BR112021006160A2 - composto conjugado, célula tumoral, composição farmacêutica, e, agentes sinérgicos - Google Patents

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Huihui GUO
Wenjun Li
Shun GAI
Lu Bai
Zhixiang GUO
Junxiang JIA
Xiaomai ZHOU
Jun Zheng
Qianqian Tong
Hongsheng Xie
Qingliang YANG
Yanhong Tong
Mingjun Chao
Zhicang YE
Yanlei YANG
Chen Lin
Binbin Chen
Yuanyuan Huang
Linyao ZHAO
Hangbo YE
Xiaotao ZHUO
Chengyu YANG
Jun Lei
Yifang Xu
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Abstract

A presente invenção refere-se a um conjugado de um fármaco/molécula citotóxico a uma molécula de ligação celular com um bis-ligante (um ligante duplo) contendo um grupo a 2,3-diaminossuccinila. Tbém se refere à preparação do conjugado de um fármaco/molécula citotóxico a uma molécula de ligação celular com o bis-ligante, particularmente quando o fármaco possui grupos funcionais de amino, hidroxila, diamino, amino-hidroxila, di-hidroxila, carboxila, hidrazina, aldeídeo e tiol para conjugação com o bis-ligante de maneira específica, bem como o uso terapêutico dos conjugados.

Description

1 / 439 COMPOSTO CONJUGADO, CÉLULA TUMORAL, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, AGENTES SINÉRGICOS
CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a um conjugado de um fármaco/molécula citotóxico a uma molécula de ligação celular com um bis- ligante (ligante duplo) contendo um grupo 2,3-aminossucinila. Também se refere à preparação do conjugado de um fármaco/molécula citotóxico a uma molécula de ligação celular com um bis-ligante, particularmente quando o fármaco com grupos funcionais de amino, hidroxila, diamino, amino- hidroxila, di-hidroxila, carboxila, hidrazina, aldeído e tiol para conjugação com o bis-ligante de maneira específica, bem como o uso terapêutico dos conjugados.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002] Um conjugado anticorpo-fármaco (ADC), que é combinação sinérgica de um anticorpo (mAbs) conjugado a pequenas moléculas quimioterapêuticas, através de um ligante condicionalmente estável para acúmulo preferencial dos fármacos de pequena molécula dentro do tumor através de endocitose mediada por receptor e, assim, poupar o tecido sadio, deu origem a uma classe de fármacos antineoplásicos extremamente eficazes com uma linha de desenvolvimento clínico (pipeline) já grande e em rápido crescimento. Os três componentes de ADCs (mAb, ligante e citotoxina) afetam a eficácia e toxicidade do conjugado. A otimização de cada um, enquanto reforçando a funcionalidade do ADC como um todo, tem sido uma das principais considerações do desenho e desenvolvimento do ADC. Acredita-se que a tecnologia de ligantes para alcançar a liberação no sítio desejado, carregamento eficiente do fármaco, estequiometria ótima e homogeneidade da macromolécula são de importância vital para atingir boa farmacocinética, eficácia e tolerabilidade (Lambert, J. e Chari, R., J. Med. Chem. 2014, 57, 6949-64; ponte, J. et al., Bioconj. Chem., 2016, 27(7), 1588-
2 / 439 98; Dovgan, I., et al. Sci. Rep. 2016, 6, 30835; Ross, P. L. e Wolfe, J. L. J. Pharm. Sci. 105(2), 391-7; Chen, T. et al. J. Pharm. Biomed. Anal., 2016, 117, 304-10; Zhao, R. Y. et al, 2011, J. Med. Chem. 54, 3606-23).
[003] Investigações anteriores sobre a estabilidade do conjugado anticorpo-fármaco (ADC) centraram-se na liberação do fármaco por desconjugação do ligante quando da estabilidade do ADC devido a cargas relativamente estáveis tais como maitansinas (Piwko C, et al, Clin Drug Investig. 2015, 35(8), 487-93; Lambert, J. e Chari, R., J. Med. Chem. 2014, 57, 6949-64). Porém, um conjugado anticorpo-fármaco disponível comercialmente, denominado T-DM1, falhou em um ensaio clínico como tratamento de primeira linha para pacientes com câncer de mama localmente avançado ou metastático irressecável HER2 positivo e como tratamento de segunda linha de câncer gástrico avançado HER2 positivo devido a poucos benefícios para pacientes quando comparada a toxicidade contralateral à eficácia (Ellis, P. A., et al, J. Clin. Oncol. 2015, 33, (supl; resumo 507 de 2015 ASCO Annual Meeting); Shen, K. et al, Sci Rep. 2016; 6: 23262; de Goeij, B. E. e Lambert, J. M. Curr Opin Immunol 2016, 40, 14-23; Barrios, C. H. et al, J Clin Oncol 2016, 34, (supp; resumo 593 de 2016 ASCO Annual Meeting).
[004] Para abordar questões de toxicidade fora do alvo, a pesquisa e o desenvolvimento da química e do design do ADC estão agora expandindo os escopos dos compartimentos de carga do ligante e a química dos conjugados além das únicas cargas potentes, e especialmente para abordar a atividade da carga do ligante de ADCs em direção a alvos/doenças alvo (Lambert, JM Ther Deliv 2016, 7, 279-82; Zhao, RY et al, 2011, J. Med. Chem. 54, 3606-23). Atualmente, muitos criadores de fármacos e instituições acadêmicas concentram-se altamente no estabelecimento de novos ligantes de conjugação específicos confiáveis e métodos para conjugação de ADC sítio- específica, que parecem ter meia-vida de circulação mais longa, maior
3 / 439 eficácia, toxicidade fora do alvo potencialmente diminuída e uma faixa estreita das propriedades farmacocinéticas (PK) in vivo dos ADCs, bem como uma melhor consistência lote a lote na produção de ADC (Hamblett, KJ et al., Clin.
Cancer Res. 2004, 10, 7063-70; Adem, Y.
T. et al, Bioconjugate Chem. 2014, 25, 656-664; Boylan, N.
J.
Bioconjugate Chem. 2013, 24, 1008-1016; Strop, P., et al 2013 Chem.
Biol. 20, 161-67; Wakankar, A. mAbs, 2011, 3, 161-172). Estes métodos de conjugação específicos relatados até agora incluem a incorporação de cisteínas manipuladas (Junutula, J.
R. et al.
Nat.
Biotechnol. 2008, 26, 925-32; Junutula, J.
R., et al 2010 Clin.
Cancer Res. 16, 4769; patentes US 8 309 300; 7 855 275; 7 521 541; 7 723 485, WO2008/141044), selenocisteínas (Hofer, T., et al.
Biochemistry 2009, 48, 12047–57; Li, X., et al.
Methods 2014, 65, 133-8; patente US 8 916 159 concedida ao US National Cancer Institute), cisteína contendo etiqueta com reagentes perfluoroaromáticos (Zhang, C. et al.
Nat.
Chem. 2015, 8, 1-9), tiolfucose (Okeley, N.
M., et al 2013 Bioconjugate Chem. 24, 1650), aminoácidos não naturais (Axup, J.
Y., et al, Proc.
Nat.
Acad.
Sci.
USA. 2012, 109, 16101-6; Zimmerman, E.S., et al., 2014, Bioconjug.
Chem. 25, 351-361; Wu, P., et al, 2009 Proc.
Natl.
Acad.
Sci. 106, 3000-5; Rabuka, D., et al, Nat.
Protoc. 2012, 7, 1052-67; e Patente US 8 778 631 e Pedido de Patente US 20100184135, WO2010/081110 concedida a Sutro Biopharma; WO2006/069246, 2007/059312, Patentes US 7 332 571, 7 696 312, e 7 638 299 concedida a Ambrx; WO2007/130453, Patentes US 7 632 492 e 7 829 659 concedida a Allozyne), conjugação a dissulfetos intermoleculares reduzidos por re-formação de pontes de dibromomalemidas (Jones, M.
W. et al.
J.
Am.
Chem.
Soc. 2012, 134, 1847-52), reagentes de bis-sulfonas (Badescu, G. et al.
Bioconjug.
Chem. 2014, 25, 1124-36; WO2013/190272, WO2014/064424 concedida a PolyTherics Ltd). dibromopiridazinadionas (Maruani, A. et al.
Nat.
Commun. 2015, 6, 6645), galactosil e sialiltransferases (Zhou, Q. et al.
Bioconjug.
Chem. 2014, 25, 510-520;
4 / 439 pedido de Patente US EUA 20140294867 pela Sanofi-Genzyme), enzima geradora de formilglicina (FGE) (Drake, P. M. et al. Bioconj. Chem. 2014, 25, 1331-41; Carrico, I. S. et al., Patente US 7 985 783; 8 097 701; 8 349 910, e Pedido de Patente US 20140141025, 20100210543 pela Redwood Bioscience), fosfopanteteinil transferases (PPTases) (Grünewald, J. et al. Bioconjug. Chem. 2015, 26, 2554-62), sortase A (Beerli, R. R., et al. PLoS One 2015, 10, e0131177), etiqueta de glutamina geneticamente introduzida com transglutaminase de Streptoverticillium mobaraense (mTG) (Strop, P., Bioconj. Chem., 2014, 25, 855-62; Strop, P., et al., Chem. Biol. 2013, 20, 161-7; patente US 8 871 908 concedida a Rinat-Pfizer) ou com transglutaminase microbiana (MTGase) (Dennler, P., et al, 2014, Bioconjug. Chem. 25, 569-78; Siegmund, V. et al. Angew. Chemie - Int. Ed. 2015, 54, 13420-4; pedido de Patente US 20130189287 pela Innate Pharma; patente US 7 893 019 concedida a Bio-Ker S.r.l. (IT)), uma enzima/bactéria que forma ligações peptídica do tipo ligação isopeptídica, formadas fora da cadeia principal da proteína (Kang, H. J., et al. Science 2007, 318, 1625-8; Zakeri, B. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2012, 109, E690-7; Zakeri, B. & Howarth, M. J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 4526-7).
[005] Nós descrevemos vários métodos de conjugação de re- formação de ponte de um par de tióis das ligações dissulfeto inter-cadeia reduzidas de um anticorpo nativo, como o uso de ligantes de bromo maleimida e dibromomaleimida (WO2014/009774), ligantes maleicos ou fumárico 2,3-dissubstituídos/2-monossubstituído/succínico 2,3-dissubstituídos (WO2015/155753, WO20160596228), ligantes acetilenodicarboxílicos (WO2015/151080, WO20160596228) ou ligantes de hidrazina (WO2015/151081). Os ADCs feitos com esses ligantes e métodos demonstraram melhores janelas de índice terapêutico do que a conjugação tradicionalmente não seletiva através dos resíduos de cisteína ou lisina em um anticorpo. Aqui descrevemos a invenção de bis-ligantes contendo grupo 2,3-
5 / 439 diaminossucinila e métodos para conjugação de uma molécula citotóxica, particularmente quando o agente citotóxico tendo grupos duplos de diamino, amino-hidroxila, di-hidroxila, carboxila, aldeído e tióis ou combinação dos grupos acima. Os imunoconjugados feitos com o bis-acoplamento prolongaram a meia-vida durante a entrega direcionada e minimizaram a exposição a células, tecidos ou órgãos não alvo durante a circulação sanguínea, resultando em menor toxicidade fora do alvo.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[006] A presente invenção provê bis-acoplamento de um anticorpo com um agente citotóxico, particularmente quando o agente citotóxico possui dois grupos funcionais de um amino, hidroxila, diamino, amino-hidroxila, dihidroxila, carboxila, hidrazina ou tiol. Também provê um bis-ligante para conjugação da molécula de ligação celular to uma molécula citotóxica de maneira específica.
[007] Em um aspecto da presente invenção, um conjugado com um bis-acoplamento contendo grupo 2,3-diaminossucinila é representado pela Fórmula (I), (II), (III) ou (IV): Fármaco1 (I), Fármaco1 Fármaco2 (II),
6 / 439 R5
O R1 Z1 Y1 N R3 X1 Fármaco1 Q Drug1 X2 Y2 R2 N R 4 Z2 O n R5' (III), R5 O Fármaco1 R1 Z1 Y1 N R3 Drug1 X1 Q Fármaco2 X2 Drug2 Y2 R2 N R4 Z2 O R5' n (IV), em que: “ “ representa uma ligação simples; “ “ é opcionalmente uma ligação simples ou está ausente; “ “ é opcionalmente uma ligação simples ou uma ligação dupla, ou pode opcionalmente estar ausente; n é 1 a 30 independentemente; Q é um agente/molécula de ligação celular que se acopla a R3 e R4 pode ser qualquer tipo presentemente conhecido, ou que se torna conhecido de uma molécula que se liga a, complexa com ou reage com uma porção de uma população de células que se pretende ser terapeuticamente ou de outro modo biologicamente modificada. Preferivelmente, o agente/molécula de ligação celular é uma proteína imunoterapêutica, um anticorpo, um fragmento de anticorpo ou peptídeos com mais de quatro aminoácidos; Fármaco1 e/ou Fármaco2 são uma molécula/agente citotóxico que é um fármaco terapêutico ou uma proteína/molécula imunoterapêutica, ou uma molécula cuja função é melhorar a ligação ou estabilizar o agente de ligação celular ou um ligando de ligação ao receptor de superfície celular, ou inibir a proliferação celular; X1 e X2 são iguais ou diferentes, e selecionados independentemente dentre NH; NHNH; N(R1); N(R1)N(R2); O; S; S-S, O-NH.
7 / 439
O-N(R1), CH2-NH.
CH2-N(R1), CH=NH.
CH=N(R1), S(O), S(O2), P(O)(OH), S(O)NH, S(O2)NH, P(O)(OH)NH, NHS(O)NH, NHS(O2)NH, NHP(O)(OH)NH, N(R1)S(O)N(R2), N(R1)S(O2)N(R2), N(R1)P(O)(OH)N(R2), OS(O)NH, OS(O2)NH, OP(O)(OH)NH, C(O), C(NH), C(NR1), C(O)NH, C(NH)NH, C(NR1)NH, OC(O)NH, OC(NH)NH; OC(NR1)NH, NHC(O)NH; NHC(NH)NH; NHC(NR1)NH, C(O)NH, C(NH)NH, C(NR1)NH, OC(O)N(R1), OC(NH)N(R1), OC(NR1)N(R1), NHC(O)N(R1), NHC(NH)N(R1), NHC(NR1)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), N(R1)C(NH)N(R1), N(R1)C(NR1)N(R1); ou alquila C1-C6; alquenila C2-C8, heteroalquila, alquilcicloalquila ou heterocicloalquila; arila C3-C8, Ar-alquila, heterocíclico, carbocíclico, cicloalquila, heteroalquilcicloalquila, alquilcarbonila ou heteroarila; Y1, Y2, Z1 e Z2 são iguais ou diferentes, e independentemente um grupo funcional que acopla uma molécula de ligação celular Q, ou fármaco1 ou fármaco2, através de uma ligação dissulfeto, éter, éster, tioéter, tioéster, peptídeo, hidrazona, carbamato, carbonato, amina (secundária, terciária ou quaternária), imina, cicloheteroalcano, heteroaromática, alquiloxima ou amida; preferivelmente, Y1, Y2, Z1 e Z2 têm independentemente as seguintes estruturas: C(O)CH, C(O)C, C(O)CH2, ArCH2, C(O), NH, NHNH, N(R1), N(R1)N(R2), O, S, S-S, O-NH, O-N(R1), CH2-NH.
CH2-N(R1), CH=NH.
CH=N(R1), S(O), S(O2), P(O)(OH), S(O)NH, S(O2)NH, P(O)(OH)NH, NHS(O)NH, NHS(O2)NH, NHP(O)(OH)NH, N(R1)S(O)N(R2), N(R1)S(O2)N(R2), N(R1)P(O)(OH)N(R2), OS(O)NH, OS(O2)NH, OP(O)(OH)NH, C(O), C(NH), C(NR1), C(O)NH, C(NH)NH, C(NR1)NH, OC(O)NH, OC(NH)NH; OC(NR1)NH, NHC(O)NH; NHC(NH)NH; NHC(NR1)NH, C(O)NH, C(NR1)NH, OC(O)N(R1), OC(NH)N(R1), OC(NR1)N(R1), NHC(O)N(R1), NHC(NH)N(R1), NHC(NR1)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), N(R1)C(NH)N(R1), N(R1)C(NR1)N(R1); ou alquila C1-C8, heteroalquila C2-C8, alquilcicloalquila, heterocicloalquila;
8 / 439 arila C3-C8, Ar-alquila, heterocíclico, carbocíclico, cicloalquila, heteroalquilcicloalquila, alquilcarbonila, heteroarila; Preferivelmente, Y1, Y2, Z1 e Z2 estão acoplados a pares de tióis de um agente/molécula de ligação celular.
Os tióis são preferivelmente pares de átomos de enxofre reduzidos nas ligações dissulfeto intercadeia do agente de ligação celular por um agente de redução selecionado dentre ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), L-glutationa (GSH), tris(2- carboxietil)fosfina (TCEP), 2-mercaptoetilamina (β-MEA) e/ou beta mercaptoetanol (β-ME, 2-ME); R1, R2, R3 e R4 são uma cadeia de átomos selecionados dentre C, N, O, S, Si e P, preferivelmente com 0~500 átomos, que se conecta covalentemente a X e Z1 e Y e Z2. Os átomos usados na formação de R1, R2, R3 e R4 podem ser combinados de todas as maneiras quimicamente relevantes, tais como formação de alquileno, alquenileno e alquinileno, éteres, polioxialquileno, ésteres, aminas, iminas, poliaminas, hidrazinas, hidrazonas, amidas, ureias, semicarbazidas, carbazidas, alcoxiaminas, alcoxilaminas, uretanos, aminoácidos, peptídeos, aciloxilaminas, ácidos hidroxâmicos ou combinação dos mesmos acima.
Preferivelmente, R1, R2, R3 e R4 são iguais ou diferentes, selecionados independentemente dentre O, NH, S, NHNH, N(R5), N(R3)N(R3’), unidade de polietilenoxi de fórmula (OCH2CH2)pOR5, (OCH2CH-(CH3))pOR5, NH(CH2CH2O)pR5, NH(CH2CH(CH3)O)pR5, N[(CH2CH2O)pR5]-[(CH2CH2O)p’R5’], (OCH2CH2)pCOOR5 ou CH2CH2(OCH2CH2)pCOOR5, em que p e p’ são um número inteiro selecionado independentemente dentre 0 a cerca de 1000, ou combinação dos mesmos; alquila C1-C8; heteroalquila C2-C8 ou alquilcicloalquila, heterocicloalquila; arila C3-C8, Ar-alquila, heterocíclico, carbocíclico, cicloalquila, heteroalquilcicloalquila, alquilcarbonila ou heteroarila; Mais preferivelmente, R1, R2, R3, R4, R5 e R5’ são independentemente H; alquila C1-C8; heteroalquila C2-C8, alquilcicloalquila
9 / 439 ou heterocicloalquila; arila C3-C8, Ar-alquila, heterocíclico, carbocíclico, heteroalquilcicloalquila, alquilcarbonila ou heteroarila; ou C1-C8 átomos de carbono ésteres, éter ou amida; ou 1~24 aminoácidos; ou polietilenoxi com a fórmula (OCH2CH2)p ou (OCH2CH(CH3))p, em que p é um número inteiro de 0 a cerca de 5000, ou combinação dos mesmos acima; R1, R2, R3 e R4 podem opcionalmente ser compostos por um ou mais componentes ligantes de 6-maleimidocaproil (“MC”), maleimidopropanoil (“MP”), valina-citrulina (“val-cit” ou “vc”), alanina- fenilalanina (“ala-phe” ou “af”), p-aminobenziloxicarbonila (“PAB”), 4- tiopentanoato (“SPP”), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (“MCC”), (4-acetil)amino-benzoato (“SIAB”), 4-tio-butirato (SPDB), 4-tio-2- hidroxisulfonil-butirato (2-Sulfo-SPDB) ou peptídeos naturais ou não naturais com 1~8 aminoácidos naturais ou não naturais. O aminoácido natural é preferivelmente selecionado dentre ácido aspártico, ácido glutâmico, arginina, histidina, lisina, serina, treonina, asparagina, glutamina, cisteína, selenocisteína, tirosina, fenilalanina, glicina, prolina, triptofano e alanina; Além disso, R1, R2, R3, R4, Y1, Y2, Z1, e Z2 podem estar independentemente ausentes.
[008] Em outro aspecto, esta invenção provê um bis-ligante prontamente reativo de Fórmula (V), (VI), (VII) e (VIII) contendo grupo 2,3- diaminossucinila abaixo, em que dois ou mais resíduos de uma molécula de ligação celular podem reagir simultânea ou sequencialmente para formar a Fórmula (I), (II), (III) e (IV) acima: Fármaco1 (V),
10 / 439 Fármaco1 Fármaco2 (VI), Fármaco1 (VII), R5
O Lv1 Y1 R1 Z1 Fármaco1 N R3 Drug1 X1 Fármaco2 X2 Drug2 Lv2 Y2 R2 N R4 Z2 O R5' (VIII), em que: “ “ é opcionalmente uma ligação simples uma ligação dupla ou uma ligação tripla, ou pode opcionalmente estar ausente; Desde que, quando representar uma ligação tripla, Lv1 e Lv2 estão ausentes; “ “, “ “, Fármaco1, Fármaco2, n, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1 e Z2 são definidos da mesma forma que na Fórmula (I)-(IV); Lv1 e Lv2 representam o mesmo grupo de partida ou diferente que pode reagir com um grupo tiol, amina, ácido carboxílico, selenol, fenol ou hidroxila em uma molécula de ligação celular. Esses grupos de partida são, entre outros, um haleto (p. ex., fluoreto, cloreto, brometo e iodeto), metanossulfonila (mesila), toluenossulfonila (tosila), trifluorometil-sulfonila (triflato), trifluorometilsulfonato, nitrofenoxila, N-succinimidiloxila (NHS), fenoxila; dinitrofenoxila; pentafluorofenoxila, tetrafluorofenoxila, trifluorofenoxila, difluorofenoxila, monofluorofenoxila, pentaclorofenoxila, 1H-imidazol-1-ila, clorofenoxila, diclorofenoxila, triclorofenoxila, tetraclorofenoxila, N-(benzotriazol-il)oxila, 2-etil-5-fenilisoxazólio-3′-
11 / 439 sulfonila, feniloxadiazol-sulfonila (-sulfona-ODA), 2-etil-5-fenilisoxazólio- ila, feniloxadiazol-ila (ODA), oxadiazol-ila, carbono insaturado (uma ligação dupla ou tripla entre carbono-carbono, carbono-nitrogênio, carbono-enxofre, carbono-fósforo, enxofre-nitrogênio, fósforo-nitrogênio, oxigênio-nitrogênio ou carbono-oxigênio) ou uma molécula intermediária gerada com um reagente de condensação para reações de Mitsunobu.
[009] Em outro aspecto, esta invenção provê um bis-ligante prontamente reativo de Fórmula (IX) e (X) dos seguintes, em que dois ou mais grupos funcionais de uma molécula citotóxica podem reagir simultânea ou sequencialmente para formar a Fórmula (I), (II), (III) ou (IV) acima.
(IX), (X), em que: “ “, “ “, Q, n, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1 e Z2 são definidos da mesma forma que na Fórmula (I)-(IV); e “ “, Lv1, Lv2, Lv1’ e Lv2’ são definidos da mesma forma que Lv1 e Lv2 na Fórmula (V)- (VIII); Em outro aspecto, esta invenção provê um bis-ligante prontamente reativo de Fórmula (XI) e (XII) abaixo, em que uma molécula citotóxica e uma molécula de ligação celular pode reagir independentemente, ou simultânea ou sequencialmente para formar a Fórmula (I)-(IV).
12 / 439 (XI) (XII), em que “ “, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1 e Z2 são definidos da mesma forma que na Fórmula (I)-(IV); e “ “, Lv1, Lv2, Lv1’ e Lv2’ são definidos da mesma forma que Lv1 e Lv2 na Fórmula (V)- (VIII); A presente invenção refere-se ainda a um método para produção de um conjugado molécula de ligação celular-fármaco de Fórmula (I), (II), (III) e (IV).
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0010] A Figura 1 mostra a síntese de análogos de tirosina (Tir) e tubutirosina (Tut) que possuem um grupo amino ou nitro no anel benzeno para bis-acoplamento a uma molécula de ligação celular.
[0011] A Figura 2 mostra a síntese de componentes de análogos de tubulisina.
[0012] A Figura 3 mostra a síntese de componentes de análogos de tubulisina.
[0013] A Figura 4 mostra a síntese de um bis-ligante contendo um grupo 2,3-diaminossucinila e um análogo de tubulisina contendo um bis- ligante com grupo 2,3-diaminossucinila.
[0014] A Figura 5 mostra a síntese de um análogo de tubulisina com um bis-ligante contendo um grupo 2,3-diaminossucinila e sua conjugação a um anticorpo através de um par de tióis do anticorpo.
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[0015] A Figura 6 mostra a síntese de um análogo de tubulisina com um bis-ligante contendo um grupo 2,3-diaminossucinila e sua conjugação a um anticorpo através de um par de tióis do anticorpo.
[0016] A Figura 7 mostra a síntese de um análogo de tubulisina com um bis-ligante contendo um grupo 2,3-diaminossucinila e sua conjugação a um anticorpo através de um par de tióis do anticorpo.
[0017] A Figura 8 mostra a síntese de um análogo de tubulisina com um bis-ligante contendo um grupo 2,3-diaminossucinila e sua conjugação a um anticorpo através de um par de tióis do anticorpo
[0018] A Figura 9 mostra a síntese de um análogo de tubulisina com um bis-ligante contendo um grupo 2,3-diaminossucinila e sua conjugação a um anticorpo através de um par de tióis do anticorpo.
[0019] A Figura 10 mostra a síntese de um análogo de tubulisina com um bis-ligante contendo um grupo 2,3-diaminossucinila e sua conjugação a um anticorpo através de um par de tióis do anticorpo.
[0020] A Figura 11 mostra a síntese de um análogo de tubulisina com um bis-ligante contendo um grupo 2,3-diaminossucinila e sua conjugação a um anticorpo através de um par de tióis do anticorpo, e a síntese de componentes de auristatina.
[0021] A Figura 12 mostra a síntese dos componentes de auristatina contendo um bis-ligante.
[0022] A Figura 13 mostra a síntese de auristatina F contendo um bis- ligante e sua conjugação a um anticorpo, e a síntese de componentes de uma amanitina e um ligante.
[0023] A Figura 14 mostra a síntese de auristatina F contendo um bis- ligante e sua conjugação a um anticorpo.
[0024] A Figura 15 mostra a síntese de um análogo de amanitina contendo um bis-ligante.
[0025] A Figura 16 mostra a síntese da conjugação de um análogo de
14 / 439 amanitina contendo um bis-ligante a um anticorpo através de um par de tióis no anticorpo.
[0026] A Figura 17 mostra a síntese da conjugação de um análogo de amanitina contendo um bis-ligante a um anticorpo através de um par de tióis no anticorpo.
[0027] A Figura 18 mostra a síntese de conjugação do análogo de tubulisina e um análogo dimérico de CBI contendo um bis-ligante a um anticorpo através de um par de tióis do anticorpo.
[0028] A Figura 19 mostra a síntese de um análogo dimérico de CBI contendo um bis-ligante e sua conjugação a um anticorpo através de um par de tióis do anticorpo.
[0029] A Figura 20 mostra a síntese de um análogo dimérico de CBI contendo um bis-ligante e sua conjugação a um anticorpo através de um par de tióis do anticorpo.
[0030] A Figura 21 mostra a síntese de um análogo dimérico de CBI contendo um bis-ligante e sua conjugação a um anticorpo através de um par de tióis do anticorpo.
[0031] A Figura 22 mostra a síntese de um análogo dimérico de CBI contendo um bis-ligante e sua conjugação a um anticorpo através de um par de tióis do anticorpo, e a síntese de componentes um dímero de PBD.
[0032] A Figura 23 mostra a síntese de um dímero de PBD contendo um bis-ligante e sua conjugação a um anticorpo através de um par de tióis do anticorpo.
[0033] A Figura 24 mostra a síntese de um dímero de PBD contendo um bis-ligante e sua conjugação a um anticorpo através de um par de tióis do anticorpo.
[0034] A Figura 25 mostra a síntese de um dímero de PBD contendo um bis-ligante e sua conjugação a um anticorpo através de um par de tióis do anticorpo.
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[0035] A Figura 26 mostra a síntese de um dímero de PBD contendo um bis-ligante e sua conjugação a um anticorpo através de um par de tióis do anticorpo.
[0036] A Figura 27 mostra a comparação do efeito antitumoral dos compostos conjugados A-3a, B-6a, B-12a, B-15a, B-18a, B-20a, B-21a, B- 24a, B-28a, C-3a, D-2a juntamente com T-DM1 e PBS (controle), usando modelo de célula N87 de tumor gástrico humano, i.v., uma injeção a uma dose de 3 mg/kg para os conjugados A-3a, B-6a, B-12a, B-15a, B-18a, B- 20a, B-21a, B-24a, B-28a, T-DM1 e na dose de 1 mg/kg para os conjugados C-3a e D-1a. Todos os 12 conjugados testados aqui demonstraram atividade antitumoral. Os animais dos grupos de compostos conjugados B-24a, C-3a, B-20a, B-21a e D-20a demonstraram melhor atividade antitumoral que T- DM1. No entanto, os animais dos grupos dos compostos conjugados B-18a, B-15a, A-3a, B-6a, B-28a e B-12a apresentaram pior atividade antitumoral que T-DM1. T-DM1 na dose de 3 mg/Kg inibiu o crescimento tumoral por 28 dias, mas não foi capaz de eliminar os tumores em nenhum momento durante o teste. Em contraste, os compostos conjugados B-20a, B-21a e D-20a erradicam alguns tumores dos animais do dia 15 ao dia 43.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES
[0037] “Alquila” refere-se a um grupo hidrocarboneto alifático ou grupos univalentes derivados de alcano pela remoção de um ou dois átomos de hidrogênio dos átomos de carbono. Pode ser linear ou ramificado com C1- C8 (1 a 8 átomos de carbono) na cadeia. “Ramificado” significa que números de C inferiores de grupos alquila, como metila, etila ou propila, estão ligados a uma cadeia alquila linear. Grupos alquila exemplares incluem metila, etila, n-propila, i-propila, n-butila, t-butila, n-pentila, 3-pentila, octila, nonila, decila, ciclopentila, ciclo-hexila, 2,2-dimetilbutila, 2, 3-dimetilbutila, 2,2- dimetilpentila, 2,3-dimetilpentila, 3,3-dimetilpentila, 2,3,4-trimetilpentila, 3-
16 / 439 metil-hexila, 2,2-dimetil-hexila, 2,4-dimetil-hexila, 2,5-dimetil-hexila, 3,5- dimetil-hexila, 2,4-dimetilpentila, 2-metil-heptila, 3-metil-heptila, n-heptila, iso-heptila, n-octila e iso-octila. Um grupo alquila C1-C8 pode ser não substituído ou substituído com um ou mais grupos, incluindo, entre outros, - alquila C1-C8,-O-(alquila C1-C8), -arila, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', - C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -S(O)2R', -S(O)R', - OH, -halogênio, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R') 2 e -CN; em que cada R' é selecionados independentemente dentre -alquila C1-C8 e arila.
[0038] “Halogênio” refere-se ao átomo de flúor, cloro, bromo ou iodo; preferivelmente, átomo de flúor e cloro.
[0039] “Heteroalquila” refere-se ao alquila C2-C8 no qual um a quatro átomos de carbono são independentemente substituídos por um heteroátomo do grupo que consiste em O, S e N.
[0040] “Carbociclo” refere-se a um anel saturado ou insaturado com 3 a 8 átomos de carbono como um monociclo ou 7 a 13 átomos de carbono como biciclo. Os carbociclos monocíclicos têm 3 a 6 átomos no anel, mais tipicamente 5 ou 6 átomos no anel. Os carbociclos bicíclicos têm de 7 a 12 átomos no anel, dispostos como um sistema [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6] de biciclo ou 9 ou 10 átomos no anel dispostos como um sistema [5,6] ou [6,6] de biciclo. Os carbociclos C3-C8 representativos incluem, entre outros, - ciclopropila, -ciclobutila, -ciclopentila, -ciclopentadienila, -ciclo-hexila, - ciclo-hexenila, -1,3-ciclo-hexadienila, -1,4-ciclo-hexadienila, -ciclo-heptila, - 1,3-ciclo-heptadienila, -1,3,5-ciclo-heptatrienila, -ciclo-octila e -ciclo- octadienila.
[0041] Um “carbociclo C3-C8” refere-se a um anel carbocíclico não aromático saturado ou insaturado de 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 membros. Um grupo carbociclo C1-C8 pode ser não substituído ou substituído com um ou mais grupos, incluindo, entre outros, -alquila C1-C8, -O-(alquila C1-C8), -arila, - C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -
17 / 439 NHC(O)R', -SR', -S(O)R',-S(O)2R', -OH, -halogênio, -N3, -NH2, -NH(R'), - N(R')2 e -CN; em que cada R' é selecionado independentemente dentre - alquila C1-C8 e arila.
[0042] “Alquenila” refere-se a um grupo hidrocarboneto alifático contendo uma ligação dupla carbono-carbono que pode ser linear ou ramificada com 2 a 8 átomos de carbono na cadeia. Grupos alquenila exemplares incluem etenila, propenila, n-butenila, i-butenila, 3-metilbut-2- enila, n-pentenila, hexilenila, heptenila, octenila.
[0043] “Alquinila” refere-se a um grupo hidrocarboneto alifático contendo uma ligação tripla carbono-carbono que pode ser linear ou ramificada com 2 a 8 átomos de carbono na cadeia. Grupos alquinila exemplares incluem etinila, propinila, n-butinila, 2-butinila, 3-metilbutinila, 5-pentinila, n-pentinila, hexinila, heptilnila e octilnila.
[0044] “Alquileno” refere-se a um radical hidrocarboneto cíclico ou de cadeia linear, ramificada ou saturada, com 1 a 18 átomos de carbono e com dois centros radicais monovalentes derivados pela remoção de dois átomos de hidrogênio dos mesmos ou dois átomos de carbono diferentes de um alcano precursor. Os radicais alquileno típicos incluem, entre outros: metileno (-CH2- ), 1,2-etil (-CH2CH2-), 1,3-propil (-CH2CH2CH2-), 1,4-butyl (- CH2CH2CH2CH2-) e semelhantes.
[0045] “Alquenileno” refere-se a um radical hidrocarboneto cíclico ou de cadeia linear, ramificada ou insaturada, com 2 a 18 átomos de carbono e com dois centros radicais monovalentes derivados pela remoção de dois átomos de hidrogênio do mesmo ou de dois átomos de carbono diferentes de um alceno precursor. Os radicais alquenileno típicos incluem, entre outros: 1,2-etileno (-CH=CH-).
[0046] “Alquinileno” refere-se a um radical hidrocarboneto cíclico ou de cadeia linear, ramificada ou insaturada, com 2 a 18 átomos de carbono e com dois centros radicais monovalentes derivados pela remoção de dois
18 / 439 átomos de hidrogênio do mesmo ou de dois átomos de carbono diferentes de um alcino precursor. Os radicais alquinileno típicos incluem, entre outros: acetileno, propargila e 4-pentinila.
[0047] “Arila” ou “Ar” refere-se a um grupo aromático ou heteroaromático, composto por um ou vários anéis, compreendendo três a catorze átomos de carbono, preferencialmente seis a dez átomos de carbono. O termo “grupo heteroaromático” refere-se a um ou vários átomos de carbono no grupo aromático, preferencialmente um, dois, três ou quatro átomos de carbono são substituídos por O, N, Si, Se, P ou S, preferencialmente por O, S e N O termo arila ou Ar também se refere a um grupo aromático, em que um ou vários átomos de H são substituídos independentemente por O, S, e N. O termo arila ou Ar também se refere a um grupo aromático, em que um ou vários átomos de H são substituídos independentemente por -R’, -halogênio, - OR’ ou -SR’, -NR’R’’, -N=NR’, -N=R’, -NR’R’’,-NO2, -S(O)R’, -S(O)2R’, - S(O)2OR’, -OS(O)2OR’, -PR’R’’, -P(O)R’R’’, -P(OR’)(OR’’), - P(O)(OR’)(OR’’) ou -OP(O)(OR’)(OR’’), em que R’, R’’ são independentemente H, alquila, alquenila, alquinila, heteroalquila, arila, arilalquila, carbonila ou sais farmacêuticos.
[0048] “Heterociclo” refere-se a um sistema de anel no qual um a quatro dos átomos de carbono do anel são substituídos independentemente por um heteroátomo do grupo de O, N, S, Se, B, Si e P. Heteroátomos preferidos são O, N e S. Heterociclos são também descritos no The Handbook of Chemistry and Physics, 78a Edição, CRC Press, Inc., 1997-1998, p. 225 a 226, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência. Os heterocíclicos não aromáticos preferidos incluem epóxi, aziridinila, tiiranila, pirrolidinila, pirazolidinila, imidazolidinila, oxiranila, tetra-hidrofuranila, dioxolanila, tetra- hidropiranila, dioxanila, dioxolanila, piperidila, piperazinila, morfolinila, piranila, imidazolinila, pirrolinila, pirazolinila, tiazolidinila, tetra-hidrotio- piranila, ditianila, tiomorfolinila, di-hidropiranila, tetra-hidropiranila, di-
19 / 439 hidropiranila, tetra-hidropiridila, di-hidropiridila, tetra-hidropiimidinila, di- hidrotiopiranila, azepanila, bem como os sistemas fundidos resultantes da condensação com um grupo fenila.
[0049] O termo “heteroarila” ou heterociclos aromáticos refere-se a um anel hetero, mono, bi ou multicíclico aromático de 3 a 14, preferencialmente 5 a 10 membros. Os exemplos incluem pirrolila, piridila, pirazolila, tienila, pirimidinila, pirazinila, tetrazolila, indolila, quinolinila, purinila, imidazolila, tienila, tiazolila, benzotiazolila, furanila, benzofuranila, 1,2,4-tiadiazolila, isotiazolila, isotiazolila, benzotienila, isobenzofurila, pirazolila, carbazolila, benzimidazolila, isoxazolila, piridil-N-óxido, bem como os sistemas fundidos resultantes da condensação com um grupo fenila.
[0050] “Alquila”, “cicloalquila”, “alquenila”, “alquinila”, “arila”, “heteroaril”, “heterocíclico” e semelhantes referem-se também ao “alquileno”, “cicloalquileno”, “alquenileno”, “alquinileno”, “arileno”, “heteroarileno”, “heterociclone” correspondentes e semelhantes que são formados pela remoção de dois átomos de hidrogênio.
[0051] “Arilalquila” refere-se a um radical alquila acíclico no qual um dos átomos de hidrogênio ligado a um átomo de carbono, tipicamente um átomo de carbono terminal ou sp3, é substituído por um radical arila. Grupos arilalquila típicos incluem, benzila, 2-feniletan-1-ila, 2-fenileten-1-ila, naftilmetila, 2-naftiletan-1-ila, 2-naftileten-1-ila, naftobenzila, 2- naftofeniletan-1-ila e semelhantes.
[0052] “Heteroarilalquila” refere-se a um radical alquila acíclico no qual um dos átomos de hidrogênio ligado a um átomo de carbono, tipicamente um átomo de carbono terminal ou sp3, é substituído por um radical heteroarila. Exemplos de grupos heteroarilalquila são 2-benzimidazolilmetila, 2-furiletila.
[0053] Exemplos de um “grupo protetor de hidroxila” incluem, éter metoximetílico, éter 2-metoxietoximetílico, éter tetra-hidropiranílico, éter
20 / 439 benzílico, éter p-metoxibenzílico, éter trimetilsilílico, éter trietilsilílico, éter tri-isopropilsilílico, éter t-butildimetilsilílico, éter trifenilmetilsilílico, éster de acetato, ésteres de acetato substituído, pivaloato, benzoato, metanossulfonato e p-toluenossulfonato.
[0054] “Grupo de saída” refere-se a um grupo funcional que pode ser substituído por outro grupo funcional. Tais grupos de saída são bem conhecidos na técnica, e exemplos incluem um haleto (por exemplo, cloreto, brometo e iodeto), metanossulfonila (mesila), p-toluenossulfonila (tosila), trifluorometilsulfonila (triflato) e trifluorometilsulfonato. Um grupo de saída preferido é selecionado dentre nitrofenol; N-hidroxissuccinimida (NHS); fenol; dinitrofenol; pentafluorofenol; tetrafluorofenol; difluorofenol; monofluorofenol; pentaclorofenol; triflato; imidazol; diclorofenol; tetraclorofenol; 1-hidroxibenzotriazol; tosilato; mesilato; 2-etil-5- fenilisoxazólio-3′-sulfonato, anidridos que se autoformaram ou formados com outro anidrido, p. ex., anidrido acético, anídrico fórmico; ou uma molécula intermediária gerada com um reagente de condensação para reações de acoplamento de peptídeos ou reações de Mitsunobu.
[0055] As seguintes abreviações podem ser usadas aqui e têm as definições indicadas: Boc, terc-butoxi-carbonila; BroP, hexafluorofosfato de bromotrispirrolidinofosfônio; CDI, 1,1'-carbonildiimidazol; DCC, diciclohexilcarbodiimida; DCE, dicloroetano; DCM, diclorometano; DEAD é azodicarboxilato de dietila, DIAD, azodicarboxilato de diisopropila; DIBAL- H, hidreto de diisobutil-alumínio; DIPEA ou DEA, diisopropiletilamina; DEPC, fosforocianidato de dietila; DMA, N,N-dimetilacetamida; DMAP, 4- (N,N-dimetilamino)piridina; DMF, N,N-dimetilformamida; DMSO, dimetilsulfóxido; DTPA é ácido dietilenotriaminopentacético; DTT, ditiotreitol; EDC, cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida; ESI-MS, espectrometria de massa por electrospray; EtOAc é acetato de etila; Fmoc é N-(9-fluorenilmetoxicarbonila); HATU, hexafluorofosfato de O-(7-
21 / 439 azabenzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametilurônio; HOBt, 1- hidroxibenzotriazol; HPLC, cromatografia líquida de alta pressão; NHS, N- hidroxissuccinimida; MeCN é acetonitrila; MeOH é metanol; MMP, 4- metilmorfolina; pAB, p-aminobenzila; pBS, solução salina tamponada com fosfato (pH 7,0~7,5); ph é fenila; phe é L-fenilalanina; pyBrop é hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidino-fosfônio; pEG, polietilenoglicol; SEC, cromatografia de exclusão por tamanho; TCEP, tris(2- carboxietil)fosfina; TFA, ácido trifluoroacético; THF, tetrahidrofurano; Val, valina; TLC é cromatografia em camada fina; UV é ultravioleta.
[0056] O(s) “aminoácido(s)” pode(m) ser aminoácido natural e/ou não natural, preferivelmente alfa-aminoácidos. Os aminoácidos naturais são aqueles codificados pelo código genético, que são alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, tirosina, triptofano e valina. Os aminoácidos não naturais são formas derivadas de aminoácidos proteinogênicos. Exemplos incluem hidroxiprolina, lantionina, ácido 2-aminoisobutírico, desidroalanina, ácido gama- aminobutírico (o neurotransmissor), ornitina, citrulina, beta alanina (ácido 3- aminopropanoico), gama-carboxiglutamato, selenocisteína (presente em muitos não eucariotas bem como a maioria dos eucariotas, mas não codificados diretamente pelo DNA), pirrolisina (encontrada apenas em algumas arqueias e uma bactéria), N-formilmetionina (que frequentemente é o aminoácido inicial de proteínas em bactérias, mitocôndrias e cloroplastos), 5- hidroxitriptofano, L-di-hidroxifenilalanina, tri-iodotironina, L-3,4-di- hidroxifenilalanina (DOPA) e O-fosfoserina. O termo aminoácido também inclui análogos e miméticos de aminoácidos. Análogos são compostos que possuem a mesma estrutura geral de H2N(R)CHCO2H de um aminoácido natural, exceto que o grupo R não é encontrado entre os aminoácidos naturais. Exemplos de análogos incluem homosserina, norleucina, metionina-sulfóxido
22 / 439 e metionina-metilsulfônio. Preferencialmente, um aminoácido mimético é um composto que possui uma estrutura diferente da estrutura química geral de um alfa-aminoácido, mas funciona de maneira semelhante a um. O termo “aminoácido não natural” pretende representar a forma estereoquímica “D”, os aminoácidos sendo da forma “L”. Quando 1~8 aminoácidos são utilizados neste pedido de patente, a sequência de aminoácidos é então preferencialmente uma sequência de reconhecimento de clivagem para uma protease. Muitas sequências de reconhecimento de clivagem são conhecidas na técnica. Ver, p. ex., Matayoshi et al. Science 247: 954 (1990); Dunn et al. Meth. Enzymol. 241: 254 (1994); Seidah et al. Meth. Enzymol. 244: 175 (1994); Thornberry, Meth. Enzymol. 244: 615 (1994); Weber et al. Meth. Enzymol. 244: 595 (1994); Smith et al. Meth. Enzymol. 244: 412 (1994); e Bouvier et al. Meth. Enzymol. 248: 614 (1995); cujos conteúdos são aqui incorporados por referência. Em particular, a sequência é selecionada a partir do grupo que consiste em Val-Cit, Ala-Val, Ala-Ala, Val-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, Ala-Ala-Asn, Lys, Cit, Ser e Glu.
[0057] O “glicosídeo” é uma molécula na qual um grupo açúcar é ligado através de seu carbono anomérico a outro grupo através de uma ligação glicosídica. Os glicosídeos podem ser acoplados por uma ligação glicosídica O- (um O-glicosídeo), N- (uma glicosilamina), S- (um tioglicosídeo) ou C- (um C-glicosídeo). Seu núcleo, a fórmula empírica é Cm(H2O)n (onde m pode ser diferente de n e m e n são <36), o glicosídeo inclui glicose (dextrose), alose de frutose (levulose), altrose, manose, gulose, iodose, galactose, talose, galactosamina, glicosamina, ácido siálico, N-acetilglicosamina, sulfoquinovose (6-desoxi-6-sulfo-D-glicopiranose), ribose, arabinose, xilose, lipose, sorbitol, manitol, sacarose, lactose, maltose, trealose maltodextrinas, rafinose, ácido glucurônico (glucuronídeo) e estaquiose. Pode estar na forma D ou na forma L, 5 átomos em forma de furanose cíclica, 6 átomos em forma
23 / 439 de piranose cíclica ou em forma acíclica, isômero α (o -OH do carbono anomérico abaixo do plano dos átomos de carbono da projeção de Haworth) ou um isômero β (o -OH do carbono anomérico acima do plano de projeção de Haworth). É aqui utilizado como monossacarídeo, dissacarídeo, polióis ou oligossacarídeos contendo 3-6 unidades de açúcar.
[0058] O termo “anticorpo”, neste relatório descritivo, refere-se a uma molécula de imunoglobulina completa ou uma porção imunologicamente ativa de uma molécula de imunoglobulina completa, ou seja, uma molécula que contém um sítio de ligação ao antígeno que se liga imunoespecificamente a um antígeno de um alvo de interesse, ou parte deste, tais alvos incluindo, entre outros, uma célula de câncer ou células que produzem anticorpos autoimunes associados com uma doença autoimune. The imunoglobulina aqui descrita pode ser de qualquer tipo (p. ex., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (p. ex., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina. As imunoglobulinas podem ser derivadas de qualquer espécie. Preferivelmente, no entanto, a imunoglobulina é de origem humana, murina ou de coelho. Os anticorpos úteis na invenção são preferivelmente monoclonais, e incluem, entre outros, anticorpos policlonais, monoclonais, biespecíficos, humanos, humanizados ou quiméricos, anticorpos de cadeia única, Fv, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos F(ab')2, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id), CDRs e fragmentos de ligação a epítopos de qualquer um dos acima que se ligam imunoespecificamente a antígenos de células cancerosas, antígenos virais ou antígenos microbianos.
[0059] Um “enantiômero”, também conhecido como “isômero óptico”, é um de dois estereoisômeros que são imagens especulares um do outro que não são sobreponíveis (não idênticas), muito como a mão direita e a esquerda serem iguais exceto por serem invertidas ao longo de um eixo (não se consegue que as mãos pareçam ser idênticas simplesmente por reorientação).
24 / 439 Um único átomo quiral ou características semelhante em um composto faz com que aquele composto tenha duas estruturas possíveis que não são sobreponíveis, cada qual uma imagem especular da outra. A presença de múltiplas características quirais em um dado composto aumenta o número de formas geométricas possíveis, embora possa haver alguns pares de imagens especulares perfeitas. Compostos enantiopuros referem-se a amostras tendo, dentro dos limites de detecção, moléculas de apenas uma quiralidade. Quando presentes em um ambiente simétrico, os enantiômeros possuem propriedades químicas e físicas idênticas exceto por sua capacidade para girarem o plano da luz polarizada (+/−) por valores iguais, em direções opostas (embora a luz polarizada possa ser considerada um meio assimétrico). Por esse motivo, são, às vezes, chamados de isômeros ópticos. Uma mistura de partes iguais de um isômero opticamente ativo é seu enantiômero é denominada racêmica e tem zero de rotação líquida no plano da luz polarizada porque a rotação positiva de cada forma (+) é exatamente neutralizada pela rotação negativa de uma (−). Parceiros enantioméricos frequentemente têm reações químicas diferentes com substâncias do outro enantiômero. Considerando que muitas moléculas biológicas são enantiômeros, há, às vezes, uma diferença acentuada nos efeitos de dois enantiômeros em organismos biológicos. Em fármacos, por exemplo, somente um dos enantiômeros de um fármaco é responsável pelos efeitos fisiológicos desejados, enquanto o outro enantiômero é menos ativo, inativo ou, às vezes, mesmo produtor de efeitos adversos. Graças a essa descoberta, podem ser desenvolvidos fármacos compostos por somente um enantiômero (“enantiopuro”) para reforçar a eficácia farmacológica e, às vezes, eliminar efeitos colaterais.
[0060] Isótopos são variantes de um elemento químico em particular que difere em número de nêutrons. Todos os isótopos de um dado elemento possuem o mesmo número de prótons em cada átomo. Cada número atômico identifica um elemento específico, mas não o isótopo; um átomo de um dado
25 / 439 elemento pode ter uma ampla variedade em seu número de nêutrons. O número de nucleons (prótons e nêutrons) no núcleo é o número de massa do átomo, e cada isótopo de um dado elemento possui um número de massa diferente. Por exemplo, carbono-12, carbono-13 e carbono-14 são três isótopos do elemento carbono com números de massa 12, 13 e 14, respectivamente. O número atômico do carbono é 6, que significa que todo átomo de carbono possui 6 prótons, de modo que o número de nêutrons desses isótopos é 6, 7 e 8 respectivamente. O átomo de hidrogênio possui três isótopos: prótio (1H), deutério (2H) e trítio (3H), em que deutério possui duas vezes a massa de prótio e trítio possui três vezes a massa de prótio. A substituição isotópica pode ser usada para determinar o mecanismo de uma reação química e através do efeito cinético do isótopo. A substituição isotópica pode ser usada para estudar como o corpo afeta um xenobiótico/substância química específica após a administração através dos mecanismos de absorção e distribuição, bem como as mudanças metabólicas da substância no corpo (p. ex., por enzimas metabólicas como enzimas do citocromo P450 ou glucuronosiltransferase), e os efeitos de vias de excreção dos metabólitos do fármaco. Esse estudo é denominado farmacocinética (PK). A substituição isotópica pode ser usada para estudar os efeitos bioquímicos e fisiológicos de fármacos. Os efeitos podem incluir aqueles manifestados em animais (incluindo humanos), microrganismos ou combinações de organismos (por exemplo, infecção). Esse estudo é denominado farmacodinâmica (PD). Os efeitos podem incluir aqueles manifestados em animais (incluindo humanos), microrganismos ou combinações de organismos (por exemplo, infecção). Ambos em conjunto influenciam as doses, benefício e efeitos adversos do fármaco. Os isótopos podem conter um elemento estável (não radioativo) ou instável. A substituição isotópica de um fármaco pode ter uma eficácia terapêutica diferente do fármaco original.
[0061] “Farmaceuticamente” ou “farmaceuticamente aceitável”
26 / 439 refere-se a entidades e composições moleculares que não produzem uma reação adversa, alérgica ou outra reação desagradável quando administradas a um animal ou humano, conforme apropriado.
[0062] “Solvato farmaceuticamente aceitável” ou “solvato” refere-se a uma associação de uma ou mais moléculas de solvente e um composto descrito. Exemplos de solventes que formam solvatos farmaceuticamente aceitáveis incluem, entre outros, água, isopropanol, etanol, metanol, DMSO, acetato de etila, ácido acético e etanolamina.
[0063] “Excipiente farmaceuticamente aceitável” inclui quaisquer veículos, diluentes, adjuvantes ou carreadores, como agentes conservantes ou antioxidantes, agentes de preenchimento, agentes desintegrantes, agentes molhantes, agentes emulsificantes, agentes de suspensão, solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, isotônicos e agentes retardadores de absorção e similares. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmacêuticas ativas é bem conhecido na técnica. Exceto quando qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o ingrediente ativo, seu uso nas composições terapêuticas é contemplado. Os ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições como combinações terapêuticas adequadas.
[0064] Neste relatório descritivo, “sais farmacêuticos” referem-se a derivados dos compostos descritos, em que o composto precursor é modificado produzindo sais de ácidos ou bases do mesmo. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais não tóxicos convencionais ou os sais de amônio quaternário do composto precursor formados, por exemplo, a partir de ácidos inorgânicos ou orgânicos não tóxicos. Por exemplo, tais sais não tóxicos convencionais incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos como clorídrico, bromídrico, sulfúrico, sulfâmico, fosfórico, nítrico e semelhantes; e os sais preparados a partir de ácidos orgânicos, como acético, propiônico, succínico, tartárico, cítrico, metanossulfônico, benzenossulfônico,
27 / 439 glucurônico, glutâmico, benzoico, salicílico, toluenossulfônico, oxálico, fumárico, maleico, láctico e semelhantes. Outros sais de adição incluem sais de amônio tais como trometamina, meglumina, epolamina etc., sais de metais como sódio, potássio, cálcio, zinco ou magnésio.
[0065] Os sais farmacêuticos da presente invenção podem ser sintetizados a partir do composto precursor que contém uma porção básica ou ácida por métodos químicos convencionais. Em geral, tais sais podem ser preparados por reação das formas ácidas ou básicas livres desses compostos com uma quantidade estequiométrica da base ou ácido apropriado em água ou em um solvente orgânico, ou em uma mistura dos dois. Geralmente, meios não aquosos, como éter, acetato de etila, etanol, isopropanol ou acetonitrila, são preferidos. Listas de sais adequados são encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, p. 1418, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência.
[0066] “Administrar” ou “administração” refere-se a qualquer modo de transferência, entrega, introdução ou transporte de um fármaco ou outro agente farmacêutico a um indivíduo. Tais modos incluem administração oral, contato tópico, administração intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intralesional, intranasal, subcutânea ou intratecal. Também contemplada pela presente invenção é a utilização de um dispositivo ou instrumento na administração de um agente. Esse dispositivo pode utilizar transporte ativo ou passivo e pode ser um dispositivo de entrega de liberação lenta ou liberação rápida.
[0067] “Quantidade terapeuticamente eficaz” significa uma quantidade de um composto/medicamento de acordo com a presente invenção que é eficaz na prevenção ou tratamento da condição patológica aqui mencionada.
[0068] O termo “paciente”, ou “paciente com necessidade do mesmo”, é destinado a um animal ou humano afetado ou que provavelmente
28 / 439 será afetado pela condição patológica aqui mencionada. Preferivelmente, o paciente é humano.
[0069] No contexto de câncer, o termo “tratar” inclui todos ou qualquer um dentre: impedir o crescimento de células tumorais ou células cancerosas, impedir a replicação de células tumorais ou células cancerosas, diminuir a carga tumoral global e melhorar um ou mais sintomas associados com a doença.
[0070] No contexto de uma doença autoimune, o termo “tratar” inclui todos ou qualquer um dentre: impedir a replicação de células associadas com um estado de doença autoimune incluindo, entre outras, células capazes de produzir um anticorpo autoimune, diminuir a carga de anticorpos autoimunes e melhorar um ou mais sintomas de uma doença autoimune.
[0071] No contexto de uma doença infecciosa, o termo “tratar” inclui todos ou qualquer um dentre: impedir o crescimento, a multiplicação ou replicação do patógeno que causa a doença infecciosa e melhorar um ou mais sintomas de uma doença infecciosa.
[0072] Exemplos de um “mamífero” ou “animal” incluem, entre outros, um humano, rato, camundongo, cobaia, macaco, porco, cabra, vaca, cão, gato, ave e galinha.
[0073] Os termos “composto”, “agente citotóxico”, “composto citotóxico”, “dímero citotóxico” e “composto dimérico citotóxico” são usados alternadamente. Destinam-se a incluir compostos dos quais uma estrutura ou fórmula ou qualquer derivado dos mesmos tenha sido descrito na presente invenção ou uma estrutura ou fórmula ou qualquer derivado dos mesmos tenha sido incorporado por referência. O termo também inclui estereoisômeros, isômeros geométricos, tautômeros, solvatos, metabólitos, sais (p. ex., sais farmaceuticamente aceitáveis) e pró-fármacos, e sais de pró- fármaco de um composto de todas as fórmulas descritas na presente invenção. O termo também inclui quaisquer solvatos, hidratos e polimorfos de qualquer
29 / 439 um dos anteriores. A menção específica de “estereoisômeros”, “isômeros geométricos”, “tautômeros”, “solvatos”, “metabólitos”, “sal” “pró-fármaco”, “sal de pró-fármaco”, “conjugados”, “sal de conjugados”, “solvato”, “hidrato” ou “polimorfo” em certos aspectos da invenção descritos neste pedido de patente não será interpretada como uma omissão intencional dessas formas em outros aspectos da invenção onde o termo “composto” é usado sem a menção dessas outras formas.
[0074] O termo “reagente imina reativo” refere-se a um reagente que é capaz de reagir com um grupo imina. Exemplos de reagente imina reativo incluem, entre outros, sulfitos (H2SO3, H2SO2 ou um sal de HSO3-, SO32- ou HSO2- formado com um cátion), metabissulfito (H2S2O5 ou um sal de S2O52- formado com um cátion), mono, di, tri e tetra-tiofosfatos (PO3SH3, PO2S2H3, POS3H3, PS4H3 ou um sal de PO3S3-, PO2S23-, POS33- ou PS43- formado com um cátion), tiofosfato ésteres ((R5O)2PS(OR5), R5SH, R5SOH, R5SO2H, R5SO3H), várias aminas (hidroxilamina (NH2OH), hidrazina (NH2NH2), NH2OR5, R5NHR5’, NH2R5), NH2-CO-NH2, NH2-C(=S)-NH2), tiossulfato (H2S2O3 ou um sal de S2O32- formado com um cátion), ditionito (H2S2O4 ou um sal de S2O42- formado com um cátion), fosforoditioato (P(=S)(OR5)(SH)(OH) ou um sal do mesmo formado com um cátion), ácido hidroxâmico (R5C(=O)NHOH ou um sal formado com um cátion), hidrazida (R5CONHNH2), formaldeído sulfoxilato (HOCH2SO2H ou um sal de HOCH2SO2- formado com um cátion, como HOCH2SO2-Na+), nucleotídeo glicado (como GDP-manose), fludarabina ou uma mistura da mesma, em que R5 e R5' são cada um independentemente um alquila linear ou ramificado com 1 a 8 átomos de carbono e são substituídos com pelo menos um substituinte selecionado dentre -N(R5)(R5’), -CO2H, -SO3H e -PO3H; R5 e R5' podem ser ainda opcionalmente substituídos com um substituinte para um alquila aqui descrito; preferivelmente, o cátion é um cátion monovalente, como Na+ ou K+. Preferivelmente, o reagente imina reativo é selecionado dentre sulfitos,
30 / 439 hidroxila amina, ureia e hidrazina. Mais preferivelmente, o reagente imina reativo é NaHSO3 ou KHSO3.
[0075] “Agentes de ligação celular” ou “moléculas de ligação celular” podem ser de qualquer tipo presentemente conhecido, ou que se tornar conhecido, e incluem peptídeos e não peptídeos. Em geral, esses podem ser anticorpos (especialmente anticorpos monoclonais) ou um fragmento de um anticorpo que contenha pelo menos um sítio de ligação, linfocinas, hormônios, fatores de crescimento, moléculas transportadoras de nutrientes (como transferrina) ou qualquer outra moléculas ou substância de ligação celular (como vitaminas).
[0076] Exemplos mais específicos de agentes de ligação celular que podem ser utilizados incluem: anticorpos monoclonais; anticorpos de cadeia única; fragmentos de anticorpos como Fab, Fab', F(ab')2, Fv, {Parham, 131 J. Immunol. 2895-2902 (1983); Spring et al, 113 J. Immunol. 470-478 (1974); Nisonoff et al, 89 Arch. Biochem. Biophys. 230-244 (1960)}, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, anticorpos anti- idiotípicos (anti-Id), CDRs e fragmentos de ligação a epítopos de qualquer um dos acima que se ligam imunoespecificamente a antígenos de células cancerosas, antígenos virais ou antígenos microbianos; interferons; peptídeos; linfocinas como IL-2, IL-3, IL-4, IL-6; hormônios como insulina, TRH (hormônios liberadores de tirotropina), MSH (hormônio estimulador de melanócitos), hormônios esteroides, como androgênios e estrogênios; fatores de crescimento e fatores estimuladores de colônias como EGF, TGFα, fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-I, IGF-II) G-CSF, M-CSF e GM-CSF {Burgess, 5 Immunology Today 155-158 (1984)}; vitaminas, como folato e; transferrina {O'Keefe et al, 260 J. Biol. Chem. 932-937 (1985)}.
[0077] A tecnologia de anticorpos monoclonais permite a produção de agentes de ligação celular extremamente seletivos na forma de anticorpos monoclonais específicos. No campo, são particularmente conhecidas as
31 / 439 técnicas para criar anticorpos monoclonais produzidos por imunização de camundongos, ratos, hamsters ou qualquer outro mamífero com o antígeno de interesse como a célula alvo intacto, antígenos isolados da célula alvo, vírus inteiros, vírus inteiros atenuados e proteínas virais como proteínas do revestimento viral. A seleção do agente de ligação celular apropriado é uma matéria de escolha que depende da população celular em particular que deverá ser atingida, mas, em geral, são preferidos anticorpos monoclonais se houver disponível um adequado.
[0078] Os novos conjugados aqui descritos usam os bis-ligantes. Exemplos de alguns ligantes adequados e suas sínteses são mostrados nas Figuras 1 a 26 e nos exemplos experimentais. CONJUGADO DE UM AGENTE DE LIGAÇÃO CELULAR-UMA MOLÉCULA CITOTÓXICA ATRAVÉS DE BIS-ACOPLAMENTO COM GRUPO 2,3-DIAMINOSSUCINILA.
[0079] O bis-acoplamento do conjugado é representado pela Fórmula (I), (II), (III) ou (IV): Fármaco1 (I), Fármaco1 Fármaco2 (II), R5
O R1 Z1 Y1 N R3 X1 Fármaco1 Q Drug1 X2 Y2 R2 N R 4 Z2 O n R 5' (III),
32 / 439 R5
O R1 Z1 Fármaco1 Y1 N R3 Drug1 X1
Q Fármaco2 X2 Drug Y2 R2 N R4 2 Z2 O R5' n (IV), ou seus isômeros ópticos, racematos, diastereômeros ou enantiômeros; em que: “ “ representa uma ligação simples; “ “ é opcionalmente uma ligação simples ou está ausente; “ “ é opcionalmente uma ligação simples ou uma ligação dupla, ou pode opcionalmente estar ausente; n é 1 a 30 independentemente; Q é um agente/molécula de ligação celular que se acopla a R3 e R4 pode ser qualquer tipo presentemente conhecido, ou que se torna conhecido de uma molécula que se liga a, complexa com ou reage com uma porção de uma população de células que se pretende ser terapeuticamente ou de outro modo biologicamente modificada. Preferivelmente, o agente/molécula de ligação celular é uma proteína imunoterapêutica, um anticorpo, um anticorpo de cadeia única; um fragmento de anticorpo que se liga à célula alvo; um anticorpo monoclonal; um anticorpo monoclonal de cadeia única; ou um fragmento de anticorpo monoclonal que se liga à célula alvo; um anticorpo quimérico; um fragmento de anticorpo quimérico que se liga à célula alvo; um anticorpo de domínio; um fragmento de anticorpo de domínio que se liga à célula alvo; adnectinas que imitam anticorpos; DARPins; uma linfocina; um hormônio; uma vitamina; um fator de crescimento; um fator estimulador de colônias; ou uma molécula de transporte de nutrientes (uma transferrina); peptídeos de ligação com mais de quatro aminoácidos, ou proteína, ou anticorpo, ou pequena molécula de ligação celular ou ligando anexado à albumina, polímeros, dendrímeros, lipossomas, nanopartículas, vesículas ou capsídeos (virais);
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Fármaco1 e/ou Fármaco2 são uma molécula/agente citotóxico que é um fármaco/molécula/agente terapêutico, ou uma proteína/ molécula imunoterapêutica ou uma molécula cuja função é melhorar a ligação ou estabilizar o agente de ligação celular ou um ligando de ligação ao receptor de superfície celular, ou inibir a proliferação celular ou monitorar, detectar ou estudar a ação de uma molécula de ligação celular.
Também pode ser um análogo, pró-fármaco ou um sal farmaceuticamente aceitável, hidrato ou sal hidratado, ou uma estrutura cristalina, um isômero óptico, racemato, diastereômero ou enantiômero de composto imunoterapêutico, um composto quimioterápico, um anticorpo (probody) ou um fragmento de anticorpo (probody), siRNA ou molécula de DNA ou um ligando de ligação de superfície celular; Preferivelmente, uma molécula citotóxica é qualquer um de muitos fármacos de molécula pequena, incluindo, entre outros, tubulisinas, caliqueamicinas, auristatinas, maitansinoides, análogos de CC-1065, morfolinos doxorrubicinas, taxanos, criptoficinas, amatoxinas (p. ex., amanitinas), epotilonas, eribulina, geldanamicinas, camptotecinas (p. ex., SN-38), duocarmicinas, daunomicinas, metotrexatos, vindesinas, vincristinas e dímeros de benzodiazepina (p. ex., dímeros de pirrolobenzodiazepina (PBD), tomaimicina, indolinobenzodiazepinas, imidazobenzotiadiazepinas ou oxazolidinobenzodiazepinas); X1 e X2 são iguais ou diferentes, e selecionados independentemente dentre NH; NHNH; N(R1); N(R1)N(R2); O; S; S-S, O-NH.
O-N(R1), CH2-NH.
CH2- N(R1), CH=NH.
CH=N(R1), S(O), S(O2), P(O)(OH), S(O)NH, S(O2)NH, P(O)(OH)NH, NHS(O)NH, NHS(O2)NH, NHP(O)(OH)NH, N(R1)S(O)N(R2), N(R1)S(O2)N(R2), N(R1)P(O)(OH)N(R2), OS(O)NH, OS(O2)NH, OP(O)(OH)NH, C(O), C(NH), C(NR1), C(O)NH, C(NH)NH, C(NR1)NH, OC(O)NH, OC(NH)NH; OC(NR1)NH, NHC(O)NH; NHC(NH)NH; NHC(NR1)NH, C(O)NH, C(NH)NH, C(NR1)NH, OC(O)N(R1),
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OC(NH)N(R1), OC(NR1)N(R1), NHC(O)N(R1), NHC(NH)N(R1), NHC(NR1)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), N(R1)C(NH)N(R1), N(R1)C(NR1)N(R1); ou alquila C1-C6; alquenila C2-C8, heteroalquila, alquilcicloalquila ou heterocicloalquila; arila C3-C8, Ar-alquila, heterocíclico, carbocíclico, cicloalquila, heteroalquilcicloalquila, alquilcarbonila ou heteroarila; Y1, Y2, Z1 e Z2 são iguais ou diferentes, e independentemente um grupo funcional que se acopla a uma molécula de ligação celular Q ou fármaco1 ou fármaco2 para formar uma ligação dissulfeto, éter, éster, tioéter, tioéster, peptídeo, hidrazona, carbamato, carbonato, amina (secundária, terciária ou quaternária), imina, cicloheteroalcano, heteroaromático, alquiloxima ou amida; preferivelmente, Y1, Y2, Z1 e Z2 têm independentemente as seguintes estruturas: C(O)CH, C(O)C, C(O)CH2, ArCH2, C(O), NH, NHNH, N(R1), N(R1)N(R2), O, S, S-S, O-NH, O-N(R1), CH2-NH.
CH2-N(R1), CH=NH.
CH=N(R1), S(O), S(O2), P(O)(OH), S(O)NH, S(O2)NH, P(O)(OH)NH, NHS(O)NH, NHS(O2)NH, NHP(O)(OH)NH, N(R1)S(O)N(R2), N(R1)S(O2)N(R2), N(R1)P(O)(OH)N(R2), OS(O)NH, OS(O2)NH, OP(O)(OH)NH, C(O), C(NH), C(NR1), C(O)NH, C(NH)NH, C(NR1)NH, OC(O)NH, OC(NH)NH; OC(NR1)NH, NHC(O)NH; NHC(NH)NH; NHC(NR1)NH, C(O)NH, C(NR1)NH, OC(O)N(R1), OC(NH)N(R1), OC(NR1)N(R1), NHC(O)N(R1), NHC(NH)N(R1), NHC(NR1)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), N(R1)C(NH)N(R1), N(R1)C(NR1)N(R1); ou alquila C1-C8, heteroalquila C2-C8, alquilcicloalquila, heterocicloalquila; arila C3-C8, Ar- alquila, heterocíclico, carbocíclico, cicloalquila, heteroalquilcicloalquila, alquilcarbonila, heteroarila; Preferivelmente, Y1, Y2, Z1 e Z2 estão acoplados a pares de tióis de um agente/molécula de ligação celular.
Os tióis são preferivelmente pares de átomos de enxofre reduzidos nas ligações dissulfeto intercadeia do agente de ligação celular por um agente de redução selecionado dentre ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), L-glutationa (GSH), tris (2-carboxietil) fosfina
35 / 439
(TCEP), 2-mercaptoetilamina (β-MEA) e/ou beta mercaptoetanol (β-ME, 2- ME); R1, R2, R3 e R4 são uma cadeia de átomos selecionados dentre C, N, O, S, Si e P, preferivelmente com 0~500 átomos, que se conecta covalentemente a X e Z1 e Y e Z2. Os átomos usados na formação de R1, R2, R3 e R4 podem ser combinados de todas as maneiras quimicamente relevantes, tais como formação de alquileno, alquenileno e alquinileno, éteres, polioxialquileno, ésteres, aminas, iminas, poliaminas, hidrazinas, hidrazonas, amidas, ureias, semicarbazidas, carbazidas, alcoxiaminas, alcoxilaminas, uretanos, aminoácidos, peptídeos, aciloxilaminas, ácidos hidroxâmicos, ou combinação dos mesmos acima.
Preferivelmente R1, R2, R3 e R4 são iguais ou diferentes, selecionados independentemente dentre O, NH, S, NHNH, N(R5), N(R3)N(R3’), unidade de polietilenoxi de fórmula (OCH2CH2)pOR5, (OCH2CH-(CH3))pOR5, NH(CH2CH2O)pR5, NH(CH2CH(CH3)O)pR5, N[(CH2CH2O)pR5]-[(CH2CH2O)p’R5’], (OCH2CH2)pCOOR5 ou CH2CH2(OCH2CH2)pCOOR5, em que p e p’ são um número inteiro selecionado independentemente dentre 0 a cerca de 1000, ou combinação dos mesmos; alquila C1-C8; heteroalquila C2-C8 ou alquilcicloalquila, heterocicloalquila; arila C3-C8, Ar-alquila, heterocíclico, carbocíclico, cicloalquila, heteroalquilcicloalquila, alquilcarbonila ou heteroarila; em que R5 e R5’ são independentemente H; alquila C1-C8; heteroalquila C2-C8, alquilcicloalquila ou heterocicloalquila; arila C3-C8, Ar-alquila, heterocíclico; C2-C8 átomos de carbono ésteres, éter ou amida; ou 1~24 aminoácidos; Mais preferivelmente, R1, R2, R3, R4, R5 e R5’ são independentemente H; alquila C1-C8; heteroalquila C2-C8, alquilcicloalquila ou heterocicloalquila; arila C3-C8, Ar-alquila, heterocíclico, carbocíclico, heteroalquilcicloalquila, alquilcarbonila ou heteroarila; ou ésteres de C2-C8 átomos de carbono, éter ou amida; ou 1~24 aminoácidos; ou polietilenoxi com a fórmula (OCH2CH2)p ou (OCH2CH(CH3))p, em que p é um número inteiro de 0 a cerca de 5000, ou
36 / 439 combinação dos mesmos acima; R1, R2, R3 e R4 podem opcionalmente ser compostos por um ou mais componentes ligantes de 6-maleimidocaproil (“MC”), maleimidopropanoil (“MP”), valina-citrulina (“val-cit” ou “vc”), alanina-fenilalanina (“ala-phe” ou “af”), p-aminobenziloxicarbonila (“PAB”), 4-tiopentanoato (“SPP”), 4-(N- maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (“MCC”), (4-acetil)amino- benzoato (“SIAB”), 4-tio-butirato (SPDB), 4-tio-2-hidroxisulfonil-butirato (2- Sulfo-SPDB) ou peptídeos naturais ou não naturais com 1~8 aminoácidos naturais ou não naturais. O aminoácido natural é preferivelmente selecionado dentre ácido aspártico, ácido glutâmico, arginina, histidina, lisina, serina, treonina, asparagina, glutamina, cisteína, selenocisteína, tirosina, fenilalanina, glicina, prolina, triptofano e alanina; Além disso, R1, R2, R3 e R4 podem conter independentemente uma das seguintes estruturas hidrofílicas: , , , , , , ,
O O X7 P X3 P X4 X5 X6 , , , , , , , , , ,
37 / 439 , , , , ,
N H H N N , H HN , , O O O
O , ， , , , , ,em que é o sítio de acoplamento; X3, X4, X5, X6 e X7 são selecionados independentemente dentre NH; NHNH; N(R5); N(R5)N(R5’); O; S; alquila C1-C6; C2-C6 heteroalquila, alquilcicloalquila ou heterocicloalquila; arila C3-C8, Ar-alquila, heterocíclico, carbocíclico, cicloalquila, heteroalquilcicloalquila, alquilcarbonila, heteroarila; ou 1~8 aminoácidos; em que R5 e R5’ são independentemente H; alquila C1-C8; heteroalquila C2-C8, alquilcicloalquila ou heterocicloalquila; arila C3-C8, Ar-alquila, heterocíclico, carbocíclico, heteroalquilcicloalquila, alquilcarbonila ou heteroarila; ésteres C1-C8, éter ou amida; ou polietilenoxi com a fórmula (OCH2CH2)p ou (OCH2CH(CH3))p, em que p é um número inteiro de 0 a cerca de 5000, ou combinação dos mesmos acima; R1, R2, R3 e R4, Y1, Y2, Z1, e Z2 podem também conter independentemente um componente autoimolativo ou não autoimolativo, unidades peptídicas, uma ligação hidrazona, um dissulfeto, um éster, uma oxima, uma amida ou uma ligação tioéter. A unidade autoimolativa inclui, entre outros, compostos aromáticos que são eletronicamente semelhantes aos grupos para- aminobenzilcarbamoíla (PAB) como derivados de 2-aminoimidazol-5- metanol, análogos heterocíclicos de PAB, beta-glucuronídeo e orto ou para- aminobenzilacetais;
38 / 439 Preferivelmente, o componente autoimolativo do ligante possui uma das seguintes estruturas: ;
O S* ;. X1 Y 1* ; ou em que o átomo (*) é o ponto de anexação de unidades espaçadoras ou ligantes liberáveis adicionais, ou o agente citotóxico e/ou a molécula de ligação (CBA); X1, Y1, Z2 e Z3 são independentemente NH, O ou S; Z1 é independentemente H, NHR5, OR1, SR5, COX1R5, em que X1 e R5 são definidos acima; v é 0 ou 1; U1 é independentemente H, OH, alquila C1~C6, (OCH2CH2)n, F, Cl, Br, I, OR5, SR5, NR5R5’, N=NR5, N=R5, NR5R5’, NO2, SOR5R5’, SO2R5, SO3R5, OSO3R5, PR5R5’, POR5R5’, PO2R5R5’, OPO(OR5)(OR5’) ou OCH2PO(OR5(OR5’), em que R5 e R5’ são selecionados independentemente dentre H, alquila C1~C8; alquenila C2~C8, alquinila, heteroalquila ou aminoácido; arila C3~C8, heterocíclico, carbocíclico, cicloalquila, heterocicloalquila, heteroaralquila, alquilcarbonila ou glicosídeo; ou sais catiônicos farmacêuticos; O componente não autoimolativo do ligante é uma das seguintes estruturas: (CH2)nCO(OCH2CH2)r OCH3 (CH2) nCON(CH2CH2O)rCOCH3 *(CH2CH2O) r* ; *CH* ; *CH* ;
O (CH2)n(OCH2CH2)r OCOCH3 (CH2)nCO(OCH2CH2)rOCOCH3 * N N * *CH* ; *CH* ; m H ;
O O S P * O * * * ; OH ; ; ; ; ; ;
COOH COOH O COOH O COOH * * * N * N* * ; ; m ; m ; m ;* S* ;
39 / 439 R5 R5 * * * * N* * * *X Y* N* N* * N* N* m O m O m ; O m; m ; O ; O ; ; ;
O COOH
N O N COOH *X1 Y1 N* * * * *N * S* m *N ; * ; O ; ; ; Ar * O N N * m H ; ; ; ;
H O OH O R5 R5' O N HOOC R5 R5' R5 R5' S* N S* S* * S HO *N S * S ; m ; * S* ; m ;
COOH O N
H O O O O O COOH O N *S N COOH * N * N m* * NH* m S* COOH * ; O ; O ; O ;
O COOH COOH HN N O O N O OH OH
COOH COOH m m m m * * N* * *N * *N * O ; O ; O O ; ; COOH O (OCH2CH2)r OCH 3 O (OCH2CH2)r OCH3
O N
COOH n m m * N* *N * *N * O ; O ; O ;
H O N(CH 2CH 2O)r CH 3 O N
N m m H2N *N * *N * H2N O ; O ; ;
O OH OH HN O P
O OH OH m HO OH *NH O * * *N * O * O ; O ; ; HO ; ; ; ;
40 / 439 SO3H N SO3H
N HN HN n
N O
O S O O m m O OH m S *N * *N * *N * O OH O ; O ; O ; ; em que o átomo (*) é o ponto de anexação de ligantes espaçadores ou liberáveis adicionais, os agentes citotóxicos, e/ou as moléculas de ligação; X1, Y1, U1, R5, R5’ são definidos como acima; r é 0~100; m e n são 0~6 independentemente; Além disso, preferivelmente, R1 , R2 , R3 e R4 podem conter independentemente um componente ligante liberável. O termo componente ligante liberável inclui pelo menos uma ligação que pode ser quebrada sob condições fisiológicas, como uma ligação lábil ao pH, lábil ao ácido, lábil à base, lábil à oxidação, metabolicamente lábil, bioquimicamente lábil ou lábil às enzimas. É apreciado que tais condições fisiológicas que resultam em quebra de ligação não necessariamente incluem um processo biológico ou metabólico e, em vez disso, podem incluir uma reação química padrão, como uma reação de hidrólise ou substituição, por exemplo, um endossoma com pH mais baixo que o pH citosólico e/ou reação de troca de ligação dissulfeto com um tiol intracelular, tal como uma faixa milimolar de glutationa abundante no interior das células malignas; Exemplos do componente ligante liberável R1, R2, R3 e R4 incluem, entre outros: -(CR5R6)m(Aa)r(CR7R8)n(OCH2CH2)t-, -(CR5R6)m(CR7R8)n(Aa)r(OCH2CH2)t- , -(Aa)r-(CR5R6)m(CR7R8)n(OCH2CH2)t- , -(CR5R6)m(CR7R8)n(OCH2CH2)r(Aa)t-, -(CR5R6)m-(CR7=CR8)(CR9R10)n(Aa) t(OCH2CH2)r-, -(CR5R6)m(NR11CO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-, - (CR5R6)m(Aa)t(NR11CO)(CR9R10)n(OCH2CH2)r-,- (CR5R6)m(OCO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-, - (CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-, -(CR5R6)m(CO)(Aa)t-
41 / 439
(CR9R10)n(OCH2CH2)r-, -(CR5R6)m(NR11CO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-, - (CR5R6)m-(OCO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-, - (CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-, - (CR5R6)m(CO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-, -(CR5R6)m- fenil-CO(Aa)t(CR7R8)n-, -(CR5R6)m-furil-CO(Aa)t(CR7R8)n-, -(CR5R6)m- oxazolil-CO(Aa)t(CR7R8)n-, -(CR5R6)m-tiazolil-CO(Aa)t(CCR7R8)n-, - (CR5R6)t-tienil-CO(CR7R8)n-, -(CR5R6)t-imidazolil-CO-(CR7R8)n-, -(CR5R6)t- morfolino-CO(Aa)t-(CR7R8)n-, -(CR5R6)tpiperazino-CO(Aa)t-(CR7R8)n-, - (CR5R6)t-N-metilpiperazin-CO(Aa)t-(CR7R8)n-, -(CR5R)m-(Aa)tfenil-, - (CR5R6)m-(Aa)tfuril-, -(CR5R6)m-oxazolil(Aa)t-, -(CR5R6)m-tiazolil(Aa)t-, - (CR5R6)m-tienil-(Aa)t-, -(CR5R6)m-imidazolil(Aa)t-, -(C R5R6)m- morfolino-(Aa)t-, -(CR5R6)m-piperazino-(Aa)t-, -(CR5R6)m- N-metilpiperazino-(Aa)t-, -K(CR5R6)m(Aa)r(CR7R8)n(OCH2CH2)t- , -K(CR5R6)m(CR7R8)n(Aa)r(OCH2CH2)t-, -K(Aa)r- (CR5R6)m(CR7R8)n(OCH2CH2)t-, -K(CR5R6)m(CR7R8)n(OCH2CH2)r(Aa)t- , -K(CR5R6)m-(CR7=CR8)(CR9R10)n(Aa)t(OCH2CH2)r- , -K(CR5R6)m(NR11CO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r- , -K(CR5R6)m(Aa)t(NR11CO)(CR9R10)n(OCH2CH2)r- , -K(CR5R6)m(OCO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r- , -K(CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-, -K(CR5R6)m(CO)(Aa)t- (CR9R10)n(OCH2CH2)r-, -K(CR5R6)m(NR11CO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r- , -K(CR5R6)m-(OCO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r- , -K(CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-, -K- (CR5R6)m(CO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-, -K(CR5R6)m- fenil-CO(Aa)t(CR7R8)n-, -K-(CR5R6)m-furil-CO(Aa)t-(CR7R8)n-, -K(CR5R6)m- oxazolil-CO(Aa)t(CR7R8)n-, -K(CR5R6)m-tiazolil-CO(Aa)t-(CR7R8)n- , -K(CR5R6)t-tienil-CO(CR7R8)n-, -K(CR5R6)timidazolil-CO-(CR7R8)n- , -K(CR5R6)tmorfolino-CO(Aa)t(CR7R8)n-, -K(CR5R6)tpiperazino-CO(Aa)t- (CR7R8)n-, -K(CR5R6)t-N-metilpiperazinCO(Aa)t(CR7R8)n-
42 / 439 , -K(CR5R)m(Aa)tfenil, -K-(CR5R6)m-(Aa)tfuril-, -K(CR5R6)m-oxazolil(Aa)t- , -K(CR5R6)m-tiazolil(Aa)t-, -K(CR5R6)m-tienil-(Aa)t-, -K(CR5R6)m- imidazolil(Aa)t-, -K(CR5R6)m-morfolino(Aa)t-, -K(CR5R6)m- piperazino-(Aa)tG, -K(CR5R6)mN-metilpiperazino(Aa)t-; em que m, Aa, m e n são descritos acima; t e r são 0-100 independentemente; R3, R4, R5, R6, R7, e R8 são escolhidos independentemente dentre H; haleto; alquila C1~C8; arila C2~C8, alquenila, alquinila, éter, éster, amina ou amida, os quais opcionalmente substituídos por um ou mais haletos, CN, NR1R2, CF3, OR1, Arila, heterociclo, S(O)R1, SO2R1, -CO2H, -SO3H, -OR1, -CO2R1, -CONR1, - PO2R1R2, -PO3H ou P(O)R1R2R3; K é NR1, -SS-, -C(=O)-, -C(=O)NH-, - C(=O)O-, -C=NH-O-, -C=N-NH-, -C(=O)NH-NH-, O, S, Se, B, Het (anel heterocíclico ou heteroaromático com C3-C8), ou peptídeos contendo 1-20 aminoácidos; Mais preferivelmente, R1, R2, R3 e R4 são independentemente alquila linear com 1-18 átomos de carbono, ou unidade de polietilenoxi com a fórmula (OCH2CH2)p, p = 1~5000, ou um peptídeo contendo 1~20 unidades de aminoácidos (forma L ou D) ou combinação acima.
[0080] Além disso, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, Z1 ou Z2 podem ser compostos independentemente por um ou mais componentes a seguir, como mostrados abaixo: 6-maleimidocaproil (MC), maleimido propanoil (MP), tio- maleido, ácido tio-amino-oxobutanoico,
43 / 439 ácido tio-amino-oxobutenoico, valina-citrulina (val-cit), alanina-fenilalanina (ala-phe), lisina-fenilalanina (lys-phe), lisina-alanina (lys-ala), p-aminobenziloxicarbonila (PAB), 4-tio-pentanoato (SPP), 4-tio- butirato (SPDB), 4-(N-maleimidometil)ciclo- hexano-1-carboxilato (MCC), maleimidoetil (ME), 4-tio-2-hidroxisulfonil-butirato (2-Sulfo-SPDB), aril-tiol (PySS), (4-acetil)aminobenzoato
O (SIAB), S , H
N oxilbenziltio, S aminobenziltio, dioxilbenziltio, diaminobenziltio, amino-oxilbenziltio, alcoxi amino (AOA),
44 / 439 etilenoxi (EO), 4-metil-4-ditio-pentanoico (MPDP), triazol, ditio, alquilsulfonila, alquilsulfonamida, sulfon-bisamida, fosfonodiamida, alquilfosfonamida, ácido fosfínico, ácido N-metilfosfonamídico, ácido N,N’-dimetilfosfonamídico, N,N’-dimetilfosfondiamida, hidrazina, acetimidamida; oxima, acetilacetohidrazida, aminoetil-amina, aminoetil-aminoetil- amina e L- ou D-peptídeos naturais ou não naturais contendo 1-20 aminoácidos; em que uma ligação de conexão no meio de átomos significa que ela pode conectar ligações de átomos de carbono vizinhos; a linha ondulada é o sítio aonde outra ligação pode ser conectada; Alternativamente, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, Z1 ou Z2 podem estar independentemente ausentes, mas Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, Z1 e Z2 não podem estar ausentes ao mesmo tempo.
[0081] Um estereoisômero preferido da Fórmula (I), (II), (III) e (IV) são apresentados pela Fórmula (Ia), (Ib), (Ic), (IIa), (IIb), (IIc), (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IVa), (IVb) e (IVc) a seguir:
45 / 439
Fármaco1
(Ia),
Fármaco1
(Ib),
Fármaco1
(Ic),
Fármaco1
Fármaco2
(IIa),
Fármaco1
Fármaco2
(IIb),
Fármaco1
Fármaco2
(IIc),
46 / 439 Fármaco1 (IIIa), Fármaco1 (IIIb), Fármaco1 (IIIc), Fármaco1 Fármaco2 (IVa), Fármaco1 Fármaco2 (IVb), Fármaco1 Fármaco2 (IVc), em que “ “, Q, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2, Fármaco1 e Fármaco2 são definidos como acima.
[0082] Preferivelmente, o bis-acoplamento do conjugado é
47 / 439 representado ainda pela Fórmula (I-01), (I-02), (I-03), (I-04), (I-05), (I-06), (I- 07), (I-08), (I-09), (I-10), (I-11), (I-12), (I-13), (I-14), (I-15), (I-16), (I-17), (I- 18), (I-19), (I-20), (I-21), (I-22), (I-23), (II-01), (II-02), (II-03), (II-04), (II- 05), (II-06), (II-07), (II-08), (II-09), (II-10), (II-11), (II-12), (II-13), (II-14), (II-15), (II-16), (II-17), (II-18), (III-01), (III-02), (III-03), (III-04), (III-05), (III-06), (III-07), (III-08), (III-09), (III-10), (III-11), (III-12), (III-13), (III-14), (III-15), (III-16), (III-17), (III-18), (III-19), (III-20), (IV-01), (IV-02), (IV- 03), (IV-04), (IV-05), (IV-06), (IV-07), (IV-08), (IV-09), (IV-10), (IV-11), (IV-12), (IV-13), (IV-14), (IV-15), (IV-16), (IV-17), (IV-18), (IV-19) e (IV- 20) abaixo:
Fármaco1
(I-01),
Fármaco1
(I-02),
Fármaco1
(I-03),
Fármaco1
(I-04),
48 / 439
Fármaco1
(I-05),
Fármaco1
(I-06),
Fármaco1
(I-07),
Fármaco1
(I-08),
Fármaco1
(I-09),
Fármaco1
(I-10),
49 / 439
Fármaco1
(I-11),
Fármaco1
(I-12),
Fármaco1
(I-13),
Fármaco1
(I-14),
Fármaco1
(I-15),
Fármaco1
(I-16),
50 / 439
Fármaco1
(I-17)
Fármaco1
(I-18),
Fármaco1
(I-19),
Fármaco1
(I-20),
Fármaco1
(I-21),
Fármaco1
(I-22),
Fármaco1
(I-23),
51 / 439
Fármaco1
Fármaco2
(II-01),
Fármaco1
Fármaco2
(II-02),
Fármaco1
Fármaco2
(II-03),
Fármaco1
Fármaco2
(II-04),
Fármaco1
Fármaco2
(II-05),
Fármaco1
Fármaco2
(II-06),
Fármaco1
Fármaco2
(II-07),
52 / 439
Fármaco1
Fármaco2
(II-08),
Fármaco1
Fármaco2
(II-09),
Fármaco1
Fármaco2
(II-10), Fármaco1
Fármaco2
(II-11),
Fármaco1
Fármaco2
(II-12),
Fármaco1
Fármaco2
(II-13),
53 / 439
Fármaco1
Fármaco2
(II-14)
Fármaco1
Fármaco2
(II-15),
Fármaco1
Fármaco2
(II-16),
Fármaco1
Fármaco2
(II-17),
Fármaco1
Fármaco2
(II-18),
Fármaco1
(III-01),
54 / 439
Fármaco1
(III-02),
Fármaco1
(III-03),
Fármaco1
(III-04),
Fármaco1
(III-05),
Fármaco1
(III-06),
55 / 439
Fármaco1
(III-07),
Fármaco1
(III-08),
Fármaco1
(III-09),
Fármaco
(III-10),
Fármaco1
(III-11),
Fármaco1
(III-12),
56 / 439
Fármaco1
(III-13),
Fármaco1
(III-14),
Fármaco1
(III-15),
Fármaco1
(III-16),
Fármaco1
(III-17),
Fármaco1
(III-18),
Fármaco1
(III-19),
57 / 439
Fármaco1
(III-20),
Fármaco1
Fármaco2
(IV-01),
Fármaco1
Fármaco2
(IV-02),
Fármaco1
Fármaco2
(IV-03),
Fármaco1
Fármaco2
(IV-04),
Fármaco1
Fármaco2
(IV-05),
58 / 439
Fármaco1
Fármaco2
(IV-06),
Fármaco1
Fármaco2
(IV-07),
Fármaco1
Fármaco2
(IV-08), Fármaco1
Fármaco2
(IV-09), Fármaco1
Fármaco2
(IV-10), Fármaco1
Fármaco2
(IV-11),
59 / 439
Fármaco1
Fármaco2
(IV-12),
Fármaco1
Fármaco2
(IV-13), Fármaco1
Fármaco2
(IV-14),
Fármaco1
Fármaco2
(IV-15),
Fármaco1
Fármaco2
(IV-16),
Fármaco1
Fármaco2
(IV-17),
Fármaco1
Fármaco2
(IV-18),
60 / 439 Fármaco1 Fármaco2 (IV-19), Fármaco1 Fármaco2 (IV-20), em que “ “, “ “, Q, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2, Fármaco1 e Fármaco2 são definidos como acima. Além disso, um dentre Fármaco1 e Fármaco2 pode estar independentemente ausente, mas não podem estar ausentes ao mesmo tempo.
A PREPARAÇÃO DOS CONJUGADOS DE FÁRMACOS A MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO CELULAR ATRAVÉS DE UM BIS- ACOPLAMENTO COM GRUPO 2,3-DIAMINOSSUCINILA
[0083] A preparação dos conjugados de fármacos a moléculas de ligação celular da presente invenção e as vias sintéticas para produzir os conjugados através de bis-acoplamento são mostradas nas Figuras 1-46 e nos exemplos experimentais.
[0084] Em outro aspecto, esta invenção provê um bis-ligante prontamente reativo de Fórmula (V), (VI), (VII) e (VIII) contendo grupo 2,3- diaminossucinila abaixo, em que dois ou mais resíduos de uma molécula de ligação celular podem reagir simultânea ou sequencialmente para formar a Fórmula (I), (II), (III) e (IV) acima: Fármaco1 (V),
61 / 439
Fármaco1
Fármaco2
(VI),
Fármaco1
(VII),
Fármaco1
Fármaco2
(VIII), em que: “ “ é opcionalmente uma ligação simples ou uma ligação dupla, ou uma ligação tripla, ou pode opcionalmente estar ausente; Desde que, quando representar uma ligação tripla, Lv1 e Lv2 estão ausentes; “ “, “ “, Fármaco1, Fármaco2, n, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1 e Z2 são definidos da mesma forma que na Fórmula (I)-(IV); Lv1 e Lv2 representam o mesmo grupo de partida ou diferente que pode ser reagido com um grupo tiol, amina, ácido carboxílico, selenol, fenol ou hidroxila em uma molécula de ligação celular.
Lv1 e Lv2 são selecionados independentemente dentre OH; F; Cl; Br; I; nitrofenol; N- hidroxissuccinimida (NHS); fenol; dinitrofenol; pentafluorofenol; tetrafluorofenol; difluorofenol; mono-fluorofenol; pentaclorofenol; triflato; imidazol; diclorofenol; tetraclorofenol;1-hidroxibenzotriazol; tosilato; mesilato; 2-etil-5-fenilisoxazólio-3′-sulfonato, anidridos que se autoformaram, ou formados com outro anidrido, p. ex., anidrido acético, anidrido fórmico; ou uma molécula intermediária gerada com um reagente de condensação para
62 / 439 reações de acoplamento de peptídeos ou para reações de Mitsunobu.
Os exemplos de reagentes de condensação são: EDC (N-(3-dimetilaminopropil)- N′-etilcarbodiimida), DCC (diciclohexil-carbodiimida), N,N′- diisopropilcarbodiimida (DIC), meto-p-toluenossulfonato de N-ciclo-hexil- N′-(2-morfolino-etil)carbodiimida (CMC ou CME-CDI), 1,1′- carbonildiimidazol (CDI), TBTU tetrafluoroborato de (O-(benzotriazol-1-il)- N,N,N′,N′-tetrametilurônio), hexafluorofosfato de N,N,N′,N′-tetrametil-O- (1H-benzotriazol-1-il)-urônio (HBTU), hexafluorofosfato de (benzotriazol-1- iloxi)tris(dimetilamino)-fosfônio (BOP), hexafluorofosfato de (benzotriazol- 1-iloxi)tripirrolidinofosfônio (PyBOP), cianofosfonato de dietila (DEPC), hexafluorofosfato de cloro-N,N,N′,N′-tetrametilformamidínio, 3-óxido de hexafluorofosfato de 1-[Bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazol[4,5- b]piridínio 3 (HATU), 3-óxido de hexafluorofosfato de 1- [(dimetilamino)(morfolino)metileno]-1H-[1,2,3]triazol[4,5-b]piridin-1-ío (HDMA), hexafluorofosfato de 2-cloro-1,3-dimetil-imidazolidínio (CIP), hexafluorofosfato de clorotripirrolidinofosfônio (PyCloP), hexafluorofosfato de fluoro-N,N,N′,N′-bis(tetrametileno)formamidínio (BTFFH), hexafluorofosfato de N,N,N′,N′-tetrametil-S-(1-oxido-2-piridil)tiourônio, O- tetrafluoroborato de (2-oxo-1(2H)piridil)-N,N,N′,N′-tetrametilurônio (TPTU), tetrafluoroborato de S-(1-oxido-2-piridil)-N,N,N′,N′-tetrametiltiourônio, hexafluorofosfato de O-[(etoxicarbonil)-cianometilenamino]-N,N,N′,N′- tetrametilurônio (HOTU), hexafluorofosfato de (1-ciano-2-etoxi-2- oxoetilidenaminoxi)dimetilamino-morfolino-carbênio (COMU), hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N′,N′- bis(tetrametileno)urônio (HBPyU), N-benzil-N′-ciclohexil-carbodiimida (com ou sem ligação a polímero), hexafluorofosfato de dipirrolidino(N- succinimidil-oxi)carbênio (HSPyU), hexafluorofosfato de clorodipirrolidinocarbênio (PyClU), tetrafluoroborato de 2-cloro-1,3- dimetilimidazolidínio (CIB), hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-
63 / 439 iloxi)dipiperidino-carbênio (HBPipU), tetrafluoroborato de O-(6- clorobenzotriazol-1-il)-N,N,N′,N′-tetrametilurônio (TCTU), hexafluorofosfato de bromotris(dimetilamino)-fosfônio (BroP), anidrido propilfosfônico (PPACA, T3P®), isocianeto de 2-morfolinoetila (MEI), hexafluorofosfato de N,N,N′,N′-getrametil-O-(N-succinimidil)urônio (HSTU), tetrafluoroborato de 2-bromo-1-etil-piridínio (BEP), tetrafluoroborato de O-[(etoxicarbonil)ciano- metilenamino]-N,N,N′,N′-tetra-metilurônio (TOTU), cloreto de 4-(4,6- dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (MMTM, DMTMM), tetrafluoroborato de N,N,N′,N′-tetrametil-O-(N-succinimidil)urônio (TSTU), tetrafluoroborato de O-(3,4-di-hidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazin-3-il)- N,N,N′,N′-tetrametilurônio (TDBTU), 1,1′-(azodicarbonil)-dipiperidina (ADD), di-(4-clorobenzil)azodicarboxilato (DCAD), azodicarboxilato de di- terc-butila (DBAD), azodicarboxilato de diisopropila (DIAD), azodicarboxilato de dietila (DEAD). Além disso, Lv1 e Lv2 podem ser um anidrido, formado pelo próprio ácido ou formado com outros anidridos de ácidos C1~C8; Preferivelmente, Lv1 e Lv2 são selecionados independentemente dentre um haleto (p. ex., fluoreto, cloreto, brometo e iodeto), metanossulfonila (mesila), toluenossulfonila (tosila), trifluorometil- sulfonila (triflato), trifluorometilsulfonato, nitrofenoxila, N-succinimidiloxila (NHS), fenoxila; dinitrofenoxila; pentafluorofenoxila, tetrafluorofenoxila, trifluorofenoxila, difluorofenoxila, monofluorofenoxila, pentaclorofenoxila, 1H-imidazol-1-ila, clorofenoxila, diclorofenoxila, triclorofenoxila, tetraclorofenoxila, N-(benzotriazol-il)oxila, 2-etil-5-fenilisoxazólio-3′- sulfonila, feniloxadiazol-sulfonila (-sulfona-ODA), 2-etil-5-fenilisoxazólio- ila, feniloxadiazol-ila (ODA), oxadiazol-ila, carbono insaturado (uma ligação dupla ou tripla entre carbono-carbono, carbono-nitrogênio, carbono-enxofre, carbono-fósforo, enxofre-nitrogênio, fósforo-nitrogênio, oxigênio-nitrogênio ou carbono-oxigênio), ou uma das seguintes estruturas:
64 / 439 dissulfeto; haloacetila;
haleto de acila (haleto ácido); éster N-hidroxissuccinimida;
maleimida; maleimida monossubstituída;
maleimida dissubstituída; succinimida monossubstituída; succinimida dissubstituída; -CHO aldeído;
etenossulfonila; acrila
(acriloíla); 2-(tosiloxi)acetila; 2-
(mesiloxi)acetila; 2-(nitrofenoxi)acetila;
2-(dinitrofenoxi)acetila;
2-(fluorofenoxi)-acetila; 2-(difluorofenoxi)-acetila;
2-(((trifluorometil)-
sulfonil)oxi)acetila; cetona ou aldeído, 2-(pentafluorofenoxi)acetila;
65 / 439
, metilsulfonafeniloxadiazol (ODA); ,
anidrido ácido, alquiloxiamino;
azido, alquinila ou hidrazida, em que X1’ é F, Cl, Br, I ou Lv3; X2’ é O, NH, N(R1) ou CH2; R6 é independentemente H, aromático, heteroaromático ou grupo aromático no qual um ou vários átomos de H átomos são substituídos independentemente por -R1, -halogênio, -OR1, - SR1, -NR1R2, - NO2, -S(O)R1,-S(O)2R1 ou -COOR1; Lv3 é um grupo de saída selecionado dentre F, Cl, Br, I, nitrofenol; N-hidroxissuccinimida (NHS); fenol; dinitrofenol; pentafluorofenol; tetrafluorofenol; difluorofenol; monofluorofenol; pentaclorofenol; triflato; imidazol; diclorofenol; tetraclorofenol; 1-hidroxibenzotriazol; tosilato; mesilato; 2-etil-5- fenilisoxazólio-3′-sulfonato, anidridos que se autoformaram, ou formados com outro anidrido, p. ex., anidrido acético, anidrido fórmico; ou uma molécula intermediária gerada com um reagente de condensação para reações de acoplamento de peptídeos ou para reações de Mitsunobu; Um estereoisômero preferido da Fórmula (I) é apresentado pela Fórmula (Va), (Vb), (Vc), (VIa), (VIb), (VIc), (VIIa), (VIIb), (VIIc), (VIIIa), (VIIIb) e (VIIIc) a seguir:
Fármaco1
(Va),
Fármaco1
(Vb),
66 / 439
Fármaco1
(Vc), Fármaco1
Fármaco2
(VIa), Fármaco1
Fármaco2
(VIb),
Fármaco1
Fármaco2
(VIc),
Fármaco1
(VIIa),
Fármaco1
(VIIb),
Fármaco1
(VIIc),
67 / 439 Fármaco1 Fármaco2 (VIIIa), Fármaco1 Fármaco2 (VIIIb), Fármaco1 Fármaco2 (VIIIc), em que “ “, Q, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2, Lv1, Lv2, Fármaco1 e Fármaco2 são definidos como acima.
[0085] Preferivelmente, o bis-acoplamento do conjugado é ainda representado pela Fórmula (V-01), (V-02), (V-03), (V-04), (V-05), (V-06), (V-07), (V-08), (V-09), (V-10), (V-11), (V-12), (V-13), (V-14), (V-15), (V- 16), (V-17), (V-18), (V-19), (V-20), (V-21), (V-22), (V-23), (VI-01), (VI-02), (VI-03), (VI-04), (VI-05), (VI-06), (VI-07), (VI-08), (VI-09), (VI-10), (VI- 11), (VI-12), (VI-13), (VI-14), (VI-15), (VI-16), (VI-17), (VI-18), (VII-01), (VII-02), (VII-03), (VII-04), (VII-05), (VII-06), (VII-07), (VII-08), (VII-09), (VII-10), (VII-11), (VII-12), (VII-13), (VII-14), (VII-15), (VII-16), (VII-17), (VII-18), (VII-19), (VII-20), (VIII-01), (VIII-02), (VIII-03), (VIII-04), (VIII- 05), (VIII-06), (VIII-07), (VIII-08), (VIII-09), (VIII-10), (VIII-11), (VIII-12), (VIII-13), (VIII-14), (VIII-15), (VIII-16), (VIII-17), (VIII-18), (VIII-19) e (VIII-20) abaixo:
68 / 439
Fármaco1
(V-01),
Fármaco1
(V-02),
Fármaco1
(V-03),
Fármaco1
(V-04),
Fármaco1
(V-05),
Fármaco1
(V-06),
Fármaco1
(V-07),
69 / 439
Fármaco1
(V-08),
Fármaco1
(V-09),
Fármaco1
(V-10),
Fármaco1
(V-11),
Fármaco1
(V-12),
Fármaco1
(V-13),
70 / 439
Fármaco1
(V-14),
Fármaco1
(V-15),
Fármaco1
(V-16),
Fármaco1
(V-17)
Fármaco1
(V-18),
Fármaco1
(V-19),
Fármaco1
(V-20),
71 / 439 Fármaco1 (V-21),
O O O O R1 Y1 N N R3 N Fármaco1 H H O Drug 1
H O O OO Y2 N N R2 N R4 O O H O (V-22), Fármaco1 (V-23), Fármaco1 Fármaco2 (VI-01), Fármaco1 Fármaco2 (VI-02), Fármaco1 Fármaco2 (VI-03),
O O O Fármaco1 R1 N Drug 1 Y1 N N R3
H H O
H O O Fármaco2 Drug2 Y R 2 N 2 O N R4 N
H O (VI-04),
72 / 439
Fármaco1
Fármaco2
(VI-05),
Fármaco1
Fármaco2
(VI-06),
Fármaco1
Fármaco2
(VI-07), Fármaco1
Fármaco2
(VI-08),
Fármaco1
Fármaco2
(VI-09),
Fármaco1
Fármaco2
(VI-10),
73 / 439
Fármaco1
Fármaco2
(VI-11),
Fármaco1
Fármaco2 (VI-12),
Fármaco1
Fármaco2
(VI-13),
Fármaco1
Fármaco2
(VI-14)
Fármaco1
Fármaco2
(VI-15),
Fármaco1
Fármaco2
(VI-16),
Fármaco1
Fármaco2
(VI-17),
74 / 439
Fármaco1
Fármaco2
(VI-18),
Fármaco1
(VII-01),
Fármaco1
(VII-02),
Fármaco1
(VII-03),
Fármaco1
(VII-04),
75 / 439
Fármaco1
(VII-05),
Fármaco1
(VII-06),
Fármaco1
(VII-07),
Fármaco1
(VII-08),
Fármaco1
(VII-09),
Fármaco1
(VII-10),
76 / 439
Fármaco1
(VII-11),
Fármaco1
(VII-12),
Fármaco1
(VII-13),
Fármaco1
(VII-14),
Fármaco1
(VII-15),
Fármaco1
(VII-16),
77 / 439
Fármaco1
(VII-17),
Fármaco1
(VII-18),
Fármaco1
(VII-19),
Fármaco1
(VII-20),
Fármaco1
Fármaco2
(VIII-01),
Fármaco1
Fármaco2
(VIII-02),
78 / 439
Fármaco1
Fármaco2
(VIII-03),
Fármaco1
Fármaco2
(VIII-04),
Fármaco1
Fármaco2
(VIII-05),
Fármaco1
Fármaco2
(VIII-06),
Fármaco1
Fármaco2
(VIII-07),
79 / 439 Fármaco1 Fármaco2 (VIII-08), Fármaco1 Fármaco2 (VIII-09), Fármaco1 Fármaco2 (VIII-10), Fármaco1 Fármaco2 (VIII-11), Fármaco1 Fármaco2 (VIII-12), O R1 O O Fármaco Drug1 S Y1 N N Z1 1 H H R3
O O H O Fármaco Drug2 2 S Y2 N N R4 Z2 R2 O O H (VIII-13),
80 / 439
O R1 O O Fármaco1 Drug1 S Y1 N N Z1 H H R3 O O Fármaco2 H O Drug2 S Y2 N N R4 Z2 R2 O O H (VIII-14),
Fármaco1
Fármaco2
(VIII-15),
Fármaco1
Fármaco2
(VIII-16),
Fármaco1
Fármaco2
(VIII-17),
Fármaco1
Fármaco2
(VIII-18), Fármaco1
Fármaco2
(VIII-19),
Fármaco1
Fármaco2
(VIII-20),
81 / 439 em que “ “, “ “, Q, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2, Fármaco1 e Fármaco2 são definidos como acima ； X1 e X1’ são independentemente H, F, Cl, Br, I, OTs, OMs, OTf, N3, CHO, -C=CH, , ArC(=O)R1, C(=O)NHNH2, -O-NH2, nitrofenol; N-hidroxi- succinimida (NHS); fenol; dinitrofenol; pentafluorofenol; tetrafluorofenol; difluorofenol; mono-fluorofenol; pentaclorofenol; triflato; imidazol; diclorofenol; tetraclorofenol; 1-hidroxibenzotriazol; tosilato; mesilato; 2-etil- 5-fenilisoxazólio-3′-sulfonato, anidridos que se autoformaram, ou formados com outro anidrido, p. ex., anidrido acético, anidrido fórmico; O-NHS (O-N- hidrossuccinimida), O-imidazol, O-triazol, O-tetrazol, O-Ar, O-ArNO2, O- Ar(NO2)2, O-ArF4, O-ArF3, O-ArF5, O-ArF2, O-ArF, O-ArCl4, O-ArCl3, O- ArCl5, O-ArCl2, O-ArCl, O-ArSO3H, O-ArOPO3H2, O-Ar(NO2)COOH, S- Ar(NO2)2COOH, O-piridina,O-nitrofenol, O-dinitrofenol, O-pentafluorofenol, O-tetrafluorofenol, O-trifluorofenol, O-difluorofenol, O-fluorofenol, O- pentaclorofenol, O-tetraclorofenol, O-tricloro-fenol, O-diclorofenol, O- clorofenol, O-piridina, O-nitropiridina, O-dinitropiridina, O-alquila C1-C8, O- triflato, O-benzotriazol, S-Ar, S-ArNO2, S-Ar(NO2)2, S-ArF4, S-ArF3, S-ArF5, S-ArF2, S-ArF, S-ArCl4, S-ArCl3, S-ArCl5, S-ArCl2, S-ArCl, S-ArSO3H, S- ArOPO3H2, S-Ar(NO2)COOH, S-Ar(NO2)2COOH, S-piridina, S-S-piridina, S-nitropiridina, S-dinitropiridina, S-alquila C1-C8, S-S-alquila C1-C8, S- triflato, S-benzotriazol, em que Ar é anel aromático C3-C8; ou uma molécula intermediária gerada com um reagente de condensação para reações de acoplamento de peptídeos ou para reações de Mitsunobu.
