CN117883438A - 治疗恶性淋巴增生性疾病的方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及治疗恶性淋巴增生性疾病的方法。提供了在患者中治疗恶性淋巴增生性疾病的方法，其包括施用有效量的GSK‑3β抑制剂，例如9‑ING‑41。还提供了用于治疗恶性淋巴增生性疾病的方法，其包括施用与另一种或多种治疗剂组合的GSK‑3β抑制剂，例如9‑ING‑41。

Description

治疗恶性淋巴增生性疾病的方法

本申请是申请日为2019年6月5日、申请号为“201980037210.9”、发明名称为“治疗恶性淋巴增生性疾病的方法”的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/US2019/035576的中国国家阶段申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年6月5日提交的美国临时申请号62/680,739的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开内容涉及使用GSK-3β抑制剂(包括3-(5-氟苯并呋喃-3-基)-4-(5-甲基-5H-[1,3]二氧并[4,5-f]吲哚-7-基)吡咯-2,5-二酮)治疗恶性淋巴增生性疾病的方法。

背景技术

恶性淋巴增生性疾病是一组以淋巴细胞异常增殖为特征的疾病。恶性淋巴增生性疾病的两种一般类型是恶性B细胞淋巴增生性疾病和恶性T细胞淋巴增生性疾病。

恶性B细胞淋巴增生性疾病包括弥漫性大B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、淋巴母细胞期慢性骨髓性白血病(lymphoid blastic phase Chronic MyeloidLeukemia)、慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、毛细胞白血病、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症/淋巴浆细胞性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞增生失调病(plasm cell dyscrasias)、浆细胞肿瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、霍奇金病(HodgkinDisease)或巨大淋巴结增生症(Castelman disease)。

恶性T细胞淋巴增生性疾病包括T细胞白血病/淋巴瘤、结外自然杀伤/T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T-细胞淋巴瘤、间变性大T细胞/零位细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤、T细胞急性淋巴细胞性白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞性白血病、淋巴母细胞期慢性骨髓性白血病、移植后淋巴增生综合征、人T细胞白血病病毒1型阳性(HTLV-1⁺)成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、T细胞幼淋巴细胞白血病(T-cell prolymphocytic leukemia，T-PLL)和未指定的T细胞淋巴瘤。

糖原合酶激酶3(GSK-3)是丝氨酸(S)/苏氨酸(T)激酶，其最初被描述为代谢(特别是糖原生物合成)的关键调节剂。Embi N,et al.Glycogen synthase kinase-3fromrabbit skeletal muscle.Separation from cyclic-AMPdependent protein kinase andphosphorylase kinase.Eur J Biochem.1980；107:519-27。从那以后，已经显示其通过调节大量不同的底物而在多种疾病过程(包括癌症和衰老、免疫疾病、代谢疾病和神经疾病)中发挥作用。Sutherland C.What Are the bona fide GSK3 Substrates？Int JAlzheimers Dis.2011；2011:505607；Gao C,et al..GSK3:a key target for thedevelopment of novel treatments for type 2diabetes mellitus and Alzheimerdisease.Rev Neurosci.2011；23:1-11；Wang H,et al.,Convergence of the mammaliantarget of rapamycin complex 1-and glycogen synthase kinase3-beta-signalingpathways regulates the innate inflammatory response.J Immunol.2011；186:5217-26；Klamer G,et al.Using small molecule GSK3beta inhibitors to treatinflammation.Curr Med Chem.2010；17:2873-81；Henriksen EJ.Dysregulation ofglycogen synthase kinase-3in skeletal muscle and the etiology of insulinresistance and type 2diabetes.Curr Diabetes Rev.2010；6:285-93。GSK-3具有两种普遍表达且高度保守的同工型，即GSK-3α和GSK-3β，其同时具有共有的和不同的底物和功能效应。已经表明，GSK-3β的异常过表达促进了多种实体瘤中的肿瘤生长和化学治疗抗性。然而，尽管知道其作为了B细胞中的代谢检查点调节剂，但是关于GSK-3β在B细胞淋巴瘤的发病机理、治疗抗性和生存方面的意义知之甚少。Jellusova J,et al.GSK3 is a metaboliccheckpoint regulator in B cells.Nat Immunol.2017；18:303-12。

GSK-3β抑制剂由于潜在地改变由GSK-3β介导的疾病的临床过程的能力而受到关注。一些GSK-3β抑制剂包括tideglusib、LY2090314、9-ING-41、CHIR-99021和CHIR-98014、SB216763和SB415286、AR-A011418、CG701338和CG202796。参见Amy Walz,Andrey Ugolkov,Sunandana Chandra,et al.,Molecular Pathways:Revisiting Glycogen SynthaseKinase-3b as a Target for the Treatment of Cancer,Clin Cancer Res；23(8)April15,2017,OF1-OF7。

3-(5-氟苯并呋喃-3-基)-4-(5-甲基-5H-[1,3]二氧并[4,5-f]吲哚-7-基)吡咯-2,5-二酮(“9-ING-41”)是GSK-3β抑制剂，其具有以下化学结构：

以下中给出了9-ING-41的合成、性质和/或生物学活性：美国专利号8,207,216；Gaisina et al.,From a Natural Product Lead to the Identification of Potentand Selective Benzofuran-3-yl-(indol-3-yl)maleimides as Glycogen SynthaseKinase 3βInhibitors That Suppress Proliferation and Survival of PancreaticCancer Cells,J.Med.Chem.2009,52,1853–1863；以及Hilliard,et al.,Glycogensynthase kinase 3βinhibitors induce apoptosis in ovarian cancer cells andinhibit in-vivo tumor growth,Anti-Cancer Drugs 2011,22:978–985。已报道9-ING-41可用于治疗某些癌症，包括脑癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、神经母细胞瘤、肾癌和胰腺癌，以及用于创伤性脑损伤。

尽管在1990年代后期对标准化学治疗加入抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗改善了响应和存活，但是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的临床过程仍然是可变化的。Coiffier B,et al.Long-term outcome of patients in the LNH-98.5trial,the first randomizedstudy comparing rituximab-CHOP to standard CHOP chemotherapy in DLBCLpatients:a study by the Groupe d'Etudes des Lymphomes de l'Adulte.Blood.2010；116:2040-5；Feugier P,et al.Long-term results of the R-CHOP study in thetreatment of elderly patients with diffuse large B-cell lymphoma:a study bythe Groupe d'Etude des Lymphomes de l'Adulte.J Clin Oncol.2005；23:4117-26。尽管60％的患者享有长期无病生存期，但一部分生物学不良的患者患有化学治疗难治性疾病，具有较为不利的结果。Sehn LH,et al.Introduction of combined CHOP plusrituximab therapy dramatically improved outcome of diffuse large B-celllymphoma in British Columbia.J Clin Oncol.2005；23:5027-33。特别地，DLBCL中c-MYC和BCL-2的双易位(称为“双打击淋巴瘤”(“double hit lymphoma，DHL”))与标准R-CHOP(利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松)之后的不良结果相关，很少有患者实现长期生存。Petrich AM,et al.Impact of induction regimen and stem celltransplantation on outcomes in double-hit lymphoma:a multicenterretrospective analysis.Blood.2014；124:2354-61。

因此，需要用于治疗恶性淋巴增生性疾病，包括淋巴瘤，并且特别是用于治疗疗法难治性淋巴瘤如DLBCL的新方法。

发明内容

在一些方面，本公开内容提供了在有此需要的患者中治疗恶性淋巴增生性疾病的方法，其包括向所述患者施用有效量的GSK-3β抑制剂。

在一些方面，本公开内容提供了在有此需要的患者中治疗恶性淋巴增生性疾病的方法，其包括向所述患者施用有效量的GSK-3β抑制剂，其中所述恶性淋巴增生性疾病是恶性B细胞淋巴增生性疾病。

在一些方面，本公开内容提供了在有此需要的患者中治疗恶性B细胞淋巴增生性疾病的方法，其包括向所述患者施用有效量的GSK-3β抑制剂，其中所述恶性B细胞淋巴增生性疾病是弥漫性大B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、淋巴母细胞期慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、毛细胞白血病、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症/淋巴浆细胞性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞增生失调病、浆细胞肿瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、霍奇金病或巨大淋巴结增生症。

在一些方面，本公开内容提供了在有此需要的患者中治疗恶性B细胞淋巴增生性疾病的方法，其包括向所述患者施用有效量的GSK-3β抑制剂，其中所述恶性B细胞淋巴增生性疾病是弥漫性大B细胞淋巴瘤。

在一些方面，本公开内容提供了在有此需要的患者中治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤的方法，其包括向所述患者施用有效量的GSK-3β抑制剂，其中所述弥漫性大B细胞淋巴瘤是双打击淋巴瘤。

在一些方面，本公开内容提供了在有此需要的患者中治疗恶性淋巴增生性疾病的方法，其包括向所述患者施用有效量的GSK-3β抑制剂，其中所述恶性淋巴增生性疾病是恶性T细胞淋巴增生性疾病。

在一些方面，本公开内容提供了在有此需要的患者中治疗恶性T细胞淋巴增生性疾病的方法，其包括向所述患者施用有效量的GSK-3β抑制剂，其中所述恶性T细胞淋巴增生性疾病是T细胞白血病/淋巴瘤、结外自然杀伤/T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T-细胞淋巴瘤、间变性大T细胞/零位细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤、T细胞急性淋巴细胞性白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞性白血病、淋巴母细胞期慢性骨髓性白血病、移植后淋巴增生综合征、人T细胞白血病病毒1型阳性(HTLV-1⁺)成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)或未指定的T细胞淋巴瘤。

在一些方面，本公开内容提供了根据以上任一方面的方法，其中所述恶性淋巴增生性疾病是化学治疗难治性的。

在一些方面，本公开内容提供了根据以上任一方面的方法，其中所述GSK-3β抑制剂是9-ING-41、tideglusib、LY2090314、CHIR-99021、CHIR-98014、SB216763、SB415286、AR-A011418、CG701338或CG202796。

在一些方面，本公开内容提供了根据以上任一方面的方法，其中所述GSK-3β抑制剂是9-ING-41、tideglusib或LY2090314。

在一些方面，本公开内容提供了根据以上任一方面的方法，其中所述GSK-3β抑制剂是9-ING-41。

在一些方面，本公开内容提供了根据以上任一方面的方法，其中所述GSK-3β抑制剂是tideglusib。

在一些方面，本公开内容提供了根据以上任一方面的方法，其中所述GSK-3β抑制剂是LY2090314。

在一些方面，本公开内容提供了根据以上任一方面的方法，其中所述GSK-3β抑制剂与第二治疗剂组合施用。

在一些方面，本公开内容提供了根据以上任一方面的方法，其中所述GSK-3β抑制剂与第二治疗剂组合施用，并且其中所述第二治疗剂以亚治疗量(sub-therapeuticamount)施用。

在一些方面，本公开内容提供了根据以上任一方面的方法，其中所述GSK-3β抑制剂与第二治疗剂组合施用，其中所述第二治疗剂是抗癌剂。

在一些方面，本公开内容提供了根据前述方面的方法，其中所述GSK-3β抑制剂与抗癌剂组合施用，其中所述抗癌剂是凋亡调节剂、CDK调节剂或mTOR/AKT/PI3K途径的调节剂。

