BR112020024931A2

BR112020024931A2 - Uso de um inibidor de gsk-3ss

Info

Publication number: BR112020024931A2
Application number: BR112020024931-9A
Authority: BR
Inventors: Francis Giles; Andrew Mazar
Original assignee: Actuate Therapeutics, Inc.
Priority date: 2018-06-05
Filing date: 2019-06-05
Publication date: 2021-03-09
Also published as: WO2019236703A1; AU2019280693A1; EP3801768A1; MX2020013163A; CA3102555A1; CN117883438A; CN112351819B; US11510904B2; US20230126700A1; IL279155A; CN112351819A; KR20210045364A; US20210228546A1; JP2021527039A; EP3801768A4; US11980607B2

Abstract

são providos métodos de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos em um paciente, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um inibidor de gsk-3ß, por exemplo, 9-ing-41. também são fornecidos métodos para o tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreendendo a administração de um inibidor de gsk-3ß, por exemplo, 9-ing-41, em combinação com um segundo ou múltiplos agentes terapêuticos.

Description

“USO DE UM INIBIDOR DE GSK-3β” Campo da invenção

[0001] A presente descrição se refere a métodos de uso de inibidores GSK-3β, incluindo 3-(5-Fluorobenzofuran-3-il)-4- (5-metil-5H-[1,3]dioxolo[4,5-f]indol-7-il)pirrol-2,5-diona, para o tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos. Antecedentes

[0002] Os distúrbios linfoproliferativos malignos são um grupo de distúrbios caracterizados pela proliferação anormal de linfócitos. Dois tipos gerais de distúrbios linfoproliferativos malignos são distúrbios linfoproliferativos de células B malignas e distúrbios linfoproliferativos de células T malignas.

[0003] Distúrbios linfoproliferativos de células B malignas incluem linfoma difuso de grandes células B, leucemia linfocítica aguda, Leucemia mielóide de fase linfóide blástica crônica, leucemia linfocítica crônica/linfoma linfocítico pequeno, linfomas de células B de zona marginal extranodal, linfomas de tecido linfóide associado à mucosa, Linfoma folicular, Linfoma de células do manto, Linfoma de células B da zona marginal nodal, Linfoma de Burkitt, Leucemia de células pilosas, Linfoma primário do sistema nervoso central, Linfoma de células B da zona marginal esplênica, macroglobulinemia de Waldenstrom/Linfoma de células plasmáticas, Mieloma múltiplo, Discrasias de células plasmáticas, Neoplasias de células plasmáticas, linfoma de células B mediastinal primário, doença de Hodgkin e doença de Castelman.

[0004] Os distúrbios linfoproliferativos malignos de células T incluem leucemia de células T/linfoma, linfoma de célula T/killer natural extranodal, linfoma cutâneo de células T, linfoma de células T tipo enteropatia, linfoma angioimunoblástico de células T, células T anaplásicas grandes/linfoma de células nulas, linfoma de células T tipo paniculite subcutâneo, leucemia linfocítica aguda de células T, leucemia de linfócitos granulares grandes de células T, leucemia mielóide crônica de fase blástica linfóide, síndromes linfoproliferativas pós-transplante, vírus da leucemia de células T adulto tipo 1 positivo (HTLV- 1+)/linfoma (ATL), leucemia prolinfocítica de células-T (T- PLL) e linfoma de células T não-especificado.

[0005] Glicogênio sintase quinase-3 (GSK-3) é uma serina (S)/treonina (T) quinase inicialmente descrita como um regulador chave do metabolismo, especificamente a biossíntese de glicogênio. Embi N, et al. Glicogênio sintase quinase-3 do músculo esquelético de coelho. Separação da proteína quinase dependente de AMP cíclico e da fosforilase quinase. Eur J Biochem. 1980; 107: 519-27. Desde então, demonstrou-se que desempenha um papel em vários processos de doenças, incluindo câncer e envelhecimento, distúrbios imunológicos, distúrbios metabólicos e distúrbios neurológicos por meio da modulação de um grande e diversificado número de substratos. Sutherland C. Quais são os substratos GSK3 genuínos? Int J Alzheimers Dis. 2011; 2011: 505607; Gao C, et al .. GSK3: um alvo chave para o desenvolvimento de novos tratamentos para diabetes mellitus tipo 2 e doença de Alzheimer. Rev Neurosci. 2011; 23: 1-11; Wang H, et al., Convergence of the mamífero target of rapamycin complex 1- and glycogen synthase kinase 3-beta- signaling pathways regulates the innate inflamatório response. J Immunol. 2011; 186: 5217-26; Klamer G., et al.

Uso de inibidores de pequenas moléculas GSK3-beta para tratar a inflamação. Curr Med Chem. 2010; 17: 2873-81; Henriksen EJ. Desregulação da glicogênio sintase quinase-3 no músculo esquelético e a etiologia da resistência à insulina e diabetes tipo 2. Curr Diabetes Rev. 2010; 6: 285-93. GSK-3 tem duas isoformas ubiquamente expressas e altamente conservadas, GSK-3α e GSK-3β, com substratos compartilhados e distintos e efeitos funcionais. Foi demonstrado que a super- expressão anormal de GSK-3β promove o crescimento do tumor e a resistência à quimioterapia em vários tumores sólidos. Pouco se sabe, entretanto, sobre a importância de GSK-3β na patogênese do linfoma de células B, resistência à terapia e sobrevivência, apesar de sua função conhecida como regulador de checkpoint metabólico em células B. Jellusova J, et al. GSK3 é um regulador de checkpoint metabólico em células B. Nat Immunol. 2017; 18: 303-12.

[0006] Os inibidores de GSK-3β são de interesse devido à sua capacidade de alterar potencialmente o curso clínico de doenças mediadas por GSK-3β. Alguns inibidores GSK-3β incluem tideglusib, LY2090314, 9-ING-41, CHIR-99021 e CHIR-98014, SB216763 e SB415286, AR-A011418, CG701338 e CG202796. Ver Amy Walz, Andrey Ugolkov, Sunandana Chandra, et al., Molecular Pathways: Revisiting Glycogen Synthase Kinase-3b as a Target for the Treatment of Cancer, Clin Cancer Res; 23 (8) 15 de abril de 2017, OF1-OF7.

[0007] 3-(5-Fluorobenzofuran-3-il)-4-(5-metil-5H- [1,3] dioxolo[4,5-f]indol-7-il)pirrol-2,5-diona ("9-ING-41") é um inibidor GSK-3β que tem a seguinte estrutura química:

[0008] A síntese, propriedades e/ou atividade biológica de 9-ING-41 são estabelecidas na Patente U.S. Número 8.207.216; Gaisina et al., From a Natural Product Lead to the Identification of Potent and Selective Benzofuran-3-yl- (indol-3-yl) maleimides as Glycogen Synthase Kinase 3β Inhibitors That Suppress Proliferation and Survival of Pancreatic Cancer Cells, J. Med . Chem. 2009, 52, 1853–1863; e Hilliard, et al., Inibidores da glicogênio sintase quinase 3β induzem a apoptose em células de câncer de ovário e inibem o crescimento tumoral in vivo, Anti-Cancer Drugs 2011, 22: 978-985. Foi relatado que o 9-ING-41 é útil para o tratamento de certos cânceres, incluindo câncer de cérebro, pulmão, mama, ovário, bexiga, neuroblastoma, renal e pancreático, bem como para o tratamento de lesão cerebral traumática.

[0009] O curso clínico para o linfoma difuso de grandes células B (DLBCL) permanece variável, apesar da melhora na resposta e na sobrevida com a adição do anticorpo monoclonal anti-CD20, rituximab, à quimioterapia padrão no final dos anos 1990. Coiffier B, et al. Resultado de longo prazo dos pacientes no ensaio LNH-98.5, o primeiro estudo randomizado comparando rituximab-CHOP à quimioterapia CHOP padrão em pacientes DLBCL: um estudo do Groupe d'Etudes des Lymphomes de l'Adulte. Sangue. 2010; 116: 2040-5; Feugier P, et al. Resultados de longo prazo do estudo R-CHOP no tratamento de pacientes idosos com linfoma difuso de grandes células B: um estudo do Groupe d'Etude des Lymphomes de l'Adulte. J Clin Oncol. 2005; 23: 4117-26. Embora 60% dos pacientes desfrutem de sobrevida livre de doença em longo prazo, um subconjunto de pacientes com biologia adversa terá doença refratária à quimioterapia com resultados menos favoráveis. Sehn LH, et al. A introdução da terapia combinada de CHOP com rituximab melhorou dramaticamente o resultado do linfoma difuso de grandes células B na Colúmbia Britânica. J Clin Oncol. 2005; 23: 5027-33. Em particular, a translocação dupla de c-MYC e BCL-2 em DLBCL, denominado "linfoma de duplo hit" ("DHL"), está associada a resultados ruins após R-CHOP padrão (rituximab, ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisona), com poucos pacientes alcançando sobrevida em longo prazo. Petrich AM, et al. Impacto do regime de indução e do transplante de células-tronco nos resultados do linfoma de duplo golpe: uma análise retrospectiva multicêntrica. Sangue. 2014; 124: 2354-61.

[0010] Assim, existe uma necessidade de novos métodos para o tratamento de doenças linfoproliferativas malignas, incluindo linfomas e, em particular, para o tratamento de linfomas refratários à terapia, como DLBCL. Sumário

[0011] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de tratamento de um distúrbio linfoproliferativo maligno em um paciente necessitando do mesmo, compreendendo a administração ao referido paciente de uma quantidade eficaz de um inibidor de GSK-3β.

[0012] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de tratamento de um distúrbio linfoproliferativo maligno em um paciente necessitando do mesmo, compreendendo a administração ao referido paciente de uma quantidade eficaz de um inibidor de GSK-3β, em que o distúrbio linfoproliferativo maligno é um B maligno desordem linfoproliferativa celular.

[0013] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de tratamento de um distúrbio linfoproliferativo de células B malignas em um paciente necessitando do mesmo, compreendendo a administração ao referido paciente de uma quantidade eficaz de um inibidor de GSK-3β, em que a célula B maligna O distúrbio linfoproliferativo é Linfoma difuso de grandes células B, leucemia linfocítica aguda, fase linfóide blástica, Leucemia mielóide crônica, Leucemia linfocítica crônica/Linfoma linfocítico pequeno, Linfomas extranodais de células B de zona marginal, Linfoma de células B da mucosa, Linfoma de células foliculares, Linfoma de tecido folicular, Linfoma de células B da zona marginal nodal, Linfoma de Burkitt, Leucemia de células pilosas, Linfoma primário do sistema nervoso central, Linfoma de células B da zona marginal esplênica, macroglobulinemia de Waldenstrom/Linfoma linfoplasmocítico, Mieloma múltiplo, Discrasias de células plasmáticas, Neoplasias de células plasmáticas, B mediastinal primário linfoma celular, doença de Hodgkin ou doença de Castelman.

[0014] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de tratamento de um distúrbio linfoproliferativo de células B malignas em um paciente necessitando do mesmo, compreendendo a administração ao referido paciente de uma quantidade eficaz de um inibidor de GSK-3β, em que a célula B maligna O distúrbio linfoproliferativo é o linfoma difuso de grandes células B.

[0015] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de tratamento de um linfoma difuso de grandes células B em um paciente necessitando do mesmo, compreendendo a administração ao referido paciente de uma quantidade eficaz de um inibidor GSK-3β, em que o linfoma de células B grandes difusas é o linfoma Double-Hit.

[0016] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de tratamento de um distúrbio linfoproliferativo maligno em um paciente necessitando do mesmo, compreendendo a administração ao referido paciente de uma quantidade eficaz de um inibidor de GSK-3β, sendo que o distúrbio linfoproliferativo maligno é um distúrbio de célula T maligna linfoproliferativa.

[0017] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método para tratamento de um distúrbio linfoproliferativo de células T malignas em um paciente necessitando do mesmo, compreendendo a administração ao referido paciente de uma quantidade eficaz de um inibidor de GSK-3β, sendo que o distúrbio de célula T maligna linfoproliferativo é leucemia/linfoma de células T, linfoma extranodal natural killer/células T, Linfoma cutâneo de células T, Linfoma de células T do tipo enteropatia, Linfoma angioimunoblástico de células T, Linfoma anaplásico de células T grandes/nulas, Paniculite subcutânea-like linfoma de células T, leucemia linfocítica aguda de células T, leucemia de linfócitos granulares grandes de células T, Leucemia mielóide crônica de fase linfóide, síndromes linfoproliferativas pós-transplante, vírus da leucemia de células T humanas tipo 1 positivo (HTLV- 1+)/linfoma de células T adultas (ATL), leucemia prolinfocítica de células T (T-PLL) ou linfoma de células T não especificado.

[0018] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de acordo com qualquer um dos aspectos acima, em que o distúrbio linfoproliferativo maligno é refratário à quimioterapia.

[0019] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de acordo com qualquer um dos aspectos acima, em que o inibidor GSK-3β é 9-ING-41, tideglusib, LY2090314, CHIR- 99021, CHIR-98014, SB216763, SB415286, AR-A011418, CG701338 ou CG202796.

