BR112020025527A2 - formulações de copolímero biodegradável fotopolimerizado para aplicações biomédicas - Google Patents

Abstract

FORMULAÇÕES DE COPOLÍMERO BIODEGRADÁVEL FOTOPOLIMERIZADO PARA APLICAÇÕES BIOMÉDICAS.O presente pedido se refere a polímeros de base biodegradável para a produção de aplicações médicas biodegradáveis. O material de base biológica compreende um copolímero constituído por dextrano modificado com metacrilato de glicidila e poli (e-caprolactona) modificada com 2-isocianatoetilmetacrilato, que são combinados em diferentes formulações e usados para produzir membranas, estruturas 3-D e tubos ocos que podem ser usados como dispositivos biomédicos para diversas aplicações. Essas aplicações dizem respeito a sistemas de administração de fármacos, estruturas de engenharia de tecidos, reparação e regeneração de nervos periféricos, entre outros.

Description

“FORMULAÇÕES DE COPOLÍMERO BIODEGRADÁVEL FOTOPOLIMERIZADO PARA APLICAÇÕES BIOMÉDICAS” CAMPO TÉCNICO

[0001] O presente pedido se destina a copolímeros, à sua produção e aplicações médicas dos mesmos.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[0002] As técnicas de tubulização foram propostas como boas alternativas para aumentar a regeneração do nervo após lesão. O escopo dessa técnica se baseia no uso de um tubo oco, que é suturado em ambas as extremidades dos nervos de forma a guiar os axônios recém-formados desde o coto distal até ao proximal. Materiais poliméricos biocompatíveis, devido às suas características físico-químicas e biológicas, têm sido usados para a preparação desse tipo específico de dispositivo médico. Nesse sentido, o dextrano, um polissacarídeo derivado de bactérias, que é biocompatível, se destaca como um bom candidato para a preparação de dispositivos adequados para aplicações relacionadas com a regeneração de tecidos (Radiat Phys Chem 142 (2018) 115-120 e Inżynieria i Aparatura Chemiczna (2014) 251-252).

[0003] Além disso, esse polímero natural tem sido amplamente usado no campo biomédico, como material nuclear de adesivos cirúrgicos (Acta Biomaterialia 53 (2017) 343- 354) e hidrogéis para fins de regeneração de tecidos (Radiat Phys Chem 142 (2018) 115-120). Além disso, o dextrano se degrada sob ambiente fisiológico e os seus produtos de degradação são considerados como sendo não tóxicos. A degradação ocorre pela ação da enzima dextranase em órgãos tais como fígado, baço, rins e cólon (Biol Pharm Bull 20 (1997) 181-187). No entanto, apesar das suas vantagens interessantes, o dextrano apresenta propriedades mecânicas pobres (J. Mater. Chem. Chem. B 2 (2014) 8346-8360 e Adv Healthc Mater. 5 (2016) 2732-2744) e, portanto, a sua modificação é frequentemente necessária (Carbohydr Polym 82

(2010) 412-418 e Carbohydr Polym 114 (2014) 467-475).

[0004] A poli ε-caprolactona (PCL) é um poliéster bioabsorvível, hidrofóbico e semicristalino (Biomaterials 26 (2005) 4817-4827). A sua degradação e propriedades mecânicas adaptáveis, juntamente com a sua boa compatibilidade, tornaram esse polímero muito atraente para o campo biomédico desde os anos 1970. Por esse período, foi usado em vários sistemas de distribuição de fármacos, mas como a sua taxa de degradação era lenta, outros polímeros reabsorvíveis tais como PGA e poli(D,L-lactídeo) (PDLA) foram preferidos. No entanto, desde a década de 2000, com o surgimento das técnicas de engenharia de tecidos, os PCL foram extensivamente testados tanto in vitro como in vivo revelando bons resultados em termos de biocompatibilidade. Especificamente, para a regeneração de nervos periféricos, esse polímero, tal como outros polímeros bioabsorvíveis, foi testado em guias nervosos apenas misturado com outros polímeros e semeado tanto com células como com fatores de crescimento de nervos. Os guias nervosos preparados com PCL- PVA (J Mater Sci Mater Med 24 (2013) 1639-1647), PCL com fator neurotrófico encapsulado derivado a partir de célula glial (GDNF) (ACS Biomater Sci Eng. 1 (2015) 504-51 2), superfícies de PCL funcionalizadas com peptídeos tais como RGD (N. Biotechnol 31 (2014) 203-213), são alguns exemplos. Infelizmente, os problemas associados com a lenta taxa de degradação ainda são mencionados.

[0005] Devido à possibilidade de adaptar as propriedades da presente tecnologia, as modalidades descritas também podem ser aplicadas a outras aplicações biomédicas onde a taxa de degradação desempenha um papel importante. Essas aplicações incluem tubos biomédicos para fins de colocação de stents; folhas biomédicas para aplicação intracorporal; bainhas biomédicas para agulhas e tubos, que são introduzidos no corpo; partículas e tampões para fins de embolização;

próteses vasculares; estruturas de engenharia de tecidos; pele artificial e (micro)esferas para direcionar a administração de fármacos. Especificamente, para o último exemplo, há um aumento do esforço para criar vias de administração não invasivas e indolores para a administração de fármacos. Nesse sentido, sistemas de liberação de fármacos com diferentes geometrias e tamanhos têm sido propostos para ultrapassar as principais desvantagens da via oral (Prog Polym Sci 39 (2014) 2030-2075). A Pesquisa tem sido conduzida com base na exploração de novas vias de administração e no desenvolvimento de novos materiais poliméricos que atendam aos requisitos de cada fármaco para o alvo específico.

SUMÁRIO

[0006] O presente pedido se refere a formulações de copolímero biodegradável fotopolimerizável compreendendo dextrano modificado com metacrilato de glicidila e poli ε- caprolactona modificada com metacrilato de 2- isocianatoetila.

[0007] Em uma modalidade, a porcentagem do dextrano modificado varia entre 25% e 50% (p/p).

[0008] Em outra modalidade a porcentagem de poli ε- caprolactona modificada varia entre 50% e 75% (p/p).

[0009] Em ainda outra modalidade as formulações compreendem adicionalmente agentes porogênicos conhecidos tipo açúcar ou tipo sal solúveis em água.

[0010] Em uma modalidade, o agente porogênico é selecionado a partir de uma lista compreendendo sacarose, cloreto de sódio e carbonato de sódio.

[0011] Em outra modalidade, o agente porogênico é D- manitol.

[0012] Em uma modalidade, o teor de D-manitol varia entre 20 e 80% (p/p) da formulação de copolímero.

[0013] Em uma modalidade, a formulação de copolímero é moldada em películas, folhas, tubos, hastes, tampões,

microesferas ou malhas.

[0014] Em uma modalidade, as formulações de copolímero são sólidas.

[0015] O presente pedido também se refere a um método de fotopolimerização para preparar materiais sólidos a partir de formulações de copolímero, compreendendo os seguintes passos: - dextrano modificado com metacrilato de glicidila é dissolvido em DMSO à temperatura ambiente; - poli ε-caprolactona modificada com metacrilato de 2- isocianatoetila é adicionada à solução anterior; - dissolução completa dos comacromonômeros anteriores e adição de um fotoiniciador; - a formulação é deixada a fotorreticular sob luz UV com um comprimento de onda de 280 nm; - o copolímero final é lavado com água durante um período de até 7 dias e depois seco sob vácuo.

[0016] Em uma modalidade, o dextrano é usado em uma gama de até 200.000 g/mol.

[0017] Em outra modalidade, 70.000 g/mol de dextrano são usados.

[0018] Em uma modalidade, a poli ε-caprolactona é usada em uma gama de até 600 g/mol.

[0019] Em uma modalidade, as formulações de copolímero finais são secas a 40 °C.

[0020] Em uma modalidade, o fotoiniciador é usado em uma concentração entre 0,02 e 2% (p/v).

[0021] Em outra modalidade, após a dissolução completa dos comacromonômeros, um agente porogênico conhecido tipo açúcar ou tipo sal solúvel em água é adicionado à solução e deixado a solubilizar.

[0022] Em ainda outra modalidade, o copolímero fotopolimerizado compreendendo o agente porogênico é imerso em água destilada e deixado em um forno a 37 °C durante 3 dias, antes de lavar o copolímero final com água e secar sob vácuo.

[0023] Adicionalmente, o presente pedido também se refere a formulações de copolímero biodegradável fotopolimerizado para uso em aplicações biomédicas.

[0024] Em uma modalidade, as formulações de copolímero biodegradável fotopolimerizado são para uso em medicina regenerativa.

[0025] Em outra modalidade, as formulações de copolímero biodegradável fotopolimerizado são para uso como guias nervosos.