在一些方面，本公开内容提供了根据前述方面的方法，其中所述GSK-3β抑制剂与抗癌剂组合施用，其中所述抗癌剂是凋亡调节剂。

在一些方面，本公开内容提供了根据前述方面的方法，其中所述GSK-3β抑制剂与凋亡调节剂组合施用，其中所述凋亡调节剂是Bcl-2抑制剂。

在一些方面，本公开内容提供了根据前述方面的方法，其中所述GSK-3β抑制剂与Bcl-2抑制剂组合施用，其中所述Bcl-2抑制剂是维奈托克(venetoclax)、ABT-737或navitoclax。

在一些方面，本公开内容提供了根据前述方面的方法，其中所述GSK-3β抑制剂与Bcl-2抑制剂组合施用，其中所述Bcl-2抑制剂是维奈托克。

在一些方面，本公开内容提供了根据以上任一方面的方法，其中所述GSK-3β抑制剂与抗癌剂组合施用，其中所述抗癌剂是CDK调节剂。

在一些方面，本公开内容提供了根据前述方面的方法，其中所述GSK-3β抑制剂与CDK调节剂组合施用，其中所述CDK调节剂是CDK9抑制剂。

在一些方面，本公开内容提供了根据前述方面的方法，其中所述GSK-3β抑制剂与CDK9抑制剂组合施用，其中所述CDK9抑制剂是BAY-1143572、LDC000067、Dinaciclib(SCH727965)、SNS-032(BMS-387032)、AT7519、P276-00、AZD5438、PHA-767491或PHA-793887。

在一些方面，本公开内容提供了根据前述方面的方法，其中所述GSK-3β抑制剂与CDK9抑制剂组合施用，其中所述CDK9抑制剂是BAY-1143572。

在一些方面，本公开内容提供了根据以上任一方面的方法，其中所述GSK-3β抑制剂与抗癌剂组合施用，其中所述抗癌剂是mTOR/AKT/PI3K途径的调节剂。

在一些方面，本公开内容提供了根据前述方面的方法，其中所述GSK-3β抑制剂与mTOR/AKT/PI3K途径的调节剂组合施用，其中所述mTOR/AKT/PI3K途径的调节剂是PI3K抑制剂。

在一些方面，本公开内容提供了根据前述方面的方法，其中所述GSK-3β抑制剂与PI3K抑制剂组合施用，其中所述PI3K抑制剂是库潘尼西(copanlisib)或艾代拉利司(idelalisib)。

在一些方面，本公开内容提供了根据前述方面的方法，其中所述GSK-3β抑制剂与PI3K抑制剂组合施用，其中所述PI3K抑制剂是艾代拉利司。

附图说明

图1A-1E显示了经9-ING-41处理的淋巴瘤细胞的生存力和增殖。将96孔板的每个孔的10,000个细胞(SUDHL-4(图1B)、KPUM-UH1(图1C)、Karpas 422(图1D)、TMD8(图1E))不进行处理或用1μM 9-ING-41一式三份进行处理，并使用MTS测定法计算第1、3、5和7天的细胞数。简单地说，将20μL MTS试剂添加至细胞并孵育2小时，并且使用Biotek读板仪读取490nm的吸光度(A490)。OD＝490nm处的吸光度随细胞密度成比例地增加。误差棒代表重复之间的标准偏差。第3天的生存力如图1A所示。

图2A-2O显示了利用与9-ING-41组合的化学治疗剂的淋巴瘤细胞的生存力。将10,000个细胞(图2A、F、K：Daudi；图2B、G、L：SUDHL-4；图2C、H、M：KPUM-UH1；图2D、I、N：Karpas422；图2E、J、O：TMD8)铺在96孔板的每个孔中，并用9-ING-41(0-0.5μM)与维奈托克(0-5,000nM)(图2A-E)或BAY-1143572(0-50μM)(图2F-J)或艾代拉利司(0-50μM)(图2K-O)的剂量反应系列一式三份进行处理。使用MTS测定法分析3天之后的生存力。简单地说，将20μL MTS试剂添加至细胞并孵育2小时，并且使用Biotek读板仪读取490nm处的吸光度。在将未处理对照的平均吸光度设置为1之后，计算相对吸光度。OD＝490nm处的吸光度随细胞密度成比例地增加。

图3显示了在有或没有0.5μM 9-ING-41的情况下维奈托克、BAY1143572和艾代拉利司的IC₅₀值。

图4显示GSK3α和GSK3βmRNA和蛋白质在淋巴瘤中过表达：(A)实时PCR定量显示与正常B或T淋巴细胞中的低表达相比，GSK3α和GSK3βmRNA在淋巴瘤系中过表达。(B)Western印迹图像证明，与纯化的正常B或T淋巴细胞相比，GSK3α和GSK3β蛋白也在多种淋巴瘤系中大量表达。

图5显示GSK3对于淋巴瘤细胞增殖和存活是必不可少的。从健康供体分离的未刺激的外周血B-和T-淋巴细胞用作正常对照。GSK3抑制剂9-ING-41在多种MCL和TCL系(A)和DLBCL系(B)中的促凋亡作用。(C)用9-ING-41处理之后多种淋巴瘤细胞系的细胞增殖图。结果(A-C)来自3个独立的实验。

图6显示淋巴瘤细胞中GSK3的抑制或缺失导致细胞周期停滞在G2/M。(A)用0、1.0和2.0μM的9-ING-41处理24小时之后3种代表性细胞系Jeko、Mino和OCI-Ly3的细胞周期图。(B)亲代Ly-1细胞和GSK3α、GSK3β、GSK3αβ敲除亚克隆的细胞周期图。插图：Western印迹图像显示了敲除Ly-1的亚克隆中GSK3α和GSK3β蛋白的消耗。

图7显示9-ING-41对GSK3的抑制导致有丝分裂前期停滞。(A)有丝分裂期间的顺序步骤(M1-M5)的卡通描绘(购自Shutterstock并已修改)。(B)未经处理和用1.0uM 9-ING-41处理24小时的Jeko细胞的代表性Wright染色图像。在未经处理的细胞中容易鉴定出各种有丝分裂阶段的细胞(M1-M5)(左图)，而在9-ING-41细胞(右图)中仅看到大量的前期(M1)细胞。(C)条形图显示了当对100个未经处理或经9-ING-41处理的Jeko细胞进行计数时鉴定的有丝分裂M1-M5细胞的数量。在至少4种不同的淋巴瘤细胞系中观察到相似的结果(数据未示出)。

图8显示GSK3β定位于中心体。(A)免疫荧光图像显示GSK3β定位于间期Jeko细胞中的核和中心体对。(B)(A)中所示的特写(放大)图像。(C-F)野生型Ly-1细胞中GSK3β和中心粒周蛋白的共免疫染色的单通道或多通道图像，显示其共定位于中心体。(G-H)GSK3β零位Ly-1细胞中GSK3β和中心粒周蛋白的共免疫染色的单通道或多通道图像，显示染色是GSK3β特异性的。(K)免疫荧光图像显示GSK3β(绿色)定位于有丝分裂Jeko细胞中类似于有丝分裂纺锤体的烟花样结构。(L)(K)中所示的有丝分裂细胞的特写图像。(M)重叠图像通过α-微管蛋白(红色)染色和DNA(蓝色)显示了微管结构。(N)(M)中所示的特写图像。(O-P)图像显示GSK3β零位Ly-1细胞中不存在GSK3β的纺锤体结构染色。(Q)免疫荧光图像显示在9-ING-41处理的Jeko细胞中GSK3β定位于有丝分裂纺锤体结构和极化的中心体。(R)(Q)中所示的代表性有丝分裂细胞的特写图像。

图9显示了原代淋巴瘤患者(P)细胞中GSK3蛋白的异常表达及其对9-ING-41的增殖响应。(A)GSK3α和GSK3β蛋白的免疫印迹，显示与正常B细胞对照相比在患者样品中过表达。P1：MCL；P2：高级B细胞淋巴瘤；P3：滤泡性大B细胞淋巴瘤3B；P4：DLBCL；P5：血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤。(B)9-ING-41在所有5个患者样品中均抑制了增殖。(C)具有多种淋巴瘤的患者的石蜡组织切片上GSK3β的免疫组织化学染色。代表性图像显示了不同淋巴瘤样品中GSK3β(棕色)过表达的光谱。亚甲蓝复染(蓝色)显示了背景和抗体阴性对照组中的GSK3β阴性细胞。图像在40倍放大倍率下采集。

图10显示了Jeko衍生的异种移植小鼠模型中体内9-ING-41的抗淋巴瘤作用。(A)显示9-ING-41处理方案和剂量的实验设计。(B)未经处理或经9-ING-41处理的异种移植小鼠的生物发光图像。显示的图像是在实验结束时(第17天)采集的。实验进行了两次，其显示出相似的结果。

具体实施方式

通过参考形成本公开内容的一部分的以下详细描述，可以更容易地理解本主题。应当理解，本发明不限于本文中描述和/或示出的特定方法、条件或参数，并且本文中使用的术语仅出于以举例的方式描述特定实施方案的目的，而无意于限制要求保护的发明。

除非本文另外定义，否则结合本申请使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外要求，否则未用数量词限定的名词是指一个/种或更多个/种。

如上文和整个公开内容中所用的，除非另外指出，否则以下术语和缩写应理解为具有以下含义。

在本公开内容中，未用数量词限定的名词是指一个/种或更多个/种，并且对特定数值的提及至少包括该特定值，除非上下文另外明确指示。因此，例如，对“化合物”的提及是对本领域技术人员已知的一种或更多种这样的化合物及其等同物的引用，等等。如本文所用，术语“多个”是指多于一个。当表达值的范围时，另一实施方案包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应理解的是，特定值形成另一实施方案。所有范围都是包含性的和可组合的。

如本文所用，术语“组分”、“组合物”、“化合物的组合物”、“化合物”、“药物”、“药理活性剂”、“活性剂”、“治疗剂”、“疗法”、“治疗”或“药物”在本文可互换使用，是指当施用于对象(人或动物)时通过局部和/或全身性作用诱导期望的药理和/或生理作用的一种或更多种化合物或物质的组合物。

如本文所用，术语“治疗”、“治疗”或“疗法”(及其不同形式)包括预防性(例如，预防)、治愈性或姑息性治疗。如本文所用，术语“治疗”包括减轻或降低病症、疾病或障碍的至少一种不利或负面影响或症状。该病症、疾病或障碍可以是癌症。

如上文和贯穿本公开内容所用的，术语“有效量”是指在所需的剂量和持续时期下有效实现在治疗相关障碍、病症或副作用方面的期望结果的量。应当理解，本发明的组分的有效量将因患者而异，不仅取决于选择的特定化合物、组分或组合物，施用途径以及组分在个体中引起期望结果的能力，还取决于因素例如疾病状态或待减轻的病症的严重程度，个体的激素水平、年龄、性别、体重，患者的状态以及所治疗的病理状况的严重程度，特定患者所遵循的并发药物或特殊饮食，以及本领域技术人员认识的其他因素，并且适当的剂量由主治医师决定。可以调整剂量方案以提供改善的治疗响应。有效量也是其中治疗有益作用超过了组分的任何毒性或有害作用的量。

在一些实施例中，有效量是基于患者的体重。在一些实施方案中，9-ING-41的有效量为约0.1mg/kg至10mg/kg，例如约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg。

如上文和整个公开内容中所用，术语“亚治疗量”是指当作为唯一治疗剂施用时无效的量。

“可药用”是指在合理的医学判断范围内适合与人和动物组织接触而没有过度毒性、刺激性、变态反应或其他问题并发症的具有合理的获益/风险比的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

