BR112020019131A2

BR112020019131A2 - Placa de análise de reação em cadeia da polimerase de alta velocidade

Info

Publication number: BR112020019131A2
Application number: BR112020019131-0A
Authority: BR
Inventors: Han Oh Park; Jong Kab Kim; Yang Won Lee; Sang Ryoung Park
Original assignee: Bioneer Corporation
Priority date: 2018-03-23
Filing date: 2019-03-22
Publication date: 2021-01-12
Also published as: CN112041073A; KR102105558B1; KR20190111588A; JP7177173B2; EP3769841A1; JP2021516552A; EP3769841A4; US20210053059A1; WO2019182407A1

Abstract

A presente invenção se refere à estrutura de uma placa de análise aplicada a uma reação em cadeia da polimerase de alta velocidade (PCR) e a uma placa de análise de PCR usada para implantar uma análise de uma PCR em tempo real, uma PCR aninhada em tempo real e uma reação de hibridização de fluxo lateral pós-PCR. A presente invenção é dotada de: uma válvula de retenção para possibilitar o mantimento de uma pressão positiva quando um filme elástico se expande em uma forma convexa tendo-se uma solução empurrada na mesma pela pressão positiva; um módulo de análise de fluxo lateral para analisar uma PCR de acompanhamento pós-PCR ou fluxo lateral; e uma válvula de fechamento que possibilita o controle do movimento da solução após cada reação terminar. Uma placa de análise de PCR de alta velocidade pode ser fornecida, pela qual, por pressão, por meio de um bloco de aquecimento controlável por temperatura, o filme elástico, que está em uma forma convexa pela solução, de uma unidade de PCR, uma solução de PCR pode ser submetida à rápida circulação de temperatura com mínima resistência ao calor, e um material seco por PCR e uma solução de ácido nucleico podem ser homogeneizados e misturados.

Description

PLACA DE ANÁLISE DE REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

DE ALTA VELOCIDADE [Campo da Técnica]

[001] A presente invenção refere-se a uma placa de análise de reação em cadeia da polimerase (PCR) que é formada fornecendo-se uma unidade de PCR, um canal de fluxo, uma válvula, e uma unidade de análise de fluxo lateral em um substrato de polímero e fundindo-se um filme elástico para possibilitar que a PCR de circulação de temperatura seja realizada em alta velocidade e tenha capacidade para transferir rapidamente o calor a uma solução de PCR através do filme elástico. Mais particularmente, a presente invenção se refere a uma placa de análise de PCR de alta velocidade que, quando usada, possibilita que uma reação de PCR em tempo real e uma reação de PCR aninhada em tempo real sejam realizadas e um ensaio de fluxo lateral com o uso de papel com sondas de ácido nucleico fixadas e semelhantes seja realizado após ambas as reações de PCR e, desse modo, seja usável para verificar rapidamente os resultados de amplificação-alvo. [Técnica Anterior]

[002] A tecnologia de diagnóstico de PCR de ponto de cuidado (POC) com capacidade para diagnosticar rapidamente os pacientes está atraindo atenção, visto que é uma tecnologia muito importante para a medicina de precisão com base em evidência e avançou grandemente devido ao desenvolvimento de vários marcadores de ácido nucleico e tecnologias de detecção de marcador de ácido nucleico de alta velocidade.

[003] Muitos métodos de detecção de marcador de ácido nucleico usados em diagnóstico molecular usam uma reação em cadeia da polimerase (doravante denominada como PCR). Desde que foi inventada por Kary Mullis em 1985, a PCR pode amplificar DNA específico rápida e facilmente e assim identificar se uma quantidade vestigial de DNA/RNA específico está presente em uma amostra biológica e, desse modo, a mesma foi amplamente usada para diagnosticar infecções microbianas patogênicas, como infecções virais. Além disso, PCR torna possível analisar quantitativamente o número de ácidos nucleicos patogênicos com alta precisão por um método, como PCR quantitativa (qPCR, PCR em tempo real) e assim medir precisamente a concentração de vírus, como HIV, HCV e HBV no sangue. Portanto, PCR foi amplamente usada para diagnóstico molecular quantitativo para monitorar um efeito terapêutico ou semelhantes.

[004] A fim de realizar a PCR descrita acima, é necessário que, após um processo de extração de ácido nucleico de remoção, de uma amostra biológica, de materiais que inibem a PCR da amostra biológica e extração de ácidos nucleicos puros ser realizado, uma solução de PCR que contém os ácidos nucleicos extraídos e um iniciador/sonda sejam preparados e inseridos em um recipiente de reação e, subsequentemente, o recipiente de reação seja submetido à circulação de temperatura para amplificar os ácidos nucleicos-alvo. Além disso, a fim de medir quantitativamente um produto de PCR, é necessário que um dispositivo de medição de quantidade de fluorescência para medir, em tempo real, a fluorescência gerada proporcional ao produto de PCR que é amplificado seja fornecido.

[005] A fim de identificar rapidamente um patógeno infeccioso do paciente entre muitos patógenos relacionados aos sintomas clínicos durante o diagnóstico molecular, um método de teste de multiplexação com capacidade para testar simultaneamente um grande número de alvos é necessário. A fim de detectar qualitativamente um grande número de alvos, é necessário que, após uma reação de PCR de multiplexação, uma reação de PCR aninhada em tempo real ou um ensaio de fluxo lateral com o uso de papel com várias sondas fixadas seja realizado.

[006] Recentemente, através de pesquisa e desenvolvimento, foram desenvolvidos vários sistemas automatizados em que os processos inteiros de extração de ácido nucleico, PCR e processos de detecção de produto de reação são automatizados e que, desse modo, permitem até mesmo que as pessoas que não têm um alto grau de conhecimento profissional usem facilmente PCR e dispositivos com o uso dos sistemas automatizados. Entretanto, os dispositivos existentes são complexos, dispendiosos e ainda têm um longo tempo de processamento, para que haja uma demanda por uma técnica com capacidade para realizar rápida e economicamente a PCR e analisar quantitativa ou qualitativamente um grande número de alvos de maneira completamente automatizada. Mais especificamente, há uma demanda por um recipiente de PCR econômico inovador com capacidade para reduzir significativamente um tempo de circulação de temperatura de PCR e analisar quantitativa ou qualitativamente um grande número de alvos.

[007] Embora 0,5 ml de recipientes de reação tenham sido usados nos últimos estágios de desenvolvimento de tecnologia de PCR, o equipamento de PCR comum e amplamente usado no presente usa recipientes de PCR de 0,2 ml para reduzir um tempo de circulação de temperatura. Entretanto, quando esse equipamento é usado, visto que leva cerca de uma a duas horas para circular a temperatura para PCR, os métodos que possibilitam PCR mais rápida e mais precisa para diagnóstico em sítio têm sido continuamente desenvolvidos (Lab Chip, 2016, 16, 3.866 a 3.884).

[008] O princípio de PCR é conforme o seguinte. Após um DNA de dupla hélice ser separado em fitas simples aquecendo-se a uma temperatura de 95 °C ou mais, uma solução de PCR é resfriada até a temperatura de anelamento de modo que os iniciadores contidos na solução de PCR, que são complementares a qualquer extremidade do sítio a ser amplificado, sejam seletivamente hibridizados nas extremidades e, então, uma reação em que uma DNA polimerase conecta sequencialmente quatro tipos de nucleosídeo trifosfatos, A, G, T, e C, de maneira que seja complementar a cada uma das fitas únicas e, assim, duplas hélices sejam formadas, é realizada repetidamente. Em laboratórios, a reação é causada realizando- se 30 a 45 ciclos (n) de aquecimento e resfriamento repetidos de uma solução de PCR, de modo que uma dupla hélice de DNA específico seja exponencialmente amplificada para 2n duplas hélices. A PCR para detectar RNA é realizada após sintetizar primeiro cDNA com o uso de uma transcriptase reversa, e o cDNA é amplificado através de PCR e analisado quantitativamente.

[009] Vários métodos foram desenvolvidos para analisar ácidos nucleicos alvo amplificados após a PCR. O primeiro método desenvolvido incluiu separar produtos de reação de acordo com o tamanho de DNA através de eletroforese que é comumente usada em laboratórios de genética e, então, confirmar se o DNA alvo amplificado é DNA do tamanho de interesse. Entretanto, esse método necessitou de um processo de eletroforese complexo adicional após PCR e teve um tempo de análise longo e, quando o experimento de PCR é repetido, como no caso de testes diagnósticos, o DNA alvo pode vazar e contaminar o laboratório durante o processo de eletroforese, e isso pode resultar em falsos positivos em experimentos de PCR subsequentes. Além disso, visto que os produtos de reação final foram analisados em ou após o 30º ciclo, diferente do caso de menos tipos de alvos, em que os alvos foram continuamente amplificados até todos os ciclos de PCR serem completados, quando há muitos tipos de DNA alvo, dNTPs foram usados e, desse modo, a reação de amplificação foi prematuramente terminada, tornando impossível quantificar concentrações iniciais de alvos através da análise mediante conclusão de ciclos de PCR.

[010] Como um método com capacidade para resolver tanto o problema de quantificação quanto o problema de contaminação causado por produtos de PCR, um método de PCR quantitativa em tempo real foi desenvolvido. Na PCR quantitativa em tempo real que tem capacidade para analisar quantitativamente os ácidos nucleicos alvo, materiais com capacidade para emitir fluorescência proporcionalmente aos fragmentos de DNA alvo a serem amplificados são adicionados a uma solução de PCR e, então, a fluorescência é medida em tempo real para cada ciclo para identificar o ciclo em que um nível de fluorescência crítica é detectado. Dessa maneira, é possível medir quantitativamente as concentrações iniciais de ácidos nucleicos alvo inseridos no recipiente de reação. Como o método de PCR quantitativa em tempo real, um método para usar um corante fluorescente que emite a fluorescência ligando-se a uma dupla hélice de DNA a ser amplificada e um método de sonda fluorescente mais preciso, em que a sonda fluorescente emite a fluorescência hibridizando-se especificamente para uma sequência de ácido nucleico amplificada, foi desenvolvido. O método para usar uma sonda fluorescente específica para uma sequência de ácido nucleico foi desenvolvido em uma tecnologia potente com capacidade para analisar quantitativamente todos dentre cinco a seis alvos diferentes em uma solução de reação.