[0086] Em outro aspecto, esta invenção provê um bis-ligante prontamente reativo de Fórmula (IX) e (X) a seguir, em que um, dois ou mais grupos funcionais de uma molécula citotóxica podem reagir simultânea ou sequencialmente para formar a Fórmula (I), (II), (III) ou (IV) acima:
82 / 439
(IX),
(X), em que: “ “, “ “, Q, n, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1 e Z2 são definidos da mesma forma que na Fórmula (I)-(IV); e “ “, Lv1, Lv2, Lv1’ e Lv2’ são definidos da mesma forma que Lv1 e Lv2 na Fórmula (V)- (VIII); Lv1, Lv2, Lv1’ e Lv2’ são um grupo funcional que pode reagir independentemente com grupos de resíduos de um fármaco citotóxico simultânea ou sequencialmente para formar um composto de Fórmula (I), (II), (III) e (IV) respectivamente; Além disso, preferivelmente, Lv1, Lv2, Lv1’ e Lv2’ são independentemente um substituinte dissulfeto, maleimido, haloacetila, alcoxiamina, azido, cetona, aldeído, hidrazina, amino, hidroxila, carboxilato, imidazole tiol ou alcino; ou um éster de N-hidroxissuccinimida, éster p- nitrofenílico, éster dinitrofenílico, éster pentafluorofenílico, éster pentaclorofenílico; éster tetrafluorofenílico; éster difluorofenílico; éster monofluorofenílico; ou éster pentaclorofenílico, éster diclorofenílico, éster tetraclorofenílico ou éster 1-hidroxibenzotriazol; um triflato, mesilato ou tosilato; 2-etil-5-fenílicoisoxa-zólio-3′-sulfonato; um piridildissulfeto ou nitropiridildissulfeto; um grupo maleimida, haloacetato, acetilenodicarboxílico ou haleto de ácido carboxílico (fluoreto, cloreto, brometo ou iodeto). Preferivelmente X e Y têm uma das seguintes estruturas:
83 / 439 éster de N-hidroxissuccinimida; maleimida; dissulfeto; haloacetila; haleto de acila
O S X2' (haleto ácido), O etenossulfonila; acrila (acriloíla); 2-(tosiloxi)acetila; 2- (mesiloxi)acetila; 2-(nitrofenoxi)acetila;
O
F O 2-(dinitrofenoxi)acetila; X2' 2- (fluorofenoxi)-acetila; 2-(difluorofenoxi)-acetila; 2-(((trifluorometil)-sulfonil)oxi)acetil; cetona ou aldeído, 2- (pentafluorofenoxi)acetila; , metilsulfona feniloxadiazol (ODA); , anidrido ácido, alquiloxiamino; azido, alquinila ou hidrazida. em que X1’ é F, Cl, Br, I ou Lv3; X2’ é O, NH, N(R1), ou CH2; R3 e R5 são H, R1, grupo aromático, heteroaromático ou aromático em que um ou vários átomos de H átomos são substituídos independentemente por -R1, -halogênio, -OR1, -SR1, -NR1R2, - NO2, -S(O)R1, -S(O)2R1 ou -COOR1; Lv3 é um grupo de saída selecionado dentre
84 / 439 metanossulfonila (mesila), toluenossulfonila (tosila), trifluorometil-sulfonila (triflato), trifluorometilsulfonato, nitrofenoxila, N-succinimidiloxila (NHS), fenoxila; dinitrofenoxila; pentafluorofenoxila, tetrafluorofenoxila, trifluorofenoxila, difluorofenoxila, monofluorofenoxila, pentaclorofenoxila, 1H-imidazol-1-ila, clorofenoxila, diclorofenoxila, triclorofenoxila, tetraclorofenoxila, N-(benzotriazol-il)oxila, 2-etil-5-fenilisoxazólio-ila, feniloxadiazol-ila (ODA), oxadiazol-ila ou uma molécula intermediária gerada com um reagente de condensação para reações de Mitsunobu, em que R1 e R2 são definidos acima; Preferivelmente, um bis-ligante composto para preparação do conjugado é representado ainda pela Fórmula (IX-01), (IX-02), (IX-03), (IX- 04), (IX-05), (IX-06), (IX-07), (IX-08), (IX-09), (IX-10), (IX-11), (IX-12), (IX-13), (IX-14), (IX-15), (IX-16), (IX-17), (IX-18), (IX-19), (IX-20), (IX- 21), (IX-22), (IX-23), (X-01), (X-02), (X-03), (X-04), (X-05), (X-06), (X-07), (X-08), (X-09), (X-10), (X-11), (X-12), (X-13), (X-14), (X-15), (X-16), (X- 17), (X-18), (X-19) e (X-20) abaixo:
(IX-01),
(IX-02),
(IX-03),
85 / 439
O O O R1 N S Lv1' Y1 N N R3
H H Q O
H O O Lv2' Y2 N S R2 N R4 N n
O H O (IX-04),
O O O Lv1' Y R1 N S 1 N N R3
H H Q O
H O O Lv2' Y2 N S R2 N R4 N n
O H O (IX-05), (IX-06), (IX-07), (IX-08), (IX-09),
86 / 439
(IX-10),
(IX-11),
(IX-12),
(IX-13),
(IX-14),
(IX-15),
87 / 439
(IX-16),
(IX-17)
(IX-18),
(IX-19),
(IX-20),
(IX-21),
88 / 439
(IX-22),
(IX-23),
(X-01),
(X-02),
(X-03),
(X-04),
89 / 439
(X-05),
(X-06),
(X-07),
(X-08),
(X-09),
(X-10),
90 / 439 (X-11), (X-12), (X-13), (X-14), (X-15), R1 O O Lv1 S Y1 N N R3 H H Z1
Q O
H O S Y2 N Lv2 N Z2 R2 O R4 n O H (X-16), (X-17),
91 / 439 (X-18),
H O O N R1 R3 Lv1
N N H H Z1
Q O O H O
N N N Z2 Lv2 H R2 O R4 n H (X-19),
H O O N R1 N R3 Lv1
N H H Z1
Q O O H O
N N N Z2 Lv2 H R2 O R4 n H (X-20), em que “ “, “ “, Q, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2, Lv1, Lv2, Lv1’ e Lv2’ são definidos como acima. Além disso, um dentre Fármaco1 e Fármaco2 pode estar independentemente ausente, mas não podem estar ausentes ao mesmo tempo.
[0087] Exemplos dos grupos funcionais, Lv1, Lv2, Lv1’ e Lv2’ que permitem a reação com o terminal do grupo amina ou hidroxila de um fármaco/agente citotóxico, podem ser, entre outros, ésteres de N- hidroxissuccinimida, ésteres p-nitrofenílicos, ésteres dinitrofenílicos, ésteres pentafluorofenílicos, cloretos de ácido carboxílico ou anidrido de ácido carboxílico; com o terminal de tiol de um agente citotóxico, podem ser, entre outros, piridildissulfetos, nitropiridildissulfetos, maleimidas, haloacetatos, metilsulfonafeniloxadiazol (ODA), cloretos de ácido carboxílico e anidrido de ácido carboxílico; com o terminal de cetona ou aldeído, podem ser, entre outros, aminas, alcoxiaminas, hidrazinas, aciloxilamina ou hidrazida; com o terminal da azida, podem ser, entre outros, alcino.
[0088] Em outro aspecto, esta invenção provê um bis-ligante prontamente reativo de Fórmula (XI) e (XII) abaixo, em que uma molécula
92 / 439 citotóxica e uma molécula de ligação celular podem reagir independentemente, ou de modo simultâneo ou sequencialmente, e formar a Fórmula (I)-(IV).
(XI), (XII), em que “ “, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1 e Z2 são definidos da mesma forma que na Fórmula (I)-(IV); e “ “, Lv1, Lv2, Lv1’ e Lv2’ são definidos da mesma forma que Lv1 e Lv2 na Fórmula (V)- (VIII); reagente de condensação para reações de Mitsunobu, em que R1 e R2 são definidos acima; Preferivelmente, um composto bis-ligante para preparação do conjugado é ainda representado pela Fórmula (XI-01), (XI-02),
93 / 439
(XI-03),
(XI-04),
(XI-05),
(XI-06)
(XI-07),
(XI-08),
(XI-09),
94 / 439
(XI-10),
(XI-11),
(XI-12),
(XI-13),
(XI-14),
(XI-15),
95 / 439
(XI-16),
(XI-17),
(XI-18),
(XII-01),
(XII-02),
(XII-03),
96 / 439
(XII-04),
(XII-05),
(XII-06),
(XII-07),
(XII-08),
(XII-09),
97 / 439 (XII-10), (XII-11), (XII-12), (XII-13), (XII-14), (XII-15), R1 O O Lv1' Y1 N Z1 Lv1
N H H R3
O
H O Lv2' Y2 N Z2 N R4 Lv2 R2 O O H (XII-16),
98 / 439 (XII-17), R1 O O Lv1' Y1 N Z1 Lv1
N H H R3
O
H O Lv2' Y2 N Z2 N R4 Lv2 R2 O O H (XII-18), (XII-19), (XII-20), O R1 O O Lv1
N N N X1 H H H R3 Z1
O H O
N 1 Lv2 X' HN R2 O N R4 Z2 H (XII-21), (XII-22), (XII-23),
99 / 439 (XII-24), em que “ “, “ “, Q, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2, Lv1, Lv2, Lv1’, Lv2’, X1 e X1’ são definidos como acima; Algumas preparações da Fórmula (I), (II), (III) e (IV) são mostradas estruturalmente nas Figuras 1~26 e nos exemplos experimentais. Para a síntese do conjugado de Fórmula (I), (II), (III) ou (IV), em geral, dois grupos funcionais em um fármaco ou em uma molécula com toxicidade celular reagem em primeiro lugar sequencial ou simultaneamente com os grupos Lv1’, Lv2’, Lv1 e Lv2 do ligante de Fórmula (XI) e (XII) em um solvente químico ou em um meio aquoso contendo solventes orgânicos 0,1%- 99,5% ou em meio aquoso 100% para formar um composto de Fórmula (V), (VI), (VII) ou (VIII). Em seguida, o composto de Fórmula (V), (VI), (VII) ou (VIII), pode ser opcionalmente isolado inicialmente, ou pode reagir imediatamente, de modo simultâneo ou sequencialmente, com dois ou mais resíduos of uma molécula de ligação celular, preferivelmente um par de tióis livres que são gerados através da redução de ligações dissulfeto da molécula de ligação celular a 0-60ºC, em meio aquoso de pH 5~9 com ou sem adição de 0~30% de solventes orgânicos misturáveis com água (miscíveis), como DMA, DMF, etanol, metanol, acetona, acetonitrila, THF, isopropanol, dioxano, propilenoglicol ou etilenodiol para formar um composto conjugado de Fórmula (I), (II), (III) ou (IV).
[0089] Alternativamente, os conjugados da Fórmula (I), (II), (III) ou (IV) podem também ser obtidos através da reação inicialmente dos ligantes da Fórmula (XI) ou (XII) com dois ou mais resíduos de uma molécula de ligação celular, preferivelmente um par de tióis livres gerados através da redução de ligações dissulfeto da molécula de ligação celular a 0-60ºC, em meio aquoso
100 / 439 de pH 5~9 com ou sem adição de 0~30% de solventes orgânicos misturáveis com água (miscíveis), para formar a molécula de ligação celular modificada de Fórmula (IX) ou (X). Os pares de tióis são pares preferidos de ligações dissulfeto que são reduzidas a partir das ligações dissulfeto intercadeia do agente de ligação celular por um agente de redução que pode ser selecionado dentre ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), L-glutationa (GSH), tris(2- carboxietil)fosfina (TCEP), 2-mercaptoetilamina (β-MEA) e/ou beta mercaptoetanol (β-ME, 2-ME), em meio aquoso de pH 4~9 com ou sem adição de 0~30% de solventes orgânicos misturáveis com água (miscíveis). Os grupos reativos de Lv1’, Lv2’, Lv1 e Lv2 na Fórmula (XI) e (XII), os quais podem ser independentemente dissulfeto, tiol, tioéster, maleimido, haloacetila, azido, 1-ino, cetona, aldeído, alcoxiamino, triflato, carbonilimidazol, tosilato, mesilato, 2-etil-5-fenilisoxazólio-3′-sulfonato ou ésteres nitrofenólicos de ácido carboxílico, N-hidroxissuccinimida (NHS), fenol; dinitrofenol, pentafluorofenol, tetrafluorofenol, difluorofenol, monofluorofenol, pentaclorofenol, diclorofenol, tetraclorofenol, 1- hidroxibenzotriazol, anidridos ou grupos hidrazida, ou outros derivados éster de ácidos, podem então reagir com um ou dois grupos em um fármaco/agente citotóxico, simultânea ou sequencialmente a 0-60ºC, meio aquoso pH 4~9,5 com ou sem adição de 0~30% de solventes orgânicos misturáveis com água (miscíveis), para produzir um conjugado da Fórmula (I), (II), (III) ou (IV), depois de purificação em coluna ou diálise.
Os grupos reativos de um fármaco/agente citotóxico reagem com a molécula de ligação celular modificada de Fórmula (IX) ou (X) de maneiras diferentes correspondentes.
Por exemplo, um acoplamento contendo ligações dissulfeto nos conjugados agente de ligação celular-fármaco de Fórmula (I), (II), (III) ou (IV) é alcançado por uma troca de dissulfeto entre a ligação dissulfeto no agente de ligação celular modificado de Fórmula (IX) ou (X) e um fármaco tendo um grupo tiol livre; Um acoplamento contendo ligações tioéter nos conjugados
101 / 439 agente de ligação celular-fármaco de Fórmula (I), (II), (III) ou (IV) é alcançado por reação do agente de ligação celular modificado por maleimido ou haloacetila ou etilsulfonila da Fórmula (IX) ou (X) e um fármaco com um grupo tiol livre; Um acoplamento contendo uma ligação de uma hidrazona lábil a ácidos nos conjugados pode ser alcançado por reação de um grupo carbonila do fármaco ou composto de Fórmula (IX) ou (X) com a porção de hidrazida no composto de Fórmula (IX) ou (X) ou o fármaco correspondente, por métodos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, P.
Hamann et al., Cancer Res. 53, 3336-34, 1993; B.
Laguzza et al., J.
Med.
Chem., 32; 548-55, 1959; p.
Trail et al., Cancer Res., 57; 100-5, 1997); Um acoplamento contendo uma ligação de triazol nos conjugados pode ser alcançada por reação de um grupo de 1-ina do fármaco ou composto de Fórmula (IX) ou (X) com a porção azido no outro equivalente, por meio da química de clique (cicloadição de Huisgen) (Lutz, J-F. et al, 2008, Adv.
Fármaco Del.
Rev.60, 958-70; Sletten, E.
M. et al 2011, AccChem.
Research 44, 666–76). Um acoplamento contendo uma ligação de oxima nos conjugados agente de ligação celular-fármaco acoplada via oxima é obtido pela reação de um grupo de uma cetona ou aldeído no agente de ligação celular modificado de Fórmula (IX) ou (X) ou um fármaco com um grupo de oxiamina em um fármaco ou no agente de ligação celular modificado de Fórmula (IX) ou (X) respectivamente.
Um fármaco contendo tiol pode reagir com o ligante da molécula de ligação celular modificada de Fórmula (IX) ou (X) portando um substituinte de maleimido, haloacetila ou etilsulfonila em pH 5,5~9,0 em tampão aquoso para fornecer um acoplamento de tioéter no conjugado molécula de ligação celular-fármaco de Fórmula (I), (II), (III) ou (IV). Um fármaco contendo tiol pode sofrer troca de dissulfeto com um ligante modificado de Fórmula (IX) ou (X) portando uma fração piridilditio para fornecer um conjugado tendo um acoplamento com ligação dissulfeto.
Um fármaco portando um grupo hidroxila ou um grupo tiol pode ser reagido com
102 / 439 um ligante de ponte modificada de Fórmula (IX) ou (X) portando um halogênio, particularmente o haleto alfa de carboxilatos, na presença de uma base leve, p. ex., pH 8,0~9,.5, para fornecer um fármaco modificado portando um acoplamento de éter ou tiol éter. Um grupo hidroxila em um fármaco pode ser condensado com um ligante cruzado de Fórmula (XI) ou (XII) portando um grupo carboxila, na presença de um agente desidratante, como EDC ou DCC, para fornecer acoplamento de éster, então o ligante em ponte modificado pelo fármaco em questão de Fórmula (IX) ou (X) sofre a conjugação com uma molécula de ligação celular. Um fármaco contendo um grupo amino pode condensar com um grupo de éster carboxílico de NHS, imidazol, nitrofenol; N-hidroxissuccinimida (NHS); fenol; dinitrofenol; pentafluorofenol; tetrafluorofenol; difluorofenol; monofluorofenol; pentaclorofenol; triflato; imidazol; diclorofenol; tetraclorofenol; 1- hidroxiben-zotriazol; tosilato; mesilato; 2-etil-5-fenilisoxazólio-3′-sulfonato na molécula de ligação celular-ligante de Fórmula ((IX) ou (X) para fornecer um conjugado através de acoplamento da ligação amida.
[0090] O conjugado sintético pode ser purificado por meios bioquímicos padrão, como filtração em gel em uma coluna Sephadex G25 ou Sephacryl S300, cromatografia de adsorção e troca iônica ou por diálise. Em alguns casos, uma molécula pequena como agente de ligação celular (por exemplo, ácido fólico, hormônio estimulador de melanócitos, EGF etc.) conjugada com fármacos moleculares pequenos pode ser purificada por cromatografia, como por HPLC, cromatografia em coluna de média pressão ou cromatografia de troca iônica.
[0091] A fim de alcançar um maior rendimento da reação de conjugação do complexo molécula citotóxica-bis ligante da Fórmula (V), (VI), (VII) ou (VIII) com um par de tióis livres na molécula de ligação celular, preferivelmente em um anticorpo, pode ser necessária a adição de uma pequena porcentagem de solventes orgânicos miscíveis em água, ou agentes
103 / 439 de transferência de fase, à mistura de reação. Para reticulação, o reagente (ligante) de Fórmula (V), (VI), (VII) ou (VIII) pode ser inicialmente dissolvido em um solvente orgânico polar que é miscível com água, por exemplo em diferentes álcoois, como metanol, etanol, propanol, acetona, acetonitrila, tetrahidrofurano (THF), 1,4-dioxano, dimetilformamida (DMF), dimetilacetamida (DMA) ou dimetilsulfóxido (DMSO) em alta concentração, por exemplo, 1-500 mM. Enquanto isso, a molécula de ligação celular, como o anticorpo dissolvido em um tampão aquoso de pH 4~9,5, preferivelmente pH 6~8,5, em concentração de 1~50 mg/mL, foi tratada com 0,5~20 equivalentes de TCEP ou DTT por 20 minutos a 48 horas. Após a redução, o DTT pode ser removido por purificação cromatográfica SEC. O TCEP também pode ser opcionalmente removido por cromatografia SEC ou cromatografia de troca iônica, permanecer na mistura de reação para a próxima etapa da reação sem purificação adicional. Além disso, a redução de anticorpos ou dos outros agentes de ligação celular com TCEP pode ser realizada juntamente com uma molécula de fármaco-ligante existente de Fórmula (V), (VI), (VII) ou (VIII), para a qual a conjugação reticulada das moléculas de ligação celular pode ser alcançada simultaneamente junto com a redução de TCEP.
[0092] As soluções aquosas para a modificação de agentes de ligação celular são tamponadas entre pH 4 e 9, preferivelmente entre 6,0 e 7,5 e podem conter quaisquer sais tampão não nucleofílicos úteis para essas faixas de pH. Os tampões típicos incluem os tampões fosfato, acetato, trietanolamina HCl, HEPES e MOPS, os quais podem conter componentes adicionais, como ciclodextrinas, Hidroxipropil-β-ciclodextrina, polietilenoglicóis, sacarose e sais, por exemplo, NaCl e KCl. Após a adição do fármaco-ligante de Fórmula (V), (VI), (VII) ou (VIII) à solução contendo as moléculas de ligação celular reduzidas, a mistura de reação é incubada a uma temperatura de 4ºC a 45ºC, preferivelmente a 15ºC - temperatura ambiente. O progresso da reação pode
104 / 439 ser monitorado medindo a diminuição na absorção em um determinado comprimento de onda UV, como a 254 nm, ou o aumento na absorção em um determinado comprimento de onda UV, como 280 nm, ou outro comprimento de onda apropriado. Após a conclusão da reação, o isolamento do agente de ligação celular modificado pode ser realizado de maneira rotineira, utilizando, por exemplo, uma cromatografia de filtração em gel, uma cromatografia de troca iônica, uma cromatografia adsortiva ou cromatografia em coluna sobre sílica gel ou alumina, cristalização, cromatografia em camada fina preparatória, cromatografia de troca iônica (catiônica ou aniônica) ou HPLC.
[0093] A extensão da modificação pode ser avaliada medindo a absorbância do grupo nitropiridinationa, dinitropiridinadiona, piridinationa, carboxilamidopiridinaditiona e dicarboxil-amidopiridina ditiona liberada através de espectros de UV. Para a conjugação sem um grupo cromóforo, a reação de modificação ou conjugação pode ser monitorada por LC-MS, preferivelmente por espectrometria de massa UPLC-QTOF, ou eletroforese capilar-espectrometria de massa (CE-MS). Os ligantes cruzados em ponte aqui descritos possuem diversos grupos funcionais que podem reagir com quaisquer fármacos, preferivelmente agentes citotóxicos que possuem um substituinte adequado. Por exemplo, as moléculas de ligação celular modificadas portando um substituinte amino ou hidroxila podem reagir com fármacos portando um éster de N-hidroxissuccinimida (NHS) éster, as moléculas de ligação celular modificadas portando um substituinte tiol podem reagir com os fármacos portando um grupo maleimido ou haloacetila. Além disso, as moléculas de ligação celular modificadas portando um substituinte carbonila (cetona ou aldeído) podem reagir com fármacos portando uma hidrazida ou alcoxiamina. O técnico no assunto pode determinar rapidamente qual ligante usar com base na reatividade conhecida do grupo funcional disponível nos ligantes. Agentes de Ligação Celular
105 / 439
[0094] A molécula de ligação celular, Cb ou Q, que compreende os conjugados e os agentes de ligação celular modificados da presente invenção pode ser de qualquer tipo atualmente conhecido, ou que se torna conhecido, molécula que se liga a, complexa com, ou reage com uma porção de uma população de células que se pretende ser terapeuticamente ou de outro modo biologicamente modificada.
[0095] Os agentes de ligação celular incluem, entre outros, proteínas de grande peso molecular, como, por exemplo, anticorpo, uma proteína semelhante a um anticorpo, anticorpos completos (anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, dímeros, multímeros, anticorpos multiespecíficos (p. ex., um anticorpo biespecífico, anticorpo triespecífico ou anticorpo tetraespecífico); anticorpos de cadeia única; fragmentos de anticorpos como Fab, Fab', F(ab')2, Fv, [Parham, J. Immunol. 131, 2895-902 (1983)], fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id), CDRs, diabody, triabody, tetrabody, minianticorpo, a probody, um fragmento de probody, pequenas proteínas imunes (SIP) e fragmentos de ligação aos epítopos de qualquer dos itens acima, que se ligam imunoespecificamente a antígenos de células cancerosas, antígenos virais, antígenos microbianos ou uma proteína gerada pelo sistema imunológico capaz de reconhecer, se ligar a um antígeno específico ou exibir a desejada atividade biológica (Miller et al (2003) J. of Immunology 170: 4854-61); interferons (como tipo I, II, III); peptídeos; linfocinas como IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-5, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25,GM-CSF, interferon-gama (IFN-γ); hormônios como insulina, TRH (hormônios liberadores de tirotropina), MSH (hormônio estimulador de melanócitos), hormônios esteroides, como andrógenos e estrógenos, hormônio estimulador de melanócitos (MSH); fatores de crescimento e fatores estimuladores de colônias, como fatores de crescimento epidérmico (EGF), fator estimulador
106 / 439 de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), fator de crescimento transformante, (TGF), como TGFα, TGFβ, insulina e fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGF-I, IGF-II) G-CSF, M-CSF e GM-CSF [Burgess, Immunology Today, 5, 155-8 (1984)]; fatores de crescimento do vírus Vaccinia (VGF); fatores de crescimento de fibroblastos (FGFs); proteínas de menor peso molecular, polipeptídeos, peptídeos e hormônios peptídicos, como bombesina, gastrina, peptídeo liberador de gastrina; fatores de crescimento derivados de plaquetas; interleucina e citocinas, como interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), fatores inibidores da leucemia, fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF); vitaminas, como folato; apoproteínas e glicoproteínas, tais como transferrina [O'Keefe et al, 260 J. Biol. Chem. 932-7 (1985)]; proteínas ou lipoproteínas de ligação a açúcar, como lectinas; moléculas de transporte de nutrientes celular; e pequenos inibidores moleculares, como inibidores de antígeno da membrana específica da próstata (PSMA) e pequenos inibidores de tirosina quinase molecular (TKI), não peptídeos ou qualquer outra molécula ou substância de ligação celular, como polímeros bioativos (Dhar, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 2008, 105, 17356-61); dendrímeros bioativos (Lee, et al, Nat. Biotechnol. 2005, 23, 1517-26; Almutairi, et al; proc. Natl. Acad. Sci. 2009, 106, 685-90); nanopartículas (Liong, et al, ACS Nano, 2008, 2, 1309-12; Medarova, et al, Nat. Med. 2007, 13, 372-7; Javier, et al, Bioconjugate Chem. 2008, 19, 1309-12); lipossomas (Medinai, et al, Curr. Phar. Des. 2004, 10, 2981-9); capsídeos virais (Flenniken, et al, Viruses Nanotechnol. 2009, 327, 71-93).
[0096] Em geral, um anticorpo monoclonal é preferido como um agente de ligação à superfície celular, se houver um anticorpo adequado disponível. E o anticorpo pode ser murino, humano, humanizado, quimérico ou derivado de outras espécies de.
[0097] A produção de anticorpos utilizados na presente invenção
107 / 439 envolve procedimentos in vivo ou in vitro ou combinações dos mesmos. Os métodos para a produção de anticorpos peptídicos antirreceptor policlonais são bem conhecidos na técnica, como na Patente dos EUA No 4 493 795 (concedida a Nestor et al). Um anticorpo monoclonal é tipicamente produzido pela fusão de células de mieloma com células de baço de um camundongo que foi imunizado com o antígeno desejado (Köhler, G.; Milstein, C. (1975). Nature 256: 495-7). Os procedimentos detalhados estão descritos em “Antibodies - A Laboratory Manual”, Harlow e Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova York (1988), cujo conteúdo é aqui incorporado por referência. Em particular, os anticorpos monoclonais são produzidos pela imunização de camundongos, ratos, hamsters ou qualquer outro mamífero com o antígeno de interesse, como a célula alvo intacta, antígenos isolados a partir da célula-alvo, vírus inteiro, vírus inteiro atenuado e proteínas virais. Os esplenócitos são tipicamente fundidos com células de mieloma usando polietilenoglicol (PEG) 6000. Os híbridos fundidos são selecionados por sua sensibilidade à HAT (hipoxantina-aminopterina-timina). Os hibridomas que produzem um anticorpo monoclonal útil na prática desta invenção são identificados por sua capacidade de imunorreagir receptores especificados ou inibir a atividade do receptor nas células alvo.
[0098] Um anticorpo monoclonal usado na presente invenção pode ser produzido dando início a uma cultura de hibridoma monoclonal compreendendo um meio nutriente contendo um hibridoma que secreta moléculas de anticorpo da especificidade de antígeno apropriada. A cultura é mantida sob condições e por um período de tempo suficiente para o hibridoma secretar as moléculas de anticorpo no meio. O meio contendo anticorpo é então coletado. As moléculas de anticorpo podem então ser adicionalmente isoladas por técnicas bem conhecidas, tais como o uso de cromatografia por afinidade de proteína A; cromatografias de exclusão por tamanho, aniônica, catiônica ou hidrofóbica (particularmente por afinidade pelo antígeno
108 / 439 específico após a proteína A e cromatografia em coluna de dimensionamento); centrifugação, solubilidade diferencial ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas.
[0099] Os meios úteis para a preparação destas composições são bem conhecidos na técnica e estão disponíveis comercialmente e incluem meios de cultura sintéticos. Um meio sintético exemplar é o meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM; Dulbecco et al., Virol. 8, 396 (1959)) suplementado com glicose 4,5 g/L, glutamina 0~20 mM, soro fetal bovino 0~20%, quantidade em várias ppm de metais pesados, como Cu, Mn, Fe ou Zn etc. e/ou os outros metais pesados adicionados em suas formas de sal e com um agente antiespumante, como copolímero em bloco de polioxietileno- polioxipropileno.
[00100] Além disso, linhagens de células produtoras de anticorpos também podem ser criadas por outras técnicas além da fusão, como transformação direta de linfócitos B com DNA oncogênico ou transfecção com oncovírus, como o vírus Epstein-Barr (EBV, também chamado de herpesvírus humano 4 (HHV-4)) ou herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV). Ver Patentes dos EUA Nos 4 341 761; 4 399 121; 4 427 783; 4 444 887; 4 451 570; 4 466 917; 4 472 500; 4 491 632; 4 493 890. Um anticorpo monoclonal também pode ser produzido através de um peptídeo antirreceptor ou peptídeos contendo o terminal carboxila, como descrito bem conhecido na técnica. Ver Niman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 4949-53 (1983); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 178-82 (1985); Lei et al. Biochemistry 34(20): 6675-88, (1995). Tipicamente, o peptídeo antirreceptor ou um análogo peptídico é utilizado sozinho ou conjugado com um veículo imunogênico, como imunogênico para a produção de anticorpos monoclonais do peptídeo antirreceptor.
[00101] Existem também várias outras técnicas bem conhecidas para produzir anticorpos monoclonais como moléculas de ligação nesta invenção.
109 / 439 São especialmente úteis métodos para produzir anticorpos totalmente humanos. Um método é a tecnologia de expressão em fagos (phage display) que pode ser usada para selecionar uma gama de anticorpos humanos que se ligam especificamente ao antígeno usando métodos de enriquecimento por afinidade. A expressão em fagos foi descrita detalhadamente na literatura e a construção e o rastreamento de bibliotecas de expressão em fagos são bem conhecidos na técnica, ver, p. ex., Dente et al, Gene. 148(1):7-13 (1994); Little et al, Biotechnol Adv. 12(3): 539-55 (1994); Clackson et al., Nature 352: 264-8 (1991); Huse et al., Science 246: 1275-81 (1989).
[00102] Os anticorpos monoclonais derivados pela técnica de hibridoma a partir de outras espécies de que não as humanas, como o camundongo, podem ser humanizados para evitar anticorpos humanos anticamundongo quando infundidos em humanos. Entre os métodos mais comuns de humanização de anticorpos estão a região determinante da complementaridade, enxerto e resurfacing. Estes métodos foram descritos extensivamente, ver, p. ex., as Patentes dos EUA Nos 5 859 205 e 6,797,492; Liu et al, Immunol Rev. 222: 9-27 (2008); Almagro et al, Front Biosci. 13: 1619-33 (2008); Lazar et al, Mol Immunol. 44(8): 1986-98 (2007); Li et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103(10): 3557-62 (2006), cujos conteúdos são aqui incorporados por referência. Os anticorpos totalmente humanos também podem ser preparados imunizando camundongos, coelhos, macacos ou outros mamíferos transgênicos, carregando grandes porções das cadeias pesada e leve da imunoglobulina humana, com um imunogênio. Exemplos de tais camundongos são: o Xenomouse. (Abgenix/Amgen), o HuMAb-Mouse (Medarex/BMS), o VelociMouse (Regeneron), ver também as Patentes dos EUA Nos 6 596 541, 6 207 418, 6 150 584, 6 111 166, 6 075 181, 5 922 545, 5 661 016, 5 545 806, 5 436 149 e 5 569 825. Na terapia humana, regiões variáveis murinas e regiões constantes humanas também podem ser fundidas para construir os chamados “anticorpos quiméricos” que são
110 / 439 consideravelmente menos imunogênicos no homem do que mAbs murinos (Kipriyanov et al, Mol Biotechnol. 26: 39-60 (2004); Houdebine, Curr Opin Biotechnol. 13: 625-9 (2002), cujos conteúdos são aqui incorporados por referência). Além disso, a mutagênese sítio dirigida na região variável de um anticorpo pode resultar em um anticorpo com maior afinidade e especificidade pelo seu antígeno (Brannigan et al, Nat Rev Mol Cell Biol. 3: 964-70, (2002)); Adams et al, J Immunol Methods. 231: 249-60 (1999)) e a troca de regiões constantes de um mAb pode melhorar sua capacidade de mediar funções efetoras de ligação e citotoxicidade.
[00103] Anticorpos imunoespecíficos para um antígeno de célula maligno também podem ser obtidos comercialmente ou produzidos por qualquer método conhecido por um especialista na técnica, como por exemplo, síntese química ou técnicas de expressão recombinante. A sequência nucleotídica que codifica anticorpos imunoespecíficos para um antígeno de célula maligna pode ser obtida comercialmente, por exemplo, no banco de dados GenBank ou em um banco de dados como esse, nas publicações da literatura ou por clonagem e sequenciamento de rotina.
[00104] Além de um anticorpo, um peptídeo ou proteína que se liga/bloqueia/direciona ou de alguma outra maneira interage com os epítopos ou receptores correspondentes em uma célula alvo pode ser usado como uma molécula de ligação. Esses peptídeos ou proteínas podem ser qualquer peptídeo ou proteína aleatória que tenham afinidade pelos epítopos ou receptores correspondentes e não precisam necessariamente pertencer à família das imunoglobulinas. Esses peptídeos podem ser isolados por técnicas semelhantes às dos anticorpos de expressão em fagos (Szardenings, J Recept Signal Transduct Res. 2003, 23(4): 307-49). O uso de peptídeos dessas bibliotecas aleatórias de peptídeos pode ser semelhante a anticorpos e fragmentos de anticorpos. As moléculas de ligação de peptídeos ou proteínas podem ser conjugadas ou ligadas a grandes moléculas ou materiais, como,
111 / 439 entre outros, uma albumina, um polímero, um lipossoma, uma nanopartícula, um dendrímero, desde que essa conexão permita que o peptídeo ou proteína retenha sua especificidade de ligação ao antígeno.
[00105] Exemplos de anticorpos usados para a conjugação de fármacos por meio dos ligantes desta prevenção para o tratamento de câncer, doença autoimune e/ou doença infecciosa incluem, entre outros, 3F8 (anti-GD2), Abagovomabe (anti-CA-125), Abciximabe (anti-CD41 (integrina alfa-IIb), Adalimumabe (anti-TNF-α), Adecatumumabe (anti-EpCAM, CD326), Afelimomabe (anti-TNF-α); Afutuzumabe (anti-CD20), Alacizumabe pegol (anti-VEGFR2), ALD518 (anti-IL-6), Alemtuzumabe (Campath, MabeCampath, anti-CD52), Altumomabe (anti-CEA), Anatumomabe (anti- TAG-72), Anrukinzumabe (IMA-638, anti-IL-13), Apolizumabe (anti-HLA- DR), Arcitumomabe (anti-CEA), Aselizumabe (anti-L-selectina (CD62L), Atlizumabe (tocilizumabe, Actemra, RoActemra, anti-receptor de IL-6), Atorolimumabe (anti-fator Rhesus), Bapineuzumabe (anti-beta amiloide), Basiliximabe (Simulect, antiCD25 (cadeia α do receptor de IL-2), Bavituximabe (anti-fosfatidilserina), Bectumomabe (LymphoScan, anti- CD22), Belimumabe (Benlysta, LymphoStat-B, anti-BAFF), Benralizumabe (anti-CD125), Bertilimumabe (anti-CCL11 (eotaxina-1)), Besilesomabe (Scintimun, anti-antígeno relacionado a CEA), Bevacizumabe (Avastin, anti- VEGF-A), Biciromabe (FibriScint, anti-cadeia beta de fibrina II), Bivatuzumabe (anti-CD44 v6), Blinatumomabe (BiTE, anti-CD19), Brentuximabe (cAC10, anti-CD30 TNFRSF8), Briakinumabe (anti-IL-12, IL- 23) Canakinumabe (Ilaris, anti-IL-1), Cantuzumabe (C242, anti-CanAg), Capromabe, Catumaxomabe (Removab, anti-EpCAM, anti-CD3), CC49 (anti- TAG-72), Cedelizumabe (anti-CD4), Certolizumabe pegol (Cimzia anti-TNF- α), Cetuximabe (Erbitux, IMC-C225, anti-EGFR), Citatuzumabe bogatox (anti-EpCAM), Cixutumumabe (anti-IGF-1), Clenoliximabe (anti-CD4), Clivatuzumabe (anti-MUC1), Conatumumabe (anti-TRAIL-R2), CR6261
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(anti-hemaglutinina do vírus Influenza A), Dacetuzumabe (anti-CD40), Daclizumabe (Zenapax, anti-CD25 (cadeia α do receptor de IL-2)), Daratumumabe (anti-CD38 (ADP ribose cíclico hidrolase), Denosumabe (Prolia, anti-RANKL), Detumomabe (anti-célula B de linfoma), Dorlimomabe, Dorlixizumabe, Ecromeximabe (anti-gangliosídeo GD3), Eculizumabe (Soliris, anti-C5), Edobacomabe (anti-endotoxina), Edrecolomabe (Panorex, Mabe17-1A, anti-EpCAM), Efalizumabe (Raptiva, anti-LFA-1 (CD11a), Efungumabe (Mycograb, anti-Hsp90), Elotuzumabe (anti-SLAMF7), Elsilimomabe (anti-IL-6), Enlimomabe pegol (anti-ICAM-1 (CD54)), Epitumomabe (anti-episialina), Epratuzumabe (anti-CD22), Erlizumabe (anti-ITGB2 (CD18)), Ertumaxomabe (Rexomun, anti-HER2/neu, CD3), Etaracizumabe (Abegrin, anti-integrina αvβ3), Exbivirumabe (anti- antígeno de superfície do vírus da hepatite B), Fanolesomabe (NeutroSpec, anti-CD15), Faralimomabe (anti-receptor de interferon), Farletuzumabe (anti- receptor 1 de folato), Felvizumabe (anti-vírus respiratório sincicial), Fezakinumabe (anti-IL-22), Figitumumabe (anti-receptor de IGF-1), Fontolizumabe (anti-IFN-γ), Foravirumabe (anti-glicoproteína do vírus da raiva), Fresolimumabe (anti-TGF-β), Galiximabe (anti-CD80), Gantenerumabe (anti-beta amiloide), Gavilimomabe (anti-CD147 (basigina)), Gemtuzumabe (anti-CD33), Girentuximabe (anti-anidrase carbônica 9), Glembatumumabe (CR011, anti-GPNMB), Golimumabe (Simponi, anti-TNF- α), Gomiliximabe (anti-CD23 (receptor de IgE)), Ibalizumabe (anti-CD4), Ibritumomabe (anti-CD20), Igovomabe (Indimacis-125, anti-CA-125), Imciromabe (Myoscint, anti-miosina cardíaca), Infliximabe (Remicade, anti- TNF-α), Intetumumabe (anti-CD51), Inolimomabe (anti-CD25 (cadeia α do receptor de IL-2)), Inotuzumabe (anti-CD22), Ipilimumabe (anti-CD152), Iratumumabe (anti-CD30 (TNFRSF8)), Keliximabe (anti-CD4), Labetuzumabe (CEA-Cide, anti-CEA), Lebrikizumabe (anti-IL-13), Lemalesomabe (anti-NCA-90 (antígeno de granulócitos)), Lerdelimumabe
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(anti-TGF beta 2), Lexatumumabe (anti-TRAIL-R2), Libivirumabe (anti- antígeno de superfície do vírus da hepatite B), Lintuzumabe (anti-CD33), Lucatumumabe (anti-CD40), Lumiliximabe (anti-CD23 (IgE receptor), Mapatumumabe (anti-TRAIL-R1), Maslimomabe (anti-receptor de células T), Matuzumabe (anti-EGFR), Mepolizumabe (Bosatria, anti-IL-5), Metelimumabe (anti-TGF beta 1), Milatuzumabe (anti-CD74), Minretumomabe (anti-TAG-72), Mitumomabe (BEC-2, anti-gangliosídeo GD3), Morolimumabe (anti-fator Rhesus), Motavizumabe (Numax, anti-vírus respiratório sincicial), Muromonab-CD3 (Orthoclone OKT3, anti-CD3), Nacolomabe (anti-C242), Naptumomabe (anti-5T4), Natalizumabe (Tysabri, anti-integrina α4), Nebacumabe (anti-endotoxina), Necitumumabe (anti- EGFR), Nerelimomabe (anti-TNF-α), Nimotuzumabe (Theracim, Theraloc, anti-EGFR), Nofetumomabe, Ocrelizumabe (anti-CD20), Odulimomabe (Afolimomabe, anti-LFA-1 (CD11a)), Ofatumumabe (Arzerra, anti-CD20), Olaratumabe (anti-PDGF-R α), Omalizumabe (Xolair, anti-região Fc de IgE), Oportuzumabe (anti-EpCAM), Oregovomabe (OvaRex, anti-CA-125), Otelixizumabe (anti-CD3), Pagibaximabe (anti-ácido lipoteicoico), Palivizumabe (Synagis, Abbosynagis, anti-vírus respiratório sincicial), Panitumumabe (Vectibix, ABX-EGF, anti-EGFR), Panobacumabe (anti- Pseudomonas aeruginosa), Pascolizumabe (anti-IL-4), Pemtumomabe (Theragyn, anti-MUC1), Pertuzumabe (Omnitarg, 2C4, anti-HER2/neu), Pexelizumabe (anti-C5), Pintumomabe (anti-antígeno de adenocarcinoma), Priliximabe (anti-CD4), Pritumumabe (anti-vimentina), PRO 140 (anti- CCR5), Racotumomabe (1E10, anti-(ácido N-glicolneuramínico (NeuGc, NGNA)-gangliosídeos GM3)), Rafivirumabe (anti-glicoproteína do vírus da raiva), Ramucirumabe (anti-VEGFR2), Ranibizumabe (Lucentis, anti-VEGF- A), Raxibacumabe (anti-toxina antraz, antígeno protetor), Regavirumabe (anti-citomegalovirus glycoprotein B), Reslizumabe (anti-IL-5), Rilotumumabe (anti-HGF), Rituximabe (MabeThera, Rituxanmabe, anti-
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CD20), Robatumumabe (anti-receptor de IGF-1), Rontalizumabe (anti-IFN- α), Rovelizumabe (LeukArrest, anti-CD11, CD18), Ruplizumabe (Antova, anti-CD154 (CD40L)), Satumomabe (anti-TAG-72), Sevirumabe (anti- citomegalovírus), Sibrotuzumabe (anti-FAP), Sifalimumabe (anti-IFN-α), Siltuximabe (anti-IL-6), Siplizumabe (anti-CD2), (Smart) MI95 (anti-CD33), Solanezumabe (anti-beta amiloide), Sonepcizumabe (anti-esfingosina-1- fosfato), Sontuzumabe (anti-episialina), Stamulumabe (anti-miostatina), Sulesomabe (LeukoScan, (anti-NCA-90 (antígeno de granulócitos), Tacatuzumabe (anti-alfa-fetoproteína), Tadocizumabe (anti-integrina αIIbβ3), Talizumabe (anti-IgE), Tanezumabe (anti-NGF), Taplitumomabe (anti- CD19), Tefibazumabe (Aurexis, (anti-fator de agrupamento A), Telimomabe, Tenatumomabe (anti-tenascina C), Teneliximabe (anti-CD40), Teplizumabe (anti-CD3), TGN1412 (anti-CD28), Ticilimumabe (Tremelimumabe, (anti- CTLA-4), Tigatuzumabe (anti-TRAIL-R2), TNX-650 (anti-IL-13), Tocilizumabe (Atlizumabe, Actemra, RoActemra, (anti-receptor de IL-6), Toralizumabe (anti-CD154 (CD40L)), Tositumomabe (anti-CD20), Trastuzumabe (Herceptin, (anti-HER2/neu), Tremelimumabe (anti-CTLA-4), Tucotuzumabe celmoleucina (anti-EpCAM), Tuvirumabe (anti-vírus da hepatite B), Urtoxazumabe (anti-Escherichia coli), Ustekinumabe (Stelara, anti-IL-12, IL-23), Vapaliximabe (anti-AOC3 (VAP-1)), Vedolizumabe, (anti-integrina α4β7), Veltuzumabe (anti-CD20), Vepalimomabe (anti-AOC3 (VAP-1), Visilizumabe (Nuvion, anti-CD3), Vitaxin (anti-integrina avb3 vascular), Volociximabe (anti-integrina α5β1), Votumumabe (HumaSPECT, anti-antígeno tumoral CTAA16.88), Zalutumumabe (HuMax-EGFr, (anti- EGFR), Zanolimumabe (HuMax-CD4, anti-CD4), Ziralimumabe (anti-CD147 (basigina)), Zolimomabe (anti-CD5), Etanercept (Enbrel®), Alefacept (Amevive®), Abatacept (Orencia®), Rilonacept (Arcalyst), 14F7 [anti-IRP-2 (Proteína Reguladora de Ferro 2)], 14G2a (anti-gangliosídeo GD2, do Nat.
Cancer Inst. para melanoma e tumores sólidos), J591 (anti-PSMA, Weill
115 / 439 Cornell Medical School para cânceres de próstata), 225.28S [anti-HMW- MAA (antígeno de alto peso molecular associado ao melanoma), Sorin Radiofarmaci S.R.L. (Milan, Itália) para melanoma], COL-1 (anti- CEACAM3, CGM1, do Nat. Cancer Inst. USA para cânceres colorretais e gástricos), CYT-356 (Oncoltad®, para cânceres de próstata), HNK20 (OraVax Inc. para vírus respiratório sincicial), ImmuRAIT (da Immunomedics para LNH), Lym-1 (anti-HLA-DR10, Peregrine Pharm. para cânceres), MAK-195F [anti-TNF (fator de necrose tumoral; TNFA, TNF-alfa; TNFSF2), da Abbott / Knoll para choque séptico tóxico], MEDI-500 [T10B9, anti-CD3, TRαβ (receptor alfa/beta de células T), complexo, da MedImmune Inc para doença do enxerto contra hospedeiro], RING SCAN [anti-TAG 72 (glicoproteína 72 associada a tumor), da Neoprobe Corp. para câncer de mama, cólon e retal], Avicidin (anti-EPCAM (molécula de adesão a células epiteliais), anti-TACSTD1 (transdutor 1 de sinal de cálcio associado ao tumor), anti-GA733-2 (proteína 2 associada a tumor gastrointestinal), anti- EGP-2 (glicoproteína epitelial 2); anti-KSA; antígeno KS1/4; M4S; antígeno tumoral 17-1A; CD326, da NeoRx Corp. para câncer de cólon, ovário e próstata e LNH]; LymphoCide (Immunomedics, NJ), Smart ID10 (Protein Design Labs), Oncolym (Techniclone Inc, CA), Allomune (BioTransplant, CA), anti-VEGF (Genentech, CA); CEAcide (Immunomedics, NJ), IMC- 1C11 (ImClone, NJ) e Cetuximabe (ImClone, NJ) .
[00106] Outros anticorpos como moléculas de ligação celular/ligandos incluem, entre outros, são anticorpos contra os seguintes antígenos: Aminopeptidase N (CD13), Anexina A1, B7-H3 (CD276, vários cânceres), CA125 (ovariano), CA15-3 (carcinomas), CA19-9 (carcinomas), L6 (carcinomas), Lewis Y (carcinomas), Lewis X (carcinomas), alfa fetoproteína (carcinomas), CA242 (coloretal), fosfatase alcalina placentária (carcinomas), antígeno específico da próstata (próstata), fosfatase ácida prostática (próstata), fator de crescimento epidérmico (carcinomas), CD2 (Doença de Hodgkin,
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LNH linfoma, mieloma múltiplo), CD3 épsilon (linfoma de células T, câncer de pulmão, mama, gástrico, ovariano, doenças autoimunes, ascite maligna), CD19 (neoplasias malignas de células B), CD20 (linfoma não Hodgkin), CD22 (leucemia, linfoma, mieloma múltiplo, LES), CD30 (Linfoma de Hodgkin), CD33 (leucemia, doenças autoimunes), CD38 (mieloma múltiplo), CD40 (linfoma, mieloma múltiplo, leucemia (CLL)), CD51 (Melanoma metastático, sarcoma), CD52 (leucemia), CD56 (câncer de pulmão de pequenas células, câncer de ovário, carcinoma de células de Merkel e o tumor líquido, mieloma múltiplo), CD66e (cânceres), CD70 (carcinoma metastático de células renais e linfoma não Hodgkin), CD74 (mieloma múltiplo), CD80 (linfoma), CD98 (cânceres), mucina (carcinomas), CD221 (tumores sólidos), CD227 (cânceres de mama, ovário), CD262 (CPNPC e outros cânceres), CD309 (cânceres de ovário), CD326 (tumores sólidos), CEACAM3 (cânceres colorretais, gástricos), CEACAM5 (antígeno carcinoembrionário; CEA, CD66e) (cânceres de mama, colorretal e pulmão), DLL3 (delta-tipo-3), DLL4 (delta-tipo-4), EGFR (Receptor do fator de crescimento epidérmico, vários cânceres), CTLA4 (melanoma), CXCR4 (CD184, Heme-oncologia, tumores sólidos), Endoglina (CD105, tumores sólidos), EPCAM (molécula de adesão de células epiteliais, cânceres de bexiga, cabeça, pescoço, cólon, LNH, próstata e de ovário), ERBB2 (Receptor do fator de crescimento epidérmico 2; de pulmão, mama e próstata), FCGR1 (doenças autoimunes), FOLR (receptor do folato, cânceres de ovário), gangliosídeo GD2 (cânceres), G-28 (glicolipídio de antígeno da superfície celular, melanoma), idiotipo GD3 (cânceres), proteínas do choque térmico (cânceres), HER1 (cânceres de pulmão, estômago), HER2 (cânceres de mama, pulmão e ovário), HLA-DR10 (NHL), HLA-DRB (LNH, leucemia de células B), gonadotrofina coriônica humana (carcinoma), IGF1R (receptor 1 de fator de crescimento semelhante à insulina, tumores sólidos, cânceres hematológicos), receptor de IL-2 (receptor de interleucina 2, leucemia e linfomas de células T), IL-6R (receptor de
117 / 439 interleucina 6, mieloma múltiplo, RA, doença de Castleman, tumores dependentes de IL6), Integrinas (αvβ3, α5β1, α6β4, αllβ3, α5β5, αvβ5, para vários cânceres), MAGE-1 (carcinomas), MAGE-2 (carcinomas), MAGE-3 (carcinomas), MAGE 4 (carcinomas), anti-receptor de transferrina (carcinomas), p97 (melanoma), MS4A1 (membro 1 da subfamília A com 4 domínios transmembranas, linfoma não Hodgkin de células B , leucemia), MUC1 ou MUC1-KLH (câncer de mama, ovário, colo do útero, brônquio e gastrointestinal), MUC16 (CA125) (cânceres de ovário), CEA (colorretal), gp100 (melanoma), MART1 (melanoma), MPG (melanoma), MS4A1 (subfamília A com 4 domínios transmembranas, cânceres de pulmão de pequenas células, LNH), Nucleolina, produto de oncogene Neu (carcinomas), P21 (carcinomas), Paratópio de anti-(ácido N-glicolilneuramínico, câncer de mama, melanoma), fosfatase alcalina testicular do tipo PLAP (cânceres de ovário, testículo), PSMA (tumores de próstata), PSA (próstata), ROBO4, TAG 72 (glicoproteína 72 associada a tumor, LMA, cânceres gástricos, colorretais e ovarianos), proteína transmembrana de células T (cânceres), Tie (CD202b), TNFRSF10B (membro 10B da superfamília do receptor de fator de necrose tumoral, cânceres), TNFRSF13B (membro 13B da superfamília do receptor de fator de necrose tumoral, mieloma múltiplo, LNH, outros cânceres, AR e LES), TPBG (glicoproteína trofoblástica, carcinoma de células renais), TRAIL-R1 (Receptor 1 de ligando indutor de apoptose de necrose tumoral, linfoma, LNH, cânceres colorretais, pulmão), VCAM-1 (CD106, Melanoma), VEGF, VEGF-A, VEGF-2 (CD309) (vários cânceres). Alguns outros antígenos associados a tumores reconhecidos por anticorpos foram revisados (Gerber, et al, mAbs 1:3, 247-53 (2009); Novellino et al, Cancer Immunol Immunother. 54(3), 187-207 (2005). Franke, et al, Cancer Biother Radiopharm. 2000, 15, 459-76).
[00107] Os agentes de ligação celular, anticorpos mais preferidos, podem ser quaisquer agentes capazes de combater células tumorais, células
118 / 439 infectadas por vírus, células infectadas por microrganismos, células infectadas por parasitas, células autoimunes, células ativadas, células mieloides, células T ativadas, células B ou melanócitos.
Mais especificamente, os agentes de ligação celular podem ser qualquer agente/molécula capaz de combater qualquer um dos seguintes antígenos ou receptores: CD2, CD2R, CD3, CD3gd, CD3e, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD8a, CD8b, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD12, CD12w, CD13, CD14, CD15, CD15s, CD15u, CD16, CD16a, CD16b, CD17, CDw17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42, CD42a, CD42b, CD42c, CD42d, CD43, CD44, CD44R, CD45, CD45RA, CD45RB, CD45RO, CD46, CD47, CD47R, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49e, CD49f, CD50, CD51, CD52, CD53, CD54, CD55,CD56, CD57, CD58, CD59, CD60, CD60a, CD60b, CD60c, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64, CD65, CD65s, CD66, CD66a, CD66b, CD66c, CD66d, CD66e, CD66f, CD67, CD68, CD69, CD70, CD71, CD72, CD73, CD74, CD74, CD75, CD75s, CD76, CD77, CD78, CD79, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CDw84, CD85, CD86, CD87, CD88, CD89, CD90, CD91, CD92, CDw92, CD93, CD94, CD95, CD96, CD97, CD98, CD99, CD99R, CD100, CD101, CD102, CD103, CD104, CD105, CD106, CD107, CD107a, CD107b, CD108, CD109, CD110, CD111, CD112, CD113, CDw113, CD114, CD115, CD116, CD117, CD118, CD119, CDw119, CD120a, CD120b, CD121a, CD121b, CDw121b, CD122, CD123, CDw123, CD124, CD125, CDw125, CD126, CD127, CD128, CDw128, CD129, CD130, CD131, CDw131, CD132, CD133, CD134, CD135, CD136, CDw136, CD137, CDw137, CD138, CD139, CD140a, CD140b, CD141, CD142, CD143, CD144, CD145, CDw145, CD146, CD147, CD148, CD149, CD150, CD151, CD152, CD153, CD154, CD155, CD156a, CD156b, CDw156c, CD157, CD158a, CD158b, CD159a, CD159b,
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CD159c, CD160, CD161, CD162, CD162R, CD163, CD164, CD165, CD166, CD167, CD167a, CD168, CD169, CD170, CD171, CD172a, CD172b, CD172g, CD173, CD174, CD175, CD175s, CD176, CD177, CD178, CD179, CD180, CD181, CD182, CD183, CD184, CD185, CD186, CDw186, CD187, CD188, CD189, CD190, Cd191, CD192, CD193, CD194, CD195, CD196, CD197, CD198, CDw198, CD199, CDw199, CD200, CD200a, CD200b, CD201, CD202, CD202b, CD203, CD203c, CD204, CD205, CD206, CD207, CD208, CD209, CD210, CDw210, CD211, CD212, CD213a1, CD213a2, CD214, CD215, CD216, CDw217, CDw218a, CDw218b, CD219, CD220, CD221, CD222, CD223, CD224, CD225, CD226, CD227, CD228, CD229, CD230, CD231, CD232, CD233, CD234, CD235a, CD235ab, CD235b, CD236, CD236R, CD237, CD238, CD239, CD240, CD240CE, CD240D, CD241, CD242, CD243, CD244, CD245, CD246, CD247, CD248, CD249, CD250, CD251, CD252, CD253, CD254, CD256, CD257, CD258, CD259, CD260, CD261, CD262, CD263, CD264, CD265, CD266, CD267, CD268, CD269, , CD270, CD271, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276 (B7-H3), CD277, CD278, CD279, CD280, CD281, CD282, CD283, CD284, CD285, CD286, CD287, CD288, CD289, CD290, CD291, CD292, CDw293, CD294, CD295, CD296, CD297, CD298, CD299, CD300a, CD300c, CD300e, CD301, CD302, CD303, CD304, CD305, CD306, CD307, CD308, CD309, CD310, CD311, CD312, CD314, CD315, CD316, CD317, CD318, CD319, CD320, CD321, CD322, CD323, CD324, CDw325, CD326, CDw327, CDw328, CDw329, CD330, CD331, CD332, CD333, CD334, CD335, CD336, CD337, CDw338, CD339, 4-1BB, 5AC, 5T4 (glicoproteína trofoblástica, TPBG, 5T4, fator inibidor ativado por Wnt 1 ou WAIF1), antígeno de adenocarcinoma, AGS-5, AGS-22M6, quinase semelhante ao receptor de ativina 1, AFP, AKAP-4, ALK, Alfa intergrina, Alfa v beta6, amino-peptidase N, Amiloide beta, receptor de androgênios, angiopoietina 2, angiopoietina 3, anexina A1, antígeno protetor da toxina antraz, anti-receptor de transferrina, AOC3 (VAP-
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1), B7-H3, antraz do Bacillus anthracis anthrax, BAFF (fator ativador de células B), células B de linfoma, bcr-abl, Bombesina, BORIS, C5, antígeno C242, CA125 (antígeno de carboidrato 125, MUC16), CA-IX (ou CAIX, anidrase carbônica 9), CALLA, CanAg, IL31 de Canis lupus familiaris, anidrase carbônica IX, miosina cardíaca, CCL11(motivo C-C de quimiocina 11), CCR4 (receptor tipo 4 de quimiocina C-C, CD194), CCR5, CD3E (épsilon), CEA (Antígeno carcinoembrionário), CEACAM3, CEACAM5 (antígeno carcinoembrionário), CFD (Factor D), Ch4D5, colecistoquinina 2 (CCK2R), CLDN18 (Claudina-18), Fator de agrupamento A, CRIPTO, FCSF1R (Receptor do fator 1 estimulador de colônias, CD115), CSF2 (fator 2 estimulador de colônias, fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF)), CTLA4 (proteína 4 associada a linfócitos T citotóxicos), antígeno tumoral CTAA16.88, CXCR4 (CD184), receptor de quimiocina C-X-C tipo 4, ADP ribose cíclico hidrolase, ciclina B1, CYP1B1, citomegalovírus, glicoproteína B de citomegalovírus, Dabigatrana, DLL3 (ligando do tipo delta 3), DLL4 (ligando do tipo delta 4), DPP4 (Dipeptidil- peptidase 4), DR5 (receptor da morte 5), toxina tipo-1 de E. coli shiga, toxina tipo-2 de E. coli shiga, ED-B, EGFL7 (proteína 7 contendo domínio semelhante ao EGF), EGFR, EGFRII, EGFRvIII, Endoglina (CD105), receptor de endotelina B, endotoxina, EpCAM (molécula de adesão de células epiteliais), EphA2, Episialina, ERBB2 (Receptor do fator de crescimento epidérmico 2), ERBB3, ERG (gene de fusão TMPRSS2 ETS), Escherichia coli, ETV6-AML, FAP (Proteína alfa de ativação de fibroblastos), FCGR1, alfa-Fetoproteína, Fibrina II, cadeia beta, domínio extra de Fibronectina, FOLR (receptor de folato), Receptor alfa de folato, folato hidrolase, antígeno 1 relacionado ao Fos, proteína F do vírus respiratório sincicial, receptor Frizzled, Fucosil GM1, gangliosídeo GD2, G-28 (glicolipídio de antígeno da superfície celular), idiotipo GD3, GloboH, Glipicano 3, ácido N- glicolilneuramínico, GM3, cadeia α do receptor GMCSF, fator de
121 / 439 diferenciação de crescimento 8, GP100, GPNMB (glicoproteína transmembrana NMB), GUCY2C (Guanilato ciclase 2C, guanilil ciclase C(GC-C), guanilato ciclase intestinal, receptor de guanilato ciclase-C, receptor de enterotoxina estável ao calor (hSTAR)), proteínas de choque térmico, hemaglutinina, antígeno de superfície do vírus da hepatite B, vírus da hepatite B, HER1 (receptor do fator de crescimento epidérmico 1 humano), HER2, HER2/neu, HER3 (ERBB-3), IgG4, HGF/SF (fator de crescimento/fator de dispersão de hepatócitos), HHGFR, HIV-1, complexo de histona, HLA-DR (antígeno leucocitário humano), HLA-DR10, HLA-DRB , HMWMAA, gonadotrofina coriônica humana, HNGF, receptor quinase do fator de dispersão humano, HPV E6/E7, Hsp90, hTERT, ICAM-1 (molécula de adesão intercelular 1), idiotipo, IGF1R (IGF-1, receptor de fator de crescimento semelhante à insulina 1), IGHE, IFN-γ, hemaglutinina do vírus Influenza, IgE, região Fc de IgE, IGHE, interleucinas (p. ex., IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-17A, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, ou IL-28), IL31RA, ILGF2 (fator de crescimento semelhante à insulina 2), integrinas (α4, αIIbβ3, αvβ3, α4β7, α5β1, α6β4, α7β7,αllβ3, α5β5, αvβ5), proteína induzida por interferon gama, ITGA2, ITGB2, KIR2D, LCK, Le, Legumaína, antígeno de Lewis-Y, LFA-1(antígeno 1 associado à função linfocitária, CD11a), LHRH, LINGO-1, ácido lipoteicoico, LIV1A, LMP2, LTA, MAD-CT-1, MAD-CT-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE A1, MAGE A3, MAGE 4, MART1, MCP-1, MIF (fator inibidor de migração de macrófagos ou fator inibidor de glicosilação (GIF)), MS4A1 (membro 1 da subfamília A de 4 domínios transmembranas), MSLN (mesotelina), MUC1 (Mucina 1, célula associada à superfície (MUC1) ou mucina epitelial polimórfica (PEM)), MUC1-KLH, MUC16 (CA125), MCP1 (proteína quimiotática monocítica 1), MelanA/MART1, ML-IAP, MPG, MS4A1 (subfamília A de 4 domínios transmembranas), MYCN, mielina glicoproteína associada a miostatina,
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NA17, NARP-1, NCA-90 (antígeno de granulócitos), Nectina-4 (ASG-22ME), NGF, proteinase 1 regulada por apoptose neural 1, NOGO-A, receptor Notch, Nucleolina, produto do oncogene Neu, NY-BR-1, NY-ESO-1, OX-40, OxLDL (lipoproteína de baixa densidade oxidada), OY-TES1,P21, p53 não mutante, P97, Page4, PAP, Paratópio de anti-(ácido N-glicolilneuramínico), PAX3, PAX5, PCSK9, PDCD1 (PD-1, proteína de morte celular programada 1,CD279), PDGF-Rα (receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas do tipo alfa), PDGFR-β, PDL-1, PLAC1, fosfatase alcalina testicular do tipo PLAP, receptor beta do fator de crescimento derivado de plaquetas, co- transportador de fosfato de sódio, PMEL 17, ácido polissiálico, proteinase3 (PR1), carcinoma prostático, PS (Fosfatidilserina), células de carcinoma prostático, Pseudomonas aeruginosa, PSMA, PSA, PSCA, glicoproteína do vírus da raiva, RHD (polipeptídeo 1 Rh (RhPI), CD240), fator Rhesus, RANKL, receptores RANTES (CCR1, CCR3, CCR5), RhoC, Ras mutante, RGS5, ROBO4, vírus respiratório sincicial, RON, pontos de ruptura da translocação do sarcoma, SART3, esclerostina, SLAMF7 (membro da família SLAM 7), Selectina P, SDC1 (Syndecan 1), sLe(a), Somatomedina C, SIP (Esfingosina-1-fosfato), Somatostatina proteína do esperma 17, SSX2, STEAP1 (antígeno epitelial 6 transmembrana da próstata 1), STEAP2, STn, TAG-72 (glicoproteína associada ao tumor 72), Survivina, receptor de células T, proteína transmembrana de células T, TEM1 (marcador endotelial tumoral 1), TENB2, Tenascina C (TN-C), TGF-α, TGF-β (fator transformador do crescimento beta), TGF-β1, TGF-β2 (fator transformador do crescimento-beta 2), Tie (CD202b), Tie2, TIM-1 (CDX-014), Tn, TNF, TNF-α, TNFRSF8, TNFRSF10B (membro da família 10B da superfamília do receptor de fator de necrose tumoral), TNFRSF13B (membro 13B da superfamília do receptor de fator de necrose tumoral 13B), TPBG (glicoproteína trofoblástica), TRAIL- R1 (receptor 1 do ligando indutor de apoptose de necrose tumoral), TRAILR2 (receptor de morte 5 (DR5)), transdutor de sinal de cálcio associado a tumor
123 / 439 2, glicosilação específica de tumor de MUC1, receptor TWEAK, TYRP1 (glicoproteína 75), TROP-2, TRP-2, tirosinase, VCAM-1 (CD106), VEGF, VEGF-A, VEGF-2 (CD309), VEGFR-1, VEGFR2 ou vimentina, WT1, XAGE 1, ou células que expressam qualquer receptor de fator de crescimento de insulina ou qualquer receptor de fator de crescimento epidérmico.
[00108] Em outra modalidade específica, os conjugados ligando de ligação celular-fármaco através dos ligandos de ponte desta invenção são utilizados para o tratamento direcionado de cânceres. Os cânceres alvo incluem, entre outros, carcinoma adrenocortical, câncer anal, câncer de bexiga, tumor cerebral (Adulto, glioma de tronco cerebral, infantil, astrocitoma cerebelar, astrocitoma cerebral, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos e pineais primitivos supratentoriais, sia visual e glioma hipotalâmico), câncer de mama, tumor carcinoide, gastrointestinal, carcinoma de primário desconhecido, câncer cervical, câncer de cólon, câncer do endométrio, câncer de esôfago, câncer de ducto biliar extra-hepático, família de tumores de Ewings (PNET), tumor de células germinativas extracranianas, câncer ocular, melanoma intraocular, câncer da vesícula biliar, câncer gástrico (estômago), tumor de células germinativas, extragonadal, tumor trofoblástico gestacional, câncer de cabeça e pescoço, câncer hipofaríngeo, carcinoma de células das ilhotas, câncer renal (câncer de células renais), câncer de laringe, leucemia (linfoblástica aguda, mieloide aguda, linfocítica crônica, mieloide crônica, células pilosas), câncer de lábio e cavidade oral, câncer de fígado, câncer de pulmão (Não pequenas células, pequenas células, linfoma (relacionado à AIDS, sistema nervoso central, célula T cutânea, doença de Hodgkin, doença não Hodgkin, mesotelioma maligno, melanoma, carcinoma de células de Merkel, câncer escamoso metastático do pescoço com primário oculto, mieloma múltiplo e outras neoplasias das células plasmáticas, micose fungoide, síndrome mielodisplásica, distúrbios mieloproliferativos, câncer nasofaríngeo,
124 / 439 neuroblastoma, câncer bucal, câncer orofaríngeo, osteossarcoma, câncer de ovário (Epitelial, tumor de células germinativas, tumor maligno de baixo potencial), câncer de pâncreas (exócrino, carcinoma de células das ilhotas), câncer do seio paranasal e cavidade nasal, câncer de paratireoide, câncer de pênis, câncer de feocromocitoma, câncer de hipófise, neoplasia de células plasmáticas, câncer de próstata, rabdomiossarcoma, câncer retal, câncer de células renais (câncer renal), pelve renal e ureter (células de transição), câncer de glândulas salivares, síndrome de Sezary, câncer de pele, câncer de pele (linfoma de células T cutâneas, sarcoma de Kaposi, melanoma), câncer de intestino delgado, sarcoma de tecidos moles, câncer de estômago, câncer de testículo, timoma (maligno), câncer de tireoide, câncer de Uretra, câncer de útero (sarcoma), câncer incomum da infância, câncer de vagina, câncer de Vulva, tumor de Wilms.
[00109] Em outra modalidade específica, os conjugados de fármaco- ligação celular desta invenção são utilizados de acordo com as composições e métodos para o tratamento ou prevenção de uma doença autoimune. As doenças autoimunes incluem, entre outras, hepatite crônica ativa autoimune com acloridria, encefalomielite aguda disseminada, leucoencefalite hemorrágica aguda, doença de Addison, agamaglobulinemia, alopecia areata, esclerose lateral amiotrófica, espondilite anquilosante, nefrite anti- GBM/TBM, síndrome antifosfolipídica, síndrome anti-sintetase, artrite, alergia atópica, dermatite atópica, anemia aplástica autoimune, cardiomiopatia autoimune, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, doença do ouvido interno autoimune, síndrome linfoproliferativa autoimune, neuropatia periférica autoimune, pancreatite autoimune, pancreatite autoimune, síndrome polendócrina autoimune Tipos I, II e III, dermatite de progesterona autoimune, púrpura trombocitopênica autoimune, uveíte autoimune, doença de Balo/esclerose concêntrica de Balo, síndrome de Bechets, doença de Berger, encefalite de Bickerstaff, síndrome de Blau, penfigoide bolhoso,
125 / 439 doença de Castleman, doença de Balman, síndrome da disfunção imune de fadiga crônica, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, ostomielite multifocal recorrente crônica, doença de Lyme crônica, doença pulmonar obstrutiva crônica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, doença celíaca, síndrome de Cogan, doença de aglutininas frias, deficiência do componente complementar 2, arterite craniana, síndrome de CREST, doença de Crohn (um tipo de doença inflamatória intestinal idiopática), síndrome de Cushing, angiite leucocitoclástica cutânea, doença de Dego, doença de Dercum, dermatite herpetiforme, dermatomiosite, diabetes mellitus tipo 1, esclerose sistêmica cutânea difusa, síndrome de Dressler, lúpus eritematoso discoide, eczema, endometriose, artrite relacionada à entesite, fasciíte eosinofílica, epidermólise bolhosa adquirida, eritema nodoso, crioglobulinemia mista essencial, síndrome de Evan, fibrodisplasia ossificante progressiva, fibromialgia, fibromiosite, alveolite fibrosante, gastrite, penfigoide gastrintestinal, arterite de células gigantes, síndrome de Goodpasture, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barré, encefalite de Hashimoto, tireoidite de Hashimoto, anemia hemolítica, púrpura de Henoch- Schonlein, herpes gestacional, hidradenite supurativa, síndrome de Hughes (ver síndrome antifosfolipídica), Hipogamaglobulinemia, doenças desmielinizantes inflamatórias idiopáticas, fibrose pulmonar idiopática, púrpura trombocitopênica idiopática (Ver púrpura trombocitopênica autoimune), nefropatia de IgA (também doença de Berger), miosite do corpo de inclusão, polineuropatia desmielinizante inflamatória, cistite intersticial, síndrome do intestino irritável, artrite idiopática juvenil, artrite reumatoide juvenil, doença de Kawasaki, síndrome miastênica de Lambert-Eaton, vasculite leucocitoclástica, Líquen plano, doença de IgA linear (LAD), doença de Lou Gehrig (também esclerose lateral amiotrófica), hepatite lupóide, lúpus eritematoso, síndrome de Majeed, doença de Ménière, polangiite microscópica, síndrome de Miller-Fisher, doença mista do tecido
126 / 439 conjuntivo, morfea, doença de Mucha-Habermann, síndrome de Muckle- Wells, mieloma múltiplo, esclerose múltipla, Miastenia gravis, miosite, narcolepsia, neuromielite óptica (Doença de Devic), neuromiotonia, penfigoide cicatricial ocular, síndrome do Opsoclonus mioclonus, tireoidite comum, reumatismo palindrômico, PANDAS (Distúrbios Neuropsiquiátricos Autoimunes Pediátricos Associados ao Estreptococo), degeneração cerebelar paraneoplásica, hemoglobinúria paroxística noturna, síndrome de Parry Romberg, síndrome de Parsonnage-Turner, Pars planitis, pênfigo, pênfigo vulgar, anemia perniciosa, encefalomielite perivenosa, síndrome de POEMS, poliarterite nodosa, polimialgia reumática, polimiosite, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária, neuropatia inflamatória progressiva, psoríase, artrite psoriática, pioderma gangrenoso, fenômeno de Raynaud, policondrite recidivante, síndrome de Reiter, síndrome das pernas inquietas, fibrose retroperitoneal, artrite reumatoide, febre reumatoide, sarcoidose, esquizofrenia, síndrome de Schmidt, síndrome de Schnitzler, esclerite, esclerodermia, síndrome de Sjögren, espondiloartropatia, síndrome do sangue pegajoso, doença de Still, síndrome da pessoa rígida, endocardite bacteriana subaguda, síndrome de Susac, síndrome de Sweet, coreia de Sydenham, oftalmia simpática, arterite de Takayasu, arterite temporal (arterite de células gigantes), síndrome de Tolosa-Hunt, mielite transversa, colite ulcerativa (um tipo de doença inflamatória intestinal idiopática), doença indiferenciada do tecido conjuntivo, espondiloartropatia indiferenciada, vasculite, vitiligo, granulomatose de Wegener, síndrome de Wilson, síndrome de Wiskott- Aldrich.
[00110] Em outra modalidade específica, uma molécula de ligação utilizada para o conjugado através dos bis-ligantes da presente invenção para o tratamento ou prevenção de uma doença autoimune pode ser, entre outras, anticorpo anti-elastina; anticorpos contra anticorpo de células epiteliais; anticorpo anti-proteína do tipo IV de colágeno de membrana basal; anticorpo
127 / 439 Anti-Nuclear; anti-DNA ds; anti-DNA ss, anticorpo anti-cardiolipina IgM, IgG; anticorpo anti-celíaco; anticorpo anti-fosfolipídio IgK, IgG; anticorpo anti-SM; anticorpo anti-mitocondrial; anticorpo de tiroide; anticorpo microssomal, anticorpo de células T; anticorpo de tiroglobulina, Anti SCL-70; Anti-Jo; Anti-U.sub.1RNP; Anti-La/SSB; Anti SSA; Anti SSB; anticorpo anti-células peritais; anti-histonas; anti-RNP; C-ANCA; p-ANCA; anti- centrômero; anticorpo anti-Fibrilarina e anticorpo anti-GBM, anticorpo anti- gangliosídeo; anticorpo anti-Desmogleína 3; anticorpo anti-p62; anticorpo anti-sp100; anticorpo anti-mitocondrial (M2); anticorpo de fator reumatoide; anticorpo anti-MCV; anticorpo anti-topoisomerase; anticorpo anti-citoplasma de neutrófilos (cANCA).
[00111] Em certas modalidades preferidas, a molécula de ligação para o conjugado na presente invenção, pode se ligar a um receptor e a um complexo receptor expresso em um linfócito ativado que está associado a uma doença autoimune. O receptor ou complexo receptor pode compreender um membro da superfamília do gene da imunoglobulina (p. ex., CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22, CD25, CD27, CD28, CD30, CD33, CD37, CD38, CD56, CD70, CD79, CD79b, CD90, CD125, CD137, CD138, CD147, CD152/CTLA-4, PD-1, PD-L1 ou ICOS), um membro da superfamília dos receptores de TNF (p. ex., CD27, CD40, CD95/Fas, CD134/OX40, CD137/4- 1BB, INF-R1, TNFR-2, RANK, TACI, BCMA, osteoprotegerina, Apo2/TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAIL-R4 e APO-3), uma integrina, um receptor de citocina, um receptor de quimiocina, uma proteína do complexo maior de histocompatibilidade, uma lectina (tipo C, tipo S ou tipo I) ou uma proteína de controle do complemento.
[00112] Em outra modalidade específica, os ligandos de ligação celular úteis que são imunoespecíficos para um antígeno viral ou microbiano são anticorpos humanizados ou monoclonais humanos. Neste relatório descritivo, o termo “antígeno viral” inclui, entre outros, qualquer peptídeo, polipeptídeo
128 / 439 proteína viral (p. ex., gp120 do HIV, nef do HIV, glicoproteína F do RSV, neuramimidase do vírus Influenza, hemaglutinina do vírus Influenza, tax do HTLV, glicoproteína do vírus da herpes simples (p. ex., gB, gC, gD e gE) e antígeno de superfície do vírus da hepatite B capaz de provocar uma resposta imune. Neste relatório descritivo, o termo “antígeno microbiano” inclui, entre outros, qualquer peptídeo, polipeptídeo, proteína, sacarídeo, polissacarídeo ou molécula lipídica microbiana (p. ex., uma bactéria, fungos, protozoários patogênicos ou polipeptídeos de leveduras, incluindo, p. ex., LPS e polisacarídeo 5/8 capsular) capaz de provocar uma resposta imune. Exemplos de anticorpos disponíveis l para a infecção viral ou microbiana incluem, entre outros, Palivizumabe, que é um anticorpo monoclonal humanizado anti-vírus sincicial respiratório para o tratamento da infecção por RSV; pRO542, que é um anticorpo de fusão de CD4 para o tratamento de infecção por HIV; Ostavir, que é um anticorpo humano para o tratamento do vírus da hepatite B; pROTVIR, que é um anticorpo IgG.sub.1 humanizado para o tratamento de citomegalovírus; e anticorpos anti-LPS.
[00113] Os conjugados moléculas de ligação celular-fármaco através dos bis-ligantes desta invenção podem ser utilizados no tratamento de doenças infecciosas. Essas doenças infecciosas incluem, entre outras, infecções por Acinetobacter, Actinomicose, doença do sono africana (tripanossomíase africana), AIDS (síndrome da imunodeficiência adquirida), amebíase, anaplasmose, antraz, infecção por Arcanobacterium haemolyticum, febre hemorrágica argentina, ascaridíase, aspergilose, infecção por astrovírus, babesiose, infecção por Bacillus cereus, pneumonia bacteriana, vaginose bacteriana, infecção por Bacteroides, balantidíase, infecção por Baylisascaris, infecção por vírus BK, piedra preta, infecção por Blastocystis hominis, blastomicose, febre hemorrágica boliviana, infecção por Borrelia e botulismo (botulismo infantil), febre hemorrágica brasileira, brucelose, infecção por Burkholderia, úlcera de Buruli, infecção por Calicivírus (Norovírus e
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Sapovírus), campilobacteriose, candidíase (Monilíase; candidíase), doença por arranhadura do gato, celulite, doença de Chagas (tripanossomíase americana), cancroide, varicela, clamídia, infecção por Chlamydophila pneumoniae, cólera, cromoblastomicose, clonorquíase, infecção por Clostridium difficile, coccidioidomicose, febre do carrapato do Colorado, resfriado comum (rinofaringite viral aguda; Coriza aguda), doença de Creutzfeldt-Jakob, febre hemorrágica do Congo-Crimeia, criptococose, criptosporidiose, larva migrans cutânea, ciclosporíase, cisticercose, infecção por citomegalovírus, dengue, dientamoebíase, difteria, difilobotríase, dracunculíase, febre hemorrágica do ébola, equinococose, erliquiose, enterobíase, (infecção por oxiúro), infecção por enterococos, infecção por enterovírus, tifo epidêmico, eritema infeccioso (Quinta doença), exantema subitum, fasciolopsíase, fasciolose, insônia familiar fatal, filariose, intoxicação alimentar por Clostridium perfringens, infecção amebiana de vida livre, infecção por Fusobacterium, gangrena gasosa (mionecrose clostridial), geotricose, síndrome de Gerstmann-Sträussler-Scheinker, giardíase, mormo, gnatostomíase, gonorreia, granuloma inguinal (Donovanose), infecção estreptocócica do grupo A, infecção estreptocócica do grupo A, infecção estreptocócica do grupo B, infecção por Haemophilus influenzae, doença da mão, pé e boca (DMPB), síndrome pulmonar por hantavírus, infecção por Helicobacter pylori, síndrome hemolítico-urêmica, febre hemorrágica com síndrome renal, hepatite A, hepatite B, hepatite C, hepatite D, hepatite E, herpes simples, histoplasmose, infecção por ancilostomídeos, infecção por bocavírus humano, erliquiose ewingii humana, anaplasmose granulocítica humana, infecção por metapneumovírus humano, erliquiose monocítica humana, infecção por papilomavírus humano, infecção pelo vírus parainfluenza humano, himenolepíase, mononucleose infecciosa do vírus Epstein-Barr (Mono), gripe, isosporíase, doença de Kawasaki, queratite, infecção por Kingella kingae, Kuru, febre de Lassa, legionelose (Doença dos
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Legionários), (Febre de Pontiac), leishmaniose, hanseníase, leptospirose, listeriose, doença de Lyme (borreliose de Lyme), filariose linfática (elefantíase), coriomeningite linfocítica, malária, febre hemorrágica de Marburg, sarampo, melioidose (doença de Whitmore), meningite, doença meningocócica, metagonimíase, microsporidiose, molusco contagioso, caxumba, tifo murino (tifo endêmico), pneumonia por micoplasma, micetoma, miíase, conjuntivite neonatal (oftalmia neonatal), doença variante (nova) de Creutzfeldt-Jakob (vCJD, nvCJD), nocardiose, oncocercose (cegueira dos rios), paracoccidioidomicose (blastomicose da América do Sul), paragonimíase, pasteurelose, Pediculosis capitis (piolho da cabeça), Pediculosis corporis (Piolho do corpo), pediculose pubiana (Piolho púbico, Piolho caranguejo), doença inflamatória pélvica, coqueluche (Tosse convulsa), peste, infecção pneumocócica, pneumonia por Pneumocystis, pneumonia, poliomielite, infecção por Prevotella, meningoencefalite amebiana primária, leucoencefalopatia multifocal progressiva, psittacose, febre Q, raiva, febre de mordida de rato, infecção por vírus sincicial respiratório, rinosporidiose, infecção por rinovírus, infecção por rickettsia, varíola de Rickettsial, febre de Vale do Rift, febre maculosa, infecção por rotavírus, rubéola, salmonelose, SARS (Síndrome Respiratória Aguda Grave), escabiose, esquistossomose, sepse, shigelose (disenteria Bacilar), herpes zoster, varíola, esporotricose, intoxicação alimentar por estafilococos, infecção estafilocócica, estrongiloidíase, sífilis, taeníase, tétano (Lockjaw), Tinea barbae (coceira do barbeiro), Tinea capitis (dermatofitose do couro cabeludo), Tinea corporis (dermatofitose do corpo), tinea cruris (Jock coceira), tinea manuum (dermatofitose da mão), tinea nigra, Tinea pedis (pé de atleta), Tinea unguium (Onicomicose), Tinea versicolor (Pitiríase versicolor), toxocaríase (Larva migrans Ocular), toxocaríase (Larva migrans Visceral), toxoplasmose, triquinelose, tricomoníase, tricuríase (infecção por verme do chicote), tuberculose, tularemia, infecção por Ureaplasma
131 / 439 urealyticum, wncefalite equina venezuelana, debre hemorrágica venezuelana, pneumonia viral,d do Nilo Ocidental, Piedra branca (Tinea blanca), infecção por Yersinia pseudotuberculosis, yersiniose, febre amarela, zigomicose.
[00114] A molécula de ligação celular, que é mais preferida por ser um anticorpo descrito nesta patente que é contra cepas patogênicas inclui, entre outras, Acinetobacter baumannii, Actinomyces israelii, Actinomyces gerencseriae e Propionibacterium propionicous, Trypanosoma brucei, HIV (vírus da imunodeficiência humana), Entamoeba histolytica, Anaplasma genus, Bacillus anthracis, Arcanobacterium haemolyticum, vírus Junin, Ascaris lumbricoides, gênero Aspergillus, família Astroviridae, gênero Babesia, Bacillus cereus, múltiplas bactérias, gênero Bacteroides, Balantidium coli, gênero Baylisascaris, vírus BK, Piedraia hortae, Blastocystis hominis, Blastomyces dermatitides, vírus Machupo, gênero Borrelia, Clostridium botulinum, Sabia, gênero Brucella, normalmente Burkholderia cepacia e outras espécies de Burkholderia, Mycobacterium ulcerans, família Caliciviridae, gênero Campylobacter, normalmente Candida albicans e outras espécies de Candida, Bartonella henselae, Streptococcus Grupo A e Staphylococcus, Trypanosoma cruzi, Haemophilus ducreyi, vírus Varicella zoster (VZV), Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Vibrio cholerae, Fonsecaea pedrosoi, Clonorchis sinensis, Clostridium difficile, Coccidioides immitis e Coccidioides posadasii, vírus da febre do carrapato do Colorado, rinovírus, coronavírus, príon CJD, vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo, Cryptococcus neoformans, gênero Cryptosporidium, Ancylostoma braziliense; múltiplos parasitas, Ciclospora cayetanensis, Taenia solium, citomegalovírus, vírus da dengue (DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4), flavivírus, Dientamoeba fragilis, Corynebacterium diphtheriae, Diphyllobothrium, Dracunculus medinensis, vírus Ebola, gênero Echinococcus, gênero Ehrlichia, Enterobius vermicularis, gênero Enterococcus, gênero Enterovirus, Rickettsia
132 / 439 prowazekii, Parvovírus B19, herpesvírus humano 6 e herpesvírus 7 humano, Fasciolopsis buski, Fasciola hepatica e Fasciola gigantica, príon FFI, superfamília Filarioidea, Clostridium perfringens, gênero Fusobacterium, Clostridium perfringens; outras espécies de Clostridium, Geotrichum candidum, príon GSS, Giardia intestinalis, Burkholderia mallei, Gnathostoma spinigerum e Gnathostoma hispidum, Neisseria gonorrhoeae, Klebsiella granulomatis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Haemophilus influenzae, Enterovírus, principalmente vírus Coxsackie A e Enterovírus 71, vírus Sin Nombre, Helicobacter pylori, Escherichia coli O157:H7, família Bunyaviridae, vírus da hepatite A, vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, vírus da hepatite D, vírus da hepatite E, vírus do herpes simples 1, vírus do herpes simples 2, Histoplasma capsulatum, Ancylostoma duodenale e Necator americanus, Hemophilus influenzae, bocavírus humano, Ehrlichia ewingii, Anaplasma phagocitophilum, metapneumovírus humano, Ehrlichia chaffeensis, papilomavírus humano, vírus Parainfluenza humanos, Hymenolepis nana e Hymenolepis diminuta, vírus Epstein-Barr, família Orthomyxoviridae, Isospora belli, Kingella kingae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenas, Klebsiella rhinoscleromotis, príon Kuru, vírus Lassa, Legionella pneumophila, Legionella pneumophila, gênero Leishmania, Mycobacterium leprae e Mycobacterium lepromatosis, gênero Leptospira, Listeria monocitogenes, Borrelia burgdorferi e outras espécies de Borrelia, Wuchereria bancrofti e Brugia malayi, vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV), gênero Plasmodium, vírus de Marburg, vírus do sarampo, Burkholderia pseudomallei, Neisseria meningitides, Metagonimus yokagawai, Microsporidia phylum, vírus do molusco contagioso (MCV), vírus da caxumba, Rickettsia typhi, Mycoplasma pneumoniae, numerosas espécies de bactérias (Actinomycetoma) e fungos (Eumycetoma), larvas de moscas dípticas parasitárias, Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae, príon vCJD, Nocardia asteroides e outras espécies de Nocardia, Onchocerca
133 / 439 volvulus, Paracoccidioides brasiliensis, Paragonimus westermani e outras espécies de Paragonimus, gênero Pasteurella, Pediculus humanus capitis, Pediculus humanus corporis, Phthirus pubis, Bordetella pertussis, Yersinia pestis, Streptococcus pneumoniae, Pneumocystis jirovecii, Poliovírus, gênero Prevotella, Naegleria fowleri, vírus JC, Chlamydophila psittaci, Coxiella burnetii, vírus da raiva, Streptobacillus moniliformis e Spirillum minus, vírus sincicial respiratório, Rhinosporidium seeberi, rinovírus, gênero Rickettsia, Rickettsia akari, vírus da febre do vale do Rift, Rickettsia rickettsii, rotavírus, vírus da rubéola, gênero Salmonella, coronavírus SARS, Sarcoptes scabiei, gênero Schistosoma, gênero Shigella, vírus Varicella zoster, variola major ou variola minor, Sporothrix schenckii, gênero Staphylococcus, gênero Staphylococcus, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Strongyloides stercoralis, Treponema pallidum, gênero Taenia, Clostridium tetani, gênero Trichophyton, Trichophyton tonsurans, gênero Trichophyton, Epidermophyton floccosum, Trichophyton rubrum e Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Hortaea werneckii, gênero Trichophyton, gênero Malassezia, Toxocara canis ou Toxocara cati, Toxoplasma gondii, Trichinella spiralis, Trichomonas vaginalis, Trichuris trichiura, Mycobacterium tuberculosis, Francisella tularensis, Ureiaplasma ureialyticum, vírus da encefalite equina venezuelana, Vibrio colerae, vírus Guanarito, vírus do Nilo Ocidental, Trichosporon beigelii, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica, , vírus da febre amarela, ordem Mucorales (mucormicose) e ordem Entomophthorales (Entomoftoramicose), Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter (Vibrio) fetus, Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda, Yersinia pestis, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Treponema pertenue, Treponema carateneum, Borrelia vincentii, Borrelia burgdorferi, Leptospira icterohemorrhagiae, Pneumocystis carinii, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella melitensis, Mycoplasma spp., Rickettsia prowazeki,
134 / 439 Rickettsia tsutsugumushi, Clamydia spp.; fungos patogênicos (Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Histoplasma capsulatum); protozoários (Entomoeba histolytica, Trichomonas tenas, Trichomonas hominis, Tryoanosoma gambiense, Trypanosoma rhodesiense, Leishmania donovani, Leishmania tropica, Leishmania braziliensis, Pneumocystis pneumonia, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malaria); ou helmintos (Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium e ancilostomídeos).
[00115] Outros anticorpos como ligandos de ligação celular usados nesta invenção para tratamento de doença viral incluem, entre outros, anticorpos contra antígenos de vírus patogênicos, incluindo a título de exemplo e não de limitação: Poxyiridae, Herpesviridae, Adenoviridae, Papovaviridae, Enteroviridae, Picornaviridae, Parvoviridae, Reoviridae, Retroviridae, vírus Influenza, vírus Parainfluenza, caxumba, sarampo, vírus sincicial respiratório, rubéola, Arboviridae, Rhabdoviridae, Arenaviridae, vírus não da Hepatite A/Não da B, Rhinoviridae, Coronaviridae, Rotoviridae, Oncovírus [como HBV (carcinoma hepatocelular), HPV (câncer do colo do útero, câncer anal), herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (sarcoma de Kaposi), vírus Epstein-Barr (carcinoma nasofaríngeo, linfoma de Burkitt, linfoma primário do sistema nervoso central), MCPyV (câncer de células de Merkel), SV40 (vírus símio 40), HCV (carcinoma hepatocelular), HTLV-I (linfoma/leucemia de células T de adulto)], vírus que causam distúrbios imunológicos: [como o vírus da imunodeficiência humana (AIDS)]; Vírus do sistema nervoso central: [como JCV (leucoencefalopatia multifocal progressiva), MeV (panencefalite esclerosante subaguda), LCV (coriomeningite linfocítica), encefalite por arbovírus, Orthomyxoviridae (provável) ((encefalite letárgica), RV (raiva), vírus Chandipura, meningite herpesviral, síndrome Ramsay Hunt tipo II; poliovírus (Poliomielite, síndrome pós-poliomielite), HTLV-I (paraparesia espástica tropical)]; Citomegalovírus
135 / 439 (retinite por citomegalovírus, HSV (queratite herpética)); vírus cardiovascular [como CBV (pericardite, miocardite)]; Sistema respiratório/nasofaringite viral aguda/pneumonia viral: [Vírus Epstein-Barr (infecção por EBV/mononucleose infecciosa), Citomegalovírus; Coronavírus SARS (síndrome respiratória aguda grave) Orthomyxoviridae: vírus Influenza A/B/C (influenza/influenza aviária), paramixovírus: Vírus de parainfluenza humano (Parainfluenza), RSV (vírus sincicial respiratório humano), hMPV]; Vírus do sistema digestivo [MuV (Caxumba), citomegalovírus (esofagite por citomegalovírus); Adenovírus (infecção por adenovírus); Rotavírus, Norovírus, Astrovírus, Coronavírus; HBV (vírus da hepatite B), CBV, HAV (vírus da hepatite A), HCV (vírus da hepatite C), HDV (vírus da hepatite D), HEV (vírus da hepatite E), HGV (vírus da hepatite G)]; Vírus urogenital [como vírus BK, MuV (Caxumba)].
[00116] De acordo com outro objeto, a presente invenção também se refere a composições farmacêuticas compreendendo o conjugado da invenção juntamente com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável para o tratamento de cânceres, infecções ou distúrbios autoimunes. O método para o tratamento de cânceres, infecções e distúrbios autoimunes pode ser praticado in vitro, in vivo ou ex vivo. Exemplos de usos in vitro incluem tratamentos de culturas de células para matar todas as células, exceto as variantes desejadas que não expressam o antígeno alvo; ou matar variantes que expressam antígenos indesejados. Exemplos de usos ex vivo incluem tratamentos de células-tronco hematopoiéticas (HSC) antes da realização do transplante (HSCT) no mesmo paciente para matar células doentes ou malignas. Por exemplo, o tratamento clínico ex vivo para remover células tumorais ou células linfoides da medula óssea antes do transplante autólogo no tratamento do câncer ou no tratamento de doenças autoimunes, ou remover células T e outras células linfoides da medula óssea ou tecido alogênico antes do transplante para prevenir a doença do enxerto contra o hospedeiro, pode
136 / 439 ser realizada como segue. A medula óssea é extraída do paciente ou de outro indivíduo e depois incubada em meio contendo soro ao qual é adicionado o conjugado da invenção, as concentrações variam de cerca de 1 pM a 0,1 mM, por cerca de 30 minutos a cerca de 48 horas a cerca de 37 º. As condições exatas de concentração e tempo de incubação (= dose) são prontamente determinadas pelos médicos especializados. Após a incubação, as células da medula óssea são lavadas com meio contendo soro e devolvidas ao paciente por infusão i.v. de acordo com métodos conhecidos. Em circunstâncias em que o paciente recebe outro tratamento, como um curso de quimioterapia ablativa ou irradiação total do corpo entre o momento da extração da medula e a reinfusão das células tratadas, as células da medula tratadas são armazenadas congeladas em nitrogênio líquido usando equipamento médico padrão. FÁRMACOS/AGENTE CITOTÓXICOS PARA CONJUGAÇÃO
[00117] Fármacos que podem ser conjugados a uma molécula de ligação celular na presente invenção são fármacos de moléculas pequenas, incluindo agentes citotóxicos, que podem ser ligados a ou depois de serem modificados para acoplamento ao agente de ligação celular. Um “fármaco de molécula pequena” é usado em amplo sentido para se referir a um composto orgânico, inorgânico ou organometálico que pode ter um peso molecular de, por exemplo, 100 a 4000, mais adequadamente 200 a 3000. Os fármacos de moléculas pequenas são bem caracterizados na técnica, como em WO05058367A2 e na Patente dos EUA No 4 956 303, entre outros, e aqui incorporados, em sua totalidade, por referência. Os fármacos incluem fármacos conhecidos e aqueles que podem se tornar fármacos conhecidos.
[00118] Os fármacos conhecidos incluem, entre outros, 1). Agentes quimioterápicos: a). Agentes alquilantes: como mostardas nitrogenadas: clorambucil, clornafazina, ciclofosfamida, dacarbazina, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de
137 / 439 mecloretamina, manomustina, mitobronitol, melfalano, mitolactol, pipobromana, novembichin, fenesterina, prednimustina, tiotepa, trofosfamida, mostarda de uracila; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); Duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189, dímeros de CBI-TMI e CBI); dímeros de benzodiazepina (p. ex., dímeros de pirrolobenzodiazepina (PBD) ou tomaimicina, indolinobenzodiazepinas, imidazobenzotiadiazepinas ou oxazolidino- benzodiazepinas); Nitrosoureias: (carmustina, lomustina, clorozotocina, fotemustina, nimustina, ranimustina); Alquilsulfonatos: (bussulfano, treossulfano, improssulfano e pipossulfano); Triazenos: (dacarbazina); compostos contendo platina: (carboplatina, cisplatina, oxaliplatina); aziridinas, como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomel-amina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina]; b). Alcaloides vegetais: como alcaloides da Vinca: (vincristina, vimblastina, vindesina, vinorelbina, navelbina); Taxoides: (paclitaxel, docetaxol) e seus análogo, Maitansinoides (DM1, DM2, DM3, DM4, maitansina e ansamitocinas) e seus análogos, criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); epotilonas, eleuterobina, discodermolida, briostatinas, dolostatinas, auristatinas, tubulisinas, cefalostatinas; pancratistatina; erbulinas; uma sarcodictina; espongistatina; c). Inibidores da DNA topoisomerase: como [Epipodofilinas: (9-aminocamptotecina, camptotecina, crisnatol, daunomicina, etoposídeo, fosfato de etoposídeo, irinotecano, mitoxantrona, novantrona, ácidos retinoicos (retinóis), teniposídeo, topotecano, 9- nitrocamptotecina (RFS 2000)); mitomicinas: (mitomicina C) e seus análogos]; d). Anti-metabólitos: como {[Anti-folato: Inibidores de DHFR: (metotrexato, trimetrexato, denopterina, pteropterina, aminopterina (ácido 4- aminopteroico) ou os outros análogos do ácido fólico); Inibidores da IMP desidrogenase: (ácido micofenólico, tiazofurina, ribavirina, EICAR);
138 / 439 Inibidores da ribonucleotídeo redutase: (hidroxiureia, deferoxamina)]; [Análogos da pirimidina: análogos de uracila: (ancitabina, azacitidina, 6- azauridina, capecitabina (Xeloda), carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, 5-Fluorouracila, floxuridina, ratitrexede (Tomudex)); Análogos de citosina: (citarabina, citosina arabinosídeo, fludarabina); Análogos da purina: (azatioprina, fludarabina, mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina)]; repositor de ácido fólico, como ácido frolínico}; e Inibidores de nicotinamida fosforribosiltransferase (NAMPT); e). Terapias hormonais: como {Antagonistas de receptores: [Anti-estrogênico: (megestrol, raloxifeno, tamoxifeno); agonistas de LHRH: (goserclina, acetato de leuprolida); Anti-androgênicos: (bicalutamida, flutamida, calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, goserelina, leuprolida, mepitiostano, nilutamida, testolactona, trilostano e outros inibidores de androgênios)]; Retinoides/Deltoides: [Análogos da vitamina D3: (CB 1093, EB 1089 KH 1060, colecalciferol, ergocalciferol); terapias fotodinâmicas: (verteporfina, ftalocianina, fotossensibilizador Pc4, demetoxi-hipocrelina A); Citocinas: (Interferon-alfa, Interferon-gama, fator de necrose tumoral (TNFs), proteínas humanas contendo um domínio TNF)]}; f). Inibidores de quinase, como BIBW 2992 (anti-EGFR/Erb2), imatinibe, gefitinibe, pegaptanibe, sorafenibe, dasatinibe, sunitinibe, erlotinibe, nilotinibe, lapatinibe, axitinibe, pazopanib. vandetanibe, E7080 (anti-VEGFR2), mubritinibe, ponatinibe (AP24534), bafetinibe (INNO-406), bosutinibe (SKI-606), cabozantinibe, vismodegibe, iniparibe, ruxolitinibe, CYT387, axitinibe, tivozanibe, sorafenibe, bevacizumabe, cetuximabe, Trastuzumabe, Ranibizumabe, Panitumumabe, ispinesibe; g). Inibidores de poli (ADP-ribose) polimerase (PARP), como olaparibe, niraparibe, iniparibe, talazoparibe, veliparibe, veliparibe, CEP 9722 (Cephalon), E7016 (Eisai), BGB-290 (BeiGene), 3- aminobenzamida.
[00119] h). antibióticos, como os antibióticos de enedina (p. ex.,
139 / 439 caliqueamicinas, especialmente caliqueamicina γ1, δ1, α1 e β1, ver, p. ex., J.
Med.
Chem., 39 (11), 2103-2117 (1996), Angew Chem Intl.
Ed.
Engl. 33:183-186 (1994); dinemicina, incluindo dinemicina A e desoxidinemicina; esperamicina, quedarcidina, C-1027, maduropeptina, bem como cromóforo de neocarzinostatina e cromóforos relacionados a antibióticos de enedina), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina; cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2- pirrolino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, nitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; i). Outros: como os Policetídeos (acetogeninas), especialmente bulatacina e bulatacinona; gencitabina, epoxomicinas (p. ex., carfilzomibe), bortezomibe, talidomida, lenalidomida, pomalidomida, tosedostate, zybrestat, PLX4032, STA-9090, Stimuvax, alovectina-7, Xegeva, Provenge, Yervoy, inibidores da isoprenilação (como Lovastatina), Neurotoxinas dopaminérgicas (como o íon 1-metil-4-fenilpiridínio), inibidores do ciclo celular (como estaurosporina), Actinomicinas (como Actinomicina D, dactinomicina), Bleomicinas (como bleomicina A2, bleomicina B2, peplomicina), Antraciclinas (como daunorrubicina, doxorrubicina (adriamicina), idarrubicina, epirrubicina, eribulina, pirarrubicina, zorrubicina, mtoxantrona, inibidores de MDR (como verapamil), inibidores de Ca2+ATPase (como tapsigargina), inibidores de histona desacetilase (Vorinostate, Romidepsina, Panobinostate, ácido valproico, Mocetinostate (MGCD0103), Belinostate, PCI-24781, Entinostate, SB939, Resminostate, Givinostate, AR-42, CUDC-101, sulforafano, Tricostatina A); Tapsigargina, Celecoxibe, glitazonas, galato de
140 / 439 epigalocatequina, Disulfiram, Salinosporamida A.; Anti-adrenais, como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; ansacrina; arabinosídeo, bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; eflornitina (DFMO), elfomitina; acetato de eliptínio, etoglucida; nitrato de gálio; gacitosina, hidroxiureia; ibandronato, lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; polisacarídeo-K (PSK®); razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2, 2',2''-triclorotrietilamina; trichotecenos (especialmente toxina T-2, verrucarina A, roridina A e anguidina); uretano, siRNA, fármacos antisense e uma enzima nucleotídica.
[00120] 2). Um agente contra doença autoimune inclui, entre outros, ciclosporina, ciclosporina A, ácido aminocaproico, azatioprina, bromocriptina, clorambucil, cloroquina, ciclofosfamida, corticosteroides (p. ex., ancinonida, betametasona, budesonida, hidrocortisona, flunisolida, propionato de afluticaso, fluocortolona danazol, dexametasona, Triancinolona acetonida, dipropionato de beclometasona), DHEA, enanercept, hidroxicloroquina, infliximabe, meloxicam, metotrexato, mofetil, micofenilato, prednisona, sirolimo, tacrolimo.
[00121] 3). Um agente contra doença infecciosa inclui, entre outros, a). Aminoglicosídeos: amicacina, astromicina, gentamicina (netilmicina, sisomicina, isepamicina), higromicina B, canamicina (amicacina, arbecacina, bekanamicina, dibecacina, tobramicina), neomicina (framicetina, paromomicina, ribostamicina), netilmicina, espectinomicina, estreptomicina, tobramicina, verdamicina; b). Anfenicóis: azidamfenicol, cloranfenicol, florfenicol, tianfenicol; c). Ansamicinas: geldanamicina, herbimicina; d). Carbapenemas: biapenem, doripenem, ertapenem, imipenem/cilastatina, meropenem, panipenem; e). Cefens: carbaceffen (loracarbef), cefacetrila,
141 / 439 cefaclor, cefradina, cefadroxil, cefalônio, cefaloridina, cefalotina ou cefalotina, cefalexina, cefaloglicina, cefamandol, cefapirina, cefatrizina, cefazaflur, cefazedona, cefazolina, cefbuperazona, cefcapeno, cefdaloxima, cefepima, cefminox, cefoxitin, cefprozil, cefroxadina, ceftezol, cefuroxima, cefixima, cefdinir, cefditoren, cefepima, cefetamet, cefmenoxima, cefodizima, cefonicida, cefoperazona, ceforanida, cefotaxima, cefotiam, cefozoprano, cefalexina, cefpimizol, cefpiramida, cefpiroma, cefpodoxima, cefprozil, cefquinoma, cefsulodina, ceftazidima, cefteram, ceftibuteno, ceftioleno, ceftizoxima, ceftobiprol, ceftriaxona, cefuroxima, cefuzonam, cefamicina (cefoxitina, cefotetano, cefmetazol), oxacefen (flomoxef, latamoxef); f). Glicopeptídeos: bleomicina, vancomicina (oritavancina, telavancina), teicoplanina (dalbavancina), ramoplanina; g). Glicilciclinas: p. ex., tigeciclina; g). Inibidores de β-lactamase: penam (sulbactam, tazobactam), clavam (ácido clavulânico); i). Lincosamidas: clindamicina, lincomicina; j). Lipopeptídeos: daptomicina, A54145, antibióticos dependentes de cálcio (CDA); k). Macrolídeos: azitromicina, cetromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, fluritromicina, josamicina, cetolídeo (telitromicina, cetromicina), midecamicina, miocamicina, oleandomicina, rifamicinas (rifampicina, rifampina, rifabutina, rifapentina), roquitamicina, roxitromicina, espectinomicina, espiramicina, tacrolimo (FK506), troleandomicina, telitromicina; l). Monobactamas: aztreonam, tigemonam; m). Oxazolidinonas: linezolida; n). Penicilinas: amoxicilina, ampicilina (pivampicilina, hetacilina, bacampicilina, metampicilina, talampicilina), azidocilina, azlocilian, benzilpenicilina, benzatina benzilpenicilina, benzatina fenoximetil-penicilina, clometocilina, procaína benzilpenicilina, carbenicilina (carindacilina), cloxacilina, dicloxacilina, epicilina, flucloxacilina, mecilinam (pivmecilinam), mezlocilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, penamecilina, penicilina, feneticilina, fenoximetilpenicilina, piperacilina, propicilina, sulbenicilina, temocilina, ticarcilina; o). Polipeptídeos: bacitracina, colistina,
142 / 439 polimixina B; p). Quinolonas: alatrofloxacino, balofloxacino, ciprofloxacino, clinafloxacino, danofloxacino, difloxacino, enoxacino, enrofloxacino, floxino, garenoxacino, gatifloxacino, gemifloxacino, grepafloxacino, kano trovafloxacino, levofloxacino, lomefloxacino, marbofloxacino, moxifloxacino, nadifloxacino, norfloxacino, orbifloxacino, ofloxacino, pefloxacino, trovafloxacino, grepafloxacino, sitafloxacino, esparfloxacino, temafloxacino, tosufloxacino, trovafloxacino; q). Estreptograminas: pristinamicina, quinupristina/dalfopristina); r). Sulfonamidas: mafenida, prontosil, sulfacetamida, sulfametizol, sulfanilimida, sulfasalazina, sulfisoxazol, trimetoprima, trimetoprima-sulfametoxazol (co-trimoxazol); s). Antibacterianos esteroides: p. ex., ácido fusídico; t). Tetraciclinas: doxiciclina, clortetraciclina, clomociclina, demeclociclina, limeciclina, meclociclina, metaciclina, minociclina, oxitetraciclina, penimepiciclina, rolitetraciclina, tetraciclina, glicilciclinas (p. ex., tigeciclina); u). Outros tipos de antibióticos: anonacina, arsfenamina, inibidores de bactoprenol (Bacitracina), inibidores de DADAL/AR (cicloserina), dictiostatina, discodermolida, eleuterobina, epotilona, etambutol, etoposídeo, faropenem, ácido fusídico, furazolidona, isoniazida, laulimalida, metronidazol, mupirocina, micolactona, inibidores da síntese de NAM (p. ex., fosfomicina), nitrofurantoína, paclitaxel, platensimicina, pirazinamida, quinupristina/dalfopristina, rifampicina (rifampina), tazobactam tinidazol, uvaricina; 4). Fármacos antivirais: a). inibidores da entrada/fusão: aplaviroc, maraviroc, vicriviroc, gp41 (enfuvirtide), PRO 140, CD4 (ibalizumabe); b). Inibidores de integrase: raltegravir, elvitegravir, globoidnan A; c). Inibidores da maturação: bevirimat, vivecon; d). Inibidores de neuraminidase: oseltamivir, zanamivir, peramivir; e). Nucleosídeos e nucleotídeos: abacavir, aciclovir, adefovir, andoxovir, apricitabina, brivudina, cidofovir, clevudina, dexelvucitabina, didanosina (ddI), elvucitabina,
143 / 439 entricitabina (FTC), entecavir, famciclovir, fluorouracila (5-FU), análogos de 2’,3’-didesoxinucleosídeos 2,3’-fluoro-substituídos (p. ex., 3’-fluoro-2’,3’- didesoxitimidina (FLT) e 3’-fluoro-2’,3’-didesoxiguanosina (FLG), fomivirsen, ganciclovir, idoxuridina, lamivudina (3TC), l-nucleosídeos (p. ex., β-l-timidina e β-l-2’-desoxicitidina), penciclovir, racivir, ribavirina, estampidina, estavudina (d4T), taribavirina (viramidina), telbivudina, tenofovir, trifluridina valaciclovir, valganciclovir, zalcitabina (ddC), zidovudina (AZT); f). Não nucleosídeos: amantadina, ateviridina, capravirina, diarilpirimidinas (etravirina, rilpivirina), delavirdina, docosanol, emivirina, efavirenz, foscarnet (ácido fosfonofórmico), imiquimode, interferon alfa, lovirida, lodenosina, methisazona, nevirapina, NOV-205, peginterferon alfa, podofilotoxina, rifampicina, rimantadina, resiquimode (R-848), tromantadina; g). Inibidores de protease: amprenavir, atazanavir, boceprevir, darunavir, fosamprenavir, indinavir, lopinavir, nelfinavir, pleconaril, ritonavir, saquinavir, telaprevir (VX-950), tipranavir; h). Outros tipos de fármacos antivirais: abzima, arbidol, calanolida a, ceragenina, cianovirina-n, diarilpirimidinas, galato de epigalocatequina (EGCG), foscarnet, griffitsina, taribavirina (viramidina), hidroxiureia, KP-1461, miltefosina, pleconaril, inibidores de portmanteau, ribavirina, seliciclibe.
