PL242508B1 - Przepływowy mikrosystem do przeprowadzenia łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) - Google Patents

Abstract

Przepływowy mikrosystem do przeprowadzenia łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR), stanowiący hybrydowy układ składający się z płytki szklanej oraz hydrofobowej płytki polimerowej z wykonanym systemem mikrokanałów oraz otworem wlotowym i wylotowym. Pod płytką szklaną (2) umieszczony jest nietrwale zintegrowany moduł grzejny (6) o trzech strefach grzejnych (6a, 6b i 6c) a w płytce polimerowej (1) znajdują się mikrokanały reakcyjne meandryczne (3), połączone łukami, ułożone w stosunku do siebie równolegle i składające się z kilkunastu cykli odpowiadających kilkunastom reakcjom PCR, przy czym cyklem jest pierwszy prosty odcinek i drugi odcinek do niego równoległy a mikrokanały reakcyjne posiadają zmienną szerokość w trzech strefach, odpowiadających trzem strefom grzejnym (6a, 6b i 6c) i strefa pierwsza odpowiada początkowi i końcowi mikrokanału (3) w każdym cyklu, strefa środkowa w pierwszym odcinku jest węższa od początku i końca mikrokanału (3) w pierwszym i drugim odcinku odpowiednio a w drugim odcinku szersza od końca i początku mikrokanału (3) w pierwszym i drugim odcinku odpowiednio.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest przepływowy mikrosystem do przeprowadzenia łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). Tego typu mikrosystemy mogą znaleźć zastosowanie w mikrobioanalityce, biologii czy medycynie, a w szczególności w diagnostyce laboratoryjnej.

Łańcuchowa reakcja polimerazy jest metodą powielania (amplifikacji) łańcuchów DNA w wyniku wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki. Znajduje ona zastosowanie między innymi w diagnostyce medycznej np. do wykrywania patogenów, w kryminalistyce, paleontologii czy w ustaleniu ojcostwa. Reakcja PCR polega na wielokrotnym powtarzaniu trzech etapów tj. denaturacji, hybrydyzacji odcinków starterowych oraz elongacji, stanowiących jeden cykl. Każdy z tych etapów przeprowadzany jest w różnych temperaturach, kolejno ok. 95°C, 45-60°C i ok. 72°C. Wartość temperatury oraz liczba cykli jest specyficznie dobrana do prowadzonego oznaczenia stosowanej mieszaniny reakcyjnej. Za pomocą klasycznych metod rekcja PCR wykonywana jest w tzw. termocyklerach, w których temperatura zm ieniana jest w czasie. Czas trwania oznaczenia wynosi co najmniej 60 min. Opracowywane są nowe rozwiązania, które umożliwiłyby skrócenie czasu analizy, zwiększyłyby czułość oznaczenia czy mogłyby stanowić przenośne narzędzia diagnostyczne typu Point-of-care. W literaturze prezentowane są statyczne i przepływowe mikrosystemy, w których wykorzystywane są wewnętrzne i zewnętrzne systemy grzejne umożliwiające zmianę temperatury. Niemniej jednak wiele proponowanych rozwiązań posiada ograniczenia technologiczne czy materiałowe, związane z możliwością wykonania dowolnych mikrostruktur. Z publikacji Cao QingQing et al. „Plastic microfluidic chip for continuous-flow polymerase chain reaction: simulations and experiments” Biotechnol. J. 2011 February; 6 (2): 177-184, znane jest urządzenie do badania reakcji łańcuchowej polimerazy o ciągłym przepływie (CF-PCR) zawierające pojedynczy kanał płynowy, który jest ogrzewany w różny sposób, tak aby wytworzyć przestrzenne zmiany temperatury układu dla trzech etapów PCR (denaturacji, hybrydyzacji odcinków starterowych oraz elongacji).

