KR20210005173A - 활성화된 병원성 t 세포 및 nk 세포의 선택적 표적화를 위한 자가/동종면역 방어 수용체 - Google Patents

활성화된 병원성 t 세포 및 nk 세포의 선택적 표적화를 위한 자가/동종면역 방어 수용체 Download PDF

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KR20210005173A
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막심 마몬킨
말콤 케이. 브레너
페이옌 모
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베이롤 칼리지 오브 메드신
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Abstract

본 개시내용의 실시형태는 병원성 T 세포를 포함하는 활성화된 T 세포를 선택적으로 표적화하여 이들을 무력화시키는 조작된 자가/동종면역 방어 수용체(ADR)-발현 T 세포에 관한 것이다. 키메라 수용체는, 예를 들어, 그 발현이 활성화된 T 세포를 나타내는 4-1BB, OX40 및 CD40L을 표적화하기 위한 모이어티를 포함한다. 특정 실시형태에서, ADR을 암호화하는 세포의 입양 T-세포 전달을 사용하여 활성화된 T 세포와 관련된 병태를 예방 또는 치료하는 방법이 있다.

Description

활성화된 병원성 T 세포 및 NK 세포의 선택적 표적화를 위한 자가/동종면역 방어 수용체
본 출원은 2018년 4월 26일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/662,817호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
연방정부 지원 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 국립 보건원 및 국립 암 연구소에 의해 수여된 P50 CA126752 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 일정한 권리를 갖는다.
기술분야
본 개시내용의 실시형태는 적어도 면역학, 세포생물학, 분자생물학 및 의학 분야를 포함한다.
T-세포와 NK-세포의 원치 않는 활성화는 종종 이식편 또는 제3자 유래의 치료 세포를 받는 환자에서 생명을 위협하는 동종면역 반응을 촉진하여 이식된 장기/조직의 거부 또는 이식편 대 숙주 질환(GvHD)의 발병을 초래한다. 마찬가지로, 자가반응성 T 세포의 원치않는 활성화는 진성 당뇨병, 자가면역 대장염 및 다발성 경화증과 같은 파괴적인 자가면역 병태를 유발할 수 있다. 현재, 이러한 질환들의 대부분은 병원성 T 세포를 선택적으로 제거할 수 없기 때문에 치유할 수 없다. 대신, 환자는 종종 면역억제성 약물로 치료되는데 이는 환자를 면역결핍성이 되게 하여 감염 및 악성 형질전환에 걸리기 쉽게 만든다.
본 개시내용은, 면역계의 원치않는 활성화로 인한 병원성 상태를 제어하는 전달된 세포의 능력을 향상시킴으로써, 기성품(off-the-shelf) 세포를 이용하는 것을 포함하는 안전하고 효과적인 조직 이식 및 입양 세포 전달 분야에서 장기간 느꼈던 필요성에 대한 해결책을 제공한다.
본 개시내용은 면역 활성화로 인한 병원성 상태를 제어하기 위한 입양 전달을 위해 사용되는 세포와 관련된 조성물 및 방법에 관한 것이다. 조성물 및 방법은 자가 세포 및 동종이계 세포에 적용된다. 수용자 개체에서 동종이계 세포의 반응성을 감소시키기 위해 몇가지 조치가 취해질 수 있지만, 이러한 세포들은 여전히 이들을 이물질로서 인식할 수 있는 수용자의 면역계(주로 T-세포 및 NK-세포)의 표적이 되어 거부를 초래하고 치료 이점을 제한할 수 있다.
본 개시내용은 활성화된 병원성 T 세포, NK-T 세포 및 NK 세포를 표적화하도록 입양 요법 세포를 변형시켜 이들의 존재와 관련된 의학적 병태를 예방 또는 치료함으로써 이러한 문제를 극복한다. 특정 실시형태에서, 조성물 및 방법은 휴지 T 세포는 허용(spare)하면서 병원성 T 세포를 선택적으로 표적화하는 수용체를 발현하는 세포를 사용한 입양 T-세포 전달을 이용한다. 특정한 실시형태에서, 전달을 위한 입양 T-세포는 T 세포상의 그 존재가 병원성 T 세포를 나타내는 소정 표적 분자를 발현하는 병원성 T 세포를 표적화하는 키메라 분자를 발현하도록 조작된다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용은 병원성 T-세포의 선택적 표적화를 위한 자가/동종면역 방어 수용체(ADR)에 관한 것이다.
본 개시내용의 특정 실시형태는 ADR로 무장한 개별 세포에 제공함으로써 조작된 동종이계 T 세포가 숙주 개체에서 제거되는 것을 방지하는 방법을 포함한다. 실시형태는 또한 예를 들어, 조직 또는 장기 이식을 받는 개체에서 동종면역 반응을 피하는 방법을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용에 포함되는 세포는 동종이계 수용자를 포함하는 수용자에서 생존할 수 있도록 변형되었거나 변형될 수 있다. 특정한 경우에, 입양 세포 요법을 위한 세포(T 세포, NKT 세포 등을 포함)는 "기성품"으로 이용하기에 적합하며, 이는 본원에서 특정한 목적으로 이를 필요로 하는 개체에게 (추가 변형되었거나 변형 없이) 제공될 수 있는 저장소 또는 은행에 보관된 세포를 의미한다. 많은 경우에 개체는 세포가 본래 유래된 개체가 아니다. 이러한 방식으로 사용되는 세포는 ADR을 발현하도록 사전 제조될 수 있지만, 일부 경우에 세포는 은행으로부터 수득한 후 ADR을 발현하도록 변형된다. 저장된 세포는 CAR 또는 재조합 TCR을 발현할 수 있거나 발현하지 않을 수 있거나, 은행으로부터 수득된 세포는 이후에 CAR 또는 재조합 TCR을 발현하도록 변형될 수 있다. 이러한 관행은 숙주에 의한 면역 거부 없이 그리고 필요할 때마다 환자-특이적 생성물을 제조하지 않고도 제3자 유래의 치료 세포의 사용을 용이하게 할 수 있다.
특정 실시형태에서, (1) OX40-특이적 리간드, 4-1BB-특이적 리간드, CD40L-특이적 리간드 또는 이들의 기능적 유도체 중 하나 이상; 이에 작동가능하게 연결된 (2) T-세포 활성화를 촉진하는 신호전달 도메인을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드가 있다. 폴리뉴클레오타이드는 OX40-특이적 리간드, 4-1BB-특이적 리간드 또는 CD40L-특이적 리간드를 포함할 수 있다. OX40-특이적 리간드는 OX40L, OX40을 표적화하는 항체, OX40L-Fc 융합체 또는 이들의 조합 또는 OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 기타 조작된 단백질일 수 있다. 4-1BB-특이적 리간드는 4-1BBL, 4-1BB를 표적화하는 항체, 4-1BBL-Fc 융합체 또는 이들의 조합 또는 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 기타 조작된 단백질일 수 있다. CD40L-특이적 리간드는 CD40, CD40L을 표적화하는 항체, CD40-Fc 융합체 또는 CD40L에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 기타 조작된 단백질 또는 이들의 조합일 수 있다. 적어도 소정 경우에, 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 10 내지 220개 아미노산 길이와 같은, (1)과 (2) 사이의 스페이서를 암호화하는 서열을 추가로 포함한다. 스페이서는 항-Fc Ab로 검출 가능한 스페이서와 같은 항체로의 표면 검출을 용이하게 하는 서열을 가질 수 있다. 스페이서는 IgG Fc 부분을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드는 키메라 항원 수용체, T-세포 수용체 또는 둘 다를 추가로 암호화할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 벡터(레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 벡터) 또는 비바이러스 벡터(플라스미드, 트랜스포존 등)와 같은 벡터 상에 존재하는 것을 포함하는 임의의 형태일 수 있다. 특정 경우에, 폴리뉴클레오타이드는 진핵 세포 또는 세균 세포를 포함하는 세포에 존재한다. 세포는 T 세포와 같은 면역 세포일 수 있다. 세포는 조작될 수 있다. 세포는 하나 이상의 키메라 항원 수용체(CAR) 및/또는 하나 이상의 조작된 T 세포 수용체(TCR)를 포함할 수 있다.
본 개시내용에 포함되는 임의의 폴리뉴클레오타이드에 의해 발현되는 폴리펩타이드는 본 개시내용의 일부분으로서 포함된다. 특정 실시형태에서, (1) OX40-특이적 리간드, 4-1BB-특이적 리간드 및 CD40 중 하나 이상; 이에 작동가능하게 연결된 (2) T-세포 활성화를 촉진하는 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드가 있다. T-세포 활성화를 촉진하는 신호전달 도메인은 CD3 제타 서브유닛, DAP12, Fc 수용체 또는 이들의 조합으로부터 유래될 수 있다.
본 개시내용에 포함되는 임의의 세포는 본 개시내용의 일부분이다. 특정 실시형태에서, 임의의 키메라 수용체-발현 세포는 본원에서 고려되는 임의의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 본원에서 고려되는 임의의 폴리펩타이드를 포함하는 세포를 포함하는 본 개시내용의 일부이다. 세포는 조작된 세포일 수 있다. 세포는 CAR-형질도입된 T 세포 및/또는 T 세포 수용체(TCR)-형질도입된 T 세포를 포함하는 T 세포와 같은 면역 세포일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 세포는 4-1BB, OX40 및/또는 CD40L 중 하나 이상이 결여된 것과 같이 하나 이상의 유전자의 내인성 발현이 결여되도록 조작된다. 세포는 CRISPR/Cas9, 징크 핑거 뉴클레아제, TALE 뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제를 사용하여 조작될 수 있다. 대안적으로, 세포는 예를 들어 소포체 또는 다른 세포내 구획 내에 고정된 특이적 항체 또는 수용체로 ADR 리간드를 포획함으로써 ADR 리간드의 표면 발현을 방지하도록 조작될 수 있다.
한 실시형태에서, 개체의 동종이계 세포, 조직 또는 장기의 거부를 피하는 방법으로서, 활성화된 T 세포상에 선택적으로 존재하는 화합물을 표적화하는 세포외 도메인을 포함하고 CD3 제타를 포함하는 조작된 키메라 수용체를 발현하는 동종이계 면역 세포의 유효량을 개체에게 전달하는 단계를 포함하고, 상기 전달 단계가 개체에서 다음을 초래하는 방법이 있다: (1) 개체에서 내인성 동종반응성 T 세포의 억제; 및/또는 (2) 개체에서 NK 세포 활성화의 억제. 특정한 실시형태에서, 동종이계 세포는 키메라 수용체를 발현하는 동종이계 면역 세포이다. 동종이계 세포는 키메라 항원 수용체 및/또는 조작된 T 세포 수용체를 발현할 수 있다. 동종이계 면역 세포는 개체의 조직 및/또는 장기 이식 전, 동안 및/또는 후에 개체에게 전달될 수 있다. 특정한 경우에, 활성화된 T 세포는 병원성 T 세포이다.
한 실시형태에서, 개체에서 활성화된 T 세포를 선택적으로 표적화하는 방법으로서, 조작된 키메라 수용체를 발현하는 세포의 유효량을 개체에게 제공하는 단계를 포함하고, 상기 키메라 수용체가 (1) 활성화된 T 세포에 선택적으로 존재하는 화합물을 표적화하는 세포외 도메인; 및 (2) T-세포 활성화를 촉진하는 신호전달 도메인을 포함하는, 방법이 있다. T-세포 활성화를 촉진하는 신호전달 도메인은 CD3 제타 서브유닛, DAP12, Fc 수용체, 임의의 ITAM-포함 서열 또는 이들의 조합으로부터 유래될 수 있다. 특정한 경우에, 활성화된 T 세포는 병원성 T 세포이다.
소정 실시형태에서, 개체에서 활성화된 T 세포와 관련된 의학적 병태를 예방 또는 치료하는 방법으로서, 상기 활성화된 T 세포를 선택적으로 표적화하는 조작된 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포의 유효량을 개체에게 전달하는 단계를 포함하고, 상기 키메라 수용체가 (1) 활성화된 T 세포에 선택적으로 존재하는 화합물을 표적화하는 세포외 도메인; 및 (2) T-세포 활성화를 촉진하는 신호전달 도메인을 포함하는, 방법이 있다. 의학적 병태는 예를 들어 이식 거부, 이식편 대 숙주 질환, I형 당뇨병, 다발성 경화증, 자가면역 대장염 또는 이들의 조합과 같은 자가면역 장애일 수 있다.
한 실시형태에서, 개체에서 동종이계 T 세포, 조직 또는 장기의 NK 세포-매개 숙주 거부를 피하는 방법으로서, 활성화된 T 세포에 선택적으로 존재하는 화합물을 표적화하는 세포외 도메인을 포함하고 T-세포 활성화를 촉진하는 신호전달 도메인을 또한 포함하는 조작된 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포의 유효량을 개체에게 제공하는 단계를 포함하는 방법이 있다. 조작된 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포는 소정 경우에 동종이계 T 세포이다. 면역 세포는 키메라 항원 수용체 및/또는 조작된 T 세포 수용체를 발현할 수 있다. 개체에게 제공되는 조작된 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포의 양은 m2당 102 내지 1012개의 범위일 수 있다. 키메라 수용체를 발현하는 세포는 개체에게 전신 또는 국소 제공될 수 있다. 면역 세포는 T 세포일 수 있다. 면역 세포는 개체에게 1회 또는 1회 이상 전달될 수 있다.
전술한 내용은 하기의 상세한 설명이 더 잘 이해될 수 있도록 본 개시내용의 특징 및 기술적 이점을 다소 폭넓게 요약하였다. 본원에서 청구범위의 요지를 형성하는 추가적인 특징 및 이점은 이후에 설명될 것이다. 당업자는 개시된 개념 및 특정한 실시형태가 본 디자인의 동일한 목적을 수행하기 위한 다른 구조를 변형하거나 디자인하기 위한 기초로서 쉽게 이용될 수 있다는 것을 인식해야 한다. 또한, 당업자는 이러한 등가 구성이 첨부된 청구범위에 제시된 바와 같은 취지 및 범위를 벗어나지 않는다는 것을 인식해야 한다. 추가의 목적 및 이점과 함께, 본 개시내용의 구성 및 작동 방법 둘 다에 관해 본 개시내용에 개시된 디자인의 특징이라 믿어지는 새로운 특징은 첨부된 도면과 관련하여 고려될 때 다음의 설명으로부터 더 잘 이해될 것이다. 그러나, 각각의 도면이 단지 예시 및 설명 목적으로만 제공되며 본 개시내용의 제한의 한정으로서 의도되지 않는다는 것을 명확히 이해하여야 한다.