[0020] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de acordo com qualquer um dos aspectos acima, em que o inibidor de GSK-3β é 9-ING-41, tideglusib ou LY2090314.

[0021] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de acordo com qualquer um dos aspectos acima, em que o inibidor de GSK-3β é 9-ING-41.

[0022] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de acordo com qualquer um dos aspectos acima, em que o inibidor de GSK-3β é tideglusib.

[0023] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de acordo com qualquer um dos aspectos acima, em que o inibidor de GSK-3β é LY2090314.

[0024] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de acordo com qualquer um dos aspectos acima, em que o inibidor de GSK-3β é administrado em combinação com um segundo agente terapêutico.

[0025] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de acordo com qualquer um dos aspectos acima, em que o inibidor de GSK-3β é administrado em combinação com um segundo agente terapêutico e em que o segundo agente terapêutico é administrado em um sub-quantidade terapêutica.

[0026] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de acordo com qualquer um dos aspectos acima, sendo que o inibidor de GSK-3β é administrado em combinação com um segundo agente terapêutico, sendo que o segundo agente terapêutico é um agente anticâncer.

[0027] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de acordo com o aspecto anterior, sendo que o inibidor GSK-3β é administrado em combinação com um agente anticâncer, sendo que o agente anticâncer é um modulador de apoptose, um modulador de CDK ou um modulador da via mTOR/AKT/PI3K.

[0028] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de acordo com o aspecto anterior, sendo que o inibidor de GSK-3β é administrado em combinação com um agente anticâncer, sendo que o agente anticâncer é um modulador de apoptose.

[0029] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de acordo com o aspecto anterior, sendo que o inibidor de GSK-3β é administrado em combinação com um modulador de apoptose, sendo que o modulador de apoptose é um inibidor de Bcl-2.

[0030] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de acordo com o aspecto anterior, sendo que o inibidor de GSK-3β é administrado em combinação com um inibidor de Bcl-2, sendo que o inibidor de Bcl-2 é venetoclax, ABT-737 ou navitoclax.

[0031] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de acordo com o aspecto anterior, sendo que o inibidor GSK-3β é administrado em combinação com um inibidor Bcl-2,

sendo que o inibidor Bcl-2 é venetoclax.

[0032] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de acordo com qualquer um dos aspectos acima, sendo que o inibidor de GSK-3β é administrado em combinação com um agente anticâncer, sendo que o agente anticâncer é um modulador de CDK.

[0033] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de acordo com o aspecto anterior, sendo que o inibidor de GSK-3β é administrado em combinação com um modulador de CDK, sendo que o modulador de CDK é um inibidor de CDK9.

[0034] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de acordo com o aspecto anterior, sendo que o inibidor GSK-3β é administrado em combinação com um inibidor CDK9, sendo que o inibidor CDK9 é BAY-1143572, LDC000067, Dinaciclib (SCH727965), SNS-032 (BMS-387032), AT7519, P276- 00, AZD5438, PHA-767491 ou PHA-793887.

[0035] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de acordo com o aspecto anterior, em que o inibidor de GSK-3β é administrado em combinação com um inibidor de CDK9, em que o inibidor de CDK9 é BAY-1143572.

[0036] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de acordo com qualquer um dos aspectos acima, sendo que o inibidor de GSK-3β é administrado em combinação com um agente anticâncer, sendo que o agente anticâncer é um modulador do mTOR/AKT/Via PI3K.

[0037] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de acordo com o aspecto anterior, sendo que o inibidor de GSK-3β é administrado em combinação com um modulador da via mTOR/AKT/PI3K, sendo que o modulador da via mTOR/AKT/A via de PI3K é um inibidor de PI3K.

[0038] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de acordo com o aspecto anterior, em que o inibidor de GSK-3β é administrado em combinação com um inibidor de PI3K, em que o inibidor de PI3K é copanlisib ou idelalisib.

[0039] Em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de acordo com o aspecto anterior, em que o inibidor de GSK-3β é administrado em combinação com um inibidor de PI3K, em que o inibidor de PI3K é idelalisib. Breve descrição dos desenhos

[0040] As Figuras 1A-1E mostram a viabilidade e proliferação de células de linfoma com tratamento com 9-ING-

41. 10.000 células (SUDHL-4 (Fig. 1B), KPUM-UH1 (Fig. 1C), Karpas 422 (Fig. 1D), TMD8 (Fig. 1E)) por poço de placa de 96 poços foram deixadas sem tratamento ou tratadas com 1μM 9 - ING-41 em triplicado, e o número de células nos dias 1, 3, 5 e 7 foram calculados usando o ensaio MTS. Resumidamente, 20μL de reagente MTS foram adicionados às células e incubados por 2 horas e, a absorbância a 490 nm (A490) foi lida usando um leitor de placas Biotek. A absorvância em DO = 490 nm aumenta proporcionalmente à densidade celular. Barras de erro representam desvio padrão entre réplicas. A viabilidade do dia 3 é mostrada na Fig. 1A.

[0041] As Figuras 2A-2O mostram a viabilidade de células de linfoma com agentes de quimioterapia em combinação com 9-ING-

41. 10.000 células (Figuras. 1A, F, K: Daudi; Figuras 1B, G, L: SUDHL-4; Figuras. 1C, H, M: KPUM-UH1; Figuras 1D, I, N: Karpas 422; E, J, O: TMD8) foram semeados por poço de uma placa de 96 poços e tratados com uma série de resposta à dose de 9-ING-41 (0-0,5 μM) e Venetoclax (0-5.000 nM) (Figuras. 1A-E) ou BAY-1143572 (0-50 μM) (Figuras. 1F-J) ou Idelalisib

(0-50 μM) (Figuras. 1K-O) em triplicado. A viabilidade após 3 dias foi analisada usando o ensaio MTS. Resumidamente, 20μl de reagente MTS foram adicionados às células e incubados por 2 horas e, a absorbância a 490 nm foi lida usando um leitor de placas Biotek. A absorvância relativa é calculada após definir a absorvância média do controle sem tratamento como

1. A absorvância em DO = 490 nm aumenta proporcionalmente à densidade celular.

[0042] A Figura 3 mostra os valores de IC50 para venetoclax, BAY1143572 e idelalisib com ou sem 0,5 μM de 9- ING-41.

[0043] A Figura 4 mostra que GSK3α e GSK3β mRNA e proteínas são super-expressos em linfoma: (A) Quantificação de PCR em tempo real mostrando GSK3α e GSK3β mRNAs são super-expressos em linhas de linfoma em comparação com baixa expressão em linfócitos B ou T normais. (B) Imagens de Western blot que demonstram as proteínas GSK3α e GSK3β também são abundantemente expressas em várias linhas de linfoma em comparação com linfócitos B ou T normais purificados.

[0044] A Figura 5 mostra que GSK3 é essencial para a proliferação e sobrevivência de células de linfoma. Linfócitos B e T de sangue periférico não-estimulado isolados de um doador saudável foram usados como controle normal. Efeito pró-apoptótico do inibidor GSK3 9-ING-41 em várias linhas MCL e TCL (A) e linhas DLBCL (B). (C) Perfil de proliferação celular de várias linhas celulares de linfoma após tratamento com 9-ING-41. Os resultados (A-C) são de 3 experiências independentes.

[0045] A Figura 6 mostra que a inibição ou deleção de GSK3 em células de linfoma leva à parada do ciclo celular em G2/M.

(A) Perfil do ciclo celular de 3 linhas celulares representativas Jeko, Mino e OCI-Ly3 após tratamento de 24 horas com 0, 1,0 e 2,0 μM de 9-ING-41. (B) Perfis de ciclo celular de células Ly-1 parentais e subclones nocaute GSK3α, GSK3β, GSK3αβ. Detalhe: imagem de Western blot mostrando a depleção das proteínas GSK3α e GSK3β nos subclones Ly-1 nocaute.

[0046] A Figura 7 mostra que a inibição de GSK3 por 9-ING- 41 leva à parada da prófase mitótica. (A) Representação dos desenhos animados das etapas sequenciais (M1-M5) durante a mitose (adquirido na Shutterstock e modificado). (B). Imagens representativas de coloração de Wright de células Jeko não tratadas e tratadas com 1,0 uM de 9-ING-41 por 24 horas. Várias células em estágio mitótico (M1-M5) são prontamente identificadas em células não tratadas (painel esquerdo), enquanto apenas células de prófase (M1) em grande número são vistas em células 9-ING-41 (painel direito). (C). Gráfico de barras mostrando o número de células mitóticas M1-M5 identificadas quando 100 células Jeko não tratadas ou tratadas com 9-ING-41 foram contadas. Resultados semelhantes (dados não mostrados) foram observados em pelo menos 4 linhas celulares de linfoma diferentes.

[0047] A Figura 8 mostra que GSK3β está localizado nos centrossomas. (A) Uma imagem de imunofluorescência mostrando GSK3β está localizada no núcleo e pares de centrossoma em células de Jeko em interfase. (B) Uma imagem em close-up (ampliação) daquela mostrada em (A). (C-F) imagens de canal único ou multicanal de coimunomarcação de GSK3β e pericentrina em células Ly-1 de tipo selvagem mostrando sua co-localização com os centrossomas. (G-H) imagens de canal único ou multicanal de co-imunomarcação de GSK3β e pericentrina em GSK3β nulo em células Ly-1 mostrando que a coloração é específica para GSK3β. (K) Uma imagem de imunofluorescência mostrando GSK3β (verde) localizada em estruturas semelhantes a fogos de artifício que se assemelham a fusos mitóticos em células mitóticas Jeko. (L) Uma imagem de close-up de uma célula mitótica mostrada em (K). (M) Uma imagem de sobreposição mostrando a estrutura dos microtúbulos por coloração com α-tubulina (vermelho) e DNA (em azul). (N) Uma imagem em close-up daquela mostrada em (M). (O-P) Imagens que mostram que a coloração da estrutura do fuso de GSK3β está ausente em células Ly-1 nulas de GSK3β. (Q) Uma imagem de imunofluorescência mostrando GSK3β localizada na estrutura do fuso mitótico e centrossomas polarizados em células Jeko tratadas com 9-ING-41. (R) Uma imagem de close-up de uma célula mitótica representativa mostrada em (Q).

[0048] A Figura 9 mostra a expressão anormal de proteínas GSK3 em células de paciente com linfoma primário (P) e sua resposta proliferativa a 9-ING-41. (A) Imunoblot de proteínas GSK3α e GSK3β mostrando super-expressão em amostras de pacientes versus controle de células B normais. P1: MCL; P2: Linfoma de células B de alto grau; P3: linfoma 3B folicular de grandes células B; P4: DLBCL; P5: linfoma de células T angioimunoblástico. (B) 9-ING-41 inibiu a proliferação em todas as 5 amostras de pacientes. (C) Coloração imunohistoquímica de GSK3β em seções de tecido de parafina de pacientes com vários linfomas. Imagens representativas mostram o espectro de super-expressão de GSK3β (em marrom) em diferentes amostras de linfoma. A contracoloração com azul de metileno (em azul) mostra células negativas para GSK3β no fundo e no painel de controle negativo de anticorpo. As imagens foram coletadas com ampliação de 40x.

[0049] A Figura 10 mostra o efeito anti-linfoma de 9-ING-41 in vivo em modelo de camundongo xenoenxerto derivado de Jeko. (A) Desenho experimental mostrando o esquema de tratamento e dosagem de 9-ING-41. (B) Imagens de bioluminescência de camundongos com xenoenxerto não tratados ou tratados com 9- ING-41. As imagens apresentadas foram coletadas no final do experimento (dia 17). O experimento foi feito duas vezes, ambos mostraram resultados semelhantes. Descrição detalhada das concretizações ilustrativas

[0050] O presente assunto pode ser compreendido mais prontamente por referência à seguinte descrição detalhada que faz parte desta descrição. Deve ser entendido que esta invenção não está limitada aos métodos, condições ou parâmetros específicos descritos e/ou mostrados neste documento, e que a terminologia usada neste documento tem o propósito de descrever concretizações particulares a título de exemplo apenas e não se destina a ser limitante da invenção reivindicada.

[0051] A menos que definido de outra forma neste documento, os termos científicos e técnicos usados em conexão com o presente pedido devem ter os significados que são comumente compreendidos por aqueles versados na técnica. Além disso, a menos que exigido de outra forma pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e os termos plurais devem incluir o singular.

[0052] Conforme empregado acima e ao longo da descrição, os seguintes termos e abreviaturas, a menos que indicado de outra forma, devem ser entendidos como tendo os seguintes significados.

[0053] Na presente descrição, as formas singulares "um", "uma" e "o" incluem a referência no plural e a referência a um determinado valor numérico inclui pelo menos esse valor específico, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, uma referência a "um composto" é uma referência a um ou mais de tais compostos e seus equivalentes conhecidos pelos versados na técnica e assim por diante. O termo "pluralidade", conforme usado neste documento, significa mais de um. Quando uma faixa de valores é expressa, outra modalidade inclui a partir de um valor particular e/ou para o outro valor particular. Da mesma forma, quando os valores são expressos como aproximações, pelo uso do antecedente "cerca de", entende-se que o valor particular forma outra modalidade. Todas as faixas são inclusivas e combináveis.