[00122] 5). Os fármacos usados para conjugados por intermédio de um bis-ligante da presente invenção também incluem radioisótopos. Exemplos de radioisótopos (radionuclídeos) são 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 99 Tc, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At ou 213Bi. Anticorpos marcados com radioisótopos são úteis em experimentos de imagem direcionados para receptores ou podem ser para tratamento direcionado como com os conjugados anticorpo-fármaco da invenção (Wu et al (2005) Nature Biotechnology 23(9): 1137-46). As moléculas de ligação celular, p. ex., um anticorpo pode ser marcados com reagentes de ligandos através dos ligantes em ponte da presente patente que se ligam, quelam ou do contrário formam
144 / 439 um complexo com radioisótopo metálico, usando as técnicas descritas em Current Protocols in Immunology, Volumes 1 e 2, Coligen et al, Ed. Wiley- Interscience, Nova York, Pubs. (1991). Ligandos quelantes que podem complexar um íon metálico incluem DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA e TETA (Macrocyclics, Dallas, Tex. EUA).
[00123] 6). Os sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos, derivados, hidrato ou sal hidratado; ou uma estrutura cristalina; ou um isômero óptico, racemato, diastereômero ou enantiômero de qualquer um dos fármacos acima.
[00124] Em outra modalidade, o fármaco/molécula citotóxica na Fórmula (I) e/ou (II) pode ser uma molécula de cromóforo, para a qual o conjugado pode ser usado para detecção, monitoramento ou estudo da interação da molécula de ligação celular com uma célula alvo. As moléculas de cromóforo são um composto que tem a capacidade de absorver um tipo de luz, como luz UV, luz fluorescente, luz infravermelha, luz próxima à infravermelha, luz visual; Uma molécula de cromatóforo inclui uma classe ou subclasse de xantóforos, eritróforos, iridóforos, leucóforos, melanóforos e cianóforos; uma classe ou subclasse de moléculas de fluoróforo que são compostos químicos fluorescentes que re-emitem luz sobre luz; uma classe ou subclasse de moléculas de fototransdução visual; uma classe ou subclasse de moléculas de fotóforo; uma classe ou subclasse de moléculas de luminescência; e uma classe ou subclasse de compostos de luciferina.
[00125] A molécula de cromóforo pode ser selecionada, entre outros, dentre fluoróforos orgânicos não proteicos, como: Derivados de xanteno (fluoresceína, rodamina, verde de Oregon, eosina e vermelho do Texas); Derivados de cianina: (cianina, indocarbocianina, oxacarbocianina, tiacarbocianina e merocianina); Derivados de esquaraína e esquaraínas substituídas no anel, incluindo corantes Seta, SeTau e Square; Derivados de naftaleno (derivados de dansil e prodan); Derivados de cumarina; Derivados de oxadiazol (piridiloxazol, nitrobenzoxadiazol e benzoxadiazol); derivados
145 / 439 de antraceno (antraquinonas, incluindo DRAQ5, DRAQ7 e CyTRAK Orange); pyrene derivatives (cascade blue, etc.); Derivados de pireno (azul cascata, etc.); Derivados de oxazina (vermelho do Nilo, azul do Nilo, violeta de cresil, oxazina 170, etc.). Derivados de acridina (proflavina, laranja de acridina, amarelo de acridina, etc.). Derivados de arilmetina (auramina, violeta cristal, verde malaquita). Derivados de tetrapirrol (porfina, ftalocianina, bilirrubina).
[00126] Ou uma molécula de cromóforo pode ser selecionada a partir de quaisquer análogos e derivados dos seguintes compostos de fluoróforo: Corantes CF (Biotium), sondas DRAQ e CyTRAK (BioStatus), BODIPY (Invitrogen), Alexa Fluor (Invitrogen), DyLight Fluor (Thermo Scientific, Pierce), Atto e Tracy (Sigma Aldrich), FluoProbes (Interchim), Abberior Dyes (Abberior), DY e MegaStokes (Dyomics), Sulfo Cy (Cyandye), HiLyte Fluor (AnaSpec), Seta, SeTau e Square (SETA BioMedicals), Quasar e Cal Fluor (Biosearch Technologies), SureLight (APC, RPEPerCP, Ficobilissomas) (Columbia Biosciences), APC, APCXL, RPE, BPE (Phyco- Biotech).
[00127] Exemplos dos compostos fluoróforos amplamente utilizados que são reativos ou conjugáveis com os ligantes da invenção são: Aloficocianina (APC), Aminocumarina, conjugados de APC-Cy7, BODIPY- FL, Azul de Cascata, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy3B, Cy5, Cy5.5, Cy7, Fluoresceína, FluorX, Hidroxicumarina, IR-783, Lissamina Rododamina B, Amarelo lúcifer, metoxicumarina, NBD, azul do Pacífico, laranja do Pacífico, conjugados de PE-Cy5, conjugados de PE-Cy7, PerCP, R-fitoeritrina (PE), Red 613, Seta-555-azida, Seta-555-DBCO, Seta-555-NHS, Seta-580-NHS, Seta-680-NHS, Seta-780-NHS, Seta-APC-780, Seta-PerCP-680, Seta-R-PE- 670, SeTau-380-NHS, SeTau-405-Maleimida, SeTau-405-NHS, SeTau-425- NHS, SeTau-647-NHS, Vermelho do Texas, TRITC, TruRed, X-Rodamina.
[00128] Os compostos fluoróforo que podem ser acoplados aos ligantes
146 / 439 da invenção para estudo de ácidos nucleicos ou proteínas são selecionados a partir dos seguintes compostos ou seus derivados: 7-AAD (7- aminoactinomicina D, CG-seletivo), laranja de acridina, cromomicina A3, laranja de CyTRAK (Biostatus, excitação vermelha escura), DAPI, DRAQ5, DRAQ7, brometo de etídio, Hoechst33258, Hoechst33342, LDS 751, mitramicina, iodeto de propídio (PI), azul SYTOX, verde SYTOX, laranja SYTOX, laranja de tiazol, TO-PRO: monômero de cianina, TOTO-1, TO- PRO-1, TOTO-3, TO-PRO-3, YOSeta-1, YOYO-1. Os compostos fluoróforo que podem ser acoplados aos ligantes da invenção para estudo de células são selecionados a partir dos seguintes compostos ou seus derivados: DCFH (2'7'Dicorodi-hidro-fluoresceína, forma oxidada), DHR (Di-hidrorrodamina 123, forma oxidada, a luz catalisa a oxidação), Fluo-3 (éster AM. pH> 6), Fluo-4 (éster AM. pH 7,2), Indo-1 (éster AM, cálcio baixo/alto (Ca2+)) e SNARF (pH 6/9). Os compostos fluoróforo preferidos que podem ser acoplados aos ligantes da invenção para estudo de proteínas/anticorpos são selecionados a partir dos seguintes compostos ou seus derivados: Aloficocianina (APC), AmCyan1 (tetrâmero, Clontech), AsRed2 (tetrâmero, Clontech), Verde de Azami (monômero, MBL), Azurita, B-fitoeritrina (BPE), Cerulean, CyPet, monômero DsRed (Clontech), DsRed2 ("RFP", Clontech), EBFP, EBFP2, ECFP, EGFP (dímero fraco, Clontech), Emerald (dímero fraco, Invitrogen), EYFP (dímero fraco, Clontech), GFP (mutação S65A), GFP (mutação S65C), GFP (mutação S65L), GFP (mutação S65T), GFP (mutação Y66F), GFP (mutação Y66H), GFP (mutação Y66W), GFPuv, HcRed1, J-Red, Katusha, Kusabira Orange (monômero, MBL), mCFP, mCherry, mCitrine, Midoriishi Ciano (dímero, MBL), mKate (TagFP635, monômero, Evrogen), mKeima-Red (monômero, MBL), mKO, mOrange, mPlum, mRaspberry, mRFP1 (monômero, laboratório de Tsien), mStrawberry, mTF1, mTurquoise2, P3 (complexo de ficobilissoma), peridinina clorofila (PerCP), R-fitoeritrina (RPE), T-Sapphire, TagCFP
147 / 439 (dímero, Evrogen), TagGFP (dímero, Evrogen), TagRFP (dímero, Evrogen), TagYFP (dímero, Evrogen), tdTomato (dímero em tandem), Topázio, TurboFP602 (dímero, Evrogen), TurboFP635 (dímero, Evrogen), TurboGFP (dímero, Evrogen), TurboRFP (dímero, Evrogen), TurboYFP (dímero, Evrogen), Venus, GFP de tipo selvagem, YPet, ZsGreen1 (tetrâmero, Clontech), ZsYellow1 (tetrâmero, Clontech).
[00129] Os exemplos da estrutura dos conjugados do anticorpo- moléculas de cromóforo através do ligante em ponte são os seguintes Ac01, Ac02, Ac03, Ac04, Ac05, Ac06, e Ac07, Ac08, Ac09, Ac010, e Ac11: Ac01, Ac02, Ac03, Ac04,
148 / 439 Ac05, Ac06, Ac07,,
HO O R5 Y1 R1 X1 N R3 Z1
O
O Q X2 O Y2 R2 N R4 Z2 O n R5' O Ac08, Ac09, Ac10 (IR800CW conjugado),
149 / 439 Ac11, em que “ “, Q, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são definidos como acima; R12 e R12’ são independentemente OH, NH2, NHR1, NHNH2, NHNHCOOH, O-R1-COOH, NH-R1-COOH, NH-(Aa)nCOOH, O(CH2CH2O)pCH2CH2OH, O(CH2CH2O)pCH2CH2NH2, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NH2, O(CH2CH2O)pCH2CH2COOH, NH(CH2CH2O)pCH2CH2COOH, O(CH2CH2O)pCH2CH2NHSO3H, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHSO3H, R1-NHSO3H, NH-R1-NHSO3H, O(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2, R1 - NHPO3H2, R1-OPO3H2, O(CH2CH2O)pCH2CH2OPO3H2, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2, OR1-NHPO3H2, NH-R1-NHPO3H2, NH- Ar-COOH, NH-Ar-NH2, em que p=0-5000, Aa é um aminoácido, (Aa)n compreende os mesmos ou diferentes aminoácidos naturais ou não naturais, n=1-30.
[00130] Em outra modalidade, o fármaco na Fórmula (I), (II), (III) e (IV) pode polialquilenoglicóis que são usados para prolongar a meia-vida da molécula de ligação celular quando administrado a um mamífero. Polialquileno glicóis incluem, entre outros, poli(etilenoglicóis) (PEGs), poli(propilenoglicol) e copolímeros de óxido de etileno e óxido de propileno; pEGs são especialmente preferidos e, mais especialmente preferidos, são hidroxiPEGs ativados monofuncionalmente (p. ex., PEGs ativados com hidroxila em um único terminal, incluindo ésteres reativos de hidroxiPEG- ácido monocarboxílicos, hidroxiPEG-monoaldeídos, hidroxiPEG- monoaminas, hidroxiPEG-mono-hidrazidas, hidroxiPEG-monocarbazatos, hidroxil-PEG-monoiodo-acetamidas, hidroxil-PEG-monomaleimidas, hidroxil-PEG-mono-ortopiridil-dissulfetos, hidroxiPEG-mono-oximas,
150 / 439 hidroxiPEG-monofenilcarbonatos, hidroxil-PEG-monofenil-glioxais, hidroxil- PEG-monotiazolidina-2-tionas, hidroxil-PEG-monotioésteres, hidroxil-PEG- monotióis, hidroxil-PEG-monotriazinas e hidroxil-PEG-monovinilsulfonas).
[00131] Em certas de tais modalidades, o polialquileno glicol tem um peso molecular entre cerca de 10 Daltons e 200 kDa, preferivelmente entre aproximadamente 88 Da e 50 kDa; duas ramificações, cada um com peso molecular entre aproximadamente 88 Da e 50 kDa; e mais preferivelmente, duas ramificações, cada uma com entre aproximadamente 88 Da e 20 kDa. Em uma modalidade em particular, o polialquileno glicol é poli(etileno) glicol e seu peso molecular é aproximadamente 10 kDa; aproximadamente 20 kDa ou aproximadamente 40 kDa. Em modalidades específicas, o PEG é PEG 10 kDa (linear ou ramificado), PEG 20 kDa (linear ou ramificado) ou PEG 40 kDa (linear ou ramificado). Várias patentes US descreveram a preparação de polímeros de PEG lineares ou ramificados “não antigênicos” PEG e derivados ou conjugados dos mesmos, p. ex., as Patentes dos EUA Nos 5 428 128; 5 621 039; 5 622 986; 5 643 575; 5 728 560; 5 730 990; 5 738 846; 5 811 076; 5 824 701; 5 840 900; 5 880 131; 5 900 402; 5 902 588; 5 919 455; 5 951 974; 5 965 119; 5 965 566; 5 969 040; 5 981 709; 6 011 042; 6 042 822; 6 113 906; 6 127 355; 6 132 713; 6 177 087 e 6 180 095. A estrutura dos conjugados do anticorpo-polialquileno glicóis através do ligante em ponte é como os seguintes Pg01, Pg02, e Pg03.
Pg01 Pg02
151 / 439 Pg03 em que “ “, Q, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são definidos como acima; preferivelmente, Y1 e Y2 são independentemente O, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, C(O)NHNHC(O) e C(O)NR1; p é 1 -5000; R1 e R3 são definidos da mesma forma que R1 acima e, preferivelmente, R1 e R3 são H, OH, OCH3, CH3 ou OC2H5 independentemente.
[00132] Em ainda outra modalidade, os agentes citotóxicos preferidos conjugados a uma molécula de ligação celular através de um ligante em ponte desta patente são tubulisinas, maitansinoides, taxanoides (taxanos), análogos de CC-1065, compostos de daunorrubicina e doxorrubicina, amatoxinas (incluindo amanitinas), indolecarboxamida, dímeros de benzodiazepina (p. ex., dímeros de pirrolobenzodiazepina (PBD), tomaimicina, antramicina, indolinobenzodiazepinas, imidazobenzotiadiazepinas ou oxazolidinobenzodiazepinas), caliqueamicinas e os antibióticos de enedina, actinomicina, azaserinas, bleomicinas, epirrubicina, eribulina, tamoxifeno, idarrubicina, dolastatinas, auristatinas (p. ex., monometil auristatina E, MMAE , MMAF, auristatina PYE, auristatina TP, Auristatinas 2-AQ, 6-AQ, EB (AEB), e EFP (AEFP) e seus análogos), duocarmicinas, geldanamicinas ou outros inibidores de HSP90, centanamicina, metotrexatos, tiotepa, vindesinas, vincristinas, erbulinas, hemiasterlinas, nazumamidas, microgininas, radiosuminas, estreptonigtina, SN38 ou outros análogos ou metabólitos de camptotecina, alterobactinas, microscleroderminas, teonelamidas, esperamicinas, PNU-159682; e seus análogos ou derivados, sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos, derivados, hidrato ou sal hidratado;
152 / 439 ou uma estrutura cristalina; ou um isômero óptico, racemato, diastereômero ou enantiômero de qualquer um dos fármacos acima.
[00133] As tubulisinas que são preferidas para a conjugação na presente invenção são bem conhecidas na técnica e podem ser isoladas de fontes naturais de acordo com métodos conhecidos ou preparadas sinteticamente de acordo com métodos conhecidos (p. ex., Balasubramanian, R., et al. J. Med. Chem., 2009, 52, 238-40; Wipf, P., et al. Org. Lett., 2004, 6, 4057-60; pando, O., et al. J. Am. Chem. Soc., 2011, 133, 7692-5; Reddy, J. A., et al. Mol. Pharmaceutics, 2009, 6, 1518-25; Raghavan, B., et al. J. Med. Chem., 2008, 51, 1530-33; patterson, A. W., et al. J. Org. Chem., 2008, 73, 4362-9; pando, O., et al. Org. Lett., 2009, 11 (24), 5567-9; Wipf, P., et al. Org. Lett., 2007, 9 (8), 1605-7; Friestad, G. K., Org. Lett., 2004, 6, 3249-52; peltier, H. M., et al. J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 16018-9; Chandrasekhar, S., et al J. Org. Chem., 2009, 74, 9531-4; Liu, Y., et al. Mol. Pharmaceutics, 2012, 9, 168-75; Friestad, G. K., et al. Org. Lett., 2009, 11, 1095-8; Kubicek, K., et al., Angew Chem Int Ed Engl, 2010.49: 4809-12; Chai, Y., et al., Chem Biol, 2010, 17: 296-309; Ullrich, A., et al., Angew Chem Int Ed Engl, 2009, 48, 4422-5; Sani, M., et al. Angew Chem Int Ed Engl, 2007, 46, 3526-9; Domling, A., et al., Angew Chem Int Ed Engl, 2006, 45, 7235-9; pedidos de patente: Zanda, M., et al, Pedido de Patente Canadense CA 2710693 (2011); Chai, Y., et al. Pedido de Patente Europeia 2174947 (2010), WO 2010034724; Leamon, C. et al, WO2010033733, WO 2009002993; Ellman, J., et al, PCT WO2009134279; WO 2009012958, Pedido de Patente US 20110263650, 20110021568; Matschiner, G., et al, WO2009095447; Vlahov, I., et al, WO2009055562, WO 2008112873; Low, P., et al, WO2009026177; Richter, W., WO2008138561; Kjems, J., et al, WO 2008125116; Davis, M.; et al, WO2008076333; Diener, J.; et al, Pedido de Patente dos EUA 20070041901, WO2006096754; Matschiner, G., et al, WO2006056464; Vaghefi, F., et al, WO2006033913; Doemling, A., Ger. Offen. DE102004030227,
153 / 439 WO2004005327, WO2004005326, WO2004005269; Stanton, M., et al, Publicação de Pedido de Patente dos EUA 20040249130; Hoefle, G., et al, Ger. Offen. DE10254439, DE10241152, DE10008089; Leung, D., et al, WO2002077036; Reichenbach, H., et al, Ger. Offen. DE19638870; Wolfgang, R., US20120129779; Chen, H., Pedido de Patente US
20110027274. As estruturas preferidas de tubulisinas para a conjugação de moléculas de ligação celular são descritas no pedido de patente de PCT/IB2012/053554.
[00134] Exemplos das estruturas dos conjugados do anticorpo- análogos de tubulisina através de um bis-ligante são T01, T02, T03, T04, T05, T06 T07, T08, T09, T10, T11, T12, T13, T14, T15, T16 T017, T18, T19, T20, T21, T22 e T23 como seguem: T01, O R5
O H X3 Y1 R1 X1 N R 3 Z1 R3 R4 N O O O Q R1 N N Y2 X2 N O N R2 N R4 Z2 2 R R5 S H R12 O n R 5' O T02, T03, T04, T05
154 / 439
T06
T07
T08
T09
T10
T11,
T12,
T13,
155 / 439 T14, T15, T16, T17, T18, T19, T20, R5 O O Z1 R3 N H Z3 R1 Y1 3 R R N 4 O O X3 O X1
Q N
N N X2 O Z2 N R2 2 S N R12 R4 O R H R5' O n T21,
156 / 439
T22,
T23, em que “ “, Q, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são definidos como acima; preferivelmente, Y1 e Y2 são independentemente O, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, C(O)NHNHC(O) e C(O)NR1; mAb é anticorpo, preferivelmente, anticorpo monoclonal; R12 é OH, NH2, NHR1, NHNH2, NHNHCOOH, O-R1-COOH, NH-R1-COOH, NH- (Aa)nCOOH, O(CH2CH2O)pCH2CH2OH, O(CH2CH2O)pCH2CH2NH2, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NH2, NR1R1’, NHOH, NHOR1, O(CH2CH2O)pCH2CH2COOH, NH(CH2CH2O)pCH2CH2COOH, NH-Ar- COOH, NH-Ar-NH2, O(CH2CH2O)pCH2CH2NHSO3H, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHSO3H, R1-NHSO3H, NH-R1-NHSO3H, O(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2, OR1, R1-NHPO3H2, R1-OPO3H2, O(CH2CH2O)pCH2CH2OPO3H2, OR1-NHPO3H2, NH-R1-NHPO3H2, NH(CH2CH2NH)pCH2CH2NH2, NH(CH2CH2S)pCH2CH2NH2, NH(CH2CH2NH)pCH2CH2OH, NH(CH2CH2S)pCH2CH2OH, NH-R1-NH2 ou NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2, em que Aa é 1-8 aminoácidos; n é 1-20; p é 1-5000; R1, R1’, R2, R3, R4 e R5 são independentemente H, alquila C1-C8 linear ou ramificada, amida, ou aminas; arila C2-C8, alquenila, alquinila, heteroarila, heteroalquila, alquilcicloalquila, éster, éter, heterocicloalquila ou aciloxilaminas; ou peptídeos contendo 1-8 aminoácidos, ou unidade de polietilenoxi com a fórmula (OCH2CH2)p ou (OCH2CH(CH3))p, em que p é
157 / 439 um número inteiro de 1 a cerca de 5000; Os dois Rs: R1R2, R2R3, R1R3 ou R3R4 podem formar um anel cíclico com 3~8 membros do grupo alquila, arila, heteroarila, heteroalquila ou alquilcicloalquila; X3 é H, CH3, CH2CH3, C3H7 ou X1’R1’, em que X1’ é NH, N(CH3), NHNH, O ou S; R1’ é H ou alquila C1- C8 linear ou ramificada, arila, heteroarila, heteroalquila, alquilcicloalquila ou aciloxilaminas; R3’ é H ou alquila C1-C6 linear ou ramificada; Z3 é H, COOR1, NH2, NHR1, OR1, CONHR1,NHCOR1, OCOR1, OP(O)(OM1)(OM2), OCH2OP(O)(OM1)(OM2), OSO3M1, R1 , O-glicosídeo (glicosídeo, galactosídeo, manosídeo, glucuronosídeo/glucuronídeo, alosídeo, frutosídeo etc.), NH-glicosídeo, S-glicosídeo ou CH2-glicosídeo; M1 e M2 são independentemente H, Na, K, Ca, Mg, NH4, NR1R2R3.
[00135] Caliqueamicinas e seus antibióticos de enedina relacionados que são preferidos para conjugados molécula de ligação celular-fármaco desta patente são descritos em: Nicolaou, K. C. et al, Science 1992, 256, 1172- 1178; proc. Natl. Acad. Sci USA. 1993, 90, 5881-8), Patentes dos EUA Nos 4 970 198; 5 053 394; 5 108 912; 5 264 586; 5 384 412; 5 606 040; 5 712 374; 5 714 586; 5 739 116; 5 770 701; 5 770 710; 5 773 001; 5 877 296; 6 015 562; 6 124 310; 8 153 768. Exemplos da estrutura do conjugado do anticorpo- análogo de caliqueamicina através do ligante em ponte são C01 e C02 como os seguintes: C01.
C02
158 / 439 em que “ “, Q, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são definidos como acima; preferivelmente, X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente O, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, C(O)NHNHC(O) e C(O)NR1; Q é preferivelmente um anticorpo monoclonal.
[00136] Os maitansinoides que são preferidos para serem utilizados na presente invenção, incluindo o maitansinol e seus análogos, são descritos nas Patentes dos EUA Nos 4 256 746, 4 361 650, 4 307 016, 4 294 757, 4 294 757, 4 371 533, 4 424 219, 4 331 598, 4 450 254, 4 364 866, 4 313 946, 4 315 929, 4 362 663, 4 322 348,4 371 533,4 424 219, 5 208 020, 5 416 064, 5 208 020, 5 416 064, 6 333 410, 6 441 163, 6 716 821, 7 276 497, 7 301 019, 7 303 749, 7 368 565, 7 411 063, 7 851 432, e 8 163 888. Um exemplo da estrutura do conjugado do anticorpo-maitansinoides através do ligante da patente constitui os seguintes My01, My02, My03, My04, My05, My06, My07 e My08: My01, My02, My03,
159 / 439 My04, My05, My06, O R1 R5 Y1 R1 O R3
O O Cl O N X1 N Z1 MeO N
Q R4 O X2 R2 N Z2 N O O R5' n H3CO HO H My07, My08, em que “ “, Q, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são definidos como acima; preferivelmente, X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente O, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, C(O)NHNHC(O) e C(O)NR1; Q é preferivelmente um anticorpo monoclonal.
[00137] Os taxanos, que incluem Paclitaxel (Taxol), um produto
160 / 439 citotóxico natural, e docetaxel (Taxotere), um derivado semissintético, e seus análogos que são preferidos para a conjugação são exemplificados em: K C. Nicolaou et al., J. Am. Chem. Soc. 117, 2409-20, (1995); Ojima et al, J. Med. Chem. 39:3889-3896 (1996); 40:267-78 (1997); 45, 5620-3 (2002); Ojima et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 96:4256-61 (1999); Kim et al., Bull. Korean Chem. Soc., 20, 1389-90 (1999); Miller, et al. J. Med. Chem., 47, 4802-5(2004); patente dos EUA No 5 475 011, 5 728 849, 5 811 452, 6 340 701, 6 372 738, 6 391 913, 6 436 931, 6 589 979, 6 596 757, 6 706 708, 7 008 942, 7 186 851, 7 217 819, 7 276 499, 7 598 290 e 7 667 054.
[00138] Exemplos das estruturas do conjugado do anticorpo-taxanos através do ligante da patente são como os seguintes Tx01, Tx02 e Tx03.
Tx01 Tx02 Tx03
161 / 439 em que “ “, Q, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são definidos como acima; preferivelmente, X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente O, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, C(O)NHNHC(O) e C(O)NR1; Q é preferivelmente um anticorpo monoclonal.
[00139] Os análogos de CC-1065 e análogos de doucarmicina são também preferidos para serem usados em um conjugado contendo bis- acoplamento em ponte da presente patente. Os exemplos dos análogos de CC- 1065 e análogos de doucarmicina, bem como as suas sínteses são descritos em: p. ex., Warpehoski, et al, J. Med. Chem. 31:590-603 (1988); D. Boger et al., J. Org. Chem; 66; 6654-61, 2001; patente U. S. Nos: 4169888, 4391904, 4671958, 4816567, 4912227, 4923990, 4952394, 4975278, 4978757, 4994578, 5037993, 5070092, 5084468, 5101038, 5117006, 5137877, 5138059, 5147786, 5187186, 5223409, 5225539, 5288514, 5324483, 5332740, 5332837, 5334528, 5403484, 5427908, 5475092, 5495009, 5530101, 5545806, 5547667, 5569825, 5571698, 5573922, 5580717, 5585089, 5585499, 5587161, 5595499, 5606017, 5622929, 5625126, 5629430, 5633425, 5641780, 5660829, 5661016, 5686237, 5693762, 5703080, 5712374, 5714586, 5739116, 5739350, 5770429, 5773001, 5773435, 5786377 5786486, 5789650, 5814318, 5846545, 5874299, 5877296, 5877397, 5885793, 5939598, 5962216, 5969108, 5985908, 6060608, 6066742, 6075181, 6103236, 6114598, 6130237, 6132722, 6143901, 6150584, 6162963, 6172197, 6180370, 6194612, 6214345, 6262271, 6281354, 6310209, 6329497, 6342480, 6486326, 6512101, 6521404, 6534660, 6544731, 6548530, 6555313, 6555693, 6566336, 6,586,618, 6593081, 6630579, 6,756,397, 6759509, 6762179, 6884869, 6897034, 6946455, 7,049,316, 7087600, 7091186, 7115573, 7129261, 7214663, 7223837, 7304032, 7329507, 7,329,760, 7,388,026, 7,655,660, 7,655,661, 7,906,545, e 8,012,978. Exemplos das estruturas do conjugado do
162 / 439 anticorpo-análogos de CC-1065 através do ligante da patente são como os seguintes CC01, CC02, CC03, CC04, CC05, CC06 e CC07.
CC01, CC02, CC03, CC04, CC05, CC06,
163 / 439 CC07, em que “ “, Q, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são definidos como acima; preferivelmente, X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente O, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, C(O)NHNHC(O) e C(O)NR1; Q é preferivelmente um anticorpo monoclonal; Z3 é H, PO(OM1)(OM2), SO3M1, CH2PO(OM1)(OM2), CH3N(CH2CH2)2NC(O)-, O(CH2CH2)2NC(O)-, R1 ou glicosídeo.
[00140] Os análogos de daunorrubicina/doxorrubicina são também preferidos para a conjugação com o bis-acoplamento da presente patente. As estruturas preferidas e suas sínteses são exemplificadas em: Hurwitz, E., et al., Cancer Res. 35, 1175-81 (1975). Yang, H. M., e Reisfeld, R. A., Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 1189-93 (1988); pietersz, C. A., E., et al., E., et al.”, Cancer Res. 48, 926-311 (1988); Trouet, et al., 79, 626-29 (1982); Z. Brich et al., J. Controlled Release, 19, 245-58 (1992); Chen et al., Syn. Comm., 33, 2377-90, 2003; King et al., Bioconj. Chem., 10, 279-88, 1999; King et al., J. Med. Chem., 45, 4336-43, 2002; Kratz et al., J Med Chem. 45, 5523-33, 2002; Kratz et al., Biol Pharm Bull. Jan. 21, 56-61, 1998; Lau et al., Bioorg. Med. Chem. 3, 1305-12, 1995; Scott et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 6, 1491- 6, 1996; Watanabe et al., Tokai J. Experimental Clin. Med. 15, 327-34, 1990; Zhou et al., J. Am. Chem. Soc. 126, 15656-7, 2004; WO 01/38318; patente dos EUA Nos 5 106 951; 5 122 368; 5 146 064; 5 177 016; 5 208 323; 5 824 805; 6 146 658; 6 214 345; 7569358; 7 803 903; 8 084 586; 8 053 205. Exemplos das estruturas do conjugado do anticorpo-análogos de CC-1065 [sic] através do ligante da patent são como os seguintes Da01, Da02, Da03, Da04, Da05, Da06, Da07, Da08, Da09, Da10 e Da11.
164 / 439 Da01,
O OH O OH O R5 Y1 R 1 R3 OH X1 N Z1
O Q O OH O R4 H3CO Y2 X2 O OH R2 N Z2 N O n R5' MeO Da02, Da03, Da04, Da05,
165 / 439
Da06,
Da07,
Da08,
Da09,
Da10,
166 / 439 O OH O R5 O R3 N R1 H X1 N Z1
OH Q O X2 R4 O OH O R2 H3CO OH N Z2 O R 5' n H2N Da11, em que “ “, Q, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são definidos como acima; preferivelmente, X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente O, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, C(O)NHNHC(O) e C(O)NR1; R12 é OH, NH2, NHR1, NHNH2, NHNHCOOH, O-R1-COOH, NH-R1-COOH, NH(Aa)nCOOH, O(CH2CH2O)pCH2CH2OH, O(CH2CH2O)pCH2CH2NH2, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NH2, NR1R1’, NHOH, NHOR1, O(CH2CH2O)pCH2CH2COOH, NH(CH2CH2O)pCH2CH2COOH, NH- Ar-COOH, NH-Ar-NH2, O(CH2CH2O)pCH2CH2NH-SO3H, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NH-SO3H, R1-NHSO3H, NH-R1-NHSO3H, O(CH2CH2O)pCH2-CH2NHPO3H2, NH(CH2CH2O)pCH2-CH2NHPO3H2, OR1, R1-NHPO3H2, R1-OPO3H2, O(CH2CH2O)pCH2CH2OPO3H2, OR1-NHPO3H2, NH-R1-NHPO3H2, NH(CH2CH2NH)pCH2-CH2NH2, NH(CH2CH2S)pCH2CH2NH2, NH(CH2CH2NH)pCH2CH2OH, NH(CH2CH2S)pCH2-CH2OH, NH-R1-NH2 ou NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2, em que Aa é 1-8 aminoácidos; p é 1-5000; Q é anticorpo, preferivelmente, um anticorpo monoclonal.
[00141] Auristatinas e dolastatinas são preferidas na conjugação contendo os bis-ligantes desta patente. As auristatinas (p. ex., auristatina E (AE) auristatina EB (AEB), auristatina EFP (AEFP), monometil auristatina E (MMAE), monometilauristatina (MMAF), Auristatina F fenilenodiamina (AFP) e uma variante com fenilalanina de MMAE), que são análogos sintéticos de dolastatinas, são descritas em Int. J. Oncol. 15: 367-72 (1999); Molecular Cancer Therapeutics, vol. 3, No. 8, pp. 921-32 (2004); Pedidos dos EUA Nos. 11134826, 20060074008, 2006022925. Patentes dos EUA Nos
167 / 439 4414205, 4753894, 4764368, 4816444, 4879278, 4943628, 4978744, 5122368, 5165923, 5169774, 5286637, 5410024, 5521284, 5530097, 5554725, 5585089, 5599902, 5629197, 5635483, 5654399, 5663149, 5665860, 5708146, 5714586, 5741892, 5767236, 5767237, 5780588, 5821337, 5840699, 5965537, 6004934, 6033876, 6034065, 6048720, 6054297, 6054561, 6124431, 6143721, 6162930, 6214345, 6239104, 6323315, 6342219, 6342221, 6407213, 6569834, 6620911, 6639055, 6884869, 6913748, 7090843, 7091186, 7097840, 7098305, 7098308, 7498298, 7375078, 7462352, 7553816, 7659241, 7662387, 7745394, 7754681, 7829531, 7837980, 7837995, 7902338, 7964566, 7964567, 7851437, 7994135. Exemplos das estruturas do conjugado do anticorpo- auristatinas através do ligante da patente são como os seguintes Au01, Au02, Au03, Au04, Au05, Au06, Au07, Au08, Au09, Au10, Au11, Au12, Au13, Au14, Au15, Au16, Au17, Au18, Au19, Au20, Au21, Au22, Au23, Au24, Au25, Au26, e Au27: Au01, Au02, Au03, R3 R5 O 3 4 R1 1 R R
N OR H O H Z1 X1 N N N Q R4 N N N X2 O O O O O O Z'3 R2 R2 R12 Z2 N O n R5 ' Au04,
168 / 439
Au05，
Au06,
Au07，
Au08,
Au09,
Au10,
Au11,
Au12,
Au13,
169 / 439
Au14,
Au15,
Au16,
Au17,
Au18,
Au19,
Au20,
Au21,
170 / 439 R3 R5 O 3 4 R1 1 R R
N OR H O H Z1 X1 N N N Q R4 N N N H O O O O O Z'3 X2 O R12 Z2 N R R2 O 2 n R5 ' Au22, Au23, Au24, Au25, Au26, Au27, em que “ “, Q, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são definidos como acima; preferivelmente, X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente O, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, C(O)NHNHC(O) e C(O)NR1; R12 é OH, NH2, NHR1, NHNH2, NHNHCOOH, O-R1-COOH, NH-R1-COOH, NH-(Aa)nCOOH, O(CH2CH2O)pCH2CH2OH, O(CH2CH2O)pCH2CH2NH2, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NH2, NR1R1’, NHOH, NHOR1, O(CH2CH2O)pCH2CH2COOH, NH(CH2CH2O)pCH2CH2COOH, NH- Ar-COOH, NH-Ar-NH2, O(CH2CH2O)pCH2CH2NH-SO3H,
171 / 439 NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHSO3H, R1-NHSO3H, NH-R1-NHSO3H, O(CH2CH2O)pCH2-CH2NHPO3H2, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2, OR1, R1-NHPO3H2, R1-OPO3H2, O(CH2CH2O)pCH2CH2OPO3H2, OR1-NHPO3H2, NH-R1-NHPO3H2, NH(CH2CH2NH)pCH2-CH2NH2, NH(CH2CH2S)pCH2CH2NH2, NH(CH2CH2NH)pCH2CH2OH, NH(CH2CH2S)pCH2-CH2OH, NH-R1-NH2 ou NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2, em que Aa é 1-8 aminoácidos; p é 1-5000; Q é preferivelmente um anticorpo monoclonal; R1, R2, R3, R4 e R5 são independentemente H; alquila C1-C8 linear ou ramificada, arila, heteroarila, heteroalquila, alquilcicloalquila, éster, éter, amida, aminas, heterocicloalquila ou aciloxilaminas; ou peptídeos contendo 1-8 aminoácidos, ou unidade de polietilenoxi com a fórmula (OCH2CH2)p ou (OCH2CH(CH3))p, em que p é um número inteiro de 1 a cerca de 5000. Os dois Rs: R1R2, R2R3, R1R3 ou R3R4 podem formar um anel cíclico com 3~8 membros do grupo alquila, arila, heteroarila, heteroalquila ou alquilcicloalquila; X3 é H, CH3 ou X1’R1’, em que X1’ é NH, N(CH3), NHNH, O ou S, e R1’ é H ou alquila C1-C8 linear ou ramificada, arila, heteroarila, heteroalquila, alquilcicloalquila, aciloxilaminas; R3’ é H ou alquila C1-C6 linear ou ramificada; Z3’ é H, COOR1, NH2, NHR1, OR1, CONHR1,NHCOR1, OCOR1, OP(O)(OM1)(OM2), OCH2OP(O)(OM1)(OM2), OSO3M1, R1 ou O-glicosídeo (glicosídeo, galactosídeo, manosídeo, glucuronosídeo/glucuronídeo, alosídeo, frutosídeo etc.), NH-glicosídeo, S-glicosídeo ou CH2-glicosídeo; M1 e M2 são independentemente H, Na, K, Ca, Mg, NH4, NR1R2R3.
[00142] Os dímeros de benzodiazepina (p. ex., dímeros de pirrolobenzodiazepina (PBD) ou (tomaimicina), indolinobenzodiazepinas, imidazobenzotiadiazepinas ou oxazolidinobenzo-diazepinas), que são agentes citotóxicos preferidos de acordo com a presente invenção são exemplificados na técnica: Patente US Nos 8 163 736; 8 153 627; 8 034 808; 7 834 005; 7 741 319; 7 704 924; 7 691 848; 7 678 787; 7 612 062; 7 608 615; 7 557 099; 7
172 / 439 528 128; 7 528 126; 7 511 032; 7 429 658; 7 407 951; 7 326 700; 7 312 210; 7 265 105; 7 202 239; 7 189 710; 7 173 026; 7 109 193; 7 067 511; 7 064 120; 7 056 913; 7 049 311; 7 022 699; 7 015 215; 6 979 684; 6 951 853; 6 884 799; 6 800 622; 6 747 144; 6 660 856; 6 608 192; 6 562 806; 6 977 254; 6 951 853; 6 909 006; 6 344 451; 5 880 122; 4 935 362; 4 764 616; 4 761 412; 4 723 007; 4 723 003; 4 683 230; 4 663 453; 4 508 647; 4 464 467; 4 427 587; 4 000 304; pedido de Patente US 20100203007, 20100316656,
20030195196. Exemplos das estruturas do conjugado do anticorpo-dímeros de benzodiazepina através do ligante em ponte são como os seguintes PB01, PB02, PB03, PB04, PB05, PB06, PB07, PB08, PB09, PB10, PB11, PB12, PB13, PB14, PB15, PB16, PB17, PB18, PB19, PB20, PB21, PB22, PB23, PB24, PB25, PB26, PB27, PB28, PB29, PB30, PB31 e PB32.
PB01, PB02, PB03, PB04,
173 / 439
PB05,
PB06,
PB07,
PB08,
PB09,
PB10, O R5 Y1 R3 X1 Z1 R1 N H N N H Y2 O O R4 Q R2 X2 R12 N N OMe MeO N Z2 n R12' O O O R5' PB11,
PB12,
174 / 439
PB13,
PB14,
PB15,
PB16,
PB17,
PB18,
PB19,
175 / 439
PB20,
PB21,
PB22,
PB23,
PB24,
PB25,
PB26,
176 / 439
PB27,
PB28,
PB29,
PB30,
PB31,
PB32, em que “ “, Q, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são definidos como acima; preferivelmente, X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente O, N, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, C(O)NHNHC(O) e C(O)NR1; R1, R2, R3, R1’, R2’ e R3’ são independentemente
177 / 439 H; F; Cl; =O; =S; OH; SH; alquila C1-C8 linear ou ramificada, arila, alquenila, heteroarila, heteroalquila, alquilcicloalquila, éster (COOR5 ou -OC(O)R5), éter (OR5), amida (CONR5), carbamato (OCONR5), aminas (NHR5, NR5R5’), heterocicloalquila ou aciloxilaminas (-C(O)NHOH, -ONHC(O)R5); ou peptídeos contendo 1-20 aminoácidos naturais ou não naturais, ou unidade de polietilenoxi de fórmula (OCH2CH2)p ou (OCH2CH(CH3))p, em que p é um número inteiro de 1 a cerca de 5000. Os dois Rs: R1R2, R2R3, R1R3, R1’R2’, R2’R3’ ou R1’R3’ podem formar independentemente um anel com 3~8 membros do grupo alquila, arila, heteroarila, heteroalquila ou alquilcicloalquila; X3 e Y3 são independentemente N, NH, CH2 ou CR5, em que R5, R6, R12 e R12’ são independentemente H, OH, NH2, NH(CH3), NHNH2, COOH, SH, OZ3, SZ3, F, Cl ou alquila C1-C8 linear ou ramificada, arila, heteroarila, heteroalquila, alquilcicloalquila, aciloxilaminas; Z3 é H, OP(O)(OM1)(OM2), OCH2OP(O)(OM1)(OM2), OSO3M1 ou O-glicosídeo (glicosídeo, galactosídeo, manosídeo, glucuronosídeo/glucuronídeo, alosídeo, frutosídeo etc.), NH-glicosídeo, S-glicosídeo ou CH2-glicosídeo; M1 e M2 são independentemente H, Na, K, Ca, Mg, NH4, NR1R2R3.
[00143] Amatoxinas que são um subgrupo de pelo menos dez compostos tóxicos originalmente encontrados em vários gêneros de cogumelos venenosos, mais notavelmente Amanita phalloides e diversas outras espécies de cogumelos, são também preferidas para a conjugação da presente patente. Essas dez amatoxinas, denominadas α-Amanitina, β- Amanitina, γ-Amanitina, ε-Amanitina, Amanulina, Ácido Amanulínico, Amaninamida, Amanina, Proamanulina, são peptídeos bicíclicos rígidos que são sintetizados como proproteínas de 35-aminoácidos, das quais, os oito aminoácidos finais são clivados por uma prolil oligopeptidase (Litten, W. 1975 Scientific American232 (3): 90-101;H. E. Hallen, et al 2007 Proc. Nat. Aca. Sci. USA 104, 19097-101; K. Baumann, et al, 1993 Biochemistry 32 (15): 4043-50; Karlson-Stiber C, Persson H. 2003, Toxicon 42 (4): 339-49;
178 / 439
Horgen, P.
A. et al. 1978 Arch.
Microbio. 118 (3): 317-9). As amatoxinas matam células inibindo a RNA polimerase II (Pol II), interrompendo a transcrição de genes e a biossíntese de proteínas (Brodner, O.
G. e Wieland, T. 1976 Biochemistry,15(16): 3480-4; Fiume, L., Curr Probl Clin Biochem, 1977, 7: 23-8; Karlson-Stiber C, Persson H. 2003, Toxicon 42(4): 339-49; Chafin, D.
R., Guo, H. & Price, D.
H. 1995 J.
Biol.
Chem. 270 (32): 19114- 19; Wieland (1983) Int.
J.
Pept.
Protein Res. 22(3): 257-76.). Amatoxinas podem ser produzidas a partir de cogumelos Amanita phalloides coletados (Yocum, R.
R. 1978 Biochemistry 17(18): 3786-9; Zhang, P. et al, 2005, FEMS Microbiol.
Lett.252(2), 223-8), ou a partir de fermentação utilizando um basidiomiceto (Muraoka, S. e Shinozawa T., 2000 J.
Biosci.
Bioeng. 89(1): 73-6) ou a partir de fermentação usando A. fissa (Guo, X.
W., et al, 2006 Wei Sheng Wu Xue Bao 46(3): 373-8), ou a partir de cultivo de Galerina fasciculata ou Galerina helvoliceps, uma cepa pertencente ao gênero (WO/1990/009799, JP11137291). No entanto, os rendimentos deste isolamento e fermentação foram bastante baixos (menos de 5 mg/L de cultura). Várias preparações de amatoxinas e seus análogos foram relatadas nas últimas três décadas (W.
E.
Savige, A.
Fontana, Chem.
Commun. 1976, 600-1; Zanotti, G., et al, Int J Pept Protein Res, 1981. 18(2): 162-8; Wieland, T., et al, Eur.
J.
Biochem. 1981, 117, 161-4; p.
A.
Bartlett, et al, Tetrahedron Lett. 1982, 23, 619-22; Zanotti, G., et al., Biochim Biophys Acta, 1986. 870(3): 454-62; Zanotti, G., et al., Int.
J.
Peptide Protein Res. 1987, 30, 323- 9; Zanotti, G., et al., Int.
J.
Peptide Protein Res. 1987, 30, 450-9; Zanotti, G., et al., Int J Pept Protein Res, 1988. 32(1): 9-20; G.
Zanotti, T. et al, Int.
J.
Peptide Protein Res. 1989, 34, 222-8; Zanotti, G., et al., Int J Pept Protein Res, 1990. 35(3): 263-70; Mullersman, J.
E. e J.
F.
Preston, 3rd, Int J Pept Protein Res, 1991. 37(6): 544-51; Mullersman, J.E., et al, Int J Pept Protein Res, 1991. 38(5): 409-16; Zanotti, G., et al, Int J Pept Protein Res, 1992. 40(6): 551-8; Schmitt, W. et al, J.
Am.
Chem.
Soc. 1996, 118, 4380-7;
179 / 439 Anderson, M.O., et al, J. Org. Chem., 2005, 70(12): 4578-84; J. P. May, et al, J. Org. Chem. 2005, 70, 8424-30; F. Brueckner, P. Cramer, Nat. Struct. Mol. Biol. 2008, 15, 811-8; J. P. May, D. M. Perrin, Chem. Eur. J. 2008, 14, 3404- 9; J. P. May, et al, Chem. Eur. J. 2008, 14, 3410-17; Q. Wang, et al, Eur. J. Org. Chem. 2002, 834-9; May, J. P. e D. M. Perrin, Biopolimers, 2007. 88(5): 714-24; May, J. P., et al., Chemistry, 2008. 14(11): 3410-7; S. De Lamo Marin, et al, Eur. J. Org. Chem. 2010, 3985-9; pousse, G., et al., Org Lett,
2010. 12(16): 3582-5; Luo, H., et al., Chem Biol, 2014. 21(12): 1610-7; Zhao, L., et al., Chembiochem, 2015. 16(10): 1420-5) e a maioria dessas preparações foi realizada por síntese parcial. Devido à sua extrema potência e mecanismo único de citotoxicidade, as amatoxinas têm sido utilizadas como cargas para conjugações (Fiume, L., Lancet, 1969. 2 (7625): 853-4; Barbanti- Brodano, G. e L. Fiume, Nat New Biol, 1973. 243(130): 281-3; Bonetti, E., M. et al, Arch Toxicol, 1976. 35(1): p. 69-73; Davis, M. T., Preston, J. F. Science 1981, 213, 1385-1388; preston, J.F., et al, Arch Biochem Biophys,
1981. 209(1): 63-71; H. Faulstich, et al, Biochemistry 1981, 20, 6498-504; Barak, L.S., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1981. 78(5): 3034-8; Faulstich, H. e L. Fiume, Methods Enzymol, 1985. 112: 225-37; Zhelev, Z., A. et al, Toxicon, 1987. 25(9): 981-7; Khalacheva, K., et al, Eksp Med Morfol, 1990. 29(3): 26-30; U. Bermbach, H. Faulstich, Biochemistry 1990, 29, 6839-45; Mullersman, J. E. e J. F. Preston, Int. J. Peptide Protein Res. 1991, 37, 544- 51; Mullersman, J.E. e J.F. Preston, Biochem Cell Biol, 1991. 69(7): 418-27; J. Anderl, H. Echner, H. Faulstich, Beilstein J. Org. Chem. 2012, 8, 2072-84; Moldenhauer, G., et al, J. Natl. Cancer Inst. 2012, 104, 622-34; A. Moshnikova, et al; Biochemistry 2013, 52, 1171-8; Zhao, L., et al., Chembiochem, 2015. 16(10): 1420-5; Zhou, B., et al., Biosens Bioelectron,
2015. 68: 189-96; WO2014/043403, US20150218220, EP 1661584). Estamos trabalhando na conjugação de amatoxinas há um tempo. Exemplos das estruturas do conjugado de anticorpo-amatoxina através do ligante de ponte
180 / 439 são preferidos como as seguintes estruturas de Am01, Am02, Am03, Am04, Am05, Am06, Am07, Am08 e Am09:
Am01,
Am02,
Am03
Am04,
Am05,
181 / 439
Am06,
Am07,
Am08,
Am09, em que “ “, X1, X2, Q, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são definidos como acima; preferivelmente, X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente O, N, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, C(O)NH-NHC(O), C(O)NR1 ou ausente; R7, R8 e R9 são independentemente H, OH, OR1, NH2, NHR1, alquila C1-C6 ou ausente; Y2 é O, O2, NR1, NH ou ausente; R10 é CH2, O, NH, NR1, NHC(O), NHC(O)NH, NHC(O)O, OC(O)O,
182 / 439 C(O), OC(O), OC(O)(NR1), (NR1)C(O)(NR1), C(O)R1 ou ausente; R11 é OH, NH2, NHR1, NHNH2, NHNHCOOH, O-R1-COOH, NH-R1-COOH, NH- (Aa)nCOOH, O(CH2CH2O)pCH2CH2OH, O(CH2CH2O)pCH2CH2NH2, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NH2, NR1R1’, O(CH2CH2O)pCH2CH2COOH, NH(CH2CH2O)pCH2-CH2COOH, NH-Ar-COOH, NH-Ar-NH2, O(CH2CH2O)pCH2CH2NHSO3H, NH(CH2CH2-O)pCH2CH2NHSO3H, R1 - NHSO3H, NH-R1-NHSO3H, O(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2, OR1, R1-NHPO3H2, R1-OPO3H2, O(CH2CH2O)pCH2C-H2OPO3H2, OR1-NHPO3H2, NH-R1-NHPO3H2 ou NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2, em que Aa é 1-20 aminoácidos; n e m1 são independentemente 1-30; p é 1-5000; Z3 é H, OH, COOR1, NH2, NHR1, OR1, CONHR1,NHCOR1, OCOR1, OP(O)(OM1)(OM2), OCH2OP(O)(OM1)(OM2), OSO3M1, R1 ou O-glicosídeo (glicosídeo, galactosídeo, manosídeo, glucuronosídeo/glucuronídeo, alosídeo, frutosídeo etc.), NH-glicosídeo, S-glicosídeo ou CH2-glicosídeo; M1 e M2 são independentemente H, Na, K, Ca, Mg, NH4, NR1R2R3.
[00144] Camptotecina (CPT) e seu derivado SN-38, Topotecano, Irinotecano (CPT-11), Silatecano (DB-67, AR-67), Cositecano (BNP-1350), Etirinotecano, Exatecano, Lurtotecano, Gimatecano (ST1481), Belotecano (CKD-602) e Rubitecano são inibidores da topoisomerase que impedem a religação do DNA e, portanto, causam danos ao DNA que resulta em apoptose. Até o momento, dois análogos de CPT, topotecano e irinotecano, foram aprovados e são usados na quimioterapia contra o câncer (Palakurthi, S., Expert Opin Drug Deliv. 2015;12(12):1911-21) e alguns deles, como SN-38 e Exatecano foram usados com êxito como cargas para conjugados ADC conjugados nos ensaios clínicos (Ocean, A. J. et al, Cancer. 2017, 123(19): 3843-3854; Starodub, A. N., et al, Clin Cancer Res. 2015, 21(17): 3870-8; Cardillo, T. M., et al, Bioconjug Chem. 2015, 26(5): 919-31; Ogitani, Y. et al, Bioorg Med Chem Lett. 2016, 26(20): 5069-5072; Takegawa, N. et al,Int J
183 / 439 Cancer. 2017 Oct 15;141(8):1682-1689. Patentes US 7 591 994; 7 999 083 8 080 250 8 268 317; pedidos de Patente US 20130090458, 20140099258, 20150297748, 20160279259). Exemplos das estruturas do conjugado do anticorpo-análogos de camptotecina através do ligante em ponte são preferidos como as seguintes estruturas of CP01, CP02, CP03, CP04, CP05 e CP06: CP01, O R5 O R3
N O R1 N Z1 O X1
O R4 Q O Y1 N X2 N Z3 R2 Z2 n
O R5' CP02, CP03, CP04,
184 / 439 O R5 O R3
N O O R1 N Z1 X1
O Y1 R4 Q N O X2 Z3 R2 N O Z2 n R5' CP05, CP06, em que “ “, Q, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são definidos como acima; preferivelmente, X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente O, N, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, CH2, C(O)NHNHC(O), C(O)NR1 ou ausente; Z3 é H, OH, COOR1, NH2, NHR1, OR1, CH3, CONHR1,NHCOR1, OCOR1, OP(O)(OM1)(OM2), OCH2OP(O)(OM1)(OM2), OSO3M1, R1 ou O-glicosídeo (glicosídeo, galactosídeo, manosídeo, glucuronosídeo/glucuronídeo, alosídeo, frutosídeo etc.), NH-glicosídeo, S-glicosídeo ou CH2-glicosídeo; M1 e M2 são independentemente H, Na, K, Ca, Mg, NH4, NR1R2R3.
[00145] Eribulina, que é ligada predominantemente a um número pequeno de sítios de alta afinidade nas extremidades excedentes de microtúbulos existentes, possui tanto mecanismos de ação citotóxicos como não citotóxicos. Seus efeitos citotóxicos estão relacionados a suas atividades antimitóticas, em que a apoptose de células cancerosas é induzida após o bloqueio mitótico prolongado e irreversível (Kuznetsov, G. et al, Cancer Research. 2004, 64 (16): 5760-6.; Towle, M. J, et al, Cancer Research. 2010, 71 (2): 496-505). Além de seus mecanismos citotóxicos antimitóticos, estudos pré-clínicos em modelos de câncer de mama humano mostraram que a eribulina também exerce efeitos complexos sobre a biologia de células
185 / 439 cancerosas sobreviventes e tumores residuais que parecem não relacionados a seus efeitos antimitóticos. A eribulina foi aprovada pela US FDA para o tratamento de câncer de mama metastático de pacientes que já receberam pelo menos dois esquemas quimioterápicos para doença em estágio final, incluindo quimioterapias à base de antraciclina e taxanos, bem como para o tratamento de lipossarcoma (um tipo específico de sarcoma de tecidos moles) que não pode ser removido por cirurgia (irressecável) ou está avançado (metastático). A eribulina tem sido utilizada como carga para conjugados ADC (US20170252458). Exemplos das estruturas do conjugado do anticorpo- eribulinas através do ligante em ponte são preferidos como as seguintes estruturas of Eb01 e Eb02.
Eb01, Eb02, em que “ “, Q, X1, X2, Y1, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são definidos como acima; preferivelmente, X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente O, N, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, CH2, C(O)NHNHC(O), C(O)NR1 ou ausente.
[00146] Inibidores de nicotinamida fosforibosiltransferase (NAMPT)
186 / 439 são cargas interessantes de ADC devido aos seus mecanismos únicos de atividade altamente potente (Sampath D, et al, Pharmacol Ther 2015; 151, 16- 31). NAMPT regula os níveis do dinucleotídeo nicotinamida-adenina (NAD) nas células, em que NAD desempenha uma função essencial como cofator de redox em apoio ao metabolismo energético e anabólico.
NAD possui diversas papéis no metabolismo.
Atua como coenzima em reações redox, como doador de porções ADP-ribose em reações de ADP-ribosilação, como precursor da segunda molécula mensageira de ADP-ribose cíclico, bem como atua como substrato para DNA ligases bacterianas e um grupo de enzimas denominadas sirtuínas que fazem uso de NAD+ para remover grupos acetila de proteínas.
Além dessas funções metabólicas, NAD+ surge como um nucleotídeo com adenina que pode ser liberado das células espontaneamente e por mecanismos regulados (Smyth L.
M, et al, J.
Biol.
Chem. 2004, 279 (47), 48893-903; Billington R.
A, et al, Mol Med. 2006, 12, 324-7) e pode, portanto, ter papéis extracelulares importantes (Billington R.
A, et al, Mol Med. 2006, 12, 324-). Quando inibidores de NAMPT estão presentes, os níveis de NAD declinam para abaixo do nível necessário para o metabolismo, resultando em crise energética e, portanto, morte celular.
Até o momento, os inibidores clínicos de NAMPT candidatos FK-866, CHS-828 e GMX-1777 evoluíram para ensaios clínicos, mas foram verificadas em cada um toxicidades limitantes da dose antes de quaisquer respostas objetivas (Holen K., et al, Invest New Drugs 2008, 26, 45-51; Hovstadius, P., et al, Clin Cancer Res 2002, 8, 2843-50; pishvaian, M.
J., et al, J Clin Oncol 2009, 27, 3581). Assim, o uso de ADCs para direcionar a entrega de inibidores de NAMPT poderia evitar as toxicidades sistêmicas para alcançar um índice terapêutico muito mais amplo.
Exemplos das estruturas do conjugado do anticorpo-inibidores de NAMPT através do ligante em ponte são preferidos como as seguintes estruturas de NP01, NP02, NP03, NP04, NP05, NP06, NP07, NP08 e NP09:
187 / 439 R5 H R3 O N N
O Z1 N X1 R1 X5
N HN CN
Q H R4 N N X2 O
N Z2 O R2 N HN CN X5 n R 5' NP01, NP02, NP03, NP04, NP05, NP06, NP07,
188 / 439 NP08， NP09, em que “ “, Q, X1, X2, Y1, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são definidos como acima; X5 é F, Cl, Br, I, OH, OR1, R1, OPO3H2, OSO3H, NHR1, OCOR1, NHCOR1; preferivelmente, X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente O, N, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, CH2, C(O)NHNHC(O), C(O)NR1 ou ausente.
[00147] Em ainda outra modalidade, uma imunotoxina pode ser conjugada a uma molécula de ligação celular através de um bis-ligante da patente. Uma imunotoxina aqui é um fármaco macromolecular que geralmente é uma proteína citotóxica derivada de uma proteína bacteriana ou vegetal, como a toxina diftérica (DT), a toxina colérica (CT), a tricosantina (TCS), a diantina, a exotoxina A de Pseudomonas (ETA′), toxinas eritrogênicas, toxina diftérica difteria, toxinas AB, exotoxinas do tipo III, etc. Ela também pode ser uma protoxina bacteriana altamente tóxica formadora de poros que requer processamento proteolítico para ativação. Um exemplo dessa protoxina é a proaerolisina e sua forma geneticamente modificada, a topsalisina. A topsalisina é uma proteína recombinante modificada que foi manipulada para ser ativada seletivamente por uma enzima na próstata, levando à morte celular localizada e à ruptura do tecido sem danificar os tecidos e nervos vizinhos.
[00148] Em ainda outra modalidade, ligandos de ligação celular ou
189 / 439 agonistas de receptores celulares podem ser conjugados a uma molécula de ligação celular através de um bis-ligante desta patente. Esses ligandos de ligação celular conjugados ou agonistas de receptores celulares, em particular conjugados anticorpo-receptor, podem funcionar não apenas como um condutor/diretor de direcionamento para entregar o conjugado a células malignas, mas também podem ser usados para modular ou coestimular uma resposta imune desejada ou alteração das vias de sinalização.
[00149] Na imunoterapia, os ligandos de ligação celular ou agonistas de receptores são preferidos para se conjugarem a um anticorpo de células T de TCR (receptores de células T) ou de células T de CARs (receptores de antígenos quiméricos) ou de receptor de células B (BCR), células natural killers (exterminadoras) naturais as células citotóxicas. Tal anticorpo é preferivelmente anti-CD3, CD4, CD8, CD16 (FcγRIII), CD27, CD40, CD40L, CD45RA, CD45RO, CD56, CD57, CD57bright, TNFβ, ligando Fas, moléculas do MHC classe I (HLA-A, B, C) ou NKR-P1. Os ligandos de ligação celular ou agonistas do receptor são selecionados, entre outros, dentre: Derivados de folato (ligação ao receptor de folato, uma proteína superexpressa no câncer de ovário e em outras neoplasias) (Low, P. S. et al 2008, Acc. Chem. Res. 41, 120-9); Derivados da ureia do ácido glutâmico (ligação ao antígeno de membrana específico da próstata, um marcador de superfície das células cancerosas da próstata (Hillier, S. M.et al, 2009, Cancer Res. 69, 6932-40); Somatostatina (também conhecida como hormônio inibidor do hormônio do crescimento (GHIH) ou fator inibidor da liberação de somatotropina (SRIF)) ou hormônio inibidor da liberação de somatotropina) e seus análogos, como octreotida (Sandostatina) e lanreotida (Somatulina) (particularmente para tumores neuroendócrinos, adenoma hipofisário produtor de GH, paraganglioma, adenoma hipofisário não funcional, feocromocitomas) (Ginj, M., et al, 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 103, 16436-41). Em geral, a somatostatina e seus subtipos de receptores
190 / 439
(sst1, sst2, sst3, sst4, e sst5) foram encontrados em muitos tipos de tumores, como tumores neuroendócrinos, em particular nos adenomas hipofisários secretores de GH (Reubi J.
C., Landolt, A.
M. 1984 J.
Clin.
Endocrinol Metab 59: 1148-51; Reubi J.
C., Landolt A.
M. 1987 J Clin Endocrinol Metab 65: 65-3; Moyse E, et al, J Clin Endocrinol Metab 61: 98-103) e tumores gastroenteropancreáticos (Reubi J.
C., et al, 1987 J Clin Endocrinol Metab 65: 1127-34; Reubi, J.
C, et al, 1990 Cancer Res 50: 5969-77), feocromocitomas (Epel-baum J, et al 1995 J Clin Endocrinol Metab 80:1837-44; Reubi J.
C., et al, 1992 J Clin Endocrinol Metab 74: 1082–9), neuroblastomas (Prevost G, 1996 Neuroendocrinology 63:188-197; Moertel, C.
L, et al 1994 Am J Clin Path 102:752-756), cânceres medulares da tireoide (Reubi, J.
C, et al 1991 Lab Invest 64:567-573) cânceres de pulmão de pequenas células (Sagman U, et al, 1990 Cancer 66:2129-2133), tumores não neuroendócrinos incluindo tumores cerebrais como meningiomas, meduloblastomas ou gliomas (Reubi J.
C., et al 1986 J Clin Endocrinol Metab 63: 433-8; Reubi J.
C., et al 1987 Cancer Res 47: 5758-64; Fruhwald, M.
C, et al 1999 Pediatr Res 45: 697- 708), carcinomas de mama (Reubi J.
C., et al 1990 Int J Cancer 46: 416-20; Srkalovic G, et al 1990 J Clin Endocrinol Metab 70: 661-669), linfomas (Reubi J.
C., et al 1992, Int J Cancer50: 895-900), cânceres de células renais (Reubi J.
C., et al 1992, Cancer Res 52: 6074-6078), tumores mesenquimais (Reubi J.
C., et al 1996 Cancer Res 56: 1922-31), carcinoma de próstata (Reubi J.
C., et al 1995, J.
Clin.
Endocrinol Metab 80: 2806-14; et al 1989, Próstata 14:191–208; Halmos G, et al J.
Clin.
Endocrinol Metab 85: 2564– 71), ovário (Halmos, G, et al, 2000 J Clin Endocrinol Metab 85: 3509-12; Reubi J.
C., et al 1991 Am J Pathol 138:1267-72), gástrico (Reubi J.
C., et al 1999, Int J Cancer 81: 376-86; Miller, G.
V, 1992 Br J Cancer 66: 391-95), hepatocelular (Kouroumalis E, et al 1998 Gut 42: 442-7; Reubi J.
C., et al 1999 Gut 45: 66-774) e nasofaríngeo (Loh K.
S, et al, 2002 Virchows Arch 441: 444-8); certos sulfonamidas aromáticos, específicas da anidrase
191 / 439 carbônica IX (um marcador de hipóxia e de carcinoma de células renais) (Neri, D., et al, Nat.
Rev.
Drug Discov. 2011, 10, 767-7); peptídeos ativadores de adenilato ciclase hipofisária (PACAP) (PAC1) para feocromocitomas e paragangliomas; peptídeos intestinais vasoativos (VIP) e seus subtipos de receptores (VPAC1, VPAC2) para cânceres de pulmão, estômago, cólon, reto, mama, próstata, dutos pancreáticos, fígado, bexiga e tumores epiteliais; receptores do hormônio estimulador de α-melanócitos (α-MSH) para vários tumores; Colecistocinina (CCK)/receptores de gastrina e seus subtipos de receptores (CCK1 (anteriormente CCK-A) e CCK2 para cânceres de pulmão de pequenas células, carcinomas medulares da tireoide, astrocitomas, insulinomas e câncer de ovário; Bombesina (Pir-Gln-Arg-Leu-Gli-Asn-Gln- Trp-Ala-Val-Gli-His-Leu-Met-NH2)/peptídeo liberador de gastrina (GRP) e seus subtipos de receptores (BB1, subtipo de receptor de GRP (BB2), BB3 e BB4) para carcinomas de células renais, mama, pulmão, gástricos e de próstata e neuroblastoma (Ohlsson, B., et al, 1999, Scand.
J.
Gastroenterology 34 (12): 1224–9; Weber, H.
C., 2009, Cur.
Opin.
Endocri.
Diab.
Obesity 16(1): 66-71, Gonzalez N, et al, 2008, Cur.
Opin.
Endocri.
Diab.
Obesity 15(1), 58-64); receptores de neurotensina e seus subtipos de receptores (NTR1, NTR2, NTR3) para câncer de pulmão de pequenas células, neuroblastoma, câncer de pâncreas, câncer de cólon e sarcoma de Ewing; receptores da substância P e seus subtipos de receptores (como o receptor NK1 para tumores gliais, Hennig I.
M., et al 1995 Int.
J.
Cancer 61, 786-792); receptores de neuropeptídeo Y (NPY) e seus subtipos de receptor (Y1-Y6) para carcinomas de mama; peptídeos de endereçamento incluem RGD (Arg- Gli-Asp), NGR (Asn-Gli-Arg), os peptídeos RGD cíclicos diméricos e multiméricos (por exemplo, cRGDfV) que reconhecem receptores (integrinas) nas superfícies do tumor (Laakkonen P, Vuorinen K. 2010, Integr Biol (Camb). 2(7-8): 326-337; Chen K, Chen X. 2011, Theranostics. 1:189-200; Garanger E, et al, Anti-Cancer Agents Med Chem. 7 (5): 552-558; Kerr, J.
S.
192 / 439 et al, Anticancer Research, 19(2A), 959-968; Thumshirn, G, et al, 2003 Chem.
Eur.
J. 9, 2717- 2725) e TAASGVRSMH ou LTLRWVGLMS (receptor do proteoglicano sulfato de condroitina NG2) e peptídeos F3 (peptídeo de 31 aminoácidos que se liga ao receptor de nucleolina expressa na superfície celular) (Zitzmann, S., 2002 Cancer Res., 62, 18, pp. 5139-5143, Temminga, K., 2005, Drug Resistance Updates, 8, 381-402; p.
Laakkonen e K.
Vuorinen, 2010 Integrative Biol, 2(7-8), 326-337; M.
A.
Burg, 1999 Cancer Res., 59(12), 2869-2874; K.
Porkka, et al 2002, Proc.
Nat.
Acad.
Sci.
USA 99(11), 7444-9); peptídeos de penetração celular (CPPs) (Nakase I, et al, 2012, J.
Control Release. 159(2),181-188); os hormônios peptídicos, como agonistas e antagonistas do hormônio liberador de hormônio luteinizante (LHRH) e agonista do hormônio liberador de gonadotropina (GnRH), atuam visando o hormônio folículo estimulante (FSH) e o hormônio luteinizante (LH), bem como a produção de testosterona, p. ex., buserelina (Pir-His-Trp-Ser-Tir-D- Ser(OtBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt), Gonadorelina (Pir-His-Trp-Ser-Tir-Gli-Leu- Arg-Pro-Gli-NH2), Goserelina (Pir-His-Trp-Ser-Tir-D-Ser(OtBu)-Leu-Arg- Pro-AzGli-NH2), Histrelina (Pir-His-Trp-Ser-Tir-D-His(N-benzil)-Leu-Arg- Pro-NHEt), leuprolida (Pir-His-Trp-Ser-Tir-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt), Nafarelina (Pir-His-Trp-Ser-Tir-2Nal-Leu-Arg-Pro-Gli-NH2), Triptorelina (Pir-His-Trp-Ser-Tir-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gli-NH2), Nafarelina, Deslorelina, Abarelix (Ac-D-2Nal-D-4-cloroPhe-D-3-(3-piridil)Ala-Ser-(N-Me)Tir-D- Asn-Leu-isopropilLys-Pro-DAla-NH2), Cetrorelix (Ac-D-2Nal-D-4-cloro- Phe-D-3-(3-piridil)Ala-Ser-Tir-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2), Degarelix (Ac-D-2Nal-D-4-cloroPhe-D-3-(3-piridil)Ala-Ser-4-aminoPhe(L-hidro- orotil)-D-4-aminoPhe(carbamoil)-Leu-isopropilLys-Pro-D-Ala-NH2) e Ganirelix (Ac-D-2Nal-D-4-cloroPhe-D-3-(3-piridil)Ala-Ser-Tir-D-(N9, N10- dietil)-homoArg-Leu-(N9, N10-dietil)-homoArg-Pro-D-Ala-NH2) (Thundimadathil, J., J.
Amino Acids, 2012, 967347, doi:10.1155/2012/967347; Boccon-Gibod, L.; et al, 2011, Therapeutic
193 / 439
Advances in Urology 3(3): 127-140; Debruyne, F., 2006, Future Oncology, 2(6), 677-696; Schally A.
V; Nagy, A. 1999 Eur J Endocrinol 141:1-14; Koppan M, et al 1999 Prostate 38:151-158); e receptores de reconhecimento de padrões (PRRs), como receptores do tipo Toll (TLRs), lectinas do tipo C e receptores do tipo Nod (NLRs) (Fukata, M., et al, 2009, Semin.
Immunol. 21, 242-253; Maisonneuve, C., et al, 2014, Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
U. S.
A. 111, 1- 6; Botos, I., et al, 2011, Structure 19, 447-459; Means, T.
K., et al, 2000, Life Sci. 68, 241-258) que variam em tamanho, desde pequenas moléculas (análogos de imiquimode, guanisina e adenosina) a grandes e biomacromoléculas complexas como lipopolissacarídeo (LPS), ácidos nucléicos (CpG DNA, poliI:C) e lipopeptídeos (Pam3CSK4) (Kasturi, S.
P., et al, 2011, Nature 470, 543-547; Lane, T., 2001, J.
R.
Soc.
Med. 94, 316; Hotz, C., e Bourquin, C., 2012, Oncoimmunology 1, 227-228; Dudek, A.
Z., et al, 2007, Clin.
Cancer Res. 13, 7119-25); Receptores de calcitonina que é um neuropeptídeo de 32 aminoácidos, envolvidos na regulação dos níveis de cálcio, em grande parte por seus efeitos nos osteoclastos e nos rins (Zaidi M, et al, 1990 Crit Rev Clin Lab Sci 28, 109-174; Gorn, A.
H., et al 1995 J Clin Invest 95:2680–91); e receptores de integrinas e seus subtipos de receptores (como αVβ1, αVβ3, αVβ5, αVβ6, α6β4, α7β1, αLβ2, αIIbβ3 etc.) que geralmente desempenham papéis importantes na angiogênese são expressos nas superfícies de uma variedade de células, em particular, de osteoclastos, células endoteliais e células tumorais (Ruoslahti, E. et al, 1994 Cell 77, 477-8; Albelda, S.
M. et al, 1990 Cancer Res., 50, 6757-64). Peptídeos curtos, GRGDSPK e pentapeptídeos RGD cíclicos, como ciclo-(RGDfV) (L1) e seus derivados [ciclo(-N(Me)R-GDfV), ciclo(R-Sar-DfV), ciclo-(RG-N(Me)D- fV), ciclo(RGD-N(Me)f-V), ciclo(RGDf-N(Me)V-)(Cilengitida)] mostraram altas afinidades de ligação dos receptores de integrina (Dechantsreiter, M.
A. et al, 1999 J.
Med.
Chem. 42, 3033-40, Goodman, S.
L., et al, 2002 J.
Med.
Chem. 45, 1045-51).
194 / 439
[00150] Os ligandos de ligação celular ou agonistas de receptor celular podem ser moléculas de esqueleto proteico à base de Ig e não à base de Ig. Os esqueletos à base de Ig podem ser selecionados, entre outros, dentre Nanobody (um derivado de VHH (Ig de camelídeos)) (Muyldermans S., 2013 Annu Rev Biochem. 82, 775-97); anticorpos de domínio (dAb, um derivado do domínio VH ou VL) (Holt, L. J, et al, 2003, Trends Biotechnol. 21, 484- 90); Engager de células T biespecíficas (BiTE, um diabody biespecífico) (Baeuerle, P. A, et al, 2009, Curr. Opin. Mol. Ther. 11, 22-30); Redirecionamento de afinidade dupla (DART, um diabody biespecífico) (Moore P. A. P, et al. 2011, Blood 117(17), 4542-51); anticorpos tetravalentes em tandem (TandAb, um diabody biespecífico dimerizado) (Cochlovius, B, et al. 2000, Cancer Res. 60(16):4336-4341). Os esqueletos não Ig podem ser selecionados, entre outros, dentre Anticalina (um derivado das lipocalinas) (Skerra A. 2008, FEBS J., 275(11): 2677-83; Beste G, et al, 1999 Proc. Nat. Acad. USA. 96(5):1898-903; Skerra, A. 2000 Biochim Biophys Acta, 1482(1- 2): 337-50; Skerra, A. 2007, Curr Opin Biotechnol. 18(4): 295-304; Skerra, A. 2008, FEBS J. 275(11):2677-83); Adnectinas (10a FN3 (Fibronectina)) (Koide, A, et al, 1998 J. Mol. Biol., 284(4):1141-51; Batori V, 2002, Protein Eng. 15(12): 1015-20; Tolcher, A. W, 2011, Clin. Cancer Res. 17(2): 363-71; Hackel, B. J, 2010, Protein Eng. Des. Sel. 23(4): 211-19); proteínas de repetição de anquirina projetadas (DARPins) (derivado de proteínas de repetição anquirina) (Boersma, Y.L, et al, 2011 Curr Opin Biotechnol. 22(6): 849-57), p. ex., DARPin C9, DARPin Ec4 e DARPin E69_LZ3_E01 (Winkler J, et al, 2009 Mol Cancer Ther. 8(9), 2674-83; patricia M-K. M., et al, Clin Cancer Res. 2011; 17(1):100-10; Boersma Y. L, et al, 2011 J. Biol. Chem. 286(48), 41273-85); Avímeros (um receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDL)/domínio A) (Boersma Y. L, 2011 J. Biol. Chem. 286(48): 41273-41285; Silverman J, et al, 2005 Nat. Biotechnol., 23(12):1556-61).
[00151] Exemplos das estruturas do conjugado dos anticorpo-ligandos
195 / 439 de ligação celular ou agonistas de receptor celular ou fármacos através do bis- ligante do pedido de patente estão listados a seguir: LB01 (conjugado de folato), LB02 (conjugado de ligando de PMSA), LB03 (conjugado de ligando de PMSA), conjugado de ligando de PMSA), LB05 (conjugado de somatostatina), LB06 (conjugado de somatostatina), LB07 (conjugado de octreotida, um análogo de somatostatina), LB08 (conjugado de lanreotida, um análogo de somatostatina), LB09 (conjugado de vapreotida (Sanvar), um análogo de somatostatina), LB10 (conjugado de ligando de CAIX), LB11 (conjugado de ligando de CAIX), LB12 (conjugado de receptor de peptídeo liberador de gastrina (GRPr) e MBA), LB13 (conjugado de ligando de hormônio liberador de hormônio luteinizante (LH-RH) e GnRH), LB14 (conjugado de hormônio liberador de hormônio luteinizante (LH-RH) e ligando de GnRH), LB15 (conjugado de abarelix, antagonista de GnRH), LB16 (conjugado de cobalamina, análogo de vitamina B12), LB17 (conjugado de cobalamina, análogo de vitamina B12), LB18 (para receptor de integrina αvβ3, conjugado de pentapeptídeo cíclico de RGD), LB19 (conjugado de ligando peptídico heterobivalente para receptor de VEGF), LB20 (conjugado de neuromedina B), LB21 (conjugado de bombesina para um receptor acoplado à proteína G), LB22 (conjugado de TLR2 para um receptor tipo Toll), LB23 (para um receptor de androgênios), LB24 (conjugado de cilengitida/ciclo(-RGDfV-) para um receptor de integrina αv), LB23 (conjugado de fludrocortisona), LB25 (conjugado de análogo de rifabutina), LB26 (conjugado de análogo de rifabutina), LB27 (conjugado de análogo de rifabutina), LB28 (conjugado de fludrocortisona), LB29 (conjugado de dexametasona), LB30 (conjugado de propionato de fluticasona), LB31 (conjugado de dipropionato de beclometasona), LB32 (conjugado de triamcinolona acetonida), LB33 (conjugado de prednisona), LB34 (conjugado de prednisolona), LB35 (conjugado de metilprednisolona), LB36 (conjugado de betametasona), LB37 (conjugado de análogo de
196 / 439 irinotecano), LB38 (conjugado de análogo de crizotinibe), LB39 (conjugado de análogo de bortezomibe), LB40 (conjugado de análogo de carfilzomibe), LB41 (conjugado de análogo de carfilzomibe), LB42 (conjugado de análogo de leuprolida), LB43 (conjugado de análogo de triptorelina), LB44 (conjugado de clindamicina), LB45 (conjugado de análogo de liraglutida), LB46 (conjugado de análogo de semaglutida), LB47 (conjugado de análogo de retapamulina), LB48 (conjugado de análogo de indibulina), LB49 (conjugado de análogo de vimblastina), LB50 (conjugado de análogo de lixisenatida), LB51 (conjugado de análogo de osimertinibe), LB52 (conjugado de um análogo de nucleosídeo), LB53 (conjugado de análogo de erlotinibe) e LB54 (conjugado de análogo de lapatinibe) que são mostrados nas seguintes estruturas:
LB01 (Conjugado de folato),
LB02 (Conjugado de ligando de PMSA),
LB03 (Conjugado de ligando de PMSA),
197 / 439 LB04 (Conjugado de ligando de PMSA), LB05 (Conjugado de somatostatina), X1 O R5 R3 R1 X1 Y1 N Z1 R2 H2N O O N O X2 R4 Q
H
N N N N O Z2
H O S H H H O O HN R5'
S N N H N NH2 HO O n
O HO O LB06 (Conjugado de somatostatina), LB07 (Conjugado de octreotida, um análogo de somatostatina),
198 / 439
LB08 (Conjugado de lanreotida, um análogo de somatostatina),
LB09 (Conjugado de vapreotida (Sanvar), um análogo de somatostatina),
LB10 (Conjugado de ligando de CAIX),
LB11 (Conjugado de ligando de CAIX),
LB12 (conjugado de receptor de peptídeo liberador de gastrina (GRPr) e MBA),
199 / 439
LB13 (conjugado de ligando de hormônio liberador de hormônio luteinizante (LH-RH) e GnRH),
LB14 (conjugado de hormônio liberador de hormônio luteinizante (LH-RH) e ligando de GnRH),
LB15 (conjugado de abarelix, antagonista de GnRH),
LB16 (conjugado de cobalamina, análogo de vitamina B12),
200 / 439
LB17 (conjugado de cobalamina, análogo de vitamina B12),
LB18 (para receptor de integrina αvβ3, conjugado de pentapeptídeo cíclico de RGD),
LB19 (conjugado de ligando peptídico heterobivalente para receptor de VEGF),
LB20 (conjugado de neuromedina B),
LB21 (conjugado de bombesina para receptor acoplado à proteína G),
201 / 439
LB22 (conjugado de TLR2 para um receptor tipo Toll),
LB23 (um receptor de androgênio),
LB24 (conjugado de cilengitida/ciclo(-RGDfV-) para um receptor de integrina αv)
LB25 (conjugado de análogo de rifabutina),
LB26 (conjugado de análogo de rifabutina),
202 / 439
LB27 (conjugado de análogo de rifabutina),
LB28 (conjugado de fludrocortisona),
LB29 (conjugado de dexametasona),
LB30 (conjugado de propionato de fluticasona),
203 / 439 LB31 (dipropionato de beclometasona), Me O N R1 O R5 R3
HO O N Z1 Me H X1 O R2 R4 Q X2 N F H Z2 O R5' n
O LB32 (conjugado de triancinolona acetonida), LB33 (conjugado de prednisona), LB34 (conjugado de prednisolona), LB35 (conjugado de metilprednisolona), LB36 (conjugado de betametasona),
204 / 439
LB37 (análogo de irinotecano),
LB38 (conjugado de análogo de crizotinibe),
LB39 (conjugado de análogo de bortezomibe), em que Y5 é N, CH, C(Cl), C(CH3) ou C(COOR1); R1 é H, alquila C1-C6, Ar C3-C8;
LB40 (conjugado de análogo de carfilzomibe),
LB41 (conjugado de análogo de carfilzomibe),
205 / 439 LB42 (conjugado de análogo de leuprolida), H2N NH2 O R5 R3 HN R1 N HO HN N O N X1 N Z1
H O H O H O H O R2
O N N
N N N N R4 Q N N N X2 N H O H O H O H O Z2 O R5' NH n
HO LB43 (conjugado de análogo de triptorelina), LB44 (conjugado de clindamicina), LB45 (conjugado de análogo de liraglutida), LB46 (conjugado de análogo de semaglutida),
206 / 439 LB47 (conjugado de análogo de retapamulina), LB48 (conjugado de análogo de indibulina), LB49 (conjugado de análogo de vimblastina), HOOC-H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M R1 O R 5 R3 G-G-N-K-L-W-E-I-F-L-R-V-A-E-E-E X 1 Z1
N Q P-S-S-G-A-P-P-S-K-K-K-K-K-K-NH R2 R4 N X2 N H Z2 n O R5' LB50 (conjugado de análogo de lixisenatida), LB51 (conjugado de análogo de osimertinibe),
207 / 439
LB52 (conjugado de análogo de um nucleosídeo),
LB53 (conjugado de análogo de erlotinibe),
LB54 (conjugado de análogo de lapatinibe), em que “ “, X1, X2, Q, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são definidos como acima; preferivelmente, X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente O, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, C(O)NHNHC(O) e C(O)NR1; X3 is CH2, O, NH, NHC(O), NHC(O)NH, C(O), OC(O), OC(O)(NR3), R1, NHR1, NR1, C(O)R1 ou ausente; X4 é H, CH2, OH, O, C(O), C(O)NH, C(O)N(R1), R1, NHR1, NR1, C(O)R1 ou C(O)O; X5 é H, CH3, F ou Cl; M1 e M2 são independentemente H, Na, K, Ca, Mg, NH4, NR1R2R3; R6 é 5'-desoxiadenosila, Me, OH ou CN; Em ainda outra modalidade, um, dois ou mais DNA, RNA, mRNA, RNA interferente pequeno (siRNA), microRNA (miRNA) e RNAs
208 / 439 que interagem com PIWI (piRNA) são preferidos conjugados a uma molécula de ligação celular através de um bis-ligante desta patente.
Sabe-se que pequenos RNAs (siRNA, miRNA, piRNA) e RNAs antissentidos não codificante longos são responsáveis por alterações epigenéticas nas células (Goodchild, J (2011), Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 764: 1- 15). DNA, RNA, mRNA, siRNA, miRNA ou piRNA aqui podem ser fitas simples ou duplas com unidades de nucleotídeos de 3 a 1 milhão e alguns de seus nucleotídeos podem não ter formas naturais (sintéticas), como oligonucleotídeo com ligações de fosforotioato, como exemplo de Fomivirsen, ou os nucleotídeos estão unidos por ligações fosforotioato em vez das ligações fosfodiéster de RNA e DNA natural e as partes de açúcar são desoxirribose na parte central da molécula e ribose modificada com 2'-O- metoxietila nas duas extremidades, como exemplo Mipomersen, ou oligonucleotídeo produzido com ácido peptonucleico (PNA), morfolino, fosforotioato, tiofosforamidato ou com 2'-O-metoxietila (MOE), 2'-O-metila, 2'-Fluoro, ácido nucléico bloqueado (LNA) ou ácido nucleico bicíclico (BNA) de açúcar ribose ou ácidos nucleicos são modificados para remover a ligação de carbono 2’-3’ no anel do açúcar (Whitehead, K.
A.; et al (2011), Annual Review of Chemical e Biomolecular Engineering 2: 77-96; Bennett, C.F.; Swayze, E.E. (2010), Annu.
Rev.
Pharmacol.
Toxicol. 50: 259-29). Preferivelmente, o comprimento dos oligonucleotídeos varia entre aproximadamente 8 e mais de 100 nucleotídeos.
Um exemplo da estrutura dos conjugados é exibido abaixo:
, SI-1 em que “ “, Q, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são definidos como acima; preferivelmente, X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente O, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH,
209 / 439 OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, CH2, C(O)NHNHC(O) e C(O)NR1; é fitas únicas ou duplas de DNA, RNA, mRNA, siRNA, miRNA ou piRNA.
[00152] Em ainda outra modalidade, os conjugados de anticorpo IgG conjugados com uma, duas ou mais moléculas ou fármacos de funções diferentes são preferidos para serem conjugados especificamente a um par de tióis (através da redução das ligações dissulfeto) entre a cadeia leve e a cadeia pesada, as ligações dissulfeto superiores entre as duas cadeias pesadas, e ligações dissulfeto inferiores entre as duas cadeias pesadas, conforme mostrado nas estruturas seguintes ST1, ST2, ST3, ST4, ST5, ou ST6: Fármaco ST1， Fármaco Fármaco ST2,
210 / 439 Fármaco ST3, R3 R5 O O R5 R3 S S Z1 N Y1 Z1 X1 R1 Y1 R N S S R4 Fármaco Drug Fármaco 1 X1 Drug R4 X R 2 Y S S Z2 N 2 2 Y2 R2 X2 N Z2 O m2 m1 R5'
O R 5' R3 R5 O Z1 Y1 N X1 R1 R4 Drug Fármaco Z2 X R2 Y N 2 2 n R5' O ST4, Fármaco Fármaco ST5, Fármaco Fármaco Fármaco Fármaco ST6, em que “ “, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são definidos como acima;; preferivelmente, X1, X2, Y1 e Y2 são
211 / 439 independentemente O, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, CH2, C(O)NHNHC(O) e C(O)NR1; m1, m2, m3 e m4 são independentemente 1-30.
[00153] Além disso, o fármaco ou as moléculas citotóxicas Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n em sítio de conjugação diferente da molécula de ligação celular podem ser diferentes quando as moléculas citotóxicas contendo bis-ligantes iguais ou diferentes são conjugadas sequencialmente a uma molécula de ligação celular, ou quando diferentes moléculas citotóxicas contendo bis-ligantes iguais ou diferentes são adicionados passo a passo em uma mistura de reação de conjugação contendo uma molécula de ligação celular a molécula de ligação celular. Formulação e aplicação
[00154] Os conjugados do pedido de patente são formulados para líquidos ou adequados para serem liofilizados e subsequentemente reconstituídos para uma formulação líquida. Uma formulação líquida compreendendo 0,1 g/L ~ 300 g/L de concentração do ingrediente ativo conjugado para entrega a um paciente sem altos níveis de agregação de anticorpos pode incluir um ou mais polióis (por exemplo, açúcares), um agente tampão com pH 4,5 a 7,5, um tensoativo (por exemplo, polissorbato 20 ou 80), um antioxidante (por exemplo, ácido ascórbico e/ou metionina), um agente de tonicidade (por exemplo, manitol, sorbitol ou NaCl), agentes quelantes como EDTA; complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn-proteína); polímeros biodegradáveis tais como poliésteres; um conservante (por exemplo, álcool benzílico) e/ou um aminoácido livre.
[00155] Os agentes tamponantes adequados para uso nas formulações incluem, entre outros, sais de ácidos orgânicos, tais como sais de ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glucônico, ácido carbônico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético ou ácido ftálico; Tris, cloridrato de (tris(hidroximetil)-aminometano) de trometamina ou tampão fosfato. Além
212 / 439 disso, os componentes de aminoácidos também podem ser usados como agente tampão. Esse componente de aminoácido inclui, entre outros, arginina, glicina, glicilglicina e histidina. Os tampões de arginina incluem acetato de arginina, cloreto de arginina, fosfato de arginina, sulfato de arginina, succinato de arginina etc. Em uma modalidade, o tampão de arginina é acetato de arginina. Exemplos de tampões de histidina incluem cloreto de histidina- cloreto de arginina, acetato de histidina-acetato de arginina, fosfato de histidina-fosfato de arginina, sulfato de histidina-sulfato de arginina, sulfato de histidina-succinato de arginina etc. As formulações dos tampões têm um pH de 4,5 a pH 7,5, preferivelmente entre aproximadamente 4,5 e 6,5, mais preferencialmente entre aproximadamente 5,0 e 6,2. Em algumas modalidades, a concentração dos sais de ácido orgânico no tampão é de cerca de 10 mM a cerca de 500 mM.
[00156] Um “poliol” que pode opcionalmente ser incluído na formulação é uma substância com vários grupos hidroxila. Os polióis podem ser utilizados como excipientes estabilizadores e/ou agentes de isotonicidade em formulações líquidas e liofilizadas. Os polióis podem proteger os produtos biofarmacêuticos das vias de degradação física e química. Preferivelmente, os cossolventes excluídos aumentam a tensão superficial efetiva do solvente na interface da proteína, pelo qual as conformações estruturais mais favoráveis em termos energéticos são aquelas com as menores áreas superficiais. Os polióis incluem açúcares (açúcares redutores e não redutores), álcoois de açúcar e ácidos de açúcar. Um “açúcar redutor” é aquele que contém um grupo hemiacetal que pode reduzir íons metálicos ou reagir covalentemente com lisina e outros grupos amino nas proteínas e um “açúcar não redutor” é aquele que não possui essas propriedades de um açúcar redutor. Exemplos de açúcares redutores são frutose, manose, maltose, lactose, arabinose, xilose, ribose, ramnose, galactose e glicose. Os açúcares não redutores incluem sacarose, trealose, sorbose, melezitose e rafinose. Álcoois de açúcar são
213 / 439 selecionados dentre manitol, xilitol, eritritol, maltitol, lactitol, eritritol, treitol, sorbitol e glicerol. Os ácidos de açúcar incluem L-gluconato e seus sais metálicos. Preferivelmente, um açúcar não redutor: sacarose ou trealose a uma concentração entre aproximadamente 0,01% e 20% é escolhido na formulação, em que trealose é preferida em relação à sacarose, por causa da estabilidade em solução da trealose.
[00157] Um tensoativo opcionalmente nas formulações é selecionado dentre polissorbato (polissorbato 20, polissorbato 40, polissorbato 65, polissorbato 80, polissorbato 81, polissorbato 85, polissorbato 85 e similares); poloxâmero (por exemplo, poloxâmero 188, poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno), poloxâmero 407 ou polietileno-polipropileno glicol e similares); Triton; dodecilsulfato de sódio (SDS); lauril sulfato de sódio; octil glicosídeo de sódio; lauril-, miristil-, linoleil- ou estearil-sulfobetaína; lauril-, miristil-, linoleil- ou estearil-sarcosina; linoleil-, miristil- ou cetil-betaína; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil- ou isoestearamidopropil-betaína (por exemplo, lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil- ou isoestearamidopropil-dimetilamina; metilcocoil- sódico, ou metil oleil-taurato dissódico; dodecil betaína, óxido de dodecil dimetilamina, cocamidopropil betaína e cocoanfoglicinato; e a série MONAQUATTM (p. ex., etossulfato de isoestearila etilimidônio); polietilglicol, polipropilglicol e copolímeros de etileno e propilenoglicol (p. ex., Pluronics, PF68 etc.); etc. Os tensoativos preferidos são os ésteres de ácidos graxos de polioxietileno sorbitano, p. ex., polissorbato 20, 40, 60 ou 80 (Tween 20, 40, 60 ou 80). A concentração de um tensoativo varia entre 0,0001% e aproximadamente 1,0%. Em certas modalidades, a concentração de tensoativo é entre aproximadamente 0,01% e 0,1%. Em uma modalidade, a concentração de tensoativo é aproximadamente 0,02%.
[00158] Um “conservante” opcionalmente nas formulações é um
214 / 439 composto que reduz essencialmente a ação bacteriana nas mesmas. Exemplos de conservantes em potencial incluem cloreto de octadecildimetilbenzilamônio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio (uma mistura de cloretos de alquilbenzildimetilamônio nos quais os grupos alquila são compostos de cadeia longa) e cloreto de benzetônio. Outros tipos de conservantes incluem álcoois aromáticos como fenol, álcool butílico e benzílico, alquil parabenos como metil ou propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclo-hexanol, 3-pentanol e m-cresol. O conservante é inferior a 5% na formulação. Preferivelmente, 0,01% a 1%. Em uma modalidade, o conservante aqui é álcool benzílico.
[00159] Aminoácidos livres adequados, opcionalmente para uso na formulação, entre outros, são arginina, lisina, histidina, ornitina, isoleucina, leucina, alanina, ácido glutâmico glicina ou ácido aspártico. É preferida a inclusão de um aminoácido básico, ou seja, arginina, lisina e/ou histidina. Se uma composição inclui histidina, essa pode atuar tanto como um agente tampão quanto como um aminoácido livre, mas quando um tampão de histidina é usado, é típico incluir um aminoácido livre não histidina, p. ex., para incluir tampão histidina e lisina. Um aminoácido pode estar presente em sua forma D e/ou L, mas a forma L é típica. O aminoácido pode estar presente como qualquer sal adequado, p. ex., um sal cloridrato, tal como arginina-HCl. A concentração de um aminoácido varia entre 0,0001% e aproximadamente 15,0%. Preferivelmente, 0,01% a 5%..
[00160] As formulações podem opcionalmente compreender metionina ou ácido ascórbico como um antioxidante a uma concentração entre aproximadamente 0,01 mg/mL e 5 mg/mL; As formulações podem opcionalmente compreender agente quelante, p. ex., EDTA, EGTA etc., a uma concentração entre aproximadamente 0,01 mM e 2 mM.
[00161] A formulação final pode ser ajustada ao pH preferido com um agente de ajuste (p. ex., um ácido, como HCl, H2SO4, ácido acético, H3PO4,
215 / 439 ácido cítrico etc., ou uma base, como NaOH, KOH, NH3OH, etanolamina, dietanolamina ou trietanolamina, fosfato de sódio, fosfato de potássio, citrato trissódico, trometamina etc.) e a formulação de ser controlada “isotônica”, o que significa que a formulação de interesse tem essencialmente a mesma pressão osmótica do sangue humano. As formulações isotônicas geralmente terão uma pressão osmótica entre cerca de 250 e 350 mOsm. A isotonicidade pode ser medida usando um osmômetro do tipo pressão de vapor ou ponto de congelamento, por exemplo,.
[00162] Outros excipientes que podem ser úteis em uma formulação líquida ou liofilizada do pedido de patente incluem, p. ex, fucose, celobiose, maltotriose, melibiose, octulose, ribose, xilitol, arginina, histidina, glicina, alanina, metionina, ácido glutâmico, lisina, imidazol, glicilglicina, manosilglicerato, Triton X-100, Pluoronic F-127, celulose, ciclodextrina, dextrano (10, 40 e/ou 70 kD), polidextrose, maltodextrina, ficol, gelatina, hidroxipropilmetila, fosfato de sódio, fosfato de potássio, ZnCl2, zinco, óxido de zinco, citrato de sódio, citrato trissódico, trometamina, cobre, fibronectina, heparina, albumina sérica humana, protamina, glicerina, glicerol, EDTA, metacresol, álcool benzílico, fenol, álcoois poli-hídricos ou poliálcoois, formas hidrogenadas de carboidratos com um grupo carbonila reduzido a um grupo hidroxila primário ou secundário.
[00163] Outros excipientes contemplados, que podem ser utilizados nas composições farmacêuticas aquosas do pedido de patente incluem, por exemplo, agentes aromatizantes, agentes antimicrobianos, adoçantes, antioxidantes, agentes antiestáticos, lipídios como fosfolipídios ou ácidos graxos, esteroides como colesterol, excipientes proteicos tais como albumina sérica (albumina sérica humana), albumina humana recombinante, gelatina, caseína, contraíons formadores de sal, tais como sódio e semelhantes. Estes e excipientes farmacêuticos conhecidos adicionais e/ou aditivos adequados para uso nas formulações da invenção são conhecidos na técnica, por exemplo,
216 / 439 conforme listado em “The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4a edição, Rowe et al., Eds., American Pharmaceuticals Association (2003); e Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 21a edição, Gennaro, Ed., Lippincott Williams & Wilkins (2005).
[00164] Em uma modalidade adicional, a invenção provê um método para preparar uma formulação compreendendo as etapas de: (a) liofilizar a formulação compreendendo os conjugados, excipientes e um sistema tampão a um pó; e (b) reconstituir a mistura liofilizada da etapa (a) em um meio de reconstituição de modo a que a formulação reconstituída seja estável. A formulação da etapa (a) pode compreender ainda um estabilizante e um ou mais excipientes selecionados a partir de um grupo que compreende agente de volume, sal, tensoativo e conservante, como descrito acima. Como meio de reconstituição, vários ácidos orgânicos diluídos ou água, isto é, água estéril, água bacteriostática para injeção (BWFI) ou podem ser usados. O meio de reconstituição pode ser selecionado dentre água, ou seja, água estéril, água bacteriostática para injeção (BWFI) ou o grupo que consiste em ácido acético, ácido propiônico, ácido succínico, cloreto de sódio, cloreto de magnésio, solução ácida de cloreto de sódio, solução ácida de cloreto de magnésio e solução ácida de arginina, em uma quantidade entre cerca de 10 e 250 mM.
[00165] Uma formulação farmacêutica líquida dos conjugados do pedido de patente deve exibir uma variedade de características predefinidas. Uma das principais preocupações em relação aos produtos de fármacos líquidos é a estabilidade, pois as proteínas/anticorpos tendem a formar agregados solúveis e insolúveis durante a fabricação e o armazenamento. Além disso, várias reações químicas podem ocorrer na solução (desamidação, oxidação, recorte, isomerização etc.), levando a um aumento nos níveis de produtos de degradação e/ou perda de bioatividade. Preferivelmente, um conjugado na formulação líquida ou de liofilizado deve exibir um prazo de validade de mais de 18 meses a 0-25ºC. Mais preferido, um conjugado na
217 / 439 formulação líquida ou de liofilizado deve exibir um prazo de validade de mais de 24 meses a 25ºC. A formulação líquida mais preferida deve exibir um prazo de validade entre aproximadamente 24 e 36 meses a 2-8ºC e a formulação de liofilizado deve exibir um prazo de validade, preferencialmente, de até 60 meses a 2-8ºC. Ambas as formulações líquidas e de liofilizado devem exibir um prazo de validade por pelo menos dois anos a - 20ºC ou -70 º C.
[00166] Em certas modalidades, a formulação é estável após congelamento (p. ex., -20ºC ou -70ºC) e descongelamento da formulação, por exemplo, após 1, 2 ou 3 ciclos de congelamento e descongelamento. A estabilidade pode ser avaliada qualitativa e/ou quantitativamente de várias maneiras diferentes, incluindo avaliação da razão fármaco/anticorpo (proteína) e formação de agregados (por exemplo, usando UV, cromatografia de exclusão por tamanho, medindo a turbidez e/ou por inspeção visual); avaliando a heterogeneidade da carga usando cromatografia de troca catiônica, focalização isoelétrica capilar de imagens (icIEF) ou eletroforese de zona capilar; análise de sequência amino-terminal ou carboxi-terminal; análise espectrométrica de massa ou espectrometria de massa de ionização e dessorção a laser assistida por matriz por tempo de voo (MALDI/TOF MS) ou HPLC-MS/MS; CE-SDS ou análise SDS-PAGE para comparar anticorpo reduzido e intacto; análise do mapa peptídico (por exemplo, tríptico ou LYS- C); avaliando a atividade biológica ou a função de ligação ao antígeno do anticorpo; etc. A instabilidade pode envolver qualquer um ou mais dentre: agregação, desamidação (p. ex., desamidação de Asn), oxidação (p. ex., oxidação de Met), isomerização (p. ex., isomerização de Asp), recorte/hidrólise/fragmentação (p. ex., fragmentação da região hinge (dobradiça)), formação de succinimida, cisteína(s) não pareada(s), extensão de N-terminal, processamento de C-terminal, diferenças de glicosilação etc.
[00167] Um conjugado estável também deve “reter sua atividade
218 / 439 biológica” em uma formulação farmacêutica, se a atividade biológica do conjugado em um dado momento, por exemplo, 12 meses, dentro de cerca de 20%, preferivelmente, cerca de 10% (dentro dos erros do ensaio) da atividade biológica exibida no momento em que a formulação farmacêutica foi preparada conforme determinada em um ensaio de ligação ao antígeno e/ou ensaio in vitro, citotóxico, por exemplo.
[00168] Um recipiente ou vasilhame farmacêutico é usado para manter a formulação farmacêutica de qualquer um dos conjugados do pedido de patente. O vasilhame é um frasco, garrafa, seringa preenchida ou seringa autoinjetora preenchida.
[00169] Para uso clínico in vivo, o conjugado através do bis- acoplamento da invenção será provido como soluções ou como um sólido liofilizado que pode ser redissolvido em água estéril para injeção. Exemplos de protocolos adequados para administração de conjugados são como segue. Os conjugados são fornecidos diária, semanal, quinzenalmente, uma vez a cada quatro semanas ou mensalmente por 8~54 semanas como bolus i.v.. As doses em bolus são fornecidas em 50 a 1000 mL de solução salina normal à qual pode ser opcionalmente adicionada albumina sérica humana (p. ex., 0,5 a 1 mL de uma solução concentrada de albumina sérica humana, 100 mg/mL). As doses serão entre cerca de 50 µg/kg a 30 mg/kg de peso corporal por semana, ou quinzenalmente ou a cada três semanas i.v. (faixa de 10 µg a 200 mg/kg por injeção). 4~54 semanas depois do tratamento, o paciente pode receber um segundo ciclo de tratamento. Protocolos clínicos específicos em relação à via de administração, excipientes, diluentes, dosagens, tempos, etc., podem ser determinados pelos médicos especializados.
[00170] Exemplos de condições médicas que podem ser tratadas de acordo com os métodos in vivo ou ex vivo para eliminar populações celulares selecionadas incluem malignidade de qualquer tipo de câncer, doenças autoimunes, rejeições de enxertos e infecções (virais, bacterianas ou
219 / 439 parasitárias).
[00171] A quantidade de um conjugado necessária para alcançar o efeito biológico desejado variará dependendo de vários fatores, incluindo as características químicas, a potência e a biodisponibilidade dos conjugados, o tipo de doença e as espécies às quais o paciente pertence, o estado de doença do paciente, a via de administração, todos os fatores que determinam as quantidades requeridas da dose, entrega e regime a serem administrados.
[00172] Em termos gerais, os conjugados através dos bis-ligantes desta invenção podem ser providos em solução fisiológica tamponada contendo 0,1 a 10% p/v de conjugados para administração parenteral. As doses típicas variam de 1 µ g/kg a 0,1 g/kg de peso corporal diariamente; semanal, quinzenalmente, a cada três semanas ou mensalmente, uma faixa preferida para dose é de 0,01 mg/kg a 30 mg/kg de peso corporal semanalmente, a cada duas semanas, a cada três semanas ou mensalmente, uma dose equivalente em um humano. A dosagem preferida do fármaco a ser administrada provavelmente dependerá de variáveis como o tipo e extensão da progressão da doença ou transtorno, o estado geral de saúde do paciente em particular, a eficácia biológica relativa do composto selecionado, a formulação do composto, a via de administração (intravenosa, intramuscular ou outra), as propriedades farmacocinéticas dos conjugados pela via de entrega escolhida e a velocidade (bolus ou infusão contínua) e o esquema de administrações (número de repetições em um dado período de tempo).
[00173] Os conjugados através dos ligantes da presente invenção também são capazes de serem administrados em formas de dose unitária, em que o termo “dose unitária” significa uma dose única que é capaz de ser administrada a um paciente e que pode ser facilmente manipulada e embalada, permanecendo como uma dose unitária fisicamente e quimicamente estável compreendendo o próprio conjugado ativo ou como uma composição farmaceuticamente aceitável, como descrito a seguir. Assim, as doses totais
220 / 439 diárias/semanais/quinzenais/mensais típicas variam de 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal. Como orientação geral, as doses unitárias para humanos variam de 1 mg a 3000 mg ao, ou por semana, a cada duas semanas (quinzenalmente), a cada três semanas ou por mês. Preferivelmente, a faixa de doses unitárias é de 1 a 500 mg, administradas uma a quatro vezes por mês, e ainda mais preferencialmente de 1 mg a 100 mg, uma vez por semana, ou uma vez a cada duas semanas, ou uma vez a cada três semanas. Os conjugados aqui providos podem ser formulados em composições farmacêuticas pela mistura com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Tais composições de dose unitária podem ser preparadas para uso por administração oral, particularmente na forma de comprimidos, cápsulas simples ou cápsulas gelatinosas moles; ou intranasal, particularmente na forma de pós, gotas nasais ou aerossóis; ou por via cutânea, por exemplo, topicamente em pomadas, cremes, loções, géis ou sprays, ou através de adesivos transdérmicos.
[00174] Em ainda outra modalidade, uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do conjugado de Fórmula (I) ou qualquer conjugado descrito através da presente patente pode ser administrada concomitantemente com outros agentes terapêuticos, tais como o agente quimioterápico, a radioterapia, agentes de imunoterapia, agentes de transtornos autoimunes, agentes anti-infecciosos ou outros conjugados para tratamento sinergicamente eficaz ou prevenção de um câncer, uma doença autoimune ou uma doença infecciosa. Preferivelmente, os agentes sinérgicos são selecionados dentre um ou vários dos fármacos seguintes: Abatacepte, abemaciclibe, acetato de abiraterona, abraxano, aducanumabe, acetaminofeno/hidrocodona, acalabrutinibe, aducanumabe, adalimumabe ADXS31-142, ADXS-HER2, dimaleato de afatinibe, aldesleucina, alectinibe, alentuzumabe, alitinibe, Alitretinoína, ado- trastuzumabe entansina, anfetamina/dextroanfetamina, anastrozol, apatinibe,
221 / 439 aripiprazol, antraciclinas, aripiprazol, atazanavir, atezolizumabe, atorvastatina, avelumabe, AVXS-101, axicabtagene ciloleucel, axitinibe, belinostato, BCG vivo, bevacizumabe, bexaroteno, blinatumomabe, bortezomibe, bosutinibe, brentuximabe vedotina, brigatinibe, brolucizumabe, budesonida, budesonida/ formoterol, buprenorfina, BYL719 (inibidor de PI3K alfa-específico), cabazitaxel, cabozantinibe, capmatinibe, capecitabina, carfilzomibe, células T geneticamente modificadas para expressar receptores quiméricos de antígenos (CAR-T), celecoxibe, ceritinibe, cetuximabe, chiauranibe, chidamida, ciclosporina, cinacalcet, crizotinibe, cobimetinibe, cosentyx, crizotinibe, tisagenlec leucel, dabigatrana, dabrafenibe, dacarbazina, daclizumabe, dacomotinibe, daptomicina, daratumumabe, darbepoetina alfa, darunavir, dasatinibe, denileucina diftitox, denosumabe, depakote, dexlansoprazol, dexmetildenidato, dexametasona, sistema de resfriamento digniCap, L-3,4-dihidroxifenil-alanina, Dinutuximabe, dornase alfa, doxiciclina, duloxetina, duvelisibe, durvalumabe, elotuzumabe, emicizumabe, entricibina/rilpivirina/tenofovir, fumarato de disoproxila, entricitbina/tenofovir/efavirenz, enoxaparina, ensartinibe, enzalutamida, epitinibe, epoetina alfa, erlotinibe, esomeprazol, eszopiclone, etanercepte, everolimo, exemestano, everolimo, exenatida ER, ezetimibe, ezetimibe/sinvastatina, famitinibe, fenofibrato, filgotinibe, filgrastim, fingolimode, flumatinibe, propionato de fluticasona, fluticasona/salmeterol, fruquintinibe, fulvestranto, gazyva, gefitinibe, glatiramer, acetato de goserelina, GSK2857916 (BCMA-ADC), henatinibe, icotinibe, imatinibe, ibritumomabe tiuxetano, ibrutinibe, icotinibe, idelalisibe, ifosfamida, infliximabe, imiquimode, ImmuCyst, Immuno BCG, iniparibe, insulina aspart, insulina detemir, insulina glargina, insulina lispro, interferon alfa, interferon alfa-1b, interferon alfa-2a, interferon alfa-2b, interferon beta, interferon beta 1a, interferon beta 1b, interferon gama-1a, lapatinibe, ipilimumabe, brometo de ipatrópio/ salbutamol, ixazomibe, Kanuma,
222 / 439 lanadelumabe, acetato de lanreotide, lenalidomida, lenaliomide, mesilato de lenvatinibe, letrozol, levotiroxina, levotiroxina, lidocaína, linezolida, liraglutida, lisdexanfetamina, LN-144 (linfócito infiltrante de tumor), lorlatinibe, lucitanibe/delitinibe, memantina, metoxi polietilenoglicol-epoetina beta, metilfenidato, metoprolol, Mekinist, mericitabina/rilpivirina/ tenofovir, modafinil, mometasona, Mycidac-C, ácido micofenólicio, necitumumabe, neratinibe, nilotinibe, niraparibe, nivolumabe, ofatumumabe, obinutuzumabe, ocrelizumabe, olaparibe, olmesartana, olmesartana/hidroclorotiazida, omalizumabe, ésteres etílicos de ácidos graxos ômega-3, oncorina, oseltamivir, osimertinibe, oxicodona, ozanimode, palbociclibe, palivizumabe, panitumumabe, panobinostate, pazopanibe, pembrolizumabe, anticorpo contra PD-1, anticorpo contra PD-L1, pemetrexede, pertuzumabe, pirfenidona, vacina conjugada pneucocócica, pomalidomida, pregabalina, ProscaVax, propranolol, puquitinibe, piotinibe, quetiapina, rabeprazol, cloreto de rádio 223, raloxifeno, raltegravir, ramucirumabe, ranibizumabe, regorafenibe, ribociclibe, risankizumabe, rituximabe, rivaroxaban, romidepsina, rosuvastatina, fosfato de ruxolitinibe, salbutamol, savolitinibe, semaglutida, Sevelamer, sildenafil, siltuximabe, simotinibe, sipatinib/cipatinibe, siponimode, Sipuleucel-T, sitagliptina, sitagliptina/metformina, solifenacina, solanezumabe, sonidegibe, sorafenibe, sulfatinibe, sunitinibe, tacrolimo, tacrimo, tadalafil, tamoxifeno, tafinlar, talimogene laherparepvec, talazoparibe, telaprevir, talazoparibe, temozolomida, tensirolimo, tenecteplase, tenofovir/entricitabina, fumarato de tenofovir disoproxil, testosterona gel, tezacaftor/ivacaftor, talidomida, teliatinibe, TICE BCG, brometo de tiotrópio, tisagenlec leucel, tocilizumabe, toremifeno, trametinibe, trastuzumabe, trabectedina (ecteinascidina 743), trametinibe, tremelimumabe, trifluridina/tipiracil, tretinoína, upadacitinibe, Uro-BCG, Ustekinumabe, valoctocogene roxaparvovec, valsartana, veliparibe, vandetanibe, vemurafenibe, venetoclax, vismodegibe, volitinibe, vorinostate, ziv-
223 / 439 aflibercepte, Zostavax e seus análogos, derivados, sais farmaceuticamente aceitáveis, veículos, diluentes ou excipientes dos mesmos ou uma combinação dos mesmos acima.