在本发明中，公开的化合物可以以可药用盐的形式制备。“可药用盐”是指所公开化合物的衍生物，其中母体化合物通过制备其酸式盐或碱式盐而被修饰。可药用盐的实例包括但不限于碱性残基如胺的无机或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱金属或有机盐；等等。可药用盐包括例如由无毒的无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐或季铵盐。例如，这样的常规的无毒盐包括衍生自无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等的那些；以及由有机酸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、扑酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙磺酸等制备的盐。这些生理上可接受的盐通过本领域已知的方法制备，例如通过用水醇中的过量酸溶解游离胺碱，或用碱金属碱(例如氢氧化物)或利用胺中和游离羧酸。

本文所述的化合物可以以替代形式制备。例如，许多含氨基的化合物可以作为酸加成盐使用或制备。通常，这样的盐改善了化合物的分离和处理性能。例如，取决于试剂、反应条件等，本文所述的化合物可以例如作为其盐酸盐或甲苯磺酸盐使用或制备。同构结晶形式、所有手性和外消旋形式、N-氧化物、水合物、溶剂合物和酸盐水合物也被考虑在本发明的范围内。

本发明的某些酸性或碱性化合物可以作为两性离子存在。化合物的所有形式(包括游离酸、游离碱和两性离子)均被考虑在本发明的范围内。在本领域中周知的是，包含氨基和羧基二者的化合物通常以其两性离子形式平衡存在。因此，本文所述的包含例如氨基和羧基二者的任何化合物也包括提及其相应的两性离子。

术语“施用”是指直接施用本发明的化合物或组合物，或施用将在体内形成等量的活性化合物或物质的前药、衍生物或类似物。

术语“对象”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指向其提供用根据本发明的药物组合物进行的治疗(包括预防性治疗)的动物，例如人。如本文所用，术语“对象”是指人和非人动物。术语“非人动物”和“非人哺乳动物”在本文可互换使用，并且包括所有脊椎动物，例如哺乳动物，例如非人灵长类动物(尤其是高等灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛、马，以及非哺乳动物，例如爬行动物、两栖动物、鸡和火鸡。

本公开内容提供了在有此需要的患者中治疗恶性淋巴增生性疾病的方法，其包括向所述患者施用有效量的GSK-3β抑制剂。

可以使用本公开内容的方法治疗的恶性淋巴增生性疾病可以是恶性B细胞淋巴增生性疾病或恶性T细胞淋巴增生性疾病。在一些实施方案中，恶性淋巴增生性疾病是恶性B细胞淋巴增生性疾病。在另一些实施方案中，恶性淋巴增生性疾病是恶性T细胞淋巴增生性疾病。

在一些实施方案中，可以使用本公开内容的方法治疗的恶性B细胞淋巴增生性疾病是弥漫性大B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、淋巴母细胞期慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、毛细胞白血病、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症/淋巴浆细胞性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞增生失调病、浆细胞肿瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、霍奇金病或巨大淋巴结增生症。

在一些实施方案中，使用本公开内容的方法治疗的恶性B细胞淋巴增生性疾病是弥漫性大B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，弥散性大B细胞淋巴瘤是双打击淋巴瘤。

在一些实施方案中，使用本公开内容的方法治疗的恶性B细胞淋巴增生性疾病是套细胞淋巴瘤。

在一些实施方案中，可以使用本公开内容的方法治疗的恶性T细胞淋巴增生性疾病是T细胞白血病/淋巴瘤、结外自然杀伤/T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T-细胞淋巴瘤、间变性大T细胞/零位细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤、T细胞急性淋巴细胞性白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞性白血病、淋巴母细胞期慢性骨髓性白血病、移植后淋巴增生综合征、人T细胞白血病病毒1型阳性(HTLV-1⁺)成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)或未指定的T细胞淋巴瘤。

在一些实施方案中，使用本公开内容的方法治疗的恶性T细胞淋巴增生性疾病是T细胞淋巴瘤。

在本公开内容的一些方面，恶性淋巴增生性疾病可以是化学治疗难治性恶性淋巴增生性疾病。化学治疗难治性恶性淋巴增生性疾病是对一种或更多种化学疗法的治疗未能响应的恶性淋巴增生性疾病。在一些实施方案中，化学治疗难治性恶性淋巴增生性疾病是双打击淋巴瘤(即，具有c-MYC和BCL-2的双易位的淋巴瘤)。在另一些实施方案中，难治性恶性淋巴增生性疾病未能响应的化学治疗是R-CHOP(利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松)。在另一些实施方案中，难治性恶性淋巴增生性疾病未能响应的化学治疗是具有或不具有单克隆抗体、激酶抑制剂、酶调节剂和凋亡调节剂的细胞毒性治疗的组合。

使用本发明方法治疗病症的患者是动物，优选哺乳动物。在一些实施方案中，患者是人类。在另一些实施方案中，患者是犬科动物(即狗)。在另一些实施方案中，患者是猫科动物(即猫)。在一些优选的实施方案中，使用本公开内容方法治疗病症的患者是人类。

在本公开内容的方法中施用的GSK-3β抑制剂是抑制糖原合酶激酶3β(GSK-3β)的活性的任何化合物。

在一些方面，在本公开内容的方法中施用的GSK-3β抑制剂是9-ING-41、tideglusib、LY2090314、CHIR-99021、CHIR-98014、SB216763、SB415286、AR-A011418、CG701338或CG202796。

在一些实施方案中，在本公开内容的方法中施用的GSK-3β抑制剂是9-ING-41。因此，在一些方面，本公开内容提供了在有此需要的患者中治疗恶性淋巴增生性疾病的方法，其包括向所述患者施用有效量的9-ING-41。

在另一些实施方案中，在本公开内容的方法中施用的GSK-3β抑制剂是tideglusib，并且本公开内容提供了在有此需要的患者中治疗恶性淋巴增生性疾病的方法，其包括向所述患者施用有效量的tideglusib。

在另一些实施方案中，在本公开内容的方法中施用的GSK-3β抑制剂是LY2090314，并且本公开内容提供了在有此需要的患者中治疗恶性淋巴增生性疾病的方法，其包括向所述患者施用有效量的LY2090314。

在本公开内容的治疗恶性淋巴增生性疾病的方法中，可以将有效量的GSK-3β抑制剂作为唯一治疗剂或与一种或更多种其他治疗剂组合施用于患者。

在一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用GSK-3β抑制剂作为唯一治疗剂。当GSK-3β抑制剂是在本公开内容的方法中施用的唯一治疗有效化合物时，该治疗称为单一治疗。在一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用9-ING-41作为唯一治疗剂。在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用tideglusib作为唯一治疗剂。在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用LY2090314作为唯一治疗剂。

在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与一种或更多种其他治疗剂组合的GSK-3β。当GSK-3β抑制剂与第二治疗剂组合施用时，该治疗称为联合治疗。在联合治疗中，无需将GSK-3β抑制剂和第二治疗剂同时引入或施用到患者身体内或上。联合治疗只需要GSK-3β抑制剂和第二治疗剂同时存在于患者身体内或上。因此，联合治疗并不意味着任何特定的给药方案。

在一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与一种或更多种其他治疗剂组合的9-ING-41。在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与一种或更多种其他治疗剂组合的tideglusib。在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与一种或更多种其他治疗剂组合的LY2090314。

在一些方面，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与凋亡调节剂组合的GSK-3β抑制剂。在一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与凋亡调节剂组合的9-ING-41。在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与凋亡调节剂组合的tideglusib。在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与凋亡调节剂组合的LY2090314。

在一些方面，凋亡调节剂是Bcl-2抑制剂。示例性的Bcl-2抑制剂包括维奈托克、ABT-737和navitoclax。在一些方面，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与Bcl-2抑制剂组合的GSK-3β抑制剂。在一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与Bcl-2抑制剂组合的9-ING-41。在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与Bcl-2抑制剂组合的tideglusib。在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与Bcl-2抑制剂组合的LY2090314。

在一些方面，Bcl-2抑制剂是维奈托克、ABT-737或navitoclax。在一些方面，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与维奈托克、ABT-737或navitoclax组合的GSK-3β抑制剂。在一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与维奈托克、ABT-737或navitoclax组合的9-ING-41。在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与维奈托克、ABT-737或navitoclax组合的tideglusib。在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与维奈托克、ABT-737或navitoclax组合的LY2090314。

在一些方面，Bcl-2抑制剂是维奈托克。在另一些方面Bcl-2抑制剂是ABT-737。在另一些方面，Bcl-2抑制剂是navitoclax。在一些方面，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与维奈托克组合的GSK-3β抑制剂。在一些方面，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与ABT-737组合的GSK-3β抑制剂。在一些方面，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与navitoclax组合的GSK-3β抑制剂。

在一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用于维奈托克组合的9-ING-41。在一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与ABT-737组合的9-ING-41。在一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与navitoclax组合的9-ING-41。

在一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与维奈托克组合的tideglusib。在一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与ABT-737组合的tideglusib。在一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括与navitoclax组合的tideglusib。

在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与维奈托克组合的LY2090314。在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与ABT-737组合的LY2090314。在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与navitoclax组合的LY2090314。

在一些方面，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)调节剂组合的GSK-3β抑制剂。在一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)调节剂组合的9-ING-41。在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)调节剂组合的tideglusib。在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)调节剂组合的LY2090314。

在一些方面，CDK调节剂是细胞周期蛋白依赖性激酶9(“CDK9”)抑制剂。示例性CDK9抑制剂包括BAY-1143572、LDC000067、Dinaciclib(SCH727965)、SNS-032(BMS-387032)、AT7519、P276-00、AZD5438、PHA-767491或PHA-793887。在一些方面，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与CDK9抑制剂组合的GSK-3β抑制剂。在一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与CDK9抑制剂组合的9-ING-41。在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与CDK9抑制剂组合的tideglusib。在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与CDK9抑制剂组合的LY2090314。

在一些方面，CDK9抑制剂是BAY-1143572、LDC000067、Dinaciclib(SCH727965)、SNS-032(BMS-387032)、AT7519、P276-00、AZD5438、PHA-767491或PHA-793887。在一些方面，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与BAY-1143572、LDC000067、Dinaciclib(SCH727965)、SNS-032(BMS-387032)、AT7519、P276-00、AZD5438、PHA-767491或PHA-793887组合的GSK-3β抑制剂。在一些方面，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与BAY-1143572、LDC000067、Dinaciclib(SCH727965)、SNS-032(BMS-387032)、AT7519、P276-00、AZD5438、PHA-767491或PHA-793887组合的9-ING-41。在另一些实施方案中，在一些方面，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与BAY-1143572、LDC000067、Dinaciclib(SCH727965)、SNS-032(BMS-387032)、AT7519、P276-00、AZD5438、PHA-767491或PHA-793887组合的tideglusib。在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与BAY-1143572、LDC000067、Dinaciclib(SCH727965)、SNS-032(BMS-387032)、AT7519、P276-00、AZD5438、PHA-767491或PHA-793887组合的LY2090314。

在一些方面，CDK9抑制剂是BAY-1143572。在一些方面，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与BAY-1143572组合的GSK-3β抑制剂。在一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与BAY-1143572组合的9-ING-41。在一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与BAY-1143572组合的tideglusib。在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与BAY-1143572组合的LY2090314。