Mikrosystem według wynalazku stanowi hybrydowy układ składający się z płytki szklanej, korzystnie ze szkła sodowego oraz hydrofobowej płytki polimerowej, która jest materiałem przezroczystym, odpornym na działanie wysokich temperatur (do 100°C) oraz umożliwiającym wykonanie w nim mikrostruktur, korzystnie poli(dimetylosiloksan) (PDMS). Mikrostruktury systemu wytworzono w PDMS metodą odlewu. Metoda odlewu polega na usieciowaniu prepolimeru PDMS z czynnikiem sieciującym na tzw. pieczątce, stanowiącej negatywowe odzwierciedlenie mikrostruktur uzyskiwanych w płytce polimerowej. Płytka szklana i PDMS mikrosystemu są ze sobą trwale połączone za pomocą plazmy tlenowej. Pod płytką szklaną umieszczony jest nietrwale zintegrowany moduł grzejny, zapewniający utrzymywanie trzech różnych temperatur w trzech strefach grzejnych. W płytce PDMS znajdują się: otwór wlotowy, otwór wylotowy oraz mikrokanały reakcyjne meandryczne, przeznaczone do przeprowadzenia reakcji. Mikrokanały są ze sobą połączone łukami, ułożone są w stosunku do siebie równolegle i składają się z kilkunastu, korzystnie 34 cykli odpowiadających 34 reakcjom PCR. Cyklem jest pierwszy prosty odcinek i drugi odcinek do niego równoległy. Mikrokanały reakcyjne posiadają zmienną szerokość w trzech strefach, odpowiadających trzem strefom grzejnym. Strefa pierwsza odpowiada początkowi i końcowi mikrokanału w każdym cyklu , a strefa środkowa w pierwszym odcinku jest węższa od początku i końca mikrokanału w pierwszym i drugim odcinku odpowiednio, ale w drugim odcinku szersza od końca i początku mikrokanału w pierwszym i drugim odcinku odpowiednio. Zmienną szerokość dobrano w taki sposób, aby mieszanina reakcyjna pozostawała w danej strefie przez odpowiednio dobrany czas, zależny od zadanego przepływu mieszaniny reakcyjnej. Stosunek czasu przebywania mieszaniny reakcyjnej w trakcie przepływu w kolejnych strefach grzejnych wynosi 4 : 4 : 3. Płytka szklana stanowi uszczelnienie mikrokanałów wytworzonych w płytce polimerowej oraz materiał zapewniający dobre przewodzenie ciepła z modułu grzejnego zintegrowanego z przepływowym mikrosystemem.

Mikrosystem według wynalazku jest nietrwale zintegrowany z modułem grzejnym zapewniającym utrzymywanie trzech różnych temperatur w trzech strefach grzejnych. Mikrosystem według wynalazku połączony jest symetrycznie z modułem grzejnym w taki sposób, że rozmieszczenie mikrokanałów reakcyjnych względem trzech stref grzejnych zapewnia przebywanie mieszaniny reakcyjnej w każdej ze stref w stosunku czasowym 4 : 4 : 3 (tzn. dla przepływu 1 μl/min wynosi on 1 min, 1 min, 45 s). Moduł grzejny korzystnie stanowi sześć połączonych ze sobą elementów grzejnych, korzystnie o wymiarach 70,53 χ 9,53 mm każda. Jedną strefę grzejną stanowią dwa elementy grzejne umieszczone obok siebie. Strefy grzejne ustawione były tak, aby temperatura zmieniała się gradientowo, w kolejności korzystnie 94°C, 72°C i 55°C. W celu uzyskania równomiernego rozkładu temperatury układ elementów grzejnych umieszczono na płytce, korzystnie aluminiowej o wymiarach odpowiadających wykonanemu przepływowemu mikrosystemowi do przeprowadzenia PCR.

Mikrosystem według wynalazku został zaprojektowany w taki sposób, że możliwe jest przeprowadzenie w nim łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). W celu przeprowadzenia eksperymentu w pierwszym etapie uruchomiany jest moduł grzejny umożliwiający uzyskanie trzech stref temperaturowych, w których wartości temperatur są dobrane w taki sposób, aby w przepływowym mikrosystemie możliwe było przeprowadzenie trzech etapów reakcji: denaturacji, hybrydyzacji odcinków starter owych oraz elongacji. Następnie do przepływowego mikrosystemu za pomocą otworu wlotowego wprowadzana jest wstępnie przygotowana mieszanina reakcyjna umożliwiająca przeprowadzenie reakcji PCR. Mieszanina korzystnie składa się z Polimerazy HotStart Taq, mieszaniny deoksynukleotydów (dNT P), jonów magnezu w postaci MgC2, specjalnie zaprojektowanej pary starterów oraz DNA matrycowego. Mieszanina przepływa w zaprojektowanych mikrokanałach reakcyjnych w taki sposób, że ulega ona kolejno podgrzaniu i ochłodzeniu w kolejnych strefach grzejnych, utrzymujących zadaną temperaturę dzięki działaniu modułu grzejnego. Jednokrotne przepłynięcie mieszaniny reakcyjnej przez trzy strefy grzejne odpowiada jednemu cyklowi reakcji PCR. Mikroukład według wynalazku został zaprojektowany w taki sposób, że mikrokanały reakcyjne meandryczne ułożone są w trzech strefach grzejnych w taki sposób, że możliwe jest przeprowadzanie reakcji PCR korzystnie w 34 cyklach. Po przepłynięciu mieszaniny reakcyjnej przez przepływowy mikrosystem mieszanina za pomocą otworu wylotowego zbierana jest do odpowiednich probówek celem oznaczenia produktu reakcji.