[0054] Tal como aqui utilizado, os termos "componente", "composição", "composição de compostos", "composto", "droga", "agente farmacologicamente ativo", "agente ativo", "terapêutico", "terapia" "Tratamento" ou "medicamento" são usados indistintamente neste documento para se referir a um composto ou a compostos ou composição de matéria que, quando administrado a um sujeito (humano ou animal) induz um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado por local e/ou ação sistêmica.

[0055] Conforme usado neste documento, os termos "tratando", "tratamento" ou "terapia" (bem como suas diferentes formas) incluem tratamento preventivo (por exemplo, profilático), curativo ou paliativo. Conforme usado neste documento, o termo "tratar" inclui o alívio ou redução de pelo menos um efeito adverso ou negativo ou sintoma de uma condição, doença ou distúrbio. Esta condição, doença ou distúrbio pode ser câncer.

[0056] Conforme empregado acima e ao longo da descrição, o termo "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para atingir o resultado desejado com relação ao tratamento do distúrbio, condição ou condição relevante efeito colateral. Será apreciado que a quantidade eficaz de componentes da presente invenção irá variar de paciente para paciente, não apenas com o composto, componente ou composição particular selecionado, a via de administração e a capacidade dos componentes de induzir um resultado desejado no individual, mas também com fatores como o estado da doença ou gravidade da condição a ser aliviada, níveis hormonais, idade, sexo, peso do indivíduo, o estado de ser do paciente e a gravidade da condição patológica a ser tratada, medicação concorrente ou dietas especiais seguidas pelo paciente em particular e outros fatores que os versados na técnica reconhecerão, com a dosagem apropriada ficando a critério do médico assistente. Os regimes de dosagem podem ser ajustados para prover a resposta terapêutica melhorada. Uma quantidade eficaz também é aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais dos componentes são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos.

[0057] Em algumas concretizações, uma quantidade eficaz é baseada no peso do paciente. Em algumas concretizações, uma quantidade eficaz de 9-ING-41 é de cerca de 0,1 mg/kg a 10 mg/kg, por exemplo, cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 6 mg/kg, cerca de 7 mg/kg, cerca de 8 mg/kg, cerca de 9 mg/kg ou cerca de 10 mg/kg.

[0058] Conforme empregado acima e ao longo da descrição, o termo "quantidade subterapêutica" se refere a uma quantidade que é ineficaz quando administrada como o único agente terapêutico.

[0059] "Farmaceuticamente aceitável" refere-se aos compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo do julgamento médico sensato, adequados para contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, alergia resposta, ou outras complicações do problema proporcionais a uma relação benefício/risco razoável.

[0060] Na presente invenção, os compostos descritos podem ser preparados na forma de sais farmaceuticamente aceitáveis. "Sais farmaceuticamente aceitáveis" referem-se a derivados dos compostos descritos, em que o composto parental é modificado pela produção de sais de ácido ou base dos mesmos. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, sais de ácidos minerais ou orgânicos de resíduos básicos, tais como aminas; sais alcalinos ou orgânicos de resíduos ácidos, tais como ácidos carboxílicos; e similar. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais não tóxicos convencionais ou os sais de amônio quaternário do composto original formado, por exemplo, a partir de ácidos inorgânicos ou orgânicos não tóxicos. Por exemplo, tais sais não tóxicos convencionais incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos tais como clorídrico, bromídrico, sulfúrico, sulfâmico, fosfórico, nítrico e semelhante; e os sais preparados a partir de ácidos orgânicos, tais como acético, propiônico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, pamóico, maleico, hidroximaleico, fenilacético, glutâmico, benzóico, salicílico, sulfanílico, 2- acetoxibenzoico, fumárico, toluenossulfônico, metanossulfônico, etano dissulfônico, oxálico, isetionico e semelhantes. Estes sais fisiologicamente aceitáveis são preparados por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, dissolvendo as bases de amina livres com um excesso de ácido em álcool aquoso, ou neutralizando um ácido carboxílico livre com uma base de metal alcalino, como um hidróxido, ou com um amina.

[0061] Os compostos descritos neste documento podem ser preparados em formas alternativas. Por exemplo, muitos compostos contendo amino podem ser usados ou preparados como um sal de adição de ácido. Frequentemente, esses sais melhoram as propriedades de isolamento e manuseio do composto. Por exemplo, dependendo dos reagentes, condições de reação e semelhantes, os compostos como aqui descritos podem ser usados ou preparados, por exemplo, como seus sais cloridrato ou tosilato. As formas cristalinas isomórficas, todas as formas quirais e racêmicas, N-óxido, hidratos, solvatos e hidratos de sal de ácido, também estão contemplados como estando dentro do escopo da presente invenção.

[0062] Certos compostos ácidos ou básicos da presente invenção podem existir como zwitterions. Todas as formas dos compostos, incluindo ácido livre, base livre e zwitterions, estão contempladas como estando dentro do âmbito da presente invenção. É bem conhecido na técnica que compostos contendo grupos amino e carboxi frequentemente existem em equilíbrio com suas formas zwitteriônicas. Assim, qualquer um dos compostos aqui descritos que contêm, por exemplo, grupos amino e carboxi, também incluem referência aos seus zwitterions correspondentes.

[0063] O termo "administrar" significa administrar diretamente um composto ou composição da presente invenção, ou administrar um pró-fármaco, derivado ou análogo que formará uma quantidade equivalente do composto ou substância ativa dentro do corpo.

[0064] Os termos "sujeito", "indivíduo" e "paciente" são usados indistintamente neste documento e se referem a um animal, por exemplo, um ser humano, a quem o tratamento, incluindo o tratamento profilático, com a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção, é fornecido. O termo "sujeito", conforme usado neste documento, refere-se a animais humanos e não humanos. Os termos "animais não humanos" e "mamíferos não humanos" são usados indistintamente aqui e incluem todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos, como primatas não humanos, (particularmente primatas superiores), ovelhas, cães, roedores, (por exemplo, camundongos ou rato), porquinho-da-índia, cabra, porco, gato, coelhos, vacas, cavalos e não mamíferos, como répteis, anfíbios, galinhas e perus.

[0065] A presente descrição provê um método de tratamento de um distúrbio linfoproliferativo maligno em um paciente necessitando do mesmo do mesmo, compreendendo a administração ao referido paciente de uma quantidade eficaz de um inibidor de GSK-3β.

[0066] O distúrbio linfoproliferativo maligno que pode ser tratado usando os métodos da presente descrição pode ser um distúrbio linfoproliferativo de células B maligno ou um distúrbio linfoproliferativo de células T maligno. Em algumas concretizações, o distúrbio linfoproliferativo maligno é um distúrbio linfoproliferativo de células B maligno. Em outras concretizações, o distúrbio linfoproliferativo maligno é um distúrbio linfoproliferativo de células T maligno.

[0067] Em algumas concretizações, o distúrbio linfoproliferativo de células B maligno que pode ser tratado usando os métodos da presente descrição é Linfoma difuso de grandes células B, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielóide crônica de fase linfóide blástica, leucemia linfocítica crônica/linfocítico pequeno Linfoma, Linfomas de células B da zona marginal extranodal, Linfomas do tecido linfóide associado à mucosa, Linfoma folicular, Linfoma de células do manto, Linfoma de células B da zona marginal nodal, Linfoma de Burkitt, Leucemia de células pilosas, Linfoma primário do sistema nervoso central, linfoma de células B- Zona marginal esplênica, macroglobulinemia de Waldenstrom/linfoma linfoplasmocítico, Mieloma múltiplo, Discrasias de células plasmáticas, Neoplasias de células plasmáticas, Linfoma de células B mediastinal primária, Doença de Hodgkin ou Doença de Castelman.

[0068] Em algumas concretizações, o distúrbio linfoproliferativo de células B malignas que é tratado usando os métodos da presente descrição é o linfoma difuso de grandes células B. Em algumas concretizações, o linfoma difuso de grandes células B é um linfoma Double-Hit.

[0069] Em algumas concretizações, o distúrbio linfoproliferativo de células B malignas que é tratado usando os métodos da presente descrição é Linfoma de células do manto.

[0070] Em algumas concretizações, o distúrbio linfoproliferativo de células T maligno que pode ser tratado usando os métodos da presente descrição é leucemia de células T/linfoma, linfoma extranodal natural killer/células T, linfoma cutâneo de células T, linfoma de células T do tipo Enteropatia, linfoma de células T angioimunoblástico, linfoma anaplásico de células T grandes/nulas, linfoma de células T tipo paniculite subcutâneo, leucemia linfocítica aguda de células T, leucemia de linfócitos T grandes de células T, fase blástica linfóide crônico Leucemia, síndromes linfoproliferativas pós-transplante, vírus da leucemia de células T humanas tipo 1 positivo (HTLV-1+), leucemia/linfoma de células T adultas (ATL), leucemia prolinfocítica de células T (T-PLL) ou T- não especificado linfoma celular.

[0071] Em algumas concretizações, o distúrbio linfoproliferativo de células T maligno que é tratado usando os métodos da presente descrição é Linfoma de células T.

[0072] Em alguns aspectos da presente descrição, o distúrbio linfoproliferativo maligno pode ser um distúrbio linfoproliferativo maligno refratário à quimioterapia. Um distúrbio linfoproliferativo maligno refratário à quimioterapia é um distúrbio linfoproliferativo maligno que não respondeu a um ou mais tratamentos quimioterápicos. Em algumas concretizações, o distúrbio linfoproliferativo maligno refratário à quimioterapia é um linfoma de duplo acerto (ou seja, um linfoma com translocação dupla de c-MYC e BCL-2). Em outras concretizações, a quimioterapia à qual o distúrbio linfoproliferativo maligno refratário não respondeu é R-CHOP (rituximab, ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisona). Em ainda outras concretizações, a quimioterapia à qual o distúrbio linfoproliferativo maligno refratário não respondeu é uma combinação de terapias citotóxicas com ou sem anticorpos monoclonais, inibidores de quinase, moduladores de enzima e modificadores de apoptose.

[0073] Os pacientes cujas condições são tratadas usando os métodos da presente invenção são animais, de preferência mamíferos. Em algumas concretizações, os pacientes são seres humanos. Em outras concretizações, os pacientes são caninos (ou seja, cães). Em ainda outras concretizações, os pacientes são felinos (ou seja, gatos). Em concretizações preferidas, os pacientes cujas condições são tratadas usando os métodos da presente descrição são seres humanos.

[0074] O inibidor de GSK-3β que é administrado nos métodos da presente descrição é qualquer composto que inibe a atividade do glicogênio sintase quinase-3β (GSK-3β).

[0075] Em alguns aspectos, o inibidor GSK-3β que é administrado nos métodos da presente descrição é 9-ING-41, tideglusib, LY2090314, CHIR-99021, CHIR-98014, SB216763, SB415286, AR-A011418, CG701338 ou CG202796.

[0076] Em algumas concretizações, o inibidor de GSK-3β que é administrado nos métodos da presente descrição é 9-ING-41. Assim, em alguns aspectos, a presente descrição provê um método de tratamento de um distúrbio linfoproliferativo maligno em um paciente necessitando do mesmo, compreendendo a administração ao referido paciente de uma quantidade eficaz de 9-ING-41.

[0077] Em outras concretizações, o inibidor GSK-3β que é administrado nos métodos da presente descrição é tideglusib, e a presente descrição provê um método de tratamento de um distúrbio linfoproliferativo maligno em um paciente necessitando do mesmo, compreendendo a administração ao referido paciente uma quantidade eficaz de tideglusib.

[0078] Em ainda outras concretizações, o inibidor de GSK-3β que é administrado nos métodos da presente descrição é LY2090314, e a presente descrição provê um método de tratamento de um distúrbio linfoproliferativo maligno em um paciente necessitando do mesmo, compreendendo a administração ao referido paciente uma quantidade eficaz de LY2090314.

[0079] Nos métodos de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos da presente descrição, uma quantidade eficaz de um inibidor de GSK-3β pode ser administrada ao paciente como o único agente terapêutico, ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos.

[0080] Em algumas concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de um inibidor de GSK-3β como o único agente terapêutico. Quando o inibidor de GSK-3β é o único composto terapeuticamente eficaz administrado nos métodos da presente descrição, o tratamento é referido como uma monoterapia. Em algumas concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de 9- ING-41 como o único agente terapêutico. Em outras concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de tideglusib como o único agente terapêutico. Em ainda outras concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de

LY2090314 como o único agente terapêutico.

[0081] Em outras concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de um GSK-3β em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos. Quando o inibidor de GSK-3β é administrado em combinação com um segundo agente terapêutico, o tratamento é referido como terapia de combinação. Em terapia de combinação, não é necessário que o inibidor de GSK-3β e o segundo agente terapêutico sejam introduzidos ou aplicados no corpo do paciente simultaneamente. A terapia de combinação requer apenas que o inibidor GSK-3β e o segundo agente terapêutico estejam presentes no ou no corpo do paciente ao mesmo tempo. Assim, a terapia de combinação não implica qualquer esquema de dosagem particular.

[0082] Em algumas concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de 9-ING-41 em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos. Em outras concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de tideglusib em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos. Em ainda outras concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de LY2090314 em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos.

