn. CDRs; isto é, CDR1, CDR2 e CDR3) refere-se aos resíduos de aminoácidos de uma região variável de anticorpo, cuja presença são os principais contribuintes para a ligação específica ao antígeno. Cada domínio de região variável (VH ou VL) tipicamente tem três CDRs identificados como CDR1, CDR2 e CDR3. Os CDRs de VH também são referidos na presente invenção como CDR H1, CDR H2 e CDR H3, respectivamente, em que CDR H1 corresponde a CDR 1 de VH, CDR H2 corresponde a CDR 2 de VH e CDR H3 corresponde a CDR 3 de VH. Da mesma forma, os CDRs de VL são referidos na presente invenção como CDR L1, CDR L2 e CDR L3, respectivamente, em que CDR L1 corresponde a CDR 1 de VL, CDR L2 corresponde a CDR 2 de VL e CDR L3 corresponde a CDR 3 de VL. Em um exemplo, as posições de aminoácidos atribuídas a CDRs e FRs são definidas de acordo com Sequências de Proteínas de Interesse Imunológico de Kabat, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 e 1991 (também referido aqui como “o sistema de numeração de Kabat” )

Em outro exemplo, as posições de aminoácidos atribuídas a CDRs e FRs são definidas de acordo com o Enhanced Chothia Numbering Scheme (http://www.bioinfo.org.uk/mdex.htmL). A presente invenção não está limitada a FRs e CDRs conforme definidas pelo sistema de numeração de Kabat, mas inclui todos os sistemas de numeração, incluindo o sistema de numeração canônico ou de Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987; Chothia et al., Nature 342: 877-883, 1989; e/ou Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273: 927-948, 1997; o sistema de numeração de Honnegher e Plükthun J. Mol. Biol. 309: 657-670, 2001; ou o sistema IMGT discutido em Giudicelli et al., Nucleic Acids Res. 25: 206-211 1997. Em um exemplo, os CDRs são definidos de acordo com o sistema de numeração de Kabat. Opcionalmente, o CDR2 de cadeia pesada de acordo com o sistema de numeração de Kabat não compreende os cinco aminoácidos C-terminais listados na presente invenção ou qualquer um ou mais desses aminoácidos são substituídos por outro aminoácido de ocorrência natural. A este respeito, Padlan et al., FASEB J., 9: 133-139, 1995 estabeleceu que os cinco aminoácidos C- terminal de CDR2 da cadeia pesada não estão geralmente envolvidos na ligação ao antígeno.

[122] As “regiões estruturais” (FRs) são aqueles resíduos da região variável diferentes dos resíduos CDR. As FRs de VH também são referidas na presente invenção como FR H1, FR H2, FR H3 e FR H4, respectivamente, em que FR H1 corresponde a FR 1 de VH, FR H2 corresponde a FR 2 de VH, FR H3 corresponde a FR 3 de VH e FR H4 corresponde a FR 4 de VH. Da mesma forma, as FRs de VL são aqui referidas como FR L1, FR L2, FR L3 e FR L4, respectivamente, em que FR L1 corresponde a FR 1 de VL, FR L2 corresponde a FR 2 de VL, FR L3 corresponde a FR 3 de VL e FR L4 corresponde a FR 4 de VL.

[123] Conforme usado na presente invenção, o termo “Fv” deve ser entendido como qualquer proteína, seja ela composta por múltiplos polipeptídeos ou um único polipeptídeo, em que um VL e um VH se associam e formam um complexo com um domínio de ligação ao antígeno, isto é, capaz de ligação especificamente a um antígeno.

O VH e o VL que formam o domínio de ligação ao antígeno podem estar em uma única cadeia polipeptídica ou em diferentes cadeias polipeptídicas.

Adicionalmente, um Fv da invenção (bem como qualquer proteína da invenção) pode ter múltiplos domínios de ligação ao antígeno que podem ou não se ligar ao mesmo antígeno.

Este termo deve ser entendido como abrangendo fragmentos diretamente derivados de um anticorpo, bem como proteínas correspondentes a esse fragmento produzido usando meios recombinantes.

Em alguns exemplos, o VH não está ligado a um domínio constante da cadeia pesada (CH) 1 e/ou o VL não está ligado a um domínio constante da cadeia leve (CL). Os Fv exemplares contendo polipeptídeos ou proteínas incluem um fragmento Fab, um fragmento Fab’, um fragmento F(ab'), um scFv, um diacorpo, um triacorpo, um tetracorpo ou complexo de ordem superior, ou qualquer um dos anteriores ligados a uma região constante ou seu domínio, por exemplo, CH2 ou domínio CH3, por exemplo, um minicorpo.

Um “fragmento Fab” consiste em um fragmento de ligação ao antígeno monovalente de uma imunoglobulina e pode ser produzido por digestão de um anticorpo inteiro com a enzima papaína, para produzir um fragmento que consiste em uma cadeia leve intacta e uma porção de uma cadeia pesada ou pode ser produzido usando meios recombinantes.

Um “fragmento Fab’” de um anticorpo pode ser obtido tratando um anticorpo inteiro com pepsina, seguido por redução, para produzir uma molécula que consiste em uma cadeia leve intacta e uma porção de uma cadeia pesada compreendendo um VH e um único domínio constante.

Dois fragmentos Fab’ são obtidos por anticorpo tratado desta maneira.

Um fragmento Fab’ também pode ser produzido por meios recombinantes.

Um “fragmento F(ab’)2” de um anticorpo consiste em um dímero de dois fragmentos Fab' mantidos juntos por duas ligações dissulfeto e é obtido pelo tratamento de uma molécula de anticorpo inteira com a enzima pepsina, sem redução subsequente. Um fragmento “Fab2” é um fragmento recombinante compreendendo dois fragmentos Fab ligados usando, por exemplo, um zíper de leucina ou um domínio CH3. Um “Fv de cadeia simples” ou “scFv” é uma molécula recombinante contendo o fragmento da região variável (Fv) de um anticorpo em que a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada estão covalentemente ligadas por um adequado e flexível ligante polipeptídico.

[124] Conforme usado na presente invenção, o termo “liga-se” em referência à interação de um sítio de ligação ao antígeno ou um domínio de ligação ao antígeno do mesmo com um antígeno significa que a interação é dependente da presença de uma estrutura particular (por exemplo, um determinante antigênico ou epítopo) no antígeno. Por exemplo, um anticorpo reconhece e se liga a uma estrutura de proteína específica em vez de às proteínas em geral. Se um anticorpo se liga ao epítopo “A”, a presença de uma molécula contendo o epítopo “A” (ou livre, “A” não marcado), em uma reação contendo “A” marcado e a proteína, reduzirá a quantidade de “A” marcado ligado ao anticorpo.

[125] Conforme usado na presente invenção, o termo “liga especificamente” ou “liga-se especificamente” deve ser entendido como significando que um sítio de ligação ao antígeno, conforme descrito na presente invenção, reage ou se associa mais frequentemente, mais rapidamente, com maior duração e/ou com maior afinidade com um antígeno particular ou célula que expressa o mesmo do que faz com antígenos ou células alternativas. Por exemplo, um sítio de ligação ao antígeno se liga a CXCR3 (por exemplo, hCXCR3) com afinidade materialmente maior (por exemplo, 1,5 vezes ou 2 vezes ou 5 vezes ou 10 vezes ou 20 vezes ou 40 vezes ou 60 vezes ou 80 vezes a 100 vezes ou 150 ou 200 vezes) do que para outros CXCRs. Em um exemplo da presente invenção, um sítio de ligação ao antígeno que “se liga especificamente” a CXCR3 (preferencialmente humano) com uma afinidade de pelo menos 1,5 vezes ou 2 vezes ou mais (por exemplo, 5 vezes ou 10 vezes ou 20 vezes ou 50 vezes ou 100 ou 200 vezes) do que para outro receptor de quimiocina, como CXCR1, CXCR2 e/ou C5aR. Geralmente, mas não necessariamente, a referência a ligação significa ligação específica, e cada termo deve ser entendido como fornecendo suporte explícito para o outro termo.

[126] Conforme usado na presente invenção, o termo “não se liga de forma detectável” deve ser entendido como significando que um sítio de ligação ao antígeno, por exemplo, um anticorpo, se liga a um antígeno candidato a um nível inferior a 10%, ou 8% ou 6% ou 5% acima do fundo. O fundo pode ser o nível de sinal de ligação detectado na ausência da proteína e/ou na presença de uma proteína de controle negativo (por exemplo, um anticorpo de controle de isotipo) e/ou o nível de ligação detectado na presença de um antígeno de controle negativo. O nível de ligação é detectado usando análise de biossensor (por exemplo, Biacore) em que o sítio de ligação ao antígeno é imobilizado e colocado em contato com um antígeno.

[127] Conforme usado na presente invenção, o termo “não se liga significativamente” deve ser entendido como significando que o nível de ligação de um sítio de ligação ao antígeno, conforme descrito na presente invenção, a um polipeptídeo não é significativamente maior estatisticamente do que o fundo, por exemplo, o nível de sinal de ligação detectado a ausência do sítio de ligação ao antígeno e/ou na presença de uma proteína de controle negativo (por exemplo, um anticorpo de controle de isotipo) e/ou o nível de ligação detectado na presença de um polipeptídeo de controle negativo. O nível de ligação é detectado usando análise de biossensor (por exemplo, Biacore) em que o sítio de ligação ao antígeno é imobilizado e colocado em contato com um antígeno.

[128] Conforme usado na presente invenção, o termo “epítopo” (sin. “determinante antigênico”) deve ser entendido como uma região dCXCR3 à qual se liga um sítio de ligação ao antígeno compreendendo um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo. A menos que definido de outra forma, este termo não está necessariamente limitado aos resíduos específicos ou estrutura com a qual o sítio de ligação ao antígeno faz contato. Por exemplo, este termo inclui a região que abrange os aminoácidos em contato com o sítio de ligação ao antígeno e 5-10 (ou mais) ou 2-5 ou 1-3 aminoácidos fora desta região. Em alguns exemplos, o epítopo compreende uma série de aminoácidos descontínuos que são posicionados próximos um do outro quando o sítio de ligação do antígeno é dobrado, isto é, um “epítopo conformacional”. O técnico no assunto também estará ciente de que o termo “epítopo” não está limitado a peptídeos ou polipeptídeos. Por exemplo, o termo "epítopo" inclui agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas, tais como cadeias laterais de açúcar, cadeias laterais de fosforila ou cadeias laterais de sulfonila e, em certos exemplos, podem ter características estruturais tridimensionais específicas e/ou características de carga específicas.

[129] Conforme usado na presente invenção, o termo “condição” refere-se a uma interrupção ou interferência com a função normal, não deve ser limitado a qualquer condição específica e incluirá doenças ou distúrbios.

[130] Conforme usado na presente invenção, os termos “prevenindo”, “prevenir” ou “prevenção” incluem a administração de um sítio de ligação ao antígeno, conforme descrito na presente invenção, para assim interromper ou impedir o desenvolvimento de pelo menos um sintoma de uma condição. Este termo também abrange o tratamento de um indivíduo em remissão para prevenir ou impedir a recaída.

[131] Conforme usado na presente invenção, os termos “tratando”, “tratar” ou “tratamento” incluem a administração de um sítio de ligação ao antígeno descrito na presente invenção para, desse modo, reduzir ou eliminar pelo menos um sintoma de uma doença ou condição especificada.

[132] Conforme usado na presente invenção, o termo “indivíduo” deve ser entendido como significando qualquer animal, incluindo humanos, por exemplo, um mamífero. Indivíduos exemplares incluem, mas não estão limitados a humanos e primatas não humanos. Por exemplo, o indivíduo é um humano. Anticorpos

[133] Em um exemplo, um sítio de ligação ao antígeno ou proteína de ligação a CXCR3, conforme descrito na presente invenção, de acordo com qualquer exemplo, é um anticorpo.

[134] Anticorpos anti-CXCR3: vários anticorpos anti-CXCR3 estão comercialmente disponíveis, incluindo, mas não se limitando a: 1C6 (anti-CXCR3 humano) ou clone 173 (anti-CXCR3 de camundongo), ambos disponíveis na Biolegend, BDBiosciences, AbCam ou outro fornecedor. Alternativamente, o anticorpo pode ser um anticorpo conforme descrito em WO2018/119299.

