BR112021000975A2 - composição de microbiota fecal para uso na redução de inflamação induzida por tratamento - Google Patents

Abstract

A invenção se refere ao uso de transplante de microbiota fecal para prevenir e/ou reduzir inflamação induzida por tratamento intestinal ou sistêmica em um indivíduo em necessidade do mesmo.

Description

“COMPOSIÇÃO DE MICROBIOTA FECAL PARA USO NA REDUÇÃO DE INFLAMAÇÃO INDUZIDA POR TRATAMENTO” CAMPO DA INVENÇÃO

[1] A presente invenção se refere ao campo de terapia anticâncer ou outros tratamentos em necessidade de terapias que provocam inflamação sistêmica ou local, e fornece meios e composições para prevenir e/ou reduzir inflamação iatrogênica, reduzindo, através disso, casos adversos.

ANTECEDENTES E TÉCNICA ANTERIOR

[2] A leucemia mieloide aguda (AML) é um câncer de sangue relativamente raro, mas potencialmente fatal. AML é caracterizada por uma proliferação anormal de células mieloides malignas e pouco diferenciadas dentro da medula óssea e sangue periférico (Saultz e Garzon, 2016). A terapia padrão para AML depende de quimioterapia convencional com ou sem transplante de células-tronco. Os pacientes elegíveis passam primeiro por uma fase de indução com quimioterapia intensiva. Se a remissão completa for alcançada, a terapia de consolidação é realizada para aprofundar a resposta e alcançar uma remissão duradoura. As terapias padrão de indução e consolidação incluem um ou vários ciclos de quimioterapia intensiva e/ou transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH), dependendo dos perfis de risco do paciente (Döhner, Weisdorf e D, 2015). As diferentes fases de tratamento da AML requerem internações prolongadas em hospitais em um ambiente protegido e vários cursos de tratamentos com antibióticos devido ao alto risco de complicações infecciosas potencialmente fatais (Mayer et al., 2015).

[3] Foi demonstrado que tais tratamentos alteram dramaticamente a composição da microbiota intestinal humana (Galloway-Pena et al., 2016; Galloway-Peña et al., 2017). A chamada disbiose induzida é caracterizada por uma redução da diversidade microbiana geral, uma interrupção das bactérias benéficas que suportam as defesas do hospedeiro e um aumento na dominância de espécies bacterianas geralmente subdominantes, incluindo alguns patógenos e patobiontes e bactérias multirresistentes (MDR) (Jandhyala et al., 2015; Montassier et al., 2015). Assim, a quimioterapia e o tratamento com antibióticos interrompem a relação mutualística entre o hospedeiro e os microrganismos e promovem condições patológicas envolvendo respostas imunes locais descontroladas e inflamação potencialmente sistêmica (Palm, Zoete e Flavell, 2015).

[4] Estudos recentes demonstraram que uma alta diversidade microbiana intestinal está associada a uma melhor resolução clínica e redução de complicações infecciosas em pacientes (Galloway-Pena (Galloway-Pena et al., 2016; Galloway-Peña et al., 2017; Malard et al., 2018). Uma diminuição significativa na diversidade microbiana ao longo da quimioterapia por indução foi observada em amostras de fezes de pacientes com AML. Além disso, a quimioterapia por indução é conhecida por ter consequências dramáticas no epitélio gastrointestinal, levando a colite com dor abdominal intensa, diarreia, hematoquezia com evidência de inflamação intestinal (Hogan et al., 2002; Camera et al., 2003). O estado inflamatório sistêmico de pacientes com AML mostrou aumentar significativamente após a quimioterapia por indução, como medido com dois marcadores séricos de inflamação: Proteína C reativa (CRP) e níveis de ferritina (Khitam AW Ali, Alaa F Alwan, 2015). As consequências intestinais dos tratamentos de AML podem, portanto, interferir no tratamento ideal do paciente: aumento de complicações relacionadas a infecções (por exemplo, sepse), mau estado de nutrição, maior duração da hospitalização, interrupção ou atrasos nos cursos de consolidação devido à toxicidade do tratamento (Elting et al., 2003).

[5] Há uma necessidade de desenvolver soluções terapêuticas para aliviar a inflamação intestinal que foi induzida pelo tratamento anticâncer em pacientes com AML.

[6] O desenvolvimento de estratégias, como a transferência de microbiota fecal (FMT) para restaurar diversas comunidades microbianas perdidas durante o tratamento da doença e, consequentemente, suprimir ou diminuir as complicações relacionadas ao tratamento em pacientes com AML, pode oferecer possibilidades terapêuticas inovadoras (Khanna, 2018; Malard et al., 2018) Khanna 2017). O objetivo do ensaio clínico prospectivo de braço único relatado no Exemplo 1 consistiu em usar FMT autólogo (AFMT) em pacientes com AML tratados com quimioterapia intensiva e antibióticos, a fim de restaurar sua diversidade da microbiota intestinal e reduzir o transporte de MDRB induzido pelo tratamento. Surpreendentemente, os inventores também mostraram que a FMT em pacientes com AML leva a uma diminuição da inflamação, especialmente a inflamação intestinal local. Uma descrição do protocolo clínico desse ensaio (chamado ODYSSEE) foi publicada por Mohty et al. ["Prevention of Dysbiosis Complications with Autologous Fecal Microbiota Transplantation (auto-FMT) in Acute

Myeloid Leukemia (AML) Patients Undergoing Intensive Treatment (ODYSSEE study): First Results of a Prospective Multicenter Trial", Blood, 7 de dezembro de 2017 eA17-12- 07]. Nem o método de preparação da amostra da microbiota fecal nem os resultados do ensaio foram divulgados nesse documento.

[7] Inúmeras publicações divulgam o uso de FMT no tratamento de disbiose intestinal induzida por quimioterapia. Por exemplo, Wang et al:P038 Fecal Microbiota Transplant (Fmt) For Immunocheckpoint Inhibitor- Induced Colitis (ICI-C) in 50 Year Old Female with Bladder Cancer”, Inflammatory Bowel Diseases, vol. 24, nº 51, 18 de janeiro de 2018 (2018-01-18), página S13, Le Bastard et al: revela "Fecal microbiota transplantation reverses antibiotic and chemotherapy-induced gut dysbiosis in mice”, Scientific Reports, vol. 8, nº 1, 18 De abril de 2018 (2018-04-18), e Cui et al: "Faecal microbiota transplantation protects against radiation-induced toxicity", EMBO Molecular medicine (online), vol. 9, nº 4, 27 de fevereiro de 2017 (2017-02-27), páginas 448-461.

[8] Tendo em vista a prevalência contínua do câncer atualmente, em particular, AML, há uma necessidade de fornecer soluções terapêuticas confiáveis, reprodutíveis e eficazes que são complementares a, ou estendem a eficácia de, ou reduzem os efeitos colaterais dos tratamentos existentes de AML. Certamente, tais soluções terapêuticas devem ser adequadas para uso em pacientes, em particular, em uma população frágil, como aqueles que têm câncer.

[9] Especificamente, há uma necessidade de fornecer soluções terapêuticas que atendam às exigências farmacêuticas atuais, em termos de segurança e eficácia. É necessário que tais produtos terapêuticos possam ser produzidos usando processos que estejam em conformidade com as Boas Práticas de Fabricação (GMP).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[10] A presente invenção pertence ao uso de uma composição de microbiota fecal para prevenir e/ou reduzir uma inflamação induzida por tratamento em um indivíduo em necessidade da mesma.

[11] De acordo com uma modalidade da invenção, a composição de microbiota foi obtida por um processo que compreende as etapas de: (i) coletar uma amostra de fezes e colocar a mesma em condições anaeróbias no máximo 5 minutos após a coleta; (ii) ainda em condições anaeróbicas, misturar a amostra com uma solução salina aquosa que compreende pelo menos um crioprotetor e/ou um agente de volume; e (iii) filtrar a amostra diluída.

[12] De acordo com uma modalidade da invenção, a composição da microbiota fecal compreende a microbiota de pelo menos duas, ou pelo menos três ou pelo menos quatro amostras de fezes do mesmo indivíduo.

[13] De acordo com uma modalidade da invenção, a composição de microbiota fecal compreende microbiota obtida a partir de pelo menos uma amostra fecal do indivíduo em necessidade de um tratamento para reduzir a inflamação.

[14] De acordo com uma modalidade da invenção, a composição de microbiota fecal é usada na prevenção e/ou redução de uma inflamação intestinal induzida por tratamento em um indivíduo em necessidade da mesma.

[15] De acordo com uma modalidade da invenção, a composição de microbiota fecal é usada na prevenção e/ou redução de a inflamação induzida por uma terapia anticâncer, incluindo quimioterapia.

[16] De acordo com uma modalidade da invenção, a prevenção e/ou redução da dita inflamação são executadas realizando- se pelo menos uma FMT de 1 a 30 dias após o final da terapia anticâncer. De preferência, dois FMTs podem ser realizados em um intervalo de 1-7 dias.

[17] De acordo com uma modalidade da invenção, a composição de microbiota fecal leva a uma diminuição de neopterina no intestino e/ou uma diminuição de CRP e/ou ferritina em soro do paciente a ser tratado.

[18] De acordo com uma modalidade da invenção, a administração da composição de microbiota fecal leva a um aumento da proporção de bactérias benéficas e uma diminuição da proporção de bactérias deletérias no trato gastrointestinal do indivíduo a ser tratado.

[19] De acordo com uma modalidade da invenção, a proporção de algum ou todos os seguintes 15 gêneros é aumentada em relação ao nível após o final da terapia anticâncer: Blautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, Subdoligranulum e Butyrivibrio.

[20] De acordo com uma modalidade da invenção, a composição de microbiota fecal administrada compreende a microbiota dos seguintes 15 gêneros: Blautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia,

Floldemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, Subdoligranulum e Butyrivibrio.

[21] De acordo com uma modalidade da invenção, o dito indivíduo a ser tratado é um paciente com câncer.

[22] De acordo com uma modalidade da invenção, o dito indivíduo a ser tratado tem uma doença hematológica.

[23] De acordo com uma modalidade da invenção, o dito indivíduo a ser tratado tem uma leucemia aguda.

LEGENDAS PARA AS FIGURAS

[24] Figura 1: Fluxograma de Estudo de Odyssee

[25] Figura 2: Avaliação de parâmetros bioquímicos e imunológicos para a população tratada de pacientes (n=25). (a) Nível sistêmico: IL-6, CRP e ferritina, (b) Nível local: neopterina, IgA.

[26] Figura 3: Avaliação de parâmetros bioquímicos e imunológicos para a população tratada (n=25) (a) sCD14 (b) TAS (c) TNFα.

[27] Figura 4: Caracterização da microbiota fecal no diagnóstico de AML, antes e após a administração de AFMT para a população por protocolo (n=20). (a) Diversidade de espécies, (b) Índice de Simpson no nível da espécie, (c) Índice de Bray Curtis no nível de espécie, (d) Número total de genes na comunidade microbiana.

[28] Figura 5: Proporção de bactérias benéficas (a) e prejudiciais (b) na microbiota dos pacientes por protocolo (n = 20).

[29] Figura 6: Abundância relativa de 15 gêneros geradores de butirato selecionados (chamados de “butycore”), a saber Blautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus,

Odoribacter, Roseburia, Holdemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, Subdoligranulum e Butyrivibrio, em pacientes no estudo ODYSSEE após cada uma das visitas ao hospital, V1, V2, V3 e V4.

[30] Figura 7: Curvas de sobrevivência para pacientes tratados, (a) curva de Sobrevivência Geral. (b) curva de Sobrevivência Livre de Leucemia (LFS).