[0083] Em alguns aspectos, o método de tratamento de doenças linfoproliferativas malignas compreende a administração de um inibidor de GSK-3β em combinação com um modulador de apoptose. Em algumas concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de 9-ING-41 em combinação com um modulador de apoptose. Em outras concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de tideglusib em combinação com um modulador de apoptose. Em ainda outras concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de LY2090314 em combinação com um modulador de apoptose.

[0084] Em alguns aspectos, o modulador de apoptose é um inibidor Bcl-2. Inibidores Bcl-2 exemplares incluem venetoclax, ABT-737 e navitoclax. Em alguns aspectos, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de um inibidor de GSK-3β em combinação com um inibidor de Bcl-2. Em algumas concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de 9- ING-41 em combinação com um inibidor de Bcl-2. Em outras concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de tideglusib em combinação com um inibidor de Bcl-2. Em ainda outras concretizações, o método de tratamento de doenças linfoproliferativas malignas compreende a administração de LY2090314 em combinação com um inibidor de Bcl-2.

[0085] Em alguns aspectos, o inibidor de Bcl-2 é venetoclax, ABT-737 ou navitoclax. Em alguns aspectos, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de um inibidor GSK-3β em combinação com venetoclax, ABT-737 ou navitoclax. Em algumas concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de 9-

ING-41 em combinação com venetoclax, ABT-737 ou navitoclax. Em outras concretizações, o método de tratamento de doenças linfoproliferativas malignas compreende a administração de tideglusib em combinação com venetoclax, ABT-737 ou navitoclax. Em ainda outras concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de LY2090314 em combinação com venetoclax, ABT-737 ou navitoclax.

[0086] Em alguns aspectos, o inibidor de Bcl-2 é venetoclax. Em outros aspectos, o inibidor de Bcl-2 é ABT-

737. Em ainda outros aspectos, o inibidor de Bcl-2 é navitoclax. Em alguns aspectos, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de um inibidor de GSK-3β em combinação com venetoclax. Em alguns aspectos, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de um inibidor de GSK-3β em combinação com ABT-

737. Em alguns aspectos, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de um inibidor de GSK-3β em combinação com navitoclax.

[0087] Em algumas concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de 9-ING-41 em combinação com venetoclax. Em algumas concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de 9- ING-41 em combinação com ABT-737. Em algumas concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de 9-ING-41 em combinação com navitoclax.

[0088] Em algumas concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de tideglusib em combinação com venetoclax. Em algumas concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de tideglusib em combinação com ABT-737. Em algumas concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de tideglusib em combinação com navitoclax.

[0089] Em ainda outras concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de LY2090314 em combinação com venetoclax. Em ainda outras concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de LY2090314 em combinação com ABT-737. Em ainda outras concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de LY2090314 em combinação com navitoclax.

[0090] Em alguns aspectos, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de um inibidor GSK-3β em combinação com um modulador de quinase dependente de ciclina (CDK). Em algumas concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de 9- ING-41 em combinação com um modulador de quinase dependente de ciclina (CDK). Em outras concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de tideglusib em combinação com um modulador de quinase dependente de ciclina (CDK). Em ainda outras concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de LY2090314 em combinação com um modulador de quinase dependente de ciclina (CDK).

[0091] Em alguns aspectos, o modulador de CDK é um inibidor de quinase 9 dependente cíclico ("CDK9"). O inibidor CDK9 exemplar inclui BAY-1143572, LDC000067, Dinaciclib (SCH727965), SNS-032 (BMS-387032), AT7519, P276-00, AZD5438, PHA-767491 ou PHA-793887. Em alguns aspectos, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de um inibidor de GSK-3β em combinação com um inibidor de CDK9. Em algumas concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de 9- ING-41 em combinação com um inibidor de CDK9. Em outras concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de tideglusib em combinação com um inibidor de CDK9. Em ainda outras concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de LY2090314 em combinação com um inibidor de CDK9.

[0092] Em alguns aspectos, o inibidor de CDK9 é BAY- 1143572, LDC000067, Dinaciclib (SCH727965), SNS-032 (BMS- 387032), AT7519, P276-00, AZD5438, PHA-767491 ou PHA-793887. Em alguns aspectos, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de um inibidor de GSK-3β em combinação com BAY-1143572, LDC000067, Dinaciclib (SCH727965), SNS-032 (BMS-387032), AT7519, P276- 00, AZD5438, PHA -767491 ou PHA-793887. Em algumas concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de 9-

ING-41 em combinação com BAY-1143572, LDC000067, Dinaciclib (SCH727965), SNS-032 (BMS-387032), AT7519, P276-00, AZD5438, PHA -767491 ou PHA-793887. Em outras concretizações, o método de tratamento de doenças linfoproliferativas malignas compreende a administração de tideglusib em combinação com BAY-1143572, LDC000067, Dinaciclib (SCH727965), SNS-032 (BMS- 387032), AT7519, P276-00, AZD5438, PHA-767491 ou PHA-793887. Em ainda outras concretizações, o método de tratamento de doenças linfoproliferativas malignas compreende a administração de LY2090314 em combinação com BAY-1143572, LDC000067, Dinaciclib (SCH727965), SNS-032 (BMS-387032), AT7519, P276-00, AZD5438, PHA-767491, ou PHA-793887.

[0093] Em alguns aspectos, o inibidor de CDK9 é BAY-

1143572. Em alguns aspectos, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de um inibidor GSK-3β em combinação com BAY-

1143572. Em algumas concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de 9-ING-41 em combinação com BAY-1143572. Em algumas concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de tideglusib em combinação com BAY-1143572. Em ainda outras concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de LY2090314 em combinação com BAY-1143572.

[0094] Em alguns aspectos, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de um inibidor de GSK-3β em combinação com um modulador da via MTOR/AKT/PI3. Em algumas concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de 9-ING-41 em combinação com um modulador da via MTOR/AKT/PI3. Em outras concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de tideglusib em combinação com um modulador da via MTOR/AKT/ PI3. Em ainda outras concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de LY2090314 em combinação com um modulador da via MTOR/AKT/PI3.

[0095] Em alguns aspectos, o modulador da via MTOR/AKT/PI3 é um inibidor de PI3K. Inibidores de PI3K exemplares incluem copanlisib e idelalisib. Em alguns aspectos, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de um inibidor de GSK-3β em combinação com um inibidor de PI3K. Em algumas concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de 9- ING-41 em combinação com um inibidor de PI3K. Em outras concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de tideglusib em combinação com um inibidor de PI3K. Em ainda outras concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de LY2090314 em combinação com um inibidor de PI3K.

[0096] Em alguns aspectos, o inibidor de PI3K é copanlisib ou idelalisib. Em alguns aspectos, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de um inibidor de GSK-3β em combinação com copanlisib ou idelalisib. Em algumas concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de 9-ING-41 em combinação com copanlisib ou idelalisib. Em outras concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de tideglusib em combinação com copanlisib ou idelalisib. Em ainda outras concretizações, o método de tratamento de doenças linfoproliferativas malignas compreende a administração de LY2090314 em combinação com copanlisib ou idelalisib.

[0097] Em alguns aspectos, o inibidor de PI3K é copanlisib. Em alguns aspectos, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de um inibidor de GSK-3β em combinação com copanlisib. Em algumas concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de 9- ING-41 em combinação com copanlisib. Em algumas concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de tideglusib em combinação com copanlisib. Em ainda outras concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de LY2090314 em combinação com copanlisib.

[0098] Em alguns aspectos, o inibidor de PI3K é idelalisib. Em alguns aspectos, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de um inibidor de GSK-3β em combinação com idelalisib. Em algumas concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de 9- ING-41 em combinação com idelalisib. Em algumas concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de tideglusib em combinação com idelalisib. Em ainda outras concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de LY2090314 em combinação com idelalisib.

[0099] Em ainda outros aspectos, o segundo agente terapêutico é um ou mais dentre 5-fluorouracil, acetato de abiraterona, acetilcolina, ado-trastuzumab emtansina, afatinib, aldesleucina, alectinib, alemtuzumab, alitretinoína, ácido aminolevulínico, anastrozol, anastrozol, aprepitantzol, trióxido de arsênio, asparaginase erwinia chrysanthemi, atezolizumabe, axitinib, azacitidina, belinostat, bendamustina, isotiocianato de benzila, bevacizumab, bexaroteno, bicalutamida, bleomicina, blinatumimumab, bortabitina carabutina, bortabitina, carabutimina, bortabitina carburante, bortibitina carabutina, cabozabutibamim, cabozabutibamim, bortibentibatina, bortibentibatina, carbita-zabutibomim, bortibentibatina, carbazelbutibatina, carabutibentibatina, carabitacibitina, carbita-zibatim, bortibentibe, carburibitanib , ceritinib, cetuximab, clorambucil, cisplatina, clofarabina, cobimetinib, crizotinib, ciclofosfamida, citarabina, dabrafenib, dacarbazina, dacarbazina, dactinomicina, daratumumab, dasatinib, daunorrubicina, digarrazotoxamidrato de digarrazotoxamida, digarrazotase de desgarrazotase, desgarrazotase-desidrato de desgarrazotase, digarrazotassanato de digarrazotixabina, desgarrazotassanodetixabina, digarrazotassanodetixabina, digarrazotassonodetassonodetixabina. (DHT), dinutuximabe, docetaxel, doxorrubicina, elotuzumab, eltrombopag, enzalutamida, epirrubicina, mesilato de eribulina, erlotinib,

etoposídeo, everolimus, exemestano, exemestano, filgrastim, fosfato de fludarabina, flutamida, fulvestrant, fulvestrant, gefitinib, gemcitumabina, acetato de oleobutamida, gemtuzibumabidasa, gemtuzanobelina, acetato de oleobutabina, gemtuzanobelina, acetato de oleibutamina, idarrubicina, idelalisib, ifosfamida, imatinib, imiquimod, interferon alfa- 2b, ipilimumab, irinotecano, ixabepilona, ixazomib, lanreotida, lapatinib, lenalidomida, lenvatinib, letrozol, mesoletamina, acetato de leucovorina, letroestroletamina, leucovorina, metilestroletamina, letroestroletamina, acetato de leucovorina, leucovorina, letroestroletamina, letroestrolina, metotrexato, mitomicina C, mitoxantrona, necitumumab, nelarabina, netupitant, nilotinib, nilutamida, nivolumab, obinutuzumab, ofatumumabe, olaparib, mepesuccinato omacetaxina, osimertinib, oxaliplatina, gemtuzumab, paclitaxel, palbociclib, palifermina, pamidronato, panitumumab, panobinostat, pazopanib, pegaspargase, peg- interferon alfa-2b, pembrolizumab, pemetrexedo, pertuzumab, plerixa para-, pomalidomida, ponatinibe, pralatrexato, prednisona, procarbazina, propranolol, dicloreto de rádio 223, raloxifeno, ramucirumabe, rasburicase, regorafenib, rituximab, rolapitant, romidepsina, romiplostim, ruxolitinib, sibule-feno, siboridimetinib, sibule-feno, sibora-porrinib, sibule-feno, sibora-tora-bogeno, tibora-hipofenitina, sibora- porridogeno, sibule-feno-tora-tora-tora-tora, sibora-tora- poci-tora, tibora-torabogeno, sibule-feno, sibora-torabina, sibora-hipocentogeno, sibulofeni-sol, tamoxifeno, temozolomida, temsirolimus, talidomida, tioguanina, tiotepa, tipiracil, topotecano, toremifeno, toremifeno, tositumomab, trabectedina, trametinib, trastuzumab, tretinoína,

trifloristibina, trifluridina, triacetato de uridina, vinaxcribetina, vinaxcribetina, vinocluridina, vinaxcribetibetato, vinaxcribetibetato, vinaxcribetina, vembletibastina, vinocluridina, vinaxcribetibetato, vinaxcribetato, vembletibastina, vinaxcribetato vorinostat, ziv-aflibercept, ácido zoledrônico e seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Em algumas concretizações, o segundo agente terapêutico é um ou mais dentre rituximab, ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisona.

[0100] Em alguns aspectos, a administração de um inibidor de GSK-3β em combinação com um segundo agente terapêutico reduz a quantidade do segundo agente terapêutico necessária para produzir um determinado efeito terapêutico. Ou seja, em algumas concretizações, um tratamento terapeuticamente eficaz compreende a administração de um inibidor de GSK-3β em combinação com uma quantidade subterapêutica (ou seja, uma quantidade que é ineficaz quando administrada como o único agente terapêutico) de um segundo agente terapêutico. Em algumas concretizações, um inibidor de GSK-3β é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de um modulador de apoptose. Em algumas concretizações, 9-ING-41 é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de um inibidor de Bcl-2. Em algumas concretizações, 9-ING-41 é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de venetoclax, ABT-737 ou navitoclax. Em algumas concretizações, 9-ING-41 é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de Venetoclax.

[0101] Em outras concretizações, tideglusib é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de um inibidor de Bcl-2. Em algumas concretizações, o tideglusib é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de venetoclax, ABT-737 ou navitoclax. Em algumas concretizações, o tideglusib é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de Venetoclax.