[135] Métodos para gerar anticorpos são conhecidos na técnica e/ou descritos em Harlow e Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,(1988). Geralmente, em tais métodos CXCR3 (por exemplo, hCXCR3) ou uma região do mesmo (por exemplo, uma região extracelular) ou fragmento imunogênico ou epítopo do mesmo ou uma célula que expressa e exibe o mesmo (isto é, um imunógeno), opcionalmente formulado com qualquer carreador adequado ou desejado, adjuvante ou excipiente farmaceuticamente aceitável, é administrado a um animal não humano, por exemplo, um camundongo, galinha, rato, coelho, porquinho da índia, cachorro, cavalo, vaca, cabra ou porco. O imunogênio pode ser administrado por via intranasal, intramuscular, subcutânea, intravenosa, intradérmica, intraperitoneal ou por outra via conhecida.

[136] A produção de anticorpos policlonais pode ser monitorada por amostragem de sangue do animal imunizado em vários pontos após a imunização. Uma ou mais imunizações adicionais podem ser dadas, se necessário para atingir um título de anticorpo desejado. O processo de reforço e titulação é repetido até que um título adequado seja alcançado. Quando um nível desejado de imunogenicidade é obtido, o animal imunizado é sangrado e o soro isolado e armazenado, e/ou o animal é usado para gerar anticorpos monoclonais (mAbs).

[137] Os anticorpos monoclonais são uma forma exemplar de anticorpo contemplada pela presente invenção. O termo “anticorpo monoclonal” ou “mAb” refere-se a uma população de anticorpos homogênea capaz de se ligar ao(s) mesmo(s) antígeno(s), por exemplo, ao mesmo epítopo dentro do antígeno. Este termo não se destina a ser limitado no que diz respeito à fonte do anticorpo ou à maneira como é feito.

[138] Para a produção de mAbs, qualquer uma de um número de técnicas conhecidas pode ser usada, como, por exemplo, o procedimento exemplificado em US4196265 ou Harlow e Lane (1988), supra.

[139] Por exemplo, um animal adequado é imunizado com um imunógeno em condições suficientes para estimular células produtoras de anticorpos. Roedores como coelhos, camundongos e ratos são animais exemplares. Camundongos geneticamente modificados para expressar anticorpos humanos, por exemplo, que não expressam anticorpos murinos, também podem ser usados para gerar um anticorpo da presente invenção (por exemplo, conforme descrito em WO2002/066630).

[140] Após a imunização, células somáticas com potencial para produzir anticorpos, especificamente linfócitos B (células B), são selecionadas para uso no protocolo de geração de mAb. Essas células podem ser obtidas a partir de biópsias de baços, amígdalas ou nódulos linfáticos, ou a partir de uma amostra de sangue periférico. As células B do animal imunizado são então fundidas com células de uma célula de mieloma imortal, geralmente derivada da mesma espécie do animal que foi imunizado com o imunógeno.

[141] Os híbridos são amplificados por cultura em um meio seletivo compreendendo um agente que bloqueia a síntese de nucleotídeos de novo no meio de cultura de tecidos. Agentes exemplares são aminopterina, metotrexato e azasserina.

[142] Os hibridomas amplificados são submetidos a uma seleção funcional para especificidade de anticorpo e/ou título, tal como, por exemplo, por citometria de fluxo e/ou imunohistoquímica e/ou imunoensaio (por exemplo, radioimunoensaio, imunoensaio enzimático, ensaio de citotoxicidade, ensaio de placa, imunoensaio de ponto, e semelhantes).

[143] Alternativamente, a tecnologia ABL-MYC (NeoClone, Madison WI 53713, EUA) é usada para produzir linhagens celulares secretoras de MAbs (por exemplo, conforme descrito em Largaespada et al, J. Immunol. Methods. 197: 85-95, 1996)).

[144] Os anticorpos também podem ser produzidos ou isolados pela triagem de uma biblioteca de exibição, por exemplo, uma biblioteca de exibição de fago, por exemplo, conforme descrita em US6300064 e/ou US5885793. Por exemplo, os presentes inventores isolaram anticorpos totalmente humanos de uma biblioteca de exibição de fago.

[145] O anticorpo da presente invenção pode ser um anticorpo sintético. Por exemplo, o anticorpo é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado,

um anticorpo humano sinumanizado, anticorpo primatizado ou um anticorpo desimunizado. Proteínas Contendo Domínio De Ligação De Anticorpo Anticorpos de Domínio Único

[146] Em alguns exemplos, uma proteína da invenção é ou compreende um anticorpo de domínio único (que é usado indistintamente com o termo “anticorpo de domínio” ou “dAb”). Um anticorpo de domínio único é uma cadeia polipeptídica única compreendendo a totalidade ou uma parte da região variável de cadeia pesada de um anticorpo. Em certas modalidades, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; vide, por exemplo, US6248516). Diacorpos, Triacorpos, Tetracorpos

[147] Em alguns exemplos, uma proteína da invenção é ou compreende um diacorpo, triacorpo, tetracorpo ou complexo de proteína de ordem superior, tal como aqueles descritos em WO98/044001 e/ou WO94/007921.

[148] Por exemplo, um diacorpo é uma proteína compreendendo duas cadeias polipeptídicas associadas, cada cadeia polipeptídica compreendendo a estrutura VL-X-VH ou VH-X-VL, em que VL é uma região variável da cadeia leve do anticorpo, VH é uma região variável da cadeia pesada do anticorpo, X é um ligante compreendendo resíduos insuficientes para permitir que o VH e VL em uma única cadeia polipeptídica se associem (ou formem um Fv) ou estejam ausentes, e em que o VH de uma cadeia polipeptídica se liga a um VL da outra cadeia polipeptídica para formar um domínio de ligação ao antígeno, isto é, formar uma molécula de Fv capaz de se ligar especificamente a um ou mais antígenos. O VL e VH podem ser o mesmo em cada cadeia polipeptídica ou o VL e VH podem ser diferentes em cada cadeia polipeptídica de modo a formar um diacorpo biespecífico (isto é, compreendendo dois Fvs com especificidade diferente). Fv de Cadeia Simples (scFv)

[149] O técnico no assunto estará ciente de que os scFvs compreendem regiões VH e VL em uma única cadeia polipeptídica e um ligante polipeptídico entre VH e VL que permite que o scFv forme a estrutura desejada para a ligação ao antígeno (isto é, para VH e VL da cadeia polipeptídica única se associarem uma à outra para formar um Fv). Por exemplo, o ligante compreende mais de 12 resíduos de aminoácidos com (Gly4Ser)3 sendo um dos ligantes mais preferenciais para um scFv.

[150] A presente invenção também contempla um Fv estabilizado por dissulfeto (ou diFv ou dsFv), no qual um único resíduo de cisteína é introduzido em uma FR de VH e uma FR de VL e os resíduos de cisteína ligados por uma ligação dissulfeto para produzir um Fv estável.

[151] Alternativamente, ou além disso, a presente invenção abrange um scFv dimérico, isto é, uma proteína compreendendo duas moléculas de scFv ligadas por uma ligação não covalente ou covalente, por exemplo, por um domínio zíper de leucina (por exemplo, derivado de Fos ou Jun). Alternativamente, dois scFvs são ligados por um ligante peptídico de comprimento suficiente para permitir que ambos os scFvs se formem e se liguem a um antígeno, por exemplo, conforme descrito em US20060263367. Anticorpos de Cadeia Pesada

[152] Os anticorpos de cadeia pesada diferem estruturalmente de muitas outras formas de anticorpos, na medida em que compreendem uma cadeia pesada, mas não compreendem uma cadeia leve. Consequentemente, esses anticorpos também são referidos como “anticorpos apenas de cadeia pesada”. Os anticorpos de cadeia pesada são encontrados, por exemplo, em camelídeos e peixes cartilaginosos (também chamados de IgNAR).

[153] As regiões variáveis presentes em anticorpos de cadeia pesada de ocorrência natural são geralmente referidas como “domínios VHH” em anticorpos de camelídeos e V-NAR em IgNAR, a fim de distingui-los das regiões variáveis da cadeia pesada que estão presentes em anticorpos convencionais de 4 cadeias (que são referidos como “domínios VH”) e a partir das regiões variáveis da cadeia leve que estão presentes em anticorpos convencionais de 4 cadeias (que são referidos como “domínios VL”).

[154] Uma descrição geral de anticorpos de cadeia pesada de camelídeos e as regiões variáveis dos mesmos e métodos para a sua produção e/ou isolamento e/ou uso é encontrada inter alia nas seguintes referências WO94/04678, WO97/49805 e WO 97/49805.

[155] Uma descrição geral de anticorpos de cadeia pesada de peixes cartilaginosos e regiões variáveis dos mesmos e métodos para a sua produção e/ou isolamento e/ou uso é encontrada inter alia em WO2005/118629. Outros Anticorpos e Proteínas compreendendo os Domínios de Ligação ao Antígeno dos Mesmos

[156] A presente invenção também contempla outros anticorpos e proteínas compreendendo domínios de ligação ao antígeno dos mesmos, tais como: (i) proteínas biespecíficas de “chave e fechadura” conforme descrito em US5731168; (ii) proteínas heteroconjugadas, por exemplo, conforme descrito em US4676980; (iii) proteínas heteroconjugadas produzidas usando um reticulador químico, por exemplo, conforme descrito em US4676980; e (iv) Fab3 (por exemplo, conforme descrito em EP19930302894). Mutações em proteínas

[157] A % de identidade de um ácido nucleico ou polipeptídeo é determinada por análise GAP (Needleman e Wunsch. Mol. Biol. 48, 443-453, 1970) (programa GCG) com uma penalidade de criação de lacuna = 5 e uma penalidade de extensão de lacuna = 0,3. A sequência de consulta tem pelo menos 50 resíduos de comprimento e a análise GAP alinha as duas sequências sobre uma região de pelo menos 50 resíduos. Por exemplo, a sequência de consulta tem pelo menos 100 resíduos de comprimento e a análise GAP alinha as duas sequências sobre uma região de pelo menos 100 resíduos. Por exemplo, as duas sequências são alinhadas em todo o seu comprimento.

[158] A presente invenção também contempla um ácido nucleico que hibridiza sob condições de hibridização rigorosas com um ácido nucleico que codifica um sítio de ligação ao antígeno descrito na presente invenção. Um “rigor moderado” é definido na presente invenção como sendo uma hibridização e/ou lavagem realizada em tampão 2 x SSC, 0,1% (p/v) SDS a uma temperatura na faixa de 45C a 65C ou condições equivalentes. Um “rigor elevado” é definido na presente invenção como sendo uma hibridização e/ou lavagem realizada em tampão 0,1 x SSC, 0,1% (p/v) SDS ou concentração de sal mais baixa e a uma temperatura de pelo menos 65C ou condições equivalentes. A referência aqui a um nível particular de restringência abrange condições equivalentes usando soluções de lavagem/hibridização diferentes de SSC conhecidas pelos técnicos no assunto. Por exemplo, métodos para calcular a temperatura na qual as fitas de um ácido nucleico de fita dupla se dissociarão (também conhecido como temperatura de fusão ou Tm) são conhecidos na técnica. Uma temperatura que é similar a (por exemplo, dentro de 5oC ou dentro de 10oC) ou igual à Tm de um ácido nucleico é considerado alto rigor. O rigor médio deve ser considerado dentro de 10oC a 20oC ou 10oC a 15oC da Tm calculada do ácido nucleico.

[159] A presente invenção também contempla formas mutantes de um sítio de ligação ao antígeno, conforme descrito na presente invenção, compreendendo uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos em comparação com uma sequência apresentada na presente invenção. Em alguns exemplos, o sítio de ligação ao antígeno compreende 10 ou menos, por exemplo, 9 ou 8 ou 7 ou 6 ou 5 ou 4 ou 3 ou 2 ou 1 substituição conservativa de aminoácidos. Uma “substituição conservativa de aminoácido” é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral semelhante e/ou hidropaticidade e/ou hidrofilicidade.