[00175] Os fármacos/agentes citotóxicos utilizados para conjugação através de um ligante em ponte da presente patente podem ser quaisquer análogos e/ou derivados de fármacos/moléculas descritos na presente patente. O técnico no campo de fármacos/agentes citotóxicos entenderá prontamente que cada um dos fármacos/agentes citotóxicos aqui descritos pode ser modificado de tal maneira que o composto resultante ainda retenha a especificidade e/ou atividade do composto de partida. O técnico no assunto também entenderá que muitos desses compostos podem ser utilizados no lugar dos fármacos/agentes citotóxicos aqui descritos. Assim, os fármacos/agentes citotóxicos da presente invenção incluem análogos e derivados dos compostos aqui descritos.
[00176] Todas as referências citadas aqui e nos exemplos a seguir são expressamente incorporadas por referência em sua totalidade. Exemplos
[00177] A invenção é descrita mais detalhadamente nos exemplos a seguir, que não se destinam a limitar o âmbito da invenção. As linhagens celulares descritas nos exemplos a seguir foram mantidas em cultura de acordo com as condições especificadas pela American Type Culture Collection (ATCC) ou Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemanha (DMSZ), ou The Shanghai Cell Culture Institute of Chinese Acadmy of Science, a menos que especificado de outra forma. Os reagentes de cultura celular foram obtidos da Invitrogen Corp., a menos que especificado de outra forma. Todos os solventes anidros foram obtidos comercialmente e armazenados em frascos Sure-seal sob nitrogênio. Todos os outros reagentes e solventes foram adquiridos como o mais alto grau disponível e utilizados sem purificação
224 / 439 adicional. As separações por HPLC foram realizadas com Varain PreStar HPLC. Os espectros de RMN foram registrados no instrumento Varian Mercury 400 MHz. Os deslocamentos químicos (.delta.) são relatados em partes por milhão (ppm) com referência ao tetrametilsilano a 0,00 e as constantes de acoplamento (J) são relatadas em Hz. Os dados espectrais de massa foram adquiridos em um espectrômetro de massa Waters Xevo QTOF equipado com módulo de separações Waters Acquity UPLC e detector Acquity TUV. Exemplo 1. Síntese de 2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-carboxilato de metila
[00178] A uma solução de maleimida (6,35 g, 65,4 mmol, 1,0 eq.) em EtOAc (120 mL), foram adicionados N-metilmorfolina (8,6 mL, 78,5 mmol, 1,2 eq.) e cloroformato de metila (6,0 mL, 78,5 mmol, 1,2 eq.) a 0ºC. A reação foi agitada a 0ºC por 30 minutos e à temperatura ambiente por 1 hora. O sólido foi separado por filtração e o filtrado, concentrado. O resíduo foi dissolvido em CH2Cl2 e filtrado através de um plug de sílica gel plug e eluído com CH2Cl2 para remover a cor. As frações apropriadas foram concentradas e o sólido resultante foi triturado com EtOAc 10%/PE para fornecer um sólido branco do composto do título (9,00 g, 89% de rendimento). Exemplo 2. Síntese de ácido (S)-3-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-(2,5-dioxo- 2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)propanoico
[00179] A uma solução de H-Dap(Boc)-OH(1,00 g, 4,9 mmol) em NaHCO3 saturado (20 mL) a 0ºC, adicionou-se 2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-carboxilato de metila (2,30 g, 14,7 mmol). A reação foi agitada a 0ºC
225 / 439 por 1 hora, então aquecida até a temperatura ambiente e agitada por outra hora. Em seguida, KHSO4 1N foi adicionado para ajustar o pH até ~6 e a mistura resultante foi extraída com EtOAc (2 × 50mL). As camadas orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4, filtradas e concentradas para fornecer o composto do título (0,42 g, 30% de rendimento). ESI m/z calculado para C12H15N2O6 [M-H]-: 283,10; encontrado 283,10. Exemplo 3. Síntese de (2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)etil)carbamato de terc-butila
[00180] Uma mistura de N-Boc-etilenodiamina (5,6 mL, 35,4 mmol, 1,1 eq.) e NaHCO3 saturado (60 mL) foi resfriada até 0ºC, à qual, 2,5-dioxo- 2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-carboxilato de metila (5,00 g, 32,2 mmol, 1,0 eq.) foi adicionado de porção em porção. Após agitação a 0ºC por 30 minutos, a reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 1 hora. O precipitado foi coletado por filtração e lavado com água fria, a seguir, dissolvido em EtOAc e lavado com salmoura, seco com Na2SO4 anidro e concentrado para fornecer o composto do título como sólido branco (6,69 g, 87% de rendimento). Exemplo 4. Síntese de (2-(1,3-dioxo-3a,4,7,7a-tetrahidro-1H-4,7-epoxi- isoindol-2(3H)-il)etil)carbamato de terc-butila
[00181] Uma solução de (2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)etil)carbamato de terc-butila (6,00 g, 25,0 mmol), furano (18,0 mL) em tolueno (120 mL) em um tubo de alta pressão foi aquecida ao refluxo e agitada por 16 horas. A solução incolor ficou amarela durante a reação. A mistura foi então resfriada até a temperatura ambiente e concentrada. O sólido
226 / 439 branco resultante foi triturado com éter etílico para fornecer o composto do título (6,5 g, 84% de rendimento). Exemplo 5. Síntese de cloridrato de 2-(2-aminoetil)-3a,4,7,7a-tetrahidro-1H- 4,7-epoxi-isoindol-1,3(2H)-diona
O NH2.HCl
N O O
[00182] Uma solução de (2-(1,3-dioxo-3a,4,7,7a-tetrahidro-1H-4,7- epoxi-isoindol-2(3H)-il)etil)carbamato de terc-butila (9.,93 g, 32,2 mmol) foi dissolvida em dioxano (15 mL) e tratada com HCl concentrado (15 mL) à temperatura ambiente por 3 horas. A reação foi concentrada e o sólido resultante foi coletado por filtração e lavagem do bolo filtrado com EtOAc. O sólido foi seco em um forno (50ºC) durante a noite para fornecer o composto do título (6,94 g, 88% de rendimento). Exemplo 6. Síntese de 2,8-dioxo-1,5-oxazocane-5-carboxilato de terc-butila
[00183] A uma solução de ácido 3,3'-azanodi-ildipropanoico (10,00 g, 62,08 mmol) em NaOH 1,0 M (300 mL) a 4ºC, adicionou-se dicarbonato de di-terc-butila (22,10 g, 101,3 mmol) em 200 mL de THF em 1 hora. Após a adição, a mistura foi mantida sob agitação por 2 horas a 4ºC. A mistura foi cuidadosamente acidificada para pH ~4 com H3PO4 0,2 M concentrado a vácuo, extraída com CH2Cl2, seco com Na2SO4, evaporada e purificada por cromatografia flash em SiO2, eluindo com AcOH/MeOH/CH2Cl2 (0,01:1:5) para fornecer ácido 3,3'-((terc-butoxicarbonil)azanodi-il)dipropanoico (13,62 g, 84% de rendimento). ESI MS m/z C11H19NO6 [M+H] +, calculado 262,27; encontrado 262,40.
[00184] A uma solução de ácido 3,3'-((terc-butoxicarbonil)azanodi- il)dipropanoico (8,0 g, 30,6 mmol) em CH2Cl2 (500 mL) a 0ºC, adicionou-se
227 / 439 pentóxido de fósforo (8,70 g, 61,30 mmol). A mistura foi agitada a 0ºC por 2 horas e, a seguir, à temperatura ambiente por 1 hora, filtrada através de coluna curta de SiO2 e enxaguada da coluna com EtOAc/CH2Cl2 (1:6). O filtrado foi concentrado e triturado com EtOAc/hexano para fornecer o composto do título (5,64 g, 74% de rendimento). ESI MS m/z C11H17NO5 [M+H] +, calculado 244,11; encontrado 244,30. Exemplo 7. Síntese de 3-(2-(2-(2-(tosiloxi)etoxi)etoxi)etoxi)propanoato de terc-butila
[00185] Uma solução de 3-(2-(2-(2- hidroxietoxi)etoxi)etoxi)propanoato de terc-butila (10,0 g, 35,95 mmol) em acetonitrila (50,0 mL) foi tratada com piridina (20,0 mL). Uma solução de cloreto de tosila (7,12 g, 37,3 mmol) em 50 mL de acetonitrila foi adicionada gota a gota através de um funil de adição durante 30 minutos. Depois de 5 horas, a análise por TLC revelou que a reação estava completa. O cloridrato de piridina que havia se formado foi filtrado e o solvente, removido. O resíduo foi purificado em sílica gel, eluindo com acetato de etila de 20% em hexano até acetato de etila puro para fornecer 11,2 g (76% de rendimento) do composto do título. RMN 1H: 1,40 (s, 9H), 2,40 (s, 3H), 2,45 (t, 2H, J=6,4 Hz), 3.52-3,68 (m, 14H), 4,11 (t, 2H, J=4,8 Hz), 7,30 (d, 2H, J=8,0 Hz), 7,75 (d, 2H, J=8,0 Hz); ESI MS m/z+ C20H33O8S (M+H), calculado 433,18; encontrado 433,30. Exemplo 8. Síntese de 3-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)propanoato de terc- butila
[00186] A 50 mL de DMF, adicionou-se 3-(2-(2-(2- (tosiloxi)etoxi)etoxi)etoxi)-propanoato de terc-butila (4,0 g, 9,25 mmol) e azida sódica (0,737 g, 11,3 mmol) com agitação. A reação foi aquecida até
228 / 439 80ºC. Depois de 4 horas, a análise por TLC revelou que a reação estava completa. A reação foi resfriada até a temperatura ambiente e interrompida com água (25 mL). A camada aquosa foi separada e extraída para acetato de etila (3 x 35 mL). As camadas orgânicas combinadas foram secas com sulfato de magnésio anidro, filtradas, e o solvente removido a vácuo. O produto de azida bruto (2,24 g, 98% de rendimento, aproximadamente 93% puro por HPLC) foi usado para a etapa seguinte sem purificação adicional. RMN 1H (CDCl3): 1,40 (s, 9H), 2,45 (t, 2H, J=6,4 Hz), 3,33 (t, 2H, J=5,2 Hz), 3,53- 3,66 (m, 12H), ESI MS m/z+ C13H26N3O8 (M+H), calculado 304,18; encontrado 304,20. Exemplo 9. Síntese de ácido 3-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)propanoico Dioxano
[00187] A 3-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)propanoato de terc-butila (2,20 g, 7,25 mmol) em 1,4-dioxano (40 mL), foi adicionado HCl (12 M, 10 mL). A mistura foi agitada por 40 minutos, diluída com dioxano (20 mL) e tolueno (40 mL), evaporada e co-evaporada com dioxano (20 mL) e tolueno (40 mL) até a secura para fornecer o produto do título bruto para a etapa seguinte sem produção adicional (1,88g, 105% de rendimento, ~92% puro por HPLC). MS ESI m/z calculado para C9H18N3O5 [M+H]+ 248,12; encontrado 248,40. Exemplo 10. Síntese de éster terc-butílico do ácido 13-amino-4,7,10- trioxadodecanoico e éster terc-butílico do ácido 13-amino-bis(4,7,10- trioxadodecanoico)
[00188] O material bruto de azida, ácido 3-(2-(2-(2- azidoetoxi)etoxi)etoxi)propanoico (5,0 g, ~14,84 mmol) foi dissolvido em etanol (80 mL) e 300 mg de 10% Pd/C 10% foram adicionados. O sistema foi
229 / 439 esvaziado sob vácuo e colocado sob 2 atm. de gás hidrogênio via reator de hidrogenação com agitação vigorosa. A reação foi então agitada durante a noite à temperatura ambiente e TLC mostrou que os materiais de partida desapareceram. A reação bruta foi passada através de uma camada curta de Celite, enxaguando com etanol. O solvente foi removido e a amina purificada em sílica gel usando uma mistura de metanol (de 5% para 15%) e trietilamina 1% em cloreto de metileno, como o eluente, para fornecer éster terc-butílico do ácido 13-amino-4,7,10-trioxadodecanoico (1,83 g, 44% de rendimento, ESI MS m/z+ C13H27NO5 (M+H), calculado 278,19; encontrado 278,30) e éster terc-butílico do ácido 13-amino-bis(4,7,10-trioxadodecanoico) (2,58 g, 32% de rendimento, ESI MS m/z+ C26H52NO10 (M+H), calculado 538,35; encontrado 538,40). Exemplo 11. Síntese de ácido 3-(2-(2-(2-Aminoetoxi)etoxi)etoxi)propanoico, sal HCl
[00189] Ao éster terc-butílico do ácido 13-amino-4,7,10- trioxadodecanoico (0,80 g, 2,89 mmol) em 30 mL de dioxano, foi [sic] 10 mL de HCl (36%) com agitação. Depois de 0,5 hora, a análise por TLC revelou que a reação estava completa, a mistura de reação foi evaporada, e co- evaporada com EtOH e EtOH/Tolueno para formar o produto do título em sal HCl (>90% puro, 0,640 g, 86% de rendimento) sem purificação adicional. ESI MS m/z+ C9H20NO5 (M+H), calculado 222,12; encontrado 222,20. Exemplo 12. Ácido 13-amino-bis(4,7,10-trioxadodecanoico, sal HCl
[00190] Ao éster terc-butílico do ácido 13-amino-bis(4,7,10- trioxadodecanoico) (1,00 g, 1,85 mmol) em 30 mL de dioxano, foi [sic] 10
230 / 439 mL de HCl (36%) com agitação. Depois de 0,5 hora, a análise por TLC revelou que a reação estava completa, a mistura de reação foi evaporada, e co- evaporada com EtOH e EtOH/Tolueno para formar o produto do título em sal HCl (>90% puro, 0,71 g, 91% de rendimento) sem purificação adicional. ESI MS m/z+ C18H36NO10 (M+H), calculado 426,22; encontrado 426,20. Exemplo 13. Síntese de 3-(2-(2-(2-hidroxietoxi)etoxi)etoxi) propanoato de terc-butila
[00191] A uma solução de 2,2’-(etano-1,2-di-ilbis(oxi))dietanol (55,0 mL, 410,75 mmol, 3,0 eq.) em THF anidro (200 mL), adicionou-se sódio (0,1 g). A mistura foi agitada até Na desaparecesse e, a seguir, acrilato de terc- butila (20,0 mL, 137,79 mmol, 1,0 eq.) foi adicionado gota a gota. A mistura foi agitada durante a noite e então interrompida por solução de HCl (20,0 mL, 1N) a 0ºC. THF foi removido por evaporação rotativa, adicionou-se salmoura (300 mL) e a mistura resultante foi extraída com EtOAc (3 × 100 mL). As camadas orgânicas foram lavadas com salmoura (3 × 300 mL), secas com Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas para fornecer um óleo incolor (30,20 g, 79,0% de rendimento), que foi usado sem purificação adicional. MS ESI m/z calculado para C13H27O6 [M + H]+ 278,1729; encontrado 278,1730. Exemplo 14. Síntese de 3-(2-(2-(2-(tosiloxi)etoxi)etoxi)etoxi) propanoato de terc-butila
[00192] A uma solução de 3-(2-(2-(2-hidroxietoxi)etoxi)etoxi) propanoato de terc-butila (30,20 g, 108,5 mmol, 1,0 eq.) e TsCl (41,37 g, 217,0 mmol, 2,0 eq.) em DCM anidro (220 mL) a 0ºC, adicionou-se TEA (30,0 mL, 217,0 mmol, 2,0 eq.). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite e, a seguir, lavada com água (3 × 300 mL) e salmoura (300 mL), seca com Na2SO4 anidro, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia em coluna de SiO2 (3:1 hexanos/ EtOAc) para fornecer um óleo
231 / 439 incolor (39,4 g, 84,0% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C20H33O8S [M + H]+ 433,1818; encontrado 433,2838. Exemplo 15. Síntese de 3-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi) propanoato de terc- butila
[00193] A uma solução de 3-(2-(2-(2-(tosiloxi)etoxi)etoxi)etoxi) propanoato de terc-butila (39,4 g, 91,1 mmol, 1,0 eq.) em DMF anidro (100 mL), adicionou-se NaN3 (20,67 g, 316,6 mmol, 3,5 eq.). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. Água (500 mL) foi adicionada e extraída com EtOAc (3 × 300 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (3 × 900 mL) e salmoura (900 mL), secas com Na2SO4 anidro, filtradas, concentradas e purificadas por cromatografia em coluna de SiO2 (hexanos/EtOAc 5:1) para fornecer um óleo amarelo claro (23,8 g, 85,53% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C13H25O3N5Na [M + Na]+ 326,2; encontrado 326,2. Exemplo 16. Síntese de 3-(2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etoxi) propanoato de terc-butila
[00194] Ni de Raney (7,5 g, suspenso em água) foi lavado com água (três vezes) e álcool isopropílico (três vezes) e misturado com 3-(2-(2-(2- azidoetoxi)etoxi)etoxi)propanoato de terc-butila (5,0 g, 16,5 mmol) em álcool isopropílico. A mistura foi agitada sob um balão de H2 à temperatura ambiente por 16 horas e então filtrada sobre uma camada de Celite, sendo a camada lavada com álcool isopropílico. O filtrado foi concentrado e purificado por cromatografia em coluna (MeOH 5-25%/DCM) para fornecer um óleo amarelo claro (2,60 g, 57% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C13H28NO5 [M+H]+ 279,19; encontrado 279,19. Exemplo 17. Síntese de 2-(2-(dibenzilamino)etoxi)etanol
232 / 439
[00195] 2-(2-aminoetoxi)etanol (21,00 g, 200 mmol, 1,0 eq.) e K2CO3 (83,00 g, 600 mmol, 3,0 eq.) em acetonitrila (350 mL) foi adicionado a BnBr (57,0 mL, 480 mmol, 2,4 eq.). A mistura foi submetida ao refluxo durante a noite. Água (1 L) foi adicionada e extraída com EtOAc (3 × 300 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (1000 mL), secas com Na2SO4 anidro, filtradas, concentradas e purificada por cromatografia em coluna de SiO2 (hexanos/ EtOAc 4:1) para fornecer um óleo incolor (50,97 g, 89,2% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C18H23NO2Na [M + Na]+ 309,1729; encontrado 309,1967. Exemplo 18. Síntese de 3-(2-(2-(dibenzilamino)etoxi)etoxi) propanoato de terc-butila
[00196] A uma mistura de 2-(2-(dibenzilamino)etoxi)etanol (47,17 g, 165,3 mmol, 1,0 eq.), acrilato de terc-butila (72,0 mL, 495,9 mmol, 3,0 eq.) e n-Bu4NI (6,10 g, 16,53 mmol, 0,1 eq.) em DCM (560 mL), adicionou-se solução de hidróxido de sódio (300 mL, 50%). A mistura foi agitada durante a noite. A camada orgânica foi separada e a camada aquosa, extraída com EtOAc (3 × 100 mL). As camadas orgânicas foram lavadas com água (3 × 300 mL) e salmoura (300 mL), secas com Na2SO4 anidro, filtradas, concentradas e purificada por cromatografia em coluna de SiO2 (hexanos/EtOAc 7:1) para fornecer um óleo incolor (61,08 g, 89,4% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C25H36NO4 [M + H]+ 414,2566; encontrado 414,2384. Exemplo 19. Síntese de 3-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)propanoato de terc-butila
[00197] A uma solução de 3-(2-(2- (dibenzilamino)etoxi)etoxi)propanoato de terc-butila (20,00 g, 48,36 mmol, 1,0 eq.) em THF (30 mL) e MeOH (60 mL), adicionou-se Pd/C (2,00 g, 10% em peso, 50% úmido) em um frasco de hidrogenação. A mistura foi agitada
233 / 439 com 1 atmosfera de pressão de H2 durante a noite, filtrada através de Celite (auxiliar de filtração), e o filtrado foi concentrado para fornecer um óleo incolor (10,58 g, 93,8% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C11H24NO4 [M + H]+ 234,1627; encontrado 234,1810. Exemplo 20. Síntese de 3-(2-(2-hidroxietoxi)etoxi)propanoato de terc-butila
[00198] A uma solução de 2,2'-oxidietanol (19,7 mL, 206,7 mmol, 3,0 eq.) em THF anidro (100 mL), adicionou-se sódio (0,1 g). A mistura foi agitada até que Na desaparecesse e, a seguir, acrilato de terc-butila (10,0 mL, 68,9 mmol, 1,0 eq.) foi adicionado gota a gota. A mistura foi agitada durante a noite, e salmoura (200 mL) foi adicionado e extraído com EtOAc (3 × 100 mL). As camadas orgânicas foram lavadas com salmoura (3 × 300 mL), secas com Na2SO4 anidro, filtradas, concentradas e purificadas por cromatografia em coluna de SiO2 (hexanos/EtOAc 1:1) para fornecer um óleo incolor (8,10 g, 49,4% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C11H23O5 [M +H]+ 235,1467; encontrado 235,1667. Exemplo 21. Síntese de 3-(2-(2-(tosiloxi)etoxi)etoxi)propanoato de terc-butila
[00199] A uma solução de 3-(2-(2-hidroxietoxi)etoxi)propanoato de terc-butila (6,24 g, 26,63 mmol, 1,0 eq.) e TsCl (10,15 g, 53,27 mmol, 2,0 eq.) em DCM anidro(50 mL) a 0ºC, adicionou-se piridina (4,3 mL, 53,27 mmol, 2,0 eq.). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite e, a seguir, lavada com água (100 mL) e a camada aquosa extraída com DCM (3 × 50 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (300 mL), secas com Na2SO4 anidro, filtradas, concentradas e purificadas por cromatografia em coluna de SiO2 (hexanos/EtOAc 5:1) para fornecer um óleo incolor (6,33 g, 61,3% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C18H27O7S [M + H]+ 389,1556; encontrado 389,2809. Exemplo 22. Síntese de 3-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)propanoato de terc-butila
234 / 439
[00200] A uma solução de 3-(2-(2-(tosiloxi)etoxi)etoxi)propanoato de terc-butila (5,80 g, 14,93 mmol, 1,0 eq.) em DMF anidro (20 mL), adicionou- se NaN3 (5,02 g, 77,22 mmol, 5,0 eq.). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. Água (120 mL) foi adicionada e extraída com EtOAc (3 × 50 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (3 × 150 mL) e salmoura (150 mL), secas com Na2SO4 anidro, filtradas, concentradas e purificadas por cromatografia em coluna de SiO2 (hexanos/EtOAc 5:1) para fornecer um óleo incolor (3,73 g, 69,6% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C11H22O3N4Na [M + H]+ 260,1532; encontrado 260,2259. Exemplo 23. Síntese de 3-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)propanoato de terc-butila
[00201] 3-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)propanoato de terc-butila (0,18 g, 0,69 mmol) foi dissolvido em MeOH (3,0 mL, com 60 µL de HCl concentrado) e hidrogenado com Pd/C (10% em peso, 20 mg) sob um balão de H2 por 30 minutos. O catalisador foi filtrado através de uma camada de Celite, sendo a camada lavada com MeOH. O filtrado foi concentrado para fornecer um óleo incolor (0,15 g, 93% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C11H24NO4 [M+H]+ 234,16; encontrado 234,14. Exemplo 24. Síntese de ácido 3-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)propanoico
[00202] 3-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)propanoato de terc-butila (2,51 g, 9,68 mmol) dissolvido em 1,4-dioxano (30 mL) foi tratado com 10 mL de HCl (conc.) à temperatura ambiente A mistura foi agitada por 35 minutos, diluída com EtOH (30 mL) e tolueno (30 mL) e concentrada sob vácuo. A mistura bruta foi purificada em sílica gel usando uma mistura de metanol (de 5% para 10%) e ácido fórmico 1% em cloreto de metileno como o eluente para fornecer o composto do título (1,63 g, 83% de rendimento), ESI MS m/z
235 / 439 C7H12N3O4 [M-H]-, calculado 202,06; encontrado 202,30. Exemplo 25. Síntese de 3-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)propanoato de 2,5- dioxopirrolidin-1-ila
[00203] Ao ácido 3-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)propanoico (1,60 g, 7,87 mmol) em 30 mL de diclorometano, adicionou-se NHS (1,08 g, 9,39 mmol) e EDC (3,60 g, 18,75 mmol) com agitação. Depois de 8 horas, a análise por TLC revelou que a reação estava completa, a mistura de reação foi concentrada e purificada em sílica gel usando uma mistura de acetato de etila (de 5% para 10%) em cloreto de metileno como o eluente para fornecer o composto do título (1,93 g, 82% de rendimento). ESI MS m/z C11H17N4O6 [M+H]+, calculado301,11; encontrado 301,20. Exemplo 26. Síntese de 3-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi) propanoato de 2,5- dioxopirrolidin-1-ila
[00204] Ao 3-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)propanoico (4,50 g, 18,21 mmol) em 80 mL de diclorometano, adicionou-se NHS (3,0 g, 26,08 mmol) e EDC (7,60 g, 39,58 mmol) com agitação. Depois de 8 horas, a análise por TLC revelou que a reação estava completa, a mistura de reação foi concentrada e purificada em sílica gel usando uma mistura de acetato de etila (de 5% para 10%) em cloreto de metileno como o eluente para fornecer o composto do título (5,38 g, 86% de rendimento). ESI MS m/z C13H20N4O7 [M+H]+, calculado 345,13; encontrado 345,30. Exemplo 27. Síntese de ácido (14S,17S)-1-azido-17-(2-(terc-butoxi)-2- oxoetil)-14-(4-((terc-butoxicarbonil)-amino)butil)-12,15-dioxo-3,6,9-trioxa- 13,16-diazaoctadecan-18-oico
236 / 439
[00205] A uma solução de ácido (S)-2-((S)-2-amino-6-((terc- butoxicarbonil)amino)hexanamido)-4-(terc-butoxi)-4-oxobutanoico (2,81 g, 6,73 mmol) na mistura de DMA (70 mL) e NaH2PO4 0,1 M (50 mL, pH 7,5), adicionou-se 3-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)-etoxi)propanoato de2,5- dioxopirrolidin-1-ila (3,50 g, 10,17). A mistura foi agitada por 4 horas, evaporada a vácuo, purificada em sílica gel usando uma mistura de metanol (de 5% para 15%) em cloreto de metileno contendo ácido acético 0,5% como o eluente para fornecer o composto do título (3,35 g, 77% de rendimento). ESI MS m/z C28H51N6O11 [M+H]+, calculado 647,35; encontrado 647,80. Exemplo 28. Síntese de 1-azido-14-(4-((terc-butoxicarbonil)-amino)butil)-17- ((4-(hidroximetil)fenil)carbamoil)-12,15-dioxo-3,6,9-trioxa-13,16- diazanonadecan-19-oato de (14S,17S)-terc-butila
[00206] Ao ácido (14S,17S)-1-azido-17-(2-(terc-butoxi)-2-oxoetil)-14- (4-((terc-butoxicarbonil)-amino)butil)-12,15-dioxo-3,6,9-trioxa-13,16- diazaoctadecan-18-oico (3,30 g, 5,10 mmol) e (4-aminofenil)metanol (0,75 g, 6,09) em DMA (25 mL), adicionou-se EDC (2,30 g, 11,97 mmol). A mistura foi agitada por durante a noite, evaporada a vácuo, purificada em sílica gel usando uma mistura de metanol (de 5% para 8%) em cloreto de metileno contendo como o eluente para fornecer o composto do título (3,18 g, 83% de rendimento). ESI MS m/z C35H58N7O11 [M+H]+, calculado752,41; encontrado 752,85. Exemplo 29. Síntese de (14S,17S)-terc-butil 1-amino-14-(4-((terc- butoxicarbonil)-amino)butil)-17-((4-(hidroximetil)fenil)carbamoil)-12,15- dioxo-3,6,9-trioxa-13,16-diazanonadecan-19-oato de (14S,17S)-terc-butila
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[00207] A uma solução de 1-azido-14-(4-((terc- butoxicarbonil)amino)butil)-17-((4-(hidroximetil)fenil)carbamoil)-12,15- dioxo-3,6,9-trioxa-13,16-diazanonadecan-19-oato de (14S,17S)-terc-butila (1,50 g, 1,99 mmol) em THF (35 mL), adicionou-se Pd/C (200 mg, 10% Pd, 50% úmido) em um frasco de hidrogenação. A mistura foi agitada com 1 atmosfera de pressão de H2 durante a noite, filtrada através de Celite (auxiliar de filtração), e o filtrado foi concentrado para fornecer o composto do título (1,43 g, 99% de rendimento) que foi usado imediatamente para a etapa seguinte sem purificação adicional. ESI MS m/z C35H60N5O11 [M+H]+, calculado726,42; encontrado 726,70. Exemplo 30. Síntese de ácido (S)-15-azido-5-isopropil-4,7-dioxo-10,13- dioxa-3,6-diazapentadecan-1-oico
[00208] A uma solução de ácido (S)-2-(2-amino-3- metilbutanamido)acético (Val-Gli) (1,01 g, 5,80 mmol) na mistura de DMA (50 mL) e NaH2PO4 0,1 M (50 mL, pH 7,5), adicionou-se 3-(2-(2- azidoetoxi)etoxi)propanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila (1,90 g, 6,33). A mistura foi agitada por 4 horas, evaporada a vácuo, purificada em sílica gel usando uma mistura de metanol (de 5% para 15%) em cloreto de metileno contendo ácido acético 0,5% como o eluente para fornecer o composto do título (1,52 g, 73% de rendimento). ESI MS m/z C14H26N5O6 [M+H]+, calculado 360,18; encontrado 360,40. Exemplo 31. Síntese de 15-azido-5-isopropil-4,7-dioxo-10,13-dioxa-3,6- diazapentadecan-1-oato de (S)-2,5-dioxopirrolidin-1-ila
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[00209] A uma solução de ácido (S)-15-azido-5-isopropil-4,7-dioxo- 10,13-dioxa-3,6-diazapentadecan-1-oico (1,50 g, 4,17 mmol) em 40 mL de diclorometano, adicionou-se NHS (0,88 g, 7,65 mmol) e EDC (2,60 g, 13,54 mmol) com agitação. Depois de 8 horas, a análise por TLC revelou que a reação estava completa, a mistura de reação foi concentrada e purificada em sílica gel usando uma mistura de acetato de etila (de 5% para 20%) em cloreto de metileno como o eluente para fornecer o composto do título (1,48 g, 78% de rendimento). ESI MS m/z C18H29N6O8 [M+H]+, calculado 457,20; encontrado 457,50. Exemplo 32. Síntese de ácido 4-(((benziloxi)carbonil)amino)butanoico
[00210] Uma solução de ácido 4-aminobutírico (7,5 g, 75 mmol) e NaOH (6 g, 150 mmol) em H2O (40 mL) foi resfriada até 0ºC e tratada com uma solução de CbzCl (16,1 g, 95 mmol) em THF (32 mL) gota a gota. Depois de 1 hora, a reação foi deixada aquecer até a temperatura ambiente e agitada por 3 horas. THF foi removido sob vácuo, o pH da solução aquosa foi ajustada para 1,5 pela adição de HCl 6 N. Extraída com acetato de etila, a camada orgânica foi lavado com salmoura, seca e concentrada para fornecer o composto do título (16,4 g, 92% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C12H16NO5 [M+H]+ 238,10; encontrado 238,08. Exemplo 33. Síntese de 4-(((benziloxi)carbonil)amino)butanoato de terc- butila
[00211] DMAP (0,8 g, 6,56 mmol) e DCC (17,1 g, 83 mmol) foram adicionados a uma solução de ácido 4-(((benziloxi)carbonil)amino)butanoico (16,4 g, 69,2 mmol) e t-BuOH (15,4 g, 208 mmol) em DCM (100 mL). Após agitação à temperatura ambiente durante a noite, a reação foi filtrada e o
239 / 439 filtrado, concentrado. O resíduo foi dissolvido em acetato de etila e lavado com HCl 1N, salmoura e seco com Na2SO4. A concentração e purificação por cromatografia em coluna (EtOAc/hexanos 10 para 50%) resultaram no composto do título (7,5 g, 37% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C16H23NO4Na [M+Na]+ 316,16; encontrado 316,13. Exemplo 34. Síntese de 4-aminobutanoato de terc-butila H2N CO2tBu
[00212] 4-(((benziloxi)carbonil)amino)butanoato de terc-butila (560 mg, 1,91 mmol) foi dissolvido em MeOH (50 mL) e misturado com o catalisador Pd/C (10% em peso, 100 mg), depois hidrogenado (1 atm.) à temperatura ambiente por 3 horas. O catalisador foi filtrado e todos os voláteis foram removidos sob vácuo para fornecer o composto do título (272 mg，90% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C8H18NO2 [M+H]+ 160,13; encontrado 160,13. Exemplo 35. Síntese de 3,3'-(benzilazanodi-il)dipropanoato de di-terc-butila
[00213] Uma mistura de fenilmetanamina (2,0 mL, 18,29 mmol, 1,0 eq.) e acrilato de terc-butila (13,3 mL, 91,46 mmol, 5,0 eq.) foi submetida ao refluxo a 80ºC durante a noite e então concentrada. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna de SiO2 (hexanos/EtOAc 20:1) para fornecer o composto do título como óleo incolor (5,10 g, 77% de rendimento). ESI MS m/z: calculado para C21H34NO4 [M+H]+ 364,2; encontrado 364,2. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,38 – 7,21 (m, 5H), 3,58 (s, 2H), 2,76 (t, J = 7,0 Hz, 4H), 2,38 (t, J = 7,0 Hz, 4H), 1,43 (s, 17H). Exemplo 36. Síntese de 3,3'-azanodi-ildipropanoato de di-terc-butila
[00214] A uma solução de 3,3'-(benzilazanodi-il)dipropanoato de di-
240 / 439 terc-butila (1,37 g, 3,77 mmol, 1,0 equiv.) em MeOH (10 mL), adicionou-se Pd/C (0,20 g, Pd/C 10%, 50% úmido) em um frasco de hidrogenação. A mistura foi agitada durante a noite sob atmosfera de H2 e, a seguir, filtrada através de uma camada de Celite. O filtrado foi concentrado para fornecer o composto do título como óleo incolor (1,22 g, 89% de rendimento). ESI MS m/z: calculado para C14H28NO4 [M+H]+ 274,19; encontrado 274,20. Exemplo 37. Síntese de 4-(2-(((benziloxi)carbonil)amino)propanamido)- butanoato de terc-butila
[00215] A uma solução de 4-aminobutanoato de terc-butila (1,00 g, 6,28 mmol, 1,0 eq.) e Z-L-alanina (2,10 g, 9,42 mmol, 1,5 eq.) em DCM anidro (50 mL) a 0ºC, foram adicionados HATU (3,10 g, 8,164 mmol, 1,3 eq.) e TEA (2,6 mL, 18,8 mmol, 3,0 eq.). A reação foi agitada a 0ºC for 10 minutos, então aquecida até a temperatura ambiente e agitada durante a noite. A mistura foi diluída com DCM e lavada com água e salmoura, seca com Na2SO4 anidro, concentrada e purificada por cromatografia em coluna de SiO2 (éter de petróleo/acetato de etila 10:3) para fornecer o composto do título como um óleo incolor (1,39 g, 61% de rendimento). ESI MS m/z: calculado para C19H29N2O5Na [M+H]+ 387,2; encontrado 387,2. Exemplo 38. Síntese de 4-(2-aminopropanamido)butanoato de terc-butila
[00216] A uma solução de 4-(2- (((benziloxi)carbonil)amino)propanamido)butanoato de terc-butila (1,39 g, 3,808 mmol, 1,0 eq.) em MeOH (12 mL), adicionou-se Pd/C (0,20 g, 10% em peso, 10% úmido) em um frasco de hidrogenação. A mistura foi agitada por 2 horas, então filtrada através de Celite (auxiliar de filtração) e concentrada para fornecer o composto do título como um óleo amarelo claro (0,838 g, 95% de
241 / 439 rendimento). ESI MS m/z: calculado para C11H23N2O3 [M+H]+ 231,16; encontrado 231,15. Exemplo 39. Síntese de ácido 3-(2-(2-(dibenzilamino)etoxi)etoxi)propanoico
[00217] A uma solução de 3-(2-(2- (dibenzilamino)etoxi)etoxi)propanoato de terc-butila (2,3g, 5,59 mmol, 1,0 eq.) em DCM (10 mL) à temperatura ambiente, adicionou-se TFA (5 mL). Após agitação por 90 minutos, a mistura de reação foi diluída com tolueno anidro e concentrada, essa operação foi repetida três vezes para fornecer o composto do título como um óleo amarelo claro (2,0 g, rendimento teórico), que foi usado diretamente na etapa seguinte. ESI MS m/z calculado para C21H28NO4 [M+H]+ 358,19; encontrado 358,19. Exemplo 40. Síntese de 3-(2-(2-(dibenzilamino)etoxi) etoxi)-propanoato de perfluorofenila
[00218] A uma solução de ácido 3-(2-(2- (dibenzilamino)etoxi)etoxi)propanoico (2,00 g, 5,59 mmol, 1,0 eq.) em DCM anidro (30 mL) a 0ºC , adicionou-se DIPEA até que o pH ficasse neutro e, então, PFP (1,54 g, 8,38 mmol, 1,5 eq.) e DIC (1,04 mL, 6,70 mmol, 1,2 eq.) foram adicionados. Após 10 minutos, a reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada durante a noite. A mistura foi filtrada, concentrada e purificada por cromatografia em coluna de SiO2 (éter de petróleo/acetato de etila 15:1) para fornecer o composto do título como óleo incolor (2,10 g, 72% de rendimento). ESI MS m/z: calculado para C27H27F5NO4 [M+H]+ 524,2; encontrado 524,2. Exemplo 41. Síntese de 2-benzil-13-metil-11,14-dioxo-1-fenil -5,8-dioxa- 2,12,15-triazanonadecan-19-oato de terc-butila
242 / 439
[00219] A uma solução de 4-(2-aminopropanamido)butanoato de terc- butila (0,736 g, 3,2 mmol, 1,0 eq.) e 3-(2-(2-(dibenzilamino)etoxi) etoxi)propanoato de perfluorofenila (2,01 g, 3,84 mmol, 1,2 eq.) em DMA anidro (20 mL) a 0ºC, adicionou-se DIPEA (1,7 mL, 9,6mmol, 3,0 eq.). Após agitação a 0ºC por 10 minutos, a reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada durante a noite. Água (100 mL) foi adicionada e a mistura foi extraída com EtOAc (3 × 100 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (3 × 200 mL) e salmoura (200 mL), secas com Na2SO4, filtradas, concentradas e purificada por cromatografia em coluna de SiO2 (DCM/MeOH 25:2) para fornecer o composto do título como um óleo incolor (1,46 g, 80% de rendimento). ESI MS m/z: calculado para C32H48N3O6 [M+H]+ 570,34; encontrado 570,33. Exemplo 42. Síntese de ácido 2-benzil-13-metil-11,14-dioxo-1-fenil-5,8- dioxa -2,12,15-triazanonadecan-19-oico
[00220] A uma solução de 2-benzil-13-metil-11,14-dioxo-1-fenil-5,8- dioxa-2,12,15-triazanonadecan-19-oato de terc-butila (0,057 g, 0,101 mmol, 1,0 eq.) em DCM (3 mL) à temperatura ambiente, adicionou-se TFA (1 mL) e agitou-se por 40 minutos. A reação foi diluída com tolueno anidro e então concentrado. Essa operação foi repetida três vezes para fornecer o composto do título como um óleo incolor (0,052 g, rendimento teórico), que foi usado diretamente na etapa seguinte. ESI MS m/z: calculado para C28H40N3O6 [M+H]+ 514,28; encontrado 514,28. Exemplo 43. Síntese de 2-(2-(((benziloxi)carbonil)amino)propanamido)- acetato de terc-butila
243 / 439
[00221] Ácido 2-(((benziloxi)carbonil)amino)propanoico (0,84 g, 5 mmol), 2-aminoacetato de terc-butila (0,66 g, 5 mmol), HOBt (0,68 g, 5 mmol), EDC (1,44 g, 7,5 mmol) foram dissolvidos em DCM (20mL), seguido pela adição de DIPEA(1,7 mL, 10 mmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, lavada com H2O (100 mL), e a camada aquosa foi extraída com EtOAc. As camadas orgânicas foram combinadas, secas com MgSO4, filtradas, evaporadas sob pressão reduzida e o resíduo foi purificado em coluna de SiO2 para fornecer o produto do título 1(0,87g, 52%). ESI: m/z: calculado para C17H25N2O5 [M+H]+: 337,17; encontrado 337,17. Exemplo 44. Síntese de ácido 2-(2- (((benziloxi)carbonil)amino)propanamido)acético
[00222] 2-(2-(((benziloxi)carbonil)amino)propanamido)acetato de terc- butila (0,25 g, 0,74 mmol) foi dissolvido em DCM (30 mL), seguido pela adição de TFA (10 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, concentrada para fornecer o composto do título que foi usado para a etapa seguinte sem purificação adicional. ESI: m/z: calculado para C13H17N2O5 [M+H]+: 281,11; encontrado 281,60. Exemplo 45. Síntese de 3-(2-(2-(2-hidroxietoxi)etoxi)etoxi)propanoato de terc-butila
O OH O O
HO O HO 3 3 Na/THF O
[00223] A 350 mL de THF anidro, foram adicionados 80 mg (0,0025 mol) de sódio metálico e trietilenoglicol (150,1 g, 1,00 mol) com agitação. Após o sódio ter sido completamente dissolvido, acrilato de terc-butila (24
244 / 439 mL, 0,33 mol) foi adicionado. A solução foi agitada por 20 horas à temperatura ambiente e neutralizada com 8 mL de HCl 1,0 M. O solvente foi removido a vácuo e o resíduo foi suspenso em salmoura (250 mL) e extraído com acetato de etila (3 x 125 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (100 mL), depois água (100 mL), secas com sulfato de sódio, e o solvente foi removido. O óleo incolor resultante foi seco sob vácuo para fornecer 69,78 g (76% de rendimentos) do produto do título. RMN 1H: 1,41 (s, 9H), 2,49 (t, 2H, J=6,4 Hz), 3,59-3,72 (m, 14H). ESI MS m/z- C13H25O6 (M-H), calculado 277,17; encontrado 277,20. Exemplo 46. Síntese de 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-decaoxahentriacontan-31- oato de terc-butila
[00224] NaH (60%, 8,0 g, 200 mmol) foi adicionado a uma solução de 2,5,8,11,14,17,20,23,26- nonaoxaoctacosan-28-ol (42,8 g, 100 mmol) em THF (1,0 L). Após agitação à temperatura ambiente por 30 minutos, 2- bromoacetato de terc-butila (48,8 g, 250 mmol) foi adicionado à mistura e agitado à temperatura ambiente por 1 hora. A mistura foi então vertida em água gelada, extraída com DCM, e a camada orgânica foi lavada com salmoura e seca com Na2SO4 anidro. A purificação por cromatografia em coluna (MeOH:DCM 0% para 5%) forneceu o composto 432 como um óleo amarelo (32 g，59% de rendimento). Exemplo 47. Síntese de ácido 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29- decaoxahentriacontan-31-oico
[00225] 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-decaoxahentriacontan-31-oato de terc-butila (40,0 g, 73,8 mmol) foi dissolvido em DCM (400 mL) e, a seguir, adicionou-se ácido fórmico (600 mL). A solução resultante foi agitada a 25ºC durante a noite. Todos os voláteis foram removidos sob vácuo, o que forneceu
245 / 439 o produto do título como um óleo amarelo (36,0 g，rendimento teórico). ESI m/z calculado para C21H43O12 [M+H]+: 487,27; encontrado 487,24. Exemplo 48. Síntese de cloreto de 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29- decaoxahentriacontan-31-oíla
[00226] À solução de ácido 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29- decaoxahentriacontan-31-oico (36,0 g, 73,8 mmol) dissolvido em DCM (640 mL), foram adicionados (COCl)2 (100 mL) e DMF (52 g, 0,74 mmol). A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente por 4 horas. Todos os voláteis foram removidos sob vácuo para fornecer o produto do título como um óleo amarelo. Exemplo 49. Síntese de ácido (S)-37-(((benziloxi)carbonil)amino)-31-oxo- 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-decaoxa-32-azaoctatriacontan-38-oico
[00227] Z-L-Lys-OH (41,4 g, 147,6 mmol), Na2CO3 (23,4 g, 221,4 mmol) e NaOH (5,9 g, 147,6 mmol) foram dissolvidos em água (720 mL). A mistura foi resfriada até 0ºC e, uma solução de cloreto de 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-decaoxahentriacontan-31-oíla (37,2 g, 73,8 mmol) em THF (20 mL) foi adicionada. A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora. THF foi removido sob vácuo e adicionou-se HCl concentrado à solução aquosa até que o pH atingisse 3 sob resfriamento com gelo. Após extração com DCM, a camada orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2SO4 e concentrada para fornecer o produto do título como um óleo amarelo (55 g，99% de rendimento). ESI m/z calculado para C35H60N2O15 [M+H]+: 749,40; encontrado 749,39. Exemplo 50. Síntese de 13-(2-(((benziloxi)carbonil)amino)-5-(terc-butoxi)-5- oxopentanamido)tridecanoato(S)-terc-butila
246 / 439
[00228] À solução de ácido (S)-2-(((benziloxi)carbonil)amino)-5-(terc- butoxi)-5-oxopentanoico（3,50 g, 10,38 mmol）e 13-aminotridecanoato de terc-butila (3,00 g, 10,51 mmol) em DMF (70 mL), adicionou-se EDC (10,00 g, 52,08 mmol) e TEA (1,60 mL, 11,16 mmol). A reação foi agitada à temperatura ambiente por 8 horas, concentrada a vácuo, diluída com água saturada com NaCl (80 mL) e EtOAc (100 mL), separado. A camada aquosa foi extraída com EtOAc (50 mL×3) e as fases orgânicas combinadas foram lavadas uma vez com 100 mL de salmoura saturada, depois secas com Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de SiO2 (EtOAc /DCM, 1:15) para fornecer o composto do título (5,45 g, 87% de rendimento), ESI: m/z: calculado para C34H57N2O7 [M+H]+: 605,41; encontrado 605,38. Exemplo 51. Síntese de 13-(2-amino-5-(terc-butoxi)-5- oxopentanamido)tridecanoato de (S)-terc-butila
[00229] A uma solução de 13-(2-(((benziloxi)carbonil)amino)-5-(terc- butoxi)-5-oxopentanamido)tridecanoato de (S)-terc-butila (2,80 g, 4,63 mmol) em DMA (100 mL), adicionou-se Pd/C 10% (0,41 g), a mistura foi agitada sob atmosfera de hidrogênio à temperatura ambiente por 18 horas. Em seguida, o Pd/C foi removido por filtração através de celite e o leito filtrante foi lavado com DMA. O filtrado foi concentrado para fornecer o produto como espuma amarela, o qual foi usado na etapa seguinte sem purificação adicional (2,19 g, 101% de rendimento). ESI: m/z: calculado para C26H51N2O5[M+H]+: 471,37; encontrado 471,80. Exemplo 52. Síntese de ácido 2,2-dimetil-4,17-dioxo-3,7,10,13,20,23,26- heptaoxa-16-azanonacosan-29-oico
247 / 439
[00230] A uma solução de 3-(2-(2-(2- aminoetoxi)etoxi)etoxi)propanoato de terc-butila (6,00 g, 21,64 mmol) e ácido 3,3'-((oxibis(etano-2,1-di-il))bis(oxi))dipropanoico (21,01 g, 84,00 mmol) em DMA (200 mL), foram adicionados EDC (18,00 g, 93,75 mmol) e DIPEA (5,00 g, 38,75 mmol). A mistura foi agitada durante a noite, depois concentrada e purificada por cromatografia em coluna de SiO2 (MeOH:CH2Cl2 = 1:12 para 1:5) para fornecer o composto do título como um óleo branco (9,15 g, 86% de rendimento). ESI m/z: calculado para C23H44NO11 [M+H]+: 510,28; encontrado: 510,55. Exemplo 53. Síntese de 14,26-dioxo-4,7,10,17,20,23,30,33,36-nonaoxa- 13,27-diazanonatriacontano-1,39-dioato de 1-benzil-39-terc-butila
O O H O
N BnO O 3 N O 3 O O H O 3
[00231] A uma solução de 13-(2-amino-5-(terc-butoxi)-5- oxopentanamido)tridecanoato de (S)-terc-butila (5,11 g, 10,03 mmol) e 3-(2- (2-(2-aminoetoxi)etoxi)etoxi)propanoato de benzila (3,21 g, 10,31 mmol) em DMA (100 mL), foram adicionados EDC (8,02 g, 41,77 mmol) e DIPEA (3,00 g, 23,25 mmol). A mistura foi agitada durante a noite, depois concentrada e purificada por cromatografia em coluna de SiO2 (EtOAc:CH2Cl2 = 1:8 para 1:3) para fornecer o composto do título como um óleo branco (7,01 g, 87% de rendimento). ESI m/z: calculado para C39H67N2O15 [M+H]+: 803,44; encontrado: 803,80. Exemplo 54. Síntese de ácido 3,16,28-trioxo-1-fenil- 2,6,9,12,19,22,25,32,35,38-decaoxa-15,29-diazahentetracontan-41-oico
[00232] 14,26-dioxo-4,7,10,17,20,23,30,33,36-nonaoxa-13,27-
248 / 439 diazanonatriacontano-1,39-dioato de 1-benzil 39-terc-butila (6,90 g, 8,60 mmol) foi dissolvido em HCOOH (50 mL) e agitado a 0-4ºC por 1 hora. A mistura de reação foi diluída com tolueno (50 mL), concentrada e co- evaporada com tolueno duas vezes, e o resíduo foi colocado em uma bomba a vácuo até o composto do título (6,45 g, ~101% de rendimento, produto bruto). ESI: m/z: calculado para C35H59N2O15 [M+H]+: 747,38; encontrado 747,50. Exemplo 55. Síntese de 14,26-dioxo-4,7,10,17,20,23,30,33,36-nonaoxa- 13,27-diazanonatriacontano-1,39-dioato de 1-benzil-39-(2,5-dioxopirrolidin- 1-ila)
[00233] A uma solução de ácido 3,16,28-trioxo-1-fenil- 2,6,9,12,19,22,25,32,35,38-decaoxa-15,29-diazahentetracontan-41-oico (4,01 g, 5,37 mmol) e NHS (N-hidroxissuccinimida) (0,68 g, 5,91 mmol) em DMA (100 mL), foram adicionados EDC (1,52 g, 7,92 mmol) e DIPEA (0,50 g, 3,87 mmol). A mistura foi agitada durante a noite, depois concentrada e purificada por cromatografia em coluna de SiO2 (EtOAc:CH2Cl2 = 1:8 para 1:4) para fornecer o composto do título como uma espuma branca (4,17 g, 92% de rendimento). ESI m/z: calculado para C39H62N3O17 [M+H]+: 844,40; encontrado: 844,85. Exemplo 56. Síntese de ácido (S)-47-(((benziloxi)carbonil)amino)- 3,16,28,41-tetraoxo-1-fenil-2,6,9,12,19,22,25,32,35,38-decaoxa-15,29,42- triazaoctatetracontan-48-oico
[00234] A uma solução de ácido (S)-6-amino-2- (((benziloxi)carbonil)amino)hexanoico (1,38 g, 4,92 mmol) em DMA (30 mL) e NaH2PO4 100 mM, tampão pH 7,5 (40 mL), adicionou-se 14,26-dioxo- 4,7,10,17,20,23,30,33,36-nonaoxa-13,27-diazanonatriacontano-1,39-dioato de
249 / 439 1-benzil-39-(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) (4,15 g, 4,92 mmol) em 4 porções durante 2 horas. A mistura foi agitada por 4 horas, depois concentrada e purificada por cromatografia em coluna de SiO2 (MeOH:CH2Cl2 = 1:7 para 1:4) para fornecer o composto do título como uma espuma branca (4,07 g, 82% de rendimento). ESI m/z: calculado para C49H77N4O18 [M+H]+: 1009,51; encontrado: 1009,90. Exemplo 57. Síntese de 45-(((benziloxi)-carbonil)amino)-14,26,39,46- tetraoxo-4,7,10,17,20,23,30,33,36-nonaoxa-13,27,40,47-tetra- azahenpentacontano-1,51-dioato de (S)-1-benzil-51-(2-(trimetilsilil)etila)
[00235] A uma solução de ácido (S)-47-(((benziloxi)carbonil)amino)- 3,16,28,41-tetraoxo-1-fenil-2,6,9,12,19,22,25,32,35,38-decaoxa-15,29,42- triazaoctatetracontan-48-oico (4,00 g, 3,96 mmol) e 4-aminobutanoato de 2- (trimetilsilil)etila (0,90 g, 4,43 mmol) em DMA (25 mL), adicionou-se EDC (2,03 g, 10,57 mmol). A mistura foi agitada por 6 horas, depois concentrada e purificada por cromatografia em coluna de SiO2 (MeOH:CH2Cl2 = 1:15 to 1:8) para fornecer o composto do título como uma espuma branca (3,97 g, 84% de rendimento). ESI m/z: calculado para C58H96N5O19Si [M+H]+: 1194,64; encontrado: 1194,90. Exemplo 58. Síntese de ácido 12-amino-2,2-dimetil-6,11,18,31,43-pentaoxo- 5,21,24,27,34,37,40,47,50,53-decaoxa-10,17,30,44-tetra-aza-2- silahexapentacontan-56-oico.
[00236] A uma solução de 45-(((benziloxi)-carbonil)amino)- 14,26,39,46-tetraoxo-4,7,10,17,20,23,30,33,36-nonaoxa-13,27,40,47-tetra- azahenpentacontano-1,51-dioato de (S)-1-benzil-51-(2-(trimetilsilil)etila)
250 / 439 (3,90 g, 3,33 mmol) em MeOH (40 mL), adicionou-se Pd/C (10% em peso, 0,20 g) em um frasco de hidrogenação. A mistura foi agitada a 40 psi de H2 por 2 horas, filtrado através de Celite (auxiliar de filtração), e o filtrado foi concentrado para fornecer o composto do título (3,16g, 98% de rendimento) que foi usado diretamente para a etapa seguinte sem purificação adicional. ESI: m/z: calculado para C43H83N5O17Si [M+H]+: 970,55; encontrado 970,70. Exemplo 59. Síntese de 4-((3aR,7R,7aS)-1,3-dioxo-3a,4,7,7a-tetrahidro-1H- 4,7-epoxi-isoindol-2(3H)-il)butanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila
[00237] Ácido 4-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)butanoico (10,0 g, 54,62 mmol) e furano (5mL, 68,74 mmol) em éter (90 mL), em um vaso de pressão, foram aquecidos a 170ºC por 6 horas. Em seguida, a solução foi resfriada para a temperatura ambiente, concentrada a vácuo e cristalizada em EtOH/Hexano para fornecer ácido 4-((3aR,7R,7aS)-1,3-dioxo-3a,4,7,7a- tetrahidro-1H-4,7-epoxi-isoindol-2(3H)-il)butanoico (11,24 g, 44,76 mmol, 82% de rendimento). Depois, NHS (7,00 g, 60,86 mmol) e EDC (25,00 g, 130,20 mmol) foram adicionados ao composto ácido produzido novamente dissolvido em CH2Cl2 (100 mL). A mistura foi agitada por 6 horas, a seguir, concentrada e purificada por cromatografia em coluna de SiO2 (EtOAc:CH2Cl2 = 1:8 para 1:5) para fornecer o composto do título como uma espuma branca (13,57 g, 87% de rendimento). ESI m/z: calculado para C16H17N2O7 [M+H]+: 349,09; encontrado: 349,55. Exemplo 60. Síntese de dicloreto de 2,3-bis(2-bromoacetamido)succinila
[00238] Ácido 2,3-diaminossuccínico (5,00 g, 33,77 mmol) na mistura de THF/H2O/DIPEA (125 mL/125 mL/8 mL) foi adicionado a brometo de 2-
251 / 439 bromoacetila (25,0 g, 125,09 mmol). A mistura foi agitada durante a noite, evaporada e purificada por cromatografia em coluna de SiO2 (H2O/CH3CN 5:95) forneceu ácido 2,3-bis(2-bromoacetamido)succínico (9,95 g, 76% de rendimento) como óleo amarelo claro. MS ESI m/z calculado para C8H11Br2N2O6 [M+H]+ 388,89; encontrado 388,68.
[00239] Ácido 2,3-bis(2-bromoacetamido)succínico (3,50 g, 9,02 mmol) em diclorometano (80 mL) foi adicionado a dicloreto de oxalila (5,80 g, 46,05 mmol) e DMF (0,01 mL). A mistura foi agitada por 2,5 horas, diluída com tolueno, concentrada e co-evaporada com dicloroetano (2 x 20 mL) e tolueno (2 x 15 mL) até a secura para fornecer dicloreto de 2,3-bis(2- bromoacetamido)succinila como produto bruto (que não é estável) para a etapa seguinte sem purificação adicional (3,90 g, 102% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C8H9Br2Cl2N2O4 [M+H]+ 424,82; encontrado 424,90. Exemplo 61. Síntese de ácido 2,3-bis(((benziloxi)carbonil)amino)succínico
[00240] A uma solução de ácido 2,3-diaminossuccínico (4,05 g, 27,35 mmol) na mistura de THF (250 mL) e NaH2PO4 (0,1 M, 250 mL, pH 8,0), adicionou-se carbonocloridrato de benzila (15,0 g, 88,23 mmol) em 4 porções durante 2 horas. A mistura foi agitada por outras 6 horas, concentrada e purificada em coluna de SiO2 eluída com H2O/CH3CN (1:9) contendo ácido fórmico 1% para fornecer o composto do título (8,65 g, 76% de rendimento, ~95% puro). MS ESI m/z calculado para C20H21N2O8 [M+H]+ 417,12; encontrado 417,60. Exemplo 62. Síntese de 2,3-bis(((benziloxi)carbonil)-amino)succinato de bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ila)
[00241] A uma solução de ácido 2,3-
252 / 439 bis(((benziloxi)carbonil)amino)succínico (4,25 g, 10,21 mmol) na mistura de DMA (70 mL), adicionou-se NHS (3,60 g, 31,30 mmol) e EDC (7,05 g, 36,72 mmol). A mistura foi agitada por durante a noite, concentrada e purificada em coluna de SiO2 eluída com EtOAc/CH2Cl2 (1:6) para fornecer o composto do título (5,42 g, 87% de rendimento, ~95% puro). MS ESI m/z calculado para C28H27N4O12 [M+H]+ 611,15; encontrado 611,60. Exemplo 63. Síntese de 4,4'-((2,3-bis(((benziloxi)carbonil)amino)- succinyl)bis(azanodi-il))dibutanoato de di-terc-butila
[00242] A uma solução de ácido 2,3- bis(((benziloxi)carbonil)amino)succínico (4,25 g, 10,21 mmol) na mistura de DMA (70 mL), adicionou-se 4-aminobutanoato de terc-butila (3,25 g, 20,42 mmol) e EDC (7,01 g, 36,70 mmol). A mistura foi agitada por durante a noite, concentrada e purificada em coluna de SiO2 eluída com EtOAc/CH2Cl2 (1:10) para fornecer o composto do título (6,56 g, 92% de rendimento, ~95% puro). MS ESI m/z calculado para C36H51N4O10 [M+H]+ 699,35; encontrado 699,55. Exemplo 64. Síntese de 4,4'-((2,3-diaminossuccinil)bis(azanodi-il))- dibutanoato de di-terc-butila
[00243] A uma solução de 4,4'-((2,3-bis(((benziloxi)carbonil)amino)- succinil)bis-(azanodi-il))dibutanoato de di-terc-butila (2,50 g, 3,58 mmol) em MeOH (100 mL), adicionou-se Pd/C 10% (0,30 g, 50% úmido) e a mistura foi agitada sob atmosfera de hidrogênio à temperatura ambiente por 18 horas. Em seguida, o Pd/C foi removido por filtração através de celite e o leito filtrante foi lavado com MeOH(~70 mL). O filtrado foi concentrado para fornecer o
253 / 439 produto como espuma amarela que foi usado na etapa seguinte sem purificação adicional (1,55 g, 101% de rendimento). ESI: m/z: calculado para C20H39N2O6 [M+H]+: 431,28; encontrado 431,40. Exemplo 65. Síntese de 4,4'-((2,3-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)propanamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoato de di-terc-butila
[00244] A uma solução de ácido 3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)propanoico (1,25 g, 7,39 mmol) na mistura de DMA (60 mL), adicionou-se 4,4'-((2,3-diaminossuccinil)bis(azanodi-il))-dibutanoato de di-terc-butila (1,55 g, ~3,58 mmol) e EDC (2,41 g, 12,61 mmol). A mistura foi agitada durante a noite, concentrada e purificada em coluna de SiO2 eluída com EtOAc/CH2Cl2 (1:10) para fornecer o composto do título (2,33 g, 89% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C34H49N6O12 [M+H]+ 733,33; encontrado 733,50. Exemplo 66. Síntese de ácido 4,4'-((2,3-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)propanamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoico
[00245] A uma solução agitada de 4,4'-((2,3-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoato de di- terc-butila (2,30 g, 3,14 mmol) em 1,4-dioxano (20 mL), adicionou-se HCl (36%, 7,0 mL). A mistura foi agitada por 30 minutos, diluída com tolueno (20 mL), concentrada e purificada em coluna de SiO2 eluída com MeOH/CH2Cl2 (1:10 para 1:4) para fornecer o composto do título (1,67 g, 85% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C26H33N6O12 [M+H]+ 621,21;
254 / 439 encontrado 621,55. Exemplo 67. Síntese de 4,4'-((2,3-bis(2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)acetamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoato de di-terc-butila
O O O O H
HN N N t BuO O
O H O O t N N BuO H N
O O
[00246] A uma solução de ácido 2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)acético (1,12 g, 7,22 mmol) na mistura de DMA (60 mL), adicionou-se 4,4'- ((2,3-diaminossuccinil)bis-(azanodi-il))dibutanoato de di-terc-butila (1,55 g, ~3,58 mmol) e EDC (2,40 g, 12,56 mmol). A mistura foi agitada durante a noite, concentrada e purificada em coluna de SiO2 eluída com EtOAc/CH2Cl2 (1:10) para fornecer o composto do título (2,27 g, 90% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C32H45N6O12 [M+H]+ 704,30; encontrado 704,55. Exemplo 68. Síntese de ácido 4,4'-((2,3-bis(2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)acetamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoico
[00247] A uma solução agitada de 4,4'-((2,3-bis(2-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)acetamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoato de di- terc-butila (2,20 g, 3,12 mmol) em 1,4-dioxano (20 mL), adicionou-se HCl (36%, 7,0 mL). A mistura foi agitada por 30 minutos, diluída com tolueno (20 mL), concentrada e purificada em coluna de SiO2 eluída com MeOH/CH2Cl2 (1:10 para 1:4) para fornecer o composto do título (1,67 g, 85% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C24H29N6O12 [M+H]+ 593,18; encontrado 593,50. Exemplo 69. Síntese de 4,4'-((2,3-bis(2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-
255 / 439 il)acetamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoato de bis(2,5-dioxopirrolidin- 1-ila)
[00248] A uma solução de ácido 4,4'-((2,3-bis(2-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)acetamido)-succinil)bis(azanodi-il))dibutanoico (1,10 g, 1,85 mmol) na mistura de DMA (30 mL), adicionou-se NHS (1- hidroxipirrolidina-2,5-diona) (0,55 g, 4,78 mmol) e EDC (1,25 g, 6,54 mmol). A mistura foi agitada durante a noite, concentrada e purificada em coluna de SiO2 eluída com EtOAc/CH2Cl2 (1:10) para fornecer o composto do título (1,28 g, 88% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C32H35N8O16 [M+H]+ 787,21; encontrado 787,50. Exemplo 70. Síntese de ácido 2,3-bis(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)succínico
[00249] Ácido 2,3-diaminossuccínico (5,00 g, 33,77 mmol) na mistura de THF/H2O/DIPEA (125 mL/125 mL/2 mL) foi adicionado a anidrido maleico (6,68 g, 68,21 mmol). A mistura foi agitada durante a noite e evaporada para fornecer ácido 2,3-bis((Z)-3-carboxiacrilamido)succínico (11,05 g, 99% de rendimento) como um sólido branco. MS ESI m/z calculado para C12H13N2O10 [M+H]+ 345,05; encontrado 345,35.
[00250] Ácido 2,3-bis((Z)-3-carboxiacrilamido)succínico (11,05 g, 33,43 mmol) em uma solução de HOAc (70 mL), DMF (10 mL) e tolueno (50 mL) foi adicionado a anidrido acético (30 mL). A mistura foi agitada por 2 horas, submetida ao refluxo com Dean-Stark Trap a 100ºC por 6 horas,
256 / 439 concentrada, co-evaporada com EtOH (2 x 40 mL) e tolueno (2 x 40 mL) e purificada em coluna de SiO2 eluída com H2O/CH3CN (1:10) para fornecer o composto do título (7,90 g, 76% de rendimento, ~95% puro). MS ESI m/z calculado para C12H9N2O8 [M+H]+ 309,03; encontrado 309,30. Exemplo 71. Síntese de 2,3-bis(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)succinato de bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ila)
[00251] A uma solução de ácido 2,3-bis(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)succínico (4,00 g, 12,98 mmol) na mistura de DMF (70 mL), adicionou-se NHS (3,60 g, 31,30 mmol) e EDC (7,05 g, 36,72 mmol). A mistura foi agitada durante a noite, concentrada e purificada em coluna de SiO2 eluída com EtOAc/CH2Cl2 (1:6) para fornecer o composto do título (5,73 g, 88% de rendimento, ~96% puro por HPLC). MS ESI m/z calculado para C20H15N4O12 [M+H]+ 503,06; encontrado 503,45. Exemplo 72. Síntese de 6,39-bis(4-((terc-butoxicarbonil)amino)butil)-22,23- bis(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-3,42-bis((4- (hidroximetil)fenil)carbamoil)-5,8,21,24,37,40-hexaoxo-11,14,17,28,31,34- hexaoxa-4,7,20,25,38,41-hexaazatetratetracontano-1,44-dioato de (3S,6S,39S,42S)-di-terc-butila
[00252] EDC (1,30 g, 6,77 mmol) foi adicionado a 1-amino-14-(4-
257 / 439 ((terc-butoxicarbonil)amino)butil)-17-((4-(hidroximetil)fenil)carbamoil)- 12,15-dioxo-3,6,9-trioxa-13,16-diazanonadecan-19-oato de (14S,17S)-terc- butila (1,43 g, 1,97 mmol) e ácido 2,3-bis(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)succínico (0,30 g, 0,97 mmol) em DMA (25 mL). A mistura foi agitada durante a noite, evaporada a vácuo, purificada em sílica gel usando uma mistura de metanol (de 5% para 8%) em cloreto de metileno, como o eluente, para fornecer o composto do título (1,33 g, 80% de rendimento). ESI MS m/z C82H123N12O28 [M+H]+, calculado1722,85; encontrado 1722,98. Exemplo 73. Síntese de 1-azido-14,17-dimetil-12,15-dioxo-3,6,9-trioxa- 13,16-diazaoctadecan-18-oato de terc-butila
O H tBuO
N O H O O OH NH2 tBuO N N3 N3 O N O 3 3 O H EDC/DMA O
[00253] A uma solução de ácido 3-(2-(2-(2- azidoetoxi)etoxi)etoxi)propanoico (1,55 g, 6,27 mmol), 2-(2- aminopropanamido)propanoato de terc-butila (1,35 g, 6,27 mmol) na mistura de DMA (60 mL), adicionou-se EDC (3,05 g, 15,88 mmol). A mistura foi agitada durante a noite, concentrada e purificada em coluna de SiO2 eluída com EtOAc/CH2Cl2 (1:3) para fornecer o composto do título (2,42 g, 86% de rendimento, ~95% puro por HPLC). MS ESI m/z calculado para C19H36N5O7 [M+H]+ 446,25; encontrado 446,60. Exemplo 74. Síntese de ácido 1-azido-14,17-dimetil-12,15-dioxo-3,6,9-trioxa- 13,16-diazaoctadecan-18-oico Dioxano
[00254] HCl (12 M, 10 mL) foi adicionado a 1-azido-14,17-dimetil- 12,15-dioxo-3,6,9-trioxa-13,16-diazaoctadecan-18-oato de terc-butila (2,20 g, 4,94 mmol) em 1,4-dioxano (40 mL). A mistura foi agitada por 40 minutos, diluída com dioxano (20 mL) e tolueno (40 mL), evaporada e co-evaporada com dioxano (20 mL) e tolueno (40 mL) até a secura para fornecer o produto
258 / 439 do título bruto para a etapa seguinte sem produção adicional (1,92g, 100% de rendimento, ~94% puro por HPLC). MS ESI m/z calculado para C15H28N5O7 [M+H]+ 390,19; encontrado 390,45. Exemplo 75. Síntese de ácido 21,22-bis(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)-2,5,38,41-tetrametil-4,7,20,23,36,39-hexaoxo-10,13,16,27,30,33-hexaoxa- 3,6,19,24,37,40-hexa-azadotetracontano-1,42-dioico
[00255] Pd/C (0,20 g, 50% úmido) foi adicionado a ácido 1-azido- 14,17-dimetil-12,15-dioxo-3,6,9-trioxa-13,16-diazaoctadecan-18-oico (1,90 g, 4,88 mmol) em DMA (40 mL). O sistema foi esvaziado sob vácuo e colocado sob 2 atm. de gás hidrogênio via reator de hidrogenação com agitação vigorosa. A reação foi então agitada por 6 horas à temperatura ambiente e TLC mostrou que os materiais de partida desapareceram. A reação bruta foi passada através de uma camada curta de Celite enxaguando com etanol. O solvente foi concentrado sob pressão reduzida para fornecer o produto bruto, ácido 1-amino-14,17-dimetil-12,15-dioxo-3,6,9-trioxa-13,16-diazaoctadecan- 18-oico em DMA que foi usado para a etapa seguinte diretamente. ESI MS m/z+ C15H30N3O7 (M+H), calculado 364,20; encontrado 364,30.
[00256] Ao composto amino em DMA (~30 mL), adicionou-se NaH2PO4 0,1 M, pH 7,5 (20 mL), seguido pela adição de 2,3-bis(2,5-dioxo- 2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)succinato de bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) (1,30 g, 2,59 mmol). A mistura foi agitada durante a noite, concentrada e purificada em coluna de SiO2 eluída com água 8% em CH3CN para fornecer o composto do título (1,97g, 81% de rendimento). ESI MS m/z+ C42H63N8O20 (M+H), calculado 999,41; encontrado 999,95.
259 / 439 Exemplo 76. Síntese de 21,22-bis(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)- 2,5,38,41-tetrametil-4,7,20,23,36,39-hexaoxo-10,13,16,27,30,33-hexaoxa- 3,6,19,24,37,40-hexa-azadotetracontano-1,42-dioato de bis(2,5- dioxopirrolidin-1-ila)
[00257] A uma solução de ácido 21,22-bis(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)-2,5,38,41-tetrametil-4,7,20,23,36,39-hexaoxo-10,13,16,27,30,33- hexaoxa-3,6,19,24,37,40-hexa-azadotetracontano-1,42-dioico (1,50 g, 1,50 mmol) na mistura de DMA (10 mL), adicionou-se NHS (0,60 g, 5,21 mmol) e EDC (1,95 g, 10,15 mmol). A mistura foi agitada durante a noite, concentrada e purificada em coluna de SiO2 eluída com EtOAc/CH2Cl2 (1:4 para 2:1) para fornecer o composto do título (1,50 g, 83% de rendimento, ~95% puro por HPLC). MS ESI m/z calculado para C50H69N10O24 [M+H]+ 1193,44; encontrado 1193,95. Exemplo 77. Síntese de 2-(hidroximetil)pirrolidina-1-carboxilato de (S)-terc- butila
[00258] Boc-L-prolina (10,0 g, 46,4 mmol) dissolvida em 50 mL de THF foi resfriada até 0ºC, à qual, BH3 em THF (1,0 M, 46,4 mL) foi adicionado cuidadosamente. A mistura foi agitada a 0ºC por 1,5 h, então, vertida em água gelada e extraída com acetato de etila. A camada orgânica foi lavada com salmoura (50 mL), seca com Na2SO4 anidro e concentrada sob pressão reduzida para fornecer o composto do título (8,50 g, 91% de rendimento) como um sólido branco. RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ 3,94 (dd, J = 4,9; 2,7 Hz, 2H), 3,60 (ddd, J = 18,7; 11,9; 9,3 Hz, 2H), 3,49-3,37 (m, 1H), 3,34-3,23 (m, 1H), 2,06-1,91 (m, 1H), 1,89-1,69 (m, 2H), 1,65-1,51 (m,
260 / 439 1H), 1,49-0,40 (m, 9H). Exemplo 78. Síntese de 2-formilpirrolidina-1-carboxilato de (S)-terc-butila
[00259] A uma solução de 2-(hidroximetil)pirrolidina-1-carboxilato de (S)-terc-butila (13,0 g, 64,6 mmol) em dimetilsulfóxido (90 mL), adicionou- se trietilamina (40 mL) e a agitação foi continuada por 15 minutos. A mistura foi resfriada em banho de gelo e o complexo trióxido de enxofre-piridina (35,98 g, 226 mmol) foi adicionado de porção em porção ao longo de um período de 40 minutos. A reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 2,5 h. Após a adição de gelo (250 g), a mistura foi extraída com diclorometano (150 mL × 3). A fase orgânica foi lavada com solução de ácido cítrico 50% (150 mL), água (150 mL), solução saturada de bicarbonato de sódio (150 mL) e salmoura (150 mL), seca com Na2SO4 anidro. A remoção do solvente a vácuo forneceu o aldeído do título (10,4 g, 81% de rendimento) como um óleo denso que foi usado sem purificação adicional. RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ 9,45 (s, 1H), 4,04 (s, 1H), 3,53 (dd, J = 14,4; 8,0 Hz, 2H), 2,00-1,82 (m, 4H), 1,44 (d, J = 22,6 Hz, 9H). Exemplo 79. Síntese de (4R,5S)-4-metil-5-fenil-3-propioniloxazolidin-2-ona
[00260] n-Butil-lítio em hexano (21,6 mL, 2,2 M, 47,43 mmol) foi adicionado gota a gota a -78ºC a uma solução agitada de 4-metil-5- feniloxazolidin-2-ona (8,0 g, 45,17 mmol) em THF (100 mL) sob N2. A solução foi mantida a -78 º por 1 hora, então, cloreto de propionila (4,4 mL, 50,59 mmol) foi adicionado lentamente. The mistura de reação foi aquecida até -50ºC, agitada por 2 horas, então, interrompida pela adição de uma solução saturada de cloreto de amônio (100 mL). O solvente orgânico foi removido a vácuo e a solução resultante foi extraída com acetato de etila (3 ×
261 / 439 100 mL). A camada orgânica foi lavada com solução saturada de bicarbonato de sódio (100 mL) e salmoura (100 mL), seca com Na2SO4, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (acetato de etila 20%/hexanos) para fornecer o composto do título como um óleo denso (10,5 g, 98% de rendimento). RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ 7,45- 7,34 (m, 3H), 7,30 (d, J = 7,0 Hz, 2H), 5,67 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 4,82-4,70 (m, 1H), 2,97 (dd, J = 19,0; 7,4 Hz, 2H), 1,19 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 0,90 (d, J = 6,6 Hz, 3H). Exemplo 80. Síntese de 2-((1R,2R)-1-hidroxi-2-metil-3-((4R,5S)-4-metil-2- oxo-5-feniloxazolidin-3-il)-3-oxopropil)pirrolidina-1-carboxilato de (S)-terc- butila
[00261] A uma solução de (4R,5S)-4-metil-5-fenil-3- propioniloxazolidin-2-ona (9,40 g, 40,4 mmol) em diclorometano (60 mL), adicionou-se Et3N (6,45 mL, 46,64 mmol) a 0ºC, seguido por triflato de dibutil-boro 1M em diclorometano (42 mL, 42 mmol). A mistura foi agitada a 0ºC por 45 minutos, resfriada até -70ºC e, a seguir, 2-formilpirrolidina-1- carboxilato de (S)-terc-butila (4,58 g, 22,97 mmol) em diclorometano (40 mL) foi adicionado lentamente ao longo de um período de 20 minutos. A reação foi agitada a -70ºC por 2 horas, 0ºC por 1 hora e à temperatura ambiente por 15 minutos, depois interrompida com solução tampão fosfato (pH 7, 38 mL). Depois da adição de MeOH 30%-H2O2 (2:1, 100 mL) abaixo de 10ºC e agitação por 20 minutos, adicionou-se água (100 mL) e a mistura foi concentrada a vácuo. Adicionou-se mais água (200 mL) ao resíduo e a mistura foi extraída com acetato de etila (3 × 100 mL). A camada orgânica foi lavada com KHSO4 1N (100 mL), solução de bicarbonato de sódio (100 mL) e salmoura (100 mL), seca com Na2SO4 anidro e concentrada a vácuo. O resíduo foi purificada por cromatografia flash em coluna (acetato de
262 / 439 etila/hexanos 10%-50%) para fornecer o composto do título como um sólido branco (7,10 g, 71% de rendimento). RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ 7,39 (dt, J = 23,4; 7,1 Hz, 3H), 7,30 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 5,67 (d, J = 7,1 Hz, 1H), 4,84- 4,67 (m, 1H), 4,08-3,93 (m, 3H), 3,92-3,84 (m, 1H), 3,50 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 3,24 (d, J = 6,7 Hz, 1H), 2,15 (s, 1H), 1,89 (dd, J = 22,4; 14,8 Hz, 3H), 1,48 (d, J = 21,5 Hz, 9H), 1,33 (d, J = 6,9 Hz, 3H), 0,88 (d, J = 6,4 Hz, 3H). Exemplo 81. Síntese de 2-((1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-((4R,5S)-4-metil-2- oxo-5-feniloxazolidin-3-il)-3-oxopropil)pirrolidina-1-carboxilato de (S)-terc- butila
[00262] A uma mistura de 2-((1R,2R)-1-hidroxi-2-metil-3 -((4R,5S)-4- metil-2-oxo-5-feniloxazolidin-3-il)-3-oxopropil)pirrolidina-1-carboxilato de (S)-terc-butila (5,1 g 11,9 mmol) e peneiras moleculares (4 Å, 5 g), adicionou-se dicloroetano anidro (30 mL) sob N2. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 20 minutos e resfriada até 0ºC. Esponja de prótons (6,62 g, 30,9 mmol) foi adicionada, seguida por tetrafluoroborato de trimetiloxônio (4,40 g, 29,7 mmol). A agitação foi continuada por 2 horas a 0ºC e 48 horas à temperatura ambiente. A mistura de reação foi filtrada e o filtrado, concentrado e purificado por cromatografia em coluna (acetato de etila/hexanos 20-70%) para fornecer o composto do título como um sólido branco (1,80 g, 35% de rendimento). RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ 7,46-7,27 (m, 5H), 5,65 (s, 1H), 4,69 (s, 1H), 3,92 (s, 1H), 3,83 (s, 1H), 3,48 (s, 3H), 3,17 (s, 2H), 2,02-1,68 (m, 5H), 1,48 (d, J = 22,3 Hz, 9H), 1,32 (t, J = 6,0 Hz, 3H), 0,91-0,84 (m, 3H). Exemplo 82. Síntese de ácido (2R,3R)-3-((S)-1-(terc- butoxicarbonil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi -2-metilpropanoico
263 / 439
[00263] A uma solução de 2-((1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3- ((4R,5S)-4- metil-2-oxo-5-feniloxazolidin-3-il)-3-oxopropil)pirrolidina-1-carboxilato de (S)-terc-butila (1,80 g, 4,03 mmol) em THF (30 mL) e H2O (7,5 mL), adicionou-se H2O2 30% (1,44 mL, 14,4 mmol) ao longo de um período de 5 minutos a 0ºC, seguido por uma solução de LiOH (0,27 g, 6,45 mmol) em água (5 mL). Após agitação a 0ºC por 3 horas, adicionou-se sulfito de sódio 1 N (15,7 mL) e a mistura foi deixada aquecer até a temperatura ambiente e agitada durante a noite. THF foi removido a vácuo e a fase aquosa foi lavada com diclorometano (3 × 50 mL) para remover a oxazolidinona auxiliar. A fase aquosa foi acidificada para pH 3 com HCl 1N e extraída com acetato de etila (3 × 50 mL). A camada orgânica foi lavada com salmoura (50 mL), seca com Na2SO4, filtrada e concentrada a vácuo para fornecer o composto do título como um óleo incolor (1,15 g, 98% de rendimento). RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ 3,99-3,74 (m, 2H), 3,44 (d, J = 2,6 Hz, 3H), 3,23 (s, 1H), 2,60-2,45 (m, 1H), 1,92 (tt, J = 56,0; 31,5 Hz, 3H), 1,79-1,69 (m, 1H), 1,58- 1,39 (m, 9H), 1,30-1,24 (m, 3H). Exemplo 83. Síntese de 3-metoxi-2-metil-3-((S)-pirrolidin-2-il)propanoato de (2R,3R)-metila
[00264] A uma solução de ácido (2R,3R)-3-((S)-1-(terc- butoxicarbonil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoico. (0,86g, 2,99 mmol) em MeOH (10 mL), adicionou-se cloreto de tionila (1,08 mL, 14,95 mmol) lentamente a 0ºC. A reação foi então aquecida até a temperatura ambiente e agitada durante a noite. A mistura foi concentrada a vácuo e co- evaporada com tolueno, fornecendo o composto do título (0,71g, 100% de rendimento) como um sólido branco, que foi usado imediatamente para a
264 / 439 etapa seguinte sem purificação adicional. HRMS (ESI) m/z calculado para C10H20NO3 [M+H]+: 202,14; encontrado: 202,14. Exemplo 84. Síntese de 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-5-metil-3-oxo heptanoato de (4S,5S)-etila
[00265] A uma solução gelada de N-Boc-L-isoleucina (4,55 g, 19,67 mmol) em THF (20 mL), adicionou-se 1,1’-carbonildiimidazol (3,51 g, 21,63 mmol). Após encerrada a evolução de gás, a mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente por 3,5 horas.
[00266] Uma solução de recém-preparada de brometo de isopropilmagnésio em THF (123 mmol, 30 mL) foi adicionada gota a gota a uma solução pré-resfriada (0ºC) de hidrogenomalonato de etila (6,50 g, 49,2 mmol) em uma taxa tal que mantivesse a temperatura abaixo de 5ºC. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 1,5 h. Essa solução de enolato de magnésio foi então resfriada em um banho-maria gelado, seguido pela adição gradual da solução de imidazolida ao longo de um período de 1 hora através de uma agulha com extremidade dupla a 0ºC. A mistura resultante foi agitada a 0ºC por 30 minutos, depois à temperatura ambiente por 64 horas. A mistura de reação foi interrompida pela adição de ácido cítrico aquoso 10% (5 mL) e acidificada para pH 3 com ácido cítrico aquoso 10% adicional (110 mL). A mistura foi extraída com acetato de etila (3 × 150 mL). Os extratos orgânicos foram lavados com água (50 mL), hidrogenocarbonato de sódio aquoso saturado (50 mL) e cloreto de sódio aquoso saturado (50 mL), secos com Na2SO4 e concentrados a vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel usando acetato de etila/hexano (1:4) como eluente para fornecer o composto do título (5,50 g, 93% de rendimento). RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ 5,04 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,20 (p, J = 7,0 Hz, 3H), 3,52 (t, J = 10,7 Hz, 2H), 1,96 (d, J = 3,7 Hz, 1H), 1,69 (s,
265 / 439 2H), 1,44 (s, 9H), 1,28 (dd, J = 7,1; 2,9 Hz, 3H), 0,98 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 0,92-0,86 (m, 3H). Exemplo 85. Síntese de 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-hidroxi-5-metil- heptanoato de (3R,4S,5S)-etila
[00267] A uma solução de 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-5-metil-3- oxo-heptanoato de (4S,5S)-etila (5,90 g, 19,83 mmol) em etanol (6 mL) a - 60ºC, adicionou-se borohidreto de sódio (3,77 g, 99,2 mmol) em uma porção. A mistura de reação foi agitada por 5,5 horas abaixo de -55ºC, então, interrompida com ácido cítrico aquoso 10% (100 mL). A solução resultante foi acidificada para pH 2 com ácido cítrico aquoso 10% adicional, seguido pela extração com acetato de etila (3 × 100 mL). Os extratos orgânicos foram lavados com cloreto de sódio aquoso saturado (100 mL), secos com Na2SO4 e concentrados a vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (acetato de etila/hexano 10-50%) para fornecer o composto do título como diastereômero (2,20 g, 37% de rendimento) e uma mistura de dois diastereômeros (2,0g, 34% de rendimento, razão próxima a 9:1). RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ 4,41 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 4,17 (tt, J = 7,1; 3,6 Hz, 2H), 4,00 (t, J = 6,9 Hz, 1H), 3,55 (dd, J = 11,7; 9,3 Hz, 1H), 2,56-2,51 (m, 2H), 2,44 (dd, J = 16,4; 9,0 Hz, 1H), 1,79 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 1,60-1,53 (m, 1H), 1,43 (s, 9H), 1,27 (dd, J = 9,3; 5,0 Hz, 3H), 1,03-0,91 (m, 7H). Exemplo 86. Síntese de ácido (3R,4S,5S)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3- hidroxi-5-metil-heptanoico
[00268] A uma solução de 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-hidroxi-5- metil-heptanoato de (3R,4S,5S)-etila (2,20 g, 7,20 mmol) em etanol (22 mL),
266 / 439 adicionou-se hidróxido de sódio aquoso 1 N (7,57 mL, 7,57 mmol). A mistura foi agitada a 0ºC por 30 minutos, depois à temperatura ambiente por 2 horas. A solução resultante foi acidificada para pH 4 pela adição de ácido clorídrico aquoso 1 N, a qual foi então extraída com acetato de etila (3 × 50 mL). Os extratos orgânicos foram lavados com hidrogenossulfato de potássio aquoso 1 N (50 mL) e cloreto de sódio aquoso saturado (50 mL), secos com Na2SO4, e concentrados a vácuo para fornecer o composto (1,90 g, 95% de rendimento). RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ 4,50 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 4,07 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 3,59 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 2,56-2,45 (m, 2H), 1,76-1,65 (m, 1H), 1,56 (d, J = 7,1 Hz, 1H), 1,45 (s, 9H), 1,26 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 0,93 (dd, J = 14,4; 7,1 Hz, 6H). Exemplo 87. Síntese de ácido (3R,4S,5S)-4-((terc- butoxicarbonil)(metil)amino)-3-metoxi-5-metil-heptanoico
[00269] A uma solução de ácido (3R,4S,5S)-4-((terc- butoxicarbonil)amino)-3-hidroxi-5-metil-heptanoico (1,90 g, 6,9 mmol) em THF (40 mL), adicionou-se hidreto de sódio (suspensão oleosa 60%, 1,93 g, 48,3 mmol) a 0ºC. Após agitação por 1 hora, iodeto de metila (6,6 mL, 103,5 mmol) foi adicionado. A agitação foi continuada a 0ºC por 40 horas antes de hidrogenocarbonato de sódio aquoso saturado (50 mL) ser adicionado, seguido por água (100 mL). A mistura foi lavada com éter dietílico (2 × 50 mL) e a camada aquosa foi acidificada para pH 3 por hidrogenossulfato de potássio aquoso 1 N, a seguir, extraída com acetato de etila (3 × 50 mL). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com tiossulfato de sódio aquoso 5% (50 mL) e cloreto de sódio aquoso saturado (50 mL), secos com Na2SO4 e concentrados a vácuo para fornecer o composto do título (1,00 g, 48% de rendimento). RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ 3,95 (d, J = 75,4 Hz, 2H), 3,42 (d, J = 4,4 Hz, 3H), 2,71 (s, 3H), 2,62 (s, 1H), 2,56-2,47 (m, 2H),
267 / 439 1,79 (s, 1H), 1,47 (s, 1H), 1,45 (d, J = 3,3 Hz, 9H), 1,13-1,05 (m, 1H), 0,96 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,89 (td, J = 7,2; 2,5 Hz, 3H). Exemplo 88. Síntese de Boc-N-Me-L-Val-OH.
[00270] A uma solução de Boc-L-Val-OH (2,00 g, 9,2 mmol) e iodeto de metila (5,74 mL, 92 mmol) em THF anidro (40 mL), adicionou-se hidreto de sódio (3,68 g, 92 mmol) a 0ºC. A mistura de reação foi agitada a 0ºC por 1,5 h, depois aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 24 horas. A reação foi interrompida por água gelada (50 mL). Após a adição de água (100 mL), a mistura de reação foi lavada com acetato de etila (3 × 50 mL) e a solução aquosa foi acidificada para pH 3, a seguir, extraída com acetato de etila (3 × 50 mL). A fase orgânica combinada foi seca com Na2SO4 e concentrada para fornecer Boc-N-Me-Val-OH (2,00 g, 94% de rendimento) como um sólido branco. RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ 4,10 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 2,87 (s, 3H), 2,37-2,13 (m, 1H), 1,44 (d, J = 26,7 Hz, 9H), 1.02 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 0,90 (t, J = 8,6 Hz, 3H). Exemplo 89. Síntese de 3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((terc-butoxicarbonil)- (metil)amino)-3-metoxi-5-metil-heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2- metilpropanoato de (2R,3R)-metila 0 ºC até r.t.
[00271] A uma solução de 3-metoxi-2-metil-3-((S)-pirrolidin-2- il)propanoato de (2R,3R)-metila (0,71g, 2,99 mmol) e ácido (3R,4S,5S)-4- ((terc-butoxicarbonil)(metil)amino)-3-metoxi-5-metil-heptanoico (1 g, 3,29 mmol) em DMF (10 mL) a 0ºC, adicionou-se cianofosfonato de dietila (545 μL, 3,59 mmol), seguido por Et3N (1,25 mL, 8,99 mmol). A mistura de reação
268 / 439 foi agitada a 0ºC por 2 horas, então aquecida até a temperatura ambiente e agitada durante a noite. A mistura de reação foi diluída com acetato de etila (50 mL), lavada com hidrogenossulfato de potássio aquoso 1 N (20 mL), água (20 mL), hidrogenocarbonato de sódio aquoso saturado (20 mL), e cloreto de sódio aquoso saturado (20 mL), seca com sulfato de sódio e concentrada a vácuo. O resíduo foi purificada em cromatografia em coluna de sílica gel, eluindo com acetato de etila/hexano (1:5 para 2:1) para fornecer o composto do título (0,9 g, 62% de rendimento) como um sólido branco. HRMS (ESI) m/z calculado para C25H46N2O7 [M+H]+: 487,33; encontrado 487,32. Exemplo 90. Síntese de 2-((1R,2R)-1-metoxi-3-(((S)-1-metoxi-1-oxo-3- fenilpropan-2-il)amino)-2-metil-3-oxopropil)pirrolidina-1-carboxilato de (S)- terc-butila
[00272] A uma solução de ácido (2R,3R)-3-((S)-1-(terc- butoxicarbonil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoico (100 mg, 0,347 mmol) e cloridrato do éster metílico de L-fenilalanina (107,8 mg, 0,500 mmol) em DMF (5 mL) a 0ºC, adicionou-se cianofosfonato de dietila (75,6 μL, 0,451 mmol), seguido por Et3N (131 μL, 0,94 mmol). A mistura de reação foi agitada a 0ºC por 2 horas, depois aquecida até a temperatura ambiente e agitada durante a noite. A mistura de reação foi então diluída com acetato de etila (80 mL), lavada com hidrogenossulfato de potássio aquoso 1 N (40 mL), água (40 mL), hidrogenocarbonato de sódio aquoso saturado (40 mL) e cloreto de sódio aquoso saturado (40 mL), seca com Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (acetato de etila/hexanos 15-75%) para fornecer o composto do título (130 mg, 83% de rendimento) como um sólido branco. RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ 7,28 (dd, J = 7,9; 6,5 Hz, 2H), 7,23 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 7,16 (s, 2H), 4,81 (s, 1H), 3,98- 3,56 (m, 5H), 3,50 (s, 1H), 3,37 (d, J = 2,9 Hz, 3H), 3,17 (dd, J = 13,9; 5,4
269 / 439 Hz, 2H), 3,04 (dd, J = 14,0; 7,7 Hz, 1H), 2,34 (s, 1H), 1,81-1,69 (m, 2H), 1,65 (s, 3H), 1,51-1,40 (m, 9H), 1,16 (d, J = 7,0 Hz, 3H). Exemplo 91. Procedimento geral para a remoção da função Boc com ácido trifluoroacético
[00273] A uma solução do aminoácido N-Boc (1,0 mmol) em cloreto de metileno (2,5 mL), adicionou-se ácido trifluoroacético (1,0 mL). Depois de agitada à temperatura ambiente por 1-3 horas, a mistura de reação foi concentrada a vácuo. A co-evaporação com tolueno forneceu o produto desprotegido, que foi usado sem qualquer purificação adicional. Exemplo 92. Síntese de 3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metil- heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoato de (2R,3R)-metila Boc-Val-OH O N O BroP, DIPEA BocHN N O HN CH2Cl2 N
O O O O O O O O
[00274] A uma solução do produto desprotegido de 3-metoxi-3-((S)-1- ((3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-(metilamino)heptanoil)pirrolidin-2-il)-2- metilpropanoato de (2R,3R)-metila (715 mg, 1,85 mmol) e Boc-Val-OH (1,2 g, 5,56 mmol) em DCM (20 mL) a 0ºC, adicionou-se BroP (1,08 g, 2,78 mmol), seguido por diisopropiletilamina (1,13 mL, 6,48 mmol). A mistura foi protegida da luz e agitada a 0ºC por 30 minutos, depois à temperatura ambiente por 48horas. A mistura de reação foi diluída com acetato de etila (50 mL), lavada com hidrogenossulfato de potássio aquoso 1 N (20 mL), água (20 mL), hidrogenocarbonato de sódio aquoso saturado (20 mL) e cloreto de sódio aquoso saturado (20 mL), seca com Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo foi purificado em cromatografia em coluna de sílica gel, eluindo com acetato de etila/hexano (1:5 para 4:1) para fornecer o composto do título (0,92 g, 85% de rendimento) como um sólido branco. HRMS (ESI) m/z calculado para C30H55N3O8 [M+H]+: 586,40; encontrado: 586,37. Exemplo 93. Síntese de 3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(2-(dimetilamino)-2-
270 / 439 metilpropanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metil- heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoato de (2R,3R)-metila
[00275] A uma solução do produto desprotegido de 3-((S)-1- ((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((terc-butoxicarbonil)amino)-N,3-dimetilbutanamido)-3- metoxi-5-metil-heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoato de (2R,3R)-metila (50 mg, 0,085 mmol) e 2-(dimetilamino)-2-metilpropanoato de perfluorofenila (74,5 mg, 0,25 mmol) em DMF (2 mL) a 0ºC, adicionou-se DIPEA (44 μL, 0,255 mmol). A mistura de reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 2 horas. A mistura de reação foi diluída com acetato de etila (30 mL), lavada com água (10 mL) e cloreto de sódio aquoso saturado (10 mL), seco com sulfato de sódio e concentrada a vácuo. O resíduo foi purificado em cromatografia em coluna de sílica gel, eluída com acetato de etila/hexano (1:5 para 5:1) para fornecer o composto do título (50 mg, 100% de rendimento). HRMS (ESI) m/z calculado para C31H58N4O7 [M+H]+: 599; encontrado: 599. Exemplo 94. Síntese de ácido (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(2- (dimetilamino)-2-metilpropanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5- metil-heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoico 1,4-dioxano H 2O
[00276] A uma solução de 3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(2- (dimetilamino)-2-metilpropanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5- metil-heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoato de (2R,3R)- metila (50 mg, 0,0836 mmol) em 1,4-dioxano (3 mL) a 0-4ºC, adicionou-se uma solução de hidróxido de lítio (14 mg, 0,334 mmol) em água (3 mL), gota
271 / 439 a gota em 5 minutos. A mistura de reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 2 horas. A mistura foi acidificada para pH 7 com HCl 1N e concentrada sob vácuo e então usada para a etapa seguinte sem purificação adicional. HRMS (ESI) m/z calculado para C30H57N4O7 [M+H]+: 585,41; encontrado: 585,80. Exemplo 95. Síntese de 3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(2-(dimetilamino)-2- metilpropanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metil- heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoato de (2R,3R)- perfluorofenila
[00277] A uma solução de ácido (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)- 2-(2-(dimetilamino)-2-metilpropanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi- 5-metil-heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoico (0,0836 mmol) e PFP (18,5 mg, 0,1 Mmol) em DCM (2 mL), adicionou-se DIC (12,7 mg, 0,1 Mmol) a 0ºC. A mistura foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada durante a noite. A mistura de reação foi concentrada sob vácuo e usada para a etapa seguinte sem purificação adicional. HRMS (ESI) m/z calculado para C36H56F5N4O7 [M+H]+: 751,40; encontrado: 751,70. Exemplo 96. Síntese de 2-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(4-hidroxi-3- nitrofenil)propanoato de (S)-metila
[00278] A uma solução de éster metílico de Boc-L-Tirosina (5 g, 16,9 mmol) em THF (50 mL), adicionou-se nitrito de terc-butila (10 mL, 84,6 mmol), depois a mistura de reação foi agitada por 5 horas à temperatura ambiente. A mistura de reação foi concentrada e purificada por cromatografia em coluna em sílica gel usando acetato de etila/hexano (1:10 para 1:5) para
272 / 439 fornecer o composto (4,5 g, 78% de rendimento) como um sólido amarelo. HRMS (ESI) m/z calculado para C15H21N2O7 [M+H]+: 341,13; encontrado: 341,30. Exemplo 97. Síntese de 3-(3-amino-4-hidroxifenil)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)propanoato de (S)-metila
[00279] A uma solução de 3-(3-amino-4-hidroxifenil)-2-(terc- butoxicarbonilamino)propanoato de (S)-metila (2 g, 6,44 mmol) em acetato de etila (20 mL), adicionou-se Pd/C (0,2 g) e agitou-se por 2 horas sob atmosfera de hidrogênio. A mistura foi filtrada e o filtrado, concentrado sob vácuo para fornecer o composto do título (1,7 g, 95% de rendimento) como um sólido branco. HRMS (ESI) m/z calculado para C15H23N2O5 [M+H]+: 311,15; encontrado: 311,30. Exemplo 98. Síntese de 3-(8,9-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)propanamido)-2,7,10,15-tetraoxo-3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16- tetradecahidro-2H-benzo[b][1,4,9,14]oxatriazaciclo-octadecin-18-il)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)propanoato de (2S)-metila
[00280] A uma solução de ácido 4,4'-((2,3-bis(2-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)acetamido)-succinil)bis(azanodi-il))dibutanoico (108,0 mg, 0,182 mmol) e 3-(3-amino-4-hidroxifenil)-2-(terc- butoxicarbonilamino)propanoato de (S)-metila (56,6 mg, 0,182 mmol) em DMF (5 mL) a 0ºC, adicionou-se EDC (130 mg, 0,678 mmol), seguido por DIPEA (64 μL, 0,365 mmol). A mistura de reação foi aquecida até a
273 / 439 temperatura ambiente e agitada durante a noite. A mistura foi diluída com acetato de etila (30 mL), lavada com água (10 mL) e cloreto de sódio aquoso saturado (10 mL), seca com sulfato de sódio e concentrada a vácuo. O resíduo foi purificado em cromatografia em coluna de sílica gel, eluindo com DCM/MeOH (20:1 para 10:1) para fornecer o composto do título (110,6 mg, 68% de rendimento). HRMS (ESI) m/z calculado para C41H51N8O15 [M+H]+: 895,34; encontrado: 895,30. Exemplo 99. Síntese de 2-amino-3-(8,9-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)propanamido)-2,7,10,15-tetraoxo- 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16-tetradecahidro-2H- benzo[b][1,4,9,14]oxatriazaciclo-octadecin-18-il)propanoato de (2S)-metila
[00281] A uma solução de 3-(8,9-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)propanamido)-2,7,10,15-tetraoxo- 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16-tetradecahidro-2H- benzo[b][1,4,9,14]oxatriazaciclo-octadecin-18-il)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)propanoato de (2S)-metila (100,2 mg, 0,112 mmol) em DCM (6 mL), adicionou-se TFA (2 mL) a 0ºC. A mistura de reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 30 minutos, diluída com tolueno, concentrada, co-evaporada com tolueno e, a seguir, usada para a etapa seguinte sem purificação adicional. HRMS (ESI) m/z calculado para C36H43N8O13 [M+H]+: 795.29; encontrado: 795,45. Exemplo 100. Síntese de 3-(8,9-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)propanamido)-2,7,10,15-tetraoxo-3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16- tetradecahidro-2H-benzo[b][1,4,9,14]oxatriazaciclo-octadecin-18-il)-2- ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(2-(dimetilamino)-2-
274 / 439 metilpropanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metil- heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)propanoato de (2S)- metila (A-01).
A-01,
[00282] A uma solução de 3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(2- (dimetilamino)-2-metilpropanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5- metil-heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoato de (2R,3R)- perfluorofenila (20 mg, 0,027 mmol) e 2-amino-3-(8,9-bis(3-(2,5-dioxo-2,5- di-hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-2,7,10,15-tetraoxo- 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16-tetradecahidro-2H- benzo[b][1,4,9,14]oxatriaza-ciclo-octadecin-18-il)propanoato de (2S)-metila (31,7 mg, 0.04 mmol) em DMA (2 mL), adicionou-se DIPEA (9 μL, 0,053 mmol) a 0ºC. A mistura de reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 30 minutos. A mistura foi concentrada sob vácuo e purificada por HPLC preparativa (C-18, 250 mm x 10 mm, eluída com H2O/CH3CN (9 mL/minuto, de água 90% para água 40% em 40 minutos) para fornecer o composto do título (16 mg, 43% de rendimento). HRMS (ESI) m/z calculado para C66H97N12O19 [M+H]+: 1361,69; encontrado: 1361,50. Exemplo 101. Síntese de 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((terc- butoxicarbonil)(metil)amino)-3-metoxi-5-metil-heptanoil)pirrolidin-2-il)-3- metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoato de (S)-metila
[00283] A uma solução do produto Boc-desprotegido de 2-((1R,2R)-1- metoxi-3-(((S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il)amino)-2-metil-3- oxopropil)pirrolidina-1-carboxilato de (S)-terc-butila (0,29 mmol) e ácido
275 / 439 (3R,4S,5S)-4-((terc-butoxicarbonil)(metil)amino)-3-metoxi-5-metil- heptanoico (96,6 mg, 0,318 mmol) em DMF (5 mL) a 0ºC, adicionou-se cianofosfonato de dietila (58 μL, 0,347 mmol), seguido por Et3N (109 μL, 0,78 mmol). A mistura de reação foi agitada a 0ºC por 2 horas, então aquecida até a temperatura ambiente e agitada durante a noite. A mistura de reação foi diluída com acetato de etila (80 mL), lavada com hidrogenossulfato de potássio aquoso 1 N (40 mL), água (40 mL), hidrogenocarbonato de sódio aquoso saturado (40 mL) e cloreto de sódio aquoso saturado (40 mL), seca com Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (acetato de etila/hexanos 15-75%) para fornecer o composto do título (150 mg, 81% de rendimento) como um sólido branco. LC-MS (ESI) m/z calculado para C34H55N3O8 [M+H]+: 634,40; encontrado: 634,40. Exemplo 102. Síntese de (2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metil- heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoato de (S)-metila
[00284] A uma solução do produto Boc-desprotegido de 2-((2R,3R)-3- ((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((terc-butoxicarbonil)(metil)amino)-3-metoxi-5-metil- heptanoil)-pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoato de (S)-metila (0,118 mmol) e Boc-Val-OH (51,8 mg, 0,236 mmol) em DCM (5 mL) a 0ºC, adicionou-se BroP (70,1 Mg, 0,184 mmol), seguido por diisopropiletilamina (70 μL, 0,425 mmol). A mistura foi protegida da luz e agitada a 0ºC por 30 minutos, depois à temperatura ambiente por 2 dias. A mistura de reação foi diluída com acetato de etila (80 mL), lavada com hidrogenossulfato de potássio aquoso 1 N (40 mL), água (40 mL), hidrogenocarbonato de sódio aquoso saturado (40 mL) e cloreto de sódio
276 / 439 aquoso saturado (40 mL), seca com Na2SO4 e concentrada a vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (acetato de etila/hexanos 20- 100%) para fornecer o composto do título (67 mg, 77% de rendimento) como um sólido branco. LC-MS (ESI) m/z calculado para C39H64N4O9 [M+H]+: 733,47; encontrado: 733,46. Exemplo 103. Síntese de 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((6S,9S,12S,13R)-12-((S)-sec- butil)-6,9-diisopropil-13-metoxi-2,2,5,11-tetrametil-4,7,10-trioxo-3-oxa- 5,8,11-triazapentadecan-15-oil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2- metilpropanamido)-3-fenilpropanoato de (S)-metila
[00285] A uma solução do produto Boc-desprotegido de 2-((2R,3R)-3- ((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((terc-butoxicarbonil)amino)-N,3- dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metil-heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2- metilpropanamido)-3-fenilpropanoato de (S)-metila (0,091 mmol) e Boc-N- Me-Val-OH (127 mg, 0,548 mmol) em DMF (5 mL) a 0ºC, adicionou-se cianofosfonato de dietila (18,2 μL, 0,114 mmol), seguido por N- metilmorfolina (59 μL, 0,548 mmol). A mistura de reação foi agitada a 0ºC por 2 horas, depois aquecida até a temperatura ambiente e agitada durante a noite. A mistura de reação foi diluída com acetato de etila (80 mL), lavada com hidrogenossulfato de potássio aquoso 1 N (40 mL), água (40 mL), hidrogenocarbonato de sódio aquoso saturado (40 mL) e cloreto de sódio aquoso saturado (40 mL), seca com sulfato de sódio e concentrada a vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (acetato de etila/hexanos 20-100%) para fornecer o composto do título (30 mg, 39% de rendimento) como um sólido branco. LC-MS (ESI) m/z calculado para C45H75N5O10 [M+H]+: 846,55; encontrado: 846,56. Exemplo 104. Síntese de 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-dimetil- 2-((S)-3-metil-2-(metilamino)butanamido)butanamido)-3-metoxi-5-metil-
277 / 439 heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoato de (S)-metila
[00286] A uma solução de 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((6S,9S,12S,13R)-12- ((S)-sec-butil)-6,9-diisopropil-13-metoxi-2,2,5,11-tetrametil-4,7,10-trioxo-3- oxa-5,8,11-triazapentadecan-15-oil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2- metilpropanamido)-3-fenilpropanoato de (S)-metila (75,0 mg, 0,0886 mmol) em cloreto de metileno (5 mL), adicionou-se ácido trifluoroacético (2 mL) à temperatura ambiente. Depois de agitada à temperatura ambiente por 1 hora, a mistura de reação foi concentrada a vácuo. A co-evaporação com tolueno forneceu o produto do título desprotegido, que foi usado sem purificação adicional. Exemplo 105. Síntese de ácido (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)- N,3-dimetil-2-((S)-3-metil-2-(metilamino)butanamido)butanamido)-3-metoxi- 5-metil-heptanoil)-pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3- fenilpropanoico
H O H
N N N HN N Ph O O O O O CO2H
[00287] 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4- ((S)-N,3-dimetil-2-((S)-3- metil-2-(metilamino)butanamido)butanamido)-3-metoxi-5-metil- heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoato de (S)-metila (25 mg, 0.030 mmol) na mistura de HCl concentrado (0,3 mL) e 1,4-dioxano (0,9 mL) foi agitado à temperatura ambiente por 35 minutos. A mistura foi diluída com EtOH (1,0 mL) e tolueno (1,0 mL), concentrada e co- evaporada com EtOH/tolueno (2:1) para fornecer o composto do título como um sólido branco (22 mg, ~100% de rendimento), que foi usado na etapa seguinte sem purificação adicional. LC-MS (ESI) m/z calculado para
278 / 439 C39H66N5O8 [M+H]+: 732,48; encontrado: 732,60. Exemplo 106. Síntese de ácido (2S)-2-((2R,3R)-3-((2S)-1-((11S,14S,17S)-1- azido-17-((R)-sec-butil)-11,14-diisopropil-18-metoxi-10,16-dimetil-9,12,15- trioxo-3,6-dioxa-10,13,16-triazai-cosan-20-oil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2- metilpropanamido)-3-fenilpropanoico
[00288] Ao ácido (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3- dimetil-2-((S)-3-metil-2-(metilamino)butanamido)butanamido)-3-metoxi-5- metil-heptanoil)-pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3- fenilpropanoico bruto (22 mg, 0,030 mmol) em uma mistura de DMA (0,8 mL) e solução tampão NaH2PO4 (pH 7,5; 1,0 M, 0,7 mL), adicionou-se 3-(2- (2-azidoetoxi)etoxi)propanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila (18,0 mg, 0,060 mmol) em quatro porções durante 2 horas. A mistura foi agitada durante a noite, concentrada e purificada por cromatografia em coluna de SiO2 (CH3OH/CH2Cl2/HOAc 1:8:0,01) para fornecer o composto do título (22,5 mg, 82% de rendimento). LC-MS (ESI) m/z calculado para C46H77N8O11 [M+H]+: 917,56; encontrado: 917,60. Exemplo 107. Síntese de ácido (2S)-2-((2R,3R)-3-((2S)-1-((11S,14S,17S)-1- amino-17-((R)-sec-butil)-11,14-diisopropil-18-metoxi-10,16-dimetil-9,12,15- trioxo-3,6-dioxa-10,13,16-triazaicosan-20-oil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2- metilpropanamido)-3-fenilpropanoico
[00289] Ao ácido (2S)-2-((2R,3R)-3-((2S)-1-((11S,14S,17S)-1-azido- 17-((R)-sec-butil)-11,14-diisopropil-18-metoxi-10,16-dimetil-9,12,15-trioxo- 3,6-dioxa-10,13,16-triazai-cosan-20-oil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2- metilpropanamido)-3-fenilpropanoico (22,0 mg, 0,024 mmol) em metanol (5
279 / 439 mL) em um frasco de hidrogenação, adicionou-se Pd/C (5 mg, Pd 10%, 50% úmido). Depois de conduzida a retirada do ar a vácuo e H2 25 psi, a mistura foi agitada por 4 horas e, filtrada através de Celite. O filtrado foi concentrado para fornecer o produto do título bruto (~20 mg, 92% de rendimento), que foi usado na etapa seguinte sem purificação adicional. ESI MS m/z+ C46H79N6O11 (M+H), calculado891,57; encontrado 891,60. Exemplo 108. Síntese de ácido (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((6S,9S,12S,13R)-12- ((S)-sec-butil)-6,9-diisopropil-13-metoxi-2,2,5,11-tetrametil-4,7,10-trioxo-3- oxa-5,8,11-triazapenta-decan-15-oil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2- metilpropanamido)-3-fenilpropanoico
[00290] A uma solução de 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((6S,9S,12S,13R)-12- ((S)-sec-butil)-6,9-diisopropil-13-metoxi-2,2,5,11-tetrametil-4,7,10-trioxo-3- oxa-5,8,11-triazapentadecan-15-oil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2- metilpropanamido)-3-fenilpropanoato de (S)-metila (30 mg, 0,035 mmol) em THF (1,0 mL), adicionou-se LiOH em água (1,0M, 0,8 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 35 minutos, neutralizada com H3PO4 0,5 M para pH 6, concentrada e purificada por cromatografia em coluna de SiO2 (CH3OH/CH2Cl2/HOAc 1:10:0,01) para fornecer o composto do título (25,0 mg, 85% de rendimento). LC-MS (ESI) m/z calculado para C44H74N5O10 [M+H]+: 832,54; encontrado: 832,60. Exemplo 109. Síntese de ácido (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)- N,3-dimetil-2-((S)-3-metil-2-(metilamino)butanamido)butanamido)-3-metoxi- 5-metil-heptanoil)-pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3- fenilpropanoico
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[00291] A uma solução de ácido (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1- ((6S,9S,12S,13R)-12-((S)-sec-butil)-6,9-diisopropil-13-metoxi-2,2,5,11- tetrametil-4,7,10-trioxo-3-oxa-5,8,11-triazapenta-decan-15-oil)pirrolidin-2- il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoico (25 mg, 0,030 mmol) em dioxano (2,0 mL), adicionou-se HCl (12,0 M, 0,6 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 30 minutos, diluída com dioxano (4 mL) e tolueno (4 mL), concentrada e purificada por cromatografia em coluna C-18 de HPLC, eluindo com MeOH e água (L200 mm x Φ20 mm, v = 9 mL/minuto, de metanol 5% para metanol 40% em 40 minutos) para fornecer o composto do título (20,0 mg, 90% de rendimento). LC-MS (ESI) m/z calculado para C39H66N5O8 [M+H]+: 732,48; encontrado: 732,90. Exemplo 110. Síntese de 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,14S,15R)-14-((S)- sec-butil)-8,11-diisopropil-15-metoxi-5,7,13-trimetil-3,6,9,12-tetraoxo-1- fenil-2-oxa-4,7,10,13-tetra-azaheptadecan-17-oil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2- metilpropanamido)-3-fenilpropanoato de (S)-metila
[00292] A uma solução de MMAF-OMe (0,132 g, 0,178 mmol, 1,0 eq.) e Z-L-Alanina (0,119 g, 0,533 mmol, 3,0 eq.) em DCM anidro (10 mL) a 0ºC, adicionou-se HATU (0,135 g, 0,356 mmol, 2,0 eq.) e NMM (0,12mL, 1,07 mmol, 6,0 eq.) em sequência. A reação foi agitada a 0ºC por 10 minutos, então aquecida até a temperatura ambiente e agitada durante a noite. A mistura foi diluída com DCM e lavada com água e salmoura, seca com Na2SO4 anidro, concentrada e purificada por cromatografia em coluna de SiO2 (DCM/MeOH 20:1) para fornecer o composto do título como um sólido branco espumoso (0,148 g, 88% de rendimento). ESI MS m/z: calculado para C51H79N6O11 [M+H]+ 951,6; encontrado 951,6. Exemplo 111. Síntese de 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((S)- 2-amino-N-metilpropanamido)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-
281 / 439 3-metoxi-5-metil-heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3- fenilpropanoato de (S)-metila
[00293] A uma solução de 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,14S, 15R)- 14-((S)-sec-butil)-8,11-diisopropil-15-metoxi-5,7,13-trimetil-3,6,9,12- tetraoxo-1-fenil-2-oxa-4,7,10,13-tetra-azaheptadecan-17-oil)pirrolidin-2-il)-3- metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenil-propanoato de (S)-metila (0,148 g, 0,156 mmol, 1,0 equiv.) em MeOH (5 mL), adicionou-se Pd/C (0,100 g, Pd/C 10%, 50% úmido) em um frasco de hidrogenação. A mistura foi agitada por 5 horas, então filtrada através de uma camada de Celite. O filtrado foi concentrado para fornecer o composto do título como um sólido branco espumoso (0,122 g, 96% de rendimento). ESI MS m/z: calculado para C43H73N6O9 [M+H]+ 817,5; encontrado 817,5. Exemplo 112. Síntese de 2-((2R,3R)-3-((2S)-1-((46S,49S,52S,55S,56R)-55- ((S)-sec-butil)-37,38-bis(2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)acetamido)- 1-hidroxi-49,52-diisopropil-56-metoxi-46,48,54-trimetil- 31,36,39,44,47,50,53-heptaoxo-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxa- 30,35,40,45,48,51,54-hepta-azaoctapentacontan-58-oil)pirrolidin-2-il)-3- metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoato de (2S)-metila (A-02).
