BR112020019257A2 - Métodos para produção de etanol usando levedura manipulada - Google Patents

Métodos para produção de etanol usando levedura manipulada Download PDF

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Brian J. Rush
Sneha Srikrishnan
Dawn Thompson
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Abstract

aspectos da descrição fornecem micróbios manipulados para a produção de etanol. métodos para manipulação e cultura de micróbios também são fornecidos neste documento. tais micróbios manipulados exibem capacidades intensificadas para a produção de etanol.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTO- DOS PARA PRODUÇÃO DE ETANOL USANDO LEVEDURA MANI- PULADA”.
PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício sob 35 USC $ 119(e) do Pedido Provisório U.S. No. de Série 62/648.679, intitulado "METHODS FOR ETHANOL PRODUCTION USING ENGINEERED YEAST" depo- sitado em 27 de março de 2018, que está aqui incorporado por referên- cia em sua totalidade.
CAMPO
[002] A descrição refere-se à produção de etanol por meio de ma- nipulação genética.
ANTECEDENTES
[003] O etanol é um biocombustível renovável que pode ser pro- duzido por meio da fermentação de produtos naturais. O etanol produ- zido pela fermentação tem inúmeras aplicações industriais, incluindo a produção de produtos como solventes, extratores, anticongelantes e como intermediário na síntese de vários produtos químicos orgânicos. O etanol também é amplamente utilizado em setores como revestimentos, tintas de impressão e adesivos. Microrganismos, incluindo leveduras, podem produzir etanol pela fermentação de vários substratos, incluindo açúcares e amidos. As vantagens de usar levedura para a produção de etanol incluem a capacidade de usar uma variedade de substratos, to- lerância a altas concentrações de etanol e a capacidade de produzir grandes rendimentos de etanol. (Mohd Azhar et al., Biochem Biophys Rep (2017) 10: 52-61). Entretanto, a produção de etanol usando a fer- mentação da levedura também leva a produção de subprodutos.
SUMÁRIO
[004] Aspectos da presente descrição se referem ao desenvolvi-
mento de novas leveduras manipuladas e métodos de uso da nova le- vedura manipulada para produzir etanol. Surpreendentemente, a leve- dura manipulada aqui descrita produz altos rendimentos de etanol sem exibir uma penalidade de fermentação e produz níveis reduzidos de sub- produtos, tais como o glicerol.
[005] Aspectos da descrição se referem à levedura manipulada compreendendo: um ácido nucleico recombinante que codifica uma gli- ceraldeído-3-fosfato desidrogenase (E.C. 1.2.1.9); expressão reduzida ou eliminada de um gene que codifica uma glicerol-3-fosfato fosfatase (E.C.3.1.3.21); e um ácido nucleico recombinante que codifica uma gli- coamilase, em que a levedura é capaz de produzir pelo menos 100 9/kg de etanol e produzir menos do que 1,5 g/kg de glicose residual em 48 horas sob as condições de Teste 1.
[006] Em algumas modalidades, a levedura manipulada é uma es- pécie de levedura pós-duplicação do genoma completo. Em algumas modalidades, a levedura é Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae).
[007] Em algumas modalidades, a levedura modificada produz um rendimento de etanol que é pelo menos 0,5% maior do que uma cepa de controle. Em algumas modalidades, o rendimento de etanol é deter- minado pelo seguinte: (Título de etanol no tempo final - título de etanol no tempo zero) dividido pelos E quivalentes Totais de Glicose no Tempo zero. Em algumas modalidades, a levedura manipulada produz 30% menos glicerol, 40% menos glicerol ou 50% menos glicerol do que uma cepa de controle. Em algumas modalidades, a produção de glicerol é determinada pelo Teste 4.
[008] Em algumas modalidades, a glicoamilase (GA) tem pelo me- nos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 38 (Saccharomycopsis fi- buligera GA). Em algumas modalidades, a GA tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 39 (Rhizopus oryzae amyA). Em algu- mas modalidades, a GA tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência coma SEQ ID NO: 41 (Rhizopus microsporus GA). Em algumas modalidades, a GA tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 40 (Rhizopus de- lemar GA).
[009] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (E.C. 1.2.1.9) tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 45. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (E.C.1.2.1.9) codifica uma proteína que tem pelo menos 80%, pelo me- nos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de se- quência com a SEQ ID NO: 42. Em algumas modalidades, a levedura manipulada compreende um ácido nucleico com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de se- quência com a SEQ ID NO: 59.
[0010] Em algumas modalidades , a levedura manipulada reduziu ou eliminou a expressão de uma glicerol-3-fosfato desidrogenase (E.C.
1.1.1.8).
[0011] Em algumas modalidades, a levedura manipulada é Saccha- romyces cerevisiae e a levedura manipulada reduziu ou eliminou a ex- pressão de GPP1, GPP2, GPD1 ou GPD2. Em algumas modalidades, a levedura manipulada é Saccharomyces cerevisiae e a levedura mani- pulada reduziu ou eliminou a expressão de GPP1.Em algumas moda- lidades, a levedura manipulada é Saccharomyces cerevisiae e a leve- dura manipulada reduziu ou eliminou a expressão de GPP2. Em algu- mas modalidades, a levedura manipulada é Saccharomyces cerevisiae e a levedura manipulada reduziu ou eliminou a expressão de GPD1. Em algumas modalidades, a levedura manipulada é Saccharomyces cere- visiae e a levedura manipulada reduziu ou eliminou a expressão de GPD?2.
[0012] Em algumas modalidades, a levedura manipulada compre- ende ainda um ácido nucleico que codifica uma trealose-6-fosfato sin- tase (Tps1; E.C. 2.4.1.15). Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica uma trealose-6-fosfato sintase (Tps1; E.C. 2.4.1.15) tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica uma trealose-6-fosfato sin- tase (Tps1; E.C 2.4.1.15) codifica uma proteína que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% identidade de sequência com a SEQ ID NO: 43.
[0013] Em algumas modalidades, a levedura manipulada compre- ende ainda um ácido nucleico que codifica uma trealose-6-fosfato sin- tase (Tps2; E.C 3.1.3.12). Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica uma trealose-6-fosfato sintase (Tps2; E.C 3.1.3.12) tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO : 56. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica uma trealose-6-fosfato sin- tase (Tps2; E.C 3.1.3.12) codifica uma proteína que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de iden- tidade de sequência com à SEQ ID NO: 44.
[0014] Aspectos da descrição se referem a levedura S. cerevisiae manipulada que compreende: um ácido nucleico recombinante que co- difica uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (E.C 1.2.1.9); e ex- pressão reduzida ou eliminada de um gene que codifica uma glicero|-3- fosfato fosfatase (E.C 3.1.3.21), em que a levedura é capaz de produzir pelo menos 100 g/kg de etanol e produzir menos de 1,5 g/kg de glicose residual em 48 horas sob as condições de Teste 2.
[0015] Em algumas modalidades, a levedura 5. cerevisiae manipu- lada produz um rendimento de etanol que é pelo menos 0,5% maior do que de uma cepa de controle. Em algumas modalidades, o rendimento de etanol é determinado pela seguinte fórmula: (Título de etanol no tempo final - título de etanol no tempo zero) dividido pelos E quivalentes Totais de Glicose no Tempo zero. Em algumas modalidades, a levedura manipulada produz 30% menos glicerol, 40% menos glicerol ou 50% menos glicerol do que uma cepa de controle. Em algumas modalidades, a produção de glicerol é determinada pelo Teste 4.
[0016] Em algumas modalidades, a GA tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de se- quência com a SEQ ID NO: 38 (Saccharomycopsis fibuligera GA). Em algumas modalidades, a GA tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 39 (Rhizopus oryzae amyA). Em algumas modalidades, a GA tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com à SEQ ID NO: 41 (Rhizo- pus microsporus GA). Em algumas modalidades, a GA tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 40 (Rhizopus delemar GA).
[0017] Aspectos da descrição se referem a levedura manipulada que compreende um ácido nucleico exógeno que codifica uma gliceral- deído-3-fosfato desidrogenase (E.C. 1.2.1.9) e um ácido nucleico exó- geno que codifica uma GA com 80% ou mais de identidade com SEQ ID NO: 38 (Saccharomycopsis fibuligera GA), SEQ ID NO : 41 (Rhizopus microsporus GA), SEQ ID NO: 40 (Rhizopus delemar GA) ou SEQ ID NO: 39 (Rhizopus oryzae amyA) em que a levedura é capaz de produzir pelo menos 100 g/kg de etanol e tendo menos de 1,5 g/kg de glicose residual em 48 horas sob as condições do Teste 1.
[0018] Em algumas modalidades, a levedura é uma espécie de le- vedura após-duplicação do genoma completo. Em algumas modalida- des, a levedura é S. cerevisiae.
[0019] Em algumas modalidades, a levedura modificada produz um rendimento de etanol que é pelo menos 0,5% maior do que uma cepa de controle. Em algumas modalidades, o rendimento de etanol é deter- minado pela seguinte fórmula: (Título de etanol no tempo final - título de etanol no tempo zero) dividido pelos E quivalentes Totais de Glicose no Tempo zero.
[0020] Em algumas modalidades, a levedura manipulada produz 30% menos glicerol, 40% menos glicerol ou 50% menos glicerol do que uma cepa de controle. Em algumas modalidades, a produção de glicerol é determinada pelo Teste 4.
[0021] Em algumas modalidades, a levedura modificada reduziu ou eliminou a expressão de um gene que codifica uma glicerol-3-fosfato fosfatase (E.C.3.1.3.21).
[0022] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (E.C. 1.2.1.9) tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 45. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (E.C.1.2.1.9) codifica uma proteína que tem pelo menos 80%, pelo me- nos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de se- quência com a SEQ ID NO: 42. Em algumas modalidades, a levedura manipulada compreende um ácido nucleico com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de se- quência com a SEQ ID NO: 59.
[0023] Em algumas modalidades , a levedura modificada reduziu ou eliminou a expressão de uma glicerol-3-fosfato desidrogenase (E.C.
1.1.1.8).
[0024] Em algumas modalidades, a levedura manipulada é Saccha- romyces cerevisiae e a levedura manipulada reduziu ou eliminou a ex- pressão de GPP1, GPP2, GPD1 ou GPD2. Em algumas modalidades, a levedura manipulada é Saccharomyces cerevisiae e a levedura mani- pulada reduziu ou eliminou a expressão de GPP1. Em algumas modali- dades, em que a levedura manipulada é Saccharomyces cerevisiae e a levedura manipulada reduziu ou eliminou a expressão de GPP2. Em al- gumas modalidades, a levedura manipulada é Saccharomyces cerevi- Siae e a levedura manipulada reduziu ou eliminou a expressão de GPD1.Em algumas modalidades, a levedura manipulada é Saccha- romyces cerevisiae e a levedura manipulada reduziu ou eliminou a ex- pressão de GPD2.
[0025] Em algumas modalidades, a levedura manipulada compre- ende ainda um ácido nucleico que codifica uma trealose-6-fosfato sin- tase (Tps1; E.C. 2.4.1.15). Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica uma trealose-6-fosfato sintase (Tps1; E.C. 2.4.1.15) tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica uma trealose-6-fosfato sin- tase (Tps1; E.C. 2.4.1.15) codifica uma proteína que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% identidade de sequência com a SEQ ID NO: 43.
[0026] Em algumas modalidades, a levedura manipulada compre- ende ainda um ácido nucleico que codifica uma trealose-6-fosfato sin- tase (Tps2; E.C. 3.1.3.12). Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica uma trealose-6-fosfato sintase (Tps2; E.C. 3.1.3.12) tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 56. Em algumas mo- dalidades, o ácido nucleico que codifica uma trealose-6-fosfato sintase (Tps2; E.C. 3.1.3.12) codifica uma proteína que tem pelo menos 80%,
pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95 % de identidade de sequência para SEQ ID NO: 44.
[0027] Aspectos da descrição se referem a métodos para a produ- ção de etanol que compreendem a fermentação da levedura manipulada aqui descrita com um substrato de fermentação. Em algumas modalida- des, o substrato de fermentação compreende amido. Em algumas mo- dalidades, o substrato de fermentação compreende glicose. Em algu- mas modalidades, o substrato de fermentação compreende saca- rose. Em algumas modalidades, o amido é obtido a partir de milho, trigo e/ou mandioca. Em algumas modalidades, o método inclui a suplemen- tação com glicoamilase.
[0028] Aspectos da presente descrição se referem a métodos para a produção de trealose, que compreendem a fermentação de qualquer uma das leveduras manipuladas aqui divulgadas com um substrato de fermentação.
[0029] Cada uma das limitações da invenção pode abranger várias modalidades da invenção. É, portanto, antecipado que cada uma das limitações da invenção que envolve qualquer um dos elementos ou com- binações de elementos pode ser incluída em cada aspecto da inven- ção. Esta invenção não está limitada em sua aplicação aos detalhes de construção e ao arranjo de componentes apresentados na descrição a seguir ou ilustrados nos desenhos. A invenção é capaz de outras mo- dalidades e de ser praticada ou realizada de várias maneiras.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS
[0030] Os desenhos em anexo não pretendem ser desenhados em escala. Para fins de clareza, nem todos os componentes podem ser ro- tulados em todos os desenhos. Nos desenhos:
[0031] A Figura 1 é um gráfico que mostra a produção de etanol em uma mosto de milho com a Cepa 1-22, que contém o gene gapN de Bacillus cereus (Bc) no lócus de GPP1 em um contexto de glicoamilase da cepa de Rhizopus oryzae (Ro).
[0032] A Figura 2 é uma tabela que mostra o rendimento de etanol no mosto de milho com a Cepa 1-22.
[0033] Figuras 3A-C. A Figura 3A é um gráfico que mostra os títu- los de etanol com a Cepa 1-22. A Figura 3B é um gráfico que mostra os títulos de glicose residual com a Cepa 1-22. A Figura 3C é um gráfico que mostra os títulos de glicerol com a Cepa 1-22.
[0034] A Figura 4 é um gráfico que mostra uma comparação da produção de etanol com as cepas 1-20 e 1-22.
[0035] A Figura 5 é uma tabela que mostra a produção de etanol com a cepa 1-22 em frascos de agitação airlock Light Steep Water/Li- quifact (matéria-prima para moagem a úmido de milho).
[0036] A Figura 6 é um gráfico que mostra os títulos de etanol no mosto de milho.
[0037] A Figura 7 é um gráfico que mostra a glicose residual no mosto de milho.
[0038] A Figura 8 é um gráfico que mostra os títulos de glicerol no mosto de milho.
[0039] A Figura 9 é um gráfico que mostra o aumento do título de etanol da Cepa 1-25 em relação à Cepa 1 no mosto de milho em 47 horas.
[0040] Figura 10A-B. A Figura 10A é um gráfico que mostra a re- dução de glicerol da Cepa 1-25 em relação à Cepa 1 no mosto de mi- lho. A Figura 10B é um gráfico que mostra a glicose residual no final da fermentação (47 horas) no mosto de milho.
[0041] A Figura 11 é um gráfico que mostra o título de glicerol em 48 horas com as cepas indicadas.
[0042] A Figura 12 é um gráfico que mostra o título de etanol em 48 horas com as cepas indicadas.
[0043] A Figura 13 é um gráfico que mostra a glicose residual em
48 horas com as cepas indicadas.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0044] Aspectos da descrição se referem a microrganismos geneti- camente manipulados para a produção de etanol. Tentativas relatadas anteriormente de manipular a levedura para reduzir a produção de sub- produtos na fermentação do etanol foram prejudicadas por penalidades de fermentação. Surpreendentemente, a levedura manipulada aqui des- crita exibe títulos de etanol aumentados sem uma penalidade de fer- mentação e produz quantidades reduzidas de subprodutos, incluindo glicerol. Consequentemente, a nova levedura manipulada aqui descrita representa uma nova abordagem inesperadamente eficiente para a pro- dução de etanol através da fermentação.
[0045] Esta invenção não está limitada em sua aplicação aos deta- lhes de construção e ao arranjo de componentes apresentados na des- crição a seguir ou ilustrados nos desenhos. A invenção é capaz de ou- tras modalidades e de ser praticada ou realizada de várias manei- ras. Além disso, a fraseologia e a terminologia usadas aqui são para fins de descrição e não devem ser consideradas como limitantes. O uso de “incluindo”, “compreendendo” ou “possuindo”, “contendo”, “envolvendo” e variações dos mesmos neste documento, pretende abranger os itens listados a seguir e seus equivalentes, assim como itens adicionais. Produção reduzida de glicerol Glicerol-3-fosfato fosfatase
[0046] As cepas de levedura manipulada aqui descritas podem in- cluir modificações genéticas em uma ou mais enzimas envolvidas na produção de glicerol. Por exemplo, as cepas de levedura manipuladas aqui descritas podem ter a expressão reduzida ou eliminada de um ou mais genes que codificam uma glicerol-3-fosfato fosfatase (Gpp; que corresponde a E.C.3.1.3.21; também conhecida como "glicerol-1-fosfa-
tase"). Enzimas glicerol-3-fosfato fosfatase hidrolisam o glicerol-3-fos- fato em glicerol e, assim, regulam os níveis celulares de glicerol-3-fos- fato, um intermediário metabólico de glicose, lipídeo e metabolismo energético (Mugabo et al., PNAS (2016) H3:E430- 439).
[0047] Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) tem dois parálo- gos de glicerol-3-fosfato fosfatase, referidos como Gpplp e Gpp2p, co- dificados pelos genes GPP1 (UniProt No. P41277) e GPP2 (UniProt No. P40106), respectivamente (Norbeck et al. (1996) /. Biol. Chem. 271 (23): 13875-81; Pahiman et al. (2001) /. Biol. Chem. 276 (5): 3555- 63). Em algumas modalidades, a levedura manipulada aqui descrita, tal como S. cerevisiae, reduziu ou eliminou a expressão de GPP1. Em ou- tras modalidades, a levedura manipulada aqui descrita, tal como S. ce- revisiae, reduziu ou eliminou a expressão de GPP2. Em outras modali- dades, a levedura manipulada aqui descrita, tal como 5. cerevisiae, re- duziu ou eliminou a expressão de ambos, GPP1 e GPP2.
[0048] A sequência de aminoácidos de Gpplp (UniProt No. P41277) (SEQ ID NO: 57) é:
MPLITKPLSLKINAALFDVDGTIILISQOPAIAAFWRDFGKDKPYFDAEHVIHISHGOWRTY
DAIAKFAPDFADEEYVNKLEGEIPEKYGEHSIEVPGAVKLCNALNALPKEKWAVATSGT RDMAKKWEFDILKIKRPEYE 1TANDVKOGKPHPEP Y LKGRNGLGEFP LNEQDPSKSKVVVE EDAPAGIAAGKAAGCKIVGIATTFDLDFLKBEKGCD11VKNHESIRVGEYNAETDEVELLI FDDYLYAKDDLLKW.
[0049] A sequência de aminoácidos de Gpp2p (UniProt No. P40106) (SEQ ID NO: 58) é:
MGLTTKPLSLKVNAALFDVDGTIIISQPAIAAFWRDFGKDKP YFDAEHVIQVSHGWRTF DALAKFAPDEFANBEYVNKLEABLPVKYGEKSIEBVPGAVKLCNALNALPKBEBKWAVAT SGT RDMAQKWFEHLGIRRPKYF I TANDVKQOGKPHPEP YLKGRNGLGYP INEQDPSKSKVVVEF EDAPAGIAAGKAAGCKIIGIATTFDLDFLKEKGCDIIVKNHESIRVGGYNAETDEVEF IL FDDYLYAKDDLLKW.
[0050] Deve ser apreciado que qualquer meio para obter a expres-
são reduzida ou eliminada de um gene que codifique uma enzima glice- rol-3-fosfatase fosfatase é compatível com os aspectos da inven- ção. Por exemplo, a expressão reduzida ou eliminada de um gene que codifica uma glicero!l-3-fosfato fosfatase pode ser obtida pela interrup- ção da sequência do gene e/ou de uma ou mais regiões reguladoras que controlam a expressão do gene, tal como através da introdução de uma ou mais mutações ou inserções na sequência do gene ou em uma ou mais regiões reguladoras que controlam a expressão do gene.
[0051] Em algumas modalidades, a expressão de um gene que co- difica uma glicerol-3-fosfato fosfatase, tal como o gene GPP1, é redu- zida em pelo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%. Em algumas modalidades, a expressão do gene que codifica uma enzima glicerol-3-fosfato fosfatase, tal como o gene GPP1, é eliminada. A expressão de um gene que codifica uma enzima glicerol-3-fosfato fosfatase, tal como um gene GPP1, pode ser eliminada por qualquer meio conhecido por aquele versado na técnica, tal como por inserção de um fragmento de ácido nucleico no lócus de GPP1 ou em regiões regulatórias em torno do lócus de GPP1.
[0052] Em algumas modalidades, a levedura manipulada aqui des- crita, tal como S. cerevisiae, é diplóide e tem a expressão de ambas as cópias do gene GPP 1 reduzida ou eliminada. Em algumas modalidades, a levedura manipulada aqui descrita, tal como 5. cerevisiae, é diplóide e contém uma deleção e/ou inserção em ambas as cópias do gene GPP1. Glicerol-3-fosfato desidrogenase (EC 1.1.1.8)
[0053] A levedura manipulada aqui descrita pode ter a expressão reduzida ou eliminada de um ou mais genes que codificam uma glicerol|- 3-fosfato desidrogenase (G pd; que corresponde a E.C. 1.1.1.8).
[0054] S. cerevisiae tem duas glicerol-3-fosfato desidrogenases, re- feridas como Gpdlp e Gpd2p, codificadas pelos genes GPD1 (UniProt
No. Q00055) e GPD2 (UniProt No. P41911), respectivamente. Em algu- mas modalidades, a levedura manipulada aqui descrita, tal como 5. ce- revisiae, reduziu ou eliminou a expressão de GPD1. Em outras modali- dades, a levedura manipulada aqui descrita, tal como 5. cerevisiae, tem a expressão de GPD2 reduzida ou eliminada. Em outras modalidades, a levedura manipulada aqui descrita, tal como 5. cerevisiae, tem a ex- pressão de ambos GPD1 e GPD2 reduzida ou eliminada.
[0055] Deve ser apreciado que qualquer meio de obter a expressão reduzida ou eliminada de um gene que codifica uma enzima glicerol-3- fosfato desidrogenase é compatível com aspectos da invenção. Por exemplo, a expressão reduzida ou eliminada de um gene que codifica uma glicerol-3- fosfato desidrogenase pode ser obtida pela interrupção da sequência do gene e/ou de uma ou mais regiões regulatórias que controlam a expressão do gene, tal como através da introdução de uma ou mais mutações ou inserções na sequência do gene ou em uma ou mais regiões reguladoras que controlam a expressão do gene.
[0056] Em algumas modalidades, a expressão de um gene que co- difica uma glicerol-3-fosfato desidrogenase, como o gene GPDI, está reduzida em pelo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%. Em algumas modalidades, a expressão do gene que codifica uma enzima glicerol-3-fosfato desidrogenase, tal como o gene GPD1, é eliminada. A expressão de um gene que codifica uma enzima glicerol-3-fosfato desidrogenase, tal como um gene GPD1, pode ser eliminada por qualquer meio conhecido por aquele versado na técnica, tal como pela inserção de um fragmento de ácido nucleico no lócus de GPD1 ou nas regiões regulatórias em torno do lócus de GPDI1.
[0057] Em algumas modalidades, a levedura manipulada aqui des- crita, tal como S. cerevisiae, é diplóide e tem a expressão de ambas as cópias do gene GPD1 reduzida ou eliminada. Em algumas modalida-
des, a levedura manipulada aqui descrita, tal como S. cerevisiae, é di- plóide e contém uma deleção e/ou inserção em ambas as cópias do gene GPD1. Em outras modalidades, a levedura manipulada aqui des- crita, tal como 5. cerevisiae, tem a expressão de uma cópia do gene GPD1 reduzida ou eliminada.
[0058] Em algumas modalidades, a levedura manipulada aqui des- crita, tal como 5. cerevisiae, tem a expressão de GPP1 e/ou GPP2 re- duzida ou eliminada e também tem a expressão de GPD1 e/ou GPD2 reduzida ou eliminada. Em certas modalidades, a levedura manipulada aqui descrita, tal como S. cerevisiae, tem a expressão de duas cópias de GPP1 reduzida ou eliminada e também tem a expressão de uma có- pia de GPD1 reduzida ou eliminada. Gliceraldeído-3-F osfato Desidrogenase (GAPN; E.C. 1.2.1.9)
[0059] A levedura manipulada aqui descrita expressa de forma re- combinante um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gapN; que corresponde a E.C.
1.2.1.9; também conhecida como "gliceraldeído-3-fosfato desidroge- nase não fosforilante dependente de NADP"). As enzimas GapN con- vertem D-gliceraldeído 3-fosfato em 3-fosfo-D-glicerato (Rosenberg et al, / Biol Chem (1955) 217: 361-71).
[0060] Deve ser apreciado que o ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima gapN pode vir de qualquer fonte. Uma levedura manipulada que expresse de forma recombinante um ácido nucleico que codifica uma enzima gapN pode ou não conter um gene endógeno que codifica uma enzima gapN. Em algumas modalidades, a levedura mani- pulada que expressa de forma recombinante um ácido nucleico que co- difica uma enzima gapN não contém uma cópia endógena de um gene que codifica uma enzima gapN. Por conseguinte, em tais modalidades, o nucleico que codifica uma enzima gapN é derivado de uma espécie ou organismo diferente da levedura manipulada.
[0061] Em outras modalidades, a levedura manipulada que ex- pressa de forma recombinante um ácido nucleico que codifica uma en- zima gapN contém uma cópia endógena de um gene que codifica uma enzima gapN. Em algumas dessas modalidades, a cópia endógena do gene que codifica uma enzima gapN ou uma região reguladora para o gene, tal como um promotor, é manipulada para aumentar a expressão do gene que codifica uma enzima gapN. Em outras de tais modalidades, um ácido nucleico que codifica uma enzima gapN é introduzido na leve- dura. Em tais modalidades, o ácido nucleico que codifica a enzima gapN que é introduzido na levedura pode ser derivado da mesma espécie ou organismo que a levedura manipulada na qual é expresso ou pode ser derivado de uma espécie ou organismo diferente da levedura manipu- lada na qual é expresso.