在一些方面，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与MTOR/AKT/PI3途径的调节剂组合的GSK-3β抑制剂。在一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与MTOR/AKT/PI3途径的调节剂组合的9-ING-41。在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与MTOR/AKT/PI3途径的调节剂组合的tideglusib。在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与MTOR/AKT/PI3途径的调节剂组合的LY2090314。

在一些方面，MTOR/AKT/PI3途径的调节剂是PI3K抑制剂。示例性PI3K抑制剂的实例包括库潘尼西和艾代拉利司。在一些方面，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与PI3K抑制剂组合的GSK-3β抑制剂。在一些实施方案中，，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与PI3K抑制剂组合的9-ING-41。在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与PI3K抑制剂组合的tideglusib。在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与PI3K抑制剂组合的LY2090314。

在一些方面，PI3K抑制剂是库潘尼西或艾代拉利司。在一些方面，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与库潘尼西或艾代拉利司组合的GSK-3β抑制剂。在一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与库潘尼西或艾代拉利司组合的9-ING-41。在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与库潘尼西或艾代拉利司组合的tideglusib。在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与库潘尼西或艾代拉利司组合的LY2090314。

在一些方面，PI3K抑制剂是库潘尼西。在一些方面，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与库潘尼西组合的GRP-3β抑制剂。在一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与库潘尼西组合的9-ING-41。在一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与库潘尼西组合的tideglusib。在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与库潘尼西组合的LY2090314。

在一些方面，PI3K抑制剂是艾代拉利司。在一些方面，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与艾代拉利司组合的GSK-3β抑制剂。在一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与艾代拉利司组合的9-ING-41。在一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与艾代拉利司组合的tideglusib。在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与艾代拉利司组合的LY2090314。

在另一些方面，第二治疗剂是以下中的一种或更多种：5-氟尿嘧啶、乙酸阿比特龙、乙酰胆碱、曲妥珠单抗(ado-trastuzumab emtansine)、阿法替尼、阿地白介素、阿来替尼(alectinib)、阿仑单抗、阿利维A酸(alitretinoin)、氨基乙酰丙酸、阿那曲唑、阿那曲唑、阿瑞匹坦、三氧化二砷、asparaginase erwinia chrysanthemi、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿西替尼、阿扎胞苷、贝利司他、苯达莫司汀、异硫氰酸苄酯、贝伐单抗、贝沙罗汀(bexarotene)、比卡鲁胺、博来霉素、博纳吐单抗(blinatumomab)、硼替佐米、博舒替尼、本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、白消安、卡巴他赛、卡博替尼(cabozantinib)、卡培他滨、卡铂、卡非佐米、卡莫司汀、色瑞替尼、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、氯法拉滨、考比替尼(cobimetinib)、克唑替尼、环磷酰胺、阿糖胞苷、达拉非尼、达卡巴嗪、达卡巴嗪、放线菌素、达雷木单抗(daratumumab)、达沙替尼、柔红霉素、地西他滨、去纤核苷酸钠(defibrotide sodium)、地加瑞克、地尼白介素(denileukin diftitox)、地诺单抗、地塞米松、右雷佐生、二氢睾酮(DHT)、地努图希单抗(dinutuximab)、多西他赛、阿霉素、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、艾曲波帕(eltrombopag)、恩杂鲁胺、表柔比星、甲磺酸艾日布林(eribulin mesylate)、厄洛替尼、依托泊苷、依维莫司、依西美坦、依西美坦、非格司亭、磷酸氟达拉滨、氟他胺、氟维司群、氟维司群、吉非替尼、吉西他滨、吉妥单抗(gemtuzumab)、吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)、羧肽酶(glucarpidase)、乙酸戈舍瑞林、羟基脲、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、依鲁替尼、伊达比星、艾代拉利司、异环磷酰胺、伊马替尼、咪喹莫特、干扰素α-2b、伊匹单抗、伊立替康、伊沙匹隆(ixabepilone)、伊沙佐米、兰瑞肽、拉帕替尼、来那度胺、乐伐替尼(lenvatinib)、来曲唑、亚叶酸(leucovorin)、亮丙瑞林、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、乙酸甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、美司钠(mesna)、氨甲喋呤、丝裂霉素C、米托蒽醌、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、奈拉滨、奈妥匹坦(netupitant)、尼洛替尼、尼鲁米特、纳武单抗、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉帕尼、高三尖杉酯碱(omacetaxine mepesuccinate)、奥西替尼(osimertinib)、奥沙利铂、奥唑米星、紫杉醇、帕博西尼(palbociclib)、帕利夫明(palifermin)、帕米膦酸盐(pamidronate)、帕尼单抗(panitumumab)、帕比司他(panobinostat)、帕唑帕尼(pazopanib)、培门冬酶(pegaspargase)、聚乙二醇干扰素α-2b(peginterferon alfa-2b)、派姆单抗(pembrolizumab)、培美曲塞(pemetrexed)、帕妥珠单抗、普乐沙福(plerixafor)、泊马度胺(pomalidomide)、帕那替尼、普拉曲沙(pralatrexate)、泼尼松、甲基苄肼(procarbazine)、普萘洛尔、二氯化镭223、雷洛昔芬、雷莫芦单抗(ramucirumab)、拉布立酶(rasburicase)、瑞戈非尼(regorafenib)、利妥昔单抗、罗拉吡坦(rolapitant)、罗米地辛(romidepsin)、罗米司亭(romiplostim)、鲁索替尼(ruxolitinib)、司妥昔单抗(siltuximab)、sipuleucel-t、索尼德吉(sonidegib)、索拉非尼、舒尼替尼、talimogene laherparepvec、他莫昔芬、替莫唑胺、坦罗莫司(temsirolimus)、沙利度胺、硫鸟嘌呤、噻替派、tipiracil、托泊替康、托瑞米芬、托瑞米芬、托西莫单抗、曲贝替定(trabectedin)、曲美替尼、曲妥珠单抗、维A酸、曲氟尿苷、三乙酸尿苷、凡德他尼(vandetanib)、维罗非尼(vemurafenib)、维奈托克(venetoclax)、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、维莫德吉(vismodegib)、伏立诺他、阿柏西普(ziv-aflibercept)、唑来膦酸及其可药用盐。在一些实施方案中，第二治疗剂是利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松中的一种或更多种。

在一些方面，施用与第二治疗剂组合的GSK-3β抑制剂降低了产生给定治疗效果所需的第二治疗剂的量。即，在一些实施方案中，治疗有效的治疗包括施用与亚治疗量(即，当作为唯一治疗剂施用时无效的量)的第二治疗剂组合的GSK-3β抑制剂。在一些实施方案中，GSK-3β抑制剂与亚治疗量的凋亡调节剂组合施用。在一些实施方案中，9-ING-41与亚治疗量的Bcl-2抑制剂组合施用。在一些实施方案中，9-ING-41与亚治疗量的维奈托克、ABT-737或navitoclax组合施用。在一些实施方案中，9-ING-41与亚治疗量的维奈托克组合施用。

在另一些实施方案中，tideglusib与亚治疗量的Bcl-2抑制剂组合施用。在一些实施方案中，tideglusib与亚治疗量的维奈托克、ABT-737或navitoclax组合施用。在一些实施方案中，tideglusib与亚治疗量的维奈托克组合施用。

在另一些实施方案中，LY2090314与亚治疗量的Bcl-2抑制剂组合施用。在一些实施方案中，LY2090314与亚治疗量的维奈托克、ABT-737或navitoclax组合施用。在一些实施方案中，LY2090314与亚治疗量的维奈托克组合施用。

在另一些实施方案中，GSK-3β抑制剂与亚治疗量的CDK调节剂组合施用。在另一些实施方案中，GSK-3β抑制剂与亚治疗量的CDK9抑制剂组合施用。在另一些实施方案中，GSK-3β抑制剂与亚治疗量的CDK9抑制剂组合施用。在一些实施方案中，9-ING-41与亚治疗量的CDK9抑制剂组合施用。在一些实施方案中，9-ING-41与亚治疗量的BAY-1143572、LDC000067、Dinaciclib(SCH727965)、SNS-032(BMS-387032)、AT7519、P276-00、AZD5438、PHA-767491或PHA-793887组合施用。在一些实施方案中，9-ING-41与亚治疗量的BAY-1143572组合施用。

在一些实施方案中，tideglusib与亚治疗量的CDK9抑制剂组合施用。在一些实施方案中，tideglusib与亚治疗量的BAY-1143572、LDC000067、Dinaciclib(SCH727965)、SNS-032(BMS-387032)、AT7519、P276-00、AZD5438、PHA-767491或PHA-793887组合施用。在一些实施方案中，tideglusib与亚治疗量的BAY-1143572组合施用。

在一些实施方案中，LY2090314与亚治疗量的CDK9抑制剂组合施用。在一些实施方案中，LY2090314与亚治疗量的BAY-1143572、LDC000067、Dinaciclib(SCH727965)、SNS-032(BMS-387032)、AT7519、P276-00、AZD5438、PHA-767491或PHA-793887组合施用。在一些实施方案中，LY2090314与亚治疗量的BAY-1143572组合施用。

在一些方面，GSK-3β抑制剂与亚治疗量的MTOR/AKT/PI3途径的调节剂组合施用。在一些方面，GSK-3β抑制剂与亚治疗量的PI3K抑制剂组合施用。在一些实施方案中，9-ING-41与亚治疗量的PI3K抑制剂组合施用。在另一些实施方案中，9-ING-41与亚治疗量的库潘尼西或艾代拉利司组合施用。在一些实施方案中，9-ING-41与亚治疗量的库潘尼西组合施用。在另一些实施方案中，9-ING-41与亚治疗量的艾代拉利司组合施用。

在一些实施方案中，tideglusib与亚治疗量的PI3K抑制剂组合施用。在另一些实施方案中，tideglusib与亚治疗量的库潘尼西或艾代拉利司组合施用。在一些实施方案中，tideglusib与亚治疗量的库潘尼西组合施用。在另一些实施方案中，tideglusib与亚治疗量的艾代拉利司组合给药。

在一些实施方案中，LY2090314与亚治疗量的PI3K抑制剂组合施用。在另一些实施方案中，LY2090314与亚治疗量的库潘尼西或艾代拉利司组合施用。在一些实施方案中，LY2090314与亚治疗量的库潘尼西组合施用。在另一些实施方案中，LY2090314与亚治疗量的艾代拉利司组合施用。

GSK-3β抑制剂可以在包含GSK-3β抑制剂和至少一种可药用载体或赋形剂的药物组合物中施用。在一些实施方案中，9-ING-41可以在包含9-ING-41和至少一种可药用载体或赋形剂的药物组合物中施用。在另一些实施方案中，tideglusib可以在包含tideglusib和至少一种可药用载体或赋形剂的药物组合物中施用。在另一些实施方案中，LY2090314可以在包含LY2090314和至少一种可药用载体或赋形剂的药物组合物中施用。类似地，第二治疗剂可以在包含第二治疗剂和至少一种可药用载体或赋形剂的药物组合物中施用。可药用载体和赋形剂是本领域已知的。参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,18^thEdition,Mack Publishing Company(1990)。

