BR112020021685A2

BR112020021685A2 - receptores de defesa auto/aloimune para o direcionamento seletivo de células t e células nk patogênicas ativadas

Info

Publication number: BR112020021685A2
Application number: BR112020021685-2A
Authority: BR
Inventors: Maksim Mamonkin; K Brenner Malcolm; Feiyan Mo
Original assignee: Baylor College Of Medicine
Priority date: 2018-04-26
Filing date: 2019-04-25
Publication date: 2021-01-26
Also published as: JP2021521847A; CN112368013A; US20210077530A1; MX2020011288A; EP3784266A4; US20220000920A1; WO2019210081A3; AU2019260705A1; IL278245A; IL278245B2; EP3784266A2; KR20210005173A; WO2019210081A2; SG11202010577YA; CA3098184A1; IL278245B1

Abstract

As modalidades da invenção referem-se às células T de expressão do receptor de defesa auto/aloimune (ADR) planejadas que seletivamente direcionam as células T ativadas, incluindo células T patogênicas, para incapacitá-las. Os receptores quiméricos compreendem componentes para direcionar 4-1BB, OX40 e CD40L, por exemplo, cuja expressão é indicativa de células T ativadas. Nas modalidades particulares, existem métodos de prevenção ou tratamento de condições associadas com as células T ativadas utilizando a transferência adotiva de células T de células que codificam os ADRs.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "RECEP- TORES DE DEFESA AUTO/ALOIMUNE PARA O DIRECIONAMEN-

TO SELETIVO DE CÉLULAS T E CÉLULAS NK PATOGÊNICAS ATIVADAS".

[001] Este pedido reivindica a prioridade ao Pedido de Patente Provisório U.S. 62/662.817, depositado em 26 de abril de 2018, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade. DECLARAÇÃO COM RESPEITO À PESQUISA OU DESENVOLVI-

MENTO PATROCINADO PELO GOVERNO FEDERAL

[002] Esta invenção foi efetuada com o apoio governamental sob P50 CA126752 concedido pelo National Institutes of Health e o Natio- nal Cancer Institute. O governo tem certos direitos sobre a invenção.

CAMPO TÉCNICO

[003] As modalidades da invenção incluem pelo menos os cam- pos de imunologia, biologia celular, biologia molecular e medicina.

ANTECEDENTES

[004] A ativação indesejada de células T e NK muitas vezes pro- move reações aloimunes com risco de vida em pacientes que recebem transplantes ou células terapêuticas derivadas de terceiros, levando à rejeição de um órgão/tecido transplantado ou desenvolvimento da do- ença de enxerto versus hospedeiro (GvHD). Da mesma forma, a ativa- ção indesejada de células T autorreativas pode levar a condições au- toimunes devastadoras, tais como diabetes melito, colite autoimune e esclerose múltipla. Atualmente, a maioria dessas doenças não é curá- vel devido à incapacidade de seletivamente eliminar as células T pato- gênicas. Em vez disso, os pacientes são frequentemente tratados com fármacos imunossupressores que os tornam imunodeficientes e, por- tanto, suscetíveis às infecções e transformações malignas.

[005] A presente invenção fornece soluções para uma necessi- dade há muito percebida na técnica de transplante de tecido seguro e eficaz e transferência de células adotivas, incluindo a utilização de cé- lulas prontas para uso, através do aumento da capacidade das células transferidas no controle das condições patogênicas devido à ativação indesejada do sistema imunológico.

BREVE SUMÁRIO

[006] A presente invenção é direcionada às composições e mé- todos relacionados com as células utilizadas para transferência adotiva para controlar as condições patogênicas devido à ativação imune. A composição e os métodos se aplicam a células autólogas e alogêni- cas. Embora algumas etapas possam ser tomadas para reduzir a rea- tividade das células alogênicas no indivíduo receptor, tais células ain- da seriam direcionadas pelo sistema imunológico do receptor (princi- palmente células T e NK), que as reconheceria como estranhas levan- do à rejeição e limitando o benefício terapêutico.

[007] A presente invenção supera este problema mediante a mo- dificação das células de terapia adotiva para direcionar células T, NK-T e NK patogênicas ativadas para prevenir ou tratar condições médicas associadas com a sua presença. Nas modalidades particulares, as composições e métodos utilizam a transferência adotiva de células T com células que expressam receptores que seletivamente direcionam as células T patogênicas enquanto poupam as células T em repouso. Nas modalidades específicas, as células T adotivas para transferência são planejadas para expressar moléculas quiméricas que direcionam as células T patogênicas que expressam certas moléculas alvo cuja presença nas células T é indicativa de células T patogênicas. Nas mo- dalidades particulares, a invenção refere-se aos receptores de defesa auto/aloimunes (ADRs) para o direcionamento seletivo de células T patogênicas.

[008] As modalidades particulares da invenção incluem métodos de proteção de células T alogênicas planejadas da eliminação em um indivíduo hospedeiro através do fornecimento às células individuais munidas com ADRs. As modalidades também incluem métodos que evitam reações aloimunes em indivíduos que recebem transplantes de tecidos ou órgãos, por exemplo.

[009] Nas modalidades particulares, as células abrangidas pela invenção foram modificadas ou podem ser modificadas para permitir que sobrevivam em um receptor, incluindo um receptor alogênico. Em casos específicos, as células para terapia celular adotiva (incluindo células T, células NKT e assim por diante) são adequadas para serem utilizadas "produzidas em série", que nesta invenção se refere a célu- las mantidas em um repositório, ou banco, que podem ser fornecidas (com ou sem modificações adicionais) a um indivíduo com sua neces- sidade para um propósito específico. O indivíduo, em muitos casos, não é o indivíduo do qual as células foram originalmente derivadas. As células utilizadas dessa maneira podem ser pré-fabricadas para ex- pressar um ADR, embora, em alguns casos, as células foram obtidas de um banco e, posteriormente, foram modificadas para expressar um ADR. As células armazenadas em banco também podem ou não ex- pressar um CAR ou TCR recombinante, ou as células obtidas do ban- co podem, mais tarde, ser modificadas para expressar um CAR ou TCR recombinante. Essas práticas levam em conta a facilidade de uso das células terapêuticas derivadas de terceiros sem rejeição imunoló- gica por um hospedeiro e sem ter que fabricar um produto específico do paciente sempre que necessário.

[0010] Nas modalidades particulares, existe um polinucleotídeo isolado, compreendendo a sequência que codifica: (1) um ou mais de um ligante específico de OX40, um ligante específico de 4-1BB, um ligante específico de CD40L, ou seus derivados funcionais; que está ligado de maneira operável a (2) um domínio de sinalização que pro- move a ativação de células T. O polinucleotídeo pode compreender um ligante específico de OX40, um ligante específico de 4-1BB ou um ligante específico de CD40L. O ligante específico de OX40 pode ser OX40L, um anticorpo que direciona OX40, uma fusão de OX40L-Fc, ou uma combinação dos mesmos, ou qualquer outra proteína planeja- da capaz de ligação específica com o OX40. O ligante específico de 4- 1BB pode ser 4-1BBL, um anticorpo que direciona o 4-1BB, uma fusão de 4-1BBL-Fc, ou uma combinação dos mesmos, ou qualquer outra proteína planejada capaz de ligação específica com o 4-1BB. O ligante específico de CD40L pode ser CD40, um anticorpo que direciona o CD40L, uma fusão de CD40-Fc, ou qualquer outra proteína planejada capaz de ligação específica com o CD40L ou combinação dos mes- mos. Em pelo menos certos casos, o polinucleotídeo ainda compreen- de uma sequência que codifica um espaçador entre (1) e (2), tal como entre 10 e 220 aminoácidos de comprimento, por exemplo. O espaça- dor pode ter uma sequência que facilita a detecção de superfície com um anticorpo, tal como o espaçador sendo detectável com um Ab anti- Fc. O espaçador pode compreender uma parte Fc de IgG.

[0011] Nas modalidades particulares, os polinucleotídeos da in- venção podem ainda codificar um receptor de antígeno quimérico, um receptor de células T, ou ambos. O polinucleotídeo pode estar em qualquer forma, incluindo presente em um vetor, tal como um vetor viral (vetor retroviral, vetor lentiviral, vetor adenoviral ou vetor viral adenoassociado) ou vetor não viral (plasmídeo, transpóson, etc.). Em casos particulares, o polinucleotídeo está presente em uma célula, in- cluindo uma célula eucariótica ou uma célula bacteriana. A célula pode ser uma célula imune, tal como uma célula T. A célula pode ser plane- jada. A célula pode compreender um ou mais receptores de antígenos quiméricos (CARs) e/ou um ou mais receptores de células T projeta- dos (TCRs).

[0012] Os polipeptídeos expressos por qualquer polinucleotídeo incluído pela invenção são incluídos como parte da invenção. Nas mo- dalidades particulares, existe um polipeptídeo que compreende: (1) um ou mais de um ligante específico de OX40, um ligante específico de 4- 1BB e CD40; isto é, ligado de maneira operável a (2) um domínio de sinalização que promove a ativação de células T. O domínio de sinali- zação que promove a ativação de células T pode ser da subunidade CD3 zeta, DAP12, um receptor Fc ou uma combinação dos mesmos.

[0013] Qualquer célula abrangida pela invenção faz parte da in- venção. Nas modalidades específicas, qualquer célula de expressão de receptor quimérico é parte da invenção, incluindo células compre- endendo qualquer polinucleotídeo contemplado nesta invenção e/ou quaisquer polipeptídeos aqui contemplados. A célula pode ser uma célula planejada. A célula pode ser uma célula imune, tal como uma célula T, incluindo uma célula T transferida por CAR e/ou uma célula T transferida pelo receptor de célula T (TCR). Nas modalidades específi- cas, a célula é planejada para ser desprovida de expressão endógena de um ou mais genes, tal como ser desprovida de um ou mais de 4- 1BB, OX40 e/ou CD40L. A célula pode ser planejada utilizando CRISPR/Cas9, nucleases de dedo de zinco, nucleases TALE ou me- ganucleases. Alternativamente, a célula pode ser planejada para pre- venir a expressão de superfície de ligantes de ADR, por exemplo, através do aprisionamento do ligante de ADR com um anticorpo espe- cífico ou um receptor ancorado no retículo endoplasmático ou outro compartimento intracelular.

[0014] Em uma modalidade, existe um método para evitar a rejei- ção de células, tecidos ou órgãos alogênicos em um indivíduo, com- preendendo a etapa de liberar ao indivíduo uma quantidade eficaz de células imunes alogênicas que expressam um receptor quimérico pro- jetado que compreende um domínio extracelular que direciona os compostos que estão seletivamente presentes nas células T ativadas e que compreende CD3 zeta, em que a etapa de liberação resulta no que se segue no indivíduo: (1) inibição de células T alorreativas endó- genas no indivíduo; e/ou (2) supressão da ativação de células NK no indivíduo. Nas modalidades específicas, as células alogênicas são as células imunes alogênicas que expressam o receptor quimérico. As células alogênicas podem expressar um receptor de antígeno quiméri- co e/ou um receptor de células T projetado. As células imunes alogê- nicas podem ser liberadas ao indivíduo antes, durante e/ou após o transplante de tecido e/ou órgão no indivíduo. Em casos específicos, as células T ativadas são células T patogênicas.

[0015] Em uma modalidade, existe um método para seletivamente direcionar as células T ativadas em um indivíduo, compreendendo a etapa de fornecer ao indivíduo uma quantidade eficaz de células que expressam um receptor quimérico projetado, dito receptor quimérico compreendendo: (1) um extracelular domínio que direciona os com- postos que estão seletivamente presentes nas células T ativadas; e (2) um domínio de sinalização que promove a ativação de células T. O domínio de sinalização que promove a ativação de células T pode ser derivado da subunidade CD3 zeta, DAP12, um receptor Fc, qualquer sequência compreendendo ITAM ou uma combinação dos mesmos. Em casos específicos, as células T ativadas são células T patogêni- cas.

[0016] Em uma determinada modalidade, há um método para pre- venir ou tratar uma condição médica relacionada com as células T ati- vadas em um indivíduo, compreendendo a etapa de liberar ao indiví- duo uma quantidade eficaz de células imunes que expressam um re- ceptor quimérico projetado que seletivamente direciona ditas células T ativadas, dito receptor quimérico compreendendo: (1) um domínio ex- tracelular que direciona os compostos que estão seletivamente pre- sentes nas células T ativadas; e (2) um domínio de sinalização que promove a ativação de células T. A condição médica pode ser um dis- túrbio autoimune, tal como rejeição de enxerto, doença de enxerto ver- sus hospedeiro, diabetes tipo I, esclerose múltipla, colite autoimune, ou uma combinação dos mesmos, por exemplo.

[0017] Em uma modalidade, existe um método para evitar a rejei- ção do hospedeiro mediada por células NK de células T alogênicas, tecidos ou órgãos de um indivíduo, compreendendo a etapa de forne- cer ao indivíduo uma quantidade eficaz de células imunes que expres- sam um receptor quimérico projetado que compreende um domínio extracelular que direciona os compostos que estão seletivamente pre- sentes nas células T ativadas e que também compreende um domínio de sinalização que promove a ativação de células T. As células imunes que expressam o receptor quimérico projetado são as células T alogê- nicas, em certos casos. As células imunes podem expressar um recep- tor de antígeno quimérico e/ou um receptor de célula T projetado. A quantidade de células imunes que expressam o receptor quimérico projetado que são fornecidas ao indivíduo pode estar em uma faixa de 102 a 1012 por m2. As células que expressam o receptor quimérico po- dem ser fornecidas ao indivíduo sistêmica ou localmente. As células imunes podem ser células T. As células imunes podem ser liberadas ao indivíduo uma ou mais de uma vez.

[0018] O precedente descreveu de forma bastante ampla as carac- terísticas e vantagens técnicas da presente invenção, a fim de que a descrição detalhada que se segue possa ser melhor compreendida. As características e vantagens adicionais serão descritas a seguir, as quais constituem o assunto das reivindicações nesta invenção. Deve ser observado por aqueles versados na técnica que a concepção e modalidades específicas divulgadas podem ser facilmente utilizadas como uma base para modificar ou projetar outras estruturas para reali- zar os mesmos propósitos dos presentes projetos. Também deve ser percebido por aqueles versados na técnica que tais construções equi- valentes não se afastam do espírito e escopo conforme apresentado nas reivindicações anexas. As novas características que se acredita serem características dos projetos aqui divulgados, tanto quanto à or- ganização e método de operação, juntamente com outros objetos e vantagens, serão melhor compreendidas a partir da seguinte descri- ção, quando considerados em conexão com as figuras anexas. Deve ficar expressamente entendido, no entanto, que cada uma das figuras é fornecida apenas para o propósito de ilustração e descrição e não se destina a ser uma definição dos limites da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0019] Para uma compreensão mais completa da presente inven- ção, é feita agora referência às seguintes descrições tomadas em con- junto com o desenho anexo, no qual:

[0020] FIGS. 1A-1E. Os ADRs podem ser expressos na superfície das células de células imunes e promover citotoxicidade contra os res- pectivos alvos. (FIG. 1A) Esquema do ADR. GFP é opcional (FIG. 1B) Expressão do ADR na superfície celular (FIG. 1C) Expansão de célu- las T do ADR após transdução (FIG. 1D) Citotoxicidade de células T do ADR contra células-alvo que expressam ligantes de ADR (FIG. 1E) Expansão das células do tipo selvagem vs células T 4-1BB KO que expressam o ADR 4-1BB e sua citotoxicidade contra alvos 4-1BB+ mostrando que a neutralização do ligante do ADR nas células T pode aumentar ainda mais a expansão e citotoxicidade e que demonstra que a coexpressão de ADR e seu ligante nas células T não é necessá- ria para a expansão ou função das células ADR-T.

