BR112021005387A2

BR112021005387A2 - aplicação de chiglitazar e compostos relacionados aos mesmos

Info

Publication number: BR112021005387A2
Application number: BR112021005387-5A
Authority: BR
Inventors: Xianping LU; Zhiqiang Ning; Desi Pan; Yidi Kong
Original assignee: Shenzhen Chipscreen Biosciences Co., Ltd.
Priority date: 2018-09-25
Filing date: 2019-09-20
Publication date: 2021-06-22
Also published as: WO2020063463A1; AU2019349124A1; CN110934866A; AU2019349124B2; EP3858346A1; CA3113427A1; JP7132434B2; RU2769446C1; KR20210065971A; JP2022503785A; US20210386705A1; EP3858346A4; JP7132434B6; TW202023541A; TWI765181B; CN110934866B; MX2021003368A; KR102661138B1

Abstract

APLICAÇÃO DE CHIGLITAZAR E COMPOSTOS RELACIONADOS AOS MESMOS. Trata-se de uma aplicação de chiglitazar e seus compostos relacionados; modelos in vitro e modelos animais ilustram que o chiglitazar e seus compostos relacionados inibem a ativação de fibroblasto, produção de matriz, ativação de monócito e atividade quimiotática in vitro e reduzem a atividade inflamatória e a área de fibrose de tecido em modelos animais de fibrose do fígado. Em comparação com compostos semelhantes conhecidos, o chiglitazar de sódio mostra características de atividade mais significativas e diferentes, e tem melhor potencial de aplicação para tratar doença fibrótica.

Description

“APLICAÇÃO DE CHIGLITAZAR E COMPOSTOS RELACIONADOS AOS MESMOS”

[0001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Chinês nº 201811114946.5, depositado na Administração Nacional de Propriedade Intelectual da China em 25 de setembro de 2018, intitulado “APPLICATION OF CHIGLITAZAR AND RELATED COMPOUNDS THEREOF”, que está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

CAMPO

[0002] A presente revelação se refere ao campo da tecnologia da medicina e, especificamente, se refere à aplicação de chiglitazar e seus compostos relacionados.

ANTECEDENTES

[0003] O chiglitazar é um produto ativo de chiglitazar de sódio. O chiglitazar de sódio, um composto inovador com direito de propriedade intelectual independente na China, se destina ao tratamento de diabetes tipo II. Confirmou-se através de modelos de teste ex vivo e in vivo que o chiglitazar de sódio tem efeitos farmacológicos de aumento da sensibilidade à insulina, redução da glicose no sangue e aprimoramento de outras síndromes metabólicas. As fórmulas estruturais dos dois são como a seguir: COOH COONa

N N O O NH NH O O

F F Chiglitazar Chiglitazar de sódio

[0004] A indicação atualmente relatada de chiglitazar é diabetes tipo II, mas não há relatos relevantes de doenças fibróticas.

[0005] A fibrose é um processo patológico que pode ocorrer em uma variedade de tecidos e órgãos no corpo. Ela apresenta características patológicas do aumento de tecido conjuntivo fibroso e da diminuição de células parenquimais nos tecidos e órgãos. A progressão contínua da fibrose pode levar à destruição da estrutura do órgão, hipofunção e até mesmo falência de órgãos, que pertence ao tipo patológico com risco fatal. Os órgãos do corpo são compostos de parênquima e interstício. O componente parenquimal se refere à estrutura principal e células funcionais de um órgão, enquanto o componente intersticial é composto de células intersticiais e matriz extracelular, que mantém principalmente a estrutura morfológica e a função normal dos tecidos e órgãos.

[0006] Os danos às células dos tecidos causados por fatores exógenos ou endógenos pode induzir resposta inflamatória local e processo de reparo. No caso de danos menores, o processo de reparo inclui proliferação limitada de células funcionais e o suplemento do interstício, enquanto no caso de danos maiores ou da persistência de fatores danosos, o processo de reparo também será induzido, e a matriz extracelular produzida pela ativação de células intersticiais ocuparia as posições das células funcionais parenquimais, para, desse modo, alterar a estrutura do tecido e reduzir as funções fisiológicas normais. Portanto, a fibrose é essencialmente uma resposta de reparo normal aos danos do tecido para proteger a integridade relativa dos tecidos e órgãos. No entanto, a fibrose excessiva pode alterar a morfologia normal dos tecidos e órgãos e enfraquecer suas funções.

[0007] Quase todos os principais órgãos do corpo humano podem desenvolver lesões fibróticas, incluindo o pulmão (como pneumonia intersticial idiopática etc.), coração (como cardiomiopatia hipertrófica etc.), fígado (como fígado gorduroso não alcoólico e cirrose etc.), rim (como nefrite crônica etc.), medula óssea (como mielofibrose etc.), pele (como esclerose sistêmica etc.) e outros tecidos e órgãos podem estar envolvidos.