(A-2) e (um produto secundário)
[00294] A uma solução de 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-
282 / 439 ((S)-2-((S)-2-amino-N-metilpropanamido)-3-metilbutanamido)-N,3- dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metil-heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2- metilpropanamido)-3-fenilpropanoato de (S)-metila (0,122 g, 0,149 mmol, 1,0 eq.) e ácido 4,4'-((2,3-bis(2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)acetamido)-succinil)bis(azanodi-il))dibutanoico (0,177 g, 0,298 mmol, 4,0 eq.) em DMA anidro (10 mL), adicionou-se HATU (0,270 g, 0,712 mmol) e NMM (0,030 mL, 0,267 mmol). A reação foi agitada por 2 horas, depois 29- amino-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxanonacosan-1-ol (0,205 mg, 0,448 mmol) foi adicionada. A mistura de reação continuou sendo agitada durante a noite. A mistura foi concentrada a vácuo e purificada por cromatografia em coluna de SiO2 (DCM/ MeOH, 10:1 para 5:1) para fornecer o composto do título (A-2) como um sólido branco espumoso (0,128 g, 47% de rendimento, ESI MS m/z: calculado para C87H140N13O29 [M+H]+ 1830,98; encontrado 1830,70), e um produto secundário, 2,3-bis(2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)acetamido)-N1,N4-bis(1-hidroxi-31-oxo-3,6,9,12,15,18,21,24,27- nonaoxa-30-azatetratriacontan-34-il)succinamida (84 mg, 38% de rendimento, ESI MS m/z: calculado para C64H111N8O30 [M+H]+ 1471,73; encontrado 1471,95). Exemplo 113. Síntese de ácido (2S)-2-((2R,3R)-3-((2S)-1- ((56S,59S,62S,63R)-62-((S)-sec-butil)-37,38-bis(2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro- 1H-pirrol-1-il)acetamido)-1-hidroxi-56,59-diisopropil-63-metoxi-55,61- dimetil-31,36,39,44,54,57,60-heptaoxo-3,6,9,12,15,18,21,24,27,48,51- undecaoxa-30,35,40,45,55,58,61-hepta-azapentahexacontan-65-oil)pirrolidin- 2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoico (A-3).
[00295] A uma solução de ácido (2S)-2-((2R,3R)-3-((2S)-1- ((11S,14S,17S)-1-amino-17-((R)-sec-butil)-11,14-diisopropil-18-metoxi-
283 / 439 10,16-dimetil-9,12,15-trioxo-3,6-dioxa-10,13,16-triazaicosan-20- oil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoico (0,155 g, 0,174 mmol, 1,0 eq.) em uma solução de DMA (10 mL) e tampão PBS (10 mL, NaH2PO4 0,1 M, pH 5,0), adicionou-se 4,4'-((2,3-bis(2-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)acetamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoato de bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) (0,275 g, 0,349 mmol, 4,0 eq.). A mistura foi agitada por 4 horas, depois 29-amino-3,6,9,12,15,18,21,24,27- nonaoxanonacosan-1-ol (0,205 mg, 0,448 mmol) foi adicionado. A mistura de reação teve o pH ajustado para 7,5 com NaHCO3 (saturado) e continuou sendo agitada durante a noite. A mistura foi concentrada a vácuo e purificada por HPLC de fase reversa (250 (L) mm x 20(d) mm, coluna C18, acetonitrila/água 10-80% em 40 minutos, v =10 mL/min.) para fornecer o composto do título (142,1 mg, 43% de rendimento, ESI MS m/z: calculado para C90H146N13O31 [M+H]+ 1905,02; encontrado 1905,80) e um produto secundário, 2,3-bis(2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)acetamido)- N1,N4-bis(1-hidroxi-31-oxo-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxa-30- azatetratriacontan-34-il)succinamida (89 mg, 35% de rendimento, ESI MS m/z: calculado para C64H111N8O30 [M+H]+ 1471,73; encontrado 1471,95). Exemplo 114. Síntese de ácido (2S,2'S)-2,2'-(((2R,2'R,3R,3'R)-3,3'-((2S,2'S)- 1,1'-((3R,4S,7S,10S,47S,50S,53S,54R)-4,53-di((S)-sec-butil)-28,29-bis(2- (2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)acetamido)-7,10,47,50-tetraisopropil- 3,54-dimetoxi-5,11,46,52-tetrametil-6,9,12,22,27,30,35,45,48,51-decaoxo- 15,18,39,42-tetraoxa-5,8,11,21,26,31,36,46,49,52-deca-azahexapentacontano- 1,56-dioil)bis(pirrolidina-2,1-di-il))bis(3-metoxi-2- metilpropanoil))bis(azanodi-il))bis(3-fenilpropanoico) (A-04).
O O O O O O H H H
NH NH N N N N N N N Ph O 2 O O O O O CO2H
O O O H O N O H O H N NH
N H N N N O O N N Ph 2 O O O O O O CO2H A-04,
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[00296] A uma solução de ácido (2S)-2-((2R,3R)-3-((2S)-1- ((11S,14S,17S)-1-amino-17-((R)-sec-butil)-11,14-diisopropil-18-metoxi- 10,16-dimetil-9,12,15-trioxo-3,6-dioxa-10,13,16-triazaicosan-20- oil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoico (0,155 g, 0,174 mmol, 1,0 eq.) em uma solução de DMA (10 mL) e tampão PBS (10 mL, NaH2PO4 0,1 M, pH 7,5), adicionou-se 4,4'-((2,3-bis(2-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)acetamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoato de bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) (0,068 g, 0,087 mmol, 1,0 eq.). A mistura foi agitada por 8 horas, concentrada a vácuo e purificada por HPLC de fase reversa (250 (L) mm x 20(d) mm, coluna C18, acetonitrila/água 10-80% em 40 minutos, v =10 mL/min.) para fornecer o composto do título (138,1 mg, 68% de rendimento). ESI MS m/z: calculado para C116H181N18O32 [M+H]+ 2338,30; encontrado 2338,90. Exemplo 115. Síntese de (S, E)-2-metil-N-(3-metilbutan-2-ilideno)propano-2- sulfonamida
[00297] A uma solução de (S)-2-metilpropano-2-sulfinamida (100 g, 0,825 mol, 1,0 eq.) em 1 L de THF, adicionou-se Ti(OEt)4 (345 mL, 1,82 mol, 2,2 eq.) e 3-metil-2-butanona (81 mL, 0,825 mol, 1,0 eq.) sob N2 à temperatura ambiente. A mistura de reação foi submetida ao refluxo por 16 horas, depois resfriada até a temperatura ambiente e vertida em água gelada. A mistura foi filtrada e o bolo filtrado foi lavado com EtOAc. A camada orgânica foi separada, seca com Na2SO4 anidro e concentrada para fornecer um resíduo que foi purificado por destilação a vácuo (15-20 torr, 95ºC) para fornecer o produto do título (141 g, 90% de rendimento) como um óleo amarelo. RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ 2,54-2,44 (m, 1H), 2,25 (s, 3H), 1,17 (s, 9H), 1,06 (dd, J = 6,9; 5,1 Hz, 6H). MS ESI m/z calculado para C9H19NaNOS [M+Na]+ 212,12; encontrado 212,11. Exemplo 116. Síntese de ácido (2S,3S)-2-azido-3-metilpentanoico
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[00298] A uma solução de NaN3 (20,0 g, 308 mmol) em uma mistura de água (50 mL) e diclorometano (80 mL), resfriada a 0ºC, adicionou-se Tf2O (10 mL, 59,2 mmol, 2,0 eq.) lentamente. Após a adição, a reação foi agitada a 0ºC por 2 horas, então a fase orgânica foi separada e a fase aquosa, extraída com diclorometano (2 × 40 mL). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com solução saturada de NaHCO3 e usada como estava. A solução em diclorometano de trifil azida foi adicionada a uma mistura de (L)-isoleucina (4,04 g, 30,8 mmol, 1,0 eq.), K2CO3 (6,39 g, 46,2 mmol, 1,5 eq.), CuSO4,5H2O (77,4 mg, 0,31mmol, 0,01 eq.) em água (100 mL) e metanol (200 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 16 horas. Os solventes orgânicos foram removidos sob pressão reduzida e a fase aquosa foi diluída com água (250 mL) e acidificada para pH 6 com HCl concentrado e diluída com tampão fosfato (0,25 M, pH 6,2, 250 mL). A camada aquosa foi lavada com EtOAc (5 × 100 mL) para remover o subproduto de sulfonamida e, a seguir, acidificada para pH 2 com HCl concentrado e extraída com EtOAc (3×150 mL). As camadas orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas para fornecer o produto do título (4,90 g, 99% de rendimento) como óleo incolor. RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ 12,01 (s, 1H), 3,82 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 2,00 (ddd, J = 10,6; 8,6; 5,5 Hz, 1H), 1,54 (dqd, J = 14,8; 7,5; 4,4 Hz, 1H), 1,36-1,24 (m, 1H), 1,08-0,99 (m, 3H), 0,97-0,87 (m, 3H). Exemplo 117. Síntese de ácido D-N-metilpipecolínico
[00299] A uma solução de ácido D (10,0 g, 77,4 mmol, 1,0 eq.) em metanol (100 mL), adicionou-se formaldeído (solução aquosa 37%, 30,8 mL, 154,8 mmol, 2,0 eq.), seguido por Pd/C (10% em peso, 1,0 g). A mistura de reação foi agitada sob H2 (1 atm.) durante a noite e, a seguir, filtrada através
286 / 439 de Celite, sendo a camada filtrante lavada com metanol. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para fornecer o composto do título (10,0 g, 90% de rendimento) como um sólido branco. Exemplo 118. Síntese de 1-metilpiperidina-2-carboxilato de (R)- perfluorofenila
[00300] A uma solução de ácido D-N-metil pipecolínico (2,65 g, 18,5 mmol) em EtOAc (50 mL), foram adicionados pentafluorofenol (3,75 g, 20,4 mmol) e DCC (4,21 g, 20,4 mmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 16 horas e, a seguir, filtrada sobre Celite. A camada filtrante foi lavada com 10 mL de EtOAc. O filtrado foi usado para a etapa seguinte sem purificação ou concentração adicional. MS ESI m/z calculado para C13H13F5NO2 [M+H]+ 309,08; encontrado 309,60. Exemplo 119. Síntese de 2-(dimetilamino)-2-metilpropanoato de perfluorofenila
[00301] A uma solução de ácido 2-(dimetilamino)-2-metilpropanoico (5,00 g, 38,10 mmol) em acetato de etila (200 mL) a 0ºC, adicionou-se 2,3,4,5,6-pentafluorofenol (10,4 g, 57,0 mmol), seguido por DIC (8,8 mL, 57,0 mmol). A mistura de reação foi aquecida até a temperatura ambiente, agitada durante a noite e filtrada. O filtrado foi concentrado para fornecer o composto do título (12,0 g, >100% de rendimento ) que foi usado para a etapa seguinte sem purificação adicional. MS ESI m/z calculado para C12H13F5NO2 [M+H]+ 298,08; encontrado 298,60. Exemplo 120. Síntese de 2,2-dietoxietanotioamida
287 / 439 OEt NH2 EtO
S
[00302] 2,2-dietoxiacetonitrila (100 g, 0,774 mol, 1,0 eq.) foi misturada com solução aquosa de (NH4)2S (48%, 143 mL, 1,05 mol, 1,36 eq.) em metanol (1,5 L) à temperatura ambiente. Depois de agitada por 16 horas, a mistura de reação foi concentrada e o resíduo foi coletada em diclorometano, lavada com solução saturada de NaHCO3 e salmoura, seca com Na2SO4 anidro e concentrada. O resíduo foi triturado com uma mistura de solventes de éter de petróleo e diclorometano. Após a filtração, o produto do título desejado foi coletado como um sólido branco (100 g, 79% de rendimento). RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ 7,81 (d, J = 71,1 Hz, 2H), 5,03 (s, 1H), 3,73 (dq, J = 9,4; 7,1 Hz, 2H), 3,64 (dq, J = 9,4; 7,0 Hz, 2H), 1,25 (t, J = 7,1 Hz, 6H). Exemplo 121. Síntese de 2-(dietoximetil)tiazol-4-carboxilato de etila
[00303] 90 g de peneiras moleculares (3Å) foram adicionados a uma mistura de 2,2-dietoxietanotioamida (100 g, 0,61 mol, 1,0 eq.) e bromopiruvato de etila (142 mL, 1,1 mol, 1,8 eq.) em 1 L de EtOH. A mistura foi submetida ao refluxo (temperatura interna próxima de 60ºC) por 1 hora, depois o etanol foi removido em rotovap e o resíduo coletado em diclorometano. O sólido foi separado por filtração e o filtrado foi concentrado e purificado por cromatografia em coluna (PE/EtOAc 5:1-3:1) para fornecer o composto do título (tiazol-carboxilato) (130 g, 82% de rendimento) como um óleo amarelo. Exemplo 122. Síntese de 2-formiltiazol-4-carboxilato de etila
[00304] A uma solução de 2-(dietoximetil)tiazol-4-carboxilato (130 g,
288 / 439 0,50 mol) em acetona (1,3 L), adicionou-se HCl 2 N (85 mL, 0,165 mol, 0,33 eq.). A mistura de reação foi submetida ao refluxo (temperatura interna próxima de 60ºC), monitorada por análise por TLC até que o material de partida tivesse sido completamente consumido (aproximadamente 1-2 horas). A acetona foi removida sob pressão reduzida e o resíduo coletado em diclorometano (1,3 L), lavado com solução saturada de NaHCO3, água e salmoura e, a seguir, seco com Na2SO4 anidro. A solução foi filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por recristralização em éter de petróleo e éter dietílico para fornecer o composto do título como um sólido branco (40 g, 43% de rendimento). RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ 10,08-10,06 (m, 1H), 8,53-8,50 (m, 1H), 4,49 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 1,44 (t, J = 7,1 Hz, 3H). MS ESI m/z calculado para C7H8NO3S [M+H]+ 186,01; encontrado 186,01. Exemplo 123. Síntese de 2-((R,E)-3-(((S)-terc-butilsulfinil)imino)-1-hidroxi- 4-metilpentil)tiazol-4-carboxilato de etila
[00305] A uma solução de diisopropilamina (121 mL, 0,86 mol, 4,0 eq.) em THF seco (300 mL), adicionou-se n-butil-lítio (2,5 M, 302 mL, 0,76 mol 3,5 eq.) a -78ºC sob N2. A mistura de reação foi aquecida até 0ºC ao longo de 30 minutos e, então, resfriada de volta para -78ºC. (S,E)-2-metil-N- (3-metilbutan-2-ilideno)propano-2-sulfonamida (57 g, 0,3 mol, 1,4 eq.) em THF (200 mL) foi adicionada. A mistura de reação foi agitada por 1 hora antes de ClTi(OiPr)3 (168,5 g, 0,645 mol, 3,0 eq.) em THF (350 mL) ser adicionado gota a gota. Após agitação por 1 hora, 2-formiltiazol-4-carboxilato de etila (40 g, 0,215 mol, 1,0 eq.) dissolvido em THF (175 mL) foi adicionado gota a gota e a mistura de reação resultante foi agitada por 2 horas. A conclusão da reação foi indicada por análise por TLC. A reação foi interrompida por uma mistura de ácido acético e THF (v/v 1:4, 200 mL),
289 / 439 depois vertida em água gelada e extraída com EtOAc (4 × 500 mL). A fase orgânica foi lavada com água e salmoura, seca com Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (DCM/EtOAc/PE 2:1:2) para fornecer o composto do título (60 g, 74% de rendimento) como um óleo incolor. RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ 8,13 (s, 1H), 6,63 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,20-5,11 (m, 1H), 4,43 (q, J = 7,0 Hz, 2H), 3,42-3,28 (m, 2H), 2,89 (dt, J = 13,1; 6,5 Hz, 1H), 1,42 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 1,33 (s, 9H), 1,25-1,22 (m, 6H). MS ESI m/z calculado para C16H26NaN2O4S2 [M+Na]+ 397,13; encontrado 397,11. Exemplo 124. Síntese de 2-((1R,3R)-3-((S)-1,1-dimetiletilsulfinamido)-1- hidroxi-4-metilpentil)tiazol-4-carboxilato de etila
[00306] Uma solução de 2-((R,E)-3-(((S)-terc-butilsulfinil)imino)-1- hidroxi-4-metilpentil)tiazol-4-carboxilato de etila (23,5 g, 62,7 mmol) dissolvido em THF (200 mL) foi resfriada até -45ºC. Ti(OEt)4 (42,9 mL, 188 mmol, 3,0 eq.) foi adicionado lentamente. Depois de concluída a adição, a mistura foi agitada por 1 hora antes de NaBH4 (4,75 g, 126 mmol, 2,0 eq.) ser adicionado de porção em porção. A mistura de reação foi agitada a -45ºC por 3 horas. A análise por TLC mostrou que algum material de partida ainda permanecia. A reação foi interrompida com HOAc/THF (v/v 1:4, 25 mL), seguido por EtOH (25 mL). A mistura de reação foi vertida em gelo (100 g) e aquecida até a temperatura ambiente Após filtração sobre Celite, a fase orgânica foi separada e lavada com água e salmoura, seca com Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (EtOAc/PE 1:1) para fornecer o produto do título (16,7 g, 71% de rendimento) como um sólido branco. RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ 8,10 (s, 1H), 5,51 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 5,23-5,15 (m, 1H), 4,41 (q, J = 7,0 Hz, 2H), 3,48-3,40 (m, 1H), 3,37 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 2,29 (t, J = 13,0 Hz, 1H), 1,95-
290 / 439 1,87 (m, 1H), 1,73-1,67 (m, 1H), 1,40 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 1,29 (s, 9H), 0,93 (d, J = 7,3 Hz, 3H), 0,90 (d, J = 7,2 Hz, 3H). MS ESI m/z calculado para C16H28NaN2O4S2 [M+Na]+ 399,15; encontrado 399,14. Exemplo 125. Síntese de 2-((1R,3R)-3-amino-1-hidroxi-4-metilpentil)tiazol- 4-carboxilato de etila, cloridrato
[00307] A uma solução de 2-((1R,3R)-3-((S)-1,1- dimetiletilsulfinamido)-1-hidroxi-4-metilpentil)tiazol-4-carboxilato de etila (6,00 g, 16,0 mmol, 1,0 eq.) em etanol (40 mL), adicionou-se HCl 4 N em dioxano (40 mL) lentamente a 0ºC. A reação foi deixada aquecer até a temperatura ambiente e agitada por 2,5 horas, então concentrada e triturada com éter de petróleo. O composto do título foi coletado como um sólido branco (4,54 g, 92% de rendimento) e usado na etapa seguinte. Exemplo 126. Síntese de 2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-2-azido-3- metilpentanamido)-1-hidroxi-4-metilpentil)tiazol-4-carboxilato de etila
[00308] Ácido (2S,3S)-2-azido-3-metilpentanoico (5,03g, 28,8 mmol, 2,0 eq.) foi dissolvido em THF (120 mL) e resfriado até 0ºC, ao qual, foram adicionados NMM (6,2 mL, 56,0 mmol, 4,0 eq.) e cloroformato de isobutila (3,7 mL, 28,8 mmol, 2,0 eq.) em sequência. A reação foi agitada a 0ºC por 30 minutos e à temperatura ambiente por 1,0 hora e, a seguir, resfriada de volta para 0ºC. 2-((1R,3R)-3-amino-1-hidroxi-4-metilpentil)tiazol-4-carboxilato de etila, cloridrato (4,54 g, 14,7 mmol, 1,0 eq.) foi adicionado de porção em porção. Após agitação a 0ºC por 30 minutos, a reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 2 horas. Adicionou-se água a 0ºC para interromper a reação e a mistura resultante foi extraída com acetato de etila
291 / 439 três vezes. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com HCl 1N, NaHCO3 saturado e salmoura, secas com Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (EtOAc/PE 0-30%) para fornecer um sólido branco o composto do título (4,55 g, 74% de rendimento). Exemplo 127. Síntese de 2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-2-azido-3- metilpentanamido)-4-metil-1-((trietilsilil)oxi)pentil)tiazol-4-carboxilato de etila
[00309] A uma solução de 2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-2-azido-3- metilpentanamido)-1-hidroxi-4-metilpentil)tiazol-4-carboxilato de etila (5,30 g, 12,8 mmol, 1,0 eq.) em CH2Cl2 (50 mL), adicionou-se imidazol (1,75 g, 25,6 mmol, 2,0 eq.), seguido por clorotrietilsilano (4,3 mL, 25,6 mmol, 2,0 eq.) a 0ºC. A mistura de reação foi deixada aquecer até a temperatura ambiente ao longo de 1 hora e agitada por mais uma hora. Adicionou-se salmoura à mistura de reação, a camada orgânica foi separada e a camada aquosa extraída com EtOAc. As fases orgânicas combinadas foram secas, filtradas, concentradas sob pressão reduzida e purificadas por cromatografia em coluna com gradiente de EtOAc 15-35% em éter de petróleo para fornecer o produto do título (6,70 g , 99% de rendimento) como um sólido branco. RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ 8,12 (s, 1H), 6,75 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 5,20- 5,12 (m, 1H), 4,44 (q, J = 7,0 Hz, 2H), 4,06-3,97 (m, 1H), 3,87 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 2,14 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 2,01-1,91 (m, 3H), 1,42 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 1,34-1,25 (m, 2H), 1,06 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,00-0,93 (m, 18H), 0,88 (dd, J = 19,1; 6,8 Hz, 6H). MS ESI m/z calculado para C24H44N5O4SSi [M+H]+ 526,28; encontrado 526,28. Exemplo 128. Síntese de 2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-2-azido-N,3-
292 / 439 dimetilpentanamido)-4-metil-1-((trietilsilil)oxi)pentil)tiazol-4-carboxilato de etila
[00310] Uma solução de 2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-2-azido-3- metilpentanamido)-4-metil-1-((trietilsilil)oxi)pentil)tiazol-4-carboxilato de etila (5,20 g, 9,9 mmol, 1,0 eq.) em THF (50 mL) foi resfriada até -45ºC e KHMDS (1M em tolueno, 23,8 mL, 23,8 mmol, 2,4 eq.) foi adicionado. A mistura resultante foi agitada a -45ºC por 20 minutos, seguido pela adição de iodeto de metila (1,85 mL, 29,7 mmol, 3,0 eq.). A mistura de reação foi aquecida até a temperatura ambiente durante 4,5 horas, então a reação foi interrompida com EtOH (10 mL). O produto bruto foi diluído com EtOAc (250 mL) e lavado com salmoura (100 mL). A camada aquosa foi extraída com EtOAc (3 × 50 mL). As camadas orgânicas foram secas, filtradas, concentradas e purificadas por cromatografia em coluna com gradiente de EtOAc 15-35% em éter de petróleo para fornecer o produto do título (3,33 g, 63% de rendimento) como um óleo amarelo claro. RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ 8,09 (s, 1H), 4,95 (d, J = 6,6 Hz, 1H),4,41 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 3,56 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 2,98 (s, 3H), 2,27-2,06 (m, 4H), 1,83-1,70 (m, 2H), 1,41 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 1,29 (ddd, J = 8,9; 6,8; 1,6 Hz, 3H), 1,01 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 0,96 (dt, J = 8,0; 2,9 Hz, 15H), 0,92 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 0,90 (d, J = 6,7 Hz,3H). MS ESI m/z calculado para C25H46N5O4SSi [M+H]+ 540,30; encontrado 540,30. Exemplo 129. Síntese de 2-((3S,6R,8R)-3-((S)-sec-butil)-10,10-dietil-6- isopropil-5-metil-1-((R)-1-metilpiperidin-2-il)-1,4-dioxo-9-oxa-2,5-diaza-10- siladodecan-8-il)tiazol-4-carboxilato de etila
293 / 439
[00311] Pd/C seco (10% em peso, 300 mg) e 2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-2- azido-N,3-dimetilpentanamido)-4-metil-1-((trietilsilil)oxi)pentil)tiazol-4- carboxilato de etila (3,33 g, 6,61 mmol) foram adicionados a 1- metilpiperidina-2-carboxilato de (R)-perfluorofenila em EtOAc. A mistura de reação foi agitada sob atmosfera de hidrogênio por 27 horas e, a seguir, filtrada através de um tampão de Celite, sendo a camada filtrante lavada com EtOAc. As porções orgânicas combinadas foram concentradas e purificadas por cromatografia em coluna com gradiente de metanol 0-5% em EtOAc para fornecer o produto do título (3,90 g, 86% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C32H59N4O5SSi [M+H]+ 639,39; encontrado 639,39. Exemplo 130. Síntese de 2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-N,3-dimetil-2-((R)-1- metilpiperidina-2-carboxamido)pentanamido)-1-hidroxi-4-metilpentil)tiazol- 4-carboxilato de etila
[00312] 2-((3S,6R,8R)-3-((S)-sec-butil)-10,10-dietil-6-isopropil-5- metil-1-((R)-1-metilpiperidin-2-il)-1,4-dioxo-9-oxa-2,5-diaza-10-siladodecan- 8-il)tiazol-4-carboxilato de etila (3,90 g, 6,1 mmol) foi dissolvido em AcOH desoxigenada/água/THF (v/v/v 3:1:1, 100 mL) e agitada à temperatura ambiente por 48 horas. A reação foi então concentrada e purificada por cromatografia em coluna de SiO2 (MeOH/EtOAc 2:98 para 15:85) para fornecer o composto do título (2,50 g, 72% de rendimento em 2 etapas). MS ESI m/z calculado para C26H45N4O5S [M+H]+ 525,30; encontrado 525,33. Exemplo 131. Síntese de ácido 2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-N,3-dimetil-2-((R)-1- metilpiperidina-2-carboxamido)pentanamido)-1-hidroxi-4-metilpentil)tiazol- 4-carboxílico.
294 / 439
[00313] Uma solução aquosa de LiOH (0,4 N, 47,7 mL, 19,1 mmol, 4,0 eq.) foi adicionada a uma solução de 2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-N,3-dimetil- 2-((R)-1-metilpiperidina-2-carboxamido)-pentanamido)-1-hidroxi-4- metilpentil)tiazol-4-carboxilato de etila (2,50 g, 4,76 mmol, 1,0 eq.) em dioxano (47,7 mL) a 0ºC. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas e então concentrada. A purificação por cromatografia em coluna de SiO2 (CH2Cl2100% depois CH2Cl2/MeOH/NH4OH 80:20:1) forneceu o composto do título (2,36 g, 99% de rendimento) como um sólido amorfo. MS ESI m/z calculado para C24H41N4O5S [M+H]+ 497,27; encontrado 497,28. Exemplo 132. Síntese de ácido 2-((1R,3R)-1-acetoxi-3-((2S,3S)-N,3-dimetil- 2-((R)-1-metilpiperidina-2-carboxamido)pentanamido)-4-metilpentil)tiazol-4- carboxílico
[00314] A uma solução de ácido 2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-N,3-dimetil-2- ((R)-1-metilpiperidina-2-carboxamido)pentanamido)-1-hidroxi-4- metilpentil)tiazol-4-carboxílico (2,36 g, 4,75 mmol) em piridina (50 mL) a 0ºC, adicionou-se anidrido acético (2,25 mL, 24 mmol) lentamente. A mistura de reação foi aquecida até a temperatura ambiente ao longo de 2 horas e agitada à temperatura ambiente por 24 horas. A reação foi concentrada e o resíduo foi purificado por HPLC de fase reversa (Coluna C18, 50 mm (d) x 250 (mm), 50 mL/minutos acetonitrila/água 10-90% em 45 minutos) para fornecer o composto do título (2,25 g, 88% de rendimento) como um sólido branco amorfo. MS ESI m/z calculado para C26H43N4O6S [M+H]+ 539,28; encontrado 539,28. Exemplo 133. Síntese de acetato de (1R,3R)-3-((2S,3S)-N,3-dimetil-2-((R)-1- metilpiperidina-2-carboxamido)pentanamido)-4-metil-1-(4-
295 / 439 (perfluorobenzoil)tiazol-2-il)pentila
[00315] A uma solução de ácido 2-((1R,3R)-1-acetoxi-3-((2S,3S)-N,3- dimetil-2-((R)-1-metil-piperidina-2-carboxamido)pentanamido)-4- metilpentil)tiazol-4-carboxílico (860 mg, 1,60 mmol, 1,0 eq.) em diclorometano (20 mL), adicionou-se pentafluorofenol (440 mg, 2,40 mmol, 1,5 eq.) e N,N’-diisopropilcarbodiimida (220 mg, 1,75 mmol, 1,1 eq.) a 0ºC. A mistura de reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada durante a noite. Após o solvente ter sido removido sob pressão reduzida, a mistura de reação foi diluída com EtOAc (20 mL), então filtrada sobre Celite. O filtrado foi concentrado e purificado por cromatografia em coluna de SiO2 (1:10 to 1:3 EtOAc/DCM) para fornecer o composto do título (935,3 mg, 82% de rendimento), que foi usado diretamente para a etapa seguinte. MS ESI m/z calculado para C32H42F5N4O6S [M+H]+ 704,28; encontrado 704,60. Exemplo 134. Síntese de 2-((6S,9R,11R)-6-((S)-sec-butil)-13,13-dietil-9- isopropil-2,3,3,8-tetrametil-4,7-dioxo-12-oxa-2,5,8-triaza-13-silapentadecan- 11-il)tiazol-4-carboxilato de etila
[00316] Pd/C seco (10% em peso, 300 mg) e 2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-2- azido-N,3-dimetilpentanamido)-4-metil-1-((trietilsilil)oxi)pentil)tiazol-4- carboxilato de etila (3,33 g, 6,16 mmol) foram adicionados a 2- (dimetilamino)-2-metilpropanoato de perfluorofenila (~2,75 g, 1,5 eq., bruto) em EtOAc. A mistura de reação foi agitada sob atmosfera de hidrogênio por 27 horas e, a seguir, filtrada através de um tampão de Celite, sendo a camada filtrante lavada com EtOAc. As porções orgânicas combinadas foram concentradas e purificadas por cromatografia em coluna com gradiente de
296 / 439 metanol 0-5% em EtOAc para fornecer o produto do título (3,24 g, 84% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C31H59N4O5SSi [M+H]+ 626,39; encontrado 626,95. Exemplo 135. Síntese de 2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-2-(2-(dimetilamino)-2- metilpropanamido)-N,3-dimetilpentanamido)-1-hidroxi-4-metilpentil)tiazol- 4-carboxilato de etila
[00317] 2-((6S,9R,11R)-6-((S)-sec-butil)-13,13-dietil-9-isopropil- 2,3,3,8-tetrametil-4,7-dioxo-12-oxa-2,5,8-triaza-13-silapentadecan-11- il)tiazol-4-carboxilato de etila (3,20 g, 5,11 mmol) foi dissolvido em AcOH desoxigenado/água/THF (v/v/v 3:1:1, 100 mL) e agitado à temperatura ambiente por 48 horas. A reação foi então concentrada e purificada por cromatografia em coluna de SiO2 (MeOH/EtOAc 2:98 para 15:85) para fornecer o composto do título (2,33 g, 89% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C25H45N4O5S [M+H]+ 512,30; encontrado 512,45. Exemplo 136. Síntese de ácido 2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-2-(2-(dimetilamino)-2- metilpropanamido)-N,3-dimetilpentanamido)-1-hidroxi-4-metilpentil)tiazol- 4-carboxílico
[00318] Uma solução aquosa de LiOH (0,4 N, 47,7 mL, 19,1 mmol, 4,0 eq.) foi adicionada a uma solução de 2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-2-(2- (dimetilamino)-2-metilpropanamido)-N,3-dimetilpentanamido)-1-hidroxi-4- metilpentil)tiazol-4-carboxilato de etila (2,30 g, 4,50 mmol, 1,0 eq.) em dioxano (50 mL) a 0ºC. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas e então concentrada. A purificação por cromatografia em coluna de SiO2 (CH2Cl2100% depois CH2Cl2/MeOH/NH4OH 80:20:1)
297 / 439 forneceu o composto do título (2,13 g, 98% de rendimento) como um sólido amorfo. MS ESI m/z calculado para C23H41N4O5S [M+H]+ 485,27; encontrado 485,55. Exemplo 137. Síntese de ácido 2-((6S,9R,11R)-6-((S)-sec-butil)-9-isopropil- 2,3,3,8-tetrametil-4,7,13-trioxo-12-oxa-2,5,8-triazatetradecan-11-il)tiazol-4- carboxílico.
[00319] A uma solução de ácido 2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-2-(2- (dimetilamino)-2-metilpropanamido)-N,3-dimetilpentanamido)-1-hidroxi-4- metilpentil)tiazol-4-carboxílico (2,10 g, 4,33 mmol) em piridina (50 mL) a 0ºC, adicionou-se anidrido acético (2,25 mL, 24 mmol) lentamente. A mistura de reação foi aquecida até a temperatura ambiente durante 2 horas e agitada à temperatura ambiente por 24 horas. A reação foi concentrado e o resíduo foi purificado por HPLC de fase reversa (Coluna C18, 50 mm (d) x 250 (mm), 50 mL/minuto, acetonitrila/água 10-90% em 45 minutos) para fornecer o composto do título (1,95 g, 86% de rendimento) como um sólido branco amorfo. MS ESI m/z calculado para C25H43N4O6S [M+H]+ 526,28; encontrado 526,80. Exemplo 138. Síntese de 2-((6S,9R,11R)-6-((S)-sec-butil)-9-isopropil-2,3,3,8- tetrametil-4,7,13-trioxo-12-oxa-2,5,8-triazatetradecan-11-il)tiazol-4- carboxilato de perfluorofenila
[00320] A uma solução de ácido 2-((6S,9R,11R)-6-((S)-sec-butil)-9- isopropil-2,3,3,8-tetrametil-4,7,13-trioxo-12-oxa-2,5,8-triazatetradecan-11- il)tiazol-4-carboxílico (1,90 g, 3,61 mmol, 1,0 eq.) em diclorometano (70 mL), adicionou-se pentafluorofenol (1,00 g, 5,43 mmol, 1,5 eq.) e N,N’-
298 / 439 diisopropilcarbodiimida (512 mg, 3,96 mmol, 1,1 eq.) a 0ºC. A mistura de reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada durante a noite. Após o solvente ter sido removido sob pressão reduzida, a mistura de reação foi diluída com EtOAc (80 mL) e filtrada sobre Celite. O filtrado foi concentrado e purificado por cromatografia em coluna de SiO2 (EtOAc/DCM 1:10 para 1:3) para fornecer o composto do título (2,09 g, 84% de rendimento), que foi usado diretamente para a etapa seguinte. MS ESI m/z calculado para C31H42F5N4O6S [M+H]+ 693,27; encontrado 693,60. Exemplo 139. Síntese de 2-(trifenilfosforanililideno)propanoato de terc-butila Ph3P CO2tBu
[00321] A mistura de 2-bromopropanoato de terc-butila (15,5 g, 74,1 mmol, 1,0 eq.) e trifenilfosfina (19,4 g, 74,1 mmol, 1,0 eq.) em acetonitrila seca (45 mL) foi agitada à temperatura ambiente por 18 horas. A acetonitrila foi removida sob pressão reduzida e tolueno foi adicionado para fragmentar um precipitado branco. O tolueno foi então decantado e o sólido branco foi dissolvido em diclorometano (100 mL) e transferido para um funil separador. NaOH 10% (100 mL) foi adicionado ao funil, e a camada orgânica tornou-se imediatamente amarela depois de agitação. A camada orgânica foi separada e a camada aquosa extraída com diclorometano (30 mL) uma vez. As camadas de diclorometano foram combinadas e lavada com salmoura (50 mL) uma vez, depois secas com Na2SO4, filtradas e concentradas fornecendo o ileto como um sólido amarelo (16,8 g, 58%). Exemplo 140. Síntese de 3-(4-(benziloxi)fenil)-2-((terc-butoxi carbonil)amino)propanoato de (S)-metila
[00322] A uma mistura de Boc-L-Tir-OMe (20,0 g, 67,7 mmol, 1,0 eq.), K2CO3 (14,0 g, 101,6 mmol, 1,5 eq.) e KI (1,12 g, 6,77 mmol, 0,1 eq.)
299 / 439 em acetona (100 mL), adicionou-se BnBr (10,5 mL, 81,3 mmol, 1,2 eq.) lentamente. A mistura foi então submetida ao refluxo durante a noite. Adicionou-se água (250 mL) e a mistura de reação foi extraída com EtOAc (3×100 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (300 mL), secas com Na2SO4 anidro, filtradas, concentradas e purificadas por cromatografia em coluna de SiO2 (hexanos/EtOAc 4:1) para fornecer um sólido branco o composto do título (26,12 g, 99% de rendimento). RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ 7,44-7,41 (m, 2H), 7,41-7,36 (m, 2H), 7,35-7,30 (m, 1H), 7,04 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 6,93-6,89 (m, 2H), 5,04 (s, 2H), 4,97 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 4,55 (d, J = 6,9 Hz, 1H), 3,71 (s, 3H), 3,03 (dd, J = 14,4; 5,7 Hz, 2H), 1,44 (d, J = 18,6 Hz, 10H). MS ESI m/z calculado para C22H27NO5Na [M+Na]+ 408,18; encontrado 408,11. Exemplo 141. Síntese de (1-(4-(benziloxi)fenil)-3-oxopropan-2-il)carbamato de (S)-terc-butila BocHN
CHO OBn
[00323] A uma solução de 3-(4-(benziloxi)fenil)-2-((terc-butoxi carbonil)amino)-propanoato de (S)-metila (26,1 g, 67,8 mmol, 1,0 eq.) em diclorometano anidro (450 mL) a -78ºC, adicionou-se DIBAL (1,0 M em hexanos, 163 mL, 2,2 eq. ) em 1 hora. A mistura foi agitada a -78ºC por 3 horas e, a seguir, interrompida com 50 mL de etanol. HCl 1N foi adicionado gota a gota até ter sido atingido pH 4. A mistura resultante foi deixada aquecer até 0ºC. As camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída mais com EtOAc (3 × 100 mL). A solução orgânica combinada foi lavada com salmoura, seca com Na2SO4 anidro e concentrada. A trituração com PE/EtOAc e filtração forneceram o composto do título como um sólido branco (18,3 g, 76% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C22H27NO5Na [M+Na]+ 378,11; encontrado 378,11. Exemplo 142. Síntese de 5-(4-(benziloxi)fenil)-4-((terc-
300 / 439 butoxicarbonil)amino)-2-metilpent-2-enoato de (S,Z)-terc-butila BocHN tBuO 2C OBn
[00324] (1-(4-(benziloxi)fenil)-3-oxopropan-2-il)carbamato de (S)- terc-butila (0,84 g, 2 mmol, 1,0 eq.) foi dissolvido em diclorometano seco (50 mL), ao qual, se adicionou 2-(trifenil-fosforanilideno)propanoato de terc- butila (1,6 g, 4 mmol, 2,0 eq.) e a solução foi agitada à temperatura ambiente por 1,5 h até determinada completa por TLC. A purificação por cromatografia em coluna (EtOAc/hexanos 10-50%) forneceu o composto do título (1,16g, 98% de rendimento). Exemplo 143. Síntese de 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-5-(4- hidroxifenil)-2- metilpentanoato de (4R)-terc-butila
[00325] 5-(4-(benziloxi)fenil)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2- metilpent-2-enoato de (S,Z)-terc-butila (467 mg，1 mmol) foi dissolvido em metanol (30 mL) e hidrogenado (1 atm.) com catalisador de Pd/C (10% em peso, 250 mg) à temperatura ambiente durante a noite. O catalisador foi removido por filtração e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para fornecer o composto do título (379 mg, 99% de rendimento). Exemplo 144. Síntese de 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-5- (4-hidroxi-3- nitrofenil)-2-metilpentanoato de (4R)-terc-butila
[00326] 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-5-(4-hidroxifenil)-2- metilpentanoato de (4R)-terc-butila (379 mg, 1 mmol, 1,0 eq.) foi dissolvido em THF (20 mL), ao qual, se adicionou uma solução de nitrito de terc-butila (315 mg, 3 mmol, 3,0 eq.) em THF (2 mL). A reação foi agitada à temperatura ambiente por 3 horas e depois vertida em água, extraída com
301 / 439 EtOAc (2 × 50 mL). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (50 mL), secas com Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas. A purificação por cromatografia em coluna (EtOAc/hexanos 10-50%) forneceu o composto do título (300 mg, 71% de rendimento). Exemplo 145. Síntese de 5-(3-amino-4-hidroxifenil)-4-((terc- butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (4R)-terc-butila
[00327] 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-5-(4-hidroxi-3-nitrofenil)-2- metil-pentanoato de (4R)-terc-butila (200 mg, 0.47 mmol) foi dissolvido em EtOAc (30 mL) e misturado com catalisador de paládio (10% em carbono, 100 mg), depois hidrogenado (1 atm.) à temperatura ambiente por 2 horas. O catalisador foi filtrado e todos os voláteis foram removidos sob vácuo, fornecendo o composto do título (185 mg, 99%).
[00328] Alternativamente, 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-5-(4- hidroxi-3-nitrofenil)-2-metilpentanoato de (4R)-terc-butila (56 mg, 0,132 mmol) foi dissolvido em EtOAc (20 mL) e misturado com catalisador de Pd/C (10% em peso, 50 mg) e hidrogenado (1 atm.) à temperatura ambiente por 3 horas. O catalisador foi filtrado e todos os voláteis foram removidos sob vácuo para fornecer o composto do título (52 mg, 99% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C21H35N2O5 [M+H]+ 395,25; encontrado 395,26. Exemplo 146. Síntese de 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-5-(4- ((terc- butildimetilsilil)oxi)-3-nitrofenil)-2-metilpentanoato de (4R)-terc-butila
[00329] A uma solução de 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-5- (4- hidroxi-3-nitrofenil)-2-metilpentanoato de (4R)-terc-butila (424 mg, 1 mmol) em DCM (20 mL), foram adicionados imidazol (408 mg, 6 mmol) e terc- butilclorodimetilsilano (602 mg, 4 mmol). A solução resultante foi agitada à
302 / 439 temperatura ambiente por 3 horas. Depois disso, a mistura de reação foi lavada com salmoura (50 mL), seca com Na2SO4 anidro, concentrada e purificada por cromatografia em coluna (EtOAc/hexanos 10% para 30%) para fornecer o composto do título (344 mg, 64% de rendimento). Exemplo 147. Síntese de 5-(3-amino-4-((terc-butildimetilsilil)oxi)fenil)-4- ((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (4R)-terc-butila
[00330] 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-5-(4-((terc- butildimetilsilil)oxi)-3-nitrofenil)-2-metilpentanoato de (4R)-terc-butila (200 mg, 0,37 mmol) foi dissolvido em EtOAc (30 mL), misturado com catalisador de paládio (10% em peso em carbono, 100 mg) e hidrogenado (1 atm.) à temperatura ambiente por 2 horas. O catalisador foi filtrado e todos os voláteis foram removidos sob vácuo para fornecer o composto do título (187 mg, 99% de rendimento). Exemplo 148. Síntese de 1-azido-14,17-dimetil-12,15-dioxo-3,6,9-trioxa- 13,16-diazaoctadecan-18-oato de 2-(1-azido-14,17-dimetil-12,15-dioxo-3,6,9- trioxa-13,16-diazaoctadecanamido)-4-((2R)-5-(terc-butoxi)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)-4-metil-5-oxopentil)fenila
[00331] A uma solução de ácido 1-azido-14,17-dimetil-12,15-dioxo- 3,6,9-trioxa-13,16-diazaoctadecan-18-oico (1,50 g, 3,85 mmol) e 5-(3-amino- 4-hidroxifenil)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (4R)- terc-butila (0,75 g, 1,90 mmol) em DMA (40 mL), adicionou-se EDC (2,05 g, 10,67 mmol) e DIPEA (0,70 mL, 4,0 mmol). A mistura foi agitada durante a
303 / 439 noite, concentrada e purificada em coluna de SiO2, eluindo com EtOAc/CH2Cl2 (1:5 para 1:1) para fornecer o composto do título (2,01 g, 82% de rendimento, ~95% puro por HPLC). MS ESI m/z calculado para C51H85N12O17 [M+H]+ 1137,61; encontrado 1137,90. Exemplo 149. Síntese de 5-(22,23-bis(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)- 3,6,39,42-tetrametil-2,5,8,21,24,37,40,43-octaoxo- 3,4,5,6,7,8,9,10,12,13,15,16,18,19,20,21,22,23, 24,25,26,27,29,30,32,33,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44-hexatriacontahidro- 2H-benzo[b][1,14,17,20,31,34,37,4,7,10,23,28,41,44]heptaoxa-hepta- azaciclohexatetracontin-46-il)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2- metilpentanoato de (4R)-terc-butila
[00332] 1-azido-14,17-dimetil-12,15-dioxo-3,6,9-trioxa-13,16- diazaoctadecan-18-oato de 2-(1-azido-14,17-dimetil-12,15-dioxo-3,6,9-trioxa- 13,16-diazaoctadecanamido)-4-((2R)-5-(terc-butoxi)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)-4-metil-5-oxopentil)fenila (900 mg, 0,79 mmol) foi dissolvido em EtOAc (30 mL), misturado com catalisador de paládio (10% em peso em carbono, 100 mg) e hidrogenado (1 atm.) à temperatura ambiente por 4 horas. O catalisador foi filtrado e todos os voláteis foram removidos sob vácuo para fornecer 1-amino-14,17-dimetil-12,15-dioxo-3,6,9-trioxa-13,16- diazaoctadecan-18-oato de 2-(1-amino-14,17-dimetil-12,15-dioxo-3,6,9-
304 / 439 trioxa-13,16-diazaoctadecanamido)-4-((2R)-5-(terc-butoxi)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)-4-metil-5-oxopentil)fenila (815 mg, 96% de rendimento) que foi usado imediatamente sem purificação adicional. MS ESI m/z calculado para C51H88N8O17 [M+H]+ 1085,62; encontrado 1085,95.
[00333] Ao composto diamino (810 mg, 0,75 mmol) e ácido 2,3- bis(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)succínico (231 mg, 0,75 mmol) em DMA (10 mL), adicionou-se EDC (1,25 g, 6,51 mmol) e DIPEA (0,35 mL, 2,0 mmol). A mistura foi agitada durante a noite, concentrada e purificada em coluna de SiO2, eluindo com EtOAc/CH2Cl2 (1:5 para 1:1) para fornecer o composto do título (844 mg, 83% de rendimento, ~95% puro por HPLC). MS ESI m/z calculado para C63H92N10O23 [M+H]+ 1357,63; encontrado 1357,95. Exemplo 150. Síntese de (2R)-1-(22,23-bis(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol- 1-il)-3,6,39,42-tetrametil-2,5,8,21,24,37,40,43-octaoxo- 3,4,5,6,7,8,9,10,12,13,15,16,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,29, 30,32,33,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44-hexatriacontahidro-2H- benzo[b][1,14,17,20,31,34,37,4,7,10,23,28,41,44]heptaoxahepta- azaciclohexatetracontin-46-il)-4-carboxipentan-2-amínio
[00334] 5-(22,23-bis(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-3,6,39,42- tetrametil-2,5,8,21,24,37,40,43-octaoxo- 3,4,5,6,7,8,9,10,12,13,15,16,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,29,30,32,33,35,36 ,37,38,39,40,41,42,43,44-hexatriacontahidro-2H-benzo[b][1,14,17,20,31,34, 37,4,7,10,23,28,41,44]heptaoxa-hepta-azaciclohexatetracontin-46-il)-4-((terc- butoxicarbonil)-amino)-2-metilpentanoato de (4R)-terc-butila (840 mg, 0,62 mmol) foi dissolvido na mistura de CH2Cl2 (6 mL) e TFA (4 mL). A mistura foi agitada durante a noite, diluída com tolueno (10 mL) e concentrada para
305 / 439 fornecer o composto do título (7,43 g, 100% de rendimento, ~91% puro por HPLC) que foi usado para a etapa seguinte sem purificação adicional. MS ESI m/z calculado para C54H76N10O21 [M+H]+ 1200,51; encontrado 1200,95. Exemplo 151. Síntese de ácido (4R)-4-(2-((1R,3R)-1-acetoxi-3-((2S,3S)-N,3- dimetil-2-((R)-1-metilpiperidina-2-carboxamido)pentanamido)-4- metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-5-(3-(3-(2-(2- azidoetoxi)etoxi)propanamido)-4-hidroxifenil)-2-metilpentanoico
[00335] A uma solução de ácido (4R)-4-(2-((1R,3R)-1-acetoxi-3- ((2S,3S)-N,3-dimetil-2-((R)-1-metilpiperidina-2-carboxamido)pentanamido)- 4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-5-(3-amino-4-hidroxifenil)-2- metilpentanoico (Huang Y. et al, Med Chem. #44, 249th ACS National Meeting, Denver, CO, Mar. 22~26, 2015; WO2014009774) (100 mg, 0,131 mmol) na mistura de DMA (10 mL) e solução tampão NaH2PO4 (pH 7,5, 1.0 M, 0,7 mL), adicionou-se 3-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)propanoato de 2,5- dioxopirrolidin-1-ila (80,0 mg, 0,266 mmol) em quatro porções durante 2 horas. A mistura foi agitada durante a noite, concentrada e purificada por HPLC preparativa em coluna C18 (3,0 × 25 cm, 25 mL/min.), eluindo com água/metanol 80% para água/metanol 10% em 45 minutos para fornecer o composto do título (101,5 mg, 82% de rendimento). LC-MS (ESI) m/z calculado para C45H70N9O11S [M+H]+: 944,48; encontrado: 944,70. Exemplo 152. Síntese de ácido (4R)-4-(2-((1R,3R)-1-acetoxi-3-((2S,3S)-N,3- dimetil-2-((R)-1-metil-piperidina-2-carboxamido)pentanamido)-4- metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-5-(3-(3-(2-(2- aminoetoxi)etoxi)propanamido)-4-hidroxifenil)-2-metilpentanoico
306 / 439
[00336] A uma solução de ácido (4R)-4-(2-((1R,3R)-1-acetoxi-3- ((2S,3S)-N,3-dimetil-2-((R)-1-metilpiperidina-2-carboxamido)pentanamido)- 4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-5-(3-(3-(2-(2- azidoetoxi)etoxi)propanamido)-4-hidroxifenil)-2-metilpentanoico (100,0 mg, 0,106 mmol) em metanol (25 mL), contendo HCl 0,1% em um frasco de hidrogenação, adicionou-se Pd/C (25 mg, 10% Pd, 50% úmido). Depois de conduzida a retirada do ar a vácuo para fora do vaso e H2 35 psi, a mistura foi agitada por 4 horas e filtrada através de Celite. O filtrado foi concentrado e purificado por HPLC preparativa em C18 (3,0 × 25 cm, 25 mL/min.), eluindo com água/metanol de 85% para água/metanol 15% em 45 minutos para fornecer o composto do título (77,5 mg, 79% de rendimento). LC-MS (ESI) m/z calculado para C45H72N7O11S [M+H]+: 918,49; encontrado: 918,60. Exemplo 153. Síntese de 5-(4-acetoxi-3-nitrofenil)-4-((terc- butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (4R)-terc-butila
[00337] A uma solução do composto 190 (107,1 mg, 0,252 mmol) em diclorometano (4,0 mL) a 0ºC , adicionou-se anidrido acético (0,11 mL, 1,17 mmol) e trietilamina (0,16 mL) em sequência. A reação foi então aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 1 hora, diluída com diclorometano e lavada com água e salmoura, seca com Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (EA/PE 0-15%) para fornecer um óleo incolor (120,3 mg, rendimento teórico). MS ESI m/z calculado para C23H35N2O8 [M+H]+ 467,23; encontrado 467,23. Exemplo 154. Síntese de 5-(4-acetoxi-3-aminofenil)-4- ((terc- butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (4R)-terc-butila
307 / 439
[00338] 5-(4-acetoxi-3-nitrofenil)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2- metilpentanoato de (4R)-terc-butila (120,3 mg, 0,258 mmol) foi dissolvido em acetato de etila (5 mL) e ácido acético (0,5 mL). A esses, adicionou-se Pd/C (10% em peso, 10 mg) e a mistura foi agitada sob balão de H2 à temperatura ambiente por 30 minutos antes da filtração através de uma camada de Celite, sendo a camada lavada com acetato de etila. O filtrado foi concentrado e purificado por cromatografia em coluna (EA/PE 0-25% EA/PE) fornecendo um óleo amarelo (120,9 mg, rendimento teórico). MS ESI m/z calculado para C23H37N2O6 [M+H]+ 437,26; encontrado 437,28. Exemplo 155. Síntese de 5-(3-(4-(((benziloxi)carbonil)amino) butanamido)-4- ((terc-butildimetilsilil)oxi)fenil)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2- metilpentanoato de (4R)-etila
[00339] 4-(((benziloxi)carbonil)amino)butanoato de 2,5- dioxopirrolidin-1-ila (0,396 g, 1,2 mmol) e 5-(3-amino-4-hidroxifenil)-4- ((terc-butoxicarbonil) amino)-2-metilpentanoato de (4R)-etila (0,44 g, 1,2 mmol) foram dissolvidos em EtOH (10 mL), e solução tampão fosfato (pH=7,5, 0,1M, 2mL) foi adicionada. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante a noite e, a seguir, o solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo purificado por cromatografia em coluna de SiO2 para fornecer o produto do título (0,485g, 70%). ESI: m/z: calculado para C31H44N3O8 [M+H]+:586,31; encontrado 586,31. Exemplo 156. Síntese de 5-(3-(4-aminobutanamido)-4-((terc- butildimetilsilil)oxi)fenil)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (4R)-etila
308 / 439
[00340] 5-(3-(4-(((benziloxi)carbonil)amino)butanamido)-4-((terc- butildimetil-silil)oxi)fenil)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (4R)-etila (0,35 g, 0,5 mmol) foi dissolvido em MeOH (5 mL), e Pd/C (10% em peso, 35 mg) foi então adicionado. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente sob balão de H2 durante a noite, depois filtrada através de Celite e o filtrado concentrado sob pressão reduzida para fornecer o produto do título (0,22 g, 79% de rendimento). ESI MS m/z: calculado para C29H52N3O6Si [M+H]+:566,35; encontrado 566,35. Exemplo 157. Síntese de ácido (2R,3S)-2,3- bis(((benziloxi)carbonil)amino)succínico
[00341] A uma solução de ácido (2R,3S)-2,3-diaminossuccínico (4,03 g, 27,30 mmol) na mistura de THF (250 mL) e NaH2PO4 (0,1 M, 250 mL, pH 8,0), adicionou-se carbocloridrato de benzila (15,0 g, 88,23 mmol) em 4 porções durante 2 horas. A mistura foi agitada por outras 6 horas, concentrada e purificada em coluna de SiO2, eluindo com H2O/CH3CN (1:9) contendo ácido fórmico 1% para fornecer o composto do título (8,63 g, 75% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C20H21N2O8 [M+H]+ 417,12; encontrado 417,50. Exemplo 158. Síntese de 2,3-bis(((benziloxi)-carbonil)amino)succinato de (2R,3S)-bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ila)
[00342] A uma solução de ácido (2R,3S)-2,3- bis(((benziloxi)carbonil)amino)succínico (4,25 g, 10,21 mmol) na mistura de
309 / 439 DMA (70 mL), adicionou-se NHS (3,60 g, 31,30 mmol) e EDC (7,00 g, 36,65 mmol). A mistura foi agitada durante a noite, concentrada e purificada em coluna de SiO2, eluindo com EtOAc/CH2Cl2 (1:6) para fornecer o composto do título (5,48 g, 88% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C28H27N4O12 [M+H]+ 611,15; encontrado 611,45. Exemplo 159. Síntese de 4,4'-(((2R,3S)-2,3-bis(((benziloxi)carbonil)- amino)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoato de di-terc-butila
[00343] A uma solução de ácido (2R,3S)-2,3- bis(((benziloxi)carbonil)amino)succínico (4,25 g, 10,21 mmol) na mistura de DMA (70 mL), adicionou-se 4-aminobutanoato de terc-butila (3,25 g, 20,42 mmol) e EDC (7,00 g, 36,65 mmol). A mistura foi agitada durante a noite, concentrada e purificada em coluna de SiO2, eluindo com EtOAc/CH2Cl2 (1:10) para fornecer o composto do título (6,50 g, 91% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C36H51N4O10 [M+H]+ 699,35; encontrado 699,55. Exemplo 160. Síntese de 4,4'-(((2R,3S)-2,3-diaminossuccinil)-bis(azanodi- il))dibutanoato de di-terc-butila
[00344] A uma solução de 4,4'-(((2R,3S)-2,3- bis(((benziloxi)carbonil)amino)-succinil)bis(azanodi-il))dibutanoato de di- terc-butila (2,50 g, 3,58 mmol) em MeOH (100 mL), adicionou-se Pd/C 10% (0,30 g, 50% úmido) e a mistura foi agitada sob atmosfera de hidrogênio à temperatura ambiente por 18 horas. Depois, o Pd/C foi removido por filtração através de celite e o leito filtrante foi lavado com MeOH (~70 mL). O filtrado foi concentrado para fornecer o produto como espuma amarela que foi usado
310 / 439 na etapa seguinte sem purificação adicional (1,54 g, 100% de rendimento). ESI: m/z: calculado para C20H39N2O6 [M+H]+: 431,28; encontrado 431,50. Exemplo 161. Síntese de 4,4'-(((2R,3S)-2,3-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)propanamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoato de di-terc-butila
[00345] A uma solução de ácido 3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)propanoico (1,25 g, 7,39 mmol) na mistura de DMA (60 mL), adicionou-se 4,4'-(((2R,3S)-2,3-diaminossuccinil)-bis(azanodi-il))dibutanoato de di-terc- butila (1,54 g, ~3,57 mmol) e EDC (2,40 g, 12,56 mmol). A mistura foi agitada durante a noite, concentrada e purificada em coluna de SiO2, eluindo com EtOAc/CH2Cl2 (1:10) para fornecer o composto do título (2,35 g, 90% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C34H49N6O12 [M+H]+ 733,33; encontrado 733,60. Exemplo 162. Síntese de ácido 4,4'-(((2R,3S)-2,3-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoico
[00346] A uma solução agitada de 4,4'-(((2R,3S)-2,3-bis(3-(2,5-dioxo- 2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoato de di-terc-butila (2,30 g, 3,14 mmol) em 1,4-dioxano (20 mL), adicionou-se HCl (36%, 7,0 mL). A mistura foi agitada por 30 minutos, diluída com tolueno (20 mL), concentrada e purificada em coluna de SiO2, eluindo com MeOH/CH2Cl2 (1:10 para 1:4) para fornecer o composto do título (1,69 g, 86% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C26H33N6O12 [M+H]+
311 / 439 621,21; encontrado 621,70. Exemplo 163. Síntese de 4,4'-(((2R,3S)-2,3-bis(2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)acetamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoato de di-terc-butila
[00347] A uma solução de ácido 2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)acético (1,12 g, 7,22 mmol) na mistura de DMA (60 mL), adicionou-se 4,4'- (((2R,3S)-2,3-diaminossuccinil)-bis(azanodi-il))dibutanoato de di-terc-butila (1,54 g, ~3,58 mmol) e EDC (2,40 g, 12,56 mmol). A mistura foi agitada durante a noite, concentrada e purificada em coluna de SiO2, eluindo com EtOAc/CH2Cl2 (1:10) para fornecer o composto do título (2,29 g, 91% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C32H45N6O12 [M+H]+ 704,30; encontrado 704,60. Exemplo 164. Síntese de ácido 4,4'-(((2R,3S)-2,3-bis(2-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)acetamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoico
[00348] A uma solução agitada de 4,4'-(((2R,3S)-2,3-bis(2-(2,5-dioxo- 2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)acetamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoato de di-terc-butila (2,20 g, 3,12 mmol) em 1,4-dioxano (20 mL), adicionou-se HCl (36%, 7,0 mL). A mistura foi agitada por 30 minutos, diluída com tolueno (20 mL), concentrada e purificada em coluna de SiO2, eluindo com MeOH/CH2Cl2 (1:10 para 1:4) para fornecer o composto do título (1,69 g, 86% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C24H29N6O12 [M+H]+ 593,18; encontrado 593,40.
312 / 439 Exemplo 165. Síntese de 4,4'-(((2R,3S)-2,3-bis(2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)acetamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoato de bis(2,5- dioxopirrolidin-1-ila)
[00349] A uma solução de ácido 4,4'-(((2R,3S)-2,3-bis(2-(2,5-dioxo- 2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)acetamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoico (1,10 g, 1,85 mmol) na mistura de DMA (30 mL), adicionou-se NHS (1- hidroxipirrolidina-2,5-diona) (0,55 g, 4,78 mmol) e EDC (1,25 g, 6,54 mmol). A mistura foi agitada durante a noite, concentrada e purificada em coluna de SiO2, eluindo com EtOAc/CH2Cl2 (1:10) para fornecer o composto do título (1,30 g, 90% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C32H35N8O16 [M+H]+ 787,21; encontrado 787,60. Exemplo 166. Síntese de ácido (2S,3S)-2,3-bis(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)succínico
[00350] Ácido (2R,3R)-2,3-diaminossuccínico (5,00 g, 33,77 mmol) na mistura de THF/H2O/DIPEA (125 mL/125 mL/2 mL) foi adicionado ao anidrido maleico (6,68 g, 68,21 mmol). A mistura foi agitada durante a noite e evaporada para fornecer ácido (2S,3S)-2,3-bis((Z)-3- carboxiacrilamido)succínico (11,05 g, 99% de rendimento) como um sólido branco. MS ESI m/z calculado para C12H13N2O10 [M+H]+ 345,05; encontrado 345,35.
[00351] Ácido (2S,3S)-2,3-bis((Z)-3-carboxiacrilamido)succínico (11,05 g, 33,43 mmol) em uma solução de HOAc (70 mL), DMF (10 mL) e
313 / 439 tolueno (50 mL) foi adicionado a anidrido acético (30 mL). A mistura foi agitada por 2 horas, submetida ao refluxo com Dean-Stark Trap a 100ºC por 6 horas, concentrada, co-evaporada com EtOH (2 x 40 mL) e tolueno (2 x 40 mL) e purificada em coluna de SiO2, eluída com H2O/CH3CN (1:10) para fornecer o composto do título (8,10 g, 78% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C12H9N2O8 [M+H]+ 309,03; encontrado 309,50. Exemplo 167. Síntese de 2,3-bis(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)succinato de (2S,3S)-bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ila)
[00352] A uma solução de ácido (2S,3S)-2,3-bis(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)succínico (4,00 g, 12,98 mmol) na mistura de DMF (70 mL), adicionou-se NHS (3,60 g, 31,30 mmol) e EDC (7,00 g, 36,65 mmol). A mistura foi agitada durante a noite, concentrada e purificada em coluna de SiO2, eluindo com EtOAc/CH2Cl2 (1:6) para fornecer o composto do título (5,79 g, 89% de rendimento, ~96% puro por HPLC). MS ESI m/z calculado para C20H15N4O12 [M+H]+ 503,06; encontrado 503,60. Exemplo 168. Síntese de 5-(3-(4-(((benziloxi)carbonil)amino)-butanamido)- 4-hidroxifenil)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (4R)- terc-butila
[00353] HATU (39,9 g, 105 mmol) foi adicionado a uma solução de ácido 4-(((benziloxi)carbonil)amino)butanoico (26,1 g, 110 mmol) em DMF (300 mL). Após agitação à temperatura ambiente por 30 minutos, a mistura foi adicionada a uma solução de (5-(3-amino-4-hidroxifenil)-4-((terc-
314 / 439 butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (4R)-terc-butila (39,4 g, 100 mmol) e TEA (20,2 g, 200 mmol) em DMF (300 mL). A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas. Água foi então adicionada e extraída com EtOAc e a camada orgânica foi lavada com salmoura e seca com Na2SO4. A purificação por cromatografia em coluna (EA/PE 20% para 70%) forneceu o produto do título como um sólido branco (45 g, 73% de rendimento). ESI m/z calculado para C33H48N3O8 [M+H]+: 614,34; encontrado 614,15. Exemplo 169. Síntese de 5-(3-(4-aminobutanamido)-4-hidroxifenil)-4-((terc- butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (4R)-terc-butila
[00354] 5-(3-(4-(((benziloxi)carbonil)amino)-butanamido)-4- hidroxifenil)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (4R)-terc- butila (100 g, 163 mmol) foi dissolvido em metanol (500 mL) e hidrogenado (1 atm.) com catalisador de Pd/C (10% em peso, 10 g) à temperatura ambiente durante a noite. O catalisador foi removido por filtração e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para fornecer o composto do título (75,8 g, 97% de rendimento) como um sólido marrom espumoso. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,11 (s, 1H), 6,83 (d, J = 10,3 Hz, 2H), 5,04-4,52 (m, 6H), 3,90- 3,56 (m, 1H), 2,81 (d, J = 5,3 Hz, 2H), 2,63 (dd, J = 12,5; 6,1 Hz, 2H), 2,54- 2,26 (dd, J = 14,0; 7,6 Hz, 4H), 1,94-1,64 (m, 3H), 1,44-1,36 (m, 18H), 1,08 (d, J = 6,9 Hz, 3H). ESI m/z calculado para C25H42N3O6 [M+H]+: 480,30; encontrado 480,59. Exemplo 170. Síntese de 5-(3-((S)-37-(((benziloxi)carbonil)amino)-31,38- dioxo-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-decaoxa-32,39-diazatritetracontanamido)-4- hidroxifenil)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (4R)-terc- butila
315 / 439
[00355] A uma solução de 5-(3-(4-aminobutanamido)-4-hidroxifenil)- 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (4R)-terc-butila (130 g, 174 mmol, 1,1 eq.) em DMF (500 mL), foram adicionados TEA (66 mL, 474 mmol, 3eq.) e HATU (72 g, 190 mmol, 1,2 eq.) em sequência a 0ºC. Em seguida, a mistura de reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 2 horas. Uma solução de ácido (S)-37-(((benziloxi)carbonil)amino)-31- oxo-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-decaoxa-32-azaoctatriacontan-38-oico (75,8 g, 158 mmol, 1,0 eq.) em DMF (500 mL) foi adicionada à solução acima a 0ºC, e a mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora. A mistura de reação foi vertida em água (4 L), a camada aquosa extraída com EtOAc (3 × 500mL), e as camadas orgânicas foram combinadas e lavadas com salmoura (2 L), secas com Na2SO4, concentradas e o produto do título bruto (190 g) foi usado na etapa seguinte diretamente. ESI: m/z: calculado para C60H100N5O20 [M+H]+: 1210,69; encontrado 1210,69. Exemplo 171. Síntese de 5-(3-((S)-37-amino-31,38-dioxo- 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-decaoxa-32,39-diazatritetracontanamido)-4- hidroxifenil)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (4R)-terc- butila
[00356] O produto bruto de 5-(3-((S)-37-(((benziloxi)carbonil)amino)- 31,38-dioxo-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-decaoxa-32,39- diazatritetracontanamido)-4-hidroxifenil)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2- metilpentanoato de (4R)-terc-butila (190 g) foi dissolvido em metanol (900
316 / 439 mL) e hidrogenado (1 atm.) com catalisador de Pd/C (10% em peso, 19 g) à temperatura ambiente durante a noite. O catalisador foi removido por filtração, o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida e o composto bruto foi purificado em coluna de SiO2 com gradiente de DCM/MeOH para fornecer o produto do título (105 g, 62% de rendimento em duas etapas) como um óleo marrom. ESI m/z calculado para C52H95N5O18 [M+H]+: 1077,65; encontrado 1077,65. Exemplo 172. Síntese de ácido 2-((6S,9S,12R,14R)-9-((S)-sec-butil)-14- hidroxi-6,12-diisopropil-2,2,5,11-tetrametil-4,7,10-trioxo-3-oxa-5,8,11- triazatetradecan-14-il)tiazol-4-carboxílico
[00357] A uma solução de Boc-N-Me-L-Val-OH (33 mg, 0,14 mmol) em EtOAc, adicionou-se pentafluorofenol (39 mg, 0,21 mmol) e DCC (32 mg, 0,154 mmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 16 horas e, a seguir, filtrada sobre uma camada de Celite, sendo a camada lavada com EtOAc. O filtrado foi concentrado e novamente dissolvido em DMA (2 mL) e, então, ácido 2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-2-amino-N,3- dimetilpentanamido)-1-hidroxi-4- metilpentil)tiazol-4-carboxílico (52 mg, 0,14 mmol) e DIPEA (48,5 μL, 0,28mmol) foram adicionados. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 24 horas e, depois, concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Coluna C18, acetonitrila/água 10- 100%) para fornecer o composto do título (40,2 mg, 49% de rendimento). ESI MS m/z: calculado para C28H49N4O7S [M+H]+: 585,32; encontrado 585,32. Exemplo 173. Síntese de ácido 2-((6S,9S,12R,14R)-9-((S)-sec-butil)-6,12-di- isopropil-2,2,5,11-tetrametil-4,7,10,16-tetraoxo-3,15-dioxa-5,8,11- triazaheptadecan-14-il)tiazol-4-carboxílico
317 / 439
[00358] Ácido 2-((6S,9S,12R,14R)-9-((S)-sec-butil)-14-hidroxi-6,12- diisopropil-2,2,5,11-tetrametil-4,7,10-trioxo-3-oxa-5,8,11-triazatetradecan- 14-il)tiazol-4-carboxílico (40 mg, 0.069 mmol) foi dissolvido em piridina (8 mL), ao qual, se adicionou anidrido acético (20,4 mg, 0,2 mmol) a 0ºC e a reação foi deixada aquecer até a temperatura ambiente e agitada durante a noite. A mistura foi concentrada e o resíduo purificado por cromatografia em coluna de SiO2 com gradiente de DCM/MeOH para fornecer o produto do título (48,1 mg, ~100% de rendimento). ESI MS m/z: calculado para C30H51N4O8S [M+H]+ 627,33; encontrado 627,33. Exemplo 174. Síntese de ácido (4R)-4-(2-((6S,9S,12R,14R)-9-((S)-sec-butil)- 6,12-diisopropil-2,2,5,11-tetrametil-4,7,10,16-tetraoxo-3,15-dioxa-5,8,11- triazaheptadecan-14-il)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoico
[00359] A uma solução de ácido 2-((6S,9S,12R,14R)-9-((S)-sec-butil)- 6,12-di- isopropil-2,2,5,11-tetrametil-4,7,10,16-tetraoxo-3,15-dioxa-5,8,11- triazaheptadecan-14-il)tiazol-4-carboxílico (48,1 mg, 0,077 mmol) em EtOAc, adicionou-se pentafluorofenol (21,2 mg, 0,115 mmol) e DCC (17,4 mg, 0.085 mmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 16 horas e então filtrada sobre uma camada de Celite, sendo a camada lavada com EtOAc. O filtrado foi concentrado e voltou a ser dissolvido em DMA (4 mL) e, a seguir, ácido (4R)-4-amino-2-metil-5-fenilpentanoico (20,7 mg, 0,1 Mmol) e DIPEA (26.8 μL, 0,154 mmol) foram adicionados. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 24 horas e, então, concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Coluna C18, acetonitrila/água 10-100%) para fornecer o composto do título (63 mg, ~100% de rendimento). ESI MS
318 / 439 m/z: calculado para C42H66N5O9S [M+H]+ 816,45; encontrado 816,45. Exemplo 175. Síntese de ácido (4R)-4-(2-((3S,6S,9R,11R)-6-((S)-sec-butil)- 3,9-diisopropil-8-metil-4,7,13-trioxo-12-oxa-2,5,8-triazatetradecan-11- il)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoico, sal cloridrato
[00360] Ácido (4R)-4-(2-((6S,9S,12R,14R)-9-((S)-sec-butil)-6,12- diisopropil-2,2,5,11-tetrametil-4,7,10,16-tetraoxo-3,15-dioxa-5,8,11- triazaheptadecan-14-il)tiazol-4-carboxamido)-2-metil-5-fenilpentanoico (60 mg, 0,073 mmol) em acetato de etila ( 3 mL) e cloreto de hidrogênio (0,8 mL, 12 M). A mistura foi agitada por 30 minutos e diluída com tolueno (5 mL) e dioxano (5 mL). A mistura foi evaporada e co-evaporada com dioxano (5 mL) e tolueno (5 mL) até a secura. O produto bruto do título obtido (57,1 mg, 103% de rendimento) foi usado para a etapa seguinte sem purificação adicional. ESI MS m/z: calculado para C37H58N5O7S [M+H]+ 716,40; encontrado 716,60. Exemplo 176. Síntese de (5-(3-(2-(2-(((benziloxi)carbonil)amino)- propanamido)acetamido)-4-hidroxifenil)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2- metilpentanoato de (4R)-terc-butila
[00361] Ácido 2-(2-(((benziloxi)carbonil)amino)propanamido)acético (0,2 g, 0,7 mmol), 5-(3-amino-4-hidroxifenil)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)- 2-metilpentanoato de (4R)-terc-butila (0,19 g, 0,48 mmol), e HATU (0,18 g, 0,48 mmol) foram dissolvidos em DCM (20mL), seguido pela adição de TEA (134 μL, 0,96 mmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, concentrada sob pressão reduzida e o resíduo foi purificado em coluna de SiO2 para fornecer o produto do título (0,3 g, 95%). ESI: m/z:
319 / 439 calculado para C34H49N4O9 [M+H]+: 657,34; encontrado 657,34. Exemplo 177. Síntese de 5-(3-(2-(2-aminopropanamido)acetamido)-4- hidroxifenil)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (4R)-terc- butila
[00362] Em um frasco de hidrogenação, Pd/C (0,1 g, 33% em peso, 50% úmido) foi adicionado a uma solução de 5-(3-(2-(2- (((benziloxi)carbonil)amino)propanamido)acetamido)-4-hidroxifenil)-4- ((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (4R)-terc-butila (0,3 g, 0,46 mmol) em MeOH (10 mL). A mistura foi agitada durante a noite sob 1 atm. de H2, então filtrada através de Celite (auxiliar de filtração), e o filtrado foi concentrado para fornecer o composto do título (0,21g, 87%) usado para a etapa seguinte sem purificação adicional. ESI: m/z: calculado para C26H43N4O7 [M+H]+: 523,31; encontrado 523,31. Exemplo 178. Síntese de brometo de 2-carboxi-N,N,N-trimetilpropan-2- amínio
[00363] A uma solução de ácido 2-bromo-2-metilpropanoico (3,00 g, 17,9 mmol) em THF (30 mL), adicionou-se trietilamina (solução 1M em THF, 17,9 mL, 35,9 mmol). A mistura de reação foi agitada durante a noite à temperatura ambiente. O precipitado foi coletado por filtração e lavado com EA para fornecer o composto do título (4,00 g, rendimento teórico) como um sólido branco. ESI m/z calculado para C7H16NO2 [M+H]+: 146; encontrado
146. Exemplo 179. Síntese de brometo de N,N,N,2-tetrametil-1-oxo-1- (perfluorofenoxi)propan-2-amínio
320 / 439
[00364] A uma solução de brometo de 2-carboxi-N,N,N- trimetilpropan-2-amínio (1,55 g, 6,9 mmol) e PFP (2,50 g, 13,8 mmol) em DCM (20 mL), adicionou-se DCC (2,80 g, 13,8 mmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. A reação foi filtrada e o filtrado foi concentrado sob vácuo para fornecer o composto do título como um óleo incolor, que foi usado diretamente na etapa seguinte. ESI m/: calculado para C13H15F5NO2 [M+H]+: 312; encontrado 312. Exemplo 180. Síntese de (5R,7R,10S)-10-(sec-butil)-5-(4- (etoxicarbonil)tiazol-2-il)-3,3-dietil-7-isopropil-N,N,N,8,13-pentametil-9,12- dioxo-4-oxa-8,11-diaza-3-silatetradecan-13-amínio.
[00365] A uma solução de 2-((1R,3R)-3-((2S)-2-amino-N,3- dimetilpentanamido)-4-metil-1-((trietilsilil)oxi)pentil)tiazol-4-carboxilato de etila (1,78 g, 3,4 mmol) e brometo de N,N,N,2-tetrametil-1-oxo-1- (perfluorofenoxi)propan-2-amínio (6,9 mmol) em DMF (20 mL), adicionou- se DIPEA (1,8 mL, 10,4 mmol) a 0ºC. A mistura de reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 1 hora, então concentrada sob vácuo e purificada em coluna de sílica (DCM/MeOH 100:1 para 5:1) para fornecer o composto do título (1,20 g, 54% de rendimento) como um sólido espumoso. ESI m/z calculado para C32H61N4O5SSi [M+H]+: 642; encontrado 642. Exemplo 181. Síntese de 1-(((2S)-1-(((1R,3R)-1-(4-(etoxicarbonil)tiazol-2-il)- 1-hidroxi-4-metilpentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)amino)- N,N,N,2-tetrametil-1-oxopropan-2-amínio
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[00366] (5R,7R,10S)-10-(sec-butil)-5-(4-(etoxicarbonil)tiazol-2-il)-3,3- dietil-7-isopropil-N,N,N,8,13-pentametil-9,12-dioxo-4-oxa-8,11-diaza-3- silatetradecan-13-amínio (1,20 g, 1,86 mmol) foi dissolvido em AcOH/THF/H2O (v/v/v 3:1:1, 20 mL) e agitado durante a noite. A reação foi então concentrada sob vácuo e usada para a etapa seguinte sem purificação adicional. ESI m/z calculado para C26H47N4O5S [M+H]+: 527; encontrado
527. Exemplo 182. Síntese de 1-(((2S)-1-(((1R,3R)-1-(4-carboxitiazol-2-il)-1- hidroxi-4-metilpentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)amino)- N,N,N,2-tetrametil-1-oxopropan-2-amínio
[00367] A uma solução de 1-(((2S)-1-(((1R,3R)-1-(4- (etoxicarbonil)tiazol-2-il)-1-hidroxi-4-metilpentan-3-il)(metil)amino)-3-metil- 1-oxopentan-2-il)amino)-N,N,N,2-tetrametil-1-oxopropan-2-amínio (1,86 mmol) em 1,4-dioxano (10 mL), adicionou-se NaOH 1N (9,3 mL). e a mistura de reação foi agitada por 2 horas e concentrada sob vácuo. O resíduo foi diluído com água (10 mL) e adicionou-se HCl 1N HCl para ajustar o pH para ~4. A mistura foi concentrada sob vácuo para fornecer o composto do título como um sólido branco. ESI m/z calculado para C24H43N4O5S [M+H]+: 499; encontrado 499. Exemplo 183. Síntese de 1-(((2S)-1-(((1R,3R)-1-acetoxi-1-(4-carboxitiazol-2- il)-4-metilpentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)amino)- N,N,N,2-tetrametil-1-oxopropan-2-amínio
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[00368] A uma solução de 1-(((2S)-1-(((1R,3R)-1-(4-carboxitiazol-2- il)-1-hidroxi-4-metilpentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2- il)amino)-N,N,N,2-tetrametil-1-oxopropan-2-amínio (1,86 mmol) em piridina (10 mL), adicionou-se anidrido acético (884 μL, 9,36 mmol) a 0ºC. Em seguida, a mistura de reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada durante a noite. A reação foi concentrada sob vácuo e então diluída com H2O (20 mL) e lavada com EA (3×10 mL). A camada aquosa foi concentrada sob vácuo para fornecer o composto do título como um sólido amarelo. ESI m/z calculado para C26H45N4O6S [M+H]+: 541; encontrado 541. Exemplo 184. Síntese de 1-(((2S)-1-(((1R,3R)-1-acetoxi-4-metil-1-(4- ((perfluorofenoxi)carbonil)tiazol-2-il)pentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1- oxopentan-2-il)amino)-N,N,N,2-tetrametil-1-oxopropan-2-amínio
[00369] A uma solução de 1-(((2S)-1-(((1R,3R)-1-acetoxi-1-(4- carboxitiazol-2-il)-4-metilpentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2- il)amino)-N,N,N,2-tetrametil-1-oxopropan-2-amínio (150 mg, 0,277 mmol) e pentafluorofenol (76,5 mg, 0,415 mmol) em DCM (2 mL), adicionou-se EDCI (63,7 mg, 0,33 mmol). A mistura de reação foi agitada por 3 horas e concentrada sob vácuo para fornecer o composto do título como um óleo amarelo. ESI m/z calculado para C32H44F5N4O6S [M+H]+:707; encontrado
707. Exemplo 185. Síntese de (S)-4-isopropil-3-propioniloxazolidin-2-ona
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[00370] A uma solução de (S)-4-isopropiloxazolidin-2-ona (400 g, 3,09 mol, 1,0 eq.) em THF anidro (8 L) a cerca de -70ºC, adicionou-se n-BuLi (2,5 M em hexanos, 1,36 L, 3,4 mol, 1,1 eq.) sob N2. A mistura foi agitada a -70ºC por 1 hora e, a seguir, cloreto de propionila (315 g, 3,4 mol, 1,1 eq.) foi adicionado lentamente. Depois de completada a adição, a mistura foi agitada a -70ºC por outra 1 hora e gradualmente aquecida até a temperatura ambiente A mistura de reação foi adicionada a uma solução gelada de cloreto de amônio saturado (7 L) e extraída com EtOAc (3 × 2 L). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (2 L) e salmoura (2 L), secas com Na2SO4 anidro, filtradas, concentradas e purificadas por cromatografia em coluna (3 kg sílica gel, éter de petróleo puro para éter de petróleo/ EtOAc5:1) para fornecer o composto do título como um óleo incolor (500 g, 87% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C9H16NO3 [M+H]+ 186,10; encontrado 186,10. Exemplo 186. Síntese de 3-(4-(benziloxi)fenil)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)propanoato de (S)-metila OBn BocHN CO2Me
[00371] A uma mistura de Boc-L-Tir-OMe (900 g, 3,05 mol, 1,0 eq.), K2CO3 (632 g, 4,58 mol, 1,5 eq.) e KI (20 g, 0,150 mol, 0,05 eq.) em acetonitrila (3L), adicionou-se brometo de benzila (547 g, 3,20 mol, 1,05 eq.) lentamente. A mistura foi então submetida ao refluxo e monitorada por TLC. Após 4 horas, a reação foi resfriada até a temperatura ambiente e filtrada. O filtrado foi concentrado e diluído com água (3L) e EtOAc (3.5 L), a fase orgânica foi separada e a fase aquosa extraída com EtOAc (2 × 1,5 L). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (2 × 3L), secas com Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas. Os produtos brutos de 4 lotes de 900 g e um lote de 400 g de material de partida foram combinados e pesavam
324 / 439 5,4 kg e, a seguir, triturados com éter de petróleo em 18 lotes (4 L de éter de petróleo por lote). O sólido foi coletado e filtrado foi concentrado e purificado por cromatografia em coluna de SiO2 (hexanos/EtOAc 4:1). Todas as coletas foram combinadas para fornecer o composto do título total, 4,85 kg de sólido branco (93% de rendimento). RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ 7,43 (d, J = 7,0 Hz, 2H), 7,38 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 7,32 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 7,04 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 6,91 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 5,04 (s, 2H), 4,55 (d, J = 6,9 Hz, 1H), 3,71 (s, 3H), 3,03 (qd, J = 14,0; 5,8 Hz, 2H), 1,43 (s, 9H). ESI: m/z: calculado para C22H28NO5 [M+H]+: 386,19; encontrado 386,19. Exemplo 187. Síntese de (1-(4-(benziloxi)fenil)-3- oxopropan-2-il)carbamato de (S)-terc-butila
[00372] A uma solução de 3-(4-(benziloxi)fenil)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)propanoato de (S)-metila (288 g, 0,74 mol, 1,0 eq.) em diclorometano anidro (2L) a -78ºC, adicionou-se DIBAL (1,5 M em tolueno, 1,0 L, 2,0 eq.) lentamente. Depois de completada a adição, a agitação foi continuada por 2 horas. e a mistura de reação foi vertida em água gelada (2 L). HCl 2N (2 L) foi adicionado para dissolver o precipitado branco formado. A fase orgânica foi separada e a fase aquosa extraída com diclorometano (2 × 500 mL). A fase orgânica combinada foi lavada com HCl 2N (500 mL) e água (500 mL), seca com Na2SO4 anidro, filtradas e concentrado. O produto bruto foi dissolvido em diclorometano (1 L) e carregada em uma coluna(1 kg de sílica gel) e eluída com diclorometano. A solução de eluição foi concentrada e triturada com PE/EtOAc para fornecer o composto do título como um sólido branco (152 g, 57% de rendimento). RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ 9,65 (s, 1H), 7,45 (d, J = 7,1 Hz, 2H), 7,41 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 7,35 (t, J = 7,1 Hz, 1H), 7,11 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 6,95 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 5,07 (s, 2H), 4,42 (dd, J =
325 / 439 12,4; 6,1 Hz, 1H), 3,09 (d, J = 6,2 Hz, 2H), 1,46 (s, 9H). ESI: m/z: calculado para C21H26NO4 [M+H]+: 356,18; encontrado 356,19. O álcool do produto super reduzido foi também coletado da coluna (65 g). Exemplo 188. Síntese de ((2S,3S,4S)-1-(4-(benziloxi)fenil)-3-hidroxi-5-((S)- 4-isopropil-2-oxooxazolidin-3-il)-4-metil-5-oxopentan-2-il)carbamato de terc- butila
[00373] A uma solução de (S)-4-isopropil-3-propioniloxazolidin-2-ona (92,6 g, 0,50 mol, 1,1 eq.) em diclorometano anidro (1,5 L), adicionou-se DIPEA (70,5 g, 0,54 mol, 1,2 eq.) à temperatura ambiente A mistura foi resfriada até -10ºC e n-Bu2BOTf (1,0 M em diclorometano, 500 mL, 1,1 eq.) foi adicionado sob N2. A temperatura da mistura de reação foi mantida abaixo de 0ºC durante a adição. A reação foi então agitada a 0ºC por 1 hora, a seguir, resfriada até -78ºC, e uma solução de (S)-4-isopropil-3- propioniloxazolidin- 2-ona (161 g, 0,45 mol, 1,0 eq.) em diclorometano (1 L) foi adicionada gota a gota. A temperatura da mistura de reação foi mantida abaixo de 0ºC durante a adição. A mistura foi agitada a -78ºC por 2 horas e, a seguir, aquecida lentamente até a temperatura ambiente e agitada durante a noite. PBS (0,1M, pH 7,0, 2 L) foi adicionado. Após a separação das fases, a fase aquosa foi extraída mais com diclorometano (2 × 500 mL). As camadas orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas. O produto bruto voltou a ser dissolvido em metanol (2 L) e resfriado até 0ºC , então tratado com H2O2 (solução aquosa 30%, 500 mL) e agitado por 1 hora. O metanol foi removido por evaporação rotativa e água (3 L) foi adicionada. A mistura resultante foi extraída com diclorometano (3 × 800 mL). As
326 / 439 camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (500 mL), NaHCO3 saturado (500 mL) e salmoura (500 mL), secas com Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas. O resíduo foi misturado com 400 g de sílica gel e purificado por cromatografia em coluna (2 kg de sílica gel, PE puro para PE/EtOAc 5:1) para fornecer o composto do título como um sólido espumoso (150 g, 61% de rendimento). RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,36 (ddd, J = 24,2; 14,2; 7,1 Hz, 5H), 7,12 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,90 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 5,02 (s, 2H), 4,69 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 4,45 (d, J = 4,1 Hz, 1H), 4,33 (t, J = 8,4 Hz, 1H), 4,15 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 3,90 (dd, J = 16,6; 8,0 Hz, 1H), 3,85-3,77 (m, 2H), 2,81 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 2,27 (dd, J = 11,4; 6,7 Hz, 1H), 1,35 (s, 9H), 0,89 (dd, J = 14,3; 6,9 Hz, 6H). MS ESI m/z calculado para C30H41N2O7 [M+H]+ 541,28; encontrado 541,30. Exemplo 189. Síntese de O-((2S,3S,4S)-5-(4-(benziloxi)fenil)-4-((terc- butoxicarbonil)amino)-1-((S)-4-isopropil-2-oxooxazolidin-3-il)-2-metil-1- oxopentan-3-il) 1H-imidazol-1-carbotioato
[00374] Uma mistura de ((2S,3S,4S)-1-(4-(benziloxi)fenil)-3-hidroxi- 5-((S)-4-isopropil-2-oxooxazolidin-3-il)-4-metil-5-oxopentan-2-il)carbamato de terc-butila (200 g, 0,37 mol, 1,0 eq.) e 1,1’-tiocarbonildiimidazol (198 g, 1,11 mol, 3,0 eq.) em THF anidro (3.5 L) foi submetida ao refluxo por 8 horas. Depois desse prazo, mais 1,1’-tiocarbonildiimidazol (65 g, 0,37 mol, 1,0 eq.) foi adicionado e a mistura foi submetida ao refluxo durante a noite. THF foi removido por evaporação rotativa e o resíduo foi misturado com 500 g de sílica gel e purificado por cromatografia em coluna (2 kg de sílica gel, PE puro para PE/EtOAc 3:1) para fornecer o composto do título como uma
327 / 439 espuma amarela (170 g, 83% de rendimento). RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,41 (s, 1H), 7,67 (s, 1H), 7,36 (dt, J = 16,0; 6,9 Hz, 6H), 7,09 (s, 1H), 7,05 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,86 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,32 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 5,01 (s, 2H), 4,56-4,43 (m, 2H), 4,32 (ddd, J = 16,2; 15,6; 7,8 Hz, 3H), 4,19 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 2,96 (dd, J = 14,6; 4,4 Hz, 1H), 2,49 (dd, J = 14,5; 10,5 Hz, 1H), 2,29 (td, J = 13,4; 6,7 Hz, 1H), 1,73 (s, 1H), 1,29 (s, 9H), 0,91 (dd, J = 13,9; 6,9 Hz, 6H). MS ESI m/z calculado para C34H43N4O7S [M+H]+ 651,27; encontrado 651,39. Exemplo 190. Síntese de ((2R,4S)-1-(4-(benziloxi)fenil)-5-((S)-4-isopropil-2- oxooxazolidin-3-il)-4-metil-5-oxopentan-2-il)carbamato de terc-butila
[00375] A uma solução de O-((2S,3S,4S)-5-(4-(benziloxi)fenil)-4- ((terc-butoxicarbonil)amino)-1-((S)-4-isopropil-2-oxooxazolidin-3-il)-2- metil-1-oxopentan-3-il) 1H-imidazol-1-carbotioato (210 g, 0,323 mol, 1,0 eq.) em tolueno anidro (3 L), adicionou-se n-Bu3SnH (182 g, 0,646 mol, 2,0 eq.) e azodiisobutironitrila (0,5 g, 3,23 mmol, 0,1 eq.) em sequência. A mistura foi submetida ao refluxo por 1,0 hora e então concentrada. O resíduo foi misturado com 500 g de sílica gel e purificada por cromatografia em coluna (2 kg de sílica gel, PE puro para PE/EtOAc 5:1) para fornecer o composto do título como uma espuma branca (141 g, 83% de rendimento). RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,36 (ddd, J = 24,5; 14,5; 7,1 Hz, 5H), 7,08 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 6,90 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 5,04 (d, J = 5,1 Hz, 2H), 4,48 (d, J = 4,2 Hz, 1H), 4,33 (t, J = 8,4 Hz, 1H), 4,22 (d, J = 9,7 Hz, 1H), 4,15 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 3,81 (s, 2H), 2,73 (dd, J = 14,1; 5,9 Hz, 1H), 2,61 (dd, J = 14,0; 7,2 Hz, 1H), 2,29 (dq, J = 13,5; 6,8 Hz, 1H), 2,11-2,00 (m, 1H), 1,60 (dd, J = 15,2;
328 / 439 6,2 Hz, 2H), 1,35 (s, 9H), 1,20 (d, J = 6,9 Hz, 3H), 0,89 (dd, J = 14,0; 6,9 Hz, 6H). MS ESI m/z calculado para C30H41N2O6 [M+H]+ 525,28; encontrado 525,37. Exemplo 191. Síntese de ácido (2S,4R)-5-(4-(benziloxi)fenil)-4-((terc- butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoico
[00376] A uma solução de ((2R,4S)-1-(4-(benziloxi)fenil)-5-((S)-4- isopropil-2-oxooxazolidin-3-il)-4-metil-5-oxopentan-2-il)carbamato de terc- butila (208 g, 0,39 mol, 1,0 equiv.) em THF (2,1 L) e água (700 mL), adicionou-se LiOH (23,7 g, 0,99 mmol, 2,5 eq.) em H2O2 (solução aquosa 30%, 336 mL, 2,97 mol, 7,6 eq.) a 0ºC. Após agitação a 0ºC por 3 horas, adicionou-se uma solução de bissulfito de sódio (1,5 M, 2 L) para interromper a reação e HCl 2 N HCl adicionado gota a gota até que se atingisse pH 4. A mistura de reação foi extraída com EtOAc (3 × 800 mL). A solução de EtOAc foi lavada com água (500 mL) e salmoura (500 mL), seca com Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada. O resíduo foi misturado com sílica gel (400 g) e purificado por cromatografia em coluna (2 kg de sílica gel, PE puro para PE/EtOAc 3:1) para fornecer o composto do título como um sólido branco (158 g, 96% de rendimento). RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,46-7,28 (m, 5H), 7,07 (d, J = 7,7 Hz, 2H), 6,91 (d, J = 7,8 Hz, 2H), 5,04 (s, 2H), 4,52 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 3,87 (d, J = 41,8 Hz, 1H), 2,82-2,43 (m, 3H), 1,85 (t, J = 12,2 Hz, 1H), 1,41 (s, 9H), 1,17 (d, J = 6,9 Hz, 3H). MS ESI m/z calculado para C24H32NO5 [M+H]+ 414,22; encontrado 414,21. Exemplo 192. Síntese de ácido (2S,4R)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-5- (4- hidroxifenil)-2-metilpentanoico
329 / 439
[00377] A mistura de ácido (2S,4R)-5-(4-(benziloxi)fenil)-4-((terc- butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoico (158 g, 0,38 mol, 1,0 eq.) e Pd/C (10%, 15 g) em metanol (1,5 L) foi hidrogenada sob pressão de 1 atm. de H2 por 16 horas e depois filtrada através de Celite (auxiliar de filtração). O filtrado foi concentrado para fornecer o composto do título como um sólido branco (123 g, >100% de rendimento). RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,00 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 6,80 (s, 2H), 4,51 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 3,88 (s, 1H), 2,66 (dd, J = 65,6; 22,6 Hz, 4H), 1,88 (t, J = 12,2 Hz, 1H), 1,42 (s, 9H), 1,14 (d, J = 6,6 Hz, 3H). MS ESI m/z calculado para C17H26NO5 [M+H]+: 324,17; encontrado 324,16. Exemplo 193. Síntese de ácido (2S,4R)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-5-(4- hidroxi-3-nitrofenil)-2-metilpentanoico
[00378] A uma solução de ácido (2S,4R)-4-((terc- butoxicarbonil)amino)-5- (4-hidroxifenil)-2-metilpentanoico (113 g, 0,35 mol, 1,0 eq.) em THF (1,5 L), adicionou-se t-BuONO (360 g, 3,5 mol, 10,0 eq.) gota a gota e agitada à temperatura ambiente por 3 horas, a seguir, misturado com sílica gel (300 g) e concentrado, carregado em uma coluna (1,5 kg de sílica gel) e eluída com PE puro, PE/EtOAc 5:1 e PE/EtOAc 2:1 para fornecer o composto do título como um sólido amarelo (85 g, 61% de rendimento). RMN 1H (400 MHz, DMSO) δ 12,00 (s, 1H), 10,68 (s, 1H), 7,67 (s, 1H), 7,34 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,03 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,69 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 3,56 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 2,67 (dd, J = 13,5; 5,1 Hz, 1H), 2,41 (dd, J = 13,8; 6,6 Hz,
330 / 439 1H), 1,78-1,65 (m, 1H), 1,27 (s, 9H), 1,18 (s, 1H), 1,05 (d, J = 7,1 Hz, 3H). MS ESI m/z calculado para C17H25N2O7 [M+H]+ 369,15; encontrado 369,14. Exemplo 194. Síntese de ácido (2S,4R)-5-(3-amino-4-hidroxifenil)-4-((terc- butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoico
[00379] Uma mistura de ácido (2S,4R)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)- 5-(4-hidroxi-3-nitrofenil)-2-metilpentanoico (51,6 g, 0,14 mol, 1,0 eq.) e Pd/C (10% em peso, 5 g) em metanol (500 mL) foi hidrogenada (1 atm., H2) à temperatura ambiente por 2 hora es, a seguir, filtrada através de Celite (auxiliar de filtração). O filtrado foi concentrado para fornecer o composto do título como uma espuma marrom (43,8 g, 93% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C17H27N2O5 [M+H]+ 339,18; encontrado 339,17. Exemplo 195. Síntese de ácido 4-(((benziloxi)carbonil)amino)butanoico
[00380] A uma solução de NaOH (23,3 g, 0,58 mol，2,0 eq.) em água (140 mL), adicionou-se ácido 4-aminobutanoico (30,0 g, 0,29 mol，1,0 eq.) e THF (60 mL) a -20ºC, depois CbzCl (54 mL, 0,38 mol, 1,3 eq.) em THF (57 mL) foi adicionado gota a gota. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 4 horas, então concentrada e lavada com EtOAc (4 × 100 mL). Ácido clorídrico concentrado foi adicionado à solução aquosa até que foi atingido pH 3. A solução foi extraída com EA (4 × 150 mL, 2 × 100 mL), e a fase orgânica combinada foi lavada com salmoura, seco com sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada para fornecer o composto do título como um sólido branco (48,3 g, 70,3%). ESI m/z: calculado para C12H16NO4 [M+H]+ 238,1; encontrado 238,1. Exemplo 296. Síntese de 4-(((benziloxi)carbonil)amino)butanoato de terc-
331 / 439 butila
[00381] A uma solução de ácido 4- (((benziloxi)carbonil)amino)butanoico (48,0 g, 0,2 mol, 1,0 eq.) e t-BuOH (58,0 mL, 0,6 mol, 3,0 eq.) em diclorometano anidro (480 mL), adicionou-se DCC (50,0 g, 0,24 mol, 1,2 eq.) e DMAP(2,5 g, 0,02 mol, 0,1 eq.) a 0ºC, e a mistura foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada durante a noite. O sólido foi separado por filtração e o filtrado foi concentrado, depois diluído com EtOAc (400 mL) e lavado com solução de NaHCO3 5% e salmoura, seco com sulfato de sódio anidro, filtrado e concentrado. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de SiO2 (PE/EtOAc = 5:1) para fornecer o composto do título como um óleo incolor (32,8 g, 55,1%). ESI m/z: calculado para C16H24NO4 [M+H]+ 294,2; encontrado 294,2. Exemplo 197. Síntese de 4-aminobutanoato de terc-butila
[00382] A uma solução de 4-(((benziloxi)carbonil)amino)butanoato de terc-butila (29,0 g, 0.099 mol, 1,0 eq.) em MeOH (100 mL), adicionou-se Pd/C (2,9 g, Pd/C 10%, 50% úmido) em um frasco de hidrogenação. A mistura foi agitada sob 1 atm. de H2 durante a noite. A mistura de reação foi filtrada, e o filtrado concentrado para fornecer o composto do título como um óleo incolor (13,8 g, 83,7% de rendimento). ESI m/z: calculado para C8H18NO2 [M+H]+ 160,1; encontrado 160,1. Exemplo 198. Síntese de 2,5,8,11,14,17,20,23,26-nonaoxaoctacosan-28-oato de terc-butila
[00383] NaH (60%, 24 g, 600 mmol) foi adicionado a uma solução de éster monometílico de octaetilenoglicol (115 g, 300 mmol) em THF (3,0 L). Após agitação à temperatura ambiente por 1 hora, 2-bromoacetato de terc- butila (146 g, 750 mmol) foi adicionado à mistura e agitado à temperatura
332 / 439 ambiente por 1 hora. A mistura foi então diluída com diclorometano (4 L) e vertida emo água gelada (2 kg). A fase orgânica foi separada e a fase aquosa extraída com diclorometano (1 L). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água, secas com Na2SO4 anidro. A purificação por cromatografia em coluna (EtOAc/PE 20%, depois DCM puro para MeOH/DCM 5%) produziu o composto do título como um óleo amarelo (108 g,72% de rendimento). Exemplo 199. Síntese de ácido 2,5,8,11,14,17,20,23,26-nonaoxaoctacosan- 28-oico
[00384] 2,5,8,11,14,17,20,23,26-nonaoxaoctacosan-28-oato de terc- butila (210 g, 422 mmol) foi dissolvido em diclorometano (400 mL) e ácido fórmico anidro (1 L). A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. Todos os voláteis foram removidos sob vácuo, o que forneceu o composto do título como um óleo amarelo (200 g,>100% de rendimento). Exemplo 200. Síntese de cloreto de 2,5,8,11,14,17,20,23,26- nonaoxaoctacosan-28-oíla
[00385] À solução de ácido 2,5,8,11,14,17,20,23,26- nonaoxaoctacosan-28-oico (198 g, 422 mmol) dissolvido em diclorometano (2,6 L), foram adicionados (COCl)2 (275 mL) e DMF (0,5 mL) à temperatura ambiente A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente por 3 horas. Todos os voláteis foram removidos sob vácuo para fornecer o composto do título como um óleo amarelo (210 g, >100% de rendimento). Exemplo 201. Síntese de ácido (S)-34-(((benziloxi)carbonil)amino)-28-oxo- 2,5,8,11,14,17,20,23,26-nonaoxa-29-azapentatriacontan-35-oico
333 / 439
[00386] Z-L-Lys-OH (236 g, 844 mmol), Na2CO3 (89,5 g, 844 mmol) e NaOH (33,8 g, 844 mmol) foram dissolvidos em água (1,6 L). A mistura foi resfriada abaixo de 0ºC usando um banho salino gelado, ao qual uma solução de cloreto de 2,5,8,11,14,17,20,23,26-nonaoxaoctacosan-28-oíla (210 g, 422 mmol) em THF (160 mL) foi adicionada. A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora e, a seguir, diluída com EtOAc (1 L). A camada aquosa foi separada, a qual HCl concentrado foi adicionado sob resfriamento gelado até pH 3 ter sido atingido. Após extração com DCM, a camada orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2SO4 e concentrada para fornecer o composto do título como um óleo amarelo (290 g, 97% de rendimento). Exemplo 202. Síntese de 34-(((benziloxi)carbonil)amino)-28-oxo- 2,5,8,11,14,17,20,23,26-nonaoxa-29-azapentatriacontan-35-oato de (S)- perfluorofenila NHCbz O C6F5O O
N O O H 8
[00387] A uma solução de ácido (S)-34-(((benziloxi)carbonil)amino)- 28-oxo-2,5,8,11,14,17,20,23,26-nonaoxa-29-azapentatriacontan-35-oico (183 g, 260 mmol) em diclorometano (2 L), adicionou-se pentafluorofenol (95,4 g, 520 mmol) e DIC (131 g, 1,04 mol). A reação foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora e, a seguir, concentrada para fornecer o produto do título bruto (430 g). Exemplo 203. Síntese de 34-(((benziloxi)carbonil)amino)-28,35-dioxo- 2,5,8,11,14,17,20,23,26-nonaoxa-29,36-diazatetracontan-40-oato de (S)-terc- butila
334 / 439
[00388] A uma solução de 4-aminobutanoato de terc-butila (62,0 g, 390 mmol) em DMF (1,5 L), adicionou-se DIPEA (134 g, 1,04 mol) a 0ºC. 34-(((benziloxi)carbonil)-amino)-28-oxo-2,5,8,11,14,17,20,23,26-nonaoxa- 29-azapentatriacontan-35-oato de (S)-perfluorofenila (430 g, bruto) foi então adicionado a 10-20ºC e a mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora. DMF foi removido sob vácuo e o resíduo diluído com diclorometano e lavado com água. A fase aquosa voltou a ser extraída com diclorometano. A fase orgânica combinada foi lavada com HCl 0,2 N e salmoura, seca com Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada. A cromatografia em coluna (EtOAc/PE 25% para EtOAc puro, depois MeOH/DCM 0 para 5%) forneceu o composto do título como um óleo amarelo (180 g, 82% de rendimento). Exemplo 204. Síntese de 34-amino-28,35-dioxo- 2,5,8,11,14,17,20,23,26- nonaoxa-29,36-diazatetracontan-40-oato de (S)-terc-butila
[00389] A uma solução de 34-(((benziloxi)carbonil)amino)-28,35- dioxo-2,5,8,11,14,17,20,23,26-nonaoxa-29,36-diazatetracontan-40-oato de (S)-terc-butila (78,0 g, 92,3 mmol, 1,0 eq.) em MeOH (500 mL), adicionou-se Pd/C (13 g, Pd/C 10%, 50% úmido). A mistura foi hidrogenada sob 1 atm. de H2 à temperatura ambiente durante a noite, depois filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (MeOH/DCM 0 para 20%) para fornecer o composto do título como um óleo amarelo esverdeado (70,2 g, 92% de rendimento). Exemplo 205. Síntese de ácido 11-(benziloxi)-11-oxoundecanoico
[00390] A uma solução de ácido undecanoico（1,73 g, 8 mmol）em DMF (30 mL), foram adicionados K2CO3(1,1 g, 8 mmol) e BnBr (1,36 g, 8
335 / 439 mmol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, então concentrada e purificada por cromatografia em coluna (PE/EtOAc) para fornecer o composto do título (1,1 g, 45% de rendimento). ESI m/z: calculado para C18H27O4 [M+H]+: 307,18; encontrado 307,15. Exemplo 206. Síntese de ácido 3-(2-(2-(dibenzilamino)etoxi)etoxi)propanoico
O
O Bn2N O OH
[00391] A uma solução de 3-(2-(2- (dibenzilamino)etoxi)etoxi)propanoato de terc-butila (2,00 g, 4,84 mmol) em DCM (5 mL), adicionou-se HCO2H (5 mL). A reação foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, depois concentrada até a secura e co- evaporada duas vezes com DCM, e o resíduo foi colocado em uma bomba para fornecer o composto do título (1,72 g, ~100% de rendimento). ESI m/z calculado para C21H27NO4 [M+H]+: 358,19; encontrado 358,19. Exemplo 207. Síntese de 2-benzil-11-oxo-1-fenil-5,8,15,18-tetraoxa-2,12- diazahenicosan-21-oato de terc-butila
O O
O O Bn2N O N O OtBu
H
[00392] A uma solução de ácido 3-(2-(2- (dibenzilamino)etoxi)etoxi)propanoico (1,12 g, 4,83 mmol) e 3-(2-(2- aminoetoxi)etoxi)propanoato de terc-butila (1,72 g, 4,83 mmol) em DCM (30 mL), foram adicionados HATU (1,83 g, 4,83 mmol) e TEA (0,68 mL, 4,83 mmol) a 0ºC. A reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 1 hora, depois diluída com 50 mL DCM e vertida em um funil separador contendo 50 mL de água. A fase orgânica foi separada e lavada com salmoura (50 mL), seca com Na2SO4 anidro, filtrada e concentrado. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (MeOH/DCM) para fornecer o composto do título (2,21 g, 80% de rendimento). ESI m/z calculado para C32H48N2O7 [M+H]+: 573,35; encontrado 573,35. Exemplo 208. Síntese de 1-amino-9-oxo-3,6,13,16-tetraoxa-10-
336 / 439 azanonadecan-19-oato de terc-butila
[00393] A uma solução de 2-benzil-11-oxo-1-fenil-5,8,15,18-tetraoxa- 2,12-diazahenicosan-21-oato de terc-butila (2,21 g, 3,86 mmol) em MeOH (20 mL), adicionou-se Pd/C (10% em peso, 0,2 g) em um frasco de hidrogenação. A mistura foi agitada sob 1 atm. de H2 durante a noite, filtrada através de Celite (auxiliar de filtração), e o filtrado foi concentrado para fornecer o composto do título (1,5 g, ~100% de rendimento). ESI m/z calculado para C18H36N2O7 [M+H]+: 393,25; encontrado 393,25. Exemplo 209. Síntese de 11,21-dioxo-4,7,14,17-tetraoxa-10,20- diazahentriacontano-1,31-dioato de 31-benzil-1-terc-butila
[00394] A uma solução de 1-amino-9-oxo-3,6,13,16-tetraoxa-10- azanonadecan-19-oato de terc-butila (1,50 g, 3,86 mmol) e ácido 11- (benziloxi)-11-oxoundecanoico (1,10 g, 3,6 mmol) em DCM (50 mL), foram adicionados HATU (1,48 g, 3,9 mmol) e TEA (0,55 mL, 3,9 mmol）a 0ºC. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora, depois diluída com 50 mL DCM e vertida em um funil separador contendo 50 mL de água. A fase orgânica foi separada, lavada com salmoura (50 mL), seca com Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (MeOH/DCM) para fornecer o composto do título (1,50 g, 61% de rendimento). ESI m/z calculado para C36H61N2O10 [M+H]+: 681,42; encontrado 681,42. Exemplo 210. Síntese de ácido 3,13,23-trioxo-1-fenil-2,17,20,27,30- pentaoxa-14,24-diazatritriacontan-33-oico
337 / 439
[00395] A uma solução de 11,21-dioxo-4,7,14,17-tetraoxa-10,20- diazahentriacontano-1,31-dioato de 31-benzil-1-terc-butila (1,50 g, 2,2 mmol) em DCM (1 mL), adicionou-se TFA (3 mL). A reação foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora, depois concentrada até a secura e co- evaporada duas vezes com DCM, e o resíduo foi colocado em uma bomba para fornecer o composto do título (0,09 g, 2,2 mmol, produto bruto). ESI m/z: calculado para C32H53N2O10 [M+H]+: 625,36; encontrado 625,35. Exemplo 211. Síntese de ácido (S)-39-(((benziloxi)carbonil)amino)- 3,13,23,33-tetraoxo-1-fenil-2,17,20,27,30-pentaoxa-14,24,34- triazatetracontan-40-oico
[00396] A uma solução de ácido 3,13,23-trioxo-1-fenil-2,17,20,27,30- pentaoxa-14,24-diazatritriacontan-33-oico (1,50 g, 2,20 mmol) e Z-Lys-OH (0,62 g, 2,20 mmol) em DCM (50 mL), foram adicionados HATU (0,84 g, 2,20 mmol) e TEA (0,31 mL, 2,20 mmol) a 0ºC. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora, então diluída com 50 mL DCM e vertida em um funil separador contendo 100 mL de água. A fase orgânica foi separada e lavada com salmoura (100 mL), seca com Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (MeOH/DCM) para fornecer o composto do título (1,00 g, 53% de rendimento). ESI m/z calculado para C46H71N4O13 [M+H]+: 887,49; encontrado 887,50. Exemplo 212. Síntese de 5-((4-((5-((2R,4S)-5-(terc-butoxi)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)-4-metil-5-oxopentil)-2-hidroxifenil)amino)-4- oxobutil)carbamoil)-3,11,21,31-tetraoxo-1-fenil-2,14,17,24,27-pentaoxa- 4,10,20,30-tetra-azahentetracontan-41-oato de (S)-benzila
338 / 439
[00397] A uma solução de ácido (S)-39-(((benziloxi)carbonil)amino)- 3,13,23,33-tetraoxo-1-fenil-2,17,20,27,30-pentaoxa-14,24,34- triazatetracontan-40-oico (0,50 g, 0,56 mmol) em DMF (5 mL), adicionou-se HATU (0,21g, 0,56mmol) e a reação foi agitada à temperatura ambiente por 30 minutos. Depois disso, uma solução de 5-(3-(4-aminobutanamido)-4- hidroxifenil)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (2S,4R)- terc-butila (0,27 g, 0,56 mmol) em DMF (5 mL) e TEA (85 µL, 0,6 mmol) foram adicionados em sequência a 0ºC, e a reação foi agitada por 1 hora. A mistura de reação foi vertida em um funil separador contendo 100 mL de água e extraída com 50 mL de EtOAc duas vezes. A fase orgânica foi lavada uma vez com 100 mL de salmoura, seca com Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (MeOH/DCM) para fornecer o composto do título (0,40 g, 55% de rendimento). ESI m/z: calculado para C71H110N7O18 [M+H]+: 1348,78; encontrado 1348,78. Exemplo 213. Síntese de 5-((5-((2R,4S)-5-(terc-butoxi)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)-4-metil-5-oxopentil)-2-hidroxifenil)carbamoil)- 3,11,21,31-tetraoxo-1-fenil-2,14,17,24,27-pentaoxa-4,10,20,30-tetra- azahentetracontan-41-oato de (S)-benzila
[00398] A uma solução de ácido (S)-39-(((benziloxi)carbonil)amino)- 3,13,23,33-tetraoxo-1-fenil-2,17,20,27,30-pentaoxa-14,24,34- triazatetracontan-40-oico (0,50 g, 0,56 mmol) em DMF (5 mL), adicionou-se HATU (0,21 g, 0,56 mmol) e a reação foi agitada à temperatura ambiente por
339 / 439 30 minutos. Depois disso, uma solução de 5-(3-amino-4-hidroxifenil)-4- ((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (2S,4R)-terc-butila (0,22 g, 0,56 mmol) em DMF (5 mL) e TEA (85 µL, 0,60 mmol) foram adicionados a 0ºC. Após agitação por 1 hora a mistura de reação foi vertida em um funil separador contendo 100 mL de água e extraída duas vezes com 50 mL de EtOAc d. A fase orgânica foi separada e lavada com 100 mL de salmoura, seca com Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (MeOH/DCM) para fornecer o composto do título (0,20 g, 26% de rendimento). ESI m/z: calculado para C67H103N6O17 [M+H]+: 1263,73; encontrado 1263,73. Exemplo 214. Síntese de 3,3'-((oxibis(etano-2,1-di-il))bis(oxi))dipropanoato de di-terc-butila
[00399] A uma solução de dietilenoglicol (20 g, 0,188 mol) em THF (200 mL), adicionou-se Na (0,43 g, 0,018 mol). Após agitação à temperatura ambiente por 1 hora, adicionou-se acrilato de terc-butila (48 g, 0,376 mol) e a mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 2 dias. A reação foi concentrada sob vácuo e purificada por cromatografia em coluna para fornecer o composto do título (34 g, 50% de rendimento). ESI m/z calculado para C18H35O7 [M+H]+: 363,23; encontrado 363,23. Exemplo 215. Síntese de ácido 3,3'-((oxibis(etano-2,1-di- il))bis(oxi))dipropanoico
[00400] 3,3'-((oxibis(etano-2,1-di-il))bis(oxi))dipropanoato de di-terc- butila (34 g, 0,093 mol) foi dissolvido em ácido fórmico (100 mL) à temperatura ambiente e agitado durante a noite. A reação foi concentrada sob vácuo para fornecer o composto do título. ESI m/z calculado para C10H19O7 [M+H]+: 251,11; encontrado 251,11.