[0062] Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima gapN compreende um gene de Bacillus cereus (por exemplo, GAPN, que corresponde a UniProt No. Q2HQS1). Em al- gumas modalidades, o ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima GapN ou uma porção da mesma, é otimizado por códons. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima gapN ou uma porção da mesma, compreende a SEQ ID NO : 45.
[0063] Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima gapN ou uma porção da mesma, tem pelo me- nos ou cerca de 50%, pelo menos ou cerca de 60%, pelo menos ou cerca de 70%, pelo menos ou cerca de 75%, pelo menos ou cerca de 80%, pelo menos ou cerca de 81%, pelo menos ou cerca de 82%, pelo menos ou cerca de 83%, pelo menos ou cerca de 84%, pelo menos ou cerca de 85%, pelo menos ou cerca de 86%, pelo menos ou cerca de 87 %, pelo menos ou cerca de 88%, pelo menos ou cerca de 89%, pelo menos ou cerca de 90%, pelo menos ou cerca de 91%, pelo menos ou cerca de 92%, pelo menos ou cerca de 93%, pelo menos ou cerca de
94% , pelo menos ou cerca de 95%, pelo menos ou cerca de 96%, pelo menos ou cerca de 97%, pelo menos ou cerca de 98%, pelo menos ou cerca de 99%, pelo menos ou cerca de 99,5% ou pelo menos ou cerca de 99,9% identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 45.
[0064] Em algumas modalidades, a proteína gapN compreende a SEQ ID NO: 42. Em algumas modalidades, a proteína gapN tem pelo menos ou cerca de 50%, pelo menos ou cerca de 60%, pelo menos ou cerca de 70%, pelo menos ou cerca de 75%, pelo menos ou cerca de 80%, pelo menos ou cerca de 81%, pelo menos ou cerca de 82%, pelo menos ou cerca de 83%, pelo menos ou cerca de 84%, pelo menos ou cerca de 85%, pelo menos ou cerca de 86%, pelo menos ou cerca de 87%, pelo menos ou cerca de 88%, pelo menos ou cerca de 89%, pelo menos ou cerca de 90%, pelo menos ou cerca de 91%, pelo menos ou cerca de 92%, pelo menos ou cerca de 93%, pelo menos ou cerca de 94%, pelo menos ou cerca de 95%, pelo menos ou cerca de 96 %, pelo menos ou cerca de 97%, pelo menos ou cerca de 98%, pelo menos ou cerca de 99%, pelo menos ou cerca de 99,5%, ou pelo menos ou cerca de 99,9% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO:
42.
[0065] Aqueles versados na técnica entenderá que um gene GAPN pode ser derivado de qualquer fonte e pode ser manipulado usando mé- todos de rotina, tais como para aperfeiçoar a expressão em uma célula hospedeira. Biossíntese de trealose
[0066] A levedura manipulada aqui descrita pode expressar de forma recombinante um ou mais genes que codificam uma ou mais pro- teínas envolvidas na biossíntese de trealose (Gancedo et al. (2004) FEMS YeastResearch 4:351-359). Exemplos não limitantes de enzimas envolvidas na biossíntese de trealose incluem trealose-6-fosfato sintase (Tpsl1; E.C. 2.4.1.15) e trealose-6-fosfato fosfatase (Tps2; E.C.
3.1.3.12).
[0067] Em5. cerevisiae, Tps1 é codificada pelo gene TPS1 (UniProt No. C7GY09), e Tps2 é codificada pelo gene TPS2 (UniProt No. P31688). Deve ser apreciado que o ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima Tps1 ou Tps2 pode vir de qualquer fonte. Uma cé- lula de levedura manipulada que expressa de forma recombinante um ácido nucleico que codifica uma enzima Tps1 ou Tps2 pode ou não con- ter um gene endógeno que codifica uma enzima Tps1 ou Tps2. Em al- gumas modalidades, a célula de levedura manipulada que expressa de forma recombinante um ácido nucleico que codifica uma enzima Tps1 ou Tps2 não contém uma cópia endógena de um gene que codifica uma enzima Tps1 ou Tps2. Por conseguinte, em tais modalidades, o ácido nucleico que codifica uma enzima Tps1 ou Tps2 é derivado de uma es- pécie ou organismo diferente da célula de levedura manipulada.
[0068] Em outras modalidades, a levedura manipulada que ex- pressa de forma recombinante um ácido nucleico que codifica uma en- zima Tps1 ou Tps2 contém uma cópia endógena de um gene que codi- fica uma enzima Tps1 ou Tps2. Em algumas dessas modalidades, a có- pia endógena do gene que codifica uma enzima Tps1 ou Tps2, ou uma região reguladora para o gene, como um promotor, é manipulada para aumentar a expressão do gene que codifica uma enzima Tpsl ou Tps2. Em outras modalidades, um ácido nucleico que codifica uma en- zima Tps1 ou Tps2 é introduzido na levedura. Em tais modalidades, o ácido nucleico que codifica a enzima Tps1 ou Tps2 que é introduzida na levedura pode ser derivado da mesma espécie ou organismo como a levedura manipulada em que é expresso, ou pode ser derivado de uma espécie ou organismo diferente da levedura manipulada na qual é ex- presso.
[0069] Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima Tps1 ou Tps2 compreende um gene de S. ce- revisiae (por exemplo, que corresponde a UniProt Nos. C7GY09 ou P31688). Em algumas modalidades, Tps1 corresponde a SEQ ID NO:
43. Em algumas modalidades, Tps2 corresponde a SEQ ID NO: 44. Aquele versado na técnica entenderá que um gene TPS1 ou TPS2 pode ser derivado de qualquer fonte e pode ser manipulado usando métodos de rotina, tais como para melhorar a expressão em uma célula hospe- deira. Glicoamilases
[0070] A levedura manipulada aqui descrita expressa de forma re- combinante um ácido nucleico que codifica uma enzima glicoamilase (E.C. 3.2.1.3). Enzimas glicoamilase hidrolisam resíduos terminais de alfa-D-glicose 1,4-ligados sucessivamente a partir de extremidades não redutoras de cadeias de amilose para liberar glicose livre (veja, por exemplo, Mertens et al, Curr Microbiol (2007) 54: 462-6).
[0071] Deve ser apreciado que o ácido nucleico que codifica uma enzima glicoamilase pode vir de qualquer fonte. Uma levedura manipu- lada que expressa de forma recombinante um ácido nucleico que codi- fica uma enzima glicoamilase pode ou não conter um gene endógeno que codifica uma enzima glicoamilase. Em algumas modalidades, a le- vedura manipulada que expressa de forma recombinante um ácido nu- cleico que codifica uma enzima glicoamilase não contém uma cópia en- dógena de um gene que codifica uma enzima glicoamilase. Por conse- guinte, em tais modalidades, o ácido nucleico que codifica uma enzima glicoamilase é derivado de uma espécie ou organismo diferente da le- vedura manipulada.
[0072] Em outras modalidades, a levedura manipulada que ex- pressa de forma recombinante um ácido nucleico que codifica uma en- zima glicoamilase contém uma cópia endógena de um gene que codifica uma enzima glicoamilase. Em algumas de tais modalidades, a cópia en- dógena do gene que codifica uma enzima glicoamilase ou uma região reguladora do gene, tal como um promotor, é manipulada para aumentar a expressão do gene que codifica uma enzima glicoamilase. Em outras modalidades, um ácido nucleico que codifica uma enzima glicoamilase é introduzido na levedura. Em tal modalidades, o ácido nucleico que co- difica a enzima glicoamilase que é introduzida na levedura pode ser de- rivado da mesma espécie ou organismo como a levedura manipulada em que é expressa, ou pode ser derivado de uma espécie ou organismo diferente da levedura manipulada em que é expresso.
[0073] Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima glicoamilase compreende um gene de Sac- charomycopsis fibuligera (por exemplo, que corresponde a UniProt No. Q8TFE5). Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima glicoamilase, ou uma porção da mesma, é oti- mizado por códons. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recom- binante que codifica uma enzima glicoamilase, ou uma porção da mesma, compreende SEQ ID NO: 46 a 49.
[0074] Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante que codifica uma glicoamilase tem pelo menos ou cerca de 50%, pelo menos ou cerca 60%, pelo menos ou cerca de 70%, pelo menos ou cerca de 80%, pelo menos ou cerca de 85%, pelo menos ou cerca de 90%, pelo menos ou cerca de 95%, pelo menos ou cerca de 96%, pelo menos ou cerca de 97 %, pelo menos ou cerca de 98%, pelo menos ou cerca de 99%, pelo menos ou cerca de 99,5%, pelo menos ou cerca de 99,9%, ou pelo menos ou cerca de 100% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:46 a 49.
[0075] Em algumas modalidades, a glicoamilase tem pelo menos ou cerca de 50%, pelo menos ou cerca de 60%, pelo menos ou cerca de 70%, pelo menos ou cerca de 80%, pelo menos ou cerca de 85%, pelo menos ou cerca de 90%, pelo menos pelo menos ou cerca de 95%, pelo menos ou cerca de 96%, pelo menos ou cerca de 97%, pelo menos ou cerca de 98%, pelo menos ou cerca de 99%, pelo menos ou cerca de 99,5%, pelo menos ou cerca de 99,9%, ou pelo menos pelo menos ou cerca de 100% de identidade de sequência com a sequência de proteína de SEQ ID NO: 38.
[0076] Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima glicoamilase compreende um gene de Rhizo- pus delemar (por exemplo, RO3G 00082, que corresponde a UniProt No. I1BGP8). Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima glicoamilase, ou uma porção da mesma, é oti- mizado por códons. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recom- binante que codifica uma enzima glicoamilase, ou uma porção da mesma, compreende SEQ ID NO: 52 ou 53.
[0077] Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante que codifica uma glicoamilase tem pelo menos ou cerca de 50%, pelo menos ou cerca de 60%, pelo menos ou cerca de 70%, pelo menos ou cerca de 80%, pelo menos ou cerca de 85%, pelo menos ou cerca de 90%, pelo menos ou cerca de 95%, pelo menos ou cerca de 96%, pelo menos ou cerca de 97%, pelo menos ou cerca de 98%, pelo menos ou cerca de 99%, pelo menos ou cerca de 99,5%, pelo menos ou cerca de 99,9% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 52 ou 53.
[0078] Em algumas modalidades, a glicoamilase tem pelo menos ou cerca de 50%, pelo menos ou cerca de 60%, pelo menos ou cerca de 70%, pelo menos ou cerca de 80%, pelo menos ou cerca de 85%, pelo menos ou cerca de 90%, pelo menos pelo menos ou cerca de 95%, pelo menos ou cerca de 96%, pelo menos ou cerca de 97%, pelo menos ou cerca de 98%, pelo menos ou cerca de 99%, pelo menos ou cerca de
99,5%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de pro- teína da SEQ ID NO: 40.
[0079] Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima glicoamilase compreende um gene de Rhizo- pus microsporus (por exemplo, que corresponde a UniProt No. AOAOC7BD37). Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombi- nante que codifica uma enzima glicoamilase, ou uma porção da mesma, é otimizado por códons. Em algumas modalidades, o ácido nucleico re- combinante que codifica uma enzima glicoamilase, ou uma porção da mesma, compreende a SEQ ID NO: 54.
[0080] Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante que codifica uma glicoamilase tem pelo menos ou cerca de 50%, pelo menos ou cerca de 60% , pelo menos ou cerca de 70%, pelo menos ou cerca de 80%, pelo menos ou cerca de 85%, pelo menos ou cerca de 90%, pelo menos ou cerca de 95%, pelo menos ou cerca de 96%, pelo menos ou cerca de 97%, pelo menos ou cerca de 98%, pelo menos ou cerca de 99%, pelo menos ou cerca de 99,5%, pelo menos ou cerca de 99,9%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:54.
[0081] Em algumas modalidades, a glicoamilase compreende pelo menos ou cerca de 50%, pelo menos ou cerca de 60%, pelo menos ou cerca de 70%, pelo menos ou cerca de 80%, pelo menos ou cerca de 85%, pelo menos ou cerca de 90%, em pelo menos ou cerca de 95%, pelo menos ou cerca de 96%, pelo menos ou cerca de 97%, pelo menos ou cerca de 98%, pelo menos ou cerca de 99%, pelo menos ou cerca de 99,5%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de proteína da SEQ ID NO: 41.
[0082] Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima glicoamilase compreende um gene de Rhizo- pus oryzae (por exemplo, amyA, que corresponde a UniProt No.
B7XC04). Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima glicoamilase, ou uma porção da mesma, é oti- mizado por códons. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recom- binante que codifica uma enzima glucoamilase, ou uma porção da mesma, compreende SEQ ID NO: 50 ou 51.
[0083] Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante que codifica uma glicoamilase tem pelo menos ou cerca de 50%, pelo menos ou cerca de 60%, pelo menos ou cerca de 70%, pelo menos ou cerca de 80%, pelo menos ou cerca de 85%, pelo menos ou cerca de 90%, pelo menos ou cerca de 95%, pelo menos ou cerca de 96%, pelo menos ou cerca de 97%, pelo menos ou cerca de 98%, pelo menos ou cerca de 99%, pelo menos ou cerca de 99,5%, pelo menos ou cerca de 99,9% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 50 ou 51.
[0084] Em algumas modalidades, a glicoamilase tem pelo menos ou cerca de 50%, pelo menos ou cerca de 60%, pelo menos ou cerca de 70%, pelo menos ou cerca de 80%, pelo menos ou cerca de 85%, pelo menos ou cerca de 90%, pelo menos pelo menos ou cerca de 95%, pelo menos ou cerca de 96%, pelo menos ou cerca de 97%, pelo menos ou cerca de 98%, pelo menos ou cerca de 99%, pelo menos ou cerca de 99,5%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de pro- teína da SEQ ID NO: 39. Células Hospedeiras
[0085] Qualquer tipo de célula que pode ser usada para fermenta- ção para produzir etanol pode ser compatível com aspectos da inven- ção, incluindo células fúngicas, tais como células de levedura. Exem- plos não limitantes de células de levedura incluem células de levedura obtidas de, por exemplo, Saccharomyces spp., Schizosaccharomyces spp., Pichia spp., Paffia spp., Kluyveromyces spp., Candida spp., Tala- romyces spp., Brettanomyces spp., Pachysolen spp. , Debaryomyces spp., Yarrowia spp. e cepas de leveduras poliplóides industriais. Em certas modalidades, a célula de levedura é uma célula de S. cerevi- siae. Outros exemplos de células fúngicas incluem células obtidas de Aspergillus spp., Penicillium spp., Fusarium spp., Rhizopus spp., Acre- monium spp., Neurospora spp., Sordaria spp., Magnaporthe spp., Allomyces spp., Ustilago spp., Botrytis spp. e Trichoderma spp.
[0086] Em algumas modalidades, a célula é de uma espécie de le- vedura pós-duplicação do genoma completo, tal como S. cerevisiae (Wolfe (2015) PLoS Biol 13 (8): e 1002221). Condições de fermentação
[0087] Novos métodos para a produção de etanol, compreendendo a fermentação com levedura manipulada são fornecidos aqui. Em algu- mas modalidades, um método para a produção de etanol inclui a cultura de uma célula, tal como uma célula manipulada aqui descrita, com um substrato de fermentação, sob condições que resultam na produção de etanol.
[0088] O substrato de fermentação pode compreender um amido. O amido pode ser obtido de uma fonte natural, tal como uma fonte vege- tal. O amido também pode ser obtido a partir de uma matéria-prima com alto teor de amido ou açúcar, incluindo, mas não limitada a milho, sorgo doce, frutas, batata doce, arroz, cevada, cana-de-açúcar, beterraba açucareira, trigo, mandioca, batata, tapioca, araruta, ervilhas ou sagu. Em algumas modalidades, o substrato de fermentação é de bio- massa lignocelulósica, tal como madeira, palha, gramíneas ou bio- massa de algas, tais como microalgas e macroalgas. Em algumas mo- dalidades, o substrato de fermentação é de gramíneas, árvores ou resí- duos agrícolas e florestais, tais como espigas e talos de milho, palha de arroz, serragem e aparas de madeira. Um substrato de fermentação também pode compreender um açúcar, tal como glicose ou sacarose.
[0089] Em algumas modalidades, o substrato de fermentação com- preende uma matéria-prima de etanol de moagem a seco, tal como mosto de milho. Em algumas modalidades, o substrato de fermentação compreende um mosto de milho liquefeito (LCM). Em algumas modali- dades, o substrato de fermentação compreende uma matéria-prima de milho de moagem a úmido, tal como Light Steep Water/Liquifact (LSW/LQ).
[0090] Os meios para a fermentação da levedura manipulada aqui descritos podem ser suplementados com vários componentes. Por exemplo, meios para fermentação de leveduras manipuladas aqui des- critas podem ser suplementados com glicoamilase. Em algumas moda- lidades, a glicoamilase é Spirizyume!" (Novozymes, Bagsvaerd, Dina- marca).
[0091] Em algumas modalidades, a concentração e a quantidade de um componente suplementar, tal como a glicoamilase, são otimiza- das. Por exemplo, em algumas modalidades, a glicoamilase é adicio- nada em uma concentração de cerca de 1%, 5%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% , 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30% ou mais do que 30%. Em algumas modali- dades, uma quantidade de glicoamilase é adicionada para atingir uma dose de aproximadamente 0,33 AGU/g de Sólidos Secos. Em algumas modalidades, uma quantidade de glicoamilase é adicionada para atingir uma dose de aproximadamente 0,0825 AGU/g de Sólidos Secos. Em algumas modalidades, uma quantidade de glicoamilase é adicionada para atingir uma dose de aproximadamente 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 ou 1 AGU/g de Sólidos Secos.
[0092] Deve ser apreciado que a levedura manipulada aqui descrita pode ser cultivada em meio de qualquer tipo e qualquer composição, e as condições de fermentação podem ser otimizadas através da experi- mentação de rotina, tal como seria entendido por aquele versado na técnica. Em algumas modalidades, as condições de fermentação são otimizadas para a produção de etanol. Os parâmetros que podem ser otimizados incluem, mas não estão limitados a temperatura, concentra- ção de açúcar, pH, tempo de fermentação, taxa de agitação e/ou tama- nho do inóculo.
[0093] Em algumas modalidades, a temperatura do meio de cultura para uma levedura manipulada aqui descrita é controlada para a produ- ção ideal de etanol. (Veja, por exemplo, Zabed etal., Sci World] (2014): 1-11; Charoenchai et al., Am) Enol Vitic (1998) 49: 283-8; MarelneCot et al, FEMS Yeast Res (2007) 7:22-32; Liu et al., Bioresour Technol (2008) 99: 847-54; Phisalaphong et al. / Biochem Eng (2006) 28:36- 43). Vários fatores podem influenciar a temperatura ótima para o cultivo de uma levedura manipulada para a produção de etanol (por exemplo, tipo de célula, meio de crescimento e condições de crescimento). Em algumas modalidades, a temperatura da cultura está entre 25 e 40ºC, inclusive. Em certas modalidades, a temperatura é de cerca de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40ºC ou qualquer valor intermediário. Em algumas modalidades, a temperatura está entre 30 e 35ºC, inclusive ou qualquer valor intermediário. Em algumas modalida- des, a temperatura é de aproximadamente 33ºC. Em certas modalida- des, a temperatura é de aproximadamente 33,3ºC.
[0094] Em algumas modalidades, o pH de um meio de cultura aqui descrito é controlado para a produção ideal de etanol (Lin et al., Bio- mass-Bioenergy (2012) 47: 395-401). Em algumas modalidades, o pH da cultura ou uma mistura de fermentação de uma célula manipulada aqui descrita está em uma faixa entre 4,0 e 6,0. Em algumas modalida- des, o pH é mantido por pelo menos parte da incubação em 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5/7,
5,8, 5,9 ou 6,0. Em algumas modalidades, o pH é mantido em uma faixa entre 5,0 e 5,5.
[0095] Em algumas modalidades, o tempo de cultura é controlado para a produção ótima de etanol (Lin et al, Biomass-Bioenergy (2012) 47:395-401). Em algumas modalidades, uma levedura manipulada é cultivada por aproximadamente 24-72 horas. Em algumas modalidades, uma levedura manipulada é cultivada por aproximadamente 12, 18, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,41 ,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 , 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 78, 80, 90, 96 horas ou mais do que 96 horas. Em algumas modalidades, uma levedura ma- nipulada aqui descrita é cultivada por aproximadamente 48 a 72 ho- ras. Em algumas modalidades, um tempo de cultura (fermentação) de cerca de 48 horas é um tempo representativo para processos de fer- mentação de etanol em escala comercial. Consequentemente, um ponto de tempo de 48 horas pode ser usado para comparar o desem- penho de fermentação de diferentes cepas de levedura.
[0096] Os parâmetros de reação podem ser medidos ou ajustados durante a produção de etanol. Exemplos não limitativos de parâmetros de reação incluem parâmetros biológicos (por exemplo, taxa de cresci- mento, tamanho da célula, número de células, densidade celular, tipo de célula ou estado da célula, etc.), parâmetros químicos (por exemplo, pH, potencial redox, concentração de reação do substrato e/ou produto, concentração de gases dissolvidos, tal como a concentração de oxigê- nio e a concentração de CO», concentrações de nutrientes, concentra- ções de metabolitos, concentração de etanol, concentração de subs- trato de fermentação, concentração de um oligopeptídeo, concentração de um aminoácido, concentração de uma vitamina, concentração de um hormônio, concentração de um aditivo, concentração sérica, força iô-
nica, concentração de um íon, umidade relativa, molaridade, osmolari- dade, concentração de outros produtos químicos, parâmetros termodi- nâmicos, tais como temperatura, intensidade/qualidade da luz, etc.). Sensores para medir os parâmetros descritos neste documento são bem conhecidos por aqueles versados na técnica.
[0097] Os teores de açúcar e oligocarboidratos são determinados usando HPLC com a coluna Aminex HP X- 87H (300 mm x 7,8 mm) à 60ºC, fase móvel de ácido sulfúrico 0,01 N, taxa de fluxo de 0,6 mL/min. Ensaio e Condições de Teste Teste 1
[0098] Aspectos da descrição se referem à levedura manipulada que é capaz de produzir pelo menos 100 9/kg de etanol e produzir me- nos do que 1,5 g/kg de glicose residual em 48 horas sob as condições de Teste 1, que envolvem a caracterização de cepas em DS mosto de milho 33% a 33,3ºC.
[0099] Como usadas aqui, as condições do "Teste 1" se referem ao seguinte:
[00100] As cepas são colocadas em uma placa YPD e incubadas a 30ºC até que colônias únicas sejam visíveis (1-2 dias). As células de uma placa YPD são raspadas em tampão de fosfato estéril de pH 7,0 e a densidade óptica (OD600) é medida. A densidade óptica é medida em um comprimento de onda de 600 nm com um comprimento de trajeto de 1 cm usando um modelo Genesys 20 Visible Spectrophotometer (Thermo Scientific). Um frasco de agitação é inoculado com o volume da emulsão de células necessário para atingir um OD600 inicial de 0,1. O volume de inoculação é tipicamente cerca de 66 ul. Imediata- mente antes da inoculação, os seguintes materiais são adicionados a cada frasco de agitação com defletor de 250 ml: 50 gramas de mosto de milho liquefeito, 190 ul de ureia esterilizada por filtração 500 g/L e 2,5 ul de um concentrado esterilizado por filtração de ampicilina de 100 mg/ml. Para os frascos de agitação que contêm a cepa de controle Etha- nol Red6, uma quantidade de glicoamilase (Spirizyme Fuel HST" No- vozymes; lote NAPM3771) para atingir uma dose de 0,33 AGU/g de Só- lidos Secos é adicionada aos frascos e 0,0825 AGU/g de Sólidos Secos (ou 25% da dose fornecida ao Ethanol RedG6) de glicoamilase (Spi- rizyme Fuel HST" Novozymes; lote NAPM3771) são adicionados aos frascos contendo a levedura que expressa a glicoamilase. A atividade da glicoamilase é medida usando o Ensaio de Atividade da Glicoamilase (descrito na seção de Exemplos). Frascos duplicados para cada cepa são incubados a 33,3ºC com agitação em um agitador orbital a 100 rom para aproximadamente 48 horas. Em 48 horas, amostras de 1ml são retiradas e analisadas quanto às concentrações de etanol e glicose no caldo por cromatografia líquida de alto desempenho com detector de Índice de refração. Teste 2
[00101] Os aspectos da descrição se referem à levedura manipulada, como 5. cerevisiae, que é capaz de produzir pelo menos 100 g/kg de etanol e produzir menos de 1,5 g/kg de glicose residual em 48 horas nas condições do Teste 2, envolvendo a caracterização de cepas em DS mosto de milho 33% a 33,3ºC.
[00102] “Talcomo usadas aqui, as condições do "Teste 2" se referem ao seguinte:
[00103] As cepas são colocadas em uma placa YPD e incubadas a 30ºC até que colônias únicas sejam visíveis (1-2 dias). As células de uma placa YPD são raspadas em tampão de fosfato estéril de pH 7,0 e a densidade óptica (O D600) é medida. A densidade óptica é medida no comprimento de onda de 600 nm com um comprimento de caminho de 1 cm usando um modelo Genesys 20 Visible Spectrophotometer (Thermo Scientific). Um frasco de agitação é inoculado com o volume da pasta de células necessário para atingir um OD600 inicial de 0,1. O volume de inoculação é tipicamente cerca de 66 ul. Imediatamente an- tes da inoculação, os seguintes materiais são adicionados a cada frasco de agitação com defletor de 250 ml: 50 gramas de mosto de milho lique- feito, 190 ul de ureia esterilizada por filtração 500 g/L e 2,5 ul de um concentrado esterilizado por filtração de ampicilina de 100 mg/ml. Os frascos de agitação recebem uma quantidade de glicoamilase (Spi- rizyme Fuel HSTY Novozymes; lote NAPM3771) para alcançar uma dose de 0,33 AGU/g de Sólidos Secos é adicionada aos frascos. A atividade da glicoamilase é medida usando o Ensaio de Atividade da Glicoamilase (descrito na seção de Exemplos). Frascos em duplicata para cada cepa são incubados a 33,3ºC com agitação em um agitador orbital a 100 rom por aproximadamente 48 horas. Em 48 horas, amostras de 1 ml são re- tiradas e analisadas quanto às concentrações de etanol e glicose no caldo por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de índice de refração. Teste 4
[00104] Aspectos da descrição se referem a cepas de levedura ma- nipuladas que exibem redução de glicerol de pelo menos 30% por 48 horas, quando comparadas a uma cepa de referência não modificada, sob as condições do Teste 4, envolvendo a avaliação de cepas em um ensaio de fermentação e sacarificação simultâneas (SSF) em frasco de agitação.