[0026] Em ainda outra modalidade, as formulações de copolímero biodegradável fotopolimerizado são para uso como drenos biomédicos, tubos biomédicos para fins de colocação de stents, folhas biomédicas para aplicação intracorporal, tal como uma folha antiadesiva, folhas biomédicas para uso tópico, tais como cobertura temporária de tratamento de feridas ou para evitar cicatrizes, espumas para tratamento de feridas, bainhas de proteção para agulhas e tubos que são introduzidos no corpo, (micro)esferas para administração de fármacos, (micro)esferas, partículas e tampões para fins de embolização, (micro)esferas para fins de cirurgia cosmética, tais como aumento dérmico, tratamento de rugas e deficiências do contorno da pele, próteses vasculares, estruturas de engenharia de tecidos, pele artificial ou tampão de estruturas para reparação de menisco.

DESCRIÇÃO GERAL

[0027] Até ao presente dia ainda há uma falta de polímeros adequados com as propriedades requeridas para serem usados na medicina regenerativa.

[0028] Portanto, o objetivo da presente tecnologia é conferir um material à base de dextrano, que cobre os requisitos para o seu uso na medicina regenerativa, incluindo a regeneração de nervos periféricos, principalmente em lesões de neurotmese onde não é possível uma sutura ponta a ponta. Para essa finalidade, o dextrano foi modificado pela incorporação de ligações duplas através da sua reação com metacrilato de glicidila (GMA). Em uma modalidade, essa reação requer tempos de reação baixos a fim de modular a quantidade de modificação de dextrano (Macromolecules 28 (1995) 6317-6322). O produto dessa reação é o Dextrano-GMA.

[0029] A fim de ajustar as propriedades do material desejado, um comacromonômero de dimetacrilato de poli ε- caprolactona (PCL) é adicionado a uma formulação compreendendo Dextrano-GMA.

[0030] Em uma modalidade, o comacromonômero de dimetacrilato de PCL é obtido a partir da reação de PCL com grupos terminais hidroxila com IEMA, resultando em PCL-IEMA (Int. J. Pharm 352 (2008) 172-181)).

[0031] Abordar a influência do teor de comacromonômeros nas propriedades dos copolímeros finais também foi o objeto da presente tecnologia.

[0032] As formulações com PCL-IEMA e dextrano-GMA são reticuladas por irradiação de luz UV originando o material final, um copolímero, com propriedades únicas para uso em aplicações médicas.

[0033] A modificação de dextrano com metacrilato de glicidila foi comprovada pelo espectro de RMN 1H de Dextrano- GMA em D2O, além dos picos típicos de polímero de dextrano, ressonâncias adicionais atribuídas aos prótons das ligações duplas e prótons do grupo –CH3 pertencentes ao grupo metacrilato foram observadas. A porcentagem de modificação do dextrano foi calculada a partir da relação entre os valores integrais dos sinais correspondentes ao dextrano e à ligação dupla de GMA. Os valores obtidos estão na gama de 31-34% (Macromolecules 28 (1995) 6317-6322).

[0034] No caso da reação de modificação de PCL, todo o IEMA adicionado foi consumido na reação. Isso foi confirmado por FT-IR onde a característica de banda forte do grupo isocianato não era visível.

[0035] Se verificou que a combinação dos dois materiais descritos acima, Dextrano-GMA e PCL-IEMA e a sua copolimerização por uma reação de fotorreticulação daria um novo produto com as características necessárias para o material final a ser usado na medicina regenerativa.

[0036] Adicionalmente, para aumentar a porosidade do material final, os copolímeros, é possível adicionar D- manitol sem comprometer a reação de fotopolimerização e a integridade do copolímero.

[0037] A fim de avaliar as características mecânicas e químicas dos copolímeros produzidos, foram efetuados testes de capacidade de intumescimento e de degradação. Testes in vitro e in vivo também foram efetuados de modo a avaliar o desempenho dos copolímeros em aplicações médicas, incluindo reconstrução e regeneração de nervos periféricos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0038] Para compreensão mais fácil do presente pedido, estão anexadas figuras que representam as formas preferidas de implementação, as quais, no entanto, não se destinam a limitar a técnica descrita no presente documento.

[0039] Os desenhos em anexos ilustram várias modalidades da presente tecnologia e fazem parte da especificação. As modalidades ilustradas são meramente exemplos da presente invenção e não limitam o escopo da tecnologia.

[0040] A Figura 1 mostra os espectros de FTIR de Dextrano, Dextrano-GMA, PCL-diol e PCL-IEMA. Os espectros de FTIR foram obtidos usando um espectrômetro Jasco FT/IR-4200 com modo ATR, à temperatura ambiente. Os dados foram coletados na gama de 4000-500 cm-1 com resolução espectral de 4 cm-1 e 64 acumulações.

[0041] A Figura 2 mostra os espectros de RMN 1H de Dextrano, Dextrano-GMA, PCL-diol e PCL-IEMA.

[0042] Os espectros de RMN 1H foram obtidos a 25 °C em um espectrômetro Bruker Avance III 400 MH usando uma sonda de detecção tripla TIX 5 mm. Os espectros de RMN 1H foram obtidos a 25 °C em um espectrômetro Bruker Avance III 400 MH usando uma sonda de detecção tripla TIX 5 mm. Para dextrano e dextrano-GMA, o solvente usado foi D2O e condições específicas foram usadas, conforme descrito em outro lugar (Macromolecules 28 (1995) 6317-6322). Resumidamente, um ângulo de pulso de 87,7º foi usado com um atraso de relaxamento de 30s. O sinal de água a 4,8 ppm foi eliminado por supressão de solvente com desacoplamento. O poder de desacoplamento foi ajustado a um nível no qual a intensidade do sinal do próton anomérico não foi afetada. Para PCL-diol e PCL-IEMA, o solvente usado foi DMSO-d6. TMS foi usado como o padrão interno.

[0043] A Figura 3 mostra curvas termogravimétricas de Dextrano, Dextrano-GMA, PCL-diol e PCL-IEMA.

[0044] A estabilidade térmica dos materiais foi avaliada por análise termogravimétrica (TGA) usando um equipamento TA Instruments Q500. Foi usada a gama de temperatura entre 25 °C e 600 °C. A taxa de aquecimento foi de 10 °C.min-1 e a análise foi realizada sob atmosfera de nitrogênio.

[0045] A Figura 4 mostra as curvas de fluxo de calor de Dextrano, Dextrano-GMA, PCL e PCL-IEMA.

[0046] O comportamento térmico dos materiais antes da degradação foi avaliado por Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC). O equipamento usado é um TA Instruments Q100, equipado com unidade de resfriamento RSC90.

[0047] Dextrano e Dextrano-GMA foram primeiro aquecidos de 25 °C a 250 °C, seguido por um ciclo de resfriamento de 250 °C a -80 °C, a fim de eliminar a sua história térmica. As amostras foram então submetidas a um segundo ciclo de aquecimento de -80 °C a 250 °C.

[0048] No caso de PCL-diol e PCL-IEMA, o primeiro ciclo de aquecimento foi efetuado de 25 °C a 150 °C, seguido por um ciclo de resfriamento até -80 °C. O segundo ciclo de aquecimento foi efetuado de -80 °C a 150 °C.

[0049] A velocidade de aquecimento foi de 10 °C.min-1 e a análise foi realizada sob atmosfera de N2 (50 mL.min-1). A massa das amostras que foram usadas foi entre 7 mg e 9 mg.

[0050] A Figura 5 mostra as curvas termogravimétricas de copolímeros de Dextrano-GMA e PCL-IEMA com diferentes proporções de porcentagem de teor de comacromonômero (usando a notação [Dextrano-GMA/PCL-IEMA]) 100/0 50/50 25/75

[0051] Além disso, as curvas obtidas para Dextrano-GMA e PCL-IEMA são incluídas para comparação.

[0052] A estabilidade térmica dos materiais foi avaliada por análise termogravimétrica (TGA) usando um equipamento TA Instruments Q500. Foi usada a gama de temperatura entre 25 °C e 600 °C. A taxa de aquecimento foi de 10 °C.min-1 e a análise foi realizada sob atmosfera de nitrogênio.

[0053] A Figura 6 valores de Tg de Dextrano, Dextrano- GMA, PCL-diol, PCL-IEMA e copolímeros de Dextrano-GMA:PCL- IEMA, obtidos por análise térmica mecânica dinâmica (DMTA). A DMTA das amostras foi efetuada em um Tritec 2000DMA. As amostras foram colocadas em bolsas de material de aço inoxidável e analisadas em modo de cantilever único. Os testes foram efetuados numa gama de temperatura de -150 °C a 300 °C, com uma taxa de aquecimento de 10 °C.min-1, no modo de multifrequência. A Tg foi determinada a partir do pico da curva tan δ, a 1Hz.

[0054] A Figura 7 mostra a capacidade de intumescimento de copolímeros de Dextrano-GMA e PCL-IEMA com diferentes proporções de porcentagem de teor de comacromonômero (usando a notação [Dextrano-GMA/PCL-IEMA])

[0055] A capacidade de intumescimento das membranas circulares com 1 cm de diâmetro foi medida em PBS (pH = 7,4, 0,01 M). Amostras secas com peso seco conhecido foram imersas em 5 mL de PBS, a 37 °C, até atingir o equilíbrio de intumescimento. Em momentos predeterminados, as amostras foram tomadas a partir do PBS e a água da superfície suavemente enxugada com papel de filtro.

