BR112020018616A2 - Métodos para a co-produção de etileno glicol e compostos de três carbonos - Google Patents

Abstract

métodos para a co-produção de etileno glicol e compostos de três carbonos. a presente invenção refere-se a processos biológicos e sistemas simples e/ou de multi-estágio para converter c5, c6 e/ou fontes de carbono de dissacarídeo a produtos desejáveis incluindo monoetileno glicol (meg) e um ou mais compostos de três carbonos tais como acetona, isopropanol ou propeno. o meg e um ou mais compostos de três carbonos no presente documento descritos são úteis como material de partida para produção de outros compostos, ou como produtos finais para uso industrial e doméstico. a invenção adicionalmente refere-se aos processos que efetuam fermentações de substratos em um biorreator de fase simples ou em um biorreator de multifase compreendendo fases de crescimento e produção. adicionalmente, os processos e sistemas no presente documento descritos resultam em alta produtividade e rendimento dos produtos desejados devido a remoção intermitente ou continua de produtos para evitar efeitos inibitórios.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS PARA A CO-PRODUÇÃO DE ETILENO GLICOL E COMPOSTOS DE TRÊS CARBONOS".

REFERÊNCIA CRUZADA À PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade ao Pedido Provisório U.S. Nº. 62/641,830, depositado em 12 de março de 2018; que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO

[0002] A presente invenção refere-se a processos biológicos e sistemas para converter fontes de carbono C5 e/ou C6 em produtos desejados por fermentação microbial. O presente pedido também refere-se aos processos e sistemas utilizando estágio(s) de biorreator simples e/ou múltiplos para produzir monoetileno glicol (MEG) e um ou mais compostos de três carbonos tais como acetona, isopropanol, ou propeno com alto rendimento simultâneo e produtividade.

ANTECEDENTES

[0003] Compostos orgânicos, tais como monoetileno glicol (MEG), e os compostos C3 acetona (ACE), isopropanol (IPA) e propeno são valiosos como matéria-prima para a produção de materiais tais como tereftalato de polietileno (PET), resinas de MEG, e o polipropileno plástico de propeno. Estes compostos orgânicos são diretamente usados para proposta industrial ou doméstica.

[0004] Contudo, os compostos são atualmente produzidos de precursores que se originam de combustíveis fósseis, que contribuem para a mudança do clima. Devido aos problemas ambientais com emissões de gás de estufa de combustível fóssil, ênfase em fontes de energia renovável tem sido globalmente aumentada. Para acompanhar as requisições globais, o meio acadêmico e indústria têm chamado a atenção ao desenvolvimento de matéria-prima ecologicamente renovável. Enquanto que os pesquisadores têm projetado microorganismos com trajetórias biossintéticas para produzir MEG ou IPA separadamente, estas trajetórias são desafiantes principalmente devido à perda de rendimento de produto e balanço redox, que são alguns obstáculos a superar. Também, um grande volume de microorganismos recombinantes em um biorreator causa outro desafio de remoção de biomoléculas excessivas produzidas durante a produção de produtos finais.

[0005] Desse modo, existe uma necessidade de processos biológicos e sistemas aperfeiçoados para a produção simultânea de MEG e compostos de três carbonos tais como ACE, IPA e propeno em biorreator(es) simples e/ou múltiplo em uma maneira eficiente, econômica, ecológica, e consistente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] O presente pedido refere-se a métodos de coprodução de monoetileno glicol e um ou mais compostos C3.

[0007] Em um aspecto, a presente invenção proporciona Processo biológico para produção de dois ou mais produtos desejáveis simultaneamente, Processo compreendendo (a) proporcionar a pelo menos um biorreator um ou mais microorganismos recombinantes projetados para expressar um ou mais enzimas de uma ou mais trajetórias de biossíntese selecionadas de uma trajetória de biossíntese de monoetileno glicol (MEG) e um ou mais trajetórias de biossíntese de compostos C3; (b) cultivar o um ou mais microorganismos recombinantes de (a) em um ou mais estágios em um meio de cultura contendo uma matéria-prima compreendendo um ou mais substratos compreendendo C5 hidratos de carbono, C6 hidratos de carbono, e/ou dissacarídeos; (c) fermentar a cultura em um ou mais estágios sob condições aeróbica, microaeróbica e/ou anaeróbica; e (d) recuperar do biorreator MEG e pelo menos um segundo produto desejável de (c) selecionado a partir do grupo consistindo de acetona, isopropanol, propeno, precursores destes, e misturas destes; no qual o pelo menos um segundo produto desejável é recuperado continuamente antes da exaustão do um ou mais substratos.

[0008] Em um aspecto, a presente invenção proporciona Processo biológico para produção de dois ou mais produtos desejáveis simultaneamente, Processo compreendendo: (a) fornecer a um biorreator um ou mais microorganismos recombinantes projetados para expressar uma ou mais enzimas de uma ou mais trajetórias de biossíntese selecionadas de uma trajetória de biossíntese de monoetileno glicol (MEG) e um ou mais trajetórias de biossíntese de composto C3; (b) cultivar o microorganismo recombinante de (a) em um ou mais estágios em um meio de cultura contendo uma matéria- prima compreendendo um ou mais substratos compreendendo C5 hidratos de carbono, C6 hidratos de carbono, e/ou dissacarídeos; (c) fermentar a cultura em um ou mais estágios sob condições aeróbica, microaeróbica e/ou anaeróbica; e (d) recuperar a partir do biorreator o MEG e pelo menos um segundo produto desejável de (c) selecionado a partir do grupo consistindo de acetona, isopropanol, propeno, precursores destes, e misturas destes; no qual o pelo menos um segundo produto desejável é recuperado a partir do biorreator duas ou mais vezes antes da exaustão do um ou mais substratos.

[0009] Em um aspecto, a presente invenção fornece um processo para produção de dois ou mais produtos desejáveis simultaneamente, Processo compreendendo: (a) fornecer a um biorreator um ou mais microorganismos recombinantes projetados para expressar uma ou mais enzimas de uma ou mais trajetórias de biossíntese selecionadas de uma trajetória de biossíntese de monoetileno glicol (MEG) e uma ou mais trajetórias de biossíntese de composto C3; (b) cultivar o um ou mais microorganismos recombinantes de (a) em um ou mais estágios em um meio de cultura contendo uma matéria-prima compreendendo um ou mais substratos compreendendo C5 hidratos de carbono, C6 hidratos de carbono, e/ou dissacarídeos; (c) fermentar a cultura em um ou mais estágios sob condições aeróbica, microaeróbica e/ou anaeróbica; e (d) recuperar a partir do biorreator MEG e pelo menos um segundo produto desejável de (c) selecionado a partir do grupo consistindo de acetona, isopropanol, propeno, precursores destes, e misturas destes; no qual o pelo menos um segundo produto desejável é recuperado a partir do biorreator continuamente antes da exaustão do um ou mais substratos; e no qual (b) e (c) ocorrem juntos no mesmo estágio.

[0010] Em um aspecto, a presente invenção fornece um processo para produção de dois ou mais produtos desejáveis simultaneamente, Processo compreendendo: (a) fornecer a um biorreator um ou mais microorganismos recombinantes projetados para expressar uma ou mais enzimas de uma ou mais trajetórias de biossíntese selecionadas de uma trajetória de biossíntese de monoetileno glicol (MEG) e uma ou mais trajetórias de biossíntese de composto C3; b) cultivar o um ou mais microorganismos recombinantes de (a) em um ou mais estágios em um meio de cultura contendo uma matéria-prima compreendendo um ou mais substratos compreendendo C5 hidratos de carbono, C6 hidratos de carbono, e/ou dissacarídeos; (c) fermentar a cultura em um ou mais estágios sob condições aeróbica, microaeróbica e/ou anaeróbica; e (d) recuperar a partir do biorreator em um ou mais estágios MEG e pelo menos um segundo produto desejável de (c) selecionado a partir do grupo consistindo de acetona, isopropanol, propeno, precursores destes, e misturas destes; no qual o pelo menos um segundo produto desejável é recuperado a partir do biorreator continuamente antes da exaustão do um ou mais substratos; e no qual (b) e (c) ocorrem em estágios separados.

[0011] Em alguns aspectos, o um ou mais microorganismos recombinantes são projetados para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo consistindo de: D-tagatose 3-epimerase, D-ribulokinase D-ribulose-1-fosfato aldolase, glico aldeído reductase, tiolase, acetato:acetoacetil-CoA transferase, acetoacetato decarboxilase, D-xilulose 1-kinase, D-xilulose-1-fosfato aldolase, xilose isomerase, xilose reductase, xilitol dehidrogenase, xilose dehidrogenase, xilonolactonase, xilonato dehidratase, 2-ceto-3-deoxi- D-pentonato aldolase, álcool secundário dehidrogenase, dehidratase, e uma variante funcionalmente equivalente de qualquer um ou mais destes.

[0012] Em aspectos adicionais, o um ou mais microorganismos recombinantes são derivados de um microorganismo de origem selecionado a partir do grupo consistindo de Clostridium sp., Clostridium ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ragsdalei, Eubacterium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Moorella thermoacetica, Clostridium aceticum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Clostridium drakei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium formicoaceticum, Clostridium scatologenes, Moorella thermoautotrophica, Acetonama longum, Blautia producta, Clostridium glycolicum, Clostridium magnum, Clostridium mayombei, Clostridium methoxybenzovorans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Oxobacter pfennigii, Thermoanaerobacter kivui, Sporomusa ovata, Thermoacetogenium phaeum, Acetobacterium carbinolicum, Sporomusa termitida, Moorella glycerini, Eubacterium aggregans, Treponema azotonutricium, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pseudomonas putida, Bacillus sp., Corynebacterium sp., Yarrowia lipolytica, Scheffersomyces stipitis e Terrisporobacter glycolicus.

[0013] Em alguns aspectos, o um ou mais microorganismos recombinantes são acetogênicos.

[0014] Em alguns aspectos, as uma ou mais trajetórias de biossíntese de composto C3 são selecionadas a partir do grupo consistindo de: uma trajetória de biossíntese de acetona, uma trajetória de biossíntese de isopropanol e uma trajetória de biossíntese de propeno. Em alguns aspectos, o um ou mais substratos são C5 hidratos de carbono selecionado a partir do grupo consistindo de xilose, arabinose, lixose, ribose, ribulose e xilulose. Em alguns aspectos, o um ou mais substratos são C6 hidratos de carbono selecionados a partir do grupo consistindo de glicose, manose, frutose, alose, gulose, idose, galactose, talose, sorbose, tagatose e psicose. Em alguns aspectos, o um ou mais substratos são dissacarídeos selecionados a partir do grupo consistindo de sacarose, lactose, lactulose, maltose, trehalose, celobiose e chitobiose. Em alguns aspectos, o um ou mais substratos compreendem C5 hidratos de carbono e C6 hidratos de carbono em uma proporção de 20:1 a 1:20.

[0015] Em alguns aspectos, o um ou mais produtos desejados são selecionados a partir do grupo consistindo de MEG, acetona, isopropanol e propeno.

[0016] Em alguns aspectos, a etapa de cultivo e etapa de fermentação ocorrem no mesmo estágio. Em alguns aspectos, a etapa de cultivo e etapa de fermentação ocorrem em estágios separados. Em alguns aspectos, a etapa de cultivo e etapa de fermentação ocorrem em biorreatores separados. Em alguns aspectos, a etapa de cultivo e etapa de fermentação ocorrem no mesmo biorreator.

[0017] Em alguns aspectos, o biorreator opera sob condições aeróbicas, microaeróbicas ou anaeróbicas; ou uma combinação destas. Em alguns aspectos, um primeiro estágio do cultivo opera sob condições aeróbicas ou microaeróbicas condições, e quais estágios subsequentes operam sob condições aeróbicas, microaeróbicas ou anaeróbicas.

[0018] Em alguns aspectos, o um ou mais estágios da etapa de fermentação recebem a cultura e/ou meio de cultura como uma alimentação de modo descontínua, uma alimentação de modo alimentada descontínua, ou uma alimentação de modo contínua. Em alguns aspectos, o estágio de cultivo recebe a cultura e/ou meio de cultura como uma alimentação de modo descontínua, uma alimentação de modo alimentada descontínua, ou uma alimentação de modo contínua, e quaisquer subsequentes estágios operam como uma alimentação de modo descontínua, uma alimentação de modo alimentada descontínua, ou uma alimentação de modo contínua. Em alguns aspectos, a etapa de cultivo ocorre em um tipo diferente de biorreator do que a etapa subsequente. Em alguns aspectos, as etapas de cultivo ocorrem no mesmo topo de biorreator como a etapa subsequente.

[0019] Em alguns aspectos, uma matéria-prima adicional compreendendo um substrato gasoso é fornecida ao biorreator. Em alguns aspectos, o substrato gasoso compreende gás hidrogênio, monóxido de carbono, dióxido de carbono, ou combinações destes.

[0020] Em alguns aspectos, a acetona, isopropanol, e/ou propeno são produzidos, e no qual referida acetona, isopropanol, e/ou propeno, ou uma mistura destes, são recuperados a partir do biorreator continuamente in situ.

[0021] Em alguns aspectos, a etapa de cultivo ocorre antes da etapa de fermentação. Em alguns aspectos, a etapa de cultivo e a etapa de fermentação ocorrem concorrentemente.

[0022] Em alguns aspectos, o pelo menos um segundo produto desejável recuperado é acetona e/ou isopropanol. Em alguns aspectos, a acetona, isopropanol, e/ou MEG, no total, são produzidos em uma quantidade de pelo menos cerca de 2 kg/m3 por hora. Em alguns aspectos, uma concentração de acetona, isopropanol e/ou MEG produzidos é pelo menos cerca de 40 g/L.

[0023] Em alguns aspectos, a concentração de oxigênio na etapa de cultivo é ajustada a uma faixa de 1% a 50% de oxigênio dissolvido no meio. Em alguns aspectos, a quantidade total do um ou mais substratos que são fornecidos à etapa de cultivo varia de cerca de 10 kg/m3 a cerca de 500 kg/m3.

[0024] Em alguns aspectos, o meio de cultura compreende carbono (C) que é fornecido de C5 hidratos de carbono, C6 hidratos de carbono, e/ou dissacarídeos. Em alguns aspectos, o meio de cultura compreende nutrientes essenciais incluindo nitrogênio (N), fósforo (P), magnésio (Mg), e ferro (Fe). Em alguns aspectos, a razão de C:N na etapa de cultivo é pelo menos 10:1. Em alguns aspectos, a razão de C:P na etapa de cultivo é pelo menos 5:1. Em alguns aspectos, a razão de C:Mg na etapa de cultivo é pelo menos 50:1. Em alguns aspectos, a razão de C:Fe na etapa de cultivo é pelo menos 300:1

[0025] Em alguns aspectos, a concentração final de massa de célula do um ou mais microorganismos recombinantes na etapa de cultivo varia de cerca de 1 kg/m3 a cerca de 100 kg/m3 como de uma massa de célula seca. Em alguns aspectos, a etapa de cultivo opera de 5 até 100 horas para o cultivo das células do um ou mais microorganismo recombinante.

[0026] Em alguns aspectos, a cultura na etapa de fermentação compreende cerca de 1% a cerca de 30% da massa de célula, que é transferida a partir da etapa de cultivo no meio de cultura com o um ou mais substratos. Em alguns aspectos, a concentração de oxigênio na etapa de fermentação é ajustada a uma faixa de 0% a 10% de oxigênio dissolvido no meio. Em alguns aspectos, a quantidade total do um ou mais substratos que são fornecidos à etapa de fermentação varia de cerca de 100 kg/m3 a cerca de 800 kg/m3.

[0027] Em alguns aspectos, a razão de C:N na etapa de fermentação é pelo menos 50:1. Em alguns aspectos, a razão de C:P na etapa de fermentação é pelo menos 20:1. Em alguns aspectos, a razão de C:Mg na etapa de fermentação é pelo menos 200:1. Em alguns aspectos, a razão de C:Fe na etapa de fermentação é pelo menos 800:1. Em alguns aspectos, a etapa de fermentação opera de 10 até 00 horas para operação alimentada descontínua e até 300 horas para operação contínua.

[0028] Em alguns aspectos, a quantidade total do um ou mais substratos que são fornecidos ao biorreator varia de cerca de 100 kg/m3 a cerca de 800 kg/m3. Em alguns aspectos, a razão C:N no biorreator é pelo menos 10:1. Em alguns aspectos, a razão de C:P na etapa de fermentação é pelo menos 5:1. Em alguns aspectos, a razão de C:Mg na etapa de fermentação é pelo menos 50:1. Em alguns aspectos, a razão de C:Fe na etapa de fermentação é pelo menos 300:1. Em alguns aspectos, a etapa de fermentação operas entre 10 e 300 horas.

[0029] Em alguns aspectos, os produtos desejáveis que são recuperados a partir da etapa de fermentação são acetona, isopropanol, MEG, e/ou propeno. Em alguns aspectos, a acetona é produzida pelo menos cerca de 20 kg/m3. Em alguns aspectos, o isopropanol é produzido pelo menos cerca de 35 kg/m3. Em alguns aspectos, o MEG é produzido pelo menos cerca de 100 kg/m3. Em alguns aspectos, a acetona e/ou isopropanol é removido a partir do caldo de fermentação in situ. Em alguns aspectos, os três ou mais produtos desejáveis são produzidos simultaneamente.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0030] Modalidades ilustrativas da invenção são ilustradas nos desenhos, em que:

[0031] Figura 1 ilustra a tolerância de E. coli crescido em meio de cultura com valores aumentados de acetona (ACE) e MEG.

[0032] Figura 2 ilustra a tolerância de E. coli crescido em meio de cultura com valores aumentados de acetona (ACE).

[0033] Figura 3 mostra o efeito de taxa de agitação de fita de acetona de caldo de cultura usado para aliviar inibição de E. coli acetona no biorreator.

[0034] Figura 4 ilustra a tolerância de E. coli crescido no meio de cultura com valores aumentados de monoetileno glicol (MEG) a um valor fixo de acetona (ACE).

[0035] Figura 5 descreve a produção de monoetileno glicol e acetona com o tempo em um processo de uma fase usando uma cepa de recombinante E. coli.

[0036] Figura 6 descreve a influência de razão de C/N na produção simultânea de E. coli de MEG e ACE.

[0037] Figura 7 descreve a produção de monoetileno glicol e acetona com o tempo em um biorreator descontínuo com pulso de carbono usando cepa recombinante E. coli.

[0038] Figura 8 ilustra a produção de monoetileno glicol e acetona em um biorreator alimentado descontínuo usando uma cepa recombinante E. coli.

[0039] Figura 9 ilustra o diagrama de processo de fluxo de operação de monoetileno glicol, acetona, e isopropanol (IPA) e propeno. Legenda: BR01 – biorreator para fase de propagação, BR02 – biorreator para fase de produção, TK – tanque de armazenagem para meio de cultura estéril, MF – módulos de microfiltração para separação de célula, GS – lavador de gás para lavagem de gás e recuperação de ACE/IPA, PVM – módulos de pervaporação para recuperação de produto, PU01 a PU06 – bombas para fluxo de meio de cultura e caldo de fermentação, VP01 – bomba de vácuo para módulos de PVM, CD – condensador para módulos de PVM.

DESCRIÇÃO DETALHADA Definições

[0040] As seguintes definições e abreviações são para serem usadas para a interpretação da invenção.

[0041] Conforme no presente documento usado e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "um", "uma", e "o" incluem formas plurais, a menos que o contexto indique claramente de outro modo. Desse modo, por exemplo, referência a "um composto de três carbonos" inclui uma pluralidade de compostos de três carbonos e referência ao "o microorganismo" inclui referência a um ou mais microorganismos, e assim por diante.