[0102] Em ainda outras concretizações, LY2090314 é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de um inibidor de Bcl-2. Em algumas concretizações, LY2090314 é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de venetoclax, ABT-737 ou navitoclax. Em algumas concretizações, LY2090314 é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de Venetoclax.

[0103] Em outras concretizações, um inibidor de GSK-3β é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de um modulador de CDK. Em outras concretizações, um inibidor de GSK-3β é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de um inibidor de CDK9. Em outras concretizações, um inibidor de GSK-3β é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de um inibidor de CDK9. Em algumas concretizações, 9-ING-41 é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de um inibidor de CDK9. Em algumas concretizações, 9-ING-41 é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de BAY-1143572, LDC000067, Dinaciclib (SCH727965), SNS-032 (BMS-387032), AT7519, P276-00, AZD5438, PHA- 767491 ou PHA-

793887. Em algumas concretizações, 9-ING-41 é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de BAY-1143572.

[0104] Em algumas concretizações, tideglusib é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de um inibidor de CDK9. Em algumas concretizações, o tideglusib é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de BAY-1143572, LDC000067, Dinaciclib (SCH727965), SNS-032 (BMS-387032), AT7519, P276-00, AZD5438, PHA-767491 ou PHA -

793887. Em algumas concretizações, o tideglusib é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de BAY-1143572.

[0105] Em algumas concretizações, LY2090314 é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de um inibidor de CDK9. Em algumas concretizações, LY2090314 é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de BAY-1143572, LDC000067, Dinaciclib (SCH727965), SNS-032 (BMS-387032), AT7519, P276-00, AZD5438, PHA-767491 ou PHA -

793887. Em algumas concretizações, LY2090314 é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de BAY-

1143572.

[0106] Em alguns aspectos, um inibidor de GSK-3β é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de um modulador da via MTOR/AKT/PI3. Em alguns aspectos, um inibidor de GSK-3β é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de um inibidor de PI3K. Em algumas concretizações, 9-ING-41 é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de um inibidor de PI3K. Em outras concretizações, 9-ING-41 é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de copanlisib ou idelalisib. Em algumas concretizações, 9-ING-41 é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de copanlisib. Em ainda outras concretizações, 9-ING-41 é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de idelalisib.

[0107] Em algumas concretizações, tideglusib é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de um inibidor de PI3K. Em outras concretizações, tideglusib é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de copanlisib ou idelalisib. Em algumas concretizações, o tideglusib é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de copanlisib. Em ainda outras concretizações, tideglusib é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de idelalisib.

[0108] Em algumas concretizações, LY2090314 é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de um inibidor de PI3K. Em outras concretizações, LY2090314 é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de copanlisib ou idelalisib. Em algumas concretizações, LY2090314 é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de copanlisib. Em ainda outras concretizações, LY2090314 é administrado em combinação com uma quantidade subterapêutica de idelalisib.

[0109] O inibidor de GSK-3β pode ser administrado em uma composição farmacêutica compreendendo o inibidor de GSK-3β e pelo menos um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas concretizações, 9-ING-41 pode ser administrado em uma composição farmacêutica compreendendo 9- ING-41 e pelo menos um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em outras concretizações, o tideglusib pode ser administrado em uma composição farmacêutica compreendendo tideglusib e pelo menos um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em outras concretizações, o LY2090314 pode ser administrado em uma composição farmacêutica compreendendo LY2090314 e pelo menos um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Da mesma forma, o segundo agente terapêutico pode ser administrado em uma composição farmacêutica compreendendo o segundo agente terapêutico e pelo menos um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Os veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ª Edição, Mack Publishing Company (1990).

[0110] Em alguns aspectos, o inibidor de GSK-3β e o segundo agente terapêutico podem ser administrados juntos em uma única composição farmacêutica. Assim, em alguns aspectos, a presente descrição é direcionada a composições farmacêuticas compreendendo um inibidor GSK-3β e um segundo agente terapêutico e pelo menos um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas concretizações, a composição farmacêutica compreende um inibidor de GSK-3β; um ou mais de um modulador de apoptose, um modulador CDK ou um modulador mTOR/AKT/PI3K; e um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas concretizações, a composição farmacêutica compreende um ou mais de 9-ING-41, tideglusib ou LY2090314; um ou mais de um modulador de apoptose, um modulador CDK ou um modulador mTOR/AKT/PI3K; e um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas concretizações, a composição farmacêutica compreende um ou mais de 9-ING-41, tideglusib ou LY2090314; um ou mais de Venetoclax, BAY-1143572 ou idelalisib; e um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas concretizações, a composição farmacêutica compreende um ou mais de 9-ING-41, tideglusib ou LY2090314; Venetoclax; e um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em outras concretizações, a composição farmacêutica compreende um ou mais de 9-ING-41, tideglusib ou LY2090314; BAY-1143572; e um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em ainda outras concretizações, a composição farmacêutica compreende um ou mais de 9-ING-41, tideglusib ou LY2090314; idelalisib; e um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0111] Métodos representativos de administração das composições farmacêuticas e terapias de combinação também são fornecidos. Várias concretizações da presente invenção referem-se ainda a métodos de administração de uma composição farmacêutica ou terapia de combinação a um paciente humano para o tratamento de linfoma. Os métodos podem compreender a administração de uma composição farmacêutica ou terapia de combinação por vias de administração geralmente aceitas (por exemplo, oral, intravenosa, subcutânea, parenteral, inalação, tópica, etc.). Em alguns casos, uma composição farmacêutica ou terapia de combinação pode ser administrada por via oral, intravenosa e/ou subcutânea. A administração pode ser feita usando qualquer regime de dosagem adequado. O regime de dosagem adequado é conhecido por pessoas com conhecimentos normais na técnica.

[0112] Em certas concretizações da presente invenção, uma composição farmacêutica ou terapia de combinação pode ser administrada a um paciente humano uma vez ao dia. Em outras concretizações, uma composição farmacêutica ou terapia de combinação pode ser administrada a um paciente humano duas vezes ao dia. Em algumas concretizações, uma composição farmacêutica ou terapia de combinação pode ser administrada a pacientes humanos entre as refeições.

[0113] Em outros aspectos da presente descrição, o inibidor de GSK-3β pode ser administrado em combinação com outro tratamento anticâncer não quimioterápico. Em algumas concretizações, o inibidor GSK-3β é administrado em combinação com terapia de radiação. Assim, em algumas concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de 9- ING-41 em combinação com terapia de radiação. Em algumas concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de tideglusib em combinação com terapia de radiação. Em ainda outras concretizações, o método de tratamento de distúrbios linfoproliferativos malignos compreende a administração de LY2090314 em combinação com terapia de radiação. Exemplos

[0114] Os exemplos a seguir ilustram ainda certos aspectos da descrição e não se destinam a limitar o escopo da presente descrição de qualquer forma. Materiais – Exemplos 1-5

[0115] As linhas de células Daudi (Burkitt) e SUDHL-4 (centro germinativo (GC), linfoma difuso de grandes células B (DLBCL)) foram adquiridas do tipo americano; cultura; coleção. (ATCC). As células KPUM-UH1 (duplo hit DLBCL) foram obtidas de Junya Kuroda, Universidade de Medicina da Prefeitura de Kyoto, Kyoto, Japão. Todas as linhagens celulares foram cultivadas assepticamente e mantidas em uma incubadora com camisa de água (Thermo-Forma) a 37ºC com 5% de CO2 e alimentadas com RPMI-1640 (Corning) contendo 0,3 g/mL de glutamina, 10% de FBS (Sigma) e antibiótico e reagente antimicótico (Gemini Bioproducts; concentrações finais - 100 unidades/mL de penicilina G, 100 μg/mL de sulfato de estreptomicina e 250 ng/mL de anfotericina B). As células Karpas 422 (GC-DLBCL) foram adquiridas da Sigma. Células TMD8

(Células B ativadas (ABC) DLBCL) foram obtidas do laboratório do Dr. Louis Stoudt do NCI e foram mantidas como acima, mas com 20% de FBS. Todos os números de células para os ensaios foram quantificados usando um contador de células automatizado TC20 (BioRad). Todas as linhas de células de linfoma testadas expressam GSK-3β ativo.

[0116] Venetoclax e Idelalisib foram adquiridos de Selleck Chemicals. BAY-1143572 foi adquirido na Active Biochem. Todas as drogas foram suspensas novamente em DMSO. DMSO sem drogas foi usado como um controle sem tratamento. Exemplo 1 - Ensaios de viabilidade e proliferação (ensaio MTS)

[0117] A viabilidade celular no dia 3 e a proliferação ao longo de 7 dias foram medidas após o tratamento de células com concentrações variáveis de 9-ING-41 usando o reagente de ensaio de proliferação celular Promega CellTiter 96® AQueous One Solution (MTS) de acordo com o instruções do fabricante. No final do tratamento, 20 μL de reagente foram adicionados por poço em uma placa de 96 poços e incubados por 2-4 h a 37 ° C. A absorvância a 490 nm (A490) foi determinada usando um leitor de placas Powerwave XS (Biotek).

[0118] Todas as linhas de células de linfoma usadas neste estudo expressam GSK-3β ativo. Células de linfoma SUDHL-4, KPUM-UH1, Karpas 422 ou TMD8 foram plaqueadas e o número de células nos dias 1, 3, 5 e 7 foi medido usando o ensaio MTS. Veja a Fig. 1. A viabilidade celular no dia 3 (Figura 1A) foi reduzida em 40-70% (p <0,05) após o tratamento com 1 μM de 9- ING-41, com SUDHL-4 e KPUM-UH1 mostrando a maior redução na viabilidade celular . Após a exposição a 1μM de 9-ING-41, todas as linhas de células de linfoma sofreram parada de crescimento (Figura 1B-1E) com proliferação de menos de 30% no dia 7, em relação ao controle (p <0,05). A viabilidade celular de células de linfoma com concentrações variáveis de 9-ING-41 (0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM e 10 μM) também foi testada e uma redução na viabilidade foi observada nas concentrações de 9-ING-41 que eram 0,5 uM ou mais. Exemplo 2 - ensaio EnzChek® caspase 3

[0119] Um ensaio EnzChek caspase 3 (Thermo Fisher Scientific) foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. 100.000 células foram semeadas em uma placa de 12 poços e tratadas com várias concentrações de 9-ING-41 por 24 horas em duplicado. No final do tratamento, as células foram centrifugadas a 200 rcf por 5 minutos e lavadas uma vez com 1X PBS e lisadas em 50 μL de tampão de lise 1X fornecido pelo kit. Para uma lise eficiente, as células foram submetidas a um único ciclo de congelamento-descongelamento. As células lisadas foram centrifugadas novamente para remover resíduos celulares e o sobrenadante foi usado no ensaio. 50 μL de solução de trabalho de substrato 2X contendo substrato Z- DEVD-R110 foram adicionados ao lisado celular, com uma incubação subsequente em temperatura ambiente por 45 minutos. O substrato derivado de rodamina 110 (Z-DEVD-R110) usado neste ensaio é um composto de bisamida não fluorescente que, após clivagem enzimática via caspase 3 ativa e talvez caspase 7 nos lisados celulares, é convertido em um processo de duas etapas para a monoamida fluorescente e então para o produto R110 ainda mais fluorescente. Ambos os produtos foram então medidos usando um leitor de placas fluorescentes Biotek synergy 2 nos comprimentos de onda correspondentes (excitação 496 nm/emissão 520 nm). A leitura fluorescente foi normalizada para a quantidade de proteína no lisado celular conforme determinado por meio de ensaio BCA padrão (Pierce Thermo Fisher Scientific). A fluorescência relativa foi calculada após definir o controle sem tratamento para 1.

[0120] O ensaio ENZCHEK Caspase 3 revelou um aumento na atividade da Caspase 3/7 observada quando as células de linfoma foram tratadas com 0,5 μM ou concentrações mais altas de 9-ING-41. Estudos farmacocinéticos em camundongos Xenoenxertados sugerem que a administração intravenosa de 20 mg/kg pode provêr cerca de 8 μM de concentração de 9-ING-41 no plasma e cerca de 40 μM de 9-ING-41 no cérebro em 30 minutos. Ugolkov A, Qiang W, Bondarenko G, Procissi D, Gaisina I, James CD, Chandler J, Kozikowski A, Gunosewoyo H, O'Halloran T, Raizer J, Mazar AP. Tratamento de combinação com o inibidor GSK-3 9-ING-41 e o CCNU cura o glioblastoma ortotópico quimiorresistente em modelos de xenoenxerto derivados do paciente. Transl Oncol. 2017; 10: 669-78. https: //doi.org/10.1016/j.tranon.2017.06.003.

[0121] Os dados do ensaio MTS e ENZCHEK Caspase 3 mostram que 9-ING-41 inibe a proliferação de linhas celulares de linfoma como um único agente e reduz a viabilidade das células de linfoma. Sem a intenção de se limitar à teoria, esses resultados sugerem que o direcionamento de GSK-3β leva à diminuição da proliferação e viabilidade de linhas de células de linfoma de células B agressivas, induzindo efeitos variáveis em sinais de pró-sobrevivência e resposta a danos no DNA, levando, em última análise, a apoptose. Esses efeitos foram independentes da célula de origem nas linhas celulares DLBCL.