[0056] A porcentagem de capacidade de intumescimento foi calculada usando a seguinte equação: Capacidade de intumescimento (%) = (W_s-W_d)/W_d × 100

[0057] Onde W_s é o peso das amostras entumescidas e W_d é o peso das amostras secas antes da imersão em PBS. As medições foram efetuadas em triplicado.

[0058] A Figura 8 mostra a degradação hidrolítica in vitro de copolímeros de Dextrano-GMA e PCL-IEMA. A seguinte notação é usada para indicar a proporção percentual do teor de comacromonômero na composição final dos copolímeros ([Dextrano-GMA/PCL-IEMA]). Os testes foram efetuados em PBS (pH = 7,4, 0,01M). Membranas circulares secas com 1 cm de diâmetro e peso conhecido foram imersas em PBS, a 37 °C, durante 30 dias. Em momentos predeterminados, as membranas foram retiradas do PBS, enxaguadas com água destilada e secas até estabilização do seu peso.

[0059] A estimativa do grau de degradação foi feita através do cálculo da perda de peso após incubação, de acordo com a seguinte equação: Perda de Peso (%) = (W_0-W_t)/W_0 × 100

[0060] Onde W_0 é o peso inicial da amostra seca antes de ser imersa e W_t é o peso da amostra seca após ser imersa em PBS e seca. As medições foram efetuadas em triplicado.

[0061] A Figura 9 mostra a absorbância avaliada pelo ensaio de viabilidade Presto Blue® de células-tronco da polpa dentária humana (hDPSC) semeadas em copolímeros. A notação usada se refere à porcentagem de comacromonômero na composição final do material ([Dextrano-GMA/PCL-IEMA]).

[0062] Os copolímeros foram fixados a cada poço em uma placa de cultura de células de 24 poços e os controles relevantes foram preparados com o agente de fixação sozinho (SG) e copolímeros sem células. Em seguida, os materiais foram semeados com densidade de 4x104 células/poço. As células foram deixadas a aderir em 0,5 mL de meio de cultura completo durante a noite. Em cada momento do tempo [24 horas (1 dia), 72 horas (3 dias), 120 horas (5 dias) e 168 horas (7 dias)] o meio de cultura foi removido de cada poço e meio completo fresco foi adicionado a cada poço, com 10% (v/v) de reagente de viabilidade celular Presto Blue® 10x. As células foram incubadas por 1 hora a 37 °C, CO2 a 5%, as alterações na viabilidade celular foram detectadas por espectroscopia de absorção em um Thermo Scientific Multiskan FC. O sobrenadante foi coletado e transferido para uma placa de 96 poços e a absorvância foi lida a 570 nm e 595 nm. Depois, as células foram lavadas com PBS para remover quaisquer resíduos de Presto Blue® e o meio de cultura fresco é reiniciado em cada poço. O comprimento de onda de excitação do Presto Blue® é de 570 nm e a emissão é de 595 nm. Para cada poço, a absorbância a 595 nm (comprimento de onda de normalização) foi subtraída à absorbância a 570 nm (resultado experimental). A absorbância corrigida é obtida através da subtração da média dos poços de controle para cada poço experimental.

[0063] A Figura 10 mostra as pontuações histológicas obtidas a partir da implantação subcutânea de copolímeros de Dextrano-GMA e PCL-IEMA. A notação usada se refere à proporção de comacromonômero na composição final do material. As pontuações foram obtidas seguindo o sistema de pontuação ISO 10998-6.

[0064] “SHAM” se refere ao controle - incisão sem implante.

[0065] A Figura 11 apresenta a porcentagem de capacidade de intumescimento de condutos de guia nervosos preparados usando o copolímero de Dextrano-GMA/PCL-IEMA (25/75) com o agente porogênico D-Manitol. A notação usada se refere ao teor percentual de Dextrano-GMA: PCL-IEMA e ao teor de D- Manitol adicionado (em porcentagem): ([Dextrano-GMA/PCL- IEMA] (D-Manitol) 25/75(0) 25/75(50)

[0066] A porcentagem de capacidade de intumescimento foi calculada usando a mesma equação mencionada acima:

[0067] A Figura 12 mostra a degradação hidrolítica in vitro de copolímeros de Dextrano-GMA e PCL-IEMA com conformação em forma de tubo. A seguinte notação é usada para indicar a proporção percentual do teor de comacromonômero na composição final dos copolímeros e teor de D-Manitol: [Dextrano-GMA/PCL-IEMA] (D-Manitol)

[0068] A degradação hidrolítica in vitro foi calculada usando a mesma metodologia mencionada na descrição da Figura

2.

[0069] A Figura 13 mostra a porcentagem de déficit motor após durante o período em que o nervo ciático do camundongo foi conectado por guias nervosos de copolímeros. A seguinte notação é usada para indicar a proporção percentual do teor de comacromonômero na composição final dos copolímeros e teor de D-Manitol: [Dextrano-GMA/PCL-IEMA] (D-Manitol)

[0070] A Figura 14 mostra o reflexo de retirada obtido pelo uso de estímulos dolorosos. A seguinte notação é usada para indicar a proporção percentual do teor de comacromonômero na composição final dos copolímeros e teor de D-Manitol: [Dextrano-GMA/PCL-IEMA] (D-Manitol)

[0071] A Figura 15 mostra o índice funcional estático dado pelas pegadas dos camundongos durante o período em que o nervo ciático do camundongo foi conectado por guias nervosos de copolímeros. A seguinte notação é usada para indicar a proporção percentual do teor de comacromonômero na composição final dos copolímeros e teor de D-Manitol: [Dextrano-GMA/PCL-IEMA] (D-Manitol)

DESCRIÇÃO DE MODALIDADES

[0072] Agora, modalidades preferidas do presente pedido serão descritas em detalhes com referência aos desenhos anexos. No entanto, essas não têm como objetivo limitar o escopo do presente pedido.

[0073] O objetivo da presente tecnologia é conferir um material à base de dextrano, que cobre os requisitos tais como biocompatibilidade, biodegradabilidade, permeabilidade adequada, propriedades biomecânicas adequadas, propriedades de superfície e dimensão personalizada, para o seu uso em medicina regenerativa.

[0074] Para obter um material final, inicialmente, o dextrano foi modificado com a incorporação de ligações duplas através da sua reação com metacrilato de glicidila (GMA). Em primeiro lugar, 2,5 g (1,54 × 10-2 mol) de dextrano foram dissolvidos em 22,5 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) em um frasco de fundo redondo imerso em banho-maria a 30 °C. Após a solubilização completa do dextrano, 0,5 g (4,09 × 10-3 mol) de dimetilaminopiridina (DMAP) foi dissolvido na solução e 2,05 mL (1,54 × 10-2 mol) de GMA foram adicionados. A reação prosseguiu por 8h sob atmosfera de nitrogênio. Após esse tempo, para neutralizar a solução, 0,33 mL de HCl a 37% (p/p) foram adicionados. O produto da reação foi então dialisado contra água. O produto foi liofilizado, dando origem a um produto semelhante a uma esponja. Essa reação produz uma formulação de Dextrano-GMA.

[0075] Na presente tecnologia, o uso de dextrano é preferido. Em uma modalidade preferida, foram usados 70.000 g/mol dextrano. No entanto, esse parâmetro pode ser alterado e outros pesos moleculares podem ser usados em uma gama de até 200.000 g/mol.

[0076] Além disso, apesar do fato de que para a modificação do polímero natural, GMA foi escolhido em uma modalidade preferida.

[0077] Seguindo a reação anterior para obter Dextrano- GMA, um comacromonômero de dimetacrilato PCL foi sintetizado.

[0078] Em uma modalidade preferida, o dimetacrilato de PCL foi obtido a partir da reação de PCL contendo grupos terminais de hidroxila com IEMA (PCL-IEMA). Em um frasco de fundo redondo colocado em banho-maria a 40 °C, 2,2g (4 mmol) de PCL-diol foram dissolvidos em 30 mL de tetraidrofurano (THF), sob atmosfera de nitrogênio. Após solubilização de PCL-diol, 1,27 g (8,2 mmol) de IEMA e 150 mg de dilaurato de dibutilestanho (aproximadamente 3 gotas) foram adicionados à mistura reacional. A reação foi deixada a prosseguir por 24h. O produto foi recuperado por precipitação em n-hexano e seco sob vácuo, até peso constante, à temperatura ambiente.

[0079] Na presente tecnologia, é preferido o uso de PCL contendo grupos terminais hidroxila. No presente pedido, a poli ε-caprolactona é usada em uma gama de até 600 g/mol.

[0080] Da mesma forma, em uma modalidade preferida, IEMA é usado para modificar PCL.

[0081] Após a preparação de Dextrano-GMA e PCL-IEMA, formulações compreendendo diferentes quantidades de ambos os materiais foram preparadas, em uma gama entre 25:50 e 50:75 [Dextrano-GMA: PCL-IEMA]. Os copolímeros foram dissolvidos em 2 mL de DMSO até solubilização completa.