[011] O diagnóstico molecular avançou na direção de possibilitar o teste de todos os patógenos que causam a doença em uma vez com base em sintomas clínicos e assim identificar a causa exata da doença em uma vez. Embora a PCR quantitativa em tempo real tenha capacidade para detectar cinco alvos ao mesmo tempo, visto que há muitos tipos de patógenos que causam sintomas similares, como no caso de doenças respiratórias ou sexualmente transmitidas, há uma demanda continuamente crescente para técnicas de detecção de multiplexação que possibilitam a detecção simultânea de 10 ou mais ou 20 ou mais alvos. Como um método para analisar um grande número de alvos, um método de PCR de multiplexação foi desenvolvido. No método de PCR de multiplex, um par de iniciadores com capacidade para amplificar um grande número de DNA alvo é adicionado a uma solução de reação e usado para amplificação. Entretanto, visto que esse método pode induzir amplificação não específica devido à interação dos iniciadores ou semelhantes, um método de análise incluindo um processo de verificação adicional foi desenvolvido.

[012] Como um método para aumentar a precisão desses testes de multiplexação e realizar convenientemente os testes em uma vez, um método para realizar PCR de multiplexação para um grande número de alvos e, então, realizar de modo secundário a PCR aninhada em tempo real com o uso de um corante fluorescente foi desenvolvido por BioFire Diagnostics (FilmArray®). Embora esse método forneça a conveniência para detectar dúzias ou mais alvos ao mesmo tempo, o método tem as limitações de levar cerca de uma hora e necessitar de um processo para dissolver reagentes em água antecipadamente, e é realizado com o uso de equipamento dispendioso e kits de teste.

[013] Como outro método de realizar, após a PCR de multiplexação, uma reação de hibridização em um arranjo em que vários alvos são fixados e detectar a fluorescência, muitos métodos com capacidade para identificar, com o uso de um microarranjo de DNA após PCR, DNA alvo amplificado hibridizado com sondas afixadas a localizações específica foram desenvolvidos. Adicionalmente, um método com o uso de placas de 96 poços incluindo sondas fixadas ao fundo das placas de 96 poços foi desenvolvido. Embora ainda outro método de análise que usa hibridização com microesferas de código de barra fluorescente às quais as sondas de DNA específico são afixadas tenha sido desenvolvido por Luminex Corporation, esse método tem um tempo de análise relativamente longo, e a operação é complicada.

[014] Como um método de detecção alvo de multiplexação que é menos dispendioso e fácil de usar, um método de detecção de ácido nucleico alvo com capacidade para realizar, após PCR, a hibridização com o uso de uma tira de fluxo lateral, lavagem e semelhantes como um processo único em cerca de 10 minutos e é econômico foi desenvolvido (Mao X et al. Anal Chem. 15 de fevereiro de 2009;81(4):1.660 a 1.668. doi: 10.1021/ac8024653). A fim de testar comercialmente um número grande de alvos com o uso do mesmo princípio, os kits de genotipagem INNO-LiPA™ HPV com capacidade para testar 32 tipos de genótipos e semelhantes foram desenvolvidos. Entretanto, no caso de tais produtos comerciais, visto que uma reação é executada por uma ou duas horas com o uso de um tubo de PCR geral e, então, os produtos de reação são testados, a manipulação é complicada e demorada, e pode haver um problema de falsos positivos causados pela contaminação de produtos de PCR.

[015] Para RCR de POC que possibilita o diagnóstico em sítio imediato, acima de tudo, é necessário mudar rapidamente a temperatura de uma solução de PCR. Além disso, a fim de amplificar seletivamente apenas os alvos desejáveis através de PCR precisa, é necessário que os iniciadores sejam projetados de modo a serem especificamente hibridizados aos alvos desejáveis, e é necessário que a temperatura de anelamento seja precisamente controlada durante a PCR circulação de temperatura.

[016] Conforme descrito acima, muitas técnicas têm sido desenvolvidas para circular termicamente uma solução de PCR em velocidade mais alta. Os métodos desenvolvidos podem ser grandemente classificados em métodos em que uma solução de PCR é movida entre espaços e métodos diferentes em que uma solução de PCR é submetida à circulação de temperatura de diferença de tempo. Nos métodos em que uma solução de PCR é movida entre espaços diferentes, um recipiente de reação ou a solução de reação é movido para e faz contato com corpos termoelétricos mantidos em temperaturas constantes e é, assim, rapidamente aquecido ou resfriado. Primeiro, como uma maneira de mover o recipiente de reação, um método para mover uma estante de recipiente de reação de modo que o recipiente de

PCR possa ser repetidamente imerso em um banho de água de alta temperatura e um banho de água de baixa temperatura por um período predeterminado de tempo foi desenvolvido e implantado como um dispositivo de PCR inicial (Turbo Thermalcycler. Bioneer Corp. Daejeon). O equipamento de PCR que circula por um reator entre as zonas de temperaturas diferentes, como tal, emprega o método de mover uma solução de PCR entre espaços diferentes, e tem uma vantagem de que um líquido de uma temperatura específica cuja temperatura já foi precisamente mantida faz contato com, e transfere rápida e precisamente calor para, o recipiente de PCR e causa PCR. Entretanto, o equipamento de PCR tem um problema de que, visto que diversos banhos de água de temperatura constante são necessários, o equipamento é grande e necessita de muito trabalho para manutenção e gerenciamento. Por essa razão, um método para mover uma solução de PCR entre blocos de alumínio diferentes que têm temperaturas constantes em vez de banhos líquidos diferentes foi desenvolvido (RoboCycler® Stratagene, San Diego). Entretanto, visto que esse método transfere o calor através do contato sólidos, há um problema em que a resistência térmica pode mudar devido à poeira fina, e é difícil de operar em alta velocidade.

[017] Como um método para mover uma solução de PCR entre espaços diferentes para PCR rápida, foram desenvolvidos métodos para circular a temperatura de uma solução de PCR movendo-se a solução de PCR entre espaços diferentes que, permitindo-se apenas que a solução de PCR em vez de um recipiente de PCR se mova rapidamente entre zonas de temperaturas diferentes através de um canal de microfluxo, possibilita a circulação de temperatura rápida da solução de

PCR sem a capacidade de calor de um recipiente de reação. Esses métodos podem ser classificados em métodos de reator aberto que permitem que uma solução de PCR flua continuamente com base em primeira entrada, primeira saída (FIFO) e métodos de reator fechado que permite que uma solução de PCR se mova repetidamente entre as zonas de temperaturas diferentes. Como o método de reator aberto, um método para enrolar um tubo capilar em torno de um bloco cilíndrico que tem compartimentos com temperaturas diferentes e permitir que uma solução de PCR flua continuamente através do tubo capilar foi desenvolvido por Nakano et al. em 1994 (Biosci. Biotech. Biochem., 58(2), 349 a 352, 1994). Em 1998, foi confirmado por Kopp et al. que em equipamento de PCR com um canal de microfluxo que permite que uma solução de PCR flua repetidamente entre uma zona de alta temperatura e uma zona de baixa temperatura, a PCR foi realizada fluindo-se uma solução de 10 μl através de 20 ciclos de 4,5 segundos cada um (Science 280 1.046 a 1.048, 1998).

[018] O método de PCR que emprega um método de circulação de temperatura de diferença de tempo é atualmente adotado pelo equipamento de PCR mais amplamente usado em laboratórios, e o equipamento de PCR com o uso de um método de circulação de temperatura de diferença de tempo, que muda a temperatura ao longo do tempo com o uso de um dispositivo Peltier ou semelhantes em um bloco fixado, é responsável pela maior parte de tal equipamento de PCR. A fim de implantar rapidamente o método de circulação de temperatura de diferença de tempo em um recipiente de reação fixado, é necessário que a solução de reação tenha uma grande área de contato com uma fonte de calor em relação à capacidade de calor em comparação com o reator de 0,2 ml geralmente usado em laboratórios e que a resistência térmica no processo de transferir calor da fonte de calor para a solução de PCR seja tão baixa que o calor seja rapidamente transferido.

Com esse propósito, vários recipientes de PCR que têm uma ampla área de troca de calor, como reatores de PCR do tipo tubo capilar (por exemplo, LightCycler 2.0, Roche Life Science), reatores de PCR do tipo placa fina (por exemplo, GeneXpert, Cepheid), e semelhantes, foram desenvolvidos.

Entretanto, esses reatores usam um tempo longo, apesar de ter uma grande área de superfície devido ao fato de os reatores aquecer ou resfriarem com o uso de ar que tem baixo calor específico e, portanto, pode levar 30 minutos para realizar 35 ciclos, e é relativamente difícil de controlar precisamente a temperatura.

No caso de reatores de PCR com capacidade para circular o calor em alta velocidade, embora uma quantidade menor de uma solução de reação seja geralmente usada, devido ao fato de que, quanto menos solução de PCR, menor a quantidade de ácido nucleico alvo introduzida, se torna impossível detectar quantidades vestigiais de patógenos, e portanto, um limite de detecção (LOD) é aumentado.

Portanto, a fim de usar 10 a 50 μl de uma solução de PCR comumente usada em diagnóstico molecular, é necessário que o reator tenha uma área de superfície relativamente grande de modo que o calor possa ser rapidamente transferido.

Nesse aspecto, um caso em que 10 μl de uma solução de PCR foram inseridos em uma depressão de reação superficial que tem um tamanho de 17×15 mm e uma profundidade de 40 a 80 μm feita em uma pastilha de silício e foi coberta com uma placa de vidro para aumentar uma área de troca de calor por unidade de volume (> 100 mm2/10 μl) foi relatado.

Entretanto, nesse caso, visto que um dispositivo Peltier convencional e um bloco de alumínio foram usados, a resistência térmica na transferência de calor para a solução de reação na pastilha de silício foi alta, então, foi necessário muito tempo para aumentar ou diminuir a temperatura da solução de reação, e a mesma teve meramente o efeito de reduzir o tempo tomado para um ciclo para cerca de três minutos (Clin. Chem. 40/9, 1815 a 1818 (1994)).

[019] A fim de resolver os problemas descritos acima, Liat® (Lab-in-a-tube), que emprega um método para mover rapidamente uma solução de PCR entre espaços diferentes e mover a solução de PCR entre dois blocos de temperatura constante através de um tubo de filme, foi desenvolvido. Com esse método, é possível extrair ácidos nucleicos e obter resultados de PCR quantitativa em tempo real em um tão tempo pequeno quanto 15 minutos. Entretanto, visto que uma reação ocorre em um tubo de vinila nesse método, esse método tem uma limitação no teste de múltiplos alvos, e visto que os reagentes devem ser inseridos no tubo, esse método é menos eficaz para produção em massa.