본 개시내용의 보다 완전한 이해를 위해, 이제 첨부된 도면과 함께 다음의 설명을 참조한다:
도 1A 내지 도 1E. ADR은 면역 세포의 세포 표면상에서 발현될 수 있으며 각 표적에 대한 세포독성을 촉진한다. (도 1A) ADR의 개략도. GFP는 선택적이다 (도 1B) 세포 표면상에서의 ADR의 발현 (도 1C) 형질도입 후 ADR T 세포의 증대(expansion)(도 1D) ADR 리간드를 발현하는 표적 세포에 대한 ADR T 세포의 세포독성 (도 1E) 야생형 대 4-1BB ADR을 발현하는 4-1BB KO T 세포의 증대 및 4-1BB+ 표적에 대한 이들의 세포독성은 T 세포상에서 ADR 리간드의 녹아웃이 증대 및 세포독성을 더욱 향상시킬 수 있음을 보여주며 T 세포상에서 ADR과 이의 리간드의 공동발현이 ADR-T 세포 증대 또는 기능에 요구되지 않음을 입증한다.
도 2A 내지 도 2E. 활성화된 T 세포상에서의 ADR 리간드의 선택적 발현은 ADR T 세포에 의한 이들의 선택적 제거를 가능하게 한다. (도 2A 내지 도 2C) TCR 자극 후 휴지 T 세포 대 활성화된 T 세포에서의 ADR 리간드의 발현. (도 2D) 휴지 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에 대한 ADR T 세포의 세포독성 부재 (도 2E) 48시간 공배양 후 ADR T 세포에 의한 활성화된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 제거.
도 3A 내지 도 3F. 4-1BB ADR의 발현은 MLR 모델에서 면역 거부로부터 T 세포를 보호한다 (도 3A) ADR을 xo-발현하는 TCRKO T 세포가 1:10 ADR T:PBMC 비에서 동종이계 PBMC와 공동배양된 후 거부로부터 보호됨을 도시하는 대표적인 점도표. (도 3B 내지 도 3C) 공동배양 동안 PBMC 중의 공여자 T 세포 및 동종이계 T 세포의 절대 계수 (도 3D 내지 도 3F) 바이러스-특이적 ADR T 세포에 대해 동일한 것.
도 4A 내지 도 4C. ADR의 발현은 시험관내 혼합 림프구 반응에서 면역 거부로부터 동종이계 바이러스-특이적 T 세포를 보호한다 (도 4A) ADR VST가 수용자 동종이계 PBMC에 의한 면역 거부로부터 보호된다는 것을 도시하는 대표적인 점도표 (도 4B 내지 도 4C) MLR 동안 다양한 시점에서의 수용자 T 세포 및 공여자 VST의 절대 계수.
도 5. ADR VST는 항바이러스 기능을 유지한다. ADR VST는 바이러스성 pepmix-펄스된(pulsed) 단핵구와 공동배양되었고 단핵구 계수는 ADR VST가 비변형 VST와 비교하여 바이러스 감염된 세포를 동일하게 잘 제거하였음을 나타냈다.
도 6A 내지 도 6H. 활성화된 NK 세포는 ADR 리간드를 상향조절하고 ADR T 세포에 의해 선택적으로 표적화될 수 있다 (도 6A 내지 도 6B) 휴지 NK 세포 대 활성화된 NK 세포에서의 4-1BB의 발현 (도 6C) 4-1BB ADR T 세포와의 24시간 공동배양 후 휴지 NK 세포 대 활성화된 NK 세포의 잔여 계수 (도 6D) MHC가 결여된 ADR T 세포는 NK 세포의 증대를 제어함으로써 동종이계 PBMC에 의한 면역 거부로부터 보호된다 (도 6E) 공동배양 동안 공여자 T 세포 및 동종 NK 세포의 절대 계수 (도 6F) MHC가 결여된 ADR T 세포는 1:1 E:T 비율에서 48시간 공동배양시 NK 세포에 의한 면역 거부에 저항한다. (도 6G 내지 도 6H) ADR T 세포는 PBMC를 사용한 MLR 동안 동종반응성 NK 세포의 증대를 제어하며, NK 세포의 절대 계수는 도 6H에 도표로 도시되어 있다.
도 7A 내지 도 7E. ADR 발현은 생체내에서 면역 거부로부터 동종이계 T 세포를 보호한다 (도 7A) 마우스에게 치사 선량 이하의 방사선 조사 후 HLA-A2+ 공여자로부터의 T 세포를 제공한 다음, 4일 후 동종이계 HLA-A2-T 세포를 투여한, 면역 거부의 마우스 모델의 개략도. (도 7B 내지 도 7C) HLA-A2- 공여자로부터의 대조군 T 세포는 18일차까지 거부된 반면, ADR-발현 세포는 보호되었다 (도 7C) 다양한 시점에서 HLA-A2+ 및 HLA-A2- 공여자로부터의 T 세포의 절대 계수. (도 7D) 마우스에게 동종이계 T 세포 대신에 공여자 1로부터의 전체 PBMC(T-세포와 NK-세포 둘 다를 함유)를 제공한 변형된 생체내 모델. (도 7E) ADR T 세포가 면역 거부로부터 보호되었고 또한 치명적인 GvHD의 급속한 발병으로부터 마우스를 보호하였음을 도시하는 대표적인 흐름도.
도 8A 내지 도 8E. CAR과 ADR의 공동발현은 두 수용체 모두의 기능을 보존한다 (도 8A) ADR과 CAR을 공동발현하는 면역 세포의 개략도 (도 8B) 세포 표면상에서의 CAR과 ADR의 공동발현 (도 8C) NALM-6(CD19+ CAR 표적)에 대한 CAR-ADR T 세포의 세포독성 (도 8D) 활성화된 T 세포(ADR 표적)에 대한 CAR-ADR T 세포의 세포독성 (도 8E) 두 세포 표적 모두와의 동시 공동배양시 두 표적 모두에 대한 CAR-ADR T 세포의 세포독성 활성.
도 9A 내지 도 9E. CAR-ADR T 세포는 면역 거부로부터 보호되고 강력한 항종양 활성을 발휘한다 (도 9A) 마우스 모델의 개략도. 마우스에게 24 시간 간격으로 공여자 1로부터의 동종이계 T 세포 및 b2mKO NALM6을 제공한 다음, 공여자 2로부터의 CAR-ADR T 세포의 단일 용량을 제공하였다. (도 9B) 말초혈 중의 기증자 2로부터의 T 세포의 동역학 (도 9C) 실험군에서의 공여자 1 T 세포의 동역학 (도 9D) 마우스의 백혈병 부담(leukemia burden) (도 9E) 마우스의 전체 생존기간.
도 10A 내지 도 10C. CAR-ADR T 세포는 고형 종양 모델에서 면역 거부로부터 보호되고 강력한 항종양 활성을 발휘한다. (도 10A) 마우스 모델의 개략도. 마우스는 24시간 간격으로 공여자 1로부터의 동종이계 T 세포 및 b2mKO 신경모세포종 세포주 CHLA255를 투여받은 다음, 공여자 2로부터의 CAR-ADR T 세포의 단일 용량을 투여 받았다. (도 10B) 공여자 2 GD2 CAR T 세포는 D18까지 거부된 반면, CAR-ADR T 세포는 동종이계 거부에 저항하고 말초혈에서 지속되었다. (도 10C) 마우스의 종양 부담, *는 ATC+ GD2 CAR T 그룹에서 이종-GvHD 관련 사망을 나타낸다.
도 11A 내지 도 11E. TCR-녹아웃 CAR-ADR T 세포는 면역 거부로부터 보호되고 강력한 항종양 활성을 발휘한다 (도 11A) 마우스 모델의 개략도. 마우스에게 24 시간 간격으로 공여자 1로부터의 동종이계 T 세포 및 b2mKO NALM6을 제공한 다음, 공여자 2로부터의 TCR-편집된 CAR-ADR T 세포의 단일 용량을 제공하였다. (도 11B) 말초혈 중의 공여자 2로부터의 T 세포의 동역학 (도 11C) 실험군에서의 공여자 1 T 세포의 동역학 (도 11D) 마우스의 백혈병 부담 (도 11E) 마우스의 전체 생존기간.
도 12A 내지 도 12D. ADR T 세포는 치명적인 이종 GvHD로부터 마우스를 보호한다 (도 12A) 모델의 개략도 (도 12B) 생체내 FFLuc-표지된 ADR T 세포의 증대 (도 12C) 마우스에서 체중 증가/감소의 동역학 (도 12D) 마우스의 전체 생존기간.
도 13A 내지 도 13G. CD28 세포내 신호전달 도메인을 갖는 2세대 ADR(ADR.28제타). (도 13A) ADR.28제타의 구조. (도 13B 내지 도 13C) 표적-발현 세포주에 대한 ADR.28제타의 시험관내 세포독성. (도 13D 내지 도 13G) ADR.28제타는 이종 -GvHD로부터 마우스를 보호하였다. (도 13D) 모델의 개략도 (도 13E) 생체내 FFLuc-표지된 ADR.28제타 T 세포의 증대(도 13F) 마우스의 체중 증가/감소의 동역학(도 13G) 마우스의 전체 생존기간.
도 14. 암에서 ADR-발현 세포의 세포독성. (좌측) HDLM-2 호지킨 림프종 세포에 대한 4-1BB ADR-발현 T 세포의 세포독성 (우측) K562 만성 골수성 백혈병(CML) 세포에 대한 4-1BB ADR-발현 T 세포의 세포독성. 1:1 효과기 대 표적 비에서 48시간 공동배양시 종양 세포의 절대 계수가 도시되어 있다.
단어 포함하는과 관련하여, 청구범위를 비롯한 본 명세서에 사용될 때 단어 "하나"(원문의 "a" 및 "an")는 "하나 이상"을 의미한다. 본 발명의 일부 실시형태는 본 발명의 하나 이상의 요소, 방법 단계 및/또는 방법으로 이루어지거나 본질적으로 이루어질 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법 또는 조성물은 본원에 기재된 임의의 다른 방법 또는 조성물과 관련하여 실시될 수 있는 것으로 고려된다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다", "포함한다" 및 "포함하는"은 언급된 단계 또는 요소, 또는 단계 또는 요소의 그룹을 포함하지만, 임의의 다른 단계 또는 요소, 또는 단계 또는 요소의 그룹을 배제하지는 않는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. "로 이루어진"이란, 문구 "로 이루어진"에 뒤따르는 모든 것을 포함하고 이들로 제한되는 것을 의미한다. 따라서, 문구 "로 이루어진"은 열거된 요소가 요구되거나 필수적인 것이고, 존재할 수 있는 다른 요소가 없음을 나타낸다. "로 본질적으로 이루어진"이란, 이 문구 다음에 열거된 임의의 요소를 포함하고, 열거된 요소의 개시에 명시된 활성 또는 작용을 저해하지 않거나 명시된 활성 또는 작용에 기여하는 기타 요소들로 제한되는 것을 의미한다. 따라서, 문구 "로 본질적으로 이루어진"은 열거된 요소가 요구되거나 필수적이지만, 선택적이고 열거된 요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지 아닌지의 여부에 따라 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있는 기타 요소가 없음을 나타낸다.
본 명세서 전체에 걸쳐 "한 실시형태" 또는 "실시형태", "특정 실시형태", "관련 실시형태", "소정 실시형태", "추가적인 실시형태" 또는 "추가의 실시형태" 또는 이들의 조합에 대한 언급은 실시형태와 관련하여 기재된 특정 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시형태에 포함되는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸쳐 다양한 위치에서 상기 문구의 출현은 반드시 모두가 동일한 실시형태를 지칭하는 것은 아니다. 더욱이, 특정 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 실시형태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 일반적으로 임의의 종류의 의학적 병태에 대한 요법이 필요한 개체를 의미한다. 대상체는 임의의 종류의 동물일 수 있다. 대상체는 포유동물, 예를 들어 사람, 실험실 동물(예를 들어, 영장류, 래트, 마우스, 토끼), 가축(예를 들어, 소, 양, 염소, 돼지, 칠면조 및 닭), 가정 애완 동물(예를 들어, 개, 고양이 및 설치류), 말 및 트랜스제닉 비사람 동물을 포함하는, 방법 또는 물질의 대상인 임의의 유기체 또는 동물 대상체일 수 있다. 대상체는 환자일 수 있고, 예를 들어 하나 이상의 감염성 질환, 하나 이상의 유전 질환, 하나 이상의 암 또는 이들의 임의의 조합과 같은 질환(의학적 병태로 지칭될 수 있음)에 걸렸거나 걸린 것으로 의심될 수 있다. 질환은 병원성일 수 있다. 대상체는 항생제 치료를 받고 있을 수 있거나 받았을 수 있다. 대상체는 무증상일 수 있다. 대상체는 건강한 개체일 수 있다. 용어 "개체"는 적어도 일부 경우에 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본원에 사용되는 "대상체" 또는 "개체"는 의료 시설에 수용되거나 수용되지 않을 수 있으며 의료 시설의 외래 환자로서 치료될 수 있다. 개체는 인터넷을 통해 하나 이상의 의료 조성물을 받을 수 있다. 개체는 임의의 연령의 사람 또는 비사람 동물을 포함할 수 있고 따라서 성인 및 청소년(즉, 아동) 및 유아를 모두 포함하며 태내 개체에 포함한다. 개체는 임의의 인종 및 성별일 수 있다. 상기 용어가 의학적 치료의 필요성을 의미하는 것은 아니며 따라서 개체는 임상적이든 기초 과학 연구를 지원하든 자발적으로 또는 비자발적으로 실험의 일부분이 될 수 있습니다.
본원에서 사용되는 용어 "조작된"은 자연에 존재하지 않고 당업계의 표준 유전자 재조합 기술에 의한 것과 같은 사람의 손에 의해 생성된 분자를 의미한다.
본 개시내용의 맥락에서, "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은, 개체에게 투여되는 경우에, 활성화된 T 세포의 표적화를 가능하게 하고/하거나 의학적 병태의 징후 및 증상을 개선시키거나 의학적 병태를 예방하는 세포의 양을 의미한다. 투여될 실제 양은 기능성 면역 세포가 의학적 병태에 대해 약리학적 활성을 나타내는 시험관내 또는 생체내에서 수행된 연구에 기초하여 결정될 수 있다.
I. 자가/동종면역 방어 수용체 및 이의 조성물 및 용도
본 개시내용은 병원성 T 세포를 포함하는 활성화된 T 세포의 선택적 표적화를 제공하는 합성 키메라 수용체 분자를 포함한다. 조작된 분자는 합성이며 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 상기 분자는 높은 특이성을 갖는 것을 포함하여 활성화된 병원성 T 세포를 포함하는 활성화된 T 세포를 표적화하는 자가/동종면역 방어 수용체로 지칭될 수 있다.