[00105] “Como usadas aqui, as "condições do Teste 4" se referem ao seguinte:
[00106] As cepas são colocadas em uma placa ScD-ura e incubadas a 30ºC até que colônias únicas sejam visíveis (2-3 dias). As células da placa ScD-ura são raspadas em meio de frasco de agitação estéril e a densidade óptica (OD600) é medida. A densidade óptica é medida no comprimento de onda de 600 nm com um comprimento de trajetória de
1 cm usando um espectrofotômetro modelo Genesys20 (Thermo Scien- tific). Um frasco de agitação é inoculado com a emulsão de células para atingir uma OD600 inicial de 0,1. Imediatamente antes da inoculação, 50 mL de meio de frasco agitado são adicionados a um frasco de agita- ção de 250 mL selado com câmara de vácuo contendo 4 ml de óleo de canola esterilizado. O meio do frasco de agitação consiste em 725 g de amido de milho parcialmente hidrolisado, 150 g de água filtrada, 10 g de água, 25 g de glicose e 1 g de uréia. As cepas são incubadas a 30ºC com agitação em um agitador orbital a 100 rpm por 72 horas. As amos- tras são coletadas e analisadas quanto as concentrações de metaboli- tos no caldo durante a fermentação por HPLC.
[00107] Em algumas modalidades, as cepas de levedura manipula- das aqui descritas produzem pelo menos 30% menos glicerol do que uma cepa de referência. Em algumas modalidades, uma cepa de refe- rência é a cepa de controle Cepa 1. Em algumas modalidades, as cepas de levedura manipuladas aqui descritas produzem pelo menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34% , 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% ou pelo menos 50 % menos glicerol do que uma cepa de referência em 48 horas. Rendimento em etanol
[00108] A levedura modificada aqui descrita produz alta concentra- ção de etanol. A concentração de etanol pode ser indicada em uma es- cala de gramas por quilograma (g/Kkg) ou em gramas por litro (g/L).
[00109] Em algumas modalidades, a concentração de etanol no caldo de fermentação no final da fermentação é cerca de ou pelo menos 10, cerca de ou pelo menos 15, cerca de ou pelo menos 20, cerca de ou pelo menos 25, cerca de ou pelo menos 30, cerca de ou pelo menos pelo menos 35, cerca de ou pelo menos 40, cerca de ou pelo menos 45,
cerca de ou pelo menos 50, cerca de ou pelo menos 55, cerca de ou pelo menos 60, cerca de ou pelo menos 65, cerca de ou pelo menos 70, cerca de ou pelo menos 75 , cerca de ou pelo menos 80, cerca de ou pelo menos 85, cerca de ou pelo menos 90, cerca de ou pelo menos 95, cerca de ou pelo menos 100, cerca de ou pelo menos 105, cerca de ou pelo menos 110, cerca de ou pelo menos 115, cerca de ou pelo menos 120, cerca de ou pelo menos 125, cerca de ou pelo menos 130, cerca de ou pelo menos 135, cerca de ou pelo menos 140, cerca de ou pelo menos 145, cerca de ou pelo menos 150, cerca de ou pelo menos 155, cerca ou pelo menos pelo menos 160, cerca de ou pelo menos 165, cerca ou pelo menos 170,cerca de ou pelo menos 175, cerca de ou pelo menos 180 (gramas por quilograma), incluindo todos os valores e inter- valos intermediários, ou mais do que 180 g9/kg.
[00110] Em algumas modalidades, a concentração de etanol no caldo de fermentação no final da fermentação é de cerca de ou pelo menos 10, cerca de ou pelo menos 15, cerca de ou pelo menos 20, cerca de ou pelo menos 25, cerca de ou pelo menos 30, cerca de ou pelo menos pelo menos 35, cerca de ou pelo menos 40, cerca de ou pelo menos 45, cerca de ou pelo menos 50, cerca de ou pelo menos 55, cerca de ou pelo menos 60, cerca de ou pelo menos 65, cerca de ou pelo menos 70, cerca de ou pelo menos 75 , cerca de ou pelo menos 80, cerca de ou pelo menos 85, cerca de ou pelo menos 90, cerca de ou pelo menos 95, cerca de ou pelo menos 100, cerca de ou pelo menos 105, cerca de ou pelo menos 110, cerca de ou pelo menos 115, cerca de ou pelo menos 120, cerca de ou pelo menos 125, cerca de ou pelo menos 130, cerca de ou pelo menos 135, cerca de ou pelo menos 140, cerca de ou pelo menos 145, cerca de ou pelo menos 150, cerca de ou pelo menos 155, cerca ou pelo menos pelo menos 160, cerca de ou pelo menos 165, cerca ou pelo menos 170,cerca de ou pelo menos 175,
cerca de ou pelo menos 180 (gramas por litro), incluindo todos os valo- res e intervalos intermediários, ou mais do que 180 g/L.
[00111] O rendimento em massa do etanol pode ser calculado divi- dindo a concentração de etanol pela glicose total consumida. Uma vez que a glicose pode estar presente como glicose livre ou ligada em oli- gômeros, é preciso levar em conta ambos. Para determinar a glicose total presente no início e no final da fermentação, uma medida de equi- valentes totais de glicose (TGE) é determinada. A medida de TGE é re- alizada da seguinte maneira. A glicose é medida por HPLC usando de- tecção RI. A separação é completada com uma coluna Bio Rad 87H usando uma fase móvel de H2504 10 mM. Uma hidrólise ácida é reali- zada em triplicata em ácido trifluoracético 6% (v/v) a 121ºC durante 15 minutos. A glicose resultante após a hidrólise é medida pelo mesmo mé- todo de HPLC. O total de equivalentes de glicose presentes em cada amostra é a quantidade de glicose medida após a hidrólise ácida. A gli- cose total consumida é calculada subtraindo os equivalentes de glicose totais presentes no final da fermentação dos equivalentes de glicose to- tais presentes no início da fermentação.
[00112] O rendimento de etanol pode ser calculado como um au- mento em relação a uma cepa de levedura de referência, por exemplo, uma cepa de referência que não contenha uma ou mais das modifica- ções genéticas de cepas de levedura manipuladas aqui descritas. Em algumas modalidades, a equação para Rendimento de Etanol pode ser definida como: (Título de Etanol no Tempo final - Título de Etanol no Tempo zero) dividido por TGE no Tempo zero. Em algumas modalida- des, o rendimento de etanol é determinado usando a equação referida como "Teste 3" abaixo.
Teste 3 (Título Etanol em Trnai - Título Etanol em T zero) Rendimento > AX 210 etanol (%) Equivalentes Totais Glicose em Tzero
[00113] Emalgumas modalidades, o aumento no rendimento de eta- nol em uma cepa manipulada aqui descrita em relação a uma cepa de referência é de cerca de ou pelo menos 0,05%, cerca de ou pelo menos 0,1%, cerca de ou pelo menos 0,2%, cerca de ou pelo menos 0,3%, cerca de ou pelo menos 0,4%, cerca de ou pelo menos 0,5%, cerca de ou pelo menos 0,6%, cerca ou pelo menos 0,7%, cerca ou pelo menos 0,8%, cerca ou pelo menos 0,9%, cerca ou pelo menos 1%, cerca de ou pelo menos 1,1%, cerca de ou pelo menos 1,2%, cerca ou pelo menos 1,3%, cerca ou pelo menos 1,4%, cerca ou pelo menos 1,5%, cerca ou pelo menos 1,6%, cerca ou pelo menos 1,7%, cerca ou pelo menos pelo menos 1,8%, cerca ou pelo menos 1,9%, cerca ou pelo menos 2%, cerca ou pelo menos 2,5%, cerca ou pelo menos 3%, cerca ou pelo me- nos 3,5%, cerca ou pelo menos 4%, cerca ou pelo menos 4,5%, ou cerca de ou pelo menos 5% em relação a uma cepa de referência, incluindo todos os valores e intervalos intermediários ou mais de 5%. Expressão de ácidos nucleicos recombinantes
[00114] Como aquele versado na técnica deverá estar ciente, genes homólogos para as enzimas aqui descritas podem ser obtidos de outras espécies e podem ser identificados por pesquisas de homologia, por exemplo, através de uma pesquisa BLAST de proteína, disponível no site da internet do National Center for Biotechnology Information (NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov). Os genes podem ser clonados, por exemplo, por amplificação por PCR e/ou digestão de restrição, a partir do DNA de qualquer fonte de DNA que contenha o dado gene. Em algumas moda- lidades, um gene é sintético. Qualquer meio para obter ou sintetizar um gene que codifique uma enzima pode ser usado.
[00115] A presente descrição se refere à expressão recombinante de genes que codificam as enzimas discutidas acima, modificações funci- onais e variantes das mesmas, assim como usos relacionados às mes- mas. Os homólogos e alelos dos ácidos nucleicos associados à inven- ção podem ser identificados por técnicas convencionais. Homólogos e alelos irão normalmente compartilhar pelo menos 75% de identidade de nucleotídeos e/ou pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com as sequências de ácidos nucleicos e polipeptídeos, respectivamente, em alguns casos irão compartilhar pelo menos 90% de identidade de nucleotídeos e/ou pelo menos 95% de identidade de aminoácidos e ainda em outros casos irão compartilhar pelo menos 95% de identidade de nucleotídeos e/ou pelo menos 99% de identidade de aminoácidos. À homologia pode ser calculada usando várias ferramentas de programas disponíveis para o público, desenvolvidas pelo NCBI (Bethesda, Maryland) que podem ser obtidas através do site do NCBI na inter- net. Ferramentas exemplificadoras incluem o programa BLAST, tam- bém disponível no site do NCBI na Internet (www.ncbi.nlm.nih.gov). O pareamento e os alinhamentos ClustalW (ajuste da matriz BLOSUM30) assim como a análise hidropática de Kyte-Doolittle podem ser obtidos usando o programa de análise de sequência MacVector (Oxford Mole- cular Group). Os complementos de Watson-Crick dos ácidos nucleicos precedentes também estão contemplados aqui.
[00116] Porexemplo, um alinhamento pode ser executado usando o programa BLAST (National Center for Biological Information (NCBI) Ba- sic Local Alignment Search Tool) versão 2.2.31 com parâmetros pa- drão. O % de identidade de sequência de aminoácidos entre as sequên- cias de aminoácidos pode ser determinado usando a proteína padroni- zada de BLAST com os seguintes parâmetros padronizados: Sequên- cias-alvo máximas: 100; Consultas curtas: parâmetros automatica- mente ajustados para sequências de entrada curtas; Limiar esperado:
10; Tamanho da palavra: 6; Máximo de correspondências em um inter- valo de consulta: 0; Matriz: BLOSUM62; Custos de lacuna: (E xistência: 11, Extensão: 1); Ajustes composicionais: Ajuste condicional da matriz de pontuação composicional; Filtro: nenhum selecionado; Máscara: ne- nhuma selecionada. O % de identidade de sequência de ácido nucleico entre as sequências de ácido nucleico pode ser determinado usando BLAST de nucleotídeo padronizado com os seguintes parâmetros pa- dronizados: Sequências-alvo máximas: 100; Consultas curtas: ajustar automaticamente os parâmetros para sequências de entrada curtas; Li- mite esperado: 10; Tamanho da palavra: 28; Máximo de correspondên- cias em um intervalo de consulta: 0; Pontuação de correspondência/in- compatibilidade: 1, -2; Custos de intervalo: Linear; Filtro: regiões de baixa complexidade; Máscara: máscara apenas para tabela de pes- quisa. Uma sequência com uma pontuação de identidade de XX% (por exemplo, 80%) em relação a uma sequência de referência usando o algoritmo NCBI BLAST versão 2.2.3.1 com parâmetros padronizados é considerada ser XX% idêntica ou, de modo equivalente, ter XX% de identidade de sequência com uma sequência de referência.
[00117] A presente descrição também se refere a ácidos nucleicos degenerados que incluem códons alternativos àqueles presentes nos materiais nativos. Por exemplo, os resíduos de serina são codificados pelos códons TCA, AGT, TCC, TCG, TCT e AGC. Cada um dos seis códons é equivalente para os propósitos de codificação de um resíduo de serina. Assim, será evidente para aquele versado na técnica que qualquer um dos tripletos de nucleotídeos que codificam a serina pode ser empregado para dirigir o aparelho de síntese de proteínas, in vitro ou in vivo, para incorporar um resíduo de serina em um polipeptídeo em alongamento. Similarmente, tripletos de sequências de nucleotídeos que codificam outros resíduos de aminoácidos incluem, mas não estão limitados a: CCA, CCC, CCG e CCT (códons de prolina); CGA, CGC,
CGG, CGT, AGA e AGG (códons de arginina); ACA, ACC, ACG e ACT (códons de treonina); AAC e AAT (códons de asparagina); e ATA, ATC e ATT (códons de isoleucina). Outros resíduos de aminoácidos podem ser codificados de forma semelhante por múltiplas sequências de nucle- otídeos. Assim, a presente descrição abrange ácidos nucleicos degene- rados que diferem dos ácidos nucleicos isolados biologicamente na se- quência de códons devido à degeneração do código genético.
[00118] Também são aqui descritas estratégias para otimizar a pro- dução de etanol em uma célula. A produção otimizada de etanol se re- fere à produção de uma quantidade maior de etanol seguindo uma es- tratégia de otimização do que seria alcançada na ausência da estratégia de otimização. Em algumas modalidades, a produção otimizada de eta- nol envolve a modificação de um gene que codifica uma enzima envol- vida na produção de etanol antes de ser expressa de forma recombi- nante em uma célula. Em algumas modalidades, a modificação envolve a otimização de códons para expressão em uma célula (por exemplo, organismo hospedeiro, tal como levedura). O uso de códons para uma variedade de organismos pode ser acessado em bancos de dados dis- poníveis para aquele versado na técnica, tal como o Codon Usage Da- tabase (kazusa.or.jp/codon/). A otimização de códons, incluindo a iden- tificação de códons ótimos para uma variedade de organismos e méto- dos para alcançar a otimização de códons, são familiares para aqueles versados na técnica e podem ser obtidos usando métodos padroniza- dos. Deve ser apreciado que várias formas com códons otimizados de qualquer uma das sequências de ácido nucleico e de proteína aqui des- critas podem ser usadas nos produtos e métodos aqui divulgados.
[00119] Em algumas modalidades, a produção de etanol em uma cé- lula pode ser otimizada através da manipulação de enzimas que atuam na mesma via que as enzimas aqui descritas (por exemplo, aumentar a expressão de uma enzima ou outro fator que atue a montante ou a ju- sante de uma enzima alvo, tal como uma enzima aqui descrita). Isso pode ser obtido pela superexpressão do fator a montante ou a jusante usando qualquer método padronizado.
[00120] Em algumas modalidades, a modificação de um gene que codifica uma enzima antes que ele seja expresso de forma recombi- nante em uma célula, envolve fazer uma ou mais mutações no gene que codifica a enzima antes que ele seja expresso de forma recombinante em uma célula. Por exemplo, uma mutação pode envolver uma substi- tuição ou deleção de um único nucleotídeo ou de vários nucleotí- deos. Em algumas modalidades, uma mutação de um ou mais nucleotí- deos em um gene que codifica uma enzima resultará em uma mutação na enzima, tal como uma substituição ou deleção de um ou mais ami- noácidos.
[00121] Mudanças adicionais podem incluir o aumento do número de cópias dos componentes do gene das vias ativas na produção de etanol, tal como por expressão epissomal adicional. Em algumas modalidades, o rastreamento de mutações em componentes da produção de etanol, ou componentes de outras vias, que levam a uma produção aumentada de etanol, pode ser conduzido por meio de um rastreamento de muta- gênese aleatória ou por meio de rastreamento de mutações conheci- das. Em algumas modalidades, a clonagem por shotgun de fragmentos genômicos pode ser usada para identificar regiões genômicas que le- vam a um aumento na produção de etanol, por meio do rastreamento de células ou organismos que possuem esses fragmentos para aumento da produção de etanol. Em alguns casos, uma ou mais mutações po- dem ser combinadas na mesma célula ou organismo.
[00122] Em algumas modalidades, a produção de etanol é aumen- tada pela seleção de promotores de várias potências para conduzir a expressão de genes. Em algumas modalidades, isso pode incluir a se- leção de plasmídeos com número de cópias alto ou plasmídeos com número de cópias baixo ou médio. A etapa de terminação da transcrição também pode ser direcionada para a regulação da expressão do gene, por meio da introdução ou eliminação de estruturas tais como haste- alças.
[00123] Proteínas ou polipeptídeos que contêm os resíduos de tipo selvagem, resíduos mutados ou resíduos com códon otimizado codifi- cados por um gene aqui descrito e moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam os polipeptídeos também são contemplados neste docu- mento. Como aqui utilizado, as expressões "proteína" e "polipeptídeo" são usadas indistintamente e, assim, a expressão polipeptídeo pode ser usada para se referir a um polipeptídeo de extensão completa e também pode ser usado para se referir a um fragmento de um polipeptídeo de extensão completa.
[00124] Em algumas modalidades aqui descritas, a célula expressa uma cópia endógena de um ou mais dos genes aqui descritos, uma có- pia recombinante de um ou mais dos genes aqui descritos ou uma cópia endógena de um ou mais dos genes aqui descritos e um cópia recom- binante de um ou mais dos genes aqui divulgados para aumento da pro- dução de etanol.
[00125] Como aqui utilizado, a expressão "superexpressão" ou "ex- pressão aumentada" se refere a um nível aumentado de expressão de um gene ou um produto de gene em uma célula, tipo de célula ou estado celular, em comparação com uma célula de referência (por exemplo, uma célula do tipo selvagem do mesmo tipo de célula ou uma célula do mesmo tipo de célula que não tenha sido modificada, tal como geneti- camente modificada). Por exemplo, em algumas modalidades, a supe- rexpressão de um ou mais genes que codificam uma enzima GapN e uma enzima glicoamilase em uma célula manipulada resulta em maior produção de etanol em relação a uma célula de referência, tal como uma célula do tipo selvagem, que não superexpressa um ou mais genes que codificam uma enzima gapN e uma enzima glicoamilase. Em algumas modalidades, a superexpressão ou o aumento da expressão de um gene em uma célula manipulada aqui descrita é obtida pela expressão recombinante de um gene endógeno para, assim, aumentar a expres- são do gene. Em algumas modalidades, a superexpressão ou aumento da expressão de um gene em uma célula manipulada aqui descrita é obtida pela expressão recombinante de um gene que não é endógeno para célula manipulada para, assim, aumentar a expressão do gene.
[00126] A expressão "exógeno", como usada aqui, significa qualquer material que se originou fora do microrganismo de interesse. Por exem- plo, a expressão "exógeno" pode ser aplicada ao material genético não presente na forma nativa de um organismo específico antes da modifi- cação genética (ou seja, tal material genético exógeno também pode ser referido como heterólogo), ou também pode ser aplicada a uma en- zima ou outra proteína que não se origine de um organismo em particu- lar.
[00127] Como descrito aqui e compreendido por aquele versado na técnica, a atividade ou expressão de um ou mais genes e produtos de gene pode ser reduzida, atenuada ou eliminada de várias maneiras, in- cluindo pela redução da expressão do gene relevante, interrompendo o gene relevante, introduzindo uma ou mais mutações no gene relevante o que resulta na produção de uma proteína com atividade enzimática reduzida, atenuada ou eliminada e/ou o uso de inibidores específicos para reduzir, atenuar ou eliminar a atividade enzimática, incluindo o uso de ácidos nucleicos, tais como micro-RNA (mIiRNA) ou RNA pequeno de interferência (siRNA), etc.
[00128] Em algumas modalidades, um ou mais dos genes aqui des- critos são expressos usando um vetor. Em algumas modalidades, um vetor se replica de forma autônoma na célula. Em outras modalidades, o vetor se integra ao genoma da célula. Um vetor pode conter um ou mais sítios de restrição de endonuclease que são cortados por uma en- donuclease de restrição para inserir e ligar um ácido nucleico que con- tenha um gene aqui descrito para produzir um vetor recombinante que é capaz de se replicar em uma célula. Os vetores são normalmente compostos de DNA, embora os vetores de RNA também estejam dispo- níveis.
[00129] Os vetores de clonagem incluem, mas não estão limitados a: plasmídeos, fosmídeos, fagomídeos, genomas de vírus e cromossomos artificiais. Como usadas aqui, as expressões "vetor de expressão" ou "construto de expressão" se referem a um construto de ácido nucleico, gerado de forma recombinante ou sintética, com uma série de elemen- tos de ácido nucleico especificados que permitem a transcrição de um ácido nucleico particular em uma célula hospedeira (por exemplo, mi- cróbio), tal como uma célula de levedura. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico de um gene aqui descrito é inserida em um vetor de clonagem de modo que seja operativamente unida a sequên- cias regulatórias e, em algumas modalidades, expressa como um trans- crito de RNA.
[00130] Em algumas modalidades, o vetor contém um ou mais mar- cadores para identificar células transformadas ou transfectadas com o vetor recombinante. Os marcadores incluem, por exemplo, genes que codificam proteínas que aumentam ou diminuem a resistência ou sensi- bilidade a compostos (por exemplo, antibióticos), genes que codificam enzimas (por exemplo, B-galactosidase, luciferase ou fosfatase alca- lina), cujas atividades são detectáveis por ensaios padronizados conhe- cidos por aqueles versados na técnica, e genes que afetam visivelmente o fenótipo de células transformadas ou transfectadas, hospedeiros, co- lônias ou placas (por exemplo, codificando proteínas fluorescentes, tais como proteína fluorescente verde). Em certas modalidades, o marcador é um marcador amdS ou um marcador URA3.
[00131] Uma sequência codificadora e uma sequência reguladora são consideradas "operativamente ligadas" quando a sequência codifi- cadora e a sequência reguladora estão ligadas covalentemente e a ex- pressão ou transcrição da sequência codificadora está sob a influência ou controle da sequência reguladora. Se a sequência codificadora é para ser traduzida em uma proteína funcional, a sequência codificadora e a sequência reguladora são ditas operativamente ligadas se a indução de um promotor na sequência reguladora 5' transcrever a sequência co- dificadora e se a natureza da ligação entre a sequência codificadora e a sequência reguladora não (1) resulta na introdução de uma mutação por mudança de matriz, (2) interfere com a capacidade da região promotora de dirigir a transcrição da sequência codificadora, ou (3) interferir com a capacidade do transcrito de RNA correspondente de ser traduzido em uma proteína. Assim, uma região promotora está operativamente ligada a uma sequência codificadora se a região do promotor transcrever a sequência codificadora e o transcrito puder ser traduzido na proteína ou polipeptídeo de interesse.
[00132] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica qualquer uma das proteínas aqui descritas está sob o controle de se- quências regulatórias (por exemplo, sequências intensificadoras). Em algumas modalidades, um ácido nucleico é expresso sob o controle de um promotor. O promotor pode ser um promotor nativo (por exemplo, o promotor do gene em seu contexto endógeno, que fornece a regulação normal da expressão do gene). Alternativamente, um promotor pode ser um promotor que é diferente do promotor nativo do gene, por exemplo, o promotor é diferente do promotor do gene em seu contexto endó- geno. Em algumas modalidades, o promotor de um gene que aumenta a produção de etanol em uma célula ou diminui a produção de glicerol em uma célula, é modificado. Um "promotor modificado" se refere a um promotor cuja sequência de nucleotídeos tenha sido alterada. Em algu- mas modalidades, o promotor modificado aumentou ou diminuiu a ativi- dade transcricional em relação a um promotor não modificado. Em al- gumas modalidades, um promotor modificado é obtido por deleção/de- leções, inserção/inserções ou mutação/ mutações ou qualquer combi- nação desses. Em algumas modalidades, um promotor é alterado, por exemplo, pela recombinação homóloga, direcionamento de gene, knockout, knock in, mutagênese direcionada ao sítio ou estratégias me- diadas por nuclease de dedo de zinco artificial, por um evento aleatório ou quase aleatório (por exemplo, irradiação ou integração de nucleotí- deos não direcionados e seleção subsequente). Outros métodos para modificar um promotor para aumentar a atividade transcricional do pro- motor conhecido por aquele versado na técnica também são contem- plados aqui.
[00133] “Como usado aqui, um "promotor heterólogo" é um promotor que não está naturalmente ou normalmente associado com ou que não controla naturalmente ou normalmente a transcrição de uma sequência de DNA à qual está operativamente ligado. Em algumas modalidades, uma sequência de ácido nucleico ou um gene aqui descrito está sob o controle de um promotor heterólogo.
[00134] Em algumas modalidades, o promotor é um promotor euca- riótico. Exemplos não limitativos de promotores eucarióticos incluem TDH3, PGK1, PKC1, TDH2, PYK1, TPI1, AT1, CMV, EFl1a, SV40, Ubc, beta actina humana, CAG, TRE, UAS, Ac5, Poliedrina, CaMKlla, GAL1, GAL10,TEF1,GDS, ADH1, CaMV35S, Ubi, H1, U6 e TEF1, como é do conhecimento daquele versado na técnica (ver, por exemplo, site da Addgene: blog.addgene.org/plasmids-101-the-promoter-region). Em al- gumas modalidades, o promotor é um promotor procariótico (por exem- plo, bacteriófago ou promotor bacteriano). Exemplos não limitantes de promotores de bacteriófagos incluem P1s 1con, T3, T7, SP6, PL. Exem- plos não limitantes de promotores bacterianos incluem Pbad, PmgrB, Ptrc2, Plac/ara, Ptac, Pm.