[020] Embora várias estruturas que possibilitam a PCR de POC para em sítio molecular testes diagnósticos tenham sido continuamente inventadas, um reator de PCR de POC de multiplexação econômico que possibilita o teste rápido e completamente automatizado de um grande número de alvos ainda não foi desenvolvido. [Revelação] [Problema da Técnica]

[021] A presente invenção é direcionada a fornecer uma placa de análise de PCR que possibilita que a análise quantitativa ou qualitativa de um grande número de alvos seja rapidamente realizada em sítio através de PCR quantitativa em tempo real. Além disso, a presente invenção é direcionada a fornecer uma placa necessária para PCR aninhada em tempo real, que tem capacidade para detectar rapidamente quantidades vestigiais de alvos em sítio com o uso do mesmo princípio. Além disso, a presente invenção é direcionada a fornecer uma placa de análise de PCR que tem capacidade para realizar PCR de multiplexação para detectar múltiplos alvos, realizar reações de cadeia de extensão de iniciador, e detectar quantidades vestigiais de muitos tipos de alvos através do ensaio de fluxo lateral. A presente invenção foi formulada para resolver os problemas descritos acima, e as placas de análise de PCR descritas acima são placas de PCR econômicas que têm capacidade para circular precisamente a temperatura de uma solução de reação em um tempo curto e são adequadas para produção automatizada.

[022] Além disso, a presente invenção é direcionada ao fornecimento de uma placa de análise de PCR que tem reprodutibilidade excelente, visto que um material seco por PCR em um estado seco em um recipiente de PCR é uniformemente misturado com uma solução de ácido nucleico que é injetada, em que, na placa de análise de PCR, o material seco em um estado seco em um recipiente de PCR inclui um iniciador, uma sonda, e uma ou mais de duas polimerases de ácido nucleico, e a placa de análise de PCR possibilita que a PCR ocorra uniformemente e de modo eficaz dissolvendo-se homogeneamente, em um tempo curto, o material seco em uma solução de ácido nucleico extraída de uma amostra.

[023] Além disso, a presente invenção é direcionada a fornecer uma placa de PCR que tem capacidade para minimizar falsos positivos tendo-se uma estrutura que permite que reagentes de PCR façam com que falsos positivos permaneçam em um espaço fechado sem vazar para fora. [Solução da Técnica]

[024] Em uma modalidade da presente invenção, um reator de PCR do tipo placa em que um filme condutor térmico elástico é fundido foi projetado a fim de fornecer uma placa de PCR econômica que tem capacidade para circular precisamente a temperatura de uma solução de PCR em alta velocidade, é adequada para produção em massa, e permite que um material seco em um estado seco em um recipiente de PCR seja uniformemente misturado com uma solução de ácido nucleico que é injetada.

[025] Um filme de polímero é fundido a uma superfície superior da placa no formato de uma linha fechada incluindo uma passagem de injeção e uma entrada conectada à passagem de injeção, e assim uma estrutura em que reagentes de PCR são vedados com um filme fino e amplo é formada. Quando uma solução de ácido nucleico é injetada na entrada, a solução é injetada juntamente com ar e empurra o ar no canal, e à medida que o filme elástico é esticado para formar um formato convexo, os reagentes de PCR são dispostos dentro da placa. Especificamente, à medida que a injeção da solução de ácido nucleico faz com que uma mistura de PCR incluindo um iniciador, um iniciador/sonda, ou um iniciador e uma sonda, que está na forma de material seco, seja dissolvida, os reagentes para PCR são colocados dentro da placa. Nesse caso, o recipiente de reação pode ser mantido convexo em um estado em que a pressão positiva é aplicada por uma válvula de fechamento disposta acima do canal de injeção ou uma válvula de retenção para impedir o refluxo. A válvula de fechamento pode ser fornecida de modo que abra quando uma solução é injetada e é fechada após a injeção, de modo que uma unidade de PCR possa manter a pressão positiva, e é preferencial que uma válvula de retenção para impedir o refluxo seja fornecida de modo que, até mesmo após a PCR ter terminado, seja possível impedir que a solução de PCR flua de modo reverso e seja descarregada e cause contaminação. Nesse caso, a PCR pode ser realizada colocando- se alternadamente uma placa de alta temperatura e uma placa de baixa temperatura em contato próximo com o filme elástico que se tornou convexo devido à solução conforme descrito acima.

[026] Além disso, a fim de fundir facilmente um filme elástico a um substrato-base com o uso de um aquecedor de vedação, as projeções que têm uma altura uniforme de 1 a 2 mm podem ser formadas em uma superfície superior da placa no formato das linhas fechadas para serem formadas na placa através da fusão e, então, um filme de polímero que tem elasticidade pode ser fundido ás projeções para que uma unidade de PCR seja formada com uma estrutura de uma depressão que tem uma pequena profundidade de 1 mm ou menos e uma área maior em uma placa.

[027] Em uma modalidade da presente invenção, a fim de realizar PCR quantitativa em tempo real com o uso da placa descrita acima, a placa pode ser formada de um material transparente de modo que a placa seja irradiada com luz de excitação através de uma superfície, a fluorescência seja detectada, e assim a PCR quantitativa em tempo real seja possibilitada.

[028] Em uma modalidade da presente invenção, a fim de fornecer uma placa necessária para PCR quantitativa aninhada em tempo real que tem capacidade para detectar rapidamente as quantidades vestigiais de alvos em sítio com o uso do mesmo princípio, uma segunda unidade de PCR adicional da mesma forma pode ser fornecida à placa fundindo-se um filme elástico a uma placa de modo que as unidades de PCR sejam formadas, formando um canal de fluxo que conecta uma unidade de PCR a outra, e instalando uma válvula de fechamento no meio do canal de fluxo de modo que a placa possibilite que uma reação de PCR primária e uma reação de PCR aninhada em tempo real secundária sejam realizadas.

[029] Adicionalmente, em uma modalidade da presente invenção, a fim de detectar um grande número de alvos, é fornecida uma placa de análise que, tendo-se uma pluralidade de unidades de PCR secundárias, um canal de fluxo que conecta uma unidade de PCR primária com a pluralidade de unidades de PCR secundárias em paralelo, e uma válvula de fechamento, possibilita que uma reação de PCR de multiplexação seja realizada na unidade de PCR primária e uma pluralidade de reações de PCR aninhada em tempo real secundárias sejam subsequentemente realizadas.

[030] Além disso, a fim de detectar qualitativamente um grande número de alvos com o uso de um reator que tem a mesma estrutura, uma placa de análise de PCR pode ser fabricada formando-se uma unidade de PCR primária, uma unidade de reação secundária, e uma unidade de análise de fluxo lateral em que o papel com sondas fixadas é montada e que forma um canal de fluxo que conecta as unidades e uma válvula de fechamento fundindo-se o mesmo filme elástico à mesma placa. Quando essa placa de PCR da presente invenção é usada, uma reação de PCR de multiplexação é realizada primeiro, e abrindo-se a válvula de fechamento, uma reação de extensão de iniciador com o uso de um iniciador marcado é repetidamente realizada 10 ou more vezes como reações secundárias em um segundo reator, e abrindo-se uma segunda válvula de fechamento e passando-se uma solução de DNA de fita simples marcada através de papel para ensaio de fluxo lateral (doravante abreviado como LFA), um grande número de alvos amplificados é quantitativamente analisado ao mesmo tempo. Nesse caso, como a marcação, as nanopartículas de ouro ou materiais fluorescentes podem ser usados. [Efeitos Vantajosos]

[031] De acordo com modalidades da presente invenção, quando uma placa de análise de PCR da presente invenção tem vantagens de que, quando um bloco de aquecimento pressiona o ar que mantém a pressão positiva, visto que o ar é comprimido e a pressão é adicionalmente aumentada, o filme elástico em contato com uma solução de reação faz contato próximo com o bloco de aquecimento com pressão igual e, portanto, o calor pode ser transferido de modo reproduzível à solução de PCR com resistência térmica mínima. Portanto, há uma vantagem de que, visto que um bloco de aquecimento de alta temperatura e um bloco de aquecimento de baixa temperatura fazem contato sequencialmente com um filme elástico que se tornou convexo devido à solução de PCR injetada em uma unidade de reação da placa, a circulação de temperatura de PCR pode ser realizada em alta velocidade. Visto que os blocos de aquecimento têm uma capacidade de calor muito maior em relação à solução de PCR e mantêm temperaturas constantes, os blocos de aquecimento podem transferir rapidamente o calor a uma área grande através do filme elástico e mudar a temperatura da solução de PCR. Visto que é suficiente que os blocos de aquecimento mantenham temperaturas constantes e não seja necessário o ciclo térmico (isto é, aquecer e resfriar) das temperaturas dos blocos de aquecimento em si, o consumo de eletricidade é pequeno, e a circulação de temperatura pode ser estavelmente controlada.

[032] Além disso, visto que a solução dentro do recipiente de reação tem uma camada de ar que exibe elasticidade, quando a parte que se tornou convexa devido à solução de PCR é pressionada, a solução pode se mover dentro do recipiente de PCR. Visto que um iniciador/sonda seco pode ser bem dissolvido devido ao movimento da solução, há uma vantagem de que a PCR uniforme pode ser realizada.

[033] Além disso, visto que uma válvula de fechamento é fornecida de modo que a pressão positiva seja mantida no espaço de reação da placa em que reagentes, que são produtos de amplificação de PCR, fazem com que uma reação de PCR e uma estrutura de válvula de retenção que tem uma função de impedimento de refluxo é fornecida de modo a impedir, até mesmo após a PCR ter terminado, a solução de PCR de fluir de modo reverso e ser descarregada e causar a contaminação, é possível fornecer uma placa de reação confiável em que o risco de falsos positivos devido à contaminação por produtos de amplificação de PCR é eliminado.

[034] Além disso, visto que uma placa de análise de PCR da presente invenção é formada de um material de polímero transparente, é possível realizar a PCR quantitativa em tempo real irradiando-se a placa com luz de excitação através de uma superfície inferior e detectar a fluorescência que aumenta com o progresso de PCR.

[035] De acordo com a presente invenção, visto que uma segunda unidade de PCR adicional da mesma forma é fornecida à placa descrita acima fundindo-se um filme elástico em uma placa de modo que as unidades de PCR sejam formadas, formando um canal de fluxo que conecta uma unidade de PCR à outra, e instalando uma válvula de fechamento no meio do canal de fluxo, a PCR primária e, então, a PCR aninhada em tempo real secundária podem ser realizadas, e, portanto, a PCR quantitativa aninhada em tempo real com capacidade para detectar rapidamente as quantidades vestigiais de alvos em sítio pode ser realizada.