[0021] FIGS. 2A-2E. A expressão seletiva de ligantes do ADR nas células T ativadas permite sua eliminação seletiva pelas células T do ADR. (FIG. 2A a FIG. 2C) Expressão de ligantes de ADR nas células T em repouso vs ativadas após estimulação do TCR. (FIG. 2D) Ausência de citotoxicidade das células T do ADR contra células T CD4+ e CD8+ em repouso (FIG. 2E) Eliminação de células T CD4+ e CD8+ ativadas por células T do ADR após uma cocultura de 48 h.

[0022] FIGS. 3A-3F. A expressão do ADR 4-1BB protege as célu- las T da rejeição imune em um modelo MLR (FIG. 3A) Gráficos de pontos representativos que mostram as células T TCRKO que coex- pressam o ADR são protegidas da rejeição após a cocultura com PBMC alogênicas em uma relação de 1:10 ADR T: PBMC. (FIG. 3B a FIG. 3C) Contagens absolutas de células T do doador e células T alo- gênicas nas PBMC durante a cocultura (FIG. 3D a FIG. 3F) mesmo para células T do ADR específicas de vírus.

[0023] FIGS. 4A-4C. A expressão de ADR protege as células T específicas de vírus alogênicas da rejeição imune em uma reação de linfócitos mistos in vitro (FIG. 4A) Gráficos de pontos representativos mostrando ADR VST são protegidos da rejeição imune pelas PBMC alogênicas do receptor (FIG. 4B a FIG. 4C) Contagens absolutas de células T do receptor e VST do doador em vários momentos durante MLR.

[0024] FIG. 5. Os ADR VSTs retêm a função antiviral. Os ADR VSTs foram cocultivados com monócitos pulsados com pepmix viral e as contagens de monócitos indicaram que eles eliminaram as células infectadas por vírus igualmente bem em comparação com os VSTs não modificados.

[0025] FIGS. 6A-6H. As células NK ativadas suprarregulam os li- gantes de ADR e podem ser seletivamente direcionadas por células T do ADR (FIG. 6A a FIG. 6B) Expressão de 4-1BB nas células NK em repouso vs ativadas (FIG. 6C) Contagens residuais de células NK em repouso vs ativadas após 24 horas de cocultura com células T do ADR 4-1BB (FIG. 6D) As células T do ADR que carecem de MHC são pro- tegidas da rejeição imune pelas PBMC alogênicas mediante o controle da expansão de células NK (FIG. 6E) Contagens absolutas de células T do doador e células NK alogênicas durante a cocultura. (FIG. 6F) Células T do ADR que carecem de MHC resistem à rejeição imune por células NK após uma cocultura de 48 h em uma relação de E:T de 1:1. (FIG. 6G a FIG. 6H) As células T do ADR controlam a expansão de células NK alorreativas durante MLR com PBMC, com contagens ab- solutas de células NK marcadas em gráfico em H.

[0026] FIGS. 7A-7E. A expressão de ADR protege as células T alogênicas da rejeição imune in vivo (FIG. 7A) Esquema do modelo de camundongo de rejeição imune, em que os camundongos receberam células T de um doador HLA-A2+ após uma irradiação subletal, segui- da pela administração de células T HLA-A2- alogênicas 4 dias depois. (FIG. 7B a FIG. 7C) As células T de controle do doador HLA-A2- foram rejeitadas no Dia 18, enquanto que as células que expressam ADR foram protegidas (FIG. 7C). Contagens absolutas de células T de doa- dores HLA-A2+ e HLA-A2- em vários momentos. (FIG. 7D) Modelo in vivo modificado em que em vez de células T alogênicas, os camun- dongos receberam PBMC inteiras (contendo células tanto T quanto NK) do doador 1. (FIG. 7E) Gráficos de fluxo representativos mostran- do que as células T do ADR foram protegidas da rejeição imune e também protegeram camundongos do início rápido de GvHD fatal.

[0027] FIGS. 8A-8E. A coexpressão de CAR e ADR preserva as funções de ambos os receptores (FIG. 8A) Representação esquemáti- ca de uma célula imune que coexpressa o ADR e um CAR (FIG. 8B) Coexpressão de CAR e ADR na superfície celular (FIG. 8C) Citotoxici- dade de células T do CAR-ADR contra NALM-6 (alvo CD19+ CAR) (FIG. 8D) Citotoxicidade de células T CAR-ADR contra células T ativa- das (alvo de ADR) (FIG. 8E) Atividade citotóxica de células T CAR- ADR contra ambos os alvos após a cocultura simultânea com ambos os alvos celulares.

[0028] FIGS. 9A-9E. As células T CAR-ADR são protegidas da re- jeição imune e exercem atividade antitumoral potente (FIG. 9A) Es- quema do modelo de camundongo. Os camundongos receberam célu- las T alogênicas do doador 1 e b2mKO NALM6 com 24 horas à parte, seguido por uma dose única de células T CAR-ADR do doador 2. (FIG. 9B) Cinética de células T do doador 2 no sangue periférico (FIG. 9C) Cinética de células T do doador 1 nos grupos experimentais (FIG. 9D) Carga de leucemia em camundongos (FIG. 9E), sobrevida total de camundongos.

[0029] FIGS. 10A-10C. As células T CAR-ADR são protegidas da rejeição imunológica e exercem atividade antitumoral potente em um modelo de tumor sólido. (FIG. 10A) Esquemático do modelo de ca- mundongo. Os camundongos receberam células T alogênicas do Doa- dor 1 e linhagem celular de neuroblastoma b2mKO CHLA255 com 24 horas à parte, seguido por uma dose única de células T CAR-ADR do doador 2. (FIG. 10B) As células T CAR do doador 2 GD2 foram rejei- tadas por D18, enquanto que as células T CAR-ADR resistiram a rejei- ção alogênica e persistiram no sangue periférico. (FIG. 10C) Carga tumoral em camundongos, * indica mortes associadas com GvHD xe- nogênico no grupo ATC+GD2 CAR T.

[0030] FIGS. 11A-11E. Células T CAR-ADR neutralizadas por TCR são protegidas da rejeição imune e exercem atividade antitumoral po- tente (FIG. 11A) Esquema do modelo de camundongo. Os camundon- gos receberam células T alogênicas do doador 1 e b2mKO NALM6 com 24 h separadamente, seguido por uma dose única de células T CAR-ADR editadas por TCR do doador 2. (FIG. 11B) Cinética de célu- las T do doador 2 no sangue periférico (FIG. 11C) Cinética de células T do doador 1 nos grupos experimentais (FIG. 11D) Carga de leuce- mia em camundongos (FIG. 11E), sobrevida total de camundongos.

[0031] FIGS. 12A-12D. As células T do ADR protegem camundon-

gos contra GvHD xenogênico fatal (FIG. 12A) Esquema do modelo (FIG. 12B) Expansão de células T do ADR marcadas com FFLuc in vivo (FIG. 12C) Cinética de ganho/perda de peso em camundongos (FIG. 12D) Sobrevivência total de camundongos.

[0032] FIGS. 13A-13G. ADR de 2a geração com domínio de sinali- zação intracelular CD28 (ADR.28zeta). (FIG. 13A) Estrutura de ADR.28zeta. (FIG. 13B a FIG. 13C) citotoxicidade in vitro de ADR.28zeta contra linhagens celulares de expressão do alvo. (FIG. 13D- FIG. 13G) ADR.28zeta protegeu camundongos de xeno-GvHD. (FIG. 13D) Esquema do modelo (FIG. 13E) Expansão de células T ADR.28zeta marcadas com FFLuc in vivo (FIG. 13F) Cinética de ga- nho/perda de peso em camundongos (FIG. 13G) Sobrevivência total de camundongos.

[0033] FIG. 14. Citotoxicidade de células de expressão de ADR no câncer. (esquerda) Citotoxicidade de células T de expressão de ADR 4-1BB contra células de linfoma de Hodgkin HDLM-2 (direita) Citotoxi- cidade de células T de expressão de ADR 4-1BB contra células K562 de leucemia mielóide crônica (CML). São mostradas contagens abso- lutas de células tumorais após uma cocultura de 48 h em uma relação de efetor para alvo de 1:1.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0034] Conforme utilizado nesta invenção, as palavras "um" e "uma", quando utilizadas no presente relatório descritivo em conjunto com a palavra compreendendo, incluindo as reivindicações, significam "um ou mais". Algumas modalidades da invenção podem consistir em ou consistir essencialmente em um ou mais elementos, etapas do mé- todo e/ ou métodos da invenção. É contemplado que qualquer método ou composição aqui descrito pode ser implementado em relação a qualquer outro método ou composição aqui descrito.

[0035] Ao longo deste relatório descritivo, a menos que o contexto exija o contrário, as palavras "compreender", "compreende" e "com- preendendo" serão entendidas de implicar a inclusão de uma etapa ou elemento declarado ou grupo de etapas ou elementos, mas não a ex- clusão de qualquer outra etapa ou elemento ou grupo de etapas ou elementos. Por "consistindo em" entende-se incluindo e limitado a tudo o que segue a frase "consistindo em". Assim, a frase “consistindo em” indica que os elementos listados são requeridos ou obrigatórios e que nenhum outro elemento pode estar presente. Por "consistindo essen- cialmente em" entende-se incluindo quaisquer elementos listados após a frase e limitados a outros elementos que não interferem ou contribu- em com a atividade ou ação especificada na invenção com relação aos elementos listados. Assim, a frase "consistindo essencialmente em" indica que os elementos listados são necessários ou obrigatórios, mas que nenhum outro elemento é opcional e pode ou não estar pre- sente dependendo se afetam ou não a atividade ou ação dos elemen- tos listados.

[0036] Referência ao longo deste relatório descritivo a “uma moda- lidade”, “uma modalidade”, “uma modalidade particular”, “uma modali- dade relacionada”, “uma certa modalidade”, “uma modalidade adicio- nal” ou “uma outra modalidade” ou suas combinações significa que um aspecto, estrutura ou aspecto particular descrita em conexão com a modalidade está incluída em pelo menos uma modalidade da presente invenção. Assim, as aparições das frases anteriores em vários lugares ao longo deste relatório descritivo não se referem necessariamente à mesma modalidade. Além disso, os aspectos, estruturas ou caracterís- ticas particulares podem ser combinados de qualquer maneira ade- quada em uma ou mais modalidades.

[0037] O termo "indivíduo", conforme aqui utilizado, geralmente se refere a um indivíduo com necessidade de uma terapia para uma con- dição médica de qualquer tipo. Um indivíduo pode ser um animal de qualquer espécie. O indivíduo pode ser qualquer organismo ou indiví- duo animal que seja objeto de um método ou material, incluindo mamí- feros, por exemplo, seres humanos, animais de laboratório (por exem- plo, primatas, ratos, camundongos, coelhos), animais de fazenda (por exemplo, vacas, ovelhas, cabras, porcos, perus e galinhas), animais domésticos (por exemplo, cães, gatos e roedores), cavalos e animais transgênicos não humanos. O indivíduo pode ser um paciente, por exemplo, tem ou é suspeito de ter uma doença (que pode ser referida como uma condição médica), tal como uma ou mais doenças infeccio- sas, um ou mais distúrbios genéticos, um ou mais cânceres, ou qual- quer combinação dos mesmos. A doença pode ser patogênica. O indi- víduo pode estar passando ou ter sido submetido a tratamento com antibióticos. O indivíduo pode ser assintomático. O indivíduo pode ser pessoas saudáveis. O termo "pessoa" pode ser utilizado de modo tro- cável, em pelo menos alguns casos. O "indivíduo" ou "pessoa", con- forme utilizado nesta invenção, pode ou não ser alojado em uma insta- lação médica e pode ser tratado como um paciente ambulatorial de uma instalação médica. A pessoa pode estar recebendo uma ou mais composições médicas pela internet. Um indivíduo pode compreender qualquer idade de um animal humano ou não humano e, portanto, in- clui tanto adultos quanto jovens (isto é, crianças) e bebês e inclui indi- víduos no útero. O indivíduo pode ser de qualquer raça e gênero. Não se pretende que o termo implique uma necessidade de tratamento médico, portanto, um indivíduo pode voluntária ou involuntariamente fazer parte do experimento, seja clínica ou para apoiar estudos cientí- ficos básicos.

[0038] O termo "planejado" como aqui utilizado, refere-se a uma molécula que não está presente na natureza e foi gerada pela mão do homem, tal como por técnicas de recombinação genética padrão na técnica.

[0039] No contexto da presente invenção, uma "quantidade eficaz" ou uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade de células que, quando administrada a um indivíduo, leva em conta o direcionamento de células T ativadas e/ou alivia os sinais e/ou sinto- mas de uma condição médica ou previne uma condição médica. A quantidade real a ser administrada pode ser determinada com base em estudos feitos in vitro ou in vivo, onde as células imunes funcionais apresentam atividade farmacológica contra uma condição médica. I. Receptores de Defesa Auto/Aloimune e Suas Composições e Uso

[0040] A presente invenção abrange moléculas receptoras quimé- ricas sintéticas que fornecem o direcionamento seletivo de células T ativadas, incluindo células T patogênicas. As moléculas planejadas são sintéticas e podem ser produzidas pela tecnologia recombinante. As moléculas podem ser referidas como receptores de defesa au- to/aloimunes que direcionam as células T ativadas, incluindo células T patogênicas ativadas, incluindo com alta especificidade.

[0041] Nas modalidades particulares, os receptores de defesa au- to/aloimunes (ADRs) compreendem uma entidade que direciona um ou mais compostos que são suprarregulados nas células T ativadas. Em- bora o composto que é suprarregulado em células T ativadas possa ser qualquer um ou uma combinação dos mesmos, nas modalidades específicas OX40, 4-1BB e CD40L são suprarregulados em células T ativadas e são os objetos dos quais os ADRs são direcionados. Os ADRs estão presentes nas células imunes alogênicas que são alogê- nicas em relação ao indivíduo que recebe as células, nas modalidades particulares. Em outros casos, os ADRs são expressos em células T autólogas, células xenogênicas e/ou células sintéticas. A. Moléculas do Receptor de Defesa Auto/Aloimune (ADR)

[0042] As moléculas de ADR são sintéticas, não naturais e produ-

zidas pela mão do homem e compreendem pelo menos (1) um domí- nio extracelular que direciona os compostos que estão seletivamente presentes nas células T ativadas (e nas modalidades específicas, o domínio extracelular é uma proteína ou fragmento funcional ou deriva- do do mesmo que direciona um ou mais compostos que são suprarre- gulados nas células T ativadas); que está ligado de maneira operável a (2) um domínio de sinalização que promove a ativação de células T, incluindo aqueles derivados da subunidade CD3 zeta, DAP12 e recep- tores Fc, ou outra sequência compreendendo ITAM, por exemplo. A molécula de ADR pode compreender ou consistir em ou consistir es- sencialmente nos elementos (1) e (2). Em pelo menos certos casos, o ADR compreende um ou mais componentes de uma proteína da transmembrana Tipo I e/ou um ou mais componentes de uma proteína da transmembrana Tipo II.