340 / 439 Exemplo 216. Síntese de ácido 2,2-dimetil-4,14,24-trioxo- 3,7,10,17,20,27,30,33-octaoxa-13,23-diazahexatriacontan-36-oico
[00401] A uma solução de 1-amino-9-oxo-3,6,13,16-tetraoxa-10- azanonadecan-19-oato de terc-butila (1,50 g, 3,82 mmol) e ácido 3,3'- ((oxibis(etano-2,1-di-il))bis(oxi))dipropanoico (1,90 g, 7,64 mmol) em DMF (10 mL), foram adicionados HATU (1,45 g, 3,82 mmol) e DIPEA (0,66 mL, 3,82 mmol) a 0ºC. A mistura de reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 1 hora, então diluída com DCM (80 mL), lavada com água (10 mL), seca com sulfato de sódio, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia em coluna de sílica gel, para fornecer o composto do título como um líquido incolor (1,75 g, 75% de rendimento). ESI m/z calculado para C28H53N2O13 [M+H]+: 625,35; encontrado 625,35. Exemplo 217. Síntese de 33-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) 11,21-dioxo- 4,7,14,17,24,27,30-heptaoxa-10,20-diazatritriacontano-1,33-dioato de 1-terc- butila
[00402] A uma solução de ácido 2,2-dimetil-4,14,24-trioxo- 3,7,10,17,20,27,30,33-octaoxa-13,23-diazahexatriacontan-36-oico (1,75 g, 2,8 mmol) em DCM (20 mL), foram adicionados EDCI (1,07 g, 5,6 mmol) e NHS (0,64 g, 5,6 mmol) a 0ºC. A reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada durante a noite, depois diluída com DCM (80 mL), lavada com água (10 mL), seca com sulfato de sódio, filtrada e concentrada sob vácuo para fornecer o composto do título (2,00 g, ~100% de rendimento). ESI m/z calculado para C32H56N3O15 [M+H]+: 722,36; encontrado 722,36. Exemplo 218. Síntese de ácido (S)-42-(((benziloxi)carbonil)amino)-2,2- dimetil-4,14,24,36-tetraoxo-3,7,10,17,20,27,30,33-octaoxa-13,23,37-
341 / 439 triazatritetracontan-43-oico
[00403] A uma solução de N-α-Cbz-L-lisina (1,17 g, 4,2 mmol) em água (10 mL), adicionou-se bicarbonato de sódio (0,47 g, 5,6 mmol), e a mistura de reação foi resfriada até 5ºC e 1-terc-butil 33-(2,5-dioxopirrolidin- 1-il) 11,21-dioxo-4,7,14,17,24,27,30-heptaoxa-10,20-diazatritriacontano- 1,33-dioato de 1-terc-butila (2,00 g, 2,8 mmol) dissolvido em 1,4-dioxano (10 mL) foi adicionado. A reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 1 hora, então acidificada para pH 3 pela adição de HCl 1 N e extraída com DCM (50 mL x 3). Os extratos orgânicos foram lavados com água (20 mL), secos com sulfato de sódio, filtrados e concentrados para fornecer o produto do título (2,3 g, 92% de rendimento). ESI m/z calculado para C42H71N4O16 [M+H]+: 887,48; encontrado 887,48. Exemplo 219. Síntese de 5-((4-((5-((2R,4S)-5-(terc-butoxi)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)-4-metil-5-oxopentil)-2-hidroxifenil)amino)-4- oxobutil)carbamoil)-3,11,23,33-tetraoxo-1-fenil-2,14,17,20,27,30,37,40- octaoxa-4,10,24,34-tetra-azatritetracontan-43-oato de (S)-terc-butila
[00404] A uma solução de 5-(3-(4-aminobutanamido)-4-hidroxifenil)- 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (2S,4R)-terc-butila (1,87 g, 3,9 mmol) e ácido (S)-42-(((benziloxi)-carbonil)amino)-2,2-dimetil- 4,14,24,36-tetraoxo-3,7,10,17,20,27,30,33-octaoxa-13,23,37- triazatritetracontan-43-oico (2,3 g, 2,59 mmol) em diclorometano (30 mL), foram adicionados HATU (0,98 g, 2,59 mmol) e DIPEA (450 µL, 2,59 mmol) a 0ºC. A mistura de reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada
342 / 439 por 1 hora, então concentrada sob vácuo e purificada por cromatografia em coluna de sílica gel para fornecer o composto do título (2,4 g, 70% de rendimento). ESI m/z calculado para C67H110N7O21 [M+H]+: 1348,77; encontrado 1348,77. Exemplo 220. Síntese de 7-(((benziloxi)carbonil)amino)-6,13,23,33-tetraoxo- 16,19,26,29-tetraoxa-5,12,22,32-tetra-azatritetracontano-1,43-dioato de (S)- 43-benzil-1-terc-butila H NHCbz O O O t BuO C N O O CO2Bn 2 N O N O N H H H 9
O
[00405] Ácido (S)-39-(((benziloxi)carbonil)amino)-3,13,23,33- tetraoxo-1-fenil-2,17,20,27,30-pentaoxa-14,24,34-triazatetracontan-40-oico (200 mg, 0,225 mmol) foi dissolvido em DMF (5 mL), resfriado até 0ºC e 4- aminobutanoato de terc-butila (71,8 mg, 0,45 mmol) e EDC (86,2 mg, 0,45 mmol) foram adicionados em sequência. A reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada durante a noite, vertida em água gela e extraída com DCM (3 × 10 mL). A fase orgânica combinada foi lavada com água (5 mL), salmoura (5 mL), seca com Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada para fornecer o composto do título (231 mg, 100% de rendimento). ESI m/z calculado para C54H86N5O14 [M+H]+:1028,61; encontrado: 1028,61. Exemplo 221. Síntese de 1-(2-((S)-39-(((benziloxi)carbonil)amino)- 3,13,23,33,40-pentaoxo-1-fenil-2,17,20,27,30-pentaoxa-14,24,34,41-tetra- azapentatetracontanamido)-4-((2R,4S)-5-(terc-butoxi)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)-4-metil-5-oxopentil)fenil) 7- (((benziloxi)carbonil)amino)-6,13,23,33-tetraoxo-16,19,26,29-tetraoxa- 5,12,22,32-tetra-azatritetracontano-1,43-dioato de (S)-43-benzila
343 / 439
[00406] 7-(((benziloxi)carbonil)amino)-6,13,23,33-tetraoxo- 16,19,26,29-tetraoxa-5,12,22,32-tetra-azatritetracontano-1,43-dioato de (S)- 43-benzil-1-terc-butila (231 mg, 0,225 mmol) foi dissolvido em DCM (3 mL) e tratado com TFA (3 mL) à temperatura ambiente por 1 hora. A reação foi concentrada, redissolvida em DMF (5 mL), resfriada até 0ºC e 5-(3-amino-4- hidroxifenil)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (2S,4R)- terc-butila (44 mg, 0,112 mmol), HATU (86 mg, 0,225 mmol) e DIPEA (39µL, 0,225 mmol) foram adicionados em sequência. A reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada durante a noite, vertida em água gelada e extraída com DCM (3 × 10 mL). A fase orgânica combinada foi lavada com HCl 1 N (5 mL), água (5 mL), salmoura (5 mL), seca com Na2SO4 anidro, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia em coluna de sílica gel, (0-5% MeOH/DCM) para fornecer uma espuma branca (209 mg, 81% de rendimento). ESI m/z calculado para C121H185N12O31 [M+H]+: 2302,32; encontrado: 2302,80. Exemplo 222. Síntese de ácido (S)-7-amino-1-((2-(((R)-7-amino-42-carboxi- 6,13,23,33-tetraoxo-16,19,26,29-tetraoxa-5,12,22,32-tetra-azadotetracontan- 1-oil)oxi)-5-((2R,4S)-5-(terc-butoxi)-2-((terc-butoxicarbonil)amino)-4-metil- 5-oxopentil)fenil)amino)-1,6,13,23,33-pentaoxo-16,19,26,29-tetraoxa- 5,12,22,32-tetra-azatritetracontan-43-oico
344 / 439
[00407] 1-(2-((S)-39-(((benziloxi)carbonil)amino)-3,13,23,33,40- pentaoxo-1-fenil-2,17,20,27,30-pentaoxa-14,24,34,41-tetra- azapentatetracontanamido)-4-((2R,4S)-5-(terc-butoxi)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)-4-metil-5-oxopentil)fenil)-7-(((benziloxi)- carbonil)amino)-6,13,23,33-tetraoxo-16,19,26,29-tetraoxa-5,12,22,32-tetra- azatritetracontano-1,43-dioato de (S)-43-benzila (206 mg, 0,089 mmol) foi dissolvido em MeOH (5 mL), misturado com Pd/C (10% em peso, 20 mg) e hidrogenado sob pressão de 1 atm. de H2 durante a noite. A mistura foi então filtrada através de Celite (auxiliar de filtração), e o filtrado concentrado para fornecer o composto do título (166 mg, 100% de rendimento). ESI m/z calculado para C91H161N12O27 [M+H]+: 1854,15; encontrado 1854,80. Exemplo 223. Síntese de ácido 1,1'-((8R,27S)-36-((2R,4S)-5-(terc-butoxi)-2- ((terc-butoxicarbonil)amino)-4-metil-5-oxopentil)-17,18-bis(2-(2,5-dioxo-2,5- di-hidro-1H-pirrol-1-il)acetil)-2,7,10,15,20,25,28,33-octaoxo- 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 ,31,32,33,34-dotriacontahidro-2H-benzo[b][1,4,9,12,17,20,21,24,29, 32]oxanona-azaciclohexatriacontina-8,27-di-il)bis(6,16,26-trioxo-9,12,19,22- tetraoxa-5,15,25-triazahexatriacontan-36-oico)
345 / 439
[00408] A uma solução de ácido (S)-7-amino-1-((2-(((R)-7-amino-42- carboxi-6,13,23,33-tetraoxo-16,19,26,29-tetraoxa-5,12,22,32-tetra- azadotetracontan-1-oil)oxi)-5-((2R,4S)-5-(terc-butoxi)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)-4-metil-5-oxopentil)fenil)amino)-1,6,13,23,33- pentaoxo-16,19,26,29-tetraoxa-5,12,22,32-tetra-azatritetracontan-43-oico (165 mg, 0,089 mmol) em etanol (10 mL), foram adicionados 4,4'-((2,2'-(1,2- bis(2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)acetil)hidrazina-1,2-di- il)bis(acetil))bis(azanodi-il))dibutanoato de bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) (70 mg, 0,089 mmol) e tampão fosfato (0,5M, pH 7,5, 3 mL) a 0ºC. A reação foi agitada à temperatura ambiente durante a noite e então concentrada e purificada por cromatografia em coluna de sílica gel, (MeOH/DCM 0-6%) para fornecer o composto do título 666 (130 mg, 62% de rendimento). ESI m/z calculado para C115H185N18O37 [M+H]+: 2410,31; encontrado: 2410,60. Exemplo 224. Síntese de ácido 1,1'-((8R,27S)-36-((2R,4S)-2-amino-4- carboxipentil)-17,18-bis(2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)acetil)- 2,7,10,15,20,25,28,33-octaoxo- 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 ,31,32,33,34-dotriacontahidro-2H- benzo[b][1,4,9,12,17,20,21,24,29,32]oxanona-azaciclohexatriacontina-8,27- di-il)bis(6,16,26-trioxo-9,12,19,22-tetraoxa-5,15,25-triazahexatriacontan-36- oico)
346 / 439
[00409] Ácido 1,1'-((8R,27S)-36-((2R,4S)-5-(terc-butoxi)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)-4-metil-5-oxopentil)-17,18-bis(2-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)acetil)-2,7,10,15,20,25,28,33-octaoxo- 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 ,31,32,33,34-dotriacontahidro-2H- benzo[b][1,4,9,12,17,20,21,24,29,32]oxanona-azaciclohexa-triacontina-8,27- di-il)bis(6,16,26-trioxo-9,12,19,22-tetraoxa-5,15,25-triazahexatriacontan-36- oico) (128 mg, 0,053 mmol) foi dissolvido em DCM (3 mL) e tratado com TFA (3 mL) à temperatura ambiente por 2 horas. A reação foi concentrada e co-evaporada com DCM três vezes para fornecer o composto do título (120 mg, 100% de rendimento). ESI m/z calculado para C106H169N18O35 [M+H]+: 2254,19; encontrado: 2254,30. Exemplo 225. Síntese de ácido 1,1'-((8R,27S)-36-((2R,4S)-2-(2- ((6S,9R,11R)-6-((S)-sec-butil)-9-isopropil-2,3,3,8-tetrametil-4,7,13-trioxo- 12-oxa-2,5,8-triazatetradecan-11-il)tiazol-4-carboxamido)-4-carboxipentil)- 17,18-bis(2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)acetil)- 2,7,10,15,20,25,28,33-octaoxo- 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31,32,33,34-dotriacontahidro-2H- benzo[b][1,4,9,12,17,20,21,24,29,32]-oxanona-azaciclohexatriacontina-8,27- di-il)bis(6,16,26-trioxo-9,12,19,22-tetraoxa-5,15,25-triazahexatriacontan-36- oico) (B-01).
347 / 439
[00410] Ácido 1,1'-((8R,27S)-36-((2R,4S)-2-amino-4-carboxipentil)- 17,18-bis(2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)acetil)- 2,7,10,15,20,25,28,33-octaoxo- 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 ,31,32,33,34-dotriacontahidro-2H-benzo[b][1,4,9,12,17,20, 21,24,29,32]oxanona-azaciclohexatriacontina-8,27-di-il)bis(6,16,26-trioxo- 9,12,19,22-tetraoxa-5,15,25-triazahexatriacontan-36-oico) (120 mg, 0,053 mmol) e o composto 41a (36,6 mg, 0,053 mmol) foram dissolvidos em DMA (5 mL) e resfriados até 0ºC. Adicionou-se DIPEA (18 µL, 0,106 mmol) e a reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 1 hora. Após a mistura de reação ter sido concentrada, o resíduo foi purificado por HPLC preparativa (C18, acetonitrila/água 10-90%) para fornecer o composto do título (B-1) (70 mg, 49% de rendimento). ESI m/z calculado para C131H209N22O40S [M+H]+: 2762,46; encontrado: 2762,85. Exemplo 226. Síntese de 10,11-bis(((benziloxi)-carbonil)amino)-6,9,12,15- tetraoxo-7,14-bis(31-oxo-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-decaoxa-32- azahexatriacontan-36-il)-5,8,13,16-tetra-azaicosane-1,20-dioato de (7S,10R,11S,14S)-di-terc-butila
348 / 439
[00411] Uma mistura de 37-(((benziloxi)carbonil)amino)-31,38-dioxo- 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-decaoxa-32,39-diazatritetracontan-43-oato de (S)- terc-butila (5,98 g, 6,73 mmol) e Pd/C (10% em peso, 0,6 g) em metanol (30 mL) foi hidrogenada sob pressão de 1 atm. de H2 durante a noite e então filtrada através de Celite (auxiliar de filtração). O filtrado foi concentrado, redissolvido em THF (60 mL) e ácido (2R,3S)-2,3- bis(((benziloxi)carbonil)amino)succínico (1,01 g, 2,42 mmol) e HOBt (817 mg, 6,05 mmol) foram adicionados a 0ºC. DCC (1,25 g, 6,05 mmol) e DIPEA (2,1 mL, 12,10 mmol) foram adicionados em sequência. A reação foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, então diluída com EtOAc (400 mL) e lavada com HCl 0,1N, bicarbonato de sódio saturado e salmoura, seca com Na2SO4 anidro, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia em coluna de SiO2 (DCM/MeOH 24:1) para fornecer o composto do título (5,65 g, 49% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C90H154N8O34 [M+H]+1892,06; encontrado1892,60. Exemplo 227. Síntese de 10,11-diamino-6,9,12,15-tetraoxo-7,14-bis(31-oxo- 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-decaoxa-32-azahexatriacontan-36-il)-5,8,13,16- tetra-azaicosano-1,20-dioato de (7S,10R,11S,14S)-di-terc-butila
349 / 439
[00412] Uma mistura de 10,11-bis(((benziloxi)-carbonil)amino)- 6,9,12,15-tetraoxo-7,14-bis(31-oxo-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-decaoxa-32- azahexatriacontan-36-il)-5,8,13,16-tetra-azaicosano-1,20-dioato de (7S,10R,11S,14S)-di-terc-butila (3,71 g, 1,96 mmol) e Pd/C (10% em peso, 0,40 g) em metanol (50 mL) foi hidrogenada sob pressão de 1 atm. de H2 durante a noite e então filtrada através de Celite (auxiliar de filtração). O filtrado foi concentrado para fornecer o composto do título (3,18 g, 100% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C74H142N8O30 [M+H]+1623,98; encontrado 1624,50. Exemplo 228. Síntese de ácido (7S,10R,11S,14S)-10,11-bis(4-(2,5-dioxo-2,5- di-hidro-1H-pirrol-1-il)butanamido)-6,9,12,15-tetraoxo-7,14-bis(31-oxo- 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-decaoxa-32-azahexatriacontan-36-il)-5,8,13,16- tetra-azaicosano-1,20-dioico
[00413] A uma solução de 10,11-diamino-6,9,12,15-tetraoxo-7,14- bis(31-oxo-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-decaoxa-32-azahexatriacontan-36-il)- 5,8,13,16-tetra-azaicosano-1,20-dioato de (7S,10R,11S,14S)-di-terc-butila (315 mg, 0,194 mmol) em DMA (10 mL), foram adicionados EDC (150 mg,
350 / 439 0,785 mmol) e ácido 4-maleido-butanoico (72 mg, 0,57 mmol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 12 horas, concentrada e purificada por cromatografia em coluna de SiO2 (MeOH/DCM 1:4) para fornecer um óleo (329 mg, 87% de rendimento), que foi dissolvido em diclorometano (25 mL) e tratado com TFA (5 mL) à temperatura ambiente por 1 hora e, a seguir, concentrado para fornecer o composto do título (309 mg, 99% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C82H140N10O36 [M+H]+1841,94; encontrado 1842,50. Exemplo 229. Síntese de 5-((8S,11S,12R,15S)-11,12-bis(4-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)butanamido)-2,7,10,13,16,21-hexaoxo-8,15-bis(31-oxo- 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-decaoxa-32-azahexatriacontan-36-il)- 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22-icosahidro-2H- benzo[b][1,4,9,12,17,20]oxapenta-azaciclotetracosin-24-il)-4-((terc- butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (2S,4R)-terc-butila
[00414] Uma solução misturada de ácido (7S,10R,11S,14S)-10,11- bis(4-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)butanamido)-6,9,12,15-tetraoxo- 7,14-bis(31-oxo-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-decaoxa-32-azahexatriacontan- 36-il)-5,8,13,16-tetra-azaicosano-1,20-dioico (154 mg, 0,0837mmol) e 5-(3- amino-4-hidroxifenil)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (2S,4R)-terc-butila (33 mg, 0.0837 mmol) em DMF (6 mL) foi resfriada até 0ºC e HATU (64 mg, 0,167 mmol) e TEA (46 µL, 0,335 mmol) foram adicionados em sequência. A reação foi agitada por 1 hora, então diluída com água (100 mL) e extraída com EtOAc (3 × 100 mL). A solução de EtOAc foi
351 / 439 lavada com salmoura, seca com Na2SO4 anidro, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia em coluna de SiO2 (DCM/MeOH 6:1) para fornecer o composto do título (95 mg, 52% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C103H170N12O39 [M+H]+ 2200,17; encontrado 2200,90. Exemplo 230. Síntese de ácido (2S,4S)-5-((8S,11S,12R,15S)-11,12-bis(4- (2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)butanamido)-2,7,10,13,16,21-hexaoxo- 8,15-bis(31-oxo-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-decaoxa-32-azahexatriacontan- 36-il)-3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22-icosahidro-2H- benzo[b][1,4,9,12,17,20]oxapenta-azaciclotetracosin-24-il)-4-(2- ((6S,9R,11R)-6-((S)-sec-butil)-9-isopropil-2,3,3,8-tetrametil-4,7,13-trioxo- 12-oxa-2,5,8-triazatetradecan-11-il)tiazol-4-carboxamido)-2-metilpentanoico (B-02)
[00415] A uma solução de 5-((8S,11S,12R,15S)-11,12-bis(4-(2,5- dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)butanamido)-2,7,10,13,16,21-hexaoxo-8,15- bis(31-oxo-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-decaoxa-32-azahexatriacontan-36-il)- 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22-icosahidro-2H- benzo[b][1,4,9,12,17,20]oxapenta-azaciclotetracosin-24-il)-4-((terc- butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (2S,4R)-terc-butila (98 mg,
0.045 mmol) em diclorometano (3 mL), adicionou-se TFA (6 mL). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora e, a seguir, concentrada, redissolvida em DMA (1 mL) e 2-((6S,9R,11R)-6-((S)-sec- butil)-9-isopropil-2,3,3,8-tetrametil-4,7,13-trioxo-12-oxa-2,5,8- triazatetradecan-11-il)tiazol-4-carboxilato (31 mg, 0,045 mmol) e DIPEA (12
352 / 439 μL, 0,068 mmol) foram adicionados. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 90 minutos, depois concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Coluna C18, acetonitrila/água 10-100%) para fornecer o composto do título (B-2) (36,2 mg, 62% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C119H194N16O42S [M+H]+1276,66; encontrado 1276,65. Exemplo 231. Síntese de ácido (S)-11-(5-(terc-butoxi)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)-5-oxopentanamido)undecanoico
[00416] A uma solução de Boc-Glu(OtBu)-OH (0,50 g, 1,65 mmol) em DMF (10 mL), foram adicionados HATU (0,69 g, 1,82 mmol) e TEA (0,26 mL, 1,82 mmol). Após agitação por 30 minutos, adicionou-se uma solução de ácido 11-aminoundecanoico (0,33 g, 1,65 mmol) em DMF (10 mL) e a reação foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora, então vertida em um funil separador contendo 200 mL de HCl 1N e extraída com DCM (3 × 50mL). A fase orgânica foi lavada uma vez com 100 mL de salmoura, seca com Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (MeOH/DCM) para fornecer o composto do título (1,0 g, >100% de rendimento). ESI: m/z: calculado para C25H47N2O7 [M+H]+: 487,33; encontrado 487,34. Exemplo 232. Síntese de ácido (S)-11-(2-amino-4- carboxibutanamido)undecanoico
[00417] A uma solução de ácido (S)-11-(5-(terc-butoxi)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)-5-oxopentanamido)undecanoico (1,0 g, ~2,05 mmol) em DCM (20 mL), adicionou-se adicionado TFA (5 mL). A reação foi agitada à temperatura ambiente por 30 minutos, concentrada até a secura e seca duas vezes com DCM. Finalmente, foi colocado em uma bomba a vácuo e para
353 / 439 fornecer o composto do título (0,68 g, ~2,06 mmol, ~100% de rendimento). ESI: m/z: calculado para C16H31N2O5 [M+H]+: 331,22; encontrado 331,22. Exemplo 233. Síntese de 5-(3-(2-(((benziloxi)carbonil)amino)-3- metilbutanamido)-4-hidroxifenil)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2- metilpentanoato de (2S,4R)-terc-butila
[00418] 5-(3-amino-4-hidroxifenil)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2- metilpentanoato de (2S,4R)-terc-butila (0,2 g, 0,51 mmol), ácido 2- (((benziloxi)carbonil)amino)-3-metilbutanoico (0,13 g, 0,51 mmol), HATU (0,20 g, 0,51mmol) foram dissolvidos em DCM (20 mL), seguido pela adição de TEA (110 μL, 0,8 mmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. Depois, o solvente foi removido sob pressão reduzida e a purificação em coluna de SiO2 forneceu o produto do título (0,30 g, 91%). ESI: m/z: calculado para C34H50N3O8 [M+H]+: 628,35; encontrado 628,45. Exemplo 234. Síntese de 5-(3-(2-amino-3-metilbutanamido)-4-hidroxifenil)- 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (2S,4R)-terc-butila
[00419] Em um frasco de hidrogenação, Pd/C (0,1 g, 33% em peso, 50% úmido) foi adicionado a uma solução de 5-(3-(2- (((benziloxi)carbonil)amino)-3-metilbutanamido)-4-hidroxifenil)-4-((terc- butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (2S,4R)-terc-butila (0,29 g, 0,46 mmol) em MeOH (10 mL). A mistura foi agitada durante a noite sob 1 atm. de H2, então filtrada através de Celite (auxiliar de filtração). O filtrado foi concentrado para fornecer o composto do título (0,23g, ~100%) e usado para a etapa seguinte sem purificação adicional. ESI: m/z: calculado para
354 / 439 C26H44N3O6 [M+H]+:494,64; encontrado 494,75. Exemplo 235. Síntese de 5-(3-(2-(2- (((benziloxi)carbonil)amino)propanamido)-3-metilbutanamido)-4- hidroxifenil)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (2S,4R)- terc-butila
[00420] 5-(3-(2-amino-3-metilbutanamido)-4-hidroxifenil)-4-((terc- butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (2S,4R)-terc-butila (0,23 g, 0,46 mmol), ácido 2-(((benziloxi)carbonil)-aminopropanoico (0,10 g, 0,46 mmol) e HATU (0,18g, 0,46 mmol) foram dissolvidos em DCM (20 mL), seguido pela adição de TEA(110 μL, 0,8 mmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, concentrada sob pressão reduzida e purificada em coluna de SiO2 para fornecer o produto do título (0,3 g, 95%). ESI: m/z: calculado para C37H55N4O9 [M+H]+: 699,39; encontrado 699,50. Exemplo 236. Síntese de 5-(3-(2-(2-aminopropanamido)-3-metilbutanamido)- 4-hidroxifenil)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (2S,4R)- terc-butila
[00421] Em um frasco de hidrogenação, Pd/C (0,1 g, 33% em peso, 50% úmido) foi adicionado a uma solução de 5-(3-(2-(2- (((benziloxi)carbonil)amino)propanamido)-3-metilbutanamido)-4- hidroxifenil)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (2S,4R)- terc-butila (0,3 g, 0,43 mmol) em MeOH (10 mL). A mistura foi agitada durante a noite sob 1 atm. de H2, filtrada através de Celite (auxiliar de filtração) e o filtrado foi concentrado para fornecer o composto do título (0,22
355 / 439 g, 93%) que foi usado para a etapa seguinte sem purificação adicional. ESI: m/z: calculado para C29H49N4O7 [M+H]+:565,35; encontrado 565,60. Exemplo 237. Síntese de 5-((3S,6S,14R,15S)-14,15-bis(2-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)acetamido)-3-isopropil-6-metil-2,5,8,13,16,21-hexaoxo- 2,3,4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21-icosahidro-1H- benzo[b][1,4,7,10,15,20]oxapenta-azaciclotetracosin-25-il)-4-((terc- butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (2S,4R)-terc-butila
[00422] 5-(3-((S)-2-((S)-2-aminopropanamido)-3-metilbutanamido)-4- hidroxifenil)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (2S,4R)- terc-butila (0,150 g, 0,27 mmol), ácido 4,4'-(((2R,3S)-2,3-bis(2-(2,5-dioxo- 2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)acetamido)succinil)bis(azanodi-il))-dibutanoico (0,160g, 0,270 mmol), HATU (0,402 g, 1,080 mmol) foram dissolvidos em DCM (30 mL), seguido pela adição de TEA(55 μL, 0,4 mmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, concentrada sob pressão reduzida e purificada em coluna de SiO2 (eluída com EtOAc/DCM, 1:10 para 1:5) para fornecer o produto do título (0,187 g, 62%). ESI: m/z: calculado para C53H73N10O17 [M+H]+: 1121,51; encontrado 1121,75. Exemplo 238. Síntese de ácido (2S,4R)-4-amino-5-((3S,6S,14R,15S)-14,15- bis(2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)acetamido)-3-isopropil-6-metil- 2,5,8,13,16,21-hexaoxo-2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21- icosahidro-1H-benzo[b][1,4,7,10,15,20]-oxapenta-azaciclotetracosin-25-il)-2-
356 / 439 metilpentanoico
[00423] 5-((3S,6S,14R,15S)-14,15-bis(2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)acetamido)-3-isopropil-6-metil-2,5,8,13,16,21-hexaoxo- 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21-icosahidro-1H- benzo[b][1,4,7,10,15,20]oxapenta-azaciclotetracosin-25-il)-4-((terc- butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (2S,4R)-terc-butila (0,175 g, 0,156 mmol) foi dissolvido em DCM (6 mL), seguido pela adição de TFA (2 mL). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas, diluída com tolueno (8 mL) e concentrada para fornecer o composto do título (150 mg, 100% de rendimento) para a etapa seguinte sem purificação adicional. ESI: m/z: calculado para C44H57N10O15 [M+H]+: 965,39; encontrado 965,70. Exemplo 239. Síntese de 1-(((2S)-1-(((1R,3R)-1-acetoxi-1-(4-(((2R,4S)-1- ((3S,6S,14R,15S)-14,15-bis(2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)acetamido)-3-isopropil-6-metil-2,5,8,13,16,21-hexaoxo- 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21-icosahidro-1H- benzo[b][1,4,7,10,15,20]oxapenta-azaciclotetracosin-25-il)-4-carboxipentan- 2-il)carbamoil)tiazol-2-il)-4-metilpentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1- oxopentan-2-il)amino)-N,N,N,2-tetrametil-1-oxopropan-2-amínio (B-03).
[00424] À solução de ácido (2S,4R)-4-amino-5-((3S,6S,14R,15S)- 14,15-bis(2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)acetamido)-3-isopropil-6-
357 / 439 metil-2,5,8,13,16,21-hexaoxo-2,3,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21-icosahidro-1H- benzo[b][1,4,7,10,15,20]-oxapenta-aza-ciclotetracosin-25-il)-2- metilpentanoico (~50 mg, 0,051 mmol) em DMA(4 mL), adicionou-se 1- (((2S)-1-(((1R,3R)-1-acetoxi-4-metil-1-(4-((perfluorofenoxi)carbonil)tiazol-2- il)pentan-3-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxopentan-2-il)amino)-N,N,N,2- tetrametil-1-oxopropan-2-amínio (37 mg, 0,052 mmol) e DIPEA (3,4 μL, 0,02 mmol). A mistura de reação foi agitada durante a noite, concentrada e purificada por HPLC com gradiente de MeCN/H2O (MeCN 10% para MeCN 70% em 45 minutos, coluna C-18, 10 mm (d) x 250 mm (l), 9 mL/min.) para fornecer o produto do título (37,1mg, 49% de rendimento). ESI: m/z: calculado para C70H99N14O20S [M]+: 1487,69; encontrado 1487,45. Exemplo 240. Síntese de ácido (4R)-5-(22,23-bis(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)-3,6,39,42-tetrametil-2,5,8,21,24,37,40,43-octaoxo- 3,4,5,6,7,8,9,10,12,13,15,16,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27, 29,30,32,33,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44-hexatriacontahidro-2H- benzo[b][1,14,17,20,31,34,37,4,7,10,23,28,41,44]heptaoxahepta- azaciclohexatetracontin-46-il)-4-(2-((6S,9R,11R)-6-((S)-sec-butil)-9- isopropil-2,3,3,8-tetrametil-4,7,13-trioxo-12-oxa-2,5,8-triazatetradecan-11- il)tiazol-4-carboxamido)-2-metilpentanoico (B-04)
[00425] À solução de (2R)-1-(22,23-bis(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)-3,6,39,42-tetrametil-2,5,8,21,24,37,40,43-octaoxo- 3,4,5,6,7,8,9,10,12,13,15,16,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,29,30,32,33,35,36
358 / 439 ,37,38,39,40,41,42,43,44-hexatriacontahidro-2H-benzo[b][1, 14,17,20,31,34,37,4,7,10,23,28,41,44]heptaoxahepta-azaciclohexatetracontin- 46-il)-4-carboxipentan-2-amínio, sal de TFA (60 mg, 0,050 mmol) em DMA (15 mL), adicionou-se o composto ácido pentafluo-ativado (44 mg, 0,06 mmol) e NaH2PO4 0,1 M, pH 7,5, 8,0 mL. A mistura de reação foi agitada durante a noite, concentrada e purificada por HPLC com gradiente de MeCN/H2O (MeCN 10% para MeCN 70% em 45 minutos, coluna C-18, 10 mm (d) x 250 mm (l), 8 mL/min.) para fornecer o produto do título B-4 (44 mg, 52% de rendimento). ESI: m/z: calculado para C79H117N14O26S [M+H]+: 1709,79; encontrado 1709,55. Exemplo 241. Síntese de acetato de (1R,3R)-1-(4-(((2R)-5-((2- aminoetil)amino)-1-(22,23-bis(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)- 3,6,39,42-tetrametil-2,5,8,21,24,37,40,43-octaoxo- 3,4,5,6,7,8,9,10,12,13,15,16,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,29,30,32,33,35,36 ,37,38,39,40,41,42,43,44-hexatriacontahidro-2H- benzo[b][1,14,17,20,31,34,37,4,7,10,23,28,41,44]heptaoxahepta-aza- ciclohexatetracontin-46-il)-4-metil-5-oxopentan-2-il)carbamoil)tiazol-2-il)-3- ((2S,3S)-2-(2-(dimetilamino)-2-metilpropanamido)-N,3-dimetilpentanamido)- 4-metilpentila (B-5)
[00426] Ao composto B-4 (22,0 mg, 0,0129 mmol) em DMA (1 mL), adicionou-se EDC (15,0 mg, 0,078 mmol), etano-1,2-diamina, sal cloridrato (8,0 mg, 0,060 mmol) e DIPEA (0,010 mL, 0,060 mmol). A mistura foi agitada durante a noite, concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (250 (L) mm x 10(d) mm, coluna C18, acetonitrila/água 10-100% em 40 minutos, v =8 mL/min.) para fornecer o composto do título (14,0 mg, 62% de
359 / 439 rendimento). ESI MS m/z: calculado para C81H123N16O25S [M+H]+ 1751,85; encontrado 1751,20. Exemplo 242. Síntese de acetato de (1R,3R)-1-(4-(((28R)-1-amino-29-(22,23- bis(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-3,6,39,42-tetrametil- 2,5,8,21,24,37,40,43-octaoxo- 3,4,5,6,7,8,9,10,12,13,15,16,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,29,30,32,33,35,36 ,37,38,39,40,41,42,43,44-hexatriacontahidro-2H- benzo[b][1,14,17,20,31,34,37,4,7,10,23,28,41,44]heptaoxahepta-aza- ciclohexatetracontin-46-il)-26-metil-25-oxo-3,6,9,12,15,18,21-heptaoxa-24- azanonacosan-28-il)carbamoil)tiazol-2-il)-3-((2S,3S)-2-(2-(dimetilamino)-2- metilpropanamido)-N,3-dimetilpentanamido)-4-metilpentila (B-06)
[00427] Ao composto B-4 (22,0 mg, 0,0129 mmol) em DMA (1 mL), adicionou-se EDC (15,0 mg, 0,078 mmol), 3,6,9,12,15,18,21- heptaoxatricosano-1,23-diamina, sal cloridrato (26,0 mg, 0,059 mmol) e DIPEA (0,010 mL, 0,060 mmol). A mistura foi agitada durante a noite, concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (250 (L) mm x 10(d) mm, coluna C18, acetonitrila/água 10-100% em 40 minutos, v =8 mL/min.) para fornecer o composto do título (14,5 mg, 55% de rendimento). ESI MS m/z: calculado para C95H151N16O32S [M+H]+ 2060,03; encontrado 2060,80. Exemplo 243. Síntese de acetato de (1R,3R)-1-(4-(((28R)-29-(22,23-bis(2,5- dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-3,6,39,42-tetrametil-2,5,8,21,24,37,40,43- octaoxo- 3,4,5,6,7,8,9,10,12,13,15,16,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,29,30,32,33,35,36 ,37,38,39,40,41,42,43,44-hexatriacontahidro-2H- benzo[b][1,14,17,20,31,34,37,4,7,10,23,28,41,44]heptaoxahepta-aza-
360 / 439 ciclohexatetracontin-46-il)-1-hidroxi-26-metil-25-oxo-3,6,9,12,15,18,21- heptaoxa-24-azanonacosan-28-il)carbamoil)tiazol-2-il)-3-((2S,3S)-2-(2- (dimetilamino)-2-metilpropanamido)-N,3-dimetilpentanamido)-4-metilpentila (B-07)
[00428] Ao composto B-4 (22,0 mg, 0,0129 mmol) em DMA (1 mL), adicionou-se EDC (15,0 mg, 0,078 mmol) e 23-amino-3,6,9,12,15,18,21- heptaoxatricosan-1-ol (22,0 mg, 0,059 mmol). A mistura foi agitada durante a noite, concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (250 (L) mm x 10 (d) mm, coluna C18, acetonitrila/água 10-100% em 40 minutos, v =8 mL/min.) para fornecer o composto do título (B-7) (14,1 mg, 53% de rendimento). ESI MS m/z: calculado para C95H150N15O33S [M+H]+ 2061,02; encontrado 2061,74. Exemplo 244. Síntese de 2-((4R)-5-(22,23-bis(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)-3,6,39,42-tetrametil-2,5,8,21,24,37,40,43-octaoxo- 3,4,5,6,7,8,9,10,12,13,15,16,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,29,30,32,33,35,36 ,37,38,39,40,41,42,43,44-hexatriacontahidro-2H- benzo[b][1,14,17,20,31,34,37,4,7,10,23,28,41,44]heptaoxahepta- azaciclohexatetracontin-46-il)-4-(2-((6S,9R,11R)-6-((S)-sec-butil)-9- isopropil-2,3,3,8-tetrametil-4,7,13-trioxo-12-oxa-2,5,8-triazatetradecan-11- il)tiazol-4-carboxamido)-2-metilpentanamido)-6-((terc- butoxicarbonil)amino)hexanoato de (2S)-terc-butila (B-08)
361 / 439
[00429] Ao composto B-4 (25,0 mg, 0,0146 mmol) em DMA (1 mL), adicionou-se EDC (15,0 mg, 0,078 mmol) e 2-amino-6-((terc- butoxicarbonil)amino)hexanoato de (S)-terc-butila (9,0 mg, 0,030 mmol). A mistura foi agitada durante a noite, concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (250 (L) mm x 10(d) mm, coluna C18, acetonitrila/água 10-100% em 40 minutos, v =8 mL/min.) para fornecer o composto do título (20,5 mg, 71% de rendimento). ESI MS m/z: calculado para C94H144N16O29S [M+H]+ 1994,00; encontrado 1994,85. Exemplo 245. Síntese de ácido (2S)-6-amino-2-((4R)-5-(22,23-bis(2,5-dioxo- 2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-3,6,39,42-tetrametil-2,5,8,21,24,37,40,43- octaoxo- 3,4,5,6,7,8,9,10,12,13,15,16,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,29,30,32,33,35,36 ,37,38,39,40,41,42,43,44-hexatriacontahidro-2H- benzo[b][1,14,17,20,31,34,37,4,7,10,23,28,41,44]heptaoxahepta-aza- ciclohexatetracontin-46-il)-4-(2-((6S,9R,11R)-6-((S)-sec-butil)-9-isopropil- 2,3,3,8-tetrametil-4,7,13-trioxo-12-oxa-2,5,8-triazatetradecan-11-il)tiazol-4- carboxamido)-2-metilpentanamido)hexanoico (B-09)
H O H O H O O OAc O N O
N N
N O N O N N N O H 3
HN HN HO O H O O O S N N H N
N N O O H 3 O O O NH2 B-09
COOH
[00430] O composto B-8 (20,0 mg, 0,010 mmol) foi dissolvido em DCM (1 mL), seguido pela adição de TFA (1 mL). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas, concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (250 (L) mm x 10 (d) mm, coluna C18, acetonitrila/água 10-100% em 40 minutos, v =8 mL/min.) para fornecer o composto do título (13,5 mg, 73% de rendimento). ESI: m/z: calculado para C85H129N16O27S [M+H]+: 1837,89; encontrado 1838,20. Exemplo 246. Síntese de 39-amino-45-((5-((2R,4S)-5-(terc-butoxi)-2-((terc-
362 / 439 butoxicarbonil)amino)-4-metil-5-oxopentil)-2-hidroxifenil)amino)- 11,21,33,40,45-pentaoxo-4,7,14,17,24,27,30-heptaoxa-10,20,34,41-tetra- azapentatetracontan-1-oato de (S)-terc-butila
[00431] A 5-((4-((5-((2R,4S)-5-(terc-butoxi)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)-4-metil-5-oxopentil)-2-hidroxifenil)amino)-4- oxobutil)carbamoil)-3,11,23,33-tetraoxo-1-fenil-2,14,17,20,27,30,37,40- octaoxa-4,10,24,34-tetra-azatritetracontan-43-oato de (S)-terc-butila (1,00 g, 0,742 mmol) em metanol (50 mL), adicionou-se Pd/C (10% em peso, 20 mg) e depois foi hidrogenado sob pressão de 1 atm. de H2 com agitação durante a noite. A mistura foi então filtrada através de Celite (auxiliar de filtração), e o filtrado concentrado para fornecer o composto do título (900 mg, 100% de rendimento). ESI m/z calculado para C59H104N7O19 [M+H]+: 1214,73; encontrado 1214,90. Exemplo 247. Síntese de ácido (42S,50S,51R)-42-((4-((5-((2R,4S)-5-(terc- butoxi)-2-((terc-butoxicarbonil)amino)-4-metil-5-oxopentil)-2- hidroxifenil)amino)-4-oxobutil)carbamoil)-50,51-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-2,2-dimetil-4,14,24,36,44,49,52-heptaoxo- 3,7,10,17,20,27,30,33-octaoxa-13,23,37,43,48,53-hexa-azaheptapentacontan- 57-oico e 38-((8S,16R,17S)-27-((2R,4S)-5-(terc-butoxi)-2-((terc- butoxicarbonil)-amino)-4-metil-5-oxopentil)-16,17-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-2,7,10,15,18,23-hexaoxo- 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23-docosahidro-1H- benzo[b][1,4,9,12,17,22]oxapenta-azaciclohexacosin-8-il)-11,21,33-trioxo- 4,7,14,17,24,27, 30-heptaoxa-10,20,34-triazaoctatriacontan-1-oato de terc- butila
363 / 439
[00432] 39-amino-45-((5-((2R,4S)-5-(terc-butoxi)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)-4-metil-5-oxopentil)-2-hidroxifenil)amino)- 11,21,33,40,45-pentaoxo-4,7,14,17,24,27,30-heptaoxa-10,20,34,41-tetra- azapentatetracontan-1-oato de (S)-terc-butila (450 mg, 0,370 mmol) e ácido 4,4'-(((2R,3S)-2,3-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)propanamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoico (230 mg, 0,370 mmol) em DMA (40 mL) foram adicionados a EDC (300 mg, 1,570 mmol) e DIPEA (100 mg, 0,775 mmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, concentrada sob pressão reduzida e purificada em coluna de SiO2 (eluída com EtOAc/DCM, 1:10 para 1:5) para fornecer ácido (42S,50S,51R)-42-((4-((5-((2R,4S)-5-(terc-butoxi)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)-4-metil-5-oxopentil)-2-hidroxifenil)amino)-4- oxobutil)carbamoil)-50,51-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)propanamido)-2,2-dimetil-4,14,24,36,44,49,52-heptaoxo- 3,7,10,17,20,27,30,33-octaoxa-13,23,37,43,48,53-hexa-azaheptapentacontan- 57-oico (0,221g, 33% de rendimento). ESI: m/z: calculado para C85H134N13O30 [M+H]+: 1816,93; encontrado 1817,25; e 38-((8S,16R,17S)-27-((2R,4S)-5- (terc-butoxi)-2-((terc-butoxicarbonil)-amino)-4-metil-5-oxopentil)-16,17- bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-2,7,10,15,18,23-
364 / 439 hexaoxo-2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23- docosahidro-1H-benzo[b][1,4,9,12,17,22]oxapenta-azaciclohexacosin-8-il)- 11,21,33-trioxo-4,7,14,17,24,27,30-heptaoxa-10,20,34-triazaoctatriacontan-1- oato de terc-butila (0,260 g, 39% de rendimento). ESI: m/z: calculado para C85H132N13O29 [M+H]+: 1797,92; encontrado 1798,20. Exemplo 248. Síntese de 39,56-bis((4-((5-((2R,4S)-5-(terc-butoxi)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)-4-metil-5-oxopentil)-2-hidroxifenil)amino)-4- oxobutil)carbamoil)-47,48-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)propanamido)-11,21,33,41,46,49,54,62,74,84-decaoxo- 4,7,14,17,24,27,30,65,68,71,78,81,88,91-tetradecaoxa- 10,20,34,40,45,50,55,61,75,85-deca-azatetranonacontano-1,94-dioato de (39S,47R,48S,56S)-di-terc-butila
[00433] 39-amino-45-((5-((2R,4S)-5-(terc-butoxi)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)-4-metil-5-oxopentil)-2-hidroxifenil)amino)- 11,21,33,40,45-pentaoxo-4,7,14,17,24,27,30-heptaoxa-10,20,34,41-tetra- azapentatetracontan-1-oato de (S)-terc-butila (450 mg, 0,370 mmol) e ácido 4,4'-(((2R,3S)-2,3-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)propanamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoico (115 mg, 0,185 mmol) em DMA (40 mL) foram adicionados a EDC (300 mg, 1,570 mmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, concentrada sob pressão reduzida e purificada em coluna de SiO2 (eluída com EtOAc/DCM, 1:10 para 1:3) para fornecer o composto do título (0,378 g,
365 / 439 68% de rendimento). ESI: m/z: calculado para C144H235N20O48 [M+H]+: 3012,65; encontrado 3012,95; Exemplo 249. Síntese de 42-((4-((5-((2R,4S)-5-(terc-butoxi)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)-4-metil-5-oxopentil)-2-hidroxifenil)amino)-4- oxobutil)carbamoil)-33,34-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)propanamido)-27,32,35,40,48,60,70-heptaoxo- 2,5,8,11,14,17,20,23,51,54,57,64,67,74,77-pentadecaoxa- 26,31,36,41,47,61,71-hepta-azaoctacontan-80-oato de (33R,34S,42S)-terc- butila
[00434] Ao ácido (42S,50S,51R)-42-((4-((5-((2R,4S)-5-(terc-butoxi)- 2-((terc-butoxicarbonil)amino)-4-metil-5-oxopentil)-2-hidroxifenil)amino)-4- oxobutil)carbamoil)-50,51-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)propanamido)-2,2-dimetil-4,14,24,36,44,49,52-heptaoxo- 3,7,10,17,20,27,30,33-octaoxa-13,23,37,43,48,53-hexa-azaheptapentacontan- 57-oico (100 mg, 0,055 mmol) em DMA (30 mL), foram adicionados 2,5,8,11,14,17,20,23-octaoxapentacosan-25-amina, sal de HCl (30 mg, 0,071 mmol) e EDC (25 mg, 0,130 mmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, concentrada sob pressão reduzida e purificada em coluna de SiO2 (eluída com EtOAc/DCM, 1:8 para 1:3) para fornecer o composto do título (92,2 mg, 76% de rendimento). ESI: m/z: calculado para C102H169N14O37 [M+H]+: 2182,17; encontrado 2182,95; Exemplo 250. Síntese de ácido (38S,46S,47R)-38-((4-((5-((2R,4S)-5-(terc- butoxi)-2-((terc-butoxicarbonil)amino)-4-metil-5-oxopentil)-2- hidroxifenil)amino)-4-oxobutil)carbamoil)-46,47-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-
366 / 439 hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-32,40,45,48-tetraoxo- 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-decaoxa-33,39,44,49-tetra-azatripentacontan-53- oico e 5-((8S,16R,17S)-16,17-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)propanamido)-2,7,10,15,18,23-hexaoxo-8-(30-oxo-2,5,9,12,15,18,21,24,27- nonaoxa-31-azapentatriacontan-35-il)- 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23-docosahidro-1H- benzo[b][1,4,9,12,17,22]-oxapenta-azaciclohexacosin-27-il)-4-((terc- butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (2S,4R)-terc-butila
O
OH O HN O 9
N O O
H H O O BocHN N HN N
N HN t BuO C
O H O O O O 2 H
N N HO H N O O
[00435] 5-(3-((S)-36-amino-30,37-dioxo-2,5,9,12,15,18,21,24,27- nonaoxa-31,38-diazadotetracontanamido)-4-hidroxifenil)-4-((terc- butoxicarbonil)amino)-2-metil-pentanoato de (2S,4R)-terc-butila (400 mg, 0,377 mmol) e ácido 4,4'-(((2R,3S)-2,3-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)propanamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoico (234 mg, 0,377 mmol) em DMA (50 mL) foram adicionados a EDC (300 mg, 1,570 mmol) e DIPEA (100 mg, 0,775 mmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, concentrada sob pressão reduzida e purificada em coluna de SiO2 (eluída com EtOAc/DCM, 1:10 para 1:5) para fornecer ácido (38S,46S,47R)-38-((4-((5-((2R,4S)-5-(terc-butoxi)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)-4-metil-5-oxopentil)-2-hidroxifenil)amino)-4-
367 / 439 oxobutil)carbamoil)-46,47-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)propanamido)-32,40,45,48-tetraoxo-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-decaoxa- 33,39,44,49-tetra-azatripentacontan-53-oico (0,192 g, 31% de rendimento). ESI: m/z: calculado para C78H124N11O28 [M+H]+: 1662,85; encontrado 1662,60; e 5-((8S,16R,17S)-16,17-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)propanamido)-2,7,10,15,18,23-hexaoxo-8-(30-oxo-2,5,9,12,15,18,21,24,27- nonaoxa-31-azapentatriacontan-35-il)- 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23-docosahidro-1H- benzo[b][1,4,9,12,17,22]-oxapenta-azaciclohexacosin-27-il)-4-((terc- butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (2S,4R)-terc-butila (0,260 g, 39% de rendimento). ESI: m/z: calculado para C78H122N11O27 [M+H]+: 1644,84; encontrado 1645,25. Exemplo 251. Síntese de 5,5'-((((7S,15R,16S,24S)-15,16-bis(3-(2,5-dioxo- 2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-6,9,14,17,22,25-hexaoxo-7,24- bis(30-oxo-2,5,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxa-31-azapentatriacontan-35-il)- 5,8,13,18,23,26-hexa-azatriacontano-1,30-dioil)bis(azanodi-il))bis(4-hidroxi- 3,1-fenileno))bis(4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (2S,2'S,4R,4'R)-di-terc-butila
[00436] 5-(3-((S)-36-amino-30,37-dioxo-2,5,9,12,15,18,21,24,27- nonaoxa-31,38-diazadotetracontanamido)-4-hidroxifenil)-4-((terc- butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (2S,4R)-terc-butila (400 mg, 0,377 mmol) e ácido 4,4'-(((2R,3S)-2,3-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-
368 / 439 pirrol-1-il)propanamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoico (115 mg, 0,185 mmol) em DMA (50 mL) foram adicionados a EDC (300 mg, 1,570 mmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, concentrada sob pressão reduzida e purificada em coluna de SiO2 (eluída com EtOAc/DCM, 1:10 para 1:3) para fornecer o composto do título (0,325 g, 65% de rendimento). ESI: m/z: calculado para C130H215N16O44 [M+H]+: 2704,50; encontrado 2704,90. Exemplo 252. Síntese de 5-(3-((34R,35S,43S)-34,35-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-1-hidroxi-28,33,36,41,44-pentaoxo-43- (32-oxo-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-decaoxa-33-azaheptatriacontan-37-il)- 3,6,9,12,15,18,21,24-octaoxa-27,32,37,42,45-penta- azanonatetracontanamido)-4-hidroxifenil)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2- metilpentanoato de (2S,4R)-terc-butila
O
OH O HN O 9
N O O
H H O O BocHN N HN N
N HN t BuO C
O H O O O O 2 H
O N N
H N H N 9H O
O
[00437] Ao ácido (38S,46S,47R)-38-((4-((5-((2R,4S)-5-(terc-butoxi)- 2-((terc-butoxicarbonil)amino)-4-metil-5-oxopentil)-2-hidroxifenil)amino)-4- oxobutil)carbamoil)-46,47-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)propanamido)-32,40,45,48-tetraoxo-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-decaoxa- 33,39,44,49-tetra-azatripentacontan-53-oico (100 mg, 0,060 mmol) em DMA (30 mL), foram adicionados 26-amino-3,6,9,12,15,18,21,24- octaoxahexacosan-1-ol, sal de HCl (31 mg, 0,069 mmol) e EDC (35 mg, 0,183 mmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, concentrada sob pressão reduzida e purificada em coluna de SiO2 (eluída com EtOAc/DCM, 1:8 para 1:3) para fornecer o composto do título (86,5 mg, 69% de rendimento). ESI: m/z: calculado para C97H163N12O37
369 / 439 [M+H]+: 2088,12; encontrado 2088,85; Exemplo 253. Síntese de ácido (39S,47R,48S)-39-((4-((5-((2R,4S)-2-(2- ((6S,9R,11R)-6-((S)-sec-butil)-9-isopropil-2,3,3,8-tetrametil-4,7,13-trioxo- 12-oxa-2,5,8-triazatetradecan-11-il)tiazol-4-carboxamido)-4-carboxipentil)-2- hidroxifenil)amino)-4-oxobutil)carbamoil)-47,48-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-11,21,33,41,46,49-hexaoxo- 4,7,14,17,24,27,30-heptaoxa-10,20,34,40,45,50-hexa-azatetrapentacontano- 1,54-dioico (B-10)
[00438] Ácido (42S,50S,51R)-42-((4-((5-((2R,4S)-5-(terc-butoxi)-2- ((terc-butoxicarbonil)amino)-4-metil-5-oxopentil)-2-hidroxifenil)amino)-4- oxobutil)carbamoil)-50,51-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)propanamido)-2,2-dimetil-4,14,24,36,44,49,52-heptaoxo- 3,7,10,17,20,27,30,33-octaoxa-13,23,37,43,48,53-hexa-azaheptapentacontan- 57-oico (0,120g, 0,066 mmol) foi dissolvido em DCM (6 mL), seguido pela adição de TFA (2 mL). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 45 minutos, diluída com tolueno (8 mL) e concentrada para fornecer ácido (39S,47R,48S)-39-((4-((5-((2R,4S)-2-amino-4-carboxipentil)- 2-hidroxifenil)amino)-4-oxobutil)carbamoil)-47,48-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-11,21,33,41,46,49-hexaoxo- 4,7,14,17,24,27,30-heptaoxa-10,20,34,40,45,50-hexa-azatetrapenta-contano- 1,54-dioico, sal de TFA (106 mg, ~100% de rendimento) para a etapa seguinte sem purificação adicional. Em seguida, ao composto em DMA(15 mL), foi adicionado 2-((6S,9R,11R)-6-((S)-sec-butil)-9-isopropil-2,3,3,8- tetrametil-4,7,13-trioxo-12-oxa-2,5,8-triazatetradecan-11-il)tiazol-4-
370 / 439 carboxilato de perfluorofenila (46 mg, 0,066 mmol) e DIPEA(10 μL, 0,055 mmol). A mistura de reação foi agitada durante a noite, concentrada e purificada por HPLC com gradiente de MeCN/H2O (MeCN 10% para MeCN 70% EM 45 minutos, coluna C-18, 20 mm (d) x 250 mm (l), 9 mL/min.) para fornecer o produto do título (64,1mg, 46% de rendimento). ESI: m/z: calculado para C97H150N17O33S [M+H]+: 2113,02; encontrado 2113,80. Exemplo 254. Síntese de ácido 38-((8S,16R,17S)-27-((2R,4S)-2-(2- ((6S,9R,11R)-6-((S)-sec-butil)-9-isopropil-2,3,3,8-tetrametil-4,7,13-trioxo- 12-oxa-2,5,8-triazatetradecan-11-il)tiazol-4-carboxamido)-4-carboxipentil)- 16,17-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)propan-amido)- 2,7,10,15,18,23-hexaoxo- 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23-docosahidro-1H- benzo[b][1,4,9,12,17,22]oxapenta-azaciclohexacosin-8-il)-11,21,33-trioxo- 4,7,14,17,24,27,30-heptaoxa-10,20,34-triazaoctatriacontan-1-oico (B-11)
[00439] 38-((8S,16R,17S)-27-((2R,4S)-5-(terc-butoxi)-2-((terc- butoxicarbonil)-amino)-4-metil-5-oxopentil)-16,17-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-2,7,10,15,18,23-hexaoxo-2,3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23-docosahidro-1H- benzo[b][1,4,9,12,17,22]oxapenta-azaciclohexacosin-8-il)-11,21,33-trioxo- 4,7,14,17,24,27,30-heptaoxa-10,20,34-triazaoctatriacontan-1-oato de terc- butila (0,150 g, 0,083 mmol) foi dissolvido em DCM (6 mL), seguido pela adição de TFA (2 mL). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 45 minutos, diluída com tolueno (8 mL) e concentrada para fornecer ácido 38-((8S,16R,17S)-27-((2R,4S)-2-amino-4-carboxipentil)- 16,17-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-
371 / 439 2,7,10,15,18,23-hexaoxo- 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23-docosahidro-1H- benzo[b][1,4,9,12,17,22]oxapenta-azaciclohexacosin-8-il)-11,21,33-trioxo- 4,7,14,17,24,27, 30-heptaoxa-10,20,34-triazaoctatriacontan-1-oico, sal de TFA (135 mg, ~101% de rendimento) para a etapa seguinte sem purificação adicional. Em seguida, o composto em DMA (15 mL) foi adicionado a 2- ((6S,9R,11R)-6-((S)-sec-butil)-9-isopropil-2,3,3,8-tetrametil-4,7,13-trioxo- 12-oxa-2,5,8-triazatetradecan-11-il)tiazol-4-carboxilato de perfluorofenila (60 mg, 0,084 mmol) e DIPEA(10 μL, 0,055 mmol). A mistura de reação foi agitada durante a noite, concentrada e purificada por HPLC com gradiente de MeCN/H2O (MeCN 10% para MeCN 70% em 45 minutos, coluna C-18, 20 mm (d) x 250 mm (l), 9 mL/min.) para fornecer o produto do título (81,6 mg, 47% de rendimento). ESI: m/z: calculado para C97H149N17O32S [M+H]+: 2095,01; encontrado 2095,65. Exemplo 255. Síntese da estrutura do composto B-12 mostrada abaixo:
[00440] 39,56-bis((4-((5-((2R,4S)-5-(terc-butoxi)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)-4-metil-5-oxopentil)-2-hidroxifenil)amino)-4- oxobutil)carbamoil)-47,48-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)propanamido)-11,21,33,41,46,49,54,62,74,84-decaoxo- 4,7,14,17,24,27,30,65,68,71,78,81,88,91-tetradecaoxa- 10,20,34,40,45,50,55,61,75,85-deca-azatetranonacontano-1,94-dioato de (39S,47R,48S,56S)-di-terc-butila (175 mg, 0,058 mmol) foi dissolvido em
372 / 439
DCM (6 mL), seguido pela adição de TFA (2 mL). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 45 minutos, diluída com tolueno (8 mL) e concentrada para fornecer ácido (39S,47R,48S,56S)-39,56-bis((4-((5- ((2R,4S)-2-amino-4-carboxipentil)-2-hidroxifenil)amino)-4- oxobutil)carbamoil)-47,48-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)propanamido)-11,21,33,41,46,49,54,62,74,84-decaoxo- 4,7,14,17,24,27,30,65,68,71,78,81,88,91-tetradecaoxa- 10,20,34,40,45,50,55,61,75,85-deca-azatetranonacontano-1,94-dioico, sal de TFA (151 mg, 99% de rendimento). Em seguida, ao composto em DMA (15 mL), adicionou-se 2-((6S,9R,11R)-6-((S)-sec-butil)-9-isopropil-2,3,3,8- tetrametil-4,7,13-trioxo-12-oxa-2,5,8-triazatetradecan-11-il)tiazol-4- carboxilato de perfluorofenila (85 mg, 0,123 mmol) e DIPEA (18 μL, 0,103 mmol). A mistura de reação foi agitada durante a noite, concentrada e purificada por HPLC com gradiente de MeCN/H2O (MeCN 10% para MeCN 70% em 45 minutos, coluna C-18, 20 mm (d) x 250 mm (l), 9 mL/min.) para fornecer o produto do título (81,6 mg, 47% de rendimento). ESI: m/z: calculado para C168H267N28O54S2 [M+H]+: 3604,84; encontrado 3604,80. Exemplo 256. Síntese de ácido (36S,44S,45R)-36-((4-((5-((2R,4S)-2-(2- ((6S,9R,11R)-6-((S)-sec-butil)-9-isopropil-2,3,3,8-tetrametil-4,7,13-trioxo- 12-oxa-2,5,8-triazatetradecan-11-il)tiazol-4-carboxamido)-4-carboxipentil)-2- hidroxifenil)amino)-4-oxobutil)carbamoil)-44,45-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-30,38,43,46-tetraoxo- 2,5,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxa-31,37,42,47-tetra-azahenpentacontan-51- oico (B-13)
373 / 439
[00441] 5-((8S,16R,17S)-16,17-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)propanamido)-2,7,10,15,18,23-hexaoxo-8-(30-oxo- 2,5,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxa-31-azapentatriacontan-35-il)-2,3,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23-docosahidro-1H- benzo[b][1,4,9,12,17,22]-oxapenta-azaciclohexacosin-27-il)-4-((terc- butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (2S,4R)-terc-butila (0,175 g, 0,152 mmol) foi dissolvido em DCM (6 mL), seguido pela adição de TFA (2 mL). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora, diluída com tolueno (8 mL) e concentrada para fornecer ácido (36S,44R,45S)- 36-((4-((5-((2R,4S)-2-amino-4-carboxipentil)-2-hidroxifenil)amino)-4- oxobutil)carbamoil)-44,45-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)propanamido)-30,38,43,46-tetraoxo-2,5,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxa- 31,37,42,47-tetra-azahenpentacontan-51-oico (230 mg, 101% de rendimento) para a etapa seguinte sem purificação adicional. Em seguida, ao composto em DMA(15 mL), adicionou-se 2-((6S,9R,11R)-6-((S)-sec-butil)-9-isopropil- 2,3,3,8-tetrametil-4,7,13-trioxo-12-oxa-2,5,8-triazatetradecan-11-il)tiazol-4- carboxilato de perfluorofenila (106 mg, 0,152 mmol) e DIPEA(20 μL, 0,115 mmol). A mistura de reação foi agitada durante a noite, concentrada e purificada por HPLC com gradiente de MeCN/H2O (MeCN 10% para MeCN 70% em 45 minutos, coluna C-18, 20 mm (d) x 250 mm (l), 9 mL/min.) para fornecer o produto do título (149,1 mg, 49% de rendimento). ESI: m/z: calculado para C94H148N15O31S [M+H]+: 2015,01; encontrado 2015,65. Exemplo 257. Síntese de ácido (2S,4R)-5-(3-((34R,35S,43S)-34,35-bis(3- (2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-1-hidroxi- 28,33,36,41,44-pentaoxo-43-(32-oxo-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-decaoxa-33- azaheptatriacontan-37-il)-3,6,9,12,15,18,21,24-octaoxa-27,32,37,42,45-penta- azanonatetracontanamido)-4-hidroxifenil)-4-(2-((6S,9R,11R)-6-((S)-sec- butil)-9-isopropil-2,3,3,8-tetrametil-4,7,13-trioxo-12-oxa-2,5,8- triazatetradecan-11-il)tiazol-4-carboxamido)-2-metilpentanoico (B-14)
374 / 439
[00442] 5-(3-((34R,35S,43S)-34,35-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)propanamido)-1-hidroxi-28,33,36,41,44-pentaoxo-43-(32-oxo- 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-decaoxa-33-azaheptatriacontan-37-il)- 3,6,9,12,15,18,21,24-octaoxa-27,32,37,42,45-penta- azanonatetracontanamido)-4-hidroxifenil)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2- metilpentanoato de (2S,4R)-terc-butila (0,085 g, 0,040 mmol) foi dissolvido em DCM (6 mL), seguido pela adição de TFA (2 mL). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora, diluída com tolueno (8 mL) e concentrada para fornecer ácido 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-decaoxa-33- azaheptatriacontan-37-il)-3,6,9,12,15,18,21,24-octaoxa-27,32,37,42,45-penta- azanonatetracontanamido)-4-hidroxifenil)-2-metilpentanoico, sal de TFA (78 mg, 100% de rendimento) para a etapa seguinte sem purificação adicional. Em seguida, ao composto em DMA (15 mL), adicionou-se 2-((6S,9R,11R)-6- ((S)-sec-butil)-9-isopropil-2,3,3,8-tetrametil-4,7,13-trioxo-12-oxa-2,5,8- triazatetradecan-11-il)tiazol-4-carboxilato de perfluorofenila (40 mg, 0,056 mmol) e DIPEA (7 μL, 0,040 mmol). A mistura de reação foi agitada durante a noite, concentrada e purificada por HPLC com gradiente de MeCN/H2O (MeCN 10% para MeCN 70% em 45 minutos, coluna C-18, 20 mm (d) x 250 mm (l), 9 mL/min.) para fornecer o produto do título (51,3 mg, 52% de rendimento). ESI: m/z: calculado para C113H187N16O40S [M+H]+: 2440,27; encontrado 2440,90. Exemplo 258. Síntese de ácido (2S,4R)-5-((8S,16R,17S)-16,17-bis(3-(2,5- dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-2,7,10,15,18,23-hexaoxo-8- (30-oxo-2,5,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxa-31-azapentatriacontan-35-il)-
375 / 439 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23-docosahidro-1H- benzo[b][1,4,9,12,17,22]oxapenta-azaciclohexacosin-27-il)-4-(2- ((6S,9R,11R)-6-((S)-sec-butil)-9-isopropil-2,3,3,8-tetrametil-4,7,13-trioxo- 12-oxa-2,5,8-triazatetradecan-11-il)tiazol-4-carboxamido)-2-metilpentanoico (B-15)
[00443] 5-((8S,16R,17S)-16,17-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)propanamido)-2,7,10,15,18,23-hexaoxo-8-(30-oxo- 2,5,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxa-31-azapentatriacontan-35-il)- 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23-docosahidro-1H- benzo[b][1,4,9,12,17,22]-oxapenta-azaciclohexacosin-27-il)-4-((terc- butoxicarbonil)amino)-2-metilpentanoato de (2S,4R)-terc-butila (0,145 g,
0.0882 mmol) foi dissolvido em DCM (6 mL), seguido pela adição de TFA (2 mL). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora, diluída com tolueno (8 mL) e concentrada para fornecer ácido (2S,4R)-4- amino-5-((8S,16R,17S)-16,17-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)propanamido)-2,7,10,15,18,23-hexaoxo-8-(30-oxo-2,5,9,12,15,18,21,24,27- nonaoxa-31-azapentatriacontan-35-il)- 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23-docosahidro-1H- benzo[b][1,4,9,12,17,22]oxapenta-aza-ciclohexacosin-27-il)-2- metilpentanoico, sal de TFA (133 mg, 101% de rendimento) para a etapa seguinte sem purificação adicional. Em seguida, ao composto em DMA (15 mL), adicionou-se 2-((6S,9R,11R)-6-((S)-sec-butil)-9-isopropil-2,3,3,8- tetrametil-4,7,13-trioxo-12-oxa-2,5,8-triazatetradecan-11-il)tiazol-4- carboxilato de perfluorofenila (62 mg, 0,0885 mmol) e DIPEA(15 μL, 0,086 mmol). A mistura de reação foi agitada durante a noite, concentrada e
376 / 439 purificada por HPLC com gradiente de MeCN/H2O (MeCN 10% para MeCN 70% em 45 minutos, coluna C-18, 20 mm (d) x 250 mm (l), 9 mL/min.) para fornecer o produto do título (83,1mg, 47% de rendimento). ESI: m/z: calculado para C94H146N15O30S [M+H]+: 1997,00; encontrado 1997,60. Exemplo 259. Síntese de ácido (S,S,R,R,2S,2'S,4R,4'R)-5,5'- ((((7S,15R,16S,24S)-15,16-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)propanamido)-6,9,14,17,22,25-hexaoxo-7,24-bis(30-oxo- 2,5,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxa-31-azapentatriacontan-35-il)- 5,8,13,18,23,26-hexa-azatriacontano-1,30-dioil)bis(azanodi-il))bis(4-hidroxi- 3,1-fenileno))bis(4-(2-((6S,9R,11R)-6-((S)-sec-butil)-9-isopropil-2,3,3,8- tetrametil-4,7,13-trioxo-12-oxa-2,5,8-triazatetradecan-11-il)tiazol-4- carboxamido)-2-metilpentanoico) (B-16)
[00444] 5,5'-((((7S,15R,16S,24S)-15,16-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro- 1H-pirrol-1-il)propanamido)-6,9,14,17,22,25-hexaoxo-7,24-bis(30-oxo- 2,5,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxa-31-azapentatriacontan-35-il)- 5,8,13,18,23,26-hexa-azatriacontano-1,30-dioil)bis-(azanodi-il))bis(4-hidroxi- 3,1-fenileno))bis(4-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metil-pentanoato de (2S,2'S,4R,4'R)-di-terc-butila) (0,175 g, 0,0647 mmol) foi dissolvido em DCM (6 mL), seguido pela adição de TFA (2 mL). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora, diluída com tolueno (8 mL) e concentrada para fornecer ácido (2S,2'S,4R,4'R)-5,5'-((((7S,15R,16S,24S)- 15,16-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)- 6,9,14,17,22,25-hexaoxo-7,24-bis(30-oxo-2,5,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxa-
377 / 439 31-azapentatriacontan-35-il)-5,8,13,18,23,26-hexa-azatriacontano-1,30- dioil)bis(azanodi-il))bis(4-hidroxi-3,1-fenileno))bis(4-amino-2- metilpentanoico) (155 mg, 100% de rendimento) para a etapa seguinte sem purificação adicional. Em seguida, ao composto em DMA (15 mL), adicionou-se 2-((6S,9R,11R)-6-((S)-sec-butil)-9-isopropil-2,3,3,8-tetrametil- 4,7,13-trioxo-12-oxa-2,5,8-triazatetradecan-11-il)tiazol-4-carboxilato de perfluorofenila (46 mg, 0,065 mmol) e DIPEA (10 μL, 0,0575 mmol). A mistura de reação foi agitada durante a noite, concentrada e purificada por HPLC com gradiente de MeCN/H2O (MeCN 10% para MeCN 70% em 45 minutos, coluna C-18, 20 mm (d) x 250 mm (l), 9 mL/min) para fornecer o produto do título (105,3 mg, 48% de rendimento). ESI: m/z: calculado para C162H263N24O50S2 [M+H]+: 3408,81; encontrado 3408,60. Exemplo 260. Síntese de 4-hidroxipirrolidina-2-carboxilato de (2S,4R)- metila, cloridrato
[00445] A uma solução de trans-4-hidroxi-L-prolina (15,0 g, 114,3 mmol) em metanol seco (250 mL), adicionou-se cloreto de tionila (17 mL, 231 mmol) gota a gota de 0 a 4ºC. A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, concentrada, cristalizada com EtOH/hexano para fornecer o composto do título (18,0 g, 87% de rendimento). ESI MS m/z 168,2 ([M+Na]+). Exemplo 261. Síntese de 2-metil 4-hidroxipirrolidina-1,2-dicarboxilato de (2S,4R)-1-terc-butila
[00446] A uma solução de éster metílico de trans-4-hidroxi-L-prolina (18,0 g, 107,0 mmol) na mistura de MeOH (150 mL) e solução de bicarbonato de sódio (2,0 M, 350 mL), adicionou-se Boc2O (30,0 g, 137,6 mmol) em três
378 / 439 porções durante 4 horas. Após agitação por 4 horas adicionais, a reação foi concentrada para ~350 mL e extraída com EtOAc (4 × 80 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (100 mL), secas (MgSO4), filtradas, concentradas e purificadas por cromatografia em coluna de SiO2 (hexanos/EtOAc 1:1) para fornecer o composto do título (22,54 g, 86% de rendimento). ESI MS m/z 268,2 ([M+Na]+). Exemplo 262. Síntese de 4-oxopirrolidina-1,2-dicarboxilato de (S)-1-terc- butil-2-metila
[00447] O composto do título preparado através de oxidação de Dess- Martin foi descrito em: Franco Manfre et al. J. Org. Chem. 1992, 57, 2060-
2065. Alternativamente, o procedimento de oxidação de Swern é como segue: A uma solução de (COCl)2 (13,0 mL, 74,38 mmol) em CH2Cl2 (350 mL) resfriada até -78ºC, adicionou-se DMSO seco (26,0 mL). A solução foi agitada a -78ºC por 15 minutos e, a seguir, 4-hidroxipirrolidina-1,2- dicarboxilato de (2S,4R)-1-terc-butil-2-metila (8,0 g, 32,63 mmol) em CH2Cl2 (100 mL) foi adicionado. Após agitação a -78ºC por 2 horas, adicionou-se trietilamina (50 mL, 180,3 mmol) gota a gota e a solução de reação foi aquecida até a temperatura ambiente. A mistura foi diluída com solução aquosa de NaH2PO4 (1,0 M, 400 mL) e as fases separadas. A camada aquosa foi extraída com CH2Cl2 (2 × 60 mL). As camadas orgânicas foram combinadas, secas com MgSO4, filtradas, concentradas e purificadas por cromatografia em coluna de SiO2 (hexanos/EtOAc 7:3) para fornecer o composto do título (6,73 g, 85% de rendimento). ESI MS m/z 266,2([M+Na+]. Exemplo 263. Síntese de 4-metilenopirrolidina-1,2-dicarboxilato de (S)-1- terc-butil-2-metila
379 / 439
[00448] A uma suspensão de brometo de metiltrifenilfosfônio (19,62 g, 55,11 mmol) em THF (150 mL) a 0ºC, adicionou-se t-butóxido de potássio (6,20 g, 55,30 mmol) em THF anidro (80 mL). Após agitação a 0ºC por 2 horas, o ileto amarelo resultante foi adicionado a uma solução de 4- oxopirrolidina-1,2-dicarboxilato de (S)-1-terc-butil-2-metila (6,70 g, 27,55 mmol) em THF (40 mL). Após agitação à temperatura ambiente por 1 hora, a mistura de reação foi concentrada, diluída com EtOAc (200 mL), lavada com H2O (150 mL), salmoura (150 mL), seco com MgSO4, concentrada e purificada por cromatografia em coluna de SiO2 (hexanos/EtOAc 9:1) para fornecer o composto do título (5,77 g, 87% de rendimento). EI MS m/z 264 ([M+Na]+). Exemplo 264. Síntese de 4-metilenopirrolidina-2-carboxilato(S)-metila, cloridrato.
[00449] A uma solução de 4-metilenopirrolidina-1,2-dicarboxilato de (S)-1-terc-butil-2-metila (5,70 g, 23,63 mmol) em EtOAc (40 mL) a 4ºC, adicionou-se HCl (12 M, 10 mL). A mistura foi agitada por 1 hora, diluída com tolueno (50 mL), concentrada e cristalizada com EtOH/hexano para fornecer o composto do título como sal de HCl (3,85 g, 92% de rendimento). EI MS m/z 142,2 ([M+H]+). Exemplo 265. Síntese de 2-(hidroximetil)-4-metilenopirrolidina-1-carboxilato de (S)-terc-butila
[00450] A uma solução de 4-metilenopirrolidina-1,2-dicarboxilato de (S)-1-terc-butil-2-metila (5.20 g, 21,56 mmol) em THF anidro (100 mL) a
380 / 439 0ºC, adicionou-se LiAlH4 (15 mL, 2M em THF). Após agitação a 0ºC por 4 horas, a reação foi interrompida pela adição de metanol (5 mL) e água (20 mL). A mistura de reação foi neutralizada com HCl 1M para pH 7, diluída com EtOAc (80 mL), filtrada através de Celite, separada e a camada aquosa foi extraída com EtOAc. As camadas orgânicas foram combinadas, secas com Na2SO4, concentradas e purificadas por cromatografia em coluna de SiO2 (EtOAc/DCM 1:5) para fornecer o composto do título (3,77 g, 82% de rendimento). EI MS m/z 236,40 ([M+Na]+). Exemplo 266. Síntese de (S)-(4-metilenopirrolidin-2-il)metanol, sal cloridrato.
[00451] A uma solução de 2-(hidroximetil)-4-metilenopirrolidina-1- carboxilato de (S)-terc-butila (3,70 g, 17,36 mmol) em EtOAc (30 mL) a 4ºC, adicionou-se HCl (12 M, 10 mL). A mistura foi agitada por 1 hora, diluída com tolueno (50 mL), concentrada e cristalizada com EtOH/hexano para fornecer o composto do título como sal de HCl (2,43 g, 94% de rendimento). EI MS m/z 115,1 ([M+H]+). Exemplo 267. Síntese de ácido 4-(benziloxi)-3-metoxibenzoico
[00452] A uma mistura de ácido 4-hidroxi-3-metoxibenzoico (50,0 g, 297,5 mmol) em etanol (350 mL) e solução aquosa de NaOH (2,0 M, 350 mL), adicionou-se BnBr (140,0 g, 823,5 mmol). A mistura foi agitada a 65ºC por 8 horas, concentrada, co-evaporada com água (2 × 400 mL), concentrada até ~400 mL e acidificada para pH 3,0 com HCl 6 N. O sólido foi coletado por filtração, cristalizado com EtOH, seco a 45ºC sob vácuo para fornecer o composto do título (63,6 g, 83% de rendimento). ESI MS m/z 281,2 ([M+Na]+). Exemplo 268. Síntese de ácido 4-(benziloxi)-5-metoxi-2-nitrobenzoico
381 / 439
[00453] A uma solução de ácido 4-(benziloxi)-3-metoxibenzoico (63,5 g, 246,0 mmol) em CH2Cl2 (400 mL) e HOAc (100 mL), adicionou-se HNO3 (fumegante, 25,0 mL, 528,5 mmol). A mistura foi agitada por 6 horas, concentrada, cristalizada com EtOH e seca a 40ºC sob vácuo para fornecer o composto do título (63,3 g, 85% de rendimento). ESI MS m/z 326,1 ([M+Na]+). Exemplo 269. Síntese de (S)-(4-(benziloxi)-5-metoxi-2-nitrofenil)(2- (hidroximetil)-4-metilenopirrolidin-1-il)metanona
[00454] Uma quantidade catalítica de DMF (30 µL) foi adicionada a uma solução de ácido 4-(benziloxi)-5-metoxi-2-nitrobenzoico (2,70 g, 8,91 mmol) e cloreto de oxalila (2,0 mL, 22,50 mmol) em CH2Cl2 anidro (70 mL) e a mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas. O excesso de CH2Cl2 e cloreto de oxalila foi removido com rotavap. O cloreto de acetila foi ressuspenso em CH2Cl2 fresco (70 mL) e adicionado lentamente a uma solução pré-misturada de (S)-(4-metilenopirrolidin-2-il)metanol, sal cloridrato (1,32 g, 8,91 mmol) e Et3N (6 mL) em CH2Cl2 a 0ºC sob atmosfera de N2. A mistura de reação foi deixada aquecer até a temperatura ambiente e a agitação foi continuada por 8 horas. Após a remoção de CH2Cl2 e Et3N, o resíduo foi repartido entre H2O e EtOAc (70/70 mL). A camada aquosa foi extraída mais com EtOAc (2 × 60 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (40 mL), secas (MgSO4) e concentradas. A purificação do resíduo com cromatografia flash (sílica gel, hexanos/EtOAc 2:8) forneceu o composto do título (2,80 g, 79% de rendimento). EI MS m/z 421,2 ([M+Na]+). Exemplo 270. Síntese de (S)-(4-(benziloxi)-5-metoxi-2-nitrofenil)(2-(((terc-
382 / 439 butildimetilsilil)oxi)metil)-4-metilenopirrolidin-1-il)metanona BnO NO2
OTBS MeO N
O
[00455] A (S)-(4-(benziloxi)-5-metoxi-2-nitrofenil)(2-(hidroximetil)-4- metilenopirrolidin-1-il)metanona (2,78 g, 8,52 mmol) na mistura de DCM (10 mL) e piridina (10 mL), adicionou-se terc-butilclorodimetilsilano (2,50 g, 16,66 mmol). A mistura foi agitada durante a noite, concentrada e purificada em coluna de SiO2 eluída com EtOAc/CH2Cl2 (1:6) para fornecer o composto do título (3,62 g, 83% de rendimento, ~95% puro). MS ESI m/z calculado para C27H37N2O6Si [M+H]+ 513,23; encontrado 513,65. Exemplo 271. Síntese de (S)-(4-hidroxi-5-metoxi-2-nitrofenil)(2- (hidroximetil)-4-metilenopirrolidin-1-il)metanona
[00456] A (S)-(4-(benziloxi)-5-metoxi-2-nitrofenil)(2-(hidroximetil)-4- metilenopirrolidin-1-il)metanona (2,80 g, 7,03 mmol) na mistura de DCM (30 mL) e CH3SO3H (8 mL), adicionou-se PhSCH3 (2,00 g, 14,06 mmol). A mistura foi agitada por 0,5 h, diluída com DCM (40 mL), neutralizada com adição cuidadosa de uma solução de Na2CO3 0,1 M. A mistura foi separada e A solução AQUOSA foi extraída com DCM (2 x 10 mL). As camadas orgânicas foram combinadas, secas com Na2SO4, concentradas e purificadas em coluna de SiO2 eluída com MeOH/CH2Cl2 (1:15 PARA 1:6) para fornecer o composto do título (1,84 g, 85% de rendimento, ~95% puro). MS ESI m/z calculado para C14H17N2O6 [M+H]+ 309,10; encontrado 309,30. Exemplo 272. Síntese de (S)-((pentano-1,5-di-ilbis(oxi))bis(5-metoxi-2-nitro- 4,1-fenileno))bis(((S)-2-(hidroximetil)-4-metilenopirrolidin-1-il)metanona)
383 / 439
[00457] A (S)-(4-hidroxi-5-metoxi-2-nitrofenil)(2-(hidroximetil)-4- metilenopirrolidin-1-il)metanona (0,801 g, 2,60 mmol) em butanona (10 mL), adicionou-se Cs2CO3, ( 2,50 g, 7,67 mmol), seguido por 1,5-diiodopentano (415 mmol, 1,28 mmol). A mistura foi agitada por 26 horas, concentrada e purificada em coluna de SiO2 eluída com MeOH/CH2Cl2 (1:15 para 1:5) para fornecer o composto do título (0,675 g, 77% de rendimento, ~95% puro). MS ESI m/z calculado para C33H41N4O12 [M+H]+ 685,26; encontrado 685,60. Exemplo 273. Síntese de (S)-((pentano-1,5-di-ilbis(oxi))bis(2-amino-5- metoxi-4,1-fenileno))bis(((S)-2-(hidroximetil)-4-metilenopirrolidin-1- il)metanona)
[00458] A (S)-((pentano-1,5-di-ilbis(oxi))bis(5-metoxi-2-nitro-4,1- fenileno))bis(((S)-2-(hidroximetil)-4-metilenopirrolidin-1-il)metanona) (0,670 g, 0,98 mmol) em CH3OH (10 mL), adicionou-se Na2S2O4 (1,01 g, 5,80 mmol) em H2O (8 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 30 horas. A mistura de reação foi evaporada e co-evaporada com DMA (2 x 10 mL) e EtOH (2 x 10 mL) sob alto vácuo até a secura para fornecer o composto do título (peso total 1,63 g) contendo sais inorgânicos que foi usado diretamente para a etapa de reação seguinte (sem separação adicional). EIMS m/z 647,32 ([M+Na]+). Exemplo 274. Síntese de C-01 (um dímero de análogo de PBD com um bis- ligante).
384 / 439
[00459] 6,39-bis(4-((terc-butoxicarbonil)amino)butil)-22,23-bis(2,5- dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-3,42-bis((4-(hidroximetil)fenil)carbamoil)- 5,8,21,24,37,40-hexaoxo-11,14,17,28,31,34-hexaoxa-4,7,20,25,38,41-hexa- azatetratetracontano-1,44-dioato de (3S,6S,39S,42S)-di-terc-butila (0,840 g,
0.488 mmol) em THF (8 mL) contendo piridina (0,100 mL, 1,24 mmol) a 0ºC foi adicionado gota a gota a uma solução de trisfosgênio (0,290 mg, 0,977 mmol) em THF (3,0 mL). A mistura de reação foi agitada a 0ºC por 15 minutos, então, usada diretamente na etapa seguinte.
[00460] (S)-((pentano-1,5-di-ilbis(oxi))bis(2-amino-5-metoxi-4,1- fenileno))bis(((S)-2-(hidroximetil)-4-metilenopirrolidin-1-il)metanona) contendo sais inorgânicos (0,842 mg, ~0.49 mmol) foi suspenso em EtOH (10 mL) a 0ºC e adicionado ao tricloreto em THF preparado acima. A mistura foi agitada a 0ºC por 4 horas, aquecida até a temperatura ambiente por 1 hora, concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (250 (L) mm x 10(d) mm, coluna C18, acetonitrila/água 10-80% em 40 minutos, v =8 mL/min.) para fornecer o composto C-01 (561,1 mg, 48% de rendimento em três etapas). ESI MS m/z: calculado para C117H163N16O38 [M+H]+ 2400,12; encontrado 2400,90. Exemplo 275. Síntese de C-02 (um dímero de análogo de PBD com um bis- ligante).
385 / 439
[00461] Periodinano de Dess-Martin (138,0 mg, 0,329 mmol) foi adicionado a uma solução do composto C-01 (132,0 mg, 0,055 mmol) em DCM (5,0 mL) a 0ºC. A mistura de reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 2 horas. Uma solução saturada de NaHCO3/Na2SO3 (5,0 mL/5,0 mL) foi então adicionada e a mistura extraída com DCM (3 x 25 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com NaHCO3/Na2SO3 (5,0 mL/5,0 mL), salmoura (10 mL), secas com Na2SO4, filtradas, concentradas e purificadas por HPLC de fase reversa (250 (L) mm x 10(d) mm, coluna C18, acetonitrila/água 10-80% em 40 minutos, v =8 mL/min.) para fornecer o composto do título (103,1 mg, 78% de rendimento) como uma espuma. ESI MS m/z: calculado para C117H158N16O38 [M+H]+ 2396,09; encontrado 2396,65. Exemplo 276. Síntese de C-03 (um dímero de análogo de PBD com um bis- ligante).
[00462] O composto C-02 (55,0 mg, 0,023 mmol) foi dissolvido em
386 / 439 DCM (3 mL), seguido pela adição de TFA (3 mL). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas, concentrada e co-evaporada com DCM/tolueno até a secura para fornecer o produto bruto C-3 (48,0 mg, 100% de rendimento, 92% puro por HPLC) que foi purificado mais por HPLC de fase reversa (250 (L) mm x 10(d) mm, coluna C18, acetonitrila/água 5-60% em 40 minutos, v =8 mL/min.) para fornecer o produto puro C-03 (42,1 mg, 88% de rendimento, 96% puro ) como uma espuma. ESI MS m/z: calculado para C99H126N16O34 [M+H]+ 2083,86; encontrado 2084,35. Exemplo 277. Síntese de C-04 (um dímero de análogo de PBD com um bis- ligante).
[00463] O composto C-03 (35,0 mg, 0,017 mmol) foi dissolvido em uma solução misturada de THF (3 mL) e NaH2PO4 0,1 M(3 mL), pH 7,5, seguido pela adição de 2,5,8,11,14,17,20,23-octaoxahexacosan-26-oato de N- succinimidila (43,0 mg, 0,084 mmol) em 4 porções durante 2 horas. A mistura de reação continuou então a ser agitada à temperatura ambiente por 4 horas e co-evaporada com DMF (10 mL) até a secura para fornecer o produto bruto C-4 que foi purificada mais por HPLC de fase reversa (250 (L) mm x 20(d) mm, coluna C18, acetonitrila/água 20-60% em 40 minutos, v =8 mL/min.) para fornecer o produto puro C-04 (39,4 mg, 81% de rendimento, 96% puro ) como uma espuma. ESI MS m/z: calculado para C135H195N16O52 [M+H]+ 2872,30; encontrado 2871,65.
387 / 439 Exemplo 278. Síntese de C-05 (um dímero de análogo de PBD com um bis- ligante).
[00464] A uma solução do composto C-04 (35,0 mg, 0,012 mmol) e 2,5,8,11,14,17,20,23-octaoxapentacosan-25-amina (15,1 mg, 0,0394 mmol) em DMA seco (2 mL), adicionou-se EDC (30,0 mg, 0,156 mmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 14 horas, concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (250 (L) mm x 20(d) mm, coluna C18, acetonitrila/água 20-60% em 40 minutos, v =8 mL/min.) para fornecer o produto puro C-05 (31,2 mg, 77% de rendimento, 97% puro por HPLC) como uma espuma. ESI MS m/z: calculado para C161H249N18O62 [M+H]+ 3426,68; encontrado 3427,21. Exemplo 279. Síntese de 1-(4-(benziloxi)-5-metoxi-2-nitrobenzoil)-4- metilenopirrolidina-2-carboxilato de (S)-metila
[00465] Uma quantidade catalítica de DMF (30 µL) foi adicionada a uma solução de ácido 4-(benziloxi)-5-metoxi-2-nitrobenzoico (2,70 g, 8,91 mmol) e cloreto de oxalila (2,0 mL, 22,50 mmol) em CH2Cl2 anidro (70 mL) e a mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas. O excesso de CH2Cl2 e cloreto de oxalila foi removido com rotavap. O cloreto
388 / 439 de acetila foi ressuspenso em CH2Cl2 fresco (70 mL) e adicionado lentamente a uma solução pré-misturada de 4-metilenopirrolidina-2-carboxilato de (S)- metila, cloridrato (1,58 g, 8,91 mmol) e Et3N (6 mL) em CH2Cl2 a 0ºC sob atmosfera de N2. A mistura de reação foi deixada aquecer até a temperatura ambiente e a agitação prosseguiu por 8 horas. Após a remoção de CH2Cl2 e Et3N, o resíduo foi repartido entre H2O e EtOAc (70/70 mL). A camada aquosa foi extraída mais com EtOAc (2 × 60 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (40 mL), secas (MgSO4) e concentradas. A purificação do resíduo com cromatografia flash (sílica gel, 2:8 hexanos/EtOAc) forneceu o composto do título (2,88 g, 76% de rendimento). EI MS m/z 449,1 ([M+Na]+). Exemplo 280. Síntese de (S)-1-(4-(benziloxi)-5-metoxi-2-nitrobenzoil)-4- metilenopirrolidina-2-carbaldeído
[00466] A uma solução agitada vigorosamente de 1-(4-(benziloxi)-5- metoxi-2-nitrobenzoil)-4-metilenopirrolidina-2-carboxilato de (S)-metila (2,80 g, 6,57 mmol) em CH2Cl2 anidro (60 mL), adicionou-se DIBAL-H (1N em CH2Cl2, 10 mL) gota a gota a -78ºC sob atmosfera de N2. Após a mistura ter sido agitada por 90 minutos adicionais, o excesso de reagente foi decomposto pela adição de 2 mL de metanol, seguido por HCl 5% (10 mL). A mistura resultante foi deixada aquecer até 0ºC. As camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída mais com CH2Cl2 (3 × 50 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secas (MgSO4) e concentradas. A purificação do resíduo com cromatografia flash (sílica gel, CHCl3/MeOH 95:5) forneceu o composto do título (2,19 g, 84% de rendimento). EIMS m/z 419,1 ([M+Na]+). Exemplo 281. Síntese de (S)-8-(benziloxi)-7-metoxi-2-metileno-2,3-di-hidro- 1H-benzo[e]-pirrol[1,2-a]azepin-5(11aH)-ona
389 / 439
[00467] Uma mistura de (S)-1-(4-(benziloxi)-5-metoxi-2-nitrobenzoil)- 4-metilenopirrolidina-2-carbaldeído (2,18 g, 5,50 mmol) e Na2S2O4 (8,0 g, 45,97 mmol) em THF (60 mL) e H2O (40 mL) foi agitada à temperatura ambiente Por 20 horas. Os Solventes foram removidos sob alto vácuo. O resíduo foi ressuspenso em MeOH (60 mL), e HCl (6M) foi adicionado gota a gota até ter sido atingido pH ~ 2. A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora. A reação foi purificada pela remoção da maior parte de MeOH, então diluída com EtOAc (100 mL). A solução de EtOAc foi lavado com NaHCO3 saturado, salmoura, seca (MgSO4) e concentrada. A purificação do resíduo com cromatografia flash (sílica gel, CHCl3/MeOH 97:3) forneceu o composto do título (1,52 g, 80%). EIMS m/z 372,1 ([M+Na]+). Exemplo 282. Síntese de (S)-8-hidroxi-7-metoxi-2-metileno-2,3 -di-hidro-1H- benzo[e]-pirrol[1,2-a]azepin-5(11aH)-ona
[00468] A uma solução de (S)-8-(benziloxi)-7-metoxi-2-metileno-2,3 - di-hidro-1H-benzo[e]-pirrol[1,2-a]azepin-5(11aH)-ona (1,50 g, 4,32 mmol) em 70 mL de CH2Cl2, adicionou-se 25 mL de CH3SO3H a 0ºC. A mistura foi agitada a 0ºC por 10 minutos, depois à temperatura ambiente por 2 horas, diluída com CH2Cl2, teve o pH ajustado para 4 com NaHCO3 1,0 N frio e filtrada. A camada aquosa foi extraída com CH2Cl2 (3 × 60 mL). As camadas orgânicas foram combinadas, secas com Na2SO4, filtradas, evaporadas e purificadas por cromatografia em coluna de SiO2 (CH3OH/CH2Cl2 1:15) para fornecer 811 mg (73% de rendimento) do produto do título. EIMS m/z 281,1 ([M+Na]+).
390 / 439 Exemplo 283. Síntese de (11aS,11a'S)-8,8'-(pentano-1,5-di-ilbis(oxi))bis(7- metoxi-2-metileno-2,3-di-hidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepin- 5(11aH)-ona)
[00469] A uma solução suspensa agitada de Cs2CO3 (0,761 g, 2,33 mmol) em butanona (8 mL), foram adicionados (S)-8-hidroxi-7-metoxi-2- metileno-2,3 -di-hidro-1H-benzo[e]-pirrol[1,2-a]azepin-5(11aH)-ona (401 mg, 1,55 mmol) e 1,5-diiodopentano (240 mg, 0,740 mmol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, concentrada e purificada por cromatografia em SiO2 (EtOAc/CH2Cl2 1:10) para fornecer 337 mg (78% de rendimento) do produto do título. EIMS m/z 607,2 ([M+Na]+). Exemplo 284. Síntese de (S)-7-metoxi-8-((5-(((S)-7-metoxi-2-metileno-5- oxo-2,3,5,10,11,11a-hexahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepin-8- il)oxi)pentil)oxi)-2-metileno-2,3-di-hidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2- a][1,4]diazepin-5(11aH)-ona
[00470] A uma solução de (11aS,11a'S)-8,8'-(pentano-1,5-di- ilbis(oxi))bis(7-metoxi-2-metileno-2,3-di-hidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2- a][1,4]diazepin-5(11aH)-ona) (150 mg, 0,256 mmol) em diclorometano anidro (1 mL) e etanol absoluto (1,5 mL), adicionou-se borohidreto de sódio em éter metoxieílico (85 µL, 0,5 M, 0,042 mmol) a 0ºC. O banho de gelo foi removido depois de 5 minutos e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por 3 horas, então resfriada até 0ºC, interrompida com cloreto de amônio saturado, diluída com diclorometano e as fases foram separadas. A camada orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2SO4 anidro, filtrada através de Celite e concentrada. O resíduo foi purificado por HPLC de fase reversa
391 / 439 (Coluna C18, acetonitrila/água). As frações correspondentes foram extraídas com diclorometano e concentradas para fornecer o composto do título (64,7 mg, 43%), MS m/z 609,2 ([M+Na]+), 625,3 ([M+K]+) e 627,2 ([M+Na+H2O]+); foi obtido o composto totalmente reduzido (16,5 mg, 11%), MS m/z 611,2 ([M+Na]+), 627,2 ([M+K]+), 629,2 ([M+Na+H2O]+); e o material de partida não reagido foi também recuperado (10,2 mg, 7%), MS m/z 607,2 ([M+Na]+), 625,2 ([M+Na+H2O]+). Exemplo 285. Síntese de (S)-8-((5-(((S)-10-(3-(2-(2- azidoetoxi)etoxi)propanoil)-7-metoxi-2-metileno-5-oxo-2,3,5,10,11,11a- hexahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)oxi)pentil)oxi)-7- metoxi-2-metileno-2,3-di-hidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepin- 5(11aH)-ona
[00471] À mistura de (S)-7-metoxi-8-((5-(((S)-7-metoxi-2-metileno-5- oxo-2,3,5,10,11,11a-hexahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepin-8- il)oxi)pentil)oxi)-2-metileno-2,3-di-hidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2- a][1,4]diazepin-5(11aH)-ona (60,0 mg, 0,102 mmol) e 3-(2-(2- azidoetoxi)etoxi)propanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila (40,5 mg, 0,134 mmol) em diclorometano (5 mL), adicionou-se EDC (100,5 mg, 0,520 mmol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, concentrada e purificada por cromatografia em coluna de SiO2 (EtOAc/CH2Cl2, 1:6) para fornecer 63,1 mg (81% de rendimento) do produto do título. ESI MS m/z C40H50N7O9 [M+H] +, calculado772,36; encontrado 772,30. Exemplo 286. Síntese de (S)-8-((5-(((S)-10-(3-(2-(2- aminoetoxi)etoxi)propanoil)-7-metoxi-2-metileno-5-oxo-2,3,5,10,11,11a- hexahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)oxi)pentil)oxi)-7- metoxi-2-metileno-2,3-di-hidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepin-
392 / 439 5(11aH)-ona
[00472] A uma solução de (S)-8-((5-(((S)-10-(3-(2-(2-azidoetoxi)etoxi) propanoil)-7-metoxi-2-metileno-5-oxo-2,3,5,10,11,11a-hexahidro-1H- benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)oxi)pentil)oxi)-7-metoxi-2-metileno- 2,3-di-hidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepin-5(11aH)-ona (60 mg, 0,078 mmol) na mistura de THF (5 mL) e solução tampão de NaH2PO4 (pH 7,5; 1,0 M, 0,7 mL), adicionou-se PPh3 (70 mg, 0,267 mmol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, concentrada e purificada por HPLC preparativa em C18, eluída com água/CH3CN (de água 90% para água 35% em 35 minutos) para fornecer 45,1 mg (79% de rendimento) do produto do título após secagem sob alto vácuo. ESI MS m/z C40H52N5O9 [M+H]+, calculado746,37; encontrado 746,50. Exemplo 287. Síntese de (S)-N-(2-((S)-8-((5-(((11S,11aS)-10-((S)-15-azido- 5-isopropil-4,7-dioxo-10,13-dioxa-3,6-diazapentadecan-1-oil)-11-hidroxi-7- metoxi-2-metileno-5-oxo-2,3,5,10,11,11a-hexahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2- a][1,4]diazepin-8-il)oxi)pentil)-oxi)-7-metoxi-2-metileno-5-oxo-2,3,11,11a- tetrahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-il)-2-oxoetil)-2-(3- (2-(2-azidoetoxi)etoxi)propanamido)-3-metilbutanamida
[00473] À mistura de (S)-7-metoxi-8-((5-(((S)-7-metoxi-2-metileno-5- oxo-2,3,5,10,11,11a-hexahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepin-8- il)oxi)pentil)oxi)-2-metileno-2,3-di-hidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2- a][1,4]diazepin-5(11aH)-ona (60,0 mg, 0,102 mmol) e ácido (S)-15-azido-5-
393 / 439 isopropil-4,7-dioxo-10,13-dioxa-3,6-diazapentadecan-1-oico (90,2 mg, 0,25 mmol) em DMA (8 mL), adicionou-se BrOP (240,2 mg, 0,618 mmol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, concentrada e purificada por cromatografia em coluna de SiO2 (CH3OH/CH2Cl2, 1:10 para 1:5) para fornecer 97,1 mg (74% de rendimento) do produto do título. ESI MS m/z C61H87N14O17 [M+H] +, calculado1287,63; encontrado 1287,95. Exemplo 288. Síntese de (S)-N-(2-((S)-8-((5-(((11S,11aS)-10-((S)-15-amino- 5-iso-propil-4,7-dioxo-10,13-dioxa-3,6-diazapentadecan-1-oil)-11-hidroxi-7- metoxi-2-metileno-5-oxo-2,3,5,10,11,11a-hexahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2- a][1,4]diazepin-8-il)oxi)pentil)oxi)-7-metoxi-2-metileno-5-oxo-2,3,11,11a- tetrahidro-1H-benzo[e]-pirrol[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-il)-2-oxoetil)-2-(3- (2-(2-aminoetoxi)etoxi)-propanamido)-3-metilbutanamida (C-06)
[00474] A uma solução de (S)-N-(2-((S)-8-((5-(((11S,11aS)-10-((S)- 15-azido-5-isopropil-4,7-dioxo-10,13-dioxa-3,6-diazapentadecan-1-oil)-11- hidroxi-7-metoxi-2-metileno-5-oxo-2,3,5,10,11,11a-hexahidro-1H- benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)oxi)pentil)-oxi)-7-metoxi-2-metileno- 5-oxo-2,3,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)- il)-2-oxoetil)-2-(3-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)propanamido)-3-metilbutanamida (85 mg, 0,066 mmol) na mistura de THF (5 mL) e solução tampão NaH2PO4 (pH 7,5; 1,0 M, 0,7 mL), adicionou-se PPh3 (100 mg, 0,381 mmol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. Depois de confirmada por
394 / 439 LC-MS a formação de (S)-N-(2-((S)-8-((5-(((11S,11aS)-10-((S)-15-amino-5- isopropil-4,7-dioxo-10,13-dioxa-3,6-diazapentadecan-1-oil)-11-hidroxi-7- metoxi-2-metileno-5-oxo-2,3,5,10,11,11a-hexahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2- a][1,4]diazepin-8-il)oxi)pentil)oxi)-7-metoxi-2-metileno-5-oxo-2,3,11,11a- tetrahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-il)-2-oxoetil)-2-(3- (2-(2-aminoetoxi)etoxi)propanamido)-3-metilbutanamida (ESI MS m/z C61H90N10O17 [M+Na]+, calculado1257,66; encontrado 1257,90), 2,3-bis(2,5- dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)succinato de bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) (33 mg, 0.066 mmol) foi adicionado. A mistura continuou sendo agitada por 4 horas, foi concentrada e purificada por HPLC preparativa em C18, eluída com água/CH3CN (de água 90% para água 30% em 35 minutos) para fornecer 40,1 mg (40% de rendimento) do produto do título C-4 após secagem sob alto vácuo. ESI MS m/z C73H95N12O23 [M+H]+, calculado 1507,66; encontrado 1507,90. Exemplo 289. Síntese de ácido 4,4'-(pentano-1,5-di-ilbis(oxi))bis(3- metoxibenzoico)
[00475] Uma solução de diiodopropano (19,0 g, 58,6 mmol) em THF (75 mL) foi adicionada gota a gota ao longo de um período de 4 horas a uma solução agitada vigorosamente de ácido vanílico (20,0 g, 119 mmol) em THF (150 mL) e NaOH aquoso (340 mL) a 65ºC na ausência de luz (balão envolvido em laminado). Após aquecimento ao refluxo por 48 horas no escuro, a solução foi resfriada e o THF removido por evaporação a vácuo. O resíduo foi extraído com EA e a camada aquosa foi separada e acidificada para pH 2 com HCl concentrado. O precipitado resultante foi coletado por filtração, lavado, seco e recristalizado com ácido acético glacial para fornecer o ácido bis-carboxílico correspondente (14,0 g, 34,7 mmol). Sólido branco, rendimento (60%).