[036] Além disso, de acordo com uma modalidade da presente invenção, visto que uma pluralidade de unidades de PCR secundárias é instalada e um canal de fluxo que conecta uma unidade de PCR primária com a pluralidade de unidades de PCR secundárias em paralelo e uma válvula de fechamento são fornecidas, é possível realizar uma reação de PCR de multiplexação na unidade de PCR primária e realizar subsequentemente uma pluralidade de reações de PCR aninhada em tempo real e assim detectar um grande número de alvos com alta sensibilidade.

[037] Além disso, quando a placa de análise de PCR da presente invenção que tem uma unidade de PCR primária, uma unidade de reação secundária, e uma unidade de análise de fluxo lateral em que o papel com sondas fixadas é montado é usada, é possível realizar uma reação de PCR de multiplexação primeiro, e abrindo-se uma válvula de fechamento, realizar repetidamente uma reação de extensão de iniciador com o uso de um iniciador marcado 10 ou mais vezes como reações secundárias em um segundo reator, e abrindo-se uma segunda válvula de fechamento, permitir que uma solução de DNA de hélice única marcada passe através de papel de LFA com sondas de âncora fixadas, e identificando-se alvos afixados examinando-se a presença de marcadores em posições em que as sondas são fixadas, detectar quantitativamente um número grande de alvos ao mesmo tempo em alta velocidade.

[038] De acordo com uma modalidade da presente invenção, é possível fornecer uma placa de PCR que possibilita a detecção em tempo real automatizada de produtos de reação através da extração de ácidos nucleicos de amostras biológicas, PCR e a varredura, tem capacidade para realizar vários testes em uma operação, é fácil de usar e, em particular, tem capacidade para fornecer resultados precisos em um tempo curto. [Descrição de Desenhos]

[039] A Figura 1 é um conjunto de diagramas conceituais que ilustram o mecanismo de operação de uma placa de análise de PCR de acordo com uma modalidade da presente invenção incluindo uma válvula de fechamento e um filme elástico fundido.

[040] A Figura 2 é um conjunto de diagramas conceituais que ilustram o mecanismo de operação de uma placa de análise de PCR de acordo com outra modalidade da presente invenção incluindo uma válvula de retenção e um filme elástico fundido.

[041] A Figura 3 é uma vista montada em perspectiva da placa de análise de PCR da Figura 2 que tem uma válvula de retenção e duas unidades de PCR, que mostra um filme elástico a ser fundido, a válvula de retenção, e um agente de vedação para formar um canal de fluxo.

[042] A Figura 4 mostra as vistas planas superior e inferior da placa de análise de PCR da Figura 3, que mostra o filme elástico a ser fundido, a válvula de retenção, e o agente de vedação para formar o canal de fluxo.

[043] A Figura 5 é uma vista em corte transversal da placa de análise de PCR da Figura 4 obtida junto à linha A- A'.

[044] A Figura 6 mostra uma fotografia de vista plana (Figura 6A) e uma fotografia de vista oblíqua (Figura 6B) que mostra a aparência real da placa de análise de PCR das Figuras 3 e 4 e mostra que o filme elástico forma um formato convexo em que a pressão positiva é mantida como uma solução de reação é injetada em uma unidade de recebimento.

[045] A Figura 7 mostra as vistas planas superior e inferior de uma placa de análise de PCR que tem uma válvula de retenção e oito unidades de PCR e uma vista em corte transversal da placa de análise de PCR obtida junto à linha A- A'.

[046] A Figura 8 é um conjunto de diagramas conceituais que ilustra o mecanismo de operação de uma placa de análise de PCR para PCR aninhada de acordo com a presente invenção que tem uma válvula de retenção, uma primeira unidade de PCR, e uma segunda unidade de PCR e possibilita a PCR aninhada.

[047] A Figura 9 é uma vista plana da placa de análise de PCR da presente invenção que tem uma válvula de retenção, uma primeira unidade de PCR e uma segunda unidade de PCR e que possibilita a PCR aninhada.

[048] A Figura 10 é uma vista montada em perspectiva da placa de análise de PCR para PCR aninhada da Figura 8 que tem uma válvula de retenção, uma primeira unidade de PCR, uma segunda unidade de PCR, uma válvula de fechamento, e uma unidade de purificação, que mostra um filme elástico a ser fundido, a válvula de retenção, a unidade de purificação, a válvula de fechamento, e um filme de vedação para formar um canal de fluxo.

[049] A Figura 11 é uma vista montada inferior da placa de análise de PCR da Figura 10.

[050] A Figura 12 é um diagrama que ilustra uma placa de análise de PCR de acordo com ainda outra modalidade da presente invenção.

[051] A Figura 13 é um conjunto de diagramas conceituais que ilustra sequencialmente o mecanismo de operação de uma placa de análise de PCR da presente invenção que possibilita a análise de fluxo lateral pós-PCR.

[052] A Figura 14 é uma vista plana da placa de análise de PCR da Figura 13.

[053] A Figura 15 é um conjunto de diagramas conceituais que ilustram sequencialmente o mecanismo de operação de uma placa de análise de PCR da presente invenção que possibilita, após uma reação de PCR, que uma reação de PCR assimétrica ou uma reação de extensão com o uso de um iniciador aninhado seja realizada, seguida por análise de fluxo lateral.

[054] A Figura 16 é uma vista plana da placa de análise de PCR da Figura 15.

[055] As Figuras 17A, 17B e 17C são, respectivamente, uma vista plana superior, uma vista plana inferior, e uma vista em corte transversal de uma placa de análise de PCR de acordo com ainda outra modalidade da presente invenção que tem duas unidades de PCR.

[056] As Figuras 18A, 18B e 18C são, respectivamente, uma vista plana superior, uma vista plana inferior, e uma vista em corte transversal de uma placa de análise de PCR de acordo com ainda outra modalidade da presente invenção que tem oito unidades de PCR. [Modo da Invenção]

[057] As vantagens e recursos da presente invenção e um método para alcançar os mesmos se tornarão evidentes com referência às modalidades exemplificativas descritas abaixo em detalhes assim como os desenhos anexos. Entretanto, a presente invenção não é limitada às modalidades descritas no presente documento e podem ser incorporadas a outras formas. Em vez disso, as modalidades exemplificativas introduzidas no presente documento são fornecidas, de modo que o conteúdo revelado possa ser minucioso e completo, e que o espírito da presente invenção pode ser suficientemente transportado por aqueles versados na técnica.

[058] Os termos usados no presente documento foram usados apenas com o propósito de descrever modalidades particulares e não são destinados a limitar a presente invenção. No presente relatório descritivo, as expressões no singular incluem expressões no plural a menos que o contexto indique claramente de outro modo. Será adicionalmente entendido que os termos “compreende”, “que compreende”, “inclui”, “incluindo”, “tem” e/ou “que tem”, quando usados no presente documento, especificam a presença de recursos, números inteiros, etapas, operações, elementos, componentes e/ou grupos declarados do mesmo, mas não excluem a presença ou adição de um ou mais outros recursos, números inteiros, etapas, operações, elementos, componentes e/ou grupos dos mesmos.

[059] A Figura 1 é um conjunto de diagramas conceituais que ilustram as partes principais de uma placa de análise de PCR de alta velocidade (doravante denominada como

"placa de PCR") de acordo com uma modalidade da presente invenção. A Figura 2 é um conjunto de diagramas conceituais que ilustra um caso em que uma válvula de retenção em vez de uma válvula de fechamento como na Figura 1 é fornecida. A Figura 3 é uma vista montada em perspectiva que ilustra um exemplo da placa de PCR da Figura 2 que tem uma válvula de retenção e duas unidades de PCR, que mostram um filme elástico a ser fundido, uma válvula de retenção, e um agente de vedação para formar um canal de fluxo. A Figura 4 tem as vistas planas superior e inferior da placa de PCR da Figura 3, e a Figura 5 é uma vista em corte transversal da placa de PCR da Figura 4 obtida junto à linha A-A'.

[060] Com referência às Figuras 1 a 4, uma placa de PCR da presente invenção pode ter a estrutura incluindo um substrato-base S, uma unidade de reação W que é fornecida no substrato-base, recebe uma solução de ácido nucleico, e inclui pelo menos uma região de acomodação, em que uma mistura de PCR incluindo um iniciador, um iniciador/sonda, ou um iniciador e uma sonda, que está na forma de material seco, é acomodada, e um filme elástico F que veda o lado interior da unidade de reação W.

[061] Especificamente, como na estrutura mostrada na Figura 3, a placa de PCR da presente invenção é implantada como uma estrutura em formato de placa incluindo uma porção de superfície e a outra porção de superfície oposta à porção de superfície.

[062] Aqui, na uma porção de superfície, é fornecida uma unidade de reação W que implanta as regiões de acomodação W1, W2 para acomodar uma mistura de PCR incluindo um iniciador, um iniciador/sonda, ou um iniciador e uma sonda,

que está na forma de material seco e, recebendo-se uma solução de ácido nucleico injetada por um cartucho de extração de ácido nucleico ou um dispositivo de injeção externa, que executa PCR. A unidade de reação W pode ser implantada como uma estrutura em que um filme elástico F é fundido ao substrato- base S e, de acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, a unidade de reação W também pode ser implantada como um espaço isolado conforme mostrado na Figura 4 com o uso de uma parede de partição de projeção GA que tem uma altura de 2 a 4 mm, preferencialmente 2 a 3 mm, e mais preferencialmente 2 mm ou menos. Quando a parede de partição é implantada com uma altura de mais do que 4 mm, há uma desvantagem de, quando um bloco de aquecimento de alta temperatura e um bloco de aquecimento de baixa temperatura fazem contato com o filme elástico em um ponto no tempo posterior, a temperatura (calor) não é precisamente transferida aos reagentes no fundo. Há máxima preferência que a parede de partição é implantada com uma altura de 2 mm ou menos, e até mesmo quando a unidade de reação é implantada através das regiões fundidas, é preferencial que as regiões fundidas sejam implantadas com uma altura (espessura) de 2 mm ou menos.

[063] Além disso, nas modalidades a seguir da presente invenção, o conceito de "fundir" é definido coo um estado em que um material de filme está em contato próximo com um substrato-base sem qualquer elevação, e embora a definição se refira geralmente à fusão alcançada por ondas ultrassônicas, aquecimento, pressão, ou semelhantes, é considerado que o conceito também inclui modificações de contato próximo implantado com o uso de um material adesivo predeterminado ou afixação.