[0122] A atividade de 9-ING-41 na linha celular DHL KPUM-

UH1, uma linha celular tipicamente resistente à quimioterapia, é de particular interesse. Sem a intenção de se limitar à teoria, a análise Luminex (descrita abaixo) sugere que o 9-ING-41 exerce efeitos na linha celular KPUM- UH1 por meio da regulação negativa da sinalização de c-MYC e da indução de apoptose por meio da redução de survivina. Esta regulação negativa da sobrevivência não parece estar associada a, ou impulsionada por mudanças em NF-κB nesta linha celular. Isto está em contraste com o que foi descrito na leucemia linfoblástica aguda (ALL), onde a supressão de GSK-3β sensibiliza as células ALL a apoptose mediada por NF- κB via efeito de survivina. Ver Hu Y, Gu X, Li R, Luo Q, Xu Y. A inibição do glicogênio-sintase quinase-3beta induz apoptose mediada pelo fator nuclear kappaB em células de leucemia linfocítica aguda pediátrica. J Exp Clin Cancer Res. 2010; 29: 154. https://doi.org/10.1186/1756-9966-29-154. Exemplo 3 - análise de Western blot

[0123] Os níveis de c-MYC foram analisados em células KPUM- UH1 via western blot para 9-ING-41 sozinho e a combinação de 9-ING-41 com Venetoclax ou BAY-1143572. Cerca de 10 milhões de células foram centrifugadas a 200 rcf por 5 minutos e lavado uma vez com PBS antes da lise em 50 μl de tampão de lise Millipore Milliplex MAP suplementado com inibidores de protease e fosfatase (Roche). A proteína desnaturada em tampão de amostra 4X suplementado com β-mercaptoetanol (Bio- Rad) foi carregada por poço. Foram utilizados géis pré- moldados de 4-20% do critério Bio-Rad sem manchas. Depois de executar o gel a 140 volts por 90 minutos, um preparo de imagem em gel Bio-Rad foi usado para ativar a tecnologia sem manchas para visualizar os níveis de proteína total carregados no gel.

Um pacote de nitrocelulose turbo- transferência e sistema (Bio-Rad) foi então usado para transferir as proteínas para a membrana, e 5% p/v de leite em pó em solução salina tamponada com Tris-Tween 20 0,1% (TBS-T) foi usado para bloquear as membranas por 1 hora.

As membranas foram então incubadas com o anticorpo primário diluído em 5% de BSA em TBS-T durante a noite.

As membranas foram então enxaguadas em TBS-T 3 vezes (uma lavagem de 15 minutos e duas lavagens de 5 minutos) e depois incubadas com o anticorpo secundário correspondente conjugado com HRP por 1 hora e enxaguado com TBS-T como antes.

Após a lavagem final, as membranas foram desenvolvidas usando um kit de quimioluminescência Pierce SuperSignal West Pico e visualizadas usando o sistema de imagem Bio-Rad.

Os anticorpos usados incluem: coelho anti-GSK-3β(Cell Signaling, Cat.

No: 12456), Rabbit anti-phospho-GSK-3β (Y216) (Abcam, Cat.

No: ab75745), Rabbit anti-c-MYC(Cell Signaling, Cat.

No: 5605), Coelho anti-fosfo-c-MYC(Ser 62)(Cell Signaling, Cat.

No: 13748), Rabbit anti-phospho-c-MYC (Thr58) (Abcam, Cat.

No: ab185655), e anti-β-Actina de camundongo (Sigma, Cat.

No: A5441) em uma diluição de 1: 1000. Os anticorpos secundários HRP anti-coelho e anti-rato HRP foram adquiridos da Cell Signaling e utilizados a uma diluição de 1: 5000. Quando necessário, as membranas foram removidas usando tampão de remoção RESTORE PLUS Western blot (Pierce) por 10 minutos e lavadas com TBS-T várias vezes e bloqueadas novamente e sondadas novamente como antes.

A quantificação das intensidades das bandas foi realizada por meio do software Image J(NIH). Estas experiências na linha de células de linfoma de duplo hit, KPUM-UH1, sugerem que o fosfo-c-MYC é modificado com o tratamento com 9-ING-41. Exemplo 4 - Análise Luminex

[0124] Mudanças de sinalização em NF-κB [MILLIPLEXMAP NF-κB Signaling Magnetic Bead Kit 6-plex Kit, EMD Millipore, analitos: c-MYC, FADD(Ser194), IκBα(Ser32), IKKα/β(Ser177/Ser181), NF-κB(Ser536), TNFR1], dano ao DNA [MILLIPLEX MAP DNA Damage/Genotoxicity Magnetic Bead Panel, EMD Millipore, analitos: ATR (total), Chk1 (Ser345), Chk2 (Thr68), H2A.X (Ser139), MDM2 (total), p21 (Total), p53 (Ser15)] e vias apoptóticas [painel de apoptose Bio-plex pro RBM 2 e 3, Bio-Rad, analitos: Bad, Bax/Bcl-2 dímero, Bcl-xL , Bim, Mcl-1, caspase 3 ativa, dímero Bcl-xL/Bak, dímero Mcl- 1/Bak, survivina] associado a 1 μM de tratamento com 9-ING-41 por 48 horas em comparação com controles sem tratamento foram determinados usando Tecnologia Luminex multiplex com instrumento FLEXMAP 3D, conforme instruções do fabricante. As células foram lisadas em tampão de lise MILLIPLEX MAP suplementado com coquetel inibidor de protease (Sigma) e coquetéis inibidores de fosfatase 2 e 3 (Sigma) e, após a determinação da proteína BCA, 15 μg de proteína foram adicionados a cada poço. Todas as amostras foram executadas em duplicado e as alterações na MFI ou quantidade absoluta entre as células tratadas com 9-ING-41 e o controle não tratado foram analisadas, e um teste t não pareado foi realizado para determinar a significância estatística.

[0125] A análise de sinalização de NF-κB mostrou uma redução significativa nos níveis totais de c-MYC nas linhas de células Karpas 422 e TMD8, mas apenas tendências para a redução desta proteína nas linhas de células restantes. A sinalização de danos ao DNA, via avaliação de p-H2A.X

(Ser139), foi encontrada aumentada para as linhas de células SUDHL-4 e Karpas 422 (ambas p <0,05). Além disso, um aumento significativo em fosfo-p53 (Ser15) após o tratamento com 9- ING-41 foi observado em células SUDHL-4 e TMD8. A análise da via de sinalização de apoptose revelou uma redução significativa (~ 2 vezes, p <0,05) na survivina e um aumento na caspase 3 ativa em todas as linhas de células de linfoma, exceto TMD8. Com exceção de KPUM-UH1, todas as linhas de células de linfoma mostraram reduções significativas (~2 vezes, p <0,05) em dímeros Mcl-1/Bak, enquanto a expressão de dímero Bcl-xl/Bak foi significativamente (~ 1,5 vezes, p <0,05) reduzido em todas as linhas celulares, exceto TMD8. Exemplo 5 - Resposta à dose de combinações

[0126] As células Daudi, SUDHL-4, KPUM-UH1, Karpas 422 ou TMD8 foram tratadas simultaneamente com uma série de concentrações de 9-ING-41 (0 μM, 0,05 μM, 0,5 μM) e Venetoclax (0 nM, 0,5 nM, 5 nM, 50 nM, 500 nM, 5000 nM), BAY- 1143572 (0 μM, 0,005 μM, 0,05 μM, 0,5 μM, 5 μM, 50 μM) ou Idelalisib (0 μM, 0,005 μM, 0,05 μM , 0,5 μM, 5 μM, 50 μM). Ver Figura 2. A viabilidade no dia 3 usando um ensaio MTS foi determinada como descrito acima. A absorvância de fundo foi subtraída do A490 das amostras e o A490 do veículo/controle sem tratamento foi definido como 1, e os A490s relativos do resto das amostras foram calculados. O IC50 foi calculado como a concentração da droga na qual A490 atingiu 0,5. Os efeitos aditivos foram calculados como uma alteração dobrada no IC50 de um novo agente quando combinado com 0,5 μM de 9- ING-41.

[0127] Como mostrado na Figura 3, a terapia de combinação usando 9-ING-41 e um segundo agente terapêutico pode reduzir a quantidade do segundo agente terapêutico necessária para produzir um determinado efeito terapêutico. Como mostrado, o tratamento de combinação da linha celular SUDHL-4 com 0,5 μM de 9-ING-41 mostrou uma redução de 8 vezes no valor de IC50 de Venetoclax. Da mesma forma, o tratamento de combinação da linha celular KPUMUH1 com 0,5 μM de 9-ING-41 mostrou uma redução de 2 vezes no valor de IC50 de Venetoclax. O tratamento de combinação da linha celular SUDHL-4 usando 0,5 μM de 9-ING-41 mostrou uma redução de 8 vezes no valor de IC50 de BAY-1143572. O tratamento de combinação com 9-ING-41 não alterou significativamente os valores de IC50 do Idelalisib nas linhas celulares estudadas. Materiais e Métodos – Exemplos 6-11

[0128] Amostras de tecido de linfoma foram obtidas de pacientes após consentimento informado por escrito. Este protocolo de bio-espécimes de Linfoma SPORE foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Mayo Clinic de acordo com a Declaração de Helsinque. Todas as amostras primárias de pacientes eram tecidos de biópsia de baço ou nódulos linfáticos. Amostras de tecido frescas foram dissociadas suavemente em suspensão de células e submetidas a centrifugação em gradiente de densidade Ficoll-Paque. As células primárias de linfoma foram então usadas diretamente para o ensaio de proliferação ou armazenadas a -80°C para análise Western posteriormente após a confirmação do diagnóstico de linfoma.

[0129] Todas as linhas de células de linfoma utilizadas neste estudo foram adquiridas da ATCC (Manassas, VA) ou DSMZ (Braunschweig, Alemanha). Linhas de DLBCL (linfoma difuso de grandes células B) foram cultivadas em meio IMDM suplementado com soro humano a 10% (Sigma-Aldrich); As linhas TCL (linfoma não Hodgkin de células T) e MCL (Linfoma de células do manto) foram mantidas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bezerro. A linha celular Jeko usada para modelagem de xenoenxerto em camundongos foi expressa de forma estável com luciferase Firefly (Fluc) através de transdução lentiviral. As linhas celulares são verificadas periodicamente quanto à ausência de infecção por micoplasma e autenticadas pelo método de PCR baseado em SNP caseiro ou por perfil de repetição em tandem curto por meio de ATCC. Anticorpos e outros reagentes

[0130] Os agentes comuns eram da Sigma-Aldrich. Anticorpos para imunotransferência, incluindo GSK3α anti-humano (Cat # 4337), GSK3β (Cat # 12456), fosfo-GSK3α-S21/GSK3β-S9 (Cat # 9327) foram adquiridos de Cell Signaling. Os anticorpos monoclonais anti-GSK3β de camundongo (clone 7/GSK3β, Cat # 610201, BD Biosciences), anti-α-tubulina (clone MD1A, Cat # T9026) e anticorpos de coelho anti-pericentrina (Cat # ab4448) usados para imunofluorescência eram da Sigma e Abcam, respectivamente. Os anticorpos secundários conjugados Alexa 488 ou Alexa 565 foram produtos da Life Technologies. Ensaio de apoptose

[0131] As células foram semeadas em 5x105 células/poço em placas de 24 poços e incubadas com 9-ING-41 nas concentrações indicadas por 48 horas. As células foram então coradas com anexina V conjugada com FITC (Life Technologies) e iodeto de propídio, seguido por análise em um citômetro de fluxo BD FACS Calibur. Ciclo da célula de DNA

[0132] As células foram fixadas e permeabilizadas com etanol frio, tratadas com RNase e coradas com iodeto de propídio (Sigma). As células coradas foram executadas em um BD FACS Calibur usando o software CELLQuest PRO (Becton Dickinson). Os dados foram analisados com o software FlowJo v.X (Tree Star Inc). Ensaio de Proliferação

[0133] As células foram semeadas a 1x104 células/poço em placas de 96 poços e incubadas com 9-ING-41 nas concentrações indicadas por 48 horas seguido de pulsação com timidina marcada com trítio durante a noite antes de ser analisada quanto à absorção de timidina. Western Immunoblott

[0134] A análise Western foi realizada conforme descrito anteriormente e desenvolvida em um gerador de imagens LI-COR Odyssey CLX usando o sistema de reagente LI-COR. PCR quantitativo

[0135] Os mRNAs totais de linhas celulares de linfoma foram isolados usando um kit RNAeasy (Qiagen) e os cDNAs sintetizados com um kit de síntese de cDNA Superscript III (tecnologia Life). A qPCR foi então realizada em um ABI 7500 Real-Time PCR Systems (Applied Biosystems) usando RT² SYBR Green ROX qPCR Mastermix (Qiagen). Cálculo do IC50 do medicamento

[0136] Os IC50s de 9-ING-41 na sobrevivência e proliferação celular foram calculados usando uma ferramenta de cálculo IC50 on-line (https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator/). Coloração imunohistoquímica

[0137] A imunohistoquímica (IHC) em seções de parafina de 5 μm de espessura foi realizada de acordo com o protocolo padrão. Resumidamente, as seções de tecido nas lâminas foram desparafinizadas com xileno, reidratadas com álcool em série, seguido pela recuperação do antígeno em tampão citrato (pH 6,0). As lâminas resultantes eram de peroxidase endógena extinta com peróxido de hidrogênio a 30%. As lâminas foram então incubadas com anticorpo anti-GSK3b (BD, 1: 150) à temperatura ambiente por 2 horas, lavadas três vezes com solução salina tamponada com Tris (5 min cada) e incubadas com anticorpo secundário anti-camundongo biotinilado (1: 200) por 1h em temperatura ambiente. Depois de tratar as lâminas com complexo ABC conjugado a HRP (Vectastain, Vector Laboratories) por 1h em temperatura ambiente, a cor foi desenvolvida com 3,39-diamino Benzidina (DAB, Vector Laboratories) contrastada com azul de metileno, montada com DPX e examinada e fotografada em um microscópio Nikon Eclipse Ti. controles negativos foram realizados em amostras de pacientes sem adição de anticorpo primário. Coloração de imunofluorescência para centrossoma e localização do fuso de GSK3β

[0138] Para a coimunomarcação de GSK3β e pericentrina em centrossomas (Figura 8C-8J), usamos um método de fixação incompleto fixando as células em lâminas de citospina com 3% de paraformaldeído em PBS por 5 min em temperatura ambiente. As células foram então permeabilizadas com 0,2% de Triton X- 100 em PBS por 10 min seguido por bloqueio com 5% de BSA em PBS por 1 hora e imunocoradas com mAb anti-GSK3β de camundongo e anti-pericentrina de coelho durante a noite a 40C. As células foram então lavadas e posteriormente coradas com anticorpos secundários conjugados com fluorocromo.