[00135] Em algumas modalidades, o promotor é um promotor induzí- vel. Tal como usado aqui, um "promotor induzível" é um promotor con- trolado pela presença ou ausência de uma molécula. Exemplos não |i- mitantes de promotores induzíveis incluem promotores regulados quimi- camente e promotores regulados fisicamente. Para promotores quimi- camente regulados, a atividade transcricional é regulada por um ou mais compostos, tais como álcool, tetraciclina, galactose, um esteroide, um metal ou outros compostos. Para promotores fisicamente regulados, a atividade transcricional é regulada por um fenômeno tal como luz ou temperatura. Exemplos não limitantes de promotores regulados por te- traciclina incluem promotores responsivos à anidrotetraciclina (aTc) e outros sistemas promotores responsivos à tetraciclina (por exemplo, uma proteína repressora de tetraciclina (tetR), uma sequência opera- dora de tetraciclina (tetO) e uma proteína de fusão trans-ativadora de tetraciclina (tTA)). Exemplos não limitantes de promotores regulados por esteróides incluem promotores baseados no receptor de glicocorti- coide de rato, receptor de estrogênio humano, receptores de ecdisona de mariposa e promotores da superfamília de receptor de esteroide/re- tinoide/tireoide. Exemplos não limitantes de promotores regulados por metal incluem promotores derivados de genes de metalotioneína (pro- teínas que se ligam e sequestram íons de metal). Exemplos não limitan- tes de promotores regulados pela patogênese incluem promotores indu- zidos por ácido salicílico, etileno ou benzotiadiazol (BTH). Exemplos não limitantes de promotores induzíveis pela temperatura/quente in- cluem promotores de choque térmico. Exemplos não limitantes de pro- motores regulados por luz incluem promotores responsivos à luz de cé-
lulas de plantas. Em certas modalidades, o promotor induzível é um pro- motor induzível pela galactose. Em algumas modalidades, o promotor induzível é induzido por uma ou mais condições fisiológicas (por exem- plo, pH, temperatura, radiação, pressão osmótica, gradientes salinos, ligação à superfície celular ou concentração de um ou mais agentes in- dutores extrínsecos ou intrínsecos). Exemplos não limitativos de um in- dutor extrínseco ou agente indutor incluem aminoácidos e análogos de aminoácidos, sacarídeos e polissacarídeos, ácidos nucleicos, ativado- res e repressores da transcrição de proteínas, citocinas, toxinas, com- postos à base de petróleo, compostos contendo metais, sais, íons, aná- logos de substrato de enzima, hormônios ou qualquer combinação dos mesmos.
[00136] Em algumas modalidades, o promotor é um promotor cons- titutivo. Como usado aqui, um "promotor constitutivo" se refere a um pro- motor não regulado que permite a transcrição contínua de um gene. Exemplos não limitantes de um promotor constitutivo incluem CP1, CMV, EFla, SV40, PGK1, Ubc, beta actina humana, CAG, Ac5, poliedrina, TEF1, GDS, CaM35S, Ubi, H1 e U6. Outros promotores in- duzíveis ou promotores constitutivos conhecidos por aquele versado na técnica também são contemplados aqui.
[00137] Em algumas modalidades, a célula é manipulada pela intro- dução de um ácido nucleico heterólogo (por exemplo, DNA e/ou RNA). Esse ácido nucleico heterólogo pode ser colocado sob controle operável de elementos transcricionais para permitir a expressão do DNA ou RNA heterólogo em uma célula manipulada aqui descrita. A expres- são heteróloga de genes para produção de etanol é demonstrada na seção de Exemplo usando S. cerevisiae. A produção de etanol usando novos métodos aqui descritos em outras células, incluindo outras célu- las fúngicas, também é contemplada aqui.
[00138] A natureza precisa das sequências regulatórias necessárias para a expressão do gene pode variar entre as espécies ou tipos de células, mas geralmente incluem, conforme necessário, sequências 5' não transcritas e 5' não traduzidas envolvidas com o início da transcri- ção e tradução, respectivamente, tais como uma TATA box, sequência de cobertura, sequência CAAT e semelhantes. Em particular, tais se- quências regulatórias 5' não transcritas incluirão uma região promotora que inclui uma sequência promotora para o controle da transcrição do gene operativamente ligado. As sequências regulatórias também po- dem incluir sequências intensificadoras ou sequências ativadoras a montante. Os vetores aqui descritos podem incluir sequências líder ou de sinal 5º. A sequência reguladora também pode incluir uma sequência terminadora. Em algumas modalidades, uma sequência terminadora marca o final de um gene no DNA durante a transcrição. A escolha e o projeto de um ou mais vetores adequados para induzir a expressão de um ou mais genes aqui descritos em um organismo heterólogo está den- tro da capacidade e do critério daquele versado na técnica.
[00139] Os vetores de expressão contendo os elementos necessá- rios para a expressão estão comercialmente disponíveis e são conheci- dos por aqueles versados na técnica (veja, por exemplo, Molecular Clo- ning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et ah, eds., Quarta Edição, Cold S pring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova lorque, 2012, ou Current Protocols in Molecular Biology, FM Ausubel, et ah, eds., J ohn Wiley & Sons, Inc., Nova York, 2010).
[00140] Em algumas modalidades, um ou mais dos genes expressos de forma recombinante aqui descritos são introduzidos em uma célula manipulada usando métodos padronizados conhecidos por aqueles ver- sados na técnica. Exemplos não limitantes incluem a transformação (por exemplo, transformação química, eletroporação, etc.), transdução, bombardeio de partículas, etc. Em algumas modalidades, um ou mais dos genes divulgados neste documento são integrados ao genoma da célula. Sequências de ácido nucleico e proteína
[00141] O gene e as sequências de aminoácidos de GapN são bem conhecidos daquele versado na técnica. Exemplos não limitantes de se- quências de gene e de proteína GapN incluem: Sequência de DNA de GAPN otimizada por códon de Bacillus cereus (SEQ ID NO:45):
ATGACAACATCAAATACCTACAAATTCTATCTAAACGGTGAATGGAGAGAATCTTCCTCT GGAGAAACTATTGAGATACCATCACCATACTTACATGAAGTGATCGGACAGGTTCAAGCA ATCACTAGAGGAGAGGTTGACGAAGCGATTGCTAGCGCTAAGGAAGCACAGAAATCTTGG GCTGAGGCATCTCTACAAGATAGAGCTAAGTACTTGTACAAATGGGCAGATGAATTGGTA AACATGCAAGACGAAATCGCCGATATCATCATGAAGGAAGTGGGCAAGGGTTACAAAGAC GCTAAAAAGGAGGTTGTTAGAACCGCCGATTTCATCAGATACACCATTGAAGAGGCACTC CATATGCACGGTGAATCCATGATGGGCGATTCATTTCCTGGTGGAACAAAATCTAAGCTA GCAATAATCCAAAGAGCGCCTCTGGGTEGTAGTCTTAGCCATCGCTCCATTCAATTACCCT GTAAACCTTTCTGCTGCAAAATTGGCACCAGCCTTAATTATGGGTAACGCTGTGATATTC AAGCCAGCAACTCAGGGTGCTATTTCCGGCATCAAAATGGTTGAAGCTTTGCATAAGGCT GGTTTGCCAAAGGGTTTGGTTAACGTTGCCACAGGTAGAGGTAGCGTCATAGGCGATTAT TTGGTCGAACACGAAGGGATAAACATGGTTTCCTTCACCGGTGGCACTAACACTGGTAAG CATTTAGCAAAAAAGGCCTCAATGATTCCATTAGTCTTGGAACTTGGTGGCAAAGATCCA GGCATCGTTCGTGAAGATGCAGACCTACAAGATGCTGCGAATCATATCGTATCTGGTECG TTCAGTTACTCAGGGCAGAGATGTACAGCCATTAAGAGAGTCCTTGTTCATGAAAATGTT GCTGATGAACTGGTATCATTGGTTAAGGAACAAGTGGCAAAGCTTTCTGTGGGATCACCA GAGCAAGATTCAACAATTGTTCCTCTGATTGACGATAAGTCCGCTGATTTTGTTCAGGGT TTAGTGGACGATGCAGTCGAAAAGGGCGCTACAATTGTCATTGGGAACAAGAGAGAACGT AACCTAATCTACCCAACATTGATTGATCACGTCACAGAGGAAATGAAAGTTGCCTGGGAG GAACCATTCGGTCCTATTCTTCCAATTATTAGAGTTAGTAGCGACGAGCAAGCTATTGAA ATTGCAAATAAGAGTGAGTTCGGATTACAAGCTTCTGTGTTTACCAAAGACATAAACAAG GCATTCGCAATCGCAAATAAGATTGAGACTGGTTCAGTGCAAATCAACGGTAGAACAGAG AGAGGACCAGATCACTTTCCTTTTATCGGGGTTAAGGGATCTGGGATGGGTGCCCAAGEC
ATCAGAAAGTCTTTGGAATCTATGACTAGAGAAAAAGTTACTGTCTTAAATCTCGTATGA Sequência da proteína GapN de Bacillus cereus (SEQ ID NO:42):
MTTSNTYKFYLNGEWRESSSGETIEIPSPYLHEVIGQVOAITRGEVDEAIASAKEAQKSW AEASLQODRAKYLYKWADELVNMODEIADIIMKEVGKGYKDAKKEVVRTADFIRYTIEEAL HMHGESMMGDSFPGGTKSKLAIIQRAPLGVVLAIAPFNYPVNLSAAKLAPALIMGNAVI KPATOGAISGIKMVEALHKAGL PKGLVNVATGRGSVIGDYLVEHEGINMVSFTGGTNTGK HLAKKASMIPLVLELGGKDPGIVREDADLQDAANHIVSGAFSYSGQRCTAIKRVLVHENV ADELVSLVKEQVAKLSVGSPEQDSTIVPLIDDKSADFVOGLVDDAVEKGATIVIGNKRER NLIYPTLIDHVTEEMKVAWEEPFGPILPIIRVSSDEQAIEIANKSEFGLOQASVFTKDINK AFAIANKIETGSVQINGRTERGPDHFPFIGVKGSGMGAQGIRKSLESMTREKVTVLNLV
[00142] O geneeas sequências de proteína da glicoamilase são bem conhecidos por aquele versado na técnica. Exemplos não limitantes de sequências de gene e proteína de glicoamilase incluem: Sequência de DNA otimizada por códon (gene GLA1) de Saccha- romycopsis fibuligera (SEQ ID NO: 46)
ATGATTAGATTAACCGTATTCCTCACTGCAGTTTTTGCAGCAGTCGCTTCCTGTGTTCCA GTTGAATTGGATAAGAGAAATACAGGCCATTTCCAAGCATATTCTGGTTACACCGTAGCT AGATCAAACTTTACTCAATGGATTCACGAGCAACCAGCCGTATCATGGTACTATTTGCTT CAGAATATAGACTATCCAGAAGGACAATTCAAGTCTGCCAAGCCAGGGGTCETTEGTEGCT TCCCCTTCTACATCCGAACCTGATTACTTCTACCAATGGACTAGAGATACTGCTATCACC TTCTTGTCACTTATCGCGGAAGTTGAGGATCATTCTTTTTCAAATACTACACTAGCCAAG GTGGTTGAATACTACATCTCTAATACTTACACATTACAAAGAGTTTCCAACCCATCTGGT AACTTCGACAGTCCAAATCACGACGGTTTGGGAGAACCAAAGTTTAATGTTGATGATACA GCTTATACTGCATCTTGGGGTAGACCACAAAATGATGGCCCAGCGTTGAGAGCATACGCA ATTTCAAGATACCTTAACGCAGTAGCAAAACACAACAACGGTAAGTTACTGCTCGCTGGA CAAAACGGTATTCCTTACTCTTCAGCTTCTGATATCTACTGGAAGATTATCAAGCCAGAT CTTCAACATGTGTCAACCCATTGGTCTACATCTGGTTTTGATTTGTGGGAAGAGAATCAG GGAACACATTTCTTTACTGCGTTGGTCCAGCTAAAAGCACTTAGTTACGGCATTCCTTTA AGTAAGACCTACAACGATCCTGGTTTCACTAGTTGGCTAGAAAAGCAAAAGGATGCTTTA AACTCTTATATCAACAGCTCTGGTTTCGTAAACTCTGGCAAAAAGCATATAGTGGAGAGC CCTCAACTATCTTCAAGAGGAGGGTTGGATAGCGCCACATACATTGCAGCCTTAATCACA CATGATATTGGCGACGACGACACTTACACACCTTTCAACGTTGACAACTCCTATGTCTTG AACTCACTGTATTACCTTCTAGTCGATAACAAAAACCGTTACAAAATCAATGGTAACTAC AAGGCCGGTGCTGCTGTTGGTAGATACCCAGAGGATGTTTACAACGGTGTTGGGACATCA GAAGGCAATCCATGGCAATTAGCTACAGCCTACGCCGGCCAAACATTTTACACACTGGCT TACAACTCATTGAAAAACAAAAAAAACTTAGTGATTGAAAAGTTGAACTACGACCTCTACÇ AATTCTTTCATAGCAGATTTATCCAAGATCGATAGTTCTTACGCATCAAAAGACTCCTTG ACTTTGACCTACGGTTCTGACAACTACAAAAACGTCATAAAGTCACTATTACAGTTTGGA GATTCATTCCTGAAGGTCTTGCTCGATCACATTGATGATAATGGACAATTAACAGAAGAG ATCAATAGATACACAGGGTTCCAGGCTGGTGCTGTTAGTTTGACATGGTCCTCTGGTTCA
TTACTTTCAGCAAACCGTGCGAGAAATAAGTTGATTGAACTATTGTAG Sequência de DNA de glicoamilase otimizada por códon (gene GLA1) de Saccharomycopsis fibuligera (SEQ ID NO: 47)
ATGATCAGACTTACAGTTTTCCTAACAGCCGTTTTCGCCGCCGTTGCATCATGTGTCCCA GTAGAATTGGATAAGAGAAACACCGGCCATTTCCAAGCATATTCAGGATACACCGTTGCA CGTTCTAATTTCACACAATGGATTCATGAGCAGCCTGCTGTGTCCTGGTACTACTTATTA CAAAACATTGATTATCCTGAGGGACAATTCAAGTCAGCGAAACCAGGCGTTGTGGTTGCT TCTCCATCCACTTCAGAACCAGACTACTTCTACCAGTGGACCCGTGACACAGCAATAACT TTCTTATCTTTGATAGCAGAAGTAGAAGATCACTCATTTTCAAATACAACTCTAGCTAAG GTTGTCGAATACTACATCTCTAACACATACACCCTACAAAGAGTTTCTAACCCATCTGGT AATTTCGATAGCCCAAATCACGATGGTCTGGGTGAACCAAAGTTCAACGTTGACGACACT GCTTACACTGCATCATGGGGCAGACCTCAAAACGACGGTCCAGCCTTAAGAGCTTACGCG ATCTCAAGATATTTGAACGCAGTTGCCAAGCATAACAACGGTAAGCTATTGCTCGCGGET CAAAATGGTATTCCTTACTCATCTGCATCAGATATCTACTGGAAGATTATCAAGCCAGAT TTACAACATGTAAGTACTCACTGGAGTACATCTGGTTTTGACTTATGGGAAGAGAATCAA GGTACACATTTCTTTACTGCACTTGTCCAGTTAAAAGCTCTTTCATACGGTATACCTTTG TCTAAGACATATAACGATCCAGGATTTACTTCTTGGTTGGAAAAGCAGAAGGATGCCTTG AACTCTTACATCAATTCCAGCGGCTTCGTCAACTCCGGGAAAAAGCACATTGTCGAATCT CCTCAATTATCTAGTAGAGGGGGTCTTGATAGCGCTACTTACATCGCTGCTCTAATTACA CATGATATTGGTGATGATGATACATACACTCCTTTTAACGTAGATAATTCTTATGTGCTG AACTCTTTATACTATCTGCTTGTAGACAACAAAAACAGATACAAGATCAACGGGAACTAC AAAGCAGGAGCTGCAGTTGGTAGATACCCAGAAGATGTGTACAATGGAGTGGGAACCTCA GAGGGAAACCCATGGCAATTGGCGACAGCATACGCCGGCCAAACCTTTTACACACTGGCT TACAATTCTCTCAAAAACAAAAAAAATTTGGTTATTGAGAAGTTGAATTACGATCTATACÇ AACTCCTTTATAGCTGACTTAAGTAAGATTGACTCCTCTTACGCTTCTAAGGATTCATTG ACATTGACCTACGGCTCAGATAACTACAAAAATGTCATTAAGTCACTTTTACAATTCGGG GATTCTTTCTTGAAAGTCTTGTTGGACCATATTGATGATAATGGTCAGCTAACAGAGGAA ATCAACAGATATACAGGTTTTCAAGCTGGCGCAGTTTCCCTCACTTGGAGTAGTGGTTCA CTCTTATCTGCAAACAGAGCCAGAAACAAGTTGATCGAATTGCTTTAG
[00143] Sequência de DNA de glicoamilase otimizada por códon (gene GLA1) de Saccharomycopsis fibuligera (SEQ ID NO: 48)
ATGATCAGACTTACTGTTTTCCTCACAGCCGTTTTTGCAGCAGTAGCTTCTTGTGTTCCA GTTGAATTGGATAAGAGAAATACAGGTCATTTCCAAGCTTACTCTGGTTACACTGTGGCT AGATCTAACTTCACACAATGGATTCATGAACAGCCTGCCGTGAGTTGGTACTATTTGCTA CAAAACATTGATTACCCTGAGGGTCAATTCAAATCAGCTAAGCCAGGTGTTGTTGTCECG AGCCCATCAACTTCTGAACCAGATTACTTCTACCAATGGACTAGAGATACCGCAATAAÇC TTCTTATCTCTAATCGCAGAGGTAGAAGATCACTCTTTTTCAAATACTACCCTGGCAAAA GTGGTCGAGTACTACATCTCAAACACATACACCTTGCAGAGAGTCTCAAACCCATCAGGA AACTTCGATTCTCCTAATCATGACGGCTTAGGAGAACCAAAGTTTAATGTTGACGATACC GCTTATACTGCATCTTGGGGTAGACCACAGAATGATGGCCCTGCCTTACGTGCATACGCC ATTTCCAGATATCTCAACGCTGTAGCGAAGCACAACAACGGTAAGCTGCTTTTAGCTGGT CAAAATGGGATACCATACTCTTCCGCTTCAGACATTTACTGGAAGATTATCAAACCAGACÇ TTGCAGCATGTCAGTACACATTGGTCAACTTCTGGTTTTGATTTGTGGGAAGAGAACCAA GGCACTCACTTCTTTACAGCCTTGGTTCAACTAAAGGCATTGTCTTACGGAATCCCTTTG TCCAAGACATACAATGATCCTGGATTCACTAGTTGGCTAGAAAAGCAAAAGGATGCACTG AACTCATACATTAACAGTTCAGGCTTTGTGAACTCCGGTAAAAAGCATATTGTTGAAAGC CCACAACTATCTAGCAGAGGTGGTTTAGATTCTGCAACCTACATAGCAGCCTTGATCACA CACGACATTGGGGATGACGATACATACACACCATTCAACGTCGACAATTCATACGTTTTG AATAGCTTATACTACCTACTGGTAGATAACAAAAACAGATATAAGATCAATGGCAACTAC AAGGCCGGTGCTGCCGTAGGAAGATACCCTGAAGATGTCTACAACGGAGTTGGTACATCA GAAGGTAACCCATGGCAATTAGCAACAGCATATGCGGGCCAGACATTTTACACTTTGGCT TACAATTCATTGAAAAACAAAAAAAATTTAGTGATAGAAAAGCTTAACTATGACCTTTACÇ AACTCTTTCATTGCCGATTTATCCAAGATTGATTCCTCCTACGCATCAAAGGACTCCTTG ACACTTACATACGGTTCTGACAACTACAAAAATGTTATCAAGTCTCTCTTGCAATTTGGT GATTCTTTCTTGAAGGTTTTACTCGATCATATCGATGATAATGGTCAACTAACTGAGGAA ATCAACAGATACACTGGGTTCCAAGCTGGAGCTGTCTCTTTAACATGGAGTTCAGGGAGT
TTGTTATCTGCTAACAGAGCGCGTAACAAACTTATTGAGCTTCTGTAG Sequência de DNA de glicoamilase otimizada por códon (gene GLA1) de Saccharomycopsis fibuligera (SEQ ID NO: 49)
ATGATTAGATTAACAGTATTTCTTACAGCCGTTTTCGCAGCCGTCGCATCCTGTGTTCCA GTAGAATTAGATAAGCGTAATACAGGACATTTTCAAGCTTACTCTGGCTATACAGTTGCG AGATCTAACTTTACACAATGGATTCACGAACAGCCAGCAGTTTCTTGGTACTATTTGCTC CAAAACATCGACTACCCTGAAGGCCAATTCAAGTCTGCAAAGCCAGGAGTGGTCGETCECT TCTCCTAGTACTTCAGAACCAGATTACTTCTACCAGTGGACAAGAGACACTGCTATTACC TTCCTGAGCTTAATCGCTGAAGTTGAAGATCACTCTTTTTCTAATACAACACTGGCCAAA GTAGTTGAGTACTACATCTCTAACACTTACACTCTACAAAGAGTGTCAAACCCTTCTGGG AACTTCGACAGCCCAAACCATGATGGTTTGGGGGAGCCAAAATTCAACGTTGATGATAÇA GCCTACACCGCATCTTGGGGTAGACCACAAAACGACGGACCAGCTTTAAGAGCATACGCA ATATCTCGTTACCTTAATGCTGTTGCAAAGCACAATAATGGAAAGTTGTTGTTGGCTGGT CAAAACGGTATTCCTTACTCTTCAGCATCTGATATCTACTGGAAGATTATCAAGCCAGAT CTTCAACACGTATCCACACATTGGTCAACCTCCGGCTTCGATTTATGGGAGGAAAATCAG GGTACACATTTCTTCACCGCTCTAGTGCAATTGAAGGCTTTGAGTTACGGCATTCCATTG TCTAAGACTTACAACGATCCTGGTTTCACCTCATGGCTTGAAAAGCAGAAGGATGCCCTG AATAGCTACATCAACTCATCTGGTTTTGTTAACTCAGGGAAAAAGCATATAGTTGAATCC CCACAACTATCATCAAGAGGAGGTTTAGACTCCGCCACATACATTGCTGCCTTGATTACA CATGATATTGGGGATGATGACACATATACTCCATTTAACGTCGATAACAGTTATGTCCTT AATTCCTTATACTATTTGTTGGTCGATAACAAAAATAGATACAAAATCAACGGCAACTAC AAGGCTGGCGCAGCGGTGGGTAGATACCCTGAGGATGTTTACAATGGTGTAGGTACATCT GAAGGCAATCCATGGCAATTAGCGACTGCTTACGCTGGACAAACTTTCTACACACTTGCG TACAACTCATTGAAAAACAAAAAAAACCTAGTCATTGAAAAGTTGAATTACGATCTGTACÇ AACTCTTTCATCGCAGACCTATCAAAGATTGACTCATCTTATGCAAGTAAAGATTCACTA ACTTTAACCTACGGTAGTGATAACTACAAAAACGTTATCAAGTCTTTACTCCAGTTTGGT GATTCATTCTTGAAGGTGTTGTTAGATCATATAGACGACAATGGTCAACTCACAGAGGAG ATAAACAGATACACTGGTTTTCAAGCAGGAGCTGTTTCACTTACTTGGTCAAGTGGTTCT TTGCTTTCCGCCAACAGAGCCAGAAACAAGCTCATCGAATTACTATAG
Sequência da proteína glicoamilase (proteína GLA1l) de Saccha- romycopsis fibuligera (SEQ ID NO: 38)
MIRLTVFLTAVFAAVASCVPVELDKRNTGHFOAYSGYTVARSNFTQOWIHEQPAVSWYYLL QNIDYPEGQFKSAKPGVVVASPSTSEPDYFYQWTRDTAITFLSLIAEVEDHSFSNTTLAK VVEYYISNTYTLORVSNPSGNFDSPNHDGLGEPKFNVDDTAYTASWGRPONDGPALRAYA ISRYLNAVAKHNNGKLLLAGONGIPYSSASDIYWKIIKPDLOHVSTHWSTSGFDLWEENQ GTHFFTALVOLKALSYGIPLSKTYNDPGFTSWLEKQKDALNSY INSSGFVNSGKKHIVES POLSSRGGLDSATYIAALITHDIGDDDTYTPFNVDNSYVLNSLYYLLVDNKNRYKINGNY KAGAAVGRY PEDVYNGVGTSEGNPWOLATAYAGOTFYTLAYNSLKNKKNLVIEKLNYDLY NSFIADLSKIDSSYASKDSLTLTYGSDNYKNVIKSLLOQFGDSFLKVLLDHIDDNGOLTEE
INRYTGFOAGAVSLTWSSGSLLSANRARNKLIELL Sequência de DNA de glicoamilase otimizada por códon (gene amyA) de Rhizopus orzyae (SEQ ID NO: 50)
ATGAAGTTCATTTCCACTTTCTTGACCTTCATTTTGGCTGCTGTCTCTGTCACCGCTGCA TCTATTCCATCTAGTGCATCTGTACAATTGGACTCCTACAATTACGATGGTTCCACATTT TCCGGCAAGATTTATGTCAAAAACATCGCTTACTCTAAAAAGGTTACTGTTGTGTACGCA GACGGTTCTGACAACTGGAACAATAACGGCAACACTATTGCTGCATCATTTTCAGGCCCA ATCTCTGGATCAAATTACGAATACTGGACATTCTCAGCATCAGTGAAGGGCATAAAGGAG TTCTACATCAAATACGAAGTTTCAGGTAAGACATATTACGACAATAACAACTCTGCAAAC TACCAAGTCTCAACTTCTAAACCTACTACAACTACTGCAGCTACAACCACAACTACAGCT CCATCAACTTCTACAACAACCCGTCCATCTAGTTCAGAGCCTGCCACCTTCCCTACTGGT AATTCTACCATCAGCTCTTGGATCAAAAAGCAGGAAGATATTTCCAGATTCGCTATGCTT AGAAACATCAACCCACCTGGTTCTGCCACAGGGTTTATCGCCGCATCACTCTCTACCGCT GGTCCAGATTACTACTACGCGTGGACAAGAGATGCCGCTTTGACATCTAACGTTATCGTT TACGAATACAACACCACATTGTCTGGGAATAAGACAATTCTAAACGTACTTAAGGATTACÇ GTCACATTCAGTGTTAAGACACAGTCTACTTCAACAGTTTGTAATTGCCTTGGTGAACCA AAGTTCAATCCAGACGGCAGTGGTTACACAGGTGCTTGGGGTAGACCTCAAAATGATGGT CCTGCAGAAAGAGCGACTACATTTGTTCTGTTTGCCGACAGCTACTTGACTCAAACTAAG GATGCCTCATACGTCACTGGTACATTAAAGCCAGCAATTTTCAAAGATCTCGATTACGTT GTTAACGTCTGGAGTAACGGATGTTTCGATTTATGGGAGGAGGTGAACGGAGTTCATTTC TACACCCTTATGGTTATGAGAAAAGGGCTATTGTTGGGGGCTGATTTCGCGAAGAGAAACÇ GGTGACTCAACTAGAGCCTCAACTTACTCTTCTACTGCTTCCACAATTGCTAACAAGATA TCAAGTTTCTGGGTTAGCTCAAACAACTGGGTGCAAGTATCCCAATCTGTCACAGGAGGT GTAAGTAAAAAGGGGTTAGACGTTAGCACCCTGTTAGCTGCGAATCTAGGATCAGTCGAT GATGGATTTTTCACTCCAGGTTCTGAAAAGATATTAGCTACAGCTGTGGCAGTCGAAGAT TCCTTTGCCAGTCTATACCCAATCAACAAAAACCTTCCATCATACTTGGGGAACGCTATT GGAAGATACCCTGAAGATACATACAACGGTAATGGTAACTCACAAGGCAATCCTTGGTTT CTGGCGGTTACCGGCTACGCAGAGTTGTACTATAGAGCAATTAAGGAATGGATTTCTAAT GGAGGCGTTACAGTGTCCTCTATCTCATTGCCATTTTTCAAAAAGTTCGATAGCTCTGCA ACATCCGGTAAAAAGTACACCGTAGGTACTTCTGACTTCAACAATTTAGCACAAAACATT GCTCTTGCTGCAGATCGTTTCCTATCTACTGTACAACTCCATGCACCAAACAATGGTTCA TTAGCAGAGGAATTTGATAGAACAACAGGTTTTTCTACCGGCGCTAGAGATTTAACATGG