[064] Além disso, na implantação da unidade de reação W, embora a Figura 3 ilustre a implantação de duas regiões de acomodação W1, W2 e a Figura 7 ilustra a implantação de oito regiões de acomodação, a presente invenção não é limitada a isso e, obviamente, também é possível implantar a unidade de reação W como uma estrutura que tem mais do que uma ou duas regiões de acomodação.

[065] Além disso, a placa de PCR da presente invenção pode ser formada fundindo-se um filme elástico F que tem elasticidade na unidade de reação W no formato de uma linha fechada e pode ser implantada como uma estrutura que veda o lado interior das regiões de acomodação. Doravante, na presente invenção, a expressão "que tem o formato de uma linha fechada" define uma estrutura processada na forma de uma região linear fundida em que, quando as porções de borda externa predeterminadas de um filme elástico são fundidas a um substrato-base, visto que as regiões fundidas são fundidas ao substrato-base perfeitamente, a estrutura é implantada como uma estrutura na qual as regiões fundidas e o espaço interior são vedados.

[066] O filme elástico F é disposto no substrato- base S de modo que o filme elástico F vede todas as regiões de acomodação W1, W2, uma unidade de canal de fluxo J, e uma unidade de válvula a ser descrita abaixo.

[067] Conforme ilustrado na Figura 3, a parede de partição GA implanta as regiões de acomodação W1, W2 e a unidade de canal de fluxo J conectada às regiões de acomodação W1, W2. A unidade de canal de fluxo J tem capacidade para orientar os ácidos nucleicos injetados através de um orifício de injeção h1 formado em uma extremidade do substrato-base oposta às regiões de acomodação W1, W2 para as regiões de acomodação W1, W2 por meio de uma depressão de válvula de retenção K.

[068] Nesse caso, uma mistura de PCR incluindo um iniciador, um iniciador/sonda, ou um iniciador e uma sonda, que está na forma de material seco para executar PCR e é acomodada nas regiões de acomodação W1, W2, reage com os ácidos nucleicos injetados, causando uma reação de PCR.

[069] A fim de executar a PCR de alta velocidade, um processo para colocar alternadamente blocos de aquecimento de alta e baixa temperaturas HB em contato próximo com as porções superiores das regiões de acomodação W1, W2 é necessária, de modo que as condições de temperatura com capacidade para induzir PCR possam ser aplicadas. Nesse caso, a transferência de calor é afetada pela proximidade em que os blocos de aquecimento HB fazem contato com o filme elástico F.

[070] De acordo com uma modalidade da presente invenção, visto que o filme elástico forma as regiões de acomodação W1, W2 da placa de PCR 200 é esticado para formar um formato convexo pela injeção de uma solução, quando os blocos de aquecimento fazem contato próximo com a parte convexa da superfície de filme elástico, o filme elástico forma contato próximo uniforme com os blocos de aquecimento HB, e uma reação de PCR rápida é possibilitada.

[071] Além disso, quando o filme elástico F que tem um formato convexo devido ao fato de a solução injetada ser pressionada, visto que a solução de ácido nucleico injetada do lado exterior é movida e homogeneamente misturada com uma mistura de PCR incluindo um iniciador, um iniciador/sonda, ou um iniciador e uma sonda, que está na forma de material seco, acomodado em uma região de acomodação, uma reação de PCR é uniformemente implantada.

[072] Entretanto, quando a pressão é aplicada na superfície superior das regiões de acomodação W1, W2 pelos blocos de aquecimento HB conforme mostrado na Figura 2, um fenômeno em que os reagentes são submetidos a uma reação misturada fluem novamente de modo reverso através da unidade de canal de fluxo J ocorre. Consequentemente, a fim de impedir o refluxo, as unidades de válvula são fornecidas na presente invenção, e uma válvula de fechamento D (Figura 1) ou uma válvula de retenção V (Figura 2) para impedir o refluxo de uma solução empurrada pelos blocos de aquecimento é disposta no substrato-base.

[073] Em uma modalidade da presente invenção, a "válvula de fechamento" é configurada como uma parte que realiza uma função intermitente de bloquear ou aplicar o fluxo de um fluido em um substrato-base, e é definida, na estrutura da Figura 10, como o conceito de uma região D implantada por um par de orifícios hd1, hd2 que executam a introdução de um fluido no substrato-base S e no membro de filme elástico F fornecido sobre o mesmo. Além disso, a válvula de retenção V é uma estrutura independente implantada entre o filme elástico e o substrato-base e é definida como uma estrutura que controla o fluxo de um fluido.

[074] Além disso, de acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, a placa de PCR inclui todas as estruturas que têm uma ou mais dentre uma válvula de fechamento D disposta entre uma unidade de canal de fluxo J conectada a uma entrada de uma unidade de reação W e a unidade de reação W e uma unidade de válvula incluindo uma válvula de retenção V para impedir o refluxo de uma solução injetada na unidade de reação W e a unidade de canal de fluxo J conectada à entrada da unidade de reação W.

[075] Isto é, em uma modalidade da presente invenção, a válvula de retenção V descrita acima é implantada na porção de unidade de válvula da Figura 3 e assentada de modo a ser separada do lado interior da depressão de válvula de retenção K que se comunica com uma extremidade da unidade de canal de fluxo J que se comunica com a unidade de reação W.

[076] A válvula de retenção V pode ser operada para fechar um orifício de entrada de fluido Ha para introduzir fluido na unidade de válvula por flutuação.

[077] Para descrever as funções da válvula de retenção V da presente invenção em detalhes, conforme mostrado nas Figuras 2 a 4, na placa de PCR da presente invenção, o trajeto de injeção para injetar ácidos nucleicos na unidade de reação W é aplicado através do orifício de injeção h1 fornecido em uma extremidade da placa, e os ácidos nucleicos aplicados passam através da depressão de válvula de retenção K e da unidade de canal de fluxo novamente e se movem em direção à extremidade dianteira da placa de PCR para a unidade de reação W.

[078] O fenômeno de "refluxo" se refere a um processo no qual os reagentes dentro da região de acomodação fluem na direção reversa do trajeto de injeção e são descarregados para o lado exterior. Na presente invenção, o fenômeno de "refluxo" pode ocorrer quando uma solução de ácido nucleico injetada flui através do canal de fluxo, fazendo com que o ar no canal de fluxo seja comprimido e o filme elástico seja esticado para formar um formato convexo e assim formar pressão positiva, quando um filme elástico convexo parte da região de acomodação é pressionado e um material seco na região de acomodação é misturado com a solução, ou quando a pressão positiva adicional é formada dentro da região de acomodação pelos blocos de aquecimento que aplicam alternadamente alta temperatura e baixa temperatura a um filme elástico convexo parte da região de acomodação para PCR, nesse caso, os reagentes dentro da região de acomodação fluem na direção reversa do trajeto de injeção e são descarregados para o lado exterior.

[079] A Figura 5 é uma vista em corte transversal da placa de PCR da Figura 4 obtida junto à linha A-A', e as Figuras 1 e 2 são diagramas conceituais que ilustram mecanismos de operação de placas de PCR de acordo com as modalidades da presente invenção.

[080] Doravante, o mecanismo de operação de uma placa de PCR que tem uma estrutura que tem uma válvula de retenção conforme implantado em uma modalidade da presente invenção será descrito com referência às Figuras 3 a 5.

[081] Conforme mostrado na Figura 5, na placa de PCR de acordo com uma modalidade da presente invenção, um orifício de entrada de fluido Ha através do que um ácido nucleico fluido introduzido do lado exterior é injetado pode ser disposto abaixo de uma depressão de válvula de retenção K onde uma válvula de retenção V é colocada, e uma estrutura de bloco de formação de trajeto Va para garantir que um trajeto de movimento de fluido possa ser implantado abaixo do orifício de entrada de fluido Ha.

[082] Na placa de PCR, um fluido que contém ácidos nucleicos introduzidos do lado exterior é injetado no orifício de injeção h1 através do fundo da placa, e o fluido injetado se move para a depressão de válvula de retenção K através de um trajeto de fluxo de entrada.

[083] Doravante, a operação descrita acima será descrita em detalhes com referência à Figura 2.

[084] A Figura 2 é um conjunto de diagramas conceituais que ilustram um processo em que um fluido que contém ácidos nucleicos se move para uma unidade de reação W em uma estrutura de placa de PCR.

[085] Com referência à Figura 2, quando um fluido que contém um extrato de ácido nucleico é introduzido do lado exterior através do orifício de injeção h1, o fluido se move ao longo de um trajeto (na direção indicada pelas setas) do fundo do orifício de entrada de fluido Ha em direção à depressão de válvula de retenção K, assim fazendo com que a válvula de retenção V flutue levemente (Figura 2A).

[086] Subsequentemente, à medida que o filme elástico se estica levemente devido à pressão causada pela injeção do fluido que contém um extrato de ácido nucleico, a válvula de retenção V flutua, e o fluido que contém um extrato de ácido nucleico se move facilmente para a unidade de reação W e, após se mover, o fluido reage com uma mistura de PCR incluindo um iniciador, um iniciador/sonda, ou um iniciador e uma sonda, que está na forma de material seco e já foi fornecida na unidade de reação W, isto é, uma região de acomodação, e assim a PCR é realizada (Figura 2B).

[087] Nesse caso, a pressão no lado interior do filme elástico que veda a porção superior da região de acomodação é aumentada devido à injeção do fluido, fazendo com que a superfície se projete para fora de modo convexo, conforme mostrado na Figura 2B. A superfície do filme elástico sob a influência de pressão positiva como tal pode colocar de modo eficaz a solução na unidade de reação da placa de PCR em contato próximo com os blocos de aquecimento HB conforme será descrito abaixo, e isso pode ser vantajoso para garantir condições de temperatura precisas.

[088] Subsequentemente, quando o equipamento que tem capacidade para aplicar uma temperatura necessária para o processo de desnaturação térmica e uma temperatura exata necessária para um processo de anelamento e realizar o aquecimento e pressão aplica pressão no lado interior da unidade de reação (região de acomodação) periodicamente enquanto controla a temperatura conforme necessário para um processo de PCR induzir PCR, a pressão positiva (PP) é formada dentro da região de acomodação e os reagentes são homogeneamente misturados.

[089] Ao mesmo tempo, a pressão positiva causa um fenômeno de refluxo em que os reagentes misturados são empurrados para fora da região de acomodação de modo reverso.