在一些方面，GSK-3β抑制剂和第二治疗剂可以在单一药物组合物中一起施用。因此，在一些方面，本公开内容涉及包含GSK-3β抑制剂和第二治疗剂以及至少一种可药用载体或赋形剂的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含GSK-3β抑制剂；凋亡调节剂、CDK调节剂或mTOR/AKT/PI3K调节剂中的一种或更多种；以及可药用载体或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物包含9-ING-41、tideglusib或LY2090314中的一种或更多种；凋亡调节剂、CDK调节剂或mTOR/AKT/PI3K调节剂中的一种或更多种；以及可药用载体或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物包含9-ING-41、tideglusib或LY2090314中的一种或更多种；维奈托克、BAY-1143572或idelalisib中的一种或更多种；以及可药用载体或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物包含9-ING-41、tideglusib或LY2090314中的一种或更多种；维奈托克；以及可药用载体或赋形剂。在另一些实施方案中，药物组合物包含9-ING-41、tideglusib或LY2090314中的一种或更多种；BAY-1143572；以及可药用载体或赋形剂。在另一些实施方案中，药物组合物包含9-ING-41、tideglusib或LY2090314中的一种或更多种；艾代拉利司；以及可药用载体或赋形剂。

还提供了施用药物组合物和联合治疗的代表性方法。本发明的多种实施方案还涉及向人患者施用药物组合物或联合治疗以治疗淋巴瘤的方法。所述方法可包括通过普遍接受的施用途径(例如，口服、静脉内、皮下、肠胃外、吸入、局部等)来施用药物组合物或组合治疗。在一些情况下，可以口服、静脉内和/或皮下施用药物组合物或联合治疗。可以使用任何合适的给药方案进行施用。合适的给药方案是本领域普通技术人员已知的。

在本发明的某些实施方案中，药物组合物或联合治疗可以每天一次施用于人患者。在另一些实施方案中，药物组合物或联合治疗可以每天两次施用于人患者。在一些实施方案中，可以将药物组合物或联合治疗在两餐之间施用于人患者。

在本公开内容的另一些方面，可以将GSK-3β抑制剂与另一种非化学治疗的抗癌治疗组合施用。在一些实施方案中，GSK-3β抑制剂与放射治疗组合施用。因此，在一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与放射治疗组合的9-ING-41。在一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与放射治疗组合的tideglusib。在另一些实施方案中，治疗恶性淋巴增生性疾病的方法包括施用与放射治疗组合的LY2090314。

实施例

以下实施例进一步示出了本公开内容的某些方面，并且无意以任何方式限制本公开内容的范围。

材料–实施例1-5。

Daudi(Burkitt)和SUDHL-4(生发中心(GC)弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL))细胞系购自美国典型培养物保藏中心(American type；culture；collection，ATCC)。KPUM-UH1(双打击DLBCL)细胞获自Junya Kuroda,Kyoto Prefectural University of Medicine,Kyoto,Japan。所有细胞系均进行无菌培养并保持在37℃、5％ CO2的水套式培养箱(Thermo-Forma)中，并用含有0.3g/mL谷氨酰胺、10％ FBS(Sigma)以及抗生素和抗真菌试剂(Gemini Bioproducts；终浓度–100单位/mL青霉素G、100μg/mL硫酸链霉素和250ng/mL两性霉素B)的RPMI-1640(Corning)饲喂。Karpas 422(GC-DLBCL)细胞购自Sigma。TMD8(活化的B细胞(ABC)DLBCL)细胞获自NCI的Louis Stoudt博士的实验室，并如上所述但是利用20％ FBS保持。使用TC20自动细胞计数仪(BioRad)量化用于测定的所有细胞数。所有测试的淋巴瘤细胞系均表达活性GSK-3β。

维奈托克和艾代拉利司购自Selleck Chemicals。BAY-1143572购自ActiveBiochem。所有药物重新悬浮在DMSO中。不含药物的DMSO用作未处理对照。

实施例1-生存力和增殖测定(MTS测定)

在使用不同浓度的9-ING-41处理细胞之后，使用Promega CellTiterAQueous One Solution细胞增殖测定试剂(MTS)根据制造商的说明测量第3天的细胞生存力和7天过程中的增殖。在处理结束时，在96孔板中每孔添加20μL试剂，并在37℃下孵育2-4小时。使用Powerwave XS读板仪(Biotek)测定490nm的吸光度(A490)。

在该研究中使用的所有淋巴瘤细胞系均表达活性GSK-3β。将SUDHL-4、KPUM-UH1、Karpas 422或TMD8淋巴瘤细胞铺板，并使用MTS测定法测量第1、3、5和7天的细胞数。参见图1。1μM 9-ING-41处理之后，第3天的细胞生存力(图1A)降低了40-70％(p<0.05)，其中SUDHL-4和KPUM-UH1表现出最高的细胞生存力降低。在暴露于1μM9-ING-41之后，所有淋巴瘤细胞系都出现了生长停滞(图1B-1E)，第7天的增殖相对于对照小于30％(p<0.05)。还测试了不同浓度的9-ING-41(0.1μM、0.5μM、1μM、5μM和10μM)下淋巴瘤细胞的细胞生存力，并且发现在9-ING-41浓度为0.5uM或更高时生存力降低。

实施例 胱天蛋白酶3测定

根据制造商的说明书进行了EnzChek胱天蛋白酶3测定(Thermo FisherScientific)。将100,000个细胞铺在12孔板中，并用不同浓度的9-ING-41一式两份处理24小时。在处理结束时，将细胞在200rcf下离心5分钟，然后用1X PBS洗涤一次，并且在试剂盒提供的50μL 1X裂解缓冲液中裂解。为了有效裂解，对细胞进行单个冻融循环。再次离心裂解的细胞以除去细胞碎片，并将上清液用于测定。将包含Z-DEVD-R110底物的50μL 2X底物工作溶液添加到细胞裂解物中，随后在室温下孵育45分钟。本测定中使用的若丹明110衍生底物(Z-DEVD-R110)是一种非荧光双酰胺化合物，其在通过细胞裂解物中的活性胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶7的酶促裂解之后，经两步转化为荧光单酰胺，然后再转化为荧光甚至更强的R110产物。然后使用Biotek synergy 2荧光读板仪在相应的波长(激发496nm/发射520nm)下测量这两种产物。将荧光读数根据通过标准BCA测定(Pierce Thermo FisherScientific)确定的细胞裂解液中的蛋白质量进行归一化。将未处理对照设置为1之后，计算相对荧光。

当用0.5μM或更高浓度的9-ING-41处理淋巴瘤细胞时，ENZCHEK胱天蛋白酶3测定揭示了观察到的胱天蛋白酶3/7活性的增加。在异种移植小鼠中的药代动力学研究表明，20mg/kg静脉内施用可以在30分钟内在血浆中提供约8μM 9-ING-41浓度，并且在脑中提供约40μM 9-ING-41。Ugolkov A,Qiang W,Bondarenko G,Procissi D,Gaisina I,James CD,Chandler J,Kozikowski A,Gunosewoyo H,O'Halloran T,Raizer J,MazarAP.Combination Treatment with the GSK-3Inhibitor 9-ING-41and CCNU CuresOrthotopic Chemoresistant Glioblastoma in Patient-Derived XenograftModels.Transl Oncol.2017；10:669-78.https://doi.org/10.1016/j.tranon.2017.06.003。

MTS和ENZCHEK胱天蛋白酶3测定数据表明9-ING-41作为单一药剂抑制淋巴瘤细胞系的增殖并降低淋巴瘤细胞的生存力。不受理论的束缚，这些结果表明，GSK-3β靶向通过诱导对存活信号和DNA损伤反应的可变作用，导致侵袭性B细胞淋巴瘤细胞系的增殖和生存力降低，最终导致凋亡。这些作用与DLBCL细胞系中的起源细胞无关。

9-ING-41在DHL细胞系KPUM-UH1(典型的化学治疗抗性细胞系)中的活性是特别使人感兴趣的。不受理论的束缚，Luminex分析(如下所述)表明9-ING-41通过下调c-MYC信号转导并通过减少生存素诱导凋亡而在KPUM-UH1细胞系中发挥作用。存活的这种下调似乎与该细胞系中NF-κB的变化无关，或不受其驱动。这与急性淋巴细胞性白血病(ALL)中的描述相反，在急性淋巴细胞性白血病中，GSK-3β抑制通过生存素效应使ALL细胞对NF-κB介导的凋亡敏感。参见Hu Y,Gu X,Li R,Luo Q,Xu Y.Glycogen synthase kinase-3betainhibition induces nuclear factor-kappaB-mediated apoptosis in pediatricacute lymphocyte leukemia cells.J Exp Clin Cancer Res.2010；29:154.https://doi.org/10.1186/1756-9966-29-154。

实施例3-Western印迹分析

对于单独9-ING-41以及9-ING-41与维奈托克或BAY-1143572的组合，通过Western印迹分析KPUM-UH1细胞中的c-MYC水平。将约1000万个细胞以200rcf旋转5分钟并用PBS漂洗一次，然后在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Roche)的50μl Millipore Milliplex MAP裂解缓冲液中裂解。每孔加载补充有β-巯基乙醇(Bio-Rad)的4X样品缓冲液中变性的蛋白质。使用了Bio-Rad免染Criterion 4-20％预制凝胶。将凝胶在140伏运行90分钟后，使用Bio-Rad凝胶成像仪激活免染技术，以使凝胶中加载的总蛋白质水平可视化。然后使用硝酸纤维素turbo-transfer包和系统(Bio-Rad)将蛋白质转移到膜上，并使用Tris缓冲盐水-0.1％ Tween 20(TBS-T)中的5％w/v干奶封闭膜1小时。然后将膜用在TBS-T中的5％BSA中稀释的一抗孵育过夜。然后将膜在TBS-T中漂洗3次(一次15分钟洗涤和两次5分钟洗涤)，然后用与HRP缀合的相应二抗体孵育1小时，然后如前所述用TBS-T漂洗。最后一次洗涤之后，将膜使用Pierce SuperSignal West Pico化学发光试剂盒显色，并使用Bio-Rad成像系统进行可视化。使用的抗体包括：兔抗GSK-3β(Cell Signaling,目录号:12456)、兔抗磷酸-GSK-3β(Y216)(Abcam,目录号:ab75745)、兔抗c-MYC(Cell Signaling,目录号:5605)、兔抗磷酸-c-MYC(Ser 62)(Cell Signaling,目录号:13748)、兔抗磷酸-c-MYC(Thr58)(Abcam,目录号:ab185655)和小鼠抗β-肌动蛋白(Sigma,目录号:A5441)，其1:1000稀释。抗兔HRP和抗小鼠HRP二抗购自Cell Signaling，并以1:5000稀释使用。必要时，将膜使用RESTOREPLUSWestern印迹剥离缓冲液(Pierce)剥离10分钟，并用TBS-T洗涤数次，并且如前所述重新封闭和重新探测。使用Image J软件(NIH)进行带强度的定量。这些在双打击淋巴瘤细胞系KPUM-UH1中进行的实验表明，9-ING-41处理对磷酸-c-MYC进行了修饰。