[0008] As lesões fibróticas são um processo patológico de múltiplos fatores e múltiplas ligações, incluindo pelo menos danos às células parenquimais dos tecidos, resposta inflamatória, ativação de célula intersticial e formação de matriz. Os danos às células parenquimais são causados por fatores exógenos, como danos por fármacos, e por fatores endógenos, como danos autoimunes e toxicidade metabólica (por exemplo, lipotoxicidade). A resposta inflamatória normal do corpo geralmente está sob controle e pode ser encerrada por fatores de retroalimentação negativa após a eliminação de fatores de ativação imunológica (por exemplo, infecção exógena e danos às células dos tecidos). No entanto, a inflamação crônica pode se desenvolver no caso da persistência de fatores estimulantes (por exemplo, inflamação crônica e autoantígenos etc.) ou imunodeficiência. As células danificadas e as células imunológicas produzem vários fatores (por exemplo, fator de crescimento de transformação TGFβ ou fator de crescimento derivado de plaquetas PDGFα/β etc.) para estimular a ativação e a proliferação de células intersticiais e a produção de matriz extracelular como colágeno. A persistência dos estímulos acima causa acúmulo de matriz e fibrose do tecido. Portanto, o processo de intervenção de doenças fibróticas requer a participação de múltiplas ligações. No tratamento clínico atual, a fibrose ainda é uma progressão irreversível da doença. Os tratamentos convencionais incluem corticosteroides e outros fármacos anti-inflamatórios, fármacos quimioterápicos e fármacos antirreceptores do fator de crescimento derivado de plaquetas, que em geral aprimoram apenas parcialmente os sintomas dos pacientes. O objetivo principal de tais tratamentos para fibrose ainda é retardar a progressão da doença e manter as funções fisiológicas normais e, para os pacientes em estágios avançados, o transplante de órgão é a única opção de resgate. Portanto, existe uma demanda clínica muito grande de tratamento clínico.

SUMÁRIO

[0009] Em vista disso, o propósito da presente revelação é fornecer uma série de aplicações de chiglitazar e seus compostos relacionados no campo das doenças fibróticas.

[0010] Na presente revelação, o chiglitazar e seus compostos relacionados incluem chiglitazar ou seus estereoisômeros, isômeros geométricos, tautômeros, solvatos, metabólitos, formas cristalinas, formas amorfas ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

[0011] O sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é chiglitazar de sódio ou chiglitazar de potássio, e suas fórmulas estruturais são como a seguir:

COONa COOK

N O N O NH NH O O

F F Chiglitazar de sódio Chiglitazar de potássio

[0012] A ativação e proliferação de fibroblastos é um processo patológico importante na progressão das doenças fibróticas. A inibição da proliferação de fibroblastos tem um potencial para tratar doenças fibróticas. A presente revelação usou células estreladas hepáticas humanas primárias e fibroblastos dérmicos humanos primários como objetos de teste para detectar os efeitos inibidores in vitro de chiglitazar de sódio e os compostos de referência em ambas as células. Os resultados mostraram que o chiglitazar de sódio teve atividade inibidora in vitro na proliferação de fibroblastos humanos derivados do fígado e da pele em comparação com o composto de referência, pioglitazona, que não mostrou atividade inibidora óbvia. O chiglitazar de sódio inibe especificamente a proliferação de fibroblastos in vitro, que é significativamente distinta de outros agonistas de PPAR conhecidos como pioglitazona. Com base nisso, a presente revelação propõe o uso de chiglitazar e seus compostos relacionados na fabricação de inibidores de fibroblasto.

[0013] O fator de crescimento de transformação β (TGF-β) pode ativar os fibroblastos e induzir a expressão de genes relacionados a matriz extracelular, que desempenha um papel importante no processo patológico das doenças fibróticas. O TGF-β1 estimula a ativação de fibroblastos e induz a expressão de matriz, incluindo a actina de músculo liso α (α-SMA) e fator de crescimento de tecido conjuntivo (CTGF), ao interagir com receptores de TGF-β. Na presente revelação, as células estreladas hepáticas humanas primárias foram cultivadas em um meio de cultura contendo TGF-β1 e chiglitazar de sódio ou um composto de referência e, então, os níveis de expressão genética da actina de músculo liso α (α-SMA) e do fator de crescimento de tecido conjuntivo (CTGF) foram detectados. Os resultados mostram que, com a estimulação do fator de crescimento de transformação TGFβ, a expressão de genes relacionados a matriz nos fibroblastos foi significativamente aumentada, que foi significativamente inibido pelo chiglitazar de sódio. Para a expressão de actina de músculo liso α, o agonista duplo PPARα/δ GFT505 teve um certo efeito inibidor, mas ainda não é tão bom quanto o chiglitazar de sódio, enquanto o agonista duplo PPARγ/α pioglitazona não teve efeito. Para a expressão do fator de crescimento de tecido conjuntivo, apenas o chiglitazar de sódio teve um efeito inibidor significativo e dependente de dose. Isso demonstrou que o chiglitazar de sódio teve um efeito inibidor melhor e inesperado na proliferação de fibroblastos e expressão genética relacionada a fibrose do que outros agonistas de PPAR como pioglitazona e GFT505. Com base nisso, a presente revelação propõe o uso de chiglitazar e seus compostos relacionados na fabricação de um inibidor de ativação mediada por TGFβ de matriz extracelular de fibroblasto.