[0139] Todas as outras imunomarcações de GSK3β e α-tubulina em preparações de citospina de células de linfoma foram fixadas com paraformaldeído a 4% em PBS por 15 min à temperatura ambiente seguido por permeabilização e as mesmas etapas de coloração acima. As células foram analisadas e fotografadas em um microscópio Zeiss convencional ou um microscópio confocal Zeiss LSR 780. Exemplo 6 - GSK3α e GSK3β são super-expressos em células de linfoma

[0140] O status de expressão de GSK3α e GSK3β em células B e T humanas normais purificadas e linhas de células de linfoma DLBCL, MCL e TCL foi examinado. Por RT-qPCR, verificou-se que a maioria das linhas de linfoma mostrou níveis mais elevados, mas variáveis de mRNAs de GSK3α e GSK3β em comparação com a expressão mais baixa em linfócitos normais (Figura 4A), indicando que a transcrição de GSK3 é aumentada na maioria das linhas de células de linfoma. A expressão da proteína GSK3 foi analisada por Western blot, mostrando que a maioria das linhas de linfoma (exceto Ly-19) mostraram forte expressão da proteína GSK3α em comparação com a expressão fraca em linfócitos B e T (Figura 4B, em verde). Da mesma forma, a proteína GSK3β também foi fortemente expressa em todas as linhas de células de linfoma, mas muito fracamente expressa (visível após longa exposição; não mostrado) em linfócitos normais (Figura 4B, em vermelho). Estes dados indicam que as proteínas GSK3 são super-expressas na maioria das linhas de células de linfoma B e T.

[0141] Por Western blot, ambas as proteínas GSK3α e GSK3β mostraram ser variavelmente fosforiladas em nosso painel de linha de linfoma semelhante aos linfócitos normais. Exemplo 7. GSK3α e GSK3β são funcionalmente importantes em células de linfoma

[0142] Dado que tanto GSK3α quanto GSK3β são super- expressos em células de linfoma, e que ambas as enzimas estão implicadas em múltiplas vias de sinalização críticas para funções celulares, foi examinado se GSK3α e GSK3β estão apoiando funcionalmente a sobrevivência e proliferação de células de linfoma. O tratamento de linhas TCL e MCL com baixas doses de 9-ING-41 por 48 horas induziu apoptose (Figura 5A); as linhas DLBCL exigiram concentrações mais altas (Figura 5B). Em contraste, nenhuma apoptose significativa em linfócitos T não estimulados normais purificados ou células mononucleares de sangue periférico foi detectada, mesmo em uma concentração de 10,0 μM de 9-ING-41. As concentrações inibitórias de 9-ING-41 na metade do efeito máximo (IC50) na sobrevivência celular de várias linhas de células de linfoma foram calculadas (Tabela 1). Tabela 1. Concentrações inibitórias de 9-ING-41 a 50% do máximo (IC50) na sobrevivência celular e proliferação celular em várias linhas de células de linfoma Linha de IC50 (μM) sobre a IC50 (μM) sobre a linfoma sobrevivência proliferação celular celular DLBCL OCI-LY1 3,05 0,69 OCI-LY19 2,21 1,96 OCI-Ly3 3,76 1,03 SU-DHL6 1.58 1,58 0,84

0.84 MCL Granta-519 0,77 0,38 Jeko 1,28 0,94 Mino 0,55 0,72 TCL Karpas-299 3,34 0,26 MyLa 0,69 0,19 SeAx 1,60 0,38

[0143] 9-ING-41 pode induzir especificamente a apoptose de células de linfoma sem afetar os linfócitos normais. O ensaio de incorporação de timidina na presença ou ausência de 9-ING- 41 foi realizado para testar o papel de GSK3 na proliferação de células de linfoma. A taxa de proliferação de todas as linhas TCL e MCL foi profundamente inibida na presença de concentrações de 9-ING-41 tão baixas quanto 1,0 μM. As linhas DLBCL exigiram concentrações ligeiramente mais altas. O IC50 de 9-ING-41 na proliferação de células para várias linhas de células de linfoma foi calculado (Tabela 1). Esses dados indicam que a atividade de GSK3 é importante para a proliferação e sobrevivência de células de linfoma.

[0144] A técnica de nocaute CRISPR/CAS9 foi usada para excluir geneticamente os genes GSK3A e GSK3B.

[0145] Os RNAs guia (gRNAs) para direcionar os primeiros exons de codificação dos genes GSK3α e GSK3β foram projetados usando uma ferramenta da web (http://crispr.mit.edu/). As sequências de gRNA (GSK3α: GACAGATGCCTTTCCGCCGC; GSK3β: CGGCTTGCAGCTCTCCGCAA), foram clonadas no vetor px458 (Addgene) carregando um GFP que coexpressa. As construções foram nucleofectadas em células de linfoma usando um kit de nucleofecção (Lonza, Basel, Suíça). Trinta e seis horas após a nucleofecção, células únicas que expressam GFP foram classificadas em placas de 96 poços em 1 célula/poço em um classificador Aria II FACS. Após a expansão de subclones de células únicas em cultura por duas semanas, cada subclone foi genotipado por PCR e sequenciamento de DNA de Sanger.

[0146] Após a expressão transitória do construto que transporta CAS9-T2A-GFP e sequências do exón 1 dos genes GSK3A ou GSK3B específicos de gRNA, GFP expressando células únicas foi classificado em placa de 96 poços por classificação de fluxo. Após 2-3 semanas em cultura, os subclones de células únicas transportando modificação única em GSK3A, GSK3B ou ambos os genes foram genotipados para a deleção do gene e Western blot verificado para a depleção da proteína.

Como resumido na Tabela 2, vários subclones nulos GSK3A nulos foram prontamente obtidos a partir de todas as 5 linhas celulares testadas e subclones nulos GSK3B também foram obtidos a partir de linhas celulares Ly-1. No entanto, depois de analisar 24-36 subclones de células únicas das linhas celulares Ly-19, Jeko, Mino e Karpas 299, nenhum subclone nocaute foi detectado; ou seja, todos os clones sobreviventes eram do tipo selvagem ou portavam mutações heterozigóticas sugerindo que células GSK3B nulas dessas linhas celulares provavelmente morreram durante a cultura.

Dado que CRISPR/CAS9 é uma abordagem altamente eficiente para a deleção bialélica do gene GSK3B em células Ly-1 (19/24, 79%), mas nenhum clone GSK3B nulo em qualquer outra linha de linfoma testada (0/24, 0/24, 0/36, 0/26, 0%), estes dados suportam a conclusão de que GSK3B é necessário para a sobrevivência de células de linfoma nestas linhas celulares.

Usando shRNA knockdown, resultados semelhantes também foram observados, mostrando que GSK3B knockdown é letal em várias linhas de linfoma, exceto Ly-1. Tabela 2. Efeito de nocaute GSK3α e/ou GSK3β usando abordagem CRISPR/Cas9 na sobrevivência de várias linhas de células de linfoma Ex Clones nocaute nulos/varredura de clones totais Lymphoma line GSK3α GSK3β GSK3α/β em OCI-LY1 9/17 19/24 6/13 pl OCI-LY19 20/28 0/24 Não feito Jeko 7/12 0/24 Não feito o Mino 5/12 0/36 Não feito Karpas299 12/20 0/26 Não feito 7 - A inibição de GSK3 bloqueia a progressão G2/M em células de linfoma

[0147] O efeito de 9-ING-41 na cinética do ciclo celular do linfoma foi examinado. Após o tratamento com 9-ING-41, o bloqueio do ciclo celular em G2/M após apenas 24 horas de tratamento em todas as linhas testadas (Figura 6A), indicando que a atividade GSK3 é necessária para a progressão bem- sucedida da mitose. Para determinar ainda se esta parada G2/M resultou especificamente da inibição de GSK3β, o perfil do ciclo celular dos subclones Ly-1 parental (tipo selvagem), GSK3A, GSK3B e GSK3A/B knockout foi examinado. Na ausência de tratamento, tanto as células parentais de tipo selvagem quanto às células Ly-1 nulas de GSK3A mostraram perfis normais de ciclo celular, enquanto os subclones nocaute GSK3B e GSK3A/B exibiram células aumentadas em G2/M (Figura 6B). Além disso, os subclones de duplo nocaute GSK3A/B também mostraram níveis aumentados de células poliplóides (> 4N), possivelmente devido à mitose defeituosa. Essas anormalidades do ciclo celular das células GSK3B-nulo e GSK3A/B-nulo Ly-1 são sutis e tem pouco impacto na sobrevivência da progênie Ly-1, provavelmente, por meio de mecanismos compensatórios específicos da linha celular Ly-1. As fenocópias do tratamento com 9-ING-41 o efeito da deleção única ou dupla de GSK3A/B de GSK3A/B na progressão do ciclo celular indicam que GSK3B é crítico para a progressão G2/M do ciclo celular do linfoma e que 9-ING-41 é um potente agente bloqueador do ciclo celular para células de linfoma. Exemplo 8 - A inibição de GSK3 para as células de linfoma no estágio de prófase da mitose

[0148] Embora as células presas em G2/M apareçam como um único pico de conteúdo de DNA (4N) em um histograma de citometria de fluxo (Figura 6A), na verdade existem pelo menos 5 etapas sequenciais (M1-M5) em G2/M críticas para o sucesso divisão celular.

Estes incluem prófase (M1, condensação cromossômica, início da formação do fuso mitótico), prometáfase (M2, ruptura da membrana nuclear, polarização do centrossoma), metáfase (M3, pares de cromossomos alinham o plano médio), anáfase (M4, cromátides filhas separadas), telófase (M5, reforma de núcleos filhos), e a citocinese final (separação de duas células filhas). Cada uma dessas etapas discretas tem uma morfologia nuclear identificável única nas células coradas de Wright (representadas na Figura 7A). A morfologia das células Jeko não tratadas e das células Jeko tratadas com 9-ING-41 para determinar em que estágio elas foram presas foi examinada.

Como mostrado na Figura 7B (painel esquerdo), todas as etapas mitóticas M1-M5 foram prontamente identificadas em células Jeko mitóticas não tratadas; no entanto, em células tratadas com 9-ING-41 (painel direito) uma grande fração de células mostrou a morfologia de cromossomos condensados e coloração citoplasmática reduzida lembrando células prófase (M1) sem células identificáveis com morfologia M2-M5. Por contagem diferencial de 100 células mitóticas, todos os estágios (M1- M5) das células mitóticas foram encontrados prontamente identificáveis em células não tratadas; apenas células de prófase (M1) foram contabilizadas em células mitóticas de tratamento com 9-ING-41 (Figura 7C). Resultados semelhantes foram observados em outras linhas de linfoma, incluindo DHL- 6, Ly-3, Mino e Karpas 299. Essas observações apoiam a conclusão de que a atividade GSK3 é necessária para a progressão da prófase mitótica.