특정 실시형태에서, 자가/동종면역 방어 수용체(ADR)는 활성화된 T 세포에서 상향조절되는 하나 이상의 화합물을 표적화하는 실체를 포함한다. 활성화된 T 세포에서 상향조절되는 화합물은 어느 하나 또는 이들의 조합일 수 있지만, 특정한 실시형태에서 OX40, 4-1BB 및 CD40L이 활성화된 T 세포에서 상향조절되고 ADR이 표적화하는 대상이다. ADR은 특정 실시형태에 세포를 받는 개체에 대해 동종이계인 면역 세포상에 존재한다. 다른 사례에서, ADR은 자가 T 세포, 이종 세포 및/또는 합성 세포에서 발현된다.
A. 자가/동종면역 방어 수용체(ADR) 분자
ADR 분자는 합성, 비천연이고 사람의 손에 의해 생성되며 적어도 (1) 활성화된 T 세포상에 선택적으로 존재하는 화합물을 표적화하는 세포외 도메인(특정한 실시형태에서, 세포외 도메인은 활성화된 T 세포에서 상향조절되는 하나 이상의 화합물을 표적화하는 단백질 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체이다); 이에 작동가능하게 연결된 (2) 예를 들어, CD3 제타 서브유닛, DAP12 및 Fc 수용체로부터 유래된 것들 또는 다른 ITAM-포함 서열을 포함하는 T-세포 활성화를 촉진하는 신호전달 도메인을 포함한다. ADR 분자는 요소(1) 및 요소(2)를 포함하거나 이것으로 이루어지거나 이것으로 본질적으로 이루어질 수 있다. 적어도 소정 경우에서, ADR은 I형 막관통 단백질의 하나 이상의 성분 및/또는 II형 막관통 단백질의 하나 이상의 성분을 포함한다.
특정한 실시형태에서, ADR 분자에서 세포외 도메인은 활성화된 T 세포상의 관련 단백질에 선택적으로 결합하는 단백질을 포함한다. 예를 들어, ADR 세포외 도메인은 활성화된 T 세포상의 수용체에 대한 리간드를 포함할 수 있거나, ADR 세포외 도메인은 활성화된 T 세포상의 리간드에 대한 수용체를 포함할 수 있다.
특정한 실시형태에서, ADR 분자에서 세포외 도메인은 OX40에 대한 리간드, 4-1BB에 대한 리간드 및/또는 CD40을 포함한다. 이러한 특정 예는 각각 OX40, 4-1BB 및 CD40L인 활성화된 T 세포상의 관련 단백질을 가지고 있다. 대안적 실시형태에서, 활성화된 T 세포상의 다른 특정 조성물이 표적화된다. 예를 들어, T 세포의 세포 표면에서 상향조절되는 다른 활성화 마커(CD69, CD25, CD71 등과 같은)는 유사한 접근 방식을 사용하여 표적화될 수 있다. 이러한 경우, 상응하는 ADR 분자는 4-1BB/OX40-특이적 리간드 대신에 각각의 CD69, CD25 또는 CD71 리간드 또는 항체 유래의 표적화 모이어티를 가질 수 있다.
일부 경우에, 활성화되지 않은 T 세포와 대조적으로, OX40의 발현의 상향조절을 갖는 활성화된 T 세포가 표적화된다. 이러한 활성화된 T 세포를 표적화하기 위해, OX40에 대한 리간드를 ADR에서 이용하여 활성화된 T 세포를 표적화할 수 있다. OX40에 대한 리간드가 ADR에서 이용되는 경우, OX40에 대한 리간드는 적어도 OX40L, OX40에 결합하는 항체(또는 이의 기능적 단편), Fc와 OX40L의 융합체 또는 이의 기능적 유도체 또는 단편을 포함하는 OX40에 대한 임의의 적합한 리간드일 수 있다. OX40L은 또한 종양 괴사 인자(리간드) 슈퍼패밀리, 구성원 4(tax-전사적으로 활성화된 당단백질 1,34kDa), OX40L, CD252, TNFSF4, TXGP1, OX-40L 또는 gp34로 지칭될 수 있다.
일부 경우에, 활성화되지 않은 T 세포와 대조적으로, 4-1BB 발현의 상향조절을 갖는 활성화된 T 세포가 표적화된다. 이러한 활성화된 T 세포를 표적화하기 위해, 4-1BB의 리간드를 ADR에서 이용하여 활성화된 T 세포를 표적화할 수 있다. 4-1BB에 대한 리간드가 ADR에서 이용되는 경우, 4-1BB에 대한 리간드는 4-1BB, 4-1BB를 표적화하는 항체(또는 이의 기능적 단편), Fc와 4-1BBL의 융합체 또는 이의 기능적 유도체 또는 단편을 포함하는 4-1BB에 대한 임의의 적합한 리간드일 수 있다.
소정 경우에, 활성화되지 않은 T 세포와 대조적으로, CD40L 발현의 상향조절을 갖는 활성화된 T 세포가 표적화된다. 이러한 활성화된 T 세포를 표적화하기 위해, CD40L에 대한 수용체를 ADR에서 이용하여 활성화된 T 세포를 표적화할 수 있다. CD40L에 대한 수용체가 ADR에서 이용되는 경우, ADR은 CD40(Bp50, CDW40, TNFRSF5 또는 p50으로도 지칭될 수 있음), CD40L을 표적화하는 항체(또는 이의 기능적 단편) 또는 이의 기능적 유도체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.
일부 경우에, ADR 분자는 활성화된 T 세포의 표적화를 용이하게 하기 위해 2개 이상의 세포외 도메인을 포함한다. 이러한 조합은 일반적으로 활성화된 T 세포의 표적화를 향상시킬 수 있거나 활성화된 T 세포의 소정 서브세트의 특이적 표적화를 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, ADR은 OX40 또는 4-1BB를 발현하는 활성화된 T 세포의 표적화를 가능하게 하기 위해 동일한 ADR 분자 내에 세포외 도메인으로서 OX40L과 4-1BBL 둘 다를 포함할 수 있다. 이러한 조합의 예는, OX40 또는 4-1BB를 발현하는 활성화된 T 세포가 CD40L을 또한 발현하는지 발현하지 않는지 여부와 관계 없이, 이러한 T 세포를 선택적으로 표적화할 수 있다. 유사하게, ADR은, CD40L 또는 OX40을 발현하는 활성화된 T 세포가 4-1BB를 또한 발현하는지 발현하지 않는지 여부와 관계 없이, 이러한 활성화된 T 세포를 표적화하기 위해 CD40과 OX40L 둘 다를 포함할 수 있다.
ADR 분자에서, 세포외 도메인은 ADR 분자의 일부분인 성분을 포함하는 하나 이상의 성분에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이러한 성분 중 하나는 T 세포 활성화 동안 다운스트림 신호전달을 매개하는 단백질일 수 있다. 특정 실시형태에서, ADR은 CD3제타(CD247, CD3-제타, CD3H, CD3Q, CD3Z, IMD25, T3Z 또는 TCRZ로도 지칭됨) 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체를 포함한다. CD3제타는 T 세포 활성화 동안 다운스트림 ITAM 유래의 신호전달을 매개한다. 다른 ITAM-함유 신호전달 도메인은 DAP12, Fc 수용체, 다른 CD3 서브유닛 등으로부터 유래된 것들을 포함할 수 있다. 신호전달 도메인은 또 다른 도메인을 통해 ADR에 비공유적으로 연결될 수 있다.
특정 실시형태에서, ADR은 활성화된 T 세포에서 상향조절되는 하나 이상의 화합물을 표적화하는 세포외 단백질과 CD3 제타 사이의 스페이서를 포함한다. 다른 경우에는 스페이서가 사용되지 않는다. 스페이서는 ADR이 가질 수 있는 임의의 기능과 관련하여 불활성이거나 실질적으로 거의 기여하지 않는 서열을 포함할 수 있는 반면, 다른 경우에 스페이서는, 예를 들어, ADR의 기능을 향상시키고/시키거나 검출될 수 있도록 하고/하거나 억제의 표적이 될 수 있도록 하는 서열을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 스페이서는 ADR을 발현하는 세포의 검출을 용이하게 하는 암호화된 단백질 서열을 포함한다. 예를 들어, 스페이서는 항-Fc Ab를 사용하는 것과 같이 세포의 표면 검출을 가능하게 할 수 있는 Fc 영역 또는 이의 단편을 암호화할 수 있다. 특정 실시형태에서, 스페이서는 I형 ADR 골격(TM, 신호전달 도메인)을 갖는 II형 막관통 단백질(4-1BBL, OX40L)의 스플라이싱에 의해 유발되는 것들과 같은 잠재적인 입체 장애를 피하기 위해 리간드 결합 도메인과 막 사이에 분리를 제공한다. 스페이서는 일례로 약 10 내지 220개의 아미노산을 포함하는 임의의 적합한 길이일 수 있다. 스페이서 길이는 10-220, 10-200, 10-150, 10-100, 10-50, 25-200, 25-150, 25-100, 25-75, 25-50, 50-200, 50-150, 50-125, 50-100, 50-75, 75-200, 75-150, 75-100, 100-200, 100-175, 100-150, 100-125, 125-200, 125-175, 125-150, 150-200, 150-175, 175-200개 등의 범위일 수 있다. 스페이서는 약 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210 또는 220개 아미노산 길이일 수 있다. 다른 경우에, 스페이서는 10개 아미노산 미만 또는 200개 아미노산 이상이다.
일부 경우에, ADR은 ADR을 발현하는 세포로부터 사이토킨 생산을 향상시키는 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 공동자극 도메인을 포함한다. 공동자극 도메인은 CD28, CD27, 4-1BB, OX40, ICOS, CD30, HVEM, CD40 등을 포함하는 공동자극 단백질의 세포내 신호전달 도메인으로부터 유래될 수 있다. 단지 일례로, ADR이 4-1BBL을 포함하는 경우, ADR의 공동자극 도메인은 4-1BB의 것일 수 있거나 아닐 수 있다.
일부 실시형태에서, ADR은, ADR의 CD3 제타 성분이 세포내에 위치할 수 있도록 하고 활성화된 T 세포에서 상향조절되는 하나 이상의 화합물을 표적화하는 세포외 도메인이 세포외에 위치할 수 있도록 하는 한, 어떠한 종류라도 될 수 있는 막관통 도메인을 포함할 것이다. 다른 사례에서, ADR은 활성화된 T 세포상의 각각의 리간드에 결합할 수 있고 TCR(예를 들어, ADR-CD3 T-세포 관여자 단백질(T-cell engager protein))을 가교결합시킴으로써 세포독성을 촉진할 수 있는 가용성 단백질이다. 세포외 도메인이 막관통 도메인(예를 들어, CD40)을 갖는 표면 단백질로부터 유래된 경우, ADR은 상응하는 내인성 분자로부터의 막관통 도메인을 포함할 수 있다. ADR 분자가 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함하는 일부 경우에, 막관통 도메인(TM)은 공동자극 도메인을 갖는 동일한 내인성 분자로부터 유래될 수 있다. TM의 예로는 CD3, CD8α, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD4 등이 포함된다.
ADR 폴리펩타이드의 예에서, 성분은 특정 N-말단(N) 내지 C-말단(C) 순서로 있을 수 있다. 일반적인 ADR의 경우, 수용체는 다음 중 하나를 포함할 수 있으며(예로서만) 세포외 도메인은 활성화된 T 세포상의 관련 단백질에 선택적으로 결합하는 단백질을 포함한다:
N-세포외 도메인-신호전달 도메인-C
N-세포외 도메인-CD3제타-C
N-세포외 도메인-스페이서-CD3제타-C
N-세포외 도메인-스페이서-공동자극 도메인-CD3제타-C
N-세포외 도메인-스페이서-2개의 공동자극 도메인-CD3제타-C
N-2개의 세포외 도메인-스페이서-공동자극 도메인-CD3제타-C
N-2개의 세포외 도메인-스페이서-2개의 공동자극 도메인-CD3제타-C
어떠한 경우에라도, 막관통 도메인은 스페이서에 대해 C-말단일 수 있다. N- 말단의 신호 펩타이드는 I형 막관통 단백질 골격(예컨대, 막관통 도메인, 신호전달 도메인, CD3 제타)상의 II형 리간드(예컨대, OX40L 및 4-1BBL)의 발현을 용이하게 하기 위해 이용될 수 있다.
일부 경우에, ADR은 발색성, 형광성 및/또는 방사성 등인 마커와 같은 하나 이상의 검출 가능한 마커를 포함한다. 예로는 녹색 형광 단백질, 청색 형광 단백질 등이 포함된다.
ADR이 합성에 의해 단백질로서 생성될 수 있지만, ADR은 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 의해 발현된 폴리펩타이드의 형태일 수 있다. ADR 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드를 생산하는 재조합 기술은 당업계에 공지되어 있다.
소정 경우에, ADR 폴리뉴클레오타이드는 발현 작제물 내에 있거나 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터일 수 있는 벡터상에 존재하는 발현 작제물의 일부분이다. 비바이러스 벡터의 예로는 플라스미드가 포함된다. 바이러스 벡터의 예로는 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스 벡터가 포함된다. ADR을 발현하는 임의의 벡터는 예를 들어 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포와 같은 면역 세포를 포함하는 진핵 세포에서 발현을 가능하게 하는 적절한 요소(들)를 가질 것이다. 이러한 적절한 요소로는 프로모터 등이 포함된다.
4-1BB ADR (서열번호 1)
Figure pct00001
OX40 ADR (서열번호 2)
Figure pct00002
CD40L ADR (서열번호 3)
Figure pct00003
특정 실시형태에서, 활성화된 T 세포를 표적화하는 세포외 도메인은 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 의미한다. 항체는 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래된 온전한 면역글로불린일 수 있고 온전한 면역글로불린의 면역반응성 부분일 수 있다. 항체는 전형적으로 면역글로불린 분자의 사량체이다. 본 발명의 항체는 예를 들어 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, Fv, Fab 및 F(ab)2뿐만 아니라 단일쇄 항체 및 사람화 항체를 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있다(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).
일부 경우에, ADR의 세포외 도메인은 항체 단편을 포함한다. 용어 "항체 단편"은 온전한 항체의 일부분을 지칭하고 온전한 항체의 항원성 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 선형 항체, scFv 항체 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
합성 항체가 ADR에 사용될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "합성 항체"란, 예를 들어 본원에 설명된 박테리오파아지에 의해 발현된 항체와 같은 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체를 의미한다. 상기 용어는 또한 항체를 암호화하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성된 항체로서, 상기 DNA 분자가 항체 단백질 또는 항체를 지정하는 아미노산 서열을 발현하고, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열이 당업계에서 이용가능하며 널리 공지된 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용함으로써 수득된 것인 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 한다.