[0042] Conforme no presente documento usado, os termos "compreende", "compreendendo", "inclui", "incluindo", "tem", "tendo", "contém", "contendo", ou qualquer outra variação destes, são previstos para cobrirem uma inclusão não-exclusiva. Uma composição, mistura, processo, método, artigo, ou aparelho que compreende uma lista de elementos não é necessariamente limitado a somente aqueles elementos, mas podem incluir outros elementos não expressamente listados ou inerentes a tal composição, mistura, processo, método, artigo ou aparelho. A i n d a , a menos que expressamente citado ao contrário, "ou" se refere a um inclusivo "ou", e não a um exclusivo "ou".

[0043] Os termos "cerca de" e "ao redor de", conforme no presente documento usado p a r a modificar um valor numérico, indica uma faixa próxima que circunda aquele valor explícito. Se "X" foi o valor, "cerca de X" ou "ao redor de X" indicaria um valor de 0,9X a 1,1X, ou, em algumas modalidades, um valor de 0,95X a 1,05X. Qualquer referência a "cerca de X" ou "ao redor de X" especificamente indica pelo menos os valores X, 0,95X, 0,96X, 0,97X, 0,98X, 0,99X, 1,01X, 1,02X, 1,03X, 1,04X, e 1,05X. Desse modo, "cerca de X" e "ao redor de X" são pretendidos para ensinar e fornecer suporte de descrição escrita para uma limitação de reivindicação de, por exemplo, "0,98X".

[0044] Conforme no presente documento usado, os termos

"microbial", "organismo microbial", e "microorganismo" incluem qualquer organismo que existe como uma célula microscópica que é incluído dentro dos domínios de archaea, bactéria ou eucariote, a última incluindo levedura e fungo filamentoso, protozoário, algas, ou Protista mais alta. Portanto, o termo é previsto para e n v o l v e r c é l u l a s procarióticas ou eucarióticas ou organismos tendo um tamanho microscópico e incluem bactéria, archaea, e eubactéria de todas as espécies, bem como microorganismos eucarióticos tais como levedura e fungos. Também incluídas estão culturas de célula de qualquer espécie que podem ser cultivadas para a produção de um químico.

[0045] Conforme no presente documento descrito, em algumas modalidades, os microorganismos recombinantes são microorganismos procarióticos. Em algumas modalidades, os microorganismos procarióticos são bactérias. "Bactérias", ou "eubactérias", se referem a um domínio de organismos procarióticos. Bactérias incluem pelo menos onze grupos distintos conforme segue: (1) bactéria Gram-positiva (gram+), da qual existem duas subdivisões maiores: (1) grupo alto G+C (Actinomycetes, Mycobacteria, Micrococcus, outros) (2) grupo baixo G+C (Bacillus, Clostridia, Lactobacillus, Staphylococci, Streptococci, Mycoplasmas); (2) Proteobactérias, por exemplo, bactérias Gram-negativa +não- fotossintética púrpura (incluem muitas bactérias Gram-negativa "comum"); (3) Cyanobacteria, por exemplo, fototrofos oxigenioico; (4) Spirochetes e espécies relacionadas; (5) Planctomyces; (6) Bacteroides, Flavobacteria; (7) Chlamydia; (8) bactéria de enxofre verde; (9) bactéria de não-enxofre verde (também fototrofos anaeróbicos); (10) Micrococci radioresistente e relativos; (11) Thermotoga e Thermosipho thermophiles.

[0046] "Bactérias Gram-negativas" incluem cocci, hastes nonentéricas, e hastes entéricas. O gênero de bactérias Gram- negativas inclui, por exemplo, Neisseria, Spirillum, Pasteurella, Brucella, Yersinia, Francisella, Haemophilus, Bordetella, Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Proteus, Vibrio, Pseudomonas, Bacteroides, Acetobacter, Aerobacter, Agrobacterium, Azotobacter, Spirilla, Serratia, Vibrio, Rhizobium, Chlamydia, Rickettsia, Treponema e Fusobacterium.

[0047] "Bactérias Gram positivas" incluem cocci, hastes de não- esporulação, e hastes de esporulação. O gênero de bactérias gram positiva inclui, por exemplo, Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Erysipelothrix, Lactobacillus, Listeria, Mycobacterium, Myxococcus, Nocardia, Staphylococcus, Streptococcus e Streptomyces.

[0048] Os termos "microorganismo recombinante" e "célula hospedeira recombinante" são usados no presente documento indistintamente e se referem a microorganismos que foram geneticamente modificados para expressar ou para sobrexpressar enzimas endógenas, para expressar enzimas heterólogas, tais como aquelas incluídas em um vetor, em um construto de integração, ou que têm uma alteração na expressão de um gene endógeno. Por "alteração" é significativo que a expressão do gene, ou nível de uma molécula de RNA ou moléculas de RNA equivalentes que codificam uma ou mais subunidades de polipeptídeos ou polipeptídeo, ou atividade de uma ou mais subunidades de polipeptídeos ou polipeptídio é regulado para cima ou regulado para baixo, tal que expressão, nível, ou atividade é maior do que ou menor do que observado na ausência da alteração. Por exemplo, o termo "alterar" pode significar "inibir", mas o uso da palavra "alterar" não é limitado a esta definição. É compreendido que os termos "microorganismo recombinante" e "célula hospedeira recombinante" se referem não somente ao microorganismo recombinante particular, mas à progenia ou progenia potencial de tal microorganismo. Devido a certas modificações poderem ocorrer em gerações que se sucedem devido a influências ou de mutação ou ambientais, tal progenia pode não, de fato, ser idêntica à célula de origem, mas são ainda incluídas dentro do escopo do termo conforme no presente documento usado.

[0049] Conforme no presente documento usado, o termo "anaeróbico" quando usado em referência a uma cultura ou condição de crescimento é previsto para significar que a quantidade de oxigênio é menor do que cerca de 0% de saturação para oxigênio dissolvido no meio líquido. O termo também é previsto para incluir câmaras vedadas de meio líquido ou sólido mantidas com uma atmosfera de menos do que cerca de 0% de oxigênio.

[0050] Conforme no presente documento usado, o termo "aeróbico" quando usado em referência a uma cultura ou condição de crescimento é previsto para significar que a quantidade de oxigênio é maior do que cerca de 10% de saturação para oxigênio dissolvido em meio líquido. O termo é também previsto para incluir câmaras vedadas de meio líquido ou sólido mantidas com uma atmosfera de cerca de 10% de oxigênio a cerca de 21% de oxigênio (conforme encontrado na atmosfera ao nível do mar).

[0051] Conforme no presente documento usado, o termo "microaeróbico" quando usado em referência a uma cultura ou condição de crescimento é previsto para significar que a quantidade de oxigênio está presente em quantidades de subsaturação entre condições anaeróbicas e aeróbicas, no qual microorganismos aerofílicos são capazes de serem sustentados sem uma morte anóxica dos microorganismos aerofílicos. O termo "microaeróbico" quando usado em referência a uma cultura ou condição de crescimento é previsto para significar que a quantidade de oxigênio está entre 0% e

10% de saturação para oxigênio dissolvido no meio líquido. O termo é também previsto para incluir câmaras vedadas de meio líquido ou sólido mantidas dentro de um fluxo de oxigênio que é utilizado a cerca da mesma taxa conforme é fornecido sem alcançar condições aeróbicas.

[0052] O termo "expressão" com relação a uma sequência de gene se refere a transcrição do gene e, conforme apropriado, translação do transcrito de mRNA resultante para uma proteína. Desse modo, conforme será claro a partir do contexto, a expressão de uma proteína resulta de transcrição e translação da sequência de estrutura de leitura aberta. O nível de expressão de um produto desejado em uma célula hospedeira pode ser determinado na base de ou a quantidade de mRNA correspondente que está presente na célula, ou a quantidade do produto desejado codificado pela sequência selecionada. Por exemplo, mRNA transcrito de uma sequência selecionada pode ser quantificado por qRT-PCR ou por hibridização Northern (ver Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Proteína codificada por uma sequência selecionada pode ser quantificada por vários métodos, por exemplo, por ELISA, por ensaio para a atividade biológica da proteína, ou por emprego de ensaios que são independentes de tal atividade, tal como western blotting ou radioimunoensaio, usando anticorpos que reconhecem e ligam a proteína. Ver Sambrook et al., 1989, supra.

[0053] O termo "polinucleotídeo" é no presente documento usado indistintamente com o termo "ácido nucleico", e se refere a um polímero orgânico composto de dois ou mais monômeros incluindo nucleotídeos, nucleosídeos ou análogos destes, incluindo, mas não limitado a, ácido deoxiribonucleico (DNA) de trançado único ou de trançado duplo, de sentido ou de antisentido de qualquer comprimento e, onde apropriado, ácido ribonucleico (RNA) de trançado único ou de trançado duplo, de sentido ou de antissentido de qualquer comprimento, incluindo siRNA. O termo "nucleotídeo" se refere a qualquer de vários compostos que consistem de um açúcar de ribose ou deoxirribose unido a uma base de purina ou uma base de pirimidina e a um grupo de fosfato, e que são as unidades estruturais básicas de ácidos nucleicos. O termo "nucleosídeo" se refere a um composto (como guanosina ou adenosina) que consiste de uma base de purina ou nase de pirimidina combinada com deoxirribose ou ribose, e é encontrado especialmente em ácidos nucleicos. O termo "análogo de nucleotídeo" ou "análogo de nucleosídeo" se refere, respectivamente, a um nucleotídeo ou nucleosídeo em que um ou mais átomos individuais foram substituídos com um átomo diferente, ou com um grupo funcional diferente. Consequentemente, o termo polinucleotídeo inclui ácidos nucleicos de qualquer comprimento, DNA, RNA, análogos e fragmentos destes. Um polinucleotídeo de três ou mais nucleotídeos é também denominado oligômero de nucleotídeo ou oligonucleotídeo.

[0054] É compreendido que os polinucleotídeos no presente documento descritos incluem "genes", e que as moléculas de ácido nucleico no presente documento descritas incluem "vetores" ou "plasmídeos". Consequentemente, o termo "gene", também denominado um "gene estrutural" se refere a um polinucleotídeo que codifica para uma sequência particular de amino ácidos, que compreende toda ou parte de uma ou mais proteínas ou enzimas, e pode incluir sequências de DNA regulatórias (não-transcritas), tais como sequências promotoras, que determinam, por exemplo, as condições sob as quais o gene é expresso. A região transcrita do gene pode incluir regiões não-transladas, incluindo introns, região 5'-não- transladada (UTR) e 3'-UTR, bem como uma sequência de codificação.

[0055] O termo "enzima", conforme no presente documento usado, se refere a qualquer substância que catalisa ou promove uma ou mais reações químicas ou bioquímicas, que usualmente incluem enzimas totalmente ou parcialmente compostas de um polipeptídeo ou polipeptídeos, mas podem incluir enzimas compostas de uma molécula diferente incluindo polinucleotídeos.

[0056] Conforme no presente documento usado, o termo "ocorrendo não-naturalmente", quando usado em referência a um organismo microorganismo ou atividade de enzima da invenção, é previsto para significar que o organismo microorganismo ou enzima tem pelo menos uma alteração genética não normalmente encontrada e m u m a c e p a d e o c o r r e naturalmente das espécies referenciadas, incluindo cepas tipo selvagem das espécies referenciadas. Alterações genéticas incluem, por exemplo, modificações introduzindo ácidos nucleicos expressíveis que codificam polipeptídeos metabólicos, outras adições de ácido nucleico, anulações de ácido nucleico, e/ou outro rompimento funcional do material genético do microorganismo. Tais modificações incluem, por exemplo, regiões de codificação e fragmentos funcionais destes, par a pol i pept í deos heterólogos, homólogos, ou a m b o s heterólogos e homólogos para as espécies referenciadas. Modificações adicionais incluem, por exemplo, regiões regulatórias de não-codificação em que as modificações alteram a expressão de um gene ou operon. Microorganismos que ocorrem não-naturalmente exemplares ou atividade de enzima incluem a atividade de hidroxilação descrita acima.

[0057] O termo "exógeno", conforme no presente documento usado, com referência a várias moléculas, por exemplo, polinucleotídeos, polipeptídeos, enzimas, etc., se refere a moléculas que não são normalmente ou naturalmente encontradas em e/ou produzidas por uma dada levedura, bactéria, organismo, microorganismo, ou célula in natura.

[0058] Por outro lado, o termo "endógeno" ou "nativo", conforme no presente documento usado, com referência a várias moléculas, por exemplo, polinucleotídeos, polipeptídeos, enzimas, etc., se refere a moléculas que são normalmente ou naturalmente encontradas em e/ou produzidas por uma dada levedura, bactéria, organismo, microorganismo, ou célula in natura.

[0059] O termo "heterólogo", conforme no presente documento usado no contexto de uma célula hospedeira modificada se refere a várias moléculas, por exemplo, polinucleotídeos, polipeptídeos, enzimas, etc., no qual pelo menos um do seguinte é verdadeiro: (a) a(s) molécula(s) é/são estranhas ("exógenas") a (isto é, não naturalmente encontradas em) na célula hospedeira; (b) a(s) molécula(s) é/são naturalmente encontradas em (por exemplo, é "endógena a") um dado microorganismo hospedeiro ou célula hospedeira, mas é ou produzida em um lugar não-natural, ou em uma quantidade não-natural na célula; e/ou (c) a(s) molécula(s) diferem em nucleotídeo e sequência de amino ácido do nucleotídeo endógeno ou sequência(s) de amino ácido, tal que a molécula que difere em nucleotídeo ou sequência de amino ácido a partir do nucleotídeo endógeno ou amino ácido, conforme encontrado endogenamente, é produzida em uma quantidade não-natural (por exemplo, maior do que naturalmente encontrada) na célula.

[0060] O termo "homólogo", conforme no presente documento usado, com relação a um enzima original ou gene de uma primeira família ou e spécie, s e refere a enzimas d i s t i n t a s ou genes d e u m a s e g u n d a f a m í l i a ou e spécie que são determinados por análises funcional, estrutural, ou genômica para ser uma enzima ou gene da segunda família ou espécie que corresponde à enzima original, ou gene da primeira família ou espécie. Homólogos mais frequentemente têm similaridades funcionais, estruturais ou genômicas. Técnicas são conhecidas pelas quais homólogos de uma enzima ou gene podem prontamente serem clonados usando sondas genéticas e PCR. Identidade de sequências clonadas como homólogos pode ser confirmada usando ensaios funcionais e/ou por mapeamento genômico dos genes.

[0061] Uma proteína tem "homologia" ou é "homóloga" a uma segunda proteína se a sequência de amino ácido codificada por um gene tem uma sequência de amino ácido similar àquela do segundo gene. Alternativamente, uma proteína tem homologia a uma segunda proteína se as duas proteínas têm sequências de amino ácido "similares". Desse modo, o termo "proteínas homólogas" é previsto para signifi car que as duas proteínas têm sequências de amino ácido similares. Em certos exemplos, a homologia entre duas proteínas é indicativa de seu ancestral compartilhado, relacionado pela evolução. Os termos "sequências homólogas" ou "homólogos" são pensados, acreditados, ou conhecidos por serem funcionalmente relacionados. Um relacionamento funcional pode ser indicado em qualquer um de um número de modos, incluindo, mas não limitados a: (a) grau de identidade de sequência e/ou (b) a mesma ou função biológica similar. De preferência, ambos (a) e (b) são indicadas. O grau de identidade de sequência pode variar, mas em uma modalidade, é pelo menos 50% (quando usando programas de alinhamento de sequência padrão conhecidos na técnica), pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos 98,5%, ou pelo menos cerca de 99%, ou pelo menos 99,5%, ou pelo menos 99,8%, ou pelo menos 99,9%. A homologia pode ser determinada usando programas de software prontamente disponíveis na técnica, tais como aqueles discutidos em Current Protocols in Molecular Biology (F.M.

Ausubel et al., eds., 1987) Supplement 30, seção 7.718, Tabela 7.71. Alguns programas de alinhamento são MacVector (Oxford Molecular Ltd, Oxford, U.K.) e ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, Pennsylvania). Outros programas de alinhamento não-limitantes incluem Sequencher (Gene Codes, Ann Arbor, Michigan), AlignX, and Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad, CA). Um função biológica similar pode incluir, mas não é limitada a: catalisação da mesma ou reação enzimática similar; tendo a mesma ou similar seletividade para um substrato ou co-fator; tendo a mesma ou estabilidade similar; tendo a mesma ou tolerância similar a várias condições de fermentação (temperatura, pH, etc.); e/ou tendo a mesma ou tolerância similar a vários substratos metabólicos, produtos, sub-produtos, intermediários, etc.

O grau de similaridade na função biológica pode variar, mas em uma modalidade, é pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos 98,5%, ou pelo menos cerca de 99%, ou pelo menos 99,5%, ou pelo menos 99,8%, ou pelo menos 99,9%, de acordo com um ou mais ensaios conhecidos a um técnico no assunto para determinar uma dada função biológica.

[0062] O termo "variante" se refere a qualquer polipeptídeo ou enzima no presente documento descrita.

Uma variante também envolve um ou mais componentes de um multímero, multímeros compreendendo um componente individual, multímeros compreendendo múltiplos de um componente individual (por exemplo, multímeros de uma molécula de referência), um produto de quebra química, e um produto de quebra biológica.

Estas variantes podem ser referidas no presente documento como "variantes funcionalmente equivalentes". Uma variante funcionalmente equivalente de uma proteína ou um peptídeo inclui aquelas proteínas ou peptídeos que compartilham pelo menos 40%, de preferência 50%, de preferência 60%, de preferência 70%, de preferência 75%, de preferência 80%, de preferência 85%, de preferência 90%, de preferência 95% ou maior identidade de amino ácido com a proteína ou peptídeo identificado, e tem substancialmente a mesma função como o peptídeo ou proteína de interesse.

Tais variantes incluem dentro de seus fragmentos de escopo de uma proteína ou peptídeo no qual o fragmento compreende uma forma truncada do polipeptídeo no qual anulações podem ser de 1 a 5, a 10, a 15, a 20, a 25 amino ácidos, e podem se estender de resíduo 1 a 25 em seu terminal do polipeptídeo, e no qual anulações podem ser de qualquer comprimento dentro da região; ou pode estar em uma localização interna.

Variantes funcionalmente equivalentes dos polipeptídeos específicos no presente documento devem também serem tomadas para incluir polipeptídeos expressos por genes homólogos em outras espécies de bactéria, por exemplo, conforme exemplificado no parágrafo anterior.

Em particular, modalidades não- limitantes, uma enzima pode ser uma "variante" relativa a uma enzima de referência em virtude de alteração(ões) em qualquer parte da sequência de polipeptídeo que codifica a enzima de referência.

Uma variante de uma enzima de referência pode ter atividade de enzima de pelo menos 10%, pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, pelo menos 105%, pelo menos 110%, pelo menos 120%, pelo menos 130% ou mais em um ensaio padrão usado para medir atividade de enzima de uma preparação da enzima.

[0063] O termo "potencial de rendimento", conforme no presente documento usado, se refere a um rendimento de um produto de uma trajetória biossintética. Em uma modalidade, o potencial de rendimento pode ser expresso como uma percentagem por massa de produto final por massa de composto de partida.

[0064] O termo "rendimento máximo termodinâmico", conforme no presente documento usado, se refere ao rendimento máximo de um produto obtido de fermentação de uma dada matéria-prima, tal como glicose ou xilose, baseado no valor energético do produto comparado às matérias-primas. Em uma fermentação normal, sem uso de fontes de energia adicionais, tal como luz, gás hidrogênio ou metano ou eletricidade, por exemplo, o produto não pode conter mais energia do que as matérias-primas. O rendimento máximo termodinâmico significa um rendimento de produto no qual toda energia e massa das matérias- primas é convertida ao produto. Este rendimento pode ser calculado e é independente de uma trajetória específica. Se uma trajetória específica em direção a um produto tem um rendimento mais baixo do que o rendimento máximo termodinâmico, então ele perde massa, e pode mais provavelmente de ser aperfeiçoado após, ou substituído com uma trajetória mais eficiente em direção ao produto.