[160] Famílias de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais similares foram definidas na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais β-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Os índices hidropáticos são descritos, por exemplo, em Kyte e Doolittle J. Mol. Biol., 157: 105-132, 1982 e os índices hidrofílicos são descritos em, por exemplo, US4554101.

[161] A presente invenção também contempla alterações não conservativas de aminoácidos. Por exemplo, são de particular interesse as substituições de aminoácidos carregados por outro aminoácido carregado e por aminoácidos neutros ou carregados positivamente. Em alguns exemplos, o sítio de ligação ao antígeno compreende 10 ou menos, por exemplo, 9 ou 8 ou 7 ou 6 ou 5 ou 4 ou 3 ou 2 ou 1 substituição não conservativas de aminoácidos.

[162] Em um exemplo, a(s) mutação(ões) ocorrem dentro de uma FR de um domínio de ligação ao antígeno de um sítio de ligação ao antígeno, conforme descrito na presente invenção. Em outro exemplo, a(s) mutação(ões) ocorrem dentro de um CDR de um sítio de ligação ao antígeno, conforme descrito na presente invenção.

[163] Métodos exemplares para a produção de formas mutantes de um sítio de ligação ao antígeno incluem: • mutagênese de DNA (Thie et al., Methods Mol. Biol. 525: 309-322, 2009) ou RNA (Kopsidas et al., Immunol. Lett. 107: 163-168, 2006; Kopsidas et al. BMC Biotechnology, 7: 18, 2007; e WO1999/058661); • introduzindo um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo em uma célula mutadora, por exemplo, células bacterianas XL-1Red, XL-mutS e XL-mutS- Kanr (Stratagene); • DNA embaralhado, por exemplo, conforme revelado em Stemmer, Nature 370: 389-91, 1994; e • mutagênese direcionada ao sítio, por exemplo, conforme descrito em Dieffenbach (ed) e Dveksler (ed) (No: PCR primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory NY, 1995).

[164] Métodos exemplares para determinar a atividade biológica dos sítios de ligação ao antígeno mutante, conforme descritos na presente invenção, serão evidentes para o técnico no assunto e/ou descritos na presente invenção, por exemplo, ligação ao antígeno. Por exemplo, métodos para determinar a ligação ao antígeno, inibição competitiva de ligação, afinidade, associação, dissociação e eficácia terapêutica são descritos na presente invenção. Regiões Constantes

[165] A presente invenção abrange sítios de ligação ao antígeno e/ou anticorpos descritos na presente invenção compreendendo uma região constante de um anticorpo. Isso inclui fragmentos de ligação ao antígeno de um anticorpo fundido a um Fc.

[166] As sequências de regiões constantes úteis para a produção das proteínas da presente invenção podem ser obtidas a partir de um número de fontes diferentes. Em alguns exemplos, a região constante ou porção da mesma da proteína é derivada a partir de um anticorpo humano. A região constante ou porção da mesma pode ser derivada a partir de qualquer classe de anticorpo, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, e qualquer isotipo de anticorpo, incluindo IgG1, IgG2 e IgG3.

[167] Em um exemplo, a região Fc da região constante tem uma capacidade aprimorada para induzir função efetora, por exemplo, em comparação com uma região Fc de IgG1 ou IgG3 humana nativa ou de tipo selvagem. Em um exemplo, a função efetora é a citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC) e/ou fagocitose mediada por células dependente de anticorpos (ADCP) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Os métodos para avaliar o nível de função efetora de uma região Fc contendo proteína são conhecidos na técnica e/ou descritos na presente invenção.

[168] Em qualquer aspecto da presente invenção, o sítio de ligação ao antígeno compreende uma região Fc que é modificada para ter capacidade aumentada para induzir citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC). Preferencialmente, a capacidade aumentada para induzir ADCC é conferida por mutação, deleção ou modificação de aminoácidos na região Fc que interagem com um receptor de Fc. Preferencialmente, os aminoácidos que são mutados, deletados ou modificados estão na posição 239, 330 e/ou 332 de acordo com a SEQ ID NO: 1 (onde a alanina está na posição 118) ou em uma posição equivalente a 239, 330 e/ou 332. Preferência, os aminoácidos são mutados para S239D, A330L e I332E. Tipicamente, o Fc compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3.

[169] Em qualquer aspecto da presente invenção, o sítio de ligação ao antígeno compreende uma região Fc que não é modificada para ter uma capacidade reduzida de induzir citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC). Preferencialmente, existem os aminoácidos na posição 234, 235 e/ou 331 de acordo com a SEQ ID NO: 1 (onde alanina é a posição 118) ou em uma posição equivalente a 234, 235 e/ou 331 não são F, E e/ou S, respectivamente. Em outras palavras, o aminoácido na posição 234 não é F, na posição 235 não é E e/ou em 331 não é S.

[170] Em qualquer aspecto da presente invenção, o sítio de ligação ao antígeno não compreende uma região Fc compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 2.

[171] Em qualquer aspecto da presente invenção, o sítio de ligação ao antígeno per se conforme descrito na presente invenção pode ter pouca ou nenhuma capacidade para reduzir a atividade ou viabilidade de uma célula CXCR3+, mas pode ser conjugado ou associado a um composto que tem a capacidade de reduzir a atividade ou viabilidade de uma célula. Por exemplo, a região Fc pode ter uma capacidade ou capacidade reduzida de induzir função efetora, por exemplo, em comparação com uma região Fc de IgG1 ou IgG3 humana nativa ou de tipo selvagem, entretanto, nesta circunstância, o sítio de ligação ao antígeno é conjugado ou associado a um composto citotóxico.

[172] Um exemplo de uma região Fc com função efetora reduzida é uma região Fc de IgG4 (isto é, de uma região constante de IgG4), por exemplo, uma região Fc de IgG4 humana. As sequências de regiões Fc de IgG4 adequadas serão evidentes para o técnico no assunto e/ou estarão disponíveis em bases de dados disponíveis publicamente (por exemplo, disponíveis pelo National Center for Biotechnology Information).

[173] Em outro exemplo, a região Fc é uma região modificada para ter função efetora reduzida, isto é, uma “região Fc não imunoestimuladora”. Por exemplo, a região Fc é uma região Fc de IgG1 compreendendo uma substituição em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em 268, 309, 330 e 331. Em outro exemplo, a região Fc é uma região Fc de IgG1 compreendendo uma ou mais das seguintes alterações E233P, L234V, L235A e deleção de G236 e/ou uma ou mais das seguintes alterações A327G, A330S e P331S (Armour et al., Eur J Immunol. 29:2613-2624,1999; Shields et al., J Biol Chem. 276(9):6591- 604, 2001). Exemplos adicionais de regiões Fc não imunoestimulantes são descritos, por exemplo, em Dall'Acqua et al., J Immunol. 177: 1129-1138 2006; e/ou Hezareh J Virol; 75: 12161-12168, 2001)).

[174] Em outro exemplo, a região Fc é uma região Fc quimérica, por exemplo, compreendendo pelo menos um domínio CH2 de um anticorpo IgG4 e pelo menos um domínio CH3 de um anticorpo IgG1, em que a região Fc compreende uma substituição em uma ou mais posições de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em 240, 262, 264, 266, 297, 299, 307, 309, 323, 399, 409 e 427 (Numeração EU) (por exemplo, conforme descrito em WO2010/085682). Substituições exemplares incluem 240F, 262L, 264T, 266F, 297Q, 299A, 299K, 307P, 309K, 309M, 309P, 323F, 399S e 427F.

[175] Em qualquer um destes exemplos, o sítio de ligação ao antígeno que tem função efetora reduzida é conjugado ou associado a um composto que pode reduzir a atividade ou viabilidade de uma célula. Modificações Adicionais

[176] A presente invenção também contempla modificações adicionais a um anticorpo ou sítio de ligação ao antígeno compreendendo uma região Fc ou região constante.

[177] Por exemplo, o anticorpo compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que aumentam a meia-vida da proteína. Por exemplo, o anticorpo compreende uma região Fc compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos que aumentam a afinidade da região Fc para a região Fc neonatal (FcRn). Por exemplo, a região Fc tem afinidade aumentada para FcRn em pH mais baixo, por exemplo, cerca de pH 6,0, para facilitar a ligação de Fc/FcRn em um endossomo. Em um exemplo, a região Fc aumentou a afinidade para FcRn em cerca de pH 6 em comparação com sua afinidade em cerca de pH 7,4, o que facilita a re-liberação de Fc no sangue após a reciclagem celular. Essas substituições de aminoácidos são úteis para estender a meia-vida de uma proteína, reduzindo a depuração a partir do sangue.

[178] Substituições de aminoácidos exemplares incluem T250Q e/ou M428L ou T252A, T254S e T266F ou M252Y, S254T e T256E ou H433K e N434F de acordo com o sistema de numeração da UE. Substituições de aminoácidos adicionais ou alternativas são descritas, por exemplo, em US20070135620 ou US7083784. Produção De Proteína

[179] Em um exemplo, um sítio de ligação ao antígeno descrito na presente invenção de acordo com qualquer exemplo é produzido por cultura de um hibridoma sob condições suficientes para produzir a proteína, por exemplo, conforme descrito na presente invenção e/ou como é conhecido na técnica. Expressão Recombinante

[180] Em outro exemplo, um sítio de ligação ao antígeno descrito na presente invenção de acordo com qualquer exemplo é recombinante.

[181] No caso de uma proteína recombinante, o ácido nucleico que codifica a mesma pode ser clonado em construtos de expressão ou vetores, que são então transfectados em células hospedeiras, tais como células de E. coli, células de levedura, células de inseto ou células de mamífero, como células COS de símio, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), células de rim embrionário humano (HEK) ou células de mieloma que não produzem a proteína de outra forma. As células exemplares usadas para expressar uma proteína são células CHO, células de mieloma ou células HEK. As técnicas de clonagem molecular para atingir esses fins são conhecidas na técnica e descritas, por exemplo, em Ausubel et al., (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates e Wiley-Interscience (1988, incluindo todas as atualizações até o presente) ou Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,(1989). Uma grande variedade de clonagem e os métodos de amplificação in vitro são adequados para a construção de ácidos nucleicos recombinantes. Os métodos de produção de anticorpos recombinantes também são conhecidos na técnica, vide, por exemplo, US4816567 ou US5530101.

[182] Após o isolamento, o ácido nucleico é inserido operacionalmente ligado a um promotor em um construto de expressão ou vetor de expressão para posterior clonagem (amplificação do DNA) ou para expressão em um sistema livre de células ou em células.

[183] Conforme usado na presente invenção, o termo “promotor” deve ser considerado em seu contexto mais amplo e inclui as sequências regulatórias de transcrição de um gene genômico, incluindo a caixa TATA ou elemento iniciador, que é solicitado para o início preciso da transcrição, com ou sem elementos regulatórios adicionais (por exemplo, sequências de ativação a montante, sítios de ligação ao fator de transcrição, potenciadores e silenciadores) que alteram a expressão de um ácido nucleico, por exemplo, em resposta a um estímulo de desenvolvimento e/ou externo, ou de uma maneira específica de tecido. No presente contexto, o termo “promotor” também é usado para descrever um ácido nucleico recombinante, sintético ou de fusão ou derivado que confere, ativa ou aumenta a expressão de um ácido nucleico ao qual está operacionalmente ligado. Promotores exemplares podem conter cópias adicionais de um ou mais elementos reguladores específicos para aumentar adicionalmente a expressão e/ou alterar a expressão espacial e/ou a expressão temporal do referido ácido nucleico.

[184] Conforme usado na presente invenção, o termo “operacionalmente ligado a” significa posicionar um promotor em relação a um ácido nucleico de modo que a expressão do ácido nucleico seja controlada pelo promotor.

[185] Muitos vetores para expressão em células estão disponíveis. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, uma sequência que codifica uma proteína (por exemplo, derivada a partir da informação fornecida na presente invenção), um elemento potenciador, um promotor e uma sequência de terminação de transcrição. O técnico no assunto estará ciente das sequências adequadas para a expressão de uma proteína. Sequências de sinal exemplares incluem sinais de secreção procariótica (por exemplo, pelB, fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou enterotoxina estável ao calor II), sinais de secreção de levedura (por exemplo, líder de invertase, líder de fator α ou líder de fosfatase ácida) ou sinais de secreção de mamíferos (por exemplo, sinal herpes simplex gD).