[0082] O material final é obtido por irradiação das formulações compreendendo dimetacrilato de PCL (PCL-IEMA) e dextrano-GMA com luz UV (comprimento de onda = 280 nm), por 2 horas à temperatura ambiente, promovendo uma reação fotorreticular entre os dois copolímeros.

[0083] No contexto do presente pedido, a temperatura ambiente é definida como a temperatura entre 15 °C e 25 °C.

[0084] Na presente tecnologia, a irradiação com luz UV é preferida, embora, os materiais finais também possam ser obtidos por técnicas de fabricação aditiva tais como impressão 3D usando radiação UV, o que permite aumentar a complexidade da forma final e tem sido reportado para a preparação de dispositivos biomédicos (Biofabrication 10 (2018) 1-20 e J. Neural Eng. 15 (2018) 1-12).

[0085] A reação de fotorreticulação é efetuada com a combinação de luz UV e um fotoiniciador em uma concentração entre 0,02-2% p/v. Em uma modalidade, a concentração do fotoiniciador é de 0,1% p/v.

[0086] Em uma modalidade, o fotoiniciador é Irgacure®2959.

[0087] Os copolímeros resultantes dessa reação, feitos com diferentes quantidades relativas de Dextrano-GMA e PCL- IEMA, são materiais transparentes e as suas propriedades termomecânicas foram consideradas dependentes dos teores de comacromonômero.

[0088] A forma dos materiais pode variar, dependendo do molde. Em uma modalidade preferida foram preparadas formas de membranas e tubos ocos. No entanto, com a presente metodologia, também é possível preparar esses materiais em uma forma de esfera, o que é comumente usado para aplicações de sistemas de liberação de fármacos.

[0089] Os copolímeros com maiores teores de PCL-IEMA apresentam maior estabilidade térmica (cerca de 8% maior) e menor transição vítrea (entre 64-93% menor), o que se traduz em materiais mais flexíveis.

[0090] Para aplicações médicas, a porosidade desses materiais é um parâmetro importante a ter em consideração (Tissue Eng Part C Methods 19 (2013) 233-243).

[0091] É reportado que os tubos permeáveis permitem a troca de nutrientes e oxigênio, permitem a drenagem do tubo e também, permitem a vascularização no interior do tubo. Todos esses fatores demonstraram ter um papel importante no aumento da regeneração do nervo (Tissue Eng Part C Methods 19 (2013) 233-243).

[0092] Em uma modalidade, a porosidade pode ser conferida aos materiais preparados através da adição de agentes porogênicos conhecidos tipo açúcar ou tipo sal solúveis em água tais como sacarose, cloreto de sódio e carbonato de sódio.

[0093] A partir de vários testes com agentes porogênicos descritos (PLoS One 7 (2012) e48824), D-manitol é capaz de dar porosidade aos materiais sem comprometer a reação de fotopolimerização e a integridade do copolímero.

[0094] A presença de D-manitol, em teores entre 20-80% (p/p) da formulação de copolímero, não perturba a reação de fotorreticulação.

[0095] Em uma modalidade, a quantidade de D-manitol adicionada à formulação de Dextrano-GMA: PCL-IEMA é 0% (p/p). Em outra modalidade, a quantidade de D-manitol adicionada foi de 80% (p/p). Em formulações com D-manitol, esse é adicionado após a solubilização completa do dextrano-GMA e PCL-IEMA em DMSO. Quando a solubilização completa do D- manitol é alcançada, Irgacure®2959 também é adicionado e solubilizado. Em seguida, as formulações são deixadas a fotorreticular sob luz UV. Após a polimerização, os materiais são imersos em água destilada e deixados em um forno a 37 °C durante 3 dias, para remover o D-manitol. Em seguida, os materiais finais são lavados com água Milli-Q por 7 dias e secos sob vácuo, a 40 °C.

[0096] Em resumo, o método de fotopolimerização para preparar o copolímero sólido de Dextrano-GMA e PCL-IEMA segue as seguintes etapas:

[0097] dextrano-GMA é dissolvido em DMSO à temperatura ambiente;

[0098] PCL-IEMA é adicionado à solução anterior;

[0099] dissolução completa dos comacromonômeros anteriores e adição de um fotoiniciador;

[0100] a formulação é deixada a fotorreticular sob luz UV com um comprimento de onda de 280 nm;

[0101] O copolímero final é lavado com água por 7 dias e depois seco sob vácuo.

[0102] A quantidade de Dextrano-GMA usada está entre 25 e 50% (p/p).

[0103] A quantidade de PCL-IEMA usada está entre 50 e 75% (p/p).

[0104] Em uma modalidade preferencial, os materiais finais são lavados com água Milli-Q.

[0105] Em uma modalidade preferencial, os materiais finais são secos sob vácuo a 40 °C.

[0106] Em uma modalidade, o Dextrano-GMA é dissolvido em 2 mL de DMSO.

[0107] Em uma modalidade a formulação é deixada a fotorreticular por 1 hora.

[0108] Em uma modalidade, após a dissolução completa de Dextrano-GMA e PCL-IEMA, um agente porogênico conhecido tipo açúcar ou tipo sal solúvel em água é adicionado à solução e deixado a solubilizar. Após a etapa de fotorreticulação, o copolímero obtido é então imerso em água destilada e deixado em um forno a 37 °C durante 3 dias, de modo a remover o agente porogênico, antes da lavagem do copolímero final com água e secagem sob vácuo.

[0109] Espectros de FTIR de Dextrano, Dextrano-GMA, PCL- diol e PCL-IEMA:

[0110] No espectro de dextrano é possível identificar as bandas típicas encontradas neste polissacarídeo, nomeadamente, a vibração de alongamento dos grupos -OH (a), que podem ser observados a 3.300 cm-1. A 2.910 cm-1 é possível observar as bandas correspondentes à vibração de alongamento de ambos os grupos CH e CH2 (b e c, respectivamente). Entre

1.000-1.100 cm-1, existem as bandas correspondentes à vibração de alongamento das ligações de éter (d) e a 914 cm- 1 é atribuída a banda para a vibração da ligação α- glicosídica (e).44 A 1.636 cm-1, é possível observar a gama que corresponde à flexão da água ligada (f).

[0111] Em relação ao espectro de Dextrano-GMA, é possível observar algumas diferenças em relação ao espectro de dextrano intocado. Uma nova gama a cerca de 1.710 cm-1 (g) corresponde à vibração de alongamento do grupo carbonila da ligação éster (presente no GMA). A vibração de flexão do grupo metacrilato pode ser vista em ambos os espectros a 813 cm-1 (h). A vibração de alongamento da ligação dupla pode ser vista a 1.650 cm-1.

[0112] No espectro do PCL-diol, é possível identificar as seguintes bandas: (a) 3.340 cm-1, correspondendo à vibração dos grupos –OH, (b) 2.940 cm-1 e 2.865 cm-1, correspondendo a alongamento assimétricos e simétrico de CH2, respectivamente. O pico em (c) 1.730 cm-1 é atribuído à vibração de alongamento do grupo –C=O da ligação éster.

[0113] No espectro de PCL-IEMA, é possível identificar as bandas características da ligação de uretano, confirmando a modificação com sucesso da estrutura de PCL-diol. A primeira dessas bandas está a (d) 1.720 cm-1, correspondendo à vibração de alongamento do grupo carbonila do éster a partir do PCL-diol, que é sobreposto com o grupo carbonila pertencente à ligação uretano. Então, a (e) 1.630 cm-1 é atribuído à vibração de alongamento do grupo C=C. Além disso, a (f) 1.566 cm-1 as bandas correspondentes à vibração de flexão do N-H e vibração de alongamento dos grupos C-N também podem ser observadas. Adicionalmente, se nota o desaparecimento da banda larga correspondente aos grupos – OH, e o aparecimento de uma banda mais evidente característica da vibração de alongamento do grupo –NH. A (g) 817 cm-1 aparece a banda correspondente à vibração de flexão das ligações duplas do grupo metacrilato. A banda forte característica do grupo isocianato (2.270 cm-1) não é visível. Isso indica que todos os grupos de isocianato foram consumidos durante a modificação.

[0114] Espectros de RMN 1H de Dextrano, Dextrano-GMA, PCL- diol e PCL-IEMA:

[0115] No espectro de RMN 1H de P_LMW em D2O, podem ser observados os picos típicos do polímero de dextrano, que são os picos de multipleto na gama de 4,0 ppm e 3,3 ppm e o pico de próton anomérico que é visível a cerca de 5,3 ppm (a').

[0116] O espectro de Dextrano-GMA mostra ressonâncias adicionais em cerca de 6,1 e 5,7 ppm (k), atribuídos aos prótons das ligações duplas, e a cerca de 1,9 ppm (j), correspondendo aos prótons do grupo –CH3 pertencentes ao grupo metacrilato. A porcentagem de modificação do dextrano foi calculada a partir da relação entre os valores integrais dos sinais correspondentes ao dextrano e à ligação dupla de GMA.