B. ADR을 발현하는 세포
입양 전달에 사용되는 동종이계 세포는 수용자 개체에 의한 면역 반응으로 인해 제한된 효능을 갖는 경향이 있다. 일부 경우에, 예를 들어 이식편 대 숙주 질환을 예방하기 위해, 세포를 (예컨대, CRISPR를 이용하여) 내인성 TCR을 제거하도록 변형시킬 수 있지만, 대안적으로 소정 병리학적 상태에서 유용한 항바이러스 활성을 유지하기 위해 바이러스-특이적 T 세포(온전한 또는 CAR/TCR 변형)를 이용할 수 있다. 이러한 VST는 이의 TCR이 바이러스 항원으로 더욱 제한되기 때문에 매우 제한된 이식편 대 숙주 활성을 갖지만, 수용자에 의한 유해 반응에 여전히 취약하다.
본 개시내용에는 합성 ADR 분자를 발현하도록 변형됨으로써 동종이계 사용을 위해 개선된 세포가 포함된다. 따라서, 본 개시내용은 ADR을 보유하는 세포를 폴리뉴클레오타이드로서 및 세포 표면상에 발현된 ADR 폴리펩타이드로서 포함한다. 특정 경우에, ADR-발현 세포는 기성품 사용을 위해 저장소에 보관할 목적으로 생산된다. 세포는 이미 ADR을 발현하도록 구성되어 저장소에 보관될 수 있거나, 세포는 은행에 보관되고 저장소로부터 회수된 후 ADR을 발현하도록 구성될 수 있다. 세균 세포와 같은 소정 세포는 ADR 분자를 생성하는데 이용될 수 있는 반면, ADR을 보유하는 진핵 세포와 같은 다른 세포는 활성화된 T 세포를 표적화하는 것을 포함하는 본 개시내용의 방법을 위해 사용될 수 있다. 본원에 제시된 바와 같이, ADR-발현 면역 세포는 활성화된 T 세포를 선택적으로 제거하고, ADR-발현 면역 세포는 동종반응성 T 세포에 의한 세포분해로부터 보호된다.
ADR 분자를 발현하는 세포는 임의의 종류일 수 있지만, 특정한 실시형태에서 이들은 면역 세포, 예를 들어 T 세포, NK 세포, NKT 세포와 같은 면역 효과기 세포, 또는 상기 계통으로부터 유래된 세포주 또는 ADR을 발현하도록 변형되어 자연에서 발견되지 않는 세포독성 활성을 갖도록 조작된 세포주이다. 집단의 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%가 ADR-발현 세포인 집단을 포함하는 비천연 ADR-발현 세포의 집단이 고려된다. 세포는 일례로 합성 ADR 폴리뉴클레오타이드의 형질감염 또는 형질도입의 표준 방법에 의해 생성될 수 있다.
일부 경우에, ADR 분자를 발현하도록 변형된 ADR 분자는 ADR 이외의 다른 조작된 비천연 분자를 갖도록 이미 조작되었을 수 있거나 이후에 조작될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 조작된 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 세포는 이렇게 함으로써 이러한 세포를 숙주 거부로부터 보호할 수 있으므로 치료 효능을 증가시킬 수 있다. 하나 이상의 CAR 및/또는 하나 이상의 TCR을 발현하는 세포는 하나 이상의 ADR을 발현하도록 조작될 수 있거나, 하나 이상의 ADR을 발현하는 세포는 하나 이상의 CAR 및/또는 하나 이상의 TCR을 발현하도록 조작될 수 있다. 따라서, 일부 경우에 ADR은 CAR 및/또는 TCR과 상이한 벡터에서 발현되지만, 다른 경우에 ADR 분자는 CAR 및/또는 TCR과 동일한 벡터에서 발현된다. ADR이 CAR과 동일한 벡터에서 발현되는 경우(일례로서), ADR 및 CAR 발현은 동일하거나 상이한 조절 요소로부터 유도될 수 있다. 임의의 경우에, ADR 및 CAR은 이들 사이에 2A와 같은 절단 가능한 요소를 갖는 단일 폴리펩타이드로서 발현될 수 있다.
ADR-발현 세포가 CAR 또는 TCR을 또한 발현하는 경우, CAR 또는 TCR은 임의의 특정 항원을 표적화할 수 있다. CAR이 사용되는 경우, CAR은 1세대, 2세대, 3세대 등일 수 있다. CAR은 특정한 경우에 이중특이적일 수 있다.
일부 경우에, ADR 분자를 발현하는 세포는 조작되는데, 예컨대 하나 이상의 내인성 분자의 발현이 결여되도록 조작된다. 특정한 경우에, 세포는 그 밖에 세포의 사멸(fratricide)를 용이하게 할 수 있는 하나 이상의 내인성 유전자의 발현이 결여되도록 조작된다. 특정한 경우에, ADR 분자를 발현하는 세포는 예를 들어 4-1BB 또는 OX40의 발현이 결여되도록 조작된다. 세포 공학은 단지 일례로서 CRISPR/Cas9에 의해 발생할 수 있다.
II. 자가/동종면역 방어 수용체의 사용 방법
본 개시내용의 실시형태는 임의의 목적을 위해 유효량의 ADR-발현 세포를 개체에게 제공하는 방법을 포함한다. 방법은 어떤 목적으로든 개체에서 활성화된 T 세포를 선택적으로 표적화하는 것을 포함한다. 활성화된 T 세포는 활성화된 T 세포를 ADR-발현 T 세포와 같은 ADR-발현 면역 세포의 유효량에 노출시킴으로써 표적화된다. 이러한 노출은 예를 들어 하나 이상의 결과적인 적용을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, ADR은 활성화된 T 세포 이외의 활성화된 면역 세포, 예컨대 B 세포를 선택적으로 표적화(루푸스, 류마티스 관절염 등과 같은 원치 않는 B 세포 반응을 제어하는데 유용할 수 있음)하는데 뿐만 아니라, 선천성 면역의 활성화(예컨대, 대식세포 활성화 증후군 등)를 표적화하는데 사용된다. 다른 실시형태에서, ADR은 예를 들어 4-1BB 또는 OX40 또는 CD40L을 포함하는 이들의 상응하는 표적을 발현하는 악성 세포를 특이적으로 표적화하기 위해 이용된다.
ADR-발현 세포의 유효량을 개체에게 제공하기 위한 용법은 공지되어 있거나 요법 또는 예방을 위해 또는 사용 방법에 관계 없이 세포를 전달하는 개체 또는 개체들에 의해 결정될 수 있다. 예방용인 경우에, 예를 들어 세포는 하나 이상의 증상의 검출 전에 전달될 수 있거나, 세포는 하나 이상의 증상의 검출 후 그러나 추가 증상(들)이 발생하고/하거나 악화되기 전에 전달될 수 있다. 치료용인 경우에, 1가지, 2가지 또는 그 이상의 증상이 발생한 후 개체에게 유효량의 세포가 제공될 수 있으며 임상 진단 후일 수 있다.
방법의 특정한 측면에서, 개체에게 치료학적 유효량의 세포의 단일 용량이 제공될 수 있거나, 개체에게 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 또는 1, 2, 3 또는 4주, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월, 또는 1년, 2년, 3년, 4년, 5년 또는 그 이상 또는 그 사이의 임의의 범위로 분리된 다수회 전달과 같은 치료학적 유효량의 세포의 다수회 전달이 제공될 수 있다. 투여 사이의 시간은 단일 용법에서는 다를 수 있다.
ADR-발현 세포의 투여는 국소적 또는 전신적 경로를 포함하는, 개체에 대한 임의의 적절한 경로를 통해 이루어질 수 있다. 특정한 실시형태에서 ADR-발현 세포는 정맥내, 경구(orally), 직장, 국소, 근육내, 주입에 의해, 장, 비강, 흡입에 의해, 설하, 구강(bucally), 경피, 피하 등으로 전달된다. 세포는 볼루스(bolus)로서 전달되거나 전달되지 않을 수 있다. 다수회 투여의 경우, 세포는 상이한 전달 경로로 개체에게 제공되거나 제공되지 않을 수 있다. 세포가 개체에게 전달될 때, 이들은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제 중에서 전달될 수 있다. ADR-발현 세포에 대한 용량의 특정 예는 104개 세포/m2, 105개 세포/m2, 106개 세포/m2, 107개 세포/m2, 108개 세포/m2, 109개 세포/m2, 1010개 세포/m2, 1011개 세포/m2 또는 1012개 세포/m2 및 그 사이의 범위를 포함한다.
A. 기성품 실시형태를 위한 사용
본 개시내용은, 세포가 본래 수득된 개체 이외의 개체에서 사용하기 위한 목적으로 저장소로부터 획득될 수 있는 것을 포함하는, 기성품으로 이용될 수 있도록 하는 입양 전달을 위한 세포를 포함한다. 세포는 저장소에 기탁되기 전에 이미 ADR을 발현할 수 있거나, 세포는 이후에 ADR을 발현하도록 변형될 수 있다. 세포는 입양 전달을 위한 임의의 종류의 면역 효과기 세포일 수 있다. 저장소에 기탁하기 전 또는 저장소로부터 수득한 후, 세포는 예를 들어 종양 특이적 수용체(예를 들어, CAR 또는 TCR)을 발현하도록 변형될 수 있다.
본원의 다른 부분에 제시된 바와 같이, ADR을 발현하는 세포는, 휴지 T 세포는 허용하면서, 활성화된 T-세포 및 NK-세포를 선택적으로 표적화한다. ADR은 생체내에서 면역 거부로부터 T 세포를 보호하는 것 외에도 시험관내에서 T-세포 및/또는 NK-세포에 의해 매개되는 면역 거부로부터 동종이계 T 세포를 보호한다. ADR과 CAR을 공동발현하는 T 세포는 시험관내에서 종양과 활성화된 T 세포 둘 다를 효율적으로 제거할 수 있기 때문에, ADR은 이렇게 하면서 조작된 항종양 수용체(일례로서 CAR)의 기능을 방해하지 않는다. 본 개시내용은 동일한 마우스에 존재하는 동종이계 T 세포로부터의 면역 거부에 대한 내성을 유지하면서 CAR과 ADR을 공동발현하는 "기성품" T 세포를 사용하는 마우스 모델에서 생체내 항암 활성을 추가로 제공한다. 일례로, 도 14에는, 4-1BB ADR이 4-1BB+ 종양 세포에 대해 효과적이어서 ADR이 4-1BB-발현 악성종양에 대한 치료 양식으로서 사용될 수 있다는 것이 도시되어 있다.
특정 실시형태에서, "기성품" 치료 세포는 ADR을 발현하여, 면역 거부에 저항하고 (예를 들어, 바이러스 또는 종양 항원에 대한) 내인성 TCR 특이성을 유지하거나 하나 이상의 CAR 및/또는 하나 이상의 재조합 TCR과 같은 조작된 항종양 수용체로 대체된 내인성 TCR을 갖는다.
특정한 실시형태에서, 기성품 세포는 저장소에 보관되며 저장소에 기탁되기 전 또는 후에 특정한 목적을 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, ADR-발현 T 세포는 이식 거부를 방지하기 위해, 예컨대 조직 또는 장기 이식 후에 저장소에 보관되고 사용 준비가 될 수 있다. ADR-발현 T 세포는 저장소에 보관될 수 있으며, 예를 들어 바이러스 감염 또는 암에 대한 천연 또는 트랜스제닉 TCR로 선택되거나 조작될 수 있다. ADR-발현 T 세포는 저장소에 보관될 수 있으며 암 또는 병원성 감염에 대해 지향된 CAR로 형질도입될 수 있다. ADR-발현 세포는 저장소에 보관될 수 있으며 특정한 암-관련 항원 또는 환자의 특정한 종양에 의해 발현된 신생항원에 대해 지향된 하나 이상의 CAR 및/또는 하나 이상의 TCR로 형질도입될 수 있다.
일부 경우에, 저장된 동종이계 세포는 특히, ADR-발현 세포가 그 자체로 동종반응성이 아닌 경우에 거부성 숙주 면역 세포를 파괴함으로써 고형 장기 이식의 거부를 예방하기 위해 사용된다.
저장소에 보관된 세포는 수용자 개체에 대해 동종이계일 수 있지만, 대안적인 실시형태에서 저장소에 보관된 세포는 수용자 개체에 대해 자가이다. 예를 들어, 암에 걸린 개체는 암이 관해에서 벗어나는 경우와 같이 후속 사용을 위해 ADR 발현 T 세포를 저장소에 기탁할 수 있다. 다른 경우에, 자가 ADR-발현 세포는 자가면역 장애의 치료를 위해 저장소에 보관된다.
B. 자가면역 장애에서의 사용
개체에서 내인성 자가반응성 T 세포의 원치 않는 활성화는 진성 당뇨병, 자가면역 대장염 및 다발성 경화증과 같은, 개체에게 치명적인 자가면역 질환을 유발할 수 있다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 자가면역 장애는 개체에서 내인성 자가반응성 T 세포를 억제함으로써 자가면역 장애(또는 이의 잠재적 발생)에 영향을 미치는 개체의 ADR-발현 면역 세포를 사용하여 예방 또는 치료된다. 특정한 실시형태에서, 이러한 ADR-발현 세포의 사용은 개체에서 휴지 비병원성 나이브(naive) T 세포 및 기억 T 세포는 허용한다. 따라서, 본 개시내용의 소정 방법은 ADR을 발현하도록 변형된 특정 세포를 이용하며, 이는 병원성 T 세포를 포함하는 활성화된 T 세포를 표적화함으로써 활성화된 T 세포의 파괴를 개시하기에 충분한 양으로 개체에게 제공된다.
원치 않는 특이성을 갖는 T 세포의 생체내 활성화는 병원성을 유발할 수 있으며, 특정 실시형태에서 하나 이상의 ADR을 발현하는 세포는 활성화된 T 세포를 표적화한다. 일부 경우에, ADR-발현 세포는 활성화된 T 세포의 서브세트인 병원성 세포를 표적화한다.
특정 경우에, ADR-발현 T 세포는 ADR-발현 T 세포를 이용한 입양 T-세포 전달을 사용하여 활성화된 T 세포에 의해 유도되는 생명에 위협적이고 쇠약하게 하는 병태(예로서, 장기 거부, 이식편 대 숙주 질환, I형 당뇨병, 다발성 경화증, 자가면역 대장염, 루푸스, 류마티스 관절염)를 예방하거나 역전시키는데 사용될 수 있다.
일부 경우에, ADR-발현 T 세포는 또한 하나 이상의 자가면역 장애의 치료 또는 예방을 용이하게 하는, ADR 이외의 하나 이상의 조성물을 포함한다.