[186] Promotores exemplares ativos em células de mamíferos incluem o promotor precoce imediato de citomegalovírus (CMV-IE), fator de alongamento humano 1- promotor (EF1), pequenos promotores de RNA nuclear (U1a e U1b), promotor da cadeia pesada da miosina, promotor do vírus Simian 40 (SV40), promotor do vírus do sarcoma de Rous (RSV), promotor tardio principal do adenovírus, promotor da β-actina; elemento regulador híbrido compreendendo um potenciador de CMV/promotor β-actina ou um promotor de imunoglobulina ou fragmento ativo deste. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamífero úteis são a linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão; células de rim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10); ou células de ovário de hamster chinês (CHO).

[187] Promotores típicos adequados para expressão em células de levedura, tais como, por exemplo, uma célula de levedura selecionada a partir do grupo compreendendo Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae e S. pombe, incluem, mas não estão limitados ao promotor ADH1, o promotor GAL1, o promotor GAL4, o promotor CUP1, o promotor PHO5, o promotor nmt, o promotor RPR1, ou o promotor TEF1.

[188] Os meios para introduzir o ácido nucleico isolado ou construto de expressão compreendendo o mesmo em uma célula para expressão são conhecidos pelos técnicos no assunto. A técnica usada para uma determinada célula depende das técnicas de sucesso conhecidas. Os meios para a introdução de DNA recombinante nas células incluem microinjeção, transfecção mediada por DEAE-dextran, transfecção mediada por lipossomas, tal como usando lipofectamina (Gibco, MD, EUA) e/ou cellfectin (Gibco, MD, EUA), absorção de DNA mediada por PEG, eletroporação e bombardeio de micropartículas, como usando tungstênio revestido com DNA ou partículas de ouro (Agracetus Inc., WI, EUA), entre outros.

[189] As células hospedeiras usadas para produzir a proteína podem ser cultivadas em uma variedade de meios, dependendo do tipo de célula usado. Os meios comercialmente disponíveis, tais como Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma), RPML-1640 (Sigma) e Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma) são adequados para a cultura de células de mamíferos. Os meios para a cultura de outros tipos de células discutidos na presente invenção são conhecidos na técnica.

Isolamento de Proteínas

[190] Os métodos para isolar uma proteína são conhecidos na técnica e/ou descritos na presente invenção.

[191] Quando um sítio de ligação ao antígeno é secretado para o meio de cultura, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão podem ser primeiro concentrados usando um filtro de concentração de proteína disponível comercialmente, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease, como PMSF, pode ser incluído em qualquer uma das etapas anteriores para inibir a proteólise e antibióticos podem ser incluídos para prevenir o crescimento de contaminantes adventícios. Alternativamente, ou adicionalmente, os sobrenadantes podem ser filtrados e/ou separados a partir das células que expressam a proteína, por exemplo, usando centrifugação contínua.

[192] O sítio de ligação ao antígeno preparado a partir das células pode ser purificado usando, por exemplo, troca iônica, cromatografia de hidroxiapatita, cromatografia de interação hidrofóbica, eletroforese em gel, diálise, cromatografia de afinidade (por exemplo, cromatografia de afinidade de proteína A ou cromatografia de proteína G), ou qualquer combinação do anterior. Estes métodos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em WO99/57134 ou Ed Harlow e David Lane (editores). Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,(1988).

[193] O técnico no assunto também estará ciente de que uma proteína pode ser modificada para incluir um marcador para facilitar a purificação ou detecção, por exemplo, de um marcador de poli-histidina, por exemplo, um marcador de hexa-histidina ou um marcador de hemaglutinina (HA) do vírus influenza, ou um marcador Vírus Símio 5 (V5), ou um marcador FLAG, ou um marcador de glutationa S-transferase (GST). A proteína resultante é então purificada usando métodos conhecidos na técnica, tais como purificação por afinidade. Por exemplo, uma proteína compreendendo um marcador hexa-his é purificada pelo contato de uma amostra compreendendo a proteína com ácido nitrilotriacético (Ni-NTA) que se liga especificamente a um marcador hexa-his imobilizada em um suporte sólido ou semissólido, lavando a amostra para remover a proteína não ligada e, subsequentemente, eludir a proteína ligada. Alternativamente, ou adicionalmente, um ligante ou anticorpo que se liga a um marcador é usado em um método de purificação por afinidade. Avaliação da Atividade de um Sítio de Ligação ao Antígeno Ligação a CXCR3 e Mutantes dos Mesmos

[194] Será evidente para o técnico no assunto a partir da revelação da presente invenção que os sítios de ligação ao antígeno descritos na presente invenção se ligam a CXCR3. Métodos para avaliar a ligação a uma proteína são conhecidos na técnica, por exemplo, conforme descrito em Scopes (In: Protein purification: principles and practice, Terceira Edição, Springer Verlag, 1994). Tal método geralmente envolve a imobilização do sítio de ligação ao antígeno e o contato com o antígeno marcado (CXCR3). Após a lavagem para remover a proteína ligada não específica, a quantidade de marcador e, como consequência, o antígeno ligado é detectado. Obviamente, o sítio de ligação ao antígeno pode ser marcado e o antígeno imobilizado. Ensaios do tipo panning também podem ser usados. Alternativamente, ou adicionalmente, podem ser usados ensaios de ressonância de plasmão de superfície.

[195] Opcionalmente, a constante de dissociação (Kd), constante de associação (Ka) e/ou constante de afinidade (KD) de um sítio de ligação ao antígeno imobilizado para CXCR3 ou um epítopo do mesmo é determinado. O “Kd” ou “Ka” ou “KD” para uma proteína de ligação a CXCR3 é, em um exemplo, medida por um ensaio de ligação de ligante CXCR3 radiomarcado ou marcado com fluorescência. No caso de um “Kd”, este ensaio equilibra o sítio de ligação ao antígeno com uma concentração mínima de CXCR3 marcado ou epítopo do mesmo na presença de uma série de titulação de CXCR3 não marcado. Após lavagem para remover CXCR3 não ligado ou seu epítopo, a quantidade de marcador é determinada, o que é indicativo do Kd da proteína.

[196] De acordo com outro exemplo, o Kd, Ka ou KD é medido usando ensaios de ressonância de plasmon de superfície, por exemplo, usando ressonância de plasmon de superfície BIAcore (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) com CXCR3 imobilizado ou uma região do mesmo ou sítio de ligação ao antígeno imobilizado. Determinando a atividade inibitória

[197] Em alguns exemplos da presente invenção, uma proteína é capaz de inibir a atividade de CXCR3.

[198] Vários ensaios são conhecidos na técnica para avaliar a capacidade de uma proteína para inibir ou reduzir a sinalização de um ligante através de um receptor que leva a uma resposta funcional.

[199] Em um exemplo, o sítio de ligação ao antígeno inibe a migração de células imunes (por exemplo, células de neutrófilos) que expressam CXCR3 que são cultivadas na presença de um ligante CXCR3 (por exemplo, MIG, IP-10 e I- TAC). Os métodos para avaliar a migração são conhecidos na técnica e descritos na presente invenção. Um sítio de ligação ao antígeno que inibe a migração em comparação com o nível observado na ausência do sítio de ligação ao antígeno é considerado inibidor ou reduz a atividade de CXCR3, especificamente a sinalização e migração mediada por CXCR3. Outros ensaios para determinar a atividade inibidora dos anticorpos anti-CXCR3 incluem ensaio de fluxo de cálcio, ensaio de ligação de radioligante, ensaio de cAMP e ensaio de recrutamento de beta-arrestina. Qualquer um dos ensaios descritos na presente invenção pode incluir um ou mais ligantes CXCR3, incluindo MIG, IP-10 e I-TAC. Condições a serem Tratadas

[200] Os sítios de ligação ao antígeno da presente invenção são úteis no tratamento ou prevenção de qualquer condição associada ou causada pela presença ou superexpressão de CXCR3.

[201] Os sítios de ligação ao antígeno da presente invenção são úteis no tratamento ou prevenção de qualquer condição associada, ou causada por células Th1.

[202] Os sítios de ligação ao antígeno da presente invenção são úteis no tratamento ou prevenção de uma condição associada ou causada por inflamação aguda ou crônica, como fibrose, doença hepática gordurosa, incluindo NASH e rejeição de transplante (doença do enxerto versus hospedeiro, GVHD). Os sítios de ligação ao antígeno da invenção encontram, preferencialmente, aplicação no tratamento ou prevenção de condições inflamatórias autoimunes.

[203] Em modalidades ainda adicionais, o sítio de ligação ao antígeno da invenção pode encontrar aplicação na redução da fibrose associada a uma doença autoimune caracterizada por inflamação.

[204] “Fibrose”, “Doença fibrótica” ou “Doença fibroproliferativa" significa a formação de tecido conjuntivo fibroso em excesso em um processo reparador após lesão. A cicatriz é o resultado da fibrose contínua que oblitera os órgãos afetados ou a arquitetura dos tecidos. Como resultado de processos reparadores anormais, que não eliminam o tecido cicatricial formado, a fibrose progride adicionalmente. A fibrose pode ser encontrada em vários tecidos, incluindo o coração, os pulmões, o fígado, a pele, os vasos sanguíneos e os rins. Exemplos de fibrose são descritos na presente invenção e incluem fibrose pulmonar, cirrose hepática, esclerose sistêmica, doença renal progressiva e fibrose cardíaca associada a várias doenças cardiovasculares.

[205] Um indivíduo pode ser identificado como tendo fibrose determinando se um indivíduo tem disfunção de órgão, cicatriz, alteração do equilíbrio da matriz extracelular normal, aumento na deposição de colágeno, fração de volume de colágeno aumentada, diferenciação de fibroblastos em miofibroblastos, redução no nível de metaloproteinases da matriz e aumento no nível de inibidores de tecido de metaloproteinases da matriz, níveis aumentados de propeptídeo N-terminal ou C-terminal de procolágeno tipo I (PINP ou PICP) e níveis diminuídos de telopeptídeo C-terminal de colágeno tipo I (CTP ou CITP), aumento da deposição de colágeno e comprometimento da função cardíaca medida por várias técnicas de imagem não invasivas, comprometimento da função renal medida pelo aumento da proteinúria e albuminureia, diminuição da taxa de filtração glomerular, duplicação dos níveis de creatinina plasmática.

[206] De acordo com uma modalidade preferencial da invenção, a fibrose hepática é resultante de uma doença hepática crônica, infecção pelo vírus da hepatite B, infecção pelo vírus da hepatite C, infecção pelo vírus da hepatite D, esquistossomose, doença hepática alcoólica ou esteatohepatite não alcoólica, doença hepática gordurosa não alcoólica, obesidade, diabetes, desnutrição protéica, doença arterial coronariana, hepatite autoimune, fibrose cística, deficiência de alfa-1-antitripsina, cirrose biliar primária, reação a drogas e exposição a toxinas.

[207] O termo “fibrose hepática” significa a formação ou desenvolvimento de tecido conjuntivo fibroso em excesso (fibrose) no fígado, resultando desse modo no desenvolvimento de tecido cicatricial (fibrótico). O tecido cicatrizado substitui o tecido saudável pelo processo de fibrose e leva à cirrose hepática subsequente. A fibrose hepática pode estar associada à esteatohepatite não alcoólica (NASH).