[0117] O espectro de RMN 1H de PCL-diol apresenta as ressonâncias típicas de PCL. No caso do espectro de RMN 1H do PCL-IEMA, é mostrada claramente a ressonância correspondente ao grupo –NH (m) da ligação de uretano, a 7,2-7,4 ppm. Também é possível identificar os picos correspondentes aos prótons das ligações duplas (l), a 5,6 e 6,1 ppm, e os picos dos prótons dos grupos –CH3 (k), a 1,8 ppm. Além disso, é possível observar que as ressonâncias correspondentes aos prótons dos grupos terminais no PCL-diol (j) desapareceram no espectro do PCL-IEMA.

Análise termogravimétrica de dextrano-GMA e PCL-IEMA:

[0118] A curva termoanalítica de dextrano apresenta dois estágios de perda de peso. Para Dextrano-GMA GMA, três estágios de perda de peso podem ser identificados. O primeiro estágio de perda de peso, entre 25 a 150 °C, é comum a ambas as amostras, pode ser atribuído à perda de umidade residual. O segundo estágio de decomposição, entre 270-370 °C, se refere à degradação das cadeias do dextrano polissacarídeo. Esse estágio de perda de peso também está presente em ambas as curvas. O estágio adicional de perda de peso observado para dextrano-GMA pode ser atribuído à degradação da parte modificada de dextrano. Esses dados sugerem que a estabilidade térmica do dextrano não é afetada pela modificação com GMA.

[0119] A decomposição de PCL-diol ocorre em dois estágios. Isso pode ser devido à degradação precoce de cadeias mais pequenas presentes dentro da matriz de PCL- diol. No que diz respeito ao PCL_IEMA, esse apresenta também dois estágios principais de perda de peso. O primeiro estágio (345-350 °C) pode ser atribuído à decomposição das ligações de uretano, seguido por um segundo estágio (378-443 °C) atribuído à degradação das ligações éster. Além disso, pode ser confirmado, que a amostra está isenta de IEMA não reagido, uma vez que não existe pico perto do seu ponto de ebulição, 211 °C (Int. J. Pharm 352 (2008) 172-181). Calorimetria de Varredura Diferencial de Dextrano-GMA e PCL- IEMA:

[0120] Nas curvas de fluxo de calor de Dextrano e Dextrano-GMA o único evento térmico que pode ser identificado é a Tg, indicando que esses materiais, como seria de esperar, são totalmente amorfos. Por outro lado, as curvas de fluxo de calor do PCL-diol mostram um evento térmico a -41,0 °C, o qual corresponde à sua Tg vítrea. Além disso, dois outros eventos térmicos estão presentes que correspondem à fusão

(Tm) do material (-9,0 °C e 7,5 °C) e, no ciclo de resfriamento, a uma cristalização (Tc) (-28,6 °C). Esse fato confirma que o PCL-diol é um polímero semicristalino. Após a modificação com IEMA, o PCL-diol perde a sua ordem estrutural, conduzindo a um material amorfo. Além disso, uma pequena diminuição no valor de Tg é observada (-42,9 °C). A inclusão de IEMA na estrutura do PCL-diol contribui para o aumento do volume livre entre as cadeias poliméricas da estrutura, justificando a diminuição observada na Tg. Análise termogravimétrica de copolímeros:

[0121] Os copolímeros preparados apenas com Dextrano-GMA (100/0) apresentam maior estabilidade térmica em comparação com o precursor correspondente (Dextrano-GMA), o que é explicado pela sua estrutura reticulada (Biomaterials 24 (2003) 759-767). As curvas termogravimétricas dos copolímeros Dextrano-GMA e PCL-IEMA com diferentes proporções de porcentagem de teor de comacromonômero mostram claramente dois estágios de perda de peso, apesar das suas composições diferentes. Os resultados mostram que o PCL-IEMA aumenta a estabilidade térmica dos copolímeros, sendo que o PCL-IEMA tem uma influência positiva na estabilidade térmica dos copolímeros. Além disso, os copolímeros com teor mais elevado de PCL-IEMA (25/75) são consistentemente mais estáveis em comparação com aqueles com menor teor (50/50). Esse comportamento pode ser atribuído à crescente reticulação dos materiais finais. Todas as membranas foram consideradas termicamente estáveis até temperaturas de cerca de 300 °C. Análise térmica mecânica dinâmica (DMTA):

[0122] A análise de DMTA mostra que todos os materiais têm um pico correspondente à Tg. O dextrano apresenta o valor de Tg mais elevado de todas as amostras. Após a sua modificação com GMA, o valor de Tg diminui ligeiramente, conforme esperado. No entanto, entre o PCL-diol e o PCL-

IEMA, não há diminuição significativa no valor de Tg, uma vez que a inclusão de IEMA contribui para um aumento no volume livre entre as cadeias poliméricas da estrutura. Em relação aos copolímeros Dextrano-GMA:PCL-IEMA, a formulação 100/0 (sem PCL-IEMA), apresenta Tg mais elevada do que Dextrano-GMA, conforme esperado, devido ao estabelecimento de uma rede reticulada. A análise de DMTA dos copolímeros 50/50 e 25/75 revela uma diminuição nas suas Tg com o aumento do teor de PCL-IEMA. Testes de intumescimento:

[0123] Com o aumento do teor de PCL-IEMA (de 0-75%) em relação a Dextrano-GMA, a capacidade de intumescimento dos copolímeros finais diminuiu de 200% para aproximadamente 100% ([Dextrano-GMA:PCL-IEMA] 50:50) e 50% ([Dextrano- GMA:PCL-IEMA] 25:75), conforme esperado devido ao caráter hidrofóbico do PCL. Por isso , é possível modular a capacidade de intumescimento dos materiais, o que é uma característica muito importante para as aplicações médicas. Testes de degradação:

[0124] Os ensaios de degradação hidrolíticas in vitro mostraram que, durante 30 dias, os copolímeros perderam entre 8-12% da sua massa total. Além disso, os copolímeros foram capazes de manter a sua integridade estrutural, não apresentando sinais de fissuras ou perda de conformação durante esse período e, portanto, não comprometendo a sua estrutura e função.

[0125] Adicionalmente aos resultados promissores obtidos a partir dos testes de intumescimento e de degradação, os copolímeros foram testados em testes celular in vitro.

[0126] Por isso , é possível modular a degradabilidade por hidrólise dos materiais, o que é uma característica muito importante para as aplicações médicas. Viabilidade celular e citocompatibilidade:

[0127] A viabilidade celular e a citocompatibilidade dos copolímeros foram testadas durante 7 dias. Após esse tempo, a viabilidade e proliferação das células em contato com os materiais foram analisadas. Todos os materiais apresentaram viabilidade celular e taxas metabólicas semelhantes, em comparação com o controle sem material o que comprova a biocompatibilidade dos materiais preparados.

[0128] Por isso , é possível modular a viabilidade celular em contato com a superfície dos materiais, o que é uma característica muito importante para as aplicações médicas. Testes preliminares in vivo (implantes subcutâneos em camundongo):

[0129] Devido aos excelentes indicadores de biocompatibilidade celular obtidos a partir desses copolímeros, testes preliminares in vivo foram realizados.

[0130] As amostras de copolímeros preparados foram implantadas subcutaneamente em camundongos e analisadas durante 15 dias, com avaliação da contagem celular e da reação biológica após 3, 7, e 15 dias. Após o final do teste, os copolímeros constituídos apenas por Dextrano-GMA foram classificados como “levemente irritantes” e os copolímeros com PCL-IEMA na formulação obtiveram pontuações correspondentes à classificação de “não irritantes”. Testes in vivo (construindo uma ponte sobre uma lacuna do nervo ciático em camundongos) - tubos testados como guias de tubos nervosos:

[0131] Em relação às boas propriedades alcançadas com os copolímeros objeto deste pedido em relação à capacidade de intumescimento, taxa de degradação, avaliação in vitro e in vivo, os copolímeros foram moldados em formas de tubo para serem testados como guias nervosos.

[0132] No que diz respeito à capacidade de intumescimento, tanto os tubos porosos como os não porosos, apresentaram valores abaixo de 60%, sendo o tubo não poroso apenas 40%, o que é uma propriedade importante no que diz respeito ao comportamento no tubo uma vez que é implantado. Em relação às taxas de degradação dos tubos preparados, o estudo hidrolítico revelou que após 180 dias, esses mantiveram a sua integridade estrutural e apenas perderam entre 12-16% do seu peso inicial.

[0133] Os tubos de guia nervoso preparados com os copolímeros descritos no presente documento possuem propriedades mecânicas suficientes, em relação à sua resistência a sutura sem rachar ou partir, o que é uma característica importante para os processos de implantação. Adicionalmente, esses são capazes de resistir a cargas mais elevadas sem quebrar (2,2-2,4N) do que o próprio nervo (1- 2N).

[0134] O desempenho in vivo do tubo de guias de nervo feito com esses copolímeros foi avaliado por criar pontes entre o nervo ciático de camundongos após uma lesão de neurotmese. Para a cirurgia, camundongos Sasco Sprague Dawley adultos, machos, pesando entre 300-350 g, foram divididos em dois grupos de seis animais cada. Todos os animais foram alojados em uma sala com temperatura e umidade controlada com ciclos de 12-12h luz/escuro, dois animais por gaiola. Atividades normais de gaiola foram permitidas, sob condições laboratoriais padrão. Os animais foram alimentados com ração padrão e água ad libitum. A dor e o desconforto foram minimizados tomando as medidas adequadas tendo em consideração os desfechos humanos para o sofrimento e angústia dos animais. Antes de entrar na experiência, os animais foram alojados por duas semanas.