[31] Figura 8: Fluxograma de Estudo OSIRIS.

[32] Figura 9: Avaliação de parâmetros bioquímicos e imunológicos para pacientes de OSIRIS com acompanhamento de (n=42) (a) Zonulina. (b) Neopterina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERENCIAIS

[33] No presente texto, as seguintes definições gerais são usadas: Microbiota intestinal

[34] A "microbiota intestinal" (formalmente chamada de flora intestinal ou microflora) designa a população de microrganismos (bactérias, arqueias, fungos, vírus) que vivem no intestino de qualquer organismo pertencente ao reino animal (humano, animal, inseto, etc.). Embora cada indivíduo tenha uma composição única de microbiota, 60 a 80 espécies bacterianas são compartilhadas por mais de 50 % de uma amostra da população humana em um total de 400-500 indivíduos/espécies bacterianas diferentes.

[35] A microbiota intestinal cumpre funções fisiológicas principais similares em todos os indivíduos e tem um impacto direto na saúde do indivíduo: • contribui para a digestão de certos alimentos que o estômago e o intestino delgado não conseguem digerir (principalmente fibras não digeríveis);

• contribui para a produção de algumas vitaminas (B e K); • protege contra agressões de outros microrganismos, mantendo a integridade da mucosa intestinal; • desempenha um papel importante no desenvolvimento de um sistema imunológico adequado; • uma microbiota intestinal saudável, diversa e equilibrada é o elemento principal para garantir o funcionamento intestinal adequado.

[36] Levando em consideração o importante papel que a microbiota intestinal desempenha no funcionamento normal do corpo e as diferentes funções que desempenha, a mesma é atualmente considerada um “órgão”. No entanto, é um órgão “adquirido”, visto que a colonização intestinal por microrganismos começa logo após o nascimento e evolui permanentemente ao longo de toda a vida e resulta de diferentes influências ambientais (modo de entrega, dieta, fatores de estresse iatrogênicos...).

[37] Embora a composição geral da microbiota intestinal dominante seja similar na maioria das pessoas saudáveis (4 filos principais, isto é, Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria e Proteobacteria), a composição em um nível de espécie é altamente personalizada e amplamente determinada pela genética dos indivíduos, ambiente dos indivíduos, dieta e histórico médico. Disbiose

[38] Embora possa se adaptar a mudanças e tenha uma alta capacidade de resiliência, uma perda de equilíbrio na composição de microbiota intestinal pode ocorrer em algumas situações específicas. Isso é chamado de "disbiose", um desvio para o que é considerado uma microbiota "saudável" em termos de abundância e diversidade dos principais grupos bacterianos (isto é, um desequilíbrio entre bactérias potencialmente "prejudiciais" e "benéficas" no intestino) levando a uma ruptura da relação simbiótica entre o hospedeiro e sua microbiota. A disbiose pode estar associada a problemas de saúde, como transtornos intestinais funcionais, doenças inflamatórias intestinais, alergias, obesidade e diabetes. Isso também pode ser a consequência de um tratamento médico, como um tratamento citotóxico (isto é, quimioterapia) ou um tratamento com antibióticos e provocar casos adversos, como dor abdominal e diarreia. A disbiose induzida por tratamento também pode favorecer casos adversos graves, como infecções e sepse. Terapia anticâncer

[39] Por “terapia anticâncer” entende-se no presente documento que qualquer tipo de tratamento usado para combater o câncer, como quimioterapia, terapias biológicas (incluindo imunoterapia), radioterapia e cirurgia. Quimioterapia anticâncer

[40] “Quimioterapia” é definida no presente documento como o tratamento de câncer com um ou mais "agentes quimioterápicos". Os agentes quimioterápicos são moléculas químicas que agem matando células que se dividem rapidamente, uma das principais propriedades da maioria das células cancerosas. Agentes de quimioterapia incluem: - agentes de alquilação, como mostardas de nitrogênio (mecloretamina, ciclofosfamida, melfalano, clorambucila, ifosfamida, busulfano, etc.), nitrosoureias (N-Nitroso-N- metilureia (MNU), carmustina (BCNU), lomustina (CCNU),

semustina (MeCCNU), etc.), tetrazinas (dacarbazina, mitozolomida, temozolomida, etc.), aziridinas (tiotepa, mitomicina, diaziquona (AZQ), etc.) e agentes de alquilação não clássicos (por exemplo, procarbazina e hexametilmelamina); - - venenos de fuso, como mebendazol, colchicina; - inibidores mitóticos (incluindo taxanos (paclitaxel (Taxol ®), docetaxel (Taxotère ®)) e alcaloides de vinca (por exemplo: vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina)), - antibióticos citotóxicos/antitumorais: como antraciclinas (por exemplo: doxorrubicina, daunorrubicina, adriamicina, idarrubicina, epirrubicina e mitoxantrona, valrubicina), estreptomicina (por exemplo: actinomicina, bleomicina, mitomicina, plicamicina) - antimetabólitos (como análogos de pirimidina (por exemplo: análogos de fluoropirimidinas, 5-fluorouracila (5- FU), floxuridina (FUDR), citosina-arabinosídeo (citarabina), Gemcitabina (Gemzar ®), capecitabina; análogos de purina (por exemplo: azatioprina, mercaptopurina, tioguanina, fludarabina, pentostatina, cladribina, capecitabina, clofarabina); análogos de ácido fólico (por exemplo: metotrexato, ácido fólico, pemetrexede, aminopterina, raltitrexedo, trimetoprima, pirimetamina), - inibidores da topoisomerase (por exemplo: camptotecinas: irinotecano, topotecano, amsacrina, etoposídeo, fosfato de etoposido, teniposídeo); - inibidores de DNA metiltransferase: 2'-deoxi-5- azacitidina (DAC), 5-azacitidina, 5-aza-2'-deoxicitidina,

1-[beta]-D-arabinofuranosil-5-azacitosina, di-hidro-5- azacitidina; - agentes disruptores vasculares, como derivados de ácido acético de flavona, ácido 5,6-dimetilxantenona-4- acético (DMXAA) e ácido acético de flavona (FAA); - outros fármacos quimioterápicos, como aprepitanto, bortezomibe (Velcade ®, Millenium Pharmaceuticals), mesilato de imatinibe (Gleevec ®), carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), tamoxifeno, gefitinibe, erlotinibiral, carboxiamidotriazol, efunapinasazol, vinapinazol, vinazazol. Terapias biológicas anticâncer

[41] As "terapias biológicas" anticâncer envolvem o uso de organismos vivos, substâncias derivadas de organismos vivos ou versões produzidas em laboratório de tais substâncias para tratar o câncer, alvejando-se tanto as células cancerosas diretamente ou estimulando-se o sistema imune do corpo para agir contra células cancerosas (“imunoterapia”). As terapias biológicas incluem anticorpos monoclonais (Mabs), incluindo aqueles que têm como alvo a superfície de células cancerosas (por exemplo, rituximabe e alemtuzumabe); anticorpos que visam um ponto de verificação imunológico, como Mabs anti-CTLA4 (por exemplo, ipilimumabe), Mabs anti-PD1, Mabs anti-PD-L1 (como Atezolizumabe ou Durvalumabe), Mabs anti-PD-L2, Mabs anti- Tim3, Mabs anti-ICOS etc.; visando fatores de crescimento (por exemplo: bevacizumabe, cetuximabe, panitumumabe e trastuzumabe); imunoconjugados (por exemplo: 90Y- ibritumomabe tiuxetano, 131l-tositumomabe e adotrastuzumabe emtansina). Outras terapias biológicas incluem citocinas

(incluindo interferons, como IFNα; interleucinas, como IL- 2, IL-11, G-CSM, GM-CSF), vacinas terapêuticas (por exemplo: Sipuleucel-T (Provenge®)), a bactéria Bacilo de Calmette-Guérin, vírus de extermínio de câncer, terapia de gene e transferência de célula T adotiva. Imunoterapia anticâncer

[42] “Imunoterapia” no presente documento designa qualquer terapia que atua através da modulação do sistema imune do paciente, usando terapias biológicas como descrito acima ou qualquer outro agente. Câncer, tratamento, etc.

[43] Como usado no presente documento, “câncer” significa todos os tipos de cânceres. Em particular, os cânceres podem ser cânceres sólidos ou não sólidos. Exemplos não limitativos de cânceres são carcinomas ou adenocarcinomas, como câncer de mama, próstata, ovário, pulmão,

[44] pâncreas ou cólon, sarcomas, linfomas, mielomas, melanomas, leucemias, cânceres de células germinativas e blastomas.

[45] Outras definições serão especificadas abaixo, quando necessário.

[46] Como descrito na parte experimental abaixo, os inventores demonstraram que pacientes de AML que recebem um transplante de microbiota fecal (FMT) após uma quimioterapia por indução combinada com antibióticos não só se beneficiaria da restauração de sua diversidade de microbiota intestinal e da redução de transporte de MDRB induzido por tratamento, mas também apresentou uma diminuição de inflamação, tanto em nível sistêmico quanto em nível intestinal local. Esse resultado inesperado é de grande importância, visto que vários casos adversos de tratamentos anticâncer estão relacionados à inflamação.

[47] Por conseguinte, de acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção pertence ao uso de uma composição de microbiota fecal para prevenir e/ou reduzir uma inflamação induzida por tratamento em um indivíduo em necessidade da mesma.

[48] No presente texto, o indivíduo em necessidade de FMT para prevenir e/ou reduzir uma inflamação induzida por tratamento é um indivíduo humano ou um animal não humano.

[49] No presente texto, uma “composição de microbiota fecal” designa uma composição que compreende material fecal com bactérias fecais vivas, especialmente uma composição adequada para transplante de microbiota fecal (FMT). De acordo com uma modalidade particular, a composição de microbiota fecal compreende toda a microbiota presente em uma amostra fecal ou um agrupamento de tal microbiota, obtida a partir de diferentes amostras.

[50] Os inventores demonstraram que o FMT reduz a inflamação sistêmica induzida pelo tratamento ou iatrogênica, como evidenciado por uma diminuição no nível de CRP e/ou no nível de ferritina. Essa redução é muito benéfica aos pacientes, visto que a inflamação sistêmica é conhecida como uma causa ou fator de risco de alguns casos adversos graves (por exemplo, sepse) ligados a tratamentos pesados, como tratamentos anticâncer. Consistentemente, os inventores não observaram qualquer sepse nos pacientes com AML em pelo menos 40 dias após receberem um FMT de acordo com a invenção. A presente invenção, portanto, se refere mais especificamente ao uso de uma composição de microbiota fecal para prevenir e/ou reduzir a inflamação induzida por tratamento sistêmico e complicações associadas, como sepse.

[51] Os inventores também demonstraram que o FMT reduz a inflamação intestinal local, como evidenciado por uma diminuição no nível de neopterina fecal. De acordo com uma modalidade particular, a composição de microbiota fecal é, assim, usada para prevenir e/ou reduzir a inflamação intestinal e sintomas gastrointestinais associados, como colite e diarreia, por exemplo.

[52] De acordo com uma modalidade particular da invenção, a composição de microbiota fecal usada para prevenir e/ou reduzir a inflamação induzida por tratamento foi obtida por um processo que compreende as etapas de: (i) coletar uma amostra de fezes e colocar a mesma em condições anaeróbias no máximo 5 minutos após a coleta; (ii) ainda em condições anaeróbicas, misturar a amostra com uma solução salina aquosa que compreende pelo menos um crioprotetor e/ou um agente de volume; e (iii) filtrar a amostra diluída, por exemplo, em cerca de 265 µm. de acordo com uma modalidade preferencial, a solução aquosa usada na etapa (ii) compreende maltodextrina e/ou trealose de modo que a concentração final (p/vol) de maltodextrina está na faixa de 5 %-15 % e/ou a concentração final (p/vol) de trealose está na faixa 5 %-15 %.