[0014] Os monócitos estão envolvidos na inflamação local induzida por lesão celular. Eles são induzidos por quimiocinas liberadas pela lesão para alcançar o local lesionado, e são ativados em macrófagos que, por sua vez, produzem vários fatores inflamatórios (como o fator de necrose tumoral TNFα e proteína quimioatraente de monócitos MCP-1 etc.) para iniciar a resposta inflamatória subsequente, e a resposta inflamatória persistente induz ativação de fibroblasto e produção de matriz extracelular, o que é um processo patológico importante das doenças fibróticas. A inibição desse processo tem usos terapêuticos para as doenças fibróticas. A presente revelação considerou linhagem de células mononucleares de leucemia monocítica aguda humana (THP-1) como o objeto de teste, as quais foram ativadas por uma certa concentração de ésteres de forbol (Forbol-12-miristato-13-acetato, PMA) e diferenciadas em macrófagos. Através desse modelo celular, os efeitos ativadores de chiglitazar de sódio e outros compostos na expressão de fatores inflamatórios relacionados a THP-1 foram detectados. Os resultados mostram que tanto o chiglitazar de sódio quanto o composto de controle GFT505 podem inibir significativamente a ativação de monócito mediada por ésteres de forbol e a expressão genética relacionada, mas o efeito do composto de controle GFT505 foi menor do que aquele do chiglitazar de sódio. Com base nisso, a presente revelação propõe o uso de chiglitazar e seus compostos relacionados na fabricação de um inibidor de fator inflamatório.

[0015] A quimiotaxia de monócitos na circulação sanguínea induzida por quimiocinas ao local lesionado, para, desse modo, iniciar e participar da resposta inflamatória subsequente, é um dos processos patológicos importantes de fibrose de tecido. A presente revelação simulou esse processo com o uso da tecnologia Transpoço, e testou o efeito de chiglitazar de sódio ou compostos de controle na quimiotaxia induzida por quimiocinas de linhagem celular monocítica THP-1. Os resultados mostraram que o chiglitazar de sódio inibiu significativamente a atividade de migração (transpoço) do monócito THP-1 induzida por quimiocinas de monócito em comparação com os compostos de controle. A pioglitazona teve atividade inibidora parcial, enquanto os outros dois compostos de controle não mostraram atividade inibidora óbvia. Diferentes agonistas de PPAR mostram diferentes características de atividade, e o chiglitazar de sódio tem uma atividade inibidora mais forte. Com base nisso, a presente revelação propõe o uso de chiglitazar e seus compostos relacionados na fabricação de um inibidor de quimiotaxia de monócito.

[0016] Os fatores de lesão endógenos e exógenos (como tóxicos químicos) causam a morte das células do tecido e induzem resposta inflamatória e reparo de tecido, o que é uma patologia típica das doenças fibróticas. O tetracloreto de carbono (CCl4) geralmente é usado como um fator de lesão química para simular a fibrose do fígado, e também é amplamente usado em modelo de pesquisa de fibrose do fígado de roedores. A presente revelação usou esse modelo para testar o efeito inibidor do chiglitazar de sódio em diferentes doses na fibrose do fígado. Os resultados mostram que no modelo de camundongo, o tetracloreto de carbono (CCl4) pode induzir a morte de células parenquimais do fígado, infiltração inflamatória e fibrose de tecido, o que e consistente com o fenômeno patológico clínico. O chiglitazar de sódio em doses alta, média e baixa pode inibir parcialmente a atividade inflamatória e o grau de fibrose do tecido do fígado e, assim, tem atividade farmacodinâmica para o tratamento de doenças fibróticas. Com base nisso e nos resultados experimentais supracitados, a presente revelação propõe o uso de chiglitazar e seus compostos relacionados na fabricação de um medicamento para tratar doenças fibróticas.

[0017] Com base em uma série de resultados experimentais da presente revelação, pode-se concluir que o chiglitazar e seus compostos relacionados têm efeitos claros no tratamento de doenças fibróticas, especialmente a doença fibrótica causada por danos às células do tecido que resultam de inflamação crônica. As doenças fibróticas causadas por danos às células do tecido que resultam de inflamação crônica incluem, mas não estão limitadas a esclerose sistêmica, nefrite crônica e fibrose renal, mielofibrose, fibrose pulmonar idiopática e fígado gorduroso não alcoólico.