[090] Quando tal fenômeno de refluxo ocorre, a válvula de retenção V é pressionada para baixo conforme mostrado na Figura 2B, nesse caso, a válvula de retenção V bloqueia naturalmente o orifício de entrada de fluido Ha. Quando a válvula de retenção V bloqueia o orifício de entrada de fluido Ha como tal, os reagentes dentro da região de acomodação não podem fluir de modo reverso para o lado exterior e continuam a reagir completamente na região de acomodação.

[091] Portanto, em uma modalidade da presente invenção, a válvula de retenção V é implantada como uma estrutura tridimensional que tem uma superfície superior que tem irregularidades e uma superfície inferior que possibilita o contato próximo.

[092] Isto é, a superfície inferior da válvula de retenção bloqueia a entrada ficando em contato próximo com a entrada, e as irregularidades na superfície superior são voltadas para a superfície interna no filme elástico, nesse caso, a válvula de retenção é pressionada e, quando uma solução é aplicada a uma porção superior da válvula de retenção que exclui as irregularidades e, desse modo, a pressão positiva é aplicada, a válvula de retenção veda fortemente a área em torno da entrada.

[093] Em outras palavras, uma estrutura é implantada para que a válvula de retenção V na depressão de válvula de retenção K flutue e abra devido ao fluxo de entrada do fluido introduzido na unidade de reação W, e ao mesmo tempo, a superfície inferior da válvula de retenção V tenha capacidade para fechar o orifício de injeção de fluido, e na superfície superior da válvula de retenção V, apenas a parte central faz contato próximo com o filme elástico, e o restante faz contato com a solução.

[094] Nesse caso, embora a válvula de retenção possa ser implantada em várias estruturas, materiais e formatos, a estrutura, material, ou formato da válvula de retenção pode ser mudado de modo variado e, por exemplo, a válvula de retenção pode ter o formato de um cone, um cilindro de duas camadas em que um diâmetro superior é no máximo 1/2 de um diâmetro inferior, ou um cilindro que tem projeções formadas em uma superfície superior do mesmo. Entretanto, é preferencial que a superfície inferior V2 inteira da válvula de retenção seja formada de um material elástico, como borracha de silicone, para que a válvula de retenção possa fechar de modo eficaz o orifício de entrada de fluido Ha inteiro.

[095] A Figura 6 mostra fotografias reais de uma placa de PCR implantada de acordo com as Figuras 2 e 5, e a Figura 6A é uma imagem da placa de PCR antes de injetar um fluido que contém ácidos nucleicos, e a Figura 6B é uma imagem da placa de PCR após injetar uma solução de ácido nucleico que mostra que o filme elástico na região de acomodação tem um formato convexo devido à pressão positiva aplicada pela injeção da solução de reação. Quando os blocos de aquecimento de alta e baixa temperaturas que mantêm temperaturas constantes pressionam alternadamente a superfície do filme elástico que tem um formato convexo para cima, conforme mostrado na Figura 6B, visto que a superfície convexa do filme elástico da região de acomodação é pressionada, o calor é transferido, e à medida que a reação solução é movida, a solução de PCR é uniformemente misturada. O refluxo causado pela pressão adicional aplicada devido ao contato pode ser controlado através da válvula de retenção.

[096] A placa de PCR é usável para a análise de amplificação de PCR em tempo real. A fim de realizar uma reação de PCR em tempo real, um valor de fluorescência da unidade de PCR é medido em cada ciclo, um ciclo em que a fluorescência é aumentada acima de um valor de fluorescência de limiar é identificado, e assim a concentração de um alvo é medida.

[097] A fim de alcançar os objetivos descritos acima, de acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, o substrato-base pode ser feito de uma resina sintética transparente. Um exemplo da resina sintética transparente é um polímero à base de polietileno (PE), polipropileno (PP), poliéster (PET), policarbonato (PC) ou polimetacrilato (PMMA). Além disso, é necessário que a resina sintética transparente seja um polímero que não contém um material fluorescente para que vários materiais fluorescentes usados para PCR quantitativa em tempo real possam ser medidos.

[098] Acima no presente documento, o princípio de operação do exemplo mais simples da placa de PCR que é a base da presente invenção foi descrito em detalhes.

[099] A modalidade descrita acima é um exemplo de realizar uma reação de PCR única e, na presente invenção, há modalidades adicionais para alcançar alto desempenho enquanto com o uso do princípio básico descrito acima.

[100] O seguinte é uma modalidade exemplificativa e é um exemplo de aplicação em relação ao desempenho de PCR aninhada que é conhecida como o método mais eficaz para amplificar quantidades vestigiais de alvos em uma amostra que contém materiais de ácido nucleico que têm sequências de ácido nucleico complexas.

[101] A Figura 8 é um conjunto de diagramas conceituais que ilustram uma placa de PCR da presente invenção que possibilita a PCR aninhada e que ilustram o mecanismo de operação da placa de PCR que tem uma válvula de retenção, uma primeira unidade de PCR, e uma segunda unidade de PCR. A Figura 9 é uma vista plana da placa de PCR da presente invenção da Figura 8 que tem uma válvula de retenção, uma primeira unidade de PCR e uma segunda unidade de PCR e que possibilita a PCR aninhada.

[102] A Figura 10 é uma vista em perspectiva explodida que ilustra a montagem da placa de PCR das Figuras

8 e 9.

[103] Primeiro, com referência às Figuras 9 e 10, a placa de PCR de acordo com a presente modalidade da presente invenção é implantada para incluir um par de unidades de reação, as quais são separadas uma da outra, e um substrato- base S. Isto é, uma primeira unidade de PCR W1 e uma segunda unidade de PCR W2 são fornecidas. Em particular, a primeira unidade de PCR W1 e a segunda unidade de PCR W2 são implantadas como espaços formados fundindo-se um filme de vedação elástica e, entre a primeira unidade de PCR W1 e a segunda unidade de PCR W2, uma válvula de fechamento D para controlar o fluxo de um fluido em uma segunda unidade de canal de fluxo J2 que conecta uma saída da primeira unidade de PCR W1 e uma entrada da segunda unidade de PCR W2 é disposta.

[104] Isto é, a presente modalidade da presente invenção é diferente da modalidade ilustrada nas Figuras 2 a 4, incluindo a válvula de retenção descrita acima, visto que a estrutura de acordo com a presente modalidade tem a estrutura da Figura 3, mas inclui adicionalmente uma segunda unidade de PCR, um canal de fluxo J2 conectado à primeira unidade de PCR W1, e uma válvula de fechamento D para controlar o fluxo de uma solução no meio do caminho através do canal de fluxo.

[105] A fim de melhorar a eficácia de PCR aninhada secundária, uma unidade de purificação FT que contém um absorvente para remover materiais inibidores que inibem a PCR aninhada secundária, como iniciadores e pirofosfato gerado na PCR primária, pode ser adicionada a um canal de fluxo antes da segunda unidade de PCR W2. A segunda unidade de PCR W2 é fabricada da mesma maneira que a primeira unidade de PCR W1. A segunda unidade de PCR W2 é fabricada fundindo-se um filme elástico ao substrato-base no formato de uma linha fechada incluindo uma entrada, em que, antes da vedação fundindo-se o filme elástico, iniciadores, sondas, deoxinucleosídeo trifosfatos (dNTPs), e uma polimerase adicionais necessários para a PCR aninhada são adicionados ao substrato-base na forma de materiais secos.

[106] A Figura 10 é uma vista montada geral de uma placa de PCR aninhada. A Figura 11 é uma vista montada inferior da placa de PCR aninhada da Figura 10.

[107] A fim de fabricar a placa de PCR aninhada da presente invenção, um canal de fluxo na superfície inferior do substrato-base S e uma unidade de purificação FT que contém um absorvente são formadas virando-se o substrato-base S de modo que a superfície inferior do mesmo fique voltada para cima e colocando o absorvente na unidade de purificação FT e vedando com um filme F3 e, portanto, o canal de fluxo e a unidade de purificação são formados em uma vez.

[108] Subsequentemente, após virar o substrato- base S de modo que a superfície superior do mesmo fique voltada para cima, uma válvula de retenção V é instalada, um primeiro material seco por PCR e um segundo material seco por PCR são colocados em suas respectivas posições na primeira unidade de PCR W1 e na segunda unidade de PCR W2, e o filme elástico F é fundido, e assim uma placa de PCR aninhada da presente invenção é obtida.

[109] O absorvente é uma partícula porosa que permite a penetração de moléculas que depende dos tamanhos de moléculas e permite a penetração de moléculas pequenas, como iniciadores ou pirofosfato enquanto bloqueia a penetração de DNA amplificado com um tamanho molecular maior, que é um produto de PCR. Como o absorvente, uma combinação de Sephadex® (G-25 ou G-50), cerâmica porosa, e semelhantes pode ser usada.

[110] O princípio de operação da PCR primária da presente invenção pode ser descrito conforme o seguinte com base na estrutura da Figura 10 com referência aos diagramas conceituais em corte transversal da Figura 8.

[111] Conforme mostrado na Figura 8A, é necessário que a válvula de fechamento seja mantida fechada a todo o tempo até a PCR primária ser completada. Um extrato de ácido nucleico ou semelhantes injetado através do de injeção h1 passa através da válvula de retenção V, e a PCR primária é realizada na primeira unidade de PCR W1. Enquanto a PCR primária é realizada, a válvula de retenção V está em um estado fechado, conforme mostrado na Figura 8B, e impede o refluxo de reagentes. A PCR primária é realizada pressionando-se alternadamente a parte projetada do filme elástico da primeira unidade de PCR W1 com blocos de aquecimento HB1.

[112] Subsequentemente, quando a PCR primária dos reagentes introduzidos é terminada, o pistão PG que pressiona a válvula de fechamento D é elevado conforme mostrado na Figura 8C, permitindo que a solução contida na primeira unidade de PCR W1 sob pressão positiva se mova ao longo do canal de fluxo, passe através da válvula de fechamento D e, então, a unidade de purificação FT, e alcance a segunda unidade de PCR W2.

[113] Nesse caso, a fim de mover o máximo possível da solução, a solução é pressionada com o bloco de aquecimento frontal HB1 enquanto o bloco de aquecimento dianteiro HB2 está em um estado elevado para que a solução seja movida completamente e, então, a válvula de fechamento D é pressionada com o pistão para bloquear o canal de fluxo.

[114] Subsequentemente, a solução é alternadamente pressionada com blocos de aquecimento de alta e baixa temperaturas HB2, que forma ciclos de PCR em que os produtos amplificados de PCR primária são submetidos a uma reação de PCR. Nesse caso, a fim de realizar uma reação de PCR em tempo real, um valor de fluorescência da unidade de PCR é medido em cada ciclo, um ciclo em que a fluorescência é aumentada acima de um valor de fluorescência de limiar é identificado, e assim a concentração de um alvo é medida. Portanto, é necessário que a placa de PCR seja fabricada com o uso dos materiais de polímero transparente descritos acima.