[0065] O termo "redox balanceado" se refere a um conjunto de reações, que tomadas juntas produzem um tanto de cofatores redox a medida que eles consumem. Delineando trajetórias metabólicas e projetando um organismo tal que os cofatores redox são balanceados ou próximos a serem balanceados usualmente resulta em uma produção de rendimento mais eficiente, mais alta dos compostos desejados. Reações redox sempre ocorrem juntas como duas meias- reações ocorrendo simultaneamente, uma sendo uma reação de oxidação e a outra uma reação de redução. Em processos redox, o redutor transfere elétrons para o oxidante. Desse modo, na reação, o redutor ou agente de redução perde elétrons, e é oxidado, e o oxidante ou agente de oxidação ganha elétrons, e é reduzido. Em uma modalidade, as reações redox ocorrem em um sistema biológico. Energia biológica é frequentemente armazenada e liberada por meio de reações redox. A fotossíntese envolve a redução de dióxido de carbono em açúcares e a oxidação de água em oxigênio molecular. A reação reversa, respiração, oxida açúcares para produzir dióxido de carbono e água. Como etapas intermediárias, os compostos de carbono reduzidos são usados para reduzir nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+), que então contribui para a criação de um gradiente de próton, que aciona a síntese de adenosina trifosfato (ATP), e é mantida pela redução de oxigênio. O termo estado redox é frequentemente usado para descrever o balanço de GSH/GSSG, NAD+/NADH e NADP+/NADPH em um sistema biológico tal como uma célula ou órgão. O estado redox é refletido no balanço de vários conjuntos de metabólitos (por exemplo, lactato e piruvato, beta- hidroxibutirato e acetoacetato), cuja interconversão é dependente nestas razões. Um estado redox anormal pode se desenvolver em uma variedade de situações nocivas, tais como hipoxia, choque e sepse.

[0066] Os termos "trajetória C2", "trajetória ramificada C2" ou "corrente C2", conforme no presente documento usados, se referem a uma trajetória bioquímica no qual o MEG pode ser produzido via glicoaldeído.

[0067] Os termos "trajetória C3", "trajetória ramificada C3y" ou

"corrente C3", conforme no presente documento usados, se referem a uma trajetória bioquímica na qual Acetona, IPA, ou um ou mais compostos de três carbonos podem ser produzidos, via piruvato ou dihidroxoacetonafosfato (DHAP).

[0068] Conforme no presente documento usado, o termo "biocatalisador" se refere a uma substância, tal como uma enzima ou hormônio que inicia ou aumenta a taxa de um reator biológico, químico ou biocatalítico. Em algumas modalidades da presente invenção, os biocatalisadores, tais como enzimas de proteína e/ou hormônios de microorganismos realizam transformações químicas em compostos orgânicos no Processo de fermentação.

[0069] Conforme no presente documento usado, o termo "bioproduto", "produto final", ou "produto desejado" se refere a um produto de fermentação de interesse, tipicamente ao produto de fermentação de concentração mais alta em um caldo de fermentação.

[0070] O termo "biorreator", bem como qualquer biorreator que pode ser incluído como parte de um "estágio de biorreator", não é limitado a um reator de laço circulado, mas mais amplamente inclui qualquer vaso adequado, ou seção dentro de um vaso, para manter um volume de líquido do meio de cultura com microorganismo carboxidotrófico que pode ser usado para efetuar os processos biológicos no presente documento descritos, que podem também serem referidos com Processos de fermentação de modo que eles são geralmente conduzidos anaerobicamente. Tipos particulares de biorreatores podem incluir quaisquer vasos adequados para contato de duas fases (gás-líquido), por exemplo, reatores de fluxo de contra- corrente (por exemplo, com uma fase de vapor de escoamento ascendente e fase de líquido de escoamento descendente), ou reatores de fluxo co-corrente (por exemplo, com fases de gás e líquido de escoamento ascendente). Em tais vasos contendo duas fases, é possível que a fase líquida seja a fase contínua, como no caso de bolhas de gás escoando através de uma coluna móvel de líquido.

De outro modo, é possível que a fase de vapor seja a fase contínua, como no caso de um líquido disperso (por exemplo, na forma de gotículas) escoando através de um espaço de vapor.

Em algumas modalidades, descritas mais completamente abaixo, zonas diferentes de um biorreator podem ser usadas para conter uma fase líquida contínua e uma fase gás contínua.

O biorreator inclui um dispositivo de fermentação consistindo de um ou mais vasos e/ou torres ou arranjo de tubulação, que inclui o Continuous Stirred Tank Biorreator, Bubble Column Biorreator, Airlift Biorreator, Fluidized Bed Biorreator, Packed Bed Bioractor, Photo-Biorreator, Immobilized Cell Reator, Trickle Bed Reator, Moving Bed Biofilm Reator, Bubble Column, Gas Lift Fermenter, Membrane Reators tal como Hollow Fiber Membrane Biorreator, ou outro vaso ou outro dispositivo adequado para contato gás-líquido.

Biorreatores adequados incluem misturadores estáticos, ou outros vasos e/ou dispositivos (por exemplo, torres ou arranjos de tubulação), adequados para contato do substrato com o meio de cultura bacterial líquido (por exemplo, com dissolução e cinéticas de transporte de massa favoráveis para efetuar a conversão biológica). As frases "pluralidade de biorreatores" ou biorreatores que podem ser incluídos em uma "pluralidade de estágios de biorreator" são significativos para incluir biorreatores de mais do que um tipo simples, embora em alguns casos a pluralidade de biorreatores pode ser de um tipo (por exemplo, reatores de laço circulados). Em algumas modalidades, o biorreator pode compreender um primeiro reator de crescimento (propagação) e um segundo reator de fermentação.

Em outras modalidades, o biorreator pode compreender um(uns) reator(es) e estágio(s) para ambos processos de crescimento (propagação) e fermentação, que podem ocorrer juntos ou separadamente. A fase de crescimento ou propagação é também conhecida como a fase de cultivo. A fase de fermentação é também conhecida como a fase de produção. Como tal, quando se referindo a adição de substrato ao biorreator ou reação de fermentação, deve ser compreendido para incluir adição a qualquer ou ambos destes reatores onde apropriado. Em algumas modalidades, o(s) biorreator(es) compreende(m) um de estágio simples, dois estágios, três estágios, quatro estágios, cinco estágios, seis estágios, sete estágios, outo estágios, nove estágios ou dez estágios. Em algumas modalidades, o(s) biorreator(es) compreende(m) pelo menos um estágio, pelo menos dois estágios, pelo menos três estágios, pelo menos quatro estágios, pelo menos cinco estágios, pelo menos seis estágios, pelo menos sete estágios, pelo menos oito estágios, pelo menos nove estágios, ou pelo menos dez estágios.

[0071] Conforme no presente documento referido, a "sangria de caldo" é a porção do caldo de fermentação removido de um biorreator que não é passado em um separador.

[0072] Conforme no presente documento referido, uma "cultura de caldo" é uma cultura de microorganismo presente no caldo de fermentação.

[0073] Conforme no presente documento referido, uma "densidade de cultura do caldo é a densidade de células de microorganismo no caldo de fermentação.

[0074] Conforme no presente documento referido, um "meio de cultura/meio" ou um "meio de nutriente/meio" é uma solução adicionada ao caldo de fermentação contendo nutrientes e outros componentes apropriados para o crescimento da cultura de microorganismo. Em algumas modalidades, um mínimo define meio de cultura/nutriente é utilizado. Em algumas modalidades, um meio indefinido complexo é utilizado.

[0075] Conforme no presente documento referido, uma "taxa de diluição" é uma taxa de substituição de substituição do caldo em um biorreator. A taxa de diluição é medida no número de volumes de biorreator que são substituídos pelo meio de nutriente por dia.

[0076] Conforme no presente documento usado, o termo "matérias-primas" se referem a pelo menos uma fonte de carbono para fermentação para produzir o(s) produto(s). Uma matéria-prima é definida como qualquer material biológico renovável que pode ser usado diretamente como um combustível, ou convertido a outra forma de combustível ou produto de energia. Matérias-primas de biomassa são os materiais de planta e alga usados para derivar combustíveis similares a etanol, butanol, biodiesel, e outros combustíveis de hidrocarboneto. Exemplos de matérias-primas de biomassa incluem amido de milho, suco de cana de açúcar, resíduos de cultura tais como palha de milho e bagaço de cada de açúcar, culturas com finalidades específicas crescidas, e plantas lenhosas. Em algumas modalidades, as matérias-primas no presente documento descritas compreendem C5 e/ou C6 hidratos de carbono. Em algumas modalidades, as matérias-primas são suplementadas com C5 e/ou C6 hidratos de carbono exógenos. Em algumas modalidades, as matérias-primas compreendem biomassa lignocelulósicas. Em algumas modalidades, as matérias-primas compreendem biomassa celulósica. Em algumas modalidades, as matérias-primas compreendem biomassa de planta. Em algumas modalidades, as matérias-primas compreendem syngas ou misturas gasosas de CO2, CO e H2. Em algumas modalidades, as matérias-primas compreendem uma biomassa que é adicionalmente suplementada com uma ou mais fontes de carbono exógenas. Em algumas modalidades, as matérias-primas podem compreender um hidrolisato de planta, de origem humana, fungal ou artificial.

[0077] Os termos "fermentação", "processo de fermentação" ou

"reação de fermentação" e similares, conforme no presente documento usado, são previstos para envolver a fase de crescimento e/ou fase de biossíntese de produto de Processo. Conforme será descrito adicionalmente no presente documento, em algumas modalidades, o biorreator pode compreender um primeiro reator de crescimento (fase de propagação) e um segundo reator de fermentação (fase de biossíntese de produto). Em outras modalidades, o biorreator pode compreender um reator para ambos processos de crescimento (propagação) e produção. Como tal, a adição de elementos ou composições a uma reação de fermentação deve ser compreendida para incluir adição a qualquer ou ambos destes reatores ou fases.

[0078] Conforme no presente documento referido, um "caldo de fermentação" é um meio de cultura compreendendo pelo menos um meio de nutriente e microorganismos.

[0079] Os termos "aumentando a eficiência", "eficiência aumentada", e similares, quando usados em relação a um processo de fermentação, incluem, mas não são limitados a, aumento de um ou mais da taxa de crescimento de microorganismos que catalisam a fermentação, a taxa de crescimento e/ou taxa de produção de produto a concentrações elevadas de produtos desejados incluindo MEG, e um ou mais compostos de três carbonos tais como acetona, isopropanol e/ou propeno, o volume de produto desejado produzido por volume de substrato consumido, a taxa de produção ou nível de produção do produto desejado, a proporção relativa do produto desejado produzido comparado com outros sub-produtos da fermentação e o rendimento de produção dos produtos desejados.

[0080] O termo "despejo industrial ou gases evaporados" deve ser tomado amplamente para incluir quaisquer gases produzidos por um processo industrial e incluem gases produzidos como um resultado de manufatura de produtos de metal ferroso, manufatura de produtos de não-ferroso, processos de refino de petróleo, gaseificação de carvão, gaseificação de biomassa, produção de energia elétrica, e manufatura de coque.

[0081] Conforme no presente documento referido, um "permeado" é um constituinte substancialmente solúvel do caldo que passa através de um separador e não são retidos pelo separador. O permeado tipicamente conterá produtos de fermentação solúveis, sub-produtos, e soluções de nutriente.

[0082] Conforme no presente documento usado, o termo "produtividade" se refere à quantidade total de bioproduto produzido por hora.

[0083] Conforme no presente documento referido, um "separador" é um módulo que é adaptado para receber caldo de fermentação de um biorreator e passa no caldo através de um filtro para produzir um concentrado e um permeado. O filtro pode ser uma membrana, por exemplo membrana de fluxo cruzado ou uma membrana de fibra oca.

[0084] O termo "armazenagem" ou "armazena" são no presente documento usados para períodos quando uma cultura microbial tem um suprimento de substrato limitado, ou um substrato é indisponível. Como tal, o termo inclui períodos quando uma cultura microbial sob condições de crescimento de estado constante é temporariamente indisponivelmente limitada no suprimento de substrato, e inclui períodos quando uma cultura microbial é transferida de um biorreator em um vaso de armazenagem, tal como vaso de transferência inóculo.

[0085] O termo "açúcar" se refere a hidratos de carbono tendo 5 a 12 átomos de carbono e inclui, mas não é limitado a, D-eritrose, L- eritrose, D-treose, L-treose, D-ribose, L-ribose, D-lixose, L-lixose, D- alose, L-alose, D-altrose, L-altrose 2-ceto-3-deoxi D-gluconato (KDG), D-manitol, guluronato, manuronato, manitol, lixose, xilitol, D-glicose, L- glicose, sacarose, D-frutose, D-manose, L-manose, D-idose, L-idose,

D-galactose, L-galactose, D-xilose, L-xilose, D-arabinose, L-arabinose, D-talose, L-talose, glucuronato, galacturonato, ramnose, fructooligossacarídeo (FOS), galactooligossacarídeo (GOS), inulina, manan oligossacarídeo (MOS), oligoalginato, manuronato, guluronato, ácido alfa-ceto, ou 4-deoxi-L-eritro-hexoselulose uronato (DEHU).

[0086] A presente invenção geralmente se relates a um processo fermentativo para simultaneamente produzir MEG, e uma ou mais outras moléculas C3 tais como acetona (ACE), isopropanol (IPA), e propeno de C5 hidratos de carbono típicos (pentose tal como xilose, arabinose, etc.), e C6 hidratos de carbono derivados de biomassa (hexose tal como glicose, manose, frutose, etc.), e dissacarídeos tais como sacarose, lactose, lactulose, maltose, trehalose, celobiose e chitobiose. Além disso, Processo usa um E. coli recombinante cultivado em um biorreator com remoção simultânea das biomoléculas produzidas, de modo a aliviar inibição de produto devido a seu acúmulo no meio de cultura. Desse modo, a presente invenção ensina a obtenção de um processo muito mais eficiente de produção de MEG e um ou mais compostos C3 no presente documento descrito do que outros processos bem conhecidos àqueles técnicos no assunto. Ver, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente Internacional Nº. WO/2016/079440 e Publicação de Pedido de Patente U.S. Nº. US20150147794, cada do qual é expressamente no presente documento incorporado por referência em sua totalidade.

[0087] Em algumas modalidades, a presente invenção ensina que o uso dos processos biológicos e sistemas para a produção de bioprodutos e/ou produtos desejados no presente documento ensinados conduzem a produtividade combinada de MEG, ACE e IPA superior a 1 kg/m3h; alta concentração de produto acima de 40 g/L; e rendimentos de produto acima de 50% de valor teórico.

Meio de cultura

[0088] Para crescimento dos microorganismos, um meio de nutriente líquido adequado é alimentado ao biorreator. Um meio de nutriente conterá vitaminas e minerais suficientes para permitir crescimento dos microorganismos. O meio anaeróbico adequado para a fermentação de acetato e/ou produtos similares usando CO 2 como a única fonte de carbono são conhecidos na técnica. Por exemplo, meios adequados são descritos nas Pat. U.S. Nos. 5.807.722 e

6.340.581, e as tabelas no presente documento.

[0089] Em algumas modalidades, o meio é mantido sob condições representadas pelo tipo de microorganismos sendo crescidos. Condições de meio consideradas incluem pressão, temperatura, taxa de fluxo de gás, taxa de fluxo de líquido, pH, potencial de redox médio, taxa de agitação, nível inóculo, concentrações de substrato de gás máximo (CO2, O2, CO, H2), e concentrações de produto máximas.

[0090] Em algumas modalidades, o meio de nutriente é alimentado a um estágio simples do biorreator. Em algumas modalidades, o meio de nutriente é alimentado a dois ou mais estágios do biorreator. Em algumas modalidades, o meio de nutriente é continuamente ao biorreator. Em algumas modalidades, os microorganismos são cultivados em um primeiro meio para maximizar a concentração ou unidades de formação de colônia de volume médio, e então a primeira cultura é adicionada a um biorreator compreendendo um segundo meio, no qual o primeiro meio e o segundo meio são distintos entre si. Em algumas modalidades, o primeiro meio é formulado para crescimento máximo do microorganismo. Em algumas modalidades, o segundo meio é formulado para produção máxima de um produto de interesse. Em algumas modalidades, o primeiro e segundo meio pode ser igual em volume e/ou concentração de soluto. Em algumas modalidades, existe mais do que um estágio do biorreator para maximizar a concentração ou formação de colônia por unidade de volume de meio.

[0091] Em algumas modalidades, o meio de cultura pode ser alimentado aos biorreatores no seguinte modo de operação de biorreatores: descontínuo, alimentado descontínuo sem ou com reciclo de célula, alimentado descontínuo constante, alimentado descontínuo exponencial, alimentado descontínuo linear, alimentado descontínuo repetido conhecido como procedimento de "encher e retirar", contínuo sem reciclo de célula, contínuo em reciclo de célula incluindo célula imobilizada por vários métodos.

[0092] Em algumas modalidades, o meio de cultura usado no Processo no presente documento descrito compreende um meio mínimo (MM) suprido com C5 hidratos de carbono, tais como xilose e arabinose, e C6 hidratos de carbono, tais como glicose, manose e frutose. O meio de cultura MM contém C5 hidratos de carbono, C6 hidratos de carbono, e/ou dissacarídeos. Em algumas modalidades, C5 e C6 hidratos de carbono em uma proporção pode ser variada na faixa de 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:10, 1:15 e 1:20. Em outras modalidades, C5 e C6 hidratos de carbono em uma proporção pode estar na faixa de 6:1 a 1:6. Em outras modalidades, C5 ou C6 hidratos de carbono podem ser usados somente como uma fonte de carbono. Em modalidades adicionais, nutrientes essenciais são incluídos no meio de cultura e proporções de nutrientes essenciais variam dependendo dos modos do Processo fermentativo tal como um processo de uma fase e/ou processo de duas fases.

[0093] Em algumas modalidades, um ou mais substratos são C5 hidratos de carbono. Em modalidades adicionais, os C5 hidratos de carbono são selecionados a partir do grupo consistindo de xilose, arabinose, lixose, ribose, ribulose e xilulose. Em algumas modalidades, um ou mais substratos são C6 hidratos de carbono. Em modalidades adicionais, os C6 hidratos de carbono são selecionados a partir do grupo consistindo de glicose, manose, frutose, alose, gulose, idose, galactose, talose, sorbose, tagatose e psicose. Em algumas modalidades, um ou mais substratos são dissacarídeos. Em modalidades adicionais, os dissacarídeos são selecionados a partir do grupo consistindo de sacarose, lactose, lactulose, maltose, trehalose, celobiose e chitobiose.

[0094] Os processos desta invenção são amplamente aplicáveis a qualquer fonte de açúcares fermentáveis tais como de qualquer fonte de biomassa adequada, incluindo, mas não limitado a, um ou mais de molho, trigo, beterrabas, aveias, cevada, cana de açúcar, sorgo, mandioca, arroz, madeira, e similares, e de biomassa celulósica. Biomassa lignocelulósica é tipicamente tratada para recuperar celulose e hemicelulose que podem então ser convertida em açúcares. Açúcar fermentável pode ser derivado ou obtido de lignocelulose. A biomassa é tipicamente submetida a pré-tratamento que tipicamente inclui um pré-tratamento físico e/ou químico, seguido por uma hidrólise enzimática e/ou física e/ou química para converter celulose, hemicelulose e/ou amidos em açúcares. O açúcar fermentável pode ser suprido ao biorreator em qualquer forma adequada incluindo, mas não limitado a, grânulos sólidos, pastas fluidas contendo sólidos de açúcar não-dissolvidos, melaços e xaropes. Onde sólidos de açúcar não-dissolvidos são introduzidos no biorreator, água suficiente está presente no biorreator para dissolver os açúcares. Não é essencial que todos os açúcares não-dissolvidos introduzidos no biorreator tornam-se dissolvidos no biorreator, e o caldo de fermentação retirado do biorreator pode conter açúcar não-dissolvido. Os açúcares podem ser fermentáveis ou uma combinação de açúcares fermentáveis e não- fermentáveis.