일부 경우에, ADR-발현 T 세포가 제공되는 개체는 하나 이상의 자가면역 장애를 예방하거나 치료하기 위한 하나 이상의 추가 요법을 받는다. 개체에게 예를 들어 글루코코르티코이드, 세포증식 억제제, 항체 및/또는 이뮤노필린에 작용하는 약물과 같은 하나 이상의 면역억제성 약물이 제공되거나 제공되지 않을 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 개체에게 하나 이상의 적절한 백신이 제공될 수 있다.
일부 경우에, 개체는 자가면역 장애에 걸릴 위험이 있으며, 개체에게 자가면역 장애의 발병을 예방하거나 발병을 지연시키고/시키거나 예를 들어 중증도 및/또는 기간을 포함하는 하나 이상의 증상을 경감시키기에 유효한 양의 ADR-발현 세포가 제공된다. 예를 들어, 자가면역 질환에 걸릴 위험이 있는 개체는 개인 병력 또는 가족력을 갖거나 소정 민족의 여성 등인 개체이다. 개체는 하나의 자가면역 장애를 가질 수 있으며, 일부 경우에 중증도 및/또는 기간을 예방하거나 감소시키거나 다른 자가면역 장애(들)의 발병을 지연시키기를 원한다.
ADR-발현 세포로 예방 또는 치료될 수 있는 자가면역 장애의 예로는 적어도 다음이 포함된다: 이완불능증; 에디슨병; 성인형 스틸병; 무감마글로불린혈증; 원형탈모증; 아밀로이드증; 강직성 척추염; 항-GBM/항-TBM 신장염; 항인지질 증후군; 자가면역 혈관부종; 자가면역 자율신경기능이상; 자가면역 뇌척수염; 자가면역 간염; 자가면역 내이 질환(AIED); 자가면역 심근염; 자가면역 난소염; 자가면역 고환염; 자가면역 췌장염; 자가면역 망막병증; 자가면역 두드러기; 축삭 및 뉴런 신경병증(AMAN); 발로병; 베체트병; 양성 점막 유사천포창; 물집유사천포창; 캐슬맨병(CD); 복강 질환; 샤가스병; 만성 염증성 탈수초 다발신경병증(CIDP); 만성 재발성 다발성 골수염(CRMO); 척-스트라우스 증후군(CSS) 또는 호산구 육아종증(EGPA); 흉터 유사천포창; 코간 증후군; 저온 응집병; 선천성 심장 차단; 콕사키 심근염; 크레스트 증후군; 크론병; 헤르페스형 피부염; 피부근육염; 데빅병(시신경 척수염); 원반모양 루푸스; 드레슬러 증후군; 자궁내막증; 호산구성 식도염(EoE); 호산구성 근막염; 결절성 홍반; 원발성 혼합 한랭글로불린증; 에반스 증후군; 섬유근육통; 섬유화 폐포염; 거대 세포 동맥염(측두 동맥염); 거대 세포 심근염; 사구체신염; 굿파스처 증후군; 육아종증 다발혈관염; 그레이브스병; 길랑-바레 증후군; 하시모토 갑상선염; 용혈성 빈혈; 헤노흐-쇤라인 자색반(HSP); 임신 헤르페스 또는 임신 유사천포창(PG); 화농성 한선염(HS)(전위 여드름); 저감마글로불린혈증; IgA 신증; IgG4-관련 경화 질환; 면역성 저혈소판 자반(ITP); 봉입체 근염(IBM); 간질성 방광염(IC); 소아 관절염; 소아 당뇨병(1형 당뇨병); 소아 근염(JM); 가와사키병; 램버트-이튼 증후군; 백혈구파괴 혈관염; 편평 태선; 경화 태선; 목질 결막염; 선상 IgA 질환(LAD); 루푸스; 만성 라임병; 메니에르병; 미세 다발혈관염(MPA); 혼합 결합 조직 질환(MCTD); 무렌 각막궤양; 무차-하버만병; 다초점성 운동 신경병증(MMN) 또는 MMNCB; 다발성 경화증; 중증 근무력증; 근염; 기면증; 신생아 루푸스; 시신경 척수염; 중성구감소증; 눈 흉터 유사천포창; 시신경염; 재발 류마티즘(PR); PANDAS; 부신생물 소뇌 퇴행증(PCD); 발작성 야간 헤모글로빈뇨증(PNH); 패리 롬버그 증후군; 평면부염(말초 포도막염); 파르소니지-터너 증후군; 천포창; 말초 신경병증; 정맥주변 뇌척수염; 악성 빈혈(PA); POEMS 증후군; 결절 다발동맥염; 다선 증후군 I형; 다선 증후군 II형; 다선 증후군 III형; 류마티스성 다발근육통; 다발근육염; 심근경색증후 증후군; 심낭막절개술후 증후군; 원발성 담즙성 간경변증; 원발성 경화 담관염; 프로게스테론 피부염; 건선; 건선성 관절염; 순수 적혈구 무형성(PRCA); 괴저화농피부증; 레이노 현상; 반응 관절염; 반사성 교감신경 이영양증; 재발성 다발연골염; 하지 불안 증후군(RLS); 후복막 섬유증; 류마티스 열; 류마티스 관절염; 사르코이드증; 슈미트 증후군; 공막염; 피부경화증; 쇼그렌 증후군; 정자 및 고환 자가면역; 강직 사람 증후군(SPS); 아급성 세균성 심내막염(SBE); 수삭 증후군; 교감 눈염증(SO); 타카야수 동맥염; 측두 동맥염/거대 세포 동맥염; 혈소판감소 자색반(TTP); 톨로사-헌트 증후군(THS); 횡단 척수염; 1형 당뇨병; 궤양성 대장염(UC); 미분화 연결 조직 질환(UCTD); 포도막염; 혈관염; 백반증; 보그트-고야나기-하라다병; 및 베게너 육아종증(또는 육아종증 다발혈관염(GPA)).
C. NK 세포를 제거하기 위한 사용
ADR-발현 면역 세포는 NK 세포를 제거하는 것이 바람직한 경우에 NK 세포를 제거하기 위해 이용될 수 있다. 본원에서 입증된 바와 같이, 소정 면역 세포상의 ADR의 존재는 HLAlow 또는 HLA-미스매치된 세포의 신속한 거부를 매개하는 것과 관련된 NK 세포에 대한 특이적 세포독성 활성을 제공한다. 따라서, HLAlow 또는 HLA-미스매치된 세포를 유지하는 것이 바람직한 상황에서, 예를 들어 동종이계 세포를 소정 개체에게 입양 전달하는 것을 이용할 수 있기 위해, ADR-발현 세포의 사용은 NK 세포 활성화 및 HLA-미스매치된 세포의 거부를 피한다. 구체적으로, 본원에 제시된 바와 같이, ADR을 발현하는 T 세포의 공동배양은 NK 세포의 제거를 초래하여 ADR-발현 동종이계 T 세포의 NK 세포-매개 숙주 거부를 상쇄한다.
D. 동종이계 세포/조직/장기 이식의 생착을 용이하게 하기 위한 사용
동종반응성 T 세포의 활성화를 피하는 특정한 측면에서, 주로 수용자로부터의 동종반응성 T 세포 집단에 의해 매개되는, 이식을 받는 개체에서의 동종이계 세포, 조직 또는 장기의 거부를 피할 수 있다. 수용자의 동종반응성 T 세포의 활성화는 예를 들어 이러한 거부를 피하기 위한 조치를 취하지 않은 경우에 이식 실패로 이어질 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 세포, 조직 또는 장기를 개체에게 이식하는 방법은 세포, 조직(들) 또는 장기(들)의 각각의 이식 전, 동안 및/또는 후에 유효량의 ADR-발현 세포의 전달을 이용한다. 일부 경우에, ADR-발현 세포는 자체가 이식 대상인 세포, 조직 또는 장기의 일부분이 아닌 반면, 다른 경우에 ADR-발현 세포는 각 세포, 조직(들) 또는 장기(들)의 일부분이다.
이식을 위한 조직은, 예를 들어, 적어도 피부, 각막, 뼈, 힘줄, 심장 판막, 정맥 또는 동맥을 포함하는 임의의 종류일 수 있다. 이식을 위한 장기는 예를 들어 심장, 신장, 간, 폐, 췌장, 장 및 흉선을 포함하는 임의의 종류일 수 있다.
특정 실시형태에서, ADR-발현 세포는 2가지 방향의 접근법으로서 개체에서 동종이계 세포 사용을 향상시킨다: (1) 이들은 개체에서 내인성 동종반응성 T-세포를 억제하고; (2) 이들은 개체에서 NK 세포-매개 거부를 억제한다. 이와 같이, ADR 분자는 개체에서 예를 들어 T-세포, NK-세포, NK-T 세포, 점막 관련 불변 T 세포(MAIT), 및 키메라 항원 수용체(CAR), 트랜스제닉 TCR 등과 같은 조작된 작제물을 발현하는 세포를 포함하는 기타 세포독성 세포를 포함하는 동종이계 치료 세포를 포함하는 임의의 유형의 제3자 유래의 치료 세포의 지속성 및 활성을 향상시킬 수 있다.
E. 동종이계 세포/조직/장기 이식 동안 이식편 대 숙주 질환(GvHD)의 예방 또는 치료에서의 사용
동종반응성 T 세포의 활성화를 피하는 또 다른 특정한 측면에서, 동종이계 세포, 조직 또는 장기를 이식 받는 개체에서 생명을 위협하는 동종면역 반응을 피할 수 있다. 이러한 이식편은, 예를 들어, 활성화를 피하기 위한 조치를 취하지 않은 경우에 이식편 대 숙주 질환(GvHD)의 발생을 유도할 수 있는 공여자 동종반응성 T 세포를 함유할 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 세포, 조직 또는 장기를 개체에게 이식하는 방법은 세포, 조직(들) 또는 장기(들)의 각 이식 전, 동안 및/또는 후에 유효량의 ADR-발현 세포의 전달을 이용한다. 일부 경우에 ADR-발현 세포 자체는 이식 대상인 세포, 조직 또는 장기의 일부분이 아닌 반면, 다른 경우에 ADR 발현 세포는 각 세포, 조직(들) 또는 장기(들)의 일부분이다.
이식용 조직은 예를 들어 적어도 피부, 각막, 뼈, 힘줄, 심장 판막, 정맥 또는 동맥을 포함하는 임의의 종류일 수 있다. 이식용 장기는 예를 들어 심장, 신장, 간, 폐, 췌장, 장 및 흉선을 포함하는 임의의 종류일 수 있다.
III. ADR-발현 세포의 생산
ADR 분자를 발현하는 세포는 다양한 방식으로 생산될 수 있으며, 모두 당업계에서 일상적일 수 있다. 생산 방법은 ADR 분자를 발현하도록 변형될 세포를 수득하는 것을 포함할 수 있으며, 또한 ADR 분자의 생성을 포함할 수 있다.
A. T 세포의 공급원
본 개시내용의 ADR-발현 T 세포의 증대 및 유전적 변형 전에, T 세포의 공급원이 대상체로부터 수득될 수 있다. 이러한 수득 단계는 방법의 일부분일 수 있거나 아닐 수 있다. 일부 경우에, 변형될 T 세포의 수득 및 이의 조작은 ADR 발현-T 세포를 개체에게 제공하는 사람 이외의 사람에 의해 수행될 수 있다. T 세포는 말초혈 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위의 조직, 복수, 흉막 삼출물, 비장 조직 및 종양을 포함하는 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 본 개시내용의 소정 실시형태에서, 당업계에서 이용 가능한 임의의 수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 소정 실시형태에서, T 세포는 Ficoll™ 분리와 같이 당업자에게 공지된 임의의 수의 기술을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액의 유니트(unit)로부터 수득될 수 있다. 한 실시형태에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 성분채집술에 의해 수득된다. 성분채집술 생성물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함하는 림프구를 함유한다. 한 실시형태에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하고 후속 처리 단계를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 세포를 배치하기 위해 세척될 수 있다. 한 실시형태에서, 세포는 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척된다. 대안적인 실시형태에서, 세척 용액은 칼슘이 결여되어 있고 마그네슘이 결여될 수 있거나 모든 2가 양이온은 아니더라도 많이 결여될 수 있다. 당업자라면, 제조업체의 지침에 따라 반자동 "통류" 원심분리기(예를 들어, Cobe 2991 세포 처리기, Baxter CytoMate 또는 Haemonetics Cell Saver 5)를 사용하는 것과 같은 당업자에게 공지된 방법에 의해 세척 단계가 달성될 수 있음을 쉽게 인식할 수 있다. 세척 후, 세포를 예를 들어 Ca2+-비함유, Mg2+-비함유 PBS, PlasmaLyte A 또는 완충액이 있거나 없는 다른 식염수 용액과 같은 다양한 생체적합성 완충액에 재현탁할 수 있다. 대안적으로, 성분채집술 샘플의 바람직하지 않은 성분을 제거하고 세포를 배양 배지에 직접 재현탁할 수 있다.
다른 실시형태에서, T 세포는, 예를 들어, PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리에 의해 또는 역류 원심분리 용출에 의해 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써 말초혈 림프구로부터 단리된다. CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및 CD45RO+ T 세포와 같은 T 세포의 특정 하위집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 집단의 농축은 음성으로 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 대해 지향된 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 한 가지 방법은 음성으로 선택된 세포에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 모노클로날 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역부착 또는 유세포측정을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 농축시키기 위해, 모노클로날 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 소정 실시형태에서, 전형적으로 CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ 및 FoxP3+를 발현하는 조절 T 세포를 농축시키거나 양성적으로 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 소정 실시형태에서, T 조절 세포는 항-C25 접합된 비이드 또는 다른 유사한 선택 방법에 의해 고갈된다.
양성 또는 음성 선택에 의해 원하는 세포 집단을 단리하기 위해, 세포 및 표면(예를 들어, 비이드와 같은 입자)의 농도를 변경할 수 있다. 소정 실시형태에서, 세포와 비이드의 최대 접촉을 보장하기 위해, 비이드와 세포가 함께 혼합되는 용적을 현저히 감소시키는(즉, 세포의 농도를 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 한 실시형태에서, 20억개 세포/ml의 농도가 사용된다. 한 실시형태에서, 10 억개 세포/ml의 농도가 사용된다. 추가 실시형태에서, 1억개 초과의 세포/ml가 사용된다. 추가 실시형태에서, 1천만, 1천 5백만, 2천만, 2천 5백만, 3천만, 3천 5백만, 4천만, 4천 5백만 또는 5천만개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 7천 5백만, 8천만, 8천 5백만, 9천만, 9천 5백만 또는 1억개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가 실시형태에서, 1억 2천 5백만 또는 1억 5천만개 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다. 고농도를 사용하면 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 증대를 증가시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 더 낮은 농도의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포와 표면(예를 들어, 비이드와 같은 입자)의 혼합물을 상당히 희석시킴으로써 입자와 세포 간의 상호작용을 최소화된다.