[0043] Nas modalidades específicas, na molécula de ADR, o do- mínio extracelular compreende uma proteína que se liga seletivamente a uma proteína associada em uma célula T ativada. Por exemplo, o domínio extracelular de ADR pode compreender um ligante para um receptor em uma célula T ativada, ou o domínio extracelular de ADR pode compreender um receptor para um ligante em uma célula T ati- vada.

[0044] Nas modalidades específicas, na molécula de ADR, o do- mínio extracelular compreende um ligante para OX40, um ligante para 4-1BB e/ou CD40. Estes exemplos particulares possuem proteínas as- sociadas em células T ativadas que são OX40, 4-1BB e CD40L, res- pectivamente. Nas modalidades alternativas, outras composições par- ticulares nas células T ativadas são direcionadas. Por exemplo, pode- se direcionar outros marcadores de ativação que são suprarregulados na superfície celular de células T (como CD69, CD25, CD71, etc.), po- dem ser direcionados utilizando uma abordagem semelhante. Nesses casos, a molécula de ADR correspondente teria um ligante respectivo CD69, CD25 ou CD71, ou um componente de direcionamento deriva- do de anticorpo, em vez de ligantes específicos de 4-1BB/OX40.

[0045] Em alguns casos, as células T ativadas são direcionadas que possuem suprarregulação da expressão de OX40, em contraste com as células T que não são ativadas. Para direcionar essas células T ativadas, um ligante de OX40 pode ser utilizado no ADR para ser capaz de direcionar as células T ativadas. Nos casos em que um ligan- te para OX40 é utilizado no ADR, o ligante para OX40 pode ser qual- quer ligante adequado para OX40 incluindo pelo menos OX40L, um anticorpo (ou fragmento funcional do mesmo) que se liga a OX40, uma fusão de Fc com OX40L, ou derivados funcionais ou seus fragmentos. OX40L também pode ser referido como superfamília do fator de ne- crose tumoral (ligante), membro 4 (glicoproteína 1, 34kDa ativada pela transcrição fiscal), OX40L, CD252, TNFSF4, TXGP1, OX-40L ou gp34.

[0046] Em alguns casos, as células T ativadas são direcionadas que possuem suprarregulação da expressão de 4-1BB, em contraste com as células T que não são ativadas. Para direcionar essas células T ativadas, um ligante de 4-1BB poderia ser utilizado no ADR para ser capaz de direcionar as células T ativadas. Nos casos em que um ligan- te para 4-1BB é utilizado no ADR, o ligante para 4-1BB pode ser qual- quer ligante adequado para 4-1BB incluindo 4-1BBL, um anticorpo (ou fragmento funcional do mesmo) que tem como alvo 4-1BB, um fusão de Fc com 4-1BBL, ou derivados funcionais ou fragmentos dos mes- mos.

[0047] Em certos casos, as células T ativadas são direcionadas que possuem sobrerregulação da expressão de CD40L, em contraste com as células T que não são ativadas. Para direcionar essas células T ativadas, um receptor para CD40L poderia ser utilizado no ADR para ser capaz de direcionar as células T ativadas. Nos casos em que um receptor para CD40L é utilizado no ADR, o ADR pode compreender CD40 (que também pode ser referido como Bp50, CDW40, TNFRSF5 ou p50), um anticorpo (ou fragmento funcional do mesmo) que tem como alvo o CD40L ou seus derivados ou fragmentos funcionais.

[0048] Em alguns casos, a molécula de ADR compreende dois ou mais domínios extracelulares para facilitar o direcionamento das célu- las T ativadas. Tais combinações podem aumentar o direcionamento de células T ativadas de uma forma geral ou podem permitir o direcio- namento específico de certos subconjuntos de células T ativadas. Por exemplo, o ADR pode compreender OX40L e 4-1BBL como domínios extracelulares na mesma molécula de ADR para levar em conta o di- recionamento de células T ativadas que expressam OX40 ou 4-1BB. Tal exemplo de uma combinação teria como alvo seletivo as células T ativadas que expressam OX40 ou 4-1BB, independentemente de es- sas células T ativadas também expressarem CD40L ou não. Analoga- mente, os ADRs podem compreender CD40 e OX40L para direcionar as células T ativadas que expressam CD40L ou OX40, independente- mente de essas células T ativadas também expressarem 4-1BB.

[0049] Na molécula de ADR, o domínio extracelular pode ser liga- do de maneira operável a um ou mais componentes, incluindo compo- nentes que fazem parte da molécula de ADR. Um desses componen- tes pode ser uma proteína que atua como mediador da sinalização a jusante durante a ativação de células T. Nas modalidades particulares, o ADR compreende CD3zeta (também referido como CD247, CD3- ZETA, CD3H, CD3Q, CD3Z, IMD25, T3Z ou TCRZ) ou um fragmento funcional ou derivado do mesmo. O CD3zeta atua como mediador da sinalização derivada de ITAM a jusante durante a ativação de células T. Outros domínios de sinalização contendo ITAM podem incluir aque- les derivados de DAP12, receptores Fc, outras subunidades CD3, etc. Os domínios de sinalização podem ser não covalentemente ligados ao

ADR por meio de outro domínio.

[0050] Nas modalidades particulares, o ADR compreende um es- paçador entre o CD3 zeta e a proteína extracelular que direciona um ou mais compostos que são suprarregulados nas células T ativadas. Em outros casos, um espaçador não é utilizado. O espaçador pode compreender uma sequência que é inerte ou contribui substancialmen- te com pouco ou nada em relação a qualquer função que o ADR possa ter, enquanto que em outros casos o espaçador compreende uma se- quência que aumenta uma função do ADR e/ou permite que seja de- tectável e/ou capaz de ser direcionado para inibição, como exemplos. Nas modalidades específicas, o espaçador compreende a sequência de proteína codificada que facilita a detecção de células que expres- sam o ADR. Por exemplo, o espaçador pode codificar a região Fc ou seus fragmentos que permitiriam a detecção de superfície das células, tal como o uso de Abs anti-Fc. Nas modalidades particulares, o espa- çador fornece separação entre o domínio de ligação ao ligante e a membrana para evitar potenciais obstáculos estéricos, tais como aque- les provocados pela junção de proteínas da transmembrana Tipo II (4- 1BBL, OX40L) com a estrutura de ADR Tipo I (TM, domínios de sinali- zação). O espaçador pode ter qualquer comprimento adequado, inclu- indo cerca de 10 a 220 aminoácidos como exemplo. O comprimento do espaçador pode estar em uma faixa de 10 a 220, 10 a 200, 10 a 150, 10 a 100, 10 a 50, 25 a 200, 25 a 150, 25 a 100, 25 a 75, 25 a 50, 50 a 200, 50 a 150, 50 a 125, 50 a 100, 50 a 75, 75 a 200, 75 a 150, 75 a 100, 100 a 200, 100 a 175, 100 a 150, 100 a 125, 125 a 200, 125 a 175, 125 a 150, 150 a 200, 150 a 175, 175 a 200, e assim por diante. O espaçador pode estar ao redor de 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210 ou 220 aminoácidos de comprimento. Em outros casos, o espaçador possui menos de 10 aminoácidos ou mais de 200 aminoácidos.

[0051] Em alguns casos, os ADRs compreendem um, dois, três ou mais domínios coestimuladores que aumentam a produção de citoci- nas a partir das células que expressam o ADR. Os domínios coestimu- ladores podem ser derivados dos domínios de sinalização intracelular de proteínas coestimuladoras, incluindo CD28, CD27, 4-1BB, OX40, ICOS, CD30, HVEM, CD40 e assim por diante. Apenas a título de exemplo, quando o ADR compreende 4-1BBL, o domínio coestimula- dor do ADR pode ou não ser de 4-1BB.

[0052] Em algumas modalidades, os ADRs compreenderão um domínio da transmembrana que pode ser de qualquer tipo, contanto que permita que o componente CD3 zeta do ADR seja localizado in- tracelularmente e o domínio extracelular que direciona um ou mais compostos que são suprarregulados nas células T ativadas para se- rem localizadas extracelularmente. Em outros casos, os ADRs são proteínas solúveis que podem se ligar ao respectivo ligante em células T ativadas e promover citotoxicidade por reticulação de TCR (por exemplo, proteína de envolvimento de células T ADR-CD3). Em um caso em que o domínio extracelular é de uma proteína de superfície com um domínio da transmembrana (CD40, por exemplo), o ADR po- de compreender o domínio da transmembrana daquela molécula en- dógena correspondente. Em alguns casos em que a molécula de ADR compreende um ou mais domínios coestimuladores, o domínio da transmembrana (TM) pode ser da mesma molécula endógena que possui o domínio coestimulador. Exemplos de TMs incluem aqueles de CD3, CD8α, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD4, etc.

[0053] Em um exemplo de um polipeptídeo do ADR, os componen- tes podem estar em uma ordem particular de N-terminal (N) para C- terminal (C). Para um ADR geral, o receptor pode compreender um dos seguintes (apenas como exemplos) e em que o domínio extracelu-

lar compreende a proteína que se liga seletivamente a uma proteína associada em uma célula T ativada: domínio N-extracelular-domínio de sinalização-C domínio N-extracelular-CD3zeta-C domínio N-extracelular-espaçador-CD3zeta-C domínio N-extracelular-espaçador-domínio coestimulador- CD3zeta-C domínio N-extracelular-espaçador-dois domínios coestimu- ladores-CD3zeta-C dois domínios N-extracelulares-espaçador-domínio coesti- mulador-CD3zeta-C dois domínios N-extracelulares-espaçador-dois domínios co-estimuladores-CD3zeta-C

[0054] Em qualquer caso, o domínio da transmembrana pode ser C-terminal em relação ao espaçador. Um peptídeo de sinal no N- terminal pode ser utilizado para facilitar a expressão de ligantes do Ti- po II (tais como OX40L e 4-1BBL) em uma estrutura de proteína da transmembrana Tipo I (tal como o domínio da transmembrana, domí- nios de sinalização, CD3 zeta).

[0055] Em alguns casos, o ADR compreende um ou mais marca- dores detectáveis, tais como marcadores que são colorimétricos, fluo- rescentes e/ou radioativos, e assim por diante. Os exemplos incluem proteína verde fluorescente, proteína azul fluorescente, e assim por diante.

[0056] O ADR pode estar na forma de um polinucleotídeo ou poli- peptídeo expresso por um polinucleotídeo, embora o ADR possa ser gerado sinteticamente como uma proteína. A tecnologia recombinante para produzir polinucleotídeos e polipeptídeos do ADR é conhecida na técnica.

[0057] Em certos casos, um polinucleotídeo do ADR está em uma construção de expressão ou faz parte de uma construção de expres- são presente em um vetor que pode ser um vetor viral ou um vetor não viral. Exemplos de vetores não virais incluem plasmídeos. Exemplos de vetores virais incluem vetores virais lentivirais, retrovirais, adenovi- rais e adenoassociados. Qualquer vetor que expressa o ADR terá elementos apropriados para permitir a expressão em uma célula euca- riótica, incluindo uma célula imune, tal como uma célula T, célula NK ou célula NKT, por exemplo. Tais elementos apropriados incluem pro- motores e assim por diante. ADR 4-1BB (SEQ ID NO: 1)

MEFGLSWLFLVAILKGVQCGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWY SDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEG SGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLL HLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSP RSEESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLA CYSLLVTVAFIIFWVRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRRE EYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIG MKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRTSAAAGGG GSGGGGSGGGGSMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGE GEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFTYGVQCFARYPDHMK QHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELK GIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHKVYITADKQKNGIKVNFKTRHNIEDG SVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHMVLL EFVTAAGITLGMDELYK

[0058] ADR OX40 (SEQ ID NO: 2)

MEFGLSWLFLVAILKGVQCQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTS QKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQ LKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQN PGEFCVLESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVG GVLACYSLLVTVAFIIFWVRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNL GRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRTSAAA GGGGSGGGGSGGGGSMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSV SGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFTYGVQCFARYPD HMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRI ELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHKVYITADKQKNGIKVNFKTRHNIE DGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHM VLLEFVTAAGITLGMDELYK

[0059] ADR CD40L (SEQ ID NO: 3)

MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQK LVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQ QKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGV SDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDV VCGPQDRLRESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVV VGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNEL NLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAE AYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRTSA AAGGGGSGGGGSGGGGSMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKF SVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFTYGVQCFARY PDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLV NRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHKVYITADKQKNGIKVNFKTRH NIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRD HMVLLEFVTAAGITLGMDELYK

[0060] Em certas modalidades, o domínio extracelular que direcio-

na as células T ativadas compreende um anticorpo ou fragmento fun- cional ou derivado do mesmo. O termo "anticorpo", conforme aqui utili- zado, refere-se a uma molécula de imunoglobulina que se liga especi- ficamente a um antígeno. Os anticorpos podem ser imunoglobulinas intactas derivadas de fontes naturais ou de fontes recombinantes e podem ser porções imunorreativas de imunoglobulinas intactas. Os anticorpos são tipicamente tetrâmeros de moléculas de imunoglobuli- na. Os anticorpos na presente invenção podem existir em uma varie- dade de formas incluindo, por exemplo, anticorpos policlonais, anticor- pos monoclonais, Fv, Fab e F(ab)2, assim como anticorpos de cadeia única e anticorpos humanizados (Harlow et al., 1999, In: Using Antibo- dies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).

[0061] Em alguns casos, o domínio extracelular do ADR compre- ende um fragmento de anticorpo. O termo "fragmento de anticorpo" refere-se a uma parte de um anticorpo intacto e refere-se às regiões variáveis determinantes antigênicas de um anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não são limitados a estes, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv, anticorpos lineares, anticorpos scFv e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticor- pos.

[0062] Anticorpos sintéticos podem ser utilizados no ADR. Pelo termo "anticorpo sintético" conforme aqui utilizado, entende-se um an- ticorpo que é gerado utilizando tecnologia de DNA recombinante, tal como, por exemplo, um anticorpo expresso por um bacteriófago como aqui descrito. O termo também deve ser interpretado de significar um anticorpo que foi gerado pela síntese de uma molécula de DNA que codifica o anticorpo e cuja molécula de DNA expressa uma proteína de anticorpo, ou uma sequência de aminoácido que especifica o anticor- po, em que o DNA ou a sequência de aminoácido foi obtido utilizando DNA sintético ou tecnologia de sequência de aminoácido que está dis- ponível e é bem conhecida na técnica. B. Células que expressam ADRs

[0063] Células alogênicas utilizadas para transferência adotiva são propensas a ter eficácia limitada por causa da reação imune do indiví- duo receptor. Embora, em alguns casos, as células possam ser modi- ficadas para remover o TCR endógeno (tal como com CRISPR), por exemplo, para prevenir a doença do enxerto versus hospedeiro, alter- nativamente pode-se utilizar células T específicas do vírus (intactas ou modificadas com CAR/TCR) para reter a atividade antiviral, que é útil em certas condições patológicas. Embora tais VSTs tenham atividade de enxerto versus hospedeiro muito limitada por causa de seus TCRs serem mais restritos a antígenos virais, eles ainda são suscetíveis a reações deletérias por parte do receptor.