实施例4-Luminex分析

利用FLEXMAP 3D仪器根据制造商的说明书，使用Luminex多重技术确定与未处理对照相比与1μM 9-ING-41处理48小时相关的NF-κB[MILLIPLEXMAP NF-κB信号转导磁珠试剂盒6重试剂盒，EMD Millipore，分析物:c-MYC、FADD(Ser194)、IκBα(Ser32)、IKKα/β(Ser177/Ser181)、NF-κB(Ser536)、TNFR1]、DNA损伤[MILLIPLEX MAP DNA损伤/基因毒性磁珠组，EMD Millipore，分析物：ATR(总)、Chk1(Ser345)、Chk2(Thr68)、H2A.X(Ser139)、MDM2(总)、p21(总)、p53(Ser15)]和凋亡途径[Bio-plex pro RBM凋亡组2和3，Bio-Rad，分析物：Bad、Bax/Bcl-2dimer、Bcl-xL、Bim、Mcl-1、活性胱天蛋白酶3,Bcl-xL/Bak二聚体、Mcl-1/Bak二聚体、生存素]中的信号转导变化。将细胞在补充有蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)和磷酸酶抑制剂混合物2和3(Sigma)的MILLIPLEX MAP裂解缓冲液中进行裂解，并且在BCA蛋白确定之后，向每个孔中添加15μg蛋白质。所有样品一式两份运行，并分析了9-ING-41处理的细胞与未处理对照之间的MFI或绝对量的变化，并且进行未配对的t检验以确定统计学显著性。

对NF-κB信号转导的分析显示，Karpas 422和TMD8细胞系中总c-MYC水平显著降低，但是在其余细胞系中该蛋白质仅具有降低趋势。通过评估p-H2A.X(Ser139)，发现SUDHL-4和Karpas 422细胞的DNA损伤信号转导升高(二者p<0.05)。此外，在SUDHL-4和TMD8细胞中观察到9-ING-41处理之后磷酸化p53(Ser15)的显著增加。凋亡信号转导途径的分析表明，在除TMD8之外的所有淋巴瘤细胞系中生存素显著降低(～2倍，p<0.05)，并且活性活性胱天蛋白酶3升高。除KPUM-UH1之外，所有淋巴瘤细胞系均显示Mcl-1/Bak二聚体显著减少(～2倍，p<0.05)，而Bcl-xl/Bak二聚体表达在除TMD8之外的所有细胞系中均显著(～1.5倍，p<0.05)降低。

实施例5-组合的剂量反应

将Daudi、SUDHL-4、KPUM-UH1、Karpas 422或TMD8细胞同时用一系列浓度的9-ING-41(0μM、0.05μM、0.5μM)与维奈托克(0nM、0.5nM、5nM、50nM、500nM、5000nM)、BAY-1143572(0μM，0.005μM，0.05μM，0.5μM，5μM，50μM)或艾代拉利司(0μM、0.005μM、0.05μM、0.5μM、5μM、50μM)进行处理。参见图2。如上所述，使用MTS测定法确定第3天的生存力。从样品的A490中减去背景吸光度，并将载剂/未处理对照的A490设置为1，并计算其余样品的相对A490。IC50计算为A490达到0.5时的药物浓度。累加效应计算为在与0.5μM的9-ING-41组合时新药的IC50的变化倍数。

如图3所示，使用9-ING-41和第二治疗剂的组合处理可以降低产生给定治疗效果所需的第二治疗剂的量。如图所示，与0.5μM 9-ING-41组合处理SUDHL-4细胞系使维奈托克的IC50值降低了8倍。同样，与0.5μM9-ING-41组合处理KPUMUH1细胞系使维奈托克的IC50值降低了2倍。使用0.5μM 9-ING-41组合处理SUDHL-4细胞系使BAY-1143572的IC50值降低了8倍。使用9-ING-41的组合处理并未在研究的细胞系中显著改变艾代拉利司的IC50值。

材料和方法–实施例6-11

在书面知情同意书之后，从患者获得淋巴瘤组织样品。这项淋巴瘤SPORE生物标本方案已根据赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)由梅奥诊所机构审查委员会(MayoClinic Institutional Review Board)批准。所有原代患者样品为来自脾或淋巴结的活检组织。将新鲜的组织样品轻轻地解离成细胞悬液，并进行Ficoll-Paque密度梯度离心。然后将原代淋巴瘤细胞直接用于增殖测定，或在淋巴瘤确诊之后储存在-80℃下以用于Western分析。

本研究中使用的所有淋巴瘤细胞系均购自ATCC(Manassas，VA)或DSMZ(Braunschweig,Germany)。DLBCL(弥漫性大B细胞淋巴瘤)系培养在补充有10％人血清(Sigma-Aldrich)的IMDM培养基中；TCL(T细胞非霍奇金淋巴瘤)和MCL(套细胞淋巴瘤)系维持在补充有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中。用于在小鼠中进行异种移植建模的Jeko细胞系通过慢病毒转导稳定表达萤火虫萤光素酶(Fluc)。定期检查细胞系是否存在支原体感染，并通过基于家庭酿造SNP的PCR方法或通过ATCC进行的短串联重复序列分析进行鉴定。

抗体和其他试剂

常见试剂来自Sigma-Aldrich。用于免疫印迹的抗体包括抗人GSK3α(目录号4337)、GSK3β(目录号12456)、磷酸-GSK3α-S21/GSK3β-S9(目录号9327)，其购自CellSignaling。用于免疫荧光的小鼠单克隆抗GSK3β(克隆7/GSK3β，目录号610201，BDBiosciences)、抗α-微管蛋白(克隆MD1A，目录号T9026)和兔抗中心粒周蛋白(目录号ab4448)抗体分别来自Sigma和Abcam。Alexa 488或Alexa 565缀合二抗是LifeTechnologies的产品。

凋亡测定

将细胞以5x10⁵细胞/孔接种在24孔板中，并利用指定浓度的9-ING-41孵育48小时。然后将细胞用FITC缀合的膜联蛋白V(Life Technologies)和碘化丙啶染色，然后在BDFACS Calibur流式细胞仪上进行分析。

DNA细胞周期

将细胞固定并用冷乙醇透化，用RNA酶处理，并用碘化丙锭(Sigma)染色。使用CELLQuest PRO软件(Becton Dickinson)在BD FACS Calibur上运行染色的细胞。使用FlowJo v.X软件(Tree Star Inc)分析数据。

增殖测定

将细胞以1x10⁴细胞/孔接种在96孔板中，并用指定浓度的9-ING-41孵育48小时，然后用氚标记的胸苷脉冲处理过夜，然后分析胸苷的摄取。

Western免疫印迹

如先前所述进行Western分析，并使用LI-COR试剂系统在LI-COR Odyssey CLX成像仪上进行显影。

定量PCR

使用RNAeasy试剂盒(Qiagen)分离来自淋巴瘤细胞系的总mRNA，并使用Superscript III cDNA合成试剂盒(Life technology)合成cDNA。然后使用RT2 SYBRGreen ROX qPCR Mastermix(Qiagen)在ABI 7500实时PCR系统(Applied Biosystems)上进行qPCR。

药物IC50计算

使用在线IC50计算工具(https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator/)计算9-ING-41对细胞存活和增殖的IC₅₀。

免疫组织化学染色

根据标准方案在5μm厚的石蜡切片上进行免疫组织化学(IHC)。简单地说，用二甲苯对载玻片上的组织切片进行脱蜡，用一系列醇再水化，然后在柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中进行抗原修复。将所得载玻片用30％过氧化氢淬灭内源性过氧化物酶。然后将载玻片用抗GSK3b抗体(BD，1:150)在室温下孵育2小时，用Tris缓冲盐水洗涤3次(每次5分钟)，并用生物素化的抗小鼠二抗(1:200)在室温下孵育1小时。在室温下用HRP缀合的ABC复合物(Vectastain，Vector Laboratories)处理载玻片1小时之后，用亚甲基蓝复染的3,39-二氨基联苯胺(DAB，Vector Laboratories)显色，用DPX固定并且在Nikon Eclipse Ti显微镜上检查和成像。在不添加一抗的情况下对患者样品进行阴性对照。

免疫荧光染色用于GSK3β的中心体和纺锤体定位

为了对中心体的GSK3β和中心粒周蛋白进行免疫共染色(图8C-8J)，我们通过在室温下用PBS中的3％多聚甲醛将细胞固定在细胞离心涂片载玻片上5分钟来使用了不完全固定方法。然后将细胞用PBS中的0.2％Triton X-100透化10分钟，然后用PBS中的5％ BSA封闭1小时，并在40℃下用小鼠抗GSK3βmAb和兔抗中心粒周蛋白免疫染色过夜。然后洗涤细胞，并用荧光染料缀合的二抗进一步染色。

将淋巴瘤细胞的细胞离心涂片制备物上的GSK3β和α-微管蛋白的所有其他免疫染色在室温下用PBS中的4％多聚甲醛固定15分钟，然后进行透化和与上述相同的染色步骤。分析细胞并在常规Zeiss显微镜或Zeiss LSR 780共聚焦显微镜上成像。

实施例6.GSK3α和GSK3β在淋巴瘤细胞中过表达。

检查了纯化的人正常B细胞和T细胞以及DLBCL、MCL和TCL淋巴瘤细胞系中GSK3α和GSK3β的表达状态。通过RT-qPCR，发现与正常淋巴细胞中的较低表达相比，大多数淋巴瘤细胞系显示出更高但是可变水平的GSK3α和GSK3βmRNA(图4A)，表明在大多数淋巴瘤细胞系中GSK3的转录增强。通过Western印迹分析了GSK3蛋白表达，表明与B和T淋巴细胞中的弱表达相比，大多数淋巴瘤细胞系(除Ly-19之外)显示出GSK3α蛋白的强表达(图4B，绿色)。同样，GSK3β蛋白在所有淋巴瘤细胞系中也强烈表达，但在正常淋巴细胞中却非常弱地表达(长时间暴露后可见；未显示)(图4B，红色)。这些数据表明，GSK3蛋白在大多数B淋巴瘤和T淋巴瘤细胞系中过表达。

通过Western印迹，与正常淋巴细胞相似，GSK3α和GSK3β蛋白二者在我们的淋巴瘤细胞系中被可变地磷酸化。

实施例7.GSK3α和GSK3β在淋巴瘤细胞中是功能上重要的。

鉴于GSK3α和GSK3β二者在淋巴瘤细胞中过表达，并且两种酶均参与对细胞功能至关重要的多种信号转导途径，因此检查了GSK3α和GSK3β是否在功能上支持淋巴瘤细胞的存活和增殖。用低剂量的9-ING-41处理TCL和MCL系48小时诱导了凋亡(图5A)；DLBCL系需要更高的浓度(图5B)。相反，即使在浓度为10.0μM的9-ING-41下，在纯化的正常未刺激T淋巴细胞或外周血单核细胞中也未检测到明显的凋亡。计算了9-ING-41对多种淋巴瘤细胞系的细胞存活的最大作用一半时的抑制浓度(IC₅₀)(表1)。

表1.在多种淋巴瘤细胞系中细胞存活和细胞增殖最大值的50％处的9-ING-41抑制浓度(IC₅₀)。

9-ING-41可以特异性地诱导淋巴瘤凋亡而不影响正常淋巴细胞。在存在或不存在9-ING-41的情况下进行胸苷掺入试验以测试GSK3在淋巴瘤细胞增殖中的作用。在低至1.0μM的9-ING-41浓度的存在下，所有TCL和MCL系的增殖速率被显著抑制。DLBCL系需要稍微更高的浓度。计算了9-ING-41对多种淋巴瘤细胞系细胞增殖的IC₅₀(表1)。这些数据表明，GSK3活性对于淋巴瘤细胞的增殖和存活是重要的。