Processo para Produção de Produtos Desejados

[0095] A presente invenção ensina que Processo para produção de produtos desejados é realizado em duas fases ou alternativamente como um processo de uma fase. Processo de duas fases é constituído de uma fase de crescimento seguido por uma fase de produção. No processo de uma fase, fases de crescimento e produção ocorrem ao mesmo tempo. Em algumas modalidades, a invenção contempla micróbios, trajetórias enzimáticas, elementos genéticos, e modificações genéticas que podem ser utilizadas na produção simultânea de MEG com uma ou mais de ACE, IPA e propeno; conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente U.S. US20170260551A1. Processo de Duas Fases i. Fase de Crescimento (Propagação)

[0096] Processo de duas fases é tipicamente realizada conforme descrito no presente documento. Na fase de crescimento, microorganismo recombinante tal como E. coli é aerobicamente crescido de um tubo ou um frasco de ou qualquer outro método conhecido de preservação de microorganismo usando o meio de cultura (MM). A fase de crescimento é realizada em um ou mais frascos de estágio ou biorreatores de volumes de meio de cultura (MM) apropriados, que aumenta com as passagens até alcançar o biorreator, ou uma série de biorreatores alcançando produtividade de densidade de célula alta.

[0097] Em algumas modalidades, o ponto de ajuste da concentração de oxigênio dissolvido na fase de crescimento é ajustado a uma faixa de cerca de 5% a 50% de saturação de oxigênio (O 2) no caldo de fermentação, de modo que as matérias-primas consumidas tais como C5 e C6 hidratos de carbono e/ou açúcares são direcionados principalmente em direção a produção de massa de célula. Em algumas modalidades, a concentração de oxigênio dissolvido no meio nunca é abaixo de 10% de uma saturação de ar.

[0098] As condições de cultura durante a fase de crescimento são as seguintes.

[0099] Em algumas modalidades, uma faixa de pH controlada com H2SO4 diluído e KOH, ou NaOH ou solução aquosa de NH 4OH ou NH3 gasoso é entre 5,0 a 9,0, 5,5 a 8,0, 6,0 a 7,5, e 6,5 a 7,0. Em algumas modalidades, uma faixa de pH controlada entre 6,5 a 7,0 automaticamente com H2SO4 diluído e KOH ou NaOH ou solução aquosa de NH4OH no NH3 gasoso.

[00100] O controle de pH em uma reação de fermentação é um fator crítico que pode afetar um número de variáveis tal como a taxa de reação e produto formado. Embora os microorganismos envolvidos na fermentação frequentemente produzirão produtos através de uma faixa de pH, mantendo um pH ótimo para condições de reação particulares pode maximizar a eficiência de crescimento e/ou produção. A formação de ácidos, tal como ácido acético e ácido láctico pode inibir a fermentação e, se não verificada, pode conduzir a colapso da cultura de microorganismo.

[00101] Em termos amplos, a invenção também fornece um método de controle do pH de um caldo de fermentação em um biorreator dependendo dos tipos de biorreator para o pH do caldo a serem continuamente controlados.

[00102] Em algumas modalidades, a temperatura controlada é entre 18-50°C, entre 25-45°C ou entre 32-40°C. Em algumas modalidades, a temperatura controlada é dentro da faixa de 32-40°C.

[00103] Em modalidades adicionais, a quantidade total de C5 e/ou C6 hidratos de carbono alimentada ao biorreator durante a fase de crescimento é pelo menos 5 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 10 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 20 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 30 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 40 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 50 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 60 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 70 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 80 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 90 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 100 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 150 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 200 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 250 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 300 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 400 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 500 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 600 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 700 kg de hidrato de carbono/m3, até 800 kg de hidrato de carbono/m3. Em algumas modalidades, a quantidade total de C5 e/ou C6 hidratos de carbono alimentada ao biorreator durante o fase de crescimento varia de cerca de 10 kg de hidrato de carbono/m3 até 500 kg de hidrato de carbono/m3.

[00104] A presente invenção ensina o meio de cultura MM é balanceada em termos de nutrientes essenciais N, P, Mg e Fe entre outros elementos para favorecer crescimento de célula durante a fase de crescimento.

[00105] Em algumas modalidades, o meio de cultura compreende Carbono (C) que é fornecido de C5 hidratos de carbono e/ou C6 hidratos de carbono. Em algumas modalidades, o meio de cultura compreende nutrientes essenciais incluindo Nitrogênio (N), Fósforo (P), Magnésio (Mg), e Ferro (Fe). Em algumas modalidades, a razão de carbono (derivado de C5 e C6 hidratos de carbono) para nutrientes essenciais é conforme segue: C/N = 1:1 a 20:1, C/P = 5:1 a 30:1, C/Mg = 30:1 a 400:1, C/Fe = 30:1 a 400:1 na fase de crescimento.

[00106] A presente invenção também fornece concentração de massa de célula final na fase de crescimento. Em algumas modalidades, a concentração de massa de célula final na fase de crescimento é pelo menos 1 kg /m3, pelo menos 2 kg /m3, pelo menos 3 kg /m3, pelo menos 4 kg /m3, pelo menos 5 kg /m3, pelo menos 10 kg /m3, pelo menos 20 kg /m3, pelo menos 30 kg /m3, pelo menos 40 kg /m3, pelo menos 50 kg /m3, pelo menos 60 kg /m3, pelo menos 70 kg /m3, pelo menos 80 kg /m3, pelo menos 90 kg /m3, pelo menos 100 kg /m3, pelo menos 110 kg /m3, pelo menos 120 kg /m3, pelo menos 130 kg /m3, pelo menos 140 kg /m3, e pelo menos 150 kg /m3 de massa de célula seca. Em algumas modalidades, a concentração de massa de célula final na fase de crescimento varia de 10 a 100 kg/m 3 de massa de célula seca.

[00107] Em algumas modalidades, o tempo requerido para a fase de crescimento varia entre 1 a 200 horas. Em modalidades adicionais, o tempo da fase de crescimento é entre 5 a 50 horas. O tempo é dependente das alimentações de hidrato de carbono e/ou de matérias- primas. ii. Fase de Produção (Fermentação)

[00108] Para a fase de produção, a massa de célula de microorganismo recombinante tal como E. coli produzido na fase de crescimento é transferida para outro biorreator. Em algumas modalidades, a massa de célula produzida na fase de crescimento ocupa pelo menos cerca de 1% a 50% de seu volume de operação para fase de produção onde a produção de produtos desejados é efetuada usando meio de cultura MM e alimentações de hidrato de carbono/matérias-primas.

[00109] Durante a fase de produção, as condições de cultura são limitadas (N, P) para crescimento de E. coli e as matérias-primas consumidas, tais como C5 e C6 hidratos de carbono e/ou açúcares são desviados principalmente para a produção de produtos de MEG, ACE e IPA.

[00110] Em algumas modalidades, a quantidade total de C5 e/ou

C6 hidratos de carbono alimentada ao biorreator durante a fase de produção é pelo menos 50 kg de hidrato de carbono/m 3, pelo menos 60 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 70 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 80 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 90 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 100 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 150 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 200 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 250 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 300 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 400 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 500 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 600 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 700 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 800 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 900 kg de hidrato de carbono/m3 até 1000 kg de hidrato de carbono /m3. Em algumas modalidades, a quantidade total de C5 e/ou C6 hidratos de carbono alimentada ao biorreator durante a fase de produção varia de cerca de 100 kg de hidrato de carbono/m3 até 800 kg de hidrato de carbono/m3.

[00111] Em algumas modalidades, o tempo requerido para a fase de produção varia entre 5 a 500 horas. Em modalidades adicionais, o tempo para a fase de produção varia de 10 a 300 horas para operações descontínua e alimentada descontínua. Em outras modalidades, o tempo da fase de produção é até 300 horas com fermentação contínua.

[00112] Em uma modalidade da invenção, a concentração de oxigênio dissolvido na fase de produção é ajustada a uma faixa entre 0 a 10% de saturação de O2 no caldo de fermentação de modo a limitar o crescimento de E. coli e direcionar o fluxo de carbono para principalmente produção de MEG, ACE e IPA. Contudo, no começo do processo de fermentação a saturação de O2 pode ser mais alta.

[00113] Em outra modalidade da invenção, o meio de cultura MM na fase de produção é ajustado para razões de Carbono: Nutrientes essenciais conforme segue: C/N > 10, C/P > 20, C/Mg > 200 e C/Fe > 400, de modo a limitar o crescimento de E. coli e desviar o fluxo de carbono principalmente para produção de MEG, ACE e IPA.

[00114] A presente invenção ensina o meio de cultura MM é balanceada em termos de nutrientes essenciais N, P, Mg e Fe entre outros elementos para favorecer a produção e manutenção da célula durante a fase de produção.

[00115] Em algumas modalidades, o meio de cultura na fase de produção compreende Carbono (C) que é fornecido de C5 hidratos de carbono e/ou C6 hidratos de carbono. Em algumas modalidades, o meio de cultura compreende nutrientes essenciais incluindo Nitrogênio (N), Fósforo (P), Magnésio (Mg), e Ferro (Fe). Em algumas modalidades, uma razão de C:N na fase de produção é pelo menos 10:1, pelo menos 15:1, pelo menos 20:1, pelo menos 25:1, e pelo menos 30:1. Em outras modalidades, uma razão de C:P na fase de produção é pelo menos 10:1, pelo menos 15:1, pelo menos 20:1, pelo menos 30:1, pelo menos 40:1, e pelo menos 50:1. Em outras modalidades, uma razão de C:Mg na fase de produção é pelo menos 100:1, pelo menos 200:1, pelo menos 300:1, pelo menos 400:1, e pelo menos 500:1. Em outras modalidades, uma razão de C:Fe na fase de produção é pelo menos 300:1, pelo menos 400:1, e pelo menos 500:1. Em outras modalidades, o meio de cultura MM na fase de produção é ajustado para razões de Carbono para Nutrientes essenciais conforme segue: C/N > 10, C/P > 20, C/Mg > 200 e C/Fe > 400 na fase de produção. Processo de Uma fase

[00116] Processo de uma fase é realizado conforme no presente documento descrito. A fase de crescimento e a fase de produção são simultaneamente efetuadas no processo de uma fase. O microorganismo recombinante tal como E. coli é cultivado em um biorreator usando o meio de cultura MM usando o mesmo pH e condições de temperatura conforme descrito na fase de crescimento do Processo de duas fases.

[00117] A presente invenção ensina que células de microorganismo são cultivadas para crescimento e propagação de tal modo que uma limitação em nutrientes essenciais do meio de cultura MM ocorre. A presente invenção fornece limitações em N, P, Mg ou Fe, ou alternativamente limitação em concentração de oxigênio dissolvido no meio de cultura. Estas limitações conduzem a aumentos na taxa de produção de MEG, ACE e IPA, à custa da diminuição da taxa de crescimento de célula de microorganismos tal como E. coli. As faixas de parâmetros usadas para a produção de processo de duas fases são as mesmas conforme descrito para a fase de produção na produção de processo de duas fases.

[00118] Em algumas modalidades, a quantidade total de C5 e/ou C6 hidratos de carbono alimentada ao biorreator para processo de uma fase é pelo menos 50 kg de hidrato de carbono/m 3, pelo menos 60 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 70 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 80 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 90 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 100 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 150 kg de hidrato de carbono/m 3, pelo menos 200 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 250 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 300 kg de hidrato de carbono/m 3, pelo menos 400 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 500 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 600 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 700 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 800 kg de hidrato de carbono/m3, pelo menos 900 kg de hidrato de carbono/m3 até 1000 kg de hidrato de carbono/m3. Em algumas modalidades, a quantidade total de C5 e/ou C6 hidratos de carbono alimentada ao biorreator durante a fase de produção varia de cerca de 100 kg de hidrato de carbono/m3 até 800 kg de hidrato de carbono/m3.

[00119] Em algumas modalidades, o tempo requerido para a fase de produção no processo de uma fase varia entre 5 a 500 horas. Em modalidades adicionais, o tempo requerido para a fase de produção em um processo de uma fase varia entre 5 a 300 horas.

[00120] Em algumas modalidades, os processos de produção de uma fase e ou de multi-fase levam cerca de 5, cerca de 10, cerca de 25, cerca de 50, cerca de 75, cerca de 100, cerca de 125, cerca de 150, cerca de 175, cerca de 200, cerca de 225, cerca de 250, cerca de 275, cerca de 300 cerca de 325, cerca de 350, cerca de 375, cerca de 400, cerca de 425, cerca de 450, cerca de 475, ou cerca de 500 horas.

[00121] Em algumas modalidades, os processos de produção de uma fase e ou de multi-fase levam 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, ou 500 horas. Produtos Finais Desejados

[00122] Em algumas modalidades, o MEG é produzido simultaneamente com um ou mais de ACE, IPA e propeno. Em algumas modalidades, o MEG é produzido simultaneamente com ACE. Em algumas modalidades, o MEG é produzido simultaneamente com IPA. Em algumas modalidades, o MEG é produzido simultaneamente com propeno. Em algumas modalidades, o MEG é produzido simultaneamente com ACE e IPA. Em algumas modalidades, o MEG é produzido simultaneamente com ACE e propeno. Em algumas modalidades, o MEG é produzido simultaneamente com IPA e propeno. Em algumas modalidades, o MEG é produzido simultaneamente com ACE, IPA e propeno.

[00123] Em algumas modalidades, pelo menos um ou mais de MEG, ACE, IPA e propeno que se acumulam no caldo de fermentação, ou em qualquer lugar, em um ou mais dos biorreatores, impactam negativamente a viabilidade, crescimento, e/ou taxas de produção dos microorganismos. Em algumas modalidades, a manutenção de uma concentração máxima de um mais de MEG, IPA, ACE ou propeno no caldo de fermentação ou em um ou mais dos biorreatores impede impactos negativos na viabilidade, crescimento, e/ou taxas de produção dos microorganismos.

[00124] Em algumas modalidades, um ou mais de MEG, IPA, ACE, e propeno são continuamente removidos a partir do sistema de biorreator para mitigar os impactos negativos da presença ou alta concentração das moléculas. Em algumas modalidades, as moléculas são continuamente removidas a partir do sistema de biorreator. Em algumas modalidades, as moléculas são removidas em lotes.

[00125] Em algumas modalidades, a remoção dos produtos desejados é realizada através de liberação de gases em um ou mais dos biorreatores, ou uma ou mais câmaras do(s) biorreator(es). Em algumas modalidades, a liberação de gases é misturada com um solvente para dissolver o gás no soluto antes da recuperação dos produtos desejados. Em algumas modalidades, a remoção dos produtos desejados é realizada por retirada em um ou mais dos meio, caldo, ou matérias-primas de um ou mais dos biorreatores ou uma ou mais mudanças do(s) biorreator(es). Em algumas modalidades, as células são excluídas do meio, caldo, ou matérias-primas antes da remoção dos produtos desejados. Em algumas modalidades, os impactos negativos incluem morte dos micróbios, atividade metabólica diminuída dos micróbios, produção diminuída de um ou mais de MEG, IPA, ACE, ou propono, inibição de crescimento microbial e/ou reprodução, inibição de expressão de proteína, e combinações destes.

[00126] Em algumas modalidades, o MEG é produzido pelo menos 1 kg/m3 h, pelo menos 2 kg/m3 h, pelo menos 3 kg/m3 h, pelo menos 4 kg/m3 h, pelo menos 5 kg/m3 h, 6 kg/m3 h, pelo menos 7 kg/m3 h, pelo menos 8 kg/m3 h, pelo menos 9 kg/m3 h, pelo menos 10 kg/m3 h, pelo menos 15 kg/m3 h, pelo menos 20 kg/m3 h.

[00127] Em algumas modalidades, a ACE é produzida pelo menos 0,5 kg/m3 h, pelo menos 1 kg/m3 h, pelo menos 2 kg/m3 h, pelo menos 3 kg/m3 h, pelo menos 4 kg/m3 h, pelo menos 5 kg/m3 h, 6 kg/m3 h, pelo menos 7 kg/m3 h, pelo menos 8 kg/m3 h, pelo menos 9 kg/m3 h, pelo menos 10 kg/m3 h, pelo menos 15 kg/m3 h, pelo menos 20 kg/m3 h.

[00128] Em algumas modalidades, o IPA é produzido pelo menos pelo menos 0,5 kg/m3 h, 1 kg/m3 h, pelo menos 2 kg/m3 h, pelo menos 3 kg/m3 h, pelo menos 4 kg/m3 h, pelo menos 5 kg/m3 h, 6 kg/m3 h, pelo menos 7 kg/m3 h, pelo menos 8 kg/m3 h, pelo menos 9 kg/m3 h, pelo menos 10 kg/m3 h, pelo menos 15 kg/m3 h, pelo menos 20 kg/m3 h.

[00129] Em algumas modalidades, o propeno é produzido pelo menos pelo menos 0,5 kg/m3 h, 1 kg/m3 h, pelo menos 2 kg/m3 h, pelo menos 3 kg/m3 h, pelo menos 4 kg/m3 h, pelo menos 5 kg/m3 h, 6 kg/m3 h, pelo menos 7 kg/m3 h, pelo menos 8 kg/m3 h, pelo menos 9 kg/m3 h, pelo menos 10 kg/m3 h, pelo menos 15 kg/m3 h, pelo menos 20 kg/m3 h.

[00130] Em algumas modalidades, os produtos combinados dos processos biológicos da presente invenção resultam em uma produção de pelo menos 1 kg/m3 h, pelo menos 2 kg/m3 h, pelo menos 3 kg/m3 h, pelo menos 4 kg/m3 h, pelo menos 5 kg/m3 h, 6 kg/m3 h, pelo menos 7 kg/m3 h, pelo menos 8 kg/m3 h, pelo menos 9 kg/m3 h, pelo menos 10 kg/m3 h, pelo menos 15 kg/m3 h, ou pelo menos 20 kg/m3 h de MEG, acetona, isopropanol propeno, precursores destes, e/ou misturas destes.

[00131] As FIGs 1 e 2 ilustram uma diminuição de taxa de crescimento para valores aumentados de MEG, IPA e ACE. Durante a produção do processo, a remoção in situ de caldo de fermentação de ACE e IPA, com ou sem remoção concomitante in situ de MEG ocorre, desse modo, aliviando seus efeitos inibitórios e concentração aumentada de produto e taxa de produto total de MEG, ACE e IPA. i. Monoetileno Glicol (MEG)

[00132] Monoetileno glicol (MEG) é uma matéria-prima importante para aplicações industriais. Um uso primário de MEG é na manufatura de resinas de tereftalato de polietileno (PET), películas e fibras. Em adição, o MEG é importante na produção de anticongelantes, refrigerantes, anti-degelo de aeronave e descongelantes e solventes. O MEG é também conhecido como etano-1,2-diol.

[00133] Etileno glicol é também usado como um meio para transferência de calor convectiva em, por exemplo, automóveis e computadores resfriados a líquido.

[00134] Devido a este alto ponto de ebulição e afinidade com a água, o etileno glicol é um dessecante útil. O etileno glicol é amplamente usado para inibir a formação de clathrates de gás natural (hidratos) em tubulações de multifase longas que transportam gás natural dos campos remotos de gás para uma facilidade de processamento de gás. O etileno glicol pode ser recuperado do gás natural e reutilizado como inibidor após tratamento de purificação que remove água e sais inorgânicos.

[00135] Usos menores de etileno glicol incluem na manufatura de capacitores, como um intermediário químico na manufatura de 1,4- dioxano, e como um aditivo para impedir corrosão em sistemas de resfriamento de líquido para computadores pessoais. O etileno glicol é também usado na manufatura de algumas vacinas; como um menor ingrediente em cera para sapatos, tintas e corantes; como um tratamento de apodrecimento e fungal para madeira; e como um conservante da espécime biológica.

ii. Acetona

[00136] A acetona (também conhecida como propanona) é um composto orgânico com a fórmula (CH3)2CO. Ela é um líquido inflamável, incolor, volátil, e é a mais simples das cetonas.