Wartość przepływu wprowadzanej mieszaniny reakcyjnej determinuje czas przeprowadzenia reakcji.

Mikrosystem według wynalazku charakteryzuje się tym, że w przepływie, operując wyłącznie wartościami przepływu mieszaniny reakcyjnej, możliwe jest szybkie przeprowadzenie łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). Istnieje możliwość optymalizacji pracy mikrosystemu do oznaczania różnych analitów poprzez zmianę temperatury oraz przepływu mieszaniny reakcyjnej. Moduł grzejny nietrwale zintegrowany z mikrosystemem wykorzystywany może być wielokrotnie. Mikrosystem według wynalazku może stać się alternatywnym rozwiązaniem do tradycyjnych metod prowadzenia reakcji PCR pozwalającym na szybką analizę wybranego analitu.

Mikrosystem według wynalazku został zilustrowany w przykładzie wykonania. Na rysunku Fig. 1 przedstawia schemat mikrokanałów reakcyjnych mikrosystemu w widoku z góry, Fig. 2 przedstawia widok perspektywiczny kolejnych warstw mikrosystemu oraz modułu grzejnego, a Fig. 3 przedstawia mikrosystem zintegrowany z modułem grzejnym w rzucie ukośnym.

Mikrosystem wykonano z płytki polimerowej 1 oraz płytki szklanej 2. Wykonanie przepływowego mikrosystemu do przeprowadzenia łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) rozpoczyna się od zaprojektowania w programie AutoCAD odpowiednich mikrostruktur. Następnie wykonywana jest tzw. maska, którą stanowi folia, na której w wysokiej rozdzielczości 3600 dpi naświetlono geometrię mikrostruktur. Mikrostruktury odwzorowywane są za pomocą metody fotolitografii polegającej na naświetleniu światłem UV filmu kapilarnego o grubości 100 μm. W ten sposób tworzone są tzw. pieczątki. W płytce polimerowej 1 wykonanej z poli(dimetylosiloksanu) za pomocą metody odlewu wytwarzane są mikrokanały reakcyjne 3 o ułożeniu meandrycznym w 34 powtórzeniach (cyklach). Wytworzenie mikrokanałów reakcyjnych 3 polega na wylaniu płynnego prepolimeru na wykonaną pieczątkę z wypukłą mikrostrukturą, a następnie jego usieciowaniu w temperaturze 70°C przez 60 min. W mikrokanałach reakcyjnych 3 wyróżnić można trzy strefy 1a, 1b oraz 1c, w każdej z nich znajdują się mikrokanały reakcyjne 3 o różnej szerokości i długości A i B. Mikrokanały reakcyjne 3 mają wysokość 100 μm oraz szerokość: w strefie 1a 350 μm, w strefie 1b naprzemiennie 150 μm oraz 530 μm, w strefie 1c 350 μm. Odległość między mikrokanałami reakcyjnymi 3 wynosi 680 μm. Szerokość strefy 1a wynosi 14,09 mm, 1b 19,06 mm, 1c 10,45 mm. Długość wszystkich stref wynosi 70,04 mm. Mikrokanały reakcyjne 3 posiadają otwór wlotowy 4 oraz otwór wylotowy 5, wykonane poprzez zamrożenie usieciowanej płytki polimerowej 1 w ciekłym azocie, a następnie wywiercenie otworów. Tak wykonaną płytkę polimerową 1 trwale połączono z płytką szklaną 2 z wykorzystaniem plazmy tlenowej. W wykonanych otworach 4 oraz 5 umieszczono wężyki. Mikrosystem według wynalazku połączono symetrycznie z modułem grzejnym 6 złożonym z sześciu połączonych ze sobą elementów grzejnych 7 oraz z płytki wykonanej z aluminium 8. Elementy grzejne 7, każda o wymiarach 70,53 mm χ 9,53 mm, połączono z płytką 8 za pomocą dwustronnej taśmy klejącej o dużym przewodnictwie cieplnym. Każdy z dwóch sąsiednich elementów grzejnych został połączony z zewnętrznym środowiskiem, umożliwiając uzyskanie trzech stref grzejnych 6a, 6b oraz 6c. Mikrosystem według wynalazku został umieszczony na module grzejnym 6, w taki sposób, że mikrokanały reakcyjne 3 ze strefy 1a, 1b oraz 1c odpowiadały strefom grzejnym 6a, 6b oraz 6c.