[53] Etapas opcionais adicionais podem ser adicionadas ao processo acima, como: (ia) controlar a amostra de fezes, por exemplo: - realizar uma testagem microbiológica na amostra, para evitar a administração de patobiontes e/ou bactérias multirresistentes a fármaco (MDRB) ao individual; - avaliar visualmente a ausência de urina e sangue no material de partida; - Descamação de fezes de Bristol do material de partida; - avaliar visualmente a homogeneidade e cor do produto, e verificar a viabilidade da bactéria presente na amostra (por cultura fecal). (iv) agrupar vários produtos da etapa (iii): misturar dois ou mais dos ditos produtos e homogeneizar a mistura; (va) congelar o produto da etapa (iii) ou (iv) a -80 °C; após o descongelamento, esse inóculo líquido será adequado para administração por enema; (vb) secar por congelamento o produto da etapa (iii) ou (iv) usar materiais e protocolos de secagem por congelamento comuns. O inóculo liofilizado é, então, adequado para administração por enema em uma solução líquida ou por via oral, em cápsulas gastrorresistentes. (vc) colocar o material seco por congelamento da etapa (vb) em cápsulas apropriadas para administração oral. (vi) verificar a viabilidade e diversidade da bactéria no produto obtido nas etapas (iii), (iv), (va), (vb) ou (vc) e/ou a ausência de patobiontes e MDRB no dito produto.

[54] A composição de microbiota fecal usada de acordo com a presente invenção pode compreender a microbiota de um único doador ou de vários doadores. Por exemplo, várias amostras diluídas e filtradas podem ser misturadas na etapa (iv) do processo descrito acima. O elemento versado na técnica escolherá, dependendo da situação, se é preferível que o paciente receba um FMT monodoador (por exemplo, do próprio paciente ou de um parente do paciente) ou um FMT multidoador.

[55] De acordo com uma modalidade particular, a composição de microbiota fecal compreende microbiota obtida a partir de uma amostra fecal do indivíduo em necessidade de um tratamento for reduzir a inflamação. Essa modalidade abrange FMT autólogo (AFMT) (isto é, a composição é feita de material fecal apenas a partir desse indivíduo), bem como FMT multidoador se a microbiota do indivíduo for agrupada com a microbiota de pelo menos um outro indivíduo.

[56] Quando o FMT autólogo é realizado no âmbito da presente invenção, é preferível coletar fezes do paciente antes do início do tratamento que irá induzir inflamação e/ou disbiose, como ilustrado no Exemplo 1 abaixo.

[57] De acordo com uma outra modalidade particular, a composição de microbiota fecal compreende pelo menos 90 % dos gêneros presentes na amostra (ou amostras) usada. Em particular, no caso de AFMT, a composição de microbiota fecal compreende pelo menos 90 % dos gêneros presentes na amostra do indivíduo coletada antes do tratamento de indução de inflamação.

[58] Os tratamentos anticâncer geralmente induzem a inflamação sistêmica e/ou local, que pode ser a causa de desconforto e, algumas vezes, de casos adversos graves (que, por sua vez, podem resultar na interrupção de tratamento). De acordo com uma modalidade particular, a presente invenção se refere, então, ao uso de uma composição de microbiota fecal como descrito acima, para prevenir e/ou reduzir a inflamação induzida por uma terapia anticâncer, possivelmente combinada com antibioterapia e/ou transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH).

[59] De acordo com uma outra modalidade particular, a presente invenção se refere ao uso de uma composição de microbiota fecal como descrito acima, para prevenir e/ou reduzir a inflamação induzida por um agente antineoplásico, possivelmente combinado com antibioterapia e/ou transplante de células-tronco hematopoiéticas (FISCT). "Agentes antineoplásicos" no presente documento designam qualquer tratamento para câncer, exceto cirurgia. Os mesmos incluem quimioterapia, terapia biológica, incluindo imunoterapia e radioterapia.

[60] De acordo ainda com uma outra modalidade particular, a presente invenção se refere ao uso de uma composição de microbiota fecal como descrito acima, para prevenir e/ou reduzir a inflamação induzida por quimioterapia, possivelmente combinada com antibioterapia e/ou transplante de células-tronco hematopoiéticas (HSCT).

[61] Ao realizar a invenção, a composição de microbiota fecal pode ser administrada para transplante de microbiota fecal (FMT) antes, durante e/ou após a terapia anticâncer, por exemplo, antes, durante e/ou após uma quimioterapia de primeira linha, por exemplo, antes, durante e/ou após uma quimioterapia por indução (como uma quimioterapia “7 + 3” com citarabina e um antibiótico antraciclina ou daunorrubicina).

[62] Vários regimes de administração podem ser considerados no quadro da presente invenção. De acordo com uma modalidade particular, ilustrado no Exemplo 1 abaixo, pelo menos um FMT é realizado de 1 a 30 dias após o final de uma terapia anticâncer, mais especificamente 20 a 30 dias após o final de uma quimioterapia por indução (o que corresponde, para esses pacientes, até o final da antibioterapia).

[63] De acordo com outra modalidade particular, também ilustrado no Exemplo 1 abaixo, pelo menos dois FMT são realizados em um intervalo de 1 a 7 dias.

[64] A presente invenção também se refere ao uso de uma composição de microbiota fecal como descrito acima, para prevenir e/ou reduzir uma inflamação induzida por tratamento em um indivíduo que recebe um tratamento anticâncer, em que a composição de microbiota fecal é administrada a cada dia, por exemplo, em cápsulas orais, no diagnóstico de câncer, antes, durante e/ou após o dito tratamento anticâncer. De acordo com uma modalidade particular, a absorção diária de cápsulas orais que compreende a composição de microbiota fecal é iniciada no início da quimioterapia por indução e é continuada durante pelo menos 3 a 6 meses.

[65] Como já mencionado, os inventores demonstraram que FMT leva a uma redução da inflamação iatrogênica do intestino nos pacientes tratados, evidenciada por uma diminuição do nível de neopterina nas fezes coletadas. De acordo com uma modalidade particular da presente invenção, FMT com uma composição de microbiota fecal como descrito acima leva a uma diminuição de neopterina no intestino, que pode ser medida em amostras de fezes do indivíduo tratado. Mais particularmente, o nível de neopterina diminui em pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 % ou pelo menos 40 %.

[66] Os inventores também demonstraram que FMT leva a uma redução da inflamação sistêmica iatrogênica nos pacientes tratados, evidenciada por uma diminuição dos níveis de CRP e/ou ferritina no soro dos pacientes. De acordo com uma modalidade particular da presente invenção, FMT com uma composição de microbiota fecal como descrito acima leva a uma diminuição de CRP e/ou ferritina no soro do indivíduo tratado. Mais particularmente, o nível sérico de CRP diminui em pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 % ou pelo menos 40 % e/ou o nível sérico de ferritina diminui em pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 % ou pelo menos 40 %.

[67] Um outro aspecto da presente invenção consiste no uso de uma composição de microbiota fecal como descrito acima, para prevenir e/ou reduzir uma inflamação induzida por tratamento em um indivíduo, em que FMT com a dita composição de microbiota fecal leva a um aumento da proporção de bactérias benéficas e uma diminuição da proporção de bactérias prejudiciais no trato gastrointestinal.

[68] No contexto da presente invenção, “bactérias benéficas” incluem bactérias pertencentes às famílias Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, Bifidobacteriaceae, Streptococcaceae, Akkermansiaceae, Lactobacillaceae, Eubacteriaceae, Erysipelotrichaceae, Eggerthellaceae, Clostridiaceae, Prevotellaceae, Oscillospiraceae, Rikenellaceae e Odoribacteraceae e “bactérias prejudiciais” incluem bactérias pertencentes às famílias Bacteroidaceae e Enterococcaceae. De acordo com a invenção, uma composição de microbiota fecal é considerada como levando a um aumento da proporção de bactérias benéficas e uma diminuição da proporção de bactérias prejudiciais no trato gastrointestinal se, entre 2 dias e 3 semanas após FMT com a dita composição, a soma das abundâncias das bactérias benéficas listadas acima é superior à medida imediatamente antes do FMT e a soma das abundâncias das bactérias prejudiciais listadas acima é inferior à medida imediatamente antes do FMT.

[69] Os dados do Requerente (consulte os Exemplos abaixo) confirmam que a presente invenção é particularmente útil para prevenir e/ou reduzir a inflamação induzida por tratamento em pacientes que sofrem de câncer.

[70] A presente invenção também é útil para prevenir e/ou reduzir a inflamação induzida pelo tratamento em pacientes que sofrem de uma doença hematológica, como uma leucemia aguda (por exemplo, leucemia mieloide aguda - AML), citopenia autoimune e aplasia idiopática da medula óssea.

[71] Além disso, os dados do Requerente nos Exemplos abaixo revelam o potencial da microbioterapia na combinação com outros tratamentos contra doenças do sangue, especialmente as malignas.

[72] Especificamente, o tratamento com o produto de FMT está associado a uma diminuição do estado inflamatório em pacientes (Exemplo 1), em contraste com pacientes que não são tratados com FMT (Exemplo 2). A inflamação e a síndrome inflamatória estão relacionadas ao aumento das comorbidades e pontuação negativa dos pacientes. De fato, marcadores inflamatórios sanguíneos, como CRP e ferritina sérica, têm valor preditivo para a incidência de infecção sistêmica em pacientes submetidos ao TCTH (Hong et al., 2015). Interessantemente, PCR de pré-tratamento (ou seja, antes do condicionamento de TCTH) é um previsor para resultados de alo-TCTH: níveis mais altos de PCR estão correlacionados com mais toxicidade infecciosa de grau 3 a 4, toxicidade hepática, maior permanência hospitalar em HCT, mais aGVFID, maior mortalidade não recidiva e sobrevida geral inferior (Artz et al., 2008). Assim, de acordo com uma modalidade da invenção, FMT repetido durante o cuidado do paciente leucêmico durante as vias de quimioterapia reduz a situação inflamatória e os níveis de CRP prevenindo, assim, toxicidades de alo-HSCT e morbidade/mortalidade associada (naqueles pacientes que são candidatos para alo-HSCT). Além disso, o impacto positivo na inflamação intestinal local tem um efeito benéfico na qualidade de vida do paciente, por exemplo, com a redução de transtornos gastrointestinais, como dor abdominal e/ou diarreia.

[73] Em contraste, os dados do inventor no Exemplo 2 mostram o impacto prejudicial de um tratamento de antibioterapia a longo prazo, demonstrado no protocolo OSIRIS com 96 AEs gastrointestinais relacionados em pacientes que foram acompanhados. Esses pacientes não receberam FMT. Esse resultado destaca a necessidade de um tratamento combinatório para reduzir a inflamação intestinal e complicações relacionadas.