TCCCACGCCTCATTGATAACAGCATCCTATGCCAAAGCCGGTGCTCCAGCTGCATAA Sequência de DNA de glicoamilase otimizada por códon (gene amyA) de Rhizopus orzyae (SEQ ID NO: 51)
ATGAAGTTTATCTCCACGTTTTTAACCTTTATCCTAGCAGCTGTCAGCGTCACCGCCGCA TCAATTCCGAGTTCAGCATCTGTACAACTTGACTCTTACAATTACGATGGCAGCACTTTC TCAGGGAAAATTTATGTGAAAAACATAGCATATAGTAAGAAGGTTACCGTGGTATATGCA GACGGTTCTGATAATTGGAATAATAATGGAAACACTATTGCCGCCAGTTTTTCCGGCCCA ATTTCTGGTTCCAATTACGAGTATTGGACCTTTTCTGCATCAGTAAAAGGCATCAAGGAA TTCTATATTAAGTACGAAGTTTCAGGTAAGACATATTACGATAACAATAACTCAGCAAAT TATCAAGTCTCTACATCTAAGCCCACAACAACAACTGCTGCTACCACCACTACAACCGCT CCTTCTACCAGCACCACTACCAGACCAAGCTCTAGTGAACCGGCTACCTTTCCTACCGGA AACAGTACCATCTCAAGCTGGATCAAAAAGCAAGAGGACATAAGTCGTTTTGCTATGTTG AGGAACATTAATCCTCCAGGATCCGCGACCGGTTTCATTGCAGCATCACTAAGTACTGCC GGGCCTGATTATTATTATGCTTGGACTAGAGACGCTGCATTAACATCAAACGTGATTGTT TATGAATATAATACGACCCTTTCCGGTAATAAAACGATCTTGAACGTATTAAAAGACTAT GTGACCTTTAGTGTGAAGACCCAATCTACATCTACAGTGTGTAATTGTTTGGGAGAACCT AAATTCAATCCAGACGGTTCTGGGTACACTGGTGCCTGGGETAGACCTCAAAACGACGGT CCAGCAGAAAGAGCAACAACCTTTGTTCTATTTGCTGACTCTTATTTAACGCAAACAAAG GACGCCTCATATGTTACAGGGACCCTAAAACCAGCAATTTTCAAAGACTTGGATTATGTT GTTAATGTTTGGAGCAACGGATGTTTTGACTTGTGGGAGGAGGTTAACGGTGTACACTTT TATACATTGATGGTGATGAGAAAAGGGTTGCTATTGGGAGCAGATTTCGCTAAAAGAAAT GGTGATTCTACAAGAGCGAGCACATATAGTAGCACCGCTTCAACAATCGCCAATAAAATC TCATCTTTCTGGGTATCTAGCAACAACTGGGTACAAGTTTCCCAAAGTGTTACCGGCEGT GTGTCCAAAAAGGGTTTAGACGTTAGCACACTTCTAGCTGCTAATTTGGGTAGCGTTGAT GACGGGTTTTTTACTCCAGGTAGTGAGAAGATACTGGCAACCGCGGTGEGCGETTEGAAGACÇ AGCTTTGCTTCATTGTATCCTATAAATAAAAATCTGCCCTCTTATCTGGGTAATGCAATT GGCAGATACCCAGAAGATACCTACAATGGTAATGGTAATTCCCAGGGGAACCCATGGTTT TTGGCTGTTACAGGCTACGCAGAACTTTATTACCGTGCAATCAAGGAATGGATTTCAAAT GGCGGCGTCACTGTCAGTAGTATAAGTTTGCCCTTTTTTAAGAAATTTGATTCCTCAGCA ACGTCTGGTAAAAAATACACCGTAGGTACTAGTGATTTCAATAATTTGGCCCAAAATATT GCGCTTGCTGCTGACAGGTTTCTTAGTACCGTTCAGTTGCACGCTCCAAATAATGGCTCA TTGGCTGAAGAATTTGATCGTACGACAGGTTTCTCCACTGGTGCTAGGGATTTGACTTGG
AGTCATGCCTCCTTAATCACAGCAAGCTATGCTAAAGCTGGTGCACCTGCTGCTTAG Sequência de proteína glicoamilase (gene amyA) de Rhizopus orzyae (SEQ ID NO: 39)
MKFISTFLTFILAAVSVTAASIPSSASVQLDSYNYDGSTFSGKIYVKNIAYSKKVTVVYA DGSDNWNNNGNTIAASFSGPISGSNYEYWTFSASVKGIKEFYIKYEVSGKTYYDNNNSAN YQVSTSKPTTTTAATTTTTAPSTSTTTRPSSSEPATFPTGNSTISSWIKKQEDISRFAML RNINPPGSATGFIAASLSTAGPDYYYAWTRDAALTSNVIVYEYNTTLSGNKTILNVLKDY VTFSVKTOSTSTVCNCLGEPKFNPDGSGYTGAWGRPONDGPAERATTFVLFADSYLTOTK DASYVTGTLKPAIFKDLDYVVNVWSNGCFDLWEEVNGVHFYTLMVMRKGLLLGADFAKRN GDSTRASTYSSTASTIANKISSFWVSSNNWVQVSQOSVTGGVSKKGLDVSTLLAANLGSVD DGFFTPGSEKILATAVAVEDSFASLYPINKNLPSYLGNAIGRYPEDTYNGNGNSQGNPWF LAVTGYAELYYRAIKEWISNGGVTVSSISLPFFKKFDSSATSGKKYTVGTSDFNNLAQNI
ALAADRFLSTVOLHAPNNGSLAEEFDRTTGFSTGARDLTWSHASLITASYAKAGAPAA Sequência de gene de glicoamilase otimizada por códon (proteína amyA) de Rhizopus delemar (SEQ ID NO: 52)
ATGCAGCTGTTCAACTTGCCATTAAAGGTTTCATTCTTTTTGGTCCTATCATACTTTAGT TTGTTGGTGTCAGCCGCATCTATTCCATCTTCAGCATCTGTACAATTAGACTCCTACAAT TACGACGGCTCTACATTCAGCGGAAAGATTTACGTGAAAAATATTGCGTACAGCAAAAAA GTAACTGTTATCTATGCCGACGGATCAGATAACTGGAACAACAATGGAAACACTATCGCT GCCAGTTACTCTGCACCAATTTCAGGTTCTAACTACGAATATTGGACATTCTCAGCCTCC ATCAATGGCATTAAGGAATTCTACATAAAGTACGAAGTTTCCGGTAAGACTTACTACGAT AACAACAATTCTGCAAACTATCAAGTATCAACATCAAAACCTACTACCACCACCGCCACA GCTACAACTACAACTGCACCTTCAACATCTACCACAACCCCACCATCTTCTAGCGAACCA GCTACATTCCCAACTGGCAATTCTACTATTTCTAGTTGGATCAAAAAACAAGAGGGTATT TCCAGATTCGCAATGTTGAGAAACATAAATCCACCAGGATCAGCAACTGGATTCATCGCA GCTTCTTTGTCCACAGCGGGGCCAGATTACTACTACGCATGGACCAGAGATGCTGCTTTG ACAAGTAACGTTATTGTTTACGAATACAATACCACTTTGTCCGGTAACAAGACTATTCTT AACGTCCTAAAGGATTACGTTACATTCTCTGTTAAGACTCAGTCTACATCCACAGTCTGC AATTGTTTGGGTGAACCAAAGTTCAACCCAGATGGCTCTGGATACACAGGTGCCTGGGÇGT CGTCCACAAAACGATGGGCCTGCCGAGAGAGCCACTACATTTATCCTATTTGCTGACTCA TACCTTACACAAACAAAAGATGCATCCTACGTGACTGGAACATTAAAGCCTGCAATCTTC AAAGACCTGGATTACGTTGTCAACGTGTGGTCTAACGGCTGTTTCGATCTATGGGAAGAG GTTAACGGCGTGCACTTCTACACTCTAATGGTCATGAGAAAGGGTCTGTTGTTAGGTGCA GATTTTGCTAAGAGAAACGGTGATTCTACACGTGCTTCTACCTACTCCTCAACAGCATCA ACTATTGCGAACAAGATTTCTTCATTTTGGGTTTCAAGTAATAACTGGATACAAGTATCT CAAAGCGTTACAGGGGGTGTCTCAAAAAAGGGTCTTGATGTTTCTACATTACTGGCTGCT AATCTTGGGTCTGTTGATGACGGTTTCTTCACCCCTGGTTCTGAAAAGATCCTCGCTACC GCCGTCGCEGTTGAGGATAGTTTTGCTTCACTCTATCCTATAAACAAAAACCTTCCTTCA TACTTAGGAAACAGTATCGGTAGATACCCAGAGGATACATACAATGGTAATGGCAATTCA CAGGGAAATCCATGGTTCCTTGCTGTTACAGGGTACGCAGAACTTTACTATAGAGCTATT AAGGAATGGATCGGCAACGGCGGTGTGACAGTTTCCTCAATCTCATTGCCATTTTTCAAA AAGTTTGACTCCAGCGCGACATCTGGTAAAAAGTATACTGTGGGGACTTCTGATTTCAAC AATTTGGCTCAAAACATTGCCTTAGCTGCCGACAGATTCTTATCTACCGTACAACTCCAT GCACATAACAATGGTAGTTTGGCAGAGGAATTTGATAGAACTACAGGACTCTCTACAGGT GCGAGAGATTTAACTTGGTCACATGCAAGTTTAATTACAGCCTCTTACGCAAAGGCTGGT
GCTCCTGCTGCATAA Sequência de gene de glicoamilase otimizada por códon (proteína amyA) de Rhizopus delemar (SEQ ID NO: 53)
ATGCAGTTATTCAACTTACCACTTAAGGTATCTTTCTTTCTAGTCTTATCTTACTTTTCA TTGTTAGTATCAGCTGCCTCTATACCAAGTTCAGCATCCGTACAACTAGATTCATACAAT TACGACGGTTCAACATTCTCAGGAAAGATATACGTGAAAAATATTGCTTACAGCAAAAAG GTTACTGTGATTTACGCAGATGGGTCAGACAACTGGAATAACAATGGAAACACAATTGCT GCTTCCTATTCTGCCCCTATTTCTGGATCTAACTACGAATACTGGACTTTTTCAGCGAGT ATAAACGGAATTAAGGAATTCTATATCAAATATGAAGTCTCTGGTAAGACCTACTACGAT AACAACAACTCCGCAAACTACCAAGTTAGCACATCAAAGCCAACCACAACAACTGCTACT GCGACAACTACAACCGCACCAAGCACTTCTACTACAACACCTCCTAGTTCATCTGAGCCA GCAACTTTCCCAACTGGTAATTCCACTATTTCTTCTTGGATCAAAAAACAAGAGGGTATC TCAAGATTCGCCATGCTTAGAAATATCAATCCTCCAGGCTCTGCAACAGGATTCATTGCA GCATCTTTATCAACTGCGGGGCCAGACTACTACTACGCCTGGACTAGAGATGCAGCTTTG ACATCAAATGTGATTGTTTATGAATACAACACAACTTTGTCCGGTAACAAGACAATCTTG AACGTCTTGAAGGATTATGTGACATTCTCTGTCAAGACTCAATCTACATCAACAGTTTGT AACTGTCTCGGCGAACCAAAGTTCAACCCTGATGGTAGTGGTTACACTGGTGCTTGGGÇT AGACCACAAAACGATGGTCCAGCAGAGAGAGCTACAACTTTCATCTTGTTTGCTGACTCT TACCTAACACAAACCAAGGATGCAAGCTACGTTACTGGAACACTAAAGCCTGCAATCTTT AAAGACCTGGACTATGTTGTAAACGTTTGGTCAAATGGCTGCTTCGATCTATGGGAGGAA GTGAACGGTGTTCACTTCTACACATTAATGGTCATGAGAAAGGGACTCTTGCTTGGTGCA GACTTTGCTAAGAGAAACGGTGATTCTACACGTGCCTCCACTTACTCCTCCACAGCTTCA ACCATTGCCAACAAAATCTCTTCTTTCTGGGTCAGCTCAAATAACTGGATTCAAGTTTCT CAATCAGTTACTGGTGGTGTTTCTAAAAAGGGCCTGGATGTGTCAACCTTGCTTGCTGCC AATTTGGGCAGTGTTGATGACGGGTTCTTCACCCCAGGTTCTGAAAAGATCCTCGCCACC GCAGTTGCCGTTGAAGATTCATTTGCTAGTTTATACCCAATCAACAAAAATCTACCATCA TACCTTGGAAATTCAATCGGTAGATATCCAGAGGATACATACAACGGTAATGGAAACTCT CAGGGTAACCCTTGGTTTCTTGCAGTTACAGGGTACGCTGAACTGTACTACAGAGCGATT AAGGAATGGATTGGTAATGGCGGCGTAACTGTTAGTTCTATTTCTCTACCTTTCTTCAAA AAGTTCGATAGTTCTGCAACATCTGGTAAAAAGTACACAGTCGGCACTTCCGATTTTAAC AATTTAGCTCAGAACATAGCACTGGCAGCTGATCGTTTCTTGAGTACAGTCCAATTGCAT GCCCATAACAACGGTAGTTTGGCTGAAGAGTTTGATAGAACCACCGGTTTATCAACCGGC GCCAGAGATTTAACATGGTCCCATGCGTCTTTGATAACTGCTTCTTACGCCAAGGCTEGGE GCACCAGCTGCCTGA
[00144] Sequência de proteína glicoamilase (proteína amyA) de Rhi- zopus delemar (SEQ ID NO: 40)
MOLFNLPLKVSFFLVLSYFSLLVSAASIPSSASVOQLDSYNYDGSTFSGKIYVKNIAYSKK VTVIYADGSDNWNNNGNTIAASYSAPISGSNYEYWTIFSASINGIKEFYIKYEVSGKTYYD NNNSANYQVSTSKPTTTTATATTTTAPSTSTTTPPSSSEPATFPTGNSTISSWIKKQEGI SRFAMLRNINPPGSATGFIAASLSTAGPDYYYAWTRDAALTSNVIVYEYNTTLSGNKTIL NVLKDYVTFSVKTOSTSTVCNCLGEPKFNPDGSGYTGAWGRPONDGPAERATTFILFADS YLTOTKDSYVTGTLKPAIFKDLDYVVNVWSNGCFDLWEEVNGVHFYTLMVMRKGLLLGA DFAKRNGDSTRASTYSSTASTIANKISSFWVSSNNWIQVSQOSVTGGVSKKGLDVSTLLAA NLGSVDDGFFTPGSEKILATAVAVEDSFASLYPINKNLPSYLGNSIGRYPEDTYNGNGNS QGNPWFLAVTGYAELYYRAIKEWIGNGGVTVSSISLPFFKKFDSSATSGKKYTVGTSDFN NLAQNIALAADRFLSTVOLHAHNNGSLAEEFDRTTGLSTGARDLTWSHASLITASYAKAG
APAA Sequência de gene de glicoamilase otimizada por códon (proteína amyA) de Rhizopus microsporus (SEQ ID NO: 54)
ATGAAACTTATGAATCCATCTATGAAGGCATACGTTTTCTTTATCTTAAGCTACTTCTCT TTACTCGTTAGCTCAGCTGCGGTGCCAACCTCTGCCGCCGTACAAGTTGAGTCATACAAT TATGACGGTACCACTTTTTCAGGTAGAATATTCGTCAAAAACATTGCCTACTCAAAGGTC GTAACAGTTATCTACTCCGATGGATCAGATAACTGGAACAATAACAACAACABAGTTTCT GCAGCTTACTCAGAAGCAATTTCTGGGTCTAACTACGAATACTGGACATTCTCCGCAAAG TTATCCGGAATTAAACAGTTTTATGTCAAATACGAAGTTTCTGGTTCAACATATTACGAC AACAACGGTACCAAAAACTACCAAGTCCAAGCAACCTCAGCGACATCTACAACAGCTACÇT GCAACCACAACTACAGCTACTGGCACAACAACTACTTCTACAGGTCCAACTAGTACTGCA TCCGTATCATTCCCTACCGGTAACTCAACAATTTCTTCCTGGATAAAAAATCAAGAGGAA ATCAGCCGTTTTGCTATGTTGAGAAATATCAATCCACCTGGGTCTGCCACAGGGTTCATA GCCGCATCTCTGTCCACAGCCGGCCCAGATTACTATTACTCTTGGACTAGAGATTCAGCA CTAACAGCTAATGTGATCGCTTACGAATACAACACAACATTCACTGGAAACACCACCCTT CTTAAGTACTTGAAAGATTACGTTACATTTTCTGTCAAAAGCCAATCTGTATCTACCGTT TGTAACTGTCTGGGAGAACCAAAGTTCAACGCTGATGGTAGTTCTTTTACAGGTCCATGG GGCAGACCACAAAACGACGGACCAGCAGAGAGAGCTGTTACTTTTATGTTGATTGCTGAC AGCTACTTGACTCAAACTAAGGACGCATCCTACGTTACCGGTACATTAAAGCCAGCAATC TTCAAAGATCTTGATTACGTAGTTTCTGTTTGGTCTAACGGTTGCTACGATTTATGGGAA GAGGTTAATGGTGTTCATTTCTATACTCTCATGGTCATGAGAAAGGGTTTGATCTTAGGT GCCGACTTCGCTGCTAGAAATGGTGACTCTAGTAGAGCTTCAACCTACAAGCAAACTGCA TCAACAATGGAATCAAAGATCAGTTCTTTTTGGTCAGATTCTAACAACTACGTCCAAGTT TCTCAATCAGTTACCGCCGGAGTGTCAAAAAAGGGACTAGATGTTAGTACACTATTGGCG GCCAACATTGGTAGTCTGCCTGATGGCTTTTTCACTCCAGGCTCCGAAAAGATATTGGCT ACAGCAGTGGCGTTAGAAAATGCATTCGCATCCTTGTACCCAATTAACTCTAACCTACCT TCTTACTTGGGTAACTCAATTGGAAGATATCCTGAGGATACATACAACGGTAATGGCAAC TCTCAGGGGAATCCATGGTTCCTTGCCGTCAACGCATACGCAGAACTTTACTACAGAGCT ATTAAGGAATGGATTAGTAATGGCAAGGTGACAGTATCCAATATCTCACTACCTTTCTTC AAAAAGTTTGATTCTTCCGCCACTTCTGGAAAGACATACACTGCTGGTACATCAGATTTC AATAACTTGGCTCAGAACATTGCTTTAGGCGCCGATAGATTCCTGTCTACTGTTAAGTTC CACGCATACACTAACGGGAGTCTATCAGAAGAGTACGATAGATCTACCGGTATGAGTACT GGGGCTCGTGATTTAACATGGTCCCATGCTTCATTGATCACAGTGGCGTACGCAAAGGCC
GGTAGTCCTGCAGCTTAG Sequência de proteína glicoamilase (proteína amyA) de Rhizopus mi- crosporus (SEQ ID NO: 41)
MKLMNPSMKAYVFFILSYFSLLVSSAAVPTSAAVQVESYNYDGTTFSGRIFVKNIAYSKV VTVIYSDGSDNWNNNNNKVSAAYSEAISGSNYEYWTFSAKLSGIKQFYVKYEVSGSTYYD NNGTKNYQVOATSATSTTATATTTTATGTTTTSTGPTSTASVSFPTGNSTISSWIKNQEE ISRFAMLRNINPPGSATGFIAASLSTAGPDYYYSWTRDSALTANVIAYEYNTTFTGNTTL LKYLKDYVTFSVKSQSVSTVCNCLGEPKFNADGSSFTGPWGRPONDGPAERAVTFMLIAD SYLTOTKDASYVTGTLKPAIFKDLDYVVSVWSNGCYDLWEEVNGVHFYTLMVMRKGLILG ADFAARNGDSSRASTYKQTASTMESKISSFWSDSNNYVQOVSQSVTAGVSKKGLDVSTLLA ANIGSLPDGFFTPGSEKILATAVALENAFASLYPINSNLPSYLGNSIGRYPEDTYNGNGN SQOGNPWFLAVNAYAELYYRAIKEWISNGKVTVSNISLPFFKKFDSSATSGKTYTAGTSDF NNLAQNIALGADRFLSTVKFHAYTNGSLSEEYDRSTGMSTGARDLTWSHASLITVAYAKA GSPAA
[00145] As sequências de proteína e do gene de trealose-6-fosfato sintase são bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Exemplos não limitantes de sequências de proteína e do gene de trealose-6-fos- fato sintase incluem: Sequência do geneTPS1 de Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 55)
ATGACTACGGATAACGCTAAGGCGCAACTGACCTCGTCTTCAGGGGGTAACATTATTGTG GTGTCCAACAGGCTTCCCGTGACAATCACTAAAAACAGCAGTACGGGACAGTACGAGTACÇ GCAATGTCGTCCGGAGGGCTEGGTCACGGCGTTGGAAGGGTTGAAGAAGACGTACACTTTC AAGTGGTTCGGATGGCCTGGGCTAGAGATTCCTGACGATGAGAAGGATCAGGTGAGGAAG GACTTGCTGGAAAAGTTTAATGCCGTACCCATCTTCCTGAGCGATGAAATCGCAGACTTA CACTACAACGGGTTCAGTAATTCTATTCTATGGCCGTTATTCCATTACCATCCTGGTGAG ATCAATTTCGACGAGAATGCGTGGTTGGCATACAACGAGGCAAACCAGACGTTCACCAAC GAGATTGCTAAGACTATGAACCATAACGATTTAATCTGGGTGCATGATTACCATTTGATG TTGGTTCCGGAAATGTTGAGAGTCAAGATTCACGAGAAGCAACTGCAAAACGTTAAGGTC GGGTGGTTCCTGCACACACCATTCCCTTCGAGTGAAATTTACAGAATCTTACCTGTCAGA CAAGAGATTTTGAAGGGTGTTTTGAGTTGTGATTTAGTCGGGTTCCACACATACGATTAT GCAAGACATTTCTTGTCTTCCGTGCAAAGAGTGCTTAACGTGAACACATTGCCTAATGGG GTGGAATACCAGGGCAGATTCGTTAACGTAGGGGCCTTCCCTATCGGTATCGACGTGGACÇ AAGTTCACCGATGGGTTGAAAAAGGAATCCGTACAAAAGAGAATCCAACAATTGAAGGAA ACTTTCAAGGGCTGCAAGATCATAGTTGGTGTCGACAGGCTGGATTACATCAAAGGTGTG CCTCAGAAGTTGCACGCCATGGAAGTGTTTCTGAACGAGCATCCAGAATGGAGGGGCAAG GTTGTTCTGGTACAGGTTGCAGTGCCAAGTCGTGGAGATGTGGAAGAGTACCAATATTTA AGATCTGTGGTCAATGAGTTGGTCGGTAGAATCAACGGTCAGTTCGGTACTGTGGAATTC GTCCCCATCCATTTCATGCACAAGTCTATACCATTTGAAGAGCTGATTTCGTTATATGCT GTGAGCGATGTCTGTTTGGTCTCGTCCACCCGTGATGGTATGAACTTGGTTTCCTACGAA TATATTGCTTGCCAAGAAGAAAAGAAAGGTTCCTTAATCCTGAGTGAGTTCACAGGTGCC GCACAATCCTTGAATGGTGCTATTATTGTAAATCCTTGGAACACCGATGATCTTTCTGAT GCCATCAACGAGGCCTTGACTTTGCCCGATGTAAAGAAAGAAGTTAACTGGGAAAAACTT TACAAATACATCTCTAAATACACTTCTGCCTTCTGGGGTGAAAATTTCGTCCATGAATTA
TACAGTACATCATCAAGCTCAACAAGCTCCTCTGCCACCAAAAACTGA Sequência da proteína TPS1 de Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 43)
MTTDNAKAQLTSSSGGNIIVVSNRLPVTITKNSSTGQYEYAMSSGGLVTALEGLKKTYTF KWFGWPGLEIPDDEKDOQVRKDLLEKFNAVPIFLSDEIADLHYNGFSNSILWPLFHYHPGE INFDENAWLAYNEANQTFTNEIAKTMNHNDLIWVHDYHLMLVPEMLRVKIHEKQLONVKV GWFLHTPFPSSEIYRILPVROQEILKGVLSCDLVGFHTYDYARHFLSSVORVLNVNTLPNG VEYQOGRFVNVGAFPIGIDVDKFTDGLKKESVOKRIQQLKETFKGCKIIVGVDRLDYIKGV POKLHAMEVFLNEHPEWRGKVVLVQVAVPSRGDVEEYQYLRSVVNELVGRINGQOFGTVEF VPIHFMHKSIPFEELISLYAVSDVCLVSSTRDGMNLVSYEYIACQEEKKGSLILSEFTGA AQSLNGAIIVNPWNTDDLSDAINEALTLPDVKKEVNWEKLYKYISKYTSAFWGENFVHEL YSTSSSSTSSSATKN
[00146] As sequências de proteína e do gene de trealose-6-fosfato fosfatase são bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Exem- plos não limitantes de sequências de proteína e do gene de trealose-6- fosfato fosfatase incluem: Sequência do gene TPS2 de Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 56)
ATGACCACCACTGCCCAAGACAATTCTCCAAAGAAGAGACAGCGTATCATCAATTGTGTC ACGCAGCTGCCCTACAAAATCCAATTGGGAGAAAGCAACGATGACTGGAAAATATCTGCT ACTACAGGTAACAGCGCATTATATTCCTCTCTAGAATACCTTCAATTTGATTCTACCGAG TACGAGCAACACGTTGTTGGTTGGACCGGCGAAATAACAAGAACCGAACGCAACCTGTTT ACTAGAGAAGCGAAAGAGAAACCACAGGATCTGGACGATGACCCACTATATTTAACAAAA GAGCAGATCAATGGGTTGACTACTACTCTACAAGATCATATGAAATCTGATAAAGAGGCA AAGACCGATACTACTCAAACAGCTCCCGTTACCAATAACGTTCATCCCGTTTGGCTACTT AGAAAAAACCAGAGTAGATGGAGAAATTACGCGGAAAAAGTAATTTGGCCAACCTTCCAC TACATCTTGAATCCTTCAAATGAAGGTGAGCAAGAAAAAAACTGGTGGTACGACTACGTC AAGTTTAACGAAGCTTATGCACAAAAAATCGGGGAAGTTTACAGGAAGGGTGACATCATC TGGATCCATGACTACTACCTACTGCTATTGCCTCAACTACTGAGAATGAAATTTAACGAC GAATCTATCATTATTGGTTATTTCCATCATGCCCCATGGCCTAGTAATGAATATTTTCGC TGTTTGCCACGTAGAAAACAAATCTTAGATGGTCTTGTTGGGGCCAATAGAATTTGTTTC CAAAATGAATCTTTCTCCCGTCATTTTGTATCGAGTTGTAAAAGATTACTCGACGCAACC GCCAAGAAATCTAAAAACTCTTCCGATAGTGATCAATATCAAGTGTCTGTGTACGGTEGT GACGTACTCGTAGATTCTTTGCCTATAGGTGTTAACACAACTCAAATACTGAAAGATGCT TTCACGAAGGATATAGATTCCAAGGTTCTTTCCATCAAGCAAGCTTATCAAAACAAAAAA ATTATTATTGGTAGAGATCGTCTGGATTCCGTCAGAGGCGTCGTTCAAAAATTAAGAGCT TTTGAAACTTTCTTGGCCATGTATCCAGAATGGCGAGATCAAGTGGTATTGATCCAGGTC AGCAGTCCTACTGCTAACAGAAATTCCCCCCAAACTATCAGATTGGAACAACAAGTCAAC GAGTTGGTTAATTCCATAAATTCTGAATATGGTAATTTGAATTTTTCTCCCGTCCAGCAT TATTATATGAGAATCCCTAAAGATGTATACTTGTCCTTACTAAGAGTTGCAGACTTATGT TTAATCACAAGTGTTAGAGACGGTATGAATACCACTGCTTTGGAATACGTCACTGTGAAA TCTCACATGTCGAACTTTTTATGCTACGGAAATCCATTGATTTTAAGTGAGTTTTCTGGC TCTAGTAACGTATTGAAAGATGCCATTGTCGTTAACCCATGGGATTCGGTGGCCETEGC TAAATCTATTAACATGGCTTTGAAATTGGACAAGGAAGAAAAGTCCAATTTAGAATCAAAA TTATGGAAAGAAGTTCCTACAATTCAAGATTGGACTAATAAGTTTTTGAGTTCATTAAAG GAAAAGGCGTCATCTGATGATGATGTGGAAAGGAAAATGACTCCAGCACTTAATAGACCT GTTCTTTTAGAAAACTACAAGCAGGCTAAGCGTAGATTATTCCTTTTTGATTACGATGGT ACTTTGACCCCAATTGTCAAAGACCCAGCTGCAGCTATTCCATCGGCAAGACTTTATAÇA ATTCTACAAAAATTATGTGCCGATCCTCATAATCAAATCTGGATTATTTCTGGTCGTGAC CAGAAGTTTTTGAACAAGTGGTTAGGCGGTAAACTTCCTCAACTGGGTCTAAGTGCGGAG CATGGATGTTTCATGAAAGATGTTTCTTGCCAAGATTGGGTCAATTTGACCGAAAAAGTT GATATGTCTTGGCAAGTACGCGTCAATGAAGTGATGGAAGAATTTACCACAAGGACCCCA GGTTCATTCATCGAAAGAAAGAAAGTCGCTCTAACTTGGCATTATAGACGTACCGTTCCA GAATTGGGTGAATTCCACGCCAAAGAACTGAAAGAAAAATTGTTATCATTTACTGATGAC TTCGATTTAGAGGTCATGGATGGTAAAGCAAACATTGAAGTTCGTCCAAGATTCGTCAAC AAAGGTGAAATAGTCAAGAGACTAGTCTGGCATCAACATGGCAAACCACAGGACATGTTG AAGGGAATCAGTGAAAAACTACCTAAGGATGAAATGCCTGATTTTGTATTATGTCTGGGT GATGACTTCACTGACGAAGACATGTTTAGACAGTTGAATACCATTGAAACTTGTTGGAAA GAAAAATATCCTGACCAAAAAAATCAATGGGGCAACTACGGATTCTATCCTGTCACTGTG GGATCTGCATCCAAGAAAACTGTCGCAAAGGCTCATTTAACCGATCCTCAGCAAGTCCTG GAGACTTTAGGTTTACTTGTTGGTGATGTCTCTCTCTTCCAAAGTGCTGGTACGGTCGACÇ CTGGATTCCAGAGGTCATGTCAAGAATAGTGAGAGCAGTTTGAAATCAAAGCTAGCATCT
AAAGCTTATGTTATGAAAAGATCGGCTTCTTACACCGGCGCAAAGGTTTGA Sequência da proteína TPS2 de Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 44)
MTTTAQDNSPKKRORIINCVTOLPYKIQLGESNDDWKISATTGNSALFSSLEYLQFDSTE YEQHVVGWTGEITRTERNLFTREAKEKPODLDDDPLYLTKEQINGLTTTLQODHMKSDKEA KTDTTQOTAPVTNNVHPVWLLRKNQOSRWRNYAEKVIWPTFHYILNPSNEGEQEKNWWYDYV KFNEAYAQKIGEVYRKGDI INIHDYYLLLLPOLLRMKFNDESIIIGYFHHAPWPSNEYFR CLPRRKQILDGLVGANRICFONESFSRHFVSSCKRLLDATAKKSKNSSNSDQYQVSVYGG DVLVDSLPIGVNTTOILKDAFTKDIDSKVLSIKQAYONKKIIIGRDRLDSVRGVVOKLRA FETFLAMYPEWRDQOVVLIQVSSPTANRNSPQOTIRLEQQVNELVNSINSEYGNLNFSPVQH YYMRIPKDVYLSLLRVADLCLITSVRDGMNTTALEYVTVKSHMSNFLCYGNPLILSEFSG SSNVLKDAIVVNPWDSVAVAKSINMALKLDKEEKSNLESKLWKEVPTIQDWTNKFLSSLK EQASSNDDMERKMTPALNRPVLLENYKQOAKRRLFLFDYDGTLTPIVKDPAAAIPSARLYT ILQKLCADPHNQIWIISGRDOKFLNKWLGGKLPQOLGLSAEHGCFMKDVSCQODWVNLTEKV DMSWQVRVNEVMEEFTTRTPGSFIERKKVALTWHYRRTVPELGEFHAKELKEKLLSFTDD FDLEVMDGKANIEVRPRFVNKGEIVKRLVWHQOHGKPQODMLKGISEKLPKDEMPDFVLCLG DDFTDEDMFRQLNTIETCWKEKY PDOKNQWGNYGFYPVTVGSASKKTVAKAHLTDPQOQVL ETLGLLVGDVSLFOSAGTVDLDSRGHVKNSESSLKSKLASKAYVMKRSASYTGAKV