[208] A fibrose hepática pode incluir, mas não está limitada a, cirrose e condições associadas, como hepatite viral crônica, doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), esteatohepatite alcoólica (ASH), esteatohepatite não alcoólica (NASH), cirrose biliar primária (PBC), cirrose biliar, hepatite autoimune). A fibrose pulmonar pode incluir fibrose pulmonar idiopática (FPI) ou alveolite fibrosante criptogênica, pneumonia intersticial fibrosante crônica, doença pulmonar intersticial (DPI) e doença pulmonar parenquimatosa difusa (DPLD)). Fibrose cardíaca, insuficiência cardíaca congestiva, cardiomiopatia, defeitos da função cardíaca pós-infarto do miocárdio; doença vascular periférica; artrite reumatóide; glaucoma; degeneração macular relacionada à idade (AMD úmida e AMD seca); enfisema, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC); esclerose múltipla; e a asma crônica também pode ser prevenida, tratada ou melhorada com composições, métodos ou usos conforme descritos na presente invenção. Doença hepática gordurosa e NASH

[209] A presente invenção também se refere a métodos para prevenir o início, prevenir a progressão de, ou tratar a doença hepática gordurosa em um paciente que está em risco de desenvolver doença hepática gordurosa ou que apresenta sintomas de doença hepática gordurosa.

[210] Em certas modalidades preferenciais, a presente invenção fornece métodos para prevenir o início, prevenir a progressão de, ou tratar NASH em um paciente que está em risco de desenvolver NASH ou que apresenta sintomas de NASH.

[211] A doença hepática gordurosa que se desenvolve na ausência de abuso de álcool é cada vez mais reconhecida como um grande problema para a saúde, em particular se um componente inflamatório estiver envolvido, como a esteatohepatite não alcoólica (NASH). Estimativas com base em estudos de imagem e biópsia sugerem que cerca de 20% a 30% dos adultos nos Estados

Unidos e em outros países ocidentais têm acúmulo excessivo de gordura no fígado. Estima-se que cerca de 10% desses pacientes, ou totalmente 2% a 3% dos adultos, atendam aos critérios diagnósticos atuais para NASH. A lesão hepática sofrida leva a fibrose progressiva e cirrose em cerca de 30% dos pacientes com NASH. Os critérios diagnósticos para NASH continuam a evoluir e dependem dos achados histológicos de esteatose, lesão hepatocelular (balonismo, corpos de Mallory) e o padrão de fibrose.

[212] Conforme usado na presente invenção, NAFLD refere-se a doença hepática gordurosa não alcoólica. A NAFLD, considerada uma doença sem risco de vida, deve ser diferenciada da NASH, que é uma forma mais grave de NAFLD e está associada ao aumento da mortalidade. Os termos “doença hepática gordurosa não alcoólica” ou “NAFLD”, “esteatohepatite não alcoólica” ou “NASH” e “Esteatose Simples" são cada um usado no sentido que é atualmente admitido pela comunidade científica. Em geral, NAFLD existe como um espectro histológico de alterações. Todos os estágios da NAFLD têm em comum o acúmulo de gordura nas células do fígado (esteatose). A esteatose simples refere-se à esteatose hepática na ausência de inflamação significativa e dano hepatocelular, enquanto NASH demonstra inflamação e dano hepatocelular e às vezes fibrose.

[213] O técnico no assunto estará familiarizado com os métodos para determinar se um paciente tem, ou está em risco de desenvolver esteatohepatite não alcoólica (NASH). Em particular, o técnico no assunto estará familiarizado com métodos para determinar se um paciente tem sintomas ou sinais de doença hepática gordurosa não alcoólica, incluindo se o paciente tem, ou está em risco de qualquer um dos subtipos de doença hepática gordurosa, como esteatose, NASH ou NAFDL e, em particular, para a diferenciação de NASH com risco de vida da NAFLD menos grave.

[214] O termo “doença hepática gordurosa” é bem conhecido na técnica.

Preferencialmente, o termo refere-se a uma deficiência do fígado. Preferencialmente, a referida deficiência é o resultado de um excesso de triacilglicerídeo que se acumula no fígado e forma grandes vacúolos. Os sintomas que acompanham a doença hepática gordurosa são bem conhecidos em livros- texto de medicina, como Stedman's ou Pschyrembel. A doença hepática gordurosa pode resultar do abuso de álcool, diabetes mellitus, defeitos nutricionais e dietas erradas, toxicidade de fármacos ou predisposição genética. A doença hepática gordurosa utilizada de acordo com a presente invenção também inclui as suas formas mais graves e, em particular, esteatose, NASH ou NAFDL. Os sintomas que acompanham essas doenças também são bem conhecidos pelos médicos e são descritos em detalhes em livros-texto padrão de medicina.

[215] A biópsia hepática tem permanecido o critério padrão ou “padrão ouro” na avaliação da etiologia e extensão da doença hepática, como NAFLD e NASH. A biópsia hepática percutânea é o método preferencial para determinar NAFLD e diferenciar NASH de NAFLD. Outros métodos de biópsia são geralmente ainda mais invasivos e incluem biópsia hepática transvenosa e laparoscópica. A American Gastroenterological Association publicou recomendações detalhadas sobre como classificar NAFLD compreendendo NASH em graus de esteatose macrovescicular, graus de atividade necroinflamatória e estágios de fibrose (American Gastroenterological Association 2002, Gastroenterology 123: 1705- 25; Brunt 1999, Am J Gastroenterol. 94: 2467-74, Brunt 2010, Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 7:195-203).

[216] Embora a esteatose simples pareça ser uma condição relativamente benigna, pode progredir para NASH com o tempo. Conseqüentemente, uma pessoa com risco de NASH pode ser uma pessoa com diagnóstico de esteatose simples. Além de sua associação com complicações cardiovasculares, a NAFLD pode causar morbidade e mortalidade relacionadas ao fígado. O risco de desenvolver cirrose é maior na presença de NASH, o que é mais provável na presença das seguintes características: diabetes mellitus tipo 2 (T2DM) obesidade (índice de massa corporal [BMI] >30 kg/m2) idade superior a 50 anos aminotransferases séricas (ALT ou AST) mais de duas vezes o limite superior do normal.

[217] Consequentemente, uma pessoa pode ser considerada em risco de NASH se for diagnosticada com NAFLD e tiver uma ou mais das características acima. Um diagnóstico definitivo de NAFLD depende de três fatores: 1) evidência de infiltração gordurosa a partir de qualquer imagem (ultrassom, ressonância magnética [MRI]) ou histologia (biópsia hepática) 2) exclusão de consumo significativo de álcool 3) exclusão de outras causas de esteatose hepática (por exemplo, medicações, cirurgia, distúrbios metabólicos).

[218] Além do acima, sinais de complicações cirróticas também podem ser considerados, incluindo sinais de hipertensão portal (esplenomegalia, aumento do tamanho da veia portal, varizes) ou outras complicações como HCC, trombose da veia portal ou ascite. O risco de fibrose e doença hepática progressiva na NAFLD aumenta com a gravidade da resistência à insulina. O número de características da síndrome metabólica (obesidade, hiperlipidemia combinada, diabetes mellitus (tipo II) e pressão alta) pode ser usado para estimar o risco de resistência à insulina. A presença de três ou mais características da síndrome, especialmente se incluir adiposidade central e diabetes mellitus tipo 2 (T2DM), são preditivas da presença de NASH, em vez de simples esteatose. Além disso, o histórico familiar desempenha um papel: um paciente com parente de primeiro grau com T2DM tem 90% de chance de desenvolver T2DM e, portanto, NASH. A adiposidade central pode ser avaliada usando a circunferência da cintura medida no ponto mais estreito entre a costela inferior e a crista ilíaca no final da expiração com o paciente em pé.

[219] Ferramentas não invasivas para estimar o grau de fibrose incluem elastografia transitória (FibroScan®), impulso de força de radiação acústica (ARFI) e algoritmos de biomarcadores não invasivos, como NAFLD Fibrosis Score, FibroTest e Hepascore.

[220] O técnico no assunto também estará familiarizado com métodos para determinar se um paciente foi tratado com sucesso de modo a prevenir a progressão adicional de NASH, reversão dos sintomas de NASH ou prevenção do desenvolvimento de NASH em um paciente em risco. O sucesso do tratamento ou prevenção pode ser determinado pela medição de uma melhoria ou redução na taxa de progressão ou agravamento de qualquer um ou mais dos sintomas descritos acima associados com NASH. Rejeição de transplante (Doença enxerto versus hospedeiro)

[221] Os métodos da presente invenção também têm utilidade no tratamento ou prevenção do início ou progressão da GVHD ou na redução da gravidade da GVHD em um paciente que necessita de transplante de células.

[222] A GVHD é uma doença inflamatória iniciada por células T no enxerto do doador que reconhecem a histocompatibilidade e outros antígenos do tecido do hospedeiro e a GVHD é mediada por uma variedade de células efetoras e citocinas inflamatórias. A GVHD se apresenta nas formas aguda e crônica. Os órgãos sintomáticos mais comuns são a pele, o fígado e o trato gastrointestinal, incluindo a cavidade oral e as regiões orofaríngeas. A GVHD pode envolver outros órgãos, como o pulmão.

[223] O tratamento da GVHD geralmente tem sucesso de apenas 50-75%;

o restante dos pacientes geralmente não sobrevive. O risco e a gravidade dessa condição imunomediada estão diretamente relacionados ao grau de incompatibilidade entre um hospedeiro e o doador de células hematopoiéticas. Por exemplo, a GVHD se desenvolve em até 30% dos receptores de medula de irmão compatível com antígeno leucocitário humano (HLA), em até 60% dos receptores de medula de doador não aparentado compatível com HLA e em uma porcentagem maior de receptores de medula incompatível com HLA. Os pacientes com GVHD intestinal leve apresentam anorexia, náusea, vômito, dor abdominal e diarreia, enquanto os pacientes com GVDH grave são incapacitados por esses sintomas. Se não for tratada, os sintomas de GVHD intestinal persistem e frequentemente progridem; remissões espontâneas são incomuns. Em sua forma mais grave, a GVHD leva à necrose e esfoliação da maioria das células epiteliais da mucosa intestinal, uma condição frequentemente fatal. Os sintomas de GVHD aguda geralmente se manifestam dentro de 100 dias após o transplante. Os sintomas da GVHD crônica geralmente se manifestam um pouco mais tarde, até três anos após o HCT alogênico, e geralmente são precedidos por um histórico de GVHD aguda.

[224] Dois tipos distintos de GVHD são clinicamente reconhecidos, agudo e crônico. A forma aguda da doença geralmente se desenvolve nos primeiros três meses após o transplante. A taxa de incidência de GVHD aguda é estimada em 30-50% entre os pacientes que receberam transplante de doadores irmãos com HLA idêntico e 50-70% em pacientes que receberam transplantes não aparentados com HLA compatível. A GVHD aguda grave (grau III-IV) ocorre em até 20% dos receptores de doadores aparentados e em até 35% dos doadores não aparentados. A GVHD aguda grave carrega um prognóstico ruim, com 25% de sobrevida em longo prazo para o grau III e 5% para o grau IV.

[225] O técnico no assunto será capaz de identificar um paciente com necessidade de tratamento ou prevenção de GVHD, incluindo a identificação de grupos de pacientes com maior probabilidade de receber transplantes de células e pacientes em risco agudo ou apresentando sinais de GVHD crônica. Por exemplo, GVHD crônica ocorre em até 60% dos pacientes que recebem enxertos de medula de irmão com HLA idêntico e 70% dos pacientes que recebem enxertos de medula de doadores alternativos que sobrevivem além do dia 100. Os sintomas de GVHD crônica geralmente se manifestam entre 3 meses e 2 anos após o transplante alogênico, e cerca de dois terços se desenvolvem nos primeiros 12 meses. Ao todo, apenas menos de 20% dos pacientes transplantados não desenvolvem GVHD aguda ou crônica. Composições

[226] Em alguns exemplos, um sítio de ligação ao antígeno, conforme descrito na presente invenção, pode ser administrado por via oral, parenteral, por inalação de spray, adsorção, absorção, topicamente, retal, nasal, bucal, vaginal, intraventricular, por meio de um reservatório implantado em formulações de dosagem contendo carreadores não tóxicos convencionais farmaceuticamente aceitáveis, ou por qualquer outra forma de dosagem conveniente. O termo “parenteral”, tal como aqui usado, inclui injeção subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intraesternal e intracraniana ou técnicas de infusão.

[227] Métodos para preparar um sítio de ligação ao antígeno em uma forma adequada para administração a um indivíduo (por exemplo, uma composição farmacêutica) são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, métodos conforme descrito em Remington's Pharmaceutical Sciences (18ª ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990) e US Pharmacopeia: National Formulary (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1984).