[74] Recentemente, foi demonstrado que a microbiota intestinal pode modular a resposta à terapia de câncer (quimioterapia, radioterapia e imunoterapia) e a suscetibilidade a efeitos colaterais tóxicos (Roy e Trinchieri, 2017; Routy et al., 2018). A restauração da microbiota intestinal com um aumento da diversidade é, portanto, sugerida para melhorar a eficácia e reduzir a toxicidade (Alexander et al., 2017). Além disso, a alta diversidade da microbiota intestinal demonstrou desempenhar um papel fundamental na sobrevida geral após alo-TCTH e no resultado do paciente com GvHD (Taur et al., 2014). Em conjunto, esses argumentos evidenciam o impacto benéfico de uma microbiota "saudável" e diversa sobre os resultados dos pacientes com câncer e, especialmente, malignidades hematológicas e apoiam fortemente a justificativa para o uso da microbioterapia como terapia adjuvante durante todo o tratamento do paciente.

[75] As proporções de bactérias benéficas e prejudiciais na microbiota de pacientes ODYSSEE foram claramente modificadas após IC, com diminuição significativa de bactéria benéfica e aumento de bactéria prejudicial, respectivamente, correlacionando-se com o aumento dos marcadores inflamatórios avaliados no sangue e nas fezes. De fato, entre as bactérias benéficas, os inventores encontraram um grupo específico de 15 gêneros de bactérias excepcionalmente benéficas: Blautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, Subdoligranulum e Butyrivibrio. Os inventores nomearam esse conjunto de gênero “butycore”.

[76] Como descrito no Exemplo 1, os inventores correlacionaram a presença dos 15 gêneros acima com uma diminuição na inflamação intestinal como evidenciado pelos níveis de marcadores de inflamação (fecal e plasmático) de neopterina e CRP plasmática nos pacientes. Portanto, a presença desses 15 gêneros em uma amostra fecal a ser administrada em FMT é desejável para maximizar a capacidade anti-inflamatória dessa amostra.

[77] Assim, a invenção inclui a administração de amostras de microbiota fecal nas quais alguns ou todos os últimos 15 gêneros benéficos estão presentes.

[78] Entre as bactérias prejudiciais, algumas famílias que compreendem bactérias pró-inflamatórias, como Escherichia ou Klebsiella, foram identificadas. Algumas dessas bactérias pró-inflamatórias podem ser multirresistentes a fármacos, como Enterococcus (Steck et al., 2011; Strickertsson et al., 2013), reforçando o racional para reduzir o transporte desses micróbios nos pacientes. É importante ressaltar que 32 % dos pacientes no protocolo OSIRIS apresentaram uma aquisição fecal de bactérias multirresistentes a fármaco após o curso do antibiótico (dados não mostrados). A restauração da diversidade e da razão bactérias benéficas/prejudiciais após FMT está associada a uma redução da inflamação local e sistemicamente no estudo ODYSSEE, destacando o efeito anti- inflamatório benéfico potencial do FMT no hospedeiro.

[79] Assim, de acordo com uma modalidade da invenção, a administração da composição de microbiota fecal a um paciente aumenta a abundância relativa dos 15 gêneros mencionados acima e/ou uma diminuição na abundância das bactérias pró-inflamatórias prejudiciais.

[80] Em particular, de acordo com uma modalidade preferencial da invenção, a composição de microbiota fecal compreende Blautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Floldemanella. Anaerostipes, Oscillibacter, Subdoligranulum e

Butyrivibrio.

[81] Geralmente, e como mostrado acima, a partir do ponto de vista terapêutico, a presença desses 15 gêneros na composição de microbiota fecal é vantajosa no tratamento da inflamação intestinal, especialmente aquela associada à disbiose intestinal.

[82] Fornecer aos pacientes com câncer uma composição de microbiota fecal geralmente pode regular a inflamação intestinal e potencializar melhor outros tratamentos anticâncer.

[83] O produto de FMT descrito no presente documento oferece uma ampla faixa de atividades que criam um ciclo interativo específico e positivo entre a microbiota intestinal, o metabolismo intestinal, o epitélio intestinal e a circulação sistêmica. Portanto, esse ciclo positivo é uma etapa crucial no processo imune para combater as células cancerosas, especialmente as células cancerosas do sangue, como os blastos mieloides presentes em pacientes com AML.

[84] Geralmente, as consequências induzidas por disbiose, como infecções e sintomas gastrointestinais, como colite, diarreia, dor abdominal, distensão abdominal, são reduzidas pela administração da composição da microbiota fecal. De preferência, a composição de microbiota fecal a ser administrada ao paciente contém alguns, ou mais preferencialmente, todos os gêneros bacterianos produtores de butirato mencionados acima. De acordo com uma modalidade preferencial da invenção, a composição de microbiota fecal a ser administrada ao paciente, se origina de pelo menos uma ou pelo menos duas ou pelo menos três ou pelo menos quatro amostras fecais do mesmo paciente. Por exemplo, de acordo com uma modalidade da invenção, a amostra de FMT é preparada de acordo com as etapas: (i) coletar uma amostra de fezes e colocar a mesma em condições anaeróbias no máximo 5 minutos após a coleta; (ii) ainda em condições anaeróbicas, misturar a amostra com uma solução salina aquosa que compreende pelo menos um crioprotetor e/ou um agente de volume; e (iii) filtrar a amostra diluída, por exemplo, em cerca de 265 µm. (iv) agrupar vários produtos da etapa (iii): misturar dois ou mais dos ditos produtos e homogeneizar a mistura;

[85] Desse modo, o paciente pode receber uma composição de microbiota derivada de pelo menos dois inóculos fecais agrupados (isto é, produtos da etapa (iii)). Por exemplo, o paciente pode doar uma ou mais amostras de fezes em um ou dois ou três dias consecutivos antes que a terapia anticâncer ocorra. Essas amostras de fezes são usadas para preparar inóculos (produto da etapa iii) que são então agrupados (etapa (iv) acima) e, em seguida, administrados como um ou dois (ou mais) produtos de FMT homogêneos após a terapia anticâncer (por exemplo, quimioterapia ou imunoterapia). Se uma ou mais administrações de terapia anticâncer adicionais forem consideradas, as próximas amostras de fezes podem ser coletadas uma vez que a microbiota intestinal tenha sido suficientemente restaurada no indivíduo, geralmente de cerca de uma semana (ou menos se a microbiota tiver sido restaurada antes disso) após o tratamento FMT anterior. O procedimento pode, portanto, ser repetido quantas vezes forem necessárias e enquanto as terapias anticâncer forem realizadas.

[86] De acordo com certas modalidades da invenção, as amostras de fezes podem ser coletadas de um doador saudável (que não é o paciente). Nesse caso, um FMT alogênico é realizado em vez de FMT autólogo. Nesse caso, os doadores são triados de modo que as amostras de doador sejam adequadas para uso no tratamento de um paciente, por exemplo, que as amostras estejam isentas de bactérias ou vírus patogênicos. No caso de FMT alogênico, inóculos fecais (isto é, produtos da etapa (iii), de diferentes doadores, podem ser agrupados como descrito acima. Assim, para amostras de FMT alogênicas de um ou dois, ou três ou quatro ou mais doadores podem ser usados. De preferência, pelo menos quatro doadores são usados, se um produto alogênico agrupado for usado.

[87] A diversidade bacteriana dos produtos transplantados é a mais alta possível e existe uma homogeneidade entre as diferentes doses de produtos (homogeneidade intralote) transplantados para a mesma pessoa. Também existe flomogeneidade entre os diferentes lotes produzidos (homogeneidade entre lotes). A viabilidade da bactéria também é preservada. A manutenção de alta diversidade da microbiota intestinal, como demonstrado pela administração das composições de microbiota fecal descritas no presente documento, tem os efeitos benéficos descritos acima.

[88] Os inventores notaram que, em um estudo clínico separado (ULYSSE, dados não mostrados), a composição de microbiota intestinal de 12 pacientes que sofrem de AML e que não receberam nenhum FMT é afetada negativamente após a primeira fase de uma quimioterapia e permanece posteriormente alterada negativamente, tendo uma baixa riqueza de espécies microbianas e com uma composição microbiana muito diferente daquela de sua microbiota de linha de base (baixa similaridade de Bray Curtis).

[89] Os dados do ULYSSE, que podem ser visualizados como uma espécie de elemento negativo do estudo ODYSSEE (mas em uma coorte diferente), demonstram que o efeito anti- inflamatório observado no Exemplo 1 é diretamente devido à administração do produto de FMT, como descrito acima.

[90] Outras características da invenção se tornarão também evidentes no curso da descrição que se segue dos ensaios biológicos que foram realizados no âmbito da invenção e que forneceram ao mesmo o suporte experimental necessário, sem limitar o seu âmbito.

EXEMPLOS Exemplo 1: Restauração da diversidade de microbiota intestinal em pacientes com leucemia mieloide aguda (LMA) submetidos à quimioterapia intensiva com transferência de microbiota fecal autóloga (FMT): resultados do estudo Odyssée

PACIENTES E MÉTODOS Pacientes e projeto de estudo

[91] Um total de 62 pacientes com idades entre 24 e 69 anos com um diagnóstico de AML de novo foi exibido a partir de 7 centros médicos franceses entre junho de 2016 e julho de 2017, e seguido até junho de 2018 (ClinicalTrials Identifier NCT02928523). Pacientes com leucemia promielocítica aguda e/ou que sofrem de outra doença grave, incluindo transtornos digestivos (doença inflamatória do intestino, colite grave...), ou que receberam antibioterapia até 4 dias antes da inclusão no estudo foram excluídos desse ensaio (Tabela 1). A segurança bacteriológica nas fezes coletadas imediatamente após a inclusão foi avaliada, e a detecção de bactérias de MDR, patógenos bacterianos, Clostridium difficile, parasitas, norovírus e/ou rotavírus levaram à exclusão dos pacientes.

Por fim, a coorte de tratamento foi composta por 25 pacientes que atenderam a todos os critérios de inclusão (Tabela 2). - Pacientes com ≥ 18 e ≤ 75 anos de idade com diagnóstico de novo de AML ou MDS de HR para os quais a quimioterapia de Critérios indução intensiva é esperada dentro de 10 dias após a admissão; de inclusão - Pacientes dispostos a doar amostras de fezes e seguir as recomendações do protocolo; - Assinatura de consentimento informado e escrito.

- Leucemia promielocítica aguda; - Alergia ou intolerância conhecida à trealose ou maltodextrina; - Gravidez (teste urinário ou sanguíneo positivo em mulheres com potencial para engravidar); - Doença grave com expectativa de vida < 3 meses; - Outro protocolo de intervenção em andamento que pode interferir no estudo; - Não elegibilidade para coleta de fezes autólogas sob admissão: - Pacientes que se recusam a consentir; - Antibioterapia no momento da inclusão do estudo ≥ 4 dias; - Diagnóstico concomitante ou prévio de uma doença inflamatória intestinal significativa (UC, CD) ou outra doença digestiva progressiva que requer tratamento ou exploração médica adicional; - Presença de colite grave de qualquer etiologia no momento Critérios da admissão ou transtornos digestivos graves (diarreia aguda ou de exclusão crônica) nos 3 meses anteriores à inclusão; - Presença de sangue nas fezes coletadas no momento da inclusão; - Paciente recebendo uma colonoscopia recente (nos 3 meses anteriores à inclusão); - Detecção de MDRB, bactérias patogênicas, parasitas, norovírus e/ou rotavírus durante a triagem de fezes autólogas coletadas imediatamente após a visita de inclusão; - Não elegibilidade para transplante de inóculo: mucosite, colite ou hemorroidas persistentes, presença de sangue nas fezes de mais de 1 paciente em 3 na semana anterior ao transplante; - Inviabilidade do procedimento de inóculo: recusa do paciente, incompatibilidade técnica ou biológica do inóculo; - Ausência de método anticoncepcional eficaz para mulheres com potencial para engravidar; - Lactação; - Incapacidade de dar consentimento informado.