[0064] Incluídas na invenção estão células que são melhoradas para uso alogênico por serem modificadas para expressar uma molé- cula de ADR sintética. Assim, a divulgação inclui células que abrigam o ADR como um polinucleotídeo e como um polipeptídeo de ADR ex- presso na superfície das células. Em casos particulares, as células de expressão de ADR são produzidas com o propósito de serem manti- das em um repositório para uso comercial. As células podem ser alo- jadas em um repositório já configurado para expressar um ADR ou po- dem ser alojadas em um banco e configuradas para expressar um ADR após a recuperação do repositório. Certas células, tais como cé- lulas bacterianas, podem ser utilizadas para gerar as moléculas de ADR, enquanto outras células, tais como células eucarióticas, que abrigam o ADR, podem ser utilizadas para os métodos da invenção, incluindo o direcionamento de células T ativadas. Como mostrado nessa invenção, as células imunes que expressam ADR eliminam se- letivamente as células T ativadas e as células imunes de expressão de ADR são protegidas contra a citólise por células T alorreativas.

[0065] As células que expressam a molécula de ADR podem ser de qualquer tipo, mas nas modalidades específicas, elas são células imunes, por exemplo, células efetoras imunes, tais como células T, células NK, células NKT ou linhagens celulares derivadas das referi- das linhagens ou planejadas para ter atividade citotóxica que foi modi- ficada para expressar o ADR e, portanto, não são encontradas na na- tureza. Populações das células não naturais de expressão de ADR são contempladas, incluindo populações que são pelo menos 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% da população sendo células de expressão de ADR. As células podem ser geradas por mé- todos padrão de transfecção ou transdução de polinucleotídeos de ADR sintéticos, como um exemplo.

[0066] Em alguns casos, as moléculas de ADR que foram modifi- cadas para expressar a molécula de ADR podem já ter sido projetadas ou subsequentemente são projetadas para ter outra molécula não na- tural projetada diferente do ADR. Por exemplo, as células que expres- sam receptores de antígenos quiméricos (CAR) ou receptores de célu- las T manipuladas (TCR) e, ao fazê-lo, podem proteger essas células contra a rejeição do hospedeiro e, portanto, aumentar a sua potência terapêutica. As células que expressam um ou mais CARs e/ou um ou mais TCRs podem ser planejadas para expressar um ou mais ADRs, ou as células que expressam um ou mais ADRs podem ser planejadas para expressar um ou mais CARs e/ou um ou mais TCRs. Assim, em alguns casos, um ADR é expresso em um vetor diferente de um CAR e/ou TCR, mas em outros casos uma molécula de ADR é expressa no mesmo vetor que um CAR e/ou TCR. Nos casos em que um ADR é expresso no mesmo vetor que um CAR (como um exemplo), a expres-

são de ADR e CAR pode ser direcionada a partir dos mesmos ou dife- rentes elementos reguladores. Em qualquer caso, o ADR e o CAR po- dem ser expressos como um único polipeptídeo com um elemento cli- vável entre eles, tal como 2A.

[0067] Nos casos em que as células de expressão de ADR tam- bém expressam um CAR ou TCR, o CAR ou TCR pode direcionar qualquer antígeno particular. Nos casos em que os CARs são empre- gados, os CARs podem ser de primeira geração, segunda geração, terceira geração e assim por diante. O CAR pode ser biespecífico, em casos específicos.

[0068] Em alguns casos, as células que expressam as moléculas de ADR são planejadas, tais como planejadas para serem desprovidas de expressão de uma ou mais moléculas endógenas. Em casos espe- cíficos, as células são planejadas para serem desprovidas de expres- são de um ou mais genes endógenos que, de outra forma, facilitariam o fratricídio das células. Em casos específicos, as células que expres- sam as moléculas de ADR são projetadas para serem desprovidas de expressão de 4-1BB ou OX40, por exemplo. A engenharia das células pode ocorrer por CRISPR/Cas9, apenas a título de exemplo. II. Métodos de Uso de Receptores de Defesa Auto/Aloimune

[0069] As modalidades da divulgação incluem métodos para for- necer uma quantidade eficaz de células de expressão de ADR a um indivíduo para qualquer propósito. Os métodos incluem o fornecimento de células T ativadas de direcionamento seletivo em um indivíduo para qualquer propósito. As células T ativadas são direcionadas pela expo- sição de células T ativadas a uma quantidade eficaz de células imunes de expressão de ADR, tais como células T que expressam ADR. Tal exposição pode ter uma ou mais aplicações resultantes, por exemplo.

[0070] Em algumas modalidades, os ADRs são utilizados para se- letivamente direcionar as células imunes ativadas diferentes das célu-

las T ativadas, tais como células B (que seriam úteis para o controle das respostas indesejadas de células B, tais como com lúpus, artrite reumatóide, etc.), assim como direcionar a ativação da imunidade ina- ta (tal como a síndrome de ativação de macrófagos, e assim por dian- te). Em outras modalidades, os ADRs são utilizados para especifica- mente direcionar as células malignas que expressam seu alvo corres- pondente, incluindo 4-1BB ou OX40 ou CD40L, por exemplo.

[0071] O regime para fornecer a um indivíduo uma quantidade efi- caz de células de expressão de ADR pode ser conhecido ou determi- nado por um indivíduo ou indivíduos que liberam as células para tera- pia ou prevenção, ou independentemente do método de uso. Em ca- sos preventivos, por exemplo, as células podem ser liberadas antes da detecção de um ou mais sintomas, ou as células podem ser liberadas após a detecção de um ou mais sintomas, mas antes de desenvolver e/ou piorar outros sintomas. Para os casos de tratamento, o indivíduo pode receber a quantidade eficaz de células após o desenvolvimento de um, dois ou mais sintomas e pode ser após o diagnóstico clínico.

[0072] Em aspectos específicos dos métodos, o indivíduo pode receber uma única dose de uma quantidade terapeuticamente eficaz de células, ou o indivíduo pode receber várias liberações da quantida- de terapeuticamente eficaz das células, tais como múltiplas liberações separadas por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 dias, ou 1, 2, 3 ou 4 semanas, ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses, ou 1, 2, 3, 4, 5 ou mais anos, ou qualquer faixa entre eles, por exemplo. O tempo entre as doses pode variar em um único regime.

[0073] A administração das células de expressão de ADR pode ser através de qualquer via adequada para o indivíduo, incluindo local ou sistemicamente. Nas modalidades específicas, as células de expres- são de ADR são distribuídas por via intravenosa, por via oral, por via retal, por via tópica, por via intramuscular, por infusão, por via entérica,

por via nasal, por inalação, por via sublingual, por via bucal, por via transdérmica, por via subcutânea, e assim por diante. As células po- dem ou não ser liberadas como um bolo. Com múltiplas administra- ções, as células podem ou não ser fornecidas ao indivíduo em diferen- tes vias de liberação. Quando as células são liberadas a um indivíduo, elas podem ser liberadas em um veículo ou excipiente farmaceutica- mente aceitável. Exemplos particulares de doses para células de ex- pressão de ADR incluem 104 células/m2, 105 células/m2, 106 célu- las/m2, 107 células/m2, 108 células/m2, 109 células/m2, 1010 células/m2, 1011 células/m2 ou 1012 células/m2 e as faixas entre eles. A. Uso para Modalidades Padrão

[0074] A divulgação abrange células para transferência adotiva que são capazes de serem utilizadas prontas para uso, incluindo ca- pazes de serem obtidas de um repositório para o propósito de uso em um indivíduo diferente do indivíduo do qual as células foram original- mente obtidas. As células já podem expressar o ADR antes de serem depositadas no repositório, ou as células podem ser modificadas mis tarde para expressar o ADR. As células podem ser qualquer tipo de células efetoras imunológicas para transferência adotiva. As células antes do depósito no repositório ou depois de obtê-las do repositório podem ser modificadas para expressar um receptor específico do tu- mor, por exemplo (por exemplo, um CAR ou um TCR).

[0075] Como mostrado em outro lugar nesta invenção, as células de expressão de ADRs seletivamente direcionam as células T e NK ativadas, enquanto poupam subconjuntos em repouso. Os ADRs pro- tegem as células T alogênicas da rejeição imune mediada por células T e/ou NK in vitro, além de proteger as células T da rejeição imune in vivo. Os ADRs ao fazer isso não interferem com a função de um re- ceptor antitumoral projetado (CAR, como um exemplo), uma vez que as células T que coexpressam ADR e CAR podem eliminar eficiente-

mente o tumor e as células T ativadas in vitro. A invenção fornece ain- da atividade anticâncer in vivo em um modelo de camundongo utili- zando células T "prontas para uso" que coexpressam CAR e ADR, en- quanto retêm resistência à rejeição imune de células T alogênicas pre- sentes nos mesmos camundongos. Como um exemplo, na FIG. 14 é mostrado que o ADR 4-1BB é eficaz contra células tumorais 4-1BB+, de tal modo que o ADR pode ser utilizado como uma modalidade tera- pêutica contra malignidades de expressão de 4-1BB.

[0076] Nas modalidades particulares, as células terapêuticas "prontas para uso" expressam ADR para resistir a rejeição imunológica e reter a especificidade do TCR endógeno (por exemplo, para antíge- nos virais ou tumorais) ou ter TCRs endógenos substituídos por recep- tores antitumorais projetados, tais como um ou mais CARs e/ou um ou mais TCRs recombinantes.

[0077] Nas modalidades específicas, células prontas para uso são alojadas em um repositório e podem ser modificadas para uma finali- dade específica antes ou depois do depósito no repositório. Por exem- plo, as células T de expressão de ADR podem ser alojadas em um re- positório e prontas para uso, tal como após um tecido ou transplante de órgão, para prevenir a rejeição do enxerto. As células T de expres- são de ADR podem ser alojadas em um repositório e podem ser sele- cionadas ou projetadas com um TCR nativo ou transgênico, por exem- plo, contra infecção viral ou câncer. As células T de expressão de ADR podem ser alojadas em um repositório e podem ser transferidas com um CAR direcionado ao câncer ou infecção patogênica. As células de expressão de ADR podem ser alojadas em um repositório e podem ser transferidas com um ou mais CARs e/ou um ou mais TCRs direciona- dos a antígenos específicos associados ao câncer ou neoantígenos expressos pelo tumor específico do paciente.

[0078] Em alguns casos, as células alogênicas armazenadas são utilizadas para a prevenção da rejeição de enxertos de órgãos sólidos, mediante a destruição de células imunes do hospedeiro rejeitadas, particularmente nos casos em que as células de expressão de ADR não eram elas mesmas alorreativas.

[0079] Embora as células que estão alojadas no repositório pos- sam ser alogênicas em relação a um indivíduo receptor, em modalida- des alternativas as células alojadas no repositório são autólogas em relação a um indivíduo receptor. Por exemplo, um indivíduo com cân- cer pode ter células T de expressão de ADR depositadas em um repo- sitório para uso subsequente, tal como no caso do câncer sair da re- missão. Em outros casos, as células autólogas de expressão de ADR são alojadas em um repositório para o tratamento de distúrbios autoi- munes. B. Uso em Distúrbios Autoimunes

[0080] A ativação indesejada de células T autorreativas endóge- nas em um indivíduo pode levar a doenças autoimunes devastadoras para o indivíduo, tais como diabetes melito, colite autoimune e escle- rose múltipla. Nas modalidades particulares, um ou mais distúrbios au- toimunes são prevenidos ou tratados utilizando células imunes de ex- pressão de ADR no indivíduo que impacta o distúrbio autoimune (ou seu desenvolvimento potencial) pela inibição de células T autorreativas endógenas no indivíduo. Nas modalidades específicas, tal uso das cé- lulas de expressão de ADR poupa as células T virgens e de memória não patogênicas em repouso no indivíduo. Assim, certos métodos da descrição utilizam células específicas modificadas para expressar ADRs que são fornecidos a um indivíduo em uma quantidade suficien- te para direcionar células T ativadas, incluindo células T patogênicas, iniciando assim a destruição das células T ativadas.

[0081] A ativação in vivo de células T com especificidade indese- jada pode provocar patogenicidade e, em modalidades particulares, as células que expressam um ou mais ADRs direcionam as células T ati- vadas. Em alguns casos, as células de expressão de ADR direcionam células patogênicas que são um subconjunto de células T ativadas.

[0082] Em casos particulares, as células T de expressão de ADR podem ser utilizadas para prevenir ou reverter condições com risco de vida e debilitantes conduzidas por células T ativadas (rejeição de ór- gão, doença enxerto versus hospedeiro, diabetes tipo I, esclerose múl- tipla, colite autoimune, lúpus, artrite reumatoide, como exemplos) utili- zando a transferência adotiva de células T com as células T de ex- pressão de ADR.

[0083] Em alguns casos, as células T de expressão de ADR tam- bém compreendem uma ou mais composições diferentes do ADR que facilitam o tratamento ou prevenção de um ou mais distúrbios autoi- munes.

[0084] Em alguns casos, um indivíduo recebendo as células T de expressão de ADR recebe uma ou mais terapias adicionais para pre- venir ou tratar um ou mais distúrbios autoimunes. O indivíduo pode ou não receber um ou mais medicamentos imunossupressores, por exemplo, tais como glicocorticóides, citostáticos, anticorpos e/ou fár- macos que atuam em imunofilinas. Além disso, ou alternativamente, o indivíduo pode receber uma ou mais vacinas apropriadas.

[0085] Em alguns casos, um indivíduo está em risco de um distúr- bio autoimune e é fornecida uma quantidade eficaz de células de ex- pressão de ADR para prevenir o início do distúrbio autoimune ou para retardar o início e/ou diminuir um ou mais sintomas, incluindo a gravi- dade e/ou duração, por exemplo. Um indivíduo em risco de desenvol- ver um distúrbio autoimune, por exemplo, é aquele que possui um his- tórico pessoal ou familiar, é uma mulher de determinada etnia, e assim por diante. O indivíduo pode ter um distúrbio autoimune e deseja pre- venir ou reduzir a gravidade e/ou a duração ou atrasar o início de ou-

tros distúrbios autoimunes, em alguns casos.