[0135] Para a cirurgia, os camundongos foram colocados em decúbito ventral em condições estéreis. A pele da parte lateral da coxa direita rapada foi esfregada com solução antisséptica, de forma rotineira. As cirurgias foram realizadas sob um microscópio operacional M-650 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha). A anestesia usada era constituída por cetamina 9 mg/100 g; xilazina 1,25 mg/100 g; atropina 0,025 mg/100 de peso corporal, e foi aplicada por via intramuscular. Sob o efeito de anestesia, foi feita uma incisão na pele que se estendia desde o trocanter maior até à metade distal. Em seguida, uma incisão de divisão muscular foi realizada de forma a expor o nervo ciático do animal. Após a imobilização, com o auxílio de tesouras microcirúrgicas retas, uma transecção (neurotmese) foi induzida. O nervo foi lesado imediatamente acima da ramificação do nervo terminal. Em ambos os grupos, os cotos proximais e distais foram inseridos 3 mm nas guias dos nervos do copolímero D e E e mantidos no lugar com duas suturas epineurais usando náilon monofilamentar 7/0. A lacuna do nervo entre os dois cotos media 10 mm. A perna oposta e o nervo ciático foram deixados intactos em ambos os grupos e foram considerados o controle para os nervos normais. Uma substância dissuasora foi aplicada no pé direito dos animais, a fim de evitar a autotomia. Todos os procedimentos foram conduzidos com a aprovação das Autoridades Veterinárias de Portugal de acordo com a Diretiva do Conselho das Comunidades Europeias de novembro de 1986 (86/609/CEE).

[0136] O desempenho motor do nervo após a lesão de neurotmese descrita anteriormente e reparação com tubo-guia nervosos da presente invenção foi avaliado pela condução de Extensor Postural Axial (EPT). Para o registro dos resultados do teste EPT, o corpo do camundongo, com exceção dos membros posteriores, é envolto em uma toalha cirúrgica. O animal é então apoiado e abaixado pelo operador em direção à plataforma de uma balança digital. Com a aproximação da plataforma, é permitido que o animal estabeleça contato visual com a plataforma. Em seguida, o animal irá antecipar o contato com a plataforma estendendo o membro posterior. Esse contato é feito pelo metatarso distal e pelos dedos. O peso (força), em gramas, aplicado na balança da plataforma digital (modelo TM 560; Gibertini, Milão, Itália) foi registrado para ambos os membros experimentais (EEPT) e normais (NEPT). As medidas foram repetidas três vezes, e o valor considerado é a média entre essas. O EEPT e o NEPT foram integrados na seguinte equação, de forma a obter o percentual de déficit funcional, conforme reportado por Koka et al. (Exp. Neurol 168 (2001) 192-195). Após 20 semanas de implantação, uma melhoria na porcentagem de recuperação motora ao longo das semanas é observada.

[0137] A função nociceptiva foi avaliada através da avaliação da Latência do Reflexo de Retirada (WRL) pelo teste da placa de aquecimento modificado conforme descrito por Masters et al. (Anesthesiology 79 (1993) 340-346). Os camundongos normais retiram as suas patas da placa de aquecimento em 4,3 s ou menos. Se a retirada da pata não ocorresse após 12s, os estímulos de calor eram removidos e o teste interrompido para evitar danos aos tecidos. Nesses casos, o animal recebeu o WRL máximo de 12s. Ao longo do tempo, uma tendência de diminuição do WRL é verificada.

[0138] As medições do índice de ciático estático (SSI) foram tomadas pela posição de pé dos animais. Todas as pegadas foram obtidas pelo menos por quatro períodos ocasionais de repouso. As medições foram feitas tanto do lado normal (N) como do lado experimental (E). Quatro pegadas foram analisadas por animal e as suas impressões foram escolhidas com base na sua clareza. As distâncias médias das três diferentes medições tomadas foram usadas para calcular os seguintes fatores: Fator de dispersão do dedo do pé (TSF), Fator de dispersão do dedo intermédio (ITSF). O cálculo desse parâmetro foi realizado usando a equação descrita por Bain (Plast Reconstr Surg 83 (1989) 129-136). Os resultados desses testes em animais estão resumidos nas Figuras 7 a 9.

[0139] Conforme evidenciado pelos resultados descritos acima, os tubo-guias do nervo preparados com esses copolímeros provaram aprimorar a recuperação funcional das patas traseiras experimentais uma vez que os animais foram capazes de produzir pegadas mais perto do normal. Os materiais preparados com copolímeros de Dextrano-GMA:PCL- IEMA apresentaram excelentes propriedades biológicas, bem como propriedades termomecânicas (resistência à tração, resistência da sutura, temperatura de transição vítrea) e propriedades de intumescimento que podem ser adequadas para uso para fins médicos, particularmente, como guias nervosos para medicina regenerativa.

[0140] O copolímero descrito no presente documento pode ser transformado em películas, folhas, tubos, hastes, tampões, microesferas ou malhas, tanto sólidos como porosos.

[0141] Exemplos dos outros produtos que podem ser feitos a partir desses copolímeros são drenos biomédicos; tubos biomédicos para fins de colocação de stents; folhas biomédicas para aplicação intracorporal, tais como uma folha antiadesiva; folhas biomédicas para uso tópico, tais como cobertura temporária de tratamento de feridas ou para evitar cicatrizes; espumas para tratamento de feridas; bainhas de proteção para agulhas e tubos que são introduzidos no corpo; (micro)esferas para administração de fármacos; (micro)esferas, partículas e tampões para fins de embolização; (micro)esferas para fins de cirurgia cosmética, tais como aumento dérmico, tratamento de rugas e deficiências do contorno da pele; próteses vasculares; estruturas de engenharia de tecidos tais como pele artificial ou tampão de estruturas para reparação de menisco.

EXEMPLOS

[0142] A seguinte notação usada é referida à porcentagem de comacromonômero na composição final de copolímeros constituídos por Dextrano-GMA e PCL-IEMA ([Dextrano-GMA/PCL- IEMA]). Exemplo I: Modificação de dextrano

[0143] Dextrano (70.000 g/mol) (Sigma Aldrich, EUA) em uma quantidade de 2,5 g (1,54 × 10-2 mol) foi dissolvido em 22,5 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) (Fisher Scientific, EUA) em um frasco de fundo redondo. O frasco foi imerso em banho- maria a 30 °C. Após a solubilização completa de dextrano, 0,5 g (4,09 × 10-3 mol) de 4-Dimetilaminopiridina (DMAP) (TCI Europa, Bélgica) foram dissolvidos na solução e 2,05 mL (1,54 × 10-2 mol) de metacrilato de glicidila(GMA) (Acros Organics, Bélgica) foram adicionados. A reação prosseguiu por 8h, sob atmosfera de nitrogênio. Após esse período, 0,33 mL de ácido clorídrico (HCl) (Fisher Scientific, EUA) 37% (p/p) foram adicionados para neutralizar a solução. O produto da reação foi então dialisado contra água. O produto foi liofilizado, dando origem a um produto semelhante a uma esponja. A notação usada para referência a esse produto foi [Dextrano-GMA]. A porcentagem de modificação do dextrano foi obtida pela relação entre os valores integrais (espectro RMN 1H) dos sinais correspondentes ao dextrano e à ligação dupla de GMA. Os valores obtidos, em média, se situaram entre 31-34%. Exemplo II: Modificação de poli (ε-caprolactona) diol

[0144] Em um frasco de fundo redondo colocado em banho- maria a 40 °C, 2,2 g (4mmol) de poli (ε-caprolactona) diol (PCL-diol) (Perstorp, RU) foram dissolvidos em 30 mL de tetraidrofurano (THF) (VWR, EUA), sob atmosfera de nitrogênio. Após solubilização de PCL-diol, 1,27 g (8,2 mmol) de metacrilato de 2-isocianatoetila (IEMA) (TCI Europa, Bélgica) e 150 mg de dilaurato de dibutilestanho (3 gotas) (Fluka, EUA) foram adicionados à mistura reacional. A reação foi deixada a prosseguir por 24h. O produto foi recuperado por precipitação em n-hexano (JMGS, Portugal) e seco sob vácuo, até peso constante, à temperatura ambiente. A notação usada para o produto resultante deste procedimento foi [PCL- IEMA]. Nos espectros FT-IR do produto final, a banda forte característica do grupo isocianato (2.270 cm-1) não é visível. Isso indica que todos os grupos de isocianato foram consumidos durante a modificação. Exemplo III: copolímero A