[00137] A acetona é miscível com água e serve como um importante solvente, tipicamente para proposta de limpeza no laboratório. Mais de 6,7 milhões de toneladas são produzidas ao redor do mundo, principalmente para uso como um solvente e produção de metil metacrilato e bisfenol A. Ele é um bloco de construção comum em química orgânica. Os usos domésticos familiares de acetona são como o ingrediente ativo em removedor de polimento de unha e como diluente. iii. Isopropanol

[00138] Álcool isopropil (nome IUPAC 2-propanol), também denominado isopropanol, é um composto com a fórmula química C3H8O ou C3H7OH ou CH3CHOHCH3. Ele é um composto químico inflamável, incolor com um forte odor. Ele é o exemplo mais simples de um álcool secundário, onde o átomo de carbono do álcool é fixado a dois outros átomos de carbono as vezes mostrado como (CH3)2CHOH. Ele é um isômero estrutural do propanol. Ele tem uma ampla variedade de usos industrial e doméstico.

[00139] O primeiro e maior uso de isopropanol (IPA) é como um solvente. O outro uso mais significante do IPA é como um intermediário químico. Ele é um componente de limpadores, desinfetantes, sprays aromáticos, vernizes e diluentes, adesivos, farmacêuticos, cosméticos e artigos de higiene. Ele é também usado como agente de extração e como um agente de desidratação. Goma xantana, por exemplo, é extraída com IPA. Em adição, o isopropanol é também usado como um aditivo de gasolina, para dissolver água e gelo em linhas de combustível e tanques, desse modo, impedindo a água de se acumular nas linhas de combustível e congelamento a baixas temperaturas. O IPA é também vendido como álcool para assepsia e usado como um desinfetante. iv. Propeno

[00140] Propeno, também conhecido como propileno ou metil etileno, é um composto químico insaturado tendo a fórmula química C3H6. Ele tem uma dupla ligação, e é o segundo membro mais simples da classe de alqueno de hidrocarbonetos.

[00141] O propeno é produzido de petróleo de combustíveis fósseis, gás natural, e, em uma menor medida, carvão. O propeno é um subproduto de refino de óleo e processamento de gás natural.

[00142] O propeno é o segundo produto de partida mais importante na indústria petroquímica após o etileno. Ele é a matéria-prima para uma ampla variedade de produtos tais como amortecedores para carros, recipientes de alimentos, películas, instrumentos médicos, e similares. Os fabricantes do polipripileno plástico contam com quase dois terços de toda demanda. O polopropileno é, por exemplo, necessário para a produção de películas, embalagens, tampas e fechamentos, bem como para outras aplicações. O propeno é também usado para a produção de químicos importantes tais como óxido de propileno, acrilonitrila, cumeno, butiraldeído, e ácido acrílico. Mais de 85 milhões de toneladas de propeno são processadas ao redor do mundo. Fermentação

[00143] A presente invenção é geralmente direcionada ao uso de substratos de hidrato de carbono derivados de biomassa. Em algumas modalidades, os substratos de hidrato de carbono incluem moléculas C5 e C6. Em algumas modalidades, os microorganismos recombinantes são utilizados para produzir MEG e um ou mais compostos C3, particularmente acetona, isopropanol e propeno, dentro de um ou mais biorreatores. Aqueles técnicos no assinto depreenderão sob consideração da presente invenção que os métodos e/ou processos no presente documento descritos podem ser aplicados a outras reações de fermentação incluindo aquelas usando os mesmos ou diferentes microorganismos. Desse modo, o escopo da presente invenção não é limitado a modalidades particulares e/ou aplicações descritas, preferivelmente para ser compreendida em um sentido mais amplo; por exemplo, a fonte dos substratos e matérias- prima no presente documento descrita não é limitante, outro do que pelo menos um componente deste é útil para alimentação de uma reação de fermentação.

[00144] Contudo, microorganismos usados para processos para a produção de etanol e outros álcoois de substratos gasosos são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto. Deve ser compreendido que aeróbicos e/ou anaeróbicos podem ser utilizados para modificação ou otimização úteis para produzir compostos C3 no presente documento descritos. Os métodos e processos não são limitados a apenas um tipo de microorganismo, preferivelmente um ou mais microorganismos podem ser utilizados ao mesmo tempo na co-cultura ou em fases diferentes ou componentes do(s) biorreator(es). Processos exemplares incluem aqueles descritos, por exemplo, em WO2007/117157, WO2008/115080, WO2009/022925, WO2009/064200, Pat. U.S. Nos.

6.340.581, 6.136.577, 5.593.886, 5.807.722 e 5.821.111, cada do qual é no presente documento incorporado por referência. Um número de bactérias anaeróbicas são conhecidas por serem capazes de efetuarem a fermentação de CO a álcoois, incluindo n-butanol e etanol, e ácido acético, e são adequados para uso no processo da presente invenção. Exemplos de tais bactérias que são adequadas para uso na invenção incluem aquelas do gênero Clostridium, tais como cepas de Clostridium ljungdahlii, incluindo aquelas descritas no

WO 00/68407, EP 117309, Pat. U.S. Nºs. 5.173.429, 5.593.886, e

6.368.819, WO 98/00558 e WO 02/08438, Clostridium carboxydivorans (Liou et al., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 33: pp 2085-2091), Clostridium ragsdalei (WO/2008/028055) and Clostridium autoethanogenum (Abrini et al, Archives of Microbiology 161: pp 345-351). Outras bactérias adequadas incluem aquelas do gênero Moorella, incluindo Moorella sp HUC22-1, (Sakai et al, Biotechnology Letters 29: pp 1607-1612), e aquelas do gênero Carboxydothermus (Svetlichny, V. A., Sokolova, T. G. et al (1991), Systematic and Applied Microbiology 14: 254-260). Exemplos adicionais incluem Moorella thermoacetica, Moorella thermoautotrophica, Ruminococcus productus, Acetobacterium woodii, Eubacterium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Oxobacter pfennigii, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina acetivorans, Desulfotomaculum kuznetsovii (Simpa et. al. Critical Reviews in Biotechnology, 2006 Vol. 26. Pp 41-65).

[00145] Em uma modalidade, um microorganismo adequado para uso na presente invenção é Clostridium autoethanogenum. Em uma modalidade, o Clostridium autoethanogenum é um Clostridium autoethanogenum tendo as características de identificação da cepa depositada no German Resource Centre for Biological Material (DSMZ) sob o número de depósito de identificação 19630. Em outra modalidade, o Clostridium autoethanogenum é um Clostridium autoethanogenum tendo as características de identificação de número de depósito DSMZ 10061.

[00146] Em algumas modalidades, o microorganismo para uso nos métodos da presente invenção pode ser selecionado a partir do grupo consistindo de Yarrowia, Candida, Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Issatchenkia, Zygosaccharomyces, Debaryomyces, Schizosaccharomyces, Pachysolen, Cryptococcus, Trichosporon,

Rhodotorula, Myxozyma, Escherichia, Clostridium, Zymomonas, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, e Brevibacterium.

[00147] Em algumas modalidades, os microorganismos para uso nos métodos da presente invenção incluem Clostridium sp., Clostridium ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ragsdalei, Eubacterium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Moorella thermoacetica, Clostridium aceticum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Clostridium drakei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium formicoaceticum, Clostridium scatologenes, Moorella thermoautotrophica, Acetonama longum, Blautia producta, Clostridium glycolicum, Clostridium magnum, Clostridium mayombei, Clostridium methoxybenzovorans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Oxobacter pfennigii, Thermoanaerobacter kivui, Sporomusa ovata, Thermoacetogenium phaeum, Acetobacterium carbinolicum, Sporomusa termitida, Moorella glycerini, Eubacterium aggregans, Treponema azotonutricium, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pseudomonas putida, Bacillus sp, Corynebacterium sp., Yarrowia lipolytica, Scheffersomyces stipitis, e Terrisporobacter glycolicus.

[00148] A cultura dos microorganismos usados nos métodos da invenção pode ser conduzida usando qualquer número de processos conhecidos na técnica para cultura e fermentação de substratos usando os microorganismos. Técnicas exemplares são fornecidas na seção de "Exemplos" abaixo. Por meio de exemplo adicional, estes processos geralmente descritos nos seguintes artigos usando substratos gasosos para fermentação podem ser utilizados: (i) K. T. Klasson, et al. (1991). Biorreatores para síntese de fermentações de gás. Conservation and Recycling, 5; 145-165; (ii) K. T. Klasson, et al.

(1991). Biorreator design for synthesis gas fermentations. Fuel. 70. 605-614; (iii) K. T. Klasson, et al. (1992). Bioconversion of synthesis gas into liquid or gaseous fuels. Enzyme and Microbial Technology. 14; 602-608; (iv) J. L. Vega, et al. (1989). Study of Gaseous Substrato Fermentation: Carbon monoxide Conversion to Acetate. 2. Continuous Culture. Biotech. Bioeng. 34. 6. 785-793; (v) J. L. Vega, et al. (1989). Study of gaseous substrate fermentations: Carbon monoxide conversion to acetate. 1. Batch culture. Biotechnology and Bioengineering. 34. 6. 774-784; (vi) J. L. Vega, et al. (1990). Design of Biorreators for Coal Synthesis Gas Fermentations. Resources, Conservation and Recycling. 3. 149-160; todos dos quais são no presente documento incorporados por referência.

[00149] A fermentação pode ser efetuada em qualquer biorreator adequado, tal como Biorreator de Tanque Agitado Contínuo, Biorreator de Coluna de Bolha, Biorreator de Elevação de Ar, Biorreator de Leito Fluidizado, Biorreator de Leito Recheado, Foto-Biorreator, Reator de Célula Imobilizado, Reator de Leito de Gotejamento, Reator de Biofilme de Leito Móvel, Coluna de Bolha, Fermentador de Elevação de Gás, Reatores de Membrana tais como Biorreator de Membrana de Fibra Oca. Também, em algumas modalidades, o biorreator compreende um primeiro reator de crescimento em que os microorganismos são cultivados, e um segundo reator de fermentação, ao qual caldo de fermentação a partir do fator de crescimento é alimentado e em que muito do produto de fermentação (por exemplo, MEG, acetona, isopropanol e propeno) é produzido. Em algumas modalidades, o biorreator simultaneamente efetua a cultura de microorganismo e a produção do produto de fermentação (por exemplo, MEG, acetona, isopropanol e propeno) de fontes de carbono, tais como substratos e/ou matérias-primas fornecidos.

[00150] De acordo com várias modalidades, a fonte de carbono para a reação de fermentação é C5 hidratos de carbono (pentose), e/ou C6 hidratos de carbono (hexose). O substrato para a reação de fermenção é C5 e/C6 açúcares, seus derivados de biomassa incluindo, mas não limitados a, amido de milho, suco de cana de açúcar, resíduos de cultura tais como palha de milho e bagaço de cada de açúcar, culturas de grama crescidas, e plantas lenhosas. Por exemplo, sub-produtos de biomassa são obtidos durante a extração e processamento de gêneros alimentícios tais como cana de açúcar, ou amido de milho ou grãos, ou resíduos de biomassa de não-elemento gerados pela indústria florestal.

[00151] A presente invenção ensina crescimento dos microorganismos recombinantes e fermentação para ocorrer, em adição às matérias-primas de substrato, com um meio de cultura líquido adequado e/ou meio de nutriente que necessitam serem alimentados ao biorreator. Um meio de cultura contém vitaminas e minerais suficientes para permitir crescimento do microorganismo usado. Por exemplo, meio adequado para crescimento de meio anaeróbico adequado para a fermentação de etanol usando CO como a única fonte de carbono são descritos na Pat. U.S. Nºs. 5.173.429 e 5.593.886 e WO 02/08438, WO2007/115157 e WO2008/115080. A presente invenção fornece um meio de cultura que tem eficácia aumentada no suporte de crescimento dos microorganismos para produção de MEG e um ou mais compostos C3 no processo de fermentação.

[00152] Em algumas modalidades, um ou mais substratos gasosos são fornecidos ao biorreator. Os substratos gasosos incluem hidrogênio molecular, dióxido de carbono, monóxido de carbono, e syngas.

[00153] Em algumas modalidades, após a depleção do hidrato de carbono ou quase depleção de hidrato de carbono do meio, um pulso de fonte de carbono é realizado.

[00154] A fermentação deve desejavelmente ser efetuada sob condições apropriadas para a fermentação desejada ocorrer. As condições de reação que devem ser consideradas incluem pressão, temperatura, taxa de fluxo de gás, taxa de fluxo de líquido, pH do meio, potencial redox do meio, taxa de agitação (se usando um reator de tanque agitado contínuo), nível inóculo, concentrações máximas de substrato para assegurar que os substratos/matérias-primas na fase de produção não se tornem limitantes, e concentrações máximas de produto para evitar inibição do produto. Condições adequadas são descritas em WO02/08438, WO07/117,157 e WO08/115,080.

[00155] A taxa de produção de produto final desejada, que é um determinante chave como se um dado processo de fermentação é economicamente atrativo, é altamente dependente do controle das condições apropriadas para crescimento do microorganismo. Por exemplo, é conhecido do WO2010/093262 que o substrato contendo CO deve ser fornecido a uma cultura microbial a uma taxa que resulta em crescimento microbial ótimo e/ou produção de metabólito desejada. Se substrato insuficiente é fornecido, o crescimento microbial diminui e o produto de fermentação produz alteração em direção ao ácido acético à custa de etanol. Se substrato excessivo é fornecido, pobre crescimento microbial e/ou morte celular pode resultar. Informação adicional relacionada aos relacionamentos entre parâmetros de operação nestes processos é encontrada no WO2011/002318.

[00156] O controle dos parâmetros de operação é particularmente importante durante o período inicial de operação, em que os objetivos de processamento são focados em não somente crescimento da cultura de célula a um nível suficiente e estabelecendo outras condições para operação contínua, mas também balanceando as produtividades do produto e subproduto. A redução de tempo necessária para condução de uma operação de cultura descontínua, antes da operação de biorreator contínua, tem maiores implicações para aperfeiçoamento de economia de processo. Isto é particularmente verdadeiro em vista do fato que micróbios capazes de crescerem em açúcares como uma fonte de alimento geralmente fazem assim a uma taxa mais rápida do que micróbios usados na competição de tecnologias com gases contendo CO. A partir da perspectiva comercial de operação de um processo de fermentação, o tempo requerido para uma população microbial se tornar estabelecida, isto é, para alcançar uma densidade de célula suficientemente alta para a síntese de níveis economicamente favoráveis de produto, representa um custo de operação chave que afeta a rentabilidade total. A capacidade de aumentar as taxas de crescimento de cultura e/ou produtividades durante um período de operação inicial, por exemplo, sob condições descontínuas, e, desse modo, reduzir o tempo requerido para alcançar densidades de célula desejadas e/ou níveis de produto, é um determinante importante para sucesso total na comercialização de processos biológicos para produção de MEG e um ou mais compostos C3 de açúcares C5 e C6 de biomassa. Recuperação de Produto

[00157] Os produtos gerados nos métodos descritos podem ser recuperados usando uma variedade de técnicas. Métodos exemplares incluem aqueles descritos em WO07/117.157, WO08/115.080, Pat. U.S. Nº. 6.340.581, Pat. U.S. Nº. 6.136.577, Pat. U.S. Nº. 5.593.886, Pat. U.S. U.S. Nº. 5.807.722 e Pat. U.S. Nº. 5.821.111. Contudo, brevemente e por meio de exemplo, álcoois podem ser recuperados a partir do caldo de fermentação por métodos tais como destilação fracional ou evaporação, fermentação extrativa, e pervaporação.

[00158] Os procedimentos de fermentação extrativa envolvem o uso de um solvente miscível em água que apresenta um baixo risco de toxicidade ao organismo de fermentação, para recuperar o etanol a partir do caldo de fermentação diluto. Por exemplo, oleil álcool é um solvente que pode ser usado neste tipo de processo de extração. Oleil álcool é continuamente introduzido em um fermentador, onde após este solvente eleva a formação de uma camada no topo do fermentador que é continuamente extraído e alimentado através de uma centrífuga. Água e células são então prontamente separadas a partir do oleil álcool e retornadas ao fermentador, enquanto que solvente carregado de etanol é alimentado em uma unidade de vaporização de flash. Muito do etanol é vaporizado e condensado, enquanto que o oleil álcool é não-volátil e é recuperado para re- utilização na fermentação.

[00159] Acetato, que é produzido como um subproduto na reação de fermentação, pode também ser recuperado a partir do caldo de fermentação usando métodos conhecidos na técnica.

[00160] Por exemplo, um sistema de adsorção envolvendo um filtro de carvão ativado pode ser usado. Neste caso, é preferido que as células microbiais sejam primeiro removidas a partir do caldo de fermentação usando uma unidade de separação adequada. Numerosos métodos à base de filtração de geração de um caldo de fermentação livre de célula para recuperação de produto são conhecidos na técnica. O etanol livre de célula e permeado contendo acetato é então passado através de uma coluna contendo carvão ativado para adsorver o acetato. O acetato na forma de ácido (ácido acético) preferivelmente do que a forma de sal (acetato) é mais prontamente adsorvido pelo carvão ativado. É, portanto, preferido que o pH do caldo de fermentação seja reduzido para menos do que cerca de 3 antes dele ter passado através da coluna de carvão ativado, para converter a maioria do acetato à forma de ácido acético.

[00161] O ácido acético adsorvido ao carvão ativado pode ser recuperado por eluição usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o etanol pode ser usado para eluir o acetato ligado.

[00162] Outros métodos para recuperação de acetato de um caldo de fermentação são também conhecidos na técnica. Por exemplo, Pat. U.S. Nºs. 6.368.819 e 6.753.170 descreve um sistema de solvente e co-solvente que pode ser usado para extração de ácido acético de caldos de fermentação. Como com o exemplo do sistema à base de oleil álcool descrito para a fermentação extrativa de etanol, os sistemas descritos nas Pat. U.S. Nºs. 6.368.819 e 6.753.170 descrevem um solvente/co-solvente imiscível em água que pode ser misturado com o caldo de fermentação em ou na presença ou ausência dos micro-organismos fermentados de modo a extrair o produto de ácido acético. O solvente/co-solvente contendo o produto de ácido acético é então separado do caldo por destilação. Uma segunda etapa de destilação pode então ser usada para purificar o ácido acético do sistema de solvente/co-solvente. Em algumas modalidades, pervaporação é usada para separar produtos de uma mistura.

[00163] Os produtos da reação de fermentação (por exemplo etanol e acetato) podem ser recuperados do caldo de fermentação por remoção continuamente de uma porção do caldo a partir do biorreator de fermentação, separação de células microbiais a partir do caldo (convenientemente por filtração), e recuperação de um ou mais produtos a partir do caldo simultaneamente ou sequencialmente. No caso de etanol, ele pode ser convenientemente recuperado por destilação, e acetato pode ser recuperado por adsorção em carvão ativado, usando os métodos descritos acima. As células microbiais separadas são, de preferência, retornadas ao biorreator de fermentação. O permeado livre de célula remanescente após o etanol e acetato ser removido é também, de preferência, retornado para o biorreator de fermentação. Nutrientes adicionais (tal como vitaminas B) podem ser adicionados ao permeado de célula livre para restabelecer o meio de nutriente antes dele der retornado ao biorreator. Também, se o pH do caldo foi ajustado conforme descrito acima para aumentar a adsorção de ácido acético ao carvão ativado, o pH deve ser re- ajustado a pH similar àquele do caldo no biorreator de fermentação, antes de ser retornado para o biorreator.