자극을 위한 T 세포는 또한 세척 단계 후에 동결될 수 있다. 이론에 얽매이지 않기를 바라면서, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단 중에서 과립구를 제거하고 어느 정도 단핵구를 제거하여 보다 균일한 제품을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후, 세포를 동결 용액에 현탁할 수 있다. 많은 동결 용액 및 매개변수가 당업계에 공지되어 있다. 소정 실시형태에서, 동결보존된 세포를 본원에서 설명한 바와 같이 해동시키고 세척하고, 본 발명의 방법을 사용하여 활성화하기 전에 실온에서 1시간 동안 휴지될 수 있도록 한다.
또한, 본 발명과 관련하여 본원에 기재된 바와 같은 증대된 세포가 필요할 수 있을 때 그 전의 일정 기간에 대상체로부터 혈액 샘플 또는 성분채집술 생성물을 수집하는 것이 고려된다. 이와 같이, 증대시킬 세포의 공급원은 필요한 임의의 시점에 수집될 수 있고, 원하는 세포, 예컨대 T 세포가 단리되고, 본원에 기재된 것과 같은 T 세포 요법으로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 수많은 질환 또는 병태에 대한 T 세포 요법에 추후 사용하기 위해 동결될 수 있다. 한 실시형태에서, 혈액 샘플 또는 성분채집술은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취된다. 소정 실시형태에서, 혈액 샘플 또는 성분채집술은 질환이 발생할 위험이 있지만 아직 질환이 발생하지 않은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취되고, 관심대상의 세포가 단리되고, 추후 사용을 위해 동결된다. 소정 실시형태에서, T 세포는 증대, 동결되고, 나중에 사용될 수 있다. 소정 실시형태에서, 샘플은 본원에 기재된 바와 같은 특정한 질환의 진단 직후에, 그러나 임의의 치료 전에 환자로부터 수집된다. 추가의 실시형태에서, 세포는 나탈리주맙(natalizumab), 에팔리주맙(efalizumab) 및 항바이러스제와 같은 제제, 화학요법, 방사선, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트(mycophenolate) 및 FK506과 같은 면역억제제, 항체, 또는 CAMPATH, 항-CD3 항체, 사이톡산, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드 및 FR901228과 같은 기타 면역절제제, 및 방사선조사를 사용하는 치료를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 수많은 관련 치료 양식 전에 대상체로부터의 혈액 샘플 또는 성분채집술로부터 단리된다. 이들 약물은 칼슘 의존성 포스파타제 칼시뉴린(사이클로스포린 및 FK506)을 억제하거나, 성장 인자 유도된 신호전달(라파마이신)에 중요한 p70S6 키나제를 억제한다(Liu et al., Cell 66: 807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73: 316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5: 763-773, 1993). 추가의 실시형태에서, 세포는 환자를 위해 단리되고, 골수 또는 줄기세포 이식, 및 플루다라빈, 외부-빔 방사선 요법(XRT) 또는 사이클로포스파미드와 같은 화학요법제 또는 OKT3 또는 CAMPATH와 같은 항체 중 하나를 이용하는 T 세포 제거 요법과 함께(예를 들어, 이전, 동시에 또는 이후) 추후 사용을 위해 동결된다. 또 다른 실시형태에서, 세포는 CD20과 반응하는 제제, 예를 들면, 리툭산(Rituxan)과 같은 B-세포 제거 요법 전에 단리하고, 상기 B-세포 제거 요법 후에 추후 사용을 위해 동결될 수 있다.
B. T 세포의 활성화 및 증대
ADR을 발현하도록 하는 T 세포의 유전적 변형 전인지 또는 후인지에 관계 없이, T 세포는 일반적으로, 예를 들어, 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 및 제6,867,041호, 및 미국 특허출원 제2006-0121005호에 기재된 방법을 이용하여 활성화되고 증대될 수 있다. 일반적으로, 본 개시내용의 T 세포는 CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 제제 및 T 세포의 표면상의 공동자극 분자를 자극하는 리간드가 부착되어 있는 표면과의 접촉에 의해 증대된다. 이러한 과정은 당업계에 공지되어 있다. 다른 사례에서, T 세포는 사전 활성화 없이 ADR을 발현하도록 변형될 수 있다.
C. ADR 분자의 생성
일반적으로 ADR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 넘어가면, ADR 분자를 암호화하는 핵산 서열은 당업계에 공지된 재조합 방법을 사용하여, 예컨대 예를 들어 유전자를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝함으로써, 이를 포함하는 것으로 공지된 벡터로부터 유전자를 유도함으로써 또는 표준 기술을 사용하여 이를 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접 단리함으로써 수득될 수 있다. 대안적으로, 관심대상의 ADR 폴리뉴클레오타이드는 클로닝하기 보다는 합성적으로 생산될 수 있다.
간단히 요약하면, ADR을 암호화하는 합성 폴리뉴클레오타이드의 발현은 전형적으로 ADR 폴리펩타이드 또는 이의 일부분을 암호화하는 핵산을 프로모터에 작동가능하게 연결하고, 작제물을 발현 벡터 내로 혼입시킴으로써 달성된다. 벡터는 진핵생물에서의 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 전사 및 번역 종결인자, 개시 서열, 및 원하는 핵산 서열의 발현의 조절에 유용한 프로모터를 함유한다.
ADR 폴리뉴클레오타이드는 수많은 유형의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스 및 코스미드를 포함하나 이에 한정되지는 않는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 특정 관심대상의 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터 및 시퀀싱 벡터를 포함한다.
또한, 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)], 및 다른 바이러스학 및 분자생물학 매뉴얼에 설명되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 렌티바이러스를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 일반적으로 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능적인 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 이상의 선택가능한 마커를 함유한다(예를 들어, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 제6,326,193호).
수많은 바이러스-기반 시스템이 포유동물 세포 내로의 유전자 전달을 위해 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 벡터 내로 삽입되고 당업계에 공지된 기술을 사용하여 레트로바이러스 입자 내에 패키징될 수 있다. 이어서, 재조합 바이러스는 단리되고, 생체내 또는 생체외에서 대상체의 세포로 전달될 수 있다. 수많은 레트로바이러스 시스템이 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 수많은 아데노바이러스 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 한 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다.
추가의 프로모터 요소, 예를 들어 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 개시 부위의 30 내지 110 bp 업스트립의 영역에 위치하지만, 수많은 프로모터는 기능적 요소를 또한 개시 부위의 다운스트림에 함유하는 것으로 밝혀진 바 있다. 프로모터 요소들 사이의 간격은 빈번하게 탄력적이어서, 프로모터 기능은 요소가 역전되거나 서로에 대해 이동할 때 보존된다. 티미딘 키나제(tk) 프로모터에서, 프로모터 요소들 사이의 간격은 활성이 감소하기 시작하기 전 50 bp까지 증가할 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소는 전사를 활성화하기 위해 협동적으로 또는 독립적으로 기능할 수 있는 것으로 보인다.
적합한 프로모터의 일례는 극초기 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 서열이다. 이러한 프로모터 서열은 그에 작동가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현을 구동할 수 있는 강력한 항시적(constitutive) 프로모터 서열이다. 적합한 프로모터의 또 다른 예는 신장 성장 인자-1알파(EF-1알파)이다. 그러나, 시미안 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV), 사람 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스 극초기 프로모터, 라우스(Rous) 육종 바이러스 프로모터 뿐만 아니라, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터 및 크레아틴 키나제 프로모터와 같으나 이에 한정되지 않는 사람 유전자 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 항시적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 항시적 프로모터의 사용으로 한정되지 않아야 한다. 유도성 프로모터가 또한 본 발명의 일부분으로서 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 발현이 바람직한 경우에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 개시할 수 있거나 발현이 바람직하지 않은 경우에 발현을 종료할 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예로는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터 및 테트라사이클린 프로모터가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.
ADR 폴리펩타이드 또는 이의 일부분의 발현을 평가하기 위해, 세포 내로 도입될 발현 벡터는 또한 바이러스 벡터를 통해 형질감염 또는 감염시키고자 하는 세포의 집단으로부터 발현 세포의 동정 및 선택을 용이하게 하기 위한 선택가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 이들 둘 다를 함유할 수 있다. 다른 측면에서, 선택가능한 마커는 DNA의 개별 조각상에 보유되고, 공동형질감염 절차에 사용될 수 있다. 선택가능한 마커 및 리포터 유전자 둘 다는 숙주 세포에서 발현이 가능하도록 하는 적절한 조절 서열과 플랭킹될 수 있다. 유용한 선택가능한 마커는 예를 들어 neo 등과 같은 항생제-내성 유전자를 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 동정하고 조절 서열의 기능성을 평가하기 위해 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는, 수용자 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 이에 의해 발현되지 않고, 이의 발현이 일부 용이하게 검출 가능한 특성, 예를 들어 효소적 활성에 의해 표시되는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포 내로 도입된 후 적합한 시간에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비형 알칼리성 포스파타제를 암호화하는 유전자 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82]). 적합한 발현 시스템은 널리 공지되어 있고, 공지된 기술을 사용하여 제조하거나 상업적으로 입수할 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 최고 수준의 발현을 나타내는, 최소 5' 플랭킹 영역을 갖는 작제물이 프로모터로서 동정된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결되고, 프로모터-구동 전사를 조정하는 능력에 대해 제제를 평가하는데 사용될 수 있다.
ADR 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 도입하고 발현시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 발현 벡터와 관련하여, 벡터는 당업계의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유동물, 세균, 효모 또는 곤충 세포 내로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다.
ADR 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주사, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)]을 참조한다. 숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하는 한 가지 방법은 인산칼슘 형질감염이다.
숙주 세포 내로 관심대상의 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 및 특히 레트로바이러스 벡터는 유전자를 포유동물, 예를 들어 사람 세포 내로 삽입하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,350,674호 및 제5,585,362호를 참조한다.
숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드성 분산액 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로구체, 비이드, 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합된 미셀 및 리포솜을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 시험관내 및 생체내에서 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드성 시스템은 리포솜(예를 들어, 인공 막 소포)이다.
비바이러스 전달 시스템이 이용되는 경우에, 예시적인 전달 비히클은 리포솜이다. 지질 제형의 사용은 숙주 세포 내로의 핵산 도입(시험관내, 생체외 또는 생체내)을 위해 고려된다. 또 다른 측면에서, 핵산은 지질과 회합될 수 있다. 지질과 회합된 핵산은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되거나, 리포솜의 지질 이중층 내에 점재되거나, 리포솜 및 올리고뉴클레오티드 둘 다와 회합된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되거나, 리포솜 내에 포획되거나, 리포솜과 복합체화되거나, 지질 함유 용액 중에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질 내에 현탁액으로서 함유되거나, 미셀과 함께 함유 또는 복합체화되거나, 또는 그밖에 지질과 회합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 회합 조성물은 용액 중의 임의의 특정한 구조로 제한되지 않는다. 예를 들어, 이들은 이중층 구조로, 미셀로서, 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 이들은 또한 단순히 용액 중에 점재되어, 가능하게는 크기 또는 형상이 균일하지 않은 응집체를 형성할 수 있다. 지질은 천연 발생 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 세포질에서 천연적으로 발생하는 지방 액적뿐만 아니라, 장쇄 지방족 탄화수소 및 이의 유도체, 예컨대 지방산, 알콜, 아민, 아미노 알콜 및 알데히드를 함유하는 화합물의 부류를 포함한다.
사용하기 적합한 지질은 상업적 공급원으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 디미리스틸 포스파티딜콜린("DMPC")은 미주리주 세인트 루이스의 시그마(Sigma)로부터 수득할 수 있고; 디세틸 포스페이트("DCP")는 케이 & 케이 래보러토리즈(K & K Laboratories)(뉴욕주 플레인뷰)로부터 수득할 수 있고; 콜레스테롤("Chol")은 칼바이오켐-베링(Calbiochem-Behring)으로부터 수득할 수 있고; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤("DMPG") 및 다른 지질은 아반티 폴라 리피즈, 인크.(Avanti Polar Lipids, Inc.)(앨라배마주 버밍엄)로부터 수득할 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올 내의 지질의 원액은 약 -20℃에서 저장될 수 있다. 클로로포름이 메탄올보다 더 용이하게 증발되기 때문에, 클로로포름이 유일한 용매로서 사용된다. "리포솜"은 둘러싸는 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다층막 지질 비히클을 포함하는 일반적 용어이다. 리포솜은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 갖는 소포 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 다층 리포솜은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질 층을 갖는다. 이들은 인지질이 과량의 수용액 중에 현탁될 경우에 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 폐쇄된 구조의 형성 전에 자기-재배열을 거치고, 물 및 지질 이중층들 사이의 용해된 용질을 포획한다 (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). 그러나, 정상 소포 구조가 아니라 용액 중에서 상이한 구조를 갖는 조성물도 포함된다. 예를 들어, 지질은 미셀 구조를 가정할 수 있거나 또는 단지 지질 분자의 불균일 응집체로서 존재할 수 있다. 또한, 리포펙타민-핵산 복합체가 고려된다.
일부 사례에서, ADR 분자는 세포의 내인성 핵산에 통합될 수 있다. 상동성 재조합을 위한 표적 부위를 가질 수 있으며, 여기서 작제물이 특정 유전자좌에 통합되는 것이 바람직하다. 예를 들어,) 내인성 유전자를 녹아웃시키고 (동일한 유전자좌 또는 다른 곳에서) 이를 당업계에 상동성 재조합용으로 공지된 공지된 물질 및 방법을 사용하여 작제물에 의해 암호화되는 유전자로 대체시킬 수 있다. 상동성 재조합을 위해 OMEGA 또는 O-벡터를 사용할 수 있다. CRISPR/Cas9, 징크 핑거 뉴클레아제, TALE 뉴클레아제, 메가뉴클레아제 및 기타 부위 지향된 뉴클레아제를 사용하여 게놈 내의 특정한 부위를 표적화하고 절단하여 상동성 재조합을 촉진할 수 있다.
ADR-발현 작제물(들)을 포함하도록 조작된 예시적인 T 세포를 선택적 조건 하에 배양물에서 성장시킬 수 있고, 이어서 작제물을 갖는 것으로서 선택된 세포를, 예를 들어, 숙주 세포에서 작제물의 존재를 결정하기 위한 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 증대시키고 추가로 분석할 수 있다. 일단 조작된 숙주 세포가 동정되면, 이들을 계획대로 사용할 수 있는데, 예를 들어 배양물에서 증대시키거나 숙주 유기체 내로 도입할 수 있다.