[0018] É possível saber, a partir das soluções técnicas acima, que através dos modelos in vitro e modelos animais, a presente revelação ilustrou que o chiglitazar e seus compostos relacionados inibiram a ativação de fibroblasto, produção de matriz, ativação de monócito e atividade quimiotática in vitro, e reduziu a atividade inflamatória e área de fibrose de tecido em modelos animais de fibrose do fígado. Em comparação com compostos semelhantes conhecidos, o chiglitazar de sódio mostrou características de atividade mais significativas e diferentes, e teve um potencial de aplicação melhor para tratar as doenças fibróticas. Breve Descrição dos Desenhos

[0019] A FIG. 1 mostra a curva de inibição de crescimento in vitro de células estreladas hepáticas humanas mediadas pelo chiglitazar de sódio (ensaio de EdU);

[0020] A FIG. 2 mostra a curva de inibição de crescimento in vitro de células estreladas hepáticas humanas mediadas pelo chiglitazar de sódio (ensaio de MTT);

[0021] A FIG. 3 mostra a curva de inibição de crescimento in vitro de fibroblastos dérmicos humanos mediados pelo chiglitazar de sódio (ensaio de MTT);

[0022] A FIG. 4 mostra os efeitos do chiglitazar de sódio em várias concentrações e dos compostos de controle GFT505 e pioglitazona na expressão de genes alvo em fibroblastos ativados por TGFβ;

[0023] A FIG. 5 mostra os efeitos do chiglitazar de sódio e do composto de controle GFT505 na expressão de genes alvo em monócitos ativados por ésteres de forbol, em que a barra em cada grupo da esquerda para a direita é o controle de solvente (sulfóxido de dimetila), chiglitazar de sódio (3 µmol/l) e GFT505 (3 µmol/l), respectivamente;

[0024] A FIG. 6 mostra os efeitos do chiglitazar de sódio e dos compostos de controle na quimiotaxia e migração de células THP-1 (mostradas como células coradas com cristal violeta), em que A é o controle de solvente (sulfóxido de dimetila), B é o controle de solvente + MCP-1 (10 ng/ml), C é chiglitazar de sódio (3 µmol/l) + MCP-1 (10 ng/ml), D é GFT505 (3 µmol/l) + MCP-1 (10 ng/ml), E é pioglitazona (3 µmol/l) + MCP-1 (10 ng/ml), e F é rosiglitazona (3 µmol/l) + MCP-1 (10 ng/ml), respectivamente;

[0025] A FIG. 7 mostra as imagens microscópicas de seções patológicas de tecido do fígado coradas com H&E;

[0026] A FIG. 8 mostra as pontuações baseadas em inflamação de seções patológicas de tecido do fígado coradas com H&E;

[0027] A FIG. 9 mostra as imagens microscópicas de seções patológicas de tecido do fígado coradas com Vermelho Picrosirius; e

[0028] A FIG. 10 mostra as pontuações de fibrose de seções patológicas de tecido do fígado coradas com Picrosirius Red.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0029] A presente revelação revela a aplicação de chiglitazar e seus compostos relacionados. Os versados na técnica podem aprender com o conteúdo da presente revelação e aprimorar adequadamente os parâmetros de processamento. Deve-se indicar particularmente que, todas as mudanças e substituições semelhantes são óbvias para os versados na técnica, as quais são consideradas como incluídas na presente revelação. As aplicações da presente revelação foram reveladas por modalidades preferenciais e, aparentemente, os versados na técnica podem fazer mudanças ou combinações e modificações adequadas das aplicações conforme descritas no presente documento para alcançar e aplicar a tecnologia da presente revelação sem se afastar do conteúdo, espírito e escopo da mesma.

[0030] O seguinte fornece uma descrição adicional da aplicação do chiglitazar e seus compostos relacionados fornecidos pela presente revelação. Exemplo 1: Ativação de receptor PPAR humano pelo chiglitazar de sódio

[0031] O modelo de gene repórter de PPAR compreende três subtipos de plasmídeos de expressão, plasmídeo de expressão de RXR, plasmídeo com gene repórter de luciferase e plasmídeo de expressão de GFP como uma referência externa. As células L-02 de linhagem celular de hepatócito humano foram semeadas em placas de 96 poços à densidade de 15.000 células/poço com cerca de 50 % de taxa de plaqueamento, seguida por cultura por 24 horas a 37 °C. As células em cada poço foram transfectadas com o plasmídeo de expressão correspondente (plasmídeo de gene repórter de luciferase de pHD + plasmídeo de expressão de PPARα + plasmídeo de expressão de GFP para detecção de atividade de PPARα; plasmídeo de gene repórter de luciferase de pACOX + plasmídeo de expressão de PPARγ + plasmídeo de expressão de RXR + plasmídeo de expressão de GFP para detecção de atividade de PPARγ; e plasmídeo de gene repórter de luciferase de pGL3-PPRE + plasmídeo de expressão de PPARδ + plasmídeo de expressão de RXR + plasmídeo de expressão de GFP para detecção de atividade de PPARδ) com o uso de FuGENE 6 da Roche.