[00164] Em algumas modalidades, a remoção dos produtos voláteis é realizada por remoção de gás, que inclui aeração da composição em que os produtos estão sendo produzidos a uma taxa apropriada para suprir oxigênio e remover os produtos voláteis a partir da composição para uma câmara de gás do biorreator. Em algumas modalidades, um separador de água é utilizado para coletar os produtos voláteis a partir do gás por borbulhamento de gás através de volumes de água ou outro solvente. Biorreatores

[00165] Os biorreatores podem ser divididos em duas categorias, reatores descontínuos e reatores contínuos. Os reatores descontínuos são geralmente tanques agitados suficientemente grandes para manusear o inventário total de um ciclo descontínuos completo. Em alguns casos, reatores descontínuos podem ser operados em modo semi-descontínuo onde um químico é carregado ao vaso, e um segundo químico é adicionado vagarosamente. Reatores contínuos são geralmente menores do que reatores descontínuos e manuseiam o produto como uma corrente de escoamento. Os reatores contínuos podem ser designados como tubos com ou sem chicanas, ou uma série de estágios interconectados ou fases. As vantagens de reatores descontínuos são conforme segue: 1) reatores descontínuos são muito versáteis e são usados para uma variedade de operações unitárias diferentes (destilação descontínua,

armazenagem, cristalização, extração líquido-líquido, etc.) em adição às reações químicas; 2) existe uma grande base instalada de reatores descontínuos dentro da indústria e seu método de uso é bem estabelecido; 3) reatores descontínuos são excelentes em materiais difíceis de manusear similares a pastas fluidas ou produtos com uma tendência à falta; e 4) Reatores descontínuos representam uma solução efetiva e econômica para muitos tipos de reações lentas.

[00166] Por outro lado, benefícios de reatores contínuos são 1) a taxa de muitas reações químicas é dependente das concentrações de reagente. Reatores contínuos são geralmente capazes de copiarem com concentrações de reagente muito mais altas devido a suas capacidades de transferência de calor superiores. Reatores de fluxo de pistão têm a vantagem adicional de maior separação entre reagentes e produtos dando um melhor perfil de concentração; 2) o tamanho pequeno de reatores contínuos torna taxas de mistura mais altas possíveis; e 3) a saída de um reator contínuo pode ser alterada por variação do tempo de curso. Esta aumenta a flexibilidade de operação para os fabricantes.

[00167] Biorreatores podem ser adicionalmente divididos em 6 subtipos. i. Biorreatores de Tanque Agitado Contínuo

[00168] Um biorreator de tanque agitado contínuo consiste de um vaso cilíndrico com eixo central acionado por motor que suportam um ou mais agitadores (impulsores). O eixo é assentado no fundo do biorreator. O número de impulsores é variável e depende do tamanho do biorreator, isto é, razão de altura para diâmetro, referida como razão de aspecto. A razão de aspecto de um biorreator de tanque agitado é usualmente entre 3-5. Contudo, para aplicações de cultura de célula animal, a razão de aspecto é menor do que 2. O diâmetro do impulsor é usualmente 1/3 rd do diâmetro do vaso. A distância entre dois impulsores é aproximadamente 1,2 o diâmetro do impulsor. Tipos diferentes de impulsores (disco de Rustom, com pá côncava, propulsor marinho. etc.) estão em uso. Nos biorreatores de tanque agitado ou em reatores de tanque agitado curtos (STRs), o ar é adicionado ao meio de cultura sob pressão através de dispositivo denominado bocal. O bocal pode ser um anel com muitos furos ou um tubo com um único orifício. O bocal junto com os impulsores (agitadores) capacitam melhor sistema de distribuição de gás através de todo o vaso. As bolhas geradas pelo bocal são rompidas a bolhas menores pelos impulsores e dispersas através de todo o meio. Isto capacita a criação de um ambiente uniforme e homogêneo através de todo o biorreator. Existem muitas vantagens dos STRs sobre outros tipos. Estes incluem a transferência de gás eficiente para crescimento de células, boa mistura dos conteúdos e condições de operação flexíveis, além da disponibilidade comercial dos biorreatores. ii. Biorreatores de Coluna de Bolha

[00169] No biorreator de coluna de bolha, o ar ou gás é introduzido na base da coluna através de tubos perfurados ou placas, ou bocais micro porosos de metal. A taxa de fluxo do ar/gás influencia o desempenho de fatores — transferência e mistura de O2. Os biorreatores de coluna de bolha podem ser assentados com placas perfuradas para aperfeiçoar o desempenho. O vaso usado para biorreatores de coluna de bolha é usualmente cilíndrico com uma razão de aspecto de 4-6 (isto é, razão de altura para diâmetro). iii. Biorreatores de Elevação de Ar

[00170] Nos biorreatores de elevação de ar, o meio do vaso é dividido em duas zonas interconectadas por meio de um chicana ou tubo de sucção. Em uma das duas zonas referidas a um riser, o ar/gás é bombeado. A outra zona que não recebe gás é o tubo de evacuação de gás. A dispersão flui para cima da zona do riser, enquanto o fluxo descendente ocorre no tubo de evacuação de gás. Existem dois tipos de biorreatores de elevação de ar. 1) Biorreator de circuito interno de elevação de ar tem um único recipiente com um tubo de sucção central que cria canais de circulação de líquido interior. Estes biorreatores são simples em desenho, com volume e circulação a uma taxa fixa para fermentação. 2) Biorreator de circuito externo de elevação de ar possui um circuito externo de modo que o líquido circula através de canais independentes separados. Estes reatores podem ser adequadamente modificados para servir as requisições de fermentações diferentes. Em geral, os biorreatores de elevação de ar são mais eficientes do que as colunas de bolha, particularmente para suspensões mais densas de microorganismos. Isto é principalmente porque nestes biorreatores, a mistura dos conteúdos é melhor comparada às colunas de bolha.

[00171] Os biorreatores de elevação de ar são comumente empregados para tecnologia de bioprocessamento aeróbico. Eles asseguram um fluxo de líquido controlado em um sistema de reciclo por bombeio. Devido à alta eficiência, os biorreatores de elevação de ar são as vezes preferidos, por exemplo, produção de metanol, tratamento de água de despejo, produção de proteína de célula única. Em geral, o desempenho dos biorreatores de elevação de ar é dependente do bombeio (injeção) de ar e a circulação de líquido.

[00172] Os biorreatores de elevação de ar de dois estágios são usados para a formação dependente da temperatura de produtos. As células de crescimento de um biorreator (em um exemplo, mantidas a temperatura de 30°C) são bombeadas em outro biorreator (em um exemplo, a temperatura de 42°C). Existe uma necessidade para o biorreator de elevação de ar de dois estágios, visto que é muito difícil elevar a temperatura rapidamente de 30°C a 42°C no mesmo vaso. Cada um dos biorreatores é ajustado com válvulas, e eles são conectados a um tubo de transferência e bomba. As células são crescidas no primeiro biorreator, e o bioprocesso correto ocorre no segundo reator.

[00173] Um fermentador de ciclo de pressão com grandes dimensões constituem um biorreator de torre. Uma alta pressão hidrostática gerada no fundo do reator aumenta a solubilidade de O2 no meio. No topo do riser, (com topo expandido) reduz pressão e facilita a expulsão de CO2. O maio flui de volta no tubo de evacuação de gás, e completa o ciclo. As vantagens com o biorreator de torre é que ele tem alta capacidades de aeração sem ter partes móveis. iv. Biorreatores de Leito Fluidizado

[00174] O biorreator de leito fluidizado é comparável ao biorreator de coluna de bolha, exceto que a posição de topo é expandida para reduzir a velocidade do fluido. O desenho dos biorreatores fluidizados (topo expandido e coluna de reação estreita) é tal que os sólidos são retidos no reator, enquanto que o líquido flui para fora. Estes biorreatores são adequados para uso para efetuar reações envolvendo biocatalisadores suspensos no fluido tais como enzimas imobilizadas, células imobilizadas, e flocos microbiais.

[00175] Para uma operação eficiente de leitos fluidizados, gás é dispensado para criar um leito de fluido de gás-líquido-sólido adequado. É também necessário assegurar que as partículas sólidas suspensas não sejam muito leves ou muito densas (as partículas sólidas suspensas muito leves podem flutuar, pelo que as partículas sólidas suspensas densas podem assentarem no fundo), e elas estão em um bom estado suspenso. A reciclagem do líquido é importante para manter o contato contínuo entre os conteúdos da reação e biocatalisadores. Isto capacita boa eficiência de bioprocessamento. v. Biorreatores de Leito Recheado

[00176] Um leito de partículas sólidas, com biocatalisadores em ou dentro da matriz de sólidos, recheados em uma coluna constitui um biorreator de leito recheado. Os sólidos usados podem ser géis porosos ou não-porosos, e eles podem ser compressíveis ou rígidos em natureza. Um caldo de nutriente flui continuamente sobre o biocatalisador imobilizado. Os produtos obtidos no biorreator de leito recheado são liberados no fluido e removidos. Enquanto que o fluxo do fluido pode ser para cima ou para baixo, fluxo para baixo sob gravidade é preferido.

[00177] A concentração dos nutrientes (e, portanto, dos produtos formados) pode ser aumentada por aumento da taxa de fluxo do caldo de nutriente. Devido a pobre mistura, ela é preferivelmente difícil de controlar o pH de biorreatores de leito recheado pela adição de ácido ou álcali. Contudo, estes biorreatores são preferidos para tecnologia de bioprocessamento envolvendo reações inibidas por produto. Os biorreatores de leito recheado não permitem acúmulo dos produtos de qualquer modo significante.

[00178] Além disso, biorreatores tendo um material poroso seletivamente permeável com uma estrutura de poro aberta são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto. Ver, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente U.S. Nº. US20090130704, que é expressamente no presente documento incorporada por referência em sua totalidade. Biorreatores podem ser categorizados em cinco classes por métodos utilizados para troca de gás, presença, ou ausência de meios para distribuição de fotorradiação, e capacidade de manter condições monossépticas.

[00179] Os biorreatores de classe I têm organismos ou células contidos e isolados fisicamente a partir do ambiente exterior para manter condições monossépticas dentro do biorreator. Gases são forçosamente introduzidos e/ou injetados como uma fase distinta no fluido de cultura. Gases incluem aqueles usados para respiração,

metabolismo aeróbico, bem como gases inertes usados para promover condições anaeróbicas e varrer produtos gasosos e produtos voláteis e subprodutos fora do reator. Universalmente, nesta classe de reatores, gases de produto e gases de subprodutos saem do reator, via um meio separado e independente do ponto de introdução forçado. O fluido de cultura é forçosamente agitado (isto é, movimento hidráulico por meio de outro do que convecção natural), ou por um agitador separado, ou pela introdução forçada de gases como uma fase distinta no fluido de cultura. Exemplos incluem tanque agitado convencional de biorreatores de elevação de ar para a produção de químicos, farmacêuticos, e moléculas pequenas.

[00180] Os biorreatores de classe II têm organismos ou células contidos e isolados fisicamente a partir do ambiente exterior para manter condições monossépticas dentro do biorreator. Gases são passivamente introduzidos ao fluido de cultura, mas NÃO como uma fase distinta. Meios de introdução ou transferência podem ser por migração através de um material permeável à gás que separa a fase de gás da fase de líquido, e também serve para isolar o fluido de cultura fisicamente a partir do ambiente exterior. Gases incluem aqueles usados para respiração, metabolismo aerobóbico, bem como gases usados para promover condições anaeróbicas ou outras condições especiais dentro do reator. Gases de produto e/ou gases de subproduto saem do biorreator via uma abertura separada como uma fase distinta, ou via migração através da mesma ou outra seção de um material permeável à gás para isolar o fluido de cultura fisicamente a partir do ambiente exterior. O fluido de cultura pode ou não pode ser forçosamente agitado. Exemplos incluem reatores de cultura de célula pequeno e grande e reatores microbiais para a produção de químicos, farmacêuticos ou gases.

[00181] Os biorreatores de classe III são idênticos aos biorreatores de classe I, exceto que o fluido de cultura é iluminado ou fotorradiado para fornecer radiação eletromagnética como uma matéria-prima integral ou componente do processo. Variações são conhecidas na técnica para maximização de distribuição de luz aos organismos (por exemplo, Gordon (2002) Intl J of Hydrogen Energy 27:1175-1184). Exemplos incluem biorreatores convencionais que são também iluminados ou internamente ou externamente para a produção de químicos, farmacêuticos, ou moléculas pequenas. Exemplos incluem biorreatores cuja proposta inclui desativação de todos os organismos ou células por exposição à radiação eletromagnética.

[00182] Os biorreatores de classe C são idênticos aos biorreatores de classe II, exceto que o fluido de cultura é iluminado ou fotorradiado para fornecer radiação eletromagnética como uma matéria-prima integral ou componente do processo. Exemplos incluem reatores de cultura de célula pequeno e grande e reatores microbiais para a produção de químicos, farmacêuticos ou gases. Exemplos incluem biorreatores onde incluem desativação de todos os organismos ou células por exposição à radiação eletromagnética.

[00183] Os biorreatores de Classe V têm organismos ou células que não são isolados fisicamente a partir do ambiente exterior. Condições Monossépticas não são mantidas no interior do biorreator. Gases são passivamente introduzidos ao fluido de cultura por transferência de massa de uma uma fase de gás presente acima e em contato com a superfície do fluido de cultura. A transferência de massa ocorre passivamente na interface de gás líquido. A transferência de massa é passiva porque a fase de gás não é bombeada ou injetada. Gases incluem aqueles usados para respiração, metabolismo aeróbico, bem como gases inertes usados para promover condições anaeróbicas ou outras condições especiais dentro do fluido de cultura. Gases de produto e/ou gases de sub-produto deixam o fluido de cultura, via a mesma área interfacial gás-líquido. O fluido de cultura pode ou não pode ser forçosamente agitado. O fluido de cultura pode ou não pode ser fotorradiado. Exemplos incluem tanques abertos para cultivo de biomassa de alga fotossintética (pode ser usada como um suplemento dietético), ou para a produção de químicos usando algas fotossintéticas e/ou bactérias fotossintéticas, bem como bactéria anaeróbica. Exemplos também incluem digestão aeróbica de matéria orgânica solúvel por culturas bacteriais misturadas em instalação de tratamento de água de despejo. Nos biorreatores de classe C materiais seletivamente porosos funcionam como barreira para minimizar a contaminação do fluido de cultura com fragmentos estranhos, enquanto que permitindo fotorradiação e troca de gás, se necessário.

[00184] Classes adicionais de biorreatores existem tendo combinações diferentes de métodos para troca de gás, presença ou ausência de meios para distribuição de fotorradiação, e capacidade de manter condições monossépticas.

[00185] Desenhos de biorreator, instruções para construção de biorreatores, e métodos para uso de biorreatores podem ser encontrados em: Biorreator Design Fundamentals by Norton G. McDuffie, October '91, 137 pp. Pub: Butterworth-Heinemann. ISBN 0750691077; Biorreator System Design by Juan A. Asenjo and J. C. Merchuk, January '95, 648 pp. Pub: Mercel Dekker. ISBN 0824790022; Biorreators in Biotechnology by A. H. Scragg, September. '91, 300 pp, Pub: Prentice Hall Professional Technical References. ISBN 0130851434; Cell Culture Systems and Conventional Biorreator Technology by H. Michelle Jones, November '97, 141 pp. Pub: Business Communications. ISBN 1569653828; Growth and Synthesis: Fermenters, Biorreators and Biomolecular Synthesizers by William L. Hochfeld, October '94, 266 pp.

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[00186] Biorreatores de classe I, II, III, e IV podem ser sistemas descontínuos, semi-descontínuos ou contínuos, e a geometria de qualquer das Classes I a IV pode ser um vaso cilíndrico, uma forma de caixa, uma forma tubular, etc. O estilo de tanque aberto (Classe V) ocorre em uma variedade de configurações. Um exemplo, denominado um desenho de pista tem um meio de circulação (por exemplo, uma pá circula vagarosamente o fluido de cultura) ao redor de uma banheira em forma de donut muito longa e estreita que é aberta para a atmosfera. Outros desenhos incluem um tanque estagnado simples e uma banheira agitada onde não existe movimento do fluido de cultura.

[00187] Todos os tipos de biorreator e métodos para uso dos biorreatores conhecidos na técnica são úteis na prática desta invenção, incluindo, mas não limitados a, biorreatores e métodos descritos em Pat. U.S. Nº. 5.763.279 (publicada em 9 de Junho 1998), Pat. U.S. Nº. 6.228.607 (publicada em 8 de maio 2001), Pat. U.S. Nº.

6.432.698 (publicada em 13 de agosto 2002), UK Patent application GB 2118572, Gordon (2002) Intl J of Hydrogen Energy 27:1175-1184, BioHydrogen (1998) Plenum Press, NY, Ed Zaborsky, WO 02/31101 (depositado em 10 de outubro 10, 2001), EP 0 100 660 (depostado em 29 julho 1983), JP 6000494 (publicada 11 de janeiro de 1994), Liang et al. (2002) Intl J of Hydrogen Energy 27:1157-165, OptiCell™,

BioCrystal Ltd., Westerville, Ohio, WO 89/11529 (depositado em 19 de maio 1989), Pat. U.S. Nº. 6.492.149 (publicada em 10 de dezembro 2002), EP 0 391 590 (depositada em 27 de março, 1990), Biorreator system design/edited by Juan A. Asenjo, José C. Merchuk, Publisher New York: M. Dekker, c1995, van't Riet, Klaas Basic biorreator design/Klaas van't Riet, Johannes Tramper Publisher New York: M. Dekker, c1991, and McDuffie, Norton G Biorreator design fundamentals/Norton G. McDuffie Publisher Boston: Butterworth- Heinemann, c1991.

[00188] Em algumas modalidades, o biorreator usado no processo ensinado nesta invenção pode ser um selecionado de Biorreator de Tanque Agitado Contínuo, Biorreator de Coluna de Bolha, Biorreator de Elevação de Ar, Biorreator de Leito Fluidizado, Biorreatores de Leito Recheado, para efetuar ou, a fase de crescimento ou a fase de produção. Em algumas modalidades, os tipos de biorreator podem ser misturados e equiparados em estágios múltiplos, dependendo das requisições de produção desejadas. Modo de Operação do Biorreator

[00189] A fermentação dentro da presente invenção procede na presença de células em ou um sistema descontínuo ou em um sistema de célula imobilizada. Sistemas descontínuos adequados neste particular incluem um sistema descontínuo de único estágio, um sistema alimentado descontínuo, um sistema de trem de fermentador contínuo, e um sistema descontínuo contínuo de multi-estágio.

[00190] Um sistema descontínuo de único estágio envolve um processo de uma etapa em que os biocatalisadores e/ou microorganismos que produzem biocatalisadores são adicionados a uma mistura fermentável em um vaso de fermentação, e permitidos fermentarem, após o qual os produtos finais desejados ensinados na invenção são separados da mistura fermentável, e os biocatalisadores e/ou microorganismos que produzem biocatalisadores são descartados. Em um sistema alimentado descontínuo, uma corrente de alimentação é continuamente adicionada ao vaso até ele alcance um volume de operação. Uma alíquota da mistura de fermentação em um vaso de fermentação pode ou não pode ser removida em intervalos durante Processo de fermentação, e ser substituída por mistura fermentativa fresca e nutrientes, com ou sem os biocatalisadores adicionais, também denominado de sistema de encher-e-retirar. A fermentação em um sistema de trem de fermentador contínuo envolves adição contínua de mistura fermentável fresca e nutrientes, com ou sem biocatalisadores adicionais, a um vaso de fermentação, que é conectado em série a outros vasos, tal que sob refluxo a partir do primeiro vaso flui no segundo vaso, e assim por diante. Em um sistema de célula imobilizado, os biocatalisadores são presos, por exemplo, em cálcio ou partículas de gel de alginato de alumínio.

[00191] Em cada destes sistemas, as células usadas no processo de fermentação podem ser recicladas por centrifugação, filtração, floculação, ou coprecipitação com materiais inertes. Por exemplo, as células recicladas podem ser adicionadas à mistura de fermentação em pontos diferentes no sistema descontínuo de multi-estágio.