CRISPR/CAS9敲除技术用于遗传缺失GSK3A和GSK3B基因。

使用网络工具(http://crispr.mit.edu/)设计了靶向GSK3α和GSK3β基因的第一个编码外显子的指导RNA(gRNA)。将gRNA序列(GSK3α:GACAGATGCCTTTCCGCCGC；GSK3β:CGGCTTGCAGCTCTCCGCAA)克隆到携带共表达GFP的px458载体(Addgene)中。使用核转染试剂盒(Lonza,Basel,Switzerland)将构建体核转染到淋巴瘤细胞中。核转染之后三十六小时，在Aria II FACS分选仪上以1个细胞/孔将表达GFP的单细胞分选到96个孔板中。将单细胞亚克隆在培养中扩增两周之后，通过PCR和Sanger的DNA测序对每个亚克隆进行基因分型。

在瞬时表达携带CAS9-T2A-GFP以及GSK3A或GSK3B基因外显子1序列的特异性gRNA的构建体后，通过流式分选将表达GFP的单细胞分选到96孔板中。培养2-3周后，对在GSK3A、GSK3B或两个基因中具有独特修饰的单细胞亚克隆进行基因分型以进行基因缺失，以及通过Western印迹验证蛋白质的消耗。如表2中总结的，从所有测试的5种细胞系中容易获得数个GSK3A零位敲除亚克隆，并且也从Ly-1细胞系获得GSK3B零位敲除亚克隆。然而，在分析了来自Ly-19、Jeko、Mino和Karpas299细胞系的24-36个单细胞亚克隆后，未检测到敲除亚克隆；即，所有存活的克隆都是野生型或携带杂合突变，表明来自那些细胞系的GSK3B零位细胞可能在培养期间死亡。鉴于CRISPR/CAS9是用于Ly-1细胞中GSK3B基因的双等位基因缺失的高效方法(19/24,79％)，但在任何其他测试的淋巴瘤细胞系中均没有GSK3B零位克隆(0/24,0/24,0/36,0/26,0％)，这些数据支持以下结论：GSK3B对于这些细胞系中的淋巴瘤细胞存活是必需的。使用shRNA敲低也观察到相似的结果，表明GSK3B敲低在除Ly-1之外的数种淋巴瘤细胞中是致命的。

表2.使用CRISPR/Cas9方法敲除GSK3α和/或GSK3β对多种淋巴瘤细胞系存活的影响

实施例7.GSK3抑制阻断了淋巴瘤细胞中的G2/M进程。

检查了9-ING-41对淋巴瘤细胞周期动力学的影响。9-ING-41处理后，在所有测试的细胞系中，在处理的早至24小时细胞周期被阻断在G2/M(图6A)，表明GSK3活性是有丝分裂的成功进展所必需的。为了进一步确定该G2/M停滞是否是由GSK3β抑制特异性引起的，检查了亲本(野生型)、GSK3A、GSK3B和GSK3A/B敲除Ly-1亚克隆的细胞周期谱。在没有处理的情况下，亲本野生型和GSK3A-零位Ly-1细胞均显示正常的细胞周期谱，而GSK3B和GSK3A/B敲除亚克隆显示出G2/M的细胞增加(图6B)。此外，GSK3A/B双敲除亚克隆还显示多倍体(>4N)细胞水平升高，可能是由于缺陷的有丝分裂所致。GSK3B-零位和GSK3A/B-零位Ly-1细胞的这些细胞周期异常很轻微，对Ly-1后代的存活几乎没有影响，这可能是通过Ly-1细胞系特异性补偿机制引起的。9-ING-41处理表型GSK3B单缺失或GSK3A/B双缺失对细胞周期进展的影响表明GSK3B对于淋巴瘤细胞周期G2/M进程至关重要，而9-ING-41是用于淋巴瘤细胞的有效细胞周期阻滞剂。

实施例8.GSK3抑制使淋巴瘤细胞停滞在有丝分裂的前期。

尽管停滞在G2/M的细胞在流式细胞术直方图上显示为单个DNA含量(4N)峰(图6A)，但实际上，在G2/M中有至少5个连续步骤(M1-M5)对成功的细胞分裂是至关重要的。这些包括前期(M1，染色体浓缩，有丝分裂纺锤体形成开始)、前中期(M2，核膜破裂，中心体极化)、中期(M3，染色体对对齐中间平面)、后期(M4，子代染色单体分离)、末期(M5，子核重建)和最终的胞质分裂(两个子细胞分离)。这些离散步骤中的每一个在Wright染色细胞上都有独特的可识别核形态(如图7A所示)。检查未处理的和9-ING-41处理的Jeko细胞的形态，以确定它们停滞在什么阶段。如图7B(左图)所示，在未处理的有丝分裂Jeko细胞中很容易确定所有M1-M5有丝分裂步骤；然而，在9-ING-41处理的细胞中(右图)，大部分细胞显示了似于前期(M1)细胞的浓缩染色体的形态和减少的细胞质染色，而没有可鉴定的具有M2-M5形态的细胞。通过对100个有丝分裂细胞进行差异计数，发现在未处理的细胞中，有丝分裂细胞的所有阶段(M1-M5)可容易地鉴定。在9-ING-41处理的有丝分裂细胞中仅具有前期(M1)细胞(图7C)。在包括DHL-6、Ly-3、Mino和Karpas299在内的其他淋巴瘤细胞系中也观察到了相似的结果。这些观察结果支持以下结论：GSK3活性对于有丝分裂前期的进展是必需的。

实施例9.GSK3β定位于淋巴瘤细胞的中心体和有丝分裂纺锤体。

检查了GSK3β在两个关键的前期事件中心体极化和有丝分裂纺锤体形成中的参与。通过免疫荧光染色检查了间期Jeko或Ly-1细胞中GSK3β蛋白的亚细胞定位。在间期期间，GSK3β显著定位在Jeko细胞的细胞核中和细胞质中的中心体样对点中(图8A-B)。为了进一步证明那些细胞质对点确实是中心体，首先使用不完全固定方案对wt Ly-1细胞的GSK3β蛋白和中心体标志物中心粒周蛋白进行共染色，并且发现胞质GSK3β点与中心粒周蛋白完美共定位(图8D-8F)，表明这些GSK3β亮点(绿色，图8A-C和8F)确实是中心体。通过显示其在GSK3B-零位Ly1细胞中不存在，进一步证明了抗GSK3β抗体染色对GSK3β蛋白是特异性的(图8G-J)。因此，我们得出结论，GSK3β定位于间期细胞中的中心体和细胞核。

为了确定GSK3β在有丝分裂细胞中的细胞内定位，分析了正常有丝分裂Jeko细胞中的GSK3β定位。GSK3β染色(绿色，图8K-L)显示出“烟花状”的模式，中间为极化的中心体，有丝分裂纺锤体或微管向外延伸。所述染色对GSK3β是特异性的，因为在GSK3B缺陷的有丝分裂细胞中不存在这种染色(图8O-P)。α-微管蛋白的染色模式(使用用于微管标志物α-微管蛋白的单独染色)与GSK3β(红色，图8M-N)的相似，表明在有丝分裂过程中GSK3β定位于微管。这些观察结果共同表明，在有丝分裂期间GSK3β蛋白特异性地定位于中心体和有丝分裂纺锤体。确定了GSK3β在9-ING-41处理的Jeko细胞中的定位(图8Q-R)。在所有前期细胞中观察到类似的烟花样GSK3β染色模式，GSK3β定位没有任何改变。总而言之，这些数据表明，GSK3β在间期定位于中心体和细胞核(图8A-B)，并且在有丝分裂期定位于中心体和有丝分裂微管(图8K-L)。9-ING-41的处理不会改变GSK3β的定位，也不影响中心体极化或微管形成。因此，9-ING-41可能在后面的步骤中抑制微管功能，从而阻止前期的进展。

实施例10.来自淋巴瘤患者的原代细胞中GSK3的表达和靶向。

检查了新鲜分离自患有MCL、高级B细胞淋巴瘤、3B级滤泡性淋巴瘤、DLBCL或血管免疫母细胞TCL的患者的原代淋巴瘤细胞中GSK3α和GSK3β蛋白的表达。与正常血液B细胞对照相比，所有5个样品具有更强的GSK3α和GSK3β蛋白表达(图9A)。这些患者细胞对9-ING-41的抗增殖作用有相似的响应(图9B)。通过IHC探测了来自具有多种淋巴瘤类型的不同队列患者的石蜡样品中GSK3β蛋白的表达。如图9C所示，发现了所有样品中具有可变强度的GSK3β过表达。从Gene Expression Profile Interactive Analysis(http://gepia.cancerpku.cn)的公共数据库中提取的原代DLBCL患者样品的RNA-Seq分析也显示与正常淋巴细胞相比淋巴瘤中GSK3α和GSK3β的表达升高。

分析了最近公布的具有临床存活数据[中位随访为10.5年(95％ CI：7.9-未达到)]的234名DLBCL患者队列的RNA-Seq数据(Schmitz R,Wright GW,Huang DW,etal.Genetics and Pathogenesis of Diffuse Large B-Cell Lymphoma.N Engl JMed.2018；378(15):1396-1407)。进行接收者工作特征(ROC)曲线分析以将GSK3α和GSK3β表达二分，以建立用于高表达和低表达分组的最佳临界值(GSK3α为10.5，GSK3β为8.6)。GSK3α高表达组(≥10.5,n＝172)的OS为7.8年(95％ OS:7.2-8.4)，而GSK3α低表达组(<10.5,n＝62)具有8.9年的显著更高的OS(95％ OS:8.2-10.1)。同样，GSK3β高表达组(≥8.6,n＝170)的OS为7.8年(5％ OS:7.2-8.2)，而GSK3β低表达组(<8.6,n＝62)具有9.7年的显著(p＝0.0005)更高的OS(95％ OS:8.6-11.5)。这些结果表明，GSK3α或GSK3β的过表达各自与较差的临床结果相关。此外，分组数据还显示，大多数DLBCL患者被分在了GSK3α或GSK3β的高表达组，进一步证实了GSK3α和GSK3β在淋巴瘤中普遍过表达的结论。

实施例11.靶向人淋巴瘤的小鼠异种移植物中的GSK3。

通过用表达萤火虫萤光素酶报道基因Fluc的Jeko细胞皮下注射NGS小鼠建立MCL异种移植小鼠模型。

用于这些实验的NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠购自杰克逊实验室(Bar Harbor,Maine)。向八至十只8周龄的相同性别小鼠在右胁侧皮下注射5x10⁶个表达Fluc的Jeko细胞。Jeko细胞接种之后4天，通过成像验证了肿瘤植入。将肿瘤植入的小鼠随机分为对照组和处理组，然后未处理或者如指示的通过IP注射9-ING-41处理。IP注射200ul15mg/ml D-荧光素(GoldBio,St.Louis,MO)并且用2.5％异氟烷麻醉之后20分钟，通过IVIS Imager(Xenogen,Alameda,CA)测量肿瘤体积。为了比较，所有成像变量保持一致。当最大的肿瘤达到IACUC方案的尺寸限制时，实验终止。

在两个独立的实验中，八至十只具有通过成像证实的移植瘤的小鼠(通常在肿瘤接种后4天)随机用作对照或每隔一天IP接受40mg/kg的9-ING-41处理(图10A)。如图10B所示，到了第17天，对照组(未处理)小鼠具有具萤光素酶活性的大肿瘤；然而，经9-ING-41处理的小鼠具有萤光素酶活性低得多的较小肿瘤。这些数据证明9-ING-41在MCL的小鼠模型中具有单药抗肿瘤活性。

实施例12：使用9-ING-41治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)