[0086] Exemplos de distúrbios autoimunes que podem ser preve- nidos ou tratados com células de expressão de ADR incluem pelo me- nos o seguinte: Acalasia; doença de Addison; doença de Still do adul- to; Agamaglobulinemia; Alopecia areata; Amiloidose; Espondilite an- quilosante; Nefrite anti-GBM/anti-TBM; Síndrome antifosfolipídica; An- gioedema autoimune; Disautonomia autoimune; Encefalomielite autoi- mune; Hepatite autoimune; Doença autoimune do ouvido interno (AIED); Miocardite autoimune; Ooforite autoimune; Orquite autoimune; Pancreatite autoimune; Retinopatia autoimune; Urticária autoimune; Neuropatia axonal e neuronal (AMAN); doença de Baló; doença de Behcet; Penfigóide benigno da mucosa; Penfigoide bolhoso; doença de Castleman (CD); doença celíaca; doença de Chagas; Polineuropa- tia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP); Osteomielite multifocal recorrente crônica (CRMO); Síndrome de Churg-Strauss (CSS) ou Granulomatose Eosinofílica (EGPA); Penfigóide cicatricial; Síndrome de Cogan; Doença de aglutinina fria; Bloqueio cardíaco congênito; Mi- ocardite de Coxsackie; Síndrome CREST; doença de Crohn; Dermatite herpetiforme; Dermatomiosite; doença de Devic (neuromielite óptica); Lúpus discóide; Síndrome de Dressler; Endometriose; Esofagite eosi- nofílica (EoE); Fasciite eosinofílica; Eritema nodoso; Crioglobulinemia mista essencial; Síndrome de Evans; Fibromialgia; Alveolite fibrosante; Arterite de células gigantes (arterite temporal); Miocardite de células gigantes; Glomerulonefrite; Síndrome de Goodpasture; Granulomatose com poliangiite; doença de Graves; síndrome de Guillain-Barre; Tireoi- dite de Hashimoto; Anemia hemolítica; púrpura de Henoch-Schonlein (HSP); Herpes gestationis ou penfigóide gestationis (PG); Hidradenite Supurativa (HS) (Acne Inversa); Hipogammalglobulinemia; Nefropatia por IgA; doença esclerosante relacionada a IgG4; Púrpura tromboci- topênica imune (ITP); Miosite de corpos de inclusão (IBM); Cistite in-

tersticial (IC); Artrite juvenil; Diabetes juvenil (diabetes tipo 1); Miosite Juvenil (JM); doença de Kawasaki; síndrome de Lambert-Eaton; Vas- culite leucocitoclástica; Líquen plano; Líquen escleroso; Conjuntivite lenhosa; doença de IgA linear (LAD); Lúpus; doença de Lyme crônica; doença de Meniere; Poliangeíte microscópica (MPA); doença mista do tecido conjuntivo (DMTC); úlcera de Mooren; doença de Mucha- Habermann; Neuropatia Motora Multifocal (MMN) ou MMNCB; Escle- rose múltipla; Miastenia grave; Miosite; Narcolepsia; Lúpus Neonatal; Neuromielite óptica; Neutropenia; Penfigóide cicatricial ocular; Neurite óptica; Reumatismo palindrômico (PR); PANDAS; Degeneração cere- belar paraneoplásica (PCD); Hemoglobinúria paroxística noturna (HPN); Síndrome de Parry Romberg; Pars planitis (uveíte periférica); síndrome de Parsonnage-Turner; Pênfigo; Neuropatia periférica; Ence- falomielite perivenosa; Anemia perniciosa (PA); síndrome de POEMS; Poliarterite nodosa; Síndromes poliglandulares tipo I, II, III; Polimialgia reumática; Polimiosite; síndrome pós-infarto do miocárdio; Síndrome pós-pericardiotomia; Cirrose biliar primária; Colangite esclerosante primária; Dermatite de progesterona; Psoríase; Artrite psoriática; Apla- sia pura de glóbulos vermelhos (PRCA); Pioderma gangrenoso; fenô- meno de Raynaud; Artrite Reativa; distrofia simpática reflexa; Policon- drite recidivante; Síndrome das pernas inquietas (RLS); Fibrose retro- peritoneal; Febre reumática; Artrite reumatóide; Sarcoidose; síndrome de Schmidt; Esclerite; Esclerodermia; síndrome de Sjögren; autoimu- nidade de esperma e testicular; Síndrome da pessoa rígida (SPS); En- docardite bacteriana subaguda (SBE); síndrome de Susac; Oftalmia simpática (SO); arterite de Takayasu; Arterite temporal/Arterite de célu- las gigantes; Púrpura trombocitopênica (TTP); síndrome de Tolosa- Hunt (THS); Mielite transversa; Diabetes tipo 1; colite ulcerativa (UC); doença indiferenciada do tecido conjuntivo (UCTD); Uveíte; Vasculite; Vitiligo; Doença de Vogt-Koyanagi-Harada; e granulomatose de We-

gener (ou Granulomatose com Poliangiite (GPA)). C. Uso para Eliminar Células NK

[0087] Células imunes de expressão de ADR podem ser utilizadas para eliminar células NK nos casos em que é desejável fazê-lo. Con- forme demonstrado nesta invenção, a presença de ADRs em certas células imunes fornece uma atividade citotóxica específica contra célu- las NK que estão envolvidas na mediação da rejeição rápida de HLA- baixo ou células HLA incompatíveis. Assim, em situações em que é de- sejável manter células HLAbaixa ou HLA incompatíveis, por exemplo, para ser capaz de utilizar a transferência adotiva de células alogênicas em certos indivíduos, o uso de células de expressão de ADR evita a ativação de células NK e rejeição da células HLA incompatíveis. Espe- cificamente, como aqui mostrado, a cocultura de células T que expres- sam ADRs leva à eliminação de células NK e, assim, compensa a re- jeição do hospedeiro mediada por células NK de células T alogênicas de expressão de ADR. D. Uso para Facilitar o Enxerto de Células Alogêni- cas/Tecido/Transplante de Órgãos

[0088] Em um aspecto específico de evitar a ativação de células T alorreativas, pode-se evitar a rejeição de células, tecidos ou órgãos alogênicos em indivíduos que recebem transplantes, que é principal- mente mediada por uma população de células T alorreativas do recep- tor. A ativação das células T alorreativas do receptor levaria à falha do enxerto, por exemplo, se medidas não fossem tomadas para evitar tal rejeição. Portanto, nas modalidades particulares, métodos de trans- plante de células, tecido ou órgãos em um indivíduo utilizam a libera- ção de uma quantidade eficaz de células de expressão de ADR antes, durante e/ou após os respectivos transplantes de células, tecidos ou órgãos. Em alguns casos, as células de expressão de ADR não fazem parte das células, tecidos ou órgãos que são objetos do transplante,

enquanto que em outros casos as células de expressão de ADR fazem parte das respectivas células, tecido(s) ou órgão(s).

[0089] O tecido para transplante pode ser de qualquer tipo, inclu- indo pelo menos pele, córnea, osso, tendões, válvulas cardíacas, veias ou artérias, por exemplo. O órgão para transplante pode ser de qual- quer tipo, incluindo coração, rins, fígado, pulmões, pâncreas, intestino e timo, por exemplo.

[0090] Nas modalidades particulares, as células de expressão de ADR aumentam o uso de células alogênicas em um indivíduo como uma abordagem dupla: (1) elas inibem as células T alorreativas endó- genas no indivíduo; e (2) elas suprimem a rejeição mediada por célu- las NK no indivíduo. Como tais, as moléculas de ADR podem aumen- tar a persistência e a atividade de qualquer tipo de células terapêuticas derivadas de terceiros no indivíduo incluindo, por exemplo, células te- rapêuticas alogênicas, incluindo células T, células NK, células NK-T, células T invariantes associadas à mucosa (MAIT) e outras células ci- totóxicas, incluindo aquelas que expressam construções projetadas tais como receptor de antígeno quimérico (CAR), TCR transgênico, etc. E. Uso na Profilaxia ou Tratamento da Doença de enxerto versus hospedeiro (GvHD) durante o Transplante de Célu- las/Tecidos/Órgãos Alogênicos

[0091] Em outro aspecto específico de evitar a ativação de células T alorreativas, pode-se evitar reações aloimunes com risco de vida em indivíduos que recebem transplantes de células, tecidos ou órgãos alogênicos. Esses transplantes conteriam células T alorreativas de do- adores que provocariam o desenvolvimento da doença do enxerto ver- sus hospedeiro (GvHD), por exemplo, se não fossem tomadas medi- das para evitar a sua ativação. Portanto, nas modalidades particulares, métodos de transplante de células, tecido ou órgãos em um indivíduo utilizam a liberação de uma quantidade eficaz de células de expressão de ADR antes, durante e/ou após os respectivos transplantes de célu- las, tecidos ou órgãos. Em alguns casos, as células de expressão de ADR não fazem parte das células, tecidos ou órgãos que são objeto do transplante, enquanto que em outros casos as células de expressão de ADR fazem parte das respectivas células, tecido(s) ou órgão(s).

[0092] O tecido para transplante pode ser de qualquer tipo, inclu- indo pelo menos pele, córnea, osso, tendões, válvulas cardíacas, veias ou artérias, por exemplo. O órgão para transplante pode ser de qual- quer tipo, incluindo coração, rins, fígado, pulmões, pâncreas, intestino e timo, por exemplo. III. Produção de Células de Expressão de ADR

[0093] As células que expressam as moléculas de ADR podem ser produzidas de uma variedade de maneiras, todas as quais podem ser rotineiras na técnica. Os métodos de produção podem incluir a obten- ção das células a serem modificadas para expressar a molécula de ADR e também incluir a geração das moléculas de ADR. A. Fontes de Células T

[0094] Antes da expansão e modificação genética das células T de expressão de ADR da invenção, uma fonte de células T pode ser obti- da a partir de um indivíduo. Essa etapa de obtenção pode ou não fazer parte do método. Em alguns casos, a obtenção de células T a serem modificadas e sua manipulação podem ser executadas por uma parte diferente da parte que fornece as células T de expressão de ADR a um indivíduo. As células T podem ser obtidas de várias fontes, incluindo células mononucleares do sangue periférico, medula óssea, tecido dos glânglios lingátivos, sangue do cordão umbilical, tecido do timo, tecido de um local da infecção, ascite, derrame pleural, tecido do baço e tu- mores. Em certas modalidades da presente invenção, qualquer núme- ro de linhagens celulares T disponíveis na técnica pode ser utilizado.

Em certas modalidades, as células T podem ser obtidas a partir de uma unidade de sangue coletada de um indivíduo utilizando qualquer número de técnicas conhecidas pelo especialista versado, tal como separação Ficoll™. Em uma modalidade, as células do sangue circu- lante de um indivíduo são obtidas por aférese. O produto de aférese contém tipicamente linfócitos, incluindo células T, monócitos, granuló- citos, células B, outros glóbulos brancos nucleados, glóbulos verme- lhos e plaquetas, por exemplo. Em uma modalidade, as células coleta- das por aférese podem ser lavadas para remover a fração do plasma e colocar as células em um tampão ou meio apropriado para as subse- quentes etapas de processamento. Em uma modalidade, as células são lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em uma modalidade alternativa, a solução de lavagem carece de cálcio e pode carecer de magnésio ou pode carecer de muitos, se não todos, cátions divalentes. Como aqueles de habilidade prática na técnica ob- servariam facilmente, uma etapa de lavagem pode ser executada por métodos conhecidos para aqueles da técnica, tais como mediante o uso de uma centrífuga semiautomática de "fluxo direto" (por exemplo, o processador de células Cobe 2991, o Baxter CytoMate ou o Haemo- netics Cell Saver 5) de acordo com as instruções do fabricante. Após a lavagem, as células podem ser colocadas novamente em suspensão em uma variedade de tampões biocompatíveis, tais como, por exem- plo, PBS livre de Ca2+, livre de Mg2+, PlasmaLyte A, ou outra solução salina com ou sem tampão. Alternativamente, os componentes indese- jáveis da amostra de aférese podem ser removidos e as células dire- tamente colocadas novamente em suspensão no meio de cultura.

[0095] Em outra modalidade, as células T são isoladas de linfóci- tos do sangue periférico através da dissolução dos glóbulos vermelhos e depleção dos monócitos, por exemplo, através da centrifugação através de um gradiente PERCOLL™ ou por elutriação centrífuga de contrafluxo. Uma subpopulação específica de células T, tais como cé- lulas T CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ e CD45RO+, pode ser ainda isolada por técnicas de seleção positiva ou negativa.

[0096] O enriquecimento de uma população de células T por sele- ção negativa pode ser executado com uma combinação de anticorpos direcionados a marcadores de superfície únicos para as células nega- tivamente selecionadas. Um método é a classificação e/ou seleção de células por meio de imunoaderência magnética negativa ou citometria de fluxo que utiliza um coquetel de anticorpos monoclonais direciona- dos aos marcadores de superfície celular presentes nas células nega- tivamente selecionadas. Por exemplo, para enriquecer as células CD4+ através da seleção negativa, um coquetel de anticorpos mono- clonais tipicamente inclui anticorpos para CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR e CD8. Em certas modalidades, pode ser desejável enrique- cer ou selecionar positivamente para células T reguladoras que tipica- mente expressam CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ e FoxP3+. Alternati- vamente, em certas modalidades, as células T reguladoras são exau- ridas por glóbulos conjugados com anti-C25 ou outro método de sele- ção semelhante.

[0097] Para o isolamento de uma população desejada de células através da seleção positiva ou negativa, a concentração de células e superfície (por exemplo, partículas tais como glóbulos) pode ser varia- da. Em certas modalidades, pode ser desejável diminuir significativa- mente o volume no qual os grânulos e as células são misturados (isto é, aumentar a concentração de células), para garantir o contato máxi- mo de células e glóbulos. Por exemplo, em uma modalidade, uma concentração de 2 bilhões de células/ml é utilizada. Em uma modali- dade, uma concentração de 1 bilhão de células/ml é utilizada. Em uma outra modalidade, mais de 100 milhões de células/ml são utilizadas. Em uma outra modalidade, uma concentração de células de 10, 15,

20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 milhões de células ml é utilizada. Em mais outra modalidade, uma concentração de células de 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 milhões de células/ml é utilizada. Em outras modalidades, con- centrações de 125 ou 150 milhões de células/ml podem ser utilizadas. O uso de altas concentrações pode resultar em maior rendimento celu- lar, ativação celular e expansão celular. Em outra modalidade, pode ser desejável utilizar concentrações mais baixas de células. Ao diluir significativamente a mistura de células T e a superfície (por exemplo, partículas tais como glóbulos), as interações entre as partículas e as células são minimizadas.

[0098] As células T para estimulação também podem ser congela- das após uma etapa de lavagem. Desejando não ser limitado pela teo- ria, a etapa de congelamento e subsequente descongelamento fornece um produto mais uniforme, mediante a remoção de granulócitos e, em certa medida, monócitos na população de células. Após a etapa de lavagem que remove o plasma e as plaquetas, as células podem ser colocadas em suspensão em uma solução de congelamento. Muitas soluções e parâmetros de congelamento são conhecidos na técnica. Em certas modalidades, as células criopreservadas são descongela- das e lavadas conforme descrito nesta invenção e deixadas em repou- so por uma hora na temperatura ambiente antes da ativação utilizando os métodos da presente invenção.

[0099] Também contemplada no contexto da invenção é a coleta de amostras de sangue ou produto de aférese de um indivíduo em um período de tempo antes da hora que as células expandidas como des- crito nesta invenção podem ser necessárias. Como tal, a fonte das cé- lulas a serem expandidas pode ser coletada em qualquer momento necessário, e as células desejadas, tais como as células T, isoladas e congeladas para uso posterior na terapia de células T para qualquer número de doenças ou condições que se beneficiariam da terapia com células T, tais como aquelas aqui descritas.