[0145] O dextrano-GMA (0,5 g) foi dissolvido em 2 mL de DMSO. Após a dissolução, um fotoiniciador biocompatível Irgacure 2959® (Ciba Specialty Chemicals, Suíça) foi adicionado em uma concentração de 0,1 p/v (1,11 x 10-2 mmol). A solução foi então colocada em uma placa de Petri e deixada a fotorreticular em uma câmara de UV (Modelo BS-02, da Dr. Gröbel, UV-Electronik GmbH), com luz com um comprimento de onda de 280 nm, por 2 horas, de modo a render membranas transparentes. As membranas foram então lavadas com água destilada durante 7 dias. Após o processo de lavagem, as membranas foram cortadas em círculos com um diâmetro de 1 cm e secas sob vácuo, à temperatura ambiente, em um dessecador. De acordo com o mencionado anteriormente, a notação para esse copolímero é 100/0. Exemplo IV: copolímero B

[0146] Dextrano-GMA e PCL-IEMA, em uma proporção de 50:50 (p/p), foram dissolvidos em 2 mL de DMSO. Após a dissolução, um fotoiniciador Irgacure 2959® (Ciba Specialty Chemicals, Suíça) foi adicionado em uma concentração de 0,1 p/v (1,11 x 10-2 mmol). A solução foi então colocada em uma placa de Petri e deixada a fotorreticular em uma câmara de UV (Modelo BS-02, da Dr. Gröbel, UV-Electronik GmbH), com luz com um comprimento de onda de 280 nm, por 2 horas, de modo a render membranas transparentes. As membranas foram então lavadas com água destilada durante 7 dias. Após o processo de lavagem, as membranas foram cortadas em círculos com um diâmetro de 1 cm e secas sob vácuo, à temperatura ambiente, em um dessecador. De acordo com o mencionado anteriormente, a notação para esse copolímero é 50/50. Exemplo V: copolímero C

[0147] Dextrano-GMA e PCL-IEMA, em uma proporção de 25:75

(p/p), foram dissolvidos em 2 mL de DMSO. Após a dissolução, um fotoiniciador Irgacure 2959® (Ciba Specialty Chemicals, Suíça) foi adicionado em uma concentração de 0,1 p/v (1,11 x 10-2 mmol). A solução foi então colocada em uma placa de Petri e deixada a fotorreticular em uma câmara de UV (Modelo BS-02, da Dr. Gröbel, UV-Electronik GmbH), com luz com um comprimento de onda de 280 nm, por 2 horas, de modo a render membranas transparentes. As membranas foram então lavadas com água destilada durante 7 dias. Após o processo de lavagem, as membranas foram cortadas em círculos com um diâmetro de 1 cm e secas sob vácuo, à temperatura ambiente, em um dessecador. De acordo com o mencionado anteriormente, a notação para esse copolímero é 25/75. A composição dos copolímeros A-C está resumida na Tabela 1. Tabela 1: Composição dos copolímeros A-C Dextrano-GMA (%) PCL-IEMA (%) Copolímero A 100 0 Copolímero B 50 50 Copolímero C 25 75 Exemplo VI: copolímero D

[0148] Dextrano-GMA e PCL-IEMA, em uma proporção de 25:75 (p/p), foram dissolvidos em 2 mL de DMSO. Após a dissolução, um fotoiniciador Irgacure 2959® (Ciba Specialty Chemicals, Suíça) foi adicionado em uma concentração de 0,1 p/v (1,11 x 10-2 mmol). A notação para esse copolímero se refere à porcentagem de comacromonômeros e porcentagem em peso de D- Manitol adicionado: [Dextrano-GMA/PCL-IEMA(D-Manitol)](D) 25/75(0). Exemplo VII: copolímero E

[0149] Dextrano-GMA e PCL-IEMA, em uma proporção de 25:75 (p/p), foram dissolvidos em 2 mL de DMSO. Após a dissolução, o agente porogênico D-Manitol (Sigma Aldrich, EUA) foi adicionado à mistura (50% p/p). Em seguida, fotoiniciador Irgacure 2959® (Ciba Specialty Chemicals, Suíça) foi adicionado em uma concentração de 0,1 p/v (1,11 x 10-2 mmol). A notação para esse copolímero se refere à porcentagem de comacromonômeros e porcentagem em peso de D-Manitol adicionado: [Dextrano-GMA/PCL-IEMA(D-Manitol)](E) 25/75(50) Exemplo VII: preparação de condutos de guia nervosos

[0150] Condutos de guia nervoso foram preparados a partir dos copolímeros D e E. Os copolímeros foram colocados em um molde composto de um tubo de quartzo com uma haste de aço inoxidável dentro de forma a obter a forma de tubo oco. O molde com os copolímeros foi deixado a fotorreticular em uma câmara de UV (Modelo BS-02, da Dr. Gröbel, UV-Electronik GmbH, com um comprimento de onda de 280 nm), por 20 minutos. Após esse período, os guias dos nervos foram desmoldados e deixados em papel absorvente por 2 dias para eliminação do excesso de DMSO. Em seguida, os guias dos nervos foram lavados com água Milli-Q. No caso do copolímero E, para remoção do D-manitol, após a polimerização, os materiais resultantes foram imersos em água destilada e deixados em estufa a 37 °C durante 3 dias. Em seguida, o copolímero E foi lavado com água Milli-Q por 7 dias.

[0151] Os guias dos nervos foram secos sob vácuo, a 40 °C. Após o processo de secagem, segmentos de tubos com 1 cm foram cortados para caracterização.

[0152] A Figura 1 mostra a capacidade de intumescimento dos copolímeros A-C. Os três copolímeros estabilizaram a sua capacidade de intumescimento após aproximadamente 2-3 horas.

[0153] O dextrano é bem conhecido pela sua elevada afinidade com a água, o que explica a capacidade de intumescimento mais elevada apresentada pelo copolímero A (100/0). Por sua vez, se verificou que com o aumento do teor de PCL-IEMA hidrofóbico na formulação dos copolímeros B e C, a capacidade de intumescimento diminui (de cerca de 200% até 100-50% aproximadamente).

[0154] A Figura 2 apresenta a degradação hidrolítica in vitro dos copolímeros A-C sob condições fisiológicas simuladas (PBS, pH = 7,4, 37 °C).

[0155] O copolímero A apresenta taxa de degradação mais elevada em relação com os copolímeros B e C. Conforme mencionado anteriormente, o dextrano possui elevada afinidade com a água, levando a altos valores de capacidade de intumescimento, o que favorece a taxa de degradação. Com a incorporação do PCL-IEMA, uma diminuição na perda de peso é observada. A natureza hidrofóbica do PCL-IEMA não permite que o meio de degradação penetre facilmente na rede reticulada, levando a uma diminuição nos valores de perda de peso.

[0156] A Figura 3 representa a absorbância avaliada pelo ensaio de viabilidade Presto Blue® de células-tronco da polpa dentária humana (hDPSC) semeadas em copolímeros A-C. Os resultados mostram que o agente de fixação usado para fixar as membranas à placa de cultura de células não afeta significativamente a adesão celular e o metabolismo celular em comparação com o controle em qualquer momento. Isso pode ser observado pela semelhança dos valores de absorbância obtidos para o controle (Ct) com os valores obtidos para o controle com o fixador (Ct SG).

[0157] É digno de nota o fato de que a adesão celular às membranas mediante sementeira é significativamente inferior para o controle e para o controle do agente de fixação.

[0158] No momento de incubação mais tardio (aos 5 e 7 dias) o copolímero C mostra viabilidade celular e atividade metabólica melhoradas em comparação com o controle.

[0159] Ao fim de 5 dias de incubação, foi alcançada a absorvância máxima e a atividade metabólica da célula foi medida. Isso se deve ao fato de as células atingirem a sua confluência entre 5 e 7 dias, levando a uma paragem na atividade metabólica celular devido à falta de espaço superficial disponível.

[0160] A Figura 4 mostra as pontuações histológicas de copolímeros A-C, obtidas de acordo com a ISO 10993-6:2016 Parte 6: Testes para efeitos locais após implantação.

[0161] Após a eutanásia, o tecido subcutâneo exposto se apresentou liso, sem sinais visíveis de hemorragia ou inflamação. Em todos os grupos, os copolímeros foram envolvidos por uma cápsula fina e transparente de tecido subcutâneo.

[0162] Microscopicamente, aos 3 dias após a implantação, um infiltrado celular misto foi observada em todos os grupos. No entanto, neste momento, uma predominância de células inflamatórias mononucleares, tais como macrófagos e linfócitos, estava presente tanto nos simulados como nos copolímeros. Eventos de necrose mínima foram observados em todos os grupos (simulado: 0,139; copolímero A: 0,563; copolímero B: 0,389 e copolímero C: 0,045; pontuação média de um máximo de 4). Em relação à fibrose, todos os grupos, incluindo o Simulado, pontuaram abaixo de 1,4 de 4 pontuações médias.

[0163] Ao fim de 7 dias de implantação, uma resposta inflamatória aguda ainda é detectável com a dominância continuada de células mononucleares. As descobertas de necrose diminuem significativamente em quase todas as amostras e simulados, exceto para o copolímero C, em que os valores chegam a 0,450, em 4 pontuações médias. Em relação à fibrose, todas as amostras e simulados mantêm as pontuações da análise de grupo de 3 dias.