Tabela 1: Seleção de pacientes para o estudo

Matéria-prima insuficiente; n=14 (23 %) Relacionado à fabricação Falha logística; n=4 (6 %) de IMP n=22 (35 %) Controle de qualidade para liberação em lote não alcançada; n=4 (6 %) FMT não realizado devido à condição do paciente; n=6 (10 %) Retirada de consentimento; n=2 (3 %) Relacionado ao paciente Diagnóstico de AML Não confirmado; n=l n=15 (24 %) (2 %) Transporte de MDRB ou C. difficile em diagnóstico; n=6 (10 %) Tabela 2: Razões para falha na triagem (n=37)

[92] Imediatamente após a inclusão dos pacientes e antes do início da quimioterapia de indução (IC) e qualquer antibioterapia, fezes e sangue foram coletados (Visita V1, dia 0) (consulte a Figura 1 para fluxograma do estudo). As análises bacteriológicas, bioquímicas e metagenômicas foram realizadas nas amostras de fezes, e as análises imunológicas e bioquímicas nas amostras de plasma. As fezes foram fabricadas e armazenadas como produtos de AFMT em uma plataforma de Boas Práticas de Fabricação (GMP) para futuro tratamento de pacientes. O paciente foi, então, hospitalizado para o início da IC e foi monitorado clínica e biologicamente de acordo com os procedimentos padrão dos departamentos de hematologia. Após a recuperação hematopoiética, fezes e sangue foram coletados dentro de 2 dias antes da descontinuação do antibiótico para análises bioquímicas, bacteriológicas, metagenômicas e imunológicas (Visita V2). O AFMT foi realizado 24 horas após a suspensão dos antibióticos (ao final da IC e antes do início da quimioterapia de consolidação), após enema retal na noite anterior e/ou 1 hora antes do procedimento. Os pacientes receberam 2 inóculos de 150 ml contendo 30 g de fezes com um dia de intervalo usando uma sonda retal introduzida em seu reto e foram monitorados durante todo o tempo do processo de transplante e até a alta hospitalar. Antes do início da quimioterapia de consolidação, fezes e sangue foram coletados para as mesmas análises anteriores (Visita V3), e ao final da hospitalização, uma última amostra de fezes foi coletada (Visita V4). A qualidade de vida dos pacientes foi avaliada em cada visita (V1 a V4), por meio de um questionário EQ-5D-5L avaliando a mobilidade, autocuidado, atividades habituais, dor/desconforto, ansiedade e depressão. Finalmente, após 6 meses (Visita V5) e 1 ano (Visita V6), informações clínicas e avaliação de segurança foram relatadas.

[93] Entre os 25 pacientes tratados, 4 pacientes receberam AFMT após a primeira quimioterapia de consolidação e não antes devido à condição do paciente (AFMT não era viável por causa de colite ou hemorroidas) e um desvio de protocolo foi observado em um paciente: 20 pacientes foram considerados como o protocolo. Todas as Figuras e Tabelas apresentarão os dados obtidos desses pacientes, salvo se especificado o contrário. Produção de inóculos AFMT

[94] As fezes foram coletadas no momento da admissão do paciente, antes do início da IC. As fezes foram processadas dentro de 72 h com um diluente crioprotetor, como descrito nos documentos WO 2016/170285 (A1) e WO 2017/103550 (A1) em um dispositivo proprietário (semelhante àquele no documento WO 2016/170290 (A1)) sob condições GMP, filtradas, condicionadas e armazenadas sob congelamento a -80 °C até o transplante. Mais precisamente, uma primeira verificação visual garantiu a ausência de urina e sangue, e a avaliação da textura com base na escala de fezes de Bristol. Em seguida, as fezes foram pesadas para adequação da quantidade de diluente crioprotetor a ser utilizado. O diluente foi, então, adicionado ao dispositivo, e uma mistura suave de ambos garantiu a homogeneização da suspensão. A suspensão é filtrada ao mesmo tempo que a mistura passa pela peneira. Todas essas etapas são realizadas em dispositivo hermeticamente fechado, garantindo que nenhum ar entre em contato com a microbiota. A suspensão é, então, coletada pela porta inferior do dispositivo e acondicionada por sistemas fechados e tubos em um saco plástico criorresistente, exibindo várias conexões, para permitir a entrada e saída do produto por vias separadas. As amostras são coletadas no final dessa etapa para serem usadas como QC. O produto é finalmente armazenado a -80 °C. Os testes microbiológicos (realizados nas fezes frescas de acordo com o guia da Agência de Saúde) e a avaliação de viabilidade por citometria de fluxo são finalmente realizados antes da liberação do produto.

[95] Paralelamente, foi realizada uma triagem microbiológica rigorosa (consulte a seção Análises microbiológicas e a Tabela 3) e permitiu a liberação do Produto Medicinal em Investigação (ME) após um período de quarentena.

Microbiologia C. PCR (fezes) difficile Norovírus PCR Rotavírus Imunocromatografia

MDRB MRSA PCR VRE et GRE Cultura (2 meios específicos) ESBLs Cultura (2 meios específicos) Carbapenemases Cultura (2 meios específicos) Bactérias Campylobacter sp PCR patogênicas Listeria sp Cultura (ALOA) Salmonella sp PCR Shigella sp PCR Vibrio sp Cultura (após enriquecimento) Yersinia sp Cultura (Cefsulodina- lrgasano- Novobiocina) Parasitas Strongyloides Concentração de stercoralis, Cyclospora, fezes - Isospora, Entamoeba coprocultura e PCR histolytica, Giardia intestinalis, Cryptosporidium, Microsporidies, Dientamoeba fragilis, Blastocystis hominis Tabela 3: Lista de testes de triagem realizados em fezes para liberação de lote Análise microbiológica

[96] Detecção de C. difficile, Salmonella sp., Shigella sp., e bactéria de MDR (Staphylococcus aureus resistente a meticilina, Enterococci resistente à vancomicina e glicopeptida, bactéria de produção de beta-lactamase de espectro estendido (ESBL) e bactéria de produção de carbapenemase) foi realizada em amostras de fezes coletadas durante as primeiras três visitas com uso de PCR e cultura em meios de isolamento específico, respectivamente. Parasitas, vírus e bactérias patogênicas foram triados nas amostras de fezes coletadas durantes a primeira visita para verificar a segurança das fezes para uso de AFMT. Parasitas foram detectados usando PCR (Microsporidia, Dientamoeba fragilis) ou microscopia (Strongyloides stercoralis, Cyclospora sp., Isospora sp., Entamoeba histolytica, Giardia intestinalis, Cryptosporidium sp., Blastocystis hominis) após concentração de fezes. Norovírus e Rotavírus foram identificados por PCR e imunocromatografia respectivamente, e bactéria patogênicas foram detectadas usando PCR (Campylobacter) e cultura (Listeria sp., Vibrio sp., Yersinia sp.). Análise bioquímica e imunológica

[97] As análises bioquímicas e imunológicas foram realizadas nas diferentes amostras de sangue e fezes coletadas durante as três primeiras visitas. Neopterina e IgA secretora (slgA) foram medidas a partir de sobrenadantes de fezes usando os kits Neopterin ELISA (IBL International) e ELISA de IgA Secretora Humana (EUROBIO), respectivamente. O estado antioxidante total (TAS) foi medido a partir do plasma usando o kit Hitachi 912 (RANDOX Laboratories), a PCR e a ferritina foram medidas a partir de amostras de plasma/soro em diferentes centros médicos de acordo com seus próprios procedimentos internos. Os marcadores imunológicos foram medidos a partir de amostras de plasma: IL6 e TNFα (kit Citocina Humana/Painel de Microesfera Magnético de Quimiocina (EMD Millipore)); CD14 solúvel (sCD14) (kit ELISA de Quanticina de CD14 Humano (Sistema R&D). Isolamento de DNA e sequenciamento metagenômico

[98] O DNA genômico foi extraído das amostras de fezes coletadas durante as quatro primeiras visitas usando o kit NucleoSpin Soil (Macherey Nagel). Uma biblioteca de sequenciamento foi construída para cada amostra de DNA usando o kit TruSeq (lllumina) de acordo com as instruções do fabricante. As bibliotecas foram então sequenciadas em 2 execuções HiSeq2500 (lllumina) de extremidade pareada (2 x 125 bp). Análises de bioinformática

[99] Após a filtragem de qualidade usando Trimmomatic (Bolger, Lohse e Usadel, 2014), a descontaminação de sequência de hospedeiro foi realizada usando Bowtie2 (Langmead, Ben e Salzberg, 2013). Assim, entre 936060 e 37212124 pares de leituras (média: 34811750 pares de leituras) foram obtidos a partir das diferentes amostras. Para comparação justa, o número de sequência de cada amostra foi normalizado aleatoriamente para a mesma profundidade de sequenciamento, ou seja, 1500000 sequências de extremidades pareadas por amostra. O perfil taxonômico foi, então, realizado com Kraken v.0.10.5-beta (Wood 2014) e o banco de dados genômico RefSeq (versão de junho de 2015, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/). A medida dos índices de diversidade α e β medianos foi realizada em R

Statistical Software após 10 subamostragens (R Core Team 2015, versão 3.4.4, http://www.R-project.org) usando pacotes vegan e phyloseq. A proporção de bactérias benéficas foi definida como a soma das abundâncias relativas (com base no perfil taxonômico da microbiota) de famílias microbianas benéficas: Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, Bifidobacteriaceae, Streptococcaceae, Akkermansiaceae, Lactobacillaceae, Eubacteriaceae, Erysipelotrichaceae, Eggerthellaceae, Clostridiaceae, Prevotellaceae e Oscillospiraceae. Da mesma forma, a proporção de bactérias prejudiciais foi definida como a soma das abundâncias das famílias Bacteroidaceae e Enterococcaceae.

[100] Análises baseadas em genes e antibiorresistência foram realizadas por meio de mapeamento de genes com Bowtie 2 usando o Catálogo Genético Integrado (IGC) (Li et al., 2014) e bases de dados de MEGARes (https://megares.meglab.org/), respectivamente. Análises estatísticas

[101] As relações de V3/V1 e V2/V1 dos seguintes parâmetros foram comparadas devido a um teste t pareado bilateral: - Índices de riqueza para espécies e genes - Índice Simpson para Espécies O teste pareado de Wilcoxon foi aplicado aos seguintes parâmetros: - Número de cópias de resistência a antibióticos - Bactéria benéfica-prejudicial (%) - Índice Bray-Curtis - CRP, Ferritina, Neopterina, IL-6, sCD14, IgA, TNFα,

TAS

RESULTADOS Características de paciente

[102] Um total de 62 pacientes de AML foram triados em nesse estudo em 7 diferentes centros, 25 foram tratados com AFMT, e 20 foram considerados como a população por protocolo em que as seguintes análises foram realizadas. As características de linha de base dos pacientes tratados e por protocolo estão listadas na Tabela 4. Havia mais homens que mulheres na população de pacientes por protocolo (proporção de 3:1) e a idade média era de 50 anos. A maioria dos pacientes (80 % dos pacientes tanto tratados quanto por protocolo) foi considerada como tendo LMA de risco intermediário, enquanto 3 e 2 pacientes da população tratada eram dos grupos de risco favorável e desfavorável, respectivamente. Todos os pacientes receberam quimioterapia por indução intensiva (regime clássico “3+7” ou equivalente). Pacientes tratados Pacientes por (n=25) protocolo (n=20) n° % n° % Masculino 18 72,00 15 75,00 Gênero Feminino 7 28,00 5 25,00 Dados ausentes 0 0,00 0 0,00 Média 50,68 - 49,05 - Idade em Mediana 52 - 50 - inclusão Faixa [24-68] - [24-68] - (anos) Dados ausentes 0 - 0 - Favorável 3 12,00 2 10,00 Categoria Intermediário 20 80,00 16 80,00 De risco Desfavorável 2 8,00 2 10,00 Dados ausentes 0 0,00 0 0,00

Média 27,44 - 28,32 - Mediana 26,33 - 26,54 - BMI em [19,72- [21,24- inclusão Faixa - - 41,34] 41,34] Dados ausentes 0 - 0 - BMI: Índice de Massa Corporal Tabela 4: Dados demográficos de base e características clínicas dos pacientes tratados e por protocolo. Resultados de segurança

[103] O tempo médio de retenção do produto AFMT foi maior do que o esperado (189,50 min e 173,33 min para o primeiro e segundo AFMT, respectivamente, em vez dos 120 min recomendados) demonstrando a viabilidade do procedimento de enema e a ausência de desconforto para os pacientes.