Em uma modalidade, uma amostra de sangue ou uma aférese é retirada de um indivíduo geral- mente saudável.

Em certas modalidades, uma amostra de sangue ou uma aférese é retirada de um indivíduo geralmente saudável que está em risco de desenvolver uma doença, mas que ainda não desenvolveu uma doença, e as células de interesse são isoladas e congeladas para uso posterior.

Em certas modalidades, as células T podem ser expan- didas, congeladas e utilizadas posteriormente.

Em certas modalidades, as amostras são coletadas de um paciente logo após o diagnóstico de uma doença específica, conforme aqui descrito, mas antes de quais- quer tratamentos.

Em uma outra modalidade, as células são isoladas de uma amostra de sangue ou uma aférese de um indivíduo antes de qualquer número de modalidades de tratamento relevantes, incluindo, mas não são limitados a estes, tratamento com agentes tais como na- talizumab, efalizumab, agentes antivirais, quimioterapia, radiação, agentes imunossupressores, tais como ciclosporina, azatioprina, meto- trexato, micofenolato e FK506, anticorpos ou outros agentes imunoa- blativos, tais como CAMPATH, anticorpos anti-CD3, citoxano, fludara- bina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteróides, FR9012 e irradiação.

Estes fármacos inibem a fosfatase calcineurina dependente de cálcio (ciclosporina e FK506) ou inibem a cinase p70S6 que é importante para a sinalização induzida pelo fator de crescimento (rapamicina) (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr.

Opin.

Immun. 5:763-773, 1993). Em uma outra modalidade, as células são isoladas para um pa- ciente e congeladas para uso posterior em conjunto com (por exemplo, antes, simultaneamente ou após) o transplante de medula óssea ou células-tronco, terapia ablativa de células T utilizando agentes quimio- terápicos tais como fludarabina, radioterapia por feixe externo (XRT), ciclofosfamida ou anticorpos tais como OKT3 ou CAMPATH.

Em outra modalidade, as células são isoladas anteriormente e podem ser con- geladas para uso posterior para tratamento após a terapia ablativa de células B tal como agentes que reagem com CD20, por exemplo, Ritu- xan. B. Ativação e Expansão de Células T

[00100] Antes ou depois da modificação genética das células T para expressar o ADR, as células T podem ser ativadas e expandidas ge- ralmente utilizando métodos como descrito, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 6.352.694; 6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358;

6.887.466; 6.905.681; 7.144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.232.566;

7.175.843; 5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6.867.041; e Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 20060121005. Geralmente, as células T da divulgação são expandidas mediante o contato com uma superfí- cie tendo anexado a ela um agente que estimula um sinal associado ao complexo CD3/TCR e um ligante que estimula uma molécula coes- timuladora na superfície das células T. Esses processos são conheci- dos na técnica. Em outros casos, as células T podem ser modificadas para expressar ADR sem ativação prévia. C. Geração de Moléculas do ADR

[00101] Voltando-se geralmente para os polinucleotídeos que codi- ficam o ADR, as sequências de ácido nucleico que codificam as molé- culas de ADR podem ser obtidas utilizando métodos recombinantes conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, através do rastrea- mento de bibliotecas de células que expressam o gene, mediante a derivação do gene de um vetor conhecido por incluir o mesmo, ou através do isolamento direto de células e tecidos contendo o mesmo, utilizando técnicas padrão. Alternativamente, o polinucleotídeo de ADR de interesse pode ser produzido sinteticamente, em vez de clonado.

[00102] Em breve sumário, a expressão de polinucleotídeos sintéti- cos que codificam ADRs é tipicamente alcançada mediante a ligação de maneira operável de um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de ADR ou suas partes a um promotor, e incorporação da construção em um vetor de expressão. Os vetores podem ser adequados para eucariotos de replicação e integração. Os vetores de clonagem típicos contêm dispositivos terminais de transcrição e tradução, sequências de iniciação e promotores úteis para a regulação da expressão da se- quência de ácido nucleico desejada.

[00103] O polinucleotídeo de ADR pode ser clonado em vários tipos de vetores. Por exemplo, o ácido nucleico pode ser clonado em um vetor incluindo, mas não limitados a estes, um plasmídeo, um fagomí- deo, um derivado de fago, um vírus animal e um cosmídeo. Os vetores de interesse particular incluem vetores de expressão, vetores de repli- cação, vetores de geração de sondas e vetores de sequenciamento.

[00104] Além disso, o vetor de expressão pode ser fornecido a uma célula na forma de um vetor viral. A tecnologia de vetor viral é bem co- nhecida na técnica e é descrita, por exemplo, em Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), e em outros manuais de virologia e biologia molecular. Os vírus, que são úteis como vetores, incluem, mas não são limitados a estes, retrovírus, adenovírus, vírus adenoassociados, vírus do herpes e lentivírus. Em geral, um vetor adequado contém uma origem de replicação funcional em pelo menos um organismo, uma sequência promotora, sítios de endonuclease de restrição convenien- tes e um ou mais marcadores selecionáveis, (por exemplo, WO 01/96584; WO 01/29058; e Patente U.S. No. 6.326.193).

[00105] Vários sistemas baseados em vírus foram desenvolvidos para transferência de genes nas células de mamíferos. Por exemplo, os retrovírus fornecem uma plataforma conveniente para sistemas de liberação de genes. Um gene selecionado pode ser inserido em um vetor e acondicionado em partículas retrovirais utilizando técnicas co-

nhecidas na especialidade. O vírus recombinante pode então ser iso- lado e liberado nas células do indivíduo in vivo ou ex vivo. Vários sis- temas retrovirais são conhecidos na técnica. Em algumas modalida- des, vetores de adenovírus são utilizados. Vários vetores de adenoví- rus são conhecidos na técnica. Em uma modalidade, vetores de lenti- vírus são utilizados.

[00106] Elementos promotores adicionais, por exemplo, intensifica- dores, regulam a frequência de início da transcrição. Tipicamente, es- tes estão localizados na região de 30 a 110 pb a montante do local de partida, embora vários promotores tenham recentemente demonstrado conter elementos funcionais a jusante do local de partida igualmente. O espaçamento entre os elementos do promotor frequentemente é fle- xível, de modo que a função do promotor seja preservada quando os elementos forem invertidos ou movidos em relação uns com os outros. No promotor da timidina cinase (tk), o espaçamento entre os elemen- tos do promotor pode ser aumentado para 50 bp antes que a atividade comece a diminuir. Dependendo do promotor, parece que os elemen- tos individuais podem funcionar de forma cooperativa ou independente para ativar a transcrição.

[00107] Um exemplo de um promotor adequado é a sequência do promotor do citomegalovírus precoce (CMV). Esta sequência promoto- ra é uma sequência promotora constitutiva forte capaz de conduzir a níveis elevados de expressão de qualquer sequência de polinucleotí- deo ligada de maneira operável a ela. Outro exemplo de um promotor adequado é o Fator de Crescimento por Alongamente-1alfa (EF-1alfa). No entanto, outras sequências promotoras constitutivas também po- dem ser utilizadas, incluindo, mas não limitadas a estas, o promotor inicial do vírus símio 40 (SV40), vírus do tumor mamário de camun- dongo (MMTV), promotor de repetição terminal longa (LTR) do vírus da imunodeficiência humana (HIV), promotor MoMuLV, um promotor do vírus da leucemia aviária, um promotor precoce imediato do vírus Epstein-Barr, um promotor do vírus do sarcoma de Rous, assim como promotores de genes humanos, tais como, mas não limitados a estes, o promotor da actina, o promotor da miosina, o promotor da hemoglo- bina e o promotor da creatina cinase. Além disso, a invenção não deve ser limitada ao uso de promotores constitutivos. Promotores induzíveis também são contemplados como parte da invenção. O uso de um promotor induzível fornece um comutador molecular capaz de ligar a expressão da sequência de polinucleotídeo que está ligada de maneira operável quando tal expressão é desejada, ou desligar a expressão quando a expressão não é desejada. Exemplos de promotores induzí- veis incluem, mas não são limitados a estes, um promotor de metaloti- onina, um promotor de glicocorticóide, um promotor de progesterona e um promotor de tetraciclina.

[00108] A fim de avaliar a expressão de um polipeptídeo de ADR ou partes do mesmo, o vetor de expressão a ser introduzido em uma cé- lula também pode conter um gene marcador selecionável ou um gene repórter ou ambos para facilitar a identificação e seleção das células de expressão da população de células liberadas para serem transfec- tadas ou infectadas através de vetores virais. Em outros aspectos, o marcador selecionável pode ser transportado em um pedaço separado de DNA e utilizado em um procedimento de cotransfecção. Tanto os marcadores selecionáveis quanto os genes repórter podem ser flan- queados com sequências reguladoras apropriadas para permitir a ex- pressão nas células hospedeiras. Marcadores selecionáveis úteis in- cluem, por exemplo, genes de resistência a antibióticos, tais como neo e semelhantes.

[00109] Genes repórteres são utilizados para identificar células po- tencialmente transfectadas e para avaliar a funcionalidade de sequên- cias reguladoras. Em geral, um gene repórter é um gene que não está presente ou é expresso pelo organismo ou tecido receptor e que codi- fica um polipeptídeo cuja expressão é manifestada por alguma propri- edade facilmente detectável, por exemplo, atividade enzimática. A ex- pressão do gene repórter é testada em um momento adequado após o DNA ter sido introduzido nas células receptoras. Genes repórter ade- quados podem incluir genes que codificam luciferase, beta- galactosidase, cloranfenicol acetil transferase, fosfatase alcalina se- gregada ou o gene da proteína verde fluorescente (por exemplo, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Os sistemas de expressão ade- quados são bem conhecidos e podem ser preparados utilizando técni- cas conhecidas ou obtidos comercialmente. Em geral, a construção com a região flanqueadora 5' mínima mostrando o nível mais alto de expressão do gene repórter é identificada como o promotor. Essas re- giões promotoras podem ser ligadas a um gene repórter e utilizadas para avaliar os agentes quanto à capacidade de modular a transcrição conduzida pelo promotor.

[00110] Os métodos de introdução e expressão de polinucleotídeos de ADR em uma célula são conhecidos na técnica. No contexto de um vetor de expressão, o vetor pode ser facilmente introduzido em uma célula hospedeira, por exemplo, célula de mamífero, bactéria, levedura ou inseto por qualquer método na técnica. Por exemplo, o vetor de ex- pressão pode ser transferido para uma célula hospedeira por meios físicos, químicos ou biológicos.

[00111] Os métodos físicos para a introdução de um polinucleotídeo de ADR em uma célula hospedeira incluem precipitação de fosfato de cálcio, lipofecção, bombardeio de partículas, microinjeção, eletropora- ção e semelhantes. Os métodos para a produção de células compre- endendo vetores e/ou ácidos nucleicos exógenos são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al. (2001, Molecular Clo- ning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York).

Um método para a introdução de um polinucleotídeo em uma célula hospedeira é a transfecção de fosfato de cálcio.

[00112] Os métodos biológicos para a introdução de um polinucleo- tídeo de ADR de interesse em uma célula hospedeira incluem o uso de vetores de DNA e RNA. Os vetores virais e, especialmente, os vetores retrovirais, tornaram-se o método mais amplamente utilizado para in- serir genes em mamíferos, por exemplo, células humanas. Outros ve- tores virais podem ser derivados de lentivírus, poxvírus, vírus do her- pes simples I, adenovírus e vírus adenoassociados e semelhantes. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 5.350.674 e 5.585.362.

[00113] Os meios químicos para a introdução de um polinucleotídeo em uma célula hospedeira incluem sistemas de dispersão coloidal, tais como complexos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, glóbulos e sistemas à base de lipídios, incluindo emulsões de óleo em água, micelas, micelas misturadas e lipossomas. Um sistema coloidal exemplar para uso como veículo de liberação in vitro e in vivo é um lipossoma (por exemplo, uma vesícula de membrana artificial).

[00114] No caso em que um sistema de liberação não viral é utiliza- do, um veículo de liberação exemplar é um lipossoma. O uso de for- mulações lipídicas é contemplado para a introdução dos ácidos nuclei- cos em uma célula hospedeira (in vitro, ex vivo ou in vivo). Em outro aspecto, o ácido nucleico pode estar associado a um lipídeo. O ácido nucleico associado a um lipídio pode ser encapsulado no interior aquoso de um lipossoma, intercalado dentro da bicamada lipídica de um lipossoma, ligado a um lipossoma por meio de uma molécula de ligação que está associada ao lipossoma e ao oligonucleotídeo, captu- rado em um lipossoma, complexado com um lipossoma, disperso em uma solução contendo um lipídio, misturado com um lipídio, combina- do com um lipídio, contido como uma suspensão em uma lipídio, con- tido ou complexo com uma micela, ou de outro modo associado com um lipídio. As composições associadas com lipídios, lipídios/DNA ou lipídio/vetores de expressão não estão limitadas a qualquer estrutura particular em solução. Por exemplo, elas podem estar presentes em uma estrutura de bicamada, como micelas, ou com uma estrutura "co- lapsada". Elas também podem ser simplesmente intercaladas em uma solução, possivelmente formando agregados que não são uniformes em tamanho ou forma. Os lipídios são substâncias gordurosas que podem ser de ocorrência natural ou lipídios sintéticos. Por exemplo, os lipídios incluem as gotículas de gordura que ocorrem naturalmente no citoplasma, assim como a classe de compostos que contêm hidrocar- bonetos alifáticos de cadeia longa e seus derivados, tais como ácidos graxos, álcoois, aminas, aminoálcoois e aldeídos.

[00115] Os lipídios adequados para uso podem ser obtidos de fon- tes comerciais. Por exemplo, a dimiristil fosfatidilcolina ("DMPC") pode ser obtida da Sigma, St. Louis, Mo.; dicetil fosfato ("DCP") pode ser obtido de K & K Laboratories (Plainview, N.Y.); o colesterol ("Choi") pode ser obtido da Calbiochem-Behring; dimiristil fosfatidilglicerol ("DMPG") e outros lipídios podem ser obtidos da Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, Ala.). Soluções mãe de lipídeos em clorofórmio ou clorofórmio/metanol podem ser armazenadas ao redor de -20 °C. O clorofórmio é utilizado como o único solvente, visto que é mais facil- mente evaporado do que o metanol. "Lipossoma" é um termo genérico que engloba uma variedade de veículos lipídicos simples e multilame- lares formados pela geração de bicamadas ou agregados lipídicos de- limitados. Os lipossomas podem ser caracterizados como tendo estru- turas vesiculares com uma membrana de bicamada fosfolipídica e um meio aquoso interno. Os lipossomas multilamelares possuem múltiplas camadas de lipídios separadas por meio aquoso. Eles se formam es- pontaneamente quando os fosfolipídios são colocados em suspensão em um excesso de solução aquosa. Os componentes lipídicos sofrem autorrearranjo antes da formação de estruturas fechadas e capturam água e solutos dissolvidos entre as bicamadas lipídicas (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). No entanto, as composições que pos- suem estruturas em solução diferentes da estrutura vesicular normal também são incluídas. Por exemplo, os lipídios podem assumir uma estrutura micelar ou simplesmente existir como agregados não unifor- mes de moléculas de lipídio. Também são contemplados os comple- xos lipofectamina-ácido nucleico.