[115] A Figura 12 é um diagrama que ilustra uma placa de PCR de acordo com ainda outra modalidade da presente invenção.

[116] A estrutura da Figura 12 é um exemplo de uma placa de PCR da presente invenção que possibilita que a PCR aninhada de multiplexação para analisar vários alvos seja realizada.

[117] Isto é, em várias modalidades da presente invenção, as estruturas que possibilitam uma reação de PCR primária e, então, uma pluralidade de reações de PCR em tempo real secundária são implantadas.

[118] A estrutura da Figura 12 é um exemplo de implantar a essência da presente invenção, e a Figura 12 é uma vista plana de uma placa de PCR exemplificativa que possibilita que uma reação de PCR de multiplexação primária e, então, as reações de PCR em tempo real secundária em oito unidades de reação secundária sejam realizadas.

[119] Isto é, a estrutura da Figura 12 tem a mesma estrutura básica que a estrutura das Figuras 9 e 10 da maneira que um orifício de injeção, uma válvula de retenção CB, uma primeira unidade de PCR W1, e uma válvula de fechamento D são dispostas e a primeira unidade de PCR W1 é configurada. Entretanto, a estrutura da Figura 12 é diferente da estrutura das Figuras 9 e 10 por a segunda unidade de PCR ser implantada como múltiplas unidades em vez de uma unidade única. Portanto, a estrutura da Figura 12 é igual à estrutura das Figuras 9 e 10 em termos de princípio de operação e é diferente visto que o canal de fluxo fornecido após a unidade de purificação FT é formado de modo que oito unidades de PCR secundárias W8 sejam conectadas em paralelo. A estrutura da Figura 12 opera de acordo com o processo descrito acima e tem a vantagem de poder analisar vários alvos através de PCR em tempo real ao mesmo tempo.

[120] A Figura 13 é um conjunto de diagramas que ilustra a estrutura de uma placa de PCR de acordo com ainda outra modalidade da presente invenção que possibilita a análise de fluxo lateral pós-PCR. A Figura 14 é uma vista plana da placa de PCR da Figura 13.

[121] Com referência às Figuras 13 e 14, visto que a placa de PCR de acordo com a presente modalidade da presente invenção tem um sistema vedado formado fundindo-se os filmes F às superfícies superior e inferior de um substrato- base S feito de um polímero, a amplificação pode ser completada em um tempo curto e, portanto, a placa de PCR é ideal para a análise de fluxo lateral integrada com PCR executada por, após a PCR, passar os produtos de PCR através do papel em que as sondas de ácido nucleico são fixadas às respectivas bandas e analisar as bandas hibridizadas desse modo.

[122] Especificamente, a fim de realizar a análise de fluxo lateral após a PCR com o uso de produtos de PCR amplificada, é necessário que o DNA de hélice única seja finalmente produzido. Para esse fim, durante a preparação do material seco por PCR descrito acima, um material seco que contém uma quantidade excessiva de um iniciador é preparado. Quando uma reação de PCR assimétrica é realizada com o uso desse material de PCR, um produto de PCR que contém uma quantidade excessiva de apenas uma fita é finalmente produzido. (Wooddell, C I; Burgess, R (1996). "Use of Asymmetric PCR to Generate Long Primers and Single-stranded DNA for Incorporating Cross-linking Analogs into Specific Sites in a DNA Probe" (PDF). Genome Res. (6): 886 a 892).

[123] A placa para análise de fluxo lateral pós- PCR de acordo com a presente invenção é fabricada para ser igual à placa de PCR das Figuras 9 e 10 em termos de ter uma estrutura incluindo uma válvula de retenção, uma primeira unidade de PCR W1, e uma válvula de fechamento D e da maneira que a placa é operada. Entretanto, a placa para análise de fluxo lateral pós-PCR de acordo com a presente invenção é fabricada completando-se um canal de fluxo inferior do substrato-base com um agente de vedação, instalando a válvula de retenção acima do canal de fluxo inferior e colocando o material seco por PCR assimétrico descrito acima e um módulo de análise de fluxo lateral (LSM) nas respectivas posições e, então, fundindo-se um filme elástico.

[124] Aqui, o módulo de análise de fluxo lateral (LSM) usado é um módulo de papel em que um coxim de carregamento L1 é afixado a uma extremidade frontal e um coxim de absorção L3 é afixado a uma extremidade dianteira e que tem as bandas

L2 incluindo um grande número de sondas fixadas no mesmo em uma porção intermediária do papel.

[125] Nesse caso, o substrato-base S é preferencialmente implantado para incluir uma depressão de modo que o módulo de análise de fluxo lateral possa ser assentado no mesmo. De acordo com a presente invenção, é possível fabricar uma placa de análise de fluxo lateral de PCR que possibilita, por um processo simples, que uma reação de PCR seja realizada em um espaço confinado em alta velocidade e a análise de hibridização de sonda de fluxo lateral seja realizada.

[126] Conforme mostrado na Figura 13, o princípio de trabalho da PCR da presente modalidade é basicamente igual àquele da placa que tem uma unidade de PCR. Entretanto, é necessário que a válvula de fechamento D seja mantida fechada a todo o tempo até a PCR ser completada. Quando a PCR é terminada, o pistão PG que pressiona a válvula de fechamento D é elevado, fazendo com que a solução contida na unidade de PCR sob pressão positiva se mova ao longo do canal de fluxo, passe através da válvula de fechamento D e entre na unidade de análise de fluxo lateral LS. Nesse caso, a fim de mover o máximo de solução inteira possível, a parte convexa da unidade de reação é pressionada com o bloco de aquecimento HB e, desse modo, a solução é movida. Subsequentemente, a solução é absorvida pelo coxim de carregamento L1 e se move lentamente ao longo do papel em que as sondas são fixadas na forma de bandas L2 e finalmente alcança o coxim de absorção L3, e quando a solução encontra as sondas complementares aos alvos, visto que a hibridização ocorre, o movimento da solução é interrompido, e a cor do marcador fluorescente ou nanopartículas de ouro aparece. Através disso, vários alvos podem ser qualitativamente detectados. Nesse caso, a temperatura da placa de PCR deve ser mantida constante para que a hibridização possa ocorrer precisamente. Para isso, a temperatura da placa de metal em que a placa de PCR é colocada deve ser controlada para ser constante, e pressionando-se o bloco de aquecimento HB enquanto se ajusta a temperatura do bloco de aquecimento HB para a mesma temperatura e pressionando a válvula de fechamento com o pistão, a temperatura da placa de PCR é mantida constante.

[127] A Figura 15 é um conjunto de diagramas conceituais que ilustram sequencialmente o mecanismo de operação de uma placa de PCR da presente invenção que possibilita, após uma reação de PCR, que uma reação de PCR assimétrica aninhada ou uma reação de extensão com o uso de um iniciador aninhado seja realizada, seguida por análise de fluxo lateral. A Figura 16 é uma vista plana da placa de PCR da Figura 15.

[128] Essa estrutura tem a forma mais complexa entre as estruturas derivadas da presente invenção e possibilita que uma reação de PCR primária, uma reação de PCR assimétrica aninhada secundária e, então, a análise de fluxo lateral sejam realizadas. Para isso, uma primeira válvula de fechamento D1 para transferir uma solução que porta os produtos da reação de PCR primária para a reação de PCR secundária e uma segunda válvula de fechamento D2 para mover uma solução da reação de PCR secundária para um analisador de fluxo lateral LS são instaladas.

[129] Além disso, uma unidade de purificação FT para remover os materiais que inibem a reação de PCR secundária dos produtos da reação de PCR primária é fornecida no canal de fluxo após a primeira válvula de fechamento.

[130] Como a reação de PCR secundária, uma reação de PCR assimétrica aninhada, uma reação de extensão de iniciador aninhado ou semelhantes podem ser usadas. Nesse caso, um iniciador para formar uma hélice única deve ser marcado com fluorescência ou semelhantes, e um material seco incluindo o iniciador deve ser inserido na segunda unidade de reação.

[131] A fim de fabricar a placa de análise de PCR da presente invenção, um canal de fluxo na superfície inferior do substrato-base e uma unidade de purificação que contém um absorvente são formadas virando-se o substrato-base de modo que a superfície inferior do mesmo fique voltada para cima e colocando o absorvente na unidade de purificação e vedando com um filme, e portanto, o canal de fluxo e a unidade de purificação são formados em uma vez. Subsequentemente, após girar o substrato-base de modo que a superfície superior do mesmo fique voltada para cima, a válvula de retenção, um primeiro material seco por PCR, um segundo material seco por PCR, e um módulo de fluxo lateral são colocados em suas respectivas posições, e um filme elástico é fundido, e assim a placa de análise de fluxo lateral de PCR aninhada da presente invenção é obtida. O absorvente é a partícula porosa descrita acima e, como o absorvente, uma combinação de Sephadex® (G-25 ou G-50), cerâmica porosa, e semelhantes pode ser usada.

[132] Com referência às Figuras 15 e 16, o princípio de operação da reação de PCR primária da presente invenção é conforme o seguinte: (a) É necessário que a primeira válvula de fechamento D1 e a segunda válvula de fechamento D2 sejam mantidas fechadas a todo o tempo até a reação de PCR primária ser completada. (b) A reação de PCR primária é realizada na unidade de reação pela operação da válvula de retenção V conforme descrito acima na modalidade da Figura 9.

[133] Subsequentemente, quando a reação de PCR primária é terminada, o pistão PG1 que pressiona a primeira válvula de fechamento D1 é elevado, permitindo que a solução contida na primeira unidade de PCR sob pressão positiva se mova ao longo do canal de fluxo, passe através da primeira válvula de fechamento D1 e, então, a unidade de purificação FT, e alcance a segunda unidade de PCR W2. Nesse caso, a fim de mover o máximo possível da solução, a solução é pressionada com o bloco de aquecimento frontal HB1 enquanto o bloco de aquecimento dianteiro HB2 está em um estado elevado para que a solução seja movida completamente e, então, a primeira válvula de fechamento D1 é pressionada com o pistão PG1 para bloquear o canal de fluxo. Subsequentemente, a solução é alternadamente pressionada com blocos de aquecimento de alta e baixa temperaturas HB2, que formam ciclos de PCR secundários, e assim uma reação de PCR secundária é realizada. Nesse caso, tanto a primeira válvula de fechamento D1 quanto a segunda válvula de fechamento D2 devem estar em um estado fechado. (d) Após a reação de PCR secundária ser terminada, a segunda válvula de fechamento D2 abre para permitir que a solução de PCR secundária flua para um coxim de carregamento da unidade de análise de fluxo lateral LS. Quando as fitas de DNA de hélice única geradas na reação de PCR secundária encontram ácidos nucleicos de sonda alvo e param de se mover, os alvos podem ser detectados por meio de detecção de marcadores em cada banda.