395 / 439 Exemplo 290. Síntese de ácido 4,4'-(pentano-1,5-di-ilbis(oxi))bis(5-metoxi-2- nitrobenzoico)
[00476] A uma suspensão de ácido 4,4'-(pentano-1,5-di- ilbis(oxi))bis(3-metoxibenzoico) (18,0 g, 66,8 mmol) em HOAc (80 mL, 1800 mmol), adicionou-se HNO3 (80 mL, 1778 mmol) gota a gota à temperatura ambiente. Depois de agitação por 2 horas, a mistura foi vertida em 100 g de gelo e extraída com EA (2 x 200 mL). A camada orgânica foi separada e lavada com H2O (2 x 100 mL), depois NaOH 4N (400 mL) foi adicionado. Depois de extraída com EA (2 x 100 mL), a camada aquosa básica foi separada e acidificada para pH 2 com HCl concentrado. A mistura foi extraída com EA (2 x 250 mL). O extrato orgânico combinado foi lavado com salmoura, seco, filtrado e concentrado. O resíduo foi purificado por cromatografia flash (DCM/MeOH = 4/1) para fornecer ácido 4,4'-(pentano- 1,5-di-ilbis(oxi))bis(5-metoxi-2-nitrobenzoico) (6,1 g, 12,3 mmol) como um sólido amarelo claro com 18% de rendimento. Rf 0,3 (DCM/MeOH = 3/1) Exemplo 291. Síntese de (S)-((pentano-1,5-di-ilbis(oxi))bis(5-metoxi-2-nitro- 4,1-fenileno))bis(((S)-2-(hidroximetil)pirrolidin-1-il)metanona)
[00477] A uma solução de ácido 4,4'-(pentano-1,5-di-ilbis(oxi))bis(5- metoxi-2-nitrobenzoico) (5,0 g, 10,0 mmol) e L-(+)-Prolinol (2,25 g, 22,3 mmol) em DMF (100 mL), adicionou-se TEA (4,0 g) à temperatura ambiente. Após 10 minutos de agitação, HATU (10,77 g, 28,3 mmol) foi adicionado. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. Depois de
396 / 439 concluída a conversão, a mistura foi diluída com H2O (100 mL) e extraída com EA (2 x 100 mL) e DCM (2 x 50 mL). O extrato orgânico combinado foi lavado com salmoura, seco, filtrado e concentrado. O resíduo foi purificado por cromatografia (DCM/MeOH = 15/1) para fornecer (S)-((pentano-1,5-di- ilbis(oxi))bis(5-metoxi-2-nitro-4,1-fenileno))bis(((S)-2- (hidroximetil)pirrolidin-1-il)metanona) (6,0 g, 9,1 mmol) como uma espuma branca com 91% de rendimento. Exemplo 292. Síntese de (S)-((pentano-1,5-di-ilbis(oxi))bis(2-amino-5- metoxi-4,1-fenileno))bis(((S)-2-(hidroximetil)pirrolidin-1-il)metanona)
[00478] A uma solução de (S)-((pentano-1,5-di-ilbis(oxi))bis(5-metoxi- 2-nitro-4,1-fenileno))-bis(((S)-2-(hidroximetil)pirrolidin-1-il)metanona) (6,0 g, 9,1 mmol) em MeOH (100 mL), adicionou-se Pd/C 10% (2,4 g) e a mistura foi agitada sob atmosfera de hidrogênio à temperatura ambiente durante a noite. Após 14 horas de agitação, o Pd/C foi removido por filtração e lavou-se com MeOH. O filtrado foi concentrado e o resíduo foi purificado por cromatografia (DCM/MeOH = 10/1) para fornecer (S)-((pentano-1,5-di- ilbis(oxi))bis(2-amino-5-metoxi-4,1-fenileno))bis(((S)-2- (hidroximetil)pirrolidin-1-il)metanona) (3,54 g, 5,9 mmol) como uma espuma branca com 65% de rendimento. Exemplo 293. Síntese de ((S)-(pentano-1,5-di-ilbis(oxi))bis(2-((S)-2- (hidroximetil)pirrolidina-1-carbonil)-4-metoxi-5,1-fenileno))dicarbamato de bis(4-((S)-2-((S)-2-(((aliloxi)carbonil)amino)-3- metilbutanamido)propanamido)benzila)
397 / 439 trifosgênio
[00479] A uma solução de ((S)-1-(((S)-1-((4- (hidroximetil)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2- il)carbamato de alila (8,0 g, 21,3 mmol) em THF seco (300 mL), adicionou-se DIPEA (5,5 g, 40,3 mmol) e uma solução de trisfosgênio (3,2 g, 10,8 mmol) em THF seco (50 mL) a 5 º. Após 15 minutos de agitação, a solução foi voltou a ser resfriada até 5ºC e uma mistura de (S)-((pentano-1,5-di- ilbis(oxi))bis(2-amino-5-metoxi-4,1-fenileno))bis(((S)-2-(hidroximetil)- pirrolidin-1-il)metanona) (3,2 g, 5,3 mmol) e DIPEA(2,75 g, 21,6 mmol) em THF seco (150 mL) foi adicionada. A solução resultante foi deixada aquecer até a temperatura ambiente e agitada durante a noite. O THF foi removido por evaporação a vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia (DCM/MeOH = 20/1) para fornecer bis(4-((S)-2-((S)-2-(((aliloxi)carbonil)amino)-3- metilbutanamido) propanamido)-benzil)((S)-(pentano-1,5-di-ilbis(oxi))bis(2- ((S)-2-(hidroximetil)pirrolidina-1-carbonil)-4-metoxi-5,1- fenileno))dicarbamato (7,0 g, 4,97 mmol) como uma espuma amarela com 94% de rendimento. Exemplo 294. Síntese de (11S,11aS,11'S,11a'S)-bis(4-((S)-2-((S)-2- (((aliloxi)carbonil)-amino)-3-metilbutanamido)propanamido)benzil) 8,8'- (pentano-1,5-di-ilbis(oxi))bis(11-hidroxi-7-metoxi-5-oxo-2,3,11,11a- tetrahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepina-10(5H)-carboxilato).
398 / 439 Periodinano de Dess- Martin
[00480] A uma solução de bis(4-((S)-2-((S)-2- (((aliloxi)carbonil)amino)-3-metilbutanamido)propanamido)benzil)((S)- (pentano-1,5-di-ilbis(oxi))bis(2-((S)-2-(hidroxi-metil)pirrolidina-1-carbonil)- 4-metoxi-5,1-fenileno))dicarbamato (300 mg, 0,21 mmol) em DCM seco (15 mL), adicionou-se DMP (280 mg, 0,66 mmol) sob nitrogênio à temperatura ambiente. Depois de concluída a conversão, a solução de reação foi adicionada Na2SO3 aquoso, seguido por NaHCO3 aquoso, e a mistura foi agitada por mais 15 minutos e extraída com DCM (3 x 20 mL). O extrato orgânico combinado foi lavado com salmoura, seco, filtrado e concentrado. O resíduo foi purificado por cromatografia (DCM/MeOH = 20/1) para fornecer (11S,11aS,11'S,11a'S)-bis(4-((S)-2-((S)-2-(((aliloxi)carbonil)amino)-3- metilbutanamido)propanamido)benzil)8,8'-(pentano-1,5-di-ilbis(oxi))bis(11- hidroxi-7-metoxi-5-oxo-2,3,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2- a][1,4]diazepina-10(5H)-carboxilato) (270 mg, 0,19 mmol) como uma espuma esbranquiçada com 92% de rendimento. Exemplo 295. Síntese de 8,8'-(pentano-1,5-di-ilbis(oxi))bis(11-hidroxi-7- metoxi-5-oxo-2,3,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepina- 10(5H)-carboxilato de (11S,11aS,11'S,11a'S)-bis(4-((S)-2-((S)-2- (((aliloxi)carbonil)-amino)-3-metilbutanamido)propanamido)benzila)).
399 / 439 pirrolidina
[00481] A uma solução de 8,8'-(pentano-1,5-di-ilbis(oxi))bis(11- hidroxi-7-metoxi-5-oxo-2,3,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2- a][1,4]diazepina-10(5H)-carboxilato de (11S,11aS,11'S,11a'S)-bis(4-((S)-2- ((S)-2-(((aliloxi)carbonil)amino)-3-metilbutanamido)propanamido)benzil)a) (774 mg, 0,55 mmol) e pirrolidina (196 mg, 2,76 mmol) em DCM (8 mL), adicionou-se Pd(pph3)4 (76 mg, 0,066 mmol). A reação foi submetida a jatos de argônio e agitada por 2 horas à temperatura ambiente, depois das quais, a reação foi diluída com DCM e lavada sequencialmente com NH4Cl aquoso saturado e salmoura. A fase orgânica foi seco com Na2SO4, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia (DCM/ MeOH = 6/1) para fornecer 8,8'-(pentano-1,5-di-ilbis(oxi))bis(11-hidroxi-7-metoxi-5-oxo- 2,3,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]-pirrol[1,2-a][1,4]diazepina-10(5H)- carboxilato de (11S,11aS,11'S,11a'S)-bis(4-((S)-2-((S)-2-(((aliloxi) carbonil)amino)-3-metil-butanamido)propanamido)benzila) (420 mg, 0,34 mmol) como um sólido esbranquiçado com 62% de rendimento. Exemplo 296. Síntese de ácido (S)-2-(((aliloxi)carbonil)amino)-3- metilbutanoico
400 / 439
[00482] Cloroformato de alila (24,8 g, 205 mmol) foi adicionado gota a gota a uma solução agitada de L-valina (20 g, 171 mmol) e K2CO3 (35,4 g, 257 mmol) em H2O (250 mL) e THF (250 mL). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, depois o solvente foi concentrado sob pressão reduzida e a solução restante extraída com éter dietílico (100 mL). A porção aquosa foi acidificada para pH 2 com HCl concentrado e extraída com DCM (3 x 200 mL). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secas com Na2SO4, filtradas e concentradas para fornecer o produto (35 g, 174 mmol). Sólido branco, rendimento (100% ). Exemplo 297. Síntese de 2-(((aliloxi)carbonil)amino)-3-metilbutanoato de (S)-2,5-dioxopirrolidin-1-ila
[00483] A uma solução agitada de ácido (S)-2- (((aliloxi)carbonil)amino)-3-metilbutanoico (35 g, 174 mmol) em DCM seco (500 mL), adicionou-se EDC (66,9 g, 348 mmol) e N-hidroxi-succinimida (30 g, 261 mmol) à temperatura ambiente. Após 14 horas de agitação, a reação foi diluída com DCM e lavada com água e salmoura. A fase orgânica foi seca com Na2SO4, filtrada e concentrada para fornecer o produto (54,5 g) que foi usado na etapa seguinte sem purificação adicional. Rendimento: óleo incolor viscoso (100%). Rf =0,5 (PE/EA = 2/1) Exemplo 298. Síntese de ácido (S)-2-((S)-2-(((aliloxi)carbonil)amino)-3- metilbutanamido)-propanoico
[00484] A uma solução de H-Ala-OH (15,7 g, 176 mmol) e NaHCO3 (15,5 g, 185 mmol) em THF (200 mL) e H2O (200 mL), adicionou-se uma
401 / 439 solução de 2-(((aliloxi)-carbonil)amino)-3-metilbutanoato de (S)-2,5- dioxopirrolidin-1-ila (50 g, 168 mmol) em THF (100 mL) à temperatura ambiente. Após 72 hours de agitação, o THF foi evaporado sob pressão reduzida. O resíduo foi acidificado para pH 3 com ácido cítrico e extraído com EA (3 x 350 mL). Os extratos combinados foram lavados com salmoura, secos, filtrados e concentrados para fornecer um sólido branco. A trituração com éter dietílico (excesso) forneceu o produto puro como um pó branco (25,2 g, 93 mmol, 55%). Exemplo 299. Síntese de ((S)-1-(((S)-1-((4-(hidroximetil)fenil)amino)-1- oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato de alila
[00485] A uma solução de ácido (S)-2-((S)-2- (((aliloxi)carbonil)amino)-3-metilbutanamido)-propanoico (25,2 g, 92,6 mmol) e álcool p-aminobenzílico (12,0 g, 97,6 mmol) em THF (300 mL), adicionou-se EEDQ (24,0 g, 97,2 mmol) à temperatura ambiente. Após 18 horas de agitação, o solvente foi evaporado sob pressão reduzida para fornecer um sólido marrom claro. O sólido foi triturado com éter dietílico, filtrado e lavado com excesso de éter dietílico. Isso forneceu o produto como um sólido branco (40 g, 106 mmol, 100%). Exemplo 300. Síntese de ácido 4-(((benziloxi)carbonil)amino)butanoico
[00486] Na2CO3 (41,1 g, 387 mmol) foi adicionado a uma solução de ácido 4-aminobutanoico (20 g, 193 mmol) em H2O (300 mL) a 5ºC. Após 10 minutos de agitação, uma solução de CbzCl (33,2 mL, 232 mmol) em THF (100 mL) foi adicionada gota a gota. A reação foi deixada aquecer até a temperatura ambiente e agitada durante a noite. Depois de concluída a
402 / 439 conversão, a mistura foi diluída com H2O (100 mL) e extraída com EA (2 x 100 mL). A camada aquosa foi acidificado para pH 2 com HCl concentrado e extraída com EA (3 x 100 mL). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secos com Na2SO4, filtrados e concentrados para fornecer um sólido branco. A trituração com PE (excesso) forneceu o produto puro como um pó branco (31,6 g, 70%). Exemplo 301. Síntese de 4-(((benziloxi)carbonil)amino)butanoato de terc- butila
[00487] A uma solução agitada de ácido 4- (((benziloxi)carbonil)amino)butanoico (5,9 g, 24,9 mmol) e terc-butanol (14,7 g, 199 mmol) em DCM seco (250 mL), adicionou-se 4-DMAP (0,61 g, 5 mmol) e DIC (4,7 g, 37,3 mmol) a 0ºC. Após 16 horas de agitação, a reação foi filtrada e extraída com DCM (2 x 200 mL). O extrato orgânico combinado foi lavado com HCl 1N e salmoura, seco com Na2SO4, filtrado e concentrado. O resíduo foi purificado por cromatografia (100% DCM) para fornecer 4- (((benziloxi)carbonil)amino)butanoato de terc-butila (4,26 g, 14,5 mmol, 58%) como óleo incolor viscoso. Exemplo 302. Síntese de 4-aminobutanoato de terc-butila
[00488] A uma solução de 4-(((benziloxi)carbonil)amino)butanoato de terc-butila (1,69 g, 5,77 mmol) em MeOH (40 mL), adicionou-se Pd/C 10% (400 mg), a mistura foi agitada sob atmosfera de hidrogênio à temperatura ambiente durante a noite. Após 14 horas de agitação, o Pd/C foi removido por filtração e lavou-se com MeOH. O filtrado foi concentrado para fornecer o produto que foi usado na etapa seguinte sem purificação adicional (897 mg, 5,64 mmol). Líquido incolor, rendimento (98%).
403 / 439 Exemplo 303. Síntese de ácido (2R,3S)-2,3-bis(benzilamino)succínico HO2C Br Hrefluxo 2N HO2C NHBn reflux + HO2C Br EtOH HO2C NHBn
[00489] A uma solução de ácido meso-2,3-dibromosuccínico (50 g, 181 mmol) em EtOH (400 mL), adicionou-se benzilamina (150 mL) gota a gota. Depois de concluída a adição, a mistura foi aquecida até 90ºC e agitada durante a noite. A mistura foi resfriada até a temperatura ambiente e diluída com H2O. HCl 6N foi adicionado até pH 4 formando-se precipitados brancos. Os precipitados foram filtrados, enxaguados com H2O e secos para fornecer ácido (2R,3S)-2,3-bis(benzilamino)succínico (50 g, 152 mmol, 84%). Exemplo 304. Síntese de ácido (2R,3S)-2,3-diaminossuccínico
[00490] A uma solução de ácido (2R,3S)-2,3- bis(benzilamino)succínico (18 g, 55 mmol) em AcOH (100 mL) e HCl (100 mL), adicionou-se Pd/C 10% (3 g) e a mistura foi agitada sob atmosfera de hidrogênio a 50ºC durante a noite. Após 48 horas de agitação, o Pd/C foi removido por filtração e lavou-se com H2O. O filtrado foi concentrado e o resíduo foi dissolvido em NaOH 1N (200 mL). AcOH foi adicionado até pH 5 formando-se precipitados brancos. Os precipitados foram filtrados, enxaguados com H2O e secos para fornecer ácido (2R,3S)-2,3- diaminossuccínico (8,7 g, 58,8 g, 100%). Exemplo 305. Síntese de ácido 2,3-bis(((benziloxi)carbonil)amino)succínico
[00491] A uma solução de ácido (2R,3S)-2,3-diaminossuccínico (31,74 g, 214 mmol) em THF (220 mL) e NaOH 4N (214 mL) foi adicionado CbzCl (61 mL, 428 mmol) gota a gota a 0ºC. Depois de concluída a adição, a mistura foi deixada aquecer até a temperatura ambiente e agitada por 2 horas. A
404 / 439 reação foi diluída com H2O (1600 mL) e extraída com EA (2 x 15600 mL). A camada aquosa foi separada e acidificada com HCl concentrado até ser atingido pH 2. A solução resultante foi agitada por 1 hora e ficou em repouso a 5ºC dando origem a precipitados brancos. Os precipitados foram filtrados, enxaguados com H2O e secos para fornecer ácido 2,3- bis(((benziloxi)carbonil)amino)succínico (52,2 g, 125 mmol, 59%). Exemplo 306. Síntese de ((3R,4S)-2,5-dioxotetrahidrofuran-3,4-di- il)dicarbamato de dibenzila
[00492] A solução de ácido 2,3- bis(((benziloxi)carbonil)amino)succínico (5,0 g, 12 mmol) em Ac2O ( 37,5 mL) foi submetida ao refluxo por 20 minutos, resfriada e concentrada para fornecer um anidrido resultante. A mistura diastereomérica foi tratada com CHCl3 (37 mL), o meso-isômero insolúvel foi filtrado e lavado com PE para fornecer cristais de ((3R,4S)-2,5-dioxotetrahidrofuran-3,4-di-il)dicarbamato de dibenzila (2,0 g, 5 mmol, 42%) Exemplo 307. Síntese de 4,4'-(((2R,3S)-2,3-bis(((benziloxi)carbonil)- amino)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoato de di-terc-butila
[00493] A uma solução de ((3R,4S)-2,5-dioxotetrahidrofuran-3,4-di- il)dicarbamato de dibenzila (2,03 g, 5,1 mmol) e 4-aminobutanoato de terc- butila (1,79 g, 11,3 mmol) em DMF (45 mL), adicionou-se DIPEA (1,98 g, 15,3 mmol) a 0ºC. Após 5 minutos de agitação, HATU(4,66 g, 12,3 mmol) foi adicionado. A mistura foi deixada aquecer até a temperatura ambiente e agitada por 2 horas. Depois de concluída a conversão, a mistura foi diluída com H2O (90 mL) e extraída com EA (2 x 200 mL) e DCM (2 x 90 mL). O
405 / 439 extrato orgânico combinado foi lavado com salmoura e seco com Na2SO4. A maior parte do solvente foi removida sob pressão reduzida, um sólido branco precipitou e foi coletado e seco para fornecer 4,4'-(((2R,3S)-2,3-bis (((benziloxi)carbonil)amino)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoato de di-terc- butila (2,8 g, 4,0 mmol) como um sólido branco com 80% de rendimento. Exemplo 308. Síntese de 4,4'-(((2R,3S)-2,3-diaminossuccinil)bis-(azanodi- il))dibutanoato de di-terc-butila
[00494] A uma solução de 4,4'-(((2R,3S)-2,3- bis(((benziloxi)carbonil)amino)succinil)bis-(azanodi-il))dibutanoato (2,8 g, 4,0 mmol) em MeOH (100 mL), adicionou-se Pd/C 10% (1,1 g) e a mistura foi agitada sob atmosfera de hidrogênio à temperatura ambiente durante a noite. Após 18 horas de agitação, o Pd/C foi removido por filtração e lavou-se com MeOH. O filtrado foi concentrado para fornecer o produto que foi usado na etapa seguinte sem purificação adiciona l(940 mg, 2,2 mmol). Líquido incolor, rendimento (55%). Exemplo 309. Síntese de 4,4'-(((2R,3S)-2,3-bis(4-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)butanamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoato de di-terc-butila
[00495] A uma solução de 4,4'-(((2R,3S)-2,3- diaminossuccinil)bis(azanodi-il))-dibutanoato de di-terc-butila (940 mg, 2,19 mmol) e ácido 4-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)butanoico (840 mg, 4,59 mmol) em DMF (25 mL), adicionou-se DIPEA (1,13 g, 8,76 mmol) a 0ºC. Após 5 minutos de agitação, HATU (1,74 g, 4,58 mmol) foi adicionado. A mistura foi deixada aquecer até a temperatura ambiente e agitada por 1
406 / 439 hora. Depois de concluída a conversão, a mistura foi diluída com H2O (50 mL) e extraída com EA (2 x 100 mL) e DCM (2 x 50 mL). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura e secos com Na2SO4. A maior parte do solvente foi removida sob pressão reduzida, um sólido branco precipitou e foi coletado e seco para fornecer 4,4'-(((2R,3S)-2,3-bis(4-(2,5- dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)butanamido)succinil)bis-(azanodi- il))dibutanoato de di-terc-butila (1,36 g, 1,79 mmol) como um sólido branco com 82% de rendimento. Exemplo 310. Síntese de ácido 4,4'-(((2R,3S)-2,3-bis(4-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)butanamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoico
[00496] A uma solução de 4,4'-(((2R,3S)-2,3-bis(4-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)butanamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoato de di- terc-butila (1,36 g, 1,79 mmol) em DCM (15 mL), adicionou-se TFA (30 mL) à temperatura ambiente 0ºC. Após 18 horas de agitação, a reação foi concentrada e o resíduo dissolvido em tolueno seco. O solvente foi removido por evaporação a vácuo, fornecendo precipitados brancos que foram usados na etapa seguinte sem purificação adicional (1,3 mg, 2,0 mmol). Rendimento (100%). Exemplo 311. Síntese do produto de PBD C-07
O H
H O N NH2 HN NH2 N
N O H O O O O O HO O O O OH HN N HO N OO N
N O O O H O O + N N NH N OMe MeO N H O OH
O O O
407 / 439
[00497] A uma solução de (11S,11aS,11'S,11a'S)-bis(4-((S)-2-((S)-2- (((aliloxi)carbonil)amino)-3-metilbutanamido)propanamido)benzil)8,8'- (pentano-1,5-di-ilbis(oxi))bis(11-hidroxi-7-metoxi-5-oxo-2,3,11,11a- tetrahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepina-10(5H)-carboxilato) (215 mg, 0,17 mmol) e ácido 4,4'-(((2R,3S)-2,3-bis(4-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)butanamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoico (115 mg, 0,18 mmol) em DMF (18 mL), adicionou-se DIPEA (90 mg, 0,70 mmol) a 0ºC. Após 5 minutos de agitação, HATU (132 mg, 0,35 mmol) foi adicionado. A mistura foi deixada aquecer até a temperatura ambiente e agitada durante a noite. Depois de concluída a conversão, a mistura foi diluída com H2O (2 mL) e extraída com EA (2 x 40 mL) e DCM (2 x 20 mL). O extrato orgânico combinado foi lavado com salmoura, seco, filtrado e concentrado. O resíduo foi purificado por HPLC preparativa para fornecer o produto de PBD C-07 (10 mg) como um pó branco. ESI MS m/z C91H115N16O26 [M+H]+, calculado 1847,81; encontrado 1847,60. Exemplo 312. Síntese de 4,4'-(((2R,3S)-2,3-bis(4-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)butanamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoato de di-terc-butila
[00498] A uma solução de 4,4'-(((2R,3S)-2,3-
408 / 439 diaminossuccinil)bis(azanodi-il))-dibutanoato de di-terc-butila (900 mg, 2,09 mmol) e ácido 3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)propanoico (840 mg, 4,97 mmol) em DMF (25 mL), adicionou-se DIPEA (0,93 g, 7,21 mmol) a 0ºC. Após 5 minutos de agitação, EDC (1,74 g, 9,06 mmol) foi adicionado. A mistura foi deixada aquecer até a temperatura ambiente e agitada por 1 hora. Depois de concluída a conversão, a mistura foi diluída com H2O (50 mL) e extraída com EA (2 x 100 mL) e DCM (2 x 50 mL). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura e secos com Na2SO4. A maior parte do solvente foi removida sob pressão reduzida, um sólido branco precipitou e foi coletado e seco para fornecer 4,4'-(((2R,3S)-2,3-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)succinil)bis-(azanodi-il))dibutanoato de di- terc-butila (1,27 g, 1,79 mmol) como um sólido branco com 83% de rendimento. ESI MS m/z+ C34H49N6O12, calculado 733,33 (M+ H); encontrado 733,55. Exemplo 313. Síntese de ácido 4,4'-(((2R,3S)-2,3-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoico
[00499] 4,4'-(((2R,3S)-2,3-bis(4-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)butanamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoato de di-terc-butila (502,0 mg, 0,685 mmol) em 1,4-dioxano (8 mL) a 4ºC foi adicionado a HCl concentrado (3 mL). A mistura foi então agitada à temperatura ambiente por 30 minutos, diluída com 1,4-dioxano (8 mL), concentrada, co-evaporada com dioxano/tolueno (1:1, 2x10 mL) até a secura e cristalizada com EtOH/Hexano para fornecer o composto do título (289,0 g, 68% de rendimento). ESI MS m/z+ C26H33N6O12, calculado 621,21 (M+ H); encontrado 621,55. Exemplo 314. Síntese de ((S)-3-metil-1-(((S)-1-((4-((((4-
409 / 439 nitrofenoxi)carbonil)-oxi)metil)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-1- oxobutan-2-il)carbamato de alila
[00500] ((S)-1-(((S)-1-((4-(hidroximetil)fenil)amino)-1-oxopropan-2- il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato de alila (2,21 g, 5,86 mmol) na mistura de piridina seca (5 mL) e CH2Cl2 (20 mL) foi adicionado a carbonocloridrato de 4-nitrofenila (1,82 g, 9,05 mmol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 8 horas, concentrada e purificada em coluna de SiO2 eluída com EtOAc/CH2Cl2 (1:12) para fornecer o composto do título (2,63 g, 83% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C26H31N4O9 [M+H]+ 543,21; encontrado 543,60 Exemplo 315. Síntese de (11aS,11a'S)-bis(4-((S)-2-((S)-2- (((aliloxi)carbonil)amino)-3-metilbutanamido)propanamido)benzil)8,8'- (pentano-1,5-di-ilbis(oxi))bis(7-metoxi-2-metileno-5-oxo-2,3,11,11a- tetrahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepina-10(5H)-carboxilato).
[00501] (11aS,11a'S)-8,8'-(pentano-1,5-di-ilbis(oxi))bis(7-metoxi-2- metileno-2,3,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepin- 5(10H)-ona) (288,2 mg, 0,490 mmol) em CH3CN seco (5 mL) foi adicionado
410 / 439 a ((S)-3-metil-1-(((S)-1-((4-((((4-nitrofenoxi)carbonil)oxi)- metil)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-1-oxobutan-2-il)carbamato de alila (770,2 mg, 1,420 mmol) e DIPEA (2 mL). A mistura foi agitada a 45ºC por 8 horas, concentrada e purificada em coluna de SiO2 eluída com EtOAc/CH2Cl2 (1:8) para fornecer o composto do título (492,0 mg, 72% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C73H91N10O18 [M+H]+ 1395,64; encontrado 1395,95. Exemplo 316. Síntese de (11aS,11a'S)-bis(4-((S)-2-((S)-2-amino-3- metilbutanamido)-propanamido)benzil)8,8'-(pentano-1,5-di-ilbis(oxi))bis(7- metoxi-2-metileno-5-oxo-2,3,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2- a][1,4]diazepina-10(5H)-carboxilato).
[00502] A uma solução de (11aS,11a'S)-bis(4-((S)-2-((S)-2- (((aliloxi)carbonil)amino)-3-metilbutanamido)propanamido)benzil)8,8'- (pentano-1,5-di-ilbis(oxi))bis(7-metoxi-2-metileno-5-oxo-2,3,11,11a- tetrahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepina-10(5H)-carboxilato) (274,2 mg, 0,197 mmol) e pirrolidina (49 mg, 6,90 mmol) em DCM seco (5 mL), adicionou-se Pd(pph3)4 (152,0 mg, 0,132 mmol). A reação foi submetida a jatos de argônio e agitada por 2 horas à temperatura ambiente, depois das quais, a reação foi diluída com DCM e lavada sequencialmente com NH4Cl aquoso saturado e salmoura. A fase orgânica foi seca com Na2SO4, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia (DCM/MeOH/Et3N = 6/1/0,02) para fornecer o composto do título (166,7 mg, 69% de rendimento) como um sólido esbranquiçado. MS ESI m/z calculado para C65H83N10O14 [M+H]+ 1227,60; encontrado 1227,93.
411 / 439 Exemplo 317. Síntese do produto de PBD C-08
[00503] EDC (95,2 mg, 0,496 mmol) foi adicionado a (11aS,11a'S)- Bis(4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-propanamido)benzil) 8,8'- (pentano-1,5-di-ilbis(oxi))bis(7-metoxi-2-metileno-5-oxo-2,3,11,11a- tetrahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepina-10(5H)-carboxilato) (151,1 mg, 0,123 mmol) e ácido 4,4'-(((2R,3S)-2,3-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)propanamido)succinil)bis-(azanodi-il))dibutanoico (77,1 mg, 0,124 mmol) em DMA (5 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 8 horas, concentrada e purificada por HPLC em coluna C-18 de 3µm (25 x 4 cm) usando um gradiente de eluição com uma mistura de (A) acetonitrila e (B) água/ ácido fórmico 0,1% (gradiente: A 15%: B 85% até A 25%: B 75% durante 5 minutos, A 35%: B 65% por 15 minutos, A 60%: B 40% descendo até A 50%: B 50% B durante 15 minutos, A 15%: B 85% por 5 minutos) com uma vazão de 8 mL/minuto. As frações contendo o composto do título foram agrupadas, evaporadas e secas em um dessecador com P2O5 para fornecer o composto C-8 de PBD (149,2 mg, 67% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C91H111N16O24 [M+H]+ 1811,79; encontrado 1812,35. Exemplo 318. Síntese de (S)-(4-(benziloxi)-5-metoxi-2-nitrofenil)(2- (hidroxila-etil)pirrolidin-1-il)metanona
[00504] Ácido 4-(benziloxi)-5-metoxi-2-nitrobenzoico (10,20 g, 33,65 mmol) e (S)-pirrolidin-2-ilmetanol (3,85 g, 38,09 mmol) em DMF seco (150 mL) foi adicionado a EDC (19,50 g, 101,56 mmol). A mistura foi agitada à
412 / 439 temperatura ambiente durante a noite, concentrada e purificada em coluna de SiO2 eluída com EtOAc/CH2Cl2 (1:4) para fornecer o composto do título (11,56 g, 89% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C20H23N2O6 [M+H]+ 387,15; encontrado 387,65. Exemplo 319. Síntese de (S)-1-(4-(benziloxi)-5-metoxi-2- nitrobenzoil)pirrolidina-2-carbaldeído Oxidante de Dress-Martin
[00505] A uma solução de (S)-(4-(benziloxi)-5-metoxi-2-nitrofenil)(2- (hidroximetil)-pirrolidin-1-il)metanona (3,80 g, 9,84 mmol) em DCM seco (15 mL), adicionou-se periodinano de Dess-Martin (DMP) (5,80 g, 13,67 mmol) sob nitrogênio à temperatura ambiente. Depois de concluída a conversão, a solução de reação foi adicionada a Na2SO3 aquoso, seguido por NaHCO3 aquoso e a mistura agitada por mais 15 minutos e extraída com DCM (3 x 20 mL). O extrato orgânico combinado foi lavado com salmoura, seco, filtrado e concentrado. O resíduo foi purificado por cromatografia em SiO2 (DCM/EtOAc = 4/1) para fornecer o composto do título (3,13 g, 83% de rendimento) como uma espuma esbranquiçada. MS ESI m/z calculado para C20H21N2O6 [M+H]+ 385,13; encontrado 385,60, 404,75 [M+H2O+H]+. Exemplo 320. Síntese de 8-hidroxi-7-metoxi-2,3,11,11a-tetrahidro-1H- benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepin-5(10H)-ona
[00506] A uma solução de S)-1-(4-(benziloxi)-5-metoxi-2- nitrobenzoil)pirrolidina-2-carbaldeído (3,00 g, 7,80 mmol) em metanol (75 mL), adicionou-se Pd/C (Pd 10%, 50% úmido, 250 mg) em um agitador de hidrogenação. Depois do ar ser retirado do agitador sob vácuo, introduziu-se hidrogênio (5 Psi). O vaso de reação foi agitado durante a noite e filtrado
413 / 439 através de Celite. O filtrado foi concentrado e purificado por cromatografia em SiO2 (DCM/MeOH/Et3N = 4/1/0,05) para fornecer o composto do título (1,66 g, 86% de rendimento) como uma espuma esbranquiçada. MS ESI m/z calculado para C13H17N2O3 [M+H]+ 249,12; encontrado 249,50. Exemplo 321. Síntese de 8-hidroxi-7-metoxi-5-oxo-2,3,11,11a-tetrahidro-1H- benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepina-10(5H)-carboxilato de 4-((14S,17S)-1- azido-17-(2-(terc-butoxi)-2-oxoetil)-14-(4-((terc-butoxicarbonil)amino)butil)- 12,15-dioxo-3,6,9-trioxa-13,16-diazaoctadecanamido)benzila
[00507] A uma solução de 1-azido-14-(4-((terc- butoxicarbonil)amino)butil)-17-((4-(hidroximetil)fenil)carbamoil)-12,15- dioxo-3,6,9-trioxa-13,16-diazanonadecan-19-oato de (14S,17S)-terc-butila (10,15 g, 13,50 mmol) em THF seco (300 mL), adicionou-se DIPEA (3,15 g, 24,41 mmol) e uma solução de trisfosgênio (5,15 g, 17,36 mmol) em THF seco (50 mL) a 4-8ºC. Após 15 minutos de agitação, a solução foi resfriada até 4-8ºC e então adicionada gota a gota a uma solução de 8-hidroxi-7- metoxi-2,3,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepin-5(10H)- ona (2,92 g, 11,76 mmol ) em mistura de THF (100 mL) a 4-8ºC em 45 minutos. A solução resultante foi deixada aquecer até a temperatura ambiente e agitada durante a noite. A mistura foi diluída com tolueno (50 mL), evaporada a vácuo e purificada por cromatografia em SiO2 (DCM/MeOH = 15/1) para fornecer o composto do título (10,02 g, 82% de rendimento) como uma espuma amarela. MS ESI m/z calculado para C50H74N9O15 [M+H]+ 1040,52; encontrado 1040,90. Exemplo 322. Síntese de 8-(3-iodopropoxi)-7-metoxi-5-oxo-2,3,11,11a- tetrahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepina-10(5H)-carboxilato de (S)-
414 / 439 4-((14S,17S)-1-azido-17-(2-(terc-butoxi)-2-oxoetil)-14-(4-((terc- butoxicarbonil)amino)butil)-12,15-dioxo-3,6,9-trioxa-13,16- diazaoctadecanamido)benzila
[00508] A uma solução de 8-hidroxi-7-metoxi-5-oxo-2,3,11,11a- tetrahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepina-10(5H)-carboxilato de 4- ((14S,17S)-1-azido-17-(2-(terc-butoxi)-2-oxoetil)-14-(4-((terc- butoxicarbonil)amino)butil)-12,15-dioxo-3,6,9-trioxa-13,16- diazaoctadecanamido)benzila (2,02 g, 1,94 mmol) em butanona (50 mL), adicionou-se Cs2CO3 (2,50 g, 7,67 mmol) e 1,3-diiodopropano (2,50 g, 8,45 mmol). A mistura foi agitada a 45ºC no escuro por 36 horas, concentrada e purificada em coluna de SiO2 eluída com EtOAc/CH2Cl2 (1:5) para fornecer o composto do título (2,08 g, 90% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C52H77IN9O15 [M+H]+ 1194,45; encontrado 1194,95. Exemplo 323. Síntese de (S)-2-((S)-1-azido-14-metil-12-oxo-3,6,9-trioxa-13- azapentadecanamido)-N-(4-(hidroximetil)fenil)propanamida
[00509] A uma solução de ácido (14S,17S)-1-azido-14,17-dimetil- 12,15-dioxo-3,6,9-trioxa-13,16-diazaoctadecan-18-oico (3,02 g, 7,75 mmol) e (4-aminofenil)metanol (1,05 g, 8,53 mmol) em DMA, adicionou-se EDC (4,90 g, 25,52 mmol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 14 horas, concentrada e purificada em coluna de SiO2 eluída com EtOAc/CH2Cl2 (1:8 para 1:3) para fornecer o composto do título (3,52 g, 92% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C22H35IN6O7 [M+H]+ 495,25; encontrado 495,60. Exemplo 324. Síntese de 8-(benziloxi)-11-hidroxi-7-metoxi-2-metileno-5-
415 / 439 oxo-2,3,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepina-10(5H)- carboxilato de (11R,11aS)-4-((14S,17S)-1-azido-14,17-dimetil-12,15-dioxo- 3,6,9-trioxa-13,16-diazaoctadecanamido)benzila Trifosgênio
[00510] A mistura de (S)-(4-(benziloxi)-5-metoxi-2-nitrofenil)(2- (hidroximetil)-4-metileno-pirrolidin-1-il)metanona (3,90 g, 9,80 mmol) e Na2S2O4 (6,0 g, 34,47 mmol) em THF (60 mL) e H2O (40 mL) foi agitada à temperatura ambiente por 20 horas, teve o pH ajustado para 10 com Na2CO3, concentrado e foi purificada em coluna C-18 curta eluída com H2O/MeOH/Et3N (de 99,4/0,5/0,2 para 50/49,8/0,2). As frações contendo o produto amino reduzido foram agrupadas, concentradas, diluídas com THF (50 mL), então resfriada até 4-8ºC. Separadamente, a uma solução de 2-(1- azido-14-metil-12-oxo-3,6,9-trioxa-13-azapentadecanamido)-N-(4-(hidroxi- metil)fenil)-propanamida (6,70 g, 13.56 mmol) em THF seco (150 mL), adicionou-se DIPEA (3,50 g, 27,12 mmol) e uma solução de trisfosgênio (4,10 g, 13,80 mmol) em THF seco (20 mL) a 4-8ºC. Após 15 minutos de agitação a 4-8ºC, a solução foi adicionada gota a gota à solução de amino acima a 4-8ºC por 45 minutos. A mistura foi aquecida até a temperatura ambiente e continuou sendo agitada por 2 horas, foi concentrada, extraída com CH2Cl2 (3 x 30 mL), seca com Na2SO4, evaporada e purificada em coluna de SiO2 eluída com EtOAc/CH2Cl2 (1:10 to 1:5) para fornecer o composto do título (7,23 g, 83% de rendimento em duas etapas). MS ESI m/z calculado para C45H57IN8O12 [M+H]+ 889,40; encontrado 889,90. Exemplo 325. Síntese de 8-(benziloxi)-11-hidroxi-7-metoxi-2-metileno-5- oxo-2,3,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepina-10(5H)-
416 / 439 carboxilato de (11S,11aS)-4-((14S,17S)-1-azido-14,17-dimetil-12,15-dioxo- 3,6,9-trioxa-13,16-diazaoctadecanamido)benzila
[00511] A uma solução de 8-(benziloxi)-11-hidroxi-7-metoxi-2- metileno-5-oxo-2,3,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepina- 10(5H)-carboxilato de (11R,11aS)-4-((14S,17S)-1-azido-14,17-dimetil-12,15- dioxo-3,6,9-trioxa-13,16-diazaoctadecanamido)benzila (3,80 g, 4,27 mmol) em DCM seco (40 mL), adicionou-se periodinano de Dess-Martin (DMP) (2,80 g, 6,60 mmol) sob nitrogênio à temperatura ambiente. Depois de concluída a conversão, a solução de reação foi adicionada a Na2SO3 aquoso, seguido por NaHCO3 aquoso, a mistura foi agitada por mais 15 minutos e extraída com DCM (3 x 20 mL). O extrato orgânico combinado foi lavado com salmoura, seco, filtrado e concentrado. O resíduo foi purificado por cromatografia em SiO2 (DCM/EtOAc = 5/1 to 2:1) para fornecer o composto do título (2,99 g, 79% de rendimento) como uma espuma esbranquiçada. MS ESI m/z calculado para C44H55N8O12 [M+H]+ 886,39; encontrado 886.80. Exemplo 326. Síntese de 8,11-dihidroxi-7-metoxi-2-metileno-5-oxo- 2,3,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepina-10(5H)- carboxilato de (11S,11aS)-4-((14S,17S)-1-azido-14,17-dimetil-12,15-dioxo- 3,6,9-trioxa-13,16-diazaoctadecanamido)benzila
[00512] A uma solução de 8-(benziloxi)-11-hidroxi-7-metoxi-2- metileno-5-oxo-2,3,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepina- 10(5H)-carboxilato de (11S,11aS)-4-((14S,17S)-1-azido-14,17-dimetil-12,15-
417 / 439 dioxo-3,6,9-trioxa-13,16-diazaoctadecanamido)benzila (2,90 g, 3,27 mmol) em 40 mL de CH2Cl2, adicionou-se 15 mL de CH3SO3H a 0ºC. A mistura foi agitada a 0ºC por 10 minutos, depois à temperatura ambiente por 1 hora, diluída com CH2Cl2, teve o pH ajustado para 4 com NaHCO3 1,0N e foi filtrada. A camada aquosa foi extraída com CH2Cl2 (3 × 60 mL). As camadas orgânicas foram combinadas, secas com Na2SO4, filtradas, evaporadas e purificadas por cromatografia em coluna de SiO2 (CH3OH/CH2Cl2 1:15 to 1:5 ) para fornecer 1,95 g (75% de rendimento) do produto do título. MS ESI m/z calculado para C37H48IN8O12 [M+H]+ 797,34; encontrado 797,90. Exemplo 327. Síntese de 8-(3-(((S)-10-(((4-((14S,17S)-1-azido-17-(2-(terc- butoxi)-2-oxoetil)-14-(4-((terc-butoxicarbonil)amino)butil)-12,15-dioxo- 3,6,9-trioxa-13,16-diazaoctadecanamido)benzil)oxi)carbonil)-7-metoxi-5- oxo-2,3,5,10,11,11a-hexahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepin-8- il)oxi)propoxi)-11-hidroxi-7-metoxi-2-metileno-5-oxo-2,3,11,11a-tetrahidro- 1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepina-10(5H)-carboxilato de (11S,11aS)-4- ((14S,17S)-1-azido-14,17-dimetil-12,15-dioxo-3,6,9-trioxa-13,16- diazaoctadecanamido)benzila
[00513] A uma solução de 8,11-dihidroxi-7-metoxi-2-metileno-5-oxo- 2,3,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepina-10(5H)- carboxilato de (11S,11aS)-4-((14S,17S)-1-azido-14,17-dimetil-12,15-dioxo- 3,6,9-trioxa-13,16-diazaoctadecanamido)benzila (402 mg, 0,504 mmol) e 8- (3-iodopropoxi)-7-metoxi-5-oxo-2,3,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2- a][1,4]diazepina-10(5H)-carboxilato de (S)-4-((14S,17S)-1-azido-17-(2-(terc- butoxi)-2-oxoetil)-14-(4-((terc-butoxicarbonil)amino)-butil)-12,15-dioxo-
418 / 439 3,6,9-trioxa-13,16-diazaoctadecanamido)benzila (650 mg, 0,544 mmol) em butanona (50 mL), adicionou-se Cs2CO3 (0,50 g, 1,53 mmol). A mistura foi agitada a 45ºC no escuro por 36 horas, concentrada e purificada em coluna de SiO2 eluída com EtOAc/CH2Cl2 (1:8 to 1:3) para fornecer o composto do título (809 mg, 86% de rendimento). MS ESI m/z calculado para C89H124N17O27 [M+H]+ 1862,89; encontrado 1863,45. Exemplo 328. Síntese de 8-(3-(((S)-10-(((4-((14S,17S)-1-amino-17-(2-(terc- butoxi)-2-oxoetil)-14-(4-((terc-butoxicarbonil)amino)butil)-12,15-dioxo- 3,6,9-trioxa-13,16-diazaoctadecanamido)benzil)oxi)carbonil)-7-metoxi-5- oxo-2,3,5,10,11,11a-hexahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepin-8- il)oxi)propoxi)-11-hidroxi-7-metoxi-2-metileno-5-oxo-2,3,11,11a-tetrahidro- 1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepina-10(5H)-carboxilato de (11S,11aS)-4- ((14S,17S)-1-amino-14,17-dimetil-12,15-dioxo-3,6,9-trioxa-13,16- diazaoctadecanamido)benzila
[00514] A 8-(3-(((S)-10-(((4-((14S,17S)-1-azido-17-(2-(terc-butoxi)-2- oxoetil)-14-(4-((terc-butoxicarbonil)amino)butil)-12,15-dioxo-3,6,9-trioxa- 13,16-diazaoctadecanamido)-benzil)oxi)carbonil)-7-metoxi-5-oxo- 2,3,5,10,11,11a-hexahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepin-8- il)oxi)propoxi)-11-hidroxi-7-metoxi-2-metileno-5-oxo-2,3,11,11a-tetrahidro- 1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepina-10(5H)-carboxilato de (11S,11aS)-4- ((14S,17S)-1-Azido-14,17-dimetil-12,15-dioxo-3,6,9-trioxa-13,16- diazaoctadecanamido)benzila (750 mg, 0,402 mmol) em THF (8 mL), adicionou-se Me3P (1,0 M em tolueno, 2,0 mL, 2,0 mmol) a 0-4ºC sob N2. Após agitação por 5 minutos, o banho de gelo foi removido e a mistura de
419 / 439 reação foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas. Em seguida, adicionou-se água (1 mL) e a mistura foi agitada por 10 minutos. A mistura foi diluída com 1,4-dioxano (10 mL), concentrada e co-evaporada com dioxano/tolueno até a secura para obter o produto de amino bruto (725 mg, ~99% de rendimento) que foi usado diretamente na etapa seguinte sem purificação adicional. MS ESI m/z calculado para C89H128N13O27 [M+H]+ 1810,90; encontrado 1811,50. Exemplo 329. Síntese de um dímero de PBD reticulado assimetricamente, C- 09
[00515] Ao composto de amina bruto acima, 8-(3-(((S)-10-(((4- ((14S,17S)-1-amino-17-(2-(terc-butoxi)-2-oxoetil)-14-(4-((terc- butoxicarbonil)amino)butil)-12,15-dioxo-3,6,9-trioxa-13,16- diazaoctadecanamido)benzil)oxi)carbonil)-7-metoxi-5-oxo-2,3,5,10,11,11a- hexahidro-1H-benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)oxi)propoxi)-11- hidroxi-7-metoxi-2-metileno-5-oxo-2,3,11,11a-tetrahidro-1H- benzo[e]pirrol[1,2-a][1,4]diazepina-10(5H)-carboxilato de ((11S,11aS)-4- ((14S,17S)-1-amino-14,17-dimetil-12,15-dioxo-3,6,9-trioxa-13,16- diazaoctadecanamido)benzila), em DMA seco (8 mL), adicionou-se ácido 4,4'-(((2R,3S)-2,3-bis(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)propanamido)succinil)bis(azanodi-il))dibutanoico (248,0 mg, 0,400 mmol) e EDC (500,0 Mg, 2,60 mmol). A mistura foi agitada por 24 horas, concentrada e purificada por HPLC preparativa C18 (17% C18, 250 mm x 50
420 / 439 mm), eluindo com água/CH3CN (de água 80% para água 30% em 40 minutos, 9 mL/min.) para fornecer 488,1 mg (51% de rendimento) do produto C-9 após secagem sob alto vácuo. ESI MS m/z C115H156N19O37 [M+H]+, calculado2395,08; encontrado 2395,90. Exemplo 330. Síntese de um dímero de PBD reticulado assimetricamente, C-
10.
[00516] O composto C-09 (465,0 mg, 0,194 mmol) foi dissolvido em DCM (4 mL), seguido pela adição de TFA (2 mL) a 0-4ºC. A mistura de reação foi então agitada à temperatura ambiente por 1 hora, diluída com tolueno (5 mL), concentrada e co-evaporada com DCM/tolueno até a secura para fornecer o produto bruto C-3 (48,0 mg, 100% de rendimento, 92% puro por HPLC) que foi purificado mais por HPLC de fase reversa (250 (L) mm x 20(d) mm, coluna C18, acetonitrila/água 5-60% em 40 minutos, v =8 mL/min.) para fornecer o produto puro C-10 (373,1 mg, 85% de rendimento, 96% puro ) como uma espuma. ESI MS m/z: calculado para C106H140N19O35 [M+H]+ 2238,97; encontrado 2239,50. Exemplo 331. Síntese de um dímero de PBD reticulado assimetricamente, C- 11
421 / 439
[00517] O composto C-10 (235,0 mg, 0,105 mmol) foi dissolvido em uma solução misturada de THF (3 mL) e NaH2PO4 0,1 M (3 mL), pH 7,5, seguido pela adição de 2,5,8,11,14,17,20,23-octaoxahexacosan-26-oato de N- succinimidila (43,0 mg, 0,084 mmol) em 4 porções in 2 horas. A mistura de reação continuou sendo agitada à temperatura ambiente por 4 horas, e foi co- evaporada com DMF (10 mL) até a secura para fornecer o produto bruto C-11 que foi purificado mais por HPLC de fase reversa (250 (L) mm x 50(d) mm, coluna C18, acetonitrila/água 20-60% em 40 minutos, v =8 mL/min.) para fornecer o produto puro C-11 (215,5 mg, 78% de rendimento, 95% puro ) como uma espuma. ESI MS m/z: calculado para C124H174N19O44 [M+H]+ 2633,20; encontrado 2633,85. Exemplo 332. Síntese de um dímero de PBD reticulado assimetricamente, C- 12
[00518] A uma solução do composto C-11 (65,0 mg, 0,0246 mmol) e 2,5,8,11,14,17,20,23-octaoxapentacosan-25-amina (15,1 mg, 0.0394 mmol) em DMA seco (2 mL), adicionou-se EDC (30,0 mg, 0,156 mmol). A mistura
422 / 439 de reação foi agitada à temperatura ambiente por 15 horas, concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (250 (L) mm x 30 (d) mm, coluna C18, acetonitrila/água 20-60% em 40 minutos, v =8 mL/min.) para fornecer o produto puro C-12 (60,2 mg, 81% de rendimento, 95% puro por HPLC) como uma espuma. ESI MS m/z: calculado para C141H209N20O51 [M+H]+ 2998,43; encontrado 2999,40. Exemplo 333. Síntese de nitro-α-amanitina
[00519] A uma solução de α-amanitina (15,0 mg, 0,0163 mmol, PCT/IB2016/052246) em ácido acético (0,5 mL) e CH2Cl2 (1 mL), adicionou- se HNO3 70% (0,3 mL) a 0ºC. A reação foi agitada a 0ºC por 1 hora, então à temperatura ambiente 2 horas. Depois que água (5 mL) e DMA (4 mL) foram [sic], a mistura de reação foi concentrada e purificada por HPLC preparativa (H2O/MeCN) para fornecer um sólido amarelo claro (9,8 mg, 62% de rendimento). ESI MS m/z: calculado para C39H54N11O16S [M+H]+ 963,34; encontrado 964,95. Exemplo 334. Síntese de nitro-β-amanitina
[00520] A uma solução de β-amanitina (15,0 mg, 0,0163 mmol,
423 / 439 PCT/IB2016/052246) em ácido acético (0,5 mL) e CH2Cl2 (1 mL), adicionou- se HNO3 70% (0,3 mL) a 0ºC. A reação foi agitada a 0ºC por 1 hora, então à temperatura ambiente 2 horas. Depois de água (5 mL) e DMA (4 mL) serem adicionados, a mistura de reação foi concentrada e purificada por HPLC preparativa (H2O/MeCN) para fornecer um sólido amarelo claro (9,8 mg, 62% de rendimento). ESI MS m/z: calculado para C39H53N10O17S [M+H]+ 965,32; encontrado 965,86. Exemplo 335. Síntese de análogos de α-amanitina conjugáveis, D-01 e D-02.
[00521] A uma solução de nitro-α-amanitina (9,0 mg, 0,0093 mmol) em DMA (1 mL)), foi adicionado Pd/C (3 mg, 50% úmido), então hidrogenado (1 atm.) à temperatura ambiente por 6 horas. O catalisador foi removido por filtração, seguido pela adição de 0,5 mL de NaH2PO4 0,1M, pH 7,5 e 21,22-bis(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-2,5,38,41- tetrametil-4,7,20,23,36,39-hexaoxo-10,13,16,27,30,33-hexaoxa-
424 / 439 3,6,19,24,37,40-hexa-azadotetracontano-1,42-dioato de bis(2,5- dioxopirrolidin-1-ila) (11,0 Mg, 0,0092 mmol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, concentrada e purificada por HPLC preparativa C18 com eluição de água/CH3CN (de água 95% para água 25% em 45 minutos). As frações coletadas por HPLC que continham cada produto foram agrupadas, concentradas e secas sob alto vácuo para fornecer o produto D-01 (6,1 mg, 35% de rendimento), ESI MS m/z C81H114N19O32S [M+H]+, calculado 1896,75; encontrado 1897,20; e o produto D-02 (4,9 mg, 27% de rendimento), ESI MS m/z C81H116N19O33S [M+H]+, calculado 1914,76; encontrado 1914,40. Exemplo 336. Síntese de análogos de β-amanitina conjugáveis, D-03 e D-04
OH O O O H O OH N N NH H O H O
HN H H N N N HO N N O 3
O O H O O O H O
N O O S N OH H N N N O 3 N
H H O HN HO O O
N O H O HO N O O D-04
O H
[00522] A uma solução de nitro-β-amanitina (9,0 mg, 0,0093 mmol) em DMA (1 mL)), foi adicionado Pd/C (3 mg, 50% úmido), depois hidrogenado (1 atm.) à temperatura ambiente por 6 horas. O catalisador foi
425 / 439 removido por filtração, seguido pela adição de 0,5 mL de NaH2PO4 0,1 M, pH 7,5 e 21,22-bis(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-2,5,38,41- tetrametil-4,7,20,23,36,39-hexaoxo-10,13,16,27,30,33-hexaoxa- 3,6,19,24,37,40-hexa-azadotetracontano-1,42-dioato de bis(2,5- dioxopirrolidin-1-ila) (11,0 Mg, 0,0092 mmol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, concentrada e purificada por HPLC preparativa C18 com eluição de água/CH3CN (de água 95% para água 25% em 45 minutos). As frações coletadas por HPLC que continham cada produto foram agrupadas, concentradas e secas sob alto vácuo para fornecer o produto D-03 (7,0 mg, 40% de rendimento), ESI MS m/z C81H113N18O33S [M+H]+, calculado 1896,74; encontrado 1897,20; e o produto D-04 (4,7 mg, 25% de rendimento), ESI MS m/z C81H115N18O34S [M+H]+, calculado 1915,75; encontrado 1916,30. Exemplo 337. Síntese de um análogo de α-amanitina conjugável (D-05) com um bis-ligante
[00523] A uma solução de nitro-α-amanitina (9,0 mg, 0,0093 mmol) em DMA seco (1 mL) foi adicionado Pd/C (3 mg, 50% úmido), depois hidrogenado (1 atm.) à temperatura ambiente por 6 horas. O catalisador foi removido por filtração, lavado com DMA (1 mL) e então 21,22-bis(2,5-
426 / 439 dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-2,5,38,41-tetrametil-4,7,20,23,36,39- hexaoxo-10,13,16,27,30,33-hexaoxa-3,6,19,24,37,40-hexa-azadotetracontano- 1,42-dioato de bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) (40,0 mg, 0.033 mmol) e DIPEA (2 µl, 0,011 mmol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 4 horas, seguido pela adição de 26-amino-3,6,9,12,15,18,21,24-octaoxahexacosan-1-ol (30,0 mg, 0,072 mmol). A mistura continuou sendo agitada durante a noite, foi concentrada e purificada por HPLC preparativa C18, eluindo com água/CH3CN (de água 95% para água 30% em 45 minutos) para fornecer (14,5 mg 69% de rendimento) do produto do título D-05 após secagem sob alto vácuo. ESI MS m/z C99H153N20O41S [M+H]+, calculado 2310,01; encontrado 2310,90; e o produto secundário, 2,3-bis(2,5-dioxo-2,5-di-hidro- 1H-pirrol-1-il)-N1,N4-bis(1-hidroxi-29,32-dimetil-28,31,34-trioxo- 3,6,9,12,15,18,21,24,37,40,43-undecaoxa-27,30,33-triazapentatetracontan-45- il)succinamida (24,3 mg, 0,013 mmol), ESI MS m/z C78H136N10O36 [M+H]+, calculado 1789,91; encontrado 1790,20. Exemplo 338. Síntese de um análogo de β-amanitina conjugável (D-06) com um bis-ligante Pg-04,
[00524] A uma solução de nitro-β-amanitina (9,0 mg, 0,0093 mmol) em DMA seco (1 mL), foi adicionado Pd/C (3 mg, 50% úmido), depois
427 / 439 hidrogenado (1 atm.) à temperatura ambiente por 6 horas. O catalisador foi removido por filtração, lavado com DMA (1 mL) e, então, 21,22-bis(2,5- dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-2,5,38,41-tetrametil-4,7,20,23,36,39- hexaoxo-10,13,16,27,30,33-hexaoxa-3,6,19,24,37,40-hexa-azadotetracontano- 1,42-dioato de bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) (40,0 mg, 0.033 mmol) e DIPEA (2 µl, 0,011 mmol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 4 horas, seguido pela adição de 26-amino-3,6,9,12,15,18,21,24-octaoxahexacosan-1-ol (30,0 mg, 0,072 mmol). A mistura continuou sendo agitada durante a noite, foi concentrada e purificada por HPLC preparativa C18, eluída com água/CH3CN (de água 95% para água 30% em 45 minutos) para fornecer (14,9 mg 69% de rendimento) do produto do título D-06 após secagem sob alto vácuo. ESI MS m/z C99H152N19O42S [M+H]+, calculado 2311,00; encontrado 2311,90; e o produto secundário Pg-04, 2,3-bis(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)-N1,N4-bis(1-hidroxi-29,32-dimetil-28,31,34-trioxo- 3,6,9,12,15,18,21,24,37,40,43-undecaoxa-27,30,33-triazapentatetracontan-45- il)succinamida (24,8 mg, 0,013 mmol), ESI MS m/z C78H136N10O36 [M+H]+, calculado 1789,91; encontrado 1790,20. Exemplo 339. Método geral para preparação do conjugado
[00525] A uma mistura de 2,0 mL de um anticorpo her2 10 mg/mL em pH 6,0~8,0, foram adicionados 0,70 ~ 2,0 mL de tampão PBS com NaH2PO4 100 mM, tampões com pH 6,5~8,5, TCEP (16-20 µL, 20 mM em água) e o composto A-01, A-02, A-03, A-04, B-01, B-02, B-03, B-04, B-05, B-06, B-07, B-08, B-09, B-10, B-11, B-12, B-13, B-14, B-15, B-16, C-02, C-03, C-04, C- 05, C-06, C-07, C-08, C-09, C-10, C-11, C-12, D-01, D-02, D-03, D-04, D- 05 ou D-06 (28-32 µL, 20 mM em DMA,) independentemente. A mistura foi incubada à temperatura ambiente por 4~18 horas, então DHAA (135 µL, 50 mM) foi adicionado. Após incubação contínua à temperatura ambiente durante a noite, a mistura foi purificada em coluna G-25, eluindo com o tampão NaH2PO4 100 mM, NaCl 50 mM, pH 6,0~7,5 para fornecer 12,8~18,1
428 / 439 mg do composto conjugado Aa-01, Aa-02, Aa-03, Aa-04, Ba-01, Ba-02, Ba- 03, Ba-04, Ba-05, Ba-06, Ba-07, Ba-08, Ba-09, Ba-10, Ba-11, Ba-12, Ba-13, Ba-14, Ba-15, Ba-16, Ca-02, Ca-03, Ca-04, Ca-05, Ca-06, Ca-07, Ca-08, Ca-09, Ca-10, Ca-11, Ca-12, Da-01, Da-02, Da-03, Da-04, Da-05 ou Da-06 (75%~90% de rendimento) correspondente em 14,4~15,5 mL de tampão.
A razão fármaco/anticorpo (DAR) foi 3,1~4,2 para o conjugado, determinada por espectro de massa UPLC-QTOF.
Foi um monômero 94~99% analisado por SEC HPLC (Tosoh Bioscience, Tskgel G3000SW, 7,8 mm ID x 30 cm, 0,5 mL/minutos, 100 min.) e uma única banda medida pelo gel SDS-PAGE.
As estruturas dos conjugados são exibidas abaixo:
429 / 439
430 / 439
H O
OH O O O N H OAc N O O HN O 3 N 2 O 2 OH
O N H O O N N H O
N H H O O O N HN N N S mAb
S N H N O
H O H O O S HO2C O N HO N N n Ba-10 O H
O
431 / 439 O NH2
H O O
N O HN O 3 N
N N
O H H S NH2 O CO2H O mAb
H O HN N H O S O N O
O N N HO CO2H O 3
O H O H N O O O O N OH H
N OMe MeO N n O Ca-03
O
432 / 439
O O O O H O N O
S N N O H O N OH mAb O O H N N H O H
O N O O N
O H O S N NH N OMe MeO N O O Ca-06 O O n
433 / 439
O O H O O HN N H O HN N
N O S 8 O O O O O O mAb
NH H O HN O N N S N O O NH H
N O N O O O O 8 O H O
O O N N O H H O N OH N O
N O O OMe
H O N O MeO N H n
O O Ca-12
434 / 439
T-1a em que n = 2,0 ~ 4,5 Exemplo 340. Avaliação de citotoxicidade in vitro do conjugado Aa-01, Aa- 02, Aa-03, Aa-04, Ba-01, Ba-02, Ba-03, Ba-04, Ba-05, Ba-06, Ba-07, Ba-08,
435 / 439 Ba-09, Ba-10, Ba-11, Ba-12, Ba-13, Ba-14, Ba-15, Ba-16, Ca-02, Ca-03, Ca-04, Ca-05, Ca-06, Ca-07, Ca-08, Ca-09, Ca-10, Ca-11, Ca-12, Da-01, Da-02, Da-03, Da-04, Da-05 ou Da-06 em comparação com T-DM1:
[00526] A linhagem celular usada nos ensaios de citotoxicidade foi NCI-N87, uma linhagem celular de carcinoma gástrico humano. As células foram cultivadas em RPMI-1640 com FBS 10%. Para executar o ensaio, as células (180 µl, 6000 células) foram adicionadas a cada poço em uma placa de 96 poços e incubadas por 24 horas a 37ºC com CO2 5%. Em seguida, as células foram tratadas com os compostos em teste (20 µl) em várias concentrações no meio de cultura celular adequado (volume total, 0,2 mL). Os poços controle contêm células e o meio, mas não possuem os compostos em teste. As placas foram incubadas por 120 horas a 37ºC com CO2 5%. Adicionou-se então MTT (5 mg/mL) aos poços (20 µl) e as placas foram incubadas por 1,5h a 37ºC. O meio foi cuidadosamente removido e DMSO (180 µL) foi adicionado depois. Após agitação por 15 minutos, a absorbância foi medida a 490 nm e 570 nm com um filtro de referência de 620 nm. A% de inibição foi calculada de acordo com a seguinte equação:% de inibição = [1- (ensaio com branco)/(controle branco)] × 100. Os resultados de citotoxicidade de IC50 e IC90 DAR Célula N87 (Ag+) IC50 Célula N87 (Ag+) IC90 (razão de fármacos) (nM) (nM) Conjugado Aa-01 4,0 0,97 nM 1,45 nM Conjugado Aa-02 3,7 0,36 nM 0,91 nM Conjugado Aa-03 3,8 0,67 nM 1,17 nM Conjugado Aa-04 4,1 0,34 nM 0,71 nM Conjugado Ba-01 3,9 0,34 nM 0,68 nM Conjugado Ba-02 3,6 0,78 nM 1,45 nM Conjugado Ba-03 3,9 0,14 nM 0,28 nM Conjugado Ba-04 3,8 0,42 nM 1,10 nM Conjugado Ba-05 3,8 0,83 nM 1,46 nM Conjugado Ba-06 3,8 0,72 nM 1,82 nM Conjugado Ba-07 3,7 0,93 nM 1,93 nM Conjugado Ba-08 3,2 0,22 nM 0,72 nM Conjugado Ba-09 3,6 0,45 nM 0,78 nM Conjugado Ba-10 3,9 0,19 nM 0,69 nM Conjugado Ba-11 3,8 0,13 nM 0,76 nM Conjugado Ba-12 3,8 0,22 nM 0,78 nM Conjugado Ba-13 3,6 0,29 nM 0,93 nM Conjugado Ba-14 3,8 0,28 nM 0,81 nM Conjugado Ba-15 3,8 0,83 nM 1,26 nM
436 / 439 DAR Célula N87 (Ag+) IC50 Célula N87 (Ag+) IC90 (razão de fármacos) (nM) (nM) Conjugado Ba-16 3,8 0,22 nM 0,82 nM Conjugado Ca-02 3,7 0,93 nM 1,93 nM Conjugado Ca-03 4,1 0,017 nM 0.12 nM Conjugado Ca-04 3,8 0.039 nM 0,22 nM Conjugado Ca-05 4,0 0,10 nM 0,82 nM Conjugado Ca-06 3,8 1,13 nM 3,48 nM Conjugado Ca-07 3,8 0,021 nM 0.088 nM Conjugado Ca-08 3,8 61,36 nM 98,6 nM Conjugado Ca-09 2,1 0,51 nM 1,252 nM Conjugado Ca-10 3,9 0,13 nM 0,72 nM Conjugado Ca-11 3,8 0.43 nM 1,10 nM Conjugado Ca-12 3,6 0,71 nM 1,32 nM Conjugado Da-01 3,8 0.041 nM 0.087 nM Conjugado Da-02 3,8 0.038 nM 0.12 nM Conjugado Da-03 3,9 0.033 nM 0.072 nM Conjugado Da-04 3,8 0.047 nM 1,31 nM Conjugado Da-05 3,8 0,21 nM 0,82 nM Conjugado Da-06 3,9 0,34 nM 0,73 nM Conjugado T-1a 3,8 0,25 nM 0,51 nM T-DM1 3.5 0.12 nM 0,26 nM Exemplo 230. Atividade antitumoral in vivo (Camundongos BALB/c Nude portadores de tumor do xenoenxerto NCI-N87)
[00527] A eficácia in vivo dos conjugados A-3a, B-6a, B-12a, B-15a, B-18a, B-20a, B-21a, B-24a, B-28a, C-3a e D-2a juntamente com T-DM1 foi avaliada em um modelos de xenoenxerto de tumor da linhagem celular N-87 de carcinoma gástrico humano. Camundongos BALB/c Nude fêmeas de cinco semanas de idade (104 animais) foram inoculados por via subcutânea na área abaixo do ombro direito com células do carcinoma N-87 (5 × 106 células/camundongo) em 0,1 mL de meio sem soro. Os tumores foram cultivados por 8 dias até um tamanho médio de 110 mm3. Os animais foram então divididos aleatoriamente em 13 grupos (8 animais por grupo). O primeiro grupo de camundongos servir como o grupo controle e foi tratado com o veículo de solução salina com tampão fosfato (PBS). 10 grupos foram tratados com os conjugados A-3a, B-6a, B-12a, B-15a, B-18a, B-20a, B-21a, B-24a, B-28a e T-DM1, respectivamente, na dose de 3 mg/Kg administrada por via intravenosa. Os 2 grupos restantes foram tratados com o conjugado C- 3a e D-1a respectivamente na dose e 1 mg/Kg administrada por via intravenosa. Três dimensões do tumor foram medidas a cada 4 dias e os
437 / 439 volumes do tumor foram calculados usando a fórmula: volume tumoral = 1/2 (comprimento × largura × altura). O peso dos animais também foi medido ao mesmo tempo. Um camundongo era sacrificado quando qualquer um dos critérios seguintes fosse satisfeito: (1) perda de peso corporal superior a 20% em relação ao peso pré-tratamento, (2) volume tumoral maior que 2000 mm3, (3) muito doente para alcançar comida e água ou (4) necrose da pele. Um camundongo era considerado livre do tumor se nenhum tumor fosse palpável.
[00528] Os resultados foram representados no gráfico da Figura 47. Todos os 13 conjugados não causaram perda de peso corporal nos animais, e os animais no grupo controle foram sacrificados no dia 50 devido ao volume tumoral maior que 1800 mm3 e por estarem doentes demais. Aqui, todos os 12 conjugados testados demonstraram atividade antitumoral. Os animais nos grupos dos compostos conjugados B-24a, C-3a, B-20a, B-21a e D-20a demonstraram melhor atividade antitumoral que T-DM1. Mas, os animais nos grupos dos compostos conjugados B-18a, B-15a, A-3a, B-6a, B-28a e B-12a apresentaram pior atividade antitumoral que T-DM1. T-DM1 na dose de 3 mg/Kg inibiu o crescimento tumoral por 28 dias, mas não foi capaz de eliminar os tumores durante o teste. Em contraste, os compostos conjugados B-20a, B-21a, e D-20a erradicam alguns tumores do animal a partir do dia 15 até o dia 43. As inibições do crescimento tumoral nessas doses estão listadas abaixo: Conjugado Atraso no crescimento tumoral T-DM1 28 dias B-18a 3 dias B-15a 5 dias A-3a 7 dias B-6a 8 dias B-28a 10 dias B-12a 19 dias B-24a 33 dias C-3a 39 dias B-20a >45 dias B-21a >45 dias D-2a >45 dias
[00529] No final do experimento (dia 50), animais dos grupos PBS, A- 3a, B-21a, T-DM1 e B-15a foram sacrificados e os tumores foram retirados e
438 / 439 são mostrados na Figura 48. Exemplo 239. Estudo de estabilidade do conjugado com um bis-acoplamento em comparação com os conjugados regulares com um mono-acoplamento no soro de camundongo
[00530] Quarenta e cinco camundongos ICR fêmeas, com 6-7 semanas de idade, foram separadas em 3 grupos. Cada grupo incluiu 15 camundongos para o estudo PK de um em cada três ADCs. Esses 15 camundongos foram divididos aleatoriamente em três grupos (n=5). Cada camundongo recebeu conjugados T-DM1, B-21a e T-1a (Huang Y. et al, Med Chem. #44, 249th ACS National Meeting, Denver, CO, Mar. 22~26, 2015; WO2014009774), respectivamente, na dose de 10 mg/Kg/por rato, bolus i.v.. A coleta de sangue seguiu as Diretrizes para Coleta de Sangue de Roedores (Guidelines for Rodent Blood Collection) do NCI. Basicamente, os camundongos em cada grupo fez um revezamento para a sangria, a fim de evitar mais duas sangrias em um período de 24 horas. O sangue foi retirado do seio retro-orbital com um capilar de 70 μL no tempo 0 (pré-administração), 0,083; 0,25; 0,5; 1; 4; 8; 24; 48; 96; 168; 312 e 504 horas após a administração. As amostras de plasma foram analisadas com relação a anticorpos totais e anticorpos conjugados a fármacos por técnicas específicas de ELISA. Resumidamente, o anticorpo conjugado ou a concentração total de anticorpos no soro do camundongo foram medidos da seguinte forma: placas ELISA de 96 poços foram revestidas respectivamente durante a noite a 4ºC com anticorpo anti-DM1, anticorpo anti-tubulisina ou anticorpo Fab anti-Her-2 (1 μg/mL em PBS 10mM, pH7,2). As placas foram então lavadas três vezes com um tampão de lavagem PBS-T (PBS/Tween20 0,025) e depois bloqueadas com um tampão de diluição BSA/PBS-T a 1% (p/v) por 1 hora a 37ºC. Após a remoção do tampão de bloqueio, as amostras padrão ou de soro de camundongo, cada uma com três repetições, foram diluídas em tampão BSA 1%/PBS-T, incubadas a 37ºC por 1 hora, então o anticorpo anti-humano de burro conjugado com AP
439 / 439 foi adicionado para 30 minutos a 37ºC após a lavagem das placas. As placas foram lavadas novamente, seguidas pela adição de substrato de pNPP para o desenvolvimento da cor e depois lidas em um leitor de microplacas com comprimento de onda de 405 nm, assim que a reação de desenvolvimento de cor foi interrompida bruscamente com hidróxido de sódio 1 mol/L. A concentração do anticorpo conjugado ou do anticorpo total foi obtida a partir de ajuste de curva de quatro parâmetros da curva padrão.
[00531] O resultado, como mostrado na Figura 49, os comportamentos PK dos anticorpos totais e anticorpos conjugados ao fármaco após a administração de três ADCs apresentaram-se como curvas de depuração bifásica típicas. As equivalências entre o plasma e os tecidos periféricos foram alcançadas 8 horas após a administração. A fase de eliminação emergiu 24 horas após a dosagem e continuou até o último ponto de amostragem. Em suma, os valores de exposições do (Auclast) para esses três ADCs foram 14981, 14713 e 16981 h·μg/kg para T-DM1, T-1a e B-21a respectivamente. Os volumes de distribuição para todos esses três conjugados são o dobro dos volumes totais de sangue. As depurações (clearances, CL) dos conjugados são 0,59; 0,57 e 0,47 mL/h/kg, que são quase a metade das dos anticorpos totais. A depuração de B-21a, tanto o conjugado como o total de anticorpos, é menor que a dos outros dois ADCs, o que indica que o conjugado tendo o bis- acoplamento é mais estável do que os conjugados mono-acoplados regulares no soro de camundongo.

Claims (47)

1 / 161 REIVINDICAÇÕES
1. Composto conjugado, caracterizado pelo fato de que contém grupo 2,3-diaminossuccinila com a Fórmula (I), (II), (III) ou (IV): Fármaco1 (I), Fármaco1 Fármaco2 R5
O R1 Z1 Y1 N R3 X1 Fármaco1 Q Drug1 X2 Y2 R2 N R 4 Z2 O n (II), R 5' (III), Fármaco1 Fármaco 2 (IV), ou seus isômeros ópticos, racematos, diastereômeros ou enantiômeros; em que: “ “ representa uma ligação simples; “ “ é opcionalmente uma ligação simples ou está ausente; “ “ é opcionalmente uma ligação simples ou uma ligação dupla, ou pode opcionalmente estar ausente; n é 1 a 30 independentemente; Q é um agente/molécula de ligação celular que se acopla a R3 e
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R4 pode ser qualquer tipo presentemente conhecido, ou que se torna conhecido de uma molécula que se liga a, complexa com ou reage com uma porção de uma população de células que se pretende ser terapeuticamente ou de outro modo biologicamente modificada.
O agente/molécula de ligação celular é uma proteína imunoterapêutica, um anticorpo, um anticorpo de cadeia única; um fragmento de anticorpo que se liga à célula alvo; um anticorpo monoclonal; um anticorpo monoclonal de cadeia única; ou um fragmento de anticorpo monoclonal que se liga à célula alvo; um anticorpo quimérico; um fragmento de anticorpo quimérico que se liga à célula alvo; um anticorpo de domínio; um fragmento de anticorpo de domínio que se liga à célula alvo; adnectinas que imitam anticorpos; DARPins; uma linfocina; um hormônio; uma vitamina; um fator de crescimento; um fator estimulador de colônia; ou uma molécula de transporte de nutrientes (uma transferrina); peptídeos de ligação com mais de quatro aminoácidos, proteína ou anticorpo, ou uma pequena molécula ou ligando de ligação celular pequeno anexado à albumina, polímeros, dendrímeros, lipossomas, nanopartículas, vesículas ou capsídeos (virais); Fármaco1 e/ou Fármaco2 são uma molécula/agente citotóxico que é um fármaco/molécula/agente terapêutico ou uma proteína/molécula imunoterapêutica ou uma molécula cuja função é melhorar a ligação ou estabilizar o agente de ligação celular, ou um ligando de ligação ao receptor de superfície celular, ou inibir a proliferação celular, ou monitorar, detectar ou estudar uma ação de molécula de ligação celular.
Também pode ser um análogo, ou pró-fármaco, ou um sal, hidrato ou sal hidratado farmaceuticamente aceitável, ou uma estrutura cristalina, ou um isômero óptico, racemato, diastereômero ou enantiômero, de composto imunoterapêutico, composto quimioterápico, um anticorpo (probody) ou um fragmento de anticorpo (probody), ou molécula de siRNA ou DNA, ou um ligando de ligação à superfície celular;
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X1 e X2 são iguais ou diferentes, e selecionados independentemente dentre NH; NHNH; N(R1); N(R1)N(R2); O; S; S-S, O-NH.
O-N(R1), CH2-NH.
CH2-N(R1), CH=NH.
CH=N(R1), S(O), S(O2), P(O)(OH), S(O)NH, S(O2)NH, P(O)(OH)NH, NHS(O)NH, NHS(O2)NH, NHP(O)(OH)NH, N(R1)S(O)N(R2), N(R1)S(O2)N(R2), N(R1)P(O)(OH)N(R2), OS(O)NH, OS(O2)NH, OP(O)(OH)NH, C(O), C(NH), C(NR1), C(O)NH, C(NH)NH, C(NR1)NH, OC(O)NH, OC(NH)NH; OC(NR1)NH, NHC(O)NH; NHC(NH)NH; NHC(NR1)NH, C(O)NH, C(NH)NH, C(NR1)NH, OC(O)N(R1), OC(NH)N(R1), OC(NR1)N(R1), NHC(O)N(R1), NHC(NH)N(R1), NHC(NR1)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), N(R1)C(NH)N(R1), N(R1)C(NR1)N(R1); ou alquila C1-C6; alquenila C2-C8, heteroalquila, alquilcicloalquila ou heterocicloalquila; arila C3-C8, Ar-alquila, heterocíclico, carbocíclico, cicloalquila, heteroalquilcicloalquila, alquilcarbonila ou heteroarila; Y1, Y2, Z1 e Z2 são iguais ou diferentes e independentemente um grupo funcional que se acoplam a uma molécula de ligação celular Q, ou fármaco1 ou fármaco2, em forma de ligação de dissulfeto, éter, éster, tioéter, tioéster, peptídeo, hidrazona, carbamato, carbonato, amina (secundária, terciária ou quaternária), imina, cicloheteroalcano, heteroaromática, alquiloxima ou amida; Y1, Y2, Z1 e Z2 têm independentemente as seguintes estruturas: C(O)CH, C(O)C, C(O)CH2, ArCH2, C(O), NH, NHNH, N(R1), N(R1)N(R2), O, S, S-S, O-NH, O-N(R1), CH2-NH.
CH2-N(R1), CH=NH.
CH=N(R1), S(O), S(O2), P(O)(OH), S(O)NH, S(O2)NH, P(O)(OH)NH, NHS(O)NH, NHS(O2)NH, NHP(O)(OH)NH, N(R1)S(O)N(R2), N(R1)S(O2)N(R2), N(R1)P(O)(OH)N(R2), OS(O)NH, OS(O2)NH, OP(O)(OH)NH, C(O), C(NH), C(NR1), C(O)NH, C(NH)NH, C(NR1)NH, OC(O)NH, OC(NH)NH; OC(NR1)NH, NHC(O)NH; NHC(NH)NH; NHC(NR1)NH, C(O)NH, C(NR1)NH, OC(O)N(R1), OC(NH)N(R1), OC(NR1)N(R1), NHC(O)N(R1), NHC(NH)N(R1), NHC(NR1)N(R1),
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N(R1)C(O)N(R1), N(R1)C(NH)N(R1), N(R1)C(NR1)N(R1); ou alquila C1-C8, heteroalquila C2-C8, alquilcicloalquila, heterocicloalquila; arila C3-C8, Ar- alquila, heterocíclico, carbocíclico, cicloalquila, heteroalquilcicloalquila, alquilcarbonila, heteroarila; R1, R2, R3 e R4 são iguais ou diferentes e selecionados independentemente dentre O, NH, S, NHNH, N(R5), N(R3)N(R3’), unidade de polietilenoxi de fórmula (OCH2CH2)pOR5, ou (OCH2CH-(CH3))pOR5, NH(CH2CH2O)pR5, NH(CH2CH(CH3)O)pR5, N[(CH2CH2O)pR5]- [(CH2CH2O)p’R5’], (OCH2CH2)pCOOR5 ou CH2CH2(OCH2CH2)pCOOR5, em que p e p’ são independentemente um número inteiro selecionado dentre 0 a cerca de 1000, ou uma combinação dos mesmos; alquila C1-C8; heteroalquila C2-C8, alquilcicloalquila, heterocicloalquila, ésteres, éter ou amida; arila C3- C8 , Ar-alquila, heterocíclico, carbocíclico, cicloalquila, heteroalquilcicloalquila, alquilcarbonila ou heteroarila; ou 1~24 aminoácidos; em que R5 e R5’ são independentemente H; alquila C1-C8; heteroalquila C2-C8, alquilcicloalquila ou heterocicloalquila; arila C3-C8, Ar-alquila, heterocíclico; átomos de carbono C2-C8 de ésteres, éter ou amida; ou 1~24 aminoácidos; ou R1, R2, R3 e R4 podem opcionalmente ser compostos por um ou mais componentes ligantes de 6-maleimidocaproil (“MC”), maleimidopropanoil (“MP”), vanila-citrulina (“val-cit” ou “vc”), alanina- fenilalanina (“ala-phe” ou “af”), p-aminobenziloxicarbonil (“PAB”), 4- tiopentanoato (“SPP”), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (“MCC”), (4-acetil)amino-benzoato (“SIAB”), 4-tio-butirato (SPDB), 4-tio-2- hidroxissulfonil-butirato (2-Sulfo-SPDB) ou peptídeos naturais ou não naturais com 1~8 aminoácidos naturais ou não naturais.
O aminoácido natural é preferivelmente selecionado dentre ácido aspártico, ácido glutâmico, arginina, histidina, lisina, serina, treonina, asparagina, glutamina, cisteína, selenocisteína, tirosina, fenilalanina, glicina, prolina, triptofano e alanina; ou R1, R2, R3 e R4 podem conter independentemente uma ou
5 / 161 mais das seguintes estruturas hidrofílicas: , , , , , , ,
O O X7 P X3 P X4 X5 X6 , , , , , , , , , , , , , , ,
N H
H N
N , H HN , ,
O
O O
O , ， , , , , ,em que é o sítio de acoplamento; X3, X4, X5, X6, e X7 são selecionados independentemente dentre NH; NHNH; N(R5); N(R5)N(R5’); O; S; alquila C1-C6; heteroalquila C2-C6, alquilcicloalquila ou heterocicloalquila; arila C3-C8, Ar-alquila,
6 / 161 heterocíclico, carbocíclico, cicloalquila, heteroalquilcicloalquila, alquilcarbonila, heteroarila; ou 1~8 aminoácidos; em que R5 e R5’ são independentemente H; alquila C1-C8; heteroalquila C2-C8, alquilcicloalquila ou heterocicloalquila; arila C3-C8, Ar-alquila, heterocíclico, carbocíclico, heteroalquilcicloalquila, alquilcarbonila, ou heteroarila; ésteres C1-C8, éter ou amida; ou polietilenoxi com a fórmula (OCH2CH2)p ou (OCH2CH(CH3))p, em que p é um número inteiro de 0 a cerca de 5000, ou uma combinação dos mesmos acima; ou R1, R2, R3, R4, Y1, Y2, Z1 e Z2 podem conter independentemente um componente autoimolativo ou não autoimolativo, unidades peptídicas, uma ligação hidrazona, um dissulfeto, um éster, uma oxima, uma amida ou uma ligação tio éter. A unidade autoimolativa inclui, mas não se limita a, compostos aromáticos eletronicamente semelhantes aos grupos para-aminobenzilcarbamoil (PAB) como derivados de 2- aminoimidazol-5-methanol, análogos heterocíclicos de PAB, beta- glucuronídeo e orto ou para-aminobenzilacetais; o componente ligante autoimolativo pode ter uma das seguintes estruturas: ;
O S* ;. X1 Y 1* ; ou em que o átomo (*) é o ponto de anexação de unidades adicionais do espaçador ou ligante que podem ser liberadas ou do agente citotóxico e/ou da molécula de ligação (CBA); X1, Y1, Z2 e Z3 são independentemente NH, O ou S; Z1 é independentemente H, NHR5, OR1, SR5, COX1R5, em que X1 e R5 são definidos acima; v é 0 ou 1; U1 é independentemente H, OH, alquila C1~C6, (OCH2CH2)n, F, Cl, Br, I, OR5,
7 / 161 SR5, NR5R5’, N=NR5, N=R5, NR5R5’, NO2, SOR5R5’, SO2R5, SO3R5, OSO3R5, PR5R5’, POR5R5’, PO2R5R5’, OPO(OR5)(OR5’) ou OCH2PO(OR5(OR5’), em que R5 e R5’ são selecionados independentemente dentre H, alquila C1~C8; alquenila C2~C8, alquinila, heteroalquila ou aminoácido; arila C3~C8, heterocíclico, carbocíclico, cicloalquila, heterocicloalquila, heteroaralquila, alquilcarbonila ou glicosídeo; ou sais catiônicos farmacêuticos; o componente ligante não autoimolativo é uma das seguintes estruturas: (CH2)nCO(OCH2CH2)r OCH3 (CH2) nCON(CH2CH2O)rCOCH3 *(CH2CH2O) r* ; *CH* ; *CH* ;
O (CH2)n(OCH2CH2)r OCOCH3 (CH2)nCO(OCH2CH2)rOCOCH3 * N N * *CH* ; *CH* ; m H ;
O O
S P * O * * OH* ; ; ; ; ; ; ;
COOH COOH O COOH O COOH * * * N * N* * ; ; m ; m ; m ;* S* ; R5 R5 * * * * N* * * *X Y* N* N* * N* N* m O m O m ; O m; m ; O ; O ; ; ;
O N* N *X1 Y1 * * * *N m *N ; * ; O ; ; ; Ar * O N N * m H ; ; ; ; O R5 R5' HOOC R5 R5' R5 R5' S* S* S* * m S *N S * S ; ; ; m ;
COOH
O N
H O O O O O COOH O N *S N COOH * N * N m* * NH* m S* COOH * ; O ; O ; O ;
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O COOH COOH
HN N O O N O
OH OH
COOH COOH m m m m * * N* * *N * *N * O ; O ; O ;O ; COOH O (OCH2CH2)r OCH 3 O (OCH2CH2)r OCH3
O N
COOH n m m * N* *N * *N * O ; O ; O ;
H O N(CH 2CH 2O)r CH 3 O N
N m m H2N *N * *N * H2N O ; O ; ;
O OH OH
HN
O P
O OH OH m HO OH *NH O * * *N * O * O ; O ; ; HO ; ; ; ; SO3H N SO3H
N HN HN n
N O
O S O O m m O OH m S *N * *N * *N * O OH O ; O ; O ; ; em que o átomo (*) é o ponto de anexação de espaçadores ou ligantes adicionais, os agentes citotóxicos e/ou as moléculas de ligação; X1, Y1, U1, R5, R5’ são como definidos acima; r é 0~100; m e n são 0~20 independentemente; ou R1, R2, R3 e R4 podem conter independentemente um componente ligante liberável que inclui pelo menos uma ligação que pode ser quebrada sob condições fisiológicas, como lábil ao pH, lábil a ácidos, lábil a bases, lábil à oxidação, metabolicamente lábil, bioquimicamente lábil ou lábil
9 / 161 a enzimas, com uma das seguintes estruturas: -(CR5R6)m(Aa)r(CR7R8)n(OCH2CH2)t- , -(CR5R6)m(CR7R8)n(Aa)r(OCH2CH2)t-, -(Aa)r- (CR5R6)m(CR7R8)n(OCH2CH2)t-, -(CR5R6)m(CR7R8)n(OCH2CH2)r(Aa)t-, - (CR5R6)m-(CR7=CR8)(CR9R10)n(Aa) t(OCH2CH2)r-, - (CR5R6)m(NR11CO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-, - (CR5R6)m(Aa)t(NR11CO)(CR9R10)n(OCH2CH2)r-,- (CR5R6)m(OCO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-, - (CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-, -(CR5R6)m(CO)(Aa)t- (CR9R10)n(OCH2CH2)r-, -(CR5R6)m(NR11CO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-, - (CR5R6)m-(OCO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-, - (CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-, - (CR5R6)m(CO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-, -(CR5R6)m- fenil-CO(Aa)t(CR7R8)n-, -(CR5R6)m-furil-CO(Aa)t(CR7R8)n-, -(CR5R6)m- oxazolil-CO(Aa)t(CR7R8)n-, -(CR5R6)m-tiazolil-CO(Aa)t(CCR7R8)n-, - (CR5R6)t-tienil-CO(CR7R8)n-, -(CR5R6)t-imidazolil-CO-(CR7R8)n-, -(CR5R6)t- morfolino-CO(Aa)t-(CR7R8)n-, -(CR5R6)tpiperazino-CO(Aa)t-(CR7R8)n-, - (CR5R6)t-N-metilpiperazin-CO(Aa)t-(CR7R8)n-, -(CR5R)m-(Aa)tfenil-, - (CR5R6)m-(Aa)tfuril-, -(CR5R6)m-oxazolil(Aa)t-, -(CR5R6)m-tiazolil(Aa)t-, - (CR5R6)m-tienil-(Aa)t-, -(CR5R6)m-imidazolil(Aa)t-, -(C R5R6)m- morfolino-(Aa)t-, -(CR5R6)m-piperazino-(Aa)t-, -(CR5R6)m- N-metilpiperazino-(Aa)t-, -K(CR5R6)m(Aa)r(CR7R8)n(OCH2CH2)t- , -K(CR5R6)m(CR7R8)n(Aa)r(OCH2CH2)t-, -K(Aa)r- (CR5R6)m(CR7R8)n(OCH2CH2)t-, -K(CR5R6)m(CR7R8)n(OCH2CH2)r(Aa)t- , -K(CR5R6)m-(CR7=CR8)(CR9R10)n(Aa)t(OCH2CH2)r- , -K(CR5R6)m(NR11CO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r- , -K(CR5R6)m(Aa)t(NR11CO)(CR9R10)n(OCH2CH2)r- , -K(CR5R6)m(OCO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r- , -K(CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-, -K(CR5R6)m(CO)(Aa)t-
10 / 161
(CR9R10)n(OCH2CH2)r-, -K(CR5R6)m(NR11CO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r- , -K(CR5R6)m-(OCO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r- , -K(CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-, -K- (CR5R6)m(CO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-, -K(CR5R6)m- fenil-CO(Aa)t(CR7R8)n-, -K-(CR5R6)m-furil-CO(Aa)t-(CR7R8)n-, -K(CR5R6)m- oxazolil-CO(Aa)t(CR7R8)n-, -K(CR5R6)m-tiazolil-CO(Aa)t-(CR7R8)n- , -K(CR5R6)t-tienil-CO(CR7R8)n-, -K(CR5R6)timidazolil-CO-(CR7R8)n- , -K(CR5R6)tmorfolino-CO(Aa)t(CR7R8)n-, -K(CR5R6)tpiperazino-CO(Aa)t- (CR7R8)n-, -K(CR5R6)t-N-metilpiperazin-CO(Aa)t(CR7R8)n- , -K(CR5R)m(Aa)tfenil, -K-(CR5R6)m-(Aa)tfuril-, -K(CR5R6)m-oxazolil(Aa)t- , -K(CR5R6)m-tiazolil(Aa)t-, -K(CR5R6)m-tienil-(Aa)t-, -K(CR5R6)m- imidazolil(Aa)t-, -K(CR5R6)m-morfolino(Aa)t-, -K(CR5R6)m- piperazino-(Aa)tG, -K(CR5R6)mN-metilpiperazino(Aa)t-; em que m, Aa, m e n são descritos acima; t e r são 0-100 independentemente; R3, R4, R5, R6, R7 e R8 são escolhidos independentemente dentre H; haleto; alquila C1~C8; arila C2~C8, alquenila, alquinila, éter, éster, amina ou amida, os quais opcionalmente substituídos com um ou mais haletos, CN, NR1R2, CF3, OR1, Arila, heterociclo, S(O)R1, SO2R1, -CO2H, -SO3H, -OR1, -CO2R1, -CONR1, - PO2R1R2, -PO3H ou P(O)R1R2R3; K é NR1, -SS-, -C(=O)-, -C(=O)NH-, - C(=O)O-, -C=NH-O-, -C=N-NH-, -C(=O)NH-NH-, O, S, Se, B, Het (anel heterocíclico ou heteroaromático com C3-C8) ou peptídeos contendo 1-20 aminoácidos; ou R1, R2, R3 e R4, são independentemente alquila linear com 1-18 átomos de carbono ou unidade de polietilenoxi com a fórmula (OCH2CH2)p, p = 1~5000, ou um peptídeo contendo 1~20 unidades de aminoácidos (forma L ou D) ou combinação acima.
Além disso, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, Z1 ou Z2 podem ser compostos independentemente por um ou mais componentes seguintes como mostrado abaixo:
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6-maleimidocaproil (MC),
maleimido propanoil (MP), tio-
maleido, ácido tio-amino-oxobutanoico,
ácido tio-amino-oxobutenoico, vanila-citrulina
(val-cit), alanina-fenilalanina (ala-phe),
lisina-fenilalanina (lys-phe),
lisina-alanina (lys-ala), p-aminobenziloxicarbonil
(PAB), 4-tio-pentanoato (SPP), 4-tio-
butirato (SPDB), 4-(N-maleimidometil)ciclo-
hexano-1-carboxilato (MCC), maleimidoetil (ME),
4-tio-2-hidroxissulfonil-butirato (2-Sulfo-SPDB),
aril-tiol (PySS), (4-acetil)aminobenzoato
12 / 161
O (SIAB), S ,
H
N oxilbenziltio, S aminobenziltio, dioxilbenziltio, diaminobenziltio, amino-oxilbenziltio, alcoxiamino (AOA), etilenoxi (EO), 4-metil-4-ditio-pentanoico (MPDP), triazol, ditio, alquilsulfonil, alquilsulfonamida, sulfon-bisamida, Fosfondiamida, alquilfosfonamida, ácido fosfínico, ácido N-metilfosfonamídico, ácido N,N’-dimetilfosfonamidico, N,N’- dimetilfosfondiamida, hidrazina, acetimidamida; oxima, acetilacetohidrazida, aminoetil-amina, aminoetil-aminoetil- amina e L- ou D-peptídeos naturais ou não naturais contendo 1-20 aminoácidos; em que uma ligação de conexão no meio dos átomos significa que ela pode conectar ligações de átomos de carbono vizinhos; a linha ondulada é o sítio ao qual outra ligação pode ser conectada;
13 / 161 alternativamente, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, Z1 ou Z2 podem estar ausentes independentemente, mas Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, Z1 e Z2 não podem estar ausentes ao mesmo tempo.
2. Compostos conjugados de Fórmula (I), (II), (III) e (IV) de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de serem feitos a partir de um composto de bis-ligante prontamente reativo de Fórmula (V), (VI), (VII) ou (VIII) contendo o grupo 2,3-diaminossuccinila abaixo, em que dois ou mais resíduos de uma molécula de ligação celular podem reagir simultânea ou sequencialmente com o composto de Fórmula (V), (VI), (VII) ou (VIII) correspondente: Fármaco1 (V), Fármaco1 Fármaco2 (VI), Fármaco1 (VII), Fármaco1 Fármaco2 (VIII), em que:
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“ “ é opcionalmente uma ligação simples, uma ligação dupla ou uma ligação tripla, ou pode opcionalmente estar ausente; Desde que, quando representa uma ligação tripla, Lv1 e Lv2 estão ausentes; “ “, “ “, Fármaco1, Fármaco2, n, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1 e Z2 são definidos do mesmo modo que na Fórmula (I)-(IV); Lv1 e Lv2 representam o mesmo grupo de saída ou diferente que pode ser reagido com um tiol, amina, ácido carboxílico, selenol, fenol ou grupo hidroxila em uma molécula de ligação celular.
Lv1 e Lv2 são selecionados independentemente dentre OH; F; Cl; Br; I; nitrofenol; N- hidroxissuccinimida (NHS); fenol; dinitrofenol; pentafluorofenol; tetrafluorofenol; difluorofenol; mono-fluorofenol; pentaclorofenol; triflato; imidazol; diclorofenol; tetraclorofenol; 1-hidroxibenzotriazol; tosilato; mesilato; 2-etil-5-fenilisoxazólio-3′-sulfonato, anidridos que se autoformaram ou foram formados com o outro anidrido: anidrido acético ou anidrido fórmico; ou uma molécula intermediária gerada com um reagente de condensação para reações de acoplamento de peptídeos ou para reações de Mitsunobu, os quais são selecionados dentre: EDC (N-(3- dimetilaminopropil)-N′-etilcarbodiimida), DCC (Diciclo-hexil-carbodiimida), N,N′-diisopropilcarbodiimida (DIC), meto-p-toluenosulfonato de N-ciclo- hexil-N′-(2-morfolino-etil)carbodiimida (CMC ou CME-CDI), 1,1′- carbonildiimidazol (CDI), TBTU (tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)- N,N,N′,N′-tetrametilurônio), hexafluorofosfato de N,N,N′,N′-tetrametil-O- (1H-benzotriazol-1-il)-urônio (HBTU), hexafluorofosfato de (benzotriazol-1- iloxi)tris(dimetilamino)-fosfônio (BOP), hexafluorofosfato de (benzotriazol- 1-iloxi)tripirrolidinofosfônio (PyBOP), cianofosfonato de dietila (DEPC), hexafluorofosfato de cloro-N,N,N′,N′-tetrametilformamidínio, 3-óxido de hexafluorofosfato de 1-[bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazol[4,5- b]piridínio (HATU), 3-óxido de hexafluorofosfato de 1- [(dimetilamino)(morfolino)metileno]-1H-[1,2,3]triazol[4,5-b]piridin-1-ío
15 / 161
(HDMA), hexafluorofosfato de 2-cloro-1,3-dimetil-imidazolidínio (CIP), hexafluorofosfato de clorotripirrolidinofosfônio (PyCloP), hexafluorofosfato de fluoro-N,N,N′,N′-bis(tetrametileno)-formamidínio (BTFFH), hexafluorofosfato de N,N,N′,N′-tetrametil-S-(1-óxido-2-piridil)tiurônio, tetrafluoroborato de O-(2-oxo-1(2H)piridil)-N,N,N′,N′-tetrametil-urônio (TPTU), tetrafluoroborato de S-(1-oxido-2-piridil)-N,N,N′,N′- tetrametiltiurônio, hexafluorofosfato de O-[(etoxicarbonil)- cianometilenamino]-N,N,N′,N′-tetrametilurônio (HOTU), hexafluorofosfato de (1-ciano-2-etoxi-2-oxoetilidenamino-oxi)dimetilamino-morfolino-carbênio (COMU), hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N′,N′- bis(tetrametileno)urônio (HBPyU), N-benzil-N′-ciclohexil-carbodiimida (com ou sem ligação a polímero), hexafluorofosfato de dipirrolidino(N- succinimidil-oxi)carbênio (HSPyU), hexafluorofosfato de clorodipirrolidinocarbênio (PyClU), tetrafluoroborato de 2-cloro-1,3-dimetil- imidazolidínio (CIB), hexafluorofosfato de (benzotriazol-1- iloxi)dipiperidinocarbênio (HBPipU), tetrafluoroborato de O-(6- clorobenzotriazol-1-il)-N,N,N′,N′-tetrametilurônio (TCTU), hexafluorofosfato de bromotris(dimetilamino)-fosfônio (BroP), anidrido propilfosfônico (PPACA, T3P®), isocianeto de 2-morfolinoetila (MEI), hexafluorofosfato de N,N,N′,N′-tetrametil-O-(N-succinimidil)urônio (HSTU), tetrafluoroborato de 2-bromo-1-etil-piridínio (BEP), tetrafluoroborato de O-[(etoxicarbonil)ciano- metilenamino]-N,N,N′,N′-tetra-metilurônio (TOTU), cloreto de 4-(4,6- dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (MMTM, DMTMM), tetrafluoroborato de N,N,N′,N′-tetrametil-O-(N-succinimidil)urônio (TSTU), tetrafluoroborato de O-(3,4-di-hidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazin-3-il)- N,N,N′,N′-tetrametilurônio -borate (TDBTU), 1,1′-(azodicarbonil)- dipiperidina (ADD), di-(4-clorobenzil)azodicarboxilato (DCAD), azodicarboxilato de di-terc-butila (DBAD), azodicarboxilato de diisopropila (DIAD), azodicarboxilato de dietila (DEAD). Além disso, Lv1 e Lv2 podem
16 / 161 ser um anidrido, formado pelo próprio ácido ou formado com outros anidridos de ácido C1~C8; ou Lv1 e Lv2 podem ser selecionados independentemente dentre, um haleto (fluoreto, cloreto, brometo e iodeto), metanossulfonila (mesila), toluenossulfonila (tosila), trifluorometilsulfonila (triflato), trifluorometilsulfonato, nitrofenoxila, N-succinimidila (NHS), fenoxila; dinitrofenoxila; pentafluorofenoxila, tetrafluorofenoxila, trifluorofenoxila, difluorofenoxila, monofluorofenoxila, pentaclorofenoxila, 1H-imidazol-1-ila, clorofenoxila, diclorofenoxila, triclorofenoxila, tetraclorofenoxila, N- (benzotriazol-il)oxila, 2-etil-5-fenilisoxazólio-3′-sulfonila, feniloxadiazol- sulfonila (-sulfona-ODA), 2-etil-5-fenilisoxazólio-ila, feniloxadiazol-ila (ODA), oxadiazol-ila, carbono insaturado (uma ligação dupla ou tripla entre carbono-carbono, carbono-nitrogênio, carbono-enxofre, carbono-fósforo, enxofre-nitrogênio, fósforo-nitrogênio, oxigênio-nitrogênio ou carbono- oxigênio), ou uma das seguintes estruturas: dissulfeto; haloacetila; haleto de acila (haleto) ácido; éster N-hidroxissuccinimida; maleimida; maleimida monossubstituída; maleimida dissubstituída; succinimida
O Lv3
N Lv3 monossubstituída; O succinimida dissubstituída; aldeído-CHO; etenossulfonila; acrila (acriloíla);
17 / 161 2-(tosiloxi)acetila; 2- (mesiloxi)acetila; 2-(nitrofenoxi)acetila;
O
F O 2-(dinitrofenoxi)acetila; X2' 2- (fluorofenoxi)-acetila; 2 -(difluorofenoxi)-acetila; 2-(((trifluorometil)-sulfonil)oxi)acetila; cetona ou aldeído, 2-(pentafluorofenoxi)acetila; , metilsulfonafeniloxadiazol (ODA); ,
O O R2 O X2' anidrido ácido, alquiloxiamino; azido, alquinila ou hidrazida, em que X1’ é F, Cl, Br, I ou Lv3; X2’ é O, NH, N(R1) ou CH2; R3 é independentemente H, grupo aromático, heteroaromático ou aromático em que um ou diversos átomos de H são substgituídos independentemente por -R1, -halogênio, -OR1, -SR1, -NR1R2, - NO2, -S(O)R1, -S(O)2R1 ou -COOR1; Lv3 é um grupo de partida selecionado dentre F, Cl, Br, I, nitrofenol; N-hidroxissuccinimida (NHS); fenol; dinitrofenol; pentafluorofenol; tetrafluorofenol; difluorofenol; monofluorofenol; pentaclorofenol; triflato; imidazol; diclorofenol; tetraclorofenol; 1-hidroxibenzotriazol; tosilato; mesilato; 2-etil-5- fenilisoxazólio-3′-sulfonato; R1 e R2 são definidos acima.
3. Compostos conjugados de Fórmula (I), (II), (III) e (IV) de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que são feitos a partir de um composto de bis-ligante prontamente reativo de Fórmula (IX) e (X) contendo o grupo 2,3-diaminossuccinila abaixo, em que dois ou mais grupos
18 / 161 funcionais de uma molécula citotóxica podem reagir simultânea ou sequencialmente com o composto de Fórmula (IX) e (X): (IX), (X), em que: “ “, “ “, Q, n, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1 e Z2 são como definidos na reivindicação 1; Lv1, Lv2, Lv1’ e Lv2’ são um grupo funcional que pode reagir independentemente com grupos de resíduos de um fármaco citotóxico simultânea ou sequencialmente para formar um composto de Fórmula (I), (II), (III) e (IV) respectivamente; Lv1’ ou Lv2’ são como definidos Lv1 ou Lv2 na reivindicação 2.
4. Composto conjugado de Fórmula (I), (II), (III) e (IV) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser feito a partir de um composto de bis-ligante prontamente reativo de Fórmula (XI) e (XII) abaixo, em que a molécula citotóxica e a molécula de ligação celular podem reagir com o composto de Fórmula (XI) e (XII) independentemente, de modo simultâneo ou sequencialmente: (XI),
19 / 161 (XII), em que “ “,X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1 e Z2 são como definidos na reivindicação 1; e “ “, Lv1, Lv2, Lv1’ e Lv2’ são como definidos para Lv1 e Lv2 na reivindicação 2.
5. Composto conjugado de Fórmula (I), (II), (III) e (IV) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tem uma estrutura representado pela Fórmula (Ia), (Ib), (Ic), (IIa), (IIb), (IIc), (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IVa), (IVb) e (IVc) abaixo: Fármaco1 (Ia), Fármaco1 (Ib), Fármaco1 (Ic), R5
O R1 Fármaco1 Y1 Drug N R3 Z1 1 X1
Q Y2 X2 Drug Fármaco2 2 N R4 Z2 R2 O n R 5' (IIa),
20 / 161 R5
O R1 Z1 Fármaco1 Y1 Drug N R3 1 X1
Q X2 Fármaco Drug 2 Y2 N R4 Z2 2 R2 n O R5' (IIb), R5
O R1 Z1 Fármaco1 Y1 Drug N R3 1 X1
Q Y2 X2 R2 N R 4 Z2 Drug Fármaco2 2 n O R5' (IIc), O R5 R1 Z1 Y1 N R3 X1 Fármaco Drug 1 Q 1 X2 Y2 R2 N R4 Z2 O n R5' (IIIa), O R5 R1 Y1 N R3 Z1 X1 Fármaco Drug1 Q 1 X2 Y2 R2 N R4 Z2 O n R5' (IIIb), Fármaco1 (IIIc), O R5 R1 Z1 Y1 X1 N R3 Drug11 Fármaco
Q X2 Fármaco2 Y2 R2 N Drug2 R4 O Z2 n R 5' (IVa),
21 / 161 O R5 R1 Z1 Y1 X1 N R3 Drug11 Fármaco
Q X2 Fármaco2 Drug2 Y2 R2 N R4 O Z2 n R5' (IVb), Fármaco1 Fármaco2 (IVc), em que “ “, Q, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2, o Fármaco1 e o Fármaco2 são como definidos na reivindicação 1.