[0032] Após a transfecção por 48 horas, várias concentrações dos fármacos a serem testados foram adicionadas às células cultivadas com DMSO como o controle de solvente, e três poços replicados foram estabelecidos para cada grupo de tratamento.

[0033] Após adicionar fármacos por 24 horas, os meios de cultura celular foram descartados e removidos completamente colocando-se as placas de 96 poços voltadas para baixo em papel absorvente e, então, 80 µl de lisados celulares (Promega, E153A) foram adicionados a cada poço. Permitiu-se que as células permanecessem por 5 minutos à temperatura ambiente antes de usar uma pipeta para misturar bem. 60 µl de lisados celulares de cada poço foram transferidos para as placas brancas para detecção (Corning, 3693).

[0034] A intensidade de fluorescência (em comprimento de onda de 485-527 nm) de proteína fluorescente verde (GFP) em cada poço foi primeiramente detectada como um padrão interno por um detector de fluorescência e, então, 30 µl de substratos de luciferase (Promega, E151A) foram adicionados a cada poço. Após agitar ligeiramente para misturar bem, os valores de absorbância a 562 nm de comprimento de onda foram detectados. A intensidade relativa de ativação de gene repórter foi obtida pela razão do sinal de detecção de fluorescência dos fármacos a serem testados para aqueles do controle de solvente, com ambos os sinais normalizados para o sinal GFP padrão interno. A meia ativação máxima (AC50) dos fármacos a serem testados foi calculada com a atividade em várias concentrações (mostradas na Tabela 1). Tabela 1. Atividade de ativação do chiglitazar de sódio em três subtipos de receptores PPAR no modelo de gene repórter. Concentração de meia ativação PPARα PPARγ PPARδ máxima de gene repórter AC50（µM） chiglitazar de sódio 1,096 0,091 0,708

[0035] O resultado mostrou que o chiglitazar de sódio teve atividade de ativação em todos os três subtipos de PPAR. Exemplo 2: Inibição de proliferação de fibroblastos pelo chiglitazar de sódio

[0036] As células estreladas hepáticas humanas primárias (HSC) adquiridas junto a Sciencell Research Laboratories, Inc. foram semeadas em placas de 96 poços com meios de crescimento completo (Meio de Célula Estrelada) por 24 horas, seguido por cultura durante a noite em meios de cultura livres de soro e fatores de crescimento e, então, os meios de cultura foram substituídos por meios frescos contendo fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-BB) e os compostos a serem testados (chiglitazar de sódio ou o composto de referência agonista duplo PPARγ/α pioglitazona adquirido junto a Selleck Chemicals LLC) em várias concentrações, e as células foram cultivadas por 24 horas. Quando as células foram tratadas com os compostos pelas últimas 17 horas, adicionou-se EdU (5-etinil-2’-desoxiuridina) às células. Finalmente, os meios de cultura foram removidos,

e as células foram fixadas com formaldeído. A quantidade da EdU incorporada no DNA das células foi quantificada ensaio fluorescente Click-it EdU de acordo com as instruções do fabricante (Beyotime). Os resultados foram mostrados como a porcentagem de células positivas para EdU no número total de células usando o valor médio de três réplicas biológicas. A inibição de proliferação celular pelos compostos foi determinada comparando o valor incorporado de EdU do grupo de controle (FIG. 1).

[0037] As células estreladas hepáticas humanas primárias ou fibroblastos dérmicos humanos primários (HDF), ambos adquiridos junto a Sciencell, foram semeados em placas de 96 poços com meios de crescimento completo (Meio de Célula Estrelada ou Meio de Célula de Fibroblasto) por 24 horas, seguido por cultura durante a noite nos meios de cultura livres de soro e fatores de crescimento e, então, os meios de cultura foram substituídos por meio fresco contendo fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-BB) e os compostos a serem testados em várias concentrações, e as células foram cultivadas por mais 72 horas. A medição foi realizada usando um kit de ensaio de MTT convencional (Promega). Os resultados foram mostrados como a absorbância relativa (OD490) para o substrato de MTT usando o valor médio de três réplicas biológicas. A inibição de proliferação celular pelos compostos foi determinada comparando o valor de absorbância do grupo de controle (FIGs. 2, 3).