[00192] Em algumas modalidades, os processos e sistema para produção no presente documento descritos podem ser operados no modo descontínuo, alimentado descontínuo, encher-e-retirar, ou contínuo, que pode proporcionar o controle do fluxo de componentes do meio de cultura MM, e, em consequência, aumento dos rendimentos de produto e produtividade. Em algumas modalidades, no final da operação descontínua, operação alimentada descontínua, ou presente na saída do processo contínuo, a massa de célula produzida pode ser separada do caldo de fermentação e usada como inóculo para o próximo curso descontínuo ou curso alimentado descontínuo, ou ser reciclada ao biorreator do processo contínuo, aumentando, portanto, a taxa de formação de produto e minimizando a necessidade de consumo de hidratos de carbono para novo crescimento de célula.

EXEMPLOS Exemplo 1: Co-tolerância de E. coli a Monoetileno glicol (MEG) e Acetona.

[00193] Meio de cultura composto de 10 g/L de triptone, 5 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de NaCl, 9,4g/L de K2HPO4, 2,2g/L de KH2PO4, 7 g/L de xilose e misturas diferentes de Acetona sintética e MEG foi usado para avaliar a co-tolerância a estes produtos. Uma cepa tipo selvagem de K12 de E. coli foi crescida em um tubo de 15mL contendo nenhum MEG ou acetona durante a noite a 37°C e 200 rpm. Esta cultura crescida foi usada para inocular uma microplaca contendo o meio com concentrações diferentes de MEG+Acetona. A placa foi incubada por 40 horas a 37°C e 200 rpm. A FIG. 1 ilustra a curva de crescimento de E. coli para valores iniciais aumentados de MEG+Acetona. Para concentrações de Acetona até 12 g/L e MEG até 61 g/L, nenhum efeito observado no perfil de crescimento de E. coli. A 15 g/L de Acetona e 79 g/L de MEG, o crescimento é cerca da metade da cepa de controle. O aumento da concentração de MEG para 96 g/L não tem impacto no resultado, mostrando que a concentração de acetona parece ser mais crítica para crescimento. 19 g/L de Acetona e 79 g/L de MEG parece ser a concentração mais alta de MEG+Acetona do que permite crescimento, alcançando um OD de cerca da metade da cepa de controle. Concentrações mais altas de acetona prejudica completamente o crescimento, enquanto que concentrações mais altas de MEG (96 g/L) com concentração mais baixa de acetona não afeta o crescimento. Estes resultados mostram que a concentração de acetona no caldo será crítica para a cepa de produção.

Exemplo 2: Tolerância de E. coli a Acetona.

[00194] Meio de cultura composto de 10 g/L de triptone, 5 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de NaCl, 9,4g/L de K2HPO4, 2,2g/L de KH2PO4, 7 g/L de xilose e uma faixa de 10 a 40 g/L de acetona sintética foi usado para avaliar a tolerância a este produto. Uma cepa tipo selvagem de K12 de E. coli foi crescida em um tubo de 15mL contendo nenhuma acetona durante a noite a 37°C e 200 rpm. Esta cultura crescida foi usada para inocular uma microplaca contendo o meio com concentrações diferentes de Acetona. A placa foi incubada por 40 horas a 37°C e 200 rpm. A Figura 2 ilustra a curva de crescimento de E. coli para aumento dos valores iniciais de acetona. Para concentrações de Acetona até 25 g/L, o perfil de crescimento é muito similar à condição de controle (nenhuma acetona), significando que não existe impacto no crescimento de E. coli. A 40 g/L de acetona, o crescimento de E. coli é completamente prejudicado. Exemplo 3. Recuperação in situ de produtos de fermentação voláteis

[00195] Meio de cultura composto de 15g/L de xilose, 12g/L de troptone, 24g/L de extrato de levedura, 9,4g/L de K2HPO4 e 2,2g/L de KH2PO4 e uma faixa de 0,5 a 1g/L de acetona sintética foi usado para avaliar a remoção in situ de produtos voláteis do caldo. Uma cepa selvagem de E. coli foi fermentada em um biorreator de 1 litro (Sartorius Stedim Biotech) a 37°C, agitação de 300 a 600 rpm e um fluxo de ar definido para proporcionar o OTR requerido e a retirada de gás de acetona. O produto foi recuperado da fase gás usando separadores de água. A análise da fração de acetona na fase líquida (caldo) e fase de gás da Figura 3 mostra remoção completa in situ de caldo e alta recuperação na fase de gás. Exemplo 4: Tolerância de E. coli para Monoetileno glicol (MEG).

[00196] Meio de cultura composto de 10 g/L de triptone, 5 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de NaCl, 9,4g/L de K2HPO4, 2,2g/L de KH2PO4, 7 g/L de xilose e uma faixa de 80 a 205 g/L de monoetileno glicol sintético foi usado para avaliar a tolerância a este produto. Uma cepa tipo selvagem K12 de E. coli foi crescida em uma microplaca por 40 horas a 37°C e 200 rpm. A Figura 4 ilustra a curva de crescimento de E. coli para aumentar valores iniciais de monoetileno glicol. Para concentrações de MEG até 150 g/L, o perfil de crescimento é muito similar à condição de controle (nenhum MEG), significando que não existe impacto no crescimento de E. coli. A 176 g/L de MEG, o OD máximo que alcança é cerca de 50% do OD para a condição de controle, significando que esta concentração de MEG começa a afetar o metabolismo de E. coli. Acima deste valor a concentração de MEG afeta fortemente as células de E. coli e nenhum crescimento é observado. Exemplo 5. Processo de uma fase para produção de MEG e Acetona usando uma fonte de carbono misturada

[00197] Uma cepa de E. coli recombinante contendo trajetórias para produção de MEG, IPA e acetona foi fermentada em um biorreator de 1 litro (Sartorius Stedim Biotech) em um processo de uma fase usando uma mistura de glicose e xilose. O inóculo foi crescido em frascos de agitação durante a noite a 37°C, usando meio mínimo composto por 2,2 g/L de KH2PO4, 9,4 g/L de K2HPO4, 1,3 g/L de (NH4)2SO4, 10 mg.L-1 de tiamina, 320 mg.L-1 de EDTA-NaOH, 2 mg/L de CoCl2.6H2O, 10 mg/L de MnSO4.H2O, 5 mg/L de CuSO4.5H2O, 2mg/L de H3BO3, 2mg/L de Na2MoO4.2H2O, 54 mg/L de ZnSO4.7H2O, 1 mg/L de NiSO4.6H2O, 100 mg/L de citrato Fe (III), 100 mg/L de CaCl2.2H2O, 0,3 g/L de MgSO4.H2O, 12,85 g/L de xilose e 2,15 g/L de glicose.

[00198] As células foram concentradas e inoculadas no biorreator produzindo uma concentração inicial de 0,5 g/L de massa de célula seca. O meio de cultivo foi descrito acima, com açúcar inicial total ajustado a 45g/L, enquanto que mantendo uma relação constante de carbono e nitrogênio. O cultivo foi realizado a 550 rpm, 37°C e pH 6,5 automaticamente controlado usando 2,5M de NaOH. Retirada de gás in situ foi realizada por ajuste de uma taxa de aeração apropriada para suprir oxigênio e para retirar muito de acetona e IPA do caldo de fermentação ao gás do biorreator. Os produtos C3 foram recuperados do caldo por borbulhamento do mesmo em uma sequência de três separadores de água de 250mL. Conforme mostrado na Figura 5, foi possível alcançar crescimento simultâneo de célula, produção de MEG e C3 acetona, com um rendimento específico de 3g de produtos per g de massa de célula seca. Exemplo 6. Efeito de nutrientes em produtos de fermentação

[00199] Fermentações de frasco de agitação foram realizadas usando meio minimamente definido (conforme descrito na Tabela 2 abaixo) e uma cepa de E. coli recombinante, usando razões diferentes de carbono para nitrogênio. Uma mistura de xilose e glicose foi usada como fonte de carbono e sulfato de nitrogênio foi usada como fonte de nitrogênio. Fermentação foi realizado a 37°C e 225 rpm, em frascos erlenmeyer com uma tampa designada capaz de proporcionar transferência de oxigênio e captura de produtos voláteis. Os frascos foram inoculados com 5 mL de uma cultura durante a noite usando o mesmo meio de cultura, alcançando um OD inicial de 0,2. Conforme mostrado na Figura 6, a razão de carbono para nitrogênio pode influenciar a produção de produtos C3, quando avaliada em parâmetros de fermentação similares.

Tabela 2: Composição de meio de cultura para testar o efeito de nutrientes em produtos de fermentação Componente Quantidade para 1 Litro KH2PO4 2,2 g K2HPO4 9,4 g NaCl 1g MgSO4.7H2O 0,3 mg Tiamina 10 mg CoCl2.6H2O 2 mg MnSO4.H2O 10 mg CuSO4.5H2O 5 mg H3BO3 2 mg Na2MoO4.2H2O 2 mg ZnSO4.7H2O 30 mg NiSO4.6H2O 1 mg C6H5FeO7 100 mg CaCl2.2H2O 100 mg Exemplo 7. Fermentação descontínua com pulso de xilose para produtos derivados de MEG e C3 com altas produtividades

[00200] Uma cepa de E. coli recombinante contendo trajetórias para produção de MEG, IPA e acetona foi fermentada em um biorreator de 1 litro (Sartorius Stedim Biotech), usando meio composto de 12 g/L de triptone, 24 g/L de extrato de levedura, 9,4 g/L de K2HPO4, 2,2 g/L de KH2PO4 e 60 g/L de xilose. Inóculo foi preparado de modo a alcançar uma concentração de célula inicial no biorreator de cerca de 1 g/L de peso de célula seco. Para esta proposta, três transferências sequenciais foram realizadas usando meio de cultura composto por 12 g/L de triptone, 24 g/L de extrato de levedura, 9,4 g/L de K2HPO4 e 2,2 g/L de KH2PO4 e 15 g/L de xilose. Células foram incubadas a 37°C, 225 rpm, por 10 a 16 horas. A inoculação do biorreator foi realizada por centrifugação das células e suspensão da pelota em 20 mL de meio fresco. O cultivo foi realizado a uma taxa de agitação de 590 rpm, 37°C e pH 7,0 automaticamente controlada usando NaOH 5 M. Após depleção de hidrato de carbono, um pulso de xilose foi realizado de modo a alcançar 30g/L no fermentador. Retirada de gás in situ foi realizada por ajuste de uma taxa de aeração apropriada para suprir oxigênio e para retirar muito da acetona e IPA do caldo de fermentação ao biorreator. Os produtos C3 foram recuperados do caldo borbulhando gás no mesmo em uma sequência de três separadores de água de 250 mL. Conforme mostrado na FIG. 7, foi possível alcançar uma produtividade de coprodutos mais alta do que 1g/L.h. Exemplo 8. Fermentação alimentada descontínua em dois estágios para produção de MEG e Acetona em altas produtividades

[00201] Uma cepa de E. coli recombinante contendo trajetórias para produção de MEG, IPA e acetona foi fermentada em um biorreator de 1 litro (Sartorius Stedim Biotech) em dois estágios: primeiro uma fase de crescimento em glicose para produzir biomassa seguido por uma fase de produção em xilose para a produção de MEG e acetona. O meio usado é composto de 2,2 g.L-1 de KH2PO4, 9,4 g.L-1 de K2HPO4, 1 g.L-1 de NaCl, 1,3 g.L-1 de (NH4)2SO4, 10 mg.L-1 de tiamina, 320 mg.L-1 de EDTA-NaOH, 2 mg.L-1 de CoCl2.6H2O, 10 mg.L-1 de MnSO4.H2O, 5 mg.L-1 de CuSO4.5H2O, 2 mg.L-1 de H3BO3, 2 mg.L-1 de Na2MoO4.2H2O, 54 mg.L-1 de ZnSO4.7H2O, 1 mg.L-1 de NiSO4.6H2O,

100 mg.L-1 de citrato Fe (III), 100 mg.L-1 de CaCl2.2H2O e 0,3 g.L-1 de MgSO4.H2O. Inóculo foi preparado em frasco de agitação, durante a noite a 37°C no meio acima descrito. As células foram concentradas e inoculadas no biorreator produzindo uma concentração inicial de 0,1 g/L de massa de célula seca. De modo a alcançar uma alta concentração de células para a fase de produção, uma fase de crescimento inicial foi realizada com glicose como fonte de carbono. Glicose foi alimentada no reator em pulsos de 15 g/L até 15 g/L de concentração de massa de célula seca que foi alcançada mantendo uma concentração de O2 dissolvido ao redor de 30% de saturação. Nitrogênio foi suplementado durante a fase de crescimento pela adição de NH4OH 6% para controle de pH. A fase de produção foi realizada em xilose que foi continuamente alimentada ao reator a 0,1 g/min. Durante esta fase, oxigênio dissolvido foi usado como o fator de limitação para produção aumentada. A temperatura foi controlada a 37°C e pH a 7. Durante a fase de produção, MEG foi mantido no reator, e de modo a aumentar os efeitos inibitórios, 30% da acetona foi retirada do reator e recuperada em separadores adjacentes. Após 13 horas de fase de produção, 20,3 g/L de MEG e 3,2 g/L de acetona foram produzidos a um rendimento global de 68% de rendimento teórico máximo de co-produtos. Conforme mostrado na Figura 8, foi possível alcançar uma produtividade de coprodutos de 1,8 g/L.h. Exemplo 9. Fluxo de Processo para MEG, ACE, IPA e produção de propeno utilizando Processo de duas fases.

[00202] Na Figura 9, BR01 suporta o biorreator para a fase de crescimento; BR02 para o biorreator para fase de produção; TK01, TK02 para tanques de armazenagem para meio de cultura estéril, respectivamente; SP para microfiltração ou centrífuga para separação de célula; GS para purificador de gás para lavagem de gás água e recuperação de ACE / IPA; PVM para módulo de pervaporação para recuperação de produto; PU01 a PU05 para bombas para meio de cultura e fluxo de caldo de fermentação; VP01 para bomba de vácuo de módulo PVM; e CD para condensador de módulo de PVM. Meio de cultura MM para a fase de crescimento e fase de produção são preparados em tanques TK01 e TK02 (tanques de armazenagem para meio de cultura estéril). Condições de cultura em biorreator BR01 (biorreator para fase de propagação) são ajustadas para promover crescimento de E. coli. BR01 é inoculado com uma cultura de E. coli. Meio de cultura MM, preparado para promover crescimento de E. coli, é bombeado para BR01 do TK01 usando a bomba PU01. Condições de cultura do biorreator BR02 são ajustadas para produção de MEG, ACE e IPA. Após crescimento de E. coli ser efetuado em BR01, a massa de célula produzida é transferida para BR02. O meio de cultura MM preparado para produção de MEG, ACE e IPA conforme descrito é bombeado para BR02 do TK02 usando a bomba PU02.

[00203] Durante a fase de produção BR02 BR02, a maioria da acetona (ACE) e isopropanol (IPA) produzidos são in situ removidos a partir do caldo de fermentação e deixam BR02 com a corrente de gás fora do biorreator. Eles são corretamente recuperados no aparelho depurador de água gás GS. Em seguida as soluções de ACE e/ou IPA são direcionadas à área de purificação de recuperação. No final da produção da fase de produção, o caldo fermentado é descarregado a um tanque de retenção TK03, e células de E. coli são separadas de caldo de fermentação com o auxílio de uma centrífuga ou aparelho de microfiltração SP. As células de E. coli remanescentes são removidas do sistema, usando uma metodologia conhecida, e corretamente descarregadas. Alternativamente, as células podem ser parcialmente recicladas para a fase de crescimento que ocorre no biorreator BR01. A solução bruta de MEG remanescente, sem células de E. coli a partir do aparelho SP, é então direcionada para a área de purificação de recuperação. Alternativamente, remoção in situ de MEG pode ocorrer no módulo de pervaporação PVM.

[00204] Enquanto que a invenção foi descrita em conjunto com modalidades específicas destas, será compreendido que ela é capaz de modificações adicionais, e este pedido é previsto para cobrir quaisquer variações, usos, ou adaptações da invenção que se segue, em geral, os princípios da invenção, e incluindo tais desvios a partir da presente invenção como estando dentro da prática conhecida ou costumeira dentro da técnica a qual a invenção pertence, e conforme pode ser aplicada às características essenciais no presente documento antes colocadas e conforme se segue no escopo das reivindicações em anexo.

[00205] Enquanto que a invenção é dividida em seções, subseções, e delineações adicionais, esta é simplesmente para proposta exemplar, e não é de nenhum modo prevista para limitar os métodos, processos, composições, produtos, substratos, meio, e similares, para uso em qualquer outro aspecto da invenção. Por exemplo, a invenção de substratos usados na subseção de fase de fermentação não limita o uso dos substratos para processos de fase de fermentação.

[00206] Todas as referências, artigos, publicações, patentes, publicações de patente, e pedidos de patente no presente documento citados são incorporados por referência em duas totalidades para todas as propostas.

[00207] Contudo, menção de qualquer referência, artigo, publicação, publicação de patente, e pedido de patente no presente documento citados não é, e não deve ser tomado como, um conhecimento ou qualquer forma de sugestão que eles constituem técnica anterior válida ou formam parte do conhecimento geral comum em qualquer país no mundo.

Modalidades Adicionais

[00208] 1. Processo biológico para produção de dois ou mais produtos desejáveis simultaneamente, Processo compreendendo:

[00209] (a) proporcionar ao pelo menos um biorreator um ou mais microorganismos recombinantes projetados para expressar uma ou mais enzimas de uma ou mais trajetórias de biossíntese selecionadas de uma trajetória de biossíntese de monoetileno glicol (MEG) e uma ou mais trajetórias de biossíntese de composto C3;

[00210] (b) cultivar o um ou mais microorganismos recombinantes de (a) em um ou mais estágios em um meio de cultura contendo uma matéria-prima compreendendo um ou mais substratos compreendendo C5 hidratos de carbono, C6 hidratos de carbono, e/ou dissacarídeos;

[00211] (c) fermentar a cultura em um ou mais estágios sob condições aeróbicas, microaeróbicas, e/ou anaeróbicas; e

[00212] (d) recuperar do biorreator MEG e pelo menos um segundo produto desejável de (c) selecionado a partir do grupo consistindo de acetona, isopropanol, propeno, precursores destes, e misturas destes;

[00213] no qual o pelo menos um segundo produto desejável é recuperado continuamente antes da exaustão do um ou mais substratos.

[00214] 2. Processo biológico para produção de dois ou mais produtos desejáveis simultaneamente, Processo compreendendo:

[00215] (a) proporcionar ao pelo menos um biorreator um ou mais microorganismos recombinantes projetados para expressar uma ou mais enzimas de uma ou mais trajetórias de biossíntese selecionadas de uma trajetória de biossíntese de monoetileno glicol (MEG) e uma ou mais trajetórias de biossíntese de composto C3;

[00216] (b) cultivar o um ou mais microorganismo recombinante de (a) em um ou mais estágios em um meio de cultura contendo uma matéria-prima compreendendo um ou mais substratos compreendendo C5 hidratos de carbono, C6 hidratos de carbono, e/ou dissacarídeos;

[00217] (c) fermentar a cultura em um ou mais estágios sob condições aeróbicas, microaeróbicas, e/ou anaeróbicas; e

[00218] (d) recuperar a partir do biorreator o MEG e pelo menos um segundo produto desejável de (c) selecionado a partir do grupo consistindo de acetona, isopropanol, propeno, precursores destes, e misturas destes;

[00219] no qual o pelo menos um segundo produto desejável é recuperado a partir do biorreator duas ou mais vezes antes da exaustão do um ou mais substratos.

[00220] 3. Processo biológico para produção de dois ou mais produtos desejáveis simultaneamente, Processo compreendendo:

[00221] (a) proporcionar ao pelo menos um biorreator um ou mais microorganismos recombinantes projetados para expressar uma ou mais enzimas de uma ou mais trajetórias de biossíntese selecionadas de uma trajetória de biossíntese de monoetileno glicol (MEG) e uma ou mais trajetórias de biossíntese de composto C3;

[00222] (b) cultivar o um ou mais microorganismos recombinantes de (a) em um meio de cultura contendo uma matéria-prima compreendendo um ou mais substratos compreendendo C5 hidratos de carbono, C6 hidratos de carbono, e/ou dissacarídeos;

[00223] (c) fermentar a cultura em um ou mais estágios sob condições aeróbicas, microaeróbicas, e/ou anaeróbicas; e

[00224] (d) recuperar a partir do biorreator MEG e pelo menos um segundo produto desejável de (c) selecionado a partir do grupo consistindo de acetona, isopropanol, propeno, precursores destes, e misturas destes;

[00225] no qual o pelo menos um segundo produto desejável é recuperado a partir do biorreator continuamente antes da exaustão do um ou mais substratos; e no qual (b) e (c) ocorrem juntos no mesmo estágio.