Mikrosystem według wynalazku został wykorzystany do przeprowadzenia reakcji polimerazy w celu amplifikacji fragmentu genu tox bakterii Corynebacterium diphteriae. W tym celu wykonany przepływowy mikrosystem został wypełniony roztworem surowiczej albuminy wołowej, inkubowany 24 h i przepłukany wodą wolną od nukleaz. Uruchomiono moduł grzejny 6, uzyskując temperaturę w strefach grzejnych 6a, 6b oraz 6c kolejno: 94°C, 72°C i 55°C. Przygotowany mikrosystem według wynalazku został umieszczony na module grzejnym 6 symetrycznie do zaprojektowanych stref 1a, 1b oraz 1c z mikrokanałami reakcyjnymi 3. Wstępnie przygotowaną mieszaninę reakcyjną wprowadzano otworem wlotowym 4. W skład mieszaniny reakcyjnej wchodziły: Polimeraza HotStar Taq, mieszanina deoksynukleotydów (dNTP), jony magnezu w postaci MgCl2, specjalnie zaprojektowana para starterów WHO1 i WHO2 oraz DNA matrycowe. Mieszanina reakcyjna przepływała w mikrokanałach reakcyjnych 3 przez kolejne strefy grzejne z prędkością 10 μl/min. Czas potrzebny na przepłynięcie mieszaniny reakcyjnej przez mikrokanały 3 w 34 cyklach wynosił 12 min. Po tym czasie mieszaninę poreakcyjną zbierano przez otwór wylotowy 5 do probówki typu eppendorf i oznaczano obecność jak i rozmiar fragmentu DNA za pomocą elektroforezy żelowej.

Claims (3)

1. Przepływowy mikrosystem do przeprowadzenia łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR), stanowiący hybrydowy układ składający się z płytki szklanej oraz hydrofobowej płytki polimerowej z wykonanym systemem mikrokanałów oraz otworem wlotowym i wylotowym, znamienny tym, że pod płytką szklaną (2) umieszczony jest nietrwale zintegrowany moduł grzejny (6), który składa się z sześciu połączonych ze sobą elementów grzejnych (7) oraz z płytki (8) wykonanej z aluminium o trzech strefach grzejnych (6a), (6b) i (6c), zaś w płytce polimerowej (1) znajdują się mikrokanały reakcyjne meandryczne (3), połączone łukami, ułożone w stosunku do siebie równolegle i składające się z 34 cykli odpowiadających 34 reakcjom PCR, przy czym cyklem jest pierwszy prosty odcinek i drugi odcinek do niego równoległy a mikrokanały reakcyjne posiadają zmienną szerokość w trzech strefach (1a), (1b) i (1c), odpowiadających trzem strefom grzejnym (6a), (6b) i (6c), przy czym mikrokanały reakcyjne mają wysokość 100 μm oraz szerokość w strefie 1a równą 350 μm, w strefie 1b naprzemiennie równą w pierwszym odcinku 150 μm i w drugim odcinku 530 μm, w strefie 1c równą 350 μm, a odległość między mikrokanałami reakcyjnymi (3) wynosi 680 μm, zaś stosunek czasowy przebywania mieszaniny reakcyjnej w każdej ze stref wynosi 4 : 4 : 3 dla przepływu 1 μl/min.

2. Mikrosystem według zastrz. 1 znamienny tym, że elementy grzejne (7) każdy o wymiarach 70,53mm χ 9,53 mm, połączone są z płytką (8) za pomocą dwustronnej taśmy klejącej o dużym przewodnictwie cieplnym, ponadto każdy z dwóch sąsiednich elementów grzejnych (7) połączony jest z zewnętrznym środowiskiem umożliwiając uzyskanie trzech stref grzejnych (6a), (6b) oraz (6c).

3. Mikrosystem według zastrz. 1 znamienny tym, że płytka polimerowa (1) wykonana jest z poli(dimetylosiloksanu), a płytka szklana (2) wykonana jest ze szkła sodowego.