[104] Durante o tratamento de AFMT, não foram observadas alterações prejudiciais nos sinais vitais dos pacientes tratados (frequência cardíaca, pressão arterial). Desse modo, durante as primeiras 24 h após AFMT, 5 casos adversos (EAs) foram relatados em 4 pacientes tratados (16 %). (Tabela 5).

[105] Nenhum caso adverso sério (SAEs) foi relatado durante esse período na população tratada. SOC PT nº (%) Transtornos Dor abdominal 1 (20 %) gastrointestinais Diarreia 2 (40 %) Transtornos gerais e condições de local de Pirexia 1 (20 %) administração

Investigações Peso aumentado 1 (20 %) Tabela 5: AEs de 24 horas após AFMT por SOC em pacientes tratados (n=25).

[106] Após as primeiras 24 horas após o AFMT e até o final do período de acompanhamento de 1 ano, 415 EAs foram relatados em 24 dos 25 pacientes tratados (96 %) (Tabela 6). Dentre esses, 2 estavam relacionados ao procedimento de enema e 1 ao produto de AFMT. Todos os outros AEs estavam de acordo com os perfis de pacientes com leucemia. Os AEs mais comuns eram doenças do sangue e do sistema linfático (n = 58; 14 %), transtornos gastrointestinais (n=78; 19 %), transtornos gerais e condições de local de administração (n=39; 9 %), e infecções e infestações (n=88; 21 %). A maioria dos EAs ocorreu entre a inclusão e AFMT (V1-V2) (taxa de incidência de 27,06 %) e entre a visita V3 e a visita V4 (taxa de incidência de 15,07 %) (Figura Suplementar S2). Além disso, 30 casos adversos graves (EAGs) foram relatados em 15 pacientes (15 %) (Tabela 7), a maioria dos mesmos sendo infecções e infestações (n = 13; 43 %). Quanto aos AEs, a maioria dos SAEs ocorreu entre a inclusão e AFMT (V1-V2) (taxa de incidência de 1,57 %) e entre a visita V3 e a visita V4 (taxa de incidência de 0,90 %). Nenhum desses SAEs ocorreu durante o primeiro mês após AFMT, e apenas um foi declarado como possivelmente relacionado ao tratamento de AFMT pelo investigador do centro. O paciente apresentou hipertermia e sintomas gastrointestinais 93 dias após o segundo AFMT e foi diagnosticado com sepse por Escherichia coli. O histórico médico anterior do indivíduo incluía colonização por E.

coli multirresistente a fármaco nas fezes após a hospitalização para quimioterapia de consolidação, ou seja, 22 dias após o segundo AFMT.

Após a antibioterapia, o paciente se recuperou totalmente.

Essa bactéria multirresistente à fármaco não foi detectada nas fezes coletadas no início da quimioterapia de consolidação.

Esse SAE ocorreu 3 meses após o AFMT, o que suscita a questão de sua ligação com o tratamento administrado.

SOC nº (%) Transtornos de sistema linfático e sanguíneo 58 (14 %) Transtornos cardíacos 2 (0 %) Transtornos congênitos, familiares e genéticos 8 (2 %) Transtornos oculares 1 (0 %) Transtornos gastrointestinais 78 (18 %) Transtornos gerais e condições de local de 39 (9 %) administração Transtornos hepatobiliares 8 (9 %) Transtornos de sistema imune 6 (1 %) Infecções e infestações 88 (21 %) Lesões, envenenamento e complicações do 13 (3 %) procedimento Investigações 20 (5 %) Transtornos de nutrição e metabolismo 14 (3 %) Transtornos musculoesqueléticos e de tecidos 12 (3 %) conjuntivos Transtornos de sistema nervoso 18 (4 %) Transtornos psiquiátricos 5 (1 %) Transtornos renais e urinários 2 (0 %) Transtornos de mama e sistema reprodutor 1 (0 %) Transtornos respiratórios, torácicos e do 17 (4 %) mediastino

Transtornos de pele e tecido subcutâneo 15 (4 %) Procedimentos cirúrgicos e médicos 1 (0 %) Transtornos vascular 9 (2 %) Tabela 6: AEs após as primeiras 24 horas após AFTM por SOC em pacientes tratados (n=25).

SOC nº (%) Transtornos de sistema linfático e 1 (3 %) sanguíneo Transtornos gastrointestinais 1 (3 %) Transtornos gerais e condições de local 3 (10 %) de administração Transtornos de sistema imune 3 (10 %) Infecções e infestações 13 (43 %) Lesões, envenenamento e complicações do 2 (6 %) procedimento Investigações 1 (3 %) Transtornos de nutrição e metabolismo 1 (3 %) Transtornos de sistema nervoso 1 (3 %) Transtornos respiratórios, torácicos e 2 (6 %) do mediastino Transtornos de pele e tecido subcutâneo 1 (3 %) Transtornos vascular 1 (3 %) Tabela 7: SAEs após as primeiras 24 horas após AFMT por SOC em pacientes tratados (n = 25).

[107] Quatro óbitos foram relatados entre os 25 pacientes tratados (16 %) (mesmos resultados na população por protocolo: 4 óbitos em 20 pacientes (20 %)) (Tabela 8). O tempo médio até o óbito do segundo AFMT foi de 182,5 dias (faixa: 113-225 dias). Um paciente faleceu de falência de múltiplos órgãos 34 dias após o TCTH (143 dias após AFMT). Outro paciente apresentou falência de múltiplos órgãos em um contexto de infecções durante aplasia pós-aloenxerto (113 dias após AFMT). Foi relatado ataque cardíaco após embolia pulmonar, possivelmente relacionado ao histórico médico de fibrilação atrial crônica e hipertensão arterial. O óbito ocorreu 225 dias após AFMT. O quarto óbito (222 dias após AFMT) foi devido a GvFID gastrointestinal resistente de grau IV, agravada por septicaemia por Klebsiella pneumoniae e Stenotrophomonas maltophilia produtores de ESBL, a presença de Enterobacter cloacae multirresistente nas urinas, reativação de citomegalovírus, viremia de herpesvírus humano tipo 6 e um contexto de encefalite aguda. Todos os óbitos foram considerados pelo investigador do centro e confirmados pelo Conselho de Monitoramento de Dados e Segurança (DMSB) como não relacionados ao tratamento de AFMT. 6 meses 12 meses Remissão completa 21 (84 %) 17 (68 %) Remissão parcial 1 (4 %) 1 (4 %) Progressão 0 (0 %) 3 (12 %) Óbito 3 (12 %) 4 (16 %) Tabela 8: Resultados clínicos de pacientes tratados (n=25).

[108] A Qualidade de vida do paciente por protocolo foi avaliada ao longo do estudo clínico. Os dados obtidos mostraram que os resultados do questionário após AFMT (V3) foram similares ou tenderam a melhorar em comparação aos de V2 antes de AFMT (especialmente autocuidado, atividades habituais e parâmetros de ansiedade e depressão), o que destaca a ausência de impacto negativo de AFMT na saúde geral dos pacientes (Tabela 9). Da mesma forma, nenhuma variação significativa de BMI foi observada ao longo do estudo para os pacientes tratados, mas o peso médio tendeu a aumentar entre V2 e V3 (26,89 a 27,26), sugerindo a ausência de problemas digestivos nos pacientes tratados.

Parâmetros Estatísticas DO D29 D40 D70 Ausente 3 4 6 7 Não tenho 16 14 problemas em 18 (81,82 %) 18 (85,71 %) (84,21 %) (77,78 %) andar Eu tenho pequenos 3 3 3 (13,64 %) 3 (14,29 %) problemas em (15,79 %) (16,67 %) andar Mobilidade Eu tenho problemas 1 (4,55 %) 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) 1 (5,56 %) moderados para andar Tenho graves problemas 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) para andar Eu não 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) consigo andar Ausente 3 4 5 7 Não tenho problemas 19 16 21 (95,45 %) 19 (90,48 %) para me lavar (95,00 %) (88,89 %) ou me vestir Tenho alguns problemas 2 1 (4,55 %) 2 (9,52 %) 1 (5,00 %) para me lavar (11,11 %) ou me vestir Autocuidados Tenho problemas moderados 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) para me lavar ou me vestir Tenho graves problemas 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) para me lavar ou me vestir

Parâmetros Estatísticas DO D29 D40 D70 Não consigo me lavar ou 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) me vestir Ausente 5 4 5 7 Não tenho problemas para fazer 15 11 12 (60,00 %) 13 (61,90 %) minhas (75,00 %) (61,11 %) atividades habituais Tenho alguns problemas para fazer 4 5 4 (20,00 %) 6 (28,57 %) minhas (20,00 %) (27,78 %) atividades habituais Tenho Atividades problemas habituais moderados 2 para fazer 2 (10,00 %) 2 (9,52 %) 1 (5,00 %) (11,11 %) minhas atividades habituais Tenho graves problemas para fazer 1 (5,00 %) 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) minhas atividades habituais Não consigo fazer minhas 1 (5,00 %) 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) atividades habituais Ausente 3 4 5 7 Dor / Não tenho dor 16 13 Desconforto ou 10 (45,45 %) 17 (80,95 %) (80,00 %) (72,22 %) desconforto

Parâmetros Estatísticas DO D29 D40 D70 Tenho um pouco de dor 4 4 8 (36,36 %) 4 (19,05 %) ou (20,00 %) (22,22 %) desconforto Tenho dor ou desconforto 4 (18,18 %) 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) 1 (5,56 %) moderado Tenho grave dor ou 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) desconforto Tenho dor ou desconforto 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) extrema Ausente 3 4 5 8 Não sou 15 8 ansioso ou 11 (50,00 %) 14 (66,67 %) (75,00 %) (47,06 %) deprimido Sou um pouco 3 6 ansioso ou 5 (22,73 %) 4 (19,05 %) (15,00 %) (35,29 %) deprimido Sou moderadamente 2 3 Ansiedade e 4 (18,18 %) 3 (14,29 %) ansioso ou (10,00 %) (17,65 %) depressão deprimido Sou gravemente 2 (9,09 %) 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) ansioso ou deprimido Sou extremamente 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) 0 (0,00 %) ansioso ou deprimido N (Ausente) 20(5) 21 (4) 20 (5) 17 (8) 61,05 76,24 78,75 71,47 Sua saúde Média (DP) (26,05) (16,44) (16,61) (15,49) atual (45,00;100,0 (50,00;95, (40,00;95, (Mín;Máx) (9,00;95,00) 0) 00) 00)