[00116] Em alguns casos, as moléculas de ADR podem ser integra- das em um ácido nucleico endógeno das células. Pode-se ter um sítio alvo para recombinação homóloga, onde se deseja que uma constru- ção seja integrada em um locus particular. Por exemplo, pode-se neu- tralizar um gene endógeno e substituí-lo (no mesmo locus ou em outro lugar) pelo gene codificado pela construção utilizando materiais e mé- todos conhecidos na técnica para recombinação homóloga. Para re- combinação homóloga, pode-se utilizar vetores OMEGA ou O. CRISPR/Cas9, nucleases de dedo de zinco, nucleases TALE, me- ganucleases e outras nucleases direcionadas ao sítio podem ser utili- zadas para direcionar e clivar um sítio específico no genoma para promover a recombinação homóloga.

[00117] As células T exemplares que foram projetadas para incluir os construtos que expressam o ADR podem ser cultivadas em cultura sob condições seletivas e as células que são selecionadas como tendo a construção podem então ser expandidas e posteriormente analisa- das, utilizando, por exemplo; a reação em cadeia da polimerase para determinar a presença da construção nas células hospedeiras. Uma vez que as células hospedeiras planejadas tenham sido identificadas, elas podem então ser utilizadas conforme planejado, por exemplo, ex- pandidas em cultura ou introduzidas em um organismo hospedeiro.

[00118] Dependendo da natureza das células, as células podem ser introduzidas em um organismo hospedeiro, por exemplo, um mamífe- ro, em uma ampla variedade de maneiras. As células podem ser intro- duzidas no local do tumor, nas modalidades específicas, embora nas modalidades alternativas as células residam no câncer ou são modifi- cadas para se alojar no tecido infectado. O número de células que são empregadas dependerá de várias circunstâncias, do propósito da in- trodução, do tempo de vida das células, do protocolo a ser utilizado, por exemplo, o número de administrações, da capacidade das células de se multiplicarem, da estabilidade da construção recombinante, e semelhantes. As células podem ser aplicadas como uma dispersão, geralmente sendo injetadas no ou próximo do local de interesse. As células podem estar em um meio fisiologicamente aceitável.

[00119] A introdução do DNA não precisa resultar em integração em todos os casos. Em algumas situações, a manutenção transitória do DNA introduzido pode ser suficiente. Desta forma, pode-se ter um efeito de curto prazo, em que as células podem ser introduzidas no hospedeiro e depois ligadas após um tempo predeterminado, por exemplo, depois que as células foram capazes de se hospedar em um determinado local.

EXEMPLOS

[00120] Os seguintes exemplos são apresentados a fim de ilustrar mais completamente as modalidades particulares da invenção. Eles não devem de forma alguma, no entanto, ser interpretados como limi- tativos do amplo escopo da invenção. EXEMPLO 1 RECEPTORES DE DEFESA AUTO/ALOIMUNE PARA O DIRECIO-

NAMENTO SELETIVO DE CÉLULAS T PATOGÊNICAS

[00121] É aqui divulgada uma nova abordagem para direcionar es- pecificamente as células T patogênicas utilizando receptores de defe- sa auto/aloimunes (ADRs) expressos em células T normais. As células

T de expressão de ADR encontram e eliminam apenas as células T ativadas e poupam as células T virgens e de memória não patogênicas em repouso, que constituem a maioria dos linfócitos circulantes.

[00122] O conceito do direcionamento mediado por ADR se baseia na observação de que dentro de 24 horas de ativação, as células T suprarregulam transitoriamente os genes coestimuladores 4-1BB, OX40 e/ou CD40L em sua superfície celular. A expressão de 4-1BB, OX40 e/ou CD40L é mantida apenas quando as células T são ativa- mente citotóxicas e é gradualmente infrarregulada em 4 a 5 dias, quando a sinalização de TCR é interrompida. Notavelmente, as células T CD8+ ativadas mostraram maior magnitude de expressão de 4-1BB, enquanto as células T CD4+ expressaram de preferência OX40 e/ou CD40L. Sem considerar as células T ativadas, os ligantes de ADR só podem ser expressos em células NK ativadas e em alguns outros sub- conjuntos de células não críticos e renováveis. O padrão de expressão de 4-1BB, OX40 e CD40L torna esses genes alvos atraentes para di- recionar as células ativadas com alta especificidade, enquanto que evi- ta danos permanentes aos tecidos críticos imunes e não imunes.

[00123] Para explorar a viabilidade de direcionar essas células T ativadas, os receptores de defesa auto/aloimunes (ADRs) foram proje- tados para compreender um ligante específico de 4-1BB ou OX40, ou um receptor específico de CD40L diretamente conectado por meio de um espaçador a uma cadeia CD3ζ codificada em um vetor gamarre- troviral SFG. A região espaçadora foi incorporada a) para permitir a integração das proteínas do tipo II 4-1BBL e OX40L na cadeia principal do tipo I do ADR e b) para facilitar a detecção de ADR na superfície celular através da coloração FACS. A transdução de células T com esta construção forçou eficazmente a expressão de ADR na superfície celular. Essas células T do ADR apresentaram citotoxicidade potente e robusta contra células de expressão de 4-1BB-, OX40- e CD40L, eli-

minando 90 a 99% das células-alvo dentro de 48 h. Estes resultados demonstram a viabilidade de gerar células T do ADR específicas de 4- 1BB-, OX40- e CD40L funcionais.

[00124] Visto que a sinalização de ADR nas células T por sua vez suprarregula 4-1BB, OX40 e CD40L, promovendo assim o fratricídio e impedindo a expansão das células efetoras, os efeitos da disrupção genômica CRISPR/Cas9 dos genes alvo de ADR nas células T efeto- ras foram explorados. Os inventores haviam mostrado anteriormente que esta abordagem CRISPR/Cas9 pode prevenir o fratricídio de célu- las T humanas primárias que expressam um CAR específico de CD7. Neste contexto, com CRISPR/Cas9, os inventores foram capazes de neutralizar a expressão de 4-1BB em ~70% das células T do ADR que aumentaram consistentemente a expansão das células T do ADR > 2 vezes em 48 h após a cocultura com células-alvo 4-1BB+ sem afetar a citotoxicidade.

[00125] Em seguida, a capacidade das células T do ADR foi testada para eliminar seletivamente as células T ativadas. As células T do ADR 4-1BB, OX40 e CD40L foram cocultivadas com células T em re- pouso marcadas com fluorescência ou ativadas com CD3/CD28. As células T CD4+ e CD8+ vivas residuais foram quantificadas por cito- metria de fluxo com contas de contagem. Não houve reatividade con- tra as células T autólogas em repouso após 72 h de cocultura com cé- lulas T que expressam o ADR específico 4-1BB-, OX40 ou CD40L (FIG. 2B). Em contraste, a cocultura de células T do ADR 4-1BB com células T ativadas por CD3/CD28 eliminou a maioria das células T CD8+ e algumas células T CD4+ em 48 h. A incubação com células T do ADR OX40 resultou em depleção recíproca de alto nível de células T CD4+ ativadas e depleção modesta de células T CD8+ ativadas. As células T do ADR CD40L produziram efeito citotóxico moderado nas células T CD4+ ativadas, mas nenhum efeito foi observado nas células

T CD8+. Os perfis de direcionamento diferencial de células T do ADR OX40, CD40L e 4-1BB contra células T CD4+ e CD8+ ativadas se cor- relacionam com as diferenças observadas na magnitude e na cinética de expressão de OX40, CD40L e 4-1BB em cada subconjunto de célu- las T. Esta propriedade dos ADRs pode ser utilizada para direcionar de preferência um ou ambos os subconjuntos de células T alo ou autorre- ativas de acordo com a necessidade. Portanto, a expressão de ADR permite que as células T especificamente direcionem as células T ati- vadas (patogênicas), mas poupem as células em repouso, sugerindo seu uso clínico.

[00126] Foi avaliado se as células T específicas de vírus (VST) que expressam ADRs podem resistir à rejeição alogênica em um ensaio de reação de linfócitos misturados (MLR) in vitro. Células T específicas para CMV foram geradas a partir de um doador negativo de HLA-A2 e controle misturado de VST não transferida ou transferida por ADR com PBMC HLA-A2+ alorreativas em uma relação de célula para célula de 1:2. Os inventores então cultivaram as células durante 12 dias. No final da cocultura, as VSTs de controle foram quase completamente elimi- nadas por PBMC HLA-A2+ enquanto as VSTs que expressam ADR 4- 1BB ou ADR OX40 resistiram à rejeição. Tomados em conjunto, estes resultados demonstram a viabilidade e seletividade de direcionar as células T ativadas utilizando a modalidade de plataforma do ADR re- centemente desenvolvida. EXEMPLO 2 RECEPTORES DE DEFESA AUTO/ ALOIMUNE PARA O DIRECIO-

NAMENTO SELETIVO DE CÉLULAS NK

[00127] Os ADRs demonstram uma atividade citotóxica específica contra as células NK, uma população fundamental de células que atua como mediador da rejeição rápida de HLAbaixo ou células HLA incom- patíveis.

[00128] As células NK são capazes de reconhecer células HLA in- compatíveis ou células com baixa expressão de HLA, como uma parte da vigilância imunológica antitumoral e antiviral. A transferência adoti- va de células alogênicas para pacientes imunorepletos resultaria, por- tanto, na ativação das células NK e na rejeição das células HLA in- compatíveis. Aqui, é mostrado que a cocultura de células T que ex- pressam receptores de defesa auto/aloimunes específicos de 4-1BB e OX40 (ADRs) leva à eliminação de células NK e, assim, compensaria a rejeição do hospedeiro mediada por células NK de células T alogêni- cas munidas do ADR. Portanto, os ADRs não apenas inibem a respos- ta de células T alorreativas, mas também suprimem a rejeição media- da por células NK, sustentando ainda a aplicação de ADRs para au- mentar a persistência e a atividade de células T terapêuticas "prontas para uso". EXEMPLO 3 CÉLULAS T DE EXPRESSÃO DE ADR ELIMINAM AS CÉLULAS-

ALVO

[00129] Os ADRs podem ser expressos na superfície celular das células imunes e promover a citotoxicidade contra os respectivos al- vos. A FIG. 1A ilustra um exemplo de um esquema de ADR (uma mar- cação tal como GFP é opcional). A expressão de ADR na superfície das células T foi confirmada (FIG. 1B) e as células foram expandidas proporcionalmente aos controles (FIG. 1C). (FIG. 1D) As células T de expressão do ADR eram a citotoxicidade contra células-alvo que ex- pressam ligantes de ADR correspondentes (FIG. 1D). A FIG. 1E de- monstra a expansão de células T do tipo selvagem vs 4-1BB KO que expressam o ADR 4-1BB e sua citotoxicidade contra alvos 4-1BB+. A neutralização do ligante de ADR nas células T pode aumentar ainda mais a expansão e a citotoxicidade, e a coexpressão de ADR e seu ligante nas células T não é necessária para a expansão ou função das células T do ADR (FIG. 1E).

[00130] A expressão seletiva de ligantes de ADR em células T ati- vadas permite sua eliminação seletiva por células T do ADR. A ex- pressão de ligantes de ADR em repouso vs células T ativadas após a estimulação de TCR é determinada (FIG. 2A-FIG. 2C). Não houve ne- nhuma citotoxicidade de células T do ADR contra células T CD4+ e CD8+ em repouso (FIG. 2D), mas houve eliminação de células T CD4+ e CD8+ ativadas por células T do ADR após uma cocultura de 48 h (FIG. 2E).

[00131] Como um exemplo, a expressão do ADR 4-1BB protege as células T da rejeição imune em um modelo MLR. Gráficos de pontos representativos que mostram que as células T TCRKO que coexpres- sam o ADR são protegidas da rejeição após a cocultura com PBMC alogênicas em uma relação de T do ADR:PBMC de 1:10 (FIG. 3A). As contagens absolutas de células T doadoras e células T alogênicas na PBMC durante a cocultura (FIG. 3B-FIG. 3C) são as mesmas para as células T do ADR específicas de vírus (FIG. 3D-FIG. 3F).

[00132] A expressão de ADR protege as células T específicas do vírus alogênicas da rejeição imune em uma reação mista de linfócitos in vitro. Gráficos de pontos representativos que mostram que as VST do ADR são protegidas da rejeição imune por PBMC alogênicas recep- toras (FIG. 4A). As contagens absolutas de células T receptoras e VST doadoras em vários momentos durante MLR são fornecidas na FIG. 4B e FIG. 4C.

[00133] Na FIG. 5, as VSTs do ADR retêm a função antiviral. As VSTs do ADR foram cocultivados com monócitos pulsados com pepmix viral e as contagens de monócitos indicaram que eles elimina- ram as células infectadas por vírus igualmente bem em comparação com as VSTs não modificadas.

[00134] As células NK ativadas suprarregulam os ligantes de ADR e podem ser seletivamente direcionadas por células T do ADR. A ex- pressão de 4-1BB nas células NK em repouso vs ativadas é confirma- da (FIG. 6A-FIG. 6B). As contagens residuais de células NK em re- pouso vs ativadas após 24 horas de cocultura com células T do ADR 4-1BB são determinadas (FIG. 6C). Na FIG. 6D, as células T do ADR sem MHC são protegidas da rejeição imune por PBMC alogênicas mediante o controle da expansão das células NK. As contagens abso- lutas de células T doadoras e células NK alogênicas durante a cocultu- ra são determinadas na FIG. 6E. As células T do ADR sem MHC resis- tem à rejeição imune por células NK após a cocultura de 48 h em uma relação de E:T de 1:1 (FIG. 6F). As células T do ADR controlam a ex- pansão de células NK alorreativas durante MLR com PBMC (FIG. 6G), com contagens absolutas de células NK representadas na FIG. 6H.

[00135] A expressão de ADR protege as células T alogênicas da rejeição imune in vivo. Na FIG. 7A, um exemplo é mostrado de um modelo de camundongo de rejeição imune, onde os camundongos re- ceberam células T de um doador HLA-A2+ após uma irradiação suble- tal, seguida pela administração de células T HLA-A2 alogênicas 4 dias depois. As células T de controle do doador HLA-A2 foram rejeitadas no Dia 18, enquanto que as células de expressão de ADR foram protegi- das (FIG. 7B). As contagens absolutas de células T de dadores HLA- A2+ e HLA-A2- em vários momentos foram determinadas (FIG. 7C). Um modelo in vivo modificado na FIG. 7D representa onde, em vez de camundongos com células T alogênicas, receberam PBMC inteiras (contendo células T e NK) do doador 1. Gráficos de fluxo representati- vos na FIG. 7E mostram que as células T do ADR foram protegidas da rejeição imune e também protegeram os camundongos do início rápido de GvHD fatal.

[00136] A coexpressão de CAR e ADR preserva as funções de am- bos os receptores. A FIG. 8A ilustra um exemplo de uma representa-

ção de uma célula imune que coexpressa o ADR e uma coexpressão de CAR de um CAR e um ADR na superfície celular foi confirmada (FIG. 8B). Na FIG. 8C, a citotoxicidade é mostrada das células T do CAR-ADR contra NALM-6 (um alvo do CAR CD19+), como um exem- plo de um alvo. A citotoxicidade das células T do CAR-ADR contra cé- lulas T ativadas (alvo de ADR) também foi determinada na FIG. 8D. A atividade citotóxica de células T do CAR-ADR contra ambos os alvos após a cocultura simultânea com ambos os alvos celulares é demons- trada na FIG. 8E.