[00147] A funçãoea vantagem dessas e de outras modalidades se- rão mais completamente compreendidas a partir dos exemplos abaixo. Os exemplos a seguir pretendem ilustrar os benefícios da pre- sente invenção, mas não exemplificam o escopo completo da invenção. Consequentemente, será entendido que a seção de Exemplos não se destina a limitar o escopo da invenção.
EXEMPLOS Exemplo 1: Geração de cepas amilolíticas de Saccharomyces cere- visiae
[00148] Estão descritas abaixo cepas de levedura de S. cerevisiae geneticamente manipuladas. As cepas descritas incluem cepas com modificações genéticas que melhoram a capacidade de consumo de lactato das leveduras produtoras de etanol. Cepa 1-3: cepa base de Saccharomyces cerevisiae ura3A
[00149] Acepal(EthanolRed6&) é transformada com a SEQ ID NO:
1. SEQ ID NO: 1 contém os seguintes elementos: i) uma cassete de expressão para uma versão mutante de um gene 3-desoxi-D-arabino- heptulosonato-7-fosfato (DAHP) sintase de Saccharomyces cerevisiae (ARO4-OFP) e ii) DNA de acompanhamento para integração cromossô- mica direcionada no lócus URA3. Os transformantes foram seleciona- dos em meio sintético completo contendo 3,5 g /L de p-fluorofenilalanina e 1 g/L de L-tirosina (SCD-PFP). Os transformantes resultantes foram selecionados para isolamento de uma única colônia em ScD-PFP. Uma única colônia é selecionada. A integração correta de SEQ ID NO: 1 em um alelo do lócus A é verificada por PCR na colônia única. Um isolado verificado por PCR é designado Cepa 1-1.
[00150] A Cepa 1-1 é transformada com a SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 2 contém os seguintes elementos: i) um cassete de expressão para um gene de acetamidase (amdS) de Aspergillus nidulans; e ii) DNA de acompanhamento para integração cromossômica direcionada no lócus URA3. Os transformantes foram selecionados na Base de Nitrogênio de Levedura (sem sulfato de amônio ou aminoácidos) contendo 80 mg/L de uracil e 1 g/L de acetamida como única fonte de nitrogênio. Uma única colônia é selecionada. A integração correta da SEQ ID NO: 2 no segundo alelo do lócus A é verificada por PCR na colônia única. Um isolado verificado por PCR é designado Cepa 1-2.
[00151] A cepa 1-2 é cotransformada com a SEQID NO: 3eaSEQ ID NO: 4. A SEQ ID NO: 3 contém os seguintes elementos: i) uma fase de leitura aberta para uma cre recombinase do bacteriófago P1 e ii) DNA de acompanhamento homólogo à SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 4 contém os seguintes elementos: i) uma origem de replicação 24; ii) um marca- dor selecionável URA3 de Saccharomyces cerevisiae; e iii) DNA de acompanhamento que contém um promotor PGK e um terminador CYC1 de Saccharomyces cerevisiae. Os transformantes foram selecio- nados em meio de eliminação sintético sem uracil (ScD-Ura). Os trans- formantes resultantes foram submetidos ao isolamento de uma única colônia em ScD-Ura. Uma única colônia é selecionada. A colônia iso- lada é testada quanto ao crescimento em ScD-PFP e Base de Nitrogê- nio de Levedura (sem sulfato de amônia ou aminoácidos) contendo 80 mg/L de uracil e 1 g/L de acetamida como a única fonte de nitrogênio. À perda dos genes ARO4-0FP e amadS é verificada por PCR. O isolado verificado por PCR é colocado em YNB contendo 5-FOA para selecionar a perda do plasmídeo 24.0 isolado verificado por PCR é designado como Cepa 1-3.
Cepa 1-4: Saccharomyces cerevisiae que expressa duas variantes com códon otimizado da glicoamilase de Saccharomycopsis fibu- ligera no primeiro alelo de CYB2
[00152] ACepa1l-3é cotransformada com a SEQIDNO:5eaSEQ ID NO: 6. SEQ ID NO: 5 contém os seguintes elementos: i) DNA homó- logo à região 5' do gene CYB2 nativo; e ii) um cassete de expressão para uma variante com códon otimizado única da glicoamilase de Sac- charomycopsis fibuligera (SEQ ID NO: 38), sob o controle do promotor TDH3 e do terminador CYC1; e ili) o promotor URA3, assim como uma porção do gene URA3. À SEQ ID NO: 6 contém os seguintes elementos: i) uma porção do gene e terminador UR A3; e ii) um cassete de expres- são para uma variante otimizada por códon única da glicoamilase de Saccharomycopsis fibuligera, sob o controle do promotor PGK e do ter- minador RPL3; e iii) DNA homólogo à região 3' do gene CY B2 nativo. Os transformantes foram selecionados em ScD-Ura. Os transformantes re- sultantes foram submetidos ao isolamento de uma única colônia em ScD-Ura. Uma única colônia é selecionada. A integração correta de SEQ ID NO: 5e SEQ ID NO: 6 em um alelo de CYB2 é verificada por PCR. O isolado verificado por PCR é designado como Cepa 1-4. Cepa 1-5: Saccharomyces cerevisiae que expressa quatro varian- tes com códon otimizado da glicoamilase de Saccharomycopsis fi- buligera no segundo alelo de CYB2
[00153] A cepa 1-4é cotransformada com a SEQ ID NO:7eaSEQ ID NO: 8. SEQ ID NO: 7 contém os seguintes elementos: i) DNA homó- logo à região 5' do gene CYB2 nativo; e ii) um cassete de expressão para uma variante otimizada por códon única da glicoamilase de Sac- charomycopsis fibuligera, sob o controle do promotor TDH3 e termina- dor CYC1; eli) o promotor TEF1 e uma porção do gene da acetamidase de Aspergillus nidulans (amdS). À SEQ ID NO: 8 contém os seguintes elementos: i) uma porção do gene da acetamidase de Aspergillus nidu- lans (amdS) e terminador ADHI; e ii) um cassete de expressão para uma variante otimizada por códon única da glicoamilase de Saccha- romycopsis fibuligera, sob o controle do promotor PGK e do terminador RPL3; e iii) DNA homólogo à região 3' do gene CYB2 nativo. Os trans- formantes foram selecionados em Base de Nitrogênio de Levedura (sem sulfato de amônio ou aminoácidos) contendo 80 mg/L de uracil e 1 g/L de acetamida como única fonte de nitrogênio. Uma única colônia é se- lecionada. A integração correta de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 no alelo remanescente de CY B2 é verificada por PCR. O isolado verificado por PCR é designado como Cepa 1-5. Cepa 1-6: Reciclagem de marcadores de URA3 e amdS através de cre recombinase na Cepa 1-5
[00154] A cepa 1-5 é transformada com a SEQ ID NO: 9. A SEQ ID NO: 9 contém os seguintes elementos: i) um cassete de expressão para uma versão mutante de um gene de 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato- 7T-fosfato (DAHP) sintase de Saccharomyces cerevisiae (ARO4- OFP); 2) um cassete de expressão para uma cre recombinase do bac- teriófago P1; 3) um cassete de expressão que contenha URA3 nativo e 4) o centrômero CENG6 de Saccharomyces cerevisiae. Os transforman- tes foram selecionados em meio sintético completo contendo 3,5 g/L de p-fluorofenilalanina e 1 g/L de L-tirosina (SCD-PFP). Os transformantes resultantes foram coletados para isolamento de uma única colônia em ScCD-PFP. Uma única colônia é selecionada. O isolado verificado por PCR é designado como Cepa 1-6. Cepa 1-7: Restauração de URA3 nativo no lócus original na Cepa- 1-6
[00155] A Cepa 1-6 6é transformada com a SEQ ID NO: 10. SEQ ID NO: 10 contém os seguintes elementos: 1) um cassete de expressão para o URA3 nativo, com homologia 5' e 3' com o lócus UR A3 interrom- pido na Cepa 1-6 . Os transformantes foram selecionados em ScD- ura. Os transformantes resultantes foram selecionados para o isola- mento de uma única colônia em ScD-ura. Uma única colônia é selecio- nada. O isolado verificado por PCR é designado como Cepa 1-7. Cepa 1-8: Saccharomyces cerevisiae que expressa uma glicoami- lase manipulada de Rhizopus orzyae no primeiro alelo de CYB2
[00156] A cepa 1-3é cotransformada com a SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12. ASEQ ID NO: 11 e a SEQ ID NO: 12 são semelhantes a SEQ ID NO: 5e SEQ ID NO: 6 com à seguinte diferença: a glicoamilase de Saccharomycopsis fibuligera é substituída pela glicoamilase de Rhi- zopus oryzae (SEQ ID NO: 39). Os transformantes são selecionados em ScD-Ura. Os transformantes resultantes foram submetidos ao isola- mento de uma única colônia em ScD-Ura. Colônias únicas foram sele- cionadas e a integração correta do cassete de expressão é confirmada por PCR. Três transformantes independentes foram testados em uma fermentação em frasco de agitação e um isolado representativo é de- signado como Cepa 1-8. Cepa 1-9: Saccharomyces cerevisiae que expressa uma glicoami- lase manipulada de Rhizopus orzyae no segundo alelo de CYB2
[00157] ACepal1l-8é cotransformada com SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14. SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14 são semelhantes à SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 com a seguinte diferença: a glicoamilase de Sac- charomycopsis fibuligera é substituída pela glicoamilase de Rhizopus oryzae. Os transformantes foram selecionados em placas YNB +aceta- mida. Os transformantes resultantes foram submetidos ao isolamento de uma única colônia em placas YNB + acetamida. Colônias únicas fo- ram selecionadas e a integração correta do cassete de expressão é con- firmada por PCR. Três transformantes independentes foram testados em uma fermentação em frasco de agitação e um isolado representativo é designado como Cepa 1-9. Cepa 1-10: Reciclagem dos marcadores URA3 e amdS através de cre recombinase na Cepa 1-9
[00158] A cepa 1-9 é transformada com a SEQ ID NO: 9. Os trans- formantes foram selecionados em meio completo sintético contendo 3,5 g/L de p-fluorofenilalanina e 1 g/L de L-tirosina (SCD-PFP). Os transfor- mantes resultantes foram selecionados para isolamento de uma única colônia em ScD-PFP. Uma única colônia é selecionada. O isolado veri- ficado por PCR é designado como Cepa 1-10. Cepa 1-11: Restauração de URA3 nativo no lócus original na Cepa 1-10
[00159] A Cepa-10 é transformada com à SEQ ID NO: 10. Os trans- formantes foram selecionados em ScD-ura. Os transformantes resultan- tes foram selecionados para o isolamento de uma colônia única em ScD-ura. Uma única colônia é selecionada. O isolado verificado por PCR é designado como Cepa 1-11. Cepa 1-12: Saccharomyces cerevisiae que expressa uma glicoami- lase manipulada de Rhizopus delemar no primeiro alelo de FCY1
[00160] Acepal-3 é cotransformada com a SEQ ID NO: 15e a SEQ ID NO: 16. SEQ ID NO: 15 contém os seguintes elementos: i) DNA ho- mólogo da região 5' do gene FC Y 1 nativo; e li) um cassete de expressão para uma única variante otimizada por códon da glicoamilase de R hizo- pus delemar (SEQ ID NO: 40), sob o controle do promotor TDH3 e do terminador CYC1; e iii) o promotor URA3, assim como uma porção do gene URA3. A SEQ ID NO: 16 contém os seguintes elementos: i) uma porção do gene e terminador UR A3; e ii) um cassete de expressão para uma única variante otimizada por códons da glicoamilase de Rhizopus delemar, sob controle do promotor PGK e terminador GAL1O; e iii) DNA homólogo à região 3' do gene FCY1 nativo. Os transformantes foram selecionados em ScD-Ura. Os transformantes resultantes foram subme- tidos ao isolamento de uma única colônia em ScD-Ura. Colônias únicas foram selecionadas e a integração correta do cassete de expressão é confirmada por PCR. Três transformantes independentes foram testa- dos em uma fermentação em frasco de agitação e um isolado represen- tativo é designado como Cepa 1-12. Cepa 1-13: Saccharomyces cerevisiae expressando uma glicoami- lase modificada de Rhizopus delemar no segundo alelo de FCY1.
[00161] ACepa1-12 é cotransformada com SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18. SEQ ID NO: 17 contém os seguintes elementos: i) DNA ho- mólogo à região 5' do gene FCY1 nativo; e ii) um cassete de expressão para uma única variante otimizada por códon da glicoamilase de R hizo- pus delemar, sob o controle do promotor TDH3 e do terminador CYC1; e iii) o promotor TEF1, assim como uma porção do gene amd'S de Asper- gillus nidulans. ASEQ ID NO: 18 contém os seguintes elementos: i) uma porção do gene da acetamidase (amd'S) de Aspergillus nidulans e o ter- minador ADH1; e ii) um cassete de expressão para uma única variante otimizada por códon da glicoamilase de R hizopus delemar, sob controle do promotor PGK e terminador GALI1OG; e ili) DNA homólogo à região 3' do gene FCY1 nativo. Os transformantes foram selecionados em placas YNB +acetamida. Os transformantes resultantes foram submetidos ao isolamento de uma única colônia em placas YNB +acetamida. Colônias únicas foram selecionadas e a integração correta do cassete de expres- são é confirmada por PCR. Três transformantes independentes foram testados em uma fermentação em frasco de agitação e um isolado re- presentativo é designado como Cepa 1-13. Cepa 1-14: Reciclagem dos marcadores URA3 e amdS através de cre recombinase na Cepa 1-13
[00162] ACepal-13é transformada com a SEQ ID NO: 9. Os trans- formantes foram selecionados em meio completo sintético contendo 3,5 g/L de p-fluorofenilalanina e 1 g/L de L-tirosina (SCD-PFP). Os transfor- mantes resultantes foram selecionados o para isolamento de uma única colônia em ScD-PFP. Uma única colônia é selecionada. O isolado veri- ficado por PCR é designado como Cepa 1-14. Cepa 1-15: Restauração de URA3 nativo no lócus original na Cepa 1-14
[00163] ACepal-14é transformada coma SEQ ID NO: 10. Os trans- formantes foram selecionados no ScD-ura. Os transformantes resultan- tes foram selecionados para o isolamento de uma colônia única em ScD-ura. Uma única colônia é selecionada. O isolado verificado por PCR é designado Cepa 1-15. Cepa 1-16: Saccharomyces cerevisiae que expressa uma glicoami- lase de Rhizopus microsporus modificada no primeiro alelo de FCY1.
[00164] ACepal-3é cotransformada coma SEQIDNO:19eaSEQ ID NO: 20. SEQ ID NO: 19 é semelhante à SEQ ID NO: 15 com a se- guinte diferença: a glicoamilase de R hizopus delemar é substituída pela glicoamilase de Rhizopus microsporus (SEQ ID NO: 41). SEQ ID NO: contém os seguintes elementos: i) uma porção do gene e terminador URA3; e ii) DNA homólogo à região 3' do gene FCY1 nativo. Os trans- formantes foram selecionados em ScD-Ura. Os transformantes resul- tantes foram submetidos ao isolamento de uma única colônia em ScD- Ura. Colônias únicas foram selecionadas e a integração correta do cas- sete de expressão é confirmada por PCR. Três transformantes indepen- dentes foram testados em uma fermentação em frasco de agitação e um isolado representativo é designado como Cepa 1-16. Cepa 1-17: Saccharomyces cerevisiae que expressa uma glicoami- lase de Rhizopus microsporus modificada no segundo alelo de FCYI1.
[00165] A Cepa 1-16 é cotransformada com a SEQ ID NO: 21 ea
SEQ ID NO: 22. SEQ ID NO: 21 é semelhante à SEQ ID NO: 17 com à seguinte diferença: a glicoamilase de Rhizopus delemar é substituída pela glicoamilase de R hizopus microsporus . SEQ ID NO: 22 contém os seguintes elementos: i) uma porção do gene de acetamidase (amdS) de Aspergillus nidulans e o terminador TEF1; e ii) DNA homólogo à região 3' do gene FCY1 nativo. Os transformantes foram selecionados em pla- cas de YNB + acetamida. Os transformantes resultantes foram subme- tidos ao isolamento de uma única colônia em placas YNB + aceta- mida. Colônias únicas foram selecionadas e a integração correta do cassete de expressão é confirmada por PCR. Três transformantes inde- pendentes foram testados em uma fermentação em frasco de agitação e um isolado representativo é designado como Cepa 1-17. Cepa 1-18: Reciclagem dos marcadores URA3 e amdS através de cre recombinase na Cepa 1-17
[00166] ACepal-17é transformada com a SEQ ID NO: 9. Os trans- formantes foram selecionados em meio completo sintético contendo 3,5 g/L de p-fluorofenilalanina e 1 g/L de L-tirosina (SCD-PFP). Os transfor- mantes resultantes foram selecionados o para isolamento de uma única colônia em ScD-PFP. Uma única colônia é selecionada. O isolado veri- ficado por PCR é designado como Cepa 1-18. Cepa 1-19: Restauração de URA3 nativo no lócus original na Cepa 1-18
[00167] ACepal-18é transformada coma SEQ ID NO: 10. Os trans- formantes foram selecionados em ScD-ura. Os transformantes resultan- tes foram selecionados para o isolamento de uma colônia única em ScD-ura. Uma única colônia é selecionada. O isolado verificado por PCR é designado como Cepa 1-19. Cepa 1-20: Saccharomyces cerevisiae que expressa uma glicoami- lase de Rhizophus orzyae modificada em ambos os alelos de CYB2 e uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase em ambos os alelos de GDP1.
[00168] A Cepa 1l-10 é cotransformada com a SEQ ID NO: 23 ea SEQ ID NO: 24 e com a SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26.
[00169] ASEQID NO: 23 contém os seguintes elementos: i) DNA homólogo à região 5' do gene GPD1 nativo; e li) um cassete de expres- são para uma única variante otimizada por códon da gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase de Bacillus cereus (SEQ ID NO: 42), sob o con- trole do promotor PGK1 e terminador CYC1; e iii) sítio de recombinação loxP e iv) uma porção do gene URA3. À SEQ ID NO: 24 contém os se- guintes elementos: i) uma porção do gene URA3 e terminador URA3; e ii) sítio de recombinação loxP; e iii) DNA homólogo à região 3' do gene GPD1 nativo.