세포의 성질에 따라, 세포는 매우 다양한 방식으로 숙주 유기체, 예를 들어 포유동물 내로 도입될 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포는 종양 부위에 도입될 수 있지만, 대안적인 실시형태에서 세포는 암으로 귀소하거나 감염된 부위로 귀소하도록 변형된다. 사용되는 세포의 수는 수많은 상황, 도입 목적, 세포의 수명, 사용될 프로토콜, 예를 들어, 투여 횟수, 세포의 증식 능력, 재조합 작제물의 안정성 등에 의해 좌우될 것이다. 세포는 일반적으로 관심대상의 부위 또는 그 근처에 주사되는 분산액으로서 적용될 수 있다. 세포는 생리학적으로 허용되는 배지 중에 있을 수 있다.
DNA 도입이 모든 경우에 통합을 야기할 필요는 없다. 일부 상황에서는, 도입된 DNA의 일시적인 유지만으로 충분할 수 있다. 이러한 방식으로, 세포가 숙주에 도입되고 이어서 미리 정해진 시간 후, 예를 들어 세포가 특정 부위로 귀소할 수 있게 된 후 작동되는 단기 효과를 가질 수 있다.
실시예
다음의 실시예는 본 개시내용의 특정 실시형태를 보다 완전하게 예시하기 위해 제시된다. 그러나, 이러한 실시예는 어떤 방식으로든 본 개시내용의 넓은 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 1
병원성 T 세포의 선택적 표적화를 위한 자가/동종면역 방어 수용체
본원에서는 정상 T 세포에서 발현되는 자가/동종면역 방어 수용체(ADR)를 사용하여 병원성 T 세포를 특이적으로 표적화하는 신규 접근법이 개시된다. ADR-발현 T 세포는 활성화된 T 세포만을 찾아내어 제거하고, 순환 림프구의 대다수를 구성하는 휴지 비병원성 나이브 및 기억 T 세포는 허용한다.
ADR-매개 표적화의 개념은, 활성화 24시간 내에 T 세포가 이들의 세포 표면상의 공동자극 유전자 4-1BB, OX40 및/또는 CD40L을 일시적으로 상향조절한다는 관찰에 기초한다. 4-1BB, OX40 및/또는 CD40L의 발현은 T-세포가 활발히 세포독성일 때에만 유지되고 TCR 신호전달이 중단되면 4 내지 5일 이내에 점차적으로 하향조절된다. 특히, 활성화된 CD8+ T 세포는 더 높은 정도의 4-1BB 발현을 보인 반면, CD4+ T 세포는 OX40 및/또는 CD40L을 우선적으로 발현하였다. 활성화된 T 세포 외에도, ADR 리간드는 활성화된 NK 세포 및 세포의 다른 중요하지 않고 보충 가능한 서브세트에서만 발현될 수 있다. 4-1BB, OX40 및 CD40L의 발현 패턴으로 인해, 이러한 유전자들은 중요한 면역 및 비면역 조직을 영구적으로 손상시키지 않으면서 높은 특이성으로 활성화된 세포를 표적화하기 위한 매력적인 표적이 된다.
이들 활성화된 T 세포의 표적화 가능성을 조사하기 위해, 자가/동종면역 방어 수용체(ADR)를 감마레트로바이러스 벡터 SFG에 암호화된 CD3ζ 쇄에 스페이서를 통해 직접 연결된 4-1BB- 또는 OX40-특이적 리간드 또는 CD40L-특이적 수용체로 구성되도록 디자인하였다. 스페이서 영역은 a) II형 단백질 4-1BBL 및 OX40L이 ADR의 I형 골격으로 통합될 수 있고 b) FACS 염색에 의해 세포 표면에서 ADR의 검출을 용이하게 하기 위해 혼입되었다. T 세포를 이러한 작제물로 형질도입하는 것은 세포 표면에서 ADR 발현을 효율적으로 강제하였다. 이들 ADR T 세포는 4-1BB-, OX40- 및 CD40L-발현 세포에 대해 강력하고 강건한 세포독성을 가져서 48시간 이내에 표적 세포의 90 내지 99%를 제거하였다. 이들 결과는 기능성 4-1BB-, OX40- 및 CD40L-특이적 ADR T 세포를 생성할 수 있는 가능성을 입증한다.
이에 따라 T 세포에서 ADR 신호전달은 4-1BB, OX40 및 CD40L을 상향조절하여 사멸을 촉진하고 효과기 세포 증대를 방해하기 때문에, 효과기 T 세포에서 ADR 표적 유전자의 CRISPR/Cas9 게놈 파괴의 효과를 조사하였다. 본 발명자들은 이전에 이러한 CRISPR/Cas9 접근법이 CD7-특이적 CAR을 발현하는 1차 사람 T 세포의 사멸을 예방할 수 있음을 보여주었다. 이러한 맥락에서, 본 발명자들은 CRISPR/Cas9를 사용하여 ADR T 세포의 약 70%에서 4-1BB 발현을 녹아웃시킬 수 있었으며, 이는 4-1BB+ 표적 세포와의 공동배양 후 48시간차에, 세포독성에 영향을 미치지 않으면서 ADR T 세포 증대를 2배 넘게 지속적으로 증가시켰다.
그 다음, 활성화된 T 세포를 선택적으로 제거하는 ADR T 세포의 능력을 시험 하였다. 4-1BB, OX40 및 CD40L ADR T 세포를 형광 표지된 휴지 또는 CD3/CD28 활성화된 T 세포와 공동배양하였다. 살아있는 잔여 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포는 계수 비이드를 사용하여 유세포측정에 의해 정량하였다. 4-1BB-, OX40- 또는 CD40L-특이적 ADR을 발현하는 T 세포와 공동배양한지 72시간 후 휴지 자가 T 세포에 대한 반응성은 없었다(도 2B). 대조적으로, 4-1BB ADR T 세포와 CD3/CD28-활성화된 T 세포의 공동배양은 48시간 내에 대부분의 CD8+ T 세포 및 일부 CD4+ T 세포를 제거하였다. OX40 ADR T 세포와의 항온배양은 활성화된 CD4+ T 세포의 상반되는 고수준 고갈 및 활성화된 CD8+ T 세포의 중간정도 고갈을 초래하였다. CD40L ADR T 세포는 활성화된 CD4+ T 세포에 대한 중간정도의 세포독성 효과를 생성하였지만, CD8+ T 세포에 대해서는 효과가 나타나지 않았다. 활성화된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에 대한 OX40, CD40L 및 4-1BB ADR T 세포의 차등적 표적화 프로파일은 각 T 세포 서브세트상에서의 OX40, CD40L 및 4-1BB 발현의 정도 및 동역학에서 관찰된 차이와 상관관계가 있다. 이러한 ADR의 특성은 필요에 따라 동종반응성 또는 자가반응성 T 세포의 서브세트 중 하나 또는 둘 다를 우선적으로 표적화하는데 이용될 수 있다. 따라서, ADR 발현은 T 세포가 활성화된(병원성) T 세포는 특이적으로 표적화할 수 있지만 휴지 세포는 허용할 수 있게 하고, 이는 이의 임상적 사용을 시사한다.
ADR을 발현하는 바이러스-특이적 T 세포(VST)가 시험관내 혼합 림프구 반응(MLR) 검정에서 동종이계 거부에 저항할 수 있는지 여부를 평가하였다. CMV-특이적 T 세포를 HLA-A2-음성 공여자로부터 생성하고 비형질도입 대조군 또는 ADR-형질도입된 VST를 1:2 세포 대 세포 비에서 동종반응성 HLA-A2+ PBMC와 혼합하였다. 이어서, 본 발명자들은 상기 세포들을 12일 동안 배양하였다. 공동배양이 종료되면, 대조군 VST는 HLA-A2+ PBMC에 의해 거의 완전히 제거된 반면, 4-1BB ADR 또는 OX40 ADR을 발현하는 VST는 거부에 저항하였다. 종합하면, 이들 결과는 새로 개발된 ADR 플랫폼 실시형태를 사용하여 활성화된 T 세포를 표적화할 수 있는 가능성 및 선택성을 입증한다.
실시예 2
NK 세포의 선택적 표적화를 위한 자가/동종면역 방어 수용체
ADR은 HLAlow 또는 HLA-미스매치된 세포의 신속한 거부를 매개하는 핵심 세포 집단인 NK 세포에 대한 특이적 세포독성 활성을 나타낸다.
NK 세포는 항종양 및 항바이러스 면역 감시의 일부분으로서 HLA-미스매치된 세포 또는 HLA 발현이 낮은 세포를 인식할 수 있다. 따라서, 동종이계 세포를 면역충족(immunoreplete) 환자에게 입양 전달하면 NK-세포가 활성화되고 HLA-미스매치된 세포가 거부될 수 있다. 여기서, 4-1BB- 및 OX40-특이적 자가/동종면역 방어 수용체(ADR)를 발현하는 T 세포의 공동배양은 NK 세포의 제거를 초래하여 ADR-무장된 동종이계 T 세포의 NK 세포-매개 숙주 거부를 상쇄할 수 있는 것으로 나타난다. 따라서, ADR은 동종반응성 T 세포 반응을 억제할 뿐만 아니라 NK 세포-매개 거부를 억제하며, 이는 "기성품" 치료 T 세포의 지속성 및 활성을 향상시키기 위한 ADR의 적용을 추가로 뒷받침한다.
실시예 3
ADR-발현 T 세포는 표적 세포를 제거한다
ADR은 면역 세포의 세포 표면에서 발현될 수 있으며 각 표적에 대한 세포독성을 촉진할 수 있다. 도 1A는 ADR의 개략도의 한 예를 도시한다(GFP와 같은 표지는 선택적이다). T 세포 표면상에서의 ADR 발현이 확인되었고(도 1B), 세포는 대조군과 비례하여 증대되었다(도 1C). (도 1D) ADR-발현 T 세포는 상응하는 ADR 리간드를 발현하는 표적 세포에 대해 세포독성이었다(도 1D). 도 1E는 야생형 대 4-1BB ADR을 발현하는 4-1BB KO T 세포의 증대 및 4-1BB+ 표적에 대한 이들의 세포독성을 입증한다. T 세포상의 ADR 리간드를 녹아웃시키는 것은 증대 및 세포독성을 더욱 향상시킬 수 있으며, T 세포상에서 ADR과 이의 리간드의 공동발현은 ADR-T 세포 증대 또는 기능을 위해 요구되지 않는다(도 1E).
활성화된 T 세포상에서 ADR 리간드의 선택적 발현은 ADR T 세포에 의한 이들의 선택적 제거를 가능하게 한다. TCR 자극 후 휴지 T 세포 대 활성화된 T 세포에서의 ADR 리간드의 발현이 결정된다(도 2A 내지 도 2C). 휴지 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에 대한 ADR T 세포의 세포독성은 없었지만(도 2D), 48시간 공동배양 후 ADR T 세포에 의해 활성화된 CDD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포가 제거되었다(도 2E).
일례로서, 4-1BB ADR의 발현은 T 세포를 MLR 모델에서 면역 거부로부터 보호한다. ADR을 공동발현하는 TCRKO T 세포가 1:10 ADR T:PBMC 비에서 동종이계 PBMC와의 공동배양 후 거부로부터 보호된다는 것을 도시하는 대표적인 점도표(도 3A). 공동배양 동안 PBMC 중의 공여자 T 세포 및 동종이계 T 세포의 절대 계수(도 3B 내지 도 3C)는 바이러스-특이적 ADR T 세포에 대해 동일하다(도 3D 내지 도 3F).
ADR의 발현은 시험관내 혼합 림프구 반응에서 면역 거부로부터 동종이계 바이러스-특이적 T 세포를 보호한다. ADR VST가 수용자 동종이계 PBMC에 의한 면역 거부로부터 보호됨을 도시하는 대표적인 점도표(도 4A). MLR 동안 다양한 시점에서 수용자 T 세포 및 공여자 VST의 절대 계수는 도 4B 및 도 4C에 제공되어 있다.
도 5에서, ADR VST는 항바이러스 기능을 유지한다. ADR VST를 바이러스성 pepmix-펄스된 단핵구와 공동배양하였고, 단핵구 계수는 ADR VST가 비변형 VST와 비교하여 바이러스 감염된 세포를 동일하게 잘 제거하였음을 나타냈다.
활성화된 NK 세포는 ADR 리간드를 상향조절하고 ADR T 세포에 의해 선택적으로 표적화될 수 있다. 휴지 NK 세포 대 활성화된 NK 세포에서의 4-1BB의 발현이 확인된다(도 6A 내지 도 6B). 4-1BB ADR T 세포와의 24시간 공동배양 후 휴지 NK 세포 대 활성화된 NK 세포의 잔여 계수가 결정된다(도 6C). 도 6D에서, MHC가 결여된 ADR T 세포는 NK 세포의 증대를 제어함으로써 동종이계 PBMC에 의한 면역 거부로부터 보호된다. 공동배양 동안 공여자 T 세포 및 동종 NK 세포의 절대 계수는 도 6E에서 결정된다. MHC가 결여된 ADR T 세포는 1:1 E:T 비에서 48시간 공동배양시 NK 세포에 의한 면역 거부에 저항한다(도 6F). ADR T 세포는 PBMC를 사용한 MLR 동안 동종반응성 NK 세포의 증대를 제어하고(도 6G), NK 세포의 절대 계수는 도 6H에 도표로 도시되어 있다.
ADR 발현은 생체내 면역 거부로부터 동종이계 T 세포를 보호한다. 도 7A에는, 마우스에게 치사 선량 이하의 방사선 조사 후 HLA-A2+ 공여자로부터의 T 세포를 제공한 다음, 4일 후 동종이계 HLA-A2-T 세포를 투여한, 면역 거부의 마우스 모델의 한 예가 도시되어 있다. HLA-A2- 공여자로부터의 대조군 T 세포는 18일차까지 거부된 반면, ADR-발현 세포는 보호되었다(도 7B). 다양한 시점에서 HLA-A2+ 공여자 및 HLA-A2- 공여자로부터의 T 세포의 절대 계수가 결정되었다(도 7C). 도 7D의 변형된 생체내 모델은 마우스에게 동종이계 T 세포 대신에 공여자 1로부터의 전체 PBMC(T-세포와 NK-세포 둘 다를 함유)를 제공하였음을 도시한다. 도 7E의 대표적인 흐름도는 ADR T 세포가 면역 거부로부터 보호되었고 또한 치명적인 GvHD의 급속한 발병으로부터 마우스를 보호하였음을 도시한다.