[0038] Pode-se observar a partir das FIGs. 1-3 que o chiglitazar de sódio teve atividade inibidora na proliferação de fibroblastos humanos derivados do fígado e da pele in vitro em comparação com o composto de referência pioglitazona, que não mostrou atividade inibidora óbvia. O chiglitazar de sódio especificamente inibe a proliferação de fibroblastos in vitro, que é significativamente distinta de outros agonistas de PPAR conhecidos como pioglitazona. Exemplo 3: Efeito do chiglitazar de sódio e dos compostos de controle na expressão da ativação mediada por fator de crescimento de transformação TGFβ de genes de fibroblasto

[0039] As células estreladas hepáticas primárias humanas foram semeadas em placas de 6 poços com meios de crescimento completo (Meio de Célula Estrelada) por 24 horas e, então, os meios de cultura foram substituídos por meios frescos (livres de soro e fatores de crescimento) contendo TGF-β1 e o composto a ser testado (chiglitazar de sódio) ou o composto de referência agonista duplo PPARγ/α pioglitazona ou agonista duplo PPARα/δ GFT505 (ambos adquiridos junto a Selleck), e as células foram cultivadas por 24 horas. O total de RNAs das amostras foi extraído, e a reação de transcrição reversa foi realizada. Em seguida, um kit de amplificação de PCR convencional (FastStart Universal SYBR@ Green Master (ROX), Roche) foi usado para detecção adicional, em que os iniciadores de PCR foram projetados com referência à sequência de mRNA padrão de NCBI dos genes alvo (Tabela 2). A detecção e reação de PCR foram realizadas no instrumento de PCR quantitativa em tempo real ABI StepOnePlus. Tabela 2. Iniciadores de gene alvo usados para detecção (incluindo gene de referência interna) Sequência de Nome do iniciador iniciador (5’ a 3’) iniciador direto de actina de músculo CGTGGGTGACGAAGCAC liso α (α-SMA) AG iniciador reverso de actina de músculo GGTGGGATGCTCTTCAG liso α (α-SMA) GG

Sequência de Nome do iniciador iniciador (5’ a 3’) Iniciador direto de fator de crescimento GGAGTGGGTGTGTGACG de tecido conjuntivo (CTGF) AG Iniciador reverso de fator de crescimento GACCAGGCAGTTGGCTC de tecido conjuntivo (CTGF) TAA

CGGGAAATCGTGCGTGA iniciador direto de β-actina (ACTB)

C

GGAAGGAAGGCTGGAAG iniciador reverso de β-actina (ACTB)

AG Iniciador direto de proteína GATCTCAGTGCAGAGGC quimioatraente de monócito 1 (MCP-1) TCG Iniciador reverso de proteína TTTGCTTGTCCAGGTGG quimioatraente de monócito 1 (MCP-1) TCC Iniciador direto de fator α de necrose TTCTCGAACCCCGAGTG tumoral (TNFα) ACA Iniciador reverso de fator α de necrose TCTCTCAGCTCCACGCC tumoral (TNFα) ATT

[0040] A quantidade relativa de transcritos foi calculada pelo "Delta-Delta CT method" (Livak et al. Methods 2001), e usando ACTB como o gene de manutenção para normalização e os dados médios de células estreladas hepáticas humanas não tratadas como um controle de referência, as dobras de mudança relativa de expressão genética foram obtidas (FIG. 4).

[0041] Os resultados mostrados na FIG. 4 indicaram que, com a estimulação do fator de crescimento de transformação TGFβ, a expressão de genes relacionados a matriz nos fibroblastos foi significativamente aumentada, que foi significativamente inibido pelo chiglitazar de sódio. Para a expressão de actina de músculo liso α, o agonista duplo PPARα/δ GFT505 teve um certo efeito inibidor, enquanto o agonista duplo PPARγ/α pioglitazona não teve efeito. Para a expressão do fator de crescimento de tecido conjuntivo, apenas o chiglitazar de sódio teve um efeito inibidor significativo e dependente de dose. Isso demonstrou que o chiglitazar de sódio teve um efeito inibidor melhor e inesperado na proliferação de fibroblastos e expressão genética relacionada a fibrose do que outros agonistas de PPAR como pioglitazona e GFT505. Exemplo 4: Efeito do chiglitazar de sódio e os compostos de controle na expressão de fatores inflamatórios relacionados na ativação mediada por ésteres de forbol de linhagem celular monocítica THP-1

[0042] As células da linhagem de células mononucleares de leucemia monocítica aguda humana (THP-1) foram ativadas por uma certa concentração de ésteres de forbol (Forbol-12-miristato-13-acetato, PMA) e diferenciadas em macrófagos. Através desse modelo celular, os efeitos ativadores de chiglitazar de sódio e outros compostos na expressão de fatores inflamatórios relacionados a THP-1 foram detectados.

[0043] As células THP-1 foram semeadas em placas de 6 poços com meios de crescimento completo por 24 horas e, então, os meios de cultura foram substituídos por meios frescos contendo PMA e o composto a ser testado (chiglitazar de sódio) ou o composto de referência GFT505 (agonista duplo PPARα/δ), e as células foram cultivadas por 6 horas. O total de RNAs das amostras foi extraído, e os modelos de cDNA foram sintetizados pela reação de transcrição reversa (Kit de Síntese de cDNA de Primeira Fita do Transcritor, Roche). Em seguida, um kit de amplificação de PCR convencional (FastStart Universal SYBR@ Green Master (ROX), Roche) foi usado para detecção de expressão genética semiquantitativa no instrumento de PCR quantitativa em tempo real ABI StepOnePlus. Os iniciadores de gene alvo foram mostrados na Tabela 2.