[134] Embora a presente invenção tenha sido descrita com base em modalidades específicas da mesma, deve ser óbvio para aqueles de habilidade comum no campo da técnica ao qual a presente invenção pertence que o espírito técnico da presente invenção não é limitado às modalidades, que as modificações ou mudanças podem ser feitas dentro do escopo descrito nas reivindicações, e que tais modificações ou mudanças são abrangidas no escopo das seguintes reivindicações. [Descrição de Referências Numéricas] S: substrato-base W: unidade de reação F: filme elástico W1: primeira unidade de PCR W2: segunda unidade de PCR W3: terceira unidade de PCR J: unidade de canal de fluxo J2: segundo canal de fluxo J3: terceiro canal de fluxo V: válvula de retenção Va: bloco de formação de trajeto K: depressão de válvula de retenção Ha: orifício de entrada D, D1, D2: válvula de fechamento LS: unidade de análise de fluxo lateral HB, HB1, HB2: bloco de aquecimento FT: unidade de purificação h1: orifício de injeção hd1, hd2: orifício L1: coxim de carregamento

L2: banda com sonda fixada L3: coxim de absorção

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. PLACA DE ANÁLISE DE REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE DE ALTA VELOCIDADE (PCR), caracterizada por compreender: um substrato-base (S) em que uma entrada é formada; uma unidade de reação (W) formada como uma estrutura fechada no substrato-base (S) fundindo-se um filme de vedação que tem elasticidade ao substrato-base (S) em um formato de uma linha fechada incluindo a entrada; e uma válvula de fechamento (D) fornecida entre a unidade de reação (W) e uma unidade de canal de fluxo (J) conectada à entrada da unidade de reação (W).

2. PLACA DE ANÁLISE DE REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE DE ALTA VELOCIDADE (PCR), caracterizada por compreender: um substrato-base (S) em que uma entrada é formada; uma unidade de reação (W) formada como uma estrutura fechada no substrato-base (S) fundindo-se um filme de vedação que tem elasticidade ao substrato-base (S) em um formato de uma linha fechada incluindo uma entrada; e uma unidade de válvula incluindo uma válvula de retenção (V) configurada para impedir um refluxo de uma solução injetada na unidade de reação (W) e uma unidade de canal de fluxo (J) conectada à entrada da unidade de reação (W).

3. PLACA DE ANÁLISE DE PCR DE ALTA VELOCIDADE, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pela unidade de reação (W) no substrato-base incluir adicionalmente: uma primeira unidade de PCR (W1) e uma segunda unidade de PCR (W2) separadas uma da outra, que são formadas como estruturas fechadas, em que um filme de vedação que tem elasticidade é fundido em um formato de uma linha fechada, em que a primeira unidade de PCR (W1) e a segunda unidade de PCR (W2) se comunicam uma com a outra através de uma segunda unidade de canal de fluxo (J2) formada em uma porção inferior do substrato-base; e uma válvula de fechamento (D) configurada para controlar de modo intermitente um fluxo de um fluido na segunda unidade de canal de fluxo entre a primeira unidade de PCR (W1) e a segunda unidade de PCR (W2).

4. PLACA DE ANÁLISE DE PCR DE ALTA VELOCIDADE, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pela segunda unidade de PCR ser formada fundindo-se um filme de vedação que tem elasticidade em um formato de linhas fechadas que formam uma pluralidade de segundas unidades de PCR que tem segundas entradas e inclui adicionalmente a segunda unidade de canal de fluxo que começa em uma saída da primeira unidade de PCR e é ramificado em um ponto de ramificação em uma pluralidade de canais de fluxo conectados em paralelo com as entradas da pluralidade de segundas unidades de PCR.

5. PLACA DE ANÁLISE DE PCR DE ALTA VELOCIDADE, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por compreender adicionalmente: uma saída formada em uma extremidade da unidade de reação (W) do substrato-base; uma unidade de análise de fluxo lateral (LS) que se comunica com a saída através de uma segunda unidade de canal de fluxo conectada à saída, em que a unidade de análise de fluxo lateral (LS) inclui um módulo de análise de fluxo lateral com uma sonda de ácido nucleico fixada e uma segunda entrada e é formada fundindo-se um filme de vedação com elasticidade em um formato de uma linha fechada; e uma válvula de fechamento (D) configurada para controlar de modo intermitente um fluxo de uma solução na segunda unidade de canal de fluxo que conecta a saída da unidade de reação e a entrada da unidade de análise de fluxo lateral.

6. PLACA DE ANÁLISE DE PCR DE ALTA VELOCIDADE, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por compreender adicionalmente: uma unidade de análise de fluxo lateral (LS) disposta para estar separada da segunda unidade de PCR (W2), incluindo uma terceira entrada, e um módulo de análise de fluxo lateral com uma sonda de ácido nucleico fixada e formada fundindo-se um filme de vedação que tem elasticidade em um formato de uma linha fechada, em que a segunda unidade de PCR (W2) inclui uma segunda saída; uma terceira unidade de canal de fluxo que conecta a segunda saída da segunda unidade de PCR (W2) e a terceira entrada da unidade de análise de fluxo lateral; e uma segunda válvula de fechamento (D2) configurada para controlar de modo intermitente um fluxo de uma solução na terceira unidade de canal de fluxo.

7. PLACA DE ANÁLISE DE PCR DE ALTA VELOCIDADE, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por: a válvula de retenção (V) ser formada de um material elástico e abre por pressão de injetar uma solução em um canal de fluxo; uma superfície da válvula de retenção (V) que faz contato com um lado interno de um filme de vedação ser implantada em um formato de um cone, um cilindro de duas camadas em que um diâmetro superior é no máximo 1/2 de um diâmetro inferior, ou um cilindro que tem projeções formadas em uma superfície superior e permite que uma solução seja permeada; e uma superfície inferior (V2) da válvula de retenção ser implantada como uma superfície de espelho liso e faz contato próximo com uma superfície para um orifício de injeção de solução no substrato-base (S).

8. PLACA DE ANÁLISE DE PCR DE ALTA VELOCIDADE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por: a válvula de fechamento (D) ser formada fundindo-se o filme de vedação que tem elasticidade em um formato de uma linha fechada incluindo uma entrada e uma saída da válvula de fechamento e abre de tal maneira que o filme de vedação seja esticado devido à pressão de uma solução que entra através da entrada e a solução sai através da saída; e quando uma porção superior do filme de vedação ser pressionada com uma unidade de compressão de válvula e o filme de vedação que tem elasticidade faz contato próximo com o substrato-base, a entrada e a saída são fechadas, visto que toda a solução em um espaço interno da válvula de fechamento é drenada.

9. PLACA DE ANÁLISE DE PCR DE ALTA VELOCIDADE, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pela linha fechada formada fundindo-se o filme de vedação que ter elasticidade para o substrato-base tem uma largura de 0,5 mm a 2 mm.

10. PLACA DE ANÁLISE DE PCR DE ALTA VELOCIDADE, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pela linha fechada formada fundindo-se o filme de vedação que tem elasticidade para o substrato-base ser formada para ser projetada a uma altura de 2 mm ou menos no substrato-base S.

11. PLACA DE ANÁLISE DE PCR DE ALTA VELOCIDADE, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo módulo de análise de fluxo lateral ter uma estrutura de papel de fluxo lateral com uma sonda de ácido nucleico fixada, inclui um coxim de carregamento fixado a uma extremidade frontal e um coxim de absorção fixado a uma extremidade dianteira, e inclui uma ou mais sondas de ácido nucleico fixadas a uma pluralidade de arranjos lineares dispostos de modo perpendicular a um fluxo de uma solução.

12. PLACA DE ANÁLISE DE PCR DE ALTA VELOCIDADE, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que: um ou mais pares de iniciadores ou um iniciador/sonda, que é material seco, são aplicados a uma porção adjacente à entrada da unidade de reação; quando uma solução de ácido nucleico alvo que contém polimerases é injetada, visto que o ar dentro da unidade de canal de fluxo e da unidade de reação é comprimido, a solução de ácido nucleico alvo é misturada com o material seco, e o filme de vedação que tem elasticidade é esticado e forma um formato convexo; e quando uma operação de pressionar a superfície convexa do filme de vedação que tem elasticidade com um bloco de pressionamento é repetidamente realizada, a solução injetada se move na unidade de reação, e uma solução de reagente de PCR se torna homogênea.

13. PLACA DE ANÁLISE DE PCR DE ALTA VELOCIDADE, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por: um ou mais iniciadores ou uma mistura de PCR incluindo um iniciador/sonda, que é material seco, serem aplicados a uma porção adjacente à entrada da unidade de reação; quando uma solução de ácido nucleico alvo é injetada, visto que o ar dentro da unidade de canal de fluxo e da unidade de reação é comprimido, a solução é misturada com o material seco, e o filme de vedação que tem elasticidade é esticado e forma um formato convexo; e quando uma operação de pressionar a superfície convexa do filme de vedação que tem elasticidade com um bloco de pressionamento é repetidamente realizada, a solução injetada se move, e uma solução de reagente de PCR se torna homogênea.

14. PLACA DE ANÁLISE DE PCR DE ALTA VELOCIDADE, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por, na segunda unidade de reação, uma mistura de PCR para PCR aninhada incluir um iniciador/sonda ou um iniciador e um corante fluorescente para detecção de DNA, que é material seco, é aplicada.

15. PLACA DE ANÁLISE DE PCR DE ALTA VELOCIDADE, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pela segunda unidade de reação (W) incluir um iniciador marcado que tem a capacidade para se ligar de modo complementar a uma posição 5' de uma fita simples de um DNA amplificado e uma mistura para uma reação de DNA polimerase, as quais são materiais secos, e sondas de um módulo de análise de hibridização têm sequências de ácido nucleico complementares ao DNA de hélice única sintetizada pelo iniciador marcado e são fixadas em um estado sólido.

16. PLACA DE ANÁLISE DE PCR DE ALTA VELOCIDADE, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo iniciador aninhado marcado ser marcado com um material fluorescente, um material quimioluminescente ou nanopartículas de ouro.