CAR과 ADR의 공동발현은 두 수용체 모두의 기능을 보존한다. 도 8A는 ADR과 CAR을 공동발현하는 면역 세포의 대표도의 한 예를 예시한다. 세포 표면상에서의 CAR과 ADR의 공동발현이 확인되었다(도 8B). 도 8C에는, 표적의 일례로서 NALM-6(CD19+ CAR 표적)에 대한 CAR-ADR T 세포의 세포독성이 도시되어 있다. 활성화된 T 세포(ADR 표적)에 대한 CAR-ADR T 세포의 세포독성이 또한 도 8D에서 결정되었다. 두 세포 표적 모두와 동시에 공동배양시 두 표적 모두에 대한 CAR-ADR T 세포의 세포독성 활성은 도 8E에 입증되어 있다.
CAR-ADR T 세포는 면역 거부로부터 보호되고 강력한 항종양 활성을 발휘한다. 마우스 모델 및 용법의 한 예가 도 9A에 도시되어 있다. 용법의 일례로서, 마우스에게 24시간 간격으로 공여자 1로부터의 동종이계 T 세포 및 b2mKO NALM6을 제공한 다음, 공여자 2로부터의 CAR-ADR T 세포의 단일 용량을 제공하였다. 말초혈 중의 기증자 2로부터의 T 세포의 동역학은 도 9B에 제공되어 있고, 실험군에서의 공여자 1 T 세포의 동역학은 도 9C에 제공되어 있다. 도 9D는 마우스의 백혈병 부담을 도시하며, 마우스의 전체 생존기간이 측정되었다(도 9E).
도 13A 내지 도 13C. CAR-ADR T 세포는 고형 종양 모델에서 면역 거부로부터 보호되고 강력한 항종양 활성을 발휘한다. 마우스 모델 및 처리의 한 예의 개략도는 도 10A에 도시되어 있고, 여기서 마우스에게 24시간 간격으로 공여자 1로부터의 동종이계 T 세포 및 b2mKO 신경모세포종 세포주 CHLA255를 제공한 다음, 공여자 2로부터의 CAR-ADR T 세포의 단일 용량을 제공하였다. 공여자 2 GD2 CAR T 세포는 D18까지 거부된 반면, CAR-ADR T 세포는 동종이계 거부에 저항하고 말초혈에서 지속되었다(도 10B). 마우스의 종양 부담은 도 13C에 도시되어 있고, 여기서 *는 ATC+ GD2 CAR T 그룹에서의 이종-GvHD 관련 사망을 나타낸다.
TCR-녹아웃 CAR-ADR T 세포는 면역 거부로부터 보호되고 강력한 항종양 활성을 발휘한다. 마우스에게 24시간 간격으로 공여자 1로부터의 동종이계 T 세포 및 b2mKO NALM6을 제공한 다음, 공여자 2로부터의 TCR-편집된 CAR-ADR T 세포의 단일 용량을 제공한, 마우스 모델의 개략도가 제공된다(도 11A). 말초혈 중의 공여자 2로부터의 T 세포의 동역학이 제공된다(도 11B). 실험군에서의 공여자 1 T 세포의 동역학이 도시된다(도 11C). 마우스의 백혈병 부담(도 11E) 및 마우스의 전체 생존기간(도 11E)이 제공된다.
ADR T 세포는 치명적인 이종 GvHD로부터 마우스를 보호한다. 모델의 개략도는 도 12A에 제공되어 있고, 생체내 FFLuc-표지된 ADR T 세포의 증대가 입증되어 있다(도 12B). 마우스의 체중 증가/감소의 동역학이 결정되었다(도 12C). 마우스의 전체 생존기간이 도시되어 있다(도 12D).
CD28 세포내 신호전달 도메인을 갖는 2세대 ADR("ADR.28제타")(일례로서)을 이용하였다. ADR.28제타의 구조의 일례가 도시되어 있다(도 13A). 표적-발현 세포주에 대한 ADR.28제타의 시험관내 세포독성이 결정되었다(도 13B 및 도 13C). ADR.28제타는 이종-GvHD 주로부터 마우스를 보호하였다(도 13B). 모델의 개략도(도 13D)가 도시되어 있다. 생체내 FFLuc-표지된 ADR.28제타 T 세포의 증대가 확인되었다(도 13E). 마우스의 체중 증가/감소의 동역학(도 13F) 및 마우스의 전체 생존기간이 결정되었다(도 13G).
본 개시내용 및 이의 장점을 상세하게 설명하였지만, 첨부된 청구범위에 의해 정의된 디자인의 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변화, 대체 및 변경이 행해질 수 있음이 이해되어야 한다. 게다가, 본 출원의 범위는 본 명세서에 기재된 공정, 기계, 제조, 물질의 조성, 수단, 방법 및 단계의 특정 실시형태에 한정되도록 의도되지 않는다. 당업자가 본 개시내용으로부터 쉽게 이해할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 기재된 상응하는 실시형태와 실질적으로 동일한 기능을 수행하거나 실질적으로 동일한 결과에 도달하는 현존하거나 추후에 개발될, 공정, 기계, 제조, 물질의 조성, 수단, 방법 또는 단계가 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다. 따라서, 첨부된 청구범위는 이러한 공정, 기계, 제조, 물질의 조성, 수단, 방법 또는 단계를 그 범위 내에 포함하도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> BAYLOR COLLEGE OF MEDICINE <120> AUTO/ALLO-IMMUNE DEFENSE RECEPTORS FOR THE SELECTIVE TARGETING OF ACTIVATED PATHOGENIC T CELLS AND NK CELLS <130> BAYM.P0252WO-1001068640 <140> PCT/US2019/029163 <141> 2019-04-25 <150> 62/662,817 <151> 2018-04-26 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 714 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu 20 25 30 Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser 35 40 45 Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys 50 55 60 Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val 65 70 75 80 Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly 85 90 95 Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly 100 105 110 Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala 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Gly Ser Gly 420 425 430 Gly Gly Gly Ser Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val 435 440 445 Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe 450 455 460 Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr 465 470 475 480 Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr 485 490 495 Leu Val Thr Thr Phe Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro 500 505 510 Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly 515 520 525 Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys 530 535 540 Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile 545 550 555 560 Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His 565 570 575 Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Lys Val Tyr Ile Thr Ala Asp 580 585 590 Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Thr Arg His Asn Ile 595 600 605 Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro 610 615 620 Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu 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Claims (68)

  1. 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 폴리펩타이드가
    (1) OX40-특이적 리간드, 4-1BB-특이적 리간드, CD40L-특이적 리간드 또는 이들의 기능적 유도체 중 하나 이상; 이에 작동가능하게 연결된
    (2) T 세포 활성화를 촉진하는 신호전달 도메인
    을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 OX40-특이적 리간드를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 4-1BB-특이적 리간드를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 CD40L-특이적 리간드를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 OX40-특이적 리간드가 OX40L, OX40을 표적화하는 항체, OX40L-Fc 융합체 또는 이들의 조합인, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  6. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 4-1BB-특이적 리간드가 4-1BBL, 4-1BB를 표적화하는 항체, 4-1BBL-Fc 융합체 또는 이들의 조합인, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  7. 제1항 또는 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD40L-특이적 리간드가 CD40, CD40L을 표적화하는 항체, CD40-Fc 융합체 또는 CD40L에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 다른 조작된 단백질인, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 1개, 2개 또는 그 이상의 공동자극 도메인을 추가로 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 (1)과 (2) 사이의 스페이서를 암호화하는 서열을 추가로 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  10. 제9항에 있어서, 상기 스페이서가 10 내지 220개 아미노산 길이인, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 스페이서가 항체를 이용한 표면 검출을 용이하게 하는 서열을 갖는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  12. 제11항에 있어서, 상기 스페이서가 항-Fc Ab를 이용하여 검출할 수 있는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  13. 제12항에 있어서, 상기 스페이서가 IgG Fc 부분을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 키메라 항원 수용체, T-세포 수용체 또는 이들 둘 다를 추가로 암호화하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  15. 제14항에 있어서, 제1항의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 상에, 및 키메라 항원 수용체, T-세포 수용체 또는 이들 둘 다를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드상에 2A 요소(element) 또는 IRES 요소가 있는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  16. 제15항에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체가 1개, 2개 또는 그 이상의 공동자극 도메인을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 벡터 상에 존재하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  18. 제17항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터인, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  19. 제18항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 벡터인, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 세포에 존재하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  21. 제20항에 있어서, 상기 세포가 진핵 세포 또는 세균 세포인, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 세포가 면역 세포인, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 조작되는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  24. 제22항에 있어서, 상기 면역 세포가 T 세포인, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  25. 제24항에 있어서, 상기 T 세포가 하나 이상의 키메라 항원 수용체를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  26. 제25항에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체가 1개, 2개 또는 그 이상의 공동자극 도메인을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  27. 제24항에 있어서, 상기 T 세포가 하나 이상의 조작된 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드에 의해 발현되는 폴리펩타이드.
  29. (1) OX40 특이적 리간드, 4-1BB 특이적 리간드 및 CD40 중 하나 이상; 이에 작동가능하게 연결된
    (2) T-세포 활성화를 촉진하는 신호전달 도메인
    을 포함하는 폴리펩타이드.
  30. 제29항에 있어서, 상기 T-세포 활성화를 촉진하는 신호전달 도메인이 CD3 제타 서브유닛, DAP12, Fc 수용체 또는 이들의 조합으로부터의 것인, 폴리펩타이드.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 1개, 2개 또는 그 이상의 공동자극 도메인을 추가로 포함하는, 폴리펩타이드.
  32. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 수용체-발현 세포.
  33. 제32항에 있어서, 상기 세포가 면역 세포인, 세포.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 세포가 조작되는, 세포.
  35. 제33항에 있어서, 상기 면역 세포가 T 세포인, 세포.
  36. 제35항에 있어서, 상기 T 세포가 CAR-형질도입된 T 세포인, 세포.
  37. 제35항에 있어서, 상기 T 세포가 T 세포 수용체(TCR)-형질도입된 T 세포인, 세포.
  38. 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 하나 이상의 유전자의 내인성 발현이 결여되도록 조작되는, 세포.
  39. 제38항에 있어서, 상기 세포가 4-1BB, OX40 및/또는 CD40L의 내인성 발현이 결여되도록 조작되는, 세포.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 세포가 CRISPR/Cas9, 징크 핑거 뉴클레아제, TALE 뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제를 사용하여 조작되는, 세포.
  41. 제32항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 세포 저장소에 보관되는(housed), 세포.
  42. 면역 효과기 세포를 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드로 형질감염시키는 단계를 포함하는, 세포 요법을 위한 세포를 생성하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 세포를 세포 저장소에 보관하는(depositing) 단계를 추가로 포함하는 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 세포를 하나 이상의 키메라 항원 수용체 및/또는 하나 이상의 재조합 T-세포 수용체를 발현하도록 변형시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 세포가 개체에 대해 동종이계인, 방법.
  47. 의학적 병태에 대해 개체를 동종이계 치료 세포로 치료하는 방법으로서, 치료학적 유효량의 동종이계 세포를 개체에게 제공하는 단계를 포함하고, 상기 세포가 (1) OX40-특이적 리간드, 4-1BB 특이적 리간드, CD40L 특이적 리간드 또는 이들의 기능적 유도체 중 하나 이상; 이에 작동가능하게 연결된 (2) T 세포 활성화를 촉진하는 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 발현하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 세포가 세포 저장소로부터 수득되는, 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 세포가 하나 이상의 키메라 항원 수용체 및/또는 하나 이상의 재조합 T-세포 수용체를 발현하는, 방법.
  50. 개체에서 동종이계 세포, 조직 또는 장기의 거부를 피하는 방법으로서, 활성화된 T 세포에 선택적으로 존재하는 화합물을 표적화하는 세포외 도메인을 포함하고 CD3 제타를 포함하는 조작된 키메라 수용체를 발현하는 동종이계 면역 세포의 유효량을 개체에게 전달하는 단계를 포함하고,
    상기 전달 단계가 개체에서
    (1) 개체에서 내인성 동종반응성 T 세포의 억제; 및/또는
    (2) 개체에서 NK 세포 활성화의 억제
    를 초래하는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 동종이계 세포가 상기 키메라 수용체를 발현하는 동종이계 면역 세포인, 방법.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 상기 동종이계 세포가 키메라 항원 수용체 또는 조작된 T 세포 수용체를 발현하는, 방법.
  53. 제50항에 있어서, 상기 동종이계 면역 세포가 개체의 조직 및/또는 장기 이식 전, 동안 및/또는 후에 개체에게 전달되는, 방법.
  54. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성화된 T 세포가 병원성 T 세포인, 방법.
  55. 개체에서 활성화된 T 세포를 선택적으로 표적화하는 방법으로서, 조작된 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포의 유효량을 개체에게 제공하는 단계를 포함하고, 상기 키메라 수용체가:
    (1) 활성화된 T 세포에 선택적으로 존재하는 화합물을 표적화하는 세포외 도메인; 및
    (2) T-세포 활성화를 촉진하는 신호전달 도메인
    을 포함하는, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 T-세포 활성화를 촉진하는 신호전달 도메인이 CD3 제타 서브유닛, DAP12, Fc 수용체 또는 이들의 조합으로부터 유래되는, 방법.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 활성화된 T 세포가 병원성 T 세포인, 방법.
  58. 개체에서 활성화된 T 세포와 관련된 의학적 병태를 예방 또는 치료하는 방법으로서, 상기 활성화된 T 세포를 선택적으로 표적화하는 조작된 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포의 유효량을 개체에게 전달하는 단계를 포함하고,
    상기 키메라 수용체가:
    (1) 활성화된 T 세포에 선택적으로 존재하는 화합물을 표적화하는 세포외 도메인; 및
    (2) T-세포 활성화를 촉진하는 신호전달 도메인
    을 포함하는, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 키메라 수용체가 1개, 2개 또는 그 이상의 공동자극 도메인을 추가로 포함하는, 방법.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 상기 의학적 병태가 자가면역 장애인, 방법.
  61. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 의학적 병태가 이식 거부, 이식편 대 숙주 질환, I형 당뇨병, 다발성 경화증, 자가면역 대장염 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  62. 개체에서 동종이계 T 세포, 조직 또는 장기의 NK 세포-매개 숙주 거부를 피하는 방법으로서, 활성화된 T 세포에 선택적으로 존재하는 화합물을 표적화하는 세포외 도메인을 포함하고 T-세포 활성화를 촉진하는 신호전달 도메인을 또한 포함하는 조작된 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포의 유효량을 개체에게 제공하는 단계를 포함하는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 조작된 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포가 동종이계 T 세포인, 방법.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 상기 면역 세포가 키메라 항원 수용체 또는 조작된 T 세포 수용체를 발현하는, 방법.
  65. 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체에게 제공되는 조작된 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포의 양이 m2당 102 내지 1012개의 범위인, 방법.
  66. 제47항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 수용체를 발현하는 세포가 개체에게 전신 또는 국소 제공되는, 방법.
  67. 제47항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 T 세포인, 방법.
  68. 제47항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 개체에게 1회 또는 1회 이상 전달되는 방법.
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