[228] As composições farmacêuticas desta invenção são particularmente úteis para administração parenteral, tal como administração intravenosa ou administração em uma cavidade corporal ou lúmen de um órgão ou articulação. As composições para administração compreenderão comumente uma solução de um sítio de ligação ao antígeno dissolvido em um carreador farmaceuticamente aceitável, por exemplo, um carreador aquoso. Uma variedade de carreadores aquosos pode ser usada, por exemplo, solução salina tamponada e semelhantes. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme necessário para aproximar as condições fisiológicas, tais como ajuste de pH e agentes tamponantes, agentes de ajuste de toxicidade e semelhantes, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio e semelhantes. A concentração de um sítio de ligação ao antígeno da presente invenção nestas formulações pode variar amplamente e será selecionada principalmente com base nos volumes de fluido, viscosidades, peso corporal e semelhantes de acordo com o modo particular de administração selecionado e as necessidades do paciente. Os carreadores exemplares incluem água, solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose e albumina de soro humano a 5%. Também podem ser usados veículos não aquosos, como óleos mistos e oleato de etilo. Os lipossomos também podem ser usados como carreadores. Os veículos podem conter pequenas quantidades de aditivos que aumentam a isotonicidade e a estabilidade química, por exemplo, tampões e conservantes.

[229] Após a formulação, um sítio de ligação ao antígeno, conforme descrito na presente invenção, será administrado de uma maneira compatível com a formulação de dosagem e em uma quantidade terapeuticamente/profilaticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, tais como os tipos de soluções injetáveis descritas acima, mas outras formas farmaceuticamente aceitáveis também são contempladas, por exemplo, comprimidos, pílulas, cápsulas ou outros sólidos para administração oral, supositórios, pessários, soluções nasais ou sprays, aerossóis, inalantes, formas lipossomais e semelhantes. Também podem ser utilizadas cápsulas ou composições farmacêuticas de “liberação lenta”. As formulações de liberação lenta são geralmente modificadas para fornecer um nível de fármaco constante durante um período prolongado e podem ser usadas para oferecer um sítio de ligação ao antígeno da presente invenção.

[230] WO2002/080967 descreve composições e métodos para administrar composições aerossolizadas compreendendo anticorpos para tratar, por exemplo, asma, que também são adequados para a administração de um sítio de ligação ao antígeno da presente invenção. Dosagens e Temporização de Administração

[231] As dosagens adequadas de um sítio de ligação ao antígeno da presente invenção variarão dependendo do sítio de ligação ao antígeno específico, a condição a ser tratada e/ou o indivíduo a ser tratado. Está dentro da capacidade de um médico experiente determinar uma dosagem adequada, por exemplo, começando com uma dosagem subótima e modificando incrementalmente a dosagem para determinar uma dosagem ótima ou útil. Alternativamente, para determinar uma dosagem apropriada para o tratamento/profilaxia, os dados dos ensaios de cultura de células ou estudos em animais são usados, em que uma dose adequada está dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem o ED50 do composto ativo com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro deste intervalo dependendo da forma de dosagem empregada e a via de administração utilizada. Uma dose terapeuticamente/profilaticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma faixa de concentração plasmática circulante que inclui o IC50 (isto é, a concentração ou quantidade do composto que atinge metade da inibição máxima dos sintomas) conforme determinado em cultura de células. Tais informações podem ser usadas para determinar com mais precisão as doses úteis em humanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alta eficiência.

[232] Em alguns exemplos, um método da presente invenção compreende a administração de uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente eficaz de uma proteína descrita na presente invenção.

[233] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” é a quantidade que, quando administrada a um indivíduo em necessidade de tratamento, melhora o prognóstico e/ou estado do indivíduo e/ou que reduz ou inibe um ou mais sintomas de uma condição clínica descrita na presente invenção para um nível que está abaixo do observado e aceito como clinicamente diagnóstico ou clinicamente característico dessa condição. A quantidade a ser administrada a um indivíduo dependerá das características particulares da condição a ser tratada, do tipo e estágio da condição a ser tratada, do modo de administração e das características do indivíduo, tais como saúde geral, outras doenças, idade, sexo, genótipo e peso corporal. Um técnico no assunto será capaz de determinar as dosagens apropriadas dependendo destes e de outros fatores. Consequentemente, este termo não deve ser interpretado como limitando a presente invenção a uma quantidade específica, por exemplo, peso ou quantidade de proteína(s), em vez disso, a presente invenção abrange qualquer quantidade de sítio(s) de ligação ao antígeno suficiente para atingir o resultado declarado em um indivíduo.

[234] Conforme usado na presente invenção, o termo “quantidade profilaticamente eficaz” deve ser entendido como uma quantidade suficiente de uma proteína para prevenir ou inibir ou atrasar o início de um ou mais sintomas detectáveis de uma condição clínica. O técnico no assunto estará ciente de que tal quantidade irá variar dependendo, por exemplo, de sítio(s) de ligação ao antígeno específico administrado e/ou o indivíduo particular e/ou o tipo ou gravidade ou nível da condição e/ou predisposição (genética ou de outra forma) para a condição. Consequentemente, este termo não deve ser interpretado como limitando a presente invenção a uma quantidade específica, por exemplo, peso ou quantidade de sítio(s) de ligação ao antígeno, em vez disso, a presente invenção abrange qualquer quantidade de sítio(s) de ligação ao antígeno suficiente para atingir o resultado declarado em um indivíduo. Kits

[235] A presente invenção compreende adicionalmente um kit compreendendo um ou mais dos seguintes: (i) um sítio de ligação ao antígeno conforme descrito na presente invenção ou construto(s) de expressão que codifica o mesmo; (ii) uma célula da invenção; (iii) um complexo da invenção; ou (iii) uma composição farmacêutica da invenção.

[236] No caso de um kit para detecção de CXCR3, o kit pode compreender adicionalmente um meio de detecção, por exemplo, ligado a um sítio de ligação ao antígeno da invenção.

[237] No caso de um kit para uso terapêutico/profilático, o kit pode compreender adicionalmente um carreador farmaceuticamente aceitável.

[238] Opcionalmente, um kit da invenção é embalado com instruções para uso em um método descrito na presente invenção de acordo com qualquer exemplo. Tabela 1: Resumo das sequências de aminoácidos e nucleotídeos

ID de SEQ ID Região Aminoácido ou sequência de nucleotídeo Anticorpo NO: hIgG1 Região Fc 1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK

DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEL TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ

QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (em negrito CH1, em itálico região de dobradiça, sublinhado CH2 e sem formatação CH3)) 3SFc Região Fc 2 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK

DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEL TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ

QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 3MFc Região Fc 3 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK

DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEL TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ

QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK mCXCR3 DNA 4 atgtaccttgaggttagtgaacgtcaagtgctagatgcctcggactttgc ctttcttctggaaaacagca cctctccctacgattatggg gaaaacgaga gcgacttctctgactccccgccctgcccacaggatttcagcctgaacttt gacagaaccttcctgccagccctctacagcctcctcttcttgctggggct gctaggcaatggggcggtggctgctgtgctactgagtcagcgcactgccc tgagcagcacggacaccttcctgctccacctggctgtagccgatgttctg ctggtgttaactcttccattgtgggcagtggatgctgctgtccagtgggt tttcggccctggcctctgcaaagtggcaggcgccttgttcaacatcaact tctatgcaggggccttcctgctggcttgtataagcttcgacagatatctg agcatagtgcacgccacccagatctaccgcagggacccccgggtacgtgt agccctcacctgcatagttgtatggggtctctgtctgctctttgccctcc cagatttcatctacctatcagccaactacgatcagcgcctcaatgccacc cattgccagtacaacttcccacaggtgggtcgcactgctc tgcgtgtact gcagctagtggctggtttcctgctgccccttctggtcatggcctactgct atgcccatatcctagctgttctgctggtctccagaggccagaggcgtttt cgagctatgaggctagtggtagtggtggtggcagcctttgctgtctgctg gaccccctatcacctggtggtgctagtggatatcctcatggatgtgggag ttttggcccgcaactgtggtcgagaaagccacgtggatgtggccaagtca gtcacctcgggcatggggtacatgcactgctgcctcaatccgctgctcta tgcctttgtgggagtgaagttcagagagcaaatgtggatgttgttcacgc gcctgggccgctctgaccagagagggccccagcggcagccgtcatcttca cggagagaatcatcctggtctgagacaactgaggcctcctacctgggcttg mCXCR3 Proteína 5 MYLEVSERQVLDASDFAFLL

ENSTSPYDYGENESDFSDSP PCPQDFSLNFDRTFLPALYS LLFLLGLLGNGAVAAVLLSQ RTALSSTDTFLLHLAVADVL LVLTLPLWAVDAAVQWVFGP GLCKVAGALFNINFYAGAFL LACISFDRYLSIVHATQIYR RDPRVRVALTCIVVWGLCLL FALPDFIYLSANYDQRLNAT HCQYNFPQVGRTALRVLQLV AGFLLPLLVMAYCYAHILAV LLVSRGQRRFRAMRLVVVVV AAFAVCWTPYHLVVLVDILM DVGVLARNCGRESHVDVAKS VTSGMGYMHCCLNPLLYAFV GVKFREQMWMLFTRLGRSDQ RGPQRQPSSSRRESSWSETT

EASYLGL hCXCR3 DNA 6 ccaaccacaagcaccaaagcagaggggcaggcagcacaccacccagcagc cagagcaccagcccagccatggtccttgaggtgagtgaccaccaagtgctaa atgacgccgaggttgccgccctcctggagaacttcagctcttcctatgactatg gagaaaacgagagtgactcgtgctgtacctccccgccctgcccacaggactt cagcctgaacttcgaccgggccttcctgccagccctctacagcctcctctttct gctggggctgctgggcaacggcgcggtggcagccgtgctgctgagccggcg gacagccctgagcagcaccgacaccttcctgctccacctagctgtagcagac acgctgctggtgctgacactgccgctctgggcagtggacgctgccgtccagtg ggtctttggctctggcctctgcaaagtggcaggtgccctcttcaacatcaactt ctacgcaggagccctcctgctggcctgcatcagctttgaccgctacctgaaca tagttcatgccacccagctctaccgccgggggcccccggcccgcgtgaccctc acctgcctggctgtctgggggctctgcctgcttttcgccctcccagacttcatct tcctgtcggcccaccacgacgagcgcctcaacgccacccactgccaatacaa cttcccacaggtgggccgcacggctctgcgggtgctgcagctggtggctggct ttctgctgcccctgctggtcatggcctactgctatgcccacatcctggccgtgct gctggtttccaggggccagcggcgcctgcgggccatgcggctggtggtggtg gtcgtggtggcctttgccctctgctggaccccctatcacctggtggtgctggtg gacatcctcatggacctgggcgctttggcccgcaactgtggccgagaaagca gggtagacgtggccaagtcggtcacctcaggcctgggctacatgcactgctg cctcaacccgctgctctatgcctttgtaggggtcaagttccgggagcggatgt ggatgctgctcttgcgcctgggctgccccaaccagagagggctccagaggca gccatcgtcttcccgccgggattcatcctggtctgagacctcagaggcctccta ctcgggcttgtgaggccggaatccgggctcccctttcgcccacagtctgacttc cccgcattccaggctcctccctccctctgccggctctggctctccccaatatcct cgctcccgggactcactggcagccccagcaccaccaggtctcccgggaagcc accctcccagctctgaggactgcaccattgctgctccttagctgccaagcccc atcctgccgcccgaggtggctgcctggagccccactgcccttctcatttggaa actaaaacttcatcttccccaagtgcggggagtacaaggcatggcgtagagg gtgctgccccatgaagccacagcccaggcctccagctcagcagtgactgtgg ccatggtccccaagacctctatatttgctcttttatttttatgtctaaaatcctgc ttaaaacttttcaataaacaagatcgtcaggaccaaaaaaaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa hCXCR3 Proteína 7 MVLEVSDHQVLNDAEVAALL

ENFSSSYDYGENESDSCCTS PPCPQDFSLNFDRAFLPALY SLLFLLGLLGNGAVAAVLLS RRTALSSTDTFLLHLAVADT LLVLTLPLWAVDAAVQWVFG SGLCKVAGALFNINFYAGAL LLACISFDRYLNIVHATQLY RRGPPARVTLTCLAVWGLCL LFALPDFIFLSAHHDERLNA THCQYNFPQVGRTALRVLQL VAGFLLPLLVMAYCYAHILA VLLVSRGQRRLRAMRLVVVV VVAFALCWTPYHLVVLVDIL MDLGALARNCGRESRVDVAK SVTSGLGYMHCCLNPLLYAF VGVKFRERMWMLLLRLGCPN QRGLQRQPSSSRRDSSWSET

SEASYSGL Peptídeo 1 8 MVLEVSDHQVLNDAEVAALL

ENF Peptídeo 2 9 NDAEVAALLENFSSSYDYGE

NE Peptídeo 3 10 FSSSYDYGENESDSCCTSPP

CP Peptídeo 4 11 ENESDSCCTSPPCPQDFSLN Exemplos Exemplo 1

[239] Este exemplo descreve um método para a produção de anticorpos CXCR3.