[0044] A mudança de expressão relativa dos genes alvo foi obtida usando o gene de β-actina de referência interna (ACTB)

como o padrão para normalização, em comparação com as amostras celulares não tratadas, e as dobras de mudança de expressão relativa foram calculadas (FIG. 5).

[0045] Os resultados mostrados na FIG. 5 indicaram que tanto o chiglitazar de sódio quanto o composto de controle GFT505 podem inibir significativamente a ativação de monócito mediada por ésteres de forbol e expressão genética relacionada, mas o efeito do composto de controle GFT505 não foi tão bom quanto o chiglitazar de sódio. Exemplo 5: Efeito de chiglitazar de sódio e os compostos de controle na quimiotaxia induzida por quimiocinas de linhagem celular monocítica THP-1

[0046] Em um modelo in vitro, a migração da linhagem celular monocítica THP-1 induzida por uma certa concentração de quimiocinas (como proteína quimiotática de monócitos 1, MCP-1) e, consequentemente, tal processo in vivo foi simulado. A tecnologia Transpoço, de acordo com as instruções do fabricante junto à Corning Inc., é considerada como um tipo de filtro de membrana de policarbonato, bem como um suporte permeável. A membrana de policarbonato divide uma câmara de cultura em superior e inferior, onde os componentes do meio de cultura na câmara inferior podem afetar o crescimento, diferenciação e movimento das células na câmara superior. Finalmente, a capacidade de migração da célula pode ser refletida pela coloração e contagem das células na câmara inferior.

[0047] Quando cultivadas no estágio de fase log, as células THP-1 foram ressuspensas, tiveram ajuste de concentração e foram semeadas em placas de 24 poços, seguido por preaquecimento com os meios de cultura contendo o composto a ser testado (chiglitazar de sódio) ou o composto de referência GFT505,

pioglitazona, ou agonista único PPARγ rosiglitazona (todos adquiridos junto a Selleck) por 24 horas. Transpoços foram usados de acordo com as instruções do fabricante. Os meios de cultura contendo quimiocina MCP-1 foram adicionados à câmara inferior (isto é, o fundo das placas de 24 poços), e a suspensão celular foi adicionada à câmara superior e cultivada por 4 horas. Posteriormente, as células cultivadas na superfície do "teto" da membrana de policarbonato foram fixadas e coradas com solução de cristal violeta (FIG. 6) e, então, o número de células na câmara inferior foi contado (Tabela 3). Tabela 3 Contagem celular na câmara inferior em experimento de transpoço Proteína quimioatraente de monócitos (MCP-1, 10 ng/ml) Controle de solvente Concentração Chiglitazar GFT505 (sulfóxido de Pioglitazona Rosiglitazona de composto de sódio (3 µmol dimetila, (3 µmol/l) (3 µmol/l) (µmol/l) (3 µmol/l) /l) concentração final a 0,1 %) Concentração 1.289 24.858 10.630 28.443 17.529 21.804 celular na 1.391 27.504 9.760 28.511 17.416 21.883 câmara inferior 1.368 26.113 9.646 27.572 17.597 20.752 (células/ml) Valor médio 1.349 26.158 10.012 28.175 17.514 21.480 Taxa de - 100 33,12 102,55 61,80 76,96 migração (%)

[0048] Pode-se observar na Tabela 3 e na FIG. 6 que o chiglitazar de sódio inibiu significativamente a atividade de migração de monócito THP-1s induzida pela quimiocina de monócito em comparação com os compostos de controle (transpoço). A pioglitazona teve atividade inibidora parcial, que obviamente não foi tão boa quanto o chiglitazar de sódio, enquanto os outros dois compostos de controle não mostraram atividade inibidora óbvia. Diferentes agonistas de PPAR mostram diferentes características de atividade, e o chiglitazar de sódio tem uma atividade inibidora mais forte.

Exemplo 6: Efeito inibidor do chiglitazar de sódio em modelo de camundongo de fibrose do fígado induzida por tetracloreto de carbono

[0049] Em camundongos BALB/c foram injetados intraperitonealmente 25 % de CCl4 (4 ml/kg de peso corporal) duas vezes por semana, o que pode causar danos ao fígado e fibrose crônica do fígado em 3 semanas. Os modelos animais foram receberam administração por 6 semanas continuamente, e ao grupo de controle não modelo foi administrado o azeite de controle de solvente pelo mesmo período. Os modelos animais foram divididos aleatoriamente em grupos a partir da terceira semana. Ao grupo de controle foi administrado solvente (0,2 % de metilcelulose de sódio) intragastricamente a partir da quarta semana, e o chiglitazar de sódio à noite, aos grupos de dose média e baixa foram administrados 40, 20, e 10 mg/kg de peso corporal do ingrediente ativo chiglitazar de sódio de maneira intragástrica, respectivamente (Tabela 4), até o fim do experimento na 7a semana. Após os animais experimentais serem sacrificados, as amostras de plasma e tecido do fígado foram coletadas para medir o teor de plasma transaminase, peso do tecido do fígado e a razão de peso do fígado para o peso corporal, respectivamente. Os tecidos do fígado foram fixados para realizar seções patológicas e, então, a coloração com hematoxilina-eosina (coloração H&E) e a coloração com vermelho Picrosirius foram conduzidas, respectivamente. O primeiro foi usado para avaliar a inflamação e danos celulares, e o último foi usado para avaliar a fibrose do tecido.