[00137] As células T do CAR-ADR são protegidas da rejeição imu- nológica e exercem uma potente atividade antitumoral. Um exemplo de um modelo de camundongo e um regime está representado na FIG. 9A. Os camundongos receberam células T alogênicas do Doador 1 e b2mKO NALM6 com 24 horas à parte, seguido por uma dose única de células T do CAR-ADR do Doador 2, como um exemplo de um regime. A cinética de células T do Doador 2 no sangue periférico é fornecida na FIG. 9B, e a cinética das células T do Doador 1 nos grupos experi- mentais é fornecida na FIG. 9C. A FIG. 9D mostra a carga de leucemia nos camundongos, com determinação da sobrevida total dos camun- dongos (FIG. 9E).

[00138] FIGS. 13A-13C. As células T do CAR-ADR são protegidas da rejeição imune e exercem atividade antitumoral potente em um mo- delo de tumor sólido. O esquema de um exemplo de um modelo de camundongo e tratamento é mostrado na FIG. 10A, em que os ca- mundongos receberam células T alogênicas do Doador 1 e linhagem celular de neuroblastoma b2mKO CHLA255 com 24 horas à parte, se- guido por uma única dose de células T do CAR-ADR do Doador 2. As células T do CAR-ADR do doador 2 foram rejeitadas por D18, enquan- to que as células T do CAR-ADR resistiram à rejeição alogênica e per- sistiram no sangue periférico (FIG. 10B). A carga tumoral em camun-

dongos é mostrada na FIG. 13C, onde * indica mortes associadas com GvHD xenogênica no grupo T do CAR ATC+GD2.

[00139] Células T do CAR-ADR neutralizadas por TCR são protegi- das da rejeição imune e exercem potente atividade antitumoral. O es- quema do modelo de camundongo é fornecido no qual os camundon- gos receberam células T alogênicas do Doador 1 e b2mKO NALM6 24 h à parte, seguido por uma dose única de células T do CAR-ADR edi- tadas por TCR do Doador 2 (FIG. 11A). A cinética de células T do Do- ador 2 no sangue periférico é fornecida (FIG. 11B). A cinética das célu- las T do doador 1 nos grupos experimentais é mostrada (FIG. 11C). A carga de leucemia em camundongos (FIG. 11D) e a sobrevivência to- tal de camundongos são fornecidas (FIG. 11E).

[00140] As células T do ADR protegem camundongos contra GvHD xenogênica fatal. O esquema de um modelo é fornecido na FIG. 12A, e a expansão de células T do ADR marcadas com FFLuc in vivo é de- monstrada (FIG. 12B). A cinética de ganho/perda de peso em camun- dongos foi determinada (FIG. 12C). A sobrevida total de camundongos é representada (FIG. 12D).

[00141] O ADR de segunda geração com domínio de sinalização intracelular de CD28 ("ADR.28zeta") (como um exemplo) foi utilizado. Um exemplo de uma estrutura de ADR.28zeta é representado (FIG. 13A). A citotoxicidade in vitro foi determinada de ADR.28zeta contra células de expressão do alvo (FIG. 13B e FIG. 13C). ADR.28zeta pro- tegeu camundongos das linhagens xeno-GvHD (FIG. 13B). O esque- ma do modelo (FIG. 13D) é mostrado. A expansão de células T ADR.28zeta marcadas com FFLuc in vivo foi confirmada (FIG. 13E) A cinética de ganho/perda de peso em camundongos (FIG. 13F) e da sobrevida total dos camundongos foi determinada (FIG. 13G).

[00142] Embora a presente invenção e suas vantagens tenham sido descritas com detalhes, deve ficar entendido que várias mudanças,

substituições e alterações podem ser feitas nesta invenção sem se afastar do espírito e do escopo do projeto conforme definido pelas rei- vindicações anexas.

Além do mais, o escopo do presente pedido não se destina a ser limitado às modalidades particulares do processo, máquina, fabricação, composição da matéria, meios, métodos e eta- pas descritos no relatório descritivo.

Como uma pessoa de habilidade prática na técnica facilmente irá observar a partir da presente inven- ção, processos, máquinas, fabricação, composições de matéria, mei- os, métodos ou etapas, atualmente existentes ou a serem desenvolvi- dos posteriormente, que executam substancialmente a mesma função ou alcançam substancialmente o mesmo resultado que as modalida- des correspondentes aqui descritas, podem ser utilizados de acordo com a presente divulgação.

Consequentemente, as reivindicações anexas se destinam a incluir dentro de seu escopo tais processos, máquinas, fabricação, composições de matéria, meios, métodos ou etapas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polinucleotídeo isolado, compreendendo a sequência que codifica um polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que dito poli- peptídeo compreende: (1) um ou mais de um ligante específico de OX40, um ligante específi- co de 4-1BB, um ligante específico de CD40L ou seus derivados funci- onais; isto é, ligado de maneira operável a (2) um domínio de sinalização que promove a ativação de células T.

2. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende um ligante espe- cífico de OX40.

3. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende um ligante espe- cífico de 4-1BB.

4. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende o ligante especí- fico de CD40L.

5. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que o ligante específico de OX40 é OX40L, um anticorpo que direciona OX40, uma fusão de OX40L-Fc ou uma combinação dos mesmos.

6. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 e 3, caracterizado pelo fato de que o ligante específico de 4-1BB é 4-1BBL, um anticorpo que direciona 4-1BB, uma fusão de 4- 1BBL-Fc ou uma combinação dos mesmos.

7. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 e 4, caracterizado pelo fato de que o ligante específico de CD40L é CD40, um anticorpo que direciona CD40L, uma fusão de CD40-Fc ou qualquer outra proteína planejada capaz de ligação espe- cífica a CD40L.

8. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo ainda compreende 1, 2 ou mais domínios coestimuladores.

9. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo ainda compreende a sequência que codifica um espaçador entre (1) e (2).

10. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 9, carac- terizado pelo fato de que o espaçador possui entre 10 e 220 aminoáci- dos de comprimento.

11. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 10, ca- racterizado pelo fato de que o espaçador possui uma sequência que facilita a detecção de superfície com um anticorpo.

12. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 11, ca- racterizado pelo fato de que o espaçador é detectável com um Ab anti- Fc.

13. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 12, ca- racterizado pelo fato de que o espaçador compreende parte do Fc de IgG.

14. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo ainda codifica um receptor de antígeno quimérico, um receptor de cé- lulas T ou ambos.

15. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 14, ca- racterizado pelo fato de que existe um elemento 2A ou elemento IRES no polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da reivindicação 1 e o polinucleotídeo que codifica o receptor de antígeno quimérico, um re- ceptor de células T ou ambos.

16. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 15, ca- racterizado pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico compre- ende 1, 2 ou mais domínios coestimuladores.

17. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo está presente em um vetor.

18. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 17, ca- racterizado pelo fato de que o vetor é um vetor viral ou um vetor não viral.

19. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 18, ca- racterizado pelo fato de que o vetor viral é um vetor retroviral, vetor lentiviral, vetor adenoviral ou vetor viral adenoassociado.

20. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo está presente em uma célula.

21. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 20, ca- racterizado pelo fato de que a célula é uma célula eucariótica ou uma célula bacteriana.

22. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula imune.

23. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 20 a 22, caracterizado pelo fato de que a célula é planeja- da.

24. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 22, ca- racterizado pelo fato de que a célula imune é uma célula T.

25. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 24, ca- racterizado pelo fato de que a célula T compreende um ou mais recep- tores de antígenos quiméricos.

26. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 25, ca- racterizado pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico compre- ende 1, 2 ou mais domínios coestimuladores.

27. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 24, ca- racterizado pelo fato de que a célula T compreende um ou mais recep-

tores de células T projetados (TCRs).

28. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que é expresso por um polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções de 1 a 27.

29. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreen- de: (1) um ou mais de um ligante específico de OX40, um ligante específi- co de 4-1BB e CD40; isto é, ligado de maneira operável a (2) um domínio de sinalização que promove a ativação de células T.

30. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 29, caracte- rizado pelo fato de que o domínio de sinalização que promove a ativa- ção de células T é, a partir da subunidade CD3 zeta, DAP12, um re- ceptor Fc, ou uma combinação dos mesmos.

31. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ainda 1, 2 ou mais domínios coestimuladores.

32. Célula de expressão do receptor quimérico, caracteri- zada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 27, ou o polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 29 a 31.

33. Célula de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula imune.

34. Célula de acordo com a reivindicação 32 ou 33, caracte- rizada pelo fato de que a célula é planejada.

35. Célula de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a célula imune é uma célula T.

36. Célula de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que a célula T é uma célula T transferida por CAR.

37. Célula de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que a célula T é uma célula T transferida pelo receptor de células T (TCR).

38. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 37, caracterizada pelo fato de que a célula é planejada para ser desprovida de expressão endógena de um ou mais genes.

39. Célula de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que a célula é planejada para ser desprovida de expres- são endógena de 4-1BB, OX40 e/ou CD40L.

40. Célula de acordo com a reivindicação 38 ou 39, caracte- rizada pelo fato de que a célula é planejada utilizando CRISPR/Cas9, nucleases de dedo de zinco, nucleases TALE ou meganucleases.

41. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 40, caracterizada pelo fato de que a célula está alojada em um repositório de células.

42. Método de preparação de células para terapia celular, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de transfecção de células efetoras imunes com o polinucleotídeo como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 27.

43. Método de acordo com a reivindicação 42, caracteriza- do pelo fato de que ainda compreende a etapa de depositar as células em um repositório de células.

44. Método de acordo com a reivindicação 42 ou 43, carac- terizado pelo fato de que ainda compreende a etapa de modificar as células para expressar um ou mais receptores de antígenos quiméri- cos e/ou um ou mais receptores de células T recombinantes.

45. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 44, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a eta- pa de fornecer uma quantidade eficaz das células a um indivíduo com sua necessidade.

46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracteriza- do pelo fato de que as células são alogênicas em relação ao indivíduo.

47. Método de tratamento de um indivíduo para uma condi- ção médica com células terapêuticas alogênicas, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de fornecer ao indivíduo uma quanti- dade terapeuticamente eficaz de células alogênicas, em que ditas cé- lulas expressam um polipeptídeo compreendendo (1) um ou mais de um ligante específico de OX40, um ligante específico de 4-1BB, um ligante específico de CD40L, ou seus derivados funcionais; que está ligado de maneira operável a (2) um domínio de sinalização que pro- move a ativação de células T.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, caracteriza- do pelo fato de que as células são obtidas de um repositório de célu- las.

49. Método de acordo com a reivindicação 47 ou 48, carac- terizado pelo fato de que as células expressam um ou mais receptores de antígenos quiméricos e/ou um ou mais receptores de células T re- combinantes.

50. Método para evitar a rejeição de células, tecidos ou ór- gãos alogênicos em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que com- preende a etapa de liberar ao indivíduo uma quantidade eficaz de célu- las imunes alogênicas que expressam um receptor quimérico projeta- do que compreende um domínio extracelular que direciona os compos- tos que estão seletivamente presentes nas células T ativadas e que compreende CD3 zeta, em que a etapa de liberação resulta no que se segue ao indivíduo: (1) inibição de células T alorreativas endógenas no indivíduo; e/ou (2) supressão da ativação das células NK no indivíduo.

51. Método de acordo com a reivindicação 50, caracteriza- do pelo fato de que as células alogênicas são as células imunes alo- gênicas que expressam o receptor quimérico.

52. Método de acordo com a reivindicação 50 ou 51, carac-

terizado pelo fato de que as células alogênicas expressam um receptor de antígeno quimérico ou um receptor de células T projetado.

53. Método de acordo com a reivindicação 50, caracteriza- do pelo fato de que as células imunes alogênicas são liberadas ao in- divíduo antes, durante e/ou após o transplante de tecido e/ou órgão no indivíduo.

54. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 50 a 53, caracterizado pelo fato de que as células T ativadas são células T patogênicas.

55. Método de direcionamento seletivo de células T ativa- das em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de fornecer ao indivíduo uma quantidade eficaz de células imu- nes que expressam um receptor quimérico projetado, dito receptor quimérico compreendendo: (1) um domínio extracelular que direciona os compostos que estão se- letivamente presentes nas células T ativadas; e (2) um domínio de sinalização que promove a ativação de células T.

56. Método de acordo com a reivindicação 55, caracteriza- do pelo fato de que o domínio de sinalização que promove a ativação de células T é derivado da subunidade CD3 zeta, DAP12, um receptor Fc, ou uma combinação dos mesmos.

57. Método de acordo com a reivindicação 55 ou 56, carac- terizado pelo fato de que as células T ativadas são células T patogêni- cas.

58. Método para prevenir ou tratar uma condição médica re- lacionada com as células T ativadas em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de liberar ao indivíduo uma quantidade eficaz de células imunes que expressam um receptor qui- mérico projetado que seletivamente direciona ditas células T ativadas, dito receptor quimérico compreendendo:

(1) um domínio extracelular que direciona os compostos que estão se- letivamente presentes nas células T ativadas; e (2) um domínio de sinalização que promove a ativação de células T.

59. Método de acordo com a reivindicação 58, caracteriza- do pelo fato de que o receptor quimérico ainda compreende 1, 2 ou mais domínios coestimuladores.

60. Método de acordo com a reivindicação 58 ou 59, carac- terizado pelo fato de que a condição médica é um distúrbio autoimune.

61. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 58 a 60, caracterizado pelo fato de que a condição médica com- preende rejeição de enxerto, doença de enxerto versus hospedeiro, diabetes tipo I, esclerose múltipla, colite autoimune ou uma combina- ção dos mesmos.

62. Método para evitar a rejeição do hospedeiro mediada por células NK de células T alogênicas, tecidos ou órgãos em um indi- víduo, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de fornecer ao indivíduo uma quantidade eficaz de células imunes que expressam um receptor quimérico projetado que compreende um domínio extrace- lular que direciona os compostos que estão seletivamente presentes nas células T ativadas e que também compreendem um domínio de sinalização que promove a ativação de células T.

63. Método de acordo com a reivindicação 62, caracteriza- do pelo fato de que as células imunes que expressam o receptor qui- mérico projetado são as células T alogênicas.

64. Método de acordo com a reivindicação 62 ou 63, carac- terizado pelo fato de que as células imunes expressam um receptor de antígeno quimérico ou um receptor de células T projetado.

65. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 62 a 64, caracterizado pelo fato de que a quantidade de células imunes que expressam o receptor quimérico projetado que são forne-

cidas ao indivíduo está na faixa de 102 a 1012 por m2.

66. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 47 a 65, caracterizado pelo fato de que as células que expressam o receptor quimérico são fornecidas ao indivíduo sistêmica ou local- mente.

67. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 47 a 66, caracterizado pelo fato de que as células imunes são células T.

68. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 47 a 67, caracterizado pelo fato de que as células imunes são liberadas ao indivíduo uma ou mais de uma vez.