[240] Os anticorpos monoclonais reativos com CXCR3 humano (hCXCR3) são gerados imunizando camundongos C57BL/6 com 2 x 107 células transfectadas L1.2/hCXCR3 estimuladas 20 horas antes da coleta com ácido butírico 5 mM e emulsionadas em Adjuvante Completo de Freund (1ª imunização intraperitoneal) ou Adjuvante Incompleto de Freund (2ª - 6ª imunizações intraperitoneal), para um total de cinco a seis vezes em intervalos de 2 semanas. A imunização final é injetada por via intravenosa em PBS. Quatro dias depois, o baço é removido e as células fundidas com a linha de células SP2/0 usando métodos padrão. Os hibridomas são cultivados em DMEM (Gibco/lnvitrogen) contendo 10% de Fetalclone (HyClone), suplemento de 1x HAT (Sigma Aldrich) mais IL-6 de camundongo. Após 10-14 dias, o sobrenadante da cultura de crescimento é retirado para a triagem inicial.

[241] Os anticorpos monoclonais reativos com CXCR3 são identificados usando células L1.2 transfectadas com CXCR3 humano e células L1.2 não transfectadas ou células L1.2 transfectadas com receptores não relacionados ou próximos, como CXCR1, CXCR2 ou C5aR usando coloração imunofluorescente e análise usando um FACSCalibur (BD Biosciences). A coloração de células com anticorpo monoclonal é desempenhada usando procedimentos padrão, conforme descrito anteriormente (Lee et al., 2006, Nat. Biotech. 24:1279-1284).

[242] A produção de anticorpos envolveu o crescimento de hibridomas em frascos de cultura de tecidos e a colheita do meio de cultura. Para alguns experimentos, a concentração de anticorpo no sobrenadante da cultura pode ser suficiente para prosseguir sem purificação adicional. A produção de anticorpos selecionados é aumentada e os anticorpos monoclonais são purificados por cromatografia em proteína G, concentrados e trocados por tampão em PBS. A concentração do anticorpo monoclonal é determinada usando um ELISA de IgG total.

[243] Transfectantes L1.2 que expressam níveis elevados de hCXCR3 são usados para imunizar camundongos, e os anticorpos monoclonais são inicialmente identificados por meio de citometria de fluxo que reagiu com células L1.2 transfectadas com hCXCR3. Para garantir a clonalidade, os hibridomas selecionados foram subclonados usando plaqueamento de diluição em uma placa de 384 poços. A especificidade da reatividade cruzada dos subclones é confirmada por citometria de fluxo com transfectantes L1.2/hCXCR3 e células L1.2 não transfectadas. Exemplo 2

[244] Este Exemplo descreve um método para determinar a especificidade de ligação ao receptor de anticorpos CXCR3.

[245] Para avaliar a reatividade dos mAbs contra as células transfectadas, são utilizadas a coloração por imunofluorescência indireta e citometria de fluxo.

As células são lavadas uma vez com PBS e ressuspensas em 100 μL de PBS contendo 2% (p/V) de BSA e 0,1% (p/V) de azida de sódio (tampão de coloração) e anticorpo purificado. Após 30 min a 4°C, as células são lavadas duas vezes com tampão de coloração e ressuspensas em 50 μL de IgG anti-humano conjugado com PE (Jackson ImmunoResearch Laboratories) diluído 1:500 em tampão de coloração para a detecção de mAbs humanizados ou 50 μL de IgG anti- camundongo conjugado com PE (Jackson ImmunoResearch Laboratories) para a detecção de mAbs de camundongo. Após incubação por 20 min a 4°C, as células são lavadas duas vezes com tampão de coloração e analisadas em citômetro de fluxo LSRII. A coloração de 7-AAD é usada para excluir células mortas. Exemplo 3 Este Exemplo descreve um método para o mapeamento de epítopos de anticorpos CXCR3.

[246] Os estudos de mapeamento de epítopos são realizados para determinar a região dentro dCXCR3 que é reconhecida pelo mAb anti-CXCR3. Inicialmente, os peptídeos biotinilados correspondentes à região N-terminal e as primeira, segunda e terceira alças extracelulares de CXCR3 são usadas em um ELISA.

[247] Peptídeos biotinilados sobrepostos abrangendo toda a região N- terminal dCXCR3 humano são então sintetizados e usados em estudos de mapeamento de epítopos mais definidos. Resumidamente, as placas de múltiplos poços são revestidas com estreptavidina e lavadas antes dos peptídeos biotinilados serem adicionados a poços separados e incubados para facilitar a ligação dos peptídeos à placa. Diferentes anticorpos anti-mCXCR3 são testados em paralelo com mAb recentemente desenvolvido, pela adição dos respectivos anticorpos aos poços da placa e pela incubação da placa. Um controle de isotipo e tampão somente são incluídos como controles negativos. Após a lavagem, os anticorpos conjugados apropriados são adicionados e as placas são incubadas. As placas são lavadas novamente e a ligação dos anticorpos aos peptídeos imobilizados é visualizada. Exemplo 4 Este exemplo descreve um método para medição da inibição da migração de células T por anticorpos anti-CXCR3.

[248] As células T CD4+ humanas são centrifugadas e lavadas em meio de migração (MM=RPMI 1640, 0,5% BSA) e ressuspensas em 107 células/mL. Insertos de cultura de tecidos (Becton Dickinson & Co., Mountain View, Calif.) são colocadas em cada um dos poços de placas de cultura de tecidos de 24 poços, formando uma câmara superior e inferior separadas por uma membrana de polietileno tereftalato com poros de 3 mm de diâmetro. Ligante quimiotáticCXCR3, CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP-10) ou CXCL11 (I-TAC), (diluído em meio de ensaio) é adicionado a 600 μL de meio de ensaio nas placas de cultura de tecido de 24 poços. Um milhão de células em 100 μL são pré-incubadas por 30 minutos com os anticorpos. Os mAb purificados são adicionados à câmara superior nos poços e as células podem migrar para a câmara inferior em uma incubadora de 5% de CO2, 37°C, por 4 h. Os insertos são removidos após a migração e as células são contadas pelo citômetro LSRII (BD Biosciences). As contagens relativas de células são obtidas adquirindo eventos por um período de tempo definido de 30 segundos. Exemplo 5

[249] Este exemplo descreve o uso de um anticorpo anti-CXCR3 de depleção para tratar NASH. Dieta MCD para induzir NASH

[250] Camundongos C57/BL6 foram alimentados com dieta controle ou MCD por 5 semanas. A dieta MCD é pobre em colina e metionina e é usada para modelar a indução e progressão de NASH. A dieta MCD foi conforme descrita no estado da técnica (vide por exemplo Machado et al., 2015, PLoS One; 10 (5): e0127991). Tratamento de anticorpos

[251] Após 5 semanas, os camundongos foram tratados com um anticorpo de controle de isotipo ou um anticorpo anti-CXCR3 de depleção. Histopatologia

[252] O tecido do fígado foi processado e corado usando procedimentos padrão. A coloração com hemolisina e eosina foi usada para visualizar depósitos de gordura. A coloração com picrosirius red foi usada para visualizar os depósitos de colágeno (e assim determinar o grau de fibrose).

[253] A esteatose foi pontuada e a gravidade foi classificada, com base na porcentagem da área total afetada, nas seguintes categorias: 0 (<5%), 1 (5–33%), 2 (34–66%) e 3 (> 66%).

[254] A inflamação é avaliada contando o número de focos inflamatórios por campo usando uma ampliação de 100 x. Medição de células NKT e células T CD8 intra-hepáticas Medição de células NKT e T CD8+ intra-hepáticas

[255] Os fígados foram picados e os linfócitos hepáticos foram purificados usando um gradiente de Ficoll. As células foram coradas com anticorpos anti- CD45, anti-TCRbeta; anti-NK1.1; anti-CD8 e anti-CXCR3. Um instrumento Fortessa (BD Biosciences) e o software FlowJo foram usados para aquisição e análise de dados. Medição dos níveis de Alanina aminotransferase no soro

[256] A atividade da alanina aminotransferase (ALT) no soro foi medida usando um ensaio Colorimétrico de Atividade ALT de acordo com o protocolo fabricado pela THE (Sigma).

Resultados: O tratamento com um anticorpo de depleção de CXCR3 protege contra NASH

[257] Como mostrado nas Figuras 4 e 5, os fígados de camundongos que receberam a dieta MCD mais o anticorpo de isotipo tinham depósitos de gordura significativos na conclusão do teste em comparação com camundongos na dieta controle (normal).

[258] Os fígados de camundongos que receberam um tratamento com anticorpos de depleção de anti-CXCR3 em conjunto com a dieta MCD indutora de NASH foram significativamente protegidos do desenvolvimento de depósitos de gordura.

[259] A Figura 4 também mostra que os camundongos que receberam um anticorpo de depleção anti-CXCR3 têm níveis reduzidos de fibrose hepática em comparação com os camundongos que receberam o anticorpo de isotipo em conjunto com a dieta MCD.

[260] Assim, os resultados mostrados nas Figuras 4 e 5 indicam que o tratamento com um anticorpo anti-CXCR3 de depleção inibe a esteatose e fibrose hepática em um modelo aceito de NASH.

[261] A Figura 6 mostra que o tratamento com mAbs anti-CXCR3 depleta as células NKT e células T CD8 intra-hepáticas ativadas. A dieta MCD aumentou a frequência de células T CD8+ CXCR3+ e de células NKT; as células NKT sãCXCR3+ e são depletadas após o tratamento com mAB anti-CXCR3 modificado por Fc.

[262] Níveis séricos aumentados de ALT são indicativos de lesão hepática. A Figura 7 mostra que o tratamento com anticorpo anti-CXCR3 diminui a liberação de alanina aminotransferase no soro e diminui a infiltração de monócitos no fígado em um modelo aceito de NASH.

[263] Em resumo, esses dados mostram que o tratamento com um anticorpo CXCR de depleção no contexto de uma dieta indutora de NASH:

• inibe a formação de depósitos de gordura (esteatose hepática); • inibe depósitos de colágeno e fibrose • depleta as células NKT e células T CD8+ intra-hepáticas ativadas • diminui a liberação de alanina aminotransferase no soro, indicando uma melhora na função hepática; e • diminui a infiltração de monócitos no fígado.

[264] Será entendido que a invenção revelada e definida neste relatório descritivo se estende a todas as combinações alternativas de duas ou mais das características individuais mencionadas ou evidentes no texto ou nos desenhos. Todas essas combinações diferentes constituem vários aspectos alternativos da invenção.

Claims (47)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para tratar uma condição associada a células T efetoras e/ou de memória em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em administrar ao indivíduo um sítio de ligação ao antígeno de depleção que se liga a CXCR3, desse modo tratando uma condição associada a células T efetoras e/ou de memória no indivíduo.

2. Método para tratar ou retardar a progressão da doença hepática gordurosa em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em administrar ao indivíduo um sítio de ligação ao antígeno de depleção que se liga a CXCR3, desse modo tratando ou retardando a progressão da doença hepática gordurosa no indivíduo.