Parâmetros Estatísticas DO D29 D40 D70 62,50 80,00 85,00 70,00 Média (Q1;Q3) (47,50;80,00 (70,00;90,00 (65,00;95, (65,00;80, ) ) 00) 00) Tabela 9: Estatísticas descritivas do questionário de qualidade de vida para pacientes tratados

[109] A segurança do AFMT foi avaliada pela medição dos parâmetros inflamatórios tanto localmente no intestino quanto sistematicamente no plasma durante as 3 primeiras visitas. Em uma abordagem sistêmica, medimos proteínas inflamatórias e citocinas no plasma, como Proteína C Reativa (PCR), ferritina, IL-6, TNFα e sCD14 (Figuras 2 e 3). Observamos um aumento significativo de CRP em V2 (V1: 11,80 ± 18,25 mg/l; V2: 24,40 ± 23,92 mg/l; p = 0,04) e um retorno para a linha de base em V3 (V3: 10,16 ± 22,07 mg/l; V2 vs V3: p= 0,02). Os níveis de ferritina seguiram as mesmas variações com um aumento em V2 e um retorno à linha de base em V3. Tendências adicionais foram observadas com a quantificação de outros parâmetros inflamatórios não mostrando aumento significativo de IL-6, TNFα e sCD14 após o tratamento de AFMT (Figura 3). Também foi medido o Status Antioxidante Total (TAS) no plasma como um marcador de estresse oxidativo que pode ser induzido por alterações da microbiota intestinal. Estudos anteriores relataram que o estresse oxidativo está intimamente relacionado à ocorrência e ao desenvolvimento de cânceres (Wu et al., 2017) e também está associado à disbiose intestinal. O estresse oxidativo que ocorre durante a inflamação é um fator que amplifica a disbiose, diminuindo-se fortemente a diversidade microbiana no intestino e promovendo-se o crescimento de taxa bacteriana específica (Weiss e Hennet, 2017). Observamos uma diminuição dos níveis de TAS entre V1 e V2 (V1: 1,33 ± 0,09 mmol/l; V2: 1,31 ± 0,19 mmol/l) e um aumento significativo após AFMT (V3: 1,59 ± 0,58 mmol/L; p=0,006) que pode estar associado à restauração da microbiota intestinal.

[110] A imunidade local e a inflamação no intestino foram avaliadas medindo-se a neopterina fecal e a IgA secretora. A neopterina é produzida e liberada a partir de macrófagos ativados estimulados com vários indutores, como IFNy, TNFα e componentes bacterianos (Nancey et al., 2013) e reflete o grau de resposta imune mediada por células e, portanto, os níveis de inflamação intestinal. Observamos um aumento significativo dos níveis médios de neopterina fecal após IC (V1: 2,79 ± 4,02 ng/g de fezes versus V2: 32,70 ± 40,15 ng/g de fezes; p=0,0006) destacando o estado inflamatório intestinal esperado dos pacientes após IC e antibioterapia. Os níveis diminuíram significativamente e voltaram à linha de base após AFMT (V3: 5,41 ± 7,42 ng/g de fezes; p =0,001). Essas variações estão de acordo com as variações de CRP. Como um espelho da imunidade local, IgA secretora também foi medida nas fezes e tendências similares foram observadas (V1: 1,95 ± 2,05 mg/g de fezes; V2: 2,75 ± 1,81 mg/g de fezes; V3: 2,39 ± 2,15 mg/g de fezes). Em conjunto, esses dados apontam claramente para a ausência de qualquer reação inflamatória prejudicial, tanto local quanto sistematicamente após AFMT. Avaliação da composição de microbiota intestinal

[111] O impacto da IC e do tratamento de AFMT subsequente na riqueza filogenética e diversidade da microbiota fecal em pacientes por protocolo foi então examinado. Os inventores demonstraram que IC induz uma mudança dramática nas comunidades microbianas, com uma diminuição estatisticamente significativa dos índices de diversidade α entre V1 e V2 no nível de espécie: Redução estimada de 39,3 % na riqueza média (960,45 a 589,71 espécies; p <0,001) (Figura 4a) e redução estimada de 42,3 % no índice de Simpson médio (0,85 a 0,50; p<0,001) (Figura 4b e Figura 5). Após tratamento de AFMT, riqueza de espécies (957,70 espécies; p<0,001) e índice de Simpson (0,86; p<0,001) voltou ao seu nível inicial sem diferença estatística entre os valores em V1 e V3. Assim, a microbiota intestinal em V3 após AFMT é reconstruída em mais de 90 % na população por protocolo com base na riqueza e no índice de Simpson em nível de espécie (p <0,001). Esta modificação das comunidades microbianas também é observada com medidas de diversidade β (Figura 4c e Figura 5). Na verdade, o índice de dissimilaridade de Bray-Curtis (BC) demonstra a indução de uma disbiose microbiana após IC (BC médio V1-V2: 0,76) e a restauração das comunidades microbianas após o tratamento de AFMT, cuja composição é mais próxima das comunidades iniciais ao nível de espécie (BC médio BC V1-V3: 0,40). (Figura 5).

[112] A proporção de bactérias benéficas e prejudiciais na microbiota de pacientes por protocolo entre V1 e V3 (Figuras 5a e 5b) foi então medida. A proporção de bactérias benéficas foi significativamente reduzida entre V1 e V2 (média V1: 5,54 %; V2: 2,43 %; p <0,01) e foi, então, aumentada para retornar ao seu nível de linha de base em V3 após AFMT (média V3: 6,82 %). Ao contrário, a proporção de bactérias prejudiciais aumentou significativamente em V2 (média V1: 10,95 %; V2: 32,29 %; p <0,5) e diminuiu para retornar ao seu status inicial em V3 após AFMT (média V3: 10,65 %).

[113] A fim de avaliar a riqueza funcional da microbiota intestinal ao longo do tratamento, o número total de genes na microbiota intestinal de pacientes por protocolo foi avaliado por meio de mapeamento de leituras contra o banco de dados de IGC. Os resultados demonstram que o número médio de genes é significativamente reduzido em 78 % (531500,20 a 21361,50 no total de genes; p <0,001) após IC e aumentou significativamente após AFMT (424374,15 genes) de modo que mais de 70 % da riqueza de genes inicial sejam recuperados para a população por protocolo (p = 0,025) (Figura 4d, Figura 5). Determinação de uma lista refinada de produtores de ácido butírico, associada à inflamação diminuída com base nos dados clínicos:

[114] Com base em uma lista de 34 gêneros produtores de butirato construída a partir da literatura, os inventores realizaram um teste de correlação entre o nível de cada gênero e neopterina fecal (marcador de inflamação) em pacientes no ensaio ODYSSEE para determinar uma lista refinada de produtores de butirato, (chamada de butycore). As correlações de Spearman e os testes de correlação de Spearman foram computados com R (teste de correlação de função do pacote de estatísticas). Nenhuma correção de teste múltiplo foi aplicada para essas análises. Resultados:

[115] Uma lista de 15 gêneros produtores de butirato que estão significativamente correlacionados com a neopterina fecal e têm uma abundância relativa estimada > 0,1 % no estudo ODYSSEE foi determinada. Essa lista é composta dos gêneros Blautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, Subdoligranulum e Butyrivibrio (consulte a Tabela 10). Produtores de Correlação de Valor p de Prevalência RA médio butirato Odyssee teste de cor de Odyssee de (literatura) Spearman de Odyssee (V1) Odyssee (V1) Blautia -0,50 1,54E-05 100,00 5,39 Faecalibacterium -0,54 2,02E-06 100,00 5,28 Faixas de AM -0,47 6,06E-05 100,00 4,75 Eubacterium -0,66 1,05E-09 100,00 1,54 Bifidobacterium -0,48 3,41E-05 92,00 1,24 Ruminococcus -0,68 2,47E-10 100,00 1,13 Clostridium -0,61 4,58E-08 100,00 0,95 Coprococcus -0,59 1,42E-07 100,00 0,86 Odoribacter -0,53 3,11E-06 100,00 0,63 Roseburia -0,64 6,44E-09 100,00 0,56 Holdemanella -0,56 7,90E-07 80,00 0,34 Anaerostipes -0,51 1,04E-05 96,00 0,25 Oscillibacter -0,60 6,19E-08 100,00 0,21 Subdoligranulum -0,56 7,04E-07 100,00 0,17 Butyrivibrio -0,59 1,13E-07 88,00 0,14 Tabela 10. Quinze gêneros produtores de butirato com base na análise de correlação e filtragem de abundância relativa.

[116] No ensaio ODYSSEE, os 15 gêneros produtores de butirato se correlacionaram negativamente com a neopterina fecal e plasmática e CRP. A abundância relativa diminui em V2 após a quimioterapia e IC, e é restaurada à linha de base em V3 após o tratamento de AFMT. Para a maioria dos pacientes, a maioria dos 15 gêneros estão presentes em V1 (linha de base), a maioria dos gêneros é eliminada em V2 e restaurada devido ao FMT em V3, que mostra um butycore similar ao medido em V1 (Figura 6). Descolonização de MDRB

[117] A presença de C. difficile e MDRB nas fezes dos pacientes foi avaliada entre V1 e V3 por análise de genes de resistência no conjunto de dados metagenômicos.

[118] As leituras de sequenciamento total foram mapeadas na base de dados de genes de antibiorresistência MEGARes. Foi visto que IC e tratamentos com antibióticos associados induziram um aumento significativo no número médio de leituras mapeadas contra genes de antibiorresistência em V2 (167546 a 371465 leituras, p <0,01) para pacientes por protocolo. Então, uma redução significativa de 43 % do número médio de leituras mapeadas foi observada em V3 após AFMT (211127 leituras, p <0,001). Resultados clínicos

[119] Resultados clínicos estão resumidos na Tabela 2. O tempo médio de acompanhamento para pacientes mortos foi de 7,13 meses (faixa, 4,8-8,5 meses). Aos 6 meses, a taxa de sobrevivência geral (OS) foi de 88 % (3 mortes) (Figura 8). Entre os pacientes tratados, 21 (84 %) alcançaram a remissão completa com base na resposta hematológica, e 1 (4 %) alcançou remissão parcial. A taxa de SG em 1 ano foi de 84 % (4 mortes) para a população tratada (Figura 8). Um total de 17 pacientes (68 %) ainda estava em remissão completa em 12 meses, e 1 paciente (4 %) estava em remissão parcial. Além disso, uma progressão de leucemia foi observada em 3 (12 %) dos pacientes tratados em um ano. Exemplo 2: Resultados do estudo clínico Osiris mostrando que a disbiose iatrogênica e a inflamação intestinal não normalizam na ausência de FMT

PACIENTES E MÉTODOS Pacientes e projeto de estudo

[120] Um total de 62 pacientes com suspeita de infecção óssea e articular (BJI) foram selecionados em 5 centros médicos franceses entre janeiro de 2017 e setembro de 2017 e acompanhados até março de 2018 (ClinicalTrials Identifier NCT03011502). Os pacientes foram classificados em 3 categorias da seguinte forma: nativos (n = 27, média de idade = 56), osteossíntese (n = 13, média de idade = 52) e BJI de próteses (n = 22, média de idade = 66). - O indivíduo está disposto, capaz de compreender e cumprir as exigências de protocolo - Mais de 18 anos Critérios de - Indivíduo é suspeito de BJI inclusão implantado ou nativo e é elegível para tratamento com antibióticos - Indivíduo assinou o Termo de Consentimento de Informação

- Gravidez - Doença grave com expectativa de vida < 3 meses - Qualquer Antibioterapia nos 14 dias Critérios de antes da inclusão exclusão - Tutela, curadoria de pacientes - Paciente não afiliado ao sistema de saúde - Paciente sob custódia Tabela 11: Seleção de pacientes para o estudo de OSIRIS