[00226] 4. Processo biológico para produção de dois ou mais produtos desejáveis simultaneamente, Processo compreendendo:

[00227] (a) proporcionar ao pelo menos um biorreator um ou mais microorganismos recombinantes projetados para expressar uma ou mais enzimas de uma ou mais trajetórias de biossíntese selecionadas de uma trajetória de biossíntese de monoetileno glicol (MEG) e uma ou mais trajetórias de biossíntese de composto C3;

[00228] (b) cultivar o um ou mais microorganismos recombinantes de (a) em um meio de cultura contendo uma matéria-prima compreendendo um ou mais substratos compreendendo C5 hidratos de carbono, C6 hidratos de carbono, e/ou dissacarídeos;

[00229] (c) fermentar a cultura em um ou mais estágios sob condições aeróbicas, microaeróbicas, e/ou anaeróbicas; e

[00230] (d) recuperar a partir do biorreator em um ou mais estágios MEG e pelo menos um segundo produto desejável de (c) selecionado a partir do grupo consistindo de acetona, isopropanol, propeno, precursores destes, e misturas destes;

[00231] no qual o pelo menos um segundo produto desejável é recuperado a partir do biorreator continuamente antes da exausão do um ou mais substratos; e no qual (b) e (c) ocorrem em estágios separados.

[00232] 5. Processo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-4, no qual o um ou mais microorganismos recombinantes são projetados para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo consistindo de: D-tagatose 3-epimerase, D-ribulokinase D-ribulose-1-fosfato aldolase, glico aldeído reductase, tiolase, acetate:acetoacetil-CoA transferase, acetoacetato decarboxilase, D- xilulose 1-kinase, D-xilulose-1-fosfato aldolase, xilose isomerase,

xilose reductase, xilitol dehidrogenase, xilose dehidrogenase, xilonolactonase, xilonate dehidratase, 2-ceto-3-deoxi-D-pentonato aldolase, álcool secundário dehidrogenase, dehidratase, e uma variante funcionalmente equivalente de qualquer um ou mais destes.

[00233] 6. Processo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-4, no qual o um ou mais microorganismos recombinantes são derivados de um microorganismo de origem selecionado a partir do grupo consistindo de Clostridium sp., Clostridium ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ragsdalei, Eubacterium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Moorella thermoacetica, Clostridium aceticum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Clostridium drakei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium formicoaceticum, Clostridium scatologenes, Moorella thermoautotrophica, Acetonama longum, Blautia producta, Clostridium glycolicum, Clostridium magnum, Clostridium mayombei, Clostridium methoxybenzovorans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Oxobacter pfennigii, Thermoanaerobacter kivui, Sporomusa ovata, Thermoacetogenium phaeum, Acetobacterium carbinolicum, Sporomusa termitida, Moorella glycerini, Eubacterium aggregans, Treponema azotonutricium, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pseudomonas putida, Bacillus sp., Corynebacterium sp., Yarrowia lipolytica, Scheffersomyces stipitis e Terrisporobacter glycolicus.

[00234] 7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, no qual o um ou mais microorganismos recombinantes são acetogênicos.

[00235] 8. Processo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-4, no qual a uma ou mais trajetórias de biossíntese de composto C3 são selecionadas a partir do grupo consistindo de: uma trajetória de biossíntese de acetona, uma trajetória de biossíntese de isopropanol, e uma trajetória de biossíntese de propeno.

[00236] 9. Processo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-4, no qual o um ou mais substratos são C5 hidratos de carbono selecionado a partir do grupo consistindo de xilose, arabinose, lixose, ribose, ribulose e xilulose.

[00237] 10. Processo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-4, no qual o um ou mais substratos são C6 hidratos de carbono selecionados a partir do grupo consistindo de glicose, manose, frutose, alose, gulose, idose, galactose, talose, sorbose, tagatose, e psicose.

[00238] 11. Processo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-4, no qual o um ou mais substratos são dissacarídeos selecionados a partir do grupo consistindo de sacarose, lactose, lactulose, maltose, trehalose, celobiose e chitobiose.

[00239] 12. Processo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-4, no qual o um ou mais substratos compreendem C5 hidratos de carbono e C6 hidratos de carbono em uma proporção de 20:1 a 1:20.

[00240] 13. Processo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-4, no qual o um ou mais produtos desejados é selecionado a partir do grupo consistindo de MEG, acetona, isopropanol, e propeno.

[00241] 14. Processo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-4, no qual as etapas de cultivo e de fermentação ocorrem no mesmo estágio.

[00242] 15. Processo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-4, no qual as etapas de cultivo e de fermentação ocorrem em estágios separados.

[00243] 16. Processo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-4, no qual as etapas de cultivo e de fermentação ocorrem em biorreatores separados.

[00244] 17. Processo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-4, no qual as etapas de cultivo e de fermentação ocorrem no mesmo biorreator.

[00245] 18. Processo, de acordo com a reivindicação 11, no qual o biorreator opera sob condições aeróbicas, microaeróbicas e/ou anaeróbicas; ou uma combinação destas.

[00246] 19. Processo, de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, no qual um primeiro estágio do cultivo opera sob condições aeróbicas ou condições microaeróbicas, e quaisquer subsequentes estágios operam sob condições aeróbicas, microaeróbicas e/ou anaeróbicas.

[00247] 20. Processo, de acordo com a reivindicação 11, no qual o um ou mais estágios de (c) recebe a cultura e/ou meio de cultura como um modo descontínuo, um modo descontínuo alimentado, ou uma alimentação de modo contínuo.

[00248] 21. Processo, de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, no qual o estágio de cultivo recebe a cultura e/ou meio de cultura como um modo descontínuo, um modo descontínuo alimentado, ou uma alimentação de modo contínuo, e quaisquer subsequentes estágios operam como um modo descontínuo, um modo descontínuo alimentado, ou uma alimentação de modo contínuo.

[00249] 22. Processo, de acordo com a reivindicação 16, no qual a etapa de cultivo ocorre em um tipo diferente de biorreator do que a etapa subsequente.

[00250] 23. Processo, de acordo com a reivindicação 16, no qual a etapa de cultivo ocorre no mesmo tipo de biorreator como a etapa subsequente.

[00251] 24. Processo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-4, no qual uma matéria-prima adicional compreendendo um substrato gasoso é fornecida ao biorreator.

[00252] 25. Processo, de acordo com a reivindicação 24, no qual o substrato gasoso compreende gás hidrogênio, monóxido de carbono, dióxido de carbono, ou combinações destes.

[00253] 26. Processo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-4, no qual a acetona, isopropanol e/ou propeno são produzidos, e no qual referida acetona, isopropanol e/ou propeno, ou uma mistura destes são recuperados a partir do biorreator continuamente in situ.

[00254] 27. Processo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-4, no qual (b) ocorre antes de (c); ou no qual (b) e (c) ocorrem concorrentemente.

[00255] 28. Processo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-4, no qual o pelo menos um segundo produto desejável recuperado são acetona e/ou isopropanol.

[00256] 29. Processo, de acordo com a reivindicação 28, no qual acetona, isopropanol e/ou MEG, no total, são produzidos em uma quantidade de pelo menos cerca de 2 kg/m3 por hora.

[00257] 30. Processo, de acordo com a reivindicação 28, no qual uma concentração de acetona, isopropanol e/ou MEG produzida é pelo menos cerca de 40 g/L.

[00258] 31. Processo, de acordo com a reivindicação 15, no qual a concentração de oxigênio na etapa de cultivo é ajustada para uma faixa de 1% a 50% de oxigênio dissolvido no meio.

[00259] 32. Processo, de acordo com a reivindicação 15, no qual uma quantidade total do um ou mais substratos que são fornecidos à etapa de cultivo varia de cerca de 10 kg/m3 a cerca de 500 kg/m3.

[00260] 33. Processo, de acordo com a reivindicação 14, no qual o meio de cultura compreende carbono (C) que é fornecido de C5 hidratos de carbono, C6 hidratos de carbono, e/ou dissacarídeos.

[00261] 34. Processo, de acordo com a reivindicação 14, no qual o meio de cultura compreende nutrientes essenciais incluindo nitrogênio (N), fósforo (P), magnésio (Mg), e ferro (Fe).

[00262] 35. Processo, de acordo com a reivindicação 15, no qual uma razão de C:N na etapa de cultivo é pelo menos 10:1.

[00263] 36. Processo, de acordo com a reivindicação 15, no qual uma razão de C:P na etapa de cultivo é pelo menos 5:1.

[00264] 37. Processo, de acordo com a reivindicação 15, no qual uma razão de C:Mg na etapa de cultivo é pelo menos 50:1.

[00265] 38. Processo, de acordo com a reivindicação 15, no qual uma razão de C:Fe na etapa de cultivo é pelo menos 300:1.

[00266] 39. Processo, de acordo com a reivindicação 15, no qual a concentração final de massa de célula do um ou mais microorganismos recombinantes na etapa de cultivo varia de cerca de 1 kg/m3 a cerca de 100 kg/ m3 como de uma massa de célula seca.

[00267] 40. Processo, de acordo com a reivindicação 15, no qual a etapa de cultivo opera de 5 até 100 horas para o cultivo das células do um ou mais microorganismos recombinantes.

[00268] 41. Processo, de acordo com a reivindicação 15, no qual a cultura na etapa de fermentação compreende cerca de 1% a cerca de 30% da massa de célula, que é transferida a partir da etapa de cultivo no meio de cultura com o um ou mais substratos.

[00269] 42. Processo, de acordo com a reivindicação 15, no qual a concentração de oxigênio na etapa de fermentação é ajustada a uma faixa de 0% a 10% de oxigênio dissolvido no meio.

[00270] 43. Processo, de acordo com a reivindicação 15, no qual uma quantidade total do um ou mais substratos que são fornecidos à etapa de fermentação varia de cerca de 100 kg/m3 a cerca de 800 kg/m3.

[00271] 44. Processo, de acordo com a reivindicação 15, no qual uma razão de C:N na etapa de fermentação é pelo menos 50:1.

[00272] 45. Processo, de acordo com a reivindicação 15, no qual uma razão de C:P na etapa de fermentação é pelo menos 20:1.

[00273] 46. Processo, de acordo com a reivindicação 15, no qual uma razão de C:Mg na etapa de fermentação é pelo menos 200:1.

[00274] 47. Processo, de acordo com a reivindicação 15, no qual uma razão de C:Fe na etapa de fermentação é pelo menos 800:1.

[00275] 48. Processo, de acordo com a reivindicação 15, no qual a etapa de fermentação opera de 10 até 300 horas para operação alimentada descontínua, e até 300 horas para operação contínua.

[00276] 49. Processo, de acordo com a reivindicação 15, no qual uma quantidade total do um ou mais substratos que são fornecidos ao biorreator varia de cerca de 100 kg/m3 a cerca de 800 kg/m3.

[00277] 50. Processo, de acordo com a reivindicação 14, no qual uma razão de C:N no biorreator é pelo menos 10:1.

[00278] 51. Processo, de acordo com a reivindicação 14, no qual uma razão de C:P no biorreator é pelo menos 5:1.

[00279] 52. Processo, de acordo com a reivindicação 14, no qual uma razão de C:Mg no biorreator é pelo menos 50:1.

[00280] 53. Processo, de acordo com a reivindicação 14, no qual uma razão de C:Fe no biorreator é pelo menos 300:1.

[00281] 54. Processo, de acordo com a reivindicação 14, no qual o biorreator opera entre 10 e 300 horas.

[00282] 55. Processo, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, no qual os produtos desejáveis que são recuperados a partir da etapa de fermentação são acetona, isopropanol, MEG e/ou propeno.

[00283] 56. Processo, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, no qual a acetona é produzida pelo menos cerca de 20 kg/m3.

[00284] 57. Processo, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, no qual isopropanol é produzido pelo menos cerca de 35 kg/m3.

[00285] 58. Processo, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, no qual MEG é produzido pelo menos cerca de 100 kg/m3.

[00286] 59. Processo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-4, 14, ou 15, no qual Processo compreende adicionalmente remover acetona e/ou isopropanol a partir do caldo de fermentação in situ.

[00287] 60. Processo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-4, no qual três ou mais produtos desejáveis são produzidos simultaneamente.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES

1. Processo biológico para produção de dois ou mais produtos desejáveis simultaneamente, Processo caracterizado pelo fato de compreender: (a) proporcionar ao pelo menos um biorreator um ou mais microorganismos recombinantes projetados para expressar uma ou mais enzimas de uma ou mais trajetórias de biossíntese selecionadas de uma trajetória de biossíntese de monoetileno glicol (MEG) e uma ou mais trajetórias de biossíntese de composto C3; (b) cultivar o um ou mais microorganismos recombinantes de (a) em um ou mais estágios em um meio de cultura contendo uma matéria-prima compreendendo um ou mais substratos compreendendo C5 hidratos de carbono, C6 hidratos de carbono, e/ou dissacarídeos; (c) fermentar a cultura em um ou mais estágios sob condições aeróbicas, microaeróbicas e/ou anaeróbicas; e (d) recuperar do biorreator MEG e pelo menos um segundo produto desejável de (c) selecionado a partir do grupo consistindo de acetona, isopropanol, propeno, precursores destes, e misturas destes; no qual o pelo menos um segundo produto desejável é recuperado continuamente antes da exaustão do um ou mais substratos.

2. Processo biológico para produção de dois ou mais produtos desejáveis simultaneamente, processo caracterizado pelo fato de compreender: (a) proporcionar ao pelo menos um biorreator um ou mais microorganismos recombinantes projetados para expressar uma ou mais enzimas de uma ou mais trajetórias de biossíntese selecionadas de uma trajetória de biossíntese de monoetileno glicol (MEG) e uma ou mais trajetórias de biossíntese de composto C3;

(b) cultivar o um ou mais microorganismo recombinante de (a) em um ou mais estágios em um meio de cultura contendo uma matéria-prima compreendendo um ou mais substratos compreendendo C5 hidratos de carbono, C6 hidratos de carbono, e/ou dissacarídeos; (c) fermentar a cultura em um ou mais estágios sob condições aeróbicas, microaeróbicas e/ou anaeróbicas; e (d) recuperar a partir do biorreator o MEG e pelo menos um segundo produto desejável de (c) selecionado a partir do grupo consistindo de acetona, isopropanol, propeno, precursores destes, e misturas destes; no qual o pelo menos um segundo produto desejável é recuperado a partir do biorreator duas ou mais vezes antes da exaustão do um ou mais substratos.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o um ou mais microorganismos recombinantes são projetados para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo consistindo de: D-tagatose 3-epimerase, D-ribulokinase D-ribulose-1-fosfato aldolase, glico aldeído reductase, tiolase, acetato:acetoacetil-CoA transferase, acetoacetato decarboxilase, D-xilulose 1-kinase, D-xilulose-1-fosfato aldolase, xilose isomerase, xilose reductase, xilitol dehidrogenase, xilose dehidrogenase, xilonolactonase, xilonate dehidratase, 2-ceto-3-deoxi- D-pentonato aldolase, álcool secundário dehidrogenase, dehidratase, e uma variante funcionalmente equivalente de qualquer um ou mais destes.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o um ou mais microorganismos recombinantes são derivados de um microorganismo de origem selecionado a partir do grupo consistindo de Clostridium sp., Clostridium ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ragsdalei, Eubacterium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Moorella thermoacetica, Clostridium aceticum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Clostridium drakei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium formicoaceticum, Clostridium scatologenes, Moorella thermoautotrophica, Acetonama longum, Blautia producta, Clostridium glycolicum, Clostridium magnum, Clostridium mayombei, Clostridium methoxybenzovorans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Oxobacter pfennigii, Thermoanaerobacter kivui, Sporomusa ovata, Thermoacetogenium phaeum, Acetobacterium carbinolicum, Sporomusa termitida, Moorella glycerini, Eubacterium aggregans, Treponema azotonutricium, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pseudomonas putida, Bacillus sp., Corynebacterium sp., Yarrowia lipolytica, Scheffersomyces stipitis e Terrisporobacter glycolicus.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais trajetórias de biossíntese de composto C3 são selecionadas a partir do grupo consistindo de: uma trajetória de biossíntese de acetona, uma trajetória de biossíntese de isopropanol, e uma trajetória de biossíntese de propeno.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o um ou mais substratos são C5 hidratos de carbono selecionado a partir do grupo consistindo de xilose, arabinose, lixose, ribose, ribulose e xilulose.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o um ou mais substratos são C6 hidratos de carbono selecionados a partir do grupo consistindo de glicose, manose, frutose, alose, gulose, idose, galactose, talose, sorbose, tagatose e psicose.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,

caracterizado pelo fato de que o um ou mais substratos são dissacarídeos selecionados a partir do grupo consistindo de sacarose, lactose, lactulose, maltose, trehalose, celobiose e chitobiose.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o um ou mais produtos desejados são selecionados a partir do grupo consistindo de MEG, acetona, isopropanol e propeno.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a etapa de cultivo e etapa de fermentação ocorrem no mesmo estágio.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a etapa de cultivo e etapa de fermentação ocorrem em estágios separados.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que um primeiro estágio do cultivo opera sob condições aeróbicas ou microaeróbicas, e quaisquer subsequentes estágios operam sob condições aeróbicas, microaeróbicas e/ou anaeróbicas.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a acetona, isopropanol, e/ou propeno são produzidos, e no qual referida acetona, isopropanol, e/ou propeno, ou uma mistura destes, são recuperados a partir do biorreator continuamente in situ.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que (b) ocorre antes de (c); ou no qual (b) e (c) ocorrem concorrentemente.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que uma concentração de acetona, isopropanol, e/ou MEG produzidos é pelo menos cerca de 40 g/L.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,

caracterizado pelo fato de que acetona é produzida pelo menos cerca de 20 kg/m3.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que isopropanol é produzido pelo menos cerca de 35 kg/m3.

18. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que MEG é produzido pelo menos cerca de 100 kg/m3.

19. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que Processo compreende adicionalmente remover acetona e/ou isopropanol do caldo de fermentação in situ.

20. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que três ou mais produtos desejáveis são produzidos simultaneamente.

Perfil de Crescimento de E. coli em misturas diferentes de MEG + Acetona

Controle

Petição 870200115577, de 11/09/2020, pág. 105/123 1/9

OD (600 nm) Tempo (h)

Tolerância de Acetona

Tempo (h)

OD (600 nm)

Total recuperado Fase líquido Tempo (h) Fase gás

Acetona (de fração inicial)

Perfil de Crescimento de E. coli em concentrações diferentes MEG

Petição 870200115577, de 11/09/2020, pág. 108/123 Controle

OD (600 nm) 4/9

Tempo (h)

OD 600 nm, Xilose, ACE (g/L)

Xilose OD (600 nm) Tempo (h) Glicose

Glicose, ACE (g/L)

Razão C/N

Rendimento relativo de C3

Produtos C3 Tempo (h)

Xilose OD (600 nm)

OD (600 nm), Xilose, MEG, produtos C3 (g/L)

Co-produção Acetona

Produtividade (g/L)

Água

Petição 870200115577, de 11/09/2020, pág. 113/123 Gás desprendido com ACE ou IPA

Inóculo Água + ACE ou IPA Gás desprendido Reciclo de célula de E. coli para recuperação Inóculo

Sangria de células de E. coli 9/9

Células w/o de caldo de fermentação com MEG para recuperação Caldo de Ar estéril Ar estéril fermentação

Caldo de fermentação