[0164] Após 15 dias de implantação, uma diminuição esperada em leucócitos polimorfonucleares foi observada em quase todos os grupos exceto no copolímero A. Além disso, uma resposta crônica moderada constituída principalmente por agregados linfocíticos ainda é detectável em todos os grupos testados. Neste momento, nenhuma necrose é observada nas amostras de copolímero A e copolímero C (pontuação média de

0,00), embora o copolímero B revele valores residuais de pontuação de necrose (0,059), menores do que os observados no simulado (0,091).

[0165] A fibrose permaneceu abaixo de 1,9 em todos os grupos. Um ligeiro aumento na vascularização foi observado no copolímero C, e uma ligeira diminuição foi registrada para o copolímero A.

[0166] De acordo com as diretrizes padrão, aos 3 e 15 dias o copolímero A foi classificado como “levemente irritante” e, aos 7 dias, tanto o copolímero A como o copolímero C foram classificados como “levemente irritante”. Todas as outras amostras foram classificadas como “não irritantes”. As pontuações calculadas mostram que os copolímeros B e C são considerados como “não irritantes”. A partir dessa figura, é inferido que os copolímeros descritos no presente documento mostraram uma resposta imunológica muito baixa com propriedades melhoradas em relação à rejeição do corpo.

[0167] A Figura 5 representa a capacidade de intumescimento dos copolímeros D e E, avaliada em PBS (pH = 7,4), a 37 °C. Os resultados mostram que a capacidade de intumescimento dos guias nervosos estabiliza aproximadamente após 4-5 horas de imersão. O copolímero D apresenta uma capacidade de intumescimento em torno de 40%, enquanto o valor obtido para o copolímero E é de cerca de 60%. Nas imagens de luz escura, (a) apresenta o guia nervoso no estado seco e (b) no estado úmido. É claro que a dimensão do diâmetro interior do tubo não é comprometida após o equilíbrio do intumescimento (b) ser alcançado. Da mesma forma, o diâmetro interior aumenta, o que será útil para fins de implantação.

[0168] A Figura 6 apresenta a degradação hidrolítica in vitro do guias nervosos preparados com copolímero D e E, sob condições fisiológicas simuladas (PBS, pH = 7,4, 37 °C).

[0169] Após 180 dias, é possível ver que o copolímero D perdeu cerca de 16% da sua massa, e que copolímero E perdeu cerca de 13%. Ambos os perfis indicam que ambos os guias nervosos podem degradar consecutivamente sem alterações significativas nas taxas de degradação até 100 dias. A partir dessa figura, se conclui que os guias nervosos preparados com os copolímeros da presente invenção apresentaram um padrão de degradação compatível com aqueles observados para os materiais e com bons valores para o processo de implantação.

[0170] A Figura 7 representa a porcentagem de déficit de motor, que resulta a partir das medições EPT. Apesar dos valores oscilantes decorrentes da dificuldade em garantir movimentos iguais dos animais durante a extensão dos membros, os traçados de regressão linear mostram uma tendência geral de diminuição da porcentagem do valor do déficit motor em ambos os grupos. Assim sendo, uma melhoria na porcentagem de recuperação motora ao longo das semanas é observada. A partir dessa figura se conclui que os guias nervosos preparados com os copolímeros da presente invenção contribuem para um aumento significativo do T, a recuperação da função motora.

[0171] A Figura 8 mostra os valores de WRL obtidos pelo uso de um estímulo doloroso. As linhas de regressão linear demonstram uma tendência de diminuição do WRL ao longo do tempo. Isso significa que foi observada uma melhoria na função sensorial. Apesar dos valores oscilantes, na semana 20 todos os animais demoraram menos para responder aos estímulos, em comparação com o primeiro momento. A partir dessa figura se conclui que os guias nervosos preparados com os copolímeros da presente invenção quando implantados em camundongos contribuem para recuperar a função sensitiva expressa nos valores WRL para um nível próximo dos saudáveis.

[0172] A Figura 9 apresenta os valores de SSI obtidos pela análise das pegadas de camundongos em pé. Os traços de regressão linear mostram que para ambos os copolímeros há uma tendência para os valores médios de SSI aumentarem ao longo do tempo. Isso significa que a recuperação funcional foi alcançada de forma consistente. Além disso, os animais que receberam ambos os guias nervosos mostram SSI superior no final da experiência em comparação com a primeira semana após a cirurgia. A partir dessa figura se conclui que os guias nervosos preparados com os copolímeros da presente invenção quando implantados em camundongos contribuem para recuperar a função sensitiva expressa nas suas pegadas experimentais que se tornaram mais semelhantes às pegadas normais.

[0173] Embora as modalidades preferidas do presente pedido tenham sido divulgadas para fins ilustrativos, os peritos na técnica apreciarão que várias modificações, adições e substituições são possíveis, sem se afastar do escopo da invenção. Portanto, a presente invenção não está limitada às modalidades descritas acima, mas a presente invenção é definida pelas reivindicações que se seguem, juntamente com o seu escopo de equivalentes.

Claims (21)

REIVINDICAÇÕES

1. Formulações de copolímero biodegradável fotopolimerizado caracterizadas pelo fato de compreenderem dextrano modificado com metacrilato de glicidila e poli ε- caprolactona modificada com metacrilato de 2- isocianatoetila.

2. Formulações de copolímero, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de a porcentagem do dextrano modificado variar entre 25% e 50% (p/p).

3. Formulações de copolímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizadas pelo fato de a porcentagem da poli ε-caprolactona modificada variar entre 50% e 75% (p/p).

4. Formulações de copolímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizadas pelo fato de as formulações compreenderem adicionalmente agentes porogênicos conhecidos tipo açúcar ou tipo sal solúveis em água.

5. Formulações de copolímero, de acordo com a reivindicação 4, caracterizadas pelo fato de o agente porogênico ser selecionado a partir de uma lista compreendendo sacarose, cloreto de sódio e carbonato de sódio.

6. Formulações de copolímero, de acordo com a reivindicação 4, caracterizadas pelo fato de o agente porogênico ser D-manitol.

7. Formulações de copolímero, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadas pelo fato de o teor de D- manitol variar entre 20 e 80% (p/p) da formulação de copolímero.

8. Formulações de copolímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7, caracterizadas pelo fato de o copolímero ser moldado em películas, folhas, tubos, hastes, tampões, microesferas,

estruturas 3D ou malhas.

9. Formulações de copolímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8, caracterizadas pelo fato de as formulações de copolímero serem sólidas.

10. Método de fotopolimerização para preparar materiais sólidos a partir de formulações de copolímero, conforme definidas na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender os seguintes passos: - dextrano modificado com metacrilato de glicidila é dissolvido em DMSO à temperatura ambiente; - poli ε-caprolactona modificada com metacrilato de 2-isocianatoetila é adicionada à solução anterior; - dissolução completa dos comacromonômeros anteriores e adição de um fotoiniciador; - a formulação é deixada a fotorreticular sob luz UV com um comprimento de onda de 280 nm; - o copolímero final é lavado com água durante um período de até 7 dias e depois seco sob vácuo.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser usado dextrano em uma gama de até 200.000 g/mol.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 e 11, caracterizado pelo fato de serem usados 70.000 g/mol de dextrano.

13. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser usada poli ε-caprolactona em uma gama de até 600 g/mol.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10, 11, 12 e 13, caracterizado pelo fato de as formulações finais de copolímero serem secas a 40 °C.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10, 11, 12, 13 e 14, caracterizado pelo fato de o fotoiniciador ser usado em uma concentração entre 0,02 e 2% (p/v).

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10, 11, 12, 13, 14 e 15, caracterizado pelo fato de após a dissolução completa dos comacromonômeros, um agente porogênico conhecido tipo açúcar ou tipo sal solúvel em água ser adicionado à solução e deixado a solubilizar.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de o copolímero compreendendo o agente porogênico ser imerso em água destilada e deixado em um forno a 37 °C durante 3 dias, antes de lavar o copolímero final com água e secar sob vácuo.

18. Formulações de copolímero biodegradável fotopolimerizado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de serem para uso em aplicações biomédicas.

19. Formulações de copolímero biodegradável fotopolimerizado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de serem para uso em medicina regenerativa.

20. Formulações de copolímero biodegradável fotopolimerizado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de serem para uso como guias nervosos.

21. Formulações de copolímero biodegradável fotopolimerizado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de serem para uso como drenos biomédicos, tubos biomédicos para fins de colocação de stents, folhas biomédicas para aplicação intracorporal, tais como uma folha antiadesiva, folhas biomédicas para uso tópico, tais como cobertura temporária de tratamento de feridas ou para evitar cicatrizes, espumas para tratamento de feridas, bainhas de proteção para agulhas e tubos que são introduzidos no corpo, (micro)esferas para a administração de fármacos, (micro)esferas, partículas e tampões para fins de embolização, (micro)esferas para fins de cirurgias cosméticas, tais como aumento dérmico, tratamento de rugas e deficiências do contorno da pele, próteses vasculares, estruturas de engenharia de tecidos, pele artificial ou tampão de estruturas para a reparação do menisco.