6. Composto conjugado de Fórmula (I), (II), (III) ou (IV) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser adicionalmente representado pela Fórmula (I-01), (I-02), (I-03), (I-04), (I-05), (I-06), (I-07), (I-08), (I-09), (I-10), (I-11), (I-12), (I-13), (I-14), (I-15), (I-16), (I-17), (I-18), (I-19), (I-20), (I-21), (I-22), (I-23), (II-01), (II-02), (II-03), (II-04), (II-05), (II- 06), (II-07), (II-08), (II-09), (II-10), (II-11), (II-12), (II-13), (II-14), (II-15), (II-16), (II-17), (II-18), (III-01), (III-02), (III-03), (III-04), (III-05), (III-06), (III-07), (III-08), (III-09), (III-10), (III-11), (III-12), (III-13), (III-14), (III-15), (III-16), (III-17), (III-18), (III-19), (III-20), (IV-01), (IV-02), (IV-03), (IV- 04), (IV-05), (IV-06), (IV-07), (IV-08), (IV-09), (IV-10), (IV-11), (IV-12), (IV-13), (IV-14), (IV-15), (IV-16), (IV-17), (IV-18), (IV-19) e (IV-20) abaixo: Fármaco1 (I-01),
22 / 161
Fármaco1
(I-02),
Fármaco1
(I-03),
Fármaco1
(I-04),
Fármaco1
(I-05),
Fármaco1
(I-06),
Fármaco1
(I-07),
Fármaco1
(I-08),
23 / 161
O O R1 H Y1 N N S S Fármaco1 Drug H O 1 Q
H O Y2 N S S R2 N O H O n (I-09), Fármaco1 (I-10), Fármaco1 (I-11), Fármaco1 (I-12), Fármaco1 (I-13), Fármaco1 (I-14),
24 / 161
Fármaco1
(I-15),
Fármaco1
(I-16),
Fármaco1
(I-17)
Fármaco1
(I-18),
Fármaco1
(I-19),
Fármaco1
(I-20),
25 / 161 Fármaco1 (I-21), Fármaco1 (I-22), Fármaco1 (I-23), Fármaco1 Fármaco2 (II-01), Fármaco1 Fármaco2 (II-02), Fármaco1 Fármaco2 (II-03),
O O O R1 N S Drug11 Fármaco Y1 N N R3
H H Q
O
H O O Fármaco2 Drug R N S 2 Y 2 2 N R4 N n
O H O (II-04),
26 / 161
Fármaco1
Fármaco2
(II-05),
Fármaco1
Fármaco2
(II-06),
Fármaco1
Fármaco2
(II-07),
Fármaco1
Fármaco2
(II-08),
Fármaco1
Fármaco2
(II-09), Fármaco1
Fármaco2
(II-10),
27 / 161
Fármaco1
Fármaco2
(II-11),
Fármaco1
Fármaco2
(II-12),
Fármaco1
Fármaco2
(II-13),
Fármaco1
Fármaco2
(II-14)
Fármaco1
Fármaco2
(II-15),
Fármaco1
Fármaco2
(II-16),
Fármaco1
Fármaco2
(II-17),
28 / 161 Fármaco1 Fármaco2 (II-18), Fármaco1 (III-01), Fármaco1 (III-02), Fármaco1 (III-03), Fármaco1 (III-04),
O O
O S R1
N N N H R3 Z1
H Q OO Drug1 Fármaco1
H O S N R N Z2 N R4 n 2 O H O (III-05),
29 / 161
Fármaco1
(III-06),
Fármaco1
(III-07),
Fármaco1
(III-08),
Fármaco1
(III-09),
Fármaco1
(III-10),
Fármaco1
(III-11),
30 / 161
Fármaco1
(III-12),
Fármaco1
(III-13),
Fármaco1
(III-14),
Fármaco1
(III-15),
Fármaco1
(III-16),
Fármaco1
(III-17),
Fármaco1
(III-18),
31 / 161
Fármaco1
(III-19),
Fármaco1
(III-20),
Fármaco1
Fármaco2
(IV-01),
Fármaco1
Fármaco2
(IV-02),
Fármaco1
Fármaco2
(IV-03),
Fármaco1
Fármaco2
(IV-04),
32 / 161
Fármaco1
Fármaco2
(IV-05),
Fármaco1
Fármaco2
(IV-06),
Fármaco1
Fármaco2
(IV-07),
Fármaco1
Fármaco2
(IV-08), Fármaco1
Fármaco2
(IV-09), Fármaco1
Fármaco2
(IV-10),
33 / 161 Fármaco1 Fármaco2 (IV-11), O R1 O O Fármaco1 Drug1 S Y1 N N Z1 H R3
H Q Fármaco O H O Drug2 2
S N N R4 Z2 Y2 R2 O H n (IV-12), Fármaco1 Fármaco2 (IV-13), Fármaco1 Fármaco2 (IV-14), Fármaco1 Fármaco2 (IV-15), R1 O O Fármaco Drug 1 Y1 N R3 1 S N Z1
H H
Q O H O Fármaco Drug2 2 S Y2 N N Z2 R2 O R4 n O H (IV-16), Fármaco1 Fármaco2 (IV-17),
34 / 161 Fármaco1 Fármaco2 (IV-18), H O O Fármaco1 N R1 Drug1 N N R3 Z1
H H Q O Fármaco2 O H O Drug2
N N N Z2 H R2 O R4 n H (IV-19),
H O O N R1 Fármaco1 N N R3 Z1 Drug1
H H Q O Fármaco2 O H O Drug2
N N N Z2 H R2 O R4 n H (IV-20), em que “ “, “ “, Q, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2, o Fármaco1 e o Fármaco2 são como definidos acima na reivindicação 1. Além disso, um dentre o Fármaco1 e o Fármaco2 pode estar independentemente ausente, mas ambos não podem estar ausentes ao mesmo tempo.
7. Composto de Fórmula (V), (VI), (VII) ou (VIII) de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que tem uma estrutura representada pela Fórmula (Va), (Vb), (Vc), (VIa), (VIb), (VIc), (VIIa), (VIIb), (VIIc), (VIIIa), (VIIIb) e (VIIIc): Fármaco1 (Va),
35 / 161
Fármaco1
(Vb),
Fármaco1
(Vc),
Fármaco1
Fármaco2
(VIa),
Fármaco1
Fármaco2
(VIb),
Fármaco1
Fármaco2
(VIc),
Fármaco1
(VIIa),
Fármaco1
(VIIb),
36 / 161 Fármaco1 (VIIc), Fármaco1 Fármaco2 (VIIIa), Fármaco1 Fármaco2 (VIIIb), Fármaco1 Fármaco2 (VIIIc), em que “ “, Q, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2, Lv1, Lv2, o Fármaco1 e o Fármaco2 são como definidos acima.
8. Composto de Fórmula (V), (VI), (VII) ou (VIII) de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que tem uma estrutura adicionalmente representada pela Fórmula (V-01), (V-02), (V-03), (V-04), (V-05), (V-06), (V-07), (V-08), (V-09), (V-10), (V-11), (V-12), (V-13), (V- 14), (V-15), (V-16), (V-17), (V-18), (V-19), (V-20), (V-21), (V-22), (V-23), (VI-01), (VI-02), (VI-03), (VI-04), (VI-05), (VI-06), (VI-07), (VI-08), (VI- 09), (VI-10), (VI-11), (VI-12), (VI-13), (VI-14), (VI-15), (VI-16), (VI-17), (VI-18), (VII-01), (VII-02), (VII-03), (VII-04), (VII-05), (VII-06), (VII-07), (VII-08), (VII-09), (VII-10), (VII-11), (VII-12), (VII-13), (VII-14), (VII-15), (VII-16), (VII-17), (VII-18), (VII-19), (VII-20), (VIII-01), (VIII-02), (VIII- 03), (VIII-04), (VIII-05), (VIII-06), (VIII-07), (VIII-08), (VIII-09), (VIII-10),
37 / 161 (VIII-11), (VIII-12), (VIII-13), (VIII-14), (VIII-15), (VIII-16), (VIII-17), (VIII-18), (VIII-19) e (VIII-20) abaixo: Fármaco1 (V-01), Fármaco1 (V-02), Fármaco1 (V-03),
O O O R1 N Y1 N N R3 Drug11 Fármaco
H H
O
H O O Y2 N R2 N R4 N
O H O (V-04),
O O O R1 N Y1 N N R3 Drug 1 Fármaco
H H 1 O
H O O Y2 N R2 N R4 N
O H O (V-05), Fármaco1 (V-06),
38 / 161 Fármaco1 (V-07), Fármaco1 (V-08), Fármaco1 (V-09), Fármaco1 (V-10),
O
O R1 HN Y1 N Fármaco1 Drug1 H HO
O O
H Y2 N N R2 O H
HO O (V-11),
O
O R1 HN Y1 N Fármaco1 Drug1 H HO
O O
H Y2 N N R2 O H
HO O (V-12),
39 / 161
Fármaco1
(V-13),
Fármaco1
(V-14),
Fármaco1
(V-15),
Fármaco1
(V-16),
Fármaco1
(V-17)
Fármaco1
(V-18),
Fármaco1
(V-19),
40 / 161
Fármaco1
(V-20),
Fármaco1
(V-21),
Fármaco1
(V-22),
Fármaco1
(V-23),
Fármaco1
Fármaco2
(VI-01),
Fármaco1
Fármaco2
(VI-02),
41 / 161 Fármaco1 Fármaco2 (VI-03),
O O O Fármaco1 R1 Drug1 Y1 N N R3 N
H H
O
H O O
N Y2 R2 Fármaco2 Drug 2 N R4 N O H O (VI-04), Fármaco1 Fármaco2 (VI-05), Fármaco1 Fármaco2 (VI-06), Fármaco1 Fármaco2 (VI-07), Fármaco1 Fármaco2 (VI-08),
42 / 161
O Fármaco1 O Drug1 R1 HN Y1 N
H HO
O O
H Fármaco Y2 N N Drug 22 R2 H
O
HO O (VI-09), Fármaco1 Fármaco2 (VI-10), Fármaco1 Fármaco2 (VI-11), Fármaco1 Fármaco2 (VI-12), Fármaco1 Fármaco2 (VI-13), Fármaco1 Fármaco2 (VI-14)
43 / 161
Fármaco1
Fármaco2
(VI-15),
Fármaco1
Fármaco2
(VI-16),
Fármaco1
Fármaco2
(VI-17),
Fármaco1
Fármaco2
(VI-18),
Fármaco1
(VII-01),
Fármaco1
(VII-02),
44 / 161
Fármaco1
(VII-03),
Fármaco1
(VII-04),
Fármaco1
(VII-05),
Fármaco1
(VII-06),
Fármaco1
(VII-07),
45 / 161
Fármaco1
(VII-08),
Fármaco1
(VII-09),
Fármaco1
(VII-10),
Fármaco1
(VII-11),
Fármaco1
(VII-12),
Fármaco1
(VII-13),
46 / 161
Fármaco1
(VII-14),
Fármaco1
(VII-15),
Fármaco1
(VII-16),
Fármaco1
(VII-17),
Fármaco1
(VII-18),
Fármaco1
(VII-19),
Fármaco1
(VII-20),
47 / 161
Fármaco1
Fármaco2
(VIII-01),
Fármaco1
Fármaco2
(VIII-02),
Fármaco1
Fármaco2
(VIII-03),
Fármaco1
Fármaco2
(VIII-04),
Fármaco1
Fármaco2
(VIII-05),
48 / 161
Fármaco1
Fármaco2
(VIII-06),
Fármaco1
Fármaco2
(VIII-07),
Fármaco1
Fármaco2
(VIII-08), Fármaco1
Fármaco2
(VIII-09), Fármaco1
Fármaco2
(VIII-10),
Fármaco1
Fármaco2
(VIII-11),
49 / 161 Fármaco1 Fármaco2 (VIII-12), Fármaco1 Fármaco2 (VIII-13), Fármaco1 Fármaco2 (VIII-14), Fármaco1 Fármaco2 (VIII-15), Fármaco1 Fármaco2 (VIII-16),
O R1 O O 1 N Fármaco Drug1 X N 1 H N R3 Z1
H H
O H O Drug2 Fármaco 2
N X1' N Z2 HN R2 O R4 H (VIII-17),
O R1 O O 1 N Fármaco1 X N Drug1 H N R3 Z1
H H
O H O Fármaco2 Drug N 2 X1' N Z2 HN R2 O R4 H (VIII-18),
50 / 161
Fármaco1
Fármaco2
(VIII-19), Fármaco1
Fármaco2
(VIII-20), em que “ “, “ “, Q, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2, o Fármaco1 e o Fármaco2 são como definidos acima；X1 e X1’ são independentemente H, F, Cl, Br, I, OTs, OMs, OTf, N3, CHO, -C=CH, , ArC(=O)R1, C(=O)NHNH2, -O-NH2, nitrofenol; N- hidroxissuccinimida (NHS); fenol; dinitrofenol; pentafluorofenol; tetrafluorofenol; difluorofenol; mono-fluorofenol; pentaclorofenol; triflato; imidazole; diclorofenol; tetraclorofenol; 1-hidroxibenzo-triazol; tosilato; mesilato; 2-etil-5-fenilisoxazólio-3′-sulfonato, anidridos que se autoformaram ou anidridos formados com anidrido acético ou anidrido fórmico; O-NHS (O- N-hidroxissuccinimida), O-imidazole, O-triazol, O-tetrazol, O-Ar, O-ArNO2, O-Ar(NO2)2, O-ArF4, O-ArF3, O-ArF5, O-ArF2, O-ArF, O-ArCl4, O-ArCl3, O- ArCl5, O-ArCl2, O-ArCl, O-ArSO3H, O-ArOPO3H2, O-Ar(NO2)COOH, S- Ar(NO2)2COOH, O-piridina, O-nitrofenol, O-dinitrofenol, O-pentafluorofenol, O-tetrafluorofenol, O-trifluorofenol, O-difluorofenol, O-fluorofenol, O- pentaclorofenol, O-tetraclorofenol, O-tricloro-fenol, O-diclorofenol, O- clorofenol, O-piridina, O-nitropiridina, O-dinitropiridina, O-alquila C1-C8, O- triflato, O-benzotriazol, S-Ar, S-ArNO2, S-Ar(NO2)2, S-ArF4, S-ArF3, S-ArF5, S-ArF2, S-ArF, S-ArCl4, S-ArCl3, S-ArCl5, S-ArCl2, S-ArCl, S-ArSO3H, S- ArOPO3H2, S-Ar(NO2)COOH, S-Ar(NO2)2COOH, S-piridina, S-S-piridina, S-nitropiridina, S-dinitropiridina, S-alquila C1-C8, S-S-alquila C1-C8, S- triflato, S-benzotriazol, em que Ar é anel aromático C3-C8; ou uma molécula
51 / 161 intermediária gerada com um reagente de condensação para reações de acoplamento de peptídeos ou para reações de Mitsunobu.
9. Composto de Fórmula (IX) ou (X) de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que tem uma estrutura representada pela Fórmula (IX-01), (IX-02), (IX-03), (IX-04), (IX-05), (IX- 06), (IX-07), (IX-08), (IX-09), (IX-10), (IX-11), (IX-12), (IX-13), (IX-14), (IX-15), (IX-16), (IX-17), (IX-18), (IX-19), (IX-20), (IX-21), (IX-22), (IX- 23), (X-01), (X-02), (X-03), (X-04), (X-05), (X-06), (X-07), (X-08), (X-09), (X-10), (X-11), (X-12), (X-13), (X-14), (X-15), (X-16), (X-17), (X-18), (X- 19) e (X-20) abaixo: (IX-01), (IX-02), (IX-03),
O O O R1 N S Lv1' Y1 N N R3
H H Q
O
H O O Lv2' Y2 N S R2 N R4 N n
O H O (IX-04),
52 / 161
O O O Lv1' Y R1 N S 1 N N R3
H H Q
O
H O O Lv2' Y2 N S R2 N R4 N n
O H O (IX-05), (IX-06), (IX-07), (IX-08), (IX-09), (IX-10),
53 / 161
(IX-11),
(IX-12),
(IX-13),
(IX-14),
(IX-15),
(IX-16),
54 / 161
(IX-17)
(IX-18),
(IX-19),
(IX-20),
(IX-21),
(IX-22),
55 / 161
(IX-23),
(X-01),
(X-02),
(X-03),
(X-04),
(X-05),
56 / 161
(X-06),
(X-07),
(X-08),
(X-09),
(X-10),
(X-11),
57 / 161 (X-12), (X-13), (X-14), (X-15), R1 O O Lv1 S Y1 N N R3 H H Z1
Q O
H O S Y2 N Lv2 N Z2 R2 O R4 n O H (X-16), (X-17), (X-18),
58 / 161
H O O N R1 Lv1 N N R3 H H Z1
Q O
O H O
N N N Z2 Lv2 H R2 O R4 n H (X-19),
H O O N R1 N R3 Lv1
N H H Z1
Q O
O H O
N N N Z2 Lv2 H R2 O R4 n H (X-20), em que “ “, “ “, Q, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2, Lv1, Lv2, Lv1’ e Lv2’ são como definidos acima. Além disso, um dentre o Fármaco1 e o Fármaco2 pode estar independentemente ausente, mas ambos podem não estar ausentes ao mesmo tempo.
10. Composto de Fórmula (XI) ou (XII) de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que tem uma estrutura representada pela Fórmula (XI-01), (XI-02), (XI-03), (XI-04), (XI-05), (XI- 06), (XI-07), (XI-08), (XI-09), (XI-10), (XI-11), (XI-12), (XI-13), (XI-14), (XI-15), (XI-16), (XI-17), (XI-18), (XII-01), (XII-02), (XII-03), (XII-04), (XII-05), (XII-06), (XII-07), (XII-08), (XII-09), (XII-10), (XII-11), (XII-12), (XII-13), (XII-14), (XII-15), (XII-16), (XII-17), (XII-18), (XII-19), (XII-20), (XII-21), (XII-22), (XII-23), e (XII-24) abaixo: (XI-01), (XI-02),
59 / 161 (XI-03),
O O R1 Lv1 Lv1' Y1 N N
H H
H O Lv2' Y2 N Lv2 R2 O N H (XI-04),
O O R1 Lv1 Lv1' Y1 N N
H H
H O Lv2' Y2 N Lv2 R2 N O H (XI-05),
O O R1 Lv1 Lv1' Y1 N N
H H
H O Lv2' Y2 N Lv2 R2 O N H (XI-06) (XI-07), (XI-08), (XI-09),
60 / 161
(XI-10),
(XI-11),
(XI-12),
(XI-13),
(XI-14),
(XI-15),
61 / 161
(XI-16),
(XI-17),
(XI-18),
(XII-01),
(XII-02),
(XII-03),
62 / 161 (XII-04), (XII-05),
O
O O X1 N R1 H N N Lv1 OH H H R3 Z1
O O O
H 1' N X Lv2 HN R2 N R4 Z2
O H
OH O (XII-06), (XII-07), (XII-08), (XII-09),
63 / 161 (XII-10), (XII-11), (XII-12), (XII-13), (XII-14), O R1 O O Lv1 X1 S Y1 N N R3 Z1
H H
O O Y2 H O X1' S N Lv2 N R4 Z2 O R2 O H (XII-15), R1 O O Lv1' Z1 Lv1 Y1 N N H H R3
O
H O Lv2' Y2 N Z2 N R4 Lv2 R2 O O H (XII-16),
64 / 161 (XII-17), R1 O O Lv1' Y1 N Z1 Lv1
N H H R3
O
H O Lv2' Y2 N Z2 N R4 Lv2 R2 O O H (XII-18), (XII-19), O R1 O O Lv1
N N N X1 H H H R3 Z1
O H O
N Lv2 X1' HN R2 O N R4 Z2 H (XII-20), (XII-21), (XII-22), (XII-23),
65 / 161 (XII-24), em que “ “, “ “, Q, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2, Lv1, Lv2, Lv1’, Lv2’, X1 e X1’ são como definidos acima.
11. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Y1, Y2, Z1 e Z2 podem ligar-se a pares de tióis de um agente/molécula de ligação celular através de redução das ligações dissulfeto intercadeia do agente de ligação celular com ditiotreitol (DTT), ditioeritriol (DTE), L-glutationa (GSH), tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), 2- mercaptoetilamina (β-MEA) e/ou beta mercaptoethanol (β-ME, 2-ME).
12. Composto conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Fármaco1 ou o Fármaco2 é selecionado dentre: (1). um agente quimioterápico selecionado a partir do grupo que consiste em: a). um agente alquilante: selecionado a partir do grupo que consiste em mostardas nitrogenadas: clorambucil, clornafazina, ciclofosfamida, dacarbazina, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, manomustina, mitobronitol, melfalano, mitolactol, pipobromana, novembichin, fenesterina, prednimustina, tiotepa, trofosfamida, mostarda de uracila; CC-1065 e adozelesina, carzelesina, bizelesina ou seus análogos sintéticos; duocarmicina e seus análogos sintéticos, KW-2189, dímeros de CBI-TMI ou CBI; dímeros de benzodiazepina ou dímeros de pirrolobenzodiazepina (PBD), dímeros de tomaimicina, dímeros de indolinobenzodiazepina, dímeros de imidazobenzotiadiazepina ou dímeros de oxazolidinobenzodiazepina; Nitrosoureias: compreendendo carmustina, lomustina, clorozotocina,
66 / 161 fotemustina, nimustina, ranimustina; Alquilsulfonatos: compreendendo bussulfano, treossulfano, improssulfano e pipossulfano); Triazenos ou dacarbazine; compostos contendo platina: compreendendo carboplatina, cisplatina e oxaliplatina; aziridinas, benzodopa, carboquona, meturedopa ou uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina]; b). um alcaloide vegetal: selecionado a partir do grupo que consiste em alcaloides da vinca: compreendendo vincristina, vimblastina, vindesina, vinorelbina e navelbina; Taxoides: compreendendo paclitaxel, docetaxol e seus análogos, Maitansinoides compreendendo DM1, DM2, DM3, DM4, DM5, DM6, DM7, maitansina, ansamitocinas e seus análogos, criptoficinas (incluindo o grupo que consiste em criptoficina1 e criptoficina8); epotilonas, eleutrobina, discodermolida, briostatinas, dolostatinas, auristatinas, tubulisinas, cefalostatinas; pancratistatina; erbulinas, uma sarcodictina; espongistatina; c). um inibidor da DNA topoisomerase: selecionado a partir dos grupos de Epipodofilinas: compreendendo 9-aminocamptotecina, camptotecina, crisnatol, daunomicina, etoposídeo, fosfato de etoposídeo, irinotecano, mitoxantrona, novantrona, ácidos retinoicos (ou retinóis), teniposídeo, topotecano, 9-nitrocamptotecina ou RFS 2000; e mitomicinas e seus análogos; d). um antimetabólito: selecionado a partir do grupo que consiste em {[Anti-folato: (inibidores de DHFR: compreendendo metotrexato, trimetrexato, denopterina, pteropterina, aminopterina (ácido 4-aminopteroico) ou análogos do ácido fólico); Inibidores de IMP desidrogenase: (compreendendo ácido micofenólico, tiazofurina, ribavirina, EICAR); Inibidores da ribonucleotídeo redutase e: (compreendendo hidroxiureia, deferoxamina)]; [análogos da pirimidina: análogos de uracila:
67 / 161
(compreendendo ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, capecitabina (Xeloda), carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, 5- fluorouracila, floxuridina, ratitrexede (Tomudex)); análogos de citosina: (compreendendo citarabina, citosina arabinosídeo, fludarabina); análogos da purina: (compreendendo azatioprina, fludarabina, mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina)]; repositor de ácido fólico, ácido frolínico}; e Inibidores da nicotinamida fosforibosiltransferase (NAMPT); e). uma terapia hormonal: selecionado a partir do grupo que consiste em {Antagonistas dos receptores: [Anti-estrogênicos: (compreendendo megestrol, raloxifeno, tamoxifeno); agonistas de LHRH: (compreendendo goserelina, acetato de leuprolida); Anti-androgênicos: (compreendendo bicalutamida, flutamida, calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, goserelina, leuprolida, mepitiostano, nilutamida, testolactona, trilostano e outros inibidores de androgênios)]; Retinoides/Deltoides: [análogos da vitamina D3: (compreendendo CB 1093, EB 1089 KH 1060, colecalciferol, ergocalciferol); terapias fotodinâmicas: (compreendendo verteporfina, ftalocianina, fotosensibilizador Pc4, demetoxi- hipocrelina A); Citocinas: (compreendendo Interferon-alfa, Interferon-gama, fator de necrose tumoral (TNFs), proteínas humanas contendo um domínio TNF)]}; f). um inibidor de quinase, selecionado a partir do grupo que consiste em BIBW 2992 (anti-EGFR/Erb2), imatinibe, gefitinibe, pegaptanibe, sorafenibe, dasatinibe, sunitinibe, erlotinibe, nilotinibe, lapatinibe, axitinibe, pazopanibe, vandetanibe, E7080 (anti-VEGFR2), mubritinibe, ponatinib (AP24534), bafetinibe (INNO-406), bosutinibe (SKI- 606), cabozantinibe, vismodegibe, iniparibe, ruxolitinibe, CYT387, axitinibe, tivozanibe, sorafenibe, bevacizumabe, cetuximabe, Trastuzumabe, Ranibizumabe, Panitumumabe, ispinesibe; g). inibidores de poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) in
68 / 161 selecionados a partir do grupo que consiste em olaparibe, niraparibe, iniparibe, talazoparibe, veliparibe, CEP 9722 (Cephalon’s), E7016 (Eisai's), BGB-290 (BeiGene’s) ou 3-aminobenzamida. h). um antibiótico, selecionado a partir do grupo que consiste em um antibiótico de enedina (selecionado a partir do grupo que consiste em caliqueamicina, caliqueamicina γ1, δ1, α1 ou β1; dinemicina, incluindo dinemicina A e desoxidinemicina; esperamicina, kedarcidina, C-1027, maduropeptina ou cromóforo de neocarzinostatina e cromóforos relacionados a antibióticos de enedina), aclacinomicinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina; cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6- diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina, epirrubicina, eribulina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, nitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; i). um policetídeo (acetogenina), bulatacina e bulatacinona; gencitabina, epoxomicinas e carfilzomibe, bortezomibe, talidomida, lenalidomida, pomalidomida, tosedostate, zybrestat, PLX4032, STA-9090, Stimuvax, alovectina-7, Xegeva, Provenge, Yervoy, inibidores da isoprenilação e Lovastatina, neurotoxinas dopaminérgicas e íon 1-metil-4- fenilpiridínio, inibidores do ciclo celular (selecionados dentre estaurosporina), Actinomicinas (compreendendo Actinomicina D, dactinomicina), amanitinas, Bleomicinas (compreendendo bleomicina A2, bleomicina B2, peplomicina), Antraciclinas (compreendendo daunorrubicina, doxorrubicina (adriamicina), idarrubicina, epirrubicina, pirarrubicina, zorrubicina, mtoxantrona, inibidores de MDR ou verapamil, inibidores de Ca2+ATPase ou tapsigargina, inibidores
69 / 161 da Histona desacetilase ((compreendendo vorinostate, romidepsina, panobinostate, ácido valproico, mocetinostate (MGCD0103), belinostate, PCI-24781, entinostate, SB939, resminostate, Givinostate, AR-42, CUDC- 101, sulforafano, tricostatina A); tapsigargina, celecoxibe, glitazonas, galato de epigalocatequina, Dissulfiram, Salinosporamida A.; Antiadrenais, selecionados a partir do grupo que consiste em aminoglutetimida, mitotano, trilostano; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; ansacrine; arabinosídeo, bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; eflornitina (DFMO), elfomitina; acetato de eliptínio, etoglucida; nitrato de gálcio; gacitosina, hidroxiureia; ibandronato, lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; pSK®; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2, 2',2''-triclorotrietilamina; trichotecenos (incluindo o grupo que consiste em toxina T-2, verrucarina A, roridina A e anguidina); uretano, siRNA, fármacos antisense; (2). um agente anti-doença autoimune: ciclosporina, ciclosporina A, ácido aminocaproico, azatioprina, bromocriptina, clorambucil, cloroquina, ciclofosfamida, corticosteroides (incluindo o grupo que consiste em ancinonida, betametasona, budesonida, hidrocortisona, flunisolida, propionato de fluticasona, fluocortolona danazol, dexametasona, Triancinolona acetonida, dipropionato de beclometasona), DHEA, enanercept, hidroxicloroquina, infliximabe, meloxicam, metotrexato, mofetil, micofenilato, prednisona, sirolimo, tacrolimo. (3). Agentes anti-doenças infecciosas compreendendo: a). aminoglicosídeos: amicacina, astromicina, gentamicina (netilmicina, sisomicina, isepamicina), higromicina B, canamicina (amicacina, arbecacina, becanamicina, dibecacina, tobramicina), neomicina (framicetina, paromomicina, ribostamicina), netilmicina, espectinomicina,
70 / 161 estreptomicina, tobramicina, verdamicina; b). anfenicóis; azidanfenicol, cloranfenicol, florfenicol, tianfenicol; c). ansamicinas: geldanamicina, herbimicina; d). carbapenemas: biapenem, doripenem, ertapenem, imipenem/cilastatina, meropenem, panipenem; e). cefens: carbacefen (loracarbef), cefacetrila, cefaclor, cefradina, cefadroxil, cefalônio, cefaloridina, cefalotina ou cefalotina, cefalexin, cefaloglicina, cefamandol, cefapirina, cefatrizina, cefazaflur, cefazedona, cefazolina, cefbuperazona, cefcapeno, cefdaloxima, cefepima, cefminox, cefoxitina, cefprozil, cefroxadina, ceftezol, cefuroxima, cefixima, cefdinir, cefditoreno, cefepima, cefetamet, cefmenoxima, cefodizima, cefonicida, cefoperazona, ceforanide, cefotaxime, cefotiam, cefozopran, cephalexin, cefpimizol, cefpiramida, cefpiroma, cefpodoxima, cefprozil, cefquinoma, cefsulodina, ceftazidima, cefteram, ceftibuteno, ceftioleno, ceftizoxima, ceftobiprol, ceftriaxona, cefuroxima, cefuzonam, cefamicina (cefoxitina, cefotetano, cefmetazol), oxacefema (flomoxef, latamoxef); f). glicopeptídeos: bleomicina, vancomicina (oritavancina, telavancina), teicoplanina (dalbavancina), ramoplanina; g). glicilciclinas: tigeciclina; h). inibidores de β-Lactamase: penam (sulbactam, tazobactam), clavam (ácido clavulânico); i). lincosamidas: clindamicina, lincomicina; j). lipopeptídeos: daptomicina, A54145, antibióticos dependente de cálcio (CDA); k). macrolídeos: azitromicina, cetromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, fluritromicina, josamicina, cetolídeo (telitromicina, cetromicina), midecamicina, miocamicina, oleandomicina, rifamicinas (rifampicina, rifampina, rifabutina, rifapentina), roquitamicina,
71 / 161 roxitromicina, espectinomicina, espiramicina, tacrolimo (FK506), troleandomicina, telitromicina; l). monobactamas: aztreonam, tigemonam; m). oxazolidinonas: linezolida; n). penicilinas: amoxicilina, ampicilina, pivampicilina, hetacilina, bacampicilina, metampicilina, talampicilina, azidocilina, azlocilina, benzilpenicilina, benzatina benzilpenicilina, benzatina fenoximetilpenicilina, clometocilina, procaína benzilpenicilina, carbenicilina (carindacilina), cloxacilina, dicloxacilina, epicilina, flucloxacilina, mecilinam (pivmecilinam), mezlocilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, penamecilina, penicilina, feneticilina, fenoximetilpenicilina, piperacilina, propicilina, sulbenicilina, temocilina, ticarcilina; o). polipeptídeos: bacitracina, colistina, polimixina B; p). quinolonas: alatrofloxacino, balofloxacino, ciprofloxacino, clinafloxacino, danofloxacino, difloxacino, enoxacino, enrofloxacino, floxino, garenoxacino, gatifloxacino, gemifloxacino, grepafloxacino, canotrovafloxacino, levofloxacino, lomefloxacino, marbofloxacino, moxifloxacino, nadifloxacino, norfloxacino, orbifloxacino, ofloxacino, pefloxacino, trovafloxacino, grepafloxacino, sitafloxacino, esparfloxacino, temafloxacino, tosufloxacino, trovafloxacino; q). estreptograminas: pristinamicina, quinupristina/dalfopristina; r). sulfonamidas: mafenida, prontosil, sulfacetamida, sulfametizol, sulfanilimida, sulfasalazina, sulfisoxazol, trimetoprima, trimetoprima-sulfametoxazol (co-trimoxazol); s). antibacterianos esteroides: selecionados dentre ácido fusídico; t). tetraciclinas: doxiciclina, clortetraciclina, clomociclina, demeclociclina, limeciclina, meclociclina, metaciclina, minociclina,
72 / 161 oxitetraciclina, penimepiciclina, rolitetraciclina, tetraciclina, glicilciclinas (incluindo tigeciclina); u). outros antibióticos: selecionados a partir do grupo que consiste em anonacina, arsfenamina, inibidores de bactoprenol (Bacitracina), inibidores de DADAL/AR (cicloserina), dictiostatina, discodermolida, eleuterobina, epotilona, etambutol, etoposídeo, faropenem, ácido fusícido, furazolidona, isoniazida, laulimalida, metronidazol, mupirocina, micolactona, inibidores da síntese de NAM (fosfomicina), nitrofurantoína, paclitaxel, platensimicina, pirazinamida, quinupristina/dalfopristina, rifampicina (rifampina), tazobactam tinidazol, uvaricina; (4). fármacos antivirais compreendendo: a). inibidores de entrada/fusão: aplaviroc, maraviroc, vicriviroc, gp41 (enfuvirtida), PRO 140, CD4 (ibalizumabe); b). inibidores de integrase: raltegravir, elvitegravir, globoidnan A; c). inibidores da maturação: bevirimat, vivecon; d). inibidores da neuraminidase: oseltamivir, zanamivir, peramivir; e). nucleosídeos e nucleotídeos: abacavir, aciclovir, adefovir, andoxovir, apricitabina, brivudina, cidofovir, clevudina, dexelvucitabina, didanosina (ddI), elvucitabina, entricitabina (FTC), entecavir, fanciclovir, fluorouracila (5-FU), análogos de 2’,3’-didesoxinucleosídeos 3’-fluoro- substituídos (incluindo o grupo que consiste em 3’-fluoro-2’,3’- didesoxitimidina (FLT) e 3’-fluoro-2’,3’-didesoxiguanosina (FLG), fomivirsen, ganciclovir, idoxuridina, lamivudina (3TC), l-nucleosídeos (incluindo o grupo que consiste em β-l-timidina e β-l-2’-desoxicitidina), penciclovir, racivir, ribavirina, estampidina, estavudina (d4T), taribavirina (viramidina), telbivudina, tenofovir, trifluridina valaciclovir, valganciclovir, zalcitabina (ddC), zidovudina (AZT);
73 / 161 f). não nucleosídeos: amantadina, ateviridina, capravirina, diarilpirimidinas (etravirina, rilpivirina), delavirdina, docosanol, emivirina, favirenz, foscarnet (ácido fosfonofórmico), imiquimode, interferon alfa, lovirida, lodenosina, metisazona, nevirapina, NOV-205, peginterferon alfa, podofilotoxina, rifampicina, rimantadina, resiquimode (R-848), tromantadina; g). inibidores de protease: amprenavir, atazanavir, boceprevir, darunavir, fosamprenavir, indinavir, lopinavir, nelfinavir, pleconaril, ritonavir, saquinavir, telaprevir (VX-950), tipranavir; h). outros tipos de fármacos antivirais: abzima, arbidol, calanolida a, ceragenina, cianovirina-n, diarilpirimidinas, galato de epigalocatequina (EGCG), foscarnet, griffitsina, taribavirina (viramidina), hidroxiureia, KP-1461, miltefosina, pleconaril, inibidores de portmanteau, ribavirina, seliciclibe. (5). Um radioisótopo que pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em (radionuclídeos) 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86 Y, 99Tc, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At ou 213Bi. (6). Uma molécula de cromóforo, que é capaz de absorver luz UV, luz fluorescente, luz infravermelha, luz próxima à infravermelha, luz visual; Uma classe ou subclasse de xantóforos, eritróforos, iridóforos, leucóforos, melanóforos, cianóforos, moléculas de fluoróforo que são compostos químicos fluorescentes que re-emitem luz sobre luz, moléculas de fototransdução visual, moléculas de fotóforo, moléculas de luminescência, compostos de luciferina; Fluoróforos orgânicos não proteicos, selecionados a partir de: Derivados de xanteno (compreendendo fluoresceína, rodamina, verde de Oregon, eosina e vermelho do Texas); Derivados de cianina: (compreendendo cianina, indocarbocianina, oxacarbocianina, tiacarbocianina e merocianina); Derivados de esquaraína e esquaraínas substituídas no anel, incluindo corantes Seta, SeTau e Square; Derivados de naftaleno (compreendendo derivados de dansil e prodan); Derivados de cumarina;
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Derivados de oxadiazol (compreendendo piridiloxazol, nitrobenzoxadiazol e benzoxadiazol); derivados de antraceno (compreendendo antraquinonas, incluindo DRAQ5, DRAQ7 e CyTRAK Orange); Derivados de pireno (azul cascata, etc.); Derivados de oxazina (compreendendo vermelho do Nilo, azul do Nilo, violeta de cresil, oxazina 170). Derivados de acridina (compreendendo proflavina, laranja de acridina, amarelo de acridina). Derivados de arilmetina (compreendendo auramina, violeta cristal, verde malaquita). Derivados de tetrapirrol (compreendendo porfina, ftalocianina, bilirrubina); Quaisquer análogos e derivados dos seguintes compostos fluoróforos compreendendo corante CF, sondas DRAQ e CyTRAK, BODIPY, Alexa Fluor, Dilight Fluor, Atto e Tracy, FluoProbes, corantes Abberior, corantes DY e MegaStokes, corantes Sulfo Cy, HiLyte Fluor, corantes Seta, SeTau e Square, corantes Quasar e Cal Fluor, corantes SureLight (APC, RPEPerCP, Ficobilissomas), APC, APCXL, RPE, BPE, Aloficocianina (APC), Aminocumarina, conjugados APC-Cy7, BODIPY-FL, Cascata Blue, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy3B, Cy5, Cy5.5, Cy7, Fluoresceína, FluorX, Hidroxicumarina, Lissamina Rodamina B, amarelo Lúcifer, Metoxicumarina, NBD, Azul do Pacífico, Laranja do Pacífico, conjugados PE-Cy5, conjugados PE-Cy7, PerCP, R-ficoeritrina (PE), Red 613, Seta-555-Azida, Seta-555- DBCO, Seta-555-NHS, Seta-580-NHS, Seta-680-NHS, Seta-780-NHS, Seta- APC-780, Seta-PerCP-680, Seta-R-PE-670, SeTau-380-NHS, SeTau-405- Maleimida, SeTau-405-NHS, SeTau-425-NHS, SeTau-647-NHS, vermelho do Texas, TRITC, TruRed, X-Rodamina, 7-AAD (7-aminoactinomicina D, CG-seletivo), laranja de acridina, cromomicina A3, CyTRAK Orange (excitação vermelho escura), DAPI, DRAQ5, DRAQ7, brometo de etídio, Hoechst33258, Hoechst33342, LDS 751, mitramicina, iodeto de propídio (PI), azul SYTOX, verde SYTOX, laranja SYTOX, laranja de tiazol, TO- PRO: monômero de cianina, TOTO-1, TO-PRO-1, TOTO-3, TO-PRO-3, YOSeta-1, YOYO-1; Um composto fluoróforo: compreendendo DCFH
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(2'7'Dicorodi-hidro-fluoresceína, forma oxidada), DHR (Di-hidro-rodamina 123, forma oxidada, a luz catalisa a oxidação), Fluo-3 (éster AM. pH > 6), Fluo-4 (éster AM. pH 7,2), Indo-1 (éster AM, cálcio baixo/alto (Ca2+)), SNARF(pH 6/9), Aloficocianina (APC), AmCyan1 (tetrâmero, Clontech), AsRed2 (tetrâmero, Clontech), verde de Azami (monômero), Azurite, B- ficoeritrina(BPE), Cerulean, CyPet, DsRed monômero (Clontech), DsRed2 (“RFP”), EBFP, EBFP2, ECFP, EGFP (dímero fraco), Emerald (dímero fraco), EYFP (dímero fraco), GFP (mutação S65A), GFP (mutação S65C), GFP (mutação S65L), GFP (mutação S65T), GFP (mutação Y66F), GFP (mutação Y66H), GFP (mutação Y66W), GFPuv, HcRed1, J-Red, Katusha, laranja de Kusabira (monômero, MBL), mCFP, mCherry, mCitrine, Midoriishi Cyan (dímero, MBL), mKate (TagFP635, monômero), mKeima- Red (monômero), mKO, mOrange, mPlum, mRaspberry, mRFP1 (monômero), mStrawberry, mTFP1, mTurquoise2, P3 (complexo de ficobilissoma), peridinina clorofila (PerCP), R-ficoeritrina(RPE), T-Sapphire, TagCFP (dímero), TagGFP (dímero), TagRFP (dímero), TagYFP (dímero), tdTomato (dímero em tandem), Topaz, TurboFP602 (dímero), TurboFP635 (dímero), TurboGFP (dímero), TurboRFP (dímero), TurboYFP (dímero), Venus, Wild Type GFP, YPet, ZsGreen1 (tetrâmero), ZsYellow1 (tetrâmero) e seus derivados. (7). Os ligandos de ligação celular ou agonistas de receptores, que podem ser selecionados a partir de: Derivados de folato; Derivados da ureia do ácido glutâmico; Somatostatina e seus análogos (selecionados a partir do grupo que consiste em octreotida (Sandostatina) e lanreotida (Somatulina)); Sulfonamidas aromáticas; peptídeo hipofisário ativador de adenilato ciclase (PACAP) (PAC1); peptídeos intestinais vasoativos (VIP/PACAP) (VPAC1, VPAC2); hormônio estimulador de melanócitos (α- MSH); Colecistocininas (CCK)/agonistas de receptores de gastrina; Bombesinas (selecionado a partir do grupo que consiste emPyr-Gln-Arg-Leu-
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Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2)/ peptídeo liberador de gastrina (GRP); ligandos dos receptores de neurotensina (NTR1, NTR2, NTR3); ligandos da substância P (receptor NK1); Neuropeptídeo Y (Y1-Y6); peptídeos de endereçamento incluindo RGD (Arg-Gly-Asp), NGR (Asn-Gly- Arg), peptídeos RGD cíclicos diméricos e multiméricos (selecionados a partir de cRGDfV), TAASGVRSMH e LTLRWVGLMS (ligandos do receptor NG2 do proteoglicano sulfato de condroitina) e peptídeos F3; peptídeos de penetração celular (CPP); hormônios peptídicos, selecionados a partir do grupo que consiste em agonistas e antagonistas do hormônio liberador de hormônio luteinizante (LHRH) e agonista do hormônio liberador de gonadotropina (GnRH), atuam visando o hormônio folículo estimulante (FSH) e o hormônio luteinizante (LH), bem como a produção de testosterona, selecionados a partir do grupo que consiste em buserelina (Pyr-His-Trp-Ser- Tyr-D-Ser(OtBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt), Gonadorelina (Pyr-His-Trp-Ser-Tyr- Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2), Goserelina (Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(OtBu)- Leu-Arg-Pro-AzGly-NH2), Histrelina (Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-His(N-benzil)- Leu-Arg-Pro-NHEt), leuprolida (Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro- NHEt), Nafarelina (Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-2Nal-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2), Triptorelina (Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2), Nafarelina, Deslorelina, Abarelix (Ac-D-2Nal-D-4-cloroPhe-D-3-(3-piridil)Ala-Ser-(N- Me)Tyr-D-Asn-Leu-isopropilLys-Pro-DAla-NH2), Cetrorelix (Ac-D-2Nal-D- 4-cloroPhe-D-3-(3-piridil)Ala-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2), Degarelix (Ac-D-2Nal-D-4-cloroPhe-D-3-(3-piridil)Ala-Ser-4-aminoPhe(L- hidroorotyl)-D-4-aminoPhe(carba-moyl)-Leu-isopropilLys-Pro-D-Ala-NH2) e Ganirelix (Ac-D-2Nal-D-4-cloroPhe-D-3-(3-piridil)Ala-Ser-Tyr-D-(N9, N10- dietil)-homoArg-Leu-(N9, N10-dietil)-homoArg-Pro-D-Ala-NH2); Receptores de reconhecimento de padrões (PRRs), selecionados a partir do grupo que consiste em ligandos dos receptores Toll-like (TLRs), lectinas tipo C e ligandos dos receptores Nodlike (NLRs); Agonistas do receptor de
77 / 161 calcitonina; agonistas dos receptores de integrina e seus subtipos de receptor (selecionadoa a partir do grupo que consiste emαVβ1, αVβ3, αVβ5, αVβ6, α6β4, α7β1, αLβ2, αIIbβ3) (selecionados a partir do grupo que consiste em GRGDSPK, ciclo(RGDfV) (L1) e seus derivados [ciclo(-N(Me)R-GDfV), ciclo(R-Sar- DfV), ciclo(RG-N(Me)D-fV), ciclo(RGD-N(Me)f-V), ciclo(RGDf-N(Me)V- )(Cilengitida)]; Nanobody (um derivado de VHH (Ig camelídeo)); anticorpos de domínio (dAb, um derivado do domínio VH ou VL); Engager de células T biespecíficas (BiTE, um diabody biespecífico); Redirecionamento de afinidade dupla (DART, um diabody biespecífico); Anticorpos tetravalentes em tandem (TandAb, um diabody biespecífico dimerizado); Anticalina (um derivado das lipocalinas); Adnectinas (10a FN3 (Fibronectina); proteínas de repetição de anquirina projetadas (DARPins); Avímeros; Agonistas de receptores de EGF e de receptores de VEGF. (8). Os sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos, derivados, hidrato ou sal hidratado; ou uma estrutura cristalina; ou um isômero óptico, racemato, diastereômero ou enantiômero de qualquer um dos fármacos acima.
13. Composto conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Fármaco1 ou o Fármaco2 é uma molécula de cromóforo, e usado para detectar, monitorar ou estudar as interações e/ou funções da molécula de ligação celular e/ou as interações do conjugado com uma célula alvo.
14. Composto conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Fármaco1 ou o Fármaco2 é polialquileno glicóis [compreendendo poli(etilenoglicol) (PEGs), poli(propilenoglicol), um copolímero de óxido de etileno ou óxido de propileno, ou seus análogos] e usado para prolongar a meia-vida da molécula de ligação celular quando é administrado a um mamífero.
15. Composto conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Fármaco1 ou o Fármaco2 é um ligando de
78 / 161 ligação celular, um agonista do receptor celular ou uma molécula de ligação ao receptor celular, o conjugado é usado como um condutor/diretor de direcionamento para entregar o conjugado a células malignas ou para modular ou coestimular a resposta imune desejada, ou para alterar as vias de sinalização.
16. Composto conjugado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o Fármaco1 ou o Fármaco2 é selecionado a partir do grupo que consiste em tubulisinas, caliqueamicinas, auristatinas, maitansinoides, análogos de CC-1065, compostos de daunorrubicina e doxorrubicina, taxanoides (taxanos), criptoficinas, epotilonas, dímeros de benzodiazepina (compreendendo dímeros de pirrolobenzodiazepina (PBD), dímeros de tomaimicina, dímeros de antramicina, dímeros de indolinobenzodiazepina, dímeros de imidazobenzotiadiazepina ou dímeros de oxazolidinobenzodiazepina e seus derivados), caliqueamicinas e o antibióticos de enedina, actinomicinas, amatoxinas, amanitinas, azaserinas, bleomicinas, epirrubicinas, tamoxifeno, idarrubicina, dolastatinas/auristatinas (compreendendo monometil auristatina E, MMAE , MMAF, auristatina PYE, auristatina TP, Auristatinas 2-AQ, 6-AQ, EB (AEB), EFP (AEFP) e seus análogos), duocarmicinas, geldanamicinas, metotrexatos, tiotepa, vindesinas, vincristinas, hemiasterlinas, nazumamidas, microgininas, radiosuminas, alterobactinas, microscleroderminas, teonelamidas, esperamicinas, erbulinas, inibidores de nicotinamida fosforribosiltransferase (NAMPT), siRNA, miRNA, piRNA, enzimas nucleolíticas e/ou sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos e/ou seus análogos, derivados, hidrato ou sal hidratado; ou uma estrutura cristalina; ou um isômero óptico, racemato, diastereômero ou enantiômero de qualquer um dos fármacos acima.
17. Composto conjugado de acordo com a reivindicação 1, 5, 6, 12 a 16, caracterizado pelo fato de que o agente/molécula de ligação celular é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo, uma proteína,
79 / 161 probody, nanocorpo, uma vitamina (incluindo folato), peptídeos, uma micela polimérica, um lipossoma, um veículo de fármacos à base de lipoproteína, um veículo de fármacos de nanopartículas, um dendrímero e uma molécula ou partícula mencionada acima que reveste com ligandos de ligação celular, ou uma combinação dos referidos acima.
18. Compostos conjugados de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 5, 6, 12 a 17, caracterizados pelo fato de que o agente/molécula de ligação celular é selecionado dentre um anticorpo, uma proteína semelhante a um anticorpo, anticorpo completo (anticorpo policlonal, anticorpo monoclonal, dímero de anticorpo, multímero de anticorpo) ou anticorpo multiespecífico (selecionado dentre anticorpo biespecífico, anticorpo triespecífico ou anticorpo tetraespecífico); um anticorpo de cadeia única, um fragmento de anticorpo que se liga à célula alvo, um anticorpo monoclonal, um anticorpo monoclonal de cadeia única ou um fragmento de anticorpo monoclonal que se liga à célula alvo, um anticorpo quimérico, um fragmento de anticorpo quimérico que se liga à célula alvo, um anticorpo de domínio, um fragmento de anticorpo de domínio que se liga à célula alvo, um anticorpo recapeado, um anticorpo recapeado de cadeia única ou um fragmento de anticorpo recapeado que se liga à célula alvo, um anticorpo humanizado ou um anticorpo recapeado, um anticorpo humanizado de cadeia única ou um fragmento de anticorpo humanizado que se liga à célula alvo, antianticorpos idiotípicos (anti-Id), CDRs, diabody, triabody, tetrabody, minianticorpo, um probody, um fragmento de probody, pequenas proteínas imunes (SIP), uma linfocina, um hormônio, uma vitamina, um fator de crescimento, um fator estimulador de colônias, uma molécula de transporte de nutrientes, proteínas de grande peso molecular, nanopartículas ou polímeros modificados com anticorpos ou proteínas de grande peso molecular.
19. Compostos conjugados de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 5, 6, 12 a 18, caracterizados pelo fato de que o
80 / 161 agente/molécula de ligação celular é capaz de se direcionar contra uma célula tumoral, uma célula infectada por vírus, uma célula infectada por microrganismos, uma célula infectada por parasitas, uma célula de doença autoimune, uma célula tumoral ativada, uma célula mieloide, uma célula T ativada, uma célula B afetada ou um melanócito ou qualquer célula que expresse qualquer um dos seguintes antígenos ou receptores: CD2, CD2R, CD3, CD3gd, CD3e, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD8a, CD8b, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD12, CD12w, CD13, CD14, CD15, CD15s, CD15u, CD16, CD16a, CD16b, CD17, CDw17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42, CD42a, CD42b, CD42c, CD42d, CD43, CD44, CD44R, CD45, CD45RA, CD45RB, CD45RO, CD46, CD47, CD47R, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49e, CD49f, CD50, CD51, CD52, CD53, CD54, CD55,CD56, CD57, CD58, CD59, CD60, CD60a, CD60b, CD60c, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64, CD65, CD65s, CD66, CD66a, CD66b, CD66c, CD66d, CD66e, CD66f, CD67, CD68, CD69, CD70, CD71, CD72, CD73, CD74, CD74, CD75, CD75s, CD76, CD77, CD78, CD79, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CDw84, CD85, CD86, CD87, CD88, CD89, CD90, CD91, CD92, CDw92, CD93, CD94, CD95, CD96, CD97, CD98, CD99, CD99R, CD100, CD101, CD102, CD103, CD104, CD105, CD106, CD107, CD107a, CD107b, CD108, CD109, CD110, CD111, CD112, CD113, CDw113, CD114, CD115, CD116, CD117, CD118, CD119, CDw119, CD120a, CD120b, CD121a, CD121b, CDw121b, CD122, CD123, CDw123, CD124, CD125, CDw125, CD126, CD127, CD128, CDw128, CD129, CD130, CD131, CDw131, CD132, CD133, CD134, CD135, CD136, CDw136, CD137, CDw137, CD138, CD139, CD140a, CD140b, CD141, CD142, CD143, CD144, CD145, CDw145, CD146, CD147, CD148, CD149, CD150, CD151, CD152, CD153, CD154, CD155,
81 / 161
CD156a, CD156b, CDw156c, CD157, CD158a, CD158b, CD159a, CD159b, CD159c, CD160, CD161, CD162, CD162R, CD163, CD164, CD165, CD166, CD167, CD167a, CD168, CD169, CD170, CD171, CD172a, CD172b, CD172g, CD173, CD174, CD175, CD175s, CD176, CD177, CD178, CD179, CD180, CD181, CD182, CD183, CD184, CD185, CD186, CDw186, CD187, CD188, CD189, CD190, Cd191, CD192, CD193, CD194, CD195, CD196, CD197, CD198, CDw198, CD199, CDw199, CD200, CD200a, CD200b, CD201, CD202, CD202b, CD203, CD203c, CD204, CD205, CD206, CD207, CD208, CD209, CD210, CDw210, CD211, CD212, CD213a1, CD213a2, CD214, CD215, CD216, CDw217, CDw218a, CDw218b, CD219, CD220, CD221, CD222, CD223, CD224, CD225, CD226, CD227, CD228, CD229, CD230, CD231, CD232, CD233, CD234, CD235a, CD235ab, CD235b, CD236, CD236R, CD237, CD238, CD239, CD240, CD240CE, CD240D, CD241, CD242, CD243, CD244, CD245, CD246, CD247, CD248, CD249, CD250, CD251, CD252, CD253, CD254, CD256, CD257, CD258, CD259, CD260, CD261, CD262, CD263, CD264, CD265, CD266, CD267, CD268, CD269, , CD270, CD271, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276 (B7-H3), CD277, CD278, CD279, CD280, CD281, CD282, CD283, CD284, CD285, CD286, CD287, CD288, CD289, CD290, CD291, CD292, CDw293, CD294, CD295, CD296, CD297, CD298, CD299, CD300a, CD300c, CD300e, CD301, CD302, CD303, CD304, CD305, CD306, CD307, CD308, CD309, CD310, CD311, CD312, CD314, CD315, CD316, CD317, CD318, CD319, CD320, CD321, CD322, CD323, CD324, CDw325, CD326, CDw327, CDw328, CDw329, CD330, CD331, CD332, CD333, CD334, CD335, CD336, CD337, CDw338, CD339, 4-1BB, 5AC, 5T4 (Glicoproteína de trofoblastos, TPBG, 5T4, fator inibidor ativado por Wnt 1 ou WAIF1), antígeno de adenocarcinoma, AGS-5, AGS-22M6, quinase semelhante ao receptor de ativina 1 (, AFP, AKAP-4, ALK, alfa integrina, alfa v beta6, amino-peptidase N, beta amiloide, receptor de andrógeno, angiopoietina 2, angiopoietina 3,
82 / 161 anexina A1, antígeno protetor da toxina antraz, anti-receptor de transferrina, AOC3 (VAP-1), B7-H3, Bacillus anthracis anthrax, BAFF (fator ativador de célula B), célula de linfoma B, bcr-abl, Bombesina, BORIS, C5, C242, antígeno CA125 (antígeno de carboidrato 125, MUC16), CA-IX (ou CAIX, anidrase carbônica 9), CALLA, CanAg, Canis lupus familiaris IL31, anidrase carbônica IX, miosina cardíaca, CCL11 (quimiocina de motivo C-C 11), CCR4 (receptor de quimiocina C-C tipo 4, CD194), CCR5, CD3E (epsilon), CEA (antígeno carcinoembrionário), CEACAM3, CEACAM5 (antígeno carcinoembrionário), CFD (Fator D), Ch4D5, colecistocinina 2 (CCK2R), CLDN18 (Claudina-18), Fator de agrupamento A, cMet, CRIPTO, FCSF1R (Receptor do fator 1 estimulador de colônias, CD115), CSF2 (fator 2 estimulador de colônias, fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF)), CTLA4 (proteína associada a linfócitos T citotóxicos 4), antígeno tumoral CTAA16.88, CXCR4, (CD184), receptor de quimiocina C-X-C tipo 4, ADP ribose hidrolase cíclica, Ciclina B1, CYP1B1, Citomegalovírus, Glicoproteína B do citomegalovírus, Dabigatran, DLL3 (ligando do tipo delta 3), DLL4 (ligando do tipo delta 4), DPP4 (dipeptidil- peptidase 4), DR5 (receptor da morte 5), toxina do tipo E. coli shiga-1, toxina do tipo E. coli shiga-2, ED-B, EGFL7 (proteína 7 contendo domínio semelhante ao EGF), EGFR, EGFRII, EGFRvIII, Endoglina (CD105), receptor de endotelina B, endotoxina, EpCAM (molécula de adesão de células epiteliais), EphA2, Episialina, ERBB2 (Receptor do fator de crescimento epidérmico 2), ERBB3, ERG (gene de fusão TMPRSS2 ETS), Escherichia coli, ETV6-AML, FAP (Proteína alfa de ativação de fibroblastos), FCGR1, alfa-fetoproteína, fibrina II, cadeia beta, domínio extra de fibronectina-B, FOLR (receptor de folato), receptor de folato alfa, folato hidrolase, antígeno relacionado ao Fos, proteína F do vírus respiratório sincicial, receptor de Frizzled, Fucosil GM1, gangliosídeo GD2, G-28 (glicolipídio de antígeno da superfície celular), idiotipo GD3, GloboH, glipicano 3, ácido N-
83 / 161 glicolilneurâmico, GM3, cadeia α do receptor GMCSF, fator de diferenciação de crescimento 8, GP100, GPNMB (glicoproteína transmembranar NMB), GUCY2C (Guanilato ciclase 2C, guanilil ciclase C (GC-C), guanilato ciclase intestinal, receptor de guanilato ciclase-C, receptor de enterotoxina estável ao calor (hSTAR)), proteínas de choque térmico, hemaglutinina, antígeno da hepatite B, vírus da hepatite B, HER1 (receptor 1 do fator de crescimento epidérmico humano), HER2, HER2/neu, HER3 (ERBB-3), IgG4, HGF/SF (fator de crescimento/fator de dispersão de hepatócitos), HHGFR, HIV-1, complexo de histona, HLA-DR (antígeno leucocitário humano), HLA-DR10, HLA-DRB, HMWMAA, gonadotrofina coriônica humana, HNGF, receptor quinase do fator de dispersão humano, HPV E6/E7, Hsp90, hTERT, ICAM -1 (molécula de adesão intercelular 1), idiotipo, IGF1R (IGF -1, receptor de fator de crescimento semelhante à insulina 1), IGHE, IFN-γ, hemaglutinina do vírus Influenza, IgE, região Fc de IgE, IGHE, interleucinas (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-17A, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27 ou IL-28), IL31RA, ILGF2 (fator de crescimento semelhante à insulina 2), integrinas (α4, αIIbβ3, αvβ3, α4β7, α5β1, α6β4, α7β7,αllβ3, α5β5, αvβ5), proteína induzida por interferon gama, ITGA2, ITGB2, KIR2D, LCK, Le, Legumaina, antígeno Lewis-Y, LFA-1 (antígeno 1 associado à função linfocitária, CD11a), LHRH, LINGO-1, ácido lipoteico, LIV1A, LMP2, LTA, MAD-CT-1, MAD-CT-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE A1, MAGE A3, MAGE 4, MART1, MCP-1, MIF (fator inibidor de migração de macrófagos ou fator inibidor de glicosilação (GIF)), MS4A1 (membro 1 da subfamília A de 4 domínios transmembranares), MSLN (mesotelina), MUC1(Mucina 1, célula associada à superfície (MUC1) ou mucina epitelial polimórfica (PEM)), MUC1-KLH, MUC16 (CA125), MCP1 (proteína quimiotática monocítica 1), MelanA/MART1, ML-IAP, MPG, MS4A1 (subfamília A de 4 domínios transmembranares), MYCN, glicoproteína associada à mielina, miostatina,
84 / 161
NA17, NARP-1, NCA-90 (antígeno de granulócitos), Nectina-4 (ASG- 22ME), NGF, proteinase 1 regulada por apoptose neural, NOGO-A, receptor Notch, Nucleolina, produto de oncogene Neu, NY-BR-1, NY-ESO-1, OX-40, OxLDL (lipoproteína oxidada de baixa densidade), OY-TES1,P21, p53 não mutante, P97, Page4, PAP, Paratópio de anti-(ácido N-glicolilneuramínico), PAX3, PAX5, PCSK9, PDCD1 (PD-1, proteína de morte celular programada 1,CD279), PDGF-Rα (receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas do tipo alfa), PDGFR-β, PDL-1, PLAC1, fosfatase alcalina testicular do tipo PLAP, receptor beta do fator de crescimento derivado de plaquetas, co- transportador de fosfato de sódio, PMEL 17, ácido polissiálico, proteinase3 (PR1), carcinoma prostático, PS (fosfatidilserina), células de carcinoma prostático, Pseudomonas aeruginosa, PSMA, PSA, PSCA, glicoproteína do vírus da raiva, RHD (Rh polipeptídeo 1 (RhPI), CD240), fator Rhesus, RANKL, receptores RANTES (CCR1, CCR3, CCR5), RhoC, Ras mutante, RGS5, ROBO4, vírus respiratório sincicial, RON, pontos de ruptura da translocação do sarcoma, SART3, Esclerostina, SLAMF7 (membro da família SLAM 7), Selectina P, SDC1 (Sindecano 1), sLe (a), Somatomedina C, SIP (Esfingosina-1-fosfato), Somatostatina, proteína do esperma 17, SSX2, STEAP1 (antígeno epitelial 6 transmembranar da próstata 1), STEAP2, STn, TAG-72 (glicoproteína associada ao tumor 72), Survivin, receptor de células T, proteína transmembrana de células T, TEM1 (marcador endotelial tumoral 1), TENB2, Tenascina C (TN-C), TGF-α, TGF-β (fator de crescimento transformador beta), TGF-β1, TGF-β2 (fator transformador do crescimento- beta 2), Tie (CD202b), Tie2, TIM-1 (CDX-014), Tn, TNF, TNF-α, TNFRSF8, TNFRSF10B (membro da família 10B da superfamília do receptor de fator de necrose tumoral), TNFRSF13B (membro 13B da superfamília do receptor de fator de necrose tumoral 13B), TPBG (glicoproteína de trofoblastos), TRAIL- R1 (receptor 1 do ligando indutor de apoptose de necrose tumoral), TRAILR2 (receptor de morte 5 (DR5)), transdutor de sinal de cálcio associado a tumor
85 / 161 2, glicosilação específica de tumor de MUC1, receptor de TWEAK, TYRP1 (glicoproteína 75), TROP-2, TRP-2, tirosinase, (CD106), VEGF, VEGF-A, VEGF-2 (CD309), VEGFR-1, VEGFR2 ou vimentina, WT1, XAGE 1 ou células que expressam qualquer receptor de fator de crescimento de insulina ou qualquer receptor de fator de crescimento epidérmico.
20. Célula tumoral como definida na reivindicação 19, caracterizado pelo fato de ser selecionada a partir do grupo que consiste em células de linfoma, células de mieloma, células renais, células de câncer de mama, células de câncer de próstata, células de câncer de ovário, células de câncer colorretal, células de câncer gástrico, células de câncer escamoso, células do câncer de pulmão de pequenas células, células de câncer de pulmão de não pequenas células, células de câncer de testículo, células malignas ou quaisquer células que crescem e se dividem em ritmo acelerado e desregulado para causar câncer.
21. Composto conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Fármaco1 ou o Fármaco2 é uma molécula de cromóforo, selecionado a partir do grupo que consiste nas estruturas de Ac01, Ac02, Ac03, Ac04, Ac05, Ac06, e Ac07, Ac08, Ac09, Ac010, e Ac11 como seguem: Ac01, Ac02,
86 / 161
Ac03,
Ac04,
Ac05,
Ac06,
Ac07,
Ac08,
87 / 161 Ac09, Ac10 (conjugado de IR800CW), Ac11, em que “ “, Q, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são como definidos acima; R12 e R12’ são independentemente OH, NH2, NHR1, NHNH2, NHNHCOOH, O-R1-COOH, NH-R1-COOH, NH-(Aa)nCOOH, O(CH2CH2O)pCH2CH2OH, O(CH2CH2O)pCH2CH2NH2, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NH2, O(CH2CH2O)pCH2CH2COOH, NH(CH2CH2O)pCH2CH2COOH, O(CH2CH2O)pCH2CH2NHSO3H, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHSO3H, R1-NHSO3H, NH-R1-NHSO3H, O(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2, R1 - NHPO3H2, R1-OPO3H2, O(CH2CH2O)pCH2CH2OPO3H2, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2, OR1-NHPO3H2, NH-R1-NHPO3H2, NH- Ar-COOH, NH-Ar-NH2, em que p=0 -5000, Aa é um aminoácido, (Aa)n compreende os mesmos ou diferentes aminoácidos naturais ou não naturais, n=1-30.
22. Composto conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Fármaco1 ou o Fármaco2 é um análogo de tubulisina, selecionado dentre as estruturas de T01, T02, T03, T04, T05, T06
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T07, T08, T09, T10, T11, T12, T13, T14, T15, T16 T017, T18, T19, T20, T21, T22 e T23 como seguem:
T01,
T02,
T03,
T04,
T05
T06
T07
89 / 161 T08 T09 T10 T11, O O R5 Z3 H X3 N R3 Z1 R3 R4 N O O O R1 X1 R 1 N Q N Y2 N O N X2 S R12 R2 N R4 Z2 R2 H O n O R5' T12, T13, O R5
O Z3 H X3 N R3 Z1 R3 R4 N O O O R1 X1
Q R1 N Y2 N X2 N O N R2 N R4 Z2 R2 S H R12 O n O R5' T14, T15,
90 / 161
T16,
T17,
T18,
T19,
T20,
T21,
T22,
T23, em que “ “, Q, X1, X2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Aa, (Aa)n, Z1, Z2, p e n são como definidos acima; Y1 e Y2 são independentemente O, NH,
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NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, C(O)NHNHC(O) e C(O)NR1; mAb é anticorpo, preferivelmente anticorpo monoclonal; R12 é OH, NH2, NHR1, NHNH2, NHNHCOOH, O-R1-COOH, NH-R1-COOH, NH- (Aa)nCOOH, O(CH2CH2O)pCH2CH2OH, O(CH2CH2O)pCH2CH2NH2, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NH2, NR1R1’, NHOH, NHOR1, O(CH2CH2O)pCH2CH2COOH, NH(CH2CH2O)pCH2CH2COOH, NH-Ar- COOH, NH-Ar-NH2, O(CH2CH2O)pCH2CH2NHSO3H, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHSO3H, R1-NHSO3H, NH-R1-NHSO3H, O(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2, OR1, R1-NHPO3H2, R1-OPO3H2, O(CH2CH2O)pCH2CH2OPO3H2, OR1-NHPO3H2, NH-R1-NHPO3H2, NH(CH2CH2NH)pCH2CH2NH2, NH(CH2CH2S)pCH2CH2NH2, NH(CH2CH2NH)pCH2CH2OH, NH(CH2CH2S)pCH2CH2OH, NH-R1-NH2 ou NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2; R1, R1’, R2, R3, R4 e R5 são independentemente H, alquila C1-C8 linear ou ramificado, amida ou aminas; arila C2-C8, alquenila, alquinila, heteroarila, heteroalquila, alquilcicloalquila, éster, éter, heterocicloalquila ou aciloxilaminas; ou peptídeos contendo 1-8 aminoácidos, ou unidade de polietilenoxi com a fórmula (OCH2CH2)p ou (OCH2CH(CH3))p, em que p é um número inteiro de 1 a cerca de 5000; Os dois Rs: R1R2, R2R3, R1R3 ou R3R4 podem formar um anel cíclico de 3~8 membros do grupo alquila, arila, heteroarila, heteroalquila ou alquilcicloalquila; X3 é H, CH3, CH2CH3, C3H7 ou X1’R1’, em que X1’ é NH, N(CH3), NHNH, O ou S; R1’ é H ou alquila C1-C8 linear ou ramificado, arila, heteroarila, heteroalquila, alquilcicloalquila ou aciloxilaminas; R3’ é H ou alquila C1-C6 linear ou ramificado; Z3 é H, COOR1, NH2, NHR1, OR1, CONHR1,NHCOR1, OCOR1, OP(O)(OM1)(OM2), OCH2OP(O)(OM1)(OM2), OSO3M1, R1 , O-glicosídeo (glicosídeo, galactosídeo, manosídeo, glucuronosídeo/glucuronídeo, alosídeo, frutosídeo etc.), NH-glicosídeo, S-
92 / 161 glicosídeo ou CH2-glicosídeo; M1 e M2 são independentemente H, Na, K, Ca, Mg, NH4, NR1R2R3.
23. Composto conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Fármaco1 ou o Fármaco2 é um análogo de caliqueamicina, selecionado dentre as estruturas de C01 e C02 como seguem: C01, C02 em que “ “, Q, X1 X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são como definidos acima; preferivelmente X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente O, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, C(O)NHNHC(O) e C(O)NR1.
24. Composto conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Fármaco1 ou o Fármaco2 é um análogo maitansinoide, selecionado dentre as estruturas seguintes My01, My02, My03, My04, My05, My06, My07 e My08: My01,
93 / 161
My02,
My03,
My04,
My05,
My06,
My07,
94 / 161 My08, em que “ “, Q, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são como definidos acima; preferivelmente X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente O, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, C(O)NHNHC(O) e C(O)NR1.
25. Composto conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Fármaco1 ou o Fármaco2 é um análogo de taxano, selecionado dentre as estruturas de Tx01, Tx02 e Tx03 como seguem: Tx01 Tx02
95 / 161 Tx03 em que “ “, Q, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são como definidos acima; preferivelmente X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente O, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, C(O)NHNHC(O) e C(O)NR1.
26. Composto conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Fármaco1 ou o Fármaco2 é um análogo de CC-1065 e/ou um análogo de duocarmicina, selecionados dentre as estruturas de CC01, CC02, CC03, CC04, CC05, CC06 e CC07 como seguem: CC01, CC02, CC03,
96 / 161 CC04, CC05, Cl Cl R5 N N O R3 N Z1 O O X1
Q R4 Y2 Y1 R1 R2 N Z2 X2 O R5' CC06, CC07, em que “ “, Q, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são como definidos acima; preferivelmente X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente O, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, C(O)NHNHC(O) e C(O)NR1; Q é preferivelmente anticorpo monoclonal; Z3 é H, PO(OM1)(OM2), SO3M1, CH2PO(OM1)(OM2), CH3N(CH2CH2)2NC(O)-, O(CH2CH2)2NC(O)-, R1 ou glicosídeo.
27. Composto conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Fármaco1 ou o Fármaco2 é um análogo de daunorrubicina ou doxorrubicina, selecionado dentre as estruturas de Da01,
97 / 161
Da02, Da03, Da04, Da05, Da06, Da07, Da08, Da09, Da10 e Da11 como segue:
Da01,
Da02,
Da03,
Da04,
Da05,
98 / 161
Da06,
Da07,
Da08,
Da09,
Da10,
99 / 161 Da11, em que “ “, Q, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2, Aa, (Aa)n, p, e n são como definidos acima; preferivelmente X1,, X2, Y1 e Y2 são independentemente O, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, C(O)NHNHC(O) e C(O)NR1; R12 é OH, NH2, NHR1, NHNH2, NHNHCOOH, O-R1-COOH, NH-R1-COOH, NH(Aa)nCOOH, O(CH2CH2O)pCH2CH2OH, O(CH2CH2O)pCH2CH2NH2, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NH2, NR1R1’, NHOH, NHOR1, O(CH2CH2O)pCH2CH2COOH, NH(CH2CH2O)pCH2CH2COOH, NH- Ar-COOH, NH-Ar-NH2, O(CH2CH2O)pCH2CH2NH-SO3H, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NH-SO3H, R1-NHSO3H, NH-R1-NHSO3H, O(CH2CH2O)pCH2-CH2NHPO3H2, NH(CH2CH2O)pCH2-CH2NHPO3H2, OR1, R1-NHPO3H2, R1-OPO3H2, O(CH2CH2O)pCH2CH2OPO3H2, OR1-NHPO3H2, NH-R1-NHPO3H2, NH(CH2CH2NH)pCH2-CH2NH2, NH(CH2CH2S)pCH2CH2NH2, NH(CH2CH2NH)pCH2CH2OH, NH(CH2CH2S)pCH2-CH2OH, NH-R1-NH2 ou NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2.
28. Composto conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Fármaco1 ou o Fármaco2 é um análogo de auristatina ou dolastatina, selecionado dentre as estruturas de Au01, Au02, Au03, Au04, Au05, Au06, Au07, Au08, Au09, Au10, Au11, Au12, Au13, Au14, Au15, Au16, Au17, Au18, Au19, Au20, Au21, Au22, Au23, Au24, Au25, Au26 e Au27 como seguem:
100 / 161
Au01, 4 Y1 O R5 R3 R H O H X1 R3 N N R1 N Z1 R1 N Q N N Y2 X2 O O R4 O O O O R12 R2 N R2 Z2 O n R 5' Au02,
Au03,
Au04,
Au05，
Au06,
Au07，
Au08,
Au09,
101 / 161
Au10,
Au11,
Au12,
Au13,
Au14,
Au15,
Au16,
Au17,
102 / 161
Au18,
Au19,
Au20,
Au21,
Au22,
Au23,
Au24,
Au25,
103 / 161
Au26,
Au27, em que “ “, Q, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2, Aa, (Aa)n, p e n são como definidos acima; preferivelmente X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente O, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, C(O)NHNHC(O) e C(O)NR1; R12 é OH, NH2, NHR1, NHNH2, NHNHCOOH, O-R1-COOH, NH-R1-COOH, NH-(Aa)nCOOH, O(CH2CH2O)pCH2CH2OH, O(CH2CH2O)pCH2CH2NH2, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NH2, NR1R1’, NHOH, NHOR1, O(CH2CH2O)pCH2CH2COOH, NH(CH2CH2O)pCH2CH2COOH, NH- Ar-COOH, NH-Ar-NH2, O(CH2CH2O)pCH2CH2NH-SO3H, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHSO3H, R1-NHSO3H, NH-R1-NHSO3H, O(CH2CH2O)pCH2-CH2NHPO3H2, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2, OR1, R1-NHPO3H2, R1-OPO3H2, O(CH2CH2O)pCH2CH2OPO3H2, OR1-NHPO3H2, NH-R1-NHPO3H2, NH(CH2CH2NH)pCH2-CH2NH2, NH(CH2CH2S)pCH2CH2NH2, NH(CH2CH2NH)pCH2CH2OH, NH(CH2CH2S)pCH2-CH2OH, NH-R1-NH2, ou NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2; R1 , R2 , R3 , R4 e R5 são independentemente H; alquila C1-C8 linear ou ramificado, arila, heteroarila, heteroalquila, alquilcicloalquila, éster, éter, amida, aminas, heterocicloalquila, ou aciloxilaminas; ou peptídeos contendo 1-8 aminoácidos ou unidade de polietilenoxi com a fórmula (OCH2CH2)p ou (OCH2CH(CH3))p, em que p é um número inteiro de 1 a cerca de 5000. Os dois Rs: R1R2, R2R3, R1R3 ou R3R4 podem formar um anel cíclico de 3~8 membros do grupo alquila, arila, heteroarila, heteroalquila ou alquilcicloalquila; X3 é H, CH3 ou X1’R1’, em
104 / 161 que X1’ é NH, N(CH3), NHNH, O ou S, e R1’ é H ou alquila C1-C8 linear ou ramificado, arila, heteroarila, heteroalquila, alquilcicloalquila, aciloxilaminas; R3’ é H ou alquila C1-C6 linear ou ramificado; Z3’ é H, COOR1, NH2, NHR1, OR1, CONHR1,NHCOR1, OCOR1, OP(O)(OM1)(OM2), OCH2OP(O)(OM1)(OM2), OSO3M1, R1, ou O-glicosídeo (glicosídeo, galactosídeo, manosídeo, glucuronosídeo/glucuronídeo, alosídeo, frutosídeo, etc.), NH-glicosídeo, S-glicosídeo ou CH2-glicosídeo; M1 e M2 são independentemente H, Na, K, Ca, Mg, NH4, NR1R2R3.
29. Composto conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Fármaco1 ou o Fármaco2 é um dímero de análogos de benzodiazepina, selecionado dentre as estruturas de PB01, PB02, PB03, PB04, PB05, PB06, PB07, PB08, PB09, PB10, PB11, PB12, PB13, PB14, PB15, PB16, PB17, PB18, PB19, PB20, PB21, PB22, PB23, PB24, PB25, PB26, PB27, PB28, PB29, PB30, PB31 e PB32: PB01, PB02, PB03, PB04,
105 / 161
PB05,
PB06,
PB07,
PB08,
PB09,
PB10,
PB11, O R5 Y1 R3 X1 Z1 R6 N H R1 N O N H Y2 O R4 Q R2 X2 N R12 N N Z2 n OMe MeO R12' O O O R5' PB12,
106 / 161
PB13,
PB14,
PB15,
PB16,
PB17,
PB18,
PB19,
107 / 161
PB20,
PB21,
PB22,
PB23,
PB24,
PB25,
PB26,
108 / 161
PB27,
PB28,
PB29,
PB30,
PB31,
PB32, em que “ “, Q, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são como definidos acima; preferivelmente X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente O, N, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, C(O)NHNHC(O) e C(O)NR1; R1, R2, R3, R1’, R2’ e R3’ são independentemente H; F; Cl; =O; =S; OH; SH; alquila C1-C8 linear ou ramificado, arila, alquenila,
109 / 161 heteroarila, heteroalquila, alquilcicloalquila, éster (COOR5 ou –OC(O)R5), éter (OR5), amida (CONR5), carbamato (OCONR5), aminas (NHR5, NR5R5’), heterocicloalquila ou aciloxilaminas (-C(O)NHOH, -ONHC(O)R5); ou peptídeos contendo 1-20 aminoácidos naturais ou não naturais ou unidade de polietilenoxi da fórmula (OCH2CH2)p ou (OCH2CH(CH3))p, em que p é um número inteiro de 1 a cerca de 5000. Os dois Rs: R1R2, R2R3, R1R3, R1’R2’, R2’R3’ ou R1’R3’ podem formar independentemente um anel cíclico de 3~8 membros do grupo alquila, arila, heteroarila, heteroalquila ou alquilcicloalquila; X3 e Y3 são independentemente N, NH, CH2 ou CR5, em que R5, R6, R12 e R12’ são independentemente H, OH, NH2, NH(CH3), NHNH2, COOH, SH, OZ3, SZ3, F, Cl ou alquila C1-C8 linear ou ramificado, arila, heteroarila, heteroalquila, alquilcicloalquila, aciloxilaminas; Z3 é H, OP(O)(OM1)(OM2), OCH2OP(O)(OM1)(OM2), OSO3M1, ou O-glicosídeo (glicosídeo, galactosídeo, manosídeo, glucuronosídeo/glucuronídeo, alosídeo, frutosídeo, etc.), NH-glicosídeo, S-glicosídeo ou CH2-glicosídeo; M1 e M2 são independentemente H, Na, K, Ca, Mg, NH4, NR1R2R3.
30. Composto conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Fármaco1 ou o Fármaco2 é um análogo de amanitina, selecionado dentre as estruturas de Am01, Am02, Am03, Am04, Am05, Am06, Am07, Am08 e Am09 abaixo: Am01,
110 / 161
Am02,
Am03
Am04,
Am05,
Am06,
111 / 161
Am07,
Am08,
Am09, em que “ “, X1, X2, Q, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são como definidos acima; preferivelmente X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente O, N, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, C(O)NH-NHC(O), C(O)NR1 ou estão ausentes; R7, R8 e R9 são independentemente H, OH, OR1, NH2, NHR1, alquila C1-C6 ou estão ausentes; Y2 é O, O2, NR1, NH ou está ausente; R10 é CH2, O, NH, NR1, NHC(O), NHC(O)-NH, NHC(O)O, OC(O)O, C(O), OC(O), OC(O)(NR1), (NR1)C(O)(NR1), C(O)R1 ou está ausente; R11 é OH, NH2, NHR1, NHNH2, NHNHCOOH, O-R1-COOH, NH-R1-COOH, NH-(Aa)nCOOH, O(CH2CH2O)pCH2CH2OH, O(CH2CH2O)pCH2CH2NH2, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NH2, NR1R1’, O(CH2CH2O)pCH2CH2COOH, NH(CH2CH2O)pCH2CH2COOH, NH-Ar-COOH, NH-Ar-NH2,
112 / 161 O(CH2CH2O)pCH2CH2NHSO3H, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHSO3H, R1 - NHSO3H, NH-R1-NHSO3H, O(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2, NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2, OR1, R1-NHPO3H2, R1-OPO3H2, O(CH2CH2O)pCH2CH2OPO3H2, OR1-NHPO3H2, NH-R1-NHPO3H2 ou NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2, em que Aa é 1-8 aminoácidos; n e m1 são independentemente 1-30; p é 1-5000; Z3 é H, OH, COOR1, NH2, NHR1, OR1, CONHR1,NHCOR1, OCOR1, OP(O)(OM1)(OM2), OCH2OP(O)(OM1)(OM2), OSO3M1, R1 ou O-glicosídeo (glicosídeo, galactosídeo, manosídeo, glucuronosídeo/glucuronídeo, alosídeo, frutosídeo etc.), NH-glicosídeo, S- glicosídeo ou CH2-glicosídeo; M1 e M2 são independentemente H, Na, K, Ca, Mg, NH4, NR1R2R3.
31. Composto conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Fármaco1 ou o Fármaco2 é camptotecina e seu derivado, selecionado dentre as estruturas de CP01, CP02, CP03, CP04, CP05 e CP06 abaixo: CP01, CP02, CP03,
113 / 161 CP04, CP05, CP06, em que “ “, Q, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são como definidos acima; preferivelmente X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente O, N, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, CH2, C(O)NHNHC(O), C(O)NR1 ou está ausente; Z3 é H, OH, COOR1, NH2, NHR1, OR1, CH3, CONHR1,NHCOR1, OCOR1, OP(O)(OM1)(OM2), OCH2OP(O)(OM1)(OM2), OSO3M1, R1, ou O-glicosídeo (glicosídeo, galactosídeo, manosídeo, glucuronosídeo/glucuronídeo, alosídeo, frutosídeo, etc.), NH-glicosídeo, S-glicosídeo ou CH2-glicosídeo; M1 e M2 são independentemente H, Na, K, Ca, Mg, NH4, NR1R2R3.
32. Composto conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Fármaco1 ou o Fármaco2 é eribulina e seu derivado, selecionado dentre as estruturas de Eb01 e Eb02 abaixo:
114 / 161 Eb01, Eb02, em que “ “, Q, X1, X2, Y1, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são como definidos acima; preferivelmente X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente O, N, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, CH2, C(O)NHNHC(O), C(O)NR1 ou estão ausentes.
33. Composto conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Fármaco1 ou o Fármaco2 é um inibidor de nicotinamida fosforribosiltransferases, selecionado dentre as estruturas de NP01, NP02, NP03, NP04, NP05, NP06, NP07, NP08 e NP09 abaixo: NP01,
115 / 161
NP02,
NP03,
NP04,
NP05,
NP06,
NP07,
NP08，
116 / 161 NP09, em que “ “, Q, X1, X2, Y1, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são como definidos acima; X5 é F, Cl, Br, I, OH, OR1, R1, OPO3H2, OSO3H, NHR1, OCOR1, NHCOR1; preferivelmente X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente O, N, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, CH2, C(O)NHNHC(O), C(O)NR1 ou estão ausentes.
34. Composto conjugado de acordo com a reivindicação 1 ou 14, caracterizado pelo fato de que o Fármaco1 ou o Fármaco2 é um análogo de polialquilenoglicol, selecionado dentre as estruturas de Pg01, Pg02, e Pg03.
Pg01 Pg02 Pg03 em que “ “, Q, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são como definidos acima; preferivelmente, Y1 e Y2 são independentemente O, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, C(O)NH-NHC(O) e C(O)NR1; p é 1-5000; R1 e R3 são como definidos para R1 acima e, preferivelmente, R1 e R3 são H, OH, OCH3, CH3 ou OC2H5
117 / 161 independentemente.
35. Composto conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Fármaco1 ou o Fármaco2 é um ligando de ligação celular ou agonista do receptor celular e seus análogos, selecionado dentre as estruturas de: LB01 (conjugado de folato), LB02 (conjugado de ligando de PMSA), LB03 (conjugado de ligando de PMSA), LB04 (conjugado de ligando de PMSA), LB05 (conjugado de somatostatina), LB06 (conjugado de somatostatina), LB07 (octreotida, um conjugado de somatostatina), L08 (Lanreotida, um conjugado de análogo da somatostatina), LB09 (Vapreotida (Sanvar), um conjugado de análogo de somatostatina), LB10 (conjugado de ligando de CAIX), LB11 (conjugado de ligando de CAIX), LB12 (receptor de peptídeo liberador de gastrina (GRPr), conjugado de MBA), LB13 (ligando de hormônio liberador de hormônio luteinizante (LH-RH) e conjugado de GnRH), LB14 (hormônio liberador de hormônio luteinizante (LH-RH) e conjugado de ligando de GnRH), LB15 (antagonista de GnRH, conjugado de Abarelix), LB16 (cobalamina, conjugado de análogo de vitamina B12), LB17 (cobalamina, conjugado de análogo de vitamina B12), LB18 (para receptor de integrina αvβ3, conjugado de pentapeptídeo cíclico de RGD), LB19 (conjugado de ligando peptídico heterobivalente para receptor de VEGF), LB20 (conjugado de Neuromedina B), LB21 (conjugado de bombesina para um receptor de junção à proteína G), LB22 (conjugado de TLR2 para um receptor tipo Toll), LB23 (para um receptor de androgênio), LB24 (Conjugado Cilengitida/ciclo(-RGDfV-) para um receptor de integrina αv, LB23 (conjugado de fludrocortisona), LB25 (conjugado de análogo de rifabutina), LB26 (conjugado de análogo de rifabutina), LB27 (conjugado de análogo de rifabutina), LB28 (conjugado de fludrocortisona), LB29 (conjugado de dexametasona), LB30 (conjugado de propionato de fluticasona), LB31 (conjugado de dipropionato de beclometasona), LB32 (conjugado de acetonida de triancinolona), LB33 (conjugado de prednisona),
118 / 161 LB34 (conjugado de prednisolona), LB35 (conjugado de metilprednisolona), LB36 (conjugado de betametasona), LB37 (conjugado de análogo de irinotecano), LB38 (conjugado de análogo de crizotinibe), LB39 (conjugado de análogo de Bortezomibe), LB40 (conjugado de análogo de carfilzomibe), LB41 (conjugado de análogo de carfilzomibe), LB42 (conjugado de análogo de leuprolida), LB43 (conjugado de análogo de triptorelina), LB44 (conjugado de clindamicina), LB45 (conjugado de análogo de liraglutida), LB46 (conjugado de análogo de semaglutida), LB47 (conjugado de análogo da retapamulina), LB48 (conjugado análogo da indibulina), LB49 (conjugado análogo da vinblastina), LB50 (conjugado análogo do lixisenatida), LB51 (conjugado análogo do osimertinibe), LB52 (um conjugado de análogo de neucleosídeo), LB53 (conjugado de análogo de Erlotinibe) e LB54 (conjugado de análogo de Lapatinibe) como mostrado nas estruturas seguintes: LB01, LB02, O R5 R3 HOOC X4 Y1 R1 Z1 X1 N O R4 Q Y2 R2 X2 N
HOOC N N COOH H H O Z2 n R5' LB03, LB04,
119 / 161
LB05,
LB06,
LB07,
LB08,
LB09,
120 / 161
LB10,
LB11,
LB12,
LB13,
LB14,
LB15,
LB16,
121 / 161
LB17,
LB18,
LB19,
LB20,
LB21,
LB22,
LB23,
122 / 161
LB24,
LB25,
LB26,
LB27,
LB28,
123 / 161 LB29, LB30, LB31, Me O N R1 O R5 R3
HO O N Z1 Me H X1 O R2 R4 Q X2 N F H Z2 R5' n O O LB32, LB33, LB34,
124 / 161
LB35,
LB36,
LB37,
LB38,
LB39, em que Y5 é N, CH, C(Cl), C(CH3) ou C(COOR1); R1 é H, alquila C1-C6, C3- C8 Ar;
LB40,
125 / 161
LB41,
LB42,
LB43,
LB44,
LB45,
LB46,
126 / 161 LB47, LB48, LB49, LB50,
N O R1 R5 R3 Y1 X1 Z1
O NH N N R2 X Q N N 2 R4 Y2 N Z2 n N N O R 5' H O LB51, LB52,
127 / 161 LB53, LB54, em que “ “, X1, X2, Q, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são como definidos acima; preferivelmente X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente O, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, C(O)NHNHC(O) e C(O)NR1; X3 é CH2, O, NH, NHC(O), NHC(O)NH, C(O), OC(O), OC(O)(NR3), R1, NHR1, NR1, C(O)R1 ou está ausente; X4 é H, CH2, OH, O, C(O), C(O)NH, C(O)N(R1), R1, NHR1, NR1, C(O)R1 ou C(O)O; X5 é H, CH3, F ou Cl; M1 e M2 são independentemente H, Na, K, Ca, Mg, NH4, NR1R2R3; R6 é 5'-desoxiadenosil, Me, OH ou CN;
36. Composto conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula citotóxica é um DNA, RNA, mRNA, RNA interferente pequeno (siRNA), microRNA (miRNA) ou RNAs que interagem com PIWI (piRNA), o composto conjugado selecionado dentre estrutura de SI-1 abaixo.
SI-1, em que “ “, Q, X1, X2, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2
128 / 161 e n são como definidos acima; preferivelmente X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente O, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, CH2, C(O)NHNHC(O) e C(O)NR1; são fita simples ou duplas de DNA, RNA, mRNA, siRNA, miRNA ou piRNA.
37. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 5, 6, 12 a 18, 21 a 36, caracterizado pelo fato de que a molécula/agente de ligação celular é selecionado dentre um anticorpo IgG, anticorpo monoclonal ou uma proteína semelhante a um anticorpo IgG, tendo a estrutura seguinte de ST1, ST2, ST3, ST4, ST5 ou ST6 abaixo, em que o conjugado é conjugado especificamente a um par de tióis gerados através da redução das ligações dissulfeto da molécula/agente de ligação celular entre a cadeia leve e a cadeia pesada, as ligações dissulfeto superiores entre as duas cadeias pesadas e as ligações dissulfeto inferiores entre as duas cadeias pesadas: Fármaco ST1， Fármaco Fármaco ST2,
129 / 161
Fármaco
ST3,
Fármaco Fármaco
Fármaco
ST4,
Fármaco
Fármaco
ST5,
Fármaco Fármaco
Fármaco Fármaco
ST6, em que “ “, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, R5’, Z1, Z2 e n são como definidos acima; preferivelmente, X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente O, NH, NHNH, NR5, S, C(O)O, C(O)NH, OC(O)NH, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(O)S, OC(O)N(R1), N(R1)C(O)N(R1), CH, CH2,
130 / 161 C(O)NHNHC(O) e C(O)NR1; m1, m2, m3 e m4 são independentemente 1-30.
38. Conjugado de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o fármaco (ou molécula citotóxica) e m1, em sítio de conjugação diferente da molécula de ligação celular, podem ser diferentes quando as moléculas citotóxicas contendo bis-ligantes iguais ou diferentes desta invenção são conjugadas a uma molécula de ligação celular sequencialmente ou passo a passo.
39. Conjugado de acordo com a reivindicação 37 ou 38, caracterizado pelo fato de que o fármaco é selecionado dentre tubulisinas, maitansinoides, taxanoides (taxanos), análogos de CC-1065, compostos de daunorrubicina e doxorrubicina, indol-carboxamida, dímeros de benzodiazepina, dímeros de pirrol-benzodiazepina (PBD), dímeros de tomaimicina, dímeros de antramicina, dímeros de indolinobenzodiazepinas, dímeros de imidazobenzotiadiazepinas, dímeros de oxazolidinobenzodiazepinas, caliqueamicinas e os antibióticos de enedinas, actinomicina, amanitinas, amatoxinas, azaserinas, bleomicinas, epirrubicina, eribulina, tamoxifeno, idarrubicina, dolastatinas, auristatinas (compreendendo monometil auristatina E, MMAE , MMAF, auristatina PYE, auristatina TP, Auristatinas 2-AQ, 6-AQ, EB (AEB), EFP (AEFP) e seus análogos), duocarmicinas, geldanamicinas, inibidores de HSP90, inibidor de nicotinamida fosforribosiltransferases, centanamicina, metotrexatos, tiotepa, vindesinas, vincristinas, hemiasterlinas, nazumamidas, microgininas, radiosuminas, estreptonigtina, SN38 ou outros análogos ou metabólitos de camptotecina, alterobactinas, microscleroderminas, teonelamidas, esperamicinas, PNU-159682 e seus análogos ou derivados, sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos, derivados, hidrato ou sal hidratado, uma estrutura cristalina, um isômero óptico, racemato, diastereômero ou enantiômero de qualquer um dos fármacos acima; ou uma molécula/composto citotóxico descrito na reivindicação 12.
131 / 161
40. Composto de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que tem a fórmula A-01, A-02, A-03, A-04, B-01, B-02, B-03, B- 04, B-05, B-06, B-07, B-08, B-09, B-10, B-11, B-12, B-13, B-14, B-15, B-16, C-01, C-02, C-03, C-04, C-05, C-06, C-07, C-08, C-09, C-10, C-11, C-12, D- 01, D-02, D-03, D-04, D-05, D-06, Pg-04, 97, 98, 116, 125, 129, 133, 135, 157a, 157b, 157c, 157d, 157e, 157f, 162, 163, 235a, 235b, 235c, 236a, 236b, 236c, 238a, 238b, 238c, 255, 256, 258a, 258b, 258c, 260, 262, 267, 271, 272, 274, 276, 278, 282, 284, 286, 287, 306, 309, 314, 318 e 325, como mostrado nas estruturas seguintes: A-01, A-02, A-03, A-04,
132 / 161
,
B-04,
,
,
,
,
133 / 161
,
,
,
,
,
134 / 161 ,
O O
H O
N H O
O N N H O OAc O H
N O O
N O N O O
N N HN N
HN H N
O S N O O
H NH
HN O HO2C O 9
O B-15, , ,
135 / 161 , ,
O
HN O O 8 O
O H O N
N O N 3 H
N O
HN O H O
N O CO2H O H H 8
HN N O
O HN
O O N O O CO2H N O O HO H 3
H N O OH O
O O N
H
N OMe MeO N C-04 O O ,
136 / 161
,
,
,
,
137 / 161
O O
HN H O H O NHBoc N N
O N
O O O O
O NH
O HN O N
N N
O O NH H
O N O O O O N CO2tBu H O
O N OMe O H H
O O N OH N O O
N
H O N O C-09 MeO N H O O , , , ,
138 / 161
,
,
,
,
139 / 161
,
Pg-04,
140 / 161
O NH O O H O 157a, m=0
HN HN N H OAc 157b, m=3 O N O O N O m HO N H O O 157c, m=4
N N HN O HN N N N 157d, m=6
N O H S H O HO H O m 157e, m=8
O HO O COOH 157f, m=12
141 / 161
H O O
N H O H O
HN N O N N O HN HO O H NH N O m
O N O H HO
O H H O O O
N N N H
S N N N O H OHH N O m O
H
N O H
O HN N O O HO H 256 O
O
142 / 161
143 / 161
144 / 161
145 / 161
41. Conjugados de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de que temem a Fórmula Aa-01, Aa-02, Aa-03, Aa- 04, Ba-01, Ba-02, Ba-03, Ba-04, Ba-05, Ba-06, Ba-07, Ba-08, Ba-09, Ba-10, Ba-11, Ba-12, Ba-13, Ba-14, Ba-15, Ba-16, Ca-02, Ca-03, Ca-04, Ca-05, Ca- 06, Ca-07, Ca-08, Ca-09, Ca-10, Ca-11, Ca-12, Da-01, Da-02, Da-03, Da-04, Da-05 ou Da-06, 99, 117, 126, 130, 136, 158a, 158b, 158c, 158d, 158e, 158f, 164, 237a, 237b, 237c, 239a, 239b, 239c, 257, 259, 261, 263, 268, 273, 275, 277, 279, 283, 285, 288, 307, 310, 315, 319 e 326, como mostrados nas estruturas a seguir:
146 / 161
147 / 161
148 / 161
149 / 161
150 / 161
151 / 161
152 / 161
153 / 161
154 / 161
155 / 161
156 / 161 em que m1 e n são como definidos na reivindicação 1; mAb é um anticorpo; A em ligação cruzada significa que ele pode conectar um de dois átomos.
42. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que
157 / 161 compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz dos compostos conjugados como definidos em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 8 a 14, 17 a 37 e um sal farmaceuticamente aceitável, veículo, diluente ou excipiente dessa forma, ou uma combinação dos conjugados dos mesmos, para o tratamento ou prevenção de um câncer, uma doença autoimune ou uma doença infecciosa.
43. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 42, seja na fórmula líquida ou no sólido liofilizado formulado, caracterizada pelo fato de que compreende, em peso: 0,01% a 99% de um ou mais conjugados como definidos em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 8 a 14, 17 a 37, 0,0% a 20,0% de um ou mais polióis; 0,0% a 2,0% de um ou mais tensoativos; 0,0% a 5,0% de um ou mais conservantes; 0,0% a 30% de um ou mais aminoácidos; 0,0% a 5,0% de um ou mais antioxidantes; 0,0% a 0,3% de um ou mais agentes quelantes de metais; 0,0% a 30,0% de um ou mais sais tamponantes para ajustar o pH da formulação para pH 4,5 a 8,5; e 0,0% a 30,0% de um ou mais agentes isotônicos para ajustar a pressão osmótica entre cerca de 250 e 350 mOsm quando reconstituída para administração a um paciente; em que o poliol é selecionado dentre frutose, manose, maltose, lactose, arabinose, xilose, ribose, ramanose, galactose, glicose, sacarose, trealose, sorbose, melezitose, rafinose, manitol, xilitol, eritriol, maltitol, lactitol, eritritol, treitol, sorbitol, glicerol ou L-gluconato e seus sais metálicos; em que o tensoativo é selecionado dentre polissorbato 20, polissorbato 40, polissorbato 65, polissorbato 80, polissorbato 81 ou polissorbato 85, poloxâmero, poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno), polietileno-polipropileno, Triton; dodecilsulfato de sódio (SDS), laurilsulfato de sódio; octil glicosídeo de sódio; lauril-, miristil-, linoleil- ou estearil- sulfobetaína; lauril-, miristil-, linoleil- ou estearil-sarcosina; linoleil-, miristil- ou cetil-betaína; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-,
158 / 161 miristamidopropil-, palmidopropil- ou isostearamidopropil-betaína (lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil- ou isostearamidopropil-dimetilamina; metilcocoil sódico ou metil-oleil-taurato dissódico; dodecilbetaína, óxido de dodecil dimetilamina, cocamidopropil betaína e cocoanfoglicinato; ou etossulfato de isoestearil-etilimidônio; polietilglicol, polipropilglicol e copolímeros de etileno e propilenoglicol; em que o conservante é selecionado dentre álcool benzílico, cloreto de octadecildimetilbenzilamônio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, fenol, álcool butílico e benzílico, alquil parabenos, metil ou propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3- pentanol ou m-cresol; em que o aminoácido é selecionado dentre arginina, cistina, glicina, lisina, histidina, ornitina, isoleucina, leucina, alanina, glicina, ácido glutâmico ou ácido aspártico; em que o antioxidante é selecionado dentre ácido ascórbico, glutationa, cistina e metionina; em que o agente quelante é selecionado dentre EDTA ou EGTA; em que o sal tamponante é selecionado dentre os sais de sódio, potássio, amônio ou trihidroxietilamino do ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glucônico, ácido carbônico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético ou ácido ftálico; Tris ou cloridrato de trometamina, fosfato ou sulfato; arginina, glicina, glicilglicina ou histidina com sais aniônicos de acetato, cloreto, fosfato, sulfato ou succinato; em que o agente de tonicidade é selecionado dentre manitol, sorbitol, acetato de sódio, cloreto de potássio, fosfato de sódio, fosfato de potássio, citrato trissódico ou cloreto de sódio.
44. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 42 ou 43, caracterizada pelo fato de estar contida em um frasco-ampola,
159 / 161 frasco, seringa preenchida ou seringa autoinjetora preenchida, em forma de líquido ou sólido liofilizado.
45. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, 2, 8 a 14, 17 a 37, ou na forma da composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 42 ou 43, caracterizado pelo fato de que tem atividade de morte celular in vivo ou ex vivo.
46. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 42 ou 43, caracterizada pelo fato de ser administrada simultaneamente com um agente quimioterápico, uma terapia de radiação, um agente de imunoterapia, um agente de transtorno autoimune, um agente anti-infeccioso ou os outros conjugados para tratamento sinérgico ou prevenção de um câncer, uma doença autoimune ou uma doença infecciosa.
47. Agentes sinérgicos como definidos na reivindicação 46, caracterizados pelo fato de que são selecionados a partir de um ou vários dos seguintes fármacos: Abatacepte, abemaciclibe, acetato de abiraterona, abraxano, aducanumabe, acetaminofeno/hidrocodona, acalabrutinibe, aducanumabe, adalimumabe, ADXS31-142, ADXS-HER2, dimaleato de afatinibe, aldesleucina, alectinibe, alentuzumabe, alitinibe, Alitretinoína, ado- trastuzumabe entansina, anfetamina/dextroanfetamina, anastrozol, apatinibe, aripiprazol, antraciclinas, aripiprazol, atazanavir, atezolizumabe, atorvastatina, avelumabe, AVXS-101, axicabtagene ciloleucel, axitinibe, belinostato, BCG vivo, bevacizumabe, bexaroteno, blinatumomabe, bortezomibe, bosutinibe, brentuximabe vedotina, brigatinibe, brolucizumabe, budesonida, budesonida/ formoterol, buprenorfina, BYL719 (inibidor de PI3K alfa-específico), cabazitaxel, cabozantinibe, capmatinibe, capecitabina, carfilzomibe, células T geneticamente modificadas para expressar receptores quiméricos de antígenos (CAR-T), celecoxibe, ceritinibe, cetuximabe, chiauranibe, chidamida, ciclosporina, cinacalcet, crizotinibe, cobimetinibe, cosentyx, crizotinibe, tisagenlec leucel, dabigatrana, dabrafenibe, dacarbazina,
160 / 161 daclizumabe, dacomotinibe, daptomicina, daratumumabe, darbepoetina alfa, darunavir, dasatinibe, denileucina diftitox, denosumabe, depakote, dexlansoprazol, dexmetildenidato, dexametasona, sistema de resfriamento digniCap, L-3,4-dihidroxifenil-alanina, dinutuximabe, dornase alfa, doxiciclina, duloxetina, duvelisibe, durvalumabe, elotuzumabe, emicizumabe, entricibina/rilpivirina/tenofovir, fumarato de disoproxila, entricitbina/tenofovir/efavirenz, enoxaparina, ensartinibe, enzalutamida, epitinibe, epoetina alfa, erlotinibe, esomeprazol, eszopiclone, etanercepte, everolimo, exemestano, everolimo, exenatida ER, ezetimibe, ezetimibe/sinvastatina, famitinibe, fenofibrato, filgotinibe, filgrastim, fingolimode, flumatinibe, propionato de fluticasona, fluticasona/salmeterol, fruquintinibe, fulvestranto, gazyva, gefitinibe, glatiramer, acetato de goserelina, GSK2857916 (BCMA-ADC), henatinibe, icotinibe, imatinibe, ibritumomabe tiuxetano, ibrutinibe, icotinibe, idelalisibe, ifosfamida, infliximabe, imiquimode, ImmuCyst, Immuno BCG, iniparibe, insulina aspart, insulina detemir, insulina glargina, insulina lispro, interferon alfa, interferon alfa-1b, interferon alfa-2a, interferon alfa-2b, interferon beta, interferon beta 1a, interferon beta 1b, interferon gama-1a, lapatinibe, ipilimumabe, brometo de ipatrópio/ salbutamol, ixazomibe, Kanuma, lanadelumabe, acetato de lanreotide, lenalidomida, lenaliomide, mesilato de lenvatinibe, letrozol, levotiroxina, levotiroxina, lidocaína, linezolida, liraglutida, lisdexanfetamina, LN-144 (linfócito infiltrante de tumor), lorlatinibe, lucitanibe/delitinibe, memantina, metoxi polietilenoglicol-epoetina beta, metilfenidato, metoprolol, Mekinist, mericitabina/rilpivirina/ tenofovir, modafinil, mometasona, Mycidac-C, ácido micofenólicio, necitumumabe, neratinibe, nilotinibe, niraparibe, nivolumabe, ofatumumabe, obinutuzumabe, ocrelizumabe, olaparibe, olmesartana, olmesartana/hidroclorotiazida, omalizumabe, ésteres etílicos de ácidos graxos ômega-3, oncorina, oseltamivir, osimertinibe, oxicodona, ozanimode, palbociclibe, palivizumabe,
161 / 161 panitumumabe, panobinostate, pazopanibe, pembrolizumabe, anticorpo contra PD-1, anticorpo contra PD-L1, pemetrexede, pertuzumabe, pirfenidona, vacina conjugada pneucocócica, pomalidomida, pregabalina, ProscaVax, propranolol, puquitinibe, piotinibe, quetiapina, rabeprazol, cloreto de rádio 223, raloxifeno, raltegravir, ramucirumabe, ranibizumabe, regorafenibe, ribociclibe, risankizumabe, rituximabe, rivaroxaban, romidepsina, rosuvastatina, fosfato de ruxolitinibe, salbutamol, savolitinibe, semaglutida, Sevelamer, sildenafil, siltuximabe, simotinibe, sipatinib/cipatinibe, siponimode, Sipuleucel-T, sitagliptina, sitagliptina/metformina, solifenacina, solanezumabe, sonidegibe, sorafenibe, sulfatinibe, sunitinibe, tacrolimo, tacrimo, tadalafil, tamoxifeno, tafinlar, talimogene laherparepvec, talazoparibe, telaprevir, talazoparibe, temozolomida, tensirolimo, tenecteplase, tenofovir/entricitabina, fumarato de tenofovir disoproxil, testosterona gel, tezacaftor/ivacaftor, talidomida, teliatinibe, TICE BCG, brometo de tiotrópio, tisagenlec leucel, tocilizumabe, toremifeno, trametinibe, trastuzumabe, trabectedina (ecteinascidina 743), trametinibe, tremelimumabe, trifluridina/tipiracil, tretinoína, upadacitinibe, Uro-BCG, Ustekinumabe, valoctocogene roxaparvovec, valsartana, veliparibe, vandetanibe, vemurafenibe, venetoclax, vismodegibe, volitinibe, vorinostate, ziv- aflibercepte, Zostavax e seus análogos, derivados, sais farmaceuticamente aceitáveis, veículos, diluentes ou excipientes dos mesmos ou uma combinação dos mesmos acima.
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11873281B2 (en) 2012-07-12 2024-01-16 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Conjugates of cell binding molecules with cytotoxic agents
HUE061182T2 (hu) 2012-07-12 2023-05-28 Hangzhou Dac Biotech Co Ltd Sejtkötõ molekulák konjugátumai citotoxikus szerekkel
US10093731B2 (en) 2017-02-24 2018-10-09 Kindred Biosciences, Inc. Anti-IL31 antibodies for veterinary use
US11634485B2 (en) 2019-02-18 2023-04-25 Eli Lilly And Company Therapeutic antibody formulation
EP3862023A1 (en) * 2020-02-05 2021-08-11 Hangzhou DAC Biotech Co, Ltd Conjugates of cell-binding molecules with cytotoxic agents
US11045546B1 (en) 2020-03-30 2021-06-29 Cytodyn Inc. Methods of treating coronavirus infection
GB202011993D0 (en) 2020-07-31 2020-09-16 Adc Therapeutics Sa ANTI-IL 13Ra2 antibodies
GB202105186D0 (en) * 2021-04-12 2021-05-26 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
US11970548B2 (en) * 2021-08-27 2024-04-30 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Nanobody target GCC and uses in chimeric antigen receptor cell therapy
WO2023205669A2 (en) * 2022-04-19 2023-10-26 Purdue Research Foundation Dual and triple hapten conjugates, compositions, processes for making, and methods of treatment therewith
CN115007177B (zh) * 2022-06-17 2023-06-23 四川大学 一种CdSeS幻数纳米团簇及其作为光催化剂的用途
CN116239513B (zh) * 2023-05-05 2023-08-18 天津凯莱英制药有限公司 Mmae关键中间体的制备方法、mmae的制备方法和抗体偶联药物
CN116754760B (zh) * 2023-06-14 2024-01-26 之江实验室 2,4-二硝基苯酚(dnp)与抗体可控断裂偶联的方法
CN117100621B (zh) * 2023-10-24 2024-01-09 山东一飞环保材料科技有限公司 一种抗菌纳米纤维干面膜及其制备方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2991975C (en) * 2015-08-10 2021-04-06 Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd. Novel linkers and their uses in specific conjugation of drugs to a biological molecule
CA3058712C (en) * 2017-04-06 2023-04-18 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd Conjugation of a cytotoxic drug with bis-linkage
JP7429987B2 (ja) * 2018-07-05 2024-02-09 ハンジョウ ディーエーシー バイオテック シーオー．，エルティディ． 架橋ピロロベンゾジアゼピン二量体（ｐｂｄ）誘導体及びその共役体

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