Exemplo 9 - GSK3β está localizado em centrossomas e fusos mitóticos de células de linfoma

[0149] O envolvimento de GSK3β em dois eventos de prófase chave, polarização do centrossoma e formação do fuso mitótico foi examinado. A localização subcelular da proteína GSK3β em células de interfase Jeko ou Ly-1 foi examinada por coloração de imunofluorescência. Durante a interfase, GSK3β está localizado de forma proeminente no núcleo e pontos de pares semelhantes à centrossoma no citoplasma das células Jeko (Figura 8A-B). Para demonstrar ainda que esses pontos de pares citoplasmáticos eram de fato centrossomas, células Ly-1 wt foram primeiro costuradas para a proteína GSK3β e o marcador de centrossoma pericentrina usando um protocolo de fixação incompleto e foi descoberto que os pontos GSK3β citoplasmáticos estavam perfeitamente colocados com pericentrina (Figura 8D -8F), indicando que estes pontos brilhantes GSK3β (em verde, Figura 8A-C e 8F) são de fato centrossomas. Foi ainda demonstrado que a coloração do anticorpo anti-GSK3β era específica para a proteína GSK3β, mostrando sua ausência em células Ly1 nulas para GSK3B (Figura 8G-J). Portanto, concluímos que GSK3β está localizado nos centrossomas e no núcleo nas células em interfase.

[0150] Para determinar a localização intracelular de GSK3β em células mitóticas, a localização de GSK3β em células mitóticas Jeko normais foi analisada. A coloração de GSK3β (em verde, Figura 8K-L) exibiu um padrão "semelhante a fogo de artifício" com centrossomas polarizados no meio e fusos mitóticos ou microtúbulos estendendo-se para fora. A coloração é específica para GSK3β, uma vez que tal coloração está ausente em células mitóticas deficientes em GSK3B (Figura 8O-P). α-tubulina dá um padrão de coloração (usando uma coloração separada para marcador de microtúbulo α- tubulina) semelhante ao de GSK3β (em vermelho, Figura 8M-N) sugerindo que GSK3β está localizado em microtúbulos durante a mitose. Estas observações indicam coletivamente que a proteína GSK3β está especificamente localizada nos centrossomas e fusos mitóticos durante a mitose. Foi determinada a localização de GSK3β em células Jeko tratadas com 9-ING-41 (Figura 8Q-R). Um padrão de coloração de GSK3β semelhante a fogo de artifício foi observado em todas as células de prófase sem qualquer localização de GSK3β alterada. Tomados em conjunto, estes dados indicam que GSK3β está localizado nos centrossomas e núcleo durante a interfase (Figura 8A-B) e nos centrossomas e microtúbulos mitóticos durante a mitose (Figura 8K-L). O tratamento de 9-ING-41 não alterou a localização de GSK3β, nem afetou a polarização do centrossoma ou a formação de microtúbulos; portanto, é provável que o 9-ING-41 iniba a função dos microtúbulos em uma etapa posterior, evitando a progressão da prófase. Exemplo 10 - Expressão de GSK3 e direcionamento em células primárias de pacientes com linfoma

[0151] A expressão das proteínas GSK3α e GSK3β em células de linfoma primário recentemente isolada de pacientes com MCL, linfoma de células B de alto grau, linfoma folicular grau 3B, DLBCL ou TCL angioimunoblástico foram examinadas. Todas as 5 amostras tiveram expressão mais forte das proteínas GSK3α e GSK3β em comparação com controles normais de células B do sangue (Figura 9A). Estas células de pacientes responderam de forma semelhante aos efeitos antiproliferativos de 9-ING-41 (Figura 9B). Amostras de parafina de pacientes de uma coorte diferente com vários tipos de linfoma foram sondadas para a expressão da proteína GSK3β por IHQ. Conforme mostrado na Figura 9C, a super- expressão de GSK3β em todas as amostras foi encontrada com intensidade variável. A análise de RNA-Seq em amostras primárias de pacientes DLBCL derivadas de um banco de dados público em Gene Expression Profile Interactive Analysis (http://gepia.cancerpku.Cn), também mostrou expressão aumentada de GSK3α e GSK3β em linfoma do que em linfócitos normais.

[0152] Dados de RNA-Seq recentemente publicados (Schmitz R, Wright GW, Huang DW, et al. Genetics and Pathogenesis of Diffuse Large Cell B-Cell Lymphoma. N Engl J Med. 2018; 378 (15): 1396-1407) em uma coorte de 234 pacientes DLBCL com dados de sobrevida clínica [acompanhamento médio foi de 10,5 anos (IC 95%: 7,9-não atingido)] foi analisada. Uma análise de curva de características operacionais do receptor (ROC) foi realizada para dicotomizar a expressão de GSK3α e GSK3β para estabelecer os pontos de corte ideais (10,5 para GSK3α e 8,6 para GSK3β) para agrupamento de alta e baixa expressão. O grupo de alta expressão GSK3α (≥10,5, n = 172) teve um OS de 7,8 anos (95% OS: 7,2-8,4), enquanto o grupo de baixa expressão GSK3α (<10,5, n = 62) teve um significativamente (p = 0,03) SO superior de 8,9 anos (SO 95%: 8,2-10,1). Da mesma forma, o grupo de alta expressão GSK3β (≥8,6, n = 170) teve um OS de 7,8 anos (95% OS: 7,2-8,2), enquanto o grupo de baixa expressão GSK3β (<8,6, n = 62) teve um significativo (p = 0,0005) SO superior de 9,7 anos (SO 95%: 8,6-11,5). Estes resultados sugerem que a super-expressão de GSK3α ou GSK3β, cada uma se correlaciona com um pior resultado clínico. Além disso, os dados de agrupamento também mostram que a maioria dos pacientes DLBCL é segregada no grupo de alta expressão para GSK3α ou GSK3β, validando ainda mais a conclusão de que GSK3α e GSK3β são geralmente super-expressos no linfoma. Exemplo 11 - Visando GSK3 em xenoenxertos de linfoma humano de camundongo

[0153] Um modelo de camundongo de xenoenxerto MCL foi estabelecido pela injeção subcutânea de camundongos NGS com células Jeko que expressam o gene repórter de luciferase de pirilampo Fluc.

[0154] Os camundongos NSG (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) usados nessas experiências foram adquiridos no Laboratório Jackson (Bar Harbor, Maine). Oito a dez ratos do mesmo sexo com 8 semanas de idade foram injetados por via subcutânea com 5x106 células Jeko que expressam Fluc nos flancos direitos. O enxerto do tumor foi verificado por imagem 4 dias após a inoculação das células Jeko. Os camundongos enxertados com tumor foram agrupados aleatoriamente em grupos de controle e tratamento, depois não tratados ou tratados com 9-ING-41 por injeção IP, conforme indicado. Os volumes do tumor foram medidos por um IVIS Imager (Xenogen, Alameda, CA) 20 minutos após a injeção IP de 200ul de 15mg/ml D-leuciferina (GoldBio, St. Louis, MO) e anestesiado com 2,5% de isoflurano. Todas as variáveis de imagem foram mantidas consistentes para comparação. A experiência terminou quando o maior tumor atingiu o limite de tamanho do protocolo IACUC.

[0155] Em dois experimentos independentes, oito e dez camundongos com tumores enxertados verificados por imagem (tipicamente 4 dias após a inoculação do tumor) serviram aleatoriamente como controles ou receberam tratamento com 9- ING-41 40 mg/kg em dias alternados IP (Figura 10A). Como mostrado na Figura 10B, os camundongos do grupo de controle (não tratado) tinham grandes tumores com atividades marcadas de luciferase no dia 17; no entanto, os camundongos tratados com 9-ING-41 tinham tumores menores com atividade de luciferase muito menor. Estes dados demonstraram que 9-ING-41 tem atividade antitumoral de agente único em um modelo de camundongo de MCL. Exemplo 12 - Tratamento de linfoma difuso de grandes células B (DLBCL) usando 9-ING-41

[0156] A um ser humano que sofre de linfoma difuso de grandes células B é administrado 1 mg/kg por dia de 9-ING-41 durante seis ciclos de 21 dias. Após o tratamento, o DLBCL do ser humano está em remissão. Exemplo 13 - Tratamento de Linfoma de Células do Manto (MCL) usando 9-ING-41

[0157] A um ser humano que sofre de linfoma de células do manto é administrado 3 mg/kg por dia de 9-ING-41 durante seis ciclos de 21 dias. Após o tratamento, o MCL do ser humano está em remissão. Exemplo 14 - Tratamento de Linfoma de Células T (TCL) usando 9-ING-41

[0158] Um humano que sofre de linfoma de células T (não- Hodgkin) é administrado 2 mg/kg por dia de 9-ING-41 durante seis ciclos de 21 dias. Após o tratamento, o TCL do ser humano está em remissão.

[0159] Ver Karmali, et al., Inibidor GSK-3β, 9-ING-41, reduz a viabilidade celular e interrompe a proliferação de linhas de células de linfoma de células B como um único agente e em combinação com novos agentes, Oncotarget. 29 de dezembro de 2017; 8 (70): 114924–114934, que é incorporado por referência neste documento em sua totalidade.

[0160] Ver Wu, et al., Targeting glycogen sintase quinase 3 para o benefício terapêutico em linfoma, Blood. Publicado online em 17 de maio de 2019 (http://www.bloodjournal.org); doi:10.1182/blood.2018874560, que é incorporado por referência neste documento em sua totalidade.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de um inibidor de GSK-3β, caracterizado pelo fato de ser para a produção de um medicamento o qual é útil no tratamento de um distúrbio linfoproliferativo maligno em um paciente necessitando do mesmo.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o distúrbio linfoproliferativo maligno ser um distúrbio linfoproliferativo de células B maligno.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de o distúrbio linfoproliferativo de células B maligno ser linfoma difuso de grandes células B, leucemia linfocítica aguda, fase blástica linfóide, leucemia mielóide crônica, leucemia linfocítica crônica/linfoma linfocítico pequeno, linfomas de células B de zona marginal extranodal, Linfomas do tecido linfóide associado à mucosa, Linfoma folicular, Linfoma de células do manto, Linfoma de células B da zona marginal nodal, Linfoma de Burkitt, Leucemia de células pilosas, Linfoma do sistema nervoso central primário, Linfoma de células B da zona marginal esplênica, macroglobulinemia/Linfoplasma de Waldenstrom, linfoma de Waldenstrom Mieloma múltiplo, Discrasias de células plasmáticas, Neoplasias de células plasmáticas, Linfoma de células B mediastinal primário, Doença de Hodgkin ou Doença de Castelman.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de o distúrbio linfoproliferativo de células B malignas ser o linfoma difuso de grandes células B.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de o linfoma difuso de grandes células B ser o linfoma Double-Hit.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o distúrbio linfoproliferativo maligno ser um distúrbio linfoproliferativo de células T maligno.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de o distúrbio linfoproliferativo de células T maligno ser leucemia/linfoma de células T, linfoma extranodal natural killer/células T, linfoma cutâneo de células T, linfoma de células T do tipo enteropatia, linfoma angioimunoblástico de células T-, Linfoma anaplásico de células T grandes/nulas, Linfoma de células T semelhante a paniculite subcutânea, leucemia linfocítica aguda de células T, leucemia de linfócitos granulares grandes de células T, Fase linfóide blástica Leucemia mielóide crônica, síndromes linfoproliferativas pós-transplante, leucemia de células T tipo 1 humana de vírus positivo (HTLV-1+), leucemia/linfoma de células T adultas (ATL), leucemia prolinfocítica de células T (T-PLL) ou linfoma de células T não especificado.

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de o distúrbio linfoproliferativo maligno ser refratário à quimioterapia.

9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de um inibidor GSK-3β ser 9-ING- 41, tideglusib, LY2090314, CHIR-99021, CHIR-98014, SB216763, SB415286, AR-A011418, CG701338 ou CG202796.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de o inibidor de GSK-3β ser 9-ING-41, tideglusib ou LY2090314.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de o inibidor de GSK-3β ser 9-ING-41.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de o inibidor de GSK-3β ser tideglusib.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de o inibidor de GSK-3β ser LY2090314.

14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizado pelo fato de o inibidor de GSK-3β ser administrado em combinação com um segundo agente terapêutico.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de o segundo agente terapêutico ser administrado em uma quantidade subterapêutica.

16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 ou 15, caracterizado pelo fato de o segundo agente terapêutico ser um agente anticâncer.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de o agente anticâncer ser um modulador de apoptose, um modulador de CDK ou um modulador do mTOR/AKT/PI3K.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de o agente anticâncer ser um modulador de apoptose.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de o modulador de apoptose ser um inibidor de Bcl-2.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o inibidor de Bcl-2 é venetoclax, ABT-737 ou navitoclax.

21. Uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de o inibidor de Bcl-2 ser venetoclax.

22. Uso, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de o agente anticâncer ser um modulador de CDK.

23. Uso, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de o modulador de CDK ser um inibidor de CDK9.

24. Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de o inibidor de CDK9 ser BAY-1143572, LDC000067,

Dinaciclib (SCH727965), SNS-032 (BMS-387032), AT7519, P276- 00, AZD5438, PHA-767491 ou PHA-793887.

25. Uso, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de o inibidor de CDK9 ser BAY-1143572.

26. Uso, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de o agente anticâncer ser um modulador da via mTOR/AKT/PI3K.

27. Uso, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de o modulador da via mTOR/AKT/PI3K ser um inibidor de PI3K.

28. Uso, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de o inibidor de PI3K ser copanlisib ou idelalisib.

29. Uso, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de o inibidor de PI3K ser idelalisib.