Tabela 4 Agrupamento de teste e tratamento com fármaco Número de Grupo animais G1: Grupo de controle em branco (azeite + 0,2 % 10 de metilcelulose de sódio) G2: Controle de modelo (CCl4+0,2 % de 10 metilcelulose de sódio) G3: CCl4+ chiglitazar de sódio em baixa dose 10 (10 mg/kg de peso corporal) G4: CCl4+ chiglitazar de sódio em média dose 10 (20 mg/kg de peso corporal) G5: CCl4+ chiglitazar de sódio em alta dose 10 (40 mg/kg de peso corporal)

[0050] As pontuações com base na inflamação dos tecidos do fígado foram obtidas por observação microscópica, e a pontuação das seções patológicas coradas com hematoxilina e eosina (coloração H&E). O teste de único cego e a pontuação foram conduzidos por patologistas, usando o sistema de pontuação Metavir para a atividade inflamatória, compreendendo quatro indicadores independentes, ou seja, inflamação portal, inflamação lobular, necrose fragmentada e necrose em ponte (FIG. 8).

[0051] As seções do tecido do fígado foram coradas com Vermelho Picrosirius para observação morfológica (FIG. 9), e medidas usando um sistema de análise de imagem digital semiautomático e o software de medição (OsteoMetrics, Inc.). O patologista testou em único cego e desenhou à mão as seções inteiras e, então, mediu a área de fibrose nas seções inteiras em linhas retas. O software calculou automaticamente a área total da medição. % de área de fibrose = área de fibrose total ÷ área de seção de tecido do fígado total*100 (FIG. 10).

[0052] Pode-se observar a partir dos resultados nas FIGs. 7-10 que, no modelo de camundongo, o tetracloreto de carbono (CCl4) pode induzir a morte de células parenquimais do fígado, infiltração inflamatória e fibrose de tecido. O chiglitazar de sódio em doses alta, média e baixa pode inibir parcialmente a atividade inflamatória e o grau de fibrose dos tecidos do fígado e, assim, teve atividade farmacodinâmica de tratamento de doenças fibróticas.

[0053] O anterior representa modalidades preferenciais da presente revelação, no entanto, deve-se observar que alguns aprimoramentos e modificações podem ser feitos às mesmas por aqueles de habilidade comum na técnica sem se afastar dos princípios da presente revelação, e esses aprimoramentos e modificações também devem ser considerados como estando dentro do escopo de proteção da presente revelação.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de chiglitazar ou seus estereoisômeros, isômeros geométricos, tautômeros, solvatos, metabólitos, formas cristalinas, formas amorfas ou sais farmaceuticamente aceitáveis caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para tratar doenças fibróticas.

2. Uso de chiglitazar ou seus estereoisômeros, isômeros geométricos, tautômeros, solvatos, metabólitos, formas cristalinas, formas amorfas, ou sais farmaceuticamente aceitáveis caracterizado por ser na fabricação de um inibidor de fibroblasto.

3. Uso de chiglitazar ou seus estereoisômeros, isômeros geométricos, tautômeros, solvatos, metabólitos, formas cristalinas, formas amorfas, ou sais farmaceuticamente aceitáveis caracterizado por ser na fabricação de um inibidor de ativação mediada por TGFβ de matriz extracelular de fibroblasto.

4. Uso de chiglitazar ou seus estereoisômeros, isômeros geométricos, tautômeros, solvatos, metabólitos, formas cristalinas, formas amorfas, ou sais farmaceuticamente aceitáveis caracterizado por ser na fabricação de um inibidor de fator inflamatório.

5. Uso de chiglitazar ou seus estereoisômeros, isômeros geométricos, tautômeros, solvatos, metabólitos, formas cristalinas, formas amorfas, ou sais farmaceuticamente aceitáveis caracterizado por ser na fabricação de um inibidor de quimiotaxia de monócito.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizado pelo fato de que o sal farmaceuticamente aceitável de chiglitazar é chiglitazar de sódio ou chiglitazar de potássio.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizado pelo fato de que a doença fibrótica é uma doença fibrótica causada por danos às células do tecido que resultam da inflamação crônica.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a doença fibrótica causada por danos às células do tecido que resultam da inflamação crônica inclui esclerose sistêmica, nefrite crônica e fibrose renal, mielofibrose, fibrose pulmonar idiopática e fígado gorduroso não alcoólico.