3. Método para prevenir ou retardar o início da doença hepática gordurosa em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em administrar ao indivíduo um sítio de ligação ao antígeno de depleção que se liga a CXCR3, desse modo prevenindo ou retardando o início da doença hepática gordurosa no indivíduo.

4. Método de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a doença hepática gordurosa é associada, causada por ou resultado do alcoolismo.

5. Método de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a doença hepática gordurosa é associada, causada por ou resultado de uma causa dietética não alcoólica (doença hepática gordurosa não alcoólica, NAFLD).

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a NAFLD é esteatose simples ou esteatose simples incluindo um ou mais sinais de inflamação e fibrose.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6,

caracterizado pelo fato de que a doença hepática gordurosa tem como característica ser esteatose hepática, triglicerídeos circulantes ou hepáticos elevados e/ou níveis elevados de colesterol circulante ou hepático.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 7, caracterizado pelo fato de que a doença hepática gordurosa é esteatohepatite não alcoólica (NASH).

9. Método para reduzir ou tratar inflamação em um indivíduo em risco de, ou tendo uma doença autoimune, caracterizado pelo fato de que compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em um sítio de ligação ao antígeno de depleção que se liga a CXCR3, desse modo reduzindo ou tratando inflamação no indivíduo.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que reduzir ou tratar inflamação compreende reduzir a proporção de uma ou mais citocinas pró-inflamatórias no paciente.

11. Método de acordo com a reivindicação 9 a 10, caracterizado pelo fato de que reduzir ou tratar a inflamação compreende aumentar a proporção de uma ou mais citocinas anti-inflamatórias no indivíduo.

12. Método para inibir o recrutamento ou migração de células CXCR3+ para um sítio de inflamação em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um sítio de ligação ao antígeno de depleção que se liga a CXCR3+, inibindo assim o recrutamento ou migração de células CXCR3+ para um sítio de inflamação no indivíduo.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 9 a 12, caracterizado pelo fato de que o indivíduo recebeu, está recebendo ou vai receber um enxerto ou transplante.

14. Método para tratar ou prevenir o acúmulo de depósitos de lipídios no fígado de um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo um sítio de ligação ao antígeno de depleção que se liga a CXCR3, desse modo tratando ou prevenindo o acúmulo de depósitos de lipídios no fígado de um indivíduo.

15. Método para tratar ou prevenir a doença hepática gordurosa em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo um sítio de ligação ao antígeno de depleção que se liga a CXCR3, desse modo tratando ou prevenindo a doença hepática gordurosa no indivíduo.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a doença hepática gordurosa é doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD).

17. Método para tratar ou prevenir esteatohepatite em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo um sítio de ligação ao antígeno de depleção que se liga a CXCR3, desse modo tratando ou prevenindo a esteatohepatite.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a esteatohepatite é esteatohepatite alcoólica (ASH) ou esteatohepatite não alcoólica (NASH), preferencialmente, em que a esteatohepatite é NASH.

19. Método para inibir rejeição a enxerto ou transplante em um indivíduo que recebeu, está recebendo ou receberá um enxerto ou transplante, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um sítio de ligação ao antígeno de depleção que se liga a CXCR3, desse modo inibindo rejeição a enxerto ou transplante no indivíduo.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o enxerto é um aloenxerto ou xenoenxerto, ou o transplante é um alotransplante ou xenotransplante.

21. Método de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que o enxerto ou transplante é selecionado a partir de um enxerto ou transplante de coração, rim, pulmão, fígado, pâncreas, ilhotas pancreáticas, tecido cerebral, estômago, intestino grosso, intestino delgado, córnea, pele, traqueia, osso, medula óssea, músculo e bexiga.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizado pelo fato de que o sítio de ligação ao antígeno é administrado ao indivíduo antes, ao mesmo tempo e/ou após o indivíduo ter recebido o enxerto ou transplante.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, caracterizado pelo fato de que o sítio de ligação ao antígeno é administrado ao indivíduo duas ou mais vezes.

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 23, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente administrar ao indivíduo um ou mais outros agentes terapêuticos, como uma citocina (por exemplo, interleucina 2), quimiocina ou anticorpo, opcionalmente, em que o agente terapêutico é um agente imunossupressor, por exemplo, um glicocorticóide, ciclosporina, rapamicina, voclosporina, sirolimo, everolimo, tacrolimo, micofenolato, mofetila, ácido micofenólico, mizoribina, um agonista S1P-R, uma malononitrilamida, um anticorpo anti-CD3, um anticorpo anti-CD25, um anticorpo anti-CD52, um anticorpo anti-CD20 ou um anticorpo anti-fator de necrose tumoral.

25. Uso de um sítio de ligação ao antígeno de depleção que se liga a CXCR3, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para depleção de células CXCR3+; inibir o recrutamento ou migração de células CXCR3+ para um sítio de inflamação; tratar ou prevenir a doença hepática gordurosa em um indivíduo, incluindo NAFLD e NASH; e/ou para a preparação de um medicamento para inibir rejeição de enxerto em um indivíduo que recebeu, está recebendo ou receberá um enxerto.

26. Sítio de ligação ao antígeno que se liga a CXCR3, caracterizado pelo fato de ser para uso na depleção de células CXCR3+; para uso na inibição do recrutamento ou migração de células CXCR3+ para um sítio de inflamação; para uso no tratamento ou prevenção de doença hepática gordurosa em um indivíduo, incluindo NAFLD e NASH; e/ou para uso na inibição da rejeição de enxerto em um indivíduo que recebeu, está recebendo ou receberá um enxerto.

27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24 ou uso de acordo com a reivindicação 25, ou sítio de ligação ao antígeno para o uso de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o sítio de ligação ao antígeno se liga a ou se liga especificamente a CXCR3 e inibe a atividade de CXCR3.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24 ou 27 ou uso de acordo com a reivindicação 25 ou 27, ou sítio de ligação ao antígeno para o uso de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que o sítio de ligação ao antígeno que se liga a CXCR3 é um anticorpo de depleção.

29. Método, uso ou sítio de ligação ao antígeno para uso de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de depleção tem a capacidade de causar ou mediar uma redução na atividade ou viabilidade de uma célula que expressa CXCR3.

30. Método, uso ou sítio de ligação ao antígeno para uso de acordo com a reivindicação 28 ou 29, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de depleção tem a capacidade de induzir citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC).

31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24 ou 27 a 30 ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 ou 27 a 30, ou sítio de ligação ao antígeno para o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 30, caracterizado pelo fato de que o sítio de ligação ao antígeno foi modificado para fornecer a capacidade de depletar uma célula, ou foi modificado para aumentar a capacidade existente do sítio de ligação ao antígeno para depletar uma célula.

32. Método, uso ou sítio de ligação ao antígeno para uso de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula T CXCR3+/CD4+, célula T CXCR3+/CD8+ e/ou célula B CXCR3+/CD19+.

33. Método, uso ou sítio de ligação ao antígeno para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que a atividade de CXCR3 que é inibida pelo sítio de ligação ao antígeno é selecionada a partir de: ligação do ligante a CXCR3; mudança conformacional induzida por ligante de CXCR3; ativação de CXCR3; ativação de proteína G; sinalização celular mediada por CXCR3; uma resposta migratória, inflamatória, de crescimento tumoral, angiogênica ou metastática de células mediada por CXCR3 in vitro ou in vivo; crescimento de células tumorais mediado por CXCR3; e/ou recrutamento mediado por CXCR3 de células inflamatórias, migração de leucócitos (por exemplo, neutrófilos, eosinófilos, mastócitos ou células T), ativação de integrina, migração quimiotática e maturação de células Th1.

34. Método, uso ou sítio de ligação ao antígeno para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que o sítio de ligação ao antígeno inibe ou reduz a atividade de CXCR3 induzida por um ou mais ligantes selecionados a partir do grupo que consiste em CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP10) e CXCL11 (I-TAC).

35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24 ou 27 a 34 ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 ou 27 a 34, ou sítio de ligação ao antígeno para o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 34, caracterizado pelo fato de que o sítio de ligação ao antígeno não se liga de maneira detectável ou se liga significativamente a CXCR1, CXCR2 e/ou C5aR.

36. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24 ou 27 a 35 ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 ou 27 a 35, ou sítio de ligação ao antígeno para o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 35, caracterizado pelo fato de que o sítio de ligação ao antígeno se liga a CXCR3 e exibe um EC50 de menos de 2 nM, menos de 1 nM ou menos de 0,5 nM, preferencialmente em que o EC50 do sítio de ligação ao antígeno é aproximadamente 0, 2 nM ou menos.

37. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24 ou 27 a 36 ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 ou 27 a 36, ou sítio de ligação ao antígeno para o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 36, caracterizado pelo fato de que o sítio de ligação ao antígeno exibe um IC50 em um ensaio de ligação de competição com MIG, ITAC e/ou IP10 inferior a cerca de 20, 15, 12, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 nM.

38. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24 ou 27 a 37 ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 ou 27 a 37, ou sítio de ligação ao antígeno para o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 37, caracterizado pelo fato de que o sítio de ligação ao antígeno se liga ao primeiro e/ou segundo loop de N-terminal em CXCR3.

39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24 ou 27 a 38 ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 ou 27 a 38, ou sítio de ligação ao antígeno para o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 38, caracterizado pelo fato de que o sítio de ligação ao antígeno está na forma de: (i) um fragmento Fv de cadeia simples (scFv);

(ii) um scFv dimérico (di-scFv); (iii) um dentre (i) ou (ii) ligado a uma região constante de um anticorpo, Fc ou um domínio constante de cadeia pesada (CH) 2 e/ou CH3; ou (iv) um dentre (i) ou (ii) ligado a uma proteína que se liga a uma célula efetora imune.

40. Método, uso ou sítio de ligação ao antígeno para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizado pelo fato de que o sítio de ligação ao antígeno está na forma de: (i) um diacorpo; (ii) um triacorpo; (iii) um tetracorpo; (iv) um Fab; (v) um F(ab')2; (vi) um Fv; (vii) um dentre (i) a (vi) ligado a uma região constante de um anticorpo, Fc ou um domínio constante de cadeia pesada (CH) 2 e/ou CH3; ou (viii) um dentre (i) a (vi) ligado a uma proteína que se liga a uma célula efetora imune.

41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24 ou 27 a 40 ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 ou 27 a 40, ou sítio de ligação ao antígeno para o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 40, caracterizado pelo fato de que o sítio de ligação ao antígeno é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, preferencialmente em que o sítio de ligação ao antígeno é um anticorpo monoclonal.

42. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24 ou 27 a 41 ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 ou 27 a 41, ou sítio de ligação ao antígeno para o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 41, caracterizado pelo fato de que o sítio de ligação ao antígeno é um anticorpo nu.

43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24 ou 27 a 42 ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 ou 27 a 42, ou sítio de ligação ao antígeno para o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 42, caracterizado pelo fato de que o sítio de ligação ao antígeno está na forma de um conjugado anticorpo-fármaco.

44. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24 ou 27 a 43 ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 ou 27 a 43, ou sítio de ligação ao antígeno para o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 43, caracterizado pelo fato de que o sítio de ligação ao antígeno compreende uma região constante humana, por exemplo, uma região constante de IgG, tal como uma IgG1, IgG2 ou IgG3 ou misturas das mesmas.

45. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24 ou 27 a 44 ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 ou 27 a 44, ou sítio de ligação ao antígeno para o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 44, caracterizado pelo fato de que o sítio de ligação ao antígeno compreende uma região Fc que é modificada para ter capacidade aumentada para induzir citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC), em que preferencialmente, a capacidade aumentada de induzir ADCC é conferida por mutação, deleção ou modificação de aminoácidos na região Fc que interagem com um receptor de Fc.

46. Método, uso ou sítio de ligação ao antígeno para uso de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que os aminoácidos que são mutados, deletados ou modificados estão na posição 239, 330 e/ou 332 da SEQ ID NO: 1 (onde alanina está na posição 118) ou em uma posição equivalente a

239, 330 e/ou 332.

47. Método, uso ou sítio de ligação ao antígeno para uso de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que os aminoácidos são mutados para S239D, A330L e I332E.