[00170] ASEQID NO: 25 contém os seguintes elementos: i) DNA homólogo à região 5' do gene GPD1 nativo; e li) um cassete de expres- são para uma única variante otimizada por códon da gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase do Bacillus cereus, sob controle do promotor PGK1 e terminador CYC1; e iii) sítios de recombinação loxP e iv) o pro- motor TEF1 e uma porção do gene da acetamidase (amdS) de Asper- gillus nidulans. A SEQ ID NO: 26 contém os seguintes elementos: i) uma porção do gene amadS e terminador TEF1; e ii) sítio de recombinação loxP e iii) DNA homólogo à região 3' do gene GPD1 nativo. Os transfor- mantes foram selecionados em placas de YNB+acetamida. Os transfor- mantes resultantes foram submetidos ao isolamento de uma única co- lônia em placas YNB+acetamida. Foram selecionadas colônias únicas e a integração correta do cassete de expressão é confirmada por se- quenciamento. Três transformantes independentes foram testados em uma fermentação em frasco de agitação e um isolado representativo é designado como Cepa 1-20. Cepa 1-21: Saccharomyces cerevisiae que expressa uma glicoami- lase de Rhizopus orzyae modificada em ambos os alelos de CYB2 e uma deleção de ambos os alelos de GPP1
[00171] Acepa1-10 é transformada com a SEQ ID NO: 27. SEQ ID NO: 27 contém os seguintes elementos: i) DNA homólogo à região 5' do gene GPP1 nativo; e ii) de Kluyveromyces lactis, o promotor URA3, as- sim como o gene URA3 e o terminador URA3; e iv) sítios de recombina- ção loxP flanqueando a cassete URA3; e iv) DNA homólogo à região 3' do gene GPP1 nativo.
[00172] Os transformantes foram selecionados em ScD-Ura. Os transformantes resultantes foram submetidos ao isolamento de uma única colônia em ScD-Ura. Foram selecionadas colônias únicas e a in- tegração correta do cassete de expressão é confirmada por sequencia- mento. Três transformantes independentes foram testados em uma fer- mentação em frasco de agitação e um isolado representativo é desig- nado como Cepa 1-21. Cepa 1-22: Saccharomyces cerevisiae que expressa uma glicoami- lase de Rhizopus oryzae modificada em ambos os alelos de CYB2 e uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Bacillus cereus em ambos os alelos de GPP1
[00173] A cepa 1-10 é cotransformada com SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 29, e SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31.
[00174] ASEQIDNO:28eSEQIDNO:29 são semelhantes à SEQ ID NO:23 e SEQ ID NO: 24 com a seguinte diferença: o DNA homólogo ao gene GPD1 nativo em SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24 é substituído pelo DNA homólogo ao gene GPP1 nativo. SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31 são semelhantes a SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26 com à seguinte diferença: o DNA homólogo ao gene GPD1 nativo na SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26 é substituído pelo DNA homólogo ao gene GPP1 nativo.
[00175] A sequência do plasmídeo para o cassete de integração GAPN é:
TGAGCTCCGGGTGGGAGGAAGGCGCGGCAATTAGAATGTGTGGGTGCGGAAGCOTCGCCG CTCCCATCAAGAGAGTGGAAGACGIATGGTCTIGGGTGCGAAGTACCACCACGITTCITI TTCATCTCITTAAGTGGGATTCITACGAAACACGICACAGGGTCAAAAGAAAGAGAACAA AAGCAATATTGTAATTGTCTCAGTCCACGGCAATGACATGGCATGGCCCCGAAGGCTTT TTTIGICTGICITCCTIGGGTCTTACCCCGCCACGCGTTAATAGTGAGACAAGCAGGAA ATCCGTIATCATTTTCICGCATACACGAACCCGCGTIGCGCCTGGTAAATTGCAGGATTCT CATTGTCCGGTTTTCTTTATGGGAATAATCATCATCACCATTATCACTGTTACTCTTGC GATCATCATCATTAACATAATTTTTTTAACGCTGTTTGATGATGGTATGTGCTTTTATT GTTCCTTACTCACCTTTTCCTITGIGTCTTITAATTTTIGACCATTTTGACCATTTTGAC CTITGATIGATIGIGTGAGTICCICTITTICITITITICIITICITITITICCITTIITTITTC TTITCITACIGIGTTAATCACITTCTTICCITITTIGITICATATIGICGICITGITCATT TTCGTTCAATTGATAATGTATATAAATCTTTCGTAAGTATCTCTTGATTGCCATTTTTT TCTTTCCAAGTTITCCTIGITCICGAGGCCAGAAAAAGGAAGTGTTTCCCTCCTICTTGA ATTIGATIGTTACCCTCATAAAGCACGIGGCCICITAICGAGAAAGAAATTACCGTICGCTC GTGATTTGITTGCAAAAAGAACAAAACTGAAAAAACCCAGACACGCTCGACTTCCIGTC TTCCTATTGATTIGCAGCTICCAATITCGTCACACAACAAGGTCCTAGCGACGGCTCACA GGTTTIGTAACAAGCAATCGAAGGTTCIGGAATGGCGGGAAAGGGTTTAGTACCACATG CTATGATGCCCACTSGTGATCTCCAGAGCAAAGTTCGTICGATCGTACTGTTACTCTCTC TCTITTCAAACAGAATTGTCCGAATCGTGTGACAACAACAGCCTGTTICTCACACACTCTT TTCTTCTAACCAAGSGGGGTGGTTTAGTTTAGTAGAACCTCGTGAAACTTACATTTACAT ATATATAAACTTIGCATAAMATTGGTCAATGCAAGAAATACATATITGGTCITTICTAATT CGTAGITTITICAAGITCTIAGATGCTTICIITITCICITITITACAGATCATCAAGGAA GTAATTATCTACTTITTACAAGTCIAGAATGACAACATCAAATACCTACAAATTCITIATC TAAACGGTGAATGGAGAGAATCTTCCTCTGGAGAAACTATTGAGATACCATCACCATAC TTACATGAAGTGATCGGACAGGTTCAAGCAATCACTAGAGGAGAGGTTGACGAAGCGAT TGCTAGCGCTAAGGAAGCACAGAAATCITGGGCTGAGGCATCICTACAAGATAGAGCTA AGTACTTGIACAAATGGGCAGATGAATTIGGIAAACATGCAAGACGAAATCGCCGATATC ATCATGAAGGAAGTGGGCAAGGGTTACAAAGACGCTAAAAAGGAGGTTGTTAGAACCGC CGATTTICATCAGATACACCATIGAAGAGGCACTCCATATGCACGGTGAATCCATGATGGS GCGATICATITTCCIGGIGGAACAAAATCTAAGCTAGCAATAATCCAAAGAGCGCCTCTG GGTGTAGTCTTAGCCATCGCTCCATTCAATTACCCTGTAAACCTTTCTGCTGCAAAATT GGCACCAGCCTTAATTATGGGTAACGCTGTGATATTCAAGCCAGCAACTCAGGGTGCTA TTTCCGGCATCAAAATGGTTGAAGCTTTIGCATAAGGCTGGTTTGCCAAAGGGTTTGGTT AACGTTGCCACAGGTAGAGGTAGCGTCATAGGCGATTATTIGGTITCGAACACGAAGGGAT AAACATGGITTTCCTICACCGGTIGGCACTAACACTGGTAAGCATTITAGCAAAAAAGGCCT CAATGATTCCATTAGTCTTGGAACTTGGTGGCAAAGATCCAGGCATCGTTCGTGAAGAT GCAGACCTACAAGATGCTGCGAATCATATCGTATCTGGTGCGTICAGTTACTCAGGGCA GAGATGTACAGCCATTAAGAGAGTCCTIGTICATGAAAATGTIGCIGATGAACTGGTAT CATTGGTTAAGGAACAAGTGGCAAAGCTTTICIGIGGGATCACCAGAGCAAGATITCAACA ATTGTTCCTCTGATTGACGATAAGTCCGCTGATTTTGTTCAGGGTTTAGTGGACGATGC AGTCGAMAAGGGCGCTACAATTGICATTGGGAACAAGAGAGAACGTAACCTAATCIACC CAACATTGATTGATCACGTCACAGAGGAAATGAMAGTTGCCTGGGAGGAACCATTCGGT CCTATTCTTICCAATTATTAGAGTTAGTAGCGACGAGCAAGCTATTGAAATTGCABATAA GAGTGAGTTCGGATTACAAGCTTCTGIGITIACCAAAGACATAMACAAGGCATTCGCAA TCGCAMATAAGATTGAGACTGGTTCAGTGCAAATCAACGGTAGAACAGAGAGAGGACCA GATCACTTTCCTTTTATCGGGGTTAAGGGATCTGGGATGGGTGCCCAAGGCATCAGAAA GTCTIIGGAATCTATGACTAGAGAAAAAGTIACÇIGICITAAAICTCGTATGATIAAAÇA GGCCCCTTTICCTTTGICGATATCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCC TCCTCCCACATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCC
CTATITAITITIITATAGITAIGITAGTAITAAGAACGITATITATATTITTCAAMATITITIT CTTTTTTTTICTGTACAAACGCGTGTACGCATGTAACGGGCAGACG (SEQ ID NO: 59).
[00176] NaSEQIDNO: 59, a região codificada pelos nucleotídeos 1- 729 é uma região de flanco superior de GPP1; a região codificada pelos nucleotídeos 730-1326 é um promotor PGK; a região codificada pelos nucleotídeos 1327-2766 é uma sequência codificadora otimizada por códon para GAPN de B. cereus; e a região codificada pelos nucleotí- deos 2767-2995 é uma região terminadora.
[00177] Ostransformantes foram selecionados em placas YNB+ace- tamida. Os transformantes resultantes foram submetidos ao isolamento de uma única colônia em placas YNB + acetamida. Foram selecionadas colônias únicas, e a integração correta do cassete de expressão é con- firmada por sequenciamento. Três transformantes independentes foram testados em uma fermentação em frasco de agitação e um isolado re- presentativo é designado como Cepa 1-22.
Cepa 1-23: Saccharomyces cerevisiae que expressa uma glicoami- lase de Saccharomycopsis fibuligera em ambos alelos de CYB2 e uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase em ambos os alelos de GPP1
[00178] A cepa 1l-66é cotransformada com a SEQ ID NO: 28 e SEQ
ID NO: 29 e os transformantes são selecionados em ScD-Ura. Os trans- formantes resultantes foram submetidos ao isolamento de uma única colônia em ScD-Ura. Colônias únicas foram selecionadas e a integração correta do cassete de expressão é confirmada por PCR. Três transfor- mantes independentes foram selecionados para integração da segunda cópia do cassete de expressão no lócus GPP1.
[00179] Três cepas irmãs independentes contendo 1 cópia da SEQ ID NO: 28eSEQ ID NO: 29 foram cotransformadas com a SEQ ID NO: e a SEQIDNO:31e os transformantes foram selecionados em pla- cas YNB +acetamida. Os transformantes resultantes foram submetidos ao isolamento de uma única colônia em placas YNB + acetamida. Colô- nias únicas foram selecionadas e a integração correta do cassete de expressão é confirmada por PCR. Três transformantes independentes foram testados em uma condição de fermentação descrita co TESTE 5 e um isolado representativo que demonstrou uma taxa de fermentação precoce e um título equivalente ou superior de etanol quando compa- rado com a Cepa 1, é designado como Cepa 1-23. Cepa 1-24: Saccharomyces cerevisiae que expressa uma glicoami- lase de Rhizopus delemar modificada em ambos os alelos de FCY1 e uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Bacillus cereus em ambos os alelos de GPP1.
[00180] A cepa 1-14 é cotransformada com SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO:29 e SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31. Os transformantes foram selecionados em placas YNB + acetamida. Os transformantes resultan- tes foram submetidos ao isolamento de uma única colônia em placas YNB + acetamida. Foram selecionadas colônias únicas e a integração correta do cassete de expressão é confirmada por sequencia- mento. Três transformantes independentes foram testados em uma fer- mentação em frasco de agitação e um isolado representativo é desig- nado como Cepa 1-24.
Cepa 1-25: Saccharomyces cerevisiae que expressa uma glicoami- lase de Rhizopus microsporus modificada em ambos os alelos de FCY1 e uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Bacillus ce- reus em ambos os alelos de GPP1.
[00181] Acepa1-18é cotransformada com a SEQ ID NO:28e SEQ ID NO: 29 e a SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31. Os transformantes foram selecionados em placas YNB + acetamida. Os transformantes re- sultantes foram submetidos ao isolamento de uma única colônia em pla- cas YNB + acetamida. Foram selecionadas colônias únicas e a integra- ção correta do cassete de expressão é confirmada por sequencia- mento. Três transformantes independentes foram testados em uma fer- mentação em frasco de agitação e um isolado representativo é desig- nado como Cepa 1-25. Cepa 1-26: Saccharomyces cerevisiae que expressa uma glicoami- lase de Rhizopus oryzae modificada em ambos os alelos de CYB2 e uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Bacillus cereus em ambos os alelos de DLDI.
[00182] A Cepa 1-10 é cotransformada com a SEQ ID NO: 32 ea SEQ ID NO: 33. SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33 são semelhantes às SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24 com à seguinte diferença: o DNA homólogo ao gene nativo GPD1 na SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24 é substituído pelo DNA homólogo ao gene nativo DLDI1. Os transforman- tes foram selecionados em ScD-Ura. Os transformantes resultantes fo- ram submetidos ao isolamento de uma única colônia em ScD-Ura. Co- lônias únicas foram selecionadas e a integração correta do cassete de expressão é confirmada por PCR. Três transformantes independentes foram encaminhadas para a integração da segunda cópia do cassete de expressão no lócus DLD1.
[00183] Três cepas irmãs independentes contendo 1 cópia da SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33 foram cotransformadas com SEQ ID NO:
34 e SEQIDNO:35.SEQIDNO:34eSEQ ID NO: 35 são semelhantes a SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26 com a seguinte diferença: o DNA homólogo ao gene nativo GPD1 na SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26 é substituído pelo DNA homólogo ao gene nativo DLDI1. Os transforman- tes foram selecionados em placas YNB +acetamida. Os transformantes resultantes foram submetidos ao isolamento de uma única colônia em placas YNB + acetamida. Colônias únicas foram selecionadas e a inte- gração correta do cassete de expressão é confirmada por PCR. Três transformantes independentes foram testados na condição de fermen- tação descrita no TESTE 45 e um isolado representativo que demons- trou precocemente uma taxa de fermentação e o título de etanol final equivalente ou superior em comparação com a Cepa 1 é designada como Cepa 1-26. Cepa 1-27: Saccharomyces cerevisiae que expressa uma glicoami- lase de Saccharomycopsis fibuligera modificada em ambos os ale- los de CYB2 e uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Baci- Ilus cereus em ambos os alelos de DLD1.
[00184] A cepa 1l-6é cotransformada com SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO:33 e os transformantes foram selecionados em ScD-Ura. Os trans- formantes resultantes foram submetidos ao isolamento de uma única colônia em ScD-Ura. Colônias únicas foram selecionadas e a integração correta do cassete de expressão é confirmada por PCR. Três transfor- mantes independentes prosseguiram para a integração da segunda có- pia do cassete de expressão no lócus de DLD1.
[00185] Três cepas irmãs independentes contendo 1 cópia da SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33 foram cotransformadas com SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 35. Os transformantes foram selecionados em placas YNB +acetamida. Os transformantes resultantes foram submetidos ao isolamento de uma única colônia em placas YNB +acetamida. Colônias únicas foram selecionadas e a integração correta do cassete de expres- são é confirmada por PCR. Três transformantes independentes foram testados na condição de fermentação descrita no TESTE f5 e um iso- lado representativo que demonstrou taxa de fermentação precoce e tí- tulo de etanol! final equivalentes ou superiores quando comparado com a Cepa 1 é designado como Cepa 1-27. Cepa 1-28: Saccharomyces cerevisiae que expressa uma glicoami- lase de Rhizopus delemar modificada em ambos os alelos de FCY1 e uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Bacillus cereus em ambos os alelos de DLDI1.
[00186] A cepa 1-14 é cotransformada com a SEQ ID NO: 32 ea SEQ ID NO: 33 e os transformantes foram selecionados em ScD- Ura. Os transformantes resultantes foram submetidos ao isolamento de uma única colônia em ScD-Ura. Colônias únicas foram selecionadas e a integração correta do cassete de expressão é confirmada por PCR. Três transformantes independentes prosseguiram para integra- ção da segunda cópia do cassete de expressão no lócus DLD1.
[00187] Três cepas irmãs independentes contendo 1 cópia de SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33 foram cotransformadas com a SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 35. Os transformantes foram selecionados em placas YNB +acetamida. Os transformantes resultantes foram submetidos ao isolamento de uma única colônia em placas YNB +acetamida. Colônias únicas foram selecionadas e a integração correta do cassete de expres- são é confirmada por PCR. Três transformantes independentes foram testados na condição de fermentação descrita no TESTE f5 e um iso- lado representativo que demonstrou taxa de fermentação precoce e tí- tulo de etanol final equivalente ou superior quando comparado com a Cepa 1 é designado como Cepa 1-28. Cepa 1-29: Saccharomyces cerevisiae que expressa uma glicoami- lase de Rhizopus microsporus modificada em ambos os alelos de
FCY1 e uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Bacillus ce- reus em ambos os alelos de DLDI.
[00188] A cepa 1-18é cotransformada com a SEQ ID NO: 32 ea SEQ ID NO: 33 e os transformantes foram selecionados em ScD- Ura. Os transformantes resultantes foram submetidos ao isolamento de uma única colônia em ScD-Ura. Colônias únicas foram selecionadas e a integração correta do cassete de expressão é confirmada por PCR. Três transformantes independentes prosseguiram para a integra- ção da segunda cópia do cassete de expressão no lócus DLD1.
[00189] Três cepas irmãs independentes contendo 1 cópia de SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33 foram cotransformadas com SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 35. Os transformantes foram selecionados em placas YNB + acetamida. Os transformantes resultantes foram submetidos ao isolamento de uma única colônia em placas YNB +acetamida. Colônias únicas foram selecionadas, e a integração correta do cassete de expres- são é confirmada por PCR. Três transformantes independentes foram testados na condição de fermentação descrita no TESTE 45 e um iso- lado representativo que demonstrou taxa de fermentação precoce e tí- tulo de etanol final equivalente ou superior quando comparado com a Cepa 1 é designado como Cepa 1-29. Cepa 1-30: Saccharomyces cerevisiae que expressa uma glicoami- lase de Rhizopus oryzae modificada em ambos os alelos de CYB2, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Bacillus cereus em am- bos os alelos de GPP1 e uma cópia de Trehalose-6-Fosfato Sinte- tase e Trehalose-6-Fosfato Sintase/fosfatase de Saccharomyces cerevisiae em um alelo de ADH2.
[00190] Acepa 1-2? é cotransformada coma SEQ ID NO: 36 e 37. A SEQ ID NO: 36 contém os seguintes elementos: i) DNA homólogo à região 5' do gene ADH?2 nativo; e ii) um cassete de expressão para a
Trehalose-6-F osfato Sintase (TPS1) (SEQ ID NO : 43) nativa de Saccha- romyces cerevisiae, sob o controle do promotor de 3-F osfoglicerato qui- nase (PGK1) nativo de Saccharomyces cerevisiae, promotor e termina- dor da Proteína de classificação vacuolar (VPS13) nativos de Saccha- romyces cerevisiae; e iii) o promotor nativo de Triose-F osfato Isomerase (TP11) de Saccharomyces cerevisiae e uma porção do marcador de re- sistência à canamicina (G418º). A SEQ ID NO: 37 contém os seguintes elementos: i) uma porção do marcador de resistência à canamicina (G418º) e o terminador nativo de álcool desidrogenase (ADH1) de Sac- charomyces cerevisiae; e ii) um cassete de expressão para Trealose-6- Fosfato Sintase/fosfatase (TPS2) (SEQ ID NO:44) nativa de Saccha- romyces cerevisiae, sob o controle do promotor nativo de Triose-F osfato desidrogenase (TDH3) de Saccharomyces cerevisiae e o terminador na- tivo da Proteína de membrana regulada por feromônio de Saccha- romyces cerevisiae (PRM9); e iii) DNA homólogo à região 3' do gene ADH2 nativo. Os transformantes são selecionados em meio YPD + G418 [1% extrato de levedura, 2% peptona, 2% glicose, 2% ágar e 200 mg/L de antibiótico seletivo de geneticina (sulfato de G418)]. Os trans- formantes resultantes são selecionados para isolamento de uma única colônia em meio de seleção. Foram selecionadas colônias únicas e a integração correta do cassete de expressão é confirmada pelo sequen- ciamento. Três transformantes independentes foram testados em uma fermentação em frasco de agitação e um isolado representativo é de- signado como Cepa 1-30.
Cepa 1-31: Saccharomyces cerevisiae que expressa uma glicoami- lase de Rhizopus oryzae modificada em ambos os alelos de CYB2, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Bacillus cereus em am- bos os alelos de GPD1 e uma cópia de Trehalose-6-Fosfato Sinte- tase e Trehalose-6-Fosfato Sintase/fosfatase de Saccharomyces cerevisiae em um alelo de ADH2.
[00191] ACepa1-20 é cotransformada com SEQ ID NO: 36 e 37, e os transformantes são selecionados em meio YPD +G418. Os transfor- mantes resultantes são selecionados para isolamento de uma única co- lônia em meio de seleção. Colônias individuais são selecionadas e a integração correta do cassete de expressão é confirmada pelo sequen- ciamento. Três transformantes independentes são testados em uma fer- mentação em frasco de agitação e um isolado representativo é desig- nado como Cepa 1-31. Tabela 1: Descrição das sequências
LE L EEE FI LE SGA SEAT — LL FSFIFRRSEATA — OE FRA RT —
Tabela 2: Descrição das cepas: [LR O egg
| saerar | core || AORARAAAR UTAD CS CORO CROUA RS | Cepa 1-27 Cepa 1-6 amas + a Las AmELMeNamBNERE Cepa1-30 | Cepal-22 TPS1/2 no lócus ADH2; URA3+, amdS +, G418+ || semeia eira O is an vs aoma RM amaSR GARE Cepa1-31 | Cepa1-20 , TPS1/2 no lócus ADH2; URA3+, amdS +, G418+ Exemplo 2: Efeito da deleção de gpp1 e superexpressão do gene gapN de B. cereus no lócus GPP1 em uma cepa de levedura com glicoamilase ativada de Rhizopus orzyae (Ro) em mosto de milho
[00192] O impacto da redução da expressão de GPP1 e da superex- pressão de GAPN na produção de etanol foi avaliado conforme descrito no Teste %&1. O gene GPP1 foi deletado (cepas 1-21 e 1-22) e gapN foi superexpresso (cepa 1-22) em cepas de S. cerevisiae com glicoamilase ativada. Os Equivalentes Totais de Glicose (TGE) foram determinados serem 279 g/kg de glicose e esse valor foi usado para determinar o di- ferencial de rendimento entre a Cepa 1-22 e a cepa parental (Cepa 1- 11), como descrito no Teste 43.
[00193] Os resultados indicam que não houve impacto na taxa de fermentação nas cepas de teste (Cepas 1-21 e 1-22) em relação à Cepa parental 1-11 (Figura 1) e que a glicose residual era <0,6 g/kg em 48 horas para todas as cepas (Figura 3B). A combinação de gapN inte- grado no lócus GPP1 da cepa de levedura com glicoamilase ativada (Cepa 1-22) resultou em uma redução de 4,3 g/L no título de glicerol (Figura 3C), um aumento de 1,8 g/L no título de etanol (Figura 3 A ) e um rendimento 1,3% maior em comparação com a cepa parental (Cepa
1-11) em 48 horas (Figura 2). Exemplo 3. Comparação da superexpressão do gene gapN de B. cereus em uma cepa de levedura com glicoamilase ativada de Rhi- zopus orzyae (Ro) em mosto de milho
[00194] O impacto da superexpressão do gene gapN de B. cereus no lócus GPD1 (Cepa 1-20) ou lócus GPP1 (Cepa 1-22) em uma cepa de levedura de Rhizopus oryzae (Ro) com glicoamilase ativada foi compa- rado no mosto de milho conforme descrito no Teste %& 1. As cepas de teste (Cepas 1-20 e 1-22) foram comparadas à cepa parental (Cepa 1- 11) e uma cepa do tipo selvagem (Cepa 1).
[00195] Foiverificado que a Cepa 1-20 produz 17% menos etanol em 40 horas no mosto de milho (calculado pela perda de massa), demons- trando uma perda de taxa significativa (Figura 4). Em contraste, a adição de GAPN ao lócus GPP1 (Cepa 1-22) levou à produção de etanol equi- valente à Cepa 1 por 40 horas (Figura 4). Em 48 horas, o título médio de etanol por perda de massa (g/L) foi o seguinte para cada cepa na Figura 4: 115,62 g/L (Cepa 1-20), 130,47 g/L (Cepa 1-22), 130,09 g/L (Cepa 1-11) e 130,16 g/L (Cepa 1). Esses dados indicam que a adição de GAPN no lócus GPD1 é menos favorável, pois resulta em uma pe- nalidade de fermentação aumentada em relação à adição de GAPN a um lócus diferente de GPD1, tal como o lócus GPP1. Exemplo 4. Produção de etanol e redução de glicerol nas Cepas 1- 21 e 1-22 em frascos airlock Light Steep Water Liquifact (matéria- prima para moagem de milho a úmido).
[00196] O efeito da redução da expressão de GPP1 e superexpres- são de GAPN na produção de etanol em frascos airlock Steep Water Liquifact (matéria-prima para moagem úmida) foi testado usando a Cepa 1, Cepa 1-11, Cepa 1-21 e Cepa 1-22, medindo o título de etanol e os níveis de glicerol conforme descrito no Teste £4.
[00197] Osdados revelaram uma redução de 3,9 g/L no glicerol e um aumento de 1,9 g/L no etanol na Cepa 1-22 em comparação com a Cepa 1-11 (Figura 5). Esta é uma redução do título de glicerol e um aumento do título de etanol semelhantes aos observados no mosto de milho (ma- téria-prima de etanol para moagem a seco). A Figura 5 mostra os resul- tados em um meio Light Steep Water Liquifact LSW/LQ (matéria-prima para moagem úmida) em 72 horas. Exemplo 5: Comparação dos antecedentes de glicoamilase e avali- ação de cepas que expressam Tps 1/2
[00198] Um experimento de fermentação (Teste *1) (4 replicatas por cepa) foi executado para comparar o efeito da superexpressão do gene gapN de B. cereus no lócus GPD1 (Cepa 1-20) ou lócus GPP1 (Cepa 1- 22) em uma cepa de levedura com glicoamilase ativada de Rhizopus orzyae (Ro). Adicionalmente, as proteínas Tps 1/2 foram superexpres- sas nas Cepas 1-20 e 1-22 para avaliar se esses genes melhorariam a taxa de fermentação do etanol. As cepas resultantes, Cepa 1-30 (gapN no lócus GPP1) e Cepa 1-31 (gapN no lócus GPD1), ambas contêm 1 cópia superexpressa dos genes de Tps1/2 no lócus ADH2. O impacto do gene gapN de B. cereus no lócus GPP1 também foi avaliado em três diferentes cenários de glicoamilase RoGA (cepa 1-22), Rdel (cepa 1- 24), e Rmic (Cepa 1-25) a fim de determinar se a fonte do gene da gli- coamilase teria impacto na produção de etanol no milho. Todas as ce- pas foram corridas por 48 horas, exceto as cepas 1-20 e 1-31 (contendo a deleção do lócus GPD1), que foram corridas por 67 horas.