[121] Imediatamente após a inclusão dos pacientes e antes do início da antibioterapia, fezes e sangue foram coletados (Visita V1, dia 0) (consulte a Figura 8 para fluxograma do estudo). As análises bacteriológicas, bioquímicas e metagenômicas foram realizadas nas amostras de fezes, e as análises bioquímicas nas amostras de plasma. Após o término da antibioterapia, fezes e sangue foram coletados para análises bioquímicas, bacteriológicas e metagenômicas (Visita V3). Duas semanas após a descontinuação da antibioterapia, fezes e sangue foram coletados para as mesmas análises anteriores (Visita V4). A qualidade de vida dos pacientes foi avaliada em cada visita (V1 a V4), por meio de um questionário EQ-5D-5L avaliando a mobilidade, autocuidado, atividades habituais, dor/desconforto, ansiedade e depressão). Finalmente, após 6 meses pós-inclusão (Visita V5), informações clínicas e avaliação de segurança foram relatadas. Análise microbiológica

[122] Detecção de C. difficile, Salmonella sp.,

Shigella sp., e bactéria de MDR (Staphylococcus aureus resistente a meticilina, Enterococci resistente à vancomicina e glicopeptida, bactéria de produção de beta- lactamase de espectro estendido (ESBL) e bactéria de produção de carbapenemase) foi realizada em amostras de fezes coletadas durante as cinco visitas com uso de PCR e cultura em meios de isolamento específico, respectivamente. Análises bioquímicas

[123] As análises bioquímicas foram realizadas em amostras de fezes coletadas durante as visitas V1, V3 e V4. Neopterina e IgA secretora (slgA) foram medidas a partir de sobrenadantes de fezes usando os kits Neopterin ELISA (IBL International) e ELISA de IgA Secretora Humana (EUROBIO), respectivamente. CRP foi medida a partir das amostras de plasma nos diferentes centros médicos de acordo com seus próprios procedimentos internos. Isolamento de DNA e sequenciamento metagenômico

[124] O DNA genômico foi extraído das amostras de fezes coletadas durante as quatro primeiras visitas usando o kit NucleoSpin Soil (Macherey Nagel). Uma biblioteca de sequenciamento foi construída para cada amostra de DNA usando o kit TruSeq (lllumina) de acordo com as instruções do fabricante. As bibliotecas foram então sequenciadas em 2 execuções HiSeq2500 (lllumina) de extremidade pareada (2 x 125 bp). Análises de bioinformática

[125] Após a filtragem de qualidade usando Trimmomatic (Bolger, Lohse e Usadel, 2014), a descontaminação de sequência de hospedeiro foi realizada usando Bowtie2 (Langmead, Ben e Salzberg, 2013). Para comparação justa, o número de sequência de cada amostra foi normalizado aleatoriamente para a mesma profundidade de sequenciamento, ou seja, 1500000 sequências de extremidades pareadas por amostra. O perfil taxonômico foi, então, realizado com Kraken v.0.10.5-beta (Wood 2014) e o banco de dados genômico RefSeq (versão de junho de 2015, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/). A medida dos índices de diversidade α e β medianos foi realizada em R Statistical Software após 10 subamostragens (R Core Team 2015, versão 3.4.4, http://www.R-project.org) usando pacotes vegan e phyloseq. Análises baseadas em genes e antibiorresistência foram realizadas por meio de mapeamento de genes com Bowtie 2 usando o Catálogo Genético Integrado (IGC) (Li et al., 2014) e bases de dados de MEGARes (https://megares.meglab.org/), respectivamente. Análises estatísticas

[126] Testes t pareados

RESULTADOS Características de paciente

[127] Um total de 62 pacientes com BJI foi selecionado em nosso estudo em 5 centros diferentes, 42 foram considerados como a intenção de tratar a população na qual algumas análises foram realizadas. As características de linha de base dos pacientes totais e por protocolo estão listadas na Tabela 12. Havia mais homens do que mulheres em pacientes por protocolo (razão de 2:1) e a idade média foi de 59 anos. Pacientes totais n° % Sexo Masculino 40 64,50

Feminino 22 35,50 Dados ausentes 0 0,00 Idade em inclusão (anos) Média 59 - BMI em inclusão Média 27,45 - SOC AEs gastointestinais 36 (96 AE) 69,2 % penicilinas - - cefalosporinas - - Antibioterapia aminosídeos - - quinolonas - - Tabela 12: Características clínicas e demográficas de linha de base. BMI: Índice de Massa Corporal

[128] Desse modo, a imunidade local e a inflamação no intestino foram avaliadas, medindo-se zonulina fecal, calprotectina, neopterina e IgA secretora. Observamos um aumento significativo dos níveis médios de neopterina fecal após a terapia com antibioterapia (V1: 97,7 ng/g de fezes versus 504 ng/g de fezes após o tratamento; p <0,001) destacando o estado inflamatório intestinal esperado dos pacientes após a antibioterapia. Os níveis não retornaram ao valor de linha de base duas semanas após o final da antibioterapia (285,4 ng/g de fezes; p =0,02). Essas variações estão de acordo com as concentrações de zonulina.

[129] Em conjunto, esses dados apontam claramente para a presença de uma reação inflamatória prejudicial, localmente, após antibioterapia. É digno de nota que quase 70 % dos pacientes do protocolo OSIRIS, sem tratamento FMT, sofreram de sintomas gastrointestinais. 9 dos mesmos, dos 42 pacientes com acompanhamento, apresentaram graves sintomas de diarreia. Avaliação da composição de microbiota intestinal

[130] O índice de dissimilaridade de Bray-Curtis (BC) medido no nível de espécie (dados não mostrados) demonstra a indução de uma disbiose microbiana após o tratamento antimicrobiano (BC médio V1-V3: 0,321) e a ausência de restauração da comunidade microbiana inicial após duas semanas (BC médio V1-V4: 0,367).

[131] No estudo OSIRIS, a abundância relativa dos 15 gêneros produtores de butirato discutidos acima também se correlaciona negativamente com a neopterina fecal e a abundância relativa de butycore diminui após o tratamento antimicrobiano. Exemplo 3: Perfil das bactérias da amostra de fezes usada para produzir a composição de microbiota fecal é mantido no produto final

[132] Os inóculos produzidos como descrito no documento WO 2016/170285 A1 em um dispositivo proprietário (similar ao descrito no documento WO 2016/170290 A1) permitem a excelente conservação de todas as famílias e gêneros de bactérias pertencentes à microbiota humana coletada. Além disso, o processo fechado evita a contaminação por outras bactérias ambientais.

[133] Quatro fezes frescas e inóculos produzidos de acordo com o processo descrito acima foram analisados usando análise de 16S rDNA. Todas as amostras foram armazenadas a -80 °C e o DNA foi extraído com o kit NucleoSpin® Soil (Macherey Nagel). As bibliotecas de rDNA 16S foram realizadas com o kit MyTag HS Mix (Bioline) usando iniciadores direcionados à região V3-V4. O sequenciamento foi realizado para obter 80.000-90.000 pares de leituras (160.000-180.000 leituras) por biblioteca. O sequenciamento de bibliotecas de rDNA 16S foi realizado usando um sequenciador MiSeq V3 2x300 bp (lllumina).

[134] A microbiota foi analisada em todos os níveis taxonômicos e os resultados para as principais famílias e gêneros são apresentados na Tabela 13 e na Tabela 14.

[135] Essas análises demonstram que o processo permite a conservação de todas as bactérias presentes nas fezes originais com abundâncias relativas próximas; geralmente mais de 90 % dos gêneros observados nas fezes iniciais são mantidos no produto congelado. Em vermelho: não detectado (valor <0,001 %)

Tabela 13: Abundâncias relativas (em %) das famílias principais identificadas em 4 fezes (SF identificado) e inóculos correspondentes (identificado IN)

Em vermelho: não detectado (valor <0,001 %) Tabela 14: Abundâncias relativas (em %) dos gêneros principais identificados em 4 fezes (SF identificado) e inóculo correspondente (IN identificado)

[136] Além disso, inóculos produzidos com o processo descrito foram usados para inocular camundongos axênicos. A microbiota fresca usada para preparar as amostras congeladas também foi inoculada em camundongos axênicos. Os dados apresentados no documento WO 2016/170285 (A1) mostram que foi encontrada excelente consistência entre os gêneros observados em camundongos inoculados com fezes frescas e camundongos inoculados com fezes processadas. Mais particularmente, o gênero Facelibacterium, conhecido por ser muito sensível a condições aeróbias, colonizou o intestino de camundongos no mesmo nível para ambos os grupos, enquanto em um grupo de controle inoculado com microbiota processada com NaCI, Faecalibacterium não conseguiu colonizar. Ao contrário, o gênero Bacteroides cresceu no grupo NaCI, onde foi encontrado em um nível similar em fezes tanto frescas quanto processadas em camundongos inoculados. A conclusão foi que o processo descrito no documento WO 2016/170285 (A1) permitiu uma excelente recuperação dos principais gêneros presentes nas fezes coletadas.

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Claims (18)

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de uma Composição de microbiota fecal caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para a prevenção e/ou redução de uma inflamação induzida por tratamento em um indivíduo em necessidade da mesma, em que a composição de microbiota fecal foi obtida por um processo que compreende as etapas de: (i) coletar uma amostra de fezes e colocar a mesma em condições anaeróbias no máximo 5 minutos após a coleta; (ii) ainda em condições anaeróbicas, misturar a amostra com uma solução salina aquosa que compreende pelo menos um crioprotetor e/ou um agente de volume; e (iii) filtrar a amostra diluída.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na etapa (ii), a solução salina aquosa compreende pelo menos um crioprotetor e um agente avolumador.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, sendo a composição de microbiota fecal caracterizado por compreender microbiota de uma ou várias amostras de fezes do indivíduo.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 3, sendo a composição de microbiota fecal caracterizado por compreender pelo menos 90 % das espécies presentes em pelo menos uma amostra do indivíduo.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a microbiota fecal prevenir e/ou reduzir uma inflamação intestinal induzida por tratamento em um indivíduo em necessidade da mesma.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a microbiota fecal prevenir e/ou reduzir a inflamação induzida por uma terapia anticâncer.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma transferência de microbiota fecal (FMT) é realizada 1 a 30 dias após o final da terapia anticâncer.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que duas FMT são realizadas em um intervalo de 1-7 dias.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o FMT com a dita composição de microbiota fecal leva a uma diminuição de neopterina no intestino e/ou uma diminuição de CRP e/ou ferritina em soro.

10. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que a FMT com a dita composição de microbiota fecal leva a um aumento da proporção de bactérias benéficas e uma diminuição da proporção de bactérias prejudiciais no trato gastrointestinal.

11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de que a proporção de alguns ou todos os seguintes 15 gêneros é aumentada em relação ao nível antes do FMT: Blautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, Subdoligranulum e Butyrivibrio.

12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, sendo a composição de microbiota fecal caracterizado por compreender alguns ou todos os seguintes 15 gêneros: Blautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, Subdoligranulum e Butyrivibrio.

13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo é um paciente com câncer.

14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo tem uma doença hematológica.

15. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo tem uma leucemia aguda.

16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo tem uma leucemia aguda mielóide.

17. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a inflamação induzida por uma terapia anticâncer combinada com antibioterapia e/ou antibioterapia e/ou transplante de células-tronco hematopoiéticas (HSCT).

18. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que a composição de microbiota fecal é administrada antes, durante e/ou após a terapia anticâncer.