向患有弥漫性大B细胞淋巴瘤的人以每天1mg/kg施用9-ING-41，持续六个21天的周期。治疗之后，该人的DLBCL缓解。

实施例13：使用9-ING-41治疗套细胞淋巴瘤(MCL)

向患有套细胞淋巴瘤的人以每天3mg/kg施用9-ING-41，持续六个21天的周期。治疗之后，该人的MCL缓解。

实施例14：使用9-ING-41治疗T细胞淋巴瘤(TCL)

向患有T细胞淋巴瘤(非霍奇金氏病)的人以每天2mg/kg施用9-ING-41，持续六个21天的周期。治疗之后，该人的TCL缓解。

参见Karmali,et al.,GSK-3βinhibitor,9-ING-41,reduces cell viabilityand halts proliferation of B-cell lymphoma cell lines as a single agent andin combination with novel agents,Oncotarget.2017Dec 29；8(70):114924–114934，其全部内容通过引用并入本文。

参见Wu,et al.,Targeting glycogen synthase kinase 3for therapeuticbenefit in lymphoma,Blood.Published online May 17,2019(http://www.bloodjournal.org)；doi:10.1182/blood.2018874560，其全部内容通过引用并入本文。

本申请还涉及以下实施方案：

1.在有此需要的患者中治疗恶性淋巴增生性疾病的方法，其包括向所述患者施用有效量的GSK-3β抑制剂。

2.根据实施方案1所述的方法，其中所述恶性淋巴增生性疾病是恶性B细胞淋巴增生性疾病。

3.根据实施方案2所述的方法，其中所述恶性B细胞淋巴增生性疾病是弥漫性大B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、淋巴母细胞期慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、毛细胞白血病、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症/淋巴浆细胞性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞增生失调病、浆细胞肿瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、霍奇金病或巨大淋巴结增生症。

4.根据实施方案3所述的方法，其中所述恶性B细胞淋巴增生性疾病是弥漫性大B细胞淋巴瘤。

5.根据实施方案4所述的方法，其中所述弥漫性大B细胞淋巴瘤是双打击淋巴瘤。

6.根据实施方案1所述的方法，其中所述恶性淋巴增生性疾病是恶性T细胞淋巴增生性疾病。

7.根据实施方案6所述的方法，其中所述恶性T细胞淋巴增生性疾病是T细胞白血病/淋巴瘤、结外自然杀伤/T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T-细胞淋巴瘤、间变性大T细胞/零位细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤、T细胞急性淋巴细胞性白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞性白血病、淋巴母细胞期慢性骨髓性白血病、移植后淋巴增生综合征、人T细胞白血病病毒1型阳性(HTLV-1⁺)成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)或未指定的T细胞淋巴瘤。

8.根据实施方案1至7中任一项所述的方法，其中所述恶性淋巴增生性疾病是化学治疗难治性的。

9.根据实施方案1至8中任一项所述的方法，其中所述GSK-3β抑制剂是9-ING-41、tideglusib、LY2090314、CHIR-99021、CHIR-98014、SB216763、SB415286、AR-A011418、CG701338或CG202796。

10.根据实施方案9所述的方法，其中所述GSK-3β抑制剂是9-ING-41、tideglusib或LY2090314。

11.根据实施方案10所述的方法，其中所述GSK-3β抑制剂是9-ING-41。

12.根据实施方案10所述的方法，其中所述GSK-3β抑制剂是tideglusib。

13.根据实施方案10所述的方法，其中所述GSK-3β抑制剂是LY2090314。

14.根据实施方案1至13中任一项所述的方法，其中所述GSK-3β抑制剂与第二治疗剂组合施用。

15.根据实施方案14所述的方法，其中所述第二治疗剂以亚治疗量施用。

16.根据实施方案14或15所述的方法，其中所述第二治疗剂是抗癌剂。

17.根据实施方案16所述的方法，其中所述抗癌剂是凋亡调节剂、CDK调节剂或mTOR/AKT/PI3K的调节剂。

18.根据实施方案17所述的方法，其中所述抗癌剂是凋亡调节剂。

19.根据实施方案18所述的方法，其中所述凋亡调节剂是Bcl-2抑制剂。

20.实施方案19所述的方法，其中所述Bcl-2抑制剂是维奈托克、ABT-737或navitoclax。

21.根据实施方案20所述的方法，其中所述Bcl-2抑制剂是维奈托克。

22.根据实施方案17所述的方法，其中所述抗癌剂是CDK调节剂。

23.根据实施方案22所述的方法，其中所述CDK调节剂是CDK9抑制剂。

24.根据实施方案23所述的方法，其中所述CDK9抑制剂是BAY-1143572、LDC000067、Dinaciclib(SCH727965)、SNS-032(BMS-387032)、AT7519、P276-00、AZD5438、PHA-767491或PHA-793887。

25.根据实施方案24所述的方法，其中所述CDK9抑制剂是BAY-1143572。

26.根据实施方案17所述的方法，其中所述抗癌剂是mTOR/AKT/PI3K途径的调节剂。

27.根据实施方案26所述的方法，其中所述mTOR/AKT/PI3K途径的调节剂是PI3K抑制剂。

28.根据实施方案27所述的方法，其中所述PI3K抑制剂是库潘尼西或艾代拉利司。

29.根据实施方案28所述的方法，其中所述PI3K抑制剂是艾代拉利司。

Claims (17)

1.有效量的9-ING-41用于制备用于在有此需要的患者中治疗恶性淋巴增生性疾病的方法中使用的药物的用途，所述方法包括向所述患者施用有效量的9-ING-41，其中所述9-ING-41在联合治疗中与第二治疗剂组合施用，其中所述第二治疗剂是以下中的一种或更多种：5-氟尿嘧啶、乙酸阿比特龙、乙酰胆碱、曲妥珠单抗、阿法替尼、阿地白介素、阿来替尼、阿仑单抗、阿利维A酸、氨基乙酰丙酸、阿那曲唑、阿那曲唑、阿瑞匹坦、三氧化二砷、asparaginase erwinia chrysanthemi、阿特珠单抗、阿西替尼、阿扎胞苷、贝利司他、苯达莫司汀、异硫氰酸苄酯、贝伐单抗、贝沙罗汀、比卡鲁胺、博来霉素、博纳吐单抗、硼替佐米、博舒替尼、本妥昔单抗、白消安、卡巴他赛、卡博替尼、卡培他滨、卡铂、卡非佐米、卡莫司汀、色瑞替尼、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、氯法拉滨、考比替尼、克唑替尼、环磷酰胺、阿糖胞苷、达拉非尼、达卡巴嗪、达卡巴嗪、放线菌素、达雷木单抗、达沙替尼、柔红霉素、地西他滨、去纤核苷酸钠、地加瑞克、地尼白介素、地诺单抗、地塞米松、右雷佐生、二氢睾酮(DHT)、地努图希单抗、多西他赛、阿霉素、埃罗妥珠单抗、艾曲波帕、恩杂鲁胺、表柔比星、甲磺酸艾日布林、厄洛替尼、依托泊苷、依维莫司、依西美坦、依西美坦、非格司亭、磷酸氟达拉滨、氟他胺、氟维司群、氟维司群、吉非替尼、吉西他滨、吉妥单抗、吉妥珠单抗奥唑米星、羧肽酶、乙酸戈舍瑞林、羟基脲、替伊莫单抗、依鲁替尼、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、咪喹莫特、干扰素α-2b、伊匹单抗、伊立替康、伊沙匹隆、伊沙佐米、兰瑞肽、拉帕替尼、来那度胺、乐伐替尼、来曲唑、亚叶酸、亮丙瑞林、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、乙酸甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、美司钠、氨甲喋呤、丝裂霉素C、米托蒽醌、耐昔妥珠单抗、奈拉滨、奈妥匹坦、尼洛替尼、尼鲁米特、纳武单抗、奥滨尤妥珠单抗、奥法木单抗、奥拉帕尼、高三尖杉酯碱、奥西替尼、奥沙利铂、奥唑米星、紫杉醇、帕博西尼、帕利夫明、帕米膦酸盐、帕尼单抗、帕比司他、帕唑帕尼、培门冬酶、聚乙二醇干扰素α-2b、派姆单抗、培美曲塞、帕妥珠单抗、普乐沙福、泊马度胺、帕那替尼、普拉曲沙、泼尼松、甲基苄肼、普萘洛尔、二氯化镭223、雷洛昔芬、雷莫芦单抗、拉布立酶、瑞戈非尼、利妥昔单抗、罗拉吡坦、罗米地辛、罗米司亭、鲁索替尼、司妥昔单抗、sipuleucel-t、索尼德吉、索拉非尼、舒尼替尼、talimogene laherparepvec、他莫昔芬、替莫唑胺、坦罗莫司、沙利度胺、硫鸟嘌呤、噻替派、tipiracil、托泊替康、托瑞米芬、托瑞米芬、托西莫单抗、曲贝替定、曲美替尼、曲妥珠单抗、维A酸、曲氟尿苷、三乙酸尿苷、凡德他尼、维罗非尼、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、维莫德吉、伏立诺他、阿柏西普、唑来膦酸及其可药用盐。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述第二治疗剂是利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松中的一种或更多种。

3.根据权利要求1所述的用途，其中口服、静脉内和/或皮下施用所述9-ING-41。

4.根据权利要求1所述的用途，其中每天一次、每天两次或在两餐之间施用所述9-ING-41。

5.根据权利要求1所述的用途，其中口服、静脉内和/或皮下施用所述第二治疗剂。

6.根据权利要求1所述的用途，其中每天一次、每天两次或在两餐之间施用所述第二治疗剂。

7.根据权利要求1所述的用途，所述方法还包括向所述患者施用另一种非化学治疗的抗癌治疗。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述非化学治疗的抗癌治疗是放射治疗。

9.根据权利要求1所述的用途，其中所述第二治疗剂以亚治疗量施用。

10.根据权利要求1所述的用途，其中所述恶性淋巴增生性疾病是恶性B细胞淋巴增生性疾病。

11.根据权利要求10所述的用途，其中所述恶性B细胞淋巴增生性疾病是弥漫性大B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、淋巴母细胞期慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、毛细胞白血病、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症/淋巴浆细胞性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞增生失调病、浆细胞肿瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、霍奇金病或巨大淋巴结增生症。

12.根据权利要求11所述的用途，其中所述恶性B细胞淋巴增生性疾病是弥漫性大B细胞淋巴瘤。

13.根据权利要求12所述的用途，其中所述弥漫性大B细胞淋巴瘤是双打击淋巴瘤。

14.根据权利要求1所述的用途，其中所述恶性淋巴增生性疾病是恶性T细胞淋巴增生性疾病。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述恶性T细胞淋巴增生性疾病是T细胞白血病/淋巴瘤、结外自然杀伤/T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T-细胞淋巴瘤、间变性大T细胞/零位细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤、T细胞急性淋巴细胞性白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞性白血病、淋巴母细胞期慢性骨髓性白血病、移植后淋巴增生综合征、人T细胞白血病病毒I型阳性(HTLV-I⁺)成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)或未指定的T细胞淋巴瘤。

16.根据权利要求1所述的用途，其中所述恶性淋巴增生性疾病是化学治疗难治性的。

17.根据权利要求1所述的用途，其中所述9-ING-41和所述第二治疗剂在包含9-ING-41、所述第二治疗剂以及至少一种可药用载体或赋形剂的单一药物组合物中一起施用。