[00199] A Figura 6 é um gráfico que mostra que as Cepas 1-24 e 1- produziram títulos maiores de etanol de 2,2 g/L e 3,6 g/L, respectiva- mente, em comparação com a Cepa 1 em mosto de milho.
[00200] A Figura 7 é um gráfico que mostra a glicose residual nas Cepas 1-24 e 1-25 em relação à Cepa 1. As cepas que contêm o gene gapN no lócus GPP1 mostram valores de glicose residual de <1,5 9/kg no final da fermentação.
[00201] A Figura 8 é um gráfico que mostra que as Cepas 1-24 e 1- produziram uma redução de 5,0 g/L e 4,6 g/L, respectivamente, no título de glicerol em relação à Cepa 1 no mosto de milho.
[00202] As cepas nas quais o gene gapN de B. cereus foi inserido no lócus GPD1 nunca alcançaram os títulos da cepa parental devido a uma sobrecarga de fermentação. Em contraste, as cepas nas quais o gene gapN de B. cereus foi inserido no lócus GP P1 tiveram melhor desempe- nho.
[00203] A Figura 9 mostra que à Cepa 1-25 produz um aumento de 4,1 g/L no título de etanol em relação à Cepa 1 no mosto de milho em 47 horas.
[00204] A Figura 10 mostra que a cepa 1-25 produz uma redução de 4,3 g/L no título de glicerol em relação à cepa 1 no mosto de milho. À Figura 10B mostra que a glicose residual no final da fermentação (47 horas) no mosto de milho é inferior a 1,5 g/L.
[00205] A cepa 1-25 exibe título de etanol melhorado e título de gli- cerol diminuído, sem um impacto negativo na taxa de fermentação.
[00206] Exemplo 6. Comparação da superexpressão do gene gapN de B. cereus no lócus GPP1 ou lócus DLD1 em uma variedade de cepas de levedura com glicoamilase ativada no mosto de milho.
[00207] Oimpacto da superexpressão do gene gapN de B. cereus no lócus GPP1 (Cepa 1-22, 1-23, 1-24, e 1-25) ou lócus DLD1 (Cepa 1-27, 1-28 e 1-29) em uma cepa de levedura com glicoamilase ativada foi comparada com o mosto de milho como descrito no Teste %1. As cepas de teste (Cepas 1-22, 1-23, 1-24, 1-25, 1-27, 1-28 e 1-29) foram com- paradas às cepas parentais (Cepas 1-7, 1-11, 1-15 e 1-19) e uma cepa de tipo selvagem (Cepa 1).
[00208] A adição de gapN de B. cereus em ambos os lócus GPP1 e lócus DLD1 resultou na redução do título de glicerol entre 3,1 9g/kg e 3,9 g/kg, dependendo do cenário anterior de glicoamilase (Figura 11). Em geral, as cepas que continham gapN, independentemente do local de integração, demonstraram aumentos no título de etanol em relação à respectiva cepa parental e em comparação com a cepa do tipo selva- gem (Cepa 1) (Figura 12). O aumento do título de etanol foi de pelo me- nos 1,4 g/kg em todas as cepas, exceto para a Cepa 1-23. Enquanto a cepa 1-23 demonstrou uma redução de glicerol de 3,1 g/kg em compa- ração com a cepa parental de controle (Cepa 1-7), os títulos de etanol foram semelhantes. A Cepa 1-29 apresentou o maior aumento no título de etanol em relação à Cepa 1, com um aumento de 3,5 g/kg (138,2 g/kg - 134,7 9/kg).
[00209] Estes dados indicam que a adição de GAPN no lócus GPP1 ou no lócus DLD1 resulta no aumento dos títulos de etanol no final da fermentação, conforme definido pelo Teste £1. Exemplo 7: Testes e Ensaios Teste 1: Caracterização das cepas em mosto de milho 33% DS a 33,3ºC
[00210] As cepas foram colocadas em uma placa YPD e incubadas a 30ºC até que colônias isoladas fossem visíveis (1-2 dias). As células de uma placa YPD foram raspadas em tampão de fosfato estéril pH 7,0 e a densidade óptica (O D600) foi medida. A densidade óptica é medida no comprimento de onda de 600 nm com um comprimento de trajeto de 1 cm usando um modelo Genesys 20 Visible Spectrophotometer (Thermo Scientific). Um frasco de agitação é inoculado com o volume da emulsão de células necessário para atingir uma OD600 inicial de 0,1. O volume de inoculação é tipicamente de cerca de 66 ul. Imediata- mente antes da inoculação, os seguintes materiais foram adicionados a cada balão de Erlenmeyer de 250 ml: 50 gramas de mosto de milho liquefeito, 190 ul de ureia esterilizada por filtração 500 g/L e 2,5 ul de um concentrado esterilizado por filtração de ampicilina 100 mg/ml. Para os frascos de agitação que contêm a cepa de controle Ethanol Red&O
(Cepa 1), uma quantidade de glicoamilase (Spirizyme Fuel HSTY No- vozymes; lote NAPM3771) para atingir uma dose de 0,33 AGU/g de Só- lidos Secos é adicionada aos frascos, e 0,0825 AGU/g de Sólidos Secos (ou 25% da dose fornecida a Ethanol RedG&) de glicoamilase (S pirizyme Fuel HSTY Novozymes; lote NAPM3771) é adicionada aos frascos que contêm a levedura que expressa a glicoamilase. A atividade da glicoa- milase é medida usando o Ensaio de Atividade da Glicoamilase (descrito abaixo). Pelo menos frascos em duplicata para cada cepa foram incu- bados a 33,3ºC com agitação em um agitador orbital a 100 rpm por aproximadamente 48 horas. Em 48 horas, amostras de 1ml foram reti- radas e analisadas quanto às concentrações de etanol e glicose no caldo por cromatografia líquida de alto desempenho com detector de Índice de refração.
Teste 2: Caracterização das cepas em mosto de milho 33% DS à 33,3ºC (TESTE 42)
[00211] As cepas foram colocadas em uma placa YPD e incubadas a 30ºC até que colônias isoladas fossem visíveis (1-2 dias). As células de uma placa YPD foram raspadas em tampão de fosfato estéril pH 7,0 e a densidade óptica (O D600) foi medida. A densidade óptica é medida no comprimento de onda de 600 nm com um comprimento de trajeto de 1 cm usando um modelo Genesys 20 Visible Spectrophotometer (Thermo Scientific). Um frasco de agitação é inoculado com o volume da emulsão de células necessário para atingir uma OD600 inicial de 0,1. O volume de inoculação é tipicamente de cerca de 66 ul. Imediata- mente antes da inoculação, os seguintes materiais foram adicionados a cada balão de Erlenmeyer de 250 ml: 50 gramas de mosto de milho liquefeito, 190 ul de ureia esterilizada por filtração 500 g/L e 2,5 ul de um concentrado esterilizado por filtração de ampicilina 100 mg/ml. Para os frascos de agitação que contêm a cepa de controle Ethanol Red&O
(Cepa 1), uma quantidade de glicoamilase (Spirizyme Fuel HSTY No- vozymes; lote NAPM3771) para atingir uma dose de 0,33 AGU/g de Só- lidos Secos é adicionada aos frascos, e 0,0825 AGU/g de Sólidos Secos (ou 25% da dose fornecida a Ethanol RedG&) de glicoamilase (S pirizyme Fuel HST" Novozymes; lote NAP M 3771) é adicionada aos frascos que contêm a levedura que expressa a glicoamilase. A atividade da glicoa- milase é medida usando o Ensaio de Atividade da Glicoamilase (definido abaixo). Pelo menos frascos em duplicata para cada cepa foram incu- bados a 33,3ºC com agitação em um agitador orbital a 100 rpm por aproximadamente 48 horas. Em 48 horas, amostras de 1ml foram reti- radas e analisadas quanto às concentrações de etanol e glicose no caldo por cromatografia líquida de alto desempenho com detector de Índice de refração. Teste 3: Cálculo do Rendimento
[00212] A equação para o Rendimento do Etanol pode ser definida como: (Título do Etanol no Tempo final - Título do Etanol no tempo zero) dividido por TGE no Tempo zero. Rendimento de — Titulo de Etanol em Trnai - Titulo de Etanol em T zero x 10 Etanol (%) Equivalentes Totais Glicose em T zero
[00213] Ao calcular a diferença de rendimento entre uma cepa de re- dução de glicerol e uma cepa de controle, o rendimento de etanol da cepa de controle é subtraído do rendimento de etanol da cepa de redu- ção de glicerol. Por exemplo, a Cepa 1-24 e a Cepa 1 foram corridas em uma fermentação com mosto de milho conforme descrito no Teste *
1. Foi determinado que o meio de partida tinha um valor de TGE de 280 g/kg de glicose e havia O g/kg de etanol. Com 48 horas, o caldo de fer- mentação foi medido por HPLC e foi determinado que a Cepa 1-24 atin- giu um título de etanol final de 130 9g/kg e a Cepa 1 atingiu um título de etanol final de 128 9g/kg. Com base no cálculo do rendimento acima,
pode ser determinado que a cepa 1-24 teve um rendimento de etanol de 46,4% (130 g/kg de etanol dividido por 280 g/kg de TGE) e a cepa 1 teve um rendimento de etanol de 45,7% (128 g/kg de etanol dividido por 280 g/kg de TGE). Ao usar o rendimento de etanol da cepa 1-24 (46,4%) e subtrair o rendimento de etanol da cepa 1 (45,7%), pode-se dizer que a cepa 1-24 tem um rendimento de 0,7% maior que a cepa 1.
[00214] Teste 4: Avaliação de cepas de Saccharomyces cerevi- siae geneticamente modificadas em um ensaio de fermentação e sacarificação simultâneas (SSF) em frasco de agitação.
[00215] As cepas foram colocadas em uma placa ScD-ura e incuba- das a 30ºC até que colônias isoladas fossem visíveis (2-3 dias). As cé- lulas da placa ScD-ura foram raspadas em meio de frasco de agitação estéril e a densidade óptica (OD600) foi medida. A densidade óptica é medida em um comprimento de onda de 600 nm com um comprimento de trajeto de 1 cm usando um espectrofotômetro modelo Genesys 20 (Thermo Scientific). Um frasco de agitação é inoculado com a emulsão de células para atingir uma OD600 inicial de 0,1. Imediatamente antes da inoculação, 50 mL de meio do frasco de agitação foram adicionados a um balão de Erlenmeyer de 250 ml com air-lock contendo 4 ml de óleo de canola esterilizado. O meio do frasco de agitação consistia em 7259 de amido de milho parcialmente hidrolisado, 150g de água de infusão leve esterilizada por filtração (0,2 um), 10 g de água, 25 g de glicose e 1 g de ureia. As cepas foram incubadas a 30ºC com agitação em um agitador orbital a 100 rpm por 72 horas. Amostras foram retiradas e ana- lisadas quanto às concentrações de metabolitos no caldo no final da fermentação por HPLC. Ensaio de Atividade de Glicoamilase
[00216] A atividade da glicoamilase (AGU) se refere à quantidade de enzima que hidrolisa 1 micromol de maltose por minuto nas condições de reação padronizadas. As seguintes soluções concentradas foram preparadas: i) solução concentrada 10X de maltose (232 mM); e ii) um concentrado 2X de tampão acetato de Na pH 4,3 (200 mM). Uma dilui- ção de 1:10 do concentrado de glicoamilase foi usada como material de partida e diluída a partir daí (0,899 g de água + 0,140 g de glicoamilase =1,0139 g no total). Diluições seriadas (1:1) foram feitas em água, tota- lizando seis diluições na série, começando com a diluição 1:10 original.
[00217] Emum volume de reação de 200 ul, os seguintes componen- tes foram adicionados em ordem: 100 ul de tampão acetato de Na pH 4,3, 20 ul de uma solução 10X concentrada de maltose (ou água no controle em branco) e 70 ul de água. A reação foi pré-aquecida a 37ºC antes de adicionar 10 ul das soluções de enzima diluídas. Após-5 minu- tos a 37ºC, a reação foi extinta com 15 ul de H2S O4 concentrado. A con- centração de glicose foi determinada usando HPLC, e a atividade da enzima foi determinada usando o seguinte cálculo:
1. A concentração de glicose (gramas/litro) no final da reação foi dividida pelo Peso Molecular da glicose (180,156 gramas/mol ) para obter uma Concentração molar (mol/litro) de glicose.
2. A Concentração molar foi multiplicada pelo volume total da reação (215 ul), para se obter a concentração micromolar de glicose.
3. Os micromoles de glicose calculados na Etapa Dois (acima) foram divididos por 2 para contabilizar a maltose que serve como substrato na reação (2 Glicose = 1 Maltose). Este número foi dividido pelos gramas da enzima usados no próprio ensaio. A diluição mais baixa foi feita con- forme descrito acima, 0,140 g em 1,1039 g de água, então multiplicando esta diluição pela diluição do ensaio (10 ul de enzima divididos por 215 ul de volume total).
[00218] Porexemplo, uma reação que contém os componentes lista- dos acima retornou uma concentração de glicose por HPLC de 4,2 gra- mas por litro e a atividade da enzima foi determinada ser 312,7 AGU/g. Tabela 3: Exemplo de ensaio de atividade de amilase
Firm Rr
[00219] Teste 5: Caracterização de cepas em mosto de milho 33% DS a 33,3ºC em tubos cônicos de 50 ml
[00220] As cepas foram colocadas em uma placa YPD e incubadas a 30ºC até que colônias isoladas fossem visíveis (1-2 dias). As células de uma placa YPD foram raspadas em tampão de fosfato estéril pH 7,0 e a densidade óptica (OD600) foi medida. A densidade óptica foi medida em um comprimento de onda de 600 nm com um comprimento de trajeto de 1 cm usando um modelo Genesys 20 Visible Spectrophotometer (Thermo Scientific). Um tubo cônico de 50 ml equipado com um filtro de 0,2 um (filtro de seringa Nalgene, Thermo Scientific; número de catá- logo: 727-2020) foi inoculado com o volume da emulsão de células ne- cessário para atingir um OD600 inicial de 0,1. O volume de inoculação foi tipicamente em torno de 26 ul. Imediatamente antes da inoculação, os seguintes materiais foram adicionados a cada tubo cônico de 50 ml (Fisher Scientific; número de catálogo: 05-539-13): 20 gramas de mosto de milho liquefeito, 76 ul de 500g/L de ureia esterilizada por filtração e 1 ul de um estoque esterilizado por filtro de 100 mg/ml de ampici- lina. Para os frascos de agitação contendo a cepa de controle Ethanol Red, uma quantidade de glicoamilase (Spirizyme Fuel HSTY No- vozymes; lote NAPM3771) para obter uma dose de 0,33 AGU/g de Só- lidos Secos foi adicionada aos frascos e 0,0825 AGU/g de Sólidos Se- cos (ou 25% da dose fornecida de Ethanol RedG) de glicoamilase (S pi- rizyme Fuel HST" Novozymes) foi adicionado aos frascos contendo a levedura que express a glicoamilase. A atividade da glicoamilase foi me- dida usando o Ensaio de Atividade da Glicoamilase (descrito acima). Frascos em duplicata para cada cepa foram incubados a 33,3ºC com agitação em um agitador orbital a 100 rom por aproximadamente 48 horas. Em 48 horas, amostras de 1 ml foram coletadas e analisadas quanto as concentrações de etanol e glicose no caldo por cromatografia líquida de alto desempenho com um detector de índice de refração.
EQUIVALENTES
[00221] Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capa- zes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção aqui des- critas. Tais equivalentes são pretendidos ser abrangidos pelas reivindi- cações a seguir.
[00222] Todas as referências, incluindo documentos de patentes, descritos neste documento são incorporados por referência em sua to- talidade, particularmente para a descrição aqui referenciada.

Claims (1)

  1. U7
    REIVINDICAÇÕES
    1. Levedura manipulada, caracterizada pelo fato de que com- preende: um ácido nucleico recombinante que codifica uma gliceralde- ído-3-fosfato desidrogenase (EC 1.2.1.9); expressão reduzida ou elimi- nada de um gene que codifica uma glicerol-3-fosfato fosfatase (EC
    3.1.3.21); e um ácido nucleico recombinante que codifica uma glicoami- lase, em que a levedura é capaz de produzir pelo menos 100 g/kg de etanol e produzir menos do que 1,5 g/kg de glicose residual em 48 horas sob condições do Teste 1.
    2. Levedura modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a levedura é uma espécie de levedura de duplicação pós-genoma completo.
    3. Levedura manipulada de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a levedura é Saccharomyces cerevisiae.
    4. Levedura manipulada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a levedura manipu- lada produz um rendimento de etanol que é pelo menos 0,5% maior do que uma cepa de controle.
    5. Levedura manipulada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a levedura manipu- lada produz 30% menos glicerol, 40% menos glicerol ou 50% menos glicerol do que uma cepa de controle.
    6. Levedura manipulada de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a produção de glicerol é determinada pelo Teste 4.
    7. Levedura manipulada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a glicoamilase (GA) tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, em pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 38 (Sac- charomycopsis fibuligera GA).
    8. Levedura manipulada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a glucoamilase (GA) tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 39 (Rhizopus oryzae amyA).
    9. Levedura manipulada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a glucoamilase (GA) tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 (Rhizopus microsporus GA).
    10. Levedura manipulada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a glicoamilase (GA) tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 40 (Rhizopus delemar GA).
    11. Levedura Saccharomyces cerevisiae manipulada, carac- terizada pelo fato de que compreende: um ácido nucleico recombinante que codifica uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (EC 1.2.1.9); e expressão reduzida ou eliminada de um gene que codifica uma glicerol- 3-fosfato fosfatase (EC 3.1.3.21), em que a levedura é capaz de produzir pelo menos 100 g/kg de etanol e produzir menos de 1,5 g/kg de glicose residual em 48 horas sob as condições do Teste 2.
    12. Levedura Saccharomyces cerevisiae manipulada de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a leve- dura manipulada produz um rendimento de etanol que é pelo menos 0,5% maior do que uma cepa de controle.
    13. Levedura Saccharomyces cerevisiae manipulada de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizada pelo fato de que a levedura manipulada produz 30% menos glicerol, 40% menos glicerol ou 50% menos glicerol do que uma cepa de controle.
    14. Levedura manipulada de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a produção de glicerol é determinada pelo Teste 4.
    15. Levedura manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizada pelo fato de que a glicoamilase (GA) tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, em pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 38 (Saccharomycopsis fibuligera GA).
    16. Levedura manipulada de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizada pelo fato de que a glicoamilase (GA) tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 39 (Rhizopus oryzae amyA).
    17. Levedura manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizada pelo fato de que a glicoamilase (GA) tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 ( Rhizopus microsporus GA).
    18. Levedura manipulada de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizada pelo fato de que a glicoamilase (GA) tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 40 (Rhizopus delemar GA).
    19. Levedura manipulada caracterizada pelo fato de que compreende um ácido nucleico exógeno que codifica uma gliceraldeído- 3- fosfato desidrogenase (EC 1.2.1.9) e um ácido nucleico exógeno que codifica uma glicoamilase (GA) com 80% ou mais de identidade com a SEQ ID NO: 38 (Saccharomycopsis fibuligera GA), SEQ ID NO: 41 (Rhi- zopus microsporus GA), SEQ ID NO: 40 (Rhizopus delemar GA) ou SEQ
    ID NO: 39 (Rhizopus oryzae amyA), em que a levedura é capaz de pro- duzir pelo menos 100 g/kg de etanol e tem menos do que 1,5 g/kg de glicose residual em 48 horas sob as condições do Teste 1.
    20. Levedura manipulada de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que a levedura é uma espécie de levedura pós-duplicação do genoma completo.
    21. Levedura manipulada de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a levedura é Saccharomyces cerevisiae.
    22. Levedura manipulada de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizada pelo fato de que a levedura mani- pulada produz um rendimento de etanol que é pelo menos 0,5% maior do que uma cepa de controle.
    23. Levedura manipulada de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, caracterizada pelo fato de que a levedura mani- pulada produz 30% menos glicerol, 40% menos glicerol ou 50% menos glicerol do que uma cepa de controle.
    24. Levedura manipulada de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a produção de glicerol é determinada pelo Teste 4.
    25. Levedura manipulada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (EC 1.2.1.9) tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo me- nos pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:
    45.
    26. Levedura manipulada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (EC 1.2.1.9) co- difica uma proteína que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ
    ID NO: 42.
    27. Levedura manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizada pelo fato de que a levedura mani- pulada compreende um ácido nucleico que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de se- quência com a SEQ ID NO: 59.
    28. Levedura manipulada de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 24, caracterizada pelo fato de que a levedura mani- pulada reduz ou elimina a expressão de um gene que codifica uma gli- cerol-3-fosfato fosfatase (EC 3.1.3.21).
    29. Levedura manipulada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizada pelo fato de que a levedura mani- pulada reduz ou elimina a expressão de uma glicerol-3-fosfato desidro- genase (EC 1.1.1.8).
    30. Levedura manipulada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizada pelo fato de que a levedura mani- pulada é Saccharomyces cerevisiae e em que a levedura manipulada reduz ou elimina a expressão de GPP1.
    31. Levedura manipulada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizada pelo fato de que a levedura mani- pulada é Saccharomyces cerevisiae e em que a levedura manipulada reduz ou elimina a expressão de GPP2.
    32. Levedura manipulada de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 31, caracterizada pelo fato de que a levedura mani- pulada é Saccharomyces cerevisiae e em que a levedura manipulada reduz ou elimina a expressão de GPD1.
    33. Levedura manipulada de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 32, caracterizada pelo fato de que a levedura mani- pulada é Saccharomyces cerevisiae e em que a levedura manipulada reduz ou elimina a expressão de GPD?2.
    34. Levedura manipulada de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 32, caracterizada pelo fato de que a levedura mani- pulada é Saccharomyces cerevisiae e em que a levedura manipulada reduz ou elimina a expressão de GPP1, GPP2, GPD1 ou GPD?2.
    35. Levedura manipulada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ácido nucleico que codifica uma trealose-6-fosfato sintase (Tps1; E.C. 2.4.1.15).
    36. Levedura manipulada de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica uma trea- lose-6-fosfato sintase (Tps1; E.C. 2.4.1.15) tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% identidade de se- quência com a SEQ ID NO: 55.
    37. Levedura manipulada de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica uma trea- lose-6-fosfato sintase (Tps1; E.C. 2.4.1.15) codifica uma proteína que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 43.
    38. Levedura manipulada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ácido nucleico que codifica uma trealose-6-fosfato sintase (Tps2; E.C. 3.1.3.12).
    39. Levedura manipulada de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica uma trea- lose-6-fosfato sintase (Tps2; E.C. 3.1.3.12) tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% identidade de se- quência com a SEQ ID NO: 56.
    40. Levedura manipulada de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica uma trea- lose-6-fosfato sintase (Tps2; E.C. 3.1.3.12) codifica uma proteína que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44.
    41. Método para produzir etanol, caracterizado pelo fato de que compreende a fermentação da levedura como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 40 com um substrato de fermentação.
    42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o substrato de fermentação compreende amido.
    43. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o substrato de fermentação compreende glicose.
    44. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o substrato de fermentação compreende sacarose.
    45. Método de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o amido é obtido a partir de milho, trigo e/ou mandioca.
    46. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 45, caracterizado pelo fato de que inclui a suplementação com gli- coamilase.
    47. Método para produzir trealose, caracterizado pelo fato de que compreende a fermentação da levedura, como definida em qual- quer uma das reivindicações 35 a 40 com um substrato de fermentação.
BR112020019257-0A 2018-03-27 2019-03-27 Métodos para produção de etanol usando levedura manipulada BR112020019257A2 (pt)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN111971379A (zh) 2018-02-28 2020-11-20 嘉吉公司 葡糖淀粉酶工程化酵母和发酵方法
CA3163108A1 (en) 2019-11-29 2021-06-03 Lallemand Hungary Liquidity Management Llc Yeast expressing heterologous glucoamylase
US20230034069A1 (en) * 2019-12-23 2023-02-02 Cargill, Incorporated Fermentation method and uses thereof
CA3175633A1 (en) * 2020-04-17 2021-10-21 Danisco Us Inc. Glucoamylase and methods of use thereof
EP4352241A1 (en) 2021-06-07 2024-04-17 Novozymes A/S Engineered microorganism for improved ethanol fermentation
WO2023064905A1 (en) * 2021-10-15 2023-04-20 Danisco Us Inc. Glucoamylase variants and methods for use thereof
WO2024040001A1 (en) * 2022-08-17 2024-02-22 Cargill, Incorporated Genetically modified yeast and fermentation processes for the production of ethanol

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61141890A (ja) * 1984-12-15 1986-06-28 Suntory Ltd アルコ−ルの製造法
ES2563040T3 (es) * 2007-12-23 2016-03-10 Gevo, Inc. Organismo de levadura que produce isobutanol a un alto rendimiento
BR112013025753A8 (pt) * 2011-04-05 2018-06-12 Lallemand Hungary Liquidity Man Llc Métodos para aprimoramento do rendimento de produto e produção em um micro-organismo através da adição de aceptores de elétrons alternativos
WO2014180820A2 (en) * 2013-05-08 2014-11-13 Dsm Ip Assets B.V. Gpd- yeast strains with improved osmotolerance
WO2016160584A1 (en) * 2015-03-27 2016-10-06 Cargill, Incorporated Glucoamylase-modified yeast strains and methods for bioproduct production
CN110582567B (zh) * 2017-05-04 2024-03-08 嘉吉公司 经遗传修饰的表达海藻糖酶的酵母及使用此类经遗传修饰的酵母的发酵方法

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